JPH09176039A - 非天然のジスルフィド架橋を有するゴナドトロピン - Google Patents
非天然のジスルフィド架橋を有するゴナドトロピンInfo
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 安定性の向上したゴナドトロピン誘導体の提
供。 【解決手段】 非天然ジスルフィド架橋、好ましくはサ
ブユニット間の非天然ジスルフィド架橋例えばヒト黄体
形成ホルモンで（Ｍｅｔ α２９ Ｃｙｓ−Ｍｅｔ β
４１ Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ α３７ Ｃｙｓ−Ｉｌｅ
β３３ Ｃｙｓ）等、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンで
（Ｍｅｔ α２９ Ｃｙｓ−Ｍｅｔ β４１ Ｃｙ
ｓ）、（Ｔｙｒ α３７ Ｃｙｓ−Ｉｌｅ β３３ Ｃ
ｙｓ）等を有するαサブユニットとβサブユニットとか
らなるゴナドトロピン、およびそのゴナドトロピンを含
有する医薬組成物。
供。 【解決手段】 非天然ジスルフィド架橋、好ましくはサ
ブユニット間の非天然ジスルフィド架橋例えばヒト黄体
形成ホルモンで（Ｍｅｔ α２９ Ｃｙｓ−Ｍｅｔ β
４１ Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ α３７ Ｃｙｓ−Ｉｌｅ
β３３ Ｃｙｓ）等、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンで
（Ｍｅｔ α２９ Ｃｙｓ−Ｍｅｔ β４１ Ｃｙ
ｓ）、（Ｔｙｒ α３７ Ｃｙｓ−Ｉｌｅ β３３ Ｃ
ｙｓ）等を有するαサブユニットとβサブユニットとか
らなるゴナドトロピン、およびそのゴナドトロピンを含
有する医薬組成物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はゴナドトロピン、該
ゴナドトロピンを含有する医薬組成物および該ゴナドト
ロピンをコードするＤＮＡに関する。
ゴナドトロピンを含有する医薬組成物および該ゴナドト
ロピンをコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】ゴナドトロピンは構造的に関連する一群
の糖タンパク質ホルモンである。代表的なものには絨毛
性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳ
Ｈ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）および甲状腺刺激ホル
モン（ＴＳＨ）がある。ＦＳＨ、ＬＨおよびＴＳＨはほ
とんどの脊椎動物種に存在し、脳下垂体により合成、分
泌される。ＣＧはこれまではヒト等の霊長類とウマのみ
に発見されており、胎盤組織により合成される。
の糖タンパク質ホルモンである。代表的なものには絨毛
性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳ
Ｈ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）および甲状腺刺激ホル
モン（ＴＳＨ）がある。ＦＳＨ、ＬＨおよびＴＳＨはほ
とんどの脊椎動物種に存在し、脳下垂体により合成、分
泌される。ＣＧはこれまではヒト等の霊長類とウマのみ
に発見されており、胎盤組織により合成される。
【０００３】ゴナドトロピンはαとβと呼ばれる２種類
の異なるサブユニットからなるヘテロダイマーであり、
これらサブユニットは非共有結合により会合している。
一つの種内では、αサブユニットはゴナドトロピンファ
ミリーの各メンバーに関しては基本的には同一であり、
種間で高度に保存されてもいる。βサブユニットは各メ
ンバー間、すなわちＣＧ、ＦＳＨ、ＴＳＨおよびＬＨ間
で異なっているが、構造的にはかなりの相同性が見られ
る。さらに、βサブユニットも種間でかなり高度に保存
されている。ヒトにおいては、αサブユニットは９２ア
ミノ酸残基からなるが、βサブユニットは各メンバー間
で大きさが異なり、ｈＦＳＨで１１１残基、ｈＬＨで１
２１残基、ｈＴＳＨで１１８残基、ｈＣＧで１４５残基
である（Ｃｏｍｂａｒｎｏｕｓ， Ｙ．（１９９２），
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ， １３， ６
７０−６９１， Ｌｕｓｔｂａｄｅｒ， Ｊ．Ｗ．ら
（１９９３）， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗ
ｓ， １４， ２９１−３１１）。ｈＣＧのβサブユニ
ットは、Ｃ末端に約３４個の付加的なアミノ酸（以下、
カルボキシ末端タンパク質（ＣＴＰ）と称する）を有し
ている点で他のβサブユニットよりも実質的に大きい。
の異なるサブユニットからなるヘテロダイマーであり、
これらサブユニットは非共有結合により会合している。
一つの種内では、αサブユニットはゴナドトロピンファ
ミリーの各メンバーに関しては基本的には同一であり、
種間で高度に保存されてもいる。βサブユニットは各メ
ンバー間、すなわちＣＧ、ＦＳＨ、ＴＳＨおよびＬＨ間
で異なっているが、構造的にはかなりの相同性が見られ
る。さらに、βサブユニットも種間でかなり高度に保存
されている。ヒトにおいては、αサブユニットは９２ア
ミノ酸残基からなるが、βサブユニットは各メンバー間
で大きさが異なり、ｈＦＳＨで１１１残基、ｈＬＨで１
２１残基、ｈＴＳＨで１１８残基、ｈＣＧで１４５残基
である（Ｃｏｍｂａｒｎｏｕｓ， Ｙ．（１９９２），
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ， １３， ６
７０−６９１， Ｌｕｓｔｂａｄｅｒ， Ｊ．Ｗ．ら
（１９９３）， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗ
ｓ， １４， ２９１−３１１）。ｈＣＧのβサブユニ
ットは、Ｃ末端に約３４個の付加的なアミノ酸（以下、
カルボキシ末端タンパク質（ＣＴＰ）と称する）を有し
ている点で他のβサブユニットよりも実質的に大きい。
【０００４】ヘテロダイマーの二つのサブユニットは多
くの保存されたサブユニット内ジスルフィド架橋を示
し、αサブユニットには５個のジスルフィド架橋、βサ
ブユニットには６個のジスルフィド架橋がある。対応す
るシステイン残基は、ゴナドトロピンファミリーのすべ
てのメンバー間で完全に保存されている。ｈＣＧの最近
得られたＸ線構造から、これらのジスルフィド架橋はジ
スルフィドの結び目（ｋｎｏｔ）と呼ばれる典型的な三
次元構造パターンに関与していることが示されている。
ゴナドトロピンはＮ−グリコシル化することのできる３
又は４個のアスパラギン残基を有している。さらに、ｈ
ＣＧのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）は４つのセリンの位置
でＯグリコシル化することができる。
くの保存されたサブユニット内ジスルフィド架橋を示
し、αサブユニットには５個のジスルフィド架橋、βサ
ブユニットには６個のジスルフィド架橋がある。対応す
るシステイン残基は、ゴナドトロピンファミリーのすべ
てのメンバー間で完全に保存されている。ｈＣＧの最近
得られたＸ線構造から、これらのジスルフィド架橋はジ
スルフィドの結び目（ｋｎｏｔ）と呼ばれる典型的な三
次元構造パターンに関与していることが示されている。
ゴナドトロピンはＮ−グリコシル化することのできる３
又は４個のアスパラギン残基を有している。さらに、ｈ
ＣＧのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）は４つのセリンの位置
でＯグリコシル化することができる。
【０００５】ゴナドトロピンは、代謝、体温調節および
生殖プロセス等の多様な体機能に重要な役割を果たして
いる。例えば、下垂体ゴナドトロピンＦＳＨは卵胞の発
達と成熟の促進に中心的な役割を果たしている一方で、
ＬＨは排卵を誘導する（Ｓｈａｒｐ， Ｒ．Ｍ．（１９
９０）， Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， ３
３，７８７−８０７； ＤｏｒｒｉｎｇｔｏｎとＡｒｍ
ｓｔｒｏｎｇ （１９７９）， Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏ
ｇ． Ｈｏｒｍ． Ｒｅｓ．， ３５， ３０１−３４
２）。最近、ＦＳＨは単独またはＬＨ活性と組み合わせ
て、卵巣刺激、すなわちインビトロ受精（ＩＶＦ）の卵
巣過剰刺激および不妊症無排卵女性のインビボ排卵の誘
導（Ｉｎｓｌｅｒ， Ｖ．（１９８８）， Ｉｎｔ．
Ｊ． Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ， ３３， ８５−９７，
ＮａｖｏｔとＲｏｓｅｎｗａｋｓ（１９８８）， Ｊ．
Ｖｉｔｒｏ Ｆｅｒｔ． Ｅｍｂｒｙｏ Ｔｒａｎｓ
ｆｅｒ， ５， ３−１３）および男性の性機能低下の
ために臨床的に応用されている。
生殖プロセス等の多様な体機能に重要な役割を果たして
いる。例えば、下垂体ゴナドトロピンＦＳＨは卵胞の発
達と成熟の促進に中心的な役割を果たしている一方で、
ＬＨは排卵を誘導する（Ｓｈａｒｐ， Ｒ．Ｍ．（１９
９０）， Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， ３
３，７８７−８０７； ＤｏｒｒｉｎｇｔｏｎとＡｒｍ
ｓｔｒｏｎｇ （１９７９）， Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏ
ｇ． Ｈｏｒｍ． Ｒｅｓ．， ３５， ３０１−３４
２）。最近、ＦＳＨは単独またはＬＨ活性と組み合わせ
て、卵巣刺激、すなわちインビトロ受精（ＩＶＦ）の卵
巣過剰刺激および不妊症無排卵女性のインビボ排卵の誘
導（Ｉｎｓｌｅｒ， Ｖ．（１９８８）， Ｉｎｔ．
Ｊ． Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ， ３３， ８５−９７，
ＮａｖｏｔとＲｏｓｅｎｗａｋｓ（１９８８）， Ｊ．
Ｖｉｔｒｏ Ｆｅｒｔ． Ｅｍｂｒｙｏ Ｔｒａｎｓ
ｆｅｒ， ５， ３−１３）および男性の性機能低下の
ために臨床的に応用されている。
【０００６】現在、治療目的のゴナドトロピンはヒト尿
から単離されており、純度が低い（Ｍｏｒｓｅら（１９
８８）， Ａｍｅｒ． Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ． ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ， １７， １４３）。これらの尿性ゴナドトロピン
とは対照的に、組換えゴナドトロピンは均一な品質、す
なわち再現性のある生化学的および生物学的性質を有し
ている点で非常に好都合である。ゲノムクローンとｃＤ
ＮＡクローンはすべてのサブユニットについて作られて
おり、それらの一次構造が解明されている。さらに、チ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をヒトゴナド
トロピンのサブユニット遺伝子でトランスフェクション
した細胞が完全なダイマーを分泌することができること
が示されている（例えば、Ｋｅｅｎｅら（１９８９），
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６４， ４７６９
−４７７５； Ｖａｎ Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋら（１９９
０）， Ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ
（ｅｄｓ Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ Ｄ．Ｊ．Ａ．およびＳ
ｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ Ｈ．編）， ２４５−２５
１）。
から単離されており、純度が低い（Ｍｏｒｓｅら（１９
８８）， Ａｍｅｒ． Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ． ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ， １７， １４３）。これらの尿性ゴナドトロピン
とは対照的に、組換えゴナドトロピンは均一な品質、す
なわち再現性のある生化学的および生物学的性質を有し
ている点で非常に好都合である。ゲノムクローンとｃＤ
ＮＡクローンはすべてのサブユニットについて作られて
おり、それらの一次構造が解明されている。さらに、チ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をヒトゴナド
トロピンのサブユニット遺伝子でトランスフェクション
した細胞が完全なダイマーを分泌することができること
が示されている（例えば、Ｋｅｅｎｅら（１９８９），
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６４， ４７６９
−４７７５； Ｖａｎ Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋら（１９９
０）， Ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ
（ｅｄｓ Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ Ｄ．Ｊ．Ａ．およびＳ
ｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ Ｈ．編）， ２４５−２５
１）。
【０００７】それ以来、例えば組換えＦＳＨの生化学的
および生物学的特性は天然のＦＳＨのものとほとんど同
一であることが示されている（Ｍａｎｎａｅｒｔｓら
（１９９１）， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １２
９， ２６２３−２６３０）。さらに、組換えＦＳＨを
用いる調節された卵巣の過剰排卵後に妊娠が得られた
（Ｇｅｒｍｏｎｄら（１９９２）， Ｌａｎｃｅｔ，
３３９， １１７０， Ｄｅｖｒｏｅｙら（１９９
２）， Ｌａｎｃｅｔ， ３３９， １１７０−１１７
１）。
および生物学的特性は天然のＦＳＨのものとほとんど同
一であることが示されている（Ｍａｎｎａｅｒｔｓら
（１９９１）， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １２
９， ２６２３−２６３０）。さらに、組換えＦＳＨを
用いる調節された卵巣の過剰排卵後に妊娠が得られた
（Ｇｅｒｍｏｎｄら（１９９２）， Ｌａｎｃｅｔ，
３３９， １１７０， Ｄｅｖｒｏｅｙら（１９９
２）， Ｌａｎｃｅｔ， ３３９， １１７０−１１７
１）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】二つのサブユニットを
ダイマーにうまく組み合わせることがダイマーの生物学
的活性にとっての絶対の必須条件である。ヘテロダイマ
ーを対応するサブユニットに解離することはインビボ生
物活性の損失の主要な要因であると考えられている。さ
らに、解離や脱アミド化等のプロセスのために、保存期
間を短くしなければならない。したがって、ヘテロダイ
マーの熱力学的な安定性はインビボとインビトロの両方
の条件下でゴナドトロピンの半減期に影響を与える重要
な因子であると考えられている。よって、ゴナドトロピ
ンの安定性がさらに改良されることが臨床的に求められ
ている。
ダイマーにうまく組み合わせることがダイマーの生物学
的活性にとっての絶対の必須条件である。ヘテロダイマ
ーを対応するサブユニットに解離することはインビボ生
物活性の損失の主要な要因であると考えられている。さ
らに、解離や脱アミド化等のプロセスのために、保存期
間を短くしなければならない。したがって、ヘテロダイ
マーの熱力学的な安定性はインビボとインビトロの両方
の条件下でゴナドトロピンの半減期に影響を与える重要
な因子であると考えられている。よって、ゴナドトロピ
ンの安定性がさらに改良されることが臨床的に求められ
ている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明はそのようなゴナ
ドトロピンを提供することにある。驚くべきことに、１
つ以上の非天然ジスルフィド架橋をゴナドトロピンに導
入した結果、該ゴナドトロピンの安定性が向上すること
が見出された。本明細書に記載の非天然ジスルフィド架
橋とは、天然のゴナドトロピンには見られないジスルフ
ィド架橋であり、したがって、この非天然のジスルフィ
ド架橋には天然のゴナドトロピンに存在するαサブユニ
ット中の５つのジスルフィド架橋もβサブユニット中の
６つのジスルフィド架橋も含まない。「天然の」ゴナド
トロピンはその関連する組織から単離されたゴナドトロ
ピンと同じアミノ酸配列を有するゴナドトロピンであ
る。
ドトロピンを提供することにある。驚くべきことに、１
つ以上の非天然ジスルフィド架橋をゴナドトロピンに導
入した結果、該ゴナドトロピンの安定性が向上すること
が見出された。本明細書に記載の非天然ジスルフィド架
橋とは、天然のゴナドトロピンには見られないジスルフ
ィド架橋であり、したがって、この非天然のジスルフィ
ド架橋には天然のゴナドトロピンに存在するαサブユニ
ット中の５つのジスルフィド架橋もβサブユニット中の
６つのジスルフィド架橋も含まない。「天然の」ゴナド
トロピンはその関連する組織から単離されたゴナドトロ
ピンと同じアミノ酸配列を有するゴナドトロピンであ
る。
【００１０】したがって、本発明は１つ以上の非天然の
ジスルフィド架橋を有するαサブユニットとβサブユニ
ットからなるゴナドトロピンを提供する。
ジスルフィド架橋を有するαサブユニットとβサブユニ
ットからなるゴナドトロピンを提供する。
【００１１】この非天然ジスルフィド架橋は部位特異的
突然変異誘発（関連部位の天然のアミノ酸残基のシステ
インへの点突然変異）を用いて導入することができる。
この点突然変異はＸ αｙ ＣｙｓまたはＸ βｙ Ｃ
ｙｓ（ここでＸは、αサブユニットまたはβサブユニッ
トの関連部位ｙでシステインにそれぞれ変異させたアミ
ノ酸残基である）の形で示す（アミノ酸には３文字コー
ドを用いる）。Ｃｙｓαｙ ＣｙｓまたはＣｙｓ βｙ
Ｃｙｓとの表記は天然サブユニットのシステインの位
置ｙを示す。本発明による点突然変異はゴナドトロピン
の高次構造にはわずかな変化をもたらす。
突然変異誘発（関連部位の天然のアミノ酸残基のシステ
インへの点突然変異）を用いて導入することができる。
この点突然変異はＸ αｙ ＣｙｓまたはＸ βｙ Ｃ
ｙｓ（ここでＸは、αサブユニットまたはβサブユニッ
トの関連部位ｙでシステインにそれぞれ変異させたアミ
ノ酸残基である）の形で示す（アミノ酸には３文字コー
ドを用いる）。Ｃｙｓαｙ ＣｙｓまたはＣｙｓ βｙ
Ｃｙｓとの表記は天然サブユニットのシステインの位
置ｙを示す。本発明による点突然変異はゴナドトロピン
の高次構造にはわずかな変化をもたらす。
【００１２】本発明の範囲は１つのみの変異が導入され
たゴナドトロピンの態様も包含する。そのような変異を
αまたはβサブユニットをコードするＤＮＡに導入し
て、すでに存在するシステイン残基とジスルフィド架橋
を形成することができる新しいシステイン残基を得るこ
とができる。そのような変異は好ましくはαサブユニッ
ト、さらに好ましくはアミノ酸位置８８〜９２に導入さ
れる。
たゴナドトロピンの態様も包含する。そのような変異を
αまたはβサブユニットをコードするＤＮＡに導入し
て、すでに存在するシステイン残基とジスルフィド架橋
を形成することができる新しいシステイン残基を得るこ
とができる。そのような変異は好ましくはαサブユニッ
ト、さらに好ましくはアミノ酸位置８８〜９２に導入さ
れる。
【００１３】本発明による非天然のジスルフィド架橋
は、異なるサブユニットに配置されている一対のアミノ
酸残基間（サブユニット間）に存在することができる。
さらに、非天然ジスルフィド架橋は、両アミノ酸残基が
同じサブユニットに配置されている一対のアミノ酸残基
間（サブユニット内）に存在することもできる。任意
に、本発明による１つ以上の非天然ジスルフィド架橋の
存在の結果として、１１個の天然のジスルフィド架橋の
うち１つ以上を欠落させてもよい。
は、異なるサブユニットに配置されている一対のアミノ
酸残基間（サブユニット間）に存在することができる。
さらに、非天然ジスルフィド架橋は、両アミノ酸残基が
同じサブユニットに配置されている一対のアミノ酸残基
間（サブユニット内）に存在することもできる。任意
に、本発明による１つ以上の非天然ジスルフィド架橋の
存在の結果として、１１個の天然のジスルフィド架橋の
うち１つ以上を欠落させてもよい。
【００１４】本発明による非天然ジスルフィド架橋はダ
イマーの解離を妨げて、天然のゴナドトロピンに比べて
高度なインビトロおよびインビボ生物活性と向上した保
存期間とをもたらす。さらに、それらはゴナドトロピン
のポリペプチド骨格の柔軟性を減じることで、これらの
ゴナドトロピンは脱アミド化が受けにくくなっている。
脱アミド化はその純度とタンパク質の安定性にマイナス
の影響を与え、かつ生理学的条件下で起こる自発的なプ
ロセスである。
イマーの解離を妨げて、天然のゴナドトロピンに比べて
高度なインビトロおよびインビボ生物活性と向上した保
存期間とをもたらす。さらに、それらはゴナドトロピン
のポリペプチド骨格の柔軟性を減じることで、これらの
ゴナドトロピンは脱アミド化が受けにくくなっている。
脱アミド化はその純度とタンパク質の安定性にマイナス
の影響を与え、かつ生理学的条件下で起こる自発的なプ
ロセスである。
【００１５】サブユニット間かサブユニット内に非天然
のジスルフィド架橋の組合せが存在するゴナドトロピン
も本発明の範囲内にある。
のジスルフィド架橋の組合せが存在するゴナドトロピン
も本発明の範囲内にある。
【００１６】αサブユニットがヒト由来である本発明の
適当なゴナドトロピンは、（Ｐｈｅα１８ Ｃｙｓ−Ｉ
ｌｅ α２５ Ｃｙｓ）、（Ｇｌｎ α２０ Ｃｙｓ−
Ａｌａ α２３ Ｃｙｓ）、（Ｓｅｒ α３４ Ｃｙｓ
−Ｓｅｒ α５７ Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ α３９ Ｃｙ
ｓ−Ｔｈｒ α５４ Ｃｙｓ）、（Ａｌａ α６２Ｃｙ
ｓ−Ｈｉｓ α７９ Ｃｙｓ）、および（Ｌｙｓ α６
３ Ｃｙｓ−Ａｌａ α８１ Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ α
６５ Ｃｙｓ−Ｈｉｓ α７９ Ｃｙｓ）、および（Ａ
ｓｎ α６６ Ｃｙｓ−Ａｓｎ α７８ Ｃｙｓ）の１
つ以上のアミノ酸対間にサブユニット内非天然ジスルフ
ィド架橋を含む。
適当なゴナドトロピンは、（Ｐｈｅα１８ Ｃｙｓ−Ｉ
ｌｅ α２５ Ｃｙｓ）、（Ｇｌｎ α２０ Ｃｙｓ−
Ａｌａ α２３ Ｃｙｓ）、（Ｓｅｒ α３４ Ｃｙｓ
−Ｓｅｒ α５７ Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ α３９ Ｃｙ
ｓ−Ｔｈｒ α５４ Ｃｙｓ）、（Ａｌａ α６２Ｃｙ
ｓ−Ｈｉｓ α７９ Ｃｙｓ）、および（Ｌｙｓ α６
３ Ｃｙｓ−Ａｌａ α８１ Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ α
６５ Ｃｙｓ−Ｈｉｓ α７９ Ｃｙｓ）、および（Ａ
ｓｎ α６６ Ｃｙｓ−Ａｓｎ α７８ Ｃｙｓ）の１
つ以上のアミノ酸対間にサブユニット内非天然ジスルフ
ィド架橋を含む。
【００１７】βサブユニットがｈＣＧのβサブユニット
である本発明の適当なゴナドトロピンは、（Ｇｌｎ α
５ Ｃｙｓ−Ａｒｇ β８ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ α２
４Ｃｙｓ−Ｇｌｙ β７１ Ｃｙｓ）、（Ｍｅｔ α２
９ Ｃｙｓ−Ｍｅｔ β４１ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ α
３５ Ｃｙｓ−Ａｌａ β３５ Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ
α３７ Ｃｙｓ−Ｉｌｅ β３３ Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ
α５１ Ｃｙｓ−Ａｓｐ β９９ Ｃｙｓ）および
（Ｈｉｓ α９０ Ｃｙｓ−Ｃｙｓ βｙ Ｃｙｓ）の
１つ以上のアミノ酸対間にサブユニット間ジスルフィド
架橋、および／または、（Ｐｒｏ β４ Ｃｙｓ−Ｐｒ
ｏ β７ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ β１１Ｃｙｓ−Ｔｈｒ
β３２ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ β１１ Ｃｙｓ−Ａｌ
ａ β８５ Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ β３２ Ｃｙｓ−Ａ
ｌａ β８５ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ β６０ Ｃｙｓ−
Ｓｅｒ β８７ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ β６０ Ｃｙｓ
−Ｇｌｎ β８９ Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ β６１ Ｃｙ
ｓ−Ｌｅｕ β８６ Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ β６１ Ｃ
ｙｓ−Ｓｅｒ β８７ Ｃｙｓ）、（Ｓｅｒ β６６
Ｃｙｓ−Ｓｅｒ β８１ Ｃｙｓ）および（Ｌｅｕ β
６９ Ｃｙｓ−Ｐｒｏ β７８ Ｃｙｓ）の１つ以上の
アミノ酸対間にサブユニット内ジスルフィド架橋を含む
ことができる。好ましくは、本発明によるｈＣＧは、
（Ｍｅｔ α２９ Ｃｙｓ−Ｍｅｔ β４１ Ｃｙ
ｓ）、（Ｔｙｒ α３７ Ｃｙｓ−Ｉｌｅβ３３ Ｃｙ
ｓ）、または（Ｌｙｓ α５１ Ｃｙｓ−Ａｓｐ β９
９ Ｃｙｓ）または（Ｈｉｓ α９０ Ｃｙｓ−Ｃｙｓ
βｙ Ｃｙｓ）のアミノ酸対間にサブユニット間非天
然ジスルフィド架橋を含むことができる。
である本発明の適当なゴナドトロピンは、（Ｇｌｎ α
５ Ｃｙｓ−Ａｒｇ β８ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ α２
４Ｃｙｓ−Ｇｌｙ β７１ Ｃｙｓ）、（Ｍｅｔ α２
９ Ｃｙｓ−Ｍｅｔ β４１ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ α
３５ Ｃｙｓ−Ａｌａ β３５ Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ
α３７ Ｃｙｓ−Ｉｌｅ β３３ Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ
α５１ Ｃｙｓ−Ａｓｐ β９９ Ｃｙｓ）および
（Ｈｉｓ α９０ Ｃｙｓ−Ｃｙｓ βｙ Ｃｙｓ）の
１つ以上のアミノ酸対間にサブユニット間ジスルフィド
架橋、および／または、（Ｐｒｏ β４ Ｃｙｓ−Ｐｒ
ｏ β７ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ β１１Ｃｙｓ−Ｔｈｒ
β３２ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ β１１ Ｃｙｓ−Ａｌ
ａ β８５ Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ β３２ Ｃｙｓ−Ａ
ｌａ β８５ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ β６０ Ｃｙｓ−
Ｓｅｒ β８７ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ β６０ Ｃｙｓ
−Ｇｌｎ β８９ Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ β６１ Ｃｙ
ｓ−Ｌｅｕ β８６ Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ β６１ Ｃ
ｙｓ−Ｓｅｒ β８７ Ｃｙｓ）、（Ｓｅｒ β６６
Ｃｙｓ−Ｓｅｒ β８１ Ｃｙｓ）および（Ｌｅｕ β
６９ Ｃｙｓ−Ｐｒｏ β７８ Ｃｙｓ）の１つ以上の
アミノ酸対間にサブユニット内ジスルフィド架橋を含む
ことができる。好ましくは、本発明によるｈＣＧは、
（Ｍｅｔ α２９ Ｃｙｓ−Ｍｅｔ β４１ Ｃｙ
ｓ）、（Ｔｙｒ α３７ Ｃｙｓ−Ｉｌｅβ３３ Ｃｙ
ｓ）、または（Ｌｙｓ α５１ Ｃｙｓ−Ａｓｐ β９
９ Ｃｙｓ）または（Ｈｉｓ α９０ Ｃｙｓ−Ｃｙｓ
βｙ Ｃｙｓ）のアミノ酸対間にサブユニット間非天
然ジスルフィド架橋を含むことができる。
【００１８】βサブユニットがｈＬＨのβサブユニット
である本発明の適当なゴナドトロピンは、（Ｇｌｎ α
５ Ｃｙｓ−Ｔｒｐ β８ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ α２
４Ｃｙｓ−Ｇｌｙ β７１ Ｃｙｓ）、（Ｍｅｔ α２
９ Ｃｙｓ−Ｍｅｔ β４１ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ α
３５ Ｃｙｓ−Ａｌａ β３５ Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ
α３７ Ｃｙｓ−Ｉｌｅ β３３ Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ
α５１ Ｃｙｓ−Ａｓｐ β９９ Ｃｙｓ）および
（Ｈｉｓ α９０ Ｃｙｓ−Ｃｙｓ βｙ Ｃｙｓ）の
１つ以上のアミノ酸対間にサブユニット間ジスルフィド
架橋、および／または、（Ｐｒｏ β４ Ｃｙｓ−Ｐｒ
ｏ β７ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ β１１Ｃｙｓ−Ｔｈｒ
β３２ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ β１１ Ｃｙｓ−Ａｌ
ａ β８５ Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ β３２ Ｃｙｓ−Ａ
ｌａ β８５ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ β６０ Ｃｙｓ−
Ｓｅｒ β８７ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ β６０ Ｃｙｓ
−Ａｒｇ β８９ Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ β６１ Ｃｙ
ｓ−Ｌｅｕ β８６ Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ β６１ Ｃ
ｙｓ−Ｓｅｒ β８７ Ｃｙｓ）、（Ｓｅｒ β６６
Ｃｙｓ−Ｓｅｒ β８１ Ｃｙｓ）および（Ｌｅｕ β
６９ Ｃｙｓ−Ｐｒｏ β７８ Ｃｙｓ）の１つ以上の
アミノ酸対間にサブユニット間ジスルフィド架橋を含
む。本発明の好ましいゴナドトロピンは、（Ｍｅｔ α
２９ Ｃｙｓ−Ｍｅｔ β４１ Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ
α３７ Ｃｙｓ−Ｉｌｅ β３３ Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ
α５１ Ｃｙｓ−Ａｓｐ β９９ Ｃｙｓ）または
（Ｈｉｓα９０ Ｃｙｓ−Ｃｙｓ βｙ Ｃｙｓ）のア
ミノ酸対間にジスルフィド架橋を含むｈＬＨである。
である本発明の適当なゴナドトロピンは、（Ｇｌｎ α
５ Ｃｙｓ−Ｔｒｐ β８ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ α２
４Ｃｙｓ−Ｇｌｙ β７１ Ｃｙｓ）、（Ｍｅｔ α２
９ Ｃｙｓ−Ｍｅｔ β４１ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ α
３５ Ｃｙｓ−Ａｌａ β３５ Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ
α３７ Ｃｙｓ−Ｉｌｅ β３３ Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ
α５１ Ｃｙｓ−Ａｓｐ β９９ Ｃｙｓ）および
（Ｈｉｓ α９０ Ｃｙｓ−Ｃｙｓ βｙ Ｃｙｓ）の
１つ以上のアミノ酸対間にサブユニット間ジスルフィド
架橋、および／または、（Ｐｒｏ β４ Ｃｙｓ−Ｐｒ
ｏ β７ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ β１１Ｃｙｓ−Ｔｈｒ
β３２ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ β１１ Ｃｙｓ−Ａｌ
ａ β８５ Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ β３２ Ｃｙｓ−Ａ
ｌａ β８５ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ β６０ Ｃｙｓ−
Ｓｅｒ β８７ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ β６０ Ｃｙｓ
−Ａｒｇ β８９ Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ β６１ Ｃｙ
ｓ−Ｌｅｕ β８６ Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ β６１ Ｃ
ｙｓ−Ｓｅｒ β８７ Ｃｙｓ）、（Ｓｅｒ β６６
Ｃｙｓ−Ｓｅｒ β８１ Ｃｙｓ）および（Ｌｅｕ β
６９ Ｃｙｓ−Ｐｒｏ β７８ Ｃｙｓ）の１つ以上の
アミノ酸対間にサブユニット間ジスルフィド架橋を含
む。本発明の好ましいゴナドトロピンは、（Ｍｅｔ α
２９ Ｃｙｓ−Ｍｅｔ β４１ Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ
α３７ Ｃｙｓ−Ｉｌｅ β３３ Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ
α５１ Ｃｙｓ−Ａｓｐ β９９ Ｃｙｓ）または
（Ｈｉｓα９０ Ｃｙｓ−Ｃｙｓ βｙ Ｃｙｓ）のア
ミノ酸対間にジスルフィド架橋を含むｈＬＨである。
【００１９】βサブユニットがｈＦＳＨのβサブユニッ
トである本発明の適当なゴナドトロピンは、（Ｇｌｎ
α５ Ｃｙｓ−Ｓｅｒ β２ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ α
２４Ｃｙｓ−Ｇｌｙ β６５ Ｃｙｓ）、（Ｍｅｔ α
２９ Ｃｙｓ−Ａｒｇ β３５ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ
α３５ Ｃｙｓ−Ａｌａ β２９ Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ
α３７ Ｃｙｓ−Ｔｒｐ β２７ Ｃｙｓ）、（Ｌｙ
ｓ α５１ Ｃｙｓ−Ａｓｐ β９３ Ｃｙｓ）および
（Ｈｉｓ α９０ Ｃｙｓ−Ｃｙｓ βｙＣｙｓ）の１
つ以上のアミノ酸対間にサブユニット間ジスルフィド架
橋、および／または、（Ｌｅｕ β５ Ｃｙｓ−Ｔｈｒ
β２６ Ｃｙｓ）、（Ｌｅｕ β５ Ｃｙｓ−Ａｌａ
β７９ Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ β２６ Ｃｙｓ−Ａｌ
ａβ７９ Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ β５４ Ｃｙｓ−Ｇｌ
ｎ β８１ Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ β５４ Ｃｙｓ−Ｈ
ｉｓ β８３ Ｃｙｓ）、（Ｇｌｕ β５５ Ｃｙｓ−
Ｔｈｒ β８０ Ｃｙｓ）、（Ｇｌｕ β５５ Ｃｙｓ
−Ｇｌｎ β８１Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ β６０ Ｃｙｓ
−Ｔｈｒ β７５ Ｃｙｓ）および（Ｖａｌ β６３
Ｃｙｓ−Ｓｅｒ β７２ Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ
酸対間にサブユニット内ジスルフィド架橋を含む。本発
明の好ましいゴナドトロピンは、βサブユニットが（Ｔ
ｙｒ α３７ Ｃｙｓ−Ｔｒｐ β２７ Ｃｙｓ）また
は（Ｈｉｓ α９０ Ｃｙｓ−Ｃｙｓ βｙ Ｃｙｓ）
のアミノ酸対間にサブユニット間ジスルフィド架橋を含
むｈＦＳＨである。
トである本発明の適当なゴナドトロピンは、（Ｇｌｎ
α５ Ｃｙｓ−Ｓｅｒ β２ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ α
２４Ｃｙｓ−Ｇｌｙ β６５ Ｃｙｓ）、（Ｍｅｔ α
２９ Ｃｙｓ−Ａｒｇ β３５ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ
α３５ Ｃｙｓ−Ａｌａ β２９ Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ
α３７ Ｃｙｓ−Ｔｒｐ β２７ Ｃｙｓ）、（Ｌｙ
ｓ α５１ Ｃｙｓ−Ａｓｐ β９３ Ｃｙｓ）および
（Ｈｉｓ α９０ Ｃｙｓ−Ｃｙｓ βｙＣｙｓ）の１
つ以上のアミノ酸対間にサブユニット間ジスルフィド架
橋、および／または、（Ｌｅｕ β５ Ｃｙｓ−Ｔｈｒ
β２６ Ｃｙｓ）、（Ｌｅｕ β５ Ｃｙｓ−Ａｌａ
β７９ Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ β２６ Ｃｙｓ−Ａｌ
ａβ７９ Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ β５４ Ｃｙｓ−Ｇｌ
ｎ β８１ Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ β５４ Ｃｙｓ−Ｈ
ｉｓ β８３ Ｃｙｓ）、（Ｇｌｕ β５５ Ｃｙｓ−
Ｔｈｒ β８０ Ｃｙｓ）、（Ｇｌｕ β５５ Ｃｙｓ
−Ｇｌｎ β８１Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ β６０ Ｃｙｓ
−Ｔｈｒ β７５ Ｃｙｓ）および（Ｖａｌ β６３
Ｃｙｓ−Ｓｅｒ β７２ Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ
酸対間にサブユニット内ジスルフィド架橋を含む。本発
明の好ましいゴナドトロピンは、βサブユニットが（Ｔ
ｙｒ α３７ Ｃｙｓ−Ｔｒｐ β２７ Ｃｙｓ）また
は（Ｈｉｓ α９０ Ｃｙｓ−Ｃｙｓ βｙ Ｃｙｓ）
のアミノ酸対間にサブユニット間ジスルフィド架橋を含
むｈＦＳＨである。
【００２０】βサブユニットがｈＴＳＨのβサブユニッ
トである本発明の適当なゴナドトロピンは、（Ｇｌｎ
α５ Ｃｙｓ−Ｐｈｅ β１ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ α
２４Ｃｙｓ−Ｇｌｙ β６６ Ｃｙｓ）、（Ｍｅｔ α
２９ Ｃｙｓ−Ａｒｇ β３４ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ
α３５ Ｃｙｓ−Ａｌａ β２８ Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ
α３７ Ｃｙｓ−Ｉｌｅ β２６ Ｃｙｓ）、（Ｌｙ
ｓ α５１ Ｃｙｓ−Ａｓｐ β９４ Ｃｙｓ）および
（Ｈｉｓ α９０ Ｃｙｓ−Ｃｙｓ βｙＣｙｓ）の１
つ以上のアミノ酸対間にサブユニット間ジスルフィド架
橋、および／または、（Ｐｒｏ β４ Ｃｙｓ−Ｔｈｒ
β２５ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ β４ Ｃｙｓ−Ａｌａ
β８０ Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ β２５ Ｃｙｓ−Ａｌ
ａβ８０ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ β５５ Ｃｙｓ−Ｓｅ
ｒ β８２ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ β５５ Ｃｙｓ−Ｌ
ｙｓ β８４ Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ β５６ Ｃｙｓ−
Ｌｅｕ β８１ Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ β５６ Ｃｙｓ
−Ｓｅｒ β８２Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ β６１ Ｃｙｓ
−Ｓｅｒ β７６ Ｃｙｓ）および（Ｉｌｅ β６４
Ｃｙｓ−Ｐｒｏ β７３ Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ
酸対間にサブユニット内ジスルフィド架橋を含む。
トである本発明の適当なゴナドトロピンは、（Ｇｌｎ
α５ Ｃｙｓ−Ｐｈｅ β１ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ α
２４Ｃｙｓ−Ｇｌｙ β６６ Ｃｙｓ）、（Ｍｅｔ α
２９ Ｃｙｓ−Ａｒｇ β３４ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ
α３５ Ｃｙｓ−Ａｌａ β２８ Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ
α３７ Ｃｙｓ−Ｉｌｅ β２６ Ｃｙｓ）、（Ｌｙ
ｓ α５１ Ｃｙｓ−Ａｓｐ β９４ Ｃｙｓ）および
（Ｈｉｓ α９０ Ｃｙｓ−Ｃｙｓ βｙＣｙｓ）の１
つ以上のアミノ酸対間にサブユニット間ジスルフィド架
橋、および／または、（Ｐｒｏ β４ Ｃｙｓ−Ｔｈｒ
β２５ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ β４ Ｃｙｓ−Ａｌａ
β８０ Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ β２５ Ｃｙｓ−Ａｌ
ａβ８０ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ β５５ Ｃｙｓ−Ｓｅ
ｒ β８２ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ β５５ Ｃｙｓ−Ｌ
ｙｓ β８４ Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ β５６ Ｃｙｓ−
Ｌｅｕ β８１ Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ β５６ Ｃｙｓ
−Ｓｅｒ β８２Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ β６１ Ｃｙｓ
−Ｓｅｒ β７６ Ｃｙｓ）および（Ｉｌｅ β６４
Ｃｙｓ−Ｐｒｏ β７３ Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ
酸対間にサブユニット内ジスルフィド架橋を含む。
【００２１】サブユニット間およびサブユニット内の非
天然ジスルフィド架橋の組合せも本発明の範囲に包含さ
れることが明らかであろう。
天然ジスルフィド架橋の組合せも本発明の範囲に包含さ
れることが明らかであろう。
【００２２】上記の変異の位置はヒトゴナドトロピンの
アミノ酸配列に関連する。他の種からのゴナドトロピン
のサブユニット内の類似の非天然ジスルフィド架橋も本
発明の範囲内にある。システインに変異させるアミノ酸
残基の正確な位置は該ゴナドトロピンのサブユニットの
配列とヒトゴナドトロピンサブユニットの配列とを並べ
合わせることから導くことができる。
アミノ酸配列に関連する。他の種からのゴナドトロピン
のサブユニット内の類似の非天然ジスルフィド架橋も本
発明の範囲内にある。システインに変異させるアミノ酸
残基の正確な位置は該ゴナドトロピンのサブユニットの
配列とヒトゴナドトロピンサブユニットの配列とを並べ
合わせることから導くことができる。
【００２３】ジスルフィド結合がサブユニットの折たた
みと組み立て中に果たす主要な役割のために、本発明に
よる非天然ジスルフィド架橋の導入が適正に折り畳まれ
たゴナドトロピンの形成を妨害しないということは非常
に驚くべきことである。適当なジスルフィド結合の形成
は機能的ゴナドトロピンの折たたみと成熟化にとって重
要な事象である。特に、βサブユニットでのジスルフィ
ド結合の形成は重要であり、すべてのジスルフィド結合
が効率的な組合せと折たたみのために必要とされる。ｈ
ＣＧの折たたみの詳細な研究により、該分子の折たたみ
が単純な連続的な経路により進むのではなく、分子の異
なるドメインで独立して進むことが明らかとなった。し
たがって、αサブユニットおよび／またはβサブユニッ
トにさらにシステイン残基を導入することは折たたみの
プロセスを乱して分子の立体構造を壊し、その結果とし
て分子の機能性と生物活性を損じると考えられた。これ
は、特に、非常に多くのシステインが既にこれらの分子
に存在しているからである。
みと組み立て中に果たす主要な役割のために、本発明に
よる非天然ジスルフィド架橋の導入が適正に折り畳まれ
たゴナドトロピンの形成を妨害しないということは非常
に驚くべきことである。適当なジスルフィド結合の形成
は機能的ゴナドトロピンの折たたみと成熟化にとって重
要な事象である。特に、βサブユニットでのジスルフィ
ド結合の形成は重要であり、すべてのジスルフィド結合
が効率的な組合せと折たたみのために必要とされる。ｈ
ＣＧの折たたみの詳細な研究により、該分子の折たたみ
が単純な連続的な経路により進むのではなく、分子の異
なるドメインで独立して進むことが明らかとなった。し
たがって、αサブユニットおよび／またはβサブユニッ
トにさらにシステイン残基を導入することは折たたみの
プロセスを乱して分子の立体構造を壊し、その結果とし
て分子の機能性と生物活性を損じると考えられた。これ
は、特に、非常に多くのシステインが既にこれらの分子
に存在しているからである。
【００２４】本発明によりシステインとする点突然変異
は全体的なアミノ酸組成とタンパク質特性をわずかに変
えるだけなので、本発明のゴナドトロピンはそれらの潜
在的な免疫原性が野性型ゴナドトロピンの免疫原性とは
実質的に異ならない利点をさらに有している。特に、非
天然ジスルフィド架橋がゴナドトロピンのダイマー界面
に置かれたときに、その免疫原性に及ぼす影響は無視す
ることができよう。
は全体的なアミノ酸組成とタンパク質特性をわずかに変
えるだけなので、本発明のゴナドトロピンはそれらの潜
在的な免疫原性が野性型ゴナドトロピンの免疫原性とは
実質的に異ならない利点をさらに有している。特に、非
天然ジスルフィド架橋がゴナドトロピンのダイマー界面
に置かれたときに、その免疫原性に及ぼす影響は無視す
ることができよう。
【００２５】本発明のゴナドトロピンはその変異部位に
よってアゴニストまたはアンタゴニストとなることがで
きる。既に示したように、変異部位は分子の高次構造に
わずかな変化を導くであろう。変異部位として、レセプ
ター結合および／またはシグナル形質導入に関連したタ
ンパク質部分を選択した場合、本発明の非天然ジスルフ
ィド架橋は、糖タンパク質の向上した安定性とともにシ
グナル形質導入活性の部分的または完全な損失をもたら
すであろう。したがって、本発明は向上した安定性を有
するアンタゴニストを提供する。変異部位として糖タン
パク質の内部核のダイマー界面を選択する場合、得られ
る非天然ジスルフィド架橋はレセプター結合および／ま
たはシグナル形質導入活性に影響を与えないが、天然の
ゴナドトロピンと比較して向上した安定性をもたらすで
あろう。そのような変異の結果、向上した安定性を有す
るゴナドトロピンアゴニストが得られる。
よってアゴニストまたはアンタゴニストとなることがで
きる。既に示したように、変異部位は分子の高次構造に
わずかな変化を導くであろう。変異部位として、レセプ
ター結合および／またはシグナル形質導入に関連したタ
ンパク質部分を選択した場合、本発明の非天然ジスルフ
ィド架橋は、糖タンパク質の向上した安定性とともにシ
グナル形質導入活性の部分的または完全な損失をもたら
すであろう。したがって、本発明は向上した安定性を有
するアンタゴニストを提供する。変異部位として糖タン
パク質の内部核のダイマー界面を選択する場合、得られ
る非天然ジスルフィド架橋はレセプター結合および／ま
たはシグナル形質導入活性に影響を与えないが、天然の
ゴナドトロピンと比較して向上した安定性をもたらすで
あろう。そのような変異の結果、向上した安定性を有す
るゴナドトロピンアゴニストが得られる。
【００２６】本発明のゴナドトロピンは本分野で通常知
られている他の改変を有してもよい。
られている他の改変を有してもよい。
【００２７】本発明のゴナドトロピンの一つのそうした
好ましい改変において、サブユニットの一つのアミノ酸
配列のＣ末端は、任意にリンカー部分を介して、他のサ
ブユニットのアミノ酸配列のＮ末端に結合させる。この
リンカー部分は好ましくは部分的または完全なＣＴＰ単
位またはその変異体である。
好ましい改変において、サブユニットの一つのアミノ酸
配列のＣ末端は、任意にリンカー部分を介して、他のサ
ブユニットのアミノ酸配列のＮ末端に結合させる。この
リンカー部分は好ましくは部分的または完全なＣＴＰ単
位またはその変異体である。
【００２８】本発明のゴナドトロピンの別の改変は、α
サブユニットおよび／またはβサブユニットをそれらの
対応するＮまたはＣ末端で部分的もしくは完全なＣＴＰ
単位またはその変異体を用いて伸長させてもよい。この
伸長は各ＣＴＰ単位を単一または複数の形で有してもよ
い。あるいは、完全なＣＴＰ単位または部分ＣＴＰ単位
またはその複数の形のものを該サブユニットのＮまたは
Ｃ末端に挿入することができる。
サブユニットおよび／またはβサブユニットをそれらの
対応するＮまたはＣ末端で部分的もしくは完全なＣＴＰ
単位またはその変異体を用いて伸長させてもよい。この
伸長は各ＣＴＰ単位を単一または複数の形で有してもよ
い。あるいは、完全なＣＴＰ単位または部分ＣＴＰ単位
またはその複数の形のものを該サブユニットのＮまたは
Ｃ末端に挿入することができる。
【００２９】さらに、本発明のゴナドトロピンは、グリ
コシル化、部分グリコシル化または非グリコシル化のい
ずれかを受けていてもよい。本発明の部分グリコシル化
または非グリコシル化ゴナドトロピンは、化学的改変、
酵素的改変または部位特異的突然変異誘発のいずれかに
よって得ることができ、それによってゴナドトロピンの
１つ以上のグリコシル化認識部位が除去される。あるい
は、本発明のゴナドトロピンのグリコシル化パターンは
さらに別のグリコシル化認識部位を導入し、任意に１つ
以上のグリコシル化認識部位を除去することにより改変
して、該ゴナドトロピンを改変グリコシル化することが
できる。本明細書で用いられるグリコシル化認識部位は
アミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここでＸは
いずれのアミノ酸でもよい）からなる。
コシル化、部分グリコシル化または非グリコシル化のい
ずれかを受けていてもよい。本発明の部分グリコシル化
または非グリコシル化ゴナドトロピンは、化学的改変、
酵素的改変または部位特異的突然変異誘発のいずれかに
よって得ることができ、それによってゴナドトロピンの
１つ以上のグリコシル化認識部位が除去される。あるい
は、本発明のゴナドトロピンのグリコシル化パターンは
さらに別のグリコシル化認識部位を導入し、任意に１つ
以上のグリコシル化認識部位を除去することにより改変
して、該ゴナドトロピンを改変グリコシル化することが
できる。本明細書で用いられるグリコシル化認識部位は
アミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここでＸは
いずれのアミノ酸でもよい）からなる。
【００３０】本明細書で用いるＣＧ、ＦＳＨ、ＬＨとＴ
ＳＨのαサブユニットとβサブユニット並びにそれらの
ヘテロダイマー形は、一般的にそれらの慣用の定義を有
し、示されるグリコシル化パターンとは関係なく、それ
自体公知のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその
対立遺伝子変異体を意味する。
ＳＨのαサブユニットとβサブユニット並びにそれらの
ヘテロダイマー形は、一般的にそれらの慣用の定義を有
し、示されるグリコシル化パターンとは関係なく、それ
自体公知のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその
対立遺伝子変異体を意味する。
【００３１】これらタンパク質の「天然」形は、その関
連する脊椎動物組織から単離されたアミノ酸配列を有
し、これらの公知の配列それ自体またはそれらの対立遺
伝子変異体を有しているタンパク質である。
連する脊椎動物組織から単離されたアミノ酸配列を有
し、これらの公知の配列それ自体またはそれらの対立遺
伝子変異体を有しているタンパク質である。
【００３２】これらの「変異体」は天然のタンパク質と
比較してアミノ酸配列に計画的な変更を有するタンパク
質である。これらの変更には単一もしくは複数の欠失、
挿入、置換およびそれらの組合せが挙げられ、例えば部
位特異的突然変異誘発または他の組換え操作により作る
ことができ、または合成により調製することができる。
これらの変更は保存アミノ酸置換からなり、置換される
残基は置換が行なわれるものと同じ一般的なアミノ酸の
カテゴリーを有する。そのようなアミノ酸の分類は本分
野では一般的に知られており、例えばＤａｙｈｏｆｆ，
Ｍ．らａ（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， １９
７２， ５， ８９−９９）による記載がある。
比較してアミノ酸配列に計画的な変更を有するタンパク
質である。これらの変更には単一もしくは複数の欠失、
挿入、置換およびそれらの組合せが挙げられ、例えば部
位特異的突然変異誘発または他の組換え操作により作る
ことができ、または合成により調製することができる。
これらの変更は保存アミノ酸置換からなり、置換される
残基は置換が行なわれるものと同じ一般的なアミノ酸の
カテゴリーを有する。そのようなアミノ酸の分類は本分
野では一般的に知られており、例えばＤａｙｈｏｆｆ，
Ｍ．らａ（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， １９
７２， ５， ８９−９９）による記載がある。
【００３３】本明細書で用いる「ＣＴＰ単位」とは、Ｃ
末端の残基のアミノ酸１１２〜１１８から１４５または
その部分まで伸びている、ｈＣＧβサブユニットのカル
ボキシル末端に見られるアミノ酸配列をいう。「完全」
ＣＴＰ単位は、ＣＴＰのＮ末端に応じて２８〜３４アミ
ノ酸を含む。「部分」ＣＴＰ単位は１１２位〜１１８位
から１４５位までを含めた位置に存在するアミノ酸配列
であるが、該配列は少なくとも一つのアミノ酸を、考え
られる最も短い「完全」ＣＴＰ単位（アミノ酸１１８〜
１４５）から欠失させてもよい。「複数（ｍｕｌｔｉｐ
ｌｅ）」ＣＴＰ単位は完全ＣＴＰ単位または部分ＣＴＰ
単位のタンデム型配列または両者の組合せを包含するも
のと理解される。
末端の残基のアミノ酸１１２〜１１８から１４５または
その部分まで伸びている、ｈＣＧβサブユニットのカル
ボキシル末端に見られるアミノ酸配列をいう。「完全」
ＣＴＰ単位は、ＣＴＰのＮ末端に応じて２８〜３４アミ
ノ酸を含む。「部分」ＣＴＰ単位は１１２位〜１１８位
から１４５位までを含めた位置に存在するアミノ酸配列
であるが、該配列は少なくとも一つのアミノ酸を、考え
られる最も短い「完全」ＣＴＰ単位（アミノ酸１１８〜
１４５）から欠失させてもよい。「複数（ｍｕｌｔｉｐ
ｌｅ）」ＣＴＰ単位は完全ＣＴＰ単位または部分ＣＴＰ
単位のタンデム型配列または両者の組合せを包含するも
のと理解される。
【００３４】本発明のいずれかのゴナドトロピンをコー
ドするＤＮＡも本発明の範囲にある。本発明の該ＤＮＡ
は、置換されるアミノ酸をコードするコドンに代えて置
換された１つ以上のシステインをコードするコドンから
なる。本発明のＤＮＡは、システインをコードするコド
ンにより置換されるアミノ酸残基をコードする１つ以上
のコドンを該ＤＮＡ中で置換することにより、天然のゴ
ナドトロピンまたはその変異体をコードするＤＮＡから
得ることができる。これらの置換は部位特異的突然変異
誘発により実施することができる。
ドするＤＮＡも本発明の範囲にある。本発明の該ＤＮＡ
は、置換されるアミノ酸をコードするコドンに代えて置
換された１つ以上のシステインをコードするコドンから
なる。本発明のＤＮＡは、システインをコードするコド
ンにより置換されるアミノ酸残基をコードする１つ以上
のコドンを該ＤＮＡ中で置換することにより、天然のゴ
ナドトロピンまたはその変異体をコードするＤＮＡから
得ることができる。これらの置換は部位特異的突然変異
誘発により実施することができる。
【００３５】本発明のゴナドトロピンを構築する方法は
本分野でよく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、最新版）。
最も実用的なアプローチは所望のタンパク質をコードす
るＤＮＡの発現によってこれらのゴナドトロピンを生産
することである。部位特異的突然変異誘発技術、付加的
配列の連結、ＰＣＲおよび適当な発現系の構築は現在で
はすべてが本分野でよく知られている。所望のタンパク
質をコードするＤＮＡの（好ましくは連結の容易さから
制限部位を含む）一部またはすべてが標準的な固相技術
を用いる合成で構築することができる。含まれるコード
配列の転写と翻訳に適当な調節要素をＤＮＡのコード配
列に付与することができる。よく知られているように、
細菌等の原核生物宿主、および酵母、植物細胞、昆虫細
胞、哺乳類細胞、鳥類細胞等の真核生物宿主などの多様
な宿主に適合性のある発現系が利用できる。宿主の選択
は特に翻訳後の事象に依存し、そのうちでも特にグリコ
シル化に依存する。グリコシル化の位置はほとんどの場
合で分子内のグリコシル化部位の性質により調節されて
いる。しかし、この部位をしめている糖の性質は主に宿
主の性質により調節されている。
本分野でよく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、最新版）。
最も実用的なアプローチは所望のタンパク質をコードす
るＤＮＡの発現によってこれらのゴナドトロピンを生産
することである。部位特異的突然変異誘発技術、付加的
配列の連結、ＰＣＲおよび適当な発現系の構築は現在で
はすべてが本分野でよく知られている。所望のタンパク
質をコードするＤＮＡの（好ましくは連結の容易さから
制限部位を含む）一部またはすべてが標準的な固相技術
を用いる合成で構築することができる。含まれるコード
配列の転写と翻訳に適当な調節要素をＤＮＡのコード配
列に付与することができる。よく知られているように、
細菌等の原核生物宿主、および酵母、植物細胞、昆虫細
胞、哺乳類細胞、鳥類細胞等の真核生物宿主などの多様
な宿主に適合性のある発現系が利用できる。宿主の選択
は特に翻訳後の事象に依存し、そのうちでも特にグリコ
シル化に依存する。グリコシル化の位置はほとんどの場
合で分子内のグリコシル化部位の性質により調節されて
いる。しかし、この部位をしめている糖の性質は主に宿
主の性質により調節されている。
【００３６】本発明のゴナドトロピンは天然のゴナドト
ロピンと同じ臨床的目的のために用いられるが、向上し
た安定性を示すという利点がある。これらの変異ゴナド
トロピンは変異の種類によりアゴニストまたはアンタゴ
ニストとして用いることができる。本発明の適当な医薬
組成物は本発明の１種類以上のゴナドトロピンと医薬上
許容しうるキャリヤーを含む。
ロピンと同じ臨床的目的のために用いられるが、向上し
た安定性を示すという利点がある。これらの変異ゴナド
トロピンは変異の種類によりアゴニストまたはアンタゴ
ニストとして用いることができる。本発明の適当な医薬
組成物は本発明の１種類以上のゴナドトロピンと医薬上
許容しうるキャリヤーを含む。
【００３７】医薬上許容しうるキャリヤーは当業者によ
く知られており、例えば、滅菌食塩水、ラクトース、ス
クロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリ
ン、寒天、ペクチン、落花生油、オリーブ油、ゴマ油お
よび水が挙げられる。
く知られており、例えば、滅菌食塩水、ラクトース、ス
クロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリ
ン、寒天、ペクチン、落花生油、オリーブ油、ゴマ油お
よび水が挙げられる。
【００３８】さらに、本発明の医薬組成物は１種類以上
の安定剤、例えば、ソルビトール、マンニット、デンプ
ン、スクロースデキストリンおよびグルコースなどの炭
水化物、アルブミンまたはカゼインなどのタンパク質、
およびアルカリ性リン酸塩のような緩衝剤などの１種類
以上の安定剤を含有してもよい。
の安定剤、例えば、ソルビトール、マンニット、デンプ
ン、スクロースデキストリンおよびグルコースなどの炭
水化物、アルブミンまたはカゼインなどのタンパク質、
およびアルカリ性リン酸塩のような緩衝剤などの１種類
以上の安定剤を含有してもよい。
【００３９】適当な投与経路は、筋内注射、皮下注射、
静脈内注射または腹腔内注射、経口および鼻腔内投与で
ある。
静脈内注射または腹腔内注射、経口および鼻腔内投与で
ある。
【００４０】
【発明の実施の形態】以下の実施例は本発明を説明する
ものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈され
るべきものではない。
ものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈され
るべきものではない。
【００４１】
【実施例】実施例 １ インターチェインムテインの製造 ベクターの構築 付加的なインターチェイン（又は鎖間）ジスルフィド結
合を有するｈＣＧムテインを発現するために３つの構築
物を作った。そららの構造と全体的な構成は、ＣＨＯ細
胞中で組換え野性型ｈＣＧ発現のために用いられるベク
ターｐＫＭＳ．ｈＣＧαg βc と基本的には同一である
（図１）。各々のｈＣＧα（Ｆｉｄｄｅｓ， Ｊ．Ｃ．
とＧｏｏｄｍａｎ， Ｈ． Ｍ．（１９８１），Ｊ．
Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １， ３−１８）
およびβサブユニット遺伝子（Ｆｉｄｄｅｓ， Ｊ．
Ｃ．とＧｏｏｄｍｍａｎ， Ｈ． Ｍ．（１９８０）Ｎ
ａｔｕｒｅ ２８６， ６８４−６８７）をｐＫＭＳに
挿入した。ｃＤＮＡクローンをゲノムクローンと組み合
わせることで完全な「ハイブリッド」ｈＣＧα遺伝子を
調製し（Ｖａｎ Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋら１９９０）、こ
れを宿主細胞にトランスフェクションすると野性型αサ
ブユニットを発現することができる。ｈＣＧβのｃＤＮ
Ａは記載されたように単離し、ベクターｐＫＭＳ．ＦＳ
Ｈ中のＦＳＨβと交換した。α遺伝子の転写はＳＶ４０
初期プロモーターによって指令されるが、β遺伝子はヒ
ト重金属誘発性メタロチオネインＩＩａプロモーターの
指令により転写される。３つのｈＣＧインターチェイン
構築物が作られた（表１）。
合を有するｈＣＧムテインを発現するために３つの構築
物を作った。そららの構造と全体的な構成は、ＣＨＯ細
胞中で組換え野性型ｈＣＧ発現のために用いられるベク
ターｐＫＭＳ．ｈＣＧαg βc と基本的には同一である
（図１）。各々のｈＣＧα（Ｆｉｄｄｅｓ， Ｊ．Ｃ．
とＧｏｏｄｍａｎ， Ｈ． Ｍ．（１９８１），Ｊ．
Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １， ３−１８）
およびβサブユニット遺伝子（Ｆｉｄｄｅｓ， Ｊ．
Ｃ．とＧｏｏｄｍｍａｎ， Ｈ． Ｍ．（１９８０）Ｎ
ａｔｕｒｅ ２８６， ６８４−６８７）をｐＫＭＳに
挿入した。ｃＤＮＡクローンをゲノムクローンと組み合
わせることで完全な「ハイブリッド」ｈＣＧα遺伝子を
調製し（Ｖａｎ Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋら１９９０）、こ
れを宿主細胞にトランスフェクションすると野性型αサ
ブユニットを発現することができる。ｈＣＧβのｃＤＮ
Ａは記載されたように単離し、ベクターｐＫＭＳ．ＦＳ
Ｈ中のＦＳＨβと交換した。α遺伝子の転写はＳＶ４０
初期プロモーターによって指令されるが、β遺伝子はヒ
ト重金属誘発性メタロチオネインＩＩａプロモーターの
指令により転写される。３つのｈＣＧインターチェイン
構築物が作られた（表１）。
【００４２】ｈＣＧインターチェイン１中でαサブユニ
ット変異を作るために、チロシンα３７をコードするコ
ドンがシステインをコードするコドンと交換されるよう
に特定の塩基置換を「ハイブリッド」ｈＣＧα遺伝子に
導入した。これは標準的なＰＣＲ条件を用いて、部位特
異的突然変異誘発および記載の配列（Ｅｒｉｃｈ，Ｈ．
Ａ．（１９８９） ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；
Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ−Ｙｏ
ｒｋ， ｐｐ ６３−６６）と重なり合うＰＣＲ断片を
組み合わせることにより行なった。ＰＣＲ断片は分け
て、ｐＧＥＭ３Ｚにサブクローニングし、自動化シーケ
ンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてチェックした。
プライマーはサブクローニングされたＰＣＲ断片がｐＫ
ＭＳ．ｈＣＧαg βc の天然のα鎖配列と交換できるよ
うに３’と５’の両方で変異のための適当な制限部位を
持つように選択した。これは標準的な技術を用いて行な
った。ｈＣＧインターチェイン１でβサブユニット変異
を作るために、イソロイシンβ３３をコードするコドン
がシステインをコードするコドンに変更されるように特
定の塩基置換をｈＣＧβに導入した。変異ＰＣＲ反応、
サブクローニングおよび配列決定をαサブユニット変異
を作るために用いられたものと同等の方法を用いて行な
った。ｈＣＧインターチェイン１の最終発現プラスミド
の構築のために、ｈＣＧβｃ野性型遺伝子を、すでにα
サブユニット変異を有しているｐＫＭＳ．ｈＣＧαg β
c 構築物中の変異ｈＣＧβ断片と交換した。
ット変異を作るために、チロシンα３７をコードするコ
ドンがシステインをコードするコドンと交換されるよう
に特定の塩基置換を「ハイブリッド」ｈＣＧα遺伝子に
導入した。これは標準的なＰＣＲ条件を用いて、部位特
異的突然変異誘発および記載の配列（Ｅｒｉｃｈ，Ｈ．
Ａ．（１９８９） ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；
Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ−Ｙｏ
ｒｋ， ｐｐ ６３−６６）と重なり合うＰＣＲ断片を
組み合わせることにより行なった。ＰＣＲ断片は分け
て、ｐＧＥＭ３Ｚにサブクローニングし、自動化シーケ
ンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてチェックした。
プライマーはサブクローニングされたＰＣＲ断片がｐＫ
ＭＳ．ｈＣＧαg βc の天然のα鎖配列と交換できるよ
うに３’と５’の両方で変異のための適当な制限部位を
持つように選択した。これは標準的な技術を用いて行な
った。ｈＣＧインターチェイン１でβサブユニット変異
を作るために、イソロイシンβ３３をコードするコドン
がシステインをコードするコドンに変更されるように特
定の塩基置換をｈＣＧβに導入した。変異ＰＣＲ反応、
サブクローニングおよび配列決定をαサブユニット変異
を作るために用いられたものと同等の方法を用いて行な
った。ｈＣＧインターチェイン１の最終発現プラスミド
の構築のために、ｈＣＧβｃ野性型遺伝子を、すでにα
サブユニット変異を有しているｐＫＭＳ．ｈＣＧαg β
c 構築物中の変異ｈＣＧβ断片と交換した。
【００４３】（リジンα５１とアスパラギンβ９９をコ
ードするコドンがシステインをコードするコドンに置き
換えられた）ｈＣＧインターチェイン２をコードするベ
クターと（メチオニンα２９とメチオニンβ４１をコー
ドするコドンがシステインをコードするコドンに置き換
えられた）ｈＣＧインターチェイン３をコードするベク
ターの構築のために相応する方法に従った。
ードするコドンがシステインをコードするコドンに置き
換えられた）ｈＣＧインターチェイン２をコードするベ
クターと（メチオニンα２９とメチオニンβ４１をコー
ドするコドンがシステインをコードするコドンに置き換
えられた）ｈＣＧインターチェイン３をコードするベク
ターの構築のために相応する方法に従った。
【００４４】
【表１】
【００４５】ＣＨＯ細胞のトランスフェクションと選択 Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い
て、ＣＨＯ Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）に１０
μｇのｐＫＭＳ．ｈＣＧインターチェイン構築物ＤＮＡ
を安定的にトランスフェクトした。ネオマイシン選択遺
伝子を有する選択プラスミドを１０：１（ｐＫＭＳ ｈ
ＣＧインターチェインを過剰とする）のモル比で同時ト
ランスフェクトすることで、Ｇ４１８（０．８ｍｇ／ｍ
ｌ）を含有する培地で細胞を選択可能とした。
て、ＣＨＯ Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）に１０
μｇのｐＫＭＳ．ｈＣＧインターチェイン構築物ＤＮＡ
を安定的にトランスフェクトした。ネオマイシン選択遺
伝子を有する選択プラスミドを１０：１（ｐＫＭＳ ｈ
ＣＧインターチェインを過剰とする）のモル比で同時ト
ランスフェクトすることで、Ｇ４１８（０．８ｍｇ／ｍ
ｌ）を含有する培地で細胞を選択可能とした。
【００４６】組換えＣＨＯ細胞を免疫反応性タンパク質
の分泌について調べた。培養上清液はαとβに特異的な
モノクローナル抗体を用いるｈＣＧサンドイッチＥＬＩ
ＳＡアッセイで陽性反応を示した。培養上清液のウェス
タンブロッテイングによりｈＣＧインターチェインムテ
インがｒｅｃ−ｈＣＧ野性型に相当する分子量を有する
ことが示された。
の分泌について調べた。培養上清液はαとβに特異的な
モノクローナル抗体を用いるｈＣＧサンドイッチＥＬＩ
ＳＡアッセイで陽性反応を示した。培養上清液のウェス
タンブロッテイングによりｈＣＧインターチェインムテ
インがｒｅｃ−ｈＣＧ野性型に相当する分子量を有する
ことが示された。
【００４７】実施例 ２ サブユニット間のジスルフィド形成の分析 新しく導入されたシステインが酸化されてサブユニット
間ジスルフィド結合となったかどうかを決定するため
に、Ｇ４１８耐性トランスフェクションプールからの細
胞培養上清液の試料をＳＤＳ含有試料緩衝液中で沸騰さ
せることにより溶解し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動にかけ、ＰＶＤＦメンブレンに移した。ｈＣＧ
はβサブユニットに対するモノクローナル抗体を用い、
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した第二
抗体ともにインキュベートし、テトラメチルベンジジン
（ＴＭＢ）／Ｃｏ++／Ｈ2 Ｏ2 を用いて染色することに
よる免疫染色を用いて目で確認できるものとした。サブ
ユニット間ジスルフィド結合が形成されている場合、試
料をＳＤＳ試料緩衝液中で沸騰しても二つのサブユニッ
トは一緒に保持されるが、ジスルフィド架橋が形成され
ていない場合ではこれらの可溶化条件ではサブユニット
に解離する。対照実験において、試料を室温で還元剤を
用いず溶解するか、又はβ−メルカプトエタノール（β
ＭＥ）を添加することで溶解した（無傷のｈＣＧ）。後
者の場合の変性では、インターチェインジスルフィド結
合が存在するか否かにかかわらずサブユニットへの変性
が起こる。図２のパネルＡに見ることができるように、
βＭＥがない状態で室温で可溶化すると、無傷（ｉｎｔ
ａｃｔ）の野性型ｈＣＧ（レーン３、約５０ｋＤの分子
量）といくぶんかの遊離βサブユニット（約３２ｋＤの
分子量）が検出できる。ＨＣＧインターチェイン１とＨ
ＣＧインターチェイン２からの試料もだいたい同じ大き
さの免疫反応性物質を含有し、無傷のｈＣＧムテインの
存在を示している。加熱すると、約５０ｋＤバンド（パ
ネルＢのレーン３）の消失から明らかなように野性型ｈ
ＣＧはサブユニットに解離する。対照的に、このことは
ｈＣＧ変異体（パネルＢのレーン１と２）には起こって
いるようには見えず、分子間に共有結合があることを示
している。還元剤の添加はｈＣＧと変異体をサブユニッ
トに解離するために（パネルＣ）、βＭＥの添加試験の
結果から、最終的に２つのサブユニットの分子間結合が
ジスルフィド結合によりもたらされていることを示して
いる。
間ジスルフィド結合となったかどうかを決定するため
に、Ｇ４１８耐性トランスフェクションプールからの細
胞培養上清液の試料をＳＤＳ含有試料緩衝液中で沸騰さ
せることにより溶解し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動にかけ、ＰＶＤＦメンブレンに移した。ｈＣＧ
はβサブユニットに対するモノクローナル抗体を用い、
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した第二
抗体ともにインキュベートし、テトラメチルベンジジン
（ＴＭＢ）／Ｃｏ++／Ｈ2 Ｏ2 を用いて染色することに
よる免疫染色を用いて目で確認できるものとした。サブ
ユニット間ジスルフィド結合が形成されている場合、試
料をＳＤＳ試料緩衝液中で沸騰しても二つのサブユニッ
トは一緒に保持されるが、ジスルフィド架橋が形成され
ていない場合ではこれらの可溶化条件ではサブユニット
に解離する。対照実験において、試料を室温で還元剤を
用いず溶解するか、又はβ−メルカプトエタノール（β
ＭＥ）を添加することで溶解した（無傷のｈＣＧ）。後
者の場合の変性では、インターチェインジスルフィド結
合が存在するか否かにかかわらずサブユニットへの変性
が起こる。図２のパネルＡに見ることができるように、
βＭＥがない状態で室温で可溶化すると、無傷（ｉｎｔ
ａｃｔ）の野性型ｈＣＧ（レーン３、約５０ｋＤの分子
量）といくぶんかの遊離βサブユニット（約３２ｋＤの
分子量）が検出できる。ＨＣＧインターチェイン１とＨ
ＣＧインターチェイン２からの試料もだいたい同じ大き
さの免疫反応性物質を含有し、無傷のｈＣＧムテインの
存在を示している。加熱すると、約５０ｋＤバンド（パ
ネルＢのレーン３）の消失から明らかなように野性型ｈ
ＣＧはサブユニットに解離する。対照的に、このことは
ｈＣＧ変異体（パネルＢのレーン１と２）には起こって
いるようには見えず、分子間に共有結合があることを示
している。還元剤の添加はｈＣＧと変異体をサブユニッ
トに解離するために（パネルＣ）、βＭＥの添加試験の
結果から、最終的に２つのサブユニットの分子間結合が
ジスルフィド結合によりもたらされていることを示して
いる。
【００４８】実施例 ３ ＬＨ／ＣＧレセプター結合 ＬＨ／ＣＧレセプターへの結合はｈＣＧの作用機構の最
初の事象である。ヨウ素化ｈＣＧのラット睾丸膜への移
動を用いるｈＣＧインターチェインムテインの相対的レ
セプター結合力を決定するためにインビトロレセプター
アッセイを用いた（Ｒａｏ， Ｍ． Ｃ．ら， Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９７７） １０１：５１２−
５２３）。この目的のために、一定量の［125 Ｉ］ｈＣ
Ｇをラット睾丸膜と試料とともに試料の量を増やしなが
ら室温で１８時間インキュベートした。これとは別に、
最大結合を調べるために試料を入れずにインキュベーシ
ョンを行なった。非特異的結合は１０００倍過剰の非標
識リガンドを添加することにより決定した（Ｐｒｅｇｎ
ｙｌ， Ｏｒｇａｎｏｎ， Ｗｅｓｔ Ｏｒａｎｇｅ，
ＮＪ）。インキュベーションは試料を、０．１％のＢ
ＳＡを補充した氷冷トリス緩衝液で２倍に希釈し、室温
で５分間１５０，０００ｘＮ．ｋｇ-1で遠心することに
より停止させた。上清を吸引した後、ペレット中の放射
能をガンマカウンターを用いて測定した。
初の事象である。ヨウ素化ｈＣＧのラット睾丸膜への移
動を用いるｈＣＧインターチェインムテインの相対的レ
セプター結合力を決定するためにインビトロレセプター
アッセイを用いた（Ｒａｏ， Ｍ． Ｃ．ら， Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９７７） １０１：５１２−
５２３）。この目的のために、一定量の［125 Ｉ］ｈＣ
Ｇをラット睾丸膜と試料とともに試料の量を増やしなが
ら室温で１８時間インキュベートした。これとは別に、
最大結合を調べるために試料を入れずにインキュベーシ
ョンを行なった。非特異的結合は１０００倍過剰の非標
識リガンドを添加することにより決定した（Ｐｒｅｇｎ
ｙｌ， Ｏｒｇａｎｏｎ， Ｗｅｓｔ Ｏｒａｎｇｅ，
ＮＪ）。インキュベーションは試料を、０．１％のＢ
ＳＡを補充した氷冷トリス緩衝液で２倍に希釈し、室温
で５分間１５０，０００ｘＮ．ｋｇ-1で遠心することに
より停止させた。上清を吸引した後、ペレット中の放射
能をガンマカウンターを用いて測定した。
【００４９】ｈＣＧインターチェイン１はｒｅｃ−ｈＣ
Ｇ野性型に相応するヨウ素化ｈＣＧの置換曲線を示して
いる（図３参照）。このことはｈＣＧインターチェイン
１のサブユニット間ジスルフィド結合がレセプター結合
に何の影響も与えないことを示し、このムテインの高次
構造がｒｅｃ−ｈＣＧ野性型と実際に同等のものである
ことを示している。ヨウ素化ｈＣＧのｈＣＧインターチ
ェイン２による置換はいくぶんか減少した。これは恐ら
くこのインターチェインジスルフィド架橋がレセプター
結合とシグナルトランスアクション（ｔｒａｎｓａｃｔ
ｉｏｎ）にとって重要な領域に位置するということによ
るものであろう。
Ｇ野性型に相応するヨウ素化ｈＣＧの置換曲線を示して
いる（図３参照）。このことはｈＣＧインターチェイン
１のサブユニット間ジスルフィド結合がレセプター結合
に何の影響も与えないことを示し、このムテインの高次
構造がｒｅｃ−ｈＣＧ野性型と実際に同等のものである
ことを示している。ヨウ素化ｈＣＧのｈＣＧインターチ
ェイン２による置換はいくぶんか減少した。これは恐ら
くこのインターチェインジスルフィド架橋がレセプター
結合とシグナルトランスアクション（ｔｒａｎｓａｃｔ
ｉｏｎ）にとって重要な領域に位置するということによ
るものであろう。
【００５０】実施例 ４ ｈＣＧ誘導テストステロンの産生 ｈＣＧはマウスライディッヒ（Ｌｅｙｄｉｇ）細胞でテ
ストステロン産生を誘導する。Ｍａｎｎａｅｒｔｓら
（Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ｏｆｒｅｐ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，（１９８７）， Ｒ． Ｒｏｌｌ
ａｎｄら（編）， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．，４９−５８）によ
り改良されたインビトロアッセイ（Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ
ら，Ａｃｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（１９７４）
７７， ６５５−６７１）を用いて、インターチェイン
ジスルフィド結合を有するｈＣＧムテインのｈＣＧ生物
活性を決定した（図４）。細胞をｈＣＧインターチェイ
ン１で処理した結果、ｒｅｃ−ｈＣＧ野性型と同じ能力
を有するテストステロン産生が用量依存的に得られた。
したがって、ｈＣＧインターチェイン１は完全なｈＣＧ
アゴニストとみなすことができる。対照的に、ｈＣＧイ
ンターチェイン２のシグナルトランスデューシング能力
はゼロまで減少し、ｈＣＧインターチェイン２が野性型
ｈＣＧの完全アンタゴニストとして用いることができる
ことを示した。
ストステロン産生を誘導する。Ｍａｎｎａｅｒｔｓら
（Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ｏｆｒｅｐ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，（１９８７）， Ｒ． Ｒｏｌｌ
ａｎｄら（編）， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．，４９−５８）によ
り改良されたインビトロアッセイ（Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ
ら，Ａｃｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（１９７４）
７７， ６５５−６７１）を用いて、インターチェイン
ジスルフィド結合を有するｈＣＧムテインのｈＣＧ生物
活性を決定した（図４）。細胞をｈＣＧインターチェイ
ン１で処理した結果、ｒｅｃ−ｈＣＧ野性型と同じ能力
を有するテストステロン産生が用量依存的に得られた。
したがって、ｈＣＧインターチェイン１は完全なｈＣＧ
アゴニストとみなすことができる。対照的に、ｈＣＧイ
ンターチェイン２のシグナルトランスデューシング能力
はゼロまで減少し、ｈＣＧインターチェイン２が野性型
ｈＣＧの完全アンタゴニストとして用いることができる
ことを示した。
【００５１】実施例 ５ 雌ビーグル犬での薬物動態学的挙動 ｈＣＧインターチェイン１の薬物動態学的挙動を、雌ビ
ーグル犬に筋内投与後に調べた。二匹の犬にｈＣＧイン
ターチェイン１の一回の筋内注射を２５（ｈＣＧ ＥＩ
Ａ）ＩＵ／ｋｇの投与レベルで行なった。血液試料を注
射前および注射の３０分後と１、１．５、２、３、４、
６、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１
６８、１９２、２１６、２４０および２６４時間後に採
取した。免疫反応性ｈＣＧインターチェイン１の血漿レ
ベルを、犬血漿で確認したｈＣＧ特異的時間分割蛍光抗
体アッセイ（ｈＣＧ−ＤＥＬＦＩＡ）により測定した。
ｈＣＧインターチェイン１のクリアランス曲線を図５に
示す。比較のために、３匹の犬での筋内投与後のｈＣＧ
（組換えｈＣＧ； ２５ ｈＣＧ ＥＩＡ ＩＵ／ｋ
ｇ）のクリアランス曲線を図５に示す。薬物動態学的パ
ラメーターＡＵＣ（血漿レベル−時間曲線下の面積）、
Ｃｍａｘ（ピーク濃度）、ｔｍａｘ（ピーク濃度の時
間）、ｔ1/2 （血清除去半減期）およびクリアランス曲
線から得られたＣＬ（クリアランス速度）を表２に示
す。１４４時間ポイントと２４０時間ポイントとの間で
測定された時間がｔ1/2 の決定に用いられた。
ーグル犬に筋内投与後に調べた。二匹の犬にｈＣＧイン
ターチェイン１の一回の筋内注射を２５（ｈＣＧ ＥＩ
Ａ）ＩＵ／ｋｇの投与レベルで行なった。血液試料を注
射前および注射の３０分後と１、１．５、２、３、４、
６、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１
６８、１９２、２１６、２４０および２６４時間後に採
取した。免疫反応性ｈＣＧインターチェイン１の血漿レ
ベルを、犬血漿で確認したｈＣＧ特異的時間分割蛍光抗
体アッセイ（ｈＣＧ−ＤＥＬＦＩＡ）により測定した。
ｈＣＧインターチェイン１のクリアランス曲線を図５に
示す。比較のために、３匹の犬での筋内投与後のｈＣＧ
（組換えｈＣＧ； ２５ ｈＣＧ ＥＩＡ ＩＵ／ｋ
ｇ）のクリアランス曲線を図５に示す。薬物動態学的パ
ラメーターＡＵＣ（血漿レベル−時間曲線下の面積）、
Ｃｍａｘ（ピーク濃度）、ｔｍａｘ（ピーク濃度の時
間）、ｔ1/2 （血清除去半減期）およびクリアランス曲
線から得られたＣＬ（クリアランス速度）を表２に示
す。１４４時間ポイントと２４０時間ポイントとの間で
測定された時間がｔ1/2 の決定に用いられた。
【００５２】ｈＣＧインターチェイン１の筋内投与とｒ
ｅｃ−ｈＣＧの筋内投与の比較の結果、ｈＣＧインター
チェイン１ＡＵＣとｔ1/2 に関して高い値とＣＬに関し
て低い値が得られた一方で、Ｃｍａｘとｔｍａｘの値は
同等であった。ｈＣＧインターチェイン１とｒｅｃ−ｈ
ＣＧの動力学的比較から、ｈＣＧインターチェイン１は
低いクリアランス速度と長い半減期を示すと結論でき
る。
ｅｃ−ｈＣＧの筋内投与の比較の結果、ｈＣＧインター
チェイン１ＡＵＣとｔ1/2 に関して高い値とＣＬに関し
て低い値が得られた一方で、Ｃｍａｘとｔｍａｘの値は
同等であった。ｈＣＧインターチェイン１とｒｅｃ−ｈ
ＣＧの動力学的比較から、ｈＣＧインターチェイン１は
低いクリアランス速度と長い半減期を示すと結論でき
る。
【００５３】
【表２】
【００５４】実施例 ６ ｈＣＧインターチェイン４（Ｇｌｎ α５ Ｃｙｓ−Ａ
ｒｇ β８ Ｃｙｓ）ベクターの構築と発現 さらにもう一つのインターチェインジスルフィド結合を
有するｈＣＧムテインを発現するために構築物を作っ
た。その構造と全体的な構成は、新しい変異を導入した
ことを除けばｐＫＭＳ．ｈＣＧαg βc （図１）と基本
的に同じである。特定の塩基置換を、「ハイブリッド」
ｈＣＧα遺伝子中でグルタミンα５をコードするコドン
をシステインをコードするコドンに変更するように導入
し、ｈＣＧβ遺伝子中でアルギニンβ８をコードするコ
ドンをシステインをコードするコドンに変更するように
導入した。構築と、その後のＣＨＯ細胞のトランスフェ
クションおよび選択は他のムテインについて記載したよ
うに同様に行なった。実施例２に記載のタンパク質分析
で、二つのサブユニット間の分子間結合がジスルフィド
によることが示された。
ｒｇ β８ Ｃｙｓ）ベクターの構築と発現 さらにもう一つのインターチェインジスルフィド結合を
有するｈＣＧムテインを発現するために構築物を作っ
た。その構造と全体的な構成は、新しい変異を導入した
ことを除けばｐＫＭＳ．ｈＣＧαg βc （図１）と基本
的に同じである。特定の塩基置換を、「ハイブリッド」
ｈＣＧα遺伝子中でグルタミンα５をコードするコドン
をシステインをコードするコドンに変更するように導入
し、ｈＣＧβ遺伝子中でアルギニンβ８をコードするコ
ドンをシステインをコードするコドンに変更するように
導入した。構築と、その後のＣＨＯ細胞のトランスフェ
クションおよび選択は他のムテインについて記載したよ
うに同様に行なった。実施例２に記載のタンパク質分析
で、二つのサブユニット間の分子間結合がジスルフィド
によることが示された。
【００５５】生物活性 レセプター結合活性およびインビトロ生物活性は、安定
にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系で発現されたヒ
トレセプター（Ｊｉａ， Ｘら（１９９１），Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， ５， ７
５９−７６８）上で決定した。ｈＣＧインターチェイン
４のレセプター結合活性は、指数増殖細胞から単離した
膜フラクションについて放射性リガンドレセプター置換
アッセイにて定量した。０．５ｍｌの総量で、約１００
μｇの膜タンパク質を一定量の125 Ｉ−ｈＣＧ（２０，
０００ｃｐｍ，約１２ｐＭ）と競合ｈＣＧとともに競合
ｈＣＧの量を増やしながら１８時間室温にてインキュベ
ートした。125 Ｉ標識ｈＣＧ（ＮＥＸ−１０６）はＤｕ
Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓから入手した。特異
的結合は添加した全125 Ｉ−ｈＣＧの１０〜１２％であ
った。インキュベーション後、結合したホルモンと遊離
のホルモンを遠心により分離した。高精製の組換えｈＣ
Ｇをスタンダードとして用いた。
にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系で発現されたヒ
トレセプター（Ｊｉａ， Ｘら（１９９１），Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， ５， ７
５９−７６８）上で決定した。ｈＣＧインターチェイン
４のレセプター結合活性は、指数増殖細胞から単離した
膜フラクションについて放射性リガンドレセプター置換
アッセイにて定量した。０．５ｍｌの総量で、約１００
μｇの膜タンパク質を一定量の125 Ｉ−ｈＣＧ（２０，
０００ｃｐｍ，約１２ｐＭ）と競合ｈＣＧとともに競合
ｈＣＧの量を増やしながら１８時間室温にてインキュベ
ートした。125 Ｉ標識ｈＣＧ（ＮＥＸ−１０６）はＤｕ
Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓから入手した。特異
的結合は添加した全125 Ｉ−ｈＣＧの１０〜１２％であ
った。インキュベーション後、結合したホルモンと遊離
のホルモンを遠心により分離した。高精製の組換えｈＣ
Ｇをスタンダードとして用いた。
【００５６】ｈＣＧインターチェイン４は、野性型ｈＣ
Ｇと比べてわずかに減少したヨウ素化ｈＣＧの置換を示
している（図６）。ｈＣＧはヒトＬＨ／ＣＧレセプター
を含有するＣＨＯ細胞でのｃＡＭＰ産生を誘導する。イ
ンビトロバイオアッセイを用いて、ｈＣＧインターチェ
イン４のｈＣＧ生物活性を決定した。０．１ｍＭ ３-
イソブチル- １- メチルキサンチンの存在下でｈＣＧイ
ンターチェイン４とともにその濃度を増加させながら細
胞を４時間インキュベートした結果、用量依存的にｃＡ
ＭＰ産生の増加がもたらされた（細胞外ｃＡＭＰ濃度は
ＲＩＡ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）により決定し、ｒｅｃ
−ｈＣＧ野性型と同等の能力を有していた（図７））。
したがって、ｈＣＧインターチェイン４は完全なｈＣＧ
アゴニストとみなすことができる。
Ｇと比べてわずかに減少したヨウ素化ｈＣＧの置換を示
している（図６）。ｈＣＧはヒトＬＨ／ＣＧレセプター
を含有するＣＨＯ細胞でのｃＡＭＰ産生を誘導する。イ
ンビトロバイオアッセイを用いて、ｈＣＧインターチェ
イン４のｈＣＧ生物活性を決定した。０．１ｍＭ ３-
イソブチル- １- メチルキサンチンの存在下でｈＣＧイ
ンターチェイン４とともにその濃度を増加させながら細
胞を４時間インキュベートした結果、用量依存的にｃＡ
ＭＰ産生の増加がもたらされた（細胞外ｃＡＭＰ濃度は
ＲＩＡ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）により決定し、ｒｅｃ
−ｈＣＧ野性型と同等の能力を有していた（図７））。
したがって、ｈＣＧインターチェイン４は完全なｈＣＧ
アゴニストとみなすことができる。
【００５７】実施例 ７ ｈＣＧインターチェイン５（Ａｒｇ α３５ Ｃｙｓ−
Ａｌａ β３５ Ｃｙｓ） ｈＣＧインターチェイン５を、α鎖の３５位とβ鎖の３
５位で、アルギニンとアラニンをそれぞれシステイン残
基に置き換える置換により作った。
Ａｌａ β３５ Ｃｙｓ） ｈＣＧインターチェイン５を、α鎖の３５位とβ鎖の３
５位で、アルギニンとアラニンをそれぞれシステイン残
基に置き換える置換により作った。
【００５８】組換えＣＨＯ細胞を、免疫反応性タンパク
質の分泌について他のｈＣＧインターチェインで記載し
たように選択した。培養上清液は、αとβに特異的なモ
ノクロナール抗体を用いるｈＣＧサンドイッチＥＬＩＳ
Ａアッセイで陽性反応を示した。２サブユニット間の分
子間結合がジスルフィドによることが実施例２で記載し
たようなタンパク質分析により示された。
質の分泌について他のｈＣＧインターチェインで記載し
たように選択した。培養上清液は、αとβに特異的なモ
ノクロナール抗体を用いるｈＣＧサンドイッチＥＬＩＳ
Ａアッセイで陽性反応を示した。２サブユニット間の分
子間結合がジスルフィドによることが実施例２で記載し
たようなタンパク質分析により示された。
【００５９】レセプター結合活性アッセイで、野性型ｈ
ＣＧに比較してわずかに減少したヨウ素化ｈＣＧの置換
が見られた（図６）。インビトロバイオアッセイで、ｈ
ＣＧインターチェイン５の能力がｒｅｃ−ｈＣＧ野性型
と同等であることが示された（図７）。したがって、ｈ
ＣＧインターチェイン５は完全なｈＣＧアゴニストとみ
なすことができる。
ＣＧに比較してわずかに減少したヨウ素化ｈＣＧの置換
が見られた（図６）。インビトロバイオアッセイで、ｈ
ＣＧインターチェイン５の能力がｒｅｃ−ｈＣＧ野性型
と同等であることが示された（図７）。したがって、ｈ
ＣＧインターチェイン５は完全なｈＣＧアゴニストとみ
なすことができる。
【００６０】実施例 ８ｈＣＧインターチェイン６（Ｈｉｓ α９０ Ｃｙｓ−
Ｃｙｓ βｙ Ｃｙｓ） ｈＣＧインターチェイン６をα鎖の９０位でヒスチジン
をシステイン残基に置き換える置換により作った。
Ｃｙｓ βｙ Ｃｙｓ） ｈＣＧインターチェイン６をα鎖の９０位でヒスチジン
をシステイン残基に置き換える置換により作った。
【００６１】組換えＣＨＯ細胞を、免疫反応性タンパク
質の分泌のために他のｈＣＧインターチェインについて
記載したように選択した。培養上清液は、αとβに特異
的なモノクロナール抗体を用いるｈＣＧサンドイッチＥ
ＬＩＳＡアッセイで陽性反応を示した。実施例２で記載
したタンパク質分析により２サブユニット間の分子間結
合がジスルフィドによることが示された。
質の分泌のために他のｈＣＧインターチェインについて
記載したように選択した。培養上清液は、αとβに特異
的なモノクロナール抗体を用いるｈＣＧサンドイッチＥ
ＬＩＳＡアッセイで陽性反応を示した。実施例２で記載
したタンパク質分析により２サブユニット間の分子間結
合がジスルフィドによることが示された。
【００６２】レセプター結合活性アッセイで、野性型ｈ
ＣＧに匹敵するヨウ素化ｈＣＧの置換が見られた。イン
ビトロアッセイで、ｈＣＧインターチェイン６の能力が
無視できることが示された。したがって、ｈＣＧインタ
ーチェイン６はｈＣＧアンタゴニストとみなすことがで
きる。
ＣＧに匹敵するヨウ素化ｈＣＧの置換が見られた。イン
ビトロアッセイで、ｈＣＧインターチェイン６の能力が
無視できることが示された。したがって、ｈＣＧインタ
ーチェイン６はｈＣＧアンタゴニストとみなすことがで
きる。
【００６３】実施例 ９ ＬＨインターチェイン１（Ｇｌｎ α５ Ｃｙｓ−Ｔｒ
ｐ β８ Ｃｙｓ） 付加的な鎖間ジスルフィド結合を有するＬＨムテインを
発現するために構築物を作った。ＬＨβのｃＤＮＡは記
載されたように単離し（Ｔａｌｍａｄｇｅら，Ｎａｔｕ
ｒｅ（１９８４） ３０７， ３７−４０）、ベクター
ｐＫＭＳ．ＦＳＨαg βg 中でＦＳＨβと交換した（Ｖ
ａｎ Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋら， １９９０）。
ｐ β８ Ｃｙｓ） 付加的な鎖間ジスルフィド結合を有するＬＨムテインを
発現するために構築物を作った。ＬＨβのｃＤＮＡは記
載されたように単離し（Ｔａｌｍａｄｇｅら，Ｎａｔｕ
ｒｅ（１９８４） ３０７， ３７−４０）、ベクター
ｐＫＭＳ．ＦＳＨαg βg 中でＦＳＨβと交換した（Ｖ
ａｎ Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋら， １９９０）。
【００６４】ＬＨインターチェイン１にα鎖変異を作る
ために、「ハイブリッド」α遺伝子で、グルタミンα５
をコードするコドンをシステインをコードするコドンに
変更するように特定の塩基置換を導入した。
ために、「ハイブリッド」α遺伝子で、グルタミンα５
をコードするコドンをシステインをコードするコドンに
変更するように特定の塩基置換を導入した。
【００６５】ＬＨβにおいて、トリプトファンβ８をコ
ードするコドンをシステインをコードするコドンと変更
するように特定の塩基置換を導入した。変異ＰＣＲ反
応、サブクローニングおよび配列決定はｈＣＧに記載の
ものと同等の方法を用いて行なった。変異タンパク質は
トランスフェクトされたＣＨＯ Ｋ１細胞（ＡＴＣＣＣ
ＣＬ６１）細胞中で発現させた。組換えＣＨＯ細胞は免
疫反応性タンパク質の分泌について選択した。培養上清
液はαとβに特異的なモノクローナル抗体を用いるＬＨ
サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで陽性反応を示した。
実施例２に記載のタンパク質分析で、二つのサブユニッ
ト間の分子間結合がジスルフィドによることが示され
た。
ードするコドンをシステインをコードするコドンと変更
するように特定の塩基置換を導入した。変異ＰＣＲ反
応、サブクローニングおよび配列決定はｈＣＧに記載の
ものと同等の方法を用いて行なった。変異タンパク質は
トランスフェクトされたＣＨＯ Ｋ１細胞（ＡＴＣＣＣ
ＣＬ６１）細胞中で発現させた。組換えＣＨＯ細胞は免
疫反応性タンパク質の分泌について選択した。培養上清
液はαとβに特異的なモノクローナル抗体を用いるＬＨ
サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで陽性反応を示した。
実施例２に記載のタンパク質分析で、二つのサブユニッ
ト間の分子間結合がジスルフィドによることが示され
た。
【００６６】レセプター結合活性とインビトロ生物活性
は安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系で発現さ
れるヒトレセプター上で決定した（Ｊｉａら）。ＬＨイ
ンターチェイン１は、野性型ＬＨに匹敵するヨウ素化ｈ
ＣＧの置換を示した（図８）。
は安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系で発現さ
れるヒトレセプター上で決定した（Ｊｉａら）。ＬＨイ
ンターチェイン１は、野性型ＬＨに匹敵するヨウ素化ｈ
ＣＧの置換を示した（図８）。
【００６７】実施例 １０ ＬＨインターチェイン２（Ａｒｇ α３５ Ｃｙｓ−Ａ
ｌａ β３５ Ｃｙｓ） ＬＨインターチェイン２を、α鎖の３５位とβ鎖の３５
位で、アルギニンとアラニンをそれぞれシステイン残基
に置き換える置換により作った。。
ｌａ β３５ Ｃｙｓ） ＬＨインターチェイン２を、α鎖の３５位とβ鎖の３５
位で、アルギニンとアラニンをそれぞれシステイン残基
に置き換える置換により作った。。
【００６８】組換えＣＨＯ細胞を、免疫反応性タンパク
質の分泌について他のｈＣＧインターチェインで記載し
たように選択した。培養上清液は、αとβに特異的なモ
ノクロナール抗体を用いるＬＨサンドイッチＥＬＩＳＡ
アッセイで陽性反応を示した。
質の分泌について他のｈＣＧインターチェインで記載し
たように選択した。培養上清液は、αとβに特異的なモ
ノクロナール抗体を用いるＬＨサンドイッチＥＬＩＳＡ
アッセイで陽性反応を示した。
【００６９】レセプター結合活性アッセイで、ヨウ素化
ｈＣＧの置換が野性型ｈＣＧに匹敵することがわかった
（図８）。
ｈＣＧの置換が野性型ｈＣＧに匹敵することがわかった
（図８）。
【００７０】実施例 １１ ＦＳＨインターチェイン１（Ｇｌｎ α５ Ｃｙｓ−Ｓ
ｅｒ β２ Ｃｙｓ） 付加的な鎖間ジスルフィド結合を有するＦＳＨムテイン
を発現するために構築物を作った。その構造と全体的な
構成は、ＣＨＯ細胞中で組換え野性型ＦＳＨの発現のた
めに用いられたベクターｐＭＫＳ．ＦＳＨαg βg のも
のと基本的には同一である。塩基置換を、ＦＳＨのαサ
ブユニットとβサブユニットの遺伝子のそれぞれ対応す
るアミノ酸位置５（Ｇｌｎ）と２（Ｓｅｒ）に導入し
て、システインコドンを得た（β遺伝子の配列に関して
はＫｅｅｎｅら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２
６４： ４７６９−４７７５．（１９８９）を参照）。
トランスフェクトされた組換えＣＨＯ細胞を免疫反応性
タンパク質の分泌について選択した。培養上清液は、α
とβに特異的なモノクローナル抗体を用いるＦＳＨサン
ドイッチＥＬＩＳＡアッセイで陽性反応を示した。
ｅｒ β２ Ｃｙｓ） 付加的な鎖間ジスルフィド結合を有するＦＳＨムテイン
を発現するために構築物を作った。その構造と全体的な
構成は、ＣＨＯ細胞中で組換え野性型ＦＳＨの発現のた
めに用いられたベクターｐＭＫＳ．ＦＳＨαg βg のも
のと基本的には同一である。塩基置換を、ＦＳＨのαサ
ブユニットとβサブユニットの遺伝子のそれぞれ対応す
るアミノ酸位置５（Ｇｌｎ）と２（Ｓｅｒ）に導入し
て、システインコドンを得た（β遺伝子の配列に関して
はＫｅｅｎｅら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２
６４： ４７６９−４７７５．（１９８９）を参照）。
トランスフェクトされた組換えＣＨＯ細胞を免疫反応性
タンパク質の分泌について選択した。培養上清液は、α
とβに特異的なモノクローナル抗体を用いるＦＳＨサン
ドイッチＥＬＩＳＡアッセイで陽性反応を示した。
【００７１】レセプター結合活性とインビトロ生物活性
は、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系で発現
されるヒトレセプター上で決定した（Ｍｉｎｅｇｉｓｈ
ら，（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．１７５， １１２５−１１
３０）。ＦＳＨインターチェイン１のレセプター結合活
性は放射性リガンドレセプター置換アッセイを用いて、
指数増殖細胞から単離した膜画分において定量した。
０．５ｍｌの総量で、約１００μｇの膜タンパク質を一
定量の125 Ｉ−ＦＳＨ（２０，０００ｃｐｍ，約１２ｐ
Ｍ）と競合ＦＳＨとともに競合ＦＳＨ量を増やしながら
１８時間室温にてインキュベートした。125 Ｉ標識ＦＳ
Ｈ（ＮＥＸ−１０６）はＤｕ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍ
ｏｕｒｓから入手した。特異的結合は添加した全125 Ｉ
−ＦＳＨの１０〜１２％であった。インキュベーション
後、結合したホルモンと遊離のホルモンを遠心により分
離した。高精製の組換えＦＳＨをスタンダードとして用
いた。ＦＳＨインターチェイン１は、野性型ＦＳＨに匹
敵するヨウ素化ＦＳＨの置換を示した（図９）。
は、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系で発現
されるヒトレセプター上で決定した（Ｍｉｎｅｇｉｓｈ
ら，（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．１７５， １１２５−１１
３０）。ＦＳＨインターチェイン１のレセプター結合活
性は放射性リガンドレセプター置換アッセイを用いて、
指数増殖細胞から単離した膜画分において定量した。
０．５ｍｌの総量で、約１００μｇの膜タンパク質を一
定量の125 Ｉ−ＦＳＨ（２０，０００ｃｐｍ，約１２ｐ
Ｍ）と競合ＦＳＨとともに競合ＦＳＨ量を増やしながら
１８時間室温にてインキュベートした。125 Ｉ標識ＦＳ
Ｈ（ＮＥＸ−１０６）はＤｕ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍ
ｏｕｒｓから入手した。特異的結合は添加した全125 Ｉ
−ＦＳＨの１０〜１２％であった。インキュベーション
後、結合したホルモンと遊離のホルモンを遠心により分
離した。高精製の組換えＦＳＨをスタンダードとして用
いた。ＦＳＨインターチェイン１は、野性型ＦＳＨに匹
敵するヨウ素化ＦＳＨの置換を示した（図９）。
【００７２】実施例 １２ ＦＳＨインターチェイン２（Ｔｙｒ α３７ Ｃｙｓ−
Ｔｒｐ β２７ Ｃｙｓ） ＦＳＨインターチェイン２を、α鎖の３７位とβ鎖の２
７位で、チロシンとトリプトファンをそれぞれシステイ
ン残基に置き換える置換により作った。
Ｔｒｐ β２７ Ｃｙｓ） ＦＳＨインターチェイン２を、α鎖の３７位とβ鎖の２
７位で、チロシンとトリプトファンをそれぞれシステイ
ン残基に置き換える置換により作った。
【００７３】組換えＣＨＯ細胞を、免疫反応性タンパク
質について他のｈＣＧインターチェインで記載したよう
に選択した。培養上清液は、αとβに特異的なモノクロ
ナール抗体を用いるＦＳＨサンドイッチＥＬＩＳＡアッ
セイで陽性反応を示した。
質について他のｈＣＧインターチェインで記載したよう
に選択した。培養上清液は、αとβに特異的なモノクロ
ナール抗体を用いるＦＳＨサンドイッチＥＬＩＳＡアッ
セイで陽性反応を示した。
【００７４】レセプター結合活性アッセイで、ヨウ素化
ＦＳＨの置換が野性型ＦＳＨに匹敵することがわかった
（図９）。
ＦＳＨの置換が野性型ＦＳＨに匹敵することがわかった
（図９）。
【図１】ｈＣＧαg βc 発現プラスミドｐＭＫＳ．ｈＣ
Ｇαc βc の構造。ＳＶ４０＝Ｓｖ４０初期プロモータ
ー。Ｅ＝Ｍ−ＭｕＬＶエンハンサー。ＭＴ−ＩＩA ＝ヒ
トメタロチオネイン−ＩＩA プロモーター。ｈＣＧαg
＝ｈＣＧαサブユニットをコードするゲノムｈＣＧαミ
ニ遺伝子。ｈＣＧβc ＝ｈＣＧβサブユニットをコード
するｃＤＮＡ。βグロビン＝ウサギβグロビンのポリア
デニル化配列とスプライスシグナル。Ｓ＝ＳＶ４０転写
停止配列。ｐＢＲ３２７＝大腸菌の複製開始点とアンピ
リシン耐性付与遺伝子を含有するプラスミドｐＢＲ３２
７の一部。
Ｇαc βc の構造。ＳＶ４０＝Ｓｖ４０初期プロモータ
ー。Ｅ＝Ｍ−ＭｕＬＶエンハンサー。ＭＴ−ＩＩA ＝ヒ
トメタロチオネイン−ＩＩA プロモーター。ｈＣＧαg
＝ｈＣＧαサブユニットをコードするゲノムｈＣＧαミ
ニ遺伝子。ｈＣＧβc ＝ｈＣＧβサブユニットをコード
するｃＤＮＡ。βグロビン＝ウサギβグロビンのポリア
デニル化配列とスプライスシグナル。Ｓ＝ＳＶ４０転写
停止配列。ｐＢＲ３２７＝大腸菌の複製開始点とアンピ
リシン耐性付与遺伝子を含有するプラスミドｐＢＲ３２
７の一部。
【図２Ａ】ｈＣＧ（ムテイン）の発現とサブユニット間
ジスルフィド架橋形成のためのｈＣＧインターチェイン
１、ｈＣＧインターチェイン２およびｈＣＧ野性型から
の細胞培養上清液のウエスタンブロット分析。Ｃ４１８
耐性トランスフェクションプール（ｈＣＧインターチェ
イン１、ｈＣＧインターチェイン２）からの、および約
０．２ＩＵ ｈＣＧを含有するｒｅｃ−ｈＣＧ野性型か
らの細胞培養上清液を、室温（パネルＡ）または１００
℃（パネルＢとＣ）にて、βメルカプトエタノールの非
存在下（パネルＡとＢ）または存在下（パネルＣ）で、
ＳＤＳ含有試料緩衝液で可溶化した。電気泳動とＰＶＤ
Ｆ膜への転写後、βｈＣＧ特異的モノクロナール抗体と
のインキュベーション後、第二抗体／ＨＲＰ複合体との
インキュベーションおよびＴＭＢによる染色によりｈＣ
Ｇを目で確認できるようにした。室温（パネルＡのレー
ン１と２）および１００℃（パネルＢのレーン１と２）
での可溶化で分かるように、両方の結果はともに完全体
（ｉｎｔａｃｔ）のホルモンを検出するが、コントロー
ル（ＷＴ−ｈＣＧ）での沸騰はホルモンをそのサブユニ
ットへと解離する（パネルＢのレーン３）。還元剤を添
加した結果、すべての３試料でサブユニットへの解離が
見られた（パネルＣ）。よって、データをまとめると、
ｈＣＧインターチェイン１と２の両方が分子間ジスルフ
ィド架橋により安定化されているとの結論が導かれる。
ジスルフィド架橋形成のためのｈＣＧインターチェイン
１、ｈＣＧインターチェイン２およびｈＣＧ野性型から
の細胞培養上清液のウエスタンブロット分析。Ｃ４１８
耐性トランスフェクションプール（ｈＣＧインターチェ
イン１、ｈＣＧインターチェイン２）からの、および約
０．２ＩＵ ｈＣＧを含有するｒｅｃ−ｈＣＧ野性型か
らの細胞培養上清液を、室温（パネルＡ）または１００
℃（パネルＢとＣ）にて、βメルカプトエタノールの非
存在下（パネルＡとＢ）または存在下（パネルＣ）で、
ＳＤＳ含有試料緩衝液で可溶化した。電気泳動とＰＶＤ
Ｆ膜への転写後、βｈＣＧ特異的モノクロナール抗体と
のインキュベーション後、第二抗体／ＨＲＰ複合体との
インキュベーションおよびＴＭＢによる染色によりｈＣ
Ｇを目で確認できるようにした。室温（パネルＡのレー
ン１と２）および１００℃（パネルＢのレーン１と２）
での可溶化で分かるように、両方の結果はともに完全体
（ｉｎｔａｃｔ）のホルモンを検出するが、コントロー
ル（ＷＴ−ｈＣＧ）での沸騰はホルモンをそのサブユニ
ットへと解離する（パネルＢのレーン３）。還元剤を添
加した結果、すべての３試料でサブユニットへの解離が
見られた（パネルＣ）。よって、データをまとめると、
ｈＣＧインターチェイン１と２の両方が分子間ジスルフ
ィド架橋により安定化されているとの結論が導かれる。
【図２Ｂ】ｈＣＧ（ムテイン）の発現とサブユニット間
ジスルフィド架橋形成のためのｈＣＧインターチェイン
１、ｈＣＧインターチェイン２およびｈＣＧ野性型から
の細胞培養上清液のウエスタンブロット分析。（説明は
図２Ａ参照）
ジスルフィド架橋形成のためのｈＣＧインターチェイン
１、ｈＣＧインターチェイン２およびｈＣＧ野性型から
の細胞培養上清液のウエスタンブロット分析。（説明は
図２Ａ参照）
【図２Ｃ】ｈＣＧ（ムテイン）の発現とサブユニット間
ジスルフィド架橋形成のためのｈＣＧインターチェイン
１、ｈＣＧインターチェイン２およびｈＣＧ野性型から
の細胞培養上清液のウエスタンブロット分析。（説明は
図２Ａ参照）
ジスルフィド架橋形成のためのｈＣＧインターチェイン
１、ｈＣＧインターチェイン２およびｈＣＧ野性型から
の細胞培養上清液のウエスタンブロット分析。（説明は
図２Ａ参照）
【図３】ｈＣＧサブユニット間ムテインのｈＣＧ置換ア
ッセイ。Ｂ／Ｂ0 ＝全結合．．．の％。−＋−＝ｈＣＧ
野性型（ＷＴ）。−Δ−＝ｈＣＧインターチェイン１。
−ｏ−＝ｈＣＧインターチェイン２。
ッセイ。Ｂ／Ｂ0 ＝全結合．．．の％。−＋−＝ｈＣＧ
野性型（ＷＴ）。−Δ−＝ｈＣＧインターチェイン１。
−ｏ−＝ｈＣＧインターチェイン２。
【図４】ｈＣＧサブユニット間ムテインのインビトロ生
物活性。−＋−＝Ｉ．Ｓ．７５／５３７。−Δ−＝ｈＣ
Ｇインターチェイン１。−ｏ−＝ｈＣＧインターチェイ
ン２。
物活性。−＋−＝Ｉ．Ｓ．７５／５３７。−Δ−＝ｈＣ
Ｇインターチェイン１。−ｏ−＝ｈＣＧインターチェイ
ン２。
【図５】雌ビーグル犬での組換えｈＣＧ調製物の筋内注
射後の血漿ｈＣＧレベル。
射後の血漿ｈＣＧレベル。
【図６】ヒトＬＨ／ＣＧレセプターを安定に発現するＣ
ＨＯ細胞の膜に対する野性型ｈＣＧとｈＣＧインターチ
ェイン変異体の結合活性。膜を125 Ｉ標識ｈＣＧととも
に、異なる濃度の未標識の野性型ｈＣＧまたはインター
チェインｈＣＧの存在下または不存在下にインキュベー
トした。置換カーブは未標識ホルモンの各用量で最大結
合に対するパーセンテージとして示している。
ＨＯ細胞の膜に対する野性型ｈＣＧとｈＣＧインターチ
ェイン変異体の結合活性。膜を125 Ｉ標識ｈＣＧととも
に、異なる濃度の未標識の野性型ｈＣＧまたはインター
チェインｈＣＧの存在下または不存在下にインキュベー
トした。置換カーブは未標識ホルモンの各用量で最大結
合に対するパーセンテージとして示している。
【図７】野性型ｈＣＧとインターチェインｈＣＧ分子の
インビトロ生物活性。細胞外ｃＡＭＰを、ヒトＬＨ／Ｃ
Ｇレセプターを安定して発現するＣＨＯ細胞の刺激後に
特異的ＲＩＡにより測定した。
インビトロ生物活性。細胞外ｃＡＭＰを、ヒトＬＨ／Ｃ
Ｇレセプターを安定して発現するＣＨＯ細胞の刺激後に
特異的ＲＩＡにより測定した。
【図８】ヒトＬＨ／ＣＧレセプターを安定に発現するＣ
ＨＯ細胞の膜に対する野性型ｈＣＧ、野性型ＬＨおよび
ＬＨインターチェイン変異体の結合活性。膜を125 Ｉ標
識ｈＣＧとともに、異なる濃度の未標識の野性型ｈＣ
Ｇ、野性型ＬＨまたはインターチェインＬＨの存在下ま
たは不存在下にインキュベートした。置換カーブは未標
識ホルモンの各用量で最大結合に対するパーセンテージ
として示している。
ＨＯ細胞の膜に対する野性型ｈＣＧ、野性型ＬＨおよび
ＬＨインターチェイン変異体の結合活性。膜を125 Ｉ標
識ｈＣＧとともに、異なる濃度の未標識の野性型ｈＣ
Ｇ、野性型ＬＨまたはインターチェインＬＨの存在下ま
たは不存在下にインキュベートした。置換カーブは未標
識ホルモンの各用量で最大結合に対するパーセンテージ
として示している。
【図９】ヒトＦＳＨレセプターを安定に発現するＣＨＯ
細胞の膜に対する野性型ＦＳＨおよびＦＳＨインターチ
ェイン変異体の結合活性。膜を125 Ｉ標識ＦＳＨととも
に、異なる濃度の未標識の野性型ＦＳＨまたはインター
チェインＦＳＨの存在下または不存在下にインキュベー
トした。置換カーブは未標識ホルモンの各用量で最大結
合に対するパーセンテージとして示している。
細胞の膜に対する野性型ＦＳＨおよびＦＳＨインターチ
ェイン変異体の結合活性。膜を125 Ｉ標識ＦＳＨととも
に、異なる濃度の未標識の野性型ＦＳＨまたはインター
チェインＦＳＨの存在下または不存在下にインキュベー
トした。置換カーブは未標識ホルモンの各用量で最大結
合に対するパーセンテージとして示している。
Claims (17)
- 【請求項１】 １つ以上の非天然ジスルフィド架橋を有
することを特徴とする、αサブユニットとβサブユニッ
トからなるゴナドトロピン。 - 【請求項２】 非天然ジスルフィド架橋がサブユニット
間のジスルフィド架橋であることを特徴とする請求項１
記載のゴナドトロピン。 - 【請求項３】 （Ｐｈｅ α１８ Ｃｙｓ−Ｉｌｅ α
２５ Ｃｙｓ）、（Ｇｌｎ α２０ Ｃｙｓ−Ａｌａ
α２３ Ｃｙｓ）、（Ｓｅｒ α３４ Ｃｙｓ−Ｓｅｒ
α５７ Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ α３９ Ｃｙｓ−Ｔｈ
ｒ α５４Ｃｙｓ）、（Ａｌａ α６２ Ｃｙｓ−Ｈｉ
ｓ α７９ Ｃｙｓ）、および（Ｌｙｓ α６３ Ｃｙ
ｓ−Ａｌａ α８１ Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ α６５ Ｃ
ｙｓ−Ｈｉｓ α７９ Ｃｙｓ）、および（Ａｓｎ α
６６ Ｃｙｓ−Ａｓｎ α７８ Ｃｙｓ）の１つ以上の
アミノ酸対間の非天然ジスルフィド架橋を含むことを特
徴とする請求項１記載のゴナドトロピン。 - 【請求項４】 βサブユニットがｈＣＧのβサブユニッ
トであることを特徴とする請求項１〜３いずれか一項に
記載のゴナドトロピン。 - 【請求項５】 （Ｇｌｎ α５ Ｃｙｓ−Ａｒｇ β８
Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ α２４ Ｃｙｓ−Ｇｌｙ β７
１ Ｃｙｓ）、（Ｍｅｔ α２９ Ｃｙｓ−Ｍｅｔ β
４１ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ α３５ Ｃｙｓ−Ａｌａ
β３５ Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ α３７ Ｃｙｓ−Ｉｌｅ
β３３ Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ α５１ Ｃｙｓ−Ａｓ
ｐ β９９ Ｃｙｓ）および（Ｈｉｓ α９０ Ｃｙｓ
−Ｃｙｓ βｙ Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ酸対間の
サブユニット間非天然ジスルフィド架橋を含むことを特
徴とする請求項４記載のゴナドトロピン。 - 【請求項６】 （Ｐｒｏ β４ Ｃｙｓ−Ｐｒｏ β７
Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ β１１ Ｃｙｓ−Ｔｈｒ β３
２ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ β１１ Ｃｙｓ−Ａｌａ β
８５ Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ β３２ Ｃｙｓ−Ａｌａ
β８５ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ β６０ Ｃｙｓ−Ｓｅｒ
β８７ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ β６０ Ｃｙｓ−Ｇｌ
ｎ β８９ Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ β６１ Ｃｙｓ−Ｌ
ｅｕβ８６ Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ β６１ Ｃｙｓ−Ｓ
ｅｒ β８７ Ｃｙｓ）、（Ｓｅｒ β６６ Ｃｙｓ−
Ｓｅｒ β８１ Ｃｙｓ）および（Ｌｅｕ β６９Ｃｙ
ｓ−Ｐｒｏ β７８ Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ酸対
間の非天然ジスルフィド架橋を含むことを特徴とする請
求項４または５記載のゴナドトロピン。 - 【請求項７】 βサブユニットがＬＨのβサブユニット
であることを特徴とする請求項１〜３いずれか一項に記
載のゴナドトロピン。 - 【請求項８】 （Ｇｌｎ α５ Ｃｙｓ−Ｔｒｐ β８
Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ α２４ Ｃｙｓ−Ｇｌｙ β７
１ Ｃｙｓ）、（Ｍｅｔ α２９ Ｃｙｓ−Ｍｅｔ β
４１ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ α３５ Ｃｙｓ−Ａｌａ
β３５ Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ α３７ Ｃｙｓ−Ｉｌｅ
β３３ Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ α５１ Ｃｙｓ−Ａｓ
ｐ β９９ Ｃｙｓ）および（Ｈｉｓ α９０ Ｃｙｓ
−Ｃｙｓ βｙ Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ酸対間の
サブユニット間非天然ジスルフィド架橋を含むことを特
徴とする請求項７記載のゴナドトロピン。 - 【請求項９】 （Ｐｒｏ β４ Ｃｙｓ−Ｐｒｏ β７
Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ β１１ Ｃｙｓ−Ｔｈｒ β３
２ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ β１１ Ｃｙｓ−Ａｌａ β
８５ Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ β３２ Ｃｙｓ−Ａｌａ
β８５ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ β６０ Ｃｙｓ−Ｓｅｒ
β８７ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ β６０ Ｃｙｓ−Ａｒ
ｇ β８９ Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ β６１ Ｃｙｓ−Ｌ
ｅｕβ８６ Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ β６１ Ｃｙｓ−Ｓ
ｅｒ β８７ Ｃｙｓ）、（Ｓｅｒ β６６ Ｃｙｓ−
Ｓｅｒ β８１ Ｃｙｓ）および（Ｌｅｕ β６９Ｃｙ
ｓ−Ｐｒｏ β７８ Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ酸対
間の非天然ジスルフィド架橋を含むことを特徴とする請
求項７または８記載のゴナドトロピン。 - 【請求項１０】 βサブユニットがＦＳＨのβサブユニ
ットであることを特徴とする請求項１〜３いずれか一項
に記載のゴナドトロピン。 - 【請求項１１】 （Ｇｌｎ α５ Ｃｙｓ−Ｓｅｒ β
２ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ α２４ Ｃｙｓ−Ｇｌｙ β
６５ Ｃｙｓ）、（Ｍｅｔ α２９ Ｃｙｓ−Ａｒｇ
β３５ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ α３５ Ｃｙｓ−Ａｌａ
β２９ Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ α３７ Ｃｙｓ−Ｔｒ
ｐ β２７ Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ α５１ Ｃｙｓ−Ａ
ｓｐ β９３ Ｃｙｓ）および（Ｈｉｓ α９０ Ｃｙ
ｓ−Ｃｙｓ βｙ Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ酸対間
のサブユニット間非天然ジスルフィド架橋を含むことを
特徴とする請求項１０記載のゴナドトロピン。 - 【請求項１２】 （Ｌｅｕ β５ Ｃｙｓ−Ｔｈｒ β
２６ Ｃｙｓ）、（Ｌｅｕ β５ Ｃｙｓ−Ａｌａ β
７９ Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ β２６ Ｃｙｓ−Ａｌａ
β７９ Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ β５４ Ｃｙｓ−Ｇｌｎ
β８１ Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ β５４ Ｃｙｓ−Ｈｉ
ｓ β８３ Ｃｙｓ）、（Ｇｌｕ β５５ Ｃｙｓ−Ｔ
ｈｒ β８０ Ｃｙｓ）、（Ｇｌｕ β５５ Ｃｙｓ−
Ｇｌｎβ８１ Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ β６０ Ｃｙｓ−
Ｔｈｒ β７５ Ｃｙｓ）および（Ｖａｌ β６３ Ｃ
ｙｓ−Ｓｅｒ β７２ Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ酸
対間の非天然ジスルフィド架橋を含むことを特徴とする
請求項１０または１１記載のゴナドトロピン。 - 【請求項１３】 βサブユニットがＴＳＨのβサブユニ
ットであることを特徴とする請求項１〜３いずれか一項
に記載のゴナドトロピン。 - 【請求項１４】 （Ｇｌｎ α５ Ｃｙｓ−Ｐｈｅ β
１ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ α２４ Ｃｙｓ−Ｇｌｙ β
６６ Ｃｙｓ）、（Ｍｅｔ α２９ Ｃｙｓ−Ａｒｇ
β３４ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ α３５ Ｃｙｓ−Ａｌａ
β２８ Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ α３７ Ｃｙｓ−Ｉｌ
ｅ β２６ Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ α５１ Ｃｙｓ−Ａ
ｓｐ β９４ Ｃｙｓ）および（Ｈｉｓ α９０ Ｃｙ
ｓ−Ｃｙｓ βｙ Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ酸対間
のサブユニット間非天然ジスルフィド架橋を含むことを
特徴とする請求項１３記載のゴナドトロピン。 - 【請求項１５】 （Ｐｒｏ β４ Ｃｙｓ−Ｔｈｒ β
２５ Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ β４ Ｃｙｓ−Ａｌａ β
８０ Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ β２５ Ｃｙｓ−Ａｌａ
β８０ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ β５５ Ｃｙｓ−Ｓｅｒ
β８２ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ β５５ Ｃｙｓ−Ｌｙ
ｓ β８４ Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ β５６ Ｃｙｓ−Ｌ
ｅｕ β８１ Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ β５６ Ｃｙｓ−
Ｓｅｒβ８２ Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ β６１ Ｃｙｓ−
Ｓｅｒ β７６ Ｃｙｓ）および（Ｉｌｅ β６４ Ｃ
ｙｓ−Ｐｒｏ β７３ Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ酸
対間の非天然ジスルフィド架橋を含むことを特徴とする
請求項１３または１４記載のゴナドトロピン。 - 【請求項１６】 治療物質として用いられる請求項１〜
１５のいずれか一項に記載のゴナドトロピン。 - 【請求項１７】 請求項１〜１５のいずれか一項に記載
の１種類以上のゴナドトロピンおよび医薬上許容されう
るキャリヤーを含む医薬組成物。
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