HU222043B1 - Nem natív diszulfidhidakat tartalmazó gonadotropinok - Google Patents
Nem natív diszulfidhidakat tartalmazó gonadotropinok Download PDFInfo
- Publication number
- HU222043B1 HU222043B1 HU9602923A HUP9602923A HU222043B1 HU 222043 B1 HU222043 B1 HU 222043B1 HU 9602923 A HU9602923 A HU 9602923A HU P9602923 A HUP9602923 A HU P9602923A HU 222043 B1 HU222043 B1 HU 222043B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- hcg
- gonadotropin
- subunit
- gonadotropins
- amino acids
- Prior art date
Links
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 title claims abstract description 98
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 title claims abstract description 98
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 title claims abstract description 98
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 title abstract description 67
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 32
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims 2
- 101000619708 Homo sapiens Peroxiredoxin-6 Proteins 0.000 claims 1
- 102100022239 Peroxiredoxin-6 Human genes 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 35
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 32
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 32
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 32
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 30
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 28
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 28
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 26
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 23
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 21
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 16
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 15
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 15
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 12
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 10
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 9
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 9
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- -1 cysteine amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 6
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 5
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 5
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 5
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 102000003864 Human Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 4
- 108010082302 Human Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 4
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 3
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 3
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 2
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 2
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 2
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 2
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002287 radioligand Substances 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 description 1
- JDKLPDJLXHXHNV-MFVUMRCOSA-N (3s,6s,9r,12s,15s,23s)-15-[[(2s)-2-acetamidohexanoyl]amino]-9-benzyl-6-[3-(diaminomethylideneamino)propyl]-12-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-3-(1h-indol-3-ylmethyl)-2,5,8,11,14,17-hexaoxo-1,4,7,10,13,18-hexazacyclotricosane-23-carboxamide Chemical compound C([C@@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)C[C@@H](C(N[C@@H](CC=2NC=NC=2)C(=O)N1)=O)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCCC)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 JDKLPDJLXHXHNV-MFVUMRCOSA-N 0.000 description 1
- APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 3 Isobutyl 1 methylxanthine Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(CC(C)C)C2=C1N=CN2 APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 101710201349 Metallothionein B Proteins 0.000 description 1
- 102100031347 Metallothionein-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710094505 Metallothionein-2 Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033266 Ovarian Hyperstimulation Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 102000002287 alpha Subunit Glycoprotein Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010000732 alpha Subunit Glycoprotein Hormones Proteins 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000002513 anti-ovulatory effect Effects 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 102000035824 beta Subunit Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010081485 beta Subunit Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003491 cAMP production Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 230000008217 follicular development Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000002332 leydig cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000001592 luteinising effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 210000005059 placental tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 229940064298 pregnyl Drugs 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000027272 reproductive process Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/85—Reproductive organs or embryos
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
A találmány tárgyát egy vagy több – előnyösen alegységeket összekötő –nem natív diszulfidhidat tartalmazó gonadotropinok, a gonadotropinokattartalmazó gyógyászati készítmények és a gonadotropinokat kódoló DNS-ek képezik. A találmány szerinti, megnövekedett stabilitásúgonadotropinok a természetes gonadotropinokkal azonos terápiás célokraalkalmazhatók. ŕ
Description
A találmány tárgyát egy vagy több - előnyösen alegységeket összekötő - nem natív diszulfidhidat tartalmazó gonadotropinok, a gonadotropinokat tartalmazó gyógyászati készítmények, valamint a gonadotropinokat kódoló DNS-ek képezik.
A találmány szerinti, megnövekedett stabilitású gonadotropinok a természetes gonadotropinokkal azonos terápiás célokra alkalmazhatók.
A gonadotropinok, egymással strukturális rokonságban álló glikoprotein-hormonok családját képezik. Tipikus tagjai a choriogonadotropin (CG), a follikuluszstimuláló hormon (FSH), a luteinizálóhormon (LH) és a pajzsmirigy-stimuláló hormon (TSH). Az FSH, LH és TSH a legtöbb gerinces fajban megtalálható, ezek a hipofízisben (agyalapi mirigyben) termelődnek, és onnan szekretálódnak. A CG-t eddig csak főemlősökben, ezen belül emberben, valamint lovakban sikerült kimutatni, ez utóbbi a méhlepény szövetében termelődik.
A gonadotropinok heterodimerek, amelyeket két, egymástól eltérő - α-nak és β-nak nevezett - alegység alkot, amelyek nem kovalens kötéssel kapcsolódnak egymással. Egy adott fajon belül, az α-alegység a gonadotropincsalád minden tagjában lényegében azonos; és a különböző fajok közt is igen állandó struktúrával rendelkezik. A β-alegység a gonadotropincsalád minden tagjában - azaz a CG-, FSH-, TSH- és LH-gonadotropinokban - más és más, de szerkezetüket tekintve jelentős homológiát mutatnak. Ezenfelül, a β-alegységek is igen állandó struktúrával rendelkeznek a különböző fajok közt. Emberben az a-alegységet 92 aminosav építi fel, míg a β-alegység mérete az egyes tagok esetében változó: a hFSH 111, a hLH 121, a hTSH 118 és a hCG 145 aminosavból áll [Combamous Y.: Endocrine Reviews 13, 670 (1992); Lustbader J. W. és munkatársai: Endocrine Reviews 14, 291 (1993)]. A hCG β-alegységének mérete lényegesen nagyobb, mint más β-alegységeké, mivel a C-terminális végen körülbelül 34 további amínosavat tartalmaz, amelyet a leírásban karboxiterminális proteinnek (CPT) nevezünk.
A heterodimer két alegységében számos, alegységen belüli, konzervált diszulfidhíd található: öt diszulfidhíd található az α-alegységben és hat diszulfidhíd a β-alegységben. A megfelelő cisztein-aminosavak a gonadotropincsalád valamennyi tagjában teljesen konzervált elhelyezkedést mutatnak. A hCG közelmúltban röntgensugárral megállapított szerkezete szerint, ezek a diszulfidhidak diszulfidcsomóknak nevezett, tipikus, háromdimenziós minta létrejöttében játszanak szerepet. A gonadotropinok három vagy négy aszparagin-aminosavat tartalmaznak, amelyek N-glikozilezési helyeket képezhetnek. Ezenfelül, a hCG C-terminális peptidje (CTP) négy szerin-aminosavnak megfelelő pozíciójában O-glikozileződés jöhet létre.
A gonadotropinok a szervezet számos különböző funkciójában lényeges szerepet töltenek be, például a metabolizmusban, a hőmérséklet-szabályozásban, és reproduktív folyamatokban. A hipofíziseredetű FSHgonadotropin például a tüszőfejlődés és tüszőérés folyamatának stimulálásában játszik döntő szerepet, míg az
LH indukálja az ovulációt [Sharp R. M.: Clin. Endocrinol. 33, 787 (1990); Dorrington és Armstrong: Recent Prog. Horm. Rés. 35, 787 (1990)]. Jelenleg, az FSH-t - önmagában vagy LH-aktivitással rendelkező hatóanyaggal kombinálva - alkalmazzák a klinikumban, például in vitro fertilizáció (IVF) esetében a petefészek hiperstimulálására, anovulációval járó termékenységi zavarban szenvedő nőkben in vivő ovuláció kiváltására [Insler V.: Int. Fertility 33, 85 (1988); Navot és Rosenwaks J. Vitro Fért. Embryo. Transfer. 5, 3 (1988)], valamint férfíhipogonadizmusban.
Jelenleg, a terápiás célra felhasznált gonadotropinokat humán vizeletből izolálják, és azok alacsony tisztasági fokkal rendelkeznek [Morse és munkatársai: Amer. J. Reproduct. Immunoi, and Microbiology 17, 143 (1988)]. Az ilyen, vizeletből származó gonadotropinokkal szemben a rekombináns gonadotropinok azzal a jelentős előnnyel bírnak, hogy minőségük állandó, azaz reprodukálható biokémiai és biológiai sajátságokkal rendelkeznek. Valamennyi alegység esetében előállítottak genomi- és cDNS-klónokat, és azok elsődleges struktúráját meghatározták. Ezenkívül, kínaihörcsögpetefészek- (CHO-) sejteket transzfektáltak humán gonadotropin-alegységeket kódoló génekkel, és ezek a sejtek képesnek bizonyultak intakt dimerek szekréciójára [Keene és munkatársai: J. Bioi. Chem. 264, 4769 (1988); Van Wezenbeek és munkatársai: „From clone to Clinic”, szerk.: Crommelin D. J. A. és Schellekens H., 245. oldal (1990)].
Azóta kimutatták, hogy például a rekombináns FSH biokémiai és biológiai sajátságai csaknem azonosak a természetes FSH sajátságaival [Mannaerts és munkatársai: Endocrinology 129, 2623 (1991)]. Ezenfelül, rekombináns FSH alkalmazásával kiváltott szabályozott petefészek-szuperovulációt követően terhességet sikerült létrehozni [Germond és munkatársai: Láncét 339, 1170 (1992); Devroey és munkatársai: Láncét 339, 1170(1992)].
A két alegység dimerré történő sikeres összeépülése a dimer biológiai aktivitásának abszolút előfeltétele. A heterodimer megfelelő alegységekre történő disszociációját a bioaktivitás in vivő elvesztése egyik fő okának tekintik. A disszociációs és dezaminációs folyamatok ezenfelül az eltarthatósági idő csökkenéséhez vezetnek, A heterodimer termodinamikai stabilitását tehát olyan lényeges faktornak tekintjük, amely mind in vivő, mind in vitro körülmények között befolyásolja a gonadotropin féléletidejét. Ezért, a klinikumban fennáll az igény a gonadotropinok stabilitásának további javítása iránt.
A találmány tárgyát a fenti igényeknek megfelelő gonadotropinok képezik. Meglepő módon azt találtuk, hogy a natív gonadotropinokba egy vagy több, nem natív diszulfidhíd beiktatása megnövekedett stabilitással rendelkező gonadotropinokat eredményez. „Nem natív diszulfidhidaknak” a leírásban olyan diszulfidhidakat nevezünk, amelyek a natív gonadotropinokban nincsenek jelen, tehát nem soroljuk nem natív diszulfidhidak közé a natív gonadotropinok α-alegységében található öt diszulfidhidat és β-alegységében található hat diszul2
HU 222 043 Β1 fidhidat. „Natív” gonadotropinoknak olyan gonadotropinokat nevezünk, amelyek a megfelelő szövetből izolált gonadotropinokkal megegyező aminosavszekvenciával rendelkeznek.
A találmány tárgyát képezik tehát egy vagy több, nem natív diszulfídhidat tartalmazó, α-alegységből és β-alegységből álló gonadotropinok.
A natív gonadotropinokban elő nem forduló diszulfidhidakat létrehozhatunk helyspecifikus mutagenezissel: a megfelelő pozícióban található natív aminosav olyan pontmutációjával, amely cisztein-aminosavat eredményez. A pontmutációt a leírásban a következőképp jelöltük: XayCys vagy XPyCys, ahol X az a-alegység vagy β-alegység y-pozíciójában található aminosav, amelynek mutációja révén a megfelelő pozícióban cisztein épül be (az aminosavak jelölésére a hárombetűs kódot alkalmaztuk). A CysayCys- vagy CysβyCys-jelölés a natív alegységben található risztéinek y-pozíciójára utal. A találmány szerinti pontmutációk a gonadotropinok konformációjának csupán kismértékű változását eredményezik.
A találmány tárgyát képezik ezenfelül olyan gonadotropinok, amelyekben csak egyetlen mutációt hoztunk létre. Ilyen mutációkat létrehozhatunk az a- vagy β-alegységet kódoló DNS-ben, mely révén olyan új cisztein jön létre, amely egy már meglévő ciszteinnel képes diszulfídhidat képezni. Ilyen mutációkat előnyösen az α-alegységben hozunk létre, előnyösebben a 88-92. aminosavpozíciókban. A találmány szerinti, natív gonadotropinban elő nem forduló diszulfidhidak létrejöhetnek különböző alegységekben található aminosavpárok között (alegységek közti diszulfidhidak). A natív gonadotropinokban elő nem forduló diszulfidhidak létrejöhetnek továbbá olyan aminosavpárok között, amelyek azonos alegységekben találhatók (alegységen belüli diszulfidhidak). Adott esetben, egy vagy több találmány szerinti, nem natív diszulfidhid jelenlétének eredményeképp a tizenegy natív diszulfidhid közül egy vagy több deletálható.
A találmány szerinti, natív gonadotropinban elő nem forduló diszulfidhidak megakadályozzák a dimer disszociációját, ami a natív gonadotropinokhoz képest megnövekedett in vitro és in vivő biostabilitást és eltarthatósági időt eredményez. Ezenfelül, azok megszüntetik a gonadotropinok polipeptidvázának flexibilitását, ezáltal a fenti gonadotropinok dezaminezéssel szembeni érzékenységét csökkentik. A dezaminezés fiziológiás körülmények mellett spontán végbemenő folyamat, amely a protein tisztaságát és stabilitását negatív irányban befolyásolja.
A találmány tárgyát képezik továbbá nem natív, alegységek közti és alegységen belüli diszulfidhidak kombinációját tartalmazó gonadotropinok.
A találmány tárgyát képezik egyrészt olyan gonadotropinok, amelyekben az α-alegység humán eredetű, és amelyek nem natív, alegységen belüli diszulfidhidat tartalmaznak, egy vagy több alábbi aminosavpár között: (Pheal8Cys-Ilea25Cys), (Glna20Cys-Alaa23Cys), (Sera34Cys-Sera57Cys), (Thra39Cys-Thra54Cys), (Alaa62Cys-Hisa79Cys), valamint (Lysa63CysAlaa81Cys), (Tyra65Cys-Hisa79Cys) és (AsnaőóCysAsna78Cys).
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan gonadotropinok, amelyekben a β-alegységet a hCG β-alegysége képviseli, és amelyek egy vagy több, alegységek közti diszulfidhidat tartalmaznak az alábbi aminosavpárok között: (Glna5Cys-A^8Cys), (Proa24Cys-G^71Cys), (Metα29Cys-Metβ41Cys), (Arga35Cys-Ala|)35Cys), (Tyra37Cys-I^33Cys), (Lysa51Cys-Aspβ99Cys) és (Hisa90Cys-CysβyCys) és/vagy, amelyek egy vagy több, alegységen belüli diszulfidhidat tartalmaznak az alábbi aminosavpárok között: (Pn^4Cys-Pn$7Cys), (ΡΓοβΙ lCys-Tlnj332Cys), (ΡΓοβΙ lCys-Ak^85Cys), (Th^32Cys-A^85Cys), (A^60Cys-Se^87Cys), (A^60Cys-Gh$89Cys), (Aspβ61Cys-Leuβ86Cys), 0M$61Cys-Se^87Cys), (Ser|366Cys-Se^81Cys) és (Leuβ69Cys-Proβ78Cys). Előnyösen a találmány szerinti hCG nem natív, alegységek közti diszulfidhidat tartalmaz az alábbi aminosavpárok között: (Meta29CysMetβ41Cys), (Tyra37Cys-I^33Cys), (Lysa51CysAsp|399Cys) vagy (Hisα90Cys-CysβyCys).
A találmány tárgyát képezik olyan gonadotropinok, amelyekben a β-alegységet a hLH β-alegysége képezi, és amelyek egy vagy több, alegységek közti diszulfidhidat tartalmaznak az alábbi aminosavpárok között: (Glnα5Cys-Trpβ8Cys), (Proa24Cys-G^71Cys), (Meta29Cys-Metβ41 Cys), (Arga3 5Cys-Α1ββ3 5Cys), (Tyra37Cys-I^33Cys), (Lysa51Cys-Aspβ99Cys) és (Hisa90Cys-CysβyCys) és/vagy, amelyek egy vagy több, alegységen belüli diszulfidhidat tartalmaznak az alábbi aminosavpárok között: (Pn^Cys-Pn$7Cys), (ΡΓοβΙ lCys-Tluf32Cys), (Ρκ>β1 lCys-A^85Cys), (Tluji32Cys-A^85Cys), (A^60Cys-Se^87Cys), (A^60Cys-A^89Cys), (Aspβ61Cys-Leuβ86Cys), (Aspβ61Cys-Serβ87Cys), (Serf$66Cys-Se$81Cys) és (Leuβ69Cys-Proβ78Cys). A találmány szerinti előnyös gonadotropin egy olyan hLH, amely nem natív diszulfidhidat tartalmaz az alábbi aminosavpárok között: (Metα29Cys-Metβ41Cys), (Tyra37Cys-I^33Cys), (Lysa51Cys-Aspβ99Cys) vagy (Hisa90CysCysβyCys).
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan gonadotropinok, amelyekben a β-alegységet a hFSH β-alegysége képviseli, és amelyek egy vagy több, alegységek közti diszulfidhidat tartalmaznak az alábbi aminosavpárok között: (Glna5Cys-Se^2Cys), (Proa24CysG^65Cys), (Meta29Cys-Arg335Cys), (Arga35CysA^29Cys), (Tyra37Cys-Trp^27Cys), (LysaőlCysAspβ93Cys) és (Hisa90Cys-CysβyCys) és/vagy, amelyek egy vagy több, alegységen belüli diszulfidhidat tartalmaznak az alábbi aminosavpárok között: (Le^5CysTluji26Cys), (Leuβ5Cys-Alaβ79Cys), (Tlu$26CysA^79Cys), (Lys(354Cys-Gh^81Cys), (I^^54CysHisβ83Cys), (Gh$55Cys-Tlu^80Cys), (Gh$55CysGh$81Cys), (Th^60Cys-Tln^75Cys), valamint (Va^63Cys-Ser372Cys). A találmány szerinti előnyös gonadotropin egy olyan hFSH, amelyben a β-alegység alegységek közti diszulfidhidat tartalmaz az alábbi aminosavpárok között: (Tyra37Cys-Tq^27Cys) vagy (Hisα90Cys-CysβyCys).
HU 222 043 Β1
Ezenfelül a találmány tárgyát képezik olyan gonadotropinok, amelyekben a β-alegységet a hTSH β-alegysége képezi, és amelyek egy vagy több, alegységek közti diszulfidhidat tartalmaznak az alábbi aminosavpárok között: (Glna5Cys-PhepiCys), (Proa24CysG^óóCys), (Meta29Cys-Argp34Cys), (Arga35CysAlap28Cys), (Tyra37Cys-Ilep26Cys), (Lysa51CysAspP94Cys) és (His<x90Cys-CysβyCys) és/vagy, amelyek egy vagy több, alegységen belüli diszulfidhidat tartalmaznak az alábbi aminosavpárok között: (Prop4Cys-ThrP25Cys), (Prop4Cys-Alap80Cys), (Thrp25Cys-Alap80Cys), (Argp55Cys-Se^82Cys), (ArgP55Cys-Lysp84Cys), (Aspβ56Cys-Leuβ81Cys), (Aspp56Cys-Serp82Cys), (Thr361Cys-Serp76Cys) és (Ilep64Cys-ProP73Cys).
Világos, hogy a találmány tárgyához tartoznak nem natív, alegységek közti és alegységen belüli diszulfidhidak kombinációi is.
A fenti mutációkat jelölő aminosavpozíciók a humán gonadotropin amínosavszekvenciájára vonatkoznak. A találmány tárgyát képezik ezenfelül más fajokból származó gonadotropinok alegységei közt létrejött, nem natív, megfelelő diszulfidhidak is. A ciszteinné alakítandó aminosav pontos pozícióját úgy kaphatjuk meg, hogy az említett gonadotropin-alegységek szekvenciáját összevetjük a humán gonadotropin-alegységek szekvenciájával.
A diszulfidhidaknak az alegységek hajtogatódásában („folding”) és összeépülésében betöltött fontos szerepét tekintve igen meglepő, hogy a találmány szerinti, nem natív diszulfidhidak beiktatása nem képezi gátját megfelelően hajtogatódott gonadotropinok képződésének. A diszulfidhidak megfelelő képződése a funkcionális gonadotropinok hajtogatódásának és érésének kritikus lépése. Különösen a β-alegységben létrejövő diszulfidhidak kialakulása lényeges: valamennyi diszulfidhídra szükség van ahhoz, hogy a megfelelő kombinálódás és hajtogatódás végbemenjen. A hCG hajtogatódásának részletes vizsgálata azt mutatta, hogy a molekula hajtogatódása nem egyszerű, egymást követő lépések során megy végbe, hanem a molekula különböző doménjaiban egymástól függetlenül zajlik. Ezért feltételezték, hogy további ciszteinek beiktatása az a- és/vagy β-alegységekbe megzavarhatja a hajtogatódás folyamatát, ezáltal megváltoztathatja a molekula eredeti konformációját, következésképp, a molekula működőképességének és bioaktivitásának elvesztéséhez vezet. Különösen azért feltételezték ezt, mivel ezekben a molekulákban már eredetileg is sok risztéin van jelen.
A találmány szerinti, cisztein-aminosavakat eredményező pontmutációk a teljes aminosav-összetételt és a protein tulajdonságait csak kismértékben változtatják meg, tehát a találmány szerinti gonadotropinok azzal a további előnnyel rendelkeznek, hogy azok immunogenitása várhatóan nem tér el lényegesen a vad típusú gonadotropinok immunogenitásától. Különösen abban az esetben, ha nem natív diszulfidhidak a dimer érintkezési felületén találhatók, az immunogenitást érintő hatás elhanyagolható.
A találmány szerinti gonadotropinok hatása, a mutáció helyétől függően lehet agonista vagy antagonista. Amint azt a korábbiakban említettük, a mutáció helye a molekula konformációjának kismértékű megváltozását eredményezheti. Amennyiben a mutáció helyét úgy választottuk meg, hogy az a protein receptorkötődésben és/vagy szignáltranszdukcióban (jelátvitelben) szerepet játszó részein jöjjön létre, a találmány szerinti, natív gonadotropinban elő nem forduló diszulfidhidak a szignáltranszdukciós aktivitás részben vagy teljes egészében való elvesztéséhez, ezzel egyidejűleg, a glikoprotein fokozott stabilitásához vezethetnek. A találmány tárgyát képezik tehát fokozott stabilitással rendelkező antagonisták. Amennyiben a mutáció helyét úgy választottuk meg, hogy az a glikoprotein belső magjában, a dimer érintkezési felületén jöjjön létre, az így kapott, natív gonadotropinban elő nem forduló diszulfidhidak nem fogják befolyásolni a receptorkötő és/vagy szignáltranszdukciós aktivitást, azonban a natív gonadotropinokhoz képest megnövekedett stabilitással rendelkező gonadotropinokat eredményeznek. Az ilyen mutációk fokozott stabilitással rendelkező, agonista hatású gonadotropinok keletkezéséhez vezetnek.
A találmány szerinti gonadotropinok a technika állása szerint ismert egyéb módosításokat is tartalmazhatnak.
A találmány szerinti gonadotropinok egy előnyös módosítása szerint, az egyik alegység aminosavszekvenciájának C-terminális végét - adott esetben egy linkerelemen (kapcsoló nukleotidszekvencián) keresztül - a másik alegység aminosavszekvenciájának N-terminális végéhez kapcsoljuk. A linkerelemet előnyösen teljes vagy részleges CTP-egység vagy annak variánsa képezi.
A találmány szerinti gonadotropinok egy további módosítása szerint, az a- és/vagy β-alegységet, annak N- vagy C-terminális végén, teljes vagy részleges CTPegységgel vagy annak variánsával meghosszabbítjuk. A meghosszabbítás egy vagy több, adott CTP-egységet tartalmazhat. Másképp eljárva, teljes CTP-egységet vagy részleges CTP-egységet vagy annak multimer formáját az említett alegység N- vagy C-terminális végébe inszertálhatjuk.
Ezenfelül, a találmány szerinti gonadotropinok lehetnek glikozilezettek, részlegesen glikozilezettek vagy nem glikozilezettek. A találmány szerinti, részlegesen glikozilezett vagy nem glikozilezett gonadotropinokat előállíthatunk kémiai módosítással, enzimatikus módosítással vagy helyspecifikus mutagenezissel, úgy, hogy a gonadotropinokban található egy vagy több glikozilezési felismerési helyet eltávolítunk. Eljárhatunk úgy is, hogy a találmány szerinti gonadotropinok glikozilezési mintáját további glikozilezési felismerési helyek beiktatásával, és adott esetben, egy vagy több glikozilezési hely eltávolításával módosítjuk, az említett gonadotropin megváltozott glikozilezését eredményezve. A leírásban „glikozilezési felismerési helynek” Asn-X-Ser/Thr aminosavszekvenciát nevezünk, ahol X bármely aminosav lehet.
HU 222 043 Bl
A leírásban említett CG, FSH, LH és TSH a- és βalegységeinek, valamint a heterodimer formáknak a meghatározása általánosan ismert; az elnevezések a technika állása szerint ismert aminosavszekvenciákkal rendelkező proteinekre vagy azok allélikus variánsaira vonatkoznak, tekintet nélkül azok glikozilezési mintájára.
A fenti proteinek „natív” formáinak olyan proteineket nevezünk, amelyek a megfelelő gerinces szövetből izolált protein aminosavszekvenciájával rendelkeznek, és természetesen, a fenti ismert szekvenciákat tartalmazzák; valamint azok allélikus variánsait.
„Variánsoknak” olyan proteineket nevezünk, amelyek az aminosavszekvenciában a natív protein szekvenciájától eltérő, szándékosan létrehozott módosítást tartalmaznak. A módosítás lehet egy vagy több aminosav deléciója, inszertálása, helyettesítése, valamint az előbbiek kombinációja, ezeket létrehozhatjuk például helyspecifikus mutagenezissel vagy más rekombináns eljárással, vagy előállíthatjuk szintetikus úton. Ezek a módosítások előnyösen konzervatív aminosavszubsztitúciók, azaz, a helyettesített aminosav ugyanabba az általános aminosavkategóriába sorolható, mint amellyel a helyettesítés történt. Az aminosavak ilyen osztályozása a technika állása szerint ismert, leírásuk megtalálható például az alábbi szakirodalmi helyen: Dayhoff M. és munkatársai: „Atlas of Protein Sequences and Structure”, 5, 89 (1972).
A leírásban „CTP-egységnek” a hCG β-alegységének C-terminális végén, a 112-118. aminosavpozícióktól a 145. aminosavpozícióig teijedő aminosavszekvenciát, vagy annak részét nevezzük. Egy „teljes CTP-egység”, a CTP N-terminális végétől függően, 28-34. aminosavat tartalmaz. A „részleges CTPegység” kifejezés a 112-118. és 145. aminosavpozíciók közti aminosavszekvenciára vonatkozik, amely a lehetséges legrövidebb teljes CTP-egységnél (a 118-145. aminosavpozícióknak megfelelő szekvenciánál) legalább eggyel kevesebb aminosavat tartalmaz. „Többszörös CTP-egységeknek” teljes CTP-egységekből vagy részleges CTP-egységekből vagy az előzőek kombinációjából felépülő tandem elrendezésű sort nevezünk.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti gonadotropinokat kódoló DNS-ek. A találmány szerinti DNS-ek egy vagy több, valamely szubsztituálandó aminosavat helyettesítő, ciszteint kódoló kodont tartalmaznak. A találmány szerinti DNS-eket előállíthatjuk a natív gonadotropinokat vagy azok variánsait kódoló DNS-ből úgy, hogy egy vagy több, az említett DNS-ben helyettesítendő aminosavat kódoló kodont ciszteint kódoló kodonra változtatunk. Ezeket a szubsztitúciókat helyspecifikus mutagenezissel hozhatjuk létre.
A találmány szerinti gonadotropinok előállítására alkalmazható eljárások a technika állása szerint jól ismertek [Sambrook és munkatársai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, „Cold Spring Harbor Laboratory Press”, Cold Spring Harbor, (a legutóbbi kiadás)]. A fenti gonadotropinokat legelőnyösebben, a kívánt proteint kódoló DNS expresszáltatásával állítjuk elő.
Helyspecifikus mutagenezisre, további szekvenciák ligálására, PCR-eljárásra és megfelelő expressziós rendszerek előállítására vonatkozó eljárások a technika állása szerint ma már jól ismertek. A kívánt proteint kódoló DNS részletei vagy annak egésze előállítható szintetikus úton, ismert, szilárd fázisú technikák alkalmazásával, előnyösen, a ligálás megkönnyítésére restrikciós hasítási helyek beiktatása céljából. A kódoló DNS-szekvenciákat elláthatjuk a beiktatott kódolószekvencia számára megfelelő transzkripciós és transzlációs szabályozóelemekkel. Amint az közismert, rendelkezésre állnak olyan expressziós rendszerek, amelyek gazdaszervezetek széles körével kompatibilisek, ezen belül prokarióta-gazdasejtekkel, például baktériumokkal, és eukarióta-gazdaszervezetekkel, például élesztőkkel, növényi sejtekkel, rovarsejtekkel, emlőssejtekkel, madársejtekkel stb. A gazdaszervezet kiválasztása főként a transzlációt követő eseményektől, elsősorban a glikozilezéstől függ. A glikozilezés helyét döntően a molekulán belül található glikozilezési helyek természete határozza meg. Az, hogy a fenti helyeket milyen cukrok foglalják el azonban, főként a gazdaszervezet szabályozása alatt áll.
A találmány szerinti gonadotropinok a natív gonadotropinokkal azonos klinikai célokra alkalmazhatók, emellett azzal az előnnyel rendelkeznek, hogy fokozott stabilitással bírnak. A mutációt hordozó gonadotropinok - a mutáció típusától függően - alkalmazhatók agonistákként vagy antagonistákként. A találmány szerinti gyógyászati készítmények egy vagy több, találmány szerinti gonadotropint, valamint gyógyászatilag elfogadható hordozó segédanyagot tartalmaznak.
Gyógyászatilag elfogadható hordozó segédanyagok szakember számára jól ismertek, azok lehetnek például a következők: steril fiziológiás sóoldat, laktóz, szacharóz, kalcium-foszfát, zselatin, dextrin, agar, pektin, mogyoróolaj, olívaolaj, szezámolaj és víz.
A találmány szerinti gyógyászati készítmények ezenfelül tartalmazhatnak egy vagy több stabilizátort, például szénhidrátokat, ezen belül szorbitolt, mannitolt, keményítőt, szacharóz-dextrint és glükózt; proteineket, például albumint vagy kazeint; és puffereket, például bázikus foszfátokat.
A találmány szerinti gyógyászati készítményeket beadhatjuk intramuszkuláris (izomba adott) injekcióval, bőr alá adott injekcióval, intravénás injekcióval, vagy intraperitoneális (hasüregbe adott) injekcióval, ezenkívül beadhatjuk szájon át vagy intranazálisan (orron keresztül).
A találmány szerinti megoldást a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leírásokhoz csatolt ábrákat.
Az 1. ábra a pMKS.hCGagpc jelű hCGag3c-t expresszáló expressziós plazmid strukturális szerveződését ábrázolja. SV40=SV40 korai promoter. E=M-MuLV-„enhanszer”. MT-IIA=humán metallotionein5
HU 222 043 Bl
IIA-promoter. hCGag=a hCGa-alegységet kódoló genomi hCGa-minigén. hCGPc=hCG3-alegységet kódoló cDNS. p-globin=nyúl-p-globin poliadenilezési szekvenciája és összeállítási („splice”) szignálszekvenciái. S=az SV40 transzkripciós terminációs szekvenciája. pBR327=a pBR327-plazmidnak az E. coli replikációs origóját, valamint ampicillinrezisztenciát létrehozó gént tartalmazó része.
A 2. ábra 1., láncok közti hCG-mutánst, 2., láncok közti hCG-mutánst és vad típusú hCG-t expresszáló sejttenyészetek felülúszóinak Westem-blot-analízisét ábrázolja, amelyben a hCG (mutánsok) expresszálódását, valamint az alegységek közti diszulfidhidak képződését vizsgáltuk. G418 rezisztens 1., láncok közti hCGmutánst, 2., láncok közti hCG-mutánst, valamint vad típusú (rekombináns) rechCG-t tartalmazó transzfekciós gyűjteményből származó, körülbelül 0,2 nemzetközi egység (IU) hCG-t tartalmazó sejttenyészet-felülúszókat szolubilizáltunk szobahőmérsékleten (A. ábra) vagy 100 °C-on (B. és C. ábrák), SDS-t tartalmazó mintapufferban, β-merkapto-etanol hiányában (A. és B. ábrák) vagy jelenlétében (C. ábra). Elektroforézist és PVDF-membránra történő átvitelt követően, a hCG-t β-hCG-specifikus monoklonális ellenanyaggal, majd egy második ellenanyag-HRP-konjugátummal végzett inkubálással, végül TMB-vel történő festéssel kimutattuk. Amint az ábrán látható, a szobahőmérsékleten végzett szolubilizáció (A. ábra 1. és 2. csík) és a 100 °C-on végzett szolubilizáció (B. ábra 1. és 2. csík) intakt hormon jelenlétét mutatta ki, míg a kontroll (vad típusú hCG, vt-hCG) forralása a hormon alegységekre történő disszociációját eredményezte (B. ábra 3. csík). Redukálószer hozzáadása mindhárom minta esetében alegységekre történő disszociációt eredményezett (C. ábra). Az adatok összegzése alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy mind az 1., láncok közti hCG-mutánst, mind a 2., láncok közti hCG-mutánst molekulák közti diszulfidhidak stabilizálják.
A 3. ábra alegységek közti hCG-mutánsok hCGvel történő leszoríthatóságának vizsgálatát szemlélteti. B/B0=kötődés az összkötődés százalékában kifejezve; +=vad típusú (vt) hCG; A=l., láncok közti hCGmutáns; o=2., láncok közti hCG-mutáns.
A 4. ábra alegységek közti hCG-mutánsok in vitro bioaktivitását szemlélteti. + =I.S 75/537;
A=l., láncok közti hCG-mutáns; o=2., láncok közti hCG-mutáns.
Az 5. ábra a Beagle-kutyák plazmájában rekombináns hCG-készítmény intramuszkuláris (im.) injekcióját követően mérhető hCGszinteket ábrázolja.
A 6. ábra vad típusú hCG, valamint a láncok közti hCG-mutánsok kötődési aktivitását ábrázolja a humán LH/CG receptort stabilan expresszáló CHO-sejtek membránjához. A membránokat 125I-jelölt hCG-vel inkubáltuk, különböző koncentrációjú, jelöletlen vad típusú hCG hiányában vagy annak jelenlétében, vagy a láncok közti hCG-mutánsok hiányában vagy jelenlétében. A leszorítási görbéken a maximális kötődésnek megfelelő százalékos arányt ábrázoltuk, a jelöletlen hormon alkalmazott dózisainak függvényében.
A 7. ábra vad típusú hCG, valamint a láncok közti hCG-mutáns molekulák in vitro biológiai aktivitását mutatja. Az extracelluláris cAMP-t specifikus RIA-eljárással határoztuk meg, a humán LH/CG receptort stabilan expresszáló CHO-sejtek stimulációját követően.
A 8. ábra a vad típusú hCG, vad típusú LH, valamint a láncok közti LH-mutánsok kötődési aktivitását ábrázolja a humán LH/CG receptort stabilan expresszáló CHO-sejtek membránjához. A membránokat 125I-jelölt hCG-vel inkubáltuk, különböző koncentrációjú, jelöletlen, vad típusú hCG, vad típusú LH, valamint láncok közti LH-mutánsok hiányában vagy azok jelenlétében. A leszorítási görbéken a kötődés maximális kötődésnek megfelelő százalékos arányát ábrázoltuk, a jelöletlen hormon alkalmazott dózisainak függvényében.
A 9. ábra vad típusú FSH és láncok közti FSH-mutánsok kötődési aktivitását ábrázolja a humán FSH-receptort stabilan expresszáló CHO-sejtek membránjához. A membránokat 125I-jelölt FSH-val inkubáltuk, különböző koncentrációjú, jelöletlen vad típusú FSH, valamint láncok közti FSH-mutánsok hiányában vagy azok jelenlétében. A leszorítási görbéken a maximális kötődésnek megfelelő százalékos arányt ábrázoltuk, a jelöletlen hormon alkalmazott dózisainak függvényében.
1. példa
Láncok közti mutánsok előállítása Vektorok előállítása
Három konstrukciót állítottunk elő, járulékos, láncok közti diszulfidhidat tartalmazó hCG-mutánsok expresszálása céljából. Ezek struktúrája és általános szerve6
HU 222 043 Β1
1. táblázat
A hCG-ben mutációval létrehozott cisztein-kodonok ződése lényegében megegyezett a pKMS.hCGagpcvektoréval, amely vektort rekombináns, vad típusú hCG CHO-sejtekben történő expresszálására alkalmaztunk (1. ábra). A megfelelő hCG-α- Fiddes J. C. és Goodman Η. M.: J. Mól. Appl. Génét. 1, 3 (1981)] és hCG-P-alegység géneket [Fiddes J. C. és Goodman H. M.: Natúré 286, 684 (1980)] pKMS-plazmidba inszertáltuk. Egy cDNS-klón és egy genomi klón kombinációjával olyan teljes „hibrid” hCGa-gént kaptunk [VanWezenbeek és munkatársai: (1990)], amely gazdasejtekbe történő transzfekciót követően vad típusú aalegység expresszálására képes. A hCG3-t kódoló cDNS-t a leírtak szerint izoláltuk, és azt a pKMS.FSHvektorban található FSHp-val helyettesítettük. A fenti vektorban az α-gén transzkripciója az SV40 korai promoterének irányítása alatt áll, míg a β-gén a humán, nehézfém által indukált metallotionein-IIA-promoterről íródik át. Három, láncok közti hCG-mutáns konstrukciót állítottunk elő (1. táblázat).
Az 1., láncok közti hCG-mutánsban található a-alegység mutáció létrehozásához a „hibrid” hCGa-génben specifikus bázisszubsztitúciókat hoztunk létre úgy, hogy az a37-tirozint kódoló kodont ciszteint kódoló kodon helyettesítse. Ezt helyspecifikus mutagenezissel és átfedő szekvenciákkal rendelkező PCR-fragmentumok kombinálásával, ismert PCR-körülmények alkalmazásával végeztük, az alábbi szakirodalmi helyen leírtak szerint [Erich H. A. „PCR Technology”, „Principles and Applications fór DNA amplification”, „Stockton Press”, 63. oldal (1989)]. A PCR-fragmentumokat szétválasztottuk, pGEM3Z-vektorba szubklónoztuk, és „Automated sequencer” (Pharmacia) alkalmazásával ellenőriztük. A láncindító oligonukleotidokat úgy választottuk meg, hogy a szubklónozott PCR-fragmentumok a mutációtól (mutációktól) mind 3’-, mind 5’-irányban megfelelő restrikciós helyeket tartalmazzanak úgy, hogy a fragmentumok a pKMS.hCGagPc-vektorban található natív α-lánc-szekvenciával felcserélhetők legyenek. A felcserélést ismert technikákkal végeztük.
Az 1., láncok közti hCG-mutánsban található β-alegység által hordozott mutáció létrehozásához, a ΜΧίβban specifikus bázisszubsztitúciókat hoztunk létre úgy, hogy a 333-izoleucint kódoló kodont ciszteint kódoló kodon helyettesítse. A mutagenezist eredményező PCRreakciót, a szubklónozást, valamint szekvenálást az a-alegységben található mutáció létrehozásánál alkalmazott eljárásokhoz hasonló módon végeztük. Az 1., láncok közti hCG-mutánst kódoló expressziós plazmid előállításának utolsó lépéseként, a pKMS.hCGc^c-konstrukcióban, amely már tartalmazta az α-alegység mutációt, a vad típusú tKX^c-gént a mutációt hordozó hCG^-fragmentummal helyettesítettük.
A 2., láncok közti hCG-mutánst kódoló vektor létrehozásához, (amelyben az a51-lizint és a $99-aszparagint kódoló kodonokat ciszteint kódoló kodonnal helyettesítettük), valamint a 3., láncok közti hCG-mutánst kódoló vektor létrehozásához, (amelyben az a29-metionint és a p41-metionint kódoló kodonokat ciszteint kódoló kodonnal helyettesítettük), az előzőhöz hasonló stratégiát alkalmaztunk.
| hCG-mutánsok | Kodon |
| 1., láncok közti hCG-mutáns | Tyra37Cys-IleP33Cys |
| 2., láncok közti hCG-mutáns | Lysa5 lCys-AspP99Cys |
| 3., láncok közti hCG-mutáns | Meta29Cys-Metp41Cys |
CHO-sejtek transzfektálása és szelekciója
KI jelű CHO-sejteket 10 pg, láncok közti mutációt hordozó pKMS.hCG-konstrukcióval stabilan transzfektáltunk, „Transfectam”-reagens alkalmazásával (Promega). Az előző plazmiddal egyidejűleg, neomycin szelekciós gént tartalmazó szelekciós plazmiddal végeztünk transzfekciót, 10:1 moláris arány mellett (a pKMS láncok közti hCG-mutánsok fölöslegben történő alkalmazásával), ami G418-at (0,8 mg/ml) tartalmazó tápfolyadékban lehetővé tette a transzfektált sejtek szelekcióját.
Rekombináns CHO-sejteket immunoreaktivitást mutató proteinek kiválasztására nézve szelektáltunk. A tenyészetek felülúszói hCG kimutatására szolgáló szendvics-ELISA-eljárásban pozitív reakciót adtak aés β-specifikus monoklonális ellenanyagokkal. A tenyészetek felülúszóinak Westem-blot-analízise szerint, a láncok közti hCG-mutánsok a vad típusú, rekombináns hCG molekulatömegéhez hasonló molekulatömeggel rendelkeztek.
2. példa
Alegységek közti diszulfidhidak képződésének analízise
Annak megállapítása céljából, hogy az újonnan beiktatott ciszteinek alegységek közti diszulfidhidakká oxidálódtak-e, összegyűjtött, G418-rezisztens transzfektáns sejttenyészetek felülúszóiból vett mintákat SDS-t tartalmazó mintapufferban végzett forralással szolubilizáltunk, SDS-poliakrilamid-gélelektroforézisnek vetettünk alá, majd PVDF-membránra vittünk át. A hCG-t immunfestéssel tettük láthatóvá, a β-alegységgel szemben előállított monoklonális ellenanyaggal, majd torma-peroxidázzal (HRP) konjugált második ellenanyaggal történő inkubáció, végül tetrametil-benzidin (TMB)/Co++/H2O2-reagenssel végzett festés alkalmazásával. Amennyiben láncok közti diszulfidhidak képződtek, a minták SDS-mintapufferban végzett forralása nem okozza a két alegység szétválását, míg a fenti szolubilizálási körülmények diszulfidhidak képződése nélkül, alegységekre történő disszociációt eredményeznek. Kontrolikísérletekben, mintákat redukálószer nélkül, szobahőmérsékleten szolubilizáltunk (intakt hCG), valamint β-merkapto-etanol (βΜΕ) hozzáadásával szolubilizáltunk. Az utóbbi esetben, a láncok közti diszulfidhidak jelenlététől függetlenül, az alegységekké történő denaturáció bekövetkezik. Amint az a 2A. ábrán látható, a szobahőmérsékleten, β-ΜΕ hozzáadása nélkül végzett szolubilizáció, intakt, vad típusú hCG (3. csík;
HU 222 043 Bl körülbelül 50 kD molekulatömeg), valamint kisebb mennyiségű szabad β-alegység kimutatását eredményezte (körülbelül 32 kD molekulatömeg). Az 1., láncok közti hCG-mutánsból, valamint a 2., láncok közti hCG-mutánsból származó minták szintén, az előzővel körülbelül megegyező méretű immunoreaktív anyagot tartalmaztak, ami intakt hCG-mutánsok jelenlétére utal. Melegítés hatására a vad típusú hCG-alegységekre disszociált, amit az 50 kD csík eltűnése jelez (B. ábra,
3. csík). Ezzel szemben, a hCG-mutánsok esetében ez a disszociáció úgy tűnik, nem történik meg (B. ábra, 1. és
2. csíkok), ami molekulák közti kovalens kötődés jelenlétére utal. A βΜΕ hozzáadásával végül azt szemléltettük, hogy a két alegység közt létrejött, molekulák közti kötődést diszulfidhidak hozzák létre, mivel redukálószer hozzáadására a hCG és mutánsai alegységekre disszociálnak (C. ábra).
3. példa
LH/CG receptorkötődés
A hCG-nek hatása kifejtéséhez, első lépésben az LH/CG receptorhoz kell kötődnie. A láncok közti hCG-mutánsok relatív receptorkötő képességének meghatározására egy in vitro receptorkötődési vizsgálati eljárást alkalmaztunk, mely vizsgálat alapját jóddal jelölt hCG patkányheremembránról történő leszorítása képezte [Rao M. C. és munkatársai: Endocrinology 101, 512 (1977)]. A fenti vizsgálathoz meghatározott mennyiségű [125I]hCG-t inkubáltunk patkányheremembránokkal, fokozatosan növekvő mennyiségű minta jelenlétében, szobahőmérsékleten, 18 órán át. A maximális kötődés meghatározására további inkubálásokat végeztünk, minta hozzáadása nélkül. A nem specifikus kötődést jelöletlen ligandum (Pregnyl, Organon, West Orange, NJ) 1000-szeres feleslegben történő hozzáadásával határoztuk meg. Az inkubálást úgy állítottuk le, hogy a mintákat 0,1% BSA-val kiegészített jéghideg trisz-pufferrel kétszeresére hígítottuk, majd 5 percig, 150 OOOxN.kg-’ mellett, szobahőmérsékleten centrifugáltuk. A felülúszó leszívását követően az üledékben található radioaktivitást gamma-számlálóval határoztuk meg.
Az 1., láncok közti hCG-mutáns esetében a jódozott hCG-leszorítási görbéje hasonló volt a vad típusú rechCG-vel kapott görbéhez (lásd 3. ábra). Ez azt mutatja, hogy 1., láncok közti hCG-mutánsban az alegységek közti diszulfidhid nem befolyásolta a receptorhoz történő kötődést, ami arra utal, hogy a mutáns konformációja valóban hasonló a vad típusú rec-hCG konformációjához. A 2., láncok közti hCG-mutáns a jódozott hCG-t kisebb mértékben volt képes leszorítani. Ez feltehetően annak a ténynek tudható be, hogy ebben a mutánsban a láncok közti diszulfidhid a receptorkötődés és szignáltranszdukció szempontjából lényeges szerepet betöltő régióban található.
4. példa hCG által indukált tesztoszterontermelödés
A hCG egér Leydig-sejtekben tesztoszteron termelődését indukálja. Egy in vitro vizsgálati eljárás [Van
Damme és munkatársai: Acta Endocrinol. 77, 655 (1974)] Mannaerts és munkatársai által módosított változatát [„Neuroendocrinology of reproduction”, R. Rolland és munkatársai: (szerk.), „Elsevier Science Publishers B.V.”, 49-58. oldal (1987)] alkalmaztuk a láncok közti diszulfidhidakat tartalmazó hCG-mutánsok hCG-bioaktivitásának meghatározására (4. ábra). A sejtek 1., láncok közti hCG-mutánssal történő kezelése dózisfüggő módon, a tesztoszterontermelödés növekedését eredményezte, a vad típusú rec-hCG-vel megegyező hatékonysággal. Az 1., láncok közti hCGmutáns tehát teljes értékű hCG-agonistának tekinthető. Ezzel szemben, a 2., láncok közti hCG-mutáns szignáltranszdukciós képessége nullára csökkent, ami azt jelenti, hogy a 2., láncok közti hCG-mutáns a vad típusú hCG teljes értékű antagonistájaként alkalmazható.
5. példa
A mutánsok farmakokinetikai viselkedése nőstény Beagle-kutyákban
Az 1., láncok közti hCG-mutáns farmakokinetikai tulajdonságait nőstény Beagle-kutyáknak beadott im. injektálást követően teszteltük. Két kutyát az 1., láncok közti hCG-mutánssal egyszeri im. injektálásban részesítettünk, 25 IU/kg (nemzetközi egység/kg) (hCG ELA-eljárás szerint meghatározott) dózis alkalmazása mellett. Vérmintákat vettünk az injektálást megelőzően, majd 30 perc, valamint 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144,168, 192, 216, 240 és 264 óra elteltével. Az immunoreaktív 1., láncok közti hCGmutáns plazmaszintjeit kutyaplazmára érvényesített, hCG-specifikus, időfelbontásos fluoroimmunvizsgálattal (hCG-DELFIA) határoztuk meg. Az 1., láncok közti hCG-mutáns kiürülési görbéit az 5. ábrán ábrázoltuk. Összehasonlításképp, az 5. ábrán a hCG (rekombináns hCG) kiürülési görbéjét is bemutatjuk három kutyának történő im. adagolást (25 hCG EIA IU/kg) követően. A 2. táblázatban összegeztük kiürülési görbék alapján meghatározott farmakokinetikai paramétereket, amelyek a következők voltak: „AUC” (a plazmaszintet az idő függvényében ábrázoló görbe alatti terület, „Area Under the plazma level versus time Curve”), Cmax (csúcskoncentráció), tmax (a csúcskoncentráció eléréséhez szükséges idő), tl/2 (a szérumból való kiürülés felezési ideje), valamint CL (a kiürülés sebessége). A tl/2 meghatározására a 144-240 órás időpontok közt mért értékeket használtuk fel.
Az 1., láncok közti hCG-mutáns im. adagolásával és a rec-hCG im. adagolásával kapott eredmények összehasonlításakor az 1., láncok közti hCG-mutáns esetében magasabb AUC, valamint tl/2-értékeket és alacsonyabb CL-értékeket kaptunk, míg a Cmax- és tmax-paraméterek azonos nagyságrendbe estek. Az
1., láncok közti hCG-mutáns és a rec-hCG kinetikai összehasonlítása alapján arra következtethetünk, hogy az 1., láncok közti hCG-mutáns alacsonyabb kiürülési sebességgel és hosszabb féléletidővel rendelkezik.
HU 222 043 Bl
2. táblázat
Az 1., láncok közti hCG-mutáns és a rec-hCG farmakokinetikai paraméterei
| Vad típusú rec-hCG | 1., láncok közti hCG-mutáns | |
| AUC (mU. óra/ml injektált egységenként) | 13,51 ±0,91 | 19,27±0,78 |
| Cmax (mU/ml injektált egységenként) | 0,51±0,07 | 0,51 ±0,04 |
| Tmax (óra) | 3,35±0,68 | 3,58±0,55 |
| tl/2 (óra) | 46,00±7,09 | 56,32±10,8 |
| Kiürülés (ml/óra/kg) | 5,68±l,06 | 4,63±0,ll |
6. példa
4., láncok közti hCG-mutáns (GlnaőCysArg$8Cys)
Vektor előállítása és expresszálás
Vektorkonstrukciót állítottunk elő olyan hCGmutáns expresszálására, amely egy további, láncok közti diszulfidhidat tartalmaz. Ennek struktúrája és általános szerveződése lényegében megegyezett a pKMS.hCGagPc- vektoré val (1. ábra), azzal az eltéréssel, hogy abban új mutációkat hoztunk létre. Specifikus bázisszubsztitúciókat iktattunk be a „hibrid” hCGagénbe úgy, hogy az a5-glutamint kódoló kodont ciszteint kódoló kodon helyettesítse, a hCGp-génbe pedig úgy, hogy a P8-arginint kódoló kodont ciszteint kódoló kodon helyettesítse. A konstrukció előállítása, az azt követő transzfekció és a CHO-sejtek szelekciója a többi mutáns esetében leírtakhoz hasonló módon történt. A 2. példában leírtak szerint végzett proteinanalízis alapján arra következtettünk, hogy a két alegység között a molekulák közti kötést diszulfidhíd hozta létre.
Bioaktivitás
A receptorkötő aktivitást és in vitro bioaktivitást stabilan transzfektált CHO-sejtvonalakban expresszálódott humán receptorokon vizsgáltuk [Jia X. és munkatársai: Molecular Endocrinology 5, 759 (1991)]. A 4., láncok közti hCG-mutáns receptorkötő aktivitását olyan vizsgálati eljárással határoztuk meg kvantitatív módon, amely szerint exponenciálisan szaporodó sejtekből izolált membránfrakciókon a mutáns által a receptorról leszorított radioligandum mennyiségét határoztuk meg. Összesen 0,5 ml térfogatban, körülbelül 100 pg membránproteint inkubáltunk meghatározott mennyiségű 125I-hCG (20 000 cpm, körülbelül 12 pmol), valamint fokozatosan növekvő mennyiségű kompetitor-hCG jelenlétében, 18 órán &X, semleges hőmérsékleten. A 125I-jelölt hCG-t (NEX-106) a „Du Pont de Nemours”-tól szereztük be. A specifikus kötődés rendszerint, az alkalmazott kijelölt hCG 10- 12%-a volt. Az inkubálást követően a kötődött és a szabad hormont centrifugálással szétválasztottuk. Standardként nagy tisztaságú, rekombináns hCG-t alkalmaztunk.
A 4., láncok közti hCG-mutáns a jóddal jelölt hCGt a vad típusú hCG-hez képest valamivel kisebb mértékben volt képes leszorítani a receptorról (6. ábra).
A hCG a humán LH/CG receptort tartalmazó CHOsejtekben cAMP képződését váltja ki. Egy in vitro vizsgálati eljárást alkalmaztunk a 4., láncok közti hCGmutáns hCG-bioaktivitásának meghatározására. A sejteknek 4 órán át, az 1., láncok közti hCG-mutáns fokozatosan növekvő koncentrációi, valamint 0,1 mmol/1 3izobutil-l-metil-xantin jelenlétében történő inkubálása a cAMP-termelődés dózisfüggő növekedéséhez vezetett, [az extracelluláris cAMP-koncentrációt RIA-eljárással (Immunotech) határoztuk meg], ez a hatás hasonló nagyságrendű volt, mint a vad típusú rec-hCG által kiváltott (7. ábra). A 4 láncok közti hCG-mutáns tehát teljes értékű hCG-agonistának tekinthető.
7. példa
5., láncok közti hCG-mutáns (Arga35CysAla$35Cys)
Az 5., láncok közti hCG-mutánst úgy állítottuk elő, hogy az a-lánc 35. pozíciójában és a β-lánc 35. pozíciójában szubsztitúciót hoztunk létre, miáltal az itt található arginint és alanint ciszteinnel helyettesítettük.
Rekombináns CHO-sejteket az egyéb, láncok közötti hCG-mutánsok esetében ismertetettek szerint szelektáltunk, immunoreaktív protein kiválasztása alapján. A tenyészet felülúszói egy hCG kimutatására szolgáló szendvics-ELISA-eljárásban a- és β-specifikus monoklonális ellenanyagokkal pozitív reakciót adtak. A 2. példában leírtak szerint végzett proteinanalízis alapján megállapítottuk, hogy a két alegység közt létrejött, molekulák közti kötéseket diszulfidhíd hozta létre.
A receptorkötődési aktivitás vizsgálata szerint az 5., láncok közti hCG-mutáns a jóddal jelölt hCG-t a vad típusú hCG-hez képest valamivel kisebb mértékben volt képes leszorítani a receptorról (6. ábra). Az in vitro bioaktivitási vizsgálati eljárásban az 5., láncok közti hCGmutáns hatékonysága azonos nagyságrendbe esett a vad típusú rec-hCG hatékonyságával (7. ábra). Az 5., láncok közti hCG-mutáns tehát teljes értékű hCG-agonistának tekinthető.
8. példa
A 6., láncok közti hCG-mutáns (Hisa.90CysCysfiyCys)
A 6., láncok közti hCG-mutánst úgy állítottuk elő, hogy az a-lánc 90. pozíciójában található hisztidint ciszteinnel helyettesítettük. Rekombináns CHO-sejteket az egyéb, láncok közötti hCG-mutánsok esetében ismertetettek szerint szelektáltunk, immunoreaktív protein kiválasztására nézve. A tenyészet felülúszói egy hCG kimutatására szolgáló szendvics-ELISA-eljárásban a- és β-specifikus monoklonális ellenanyagokkal pozitív reakciót adtak. A 2. példában leírtak szerint végzett proteinanalízis alapján megállapítottuk, hogy a két alegység közt létrejött, molekulák közti kötéseket diszulfidhíd hozta létre.
A receptorkötődési aktivitás vizsgálata szerint, a mutáns a jóddal jelölt hCG-t a vad típusú hCG-hez hasonló mértékben volt képes leszorítani. Az in vitro bioaktivitási vizsgálati eljárásban a 6., láncok közti hCG-mutáns hatékonysága elhanyagolható volt. A 6., láncok közti hCG-mutáns tehát hCG-antagonistának tekinthető.
HU 222 043 Bl
9. példa
1., láncok közti LH-mutáns (Glna5Cys-Trp^8Cys)
Vektorkonstrukciót állítottunk elő olyan LH-mutáns expresszálására, amely egy további, láncok közti diszulfidhidat tartalmaz. Az LH β-láncát kódoló cDNS-t a leírtak szerint izoláltuk [Talmadge és munkatársai: Natúré 307, 37 (1984)], és azzal a pKMS.FSHagPg-vektorban az FSH-p-láncot kódoló cDNS-t helyettesítettük [Van Wezenbeek és munkatársai: (1990)].
Abból a célból, hogy az 1., láncok közti LH-mutáns α-láncába mutációt hozzunk létre, specifikus bázisszubsztitúciókat iktattunk be a „hibrid” α-génbe úgy, hogy az a5-glutamint kódoló kodont ciszteint kódoló kodon helyettesítse.
Az LHP-láncba specifikus bázisszubsztitúciókat iktattunk be úgy, hogy a p8-triptofánt kódoló kodont ciszteint kódoló kodon helyettesítse. A mutagenezist létrehozó PCR-reakciókat, a szubklónozást és szekvenálást a hCG esetében leírtakhoz hasonló módon végeztük. A mutációt hordozó proteint transzfektált CHO-K1sejtekben (ATCC CCL61) expresszáltattuk. Rekombináns CHO-sejteket immunoreaktív protein kiválasztása alapján szelektáltunk. A tenyészet felülúszói a- és βspecifikus monoklonális ellenanyagok alkalmazásával pozitív reakciót adtak egy LH kimutatására szolgáló szendvics-ELISA-eljárásban. A 2. példában leírtak szerint végzett proteinanalízis alapján arra következtettünk, hogy a két alegység között a molekulák közti kötést diszulfidhíd hozta létre.
A receptorkötő aktivitást és in vitro bioaktivitást a stabilan transzfektált CHO-sejtvonalakban expresszálódott humán receptorokon vizsgáltuk [Jia X. és munkatársai: (1991)]. Az 1., láncok közti LH-mutáns a jóddal jelölt hCG-t a vad típusú LH-hoz hasonló mértékben volt képes leszorítani (8. ábra).
10. példa
2., láncok közti LH-mutáns (Arga35CysA/ap35Cys)
A 2., láncok közti LH-mutánst úgy állítottuk elő, hogy az a-lánc 35. pozíciójában és a β-lánc 35. pozíciójában szubsztitúciót hoztunk létre, miáltal az itt található arginint és alanint cisztein-aminosawal helyettesítettük.
Rekombináns CHO-sejteket az egyéb, láncok közötti hCG-mutánsok esetében ismertetettek szerint szelektáltunk, immunoreaktív protein kiválasztása alapján. A tenyészet felülúszói a- és β-specifikus monoklonális ellenanyagok alkalmazásával pozitív reakciót adtak egy LH kimutatására szolgáló szendvics-ELISA-eljárásban. A receptorkötődési aktivitás vizsgálata során a 2., láncok közti LH-mutáns a jóddal jelölt hCG-t a vad típusú hCG-hez hasonló mértékben volt képes leszorítani (8. ábra).
11. példa
1., láncok közti FSH-mutáns (Glna5Cys-Ser$2Cys)
Vektorkonstrukciót állítottunk elő olyan FSH-mutáns expresszálására, amely egy további, láncok közti diszulfidhidat tartalmaz. Ezek struktúrája és általános szerveződése lényegében megegyezett a pKMS.FSHagpgvektoréval, amely vektort rekombináns, vad típusú FSH CHO-sejtekben történő expresszálására alkalmaztunk. A megfelelő amínosavpozíciókban - közelebbről, az FSH a- és β-alegységeit kódoló gének 5. (Gin) és 2. (Ser) pozíciójában - bázisszubsztitúciókat hoztunk létre úgy, hogy azokat ciszteint kódoló kodon helyettesítse (a β-gén szekvenciáját lásd, Keene és munkatársai: J. Bioi. Chem. 264, 4769 (1989)]. Transzfektált, rekombináns CHO-sejteket immunoreaktív proteinek kiválasztása alapján szelektáltunk. A tenyészet felülúszói a- és βspecifikus monoklonális ellenanyagok alkalmazásával pozitív reakciót adtak egy FSH kimutatására szolgáló szendvics-ELISA-eljárásban.
A receptorkötő aktivitást és in vitro bioaktivitást a stabilan transzfektált CHO-sejtvonalban expresszálódott humán receptorokon vizsgáltuk [Minegish és munkatársai: Biochem. Biophys. Rés. Comm. 175, 1125 (1991)]. Az 1., láncok közti FSH-mutáns receptorkötő aktivitását úgy határoztuk meg kvantitatív módon, hogy exponenciálisan szaporodó sejtekből izolált membránfiakciókon a mutáns által a receptorról leszorított radioligandum mennyiségét mértük. Összesen 0,5 ml térfogatban, körülbelül 100 pg membránproteint inkubáltunk meghatározott mennyiségű 125I-FSH (20 000 cpm, körülbelül 12 pmol), valamint fokozatosan növekvő mennyiségű kompetitor-FSH jelenlétében, 18 órán át, semleges hőmérsékleten. A 125I-jelölt FSH-t (NEX-106) a „Du Pont de Nemours”-tól szereztük be. A specifikus kötődés rendszerint, az alkalmazott 125I-jelölt FSH 10-12%-a volt. Az inkubálást követően a kötődött és a szabad hormont centrifúgálással szétválasztottuk. Standardként nagy tisztaságú, rekombináns FSH-t alkalmaztunk.
Az 1., láncok közti FSH-mutáns a jóddal jelölt FSH-t hasonló mértékben volt képes leszorítani a receptorról, mint a vad típusú FSH (9. ábra).
12. példa
2., láncok közti FSH-mutáns (Trpa37CysTrp$27Cys)
A 2., láncok közti FSH-mutánst úgy állítottuk elő, hogy az a-lánc 37. pozíciójában és a β-lánc 27. pozíciójában található aminosavak pozíciójában, ciszteint eredményező szubsztitúciókat hoztunk létre.
Rekombináns CHO-sejteket az egyéb, láncok közötti hCG-mutánsok esetében ismertetettek szerint szelektáltunk, immunoreaktív protein kiválasztása alapján. A tenyészet felülúszói a- és β-specifikus monoklonális ellenanyagok alkalmazásával pozitív reakciót adtak egy FSH kimutatására szolgáló szendvics-ELISA-eljárásban.
A receptorkötődési aktivitás vizsgálata során az 2., láncok közti FSH-mutáns a jóddal jelölt FSH-t hasonló mértékben volt képes leszorítani a receptorról, mint a vad típusú FSH (9. ábra).
Claims (17)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. a-Alegységből és β-alegységből felépülő gonadotropin, amely egy vagy több, nem natív diszulfidhidat tartalmaz.HU 222 043 Β1
- 2. Az 1. igénypont szerinti gonadotropin, amely alegységeket összekötő nem natív diszulfidhida(ka)t tartalmaz.
- 3. Az 1. igénypont szerinti gonadotropin, amely a felsorolt aminosavpárok közül egy vagy több pár tagjai között tartalmaz nem natív diszulfidhidat: (Pheal8CysIlea25Cys), (Glna20Cys-Alaa23Cys), (Sera34CysSera57Cys), (Thra39Cys-Thra54Cys), (Alaa62CysHisa79Cys), (Lysa63Cys-Alaa81Cys), (Tyra65CysHisa79Cys), valamint (Asna66Cys-Asna78Cys).
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti gonadotropin, amely β-alegységként a hCG β-alegységét tartalmazza.
- 5. A 4. igénypont szerinti gonadotropin, amely a felsorolt aminosavpárok közül egy vagy több pár tagjai között tartalmaz nem natív diszulfidhidat: (Glna5CysA^8Cys), (Proa24Cys-GlyP71Cys), (Meta29CysMetβ41Cys), (Arga35Cys-A^35Cys), (Tyra37CysIleβ33Cys), ^βοόΙί^β-Αβρβ^Ε^) és (Hisa90CysCysβyCys).
- 6. A 4. vagy 5. igénypont szerinti gonadotropin, amely a felsorolt aminosavpárok közül egy vagy több pár tagjai között tartalmaz nem natív diszulfidhidat: (Pn^4Cys-Pn^7Cys), (Pn^llCys-Tlui332Cys), (Propi 1 Cys-Alap85Cys), (Thrp32Cys-Alap85Cys), (ArgP60Cys-Serp87Cys), (ArgP60Cys-Glnp89Cys), (AspP61Cys-LeuP86Cys), (Aspp61Cys-Serp87Cys), (Serp66Cys-SerP81Cys) és (LeuP69Cys-ProP78Cys).
- 7. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti gonadotropin, amely a β-alegységként az LH β-alegységét tartalmazza.
- 8. A 7. igénypont szerinti gonadotropin, amely a felsorolt aminosavpárok közül egy vagy több pár tagjai között tartalmaz nem natív diszulfidhidat: (Glna5CysTrpp8Cys), (Proa24Cys-GlyP71Cys), (Meta29CysMetp41Cys), (Arga35Cys-Alap35Cys), (Tyra37CysIlep33Cys), (Lysa51Cys-Aspp99Cys) és (Hisa90CysCysPyCys).
- 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti gonadotropin, amely a felsorolt aminosavpárok közül egy vagy több pár tagjai között tartalmaz nem natív diszulfidhidat: (Prop4Cys-Prop7Cys), (Propi lCys-Thrp32Cys), (Propi lCys-Alap85Cys), (ThrP32Cys-AlaP85Cys), (ArgP60Cys-Serp87Cys), (ArgP60Cys-ArgP89Cys), (AspP61Cys-Leup86Cys), (AspP61Cys-SerP87Cys), (SerP66Cys-Serp81Cys) és (LeuP69Cys-Prop78Cys).
- 10. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti gonadotropin, amely β-alegységként az FSH β-alegységét tartalmazza.
- 11. A 10. igénypont szerinti gonadotropin, amely a felsorolt aminosavpárok közül egy vagy több pár tagjai között tartalmaz nem natív diszulfidhidat: (Glna5CysSerp2Cys), (Proa24Cys-GlyP65Cys), (Meta29CysArgP35Cys), (Arga35Cys-Alap29Cys), (Tyra37CysTrpP27Cys), (Lysa51Cys-AspP93Cys) és (Hisa90CysCysPyCys).
- 12. A 10. vagy 11. igénypont szerinti gonadotropin, amely a felsorolt aminosavpárok közül egy vagy több pár tagjai között tartalmaz nem natív diszulfidhidat: (LeuP5Cys-Thrp26Cys), (LeuP5Cys-Alap79Cys), (ThrP26Cys-AlaP79Cys), (LysP54Cys-GlnP81Cys), (Lysp54Cys-Hisp83Cys), (Glup55Cys-Thrp80Cys), (Glup55Cys-Glnp81Cys), (Thrp60Cys-Thrp75Cys), valamint (Vaip63Cys-SerP72Cys).
- 13. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti gonadotropin, amely β-alegységként a TSH β-alegységét tartalmazza.
- 14. A 13. igénypont szerinti gonadotropin, amely a felsorolt aminosavpárok közül egy vagy több pár tagjai között tartalmaz nem natív diszulfidhidat: (Glna5CysPheβlCys), (Proa24Cys-GlyP66Cys), (Meta29CysArgp34Cys), (Arga35Cys-Alap28Cys), (Tyra37CysIlep26Cys), (Lysa51Cys-AspP94Cys) és (Hisa90CysCysβyCys).
- 15. A 13. vagy 14. igénypont szerinti gonadotropin, amely a felsorolt aminosavpárok közül egy vagy több pár tagjai között tartalmaz nem natív diszulfidhidat: (Prop4Cys-ThrP25Cys), (ProP4Cys-AlaP80Cys), (Thrp25Cys-AlaP80Cys), (ArgP55Cys-SerP82Cys), (ArgP55Cys-Lysp84Cys), (Aspp56Cys-Leup81Cys), (Aspβ56Cys-Serβ82Cys), (Thrp61Cys-Ser376Cys) és (IleP64Cys-ProP73Cys).
- 16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti gonadotropin, terápiás hatóanyagként történő alkalmazásra.
- 17. Gyógyászati készítmény, amely egy vagy több, 1-15. igénypontok bármelyike szerinti gonadotropint és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP95202876 | 1995-10-24 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9602923D0 HU9602923D0 (en) | 1996-12-30 |
| HUP9602923A1 HUP9602923A1 (hu) | 1999-02-01 |
| HU222043B1 true HU222043B1 (hu) | 2003-04-28 |
Family
ID=8220762
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9602923A HU222043B1 (hu) | 1995-10-24 | 1996-10-22 | Nem natív diszulfidhidakat tartalmazó gonadotropinok |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5691455A (hu) |
| EP (1) | EP0785215B1 (hu) |
| JP (1) | JP4086922B2 (hu) |
| KR (1) | KR100498532B1 (hu) |
| CN (1) | CN1161381C (hu) |
| AR (1) | AR004088A1 (hu) |
| AT (1) | ATE218584T1 (hu) |
| AU (1) | AU711081B2 (hu) |
| BR (1) | BR9605220B1 (hu) |
| CA (1) | CA2188508C (hu) |
| DE (1) | DE69621577T2 (hu) |
| DK (1) | DK0785215T3 (hu) |
| ES (1) | ES2177721T3 (hu) |
| HU (1) | HU222043B1 (hu) |
| IL (1) | IL119412A (hu) |
| RU (1) | RU2174407C2 (hu) |
| TR (1) | TR199600852A2 (hu) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA985545B (en) * | 1997-06-25 | 1999-04-01 | Applied Research Systems | Disulfide crosslinking glycoprotein hormone analogs and their preparation and use |
| ZA987497B (en) * | 1997-09-08 | 1999-02-23 | Akzo Nobel Nv | Expression of gonadotropins in dictyostelium |
-
1995
- 1995-11-09 US US08/556,114 patent/US5691455A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-10-11 IL IL11941296A patent/IL119412A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-10-22 HU HU9602923A patent/HU222043B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-10-22 CA CA002188508A patent/CA2188508C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-10-22 EP EP96202940A patent/EP0785215B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-22 ES ES96202940T patent/ES2177721T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-22 AT AT96202940T patent/ATE218584T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-10-22 DK DK96202940T patent/DK0785215T3/da active
- 1996-10-22 DE DE69621577T patent/DE69621577T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-23 BR BRPI9605220-1A patent/BR9605220B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-10-23 RU RU96121076/14A patent/RU2174407C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-10-23 CN CNB961219521A patent/CN1161381C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-10-23 KR KR1019960047613A patent/KR100498532B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-10-24 AR ARP960104879A patent/AR004088A1/es active IP Right Grant
- 1996-10-24 AU AU70378/96A patent/AU711081B2/en not_active Ceased
- 1996-10-24 JP JP28263896A patent/JP4086922B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-10-24 TR TR96/00852A patent/TR199600852A2/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP9602923A1 (hu) | 1999-02-01 |
| BR9605220B1 (pt) | 2010-10-19 |
| AU7037896A (en) | 1997-05-01 |
| IL119412A0 (en) | 1997-01-10 |
| HU9602923D0 (en) | 1996-12-30 |
| US5691455A (en) | 1997-11-25 |
| JPH09176039A (ja) | 1997-07-08 |
| DE69621577D1 (de) | 2002-07-11 |
| CN1154371A (zh) | 1997-07-16 |
| KR100498532B1 (ko) | 2005-10-06 |
| AR004088A1 (es) | 1998-09-30 |
| RU2174407C2 (ru) | 2001-10-10 |
| EP0785215A1 (en) | 1997-07-23 |
| CA2188508A1 (en) | 1997-04-25 |
| CN1161381C (zh) | 2004-08-11 |
| ATE218584T1 (de) | 2002-06-15 |
| TR199600852A3 (hu) | 1997-05-21 |
| ES2177721T3 (es) | 2002-12-16 |
| DK0785215T3 (da) | 2002-09-16 |
| CA2188508C (en) | 2005-12-20 |
| AU711081B2 (en) | 1999-10-07 |
| MX9605048A (es) | 1997-09-30 |
| EP0785215B1 (en) | 2002-06-05 |
| JP4086922B2 (ja) | 2008-05-14 |
| TR199600852A2 (tr) | 1997-05-21 |
| DE69621577T2 (de) | 2003-01-16 |
| BR9605220A (pt) | 1998-07-21 |
| KR970021096A (ko) | 1997-05-28 |
| IL119412A (en) | 2000-07-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ryan et al. | The glycoprotein hormones: recent studies of structure‐function relationships | |
| Lambert et al. | Gonadotrophin heterogeneity and biopotency: implications for assisted reproduction. | |
| US20020110909A1 (en) | Glycoprotein hormone superagonists | |
| US20020160944A1 (en) | Multifunctional single chain glycoprotein hormones | |
| KR100560279B1 (ko) | 이황화결합으로 연결된 당단백질 호르몬 유사체, 이의제조방법 및 이의 용도 | |
| US6635256B1 (en) | Glycoprotein hormone compositions comprising two β subunits and methods of use thereof | |
| EP1017817B1 (en) | Mutants of thyroid stimulating hormone | |
| EP0673383B1 (en) | Analogs of glycoprotein hormones having altered receptor binding specificity and activity and methods for preparing and using same | |
| EP0954578B1 (en) | Glycoprotein hormone (tsh) superagonists | |
| HU222043B1 (hu) | Nem natív diszulfidhidakat tartalmazó gonadotropinok | |
| AU746780B2 (en) | Expression of gonadotropins in dictyostelium | |
| US5075224A (en) | Prepro-LHRH C-terminal peptide DNA | |
| US5130422A (en) | Variant somatotropin-encoding DNA | |
| MXPA96005048A (en) | Gonadotropinas with nonati disulfide bridges | |
| Haro et al. | Human growth hormone deletion mutant (hGH44-191) binds with high affinity to lactogenic receptors but not to somatogenic receptors | |
| EP1276765B1 (en) | Single-chain fertility hormones with variable lh activity | |
| Mills et al. | Fragments of human growth hormone produced by digestion with bromelain: Chemistry and biological properties | |
| Banerjee et al. | Structure function analysis: Lessons from human chorionic gonadotropin | |
| MXPA01003947A (en) | Multiple domain glycoprotein hormones and methods of using | |
| Dias | Human follitropin: Structure-activity relationships | |
| Bidart | Origin and properties of native and therapeutic hCG | |
| MXPA00002336A (en) | Expression of gonadotropins in dictyostelium | |
| MXPA00002716A (en) | Mutants of thyroid stimulating hormone and methods based thereon |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HFG4 | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20030131 |
|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: N.V. ORGANON, NL Free format text: FORMER OWNER(S): AKZO NOBEL N.V., NL |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |