CN1154371A - 具有非天然二硫键的促性腺激素 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由α和β亚单位组成的促性腺激素，所述促性腺激素含有非天然二硫桥键。优选的是非天然亚单位间二硫键。本发明的促性腺激素的稳定性提高。本发明进一步提供了含有所述促性腺激素的药物组合物。

Description

具有非天然二硫键的促性腺激素
本发明涉及促性腺激素，含有所述促性腺激素的药物组合物以及编码所述促性腺激素的DNA。
促性腺激素形成一个结构上相关的糖蛋白激素簇。典型的成员包括绒毛促性腺激素(CG)，促滤泡激素(FSH)，促黄体生成激素(LH)和促甲状腺激素(TSH)。FSH，LH和TSH存在于大多数脊椎动物种中，并且是由垂体合成和分泌的。至今为止仅在灵长类动物，包括人，以及在马中发现了CG，并且是由胎盘组织合成的。
促性腺激素是由称为α和β的两个不相同的亚单位组成的异二聚体。这两个亚单位是通过非共价键结合的。在一个物种内，对于促性激素簇的各个成员，其α-亚单位基本上是相同的；种与种之间也是高度保守的。对于不同的成员即CG，FSH，TSH和LH，β-亚单位是不同的，但是其结构具有相当高的同源性。此外，种与种之间β-亚单位也是高度保守的。对于人，α亚单位由92个氨基酸残基组成，而β亚单位的大小随不同的簇内成员而变化：对hFSH为111个残基，hLH为121个残基，对于hTSH为118个残基，而hCG为145个残基(Combarnous，Y.(1992)，Endocrine Reviews，13，670-691，Iustbader，J.W.等人(1993)，EndocrineReviews，14，291-311)。hCG的β亚单位实质上大于其他β亚单位，其C-末端含有另外的大约34个氨基酸，在本文中将这一段称为羧基末端蛋白(CTP)。
异源二聚体的两个亚单位存在许多保守的亚单位内二硫键：α-亚单位内有五个二硫桥键并且β-亚单位内有6个二硫桥键。在促性腺激素簇的所有成员中间相应的半胱氨酸残基是完全保守的。最近获得的hCG的X-射线结构显示这些二硫键参与形成了称为二硫结的典型的三维空间图形。促性腺激素具有可以是N-糖基化的三个或四个天冬酰胺残基。另外，hCG的C-末端肽(CTP)在四个丝氨酸位置上可以是O-糖基化。
促性腺激素在各种各样的机体的功能包括代谢，温度调节和生殖过程中起着重要的作用。垂体促性腺激素FSH例如在刺激滤泡发育和成熟中起着关键性的作用而LH诱导排卵(Sharp，R.M.(1990)，ClinEndocrinol.，33，787-807，Dorringtonand Armstrong(1979)，Recent Prog.Horm.Res.，35，301-342)。目前，在临床上将FSH单独应用于或与LH活性物一起应用于刺激卵巢即体外受精(IVF)时进行卵巢的过刺激作用以及诱导不育不排卵妇女的体内排卵(Insler，V.(1988)，Int.J.Fertility，33，85-97，Navotand Rosenwaks(1988)，J.Vitro Fert.Embrgo Transfer，5，3-13)，以及应用于男性腺性功能减退症。
目前，用于治疗目的的促性腺激素是从人尿中分离到的并且是低纯度的(Morse et al(1988)，Amer.J.Reproduct.Immund.and Microbialogy，17.143)。与这些尿促性腺激素相反，重组促性腺激素具有特性不变的巨大优点，即可重复再现的生化和生物学特性。已经制备了所有亚单位的基团组和cDNA克隆，并已测出了其一级结构。而且，已经用人促性腺激素亚单位基因转染了中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，并且已经证明这些细胞能够分泌完整的二聚体(例如，Keene et al(1989)，J.Biol.Chem.，264，4769-4775；Van Wezenbeek at al(1990)，in From clone to Clinic(edsCrommelin D.J.A. and Schellekens H.)，245-251)。
从那以后，已经证实了例如重组FSH的生化和生物学特性几乎与天然FSH的特性相同(Mannaerts et al(1991)，Endocrinology，129；2623-2630)。而且，在利用重组FSH控制卵巢过多排卵之后怀孕成功(Germond et al(1992)，Lancet，339，1170，Devroey etal.(1992)，Lancet，339，1170-1171)。
两个亚单位成功地集配为二聚体是该二聚体具生物学活性的绝对必要条件。据认为异源二聚体离解为相应的亚单位是体内失去生物学活性的主要原因。再者，例如离解和脱酰胺作用的过程导致其货架期延长。因此据认为异源二聚体的热动力学稳定性是在体内和体外条件下影响促性腺激素半衰期的重要因素。因此，进一步改善促性腺激素的稳定性是临床应用的需要。
本发明提供了上面所述的促性腺激素。令人惊奇的是发现可将一个或多个非天然二硫桥键导入到促性腺激素中导致所述促性腺激素的稳定性增加。本文中所述的非天然二硫桥键是天然促性腺激素中不存在的二硫桥键，因此非天然二硫桥键并不包括在天然促性腺激素的α亚单位的五个二硫桥键中也不包括β亚单位中的六个二硫桥键。“天然”促性腺激素是那些与从有关组织中分离的促性腺激素具有相同氨基酸序列的促性腺激素。
因此，本发明提供了由含有一个或多个非天然二硫桥键的α亚单位和β亚单位组成的促性腺激素。
通过位点特异性诱变可以导入非天然二硫桥键：在相应位置上的天然氨基酸残基点突变为半胱氨酸。将点突变标记为Xαy Cys或Xβy Cys，其中X分别是α或β亚单位相应位置y上的氨基酸残基，它的分别突变为半胱氨酸(氨基酸用三字母密码表示)。标记Cysαy Cys或Cysβy Cys是指天然亚单位中y位的半胱氨酸。本发明的点突变导致促性腺激素的构型发生细微的变化。
本发明范围还包括其中仅导入一个突变的促性腺激素。可以在编码α或β亚单位的DNA中导入这样一种突变，使得到的亚单位中产生能与已经存在的半胱氨酸残基形成二硫桥键的一个新半胱氨酸残基。优选地是在α亚单位中导入这样的突变，更优选地是在88-92位氨基酸中导入这样的突变。
本发明的非天然二硫桥键可存在于氨基酸残基对之间，其中所述氨基酸残基定位于不同亚单位(亚单位之间)。另外，非天然二硫键也可存在于两个氨基酸残基定位于相同亚单位(亚单位内)的氨基酸残基对之间。非必要步骤，由于存在本发明所述的一个或多个非天然二硫键，可以使11个天然二硫桥键中的一个或多个缺失。
本发明的非天然二硫键阻止二聚体离解，从而相对天然促性腺激素而言，使其在体外和体内有较高的生物稳定性，和改善的货架期。此外，他们降低了促性腺激素多肽主链的伸展性，因此，使这些促性腺激素对脱酰胺作用的敏感性较小。脱酰胺作用是在生理条件下出现的自发过程并且以消极方式影响纯度和蛋白质稳定性。
存在非天然亚单位间和亚单位内二硫键的促性腺激素也在本发明范围内。
其中α亚单位来源于人的本发明的合适的促性腺激素包含位于一或多个氨基酸对之间的(Pheα18 Cys-Ileα25 Cys)，(Glnα20Cys-Alaα23Cys)，(Serα34Cys-Serα57Cys)，(Thrα39Cys-Thrα54Cys)，(Alaα62Cys-Hisα79Cys)，和(Lysα63Cys-Alaα81Cys)，(Tyrα65Cys-Hisα79Cys)，和(Asnα66Cys-Asnα78Cys)非天然亚单位内二硫键。
其中β亚单位是hCG的β亚单位的本发明的合适的促性腺激素可包含位于一或多个氨基酸对(Glnα5Cys-Argβ8Cys)，(Proα24Cys-Glyβ71Cys)，(Metα29Cys-Metβ41Cys)，(Argα35Cys-Alaβ35Cys)，(Tyrα37Cys-Ileβ33Cys)，(Lysα51Cys-Aspβ99Cys)和(Hisα90Cysβy Cys)之间的亚单位间二硫桥键和/或一个或多个氨基酸对(Proβ4Cys-Proβ7Cys)，(Proβ11Cys-Thrβ32Cys)，(Proβ11Cys-Alaβ85Cys)，(Thrβ32Cys-Alaβ85Cys)，(Argβ60Cys-Serβ87Cys)，(Argβ60Cys-Glnβ89Cys)，(Aspβ61Cys-Lenβ86Cys)，(Aspβ61Cys-Serβ87Cys)，(Serβ66Cys-Serβ81Cys)和(Leuβ69Cys-Proβ78Cys)之间的亚单位内二硫桥键。优选地，本发明的hCG包含位于氨基酸对(Metα29Cys-Metβ41Cys)，(Tyrα37Cys-Ileβ33Cys)，或(Lysα51Cys-Aspβ99Cys)或(Hisα90Cys-Cysβy Cys).之间的非天然，亚单位间二硫桥键。
其中β亚单位是hLH的β亚单位的本发明的合适的促性腺激素含有一个或多个氨基酸对(Glnα5Cys-Trpβ8Cys)，(Proα24Cys-Glyβ71Cys)，(Metα29Cys-Metβ41Cys)，(Argα35Cys-Alaβ35Cys)，(Tyrα37Cys-Ileβ33Cys)，(Lysα51Cys-Aspβ99Cys)和(Hisα90Cys-Cys-αy Cys)之间的亚单位间二硫桥键和/或位于一个或多个氨基酸对(Proβ4Cys-Proβ7Cys)，(Proβ11Cys-Thrβ32Cys)，(Proβ11Cys-Alaβ85Cys)，(Thrβ32Cys-Alaβ85Cys)，(Argβ60Cys-Serβ87Cys)，(Argβ60Cys-Argβ89Cys)，(Aspβ61Cys-Leuβ86Cys)，(Aspβ61Cys-Serβ87Cys)，(Serβ66Cys-Serβ81Cys)和(Lenβ69Cys-Proβ78Cys)之间的亚单位内二硫键。本发明优选的促进腺激素是hLH，包含有位于氨基酸对(Metα29Cys-Metβ41Cys)，(Tyrα37Cys-Ileβ33Cys)，(Lysα51Cys-Aspβ99Cys)或(Hisα90Cys-Cysβy Cys).之间的一个二硫键。
其中β亚单位是hFSH的β亚单位的本发明的合适的促性腺激素包含一个或多个氨基酸对(Glnα5Cys-Serβ2Cys)，(Proα24Cys-Glyβ65Cys)，(Metα29Cys-Argβ35Cys)，(Argα35Cys-Alaβ29Cys)，(Tyrα37Cys-Trpβ27Cys)，(Lysα51Cys-Aspβ93Cys)和(Hisα90Cys-Cysβy Cys)之间的一个亚单位间二硫键和/或一个或多个氨基酸对(Leuβ5Cys-Thrβ26Cys)，(leuβ5Cys-Alaβ79Cys)，(Thrβ26Cys-Alaβ79Cys)，(Lysβ54Cys-Glnβ81Cys)，(Lysβ54Cys-Hisβ83Cys)，(Gluβ55Cys-Thrβ80Cys)，(Gluβ55Cys-Glnβ81Cys)，(Thrβ60Cys-Thrβ75Cys)和(Valβ63Cys-Serβ72Cys).之间一个亚单位内二硫键。本发明优选的促性腺激素是hFSH其中β亚单位含有位于氨基酸对(Tyrα37Cys-Trpβ27Cys)或(Hisα90Cys-CysβgCys)之间的亚单位间二硫键。
其中β亚单位是hTSH的β亚单位的本发明的合适的促性腺激素包含一个或多个氨基酸对(Glnα5Cys-Pheβ1Cys)，(Proα24Cys-Glyβ66Cys)，(Metα29Cys-Argβ34Cys)，(Argα35Cys-Alaβ28Cys)，(Tyrα37Cys-Ileβ26Cys)，(Lysα51Cys-Aspβ94Cys)和(Hisα90Cys-Cysβy Cys)之间的亚单位间二硫桥键和/或位于一个或多个氨基酸对(Proβ4Cys-Thrβ25Cys)，(Proβ4Cys-Alaβ80Cys)，(Thrβ25Cys-Alaβ80Cys)，(Argβ55Cys-Serβ82Cys)，(Argβ55Cys-Lysβ84Cys)，(Aspβ56Cys-Leuβ81Cys)，(Aspβ56Cys-Serβ82Cys)，(Thrβ61Cys-Serβ76Cys)和(Ileβ64Cys-Proβ73Cys)之间的亚单位内二硫键。
显然亚疸位间和内非天然二硫键的组合也在本发明范围内。
上文中列出的突变位点是指人促性腺激素的氨基酸序列。该促性腺激素的亚单位内相当于其他种的非天然二硫键也在本发明范围内。根据将所述促性腺激素亚单位与人促性腺激素亚单位进行序列排列结果可以推导出突变为半胱氨酸的氨酸酸残基的精确位置。
由于亚单位折迭和组装期间二硫键键合起主要作用，令人十分惊奇的是导入本发明的非天然二硫键并不干扰形成正确折迭的促性腺激素。正确二硫键的形成是功能性促性腺激素进行折迭和成熟的关键步骤。尤其是β亚单位内二硫键的形成是关键：所有二硫键是有效结合和折迭所必需的。对hCG折迭的详细研究结果显示该分子的折迭并不由简单的连续途径着手进行的，但是在该分子的不同区域单独进行的。因此可认为在α和/或β亚单位内导入其他的半胱氨酸残基将干扰折迭过程，导致该分子失去构象并且结果使该分子失去了功能和生物活性。特别是。因为有如此多的半胱氨酸已经存在于这些分子中。
本发明所述的点突变为半胱氨酸仅勉强改变总体氨基酸组分和蛋白质特性，因此，本发明的促性腺激素具有其它优点即它们潜在的免疫原性实质上不同于野生型促性腺激素的免疫原性。特别是，当非天然二硫桥键定位于促性腺激素的二聚体界面时，可以忽略对免疫原性的影响。
依据突变位点不同，本发明所述的促性腺激素可以是激动剂或拮抗剂。如在前面介绍的，突变位点可以导致分子构型的细微变化。如果突变位点选定于与受体结合和/或信号转导的相关的蛋白质部分，则本发明所述的非天然二硫键可导致与糖蛋白稳定性增加相结合的信号转导活性的部分或全部丧失。因此本发明提供了稳定性增加的拮抗剂。如果突变位点选定于糖蛋白惰性核心的二聚体界面处，则得到的非天然二硫桥键不会影响受体结合和/或信号转导活性，但是将会引起其与天然促性腺激素相比稳定性增强。所述突变导致产生稳定性增强的促性腺激素拮抗剂。
本发明的促性腺激素可包含本领域内已知的其他修饰形式。
在本发明所述的促性腺激素的这样一种优选修饰形式中，亚单位之一的氨基酸序列的C-末端，必要时借助于一个连接分子部分，连接到另一个亚单位的氨基酸序列的N-末端上。优选地连接分子是整个或部分CTP单位或其变异体。
本发明促性腺激素的另一种修饰形式可以是在α和/或β亚单位的带有一个完整的或部分CTP单位或其变异体形式的各N-或C-末端的一个延伸部分。该延伸部分可包含单个或多个形式的相应的CTP单位。换一种方法，可以在所述亚单位的N-或C-末端插入一个完整CTP单位或部分CTP单位或其多个形式。
此外，本发明的促性腺激素可以是糖基化形式，部分糖基化或非糖基化形式。通过化学修饰，酶修饰或通过位点特异性诱变可以获得本发明的部分或非糖基化的促性腺激素，所述修饰和诱变去除了促性腺激素中的一个或多个糖基化识别位点。另一种可选方法，通过导入其他的糖基化识别位点和必要时，去除一个或多个糖基化识别位点可以对本发明的促性腺激素的糖基化形式进行修饰，结果导致得到经修饰的糖基化的所述促性腺激素。本发明中使用的糖基化识别位点由Asn-X-Ser/Thr氨基酸序列组成，其中X可以是任何氨基酸。
如本文中使用的，通常CG，FSH，LH和TSH的α和β亚单位以及其异源二聚体形式有其习惯的定义，并且是指具有本领域已知的氨基酸序列的蛋白质，或其等位变异体，不论是否是糖基化形式。
这些蛋白质的“天然”形式是那些具有相同于从有关的脊椎动物组织中分离的氨基酸序列并且具有这些本身已知的序列的蛋白质，或其等位变导体。
这些“变异体”是那些与天然蛋白质相比其氨基酸序列发生任意变化的蛋白质。这种变化可包括单个呈多个缺失，插入，替代和它们的组合并且可以通过例如位点特异性诱变或通过其他重组操作产生或者可以通过合成制备。优选的这些变化由保守的氨基酸替代组成，其中被替代的残基是相似于该残基的一般氨基酸类型，以使有利于发生这种取代。这种氨基酸分类是通常是本领域内已知的并且例如由Dayhoff，M.et al，Atlas ofProtein Sequence and Structure，1972，S，89-99描述。
如本文中使用的，“CTP”单位是指在hCG的β亚单位的羧基末端存在的氨基酸序列，该单位长度是从112-118位氨基酸延伸至C-末端的145位残基或延伸到其一部分。由CTP的N-末端决定了一个“完整的”CTP单位含有28-34个氨基酸。“部分”CTP单位是在112-118位至包括145位之间出现的一个氨基酸序列，但是至少从尽可能最短的完整CTP单位(118位-145位氨基酸)中缺失了至少一个氨基酸。“多个”CTP单位是指包含完整CTP单位或部分CTP单位或两者组合体的串联排列。
编码本发明促性腺激素的DNA也在本发明范围内。本发明所说DNA包括一个或多个编码半胱氨酸的密码子，所述密码子已被编码将被替代的氨基酸的密码子所替代。通过在所述DNA中用编码半胱氨酸的密码子替代编码将要被替代的氨基酸残基的一个或多个密码子可以从编码天然促性腺激素或其变异体的DNA获得本发明的DNA。采用位点特异性诱变可以完成这些替代。
构建本发明促性腺激素的方法是本领域内熟知的(Sambrooket al.，Molecular Cloning：a LaboratorgManual，(old Spring Harbor LaboratorgPress，Cold Spring Harbor，Latestedition)。最有效的方法是通过表达编码所需蛋白质的DNA可以生产这些促性腺激素。位点特异性诱变技术，与其他序列连接的技术，PCR和构建合适表达系统的技术都是目前本领域内技术人员熟知的。利用标准的固相技术可以通过合成构建编码所需蛋白质的完整或部分DNA，优选地它包括易于连接的限制性位点。可以给DNA编码序列提供用于所含有编码序列转译和转录的合适的控制元件。正如公知的，目前可以购买与各种各样的宿主包括原核宿主例如细菌和真核宿主例如酵母，植物细胞，昆虫细胞，哺乳动物细胞，鸟类细胞等等相容的表达系统。宿主的选择特别取决于转译后的处理，最主要的是取决于糖基化过程。发生糖基化的位置主要受该分子内糖基化位点的特性控制的。但是，占据该位点的糖的特性主要受宿主的特性控制的。
本发明的促性腺激素可用于相同于天然促性腺激素的临床目的，优点是它们显示出具有改善的稳定性。根据突变类型的不同突变的促性腺激素可用作为激动剂或拮抗剂。本发明所述的合适的药物组合物含有一种或多种本发明的促性腺激素和一种药物学可接受的载体。
药物学上可接受载体是本领域内技术人员熟知的并且例如包括无菌盐水，乳糖，蔗糖，磷酸钙，明胶，葡聚糖，琼脂，果胶，花生油，棕榈油，芝麻油和水。
此外本发明的药物组合物可包含一种或多种稳定剂例如碳水化合物包括山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖葡聚糖和蔗糖，蛋白质例如白蛋白或酷蛋白和缓冲液例如碱性磷酸盐。
合适的给药途径是肌内注射，皮下注射，静脉注射或腹膜注射，口服和鼻内给药。
下面实施例是用于描述本发明并且不应以任何方式理解为限制本发明范围。
附图描述
图1：hCG×gβc表达质粒pMKS.hCGαcβc的结构。SV40＝SV40早期启动子。E＝M-MuLV加强子。MT-IIA＝人金属硫蛋白-IIA启动子。hCGαg＝编码hCGα亚单位的基因组hCGα小基因。hCGβc＝编码hCGβ亚单位的cDNA。β-球蛋白＝兔β-球蛋白聚腺苷化序列和拼接信号。S＝SV40转译终止序列。pBR327＝含有大肠杆菌复制源和提供氨苄青霉素抗性基因的部分质粒pBR327。
附图2：对hCG间链1，hCG间链2和hCG野生型的细胞培养上清液的Western印迹分析，分析其hCG(突变蛋白)的表达和亚单位间二硫键的形成。在室温(小组A)或100℃(小组B和C)时，将G418抗性转染库hCG间链1，hCG间链2和来自含有约0.2IV hCG的垂组-hCG野生型的细胞培养上清液溶解于没有(小组A和B)或有β-巯基乙醇(小组C)的含有SDS的样品缓冲液中。在经过电泳和转移到PVDF膜之后，通过首先与β-hCG特异性单克隆抗体培养，随后用第二抗体-HRP共轭物一起培养并且用TMB染色可以肉眼观察到hCG。正如所看到的，在室温(小时A，泳道1和2)和100℃(小组B泳道1和2)溶解时两种情况都导被检测到完整激素，而对于对照(WT-hCG)；煮沸时将该激素离解为其亚单位(小组B泳道3)。在所有三个样品中(小组C)加入还原剂致其离解为亚单位。因此将这些资料结合在一起可得出结论HCG间链1和2都是通过分子间二硫键而稳定的。
图3：hCG亚单位间突变蛋白的hCG替代分析。B/Bo＝结合总百分数…-+-＝hCG野生型(WT)-△-＝hCG间链1。-O-＝hCG间链2。
附图4：hCG亚单位间突变蛋白的体外生物活性。-+＝＝I，S75/537。-△-＝hCG间链1。-O-＝hCG间链2。
附图5：重组hCG制剂肌肉注射到雌性Beagle狗之后血浆中hCG含量。
附图6：野生型hCG和hCG间链突变蛋白与稳定表达人LH/CG受体的CHO细胞膜的结合活性。在有或没有各种浓度的未标记野生型hCG或间链bCG的将该膜与125I-标记的hCG一起培养。替代曲线表示为在各个剂量的非标记的激素时最大结合百分数。
附图7：野生型hCG和间链hCG分子的体外生物活性。在刺激稳定表达人LH/CG受体的CHO细胞之后采用特异性RIA检测胞外CAMP。
附图8：野生型hCG，野生型LH和LH间链突变体与能稳定表达人LH/CG受体的CHO细胞的膜的结合活性。在没有或有各种浓度的未标记野生型hCG，野生型LH或间链LH的情况下将该膜与125I-标记的hCG一起培养。替代曲线表示为各个剂量的未标记激素最大结合百分数。
附图9：野生型FSH和FSH间链突变体与稳定表达人FSH受体的CHO细胞的膜的结合活性。在有或没有各种浓度的未标记野生型FSH或间链FSH时将该膜与125I-标记的FSH一起培养。替代曲线表示为各个剂量未标记激素的最大结合百分数。
                          实施例1
间链突变蛋白的生产
载体构建
制备三个构建体以表达含有附加的链间二硫键的hCG突变蛋白。它们的结构和总的构造基本上等同于pKMS.hCGαgβc，该载体用于在CHO细胞中表达重组野生型hCG(附图1)。在pKMS中已经插入了相应的hCGα(Fiddes，J.C.和Goodman H.M.(1981)，J.Mol.Appl.Genet.1，3-18)和β亚单位基因(Fiddes，J.C.和Goodman，H.M.(1980)Nature 286，684-687)。通过将cDNA克隆与基因组克隆结合，制备了完整的“杂合”hCGα基因(Van Wezenbeeket al.1990)，它能够通过转染至宿主细胞中而表达野生型α亚单位。按照描述分离编码hCGβ的cDNA并且与pKMS.FSH载体中的FSHβ交换。β基因的转录是由SV40早期启动子指导的，而β基因是从人重金属可诱导的金属硫蛋白IIa启动子转录的。制备了三个hCG间链构建体(表1)。
为了构建在hCG间链1突变的α亚单位，以这样的方式：即将编码酪氨酸α37的密码子改变为编码半胱氨酸的密码子方式在“杂合”hCGα基因中导入特定的碱基替代。这可以通过采用位点特异性诱变和按照Erich描述的(Erich，H.A.(1989)PCR Technology，Principles and Application for DNAamplification。Stockton Press，New-York，pp 63-66)序列重叠的结合PCR片段，利用标准的PCR条件来完成的。将PCR片段分离开，亚克隆到pGEM3Z中并且利用自动测序仪(Pharmacia)进行检测。以下列方式选择引物即：亚克隆的PCR片段含有3’和5’突变的合适限制性位点以便它可以与pKMS.hCGαgβc中的天然α链序列进行交换。利用标准技术可完成这一步骤。为了构建hCG-间链1中空变的β亚单位，以下列方式在hCGβ中导入特定的碱基替代：即将编码异亮氨酸β33的密码子改变为编码半胱氨酸的密码子。利用类似于用于构建α亚单位突变的方法，可以完成诱变PDR反应，亚克隆和测序。为了构建hCG间链1的最终表达质粒，将hCGβc野生型基因与pKMS.hCGαgβc构建体中的突变hCGβ片段进行交换，所述构建体已经含有α亚单位突变。
为了构建编码hCG-间链2的载体(其中编码赖氨酸α51和天冬酰胺β99的密码子已被半胱氨酸编码密码子替代)和编码hCG-间链3的载体(其中编码蛋氨酸α29的密码子和编码甲硫氨酸β41的密码子已被编码半胱氨酸的密码子替代)，下面提供了相应方案。
表1，hCG中突变的半胱氨酸密码子
  hCG突变蛋白             密码子
hCG间链1hCG间链2hCG间链3 Tyrα37Cys-Ileβ33CysLysα51Cys-Aspβ99CysMetα29Cys-Metβ41Cys
CHO细胞的转染和选择
利用Transfectam试剂(Promega)用10μg的pKMS.hCG间链构建体稳定地转染CHOK1细胞(ATCC CCL61)。以10∶1的摩尔比(过量的PKMS hCG-间链)共转染含有新霉素选择性基因的一个选择质粒以便可以在含有G418(0.8mg/ml)的培养基中选择细胞。
筛选可以分泌免疫反应蛋白质的重组CHO细胞。利用α和β特异性单克隆抗体进行的hCG夹层ELISA分析中细胞培养上清液反应显示阳性。培养上清液的Western印迹分析显示hCG间链突变蛋白具有的分子量大小类似于rec-hCG野生型的大小。
                   实施例2
亚单位间二硫键形成的分析
为了测定新导入的半胱氨酸是否已氧化为亚单位间二硫键，通过煮沸将G418抗性转染库的细胞培养上清液的样本溶于含有SDS的样品缓冲液中，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移到PVDF膜上。利用抗β亚单位的单克隆抗体进行免疫染色，随后用结合到辣根过氧化酶(HRP)的第二抗体培养，并用四甲基联苯胺(TMB)/Co#/H2O2进行染色而观察hCG。当形成亚单位间二硫键时，在SDS样品缓冲液中煮沸样品可以保持两个亚单位连在一起，而如果没有二硫键形成的话，这样的溶解条件导致离解为亚单位。对照试验中在室温(完整hCG没有还原剂条件下以及通过加入β-巯基乙醇(βME)可溶解样品。对于后一种情况，不论是否存在链间二硫键都将会出现变性为亚单位的情况。如在图2中看到的，小组A，在没有βME的室温下溶解时，可以检测到完整野生型hCG(泳道3，分子量大约50KD)以及一些游离β亚单位(分子量约32KD)。来自HCG链间1和HCG链间2的样品也含有大约相同的大小的免疫反应物质，表明存在有完整hCG突变蛋白。由于消失了50KD谱带(小组B泳道3)可证明通过加热，野生型hCG离解为亚单位。相反，用hCG突变体不会出现这种情况(小组B，泳道1和2)，表明存在有分子间共价键合。最后加入βME证明由于加入还原剂将hCG和突变体离解为亚单位(小组C)因而2个亚单位之间产生了分子间的二硫键键合。
                 实施例3
LH/CG受体结合
在hCG的作用机理中与LH/CG受体的结合是第一步骤。利用体外受体分析，通过将碘化的hCG替代为大鼠睾丸膜(Rao，M.C.etal.，Endocrionlogy(1977)101：512-523)可以测定hCG链间突变蛋白的相对受体结合潜力。为此，将固定量的[125I]hCG与大鼠睾丸膜和量逐渐增加的样品一起在室温下培养18小时。为了估测最大结合情况在没有样品情况下进行另外培养。通过加入过量1000倍的未标记的配体测定非特异性结合情况(Pregnyl，Organon，West Orange，NJ)。通过用补充了0.1％BSA的冰冷Tris缓冲液将样品稀释2倍终止培养，并在室温下以150.000×N.kg-1离心5分钟。在吸出上清液之后，利用υ计数器测出沉淀的放射活性。
hCG间链1显示的碘化的hCG的替代曲线类似于rec-hCG野生型(参见附图3)。这证实了hCG间链1的亚单位间二硫键对受体结合没有影响，表明该突变蛋白的构型的确类似于rec-hCG野生型。由hCG链间2对碘化的hCG的替代被稍微减弱。可推测这是由于下列事实。该链间二硫桥键定位于为受体结合和信号处理重要的一个区域。
                      实施例4
hCG诱导的睾丸激素的生产
在鼠Leydig细胞中hCG诱导睾丸激素的生产。利用由Mannaerts等人(Neuroendocrinology of reproduation，(1987)，R.Rolland et al.(eds.)，Elsevier Sciencl Publishers B.V.，49-58)改良的体外分析法(Van Damme et al.，Acta Endocrinal.(1974)77，655-671)测定含有链间二硫键的hCG突变蛋白的hCG生物活性(图4)。用hCG间链1处理细胞导致睾丸激素生产以相似于rec-hCG野生型的的效力呈剂量依赖性增加。因此，hCG间链1可被看作为十足的hCG激动剂。相反，hCG链间2的信号转导能力降至0，表明hCG链间2可用作为野生型hCG的完全拮抗剂。
                   实施例5
在雌性beagle狗中的药物动力学行为
在通过肌肉注射到雌性beagle狗中之后检测hCG链间1的药物动力学行为。两条狗接受hCG链间1的单次肌肉注射，剂量为25(hCGEIA)IU/kg。在注射之前和在注射之后30分钟和1，1.5，2，3，4，6，8，24，48，72，96，120，144，168，192，216，240和264小时收取血样品。用对狗血浆有效的hCG特定时间溶解的荧光免疫检测方法(hCG-DELFIA)检测免疫反应hCG链间1的血浆水平。附图5显示了hCG链间1的清除曲线。为了进行比较在附图5中也显示了三只狗中肌内给药之后hCG(重组hCG，25hCGEIA IU/kg)的清除曲线。表2中显示了从清除曲线得到的药物动力学参数AUC(相对于时间的血浆水平曲线下面积)，Cmax(峰值浓度)，tmax(达到峰值浓度的时间，t1/2(血清清除的半寿期)和CL(清除速率)。在144和240小时时间点之间测定的值用于测定t1/2。
对肌内注射的hCG间链1与肌内注射的rec-hCG进行比较，结果显示hCG间链1有较高的AUC和t1/2值以及对于CL其AUC和t1/2值较低，而对于Cmax和tmax的值也相当。从hCG间链1与rec-hCG的动力学比较结果可总结出hCG间链1显示较低的清除速率和较长的半寿期。
表2hCG间链1与rec-hCG的药物动力学参数
rec-hCG野生型 hCG间链1
AUC(mU.h/注射的每个U的ml)Cmax(mU/注射的每个U的ml)Tmax(h)t1/2(h)清除(ml/h/kg) 13.51±0.910.51±0.073.35±0.6846.00±7.095.68±1.06 19.27±0.780.51±0.043.58±0.5556.32±10.84.63±0.11
                  实施例6
hCG间链4(Glnα5Cys-Argβ8Cys)载体构建和表达
制备一种表达hCG突变蛋白的构建体，该hCG含有另一种附加的链间二硫键。其结构和总的构造基本上相同于pKMS.hCGαgβc(附图1)，不同的是导入了新的突变。以下述方式在‘杂合’hCGα基因中导入特定的碱基取代，所述方式是将编码谷氨酰胺α5的密码子改变为编码半胱氨酸密码子并且在hCGβ基因中将编码精氨酸β8的密码子改变为编码半胱氨酸密码子。按照类似于其它突变蛋白的方式完成CHO细胞的构建和随后的转染和选择。实施例2中描述的蛋白质分析显示由一个二硫键引起2个亚单位间的分子间键合。
生物活性
在人受体上测定受体结合活性和体外生物活性(Jia，X.et al.(1991)，Molecular Endocrinology5，759-768)。如在稳定转染的CHO细胞系中表达的，用放射性配体受体替代分析试验，在从指数生长期细胞分离的膜组分上定量检测hCG间链4的受体结合活性。在0.5ml的总体积中将大约100μg的膜蛋白与固定量的125I-hCG(20,000cpm，大约12pM)和逐渐增加量的竞争性hCG一起在室温下培养18小时。125I-标记的hCG(NEX-106)是从Du Pontde Nenours获得的。通常特定的结合是加入10-12％的总125I-hCG。在培养之后通过离心分离结合的和游离的激素。以高度纯化的，重组hCG用作为标准。
hCG间链4显示与野生型hCG相比碘化的hCG的替代稍微被较低(附图6)。
hCG在含有人LH/CG受体的CHO细胞中诱导产生cAMP。利用体外生物分析试验测定hCG间链4的hCG生物活性。在0.1mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤存在下用浓度逐渐增加的hCG间链4将细胞培养4小时结果导致cAMP的生产呈剂量依赖性增加(由RIA测定胞外cAMP浓度(Immunotech)，其效力类似于rec-hCG野生型(附图7)。因此，可认为hCG间链4是完全的hCG激动剂。
                   实施例7
hCG间链5(Argα35Cys-Alaβ35Cys)
通过分别在α链的35位和β链的35位由半胱氨酸残基替代精氨酸和丙氨酸而产生hCG间链5。
按照用于其他hCG间链的方法选择分泌免疫反应蛋白质的重组CHO细胞。在利用αβ特异性单克隆抗体的hCG夹层ELISA分析试验中培养物上清液反应呈阳性。采用如实施例2中描述的蛋白质分析方法显示由一个二硫键引导2个亚单位间的分子间键合。
在受体结合活性试验中，与野生型hCG相比，其被碘化hCG的替代作用被稍微减少(图6)。在体外生物检测中，显示hCG间链5的效力相当于rec-hCG野生型(附图7)。因此，可认为hCG间链5是完全的hCG激动剂。
                    实施例8
hCG间链6(Hisα90Cys-Cysβy Cys)
通过在α链的90位用一个半胱氨酸替代组氨酸而制备HCG间链6。
按照用于其他hCG间链的方法选择分泌免疫反应蛋白质的重组CHO细胞。在利用α和β特异性单克隆抗体的hCG夹层ELISA分析试验中培养物上清液反应呈阳性。采用如实施例2中描述的蛋白质分析方法显示由一个二硫键引导2个亚单位间的分子间键合。
在受体结合活性试验中，其被碘化hCG的替代作用相当于野生型hCG。在体外生物检测中，显示hCG间链6的效力是微不足道的。因此，可认为hCG间链6是完整的hCG拮抗剂。
                    实施例9
LH间链1(Glnα5Cys-Trpβ8Cys)
制备表达LH突变蛋白的构建体，该突变蛋白含有另外的链间二硫键。按照描述(Talmadge et al.，Natare(1984)307，37-40)分离编码LHβ的CDNA并且与载体pKMS.FSHαgβg中的FSHβ交换(Van Wezenbeek et al.，1990)。
为了构建LH间链1的α链突变体，以下列方式在‘杂合’α基因中导入特定的碱基替代，即编码谷氨酸α5的密码子改变为编码半胱氨酸的密码子。
以下列方式在LHβ中导入特定的碱基替代，即将密码色氨酸β8的密码子改变为编码半胱氨酸的密码子。利用类似于在制备hCG中描述的方法完成诱变PCR反应，亚克隆和测序。在转染CHO K1细胞(ATCCCCL61)中表达突变的蛋白质。选择能分泌免疫反应蛋白的重组CHO细胞。在利用α和β的特异性单克隆抗体进行的LH夹层ELISA试验中培养物上清液反应呈阳性。按实施例2描述的蛋白质分析显示由二硫键引起2个亚单位间分子间的键合。
用在稳定转染的CHO细胞系表达的人受体进行受体结合活性和体外生物活性测定(Jia et al.)。LH间链1显示碘化hCG的替代类似于野生型LH(附图8)。
                   实施例10
LH间链2(Argα35Cys-Alaβ35Cys)
分别在α链的35位和β链的35位用半胱氨酸残基替代精氨酸和丙氨酸。
按照对于其他hCG间链时描述的方法选择能分泌免疫反应蛋白质的重组CHO细胞。在利用α和β特异性单克隆抗体的LH夹层ELISA分析中培养物上清液反应呈阳性。
在受体结合活性分析中发现碘化的hCG的替代类似于野生型hCG(附图8)。
                     实施例11
LH间链1(Glnα5Cys-Serβ2Cys)
制备能表达FSH突变蛋白的构建体，该突变蛋白含有另一个链间二硫键。其结构和总的构造基本上相同于pKMS.FSHαgβg，该载体用于在CHO细胞中表达重组野生型FSH。分别在FSH和β亚单位基因的相应氨基酸位置5(Gln)和2(Ser)导入碱基替代，导致产生半胱氨酸密码子(参见Keene et al，(1989)，J.Biol.Chem。264：4769-4775(1989)r β基因序列)。筛选可分泌免疫反应蛋白质的转染重组CHO细胞。在利用α和β特异性单克隆抗体的FSH夹层ELISA分析中培养物上清液反应呈阳性。
在由稳定转染的CHO细胞系表达的人受体(Minegish etal，(1991)Bioohem。Biophys.Res.Comm.175，1125-1130)上测定受体结合活性和体外生物活性。在从指数生长期细胞分离到的膜组分上进行放射性配体受体替代分析定量检测FSH间链1的受体结合活性。在0.5ml的总体积中用固定量的125I-FSH(20,000cpm，大约12PM)和逐渐增加量的竞争性FSH与约100μg的膜蛋白在室温下培养18小时。125I-标记的FSH(NEX-106)是从Du Pont de Nemours获得的。通常特定的结合是加入10-12％总125I-FSH。在培养之后，通过离心分离结合和游离的激素。以高度纯化的重组FSH用作标准。FSH间链1显示碘化FSH的替代作用类似于野生型FSH(附图9)。
                    实施例12
FSH间链2(Tyrα37Cys-Trpβ27Cys)
通过在α链的37位和β链的27位分别用半胱氨酸残基替代而生产FSH间链Z。
按照对于其他hCG间链描述的方法筛选能够分泌免疫反应蛋白质的重组CHO细胞。在利用α和β特异性单克隆抗体进行的FSH夹层ELISA分析中培养物上清液反应呈阳性。
在受体-结合活性分析中碘化的FSH的替代类似于野生型FSH(附图9)。

Claims (17)

1、由α亚单位和β亚单位组成的促性腺激素，其特征在于所述促性腺激素包含一个或多个非天然二硫键。
2、根据权利要求1所述促性腺激素，其特征在于非天然二硫键是亚单位间二硫键。
3、根据权利要求1所述促性腺激素，其特征在于所述促性腺激素包含一个或多个氨基酸对(Pheα18Cys-Ileα25Cys)，(Glnα20Cys-Alaα23Cys)，(Serα34Cys-Serα57Cys)，(Thrα39Cys-Thrα54Cys)，(Alaα62Cys-Hisα79Cys)，和(Lysα63Cys-Alaα81Cys)，(Tyrα65Cys-Hisα79Cys)，和(Asnα66Cys-Asnα78Cys)之间的一个非天然二硫键。
4、根据权利要求1-3中任一项所述促性腺激素，其特征在于β亚单位是hCG的β亚单位。
5、根据权利要求4所述促性腺激素，其特征在于所述促性腺激素在一个或多个氨基酸对(Glnα5Cys-Argβ8Cys)，(Proα24Cys-Glyβ71Cys)，(Metα29Cys-Metβ41Cys)，(Argα35Cys-Alaβ35Cys)，(Tyrα37Cys-Ileβ33Cys)，(Lysα51Cys-Aspβ99Cys)和(Hisα90Cys-CysβyCys)之间包含一个非天然亚单位间二硫键。
6、根据权利要求4或5所述促性腺激素，其特征在于所述促性腺激素在一个或多个氨基酸对(Proβ4Cys-Proβ7Cys)，(Proβ11Cys-Thrβ32Cys)，(Proβ11Cys-Alaβ85Cys)，(Thrβ32Cys-Alaβ85Cys)，(Argβ60Cys-Serβ87Cys)，(Argβ60Cys-Glnβ89Cys)，(Aspβ61Cys-Leuβ86Cys)，(Aspβ61Cys-Serβ87Cys)，(Serβ66Cys-Serβ81Cys)和(Leuβ69Cys-Proβ78Cys)之间的一个非天然二硫键。
7、根据权利要求1-3任一项所述的促性腺激素，其特征在于β亚单位是LH的β亚单位。
8、根据权利要求7所述促性腺激素，其特征在于所述促性腺激素在一个或多个氨基酸对(Glnα5Cys-Trpβ8Cys)，(Proα24Cys-Glyβ71Cys)，(Metα29Cys-Metβ41Cys)，(Argα35Cys-Alaβ35Cys)，(Tyrα37Cys-Ileβ33Cys)，(Lysα51Cys-Aspβ99Cys)和(Hisα90Cys-CysβyCys)之间含有非天然亚单位间二硫键。
9、根据权利要求7或8所述促性腺激素，其特征在于所述促性腺激素含有在一个或多个氨基酸对(Proβ4Cys-Proβ7Cys)，(Proβ11Cys-Thrβ32Cys)，(Proβ11Cys-Alaβ85Cys)，(Thrβ32Cys-Alaβ85Cys)，(Argβ60Cys-Serβ87Cys)，(Argβ60Cys-Argβ89Cys)，(Aspβ61Cys-Leuβ86Cys)，(Aspβ61Cys-Serβ87Cys)，(Serβ66Cys-Serβ81Cys)和(Leuβ69Cys-Proβ78Cys)之间的非天然二硫键。
10  权利要求1-3任一项所述促性腺激素，其特征在于β亚单位是FSHβ亚单位。
11、根据权利要求10所述促性腺激素，其特征在于所述促性腺激素在一个或多个氨基酸对(Glnα5Cys-Serβ2Cys)，(Proαα24Cys-Glyβ65Cys)，(Metα29Cys-Argβ35Cys)，(Argα35Cys-Alaβ29Cys)，(Tyrα37Cys-Trpβ27Cys)，(Lysα51Cys-Aspβ93Cys)和(Hisα90Cys-CysβyCys)之间的一个非天然亚单位间二硫键。
12、根据权利要求10或11所述的促性腺激素，其特征在于所述促性腺激素在一个或多个氨基酸对(Leuβ5Cys-Thrβ26Cys)，(Leuβ5Cys-Alaβ79Cys)，(Thrβ26Cys-Alaβ79Cys)，(Lysβ54Cys-Glnβ81Cys)，(Lysβ54Cys-Hisβ83Cys)，(Gluβ55Cys-Thrβ80Cys)，(Gluβ55Cys-Glnβ81Cys)，(Thrβ60Cys-Thrβ75Cys)and(Valβ63Cys-Serβ72Cys)之间包含非天然二硫键。
13、根据权利要求1-3任一项所述促性腺激素，其特征在于β亚单位是TSH的β亚单位。
14、根据权利要求13所述促性腺激素，其特征在于促性腺激素含有在二个或多个氨基酸对(Glnα5Cys-Pheβ1Cys)，(Proα24Cys-Glyβ66Cys)，(Metα29Cys-Argβ34Cys)，(Argα35Cys-Alaβ28Cys)，(Tyrα37Cys-Ileβ26Cys)，(Lysα51Cys-Aspβ94Cys)和(Hisα90Cys-CysβyCys)之间的非天然亚单位间二硫键。
15、根据权利要求13或14所述促性腺激素，其特征在于所述促性腺激素在一个或多个氨基酸对(Proβ4Cys-Thrβ25Cys)，(Proβ4Cys-Alaβ80Cys)，(Thrβ25Cys-Alaβ80Cys)，(Argβ55Cys-Serβ82Cys)，(Argβ55Cys-Lysβ84Cys)，(Aspβ56Cys-Leuβ81Cys)，(Aspβ56Cys-Serβ82Cys)，(Thrβ61Cys-Serβ76Cys)和(Ileβ64Cys-Proβ73Cys)之间的一个非天然二硫键。
16、根据权利要求1-15所述的促性腺激素用作治疗物质。
17、药物组合物，含有权利要求1-15的一种或多种促性腺激素和一种药物学上可接受载体。
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