DE69621577T2 - Gonadotropinderivate mit unnatürlichen Disulfidbrücken - Google Patents
Gonadotropinderivate mit unnatürlichen DisulfidbrückenInfo
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Description
- Die Erfindung bezieht sich auf Gonadotropine, auf pharmazeutische Arzneimittelzubereitungen, welche genannte Gonadotropine umfassen, und auf eine DNA, welche die genannten Gonadotropine kodiert.
- Die Gonadotropine bilden eine Familie von strukturell verwandten Glykoproteinhormonen. Typische Vertreter umfassen das Choriongonadotropin (CG), das follikelstimulierende Hormon (FSH), das luteinisierende Hormon (LH) und das thyreotrope Hormon (TSH). FSH, LH und TSH sind bei den meisten Wirbeltieren vorhanden und werden von der Hypophyse synthetisiert und sezerniert. CG wurde bislang nur bei Primaten, einschliesslich des Menschen, sowie bei Pferden nachgewiesen und wird im plazentaren Gewebe synthetisiert. Die Gonadotropine sind Heterodimere, die aus zwei ungleichen Untereinheiten, α und β genannt, zusammengesetzt sind, die durch eine nicht kovalente Bindung verbunden sind. Innerhalb einer Spezies ist die α-Untereinheit für jeden Vertreter der Gonadotropinfamilie im wesentlichen identisch; sie ist auch von Spezies zu Spezies in hohem Masse kohserviert. Die β- Untereinheiten sind bei jedem Vertreter, d. h. CG, FSH, TSH und LH, unterschiedlich, zeigen aber hinsichtlich ihrer Struktur beträchtliche Homologien. Weiter sind auch die β-Untereinheiten von Spezies zu Spezies in hohem Masse konserviert. Bei dem Menschen beinhaltet die α-Untereinheit 92 Aminosäurereste, während die β-Untereinheit sich bei jedem Vertreter in der Länge unterscheidet; 111 Reste in menschlichem FSH, 121 Reste in menschlichem LH, 118 Reste in menschlichem TSH und 145 Reste in HCG (Combarnous., Y. (1992), Endocrine Reviews, 13, 670-691. Lustbader, J.W. et al. (1993), Endocrine Reviews, 14, 291-311). Die β-Untereinheit des HCG ist wesentlich länger als die anderen β-Untereinheiten, da sie ungefähr 34 zusätzliche Aminosäuren am C-Terminus, hierin als das terminale Carboxyprotein (CTP) bezeichnet, beinhaltet.
- Die zwei Untereinheiten des Heterodimers machen viele konservierte Disulfidbrücken innerhalb der Untereinheit sichtbar, fünf Disulfidbrücken in der α-Untereinheit und sechs Disulfidbrücken in der β-Untereinheit. Die korrespondierenden Cysteinreste sind unter allen Mitgliedern der Gonadotropinfamilie vollständig konserviert. Die kürzlich ermittelte Röntgenstruktur des HCG zeigt, dass diese Disulfidbrücken in einem typischen dreidimensionalen Muster, dem sogenannten Disulfidknoten, angeordnet sind. Die Gonadotropine besitzen drei oder vier Asparaginreste, die N- glykolisiert sein können. Zudem kann das C-terminale Peptid (CTP) von HCG an vier Serinpositionen O-glykolisiert sein. Die Gonadotropine haben wichtige Aufgaben bei einer Vielzahl von Körperfunktionen, einschliesslich beim Metabolismus, der Temperaturregelung und beim Reproduktionsvorgang. Das Gonadotropin FSH aus der Hypophyse spielt zum Beispiel eine kardinale Rolle in der Stimulation der Follikelentwicklung und -reifung, während LH die Ovulation auslöst (Sharp, R.M. (1990), Clin. Endocrinol., 33, 787-807; Dorrington und Armstrong (1979), Recent. Prog. Horm. Res., 35, 301-342). Gegenwärtig wird FSH entweder allein oder in Kombination mit der LH-Aktivität zur ovariellen Stimulation, d. h. zur ovariellen Hyperstimulation bei der in vitro-Fertilisation (IVF) und zur Induktion einer in vivo-Ovulation bei infertilen, anovulatorischen Frauen (Insler, V. (1988), Int. J. Fertility, 33, 85-97, flavot und Rosenwaks (1988), J. Vitro. Fert. Embryo Transfer, 5, 3-14), sowie bei männlichem Hypogonadismus klinisch angewendet.
- Zur Zeit werden Gonadotropine, die für therapeutische Zwecke bestimmt sind, aus menschlichem Urin isoliert und sind daher von geringer Reinheit (Morse et al. (1988, Amer. J. Reproduct. Immunol. and Microbiology, 17, 143). Im Gegensatz zu diesen, aus dem Urin gewonnenen Gonadotropinen, bieten rekombinante Gonadotropine insofern grosse Vorteile, als dass sie von gleichbleibender Qualität sind, d. h. reproduzierbare biochemische und biologische Eigenschaften besitzen. Genomische und cDNA-Klone sind schon für alle Untereinheiten hergestellt worden und ihre Primärstrukturen entwickelt worden. Weiter sind chinesische Hamsterovarien (CHO) mit den Genen der menschlichen Gonadotropin-Untereinheiten transfiziert worden und diese Zellen zeigten sich in der Lage intakte Dimere zu sezernieren (z. B. Keene et al. (1989), J Biol. Chem., 264, 4769-4775; Van Wezenbeek et al., (1900), in From clone to Clinic (eds. Crommelin, D.J.A. und Schellekens, H.), 245-251).
- Seither konnte gezeigt werden, dass die biochemischen und biologischen Eigenschaften von z. B. rekombinantem FSH fast identisch mit denen des natürlichen FSH sind (Mannaerts et al. (1991), Endocrinology, 129, 2623-2630). Weiter konnten Schwangerschaften nach kontrollierter ovarieller Superovulation mit rekombinantem FSH erreicht werden (Germond et al. (1992), Lancet, 339, 1170, Devroey et al. (1992), Lancet, 339, 1170-1171).
- Die erfolgreiche Zusammenfügung der zwei Untereinheiten in das Dimer ist eine unabdingbare Vorraussetzung für die biologische Aktivität des Dimer. Die Dissoziation des Heterodimer in die zwei korrespondierenden Untereinheiten wird als Hauptpunkt für den Verlust der in vivo-Bioaktivität betrachtet. Im Weiteren führen Vorgänge, wie die Dissoziation und Desaminierung, zu einer verminderten Gebrauchsfähigkeitsdauer. Die thermodynamische Stabilität des Heterodimer wird daher als wichtiger Faktor betrachtet, der die Halbwertszeit der Gonadotropine unter in vivo- genauso wie unter in vitro- Bedingungen beeinflusst. Demzufolge gibt es einen klinischen Bedarf für weitere Verbesserungen der Stabilität der Gonadotropine.
- Die vorliegende Erfindung stellt solche Gonadotropine bereit. Überraschenderweise wurde nachgewiesen, dass eine oder mehr Disulfidbrücken in die Gonadotropine eingeführt werden konnten, was zu einer verbesserten Stabilität der genannten Gonadotropine führte. Nicht native Disulfidbrücken, wie hierin beschrieben, sind Disulfidbrücken, die nicht in den nativen Gonadotropinen vorkommen, folglich umfassen die nicht nativen Disulfidbrücken weder die fünf Disulfidbrücken in der α- Untereinheit noch die sechs Disulfidbrücken in der β- Untereinheit, die in den nativen Gonadotropinen vorhanden sind. Native Gonadotropine sind diejenigen Gonadotropine, die die gleiche Aminosäuresequenz haben wie die Gonadotropine, die aus dem relevanten Gewebe isoliert wurden.
- Daher stellt die vorliegende Erfindung Gonadotropine bereit, die eine α-Untereinheit und eine β-Untereinheit beinhalten, die eine oder mehrere nicht native Disulfidbrücken umfassen. Die nicht nativen Disulfidbrücken können durch gezielte Mutagenese eingeführt werden: Punktmutation des nativen Aminosäurerests an der relevanten Position zu einem Cystein. Die Punktmutation wird als X αy Cys oder X βy Cys notiert, in denen X der Aminosäurerest an der relevanten Position y auf der α- bzw. der β-Untereinheit ist und zu Cystein mutiert wird (der 3-Buchstaben-Code wird für die Aminosäuren verwendet). Die Schreibweisen Cys αy Cys oder Cys βy Cys beziehen sich auf die Positionen y der Cysteine in der nativen Untereinheit. Die Punktmutationen gemäss der Erfindung führen zu feinen Änderungen in der Konformation der Gonadotropine.
- Der Anwendungsbereich der Erfindung umfasst auch Gonadotropine, in denen nur eine Mutation eingeführt worden ist. Solch eine Mutation kann in die DNA, die die α- und β- Untereinheit kodiert, eingeführt werden, wobei ein neuer Cysteinrest entsteht, der in der Lage ist, eine Disulfidbrücke mit einem schon existierenden Cysteinrest zu bilden. Solche Mutationen werden vorzugsweise in die α-Untereinheit eingeführt, am bevorzugtesten in die Aminosäurepositionen 88- 92.
- Die nicht nativen Disulfidbrücken gemäss der Erfindung können zwischen den Paaren der Aminosäurereste vorhanden sein, wobei die Aminosäurereste auf verschiedenen Untereinheiten (zwischen den Untereinheiten) positioniert sind. Zusätzlich können die nicht nativen Disulfidbrücken auch zwischen den Aminosäurerestpaare vorhanden sein, wobei beide Aminosäurereste auf derselben Untereinheit positioniert sind (innerhalb der Untereinheit). Als Folge der Gegenwart einer oder mehrerer nicht nativer Disulfidbrücken gemäss der Erfindung können gegebenenfalls eine oder mehrere der elf Disulfidbrücken getilgt werden.
- Die nicht nativen, erfindungsgemässen Disulfidbrücken verhindern die Dimerdissoziation, woraus sich eine höhere in vitro- sowie in vivo-Biostabilität und eine verbesserte Gebrauchsfähigkeitsdauer gegenüber den nativen Glykoproteinen ergibt. Weiter verringern sie die Flexibilität des Polypeptidgerüsts der Gonadotropine, was die Gonadotropine weniger empfänglich für die Desaminierung macht. Desaminierung ist ein spontaner Vorgang, der unter physiologischen Bedingungen vorkommt und die Reinheit und Proteinstabilität in negativer Weise beeinflusst.
- Gonadotropine, in denen eine Kombination von nicht nativen Disulfidbrücken zwischen und innerhalb der Untereinheiten vorhanden ist, liegen auch im Anwendungsbereich der Erfindung.
- Geeignete erfindungsgemässe Gonadotropine, in denen die α- Untereinheit menschlichen Ursprungs ist, umfassen eine nicht native Disulfidbrücke innerhalb der Untereinheit zwischen einem Aminosäurepaar oder mehrerer Aminosäurepaaren (Phe α18 Cys-Ile α25 Cys), (Gln α20 Cys-Ala α23 Cys), (Ser α34 Cys -Ser α57 Cys), (Thr α39 Cys-Thr α54 Cys), (Ala α62 Cys- His α79 Cys) und (Lys α63 Cys-Ala α81 Cys), (Tyr α65 Cys- His α79 Cys) und (Asn α66 Cys-Asn α78 Cys).
- Geeignete Gonadotropine gemäss der vorliegenden Erfindung, in denen die β-Untereinheit die β-Untereinheit von HCG ist, können eine Disulfidbrücke zwischen den Untereinheiten zwischen einem Aminosäurepaar oder mehreren Aminosäurepaaren (Gln α5 Cys- Arg β8 Cys), (Pro α24 Cys-Gly β71 Cys), (Met α29 Cys-Met β41 Cys), (Arg α35 Cys-Ala β35 Cys), (Tyr α37 Cys-Ile β33 Cys), (Lys α51 Cys-Asp β99 Cys) und (His α90 Cys-Cys βy Cys) und/oder eine Disulfidbrücke innerhalb der Untereinheit zwischen einem Aminosäurepaar oder mehreren Aminosäurepaaren (Pro β4 Cys-Pro β7 Cys), (Pro β11 Cys-Thr β32 Cys), (Pro β11 Cys-Ala β85 Cys), (Thr β32 Cys-Ala β85 Cys), (Arg β60 Cys-Ser β87 Cys), (Arg β60 Cys-Gln β89 Cys), (Asp β61 Cys- Leu β86 Cys), (Asp β61 Cys-Ser β87 Cys), (Ser β66 Cys-Ser β81 Cys) und (Leu β69 Cys-Pro β78 Cys) umfassen. Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemässe HCG eine nicht native Disulfidbrücke zwischen den Untereinheiten zwischen den Aminosäurepaaren (Met α29 Cys-Met β41 Cys), (Tyr α37 Cys- Ile β33 Cys) oder (Lys α51 Cys-Asp β99 Cys) oder (His α90 Cys -Cys βy Cys).
- Geeignete erfindungsgemässe Gonadotropine, in denen die β- Untereinheit die β-Untereinheit von menschlichem LH ist, umfassen eine Disulfidbrücke zwischen den Untereinheiten zwischen einem Aminosäurepaar oder mehreren Aminosäurepaaren (Gln α5 Cys-Trp β8 Cys), (Pro α24 Cys-Gly β71 Cys), (Met α29 Cys-Met β41 Cys), (Arg α35 Cys-Ala β35 Cys), (Tyr α37 Cys-Ile β33 Cys), (Lys α51 Cys-Asp β99 Cys) und (His α90 Cys-Cys βy Cys) und/oder eine Disulfidbrücke innerhalb der Untereinheit zwischen einem Aminosäurepaar oder mehreren Aminosäurepaaren (Pro β4 Cys-Pro β7 Cys), (Pro β11 Cys-Thr β32 Cys), (Pro β11-Ala β85 Cys), (Thr β32 Cys-Ala β85 Cys), (Arg β60 Cys-Ser β87 Cys), (Arg β60 Cys-Arg β89 Cys), (Asp β61 Cys-Leu β86 Cys), (Asp β61 Cys-Ser β87 Cys), (Ser β66 Cys-Ser β81 Cys) und (Leu β69 Cys-Pro β78 Cys). Ein bevorzugtes Gonadotropin gemäss der Erfindung ist menschliches LH, das eine Disulfidbrücke zwischen den Aminosäurepaaren (Met α29 Cys-Met β41 Cys), (Tyr α37 Cys-Ile β33 Cys), (Lys α51 Cys-Asp β99 Cys) oder (His α90 Cys-Cys βy Cys) umfasst. Geeignete Gonadotropine gemäss der Erfindung, in denen die β- Untereinheit die β-Untereinheit von menschlichem FSH ist, umfassen eine Disulfidbrücke zwischen den Untereinheiten zwischen einem Aminosäurepaar oder mehreren Aminosäurepaaren (Gln α5 Cys-Ser β2 Cys), (Pro α24 Cys-Gly β65 Cys), ((Met α29 Cys-Arg β35 Cys), (Arg α35 Cys-Ala β29 Cys), (Tyr α37 Cys-Trp β27 Cys), (Lys α51 Cys-Asp β93 Cys) und (His α90 Cys-Cys βy Cys) und/oder eine Disulfidbrücke innerhalb der Untereinheit zwischen einem Aminosäurepaar oder mehreren Aminosäurepaaren (Leu β5 Cys-Thr β26 Cys), (Leu β5 Cys-Ala β79 Cys), (Thr β26 Cys-Ala β79 Cys), (Lys β54 Cys-Gln β81- Cys), (Lys β54 Cys-His β83 Cys), (Glu β55 Cys-Thr β80 Cys), (Glu β55 Cys-Gln β81 Cys), (Thr β60 Cys-Thr β75 Cys) und (Val β63 Cys-Ser β72 Cys). Ein bevorzugtes Gonadotropin gemäss der Erfindung ist menschliches FSH, in dem die β- Untereinheit eine Disulfidbrücke zwischen den Untereinheiten zwischen dem Aminosäurepaar (Tyr α37 Cys-Trp β27 Cys) oder (His α90 Cys-Cys βy Cys) umfasst.
- Geeignete Gonadotropine gemäss der Erfindung, in denen die β- Untereinheit die β-Untereinheit von menschlichem TSH ist, umfassen eine Disulfidbrücke zwischen den Untereinheiten zwischen einem Aminosäurepaar oder mehrerer Aminosäurepaaren (Gln α5 Cys-Phe β1 Cys), (Pro α24 Cys-Gly β66 Cys), (Met α29 Cys-Arg β34 Cys), (Arg α35 Cys-Ala β28 Cys), (Tyr α37 Cys-Ile β26 Cys), (Lys α51 Cys-Asp β94 Cys) und (His α90 Cys-Cys βy Cys) und/oder eine Disulfidbrücke innerhalb der Untereinheit zwischen einem Aminosäurepaar oder mehreren Aminosäurepaaren (Pro β4 Cys-Thr β25 Cys), (Pro β4 Cys-Ala β80 Cys), (Thr β25 Cys-Ala β80 Cys), (Arg β55 Cys-Ser β82 Cys), (Arg β55 Cys-Lys β84 Cys), (Asp β56 Cys-Leu β81 Cys), (Asp β56 Cys-Ser β82 Cys), (Thr β61 Cys- Ser β76 Cys) und (Ile β64 Cys-Pro β73 Cys).
- Es ist offensichtlich, dass auch Kombinationen von nicht nativen Disulfidbrücken zwischen den Untereinheiten oder innerhalb der Untereinheiten in die Erfindung eingeschlossen sind.
- Die Position der Mutationen, wie siehe oben angegeben wurden, beziehen sich auf Aminosäuresequenzen von menschlichen Gonadotropinen. Vergleichbare, nicht native Disulfidbrücken innerhalb der Untereinheiten der Gonadotropine von anderen Spezies liegen auch innerhalb des Anwendungsbereichs der Erfindung. Die genaue Position der Aminosäurereste, die zu Cystein mutiert werden sollen, können aus der Sequenzausrichtung der genannten Gonadotropin-Untereinheiten mit den menschlichen Gonadotropin-Untereinheiten hergeleitet werden.
- Aufgrund der wichtigen Rolle, die die Disulfidbindung bei der Faltung und Zusammensetzung der Untereinheiten spielt, ist es sehr überraschend, dass die Einführung der nicht nativen, erfindungsgemässen Disulfidbrücken nicht mit der Formation der ordnungsgemäss gefalteten Gonadotropine interferiert. Die passende Formation der Disulfidbindung ist ein kritischer Punkt bei der Faltung und Reifung der funktionellen Gonadotropine. Insbesondere die Formation der Disulfidbindung in der β-Untereinheit ist kritisch: alle Disulfidbindungen werden für die erfolgreiche Kombination und Faltung benötigt. Detaillierte Studien zur Faltung des HCG bestätigten, dass die Faltung des Moleküls nicht durch einen einfachen sequentiellen Pathway abläuft, sondern unabhängig voneinander in verschiedenen Domänen des Moleküls. Daraus schloss man, dass die Einführung eines zusätzlichen Cysteinrestes in die α- und/oder β-Untereinheiten den Faltvorgang insofern stören würde, als dass sich ein Verlust der Konformation des Moleküls ergeben würde und als Konsequenz hieraus eine Einbusse an Funktionalität und Bioaktivität des Moleküls entstehen würde. Insbesondere wenn schon viele Cysteine in diesen Molekülen vorhanden sind.
- Die erfindungsgemässen Punktmutationen zu Cystein verändern nur am Rande die Gesamtaminosäurezusammensetzung und die Proteineigenschaften, daher haben die erfindungsgemässen Gonadotropine den zusätzlichen Vorteil, dass ihre potentielle Fähigkeit Immunreaktionen auszulösen sich nicht wesentlich von derjenigen der Gonadotropine des Wildtyps unterscheidet. Die Wirkung auf die immunreaktive Potenz wird vernachlässigbar sein, wenn insbesondere die nicht nativen Disulfidbrücken an der Dimerschnittstelle der Gonadotropine positioniert sind. Die erfindungsgemässen Gonadotropine können in Abhängigkeit von ihrem Mutationsort Agonisten oder Antagonisten sein. Wie schon vorher erwähnt, kann die Mutationsstelle zu geringfügigen Änderungen in der Konformation des Moleküls führen. Wenn die Mutationsstelle in Teilen des Proteins gewählt wird, die mit der Rezeptorbindungsstelle und/oder der Signaltransduktion assoziiert sind, können die erfindungsgemässen, nicht nativen Disulfidbrücken zu einem teilweisen oder vollständigen Verlust der Signaltransduktionsaktivität in Kombination mit erhöhter Proteinstabilität führen. Wenn die Mutationsstelle an der Dimerschnittstelle am inneren Kern des Glykproteins gewählt wird, werden die sich ergebenden, nicht nativen Disulfidbrücken keine Wirkung auf die Rezeptorbindung und/oder Signaltransduktionsaktivität haben, aber zu einer erhöhten Stabilität im Vergleich zu den nativen Gonadotropinen führen. Solche Mutationen werden einen Gonadotropinagonisten mit erhöhter Stabilität ergeben.
- Die erfindungsgemässen Gonadotropine können andere Modifikationen, die im Stand der Technik bekannt sind, umfassen.
- In solch einer bevorzugten Modifikation der erfindungsgemässen Gonadotropine ist der C-Terminus der Aminosäuresequenz einer Untereinheit mit dem N-Terminus der Aminosäuresequenz der anderen Untereinheit (gegebenenfalls durch eine Linkerkomponente) verbunden. Vorzugsweise ist die Linkerkomponente eine vollständige oder teilweise CPT-Einheit oder eine Variante davon.
- Andere Modifikationen der erfindungsgemässen Gonadotropine können eine Extension der α- und/oder β-Untereinheit an ihrem N- bzw. C-Terminus mit einer vollständigen oder teilweisen CTP-Einheit oder einer Variante davon sein. Die Extension kann die jeweiligen CTP-Einheiten in einfacher oder mehrfachen Form umfassen. Alternativ hierzu kann eine vollständige CTP-Einheit oder eine teilweise CTP-Einheit oder eine Mehrfachform davon in die N- oder C-Termini der genannten Untereinheiten eingefügt werden.
- Weiter können die erfindungsgemässen Gonadotropine entweder glykosyliert, teilweise glykosyliert oder nicht glykosyliert sein. Teilweise oder nicht glykolysierte, erfindungsgemässe Gonadotropine können entweder durch chemische Veränderung, enzymatische Veränderung oder durch gerichtete Mutagenese ("site directed") gewonnen werden, wodurch eine oder mehrere Erkennungsstellen für die Glykolysierung in den Gonadotropinen entfernt werden. Alternativ hierzu können die Glykolysierungsmuster der erfindungsgemässen Gonadotropine durch die Einführung zusätzlicher Glykolysierungs- Erkennungsstellen und gegebenenfalls durch Entfernung einer oder mehrerer Glykolysierungs-Erkennungsstellen modifiziert werden, was eine veränderte Glykolysierung der genannten Gonadotropine ergibt. Eine Glykolysierungs-Erkennungsstelle, wie sie hierin verwendet wird, besteht aus der Aminosäuresequenz Asn-X-Ser/Thr, worin X irgendeine Aminosäure sein kann.
- Wie hierin verwendet haben im Allgemeinen die α- und β- Untereinheiten von CG, FSH, LH und TSH sowie die heterodimeren Formen ihre konventionellen Definitionen und beziehen sich auf die Proteine, welche die Aminosäuresequenzen oder allele Varianten davon besitzen, die per se im Stand der Technik bekannt sind, unabhängig von ihrem angezeigten Glykolysierungsmuster.
- "Native" Formen dieser Proteine sind solche Proteine, welche die Aminosäuresequenzen besitzen, die von dem entsprechenden Wirbeltiergewebe isoliert wurden.
- Diese "Varianten" sind solche Proteine, die im Vergleich zu den nativen Proteinen bewusste Veränderungen in der Aminosäuresequenz besitzen. Die Veränderungen können einfache oder mehrfache Deletionen, Insertionen, Substitutionen und Kombinationen davon beinhalten und können zum Beispiel durch Mutagenese an dem spezifischen Mutationsort oder durch andere rekombinante Manipulationen erreicht werden oder sie können synthetisch hergestellt werden. Vorzugsweise bestehen diese Veränderungen aus konservativen Aminosäuresubstitutionen, in denen der substituierte Rest aus der gleichen allgemeinen Aminosäurekategorie stammt wie der Rest, der für die Substitution verwendet wurde. Solch eine Klassifizierung der Aminosäuren ist allgemein in der Technik bekannt und beschrieben, zum Beispiel in Dayhoff, M. et al., Atlas of Protein Sequences and Structure, 1972, 5, 89-99.
- Die hierin verwendete "CTP-Einheit" bezieht sich auf die Aminosäuresequenz, die an dem Carboxy-Ende der β-Untereinheit des HCG gefunden wurde, die sich über die Aminosäure 112-118 bis Rest 145 an dem C-Terminus erstreckt oder über einen Teil hiervon. Eine "vollständige" CTP-Einheit beinhaltet 28-34 Aminosäuren, was abhängig von dem N-Terminus von CTP ist. Eine "partielle" CTP-Einheit ist eine Aminosäuresequenz, die zwischen den Positionen 112-118 bis inklusive 145 vorkommt, aber wenigstens eine Aminosäure besitzt, die von der kürzest möglichen CTP-Einheit (Aminosäure 118-145) deletiert ist. Unter "mehreren" CTP-Einheiten wird verstanden, dass sie eine Tandemanordnung von einer "vollständigen" CTP-Einheit oder einer "partiellen" CTP-Einheit oder einer Kombination davon umfassen.
- Die DNA, die einen der erfindungsgemässen Gonadotropine kodiert, liegt auch im Bereich der Erfindung. Die genannte erfindungsgemässe DNA umfasst eine oder mehrere Cysteinkodierende Kodone, die für die Kodone substituiert wurden, die die zu ersetzende Aminosäure kodieren. Die erfindungsgemässe DNA kann aus der DNA hergestellt werden, welche die nativen Gonadotropine oder Varianten davon kodiert, mittels Substitution von einem oder mehreren Kodonen, die den Aminosäurerest in der genannten DNA kodieren, welcher durch ein Cystein kodierendes Kodon ersetzt wird. Diese Mutationen können durch gerichtete Mutagenese hergestellt werden.
- Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Gonadotropine sind im Stand der Technik gut bekannt (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, letzte Edition). Die praktischste Herangehensweise ist die Herstellung dieser Gonadotropine durch Expression der DNA, die das gewünschte Protein kodiert. Techniken für die gerichtete Mutagenese, Ligation zusätzlicher Sequenzen, PCR und Herstellung geeigneter Expressionssysteme sind mittlerweile in der Technik bekannt. Die gesamte oder teilweise DNA, die das gewünschte Protein kodiert, kann durch standardisierte Festphasentechniken, vorzugsweise um Restriktionsstellen für eine erleichterte Ligation zu beinhalten, synthetisch hergestellt werden. Geeignete Kontrollelemente für die Transkription und Translation der eingeschlossenen kodierenden Sequenzen können den DNAkodierenden Sequenzen bereitgestellt werden. Wie gut bekannt ist, sind Expressionssysteme nun erhältlich, die mit einer grossen Vielfalt von Wirten kompatibel sind, eingeschlossen prokaryontische Wirte, wie Bakterien und eukaryontische Wirte, wie Hefe, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Säugetierzellen, Vogelzellen und dergleichen. Die Wahl des Wirts ist insbesondere von posttranslatorischen Ereignissen, im wesentlichen von der Glykosylierung, abhängig. Der Ort der Glykosylierung wird meistens von dem Wesen der Glykosylierungsstelle innerhalb des Moleküls kontrolliert. Trotzdem werden die Eigenschaften der Zucker, die diese Stelle belegen, weitgehend durch das Wesen des Wirtes bestimmt.
- Die erfindungsgemässen Gonadotropine können für die gleichen klinischen Zwecke wie die natürlichen Gonadotropine angewendet werden, nur mit dem Vorteil, dass sie eine verbesserte Stabilität aufweisen. Die mutierten Gonadotropine können als Agonisten oder als Antagonisten, abhängig von der Art der Mutation, angewendet werden. Geeignete pharmazeutische Zubereitungen gemäss der Erfindung umfassen ein oder mehrere der erfindungsgemässen Gonadotropine und einen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff.
- Pharmazeutisch annehmbare Trägerstoffe sind den im Stand der Technik Erfahrenen gut bekannt und beinhalten zum Beispiel sterile Salze, Laktose, Sucrose, Calciumphosphat, Gelatine, Dextrin, Agar, Pektin, Erdnussöl, Olivenöl, Sesamöl und Wasser.
- Weiter kann die pharmazeutische Zubereitung gemäss der Erfindung einen oder mehrere Stabilisatoren umfassen, wie zum Beispiel Kohlenhydrate, darunter Sorbitol, Mannitol, Stärke, Sukrosedextrin und Glukose, sowie Proteine, wie Albumin oder Kasein, und Puffer wie alkalische Phosphate.
- Geeignete Anwendungsmöglichkeiten sind die intramuskuläre Injektion, die subkutane Injektion, die intravenöse Injektion oder die intraperitoneale Injektion sowie die orale und intranasale Anwendung.
- Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung und sollten in keinster Weise als Einschränkung des Erfindungsbereichs interpretiert werden.
- Abb. 1: Die strukturelle Organisation des HCGαgβc Expressionsplasmid pMKS. HCGαcβc. SV40 = SV40 früher Promotor. E = M-MuLV Verstärker. MT-IIA = menschliches Metallothionein- IIA-Promotor. HCGαg = genomes HCGα Minigen, das die HCGα- Untereinheit kodiert. HCGβc = cDNA, die die HCGβ-Untereinheit kodiert. β-Globin = Hasen β-Globin Polyadenylierungssequenz und Spleisssignale. S = SV40 terminierende Transkriptionssequenz. PBR327 = Teil des Plasmid pBR327, das die originäre E.coli Replikation und ein Ampicillinresistenz vermittelndes Gen beinhaltet.
- Abb. 2: Westernblot-Analyse von Zellkulturüberständen von HCG-interchain 1, HCG-interchain 2 und von dem HCG-Wildtyp hinsichtlich der Expression von HCG (mutierte Proteine) und der Bildung von Disulfidbrücken, die zwischen den Untereinheiten liegen. Zellkulturüberstände von G418- resistenten Transfektionspools HCG-Interchain 1, HCG- Interchain 2 und vom rec-HCG Wildtyp, die ungefähr 0,2 IU HCG beinhalten, werden bei Raumtemperatur (Panel A) oder bei 100ºC (Panels B und C) in SDS-haltigem Probenpuffer in Abwesenheit (Panels A und B) oder Anwesenheit von β-Mercaptoethanol (Panel C) gelöst. Nach Elektrophorese und dem Transfer auf PVDF- Membranen wurde das HCG durch Inkubation mit einem β-HCG spezifischen monoklonalen Antikörper sichtbar gemacht, gefolgt von der Inkubation mit einem zweiten Antikörper-HRP-Konjugat und der Färbung mit TMB. Wie gesehen werden kann, konnte durch die Solubilisierung bei Raumtemperatur (Panel A, Reihe 1 und 2) sowie bei 100ºC (Panel B, Reihe 1 und 2) der Nachweis des intakten Hormons erbracht werden, wohingegen bei der Kontrolle (HCG-WT) das Hormon durch das Kochen in seine Untereinheiten zerteilte wurde (Panel B, Reihe 3). Die Zugabe eines reduzierenden Stoffes bewirkt die Dissoziation der Untereinheiten in allen drei Proben (Panel C). Die kombinierten Daten führen so zu der Schlussfolgerung, dass HCG-Interchain 1 sowie 2 durch eine intermolekulare Disulfidbrücke stabilisiert werden.
- Abb. 3: HCG-Verdrängungstest von zwischen den Untereinheiten mutierten HCG-Proteinen. B/B0 = % der totalen Bindung... -+- = HCG-Wildtyp (WT) -Δ- = HCG-interchain 1 -o- = HCG-interchain 2.
- Abb. 4: In vitro-Bioaktivität von zwischen den Untereinheiten mutierten HCG-Proteinen. -+- I.S. 75/537. -Δ- = HCG-interchain 1 -o- = HCG-interchain 2.
- Abb. 5: HCG-Plasmaspiegel nach i.m. Injektion einer rekombinanten HCG-Zubereitung bei weiblichen Beagles.
- Abb. 6: Bindungsaktivität vom HCG-Wildtyp und den zwischen den Ketten mutierten HCG-Mutanten gegenüber CHO- Zellmembranen, welche den menschlichen LH/CG-Rezeptor stabil exprimieren. Die Membranen wurden mit ¹²&sup5;J-markiertem HCG in Abwesenheit oder Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen des nicht markierten HCG-Wildtyps oder der zwischen den Ketten mutierten HCGs inkubiert. Die Verdrängungskurven sind als prozentualer Anteil der maximalen Bindung bei der jeweiligen Dosis nicht markierter Hormone dargestellt.
- Abb. 7: Biologische in vitro-Aktivität des HCG-Wildtyps und der HCG-interchain-Moleküle. Das extrazelluläre cAMP wurde durch spezifische RIA nach Stimulation der CHO-Zellen, die den menschlichen LH/CG-Rezeptor stabil exprimieren, gemessen.
- Abb. 8: Bindungsaktivität des HCG-Wildtyps, des LH- Wildtyps und der LH-Interchain-Mutanten gegenüber CHO- Zellmembranen, welche den menschlichen LH/CG-Rezeptor stabil exprimieren. Die Membranen wurden mit ¹²&sup5;J-markiertem HCG in Ab- oder Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen nicht markiertem HCG-Wildtyp, LH-Wildtyp oder den LH- Interchain-Mutanten inkubiert. Die Verdrängungskurven werden als prozentualer Anteil der maximalen Bindung unter der jeweiligen unmarkierten Hormondosis dargestellt.
- Abb. 9: Bindungsaktivität des FSH-Wildtyps und der FSH- Interchain-Mutanten gegenüber CHO-Zellmembranen, die stabil den menschlichen FSH-Rezeptor exprimieren. Die Membranen wurden mit ¹²&sup5;J-markiertem FSH in An- oder Abwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen nicht markiertem FSH-Wildtyp oder den FSH-Interchain-Mutanten. Die Verdrängungskurven wurden als prozentualer Anteil an der maximalen Bindung bei der jeweiligen Dosis des unmarkierten Hormons dargestellt.
- Es wurden drei Bauweisen entwickelt, um mutierte HCG-Proteine mit einer zusätzlichen, zwischen den Ketten befindlichen Disulfidbrücke zu exprimieren. Ihre Struktur und Gesamtorganisation ist im Wesentlichen identisch mit pKMS. HCGαgβc, dem Vektor, der für die Expression des rekombinanten HCG-Wildtyps in CHO-Zellen verwendet wurde (Abb. 1). Die jeweiligen Gene der HCG α-Untereinheit (Fiddes, J.C. and Goodman, H.M. (1981), J. Mol. Appl. Genet. 1, 3-18) und der β-Untereinheit (Fiddes, J.C. and Goodman, H. M., Nature 286, 684-687) sind in pKMS eingeführt worden. Durch die Verbindung eines cDNA-Klons mit einem genomischen Klon wurde ein vollständiges "hybrides" HCG-α-Gen hergestellt (Van Wezenbeek et al., 1990), welches in der Lage ist, die α-Untereinheit des Wildtypen über Transfektion in eine Wirtszelle zu exprimieren. Die cDNA für die β-Untereinheit des HCG wurde wie beschrieben hergestellt und mit der β-Untereinheit des FSH im Vektor pKMS. FSH ausgetauscht. Die Transkription des α-Gens wird vom SV40- Frühpromotor gesteuert, wobei das β-Gen von dem menschlichen, durch Schwermetalle induzierbaren Metallothionein IIa-Promotor transkribiert wird. Drei HCG interchain Konstrukte wurden hergestellt (Tabelle 1).
- Für die Konstruktion der Mutation in der α-Untereinheit von HCG-interchain 1 wurden spezifische Basensubstitutionen in das "hybride" HCG-α-Gen auf die Weise eingeführt, dass das Kodon, das Tyrosin α37 kodiert, für ein Cystein kodierendes Kodon ausgetauscht wurde. Dies wurde mit einer gerichteten Mutagenese und durch die Vereinigung der PCR-Fragmente, die in den Sequenzen überlappen, wie beschrieben unter Verwendung von standardisierten PCR-Bedingungen durchgeführt (Erich, H.A. (1989) PCR Technology; Principles and Applications for DNA- Amplification. Stockton Press, New York, pp 63-66). Die PCR- Fragmente wurden getrennt, in pGEM3Z geklont und unter Verwendung eines Sequenzierungsautomaten (Pharmacia) kontrolliert. Die Primer wurden folgendermassen ausgewählt: das subklonierte PCR-Fragment beinhaltete geeignete Restriktionsstellen, die beide 3' und 5' von der Mutation bzw. den Mutationen gelegen sind, so dass sie mit der nativen α- Kettensequenz in pKMS. HCGαgβc ausgetauscht werden konnten. Dieses wurde unter Standardbedingungen ausgeführt.
- Für die Konstruktion der Mutation in der β-Kette von HCG- interchain 1 wurden spezifische Basensubstitutionen in die β- Kette des HCG in der Weise eingeführt, dass das Kodon, welches Isoleucin β33 kodiert, für ein Cystein kodierendes Kodon ausgetauscht wurde. Die mutagenen PCR-Reaktionen, das Subklonieren und Sequenzieren wurden mit Verfahren durchgeführt, die vergleichbar mit denen sind, die für die Konstruktion der Mutation in der α-Untereinheit verwendet wurden. Für die Konstruktion des endgültigen Expressionsplasmid der HCG-interchain 1 wurde das Gen des HCGßc-Wildtyps mit dem mutierten HCG β-Fragment in dem pKMS. HCGαgßc-Konstrukt, das schon die Mutation in der α- Untereinheit beinhaltet, ausgetauscht.
- Für die Konstruktion der Vektoren, die das HCG-interchain 2 (in der die Kodone für Lysin α51 und Asparagin β99 durch Cystein-kodierende Kodone ersetzt worden sind) und das HCG- interchain 3 (in der die Kodone für Methionin α29 und Methionin β41 durch Cystein-kodierende Kodone ersetzt worden sind) kodieren, wurde nach einer vergleichbaren Vorgehensweise vorgegangen. Tabelle 1. Die mutierten Cystein-Kodone im HCG.
- Die CHO-K1-Zellen (ATCC CCL61) wurden dauerhaft mit 10 ug der pKMS HCG-interchain-Konstrukte mit Transfectam-Reagenz (Promega) transfiziert. Ein Selektionsplasmid, das ein Neomyzin-Selektionsgen beinhaltet, wurde in einem molaren Verhältnis von 10 : 1 (pKMS HCG-interchain bildet den grösseren Anteil) kotransfiziert, um eine Selektion von Zellen im Kulturmedium, welches G418 (0,8 mg/ml) enthält, zu erreichen. Rekombinante CHO-Zellen wurden hinsichtlich der Exkretion eines immunreaktiven Proteins selektioniert. Kulturüberstände reagierten positiv in einem HCG-Sandwich-ELISA-Test unter Verwendung von α- und β-spezifischen monoklonalen Antikörpern. Die Durchführung eines Western Blot an der Kultur zeigte, dass die HCG-interchain-Mutanten ein molekulares Gewicht zeigen, das vergleichbar mit dem Gewicht des rec-HCG-Wildtyps ist.
- Um zu bestimmen, ob die neu eingeführten Cysteine in eine zwischen den Ketten liegende Disulfidbindung oxidiert worden sind, wurden Proben der Zellkulturüberstände des G418- resistenten Transfektionspool durch Kochen in einem SDS- haltigen Probenpuffer gelöst, einer SDS-Polyacrylamidgel- Elektrophorese zugeführt und auf eine PVDF-Membran transferiert. Das HCG wurde mit Hilfe einer Immunfärbung mit einem monoklonalen Antikörper, der gegen die β-Untereinheit gerichtet ist, und nachfolgender Inkubation mit einem zweiten Antikörper, der mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiert ist, und Färbung mit Tetramethylbenzidin (TMB)/Co&spplus;&spplus;/H&sub2;O&sub2;, sichtbar gemacht. Wenn sich die Disulfidbindung zwischen den Untereinheiten gebildet hat, würde das Kochen der Proben in einem SDS-Probenpuffer die zwei Untereinheiten zusammen halten, wohingegen diese Lösungsbedingungen eine Aufspaltung in Untereinheiten bewirken würde, sofern keine Disulfidbrücke gebildet worden sind. In Kontrollexperimenten wurden die Proben ohne einen reduzierenden Stoff bei Raumtemperatur (intaktes HCG) und durch Zufügung von β-Mercaptoethanol (βME) gelöst. Im letzteren Fall wird unabhängig von der Anwesenheit einer zwischen den Untereinheiten liegenden Disulfidbindung eine Denaturierung in Untereinheiten stattfinden. Wie auf Abb. 2, Panel A, gesehen werden kann, resultiert die Auflösung bei Raumtemperatur in Abwesenheit von βME in einem Nachweis des intakten HCG-Wildtyps (Reihe 3, molekulare Masse ca. 50 kD) sowie einige freie β-Untereinheiten (molekulare Masse ca. 31 kD). Proben der HCG-interchain 1 und der HCG- interchain 2 beinhalten auch immunreaktives Material in ungefähr gleicher Grösse, was die Anwesenheit von intakten, mutierten HCG-Proteinen nachweist. Unter Hitze dissoziiert der HCG-Wildtyp in Untereinheiten, wie durch das Verschwinden der 50 kD-Bande (Panel B, Reihe 3) dargestellt wird. Im Gegensatz hierzu scheint dies nicht mit den HCG-Mutanten zu passieren (Panel B, Reihe 1 und 2), was die Anwesenheit von intermolekularen, kovalenten Bindungen nachweist. Schliesslich zeigt die Zugabe von βME, dass eine intermolekulare Bindung zwischen zwei Untereinheiten durch ein Disulfid zustande gebracht wird, da die Zugabe eines reduzierenden Stoffes HCG und die Mutanten in Untereinheiten dissoziieren lässt (Panel C).
- Die Bindung an den LH/CG-Rezeptor ist der erste Schritt im Wirkungsmechanismus des HCG. Zur Bestimmung der relativen Rezeptorbindungsfähigkeit der HCG-interchain-Mutanten wurde mit Hilfe der Verdrängung von jodiertem HCG von Rattenhodenmembranen (Rao, M.C. et al., Endocrinology (1977) 101: 512-523) ein in vitro-Rezeptorassay verwendet. Für diesen Zweck wurde eine festgelegte Menge von [¹²&sup5;J]HCG mit Rattenhodenmembranen und ansteigenden Probenmengen bei Raumtemperatur für 18 Stunden inkubiert. Zusätzliche Inkubationen ohne Proben wurden für die Festlegung der maximalen Bindung durchgeführt. Die nichtspezifische Bindung wurde durch Zugabe von einer tausendfachen Übersteigung eines unmarkierten Liganden (Pregnyl, Organon, West Organge, NJ) nachgewiesen. Die Inkubation wurde durch 2-fache Verdünnung der Proben mit eiskaltem Trispuffer, der mit 0,1% BSA angereichert ist, und durch Zentrifugieren mit 150 000 · N.kg- 1 über 5 Minuten bei Raumtemperatur beendet. Nach Absaugen des Überstandes wurde mit Hilfe eines Gammastrahlenzählers die Radioaktivität in den Pellets gemessen.
- Die HCG-interchain 1 zeigt eine Verdrängungskurve von jodiertem HCG im Vergleich zu dem rec-HCG-Wildtyp (siehe Abb. 3). Die zeigt, dass die zwischen den Untereinheiten liegende Disulfidbindung von HCG-interchain 1 keine Wirkung auf die Rezeptorbindung hat, was darauf hinweist, dass die Konformation dieses mutierten Proteins tatsächlich vergleichbar mit dem des rec-HCG-Wildtyps ist. Die Verdrängung des jodierten HCG durch HCG-interchain 2 ist leicht vermindert. Wahrscheinlich geschieht dies aufgrund der Tatsache, dass diese zwischen den Ketten liegende Disulfidbrücke in einem Gebiet lokalisiert ist, das für die Rezeptorbindung und Signaltransaktion wichtig ist.
- HCG induziert die Testosteronbildung in den Leydigzellen von Mäusen. Ein in vitro Test (von Damme et al., Acta Endocrinol. (1974) 77, 655-671), von Mannaerts et al. Modifiziert (Neuroendocrinology of reproduction (1987), R. Roland et al. (Eds.), Elsevier Science Publishers B.V., 49-58) wird für die Bestimmung der HCG-Bioaktivität von HCG-Mutanten, die zwischen den Ketten liegende Disulfidbindungen beinhalten, verwendet (Abb. 4). Die Behandlung der Zellen mit HCG-interchain 1 ergab eine dosisabhängige Zunahme der Testosteronbildung mit der gleichen Potenz wie beim rec-HCG-Wildtyp. Daher kann das HCG-interchain 1 als vollwertiger HCG-Agonist betrachtet werden. Im Gegensatz hierzu verringerte sich die Fähigkeit zur Signaltransduktion der HCG-interchain 2 auf Null, was zeigt, dass HCG-interchain 2 als vollwertiger Antagonist des HCG- Wildtyps verwendet werden kann.
- Das pharmakokinetische Verhalten des HCG-interchain 1 wurde nach i.m. Verabreichung an weibliche Beagles getestet. Zwei Hunde erhielten eine einmalige i.m. Injektion von HCG- interchain 1 in einer Dosierung von 25 (HCG-EIA) IU/kg. Blutproben wurden 30 Minuten vor Injektion und 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240 und 264 Stunden nach Injektion entnommen. Die Plasmaspiegel des immunreaktiven HCG-interchain 1 wurden mit einem spezifischen, zeitaufgelösten HCG-Fluorimmungssay (HCG-DELFIA), das auf Hunde geeicht ist, gemessen. Die Clearancekurven von HCG- interchain 1 sind in Abb. 5 dargestellt.
- Die aus den Clearancekurven erstellten pharmakokinetischen Parameter AUC (Bereich unterhalb des Plasmaspiegels gegen die Zeitkurve), Cmax (Spitzenkonzentration), tmax (Zeit bis zur Erreichung der Spitzenkonzentration), t1/2 (Eliminationshalbwertszeit im Serum) und CL (Clearancerate) sind in Tabelle 2 abgebildet. Die Werte, die zwischen den 144- und 240- Stunden-Werten gemessenen wurden, wurden für die Bestimmung von t1/2 herangezogen.
- Der Vergleich von der i.m.-Verabreichung von HCG-interchain 1 mit der i.m.-Verabreichung von rec-HCG ergab für HCG- interchain 1 höhere Werte in der AUC und für t1/2 und niedrigere Werte für CL, wohingegen die Werte für Cmax und tmax vergleichbar waren.
- Ein Vergleich der Kinetik von HCG-interchain 1 und rec-HCG ergab höhere Werte bei der AUC und t1/2 für HCG-Interchain 1 und niedrigere CL-Werte, wohingegen die Werte für Cmax und tmax vergleichbar waren. Aus dem kinetischen Vergleich von HCG- interchain 1 und rec-HCG kann geschlossen werden, dass HCG- interchain 1 eine niedrigere Clearancerate und eine verlängerte Halbwertszeit zeigt. Tabelle 2. Pharmakokinetische Parameter von HCG-interchain 1 und rec-HCG
- Es wurde ein Konstrukt hergestellt, um ein mutiertes HCG- Protein zu exprimieren, welches eine andere zusätzliche Disulfidbindung zwischen den Ketten beinhaltet. Seine Struktur und Gesamtorganisation ist im wesentlichen identisch mit der von pKMS. HCGαgβc (Abbildung1), ausser dass neue Mutationen eingeführt wurden. Es wurden spezifische Basensubstitutionen in das hybride HCGα-Gen derart eingeführt, dass das Kodon, das Glutamin α5 kodiert, für ein Cystein kodierendes Kodon ausgetauscht wurde, und im HCGβ-Gen wurden sie derart eingeführt, dass das Kodon, das Arginin β8 kodiert, für ein Cystein kodierendes Kodon ausgetauscht wurde. Die Konstruktion und nachfolgende Transfektion und Selektion der CHO-Zellen wurde in gleicher Weise durchgeführt wie es für die anderen mutierten Proteine beschrieben wurde. Die Proteinanalyse, die in Beispiel 2 beschrieben wurde, zeigte, dass eine intermolekulare Bindung zwischen den 2 Untereinheiten durch eine Disulfid hergestellt wurde.
- Die Rezeptorbindungsaktivität und in vitro-Bioaktivität wurden am menschlichen Rezeptor (Jia, X. et al., (1991), Molecular Endocrinology 5, 759-768), wie sie in stabil transfizierten CHO-Zelllinien exprimiert werden, bestimmt. Die Rezeptorbindungsaktivität der HCG-interchain 4 wurde mit einem Radioliganden-Rezeptorverdrängungstest auf Membranfraktionen, die von exponentiell wachsenden Zellen isoliert wurden, quantifiziert. In einem Gesamtvolumen von 0,5 ml wurden ungefähr 100 ug Membranprotein mit einer festgelegten Menge von ¹²&sup5;J-HCG (20000 cpm, ungefähr 12 pM) und zunehmenden Mengen an Konkurrenz-HCG über 18 Stunden bei Umgebungstemperatur inkubiert. Das ¹²&sup5;J-markierte HCG (NEX-106) wurde von Du Pont de Nemours bezogen. Die spezifische Bindung betrug routinemässig 10-12% der zugefügten Gesamtmenge von ¹²&sup5;J-HCG. Nach der Inkubation wurden die gebundenen und freien Hormone durch Zentrifugation getrennt. Hochgereinigtes rekombinantes HCG wurde als Standard verwendet.
- Die HCG-interchain 4 zeigt gegenüber dem HCG-Wildtyp eine leicht verminderte Verdrängung von jodiertem HCG (Abb. 6)
- HCG induziert in den CHO-Zellen, die den menschlichen LH/CG- Rezeptor beinhalten, eine cAMP-Bildung.
- Ein in vitro-Bioassay wurde für die Bestimmung der HCG- Bioaktivität der HCG-interchain 4 verwendet. Die Inkubation von Zellen über 4 Stunden mit zunehmenden Konzentrationen von HCG-interchain 4 in Gegenwart von 0,1 mM. 3-Isobutyl-1- methylxanthin ergab eine dosisabhängige Zunahme der cAMP- Bildung (die extrazelluläre cAMP-Konzentration wurde durch RIA (Immunotech) bestimmt) mit einer Wirksamkeit, die vergleichbar mit der des HCG-Wildtyps ist (Abb. 7). Daher kann HCG- interchain 4 als vollwertiger HCG-Agonist betrachtet werden.
- HCG-interchain 5 wurde durch Substitution der α-Kette an Position 35 und durch Substitution der β-Kette an Position 35 hergestellt, indem Arginin bzw. Alanin durch Cysteinreste ersetzt wurden.
- Rekombinante CHO-Zellen wurden hinsichtlich der Exkretion eines immunreaktiven Proteins selektioniert, wie es für die anderen HCG-interchains beschrieben wurde. In einem HCG- Sandwich-ELISA-Test unter Verwendung von α- und β-spezifischen monoklonalen Antikörpern reagierten die Kulturüberstände positiv. Die intermolekulare Bindung zwischen den zwei Untereinheiten wurde durch ein Disulfid, welches durch die in Beispiel 2 beschriebene Proteinanalyse nachgewiesen wurde, hergestellt.
- Im Rezeptorbindungsaktivitätstest wurde eine Verdrängung des jodierten HCG nachgewiesen, die gegenüber dem HCG-Wildtyp leicht verringert ausfiel (Abb. 6). Im in vitro-Bioassay wurde gezeigt, dass die Wirksamkeit von HCG-interchain 5 vergleichbar mit der des rekombinanten HCG-Wildtyp ist (Abb. 7). Damit kann HCG-interchain 5 als vollwertiger HCG-Agonist angesehen werden.
- HCG-interchain 6 wurde durch Substitution der α-Kette in Position 90 hergestellt, wobei Histidin durch einen Cysteinrest ersetzt wurde.
- Rekombinante CHO-Zellen wurden hinsichtlich der Exkretion immunreaktiver Proteine, wie es für die anderen HCG- interchains beschrieben wurde, selektioniert. In einem HCG- Sandwich-ELISA-Test unter Verwendung von α- und β-spezifischen monoklonalen Antikörpern reagierten die Kulturüberstände positiv. Die intermolekulare Bindung zwischen den zwei Untereinheiten wurde durch ein Disulfid, welches durch die in Beispiel 2 beschriebene Proteinanalyse nachgewiesen wurde, hergestellt.
- In dem Rezeptorbindungsaktivitätstest wurde eine Verdrängung von jodiertem HCG nachgewiesen, die vergleichbar mit der des HCG-Wildtyps ist. Im in vitro-Biotest zeigte sich, dass die Wirksamkeit von HCG-interchain 6 vernachlässigbar ist. Damit kann HCG-interchain 6 als ein HCG-Antagonist angesehen werden.
- Es wurde ein Konstrukt hergestellt, um ein mutiertes LH mit einer zusätzlichen Disulfidbindung zwischen den Ketten zu exprimieren. Die cDNA für die LH-β-Kette wurde wie beschrieben isoliert (Talmadge et al., Nature (1984) 307, 37-40) und mit der β-Kette von FSH im Vektor pKMS. FSHαgβg ausgetauscht (Van Wezenbeek et al., 1990).
- Für die Konstruktion der Mutation in der α-Kette der LH- interchain 1 wurden spezifische Basensubstitutionen in das hybride α-Gen derart eingeführt, dass das Kodon, das Glutamin α5 kodiert, gegen ein Cystein kodierendes Kodon ausgetauscht wurde.
- In LHβ wurden spezifische Basensubstitutionen so eingeführt, dass das Kodon, das Tryptophan β8 kodiert, in ein Cystein kodierendes Kodon geändert wurde. Mutagene PCR-Reaktionen, Subklonen und Sequenzierung wurden mit Verfahren durchgeführt, die vergleichbar mit denen sind, die für HCG beschrieben wurden. Das mutierte Protein wurde in transfizierten CHO-K1- Zellen (ATCC CCL61) exprimiert. Rekombinante CHO-Zellen wurden hinsichtlich der Exkretion eines immunreaktiven Proteins selektioniert. In einem HCG-Sandwich-ELISA-Test unter Verwendung von α- und β-spezifischen monoklonalen Antikörpern reagierten die Kulturüberstände positiv. Die intermolekulare Bindung zwischen den zwei Untereinheiten wurde durch ein Disulfid, welches durch die in Beispiel 2 beschriebene Proteinanalyse nachgewiesen wurde, hergestellt.
- Die Rezeptorbindungsaktivität und die in vitro-Bioaktivität wurden am menschlichen Rezeptor, wie er in stabil transfizierten CHO-Zelllinien (Jia et al.) exprimiert wird, bestimmt. Die LH-interchain 1 zeigte eine mit dem LH-Wildtyp vergleichbare Verdrängung des jodierten HCG (Abb. 8).
- LH-interchain 2 wurde durch Substitutionen an der Position 35 der α-Kette und der Position 35 der β-Kette durch Ersetzen von Arginin bzw. Alanin durch Cysteinreste hergestellt. Rekombinante CHO-Zellen wurden, wie für die anderen HCG- interchains beschrieben, hinsichtlich der Exkretion eines immunreaktiven Proteins selektioniert. In einem HCG-Sandwich- ELISA-Test unter Verwendung von α- und β-spezifischen monoklonalen Antikörpern reagierten die Kulturüberstände positiv.
- In einem Rezeptorbindungsaktivitätstest wurde eine mit dem HCG-Wildtyp vergleichbare Verdrängung von jodiertem HCG nachgewiesen (Abb. 8).
- Ein Konstrukt wurde hergestellt, um ein mutiertes FSH-Protein mit einer zusätzlichen Disulfidbindung zwischen den Ketten zu exprimieren. Seine Struktur und Gesamtorganisation ist im wesentlichen mit der von pKMS. FSHαgβg identisch, welcher für die Expression des rekombinanten FSH-Wildtyps in CHO-Zellen verwendet wird. Es wurden Basensubstitutionen an den korrespondierenden Aminosäurepositionen 5 (Gln) bzw. 2 (Ser) des Gens für die FSH α- bzw. β-Untereinheiten eingeführt, um Cysteinkodone zu erreichen (für die Sequenz des β-Gens siehe Keene et al., (1989), J Biol Chem 264; 4769-4775). Transfizierte rekombinante CHO-Zellen wurden hinsichtlich der Exkretion eines immunreaktiven Proteins selektioniert. In einem HCG-Sandwich-ELISA-Test unter Verwendung von α- und β- spezifischen monoklonalen Antikörpern reagierten die Kulturüberstände positiv.
- Die Rezeptorbindungsaktivität und in vitro-Bioaktivität wurden am menschlichen Rezeptor, wie sie in stabil transfizierten CHO-Zelllinien exprimiert werden, bestimmt (Minegish et al., (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 175, 1125-1130). Die Rezeptorbindungsaktivität der FSH-Interchain 1 wurde mit einem Radioliganden-Rezeptorverdrängungstest auf Membranfraktionen, die von exponentiell wachsenden Zellen isoliert wurden, quantifiziert. In einem Gesamtvolumen von 0,5 ml wurden ungefähr 100 ug Membranprotein mit einer festgelegten Menge von J-FSH (20000 cpm, ungefähr 12 pM) und zunehmenden Mengen an Konkurrenz-FSH über 18 Stunden bei Umgebungstemperatur inkubiert. Das ¹²&sup5;J-markierte FSH (NEX-106) wurde von Du Pont de Nemours bezogen. Die spezifische Bindung betrug routinemässig 10-12% der zugefügten Gesamtmenge von ¹²&sup5;J-FSH. Nach der Inkubation wurden die gebundenen und freien Hormone durch Zentrifugation getrennt. Hochgereinigtes rekombinantes FSH wurde als Standard verwendet.
- Die FSH-interchain 1 zeigt eine Verdrängung des jodierten HCG, die vergleichbar mit der Verdrängung des FSH-Wildtyps ist (Abb. 6).
- FSH-interchain 2 wurde durch Substitutionen an Position 37 der α-Kette und an der Position 27 der β-Kette, wobei Tyrosin bzw. Tryptophan durch Cysteinreste ersetzt wurden, hergestellt. Rekombinante CHO-Zellen wurden, wie für die anderen HCG- interchains beschrieben, hinsichtlich der Exkretion eines immunreaktiven Proteins selektioniert. In einem HCG-Sandwich- ELISA-Test unter Verwendung von α- und β-spezifischen monoklonalen Antikörpern reagierten die Kulturüberstände positiv.
- In dem Rezeptorbindungsaktivitätstest wurde eine Verdrängung von jodiertem FSH nachgewiesen, die vergleichbar mit der Verdrängung des FSH-Wildtyps ist.
Claims (17)
1. Gonadotropine mit einer α-Untereinheit und einer β-
Untereinheit, dadurch gekennzeichnet, dass genannte
Gonadotropine eine oder mehrere nicht native
Disulfidbrücken umfassen.
2. Gonadotropine gemäss Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, dass die nicht nativen Disulfidbrücken
zwischen den Untereinheiten gelegen sind.
3. Gonadotropine gemäss Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, dass genannte Gonadotropine eine nicht
native Disulfidbrücke zwischen einem Aminosäurepaar
oder mehreren Aminosäurepaaren (Phe α18 Cys-Ile α25
Cys), (Gln α20 Cys-Ala α23 Cys), (Ser α34 Cys-Ser
α57 Cys), (Thr α39 Cys-Thr α54 Cys), (Ala α62 Cys-
His α79 Cys) und (Lys α63 Cys-Ala α81 Cys), (Tyr α65
Cys-His α79 Cys) und (Asn α66 Cys-Asn α78 Cys)
umfassen.
4. Gonadotropine gemäss einem der Ansprüche 1-3, dadurch
gekennzeichnet, dass die β-Untereinheit die β-
Untereinheit von HCG ist.
5. Gonadotropine gemäss Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, dass genannte Gonadotropine eine
zwischen den Untereinheiten gelegene, nicht native
Disulfidbrücke zwischen einem Aminosäurepaar oder
mehreren Aminosäurepaaren (Gln α5 Cys-Arg β8 Cys),
(Pro α24 Cys-Gly β71 Cys), (Met α29 Cys-Met β41
Cys), (Arg α35 Cys-Ala β35 Cys), (Tyr α37 Cys-Ile
β33 Cys), (Lys α51 Cys-Asp β99 Cys) und (His α90 Cys
-Cys βy Cys) umfassen.
6. Gonadotropine gemäss Anspruch 4 oder 5, dadurch
gekennzeichnet, dass genannte Gonadotropine eine nicht
native Disulfidbrücke zwischen einem Aminosäurepaar
oder mehreren Aminosäurepaaren (Pro β4 Cys-Pro β7
Cys), (Pro β11 Cys-Thr β32 Cys), (Pro β11 Cys-Ala
β85 Cys), (Thr β32 Cys-Ala β85 Cys), (Arg β60 Cys-
Ser β87 Cys), (Arg β60 Cys-Gln β89 Cys), (Asp β61 Cys
-Leu β86 Cys), (Asp β61 Cys-Ser β87 Cys), (Ser β66
Cys-Ser β81 Cys) und (Leu β69 Cys-Pro β78 Cys)
umfassen.
7. Gonadotropine gemäss einem der Ansprüche 1-3, dadurch
gekennzeichnet, dass die β-Untereinheit eine β-
Untereinheit von LH ist.
8. Gonadotropine gemäss Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, dass genannte Gonadotropine eine
zwischen den Untereinheiten gelegene, nicht native
Disulfidbrücke zwischen einem Aminosäurepaar oder
mehreren Aminosäurepaaren (Gln α5 Cys-Trp β8 Cys),
(Pro α24 Cys-Gly β71 Cys), (Met α29 Cys-Met β41
Cys), (Arg α35 Cys-Ala β35 Cys), (Tyr α37 Cys-Ile
β33 Cys), (Lys α51 Cys-Asp β99 Cys) und (His α90 Cys
-Cys βy Cys) umfassen.
9. Gonadotropine gemäss Anspruch 7 oder 8, gekennzeichnet
dadurch, dass genannte Gonadotropine eine nicht native
Disulfidbrücke zwischen einem Aminosäurepaar oder
mehreren Aminosäurepaaren (Pro β4 Cys-Pro β7 Cys),
(Pro β11 Cys-Thr β32 Cys), (Pro β11 Cys-Ala β85
Cys), (Thr β32 Cys-Ala β85 Cys), (Arg β60 Cys-Ser
β87 Cys), (Arg β60 Cys-Arg β89 Cys), (Asp β61 Cys-
Leu β86 Cys), (Asp β61 Cys-Ser β87 Cys), (Ser β66 Cys
-Ser β81 Cys) und (Leu β69 Cys-Pro β78 Cys)
umfassen.
10. Gonadotropine gemäss einem der Ansprüche 1-3,
gekennzeichnet dadurch, dass die β-Untereinheit die β-
Untereinheit von FSH ist.
11. Gonadotropine gemäss Anspruch 10, gekennzeichnet
dadurch, dass genannte Gonadotropine eine zwischen den
Untereinheiten gelegene, nicht native Disulfidbrücke
zwischen einem Aminosäurepaar und mehreren
Aminosäurepaaren (Gln α5 Cys-Ser β2 Cys), (Pro α24
Cys-Gly β65 Cys), ((Met α29 Cys-Arg β35 Cys), (Arg
α35 Cys-Ala β29 Cys), (Tyr α37 Cys-Trp β27 Cys),
(Lys α51 Cys-Asp β93 Cys) und (His α90 Cys-Cys βy
Cys) umfassen.
12. Gonadotropine gemäss Anspruch 10 oder 11, dadurch
gekennzeichnet, dass genannte Gonadotropine eine nicht
native Disulfidbrücke zwischen einem Aminosäurepaar und
mehreren Aminosäurepaaren (Leu β5 Cys-Thr β26
Cys),
(Leu β5 Cys-Ala β79 Cys), (Thr β26 Cys-Ala β79
Cys), (Lys β54 Cys-Gln β81 Cys), (Lys β54 Cys-His
β83 Cys), (Glu β55 Cys-Thr β80 Cys), (Glu β55 Cys-
Gln β81 Cys), (Thr β60 Cys-Thr β75 Cys) und (Val β63
Cys-Ser β72 Cys) umfassen.
13. Gonadotropine gemäss einer der Ansprüche 1-3, dadurch
gekennzeichnet, dass die β-Untereinheit die β-
Untereinheit von TSH ist.
14. Gonadotropine gemäss Anspruch 13, dadurch
gekennzeichnet, dass die genannten Gonadotropine eine
zwischen den Untereinheiten gelegene, nicht native
Disulfidbrücke zwischen einem Aminosäurepaar oder
mehreren Aminosäurepaaren (Gln α5 Cys-Phe β1 Cys),
(Pro α24 Cys-Gly β66 Cys), (Met α29 Cys-Arg β34
Cys), (Arg α35 Cys-Ala β28 Cys), (Tyr α37 Cys-Ile
β26 Cys), (Lys α51 Cys-Asp β94 Cys) und (His α90 Cys
-Cys βy Cys) umfassen.
15. Gonadotropine gemäss Anspruch 13 oder 14, dadurch
gekennzeichnet, dass genannte Gonadotropine eine nicht
native Disulfidbrücke zwischen einem Aminosäurepaar und
mehreren Aminosäurepaaren (Pro β4 Cys-Thr β25 Cys),
(Pro β4 Cys-Ala β80 Cys), (Thr β25 Cys-Ala β80
Cys), (Arg β55 Cys-Ser β82 Cys), (Arg β55 Cys-Lys
β84 Cys), (Asp β56 Cys-Leu β81 Cys), (Asp β56 Cys-
Ser β82 Cys), (Thr β61 Cys-Ser β76 Cys) und (Ile β64
Cys-Pro β73 Cys) umfassen.
16. Gonadotropine gemäss den Ansprüchen 1-15 für die
Verwendung als therapeutische Substanz.
17. Pharmazeutische Arzneimittelzubereitung, welche ein
Gonadotropin oder mehrere Gonadotropine gemäss den
Ansprüchen 1-15 und einen pharmazeutisch annehmbaren
Trägerstoff umfasst.
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