BRPI0706742B1

BRPI0706742B1 - proteína de fusão isolada, homodímero, proteína homodimérica isolada, dímero isolado, sequência de ácido nucleico, polinucleotídeo isolada, molécula de dna recombinante isolada, composição farmacêutica, método para produzir uma proteína, e, uso de uma proteína de fusão e de um dímero

Info

Publication number: BRPI0706742B1
Authority: BR
Inventors: Wang Haitao; Xu Jing; Liu Longbin; Zhang Rui; Du Yong
Original assignee: Novagen Holding Corp
Priority date: 2006-01-27
Filing date: 2007-01-25
Publication date: 2019-12-03
Also published as: BRPI0706742A2; CA2650072A1; PT1994157E; US11279742B2; JP2013066477A; US20070178112A1; US8431132B2; BRPI0706742C1; US20190070307A1; CN102816242B; EP1994157A1; CN101321870B; AU2007209722A1; ES2539759T3; EP1994157B1; RU2433181C2; TW200904829A; EP2450373A2; RU2008134389A; US20230265143A1

Abstract

proteina de fusão, construção de proteina dimerica, proteina dimerica, composição farmacêutica, sequencia de ácido nucleico, molécula de dna recombinante, linhagem de células, metodos para produzir uma proteina e para estimular a eritropojese em um mamífero, e, dímero uma proteína de fusão recombinante compreendendo uma porção de peptídeo de eritropoietina humana ligada a uma porção de peptídeo de imunoglobulina é descrita. a proteína de fusão tem uma meia-vida prolongada in vivo em comparação com a eritropoietina humana de ocorrência natural ou nativarecombinante. em uma forma de realização da invenção, a proteína tem uma meia-vida in vivo pelo menos três vezes maior do que a da eritropoietina humana nativa. a proteína de fusão também demonstra uma melhorada bioatividade eritropoiética em comparação com a eritropoietina humana nativa. em uma forma de realização, a proteína de fusão compreende a seqúência de peptídeo completade uma molécula de eritropoietina humana (epo) e a seqúência de peptídeo de um fragmento fc de imunoglobulina humana igg 1. o fragmento fc na proteína de fusão inclui a região de articulação, domínios ch2 e c113 de imunoglobulina humana iggl. a molécula de epo pode estar ligada diretamente ao fragmento fe para evitar ligadores de peptídeo estranhos e diminuir o risco de uma resposta imunogênica quando administrada in vivo. em uma forma de realização, a regiãode articulação é uma variante do fragmento fc humano tendo um resíduo não cisteína em aminoácido 6. a invenção também refere-se às seqúências de ácido nucleico e aminoácido codificando a proteína de fusão e linhagens de células transfectadas e métodos para produzir a proteína de fusão. a invenção ainda inclui composições farmacêuticas compreendendo a proteína de fusão e métodos de usar a proteína de fusão e/ou as composições farmacêuticas, por exemplo para estimular a eritropoiese em indivíduos em necessidade de terapia.

Description

“PROTEÍNA DE FUSÃO ISOLADA, HOMODÍMERO, PROTEÍNA HOMODIMÉRICA ISOLADA, DÍMERO ISOLADO, SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADA, MOLÉCULA DE DNA RECOMBINANTE ISOLADA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA, E, USO DE UMA PROTEÍNA DE FUSÃO E DE UM DÍMERO.” Pedido relacionado Este pedido refere-se a e reivindica o benefício de pedido de patente US 11/340 661, depositado em 27 de janeiro de 2006.

Campo Técnico Este pedido refere-se a proteínas de fusão de eritropoietina humana.

Fundamentos A eritropoietina humana (EPO), um membro da família de fator de crescimento hematopoiético, é sintetizada principalmente no rim adulto e no fígado fetal em resposta a hipoxia de tecido devido à disponibilidade de oxigênio no sangue diminuído [1]. A função principal de EPO consiste em atuar diretamente sobre alguns progenitores de células do sangue vermelhas (RBC) e precursores na medula óssea para estimular a síntese de hemoglobina e RBCs maduros. Também controla a proliferação, diferenciação e maturação de RBCs. EPO recombinante tendo a seqüência de aminoácido de EPO de ocorrência natural foi produzido e aprovado para tratar anemia associada com a falha funcional do rim, câncer e outras condições patológicas [2]. Além de suas propriedades eritropoiéticas, relatórios de pesquisa recente [3] indicam que EPO também atua em células não da medula óssea como neurônios, sugerindo outras funções fisiológicas / patológicas possíveis de EPO no sistema nervoso central (SNC) e outros órgãos/ sistemas. Porque os receptores de EPO foram encontrados em muitos órgãos diferentes, EPO pode ter efeitos biológicos múltiplos, como atuando como um agente anti-apoptótico. EPO humano é uma glicoproteína com um peso molecular de 30,4 quilodaltons. Os carboidratos perfazem aproximadamente 39% de sua massa total. O gene de EPO está localizado no cromossomo 7q 12-22 e se estende em uma região de 5,4kb com cinco exons e quatro introns [4]. O precursor de EPO consiste de 193 aminoácidos. A divagem da seqüência líder e o último aminoácido Arg por modificação pós-translacional dá o EPO maduro tendo 165 aminoácidos. A glicosilação com três sítios N-ligados a Asn24, Asn3S, AsnS3 e um sítio O-ligado a Serl26, desempenha um papel crucial na biossíntese, estrutura terciária e na bioatividade in vivo de EPO [5]. EPO funciona por ligação a um receptor de eritropoietina, um polipeptídeo de transmembrana glicosilado e fosforilado com o peso molecular de 72-7S quilodaltons. Esta ligação desencadeia a homodimerização dos receptores que leva à ativação de várias vias de transdueão de sinal: sistema JAK2/STAT5, proteína G, canal de cálcio, e quinases. Duas moléculas de proteína EPO são necessárias para ligar simultaneamente a uma molécula de receptor para obter uma ativação do receptor ótima [6].

Como o primeiro fator de crescimento hematopoiético aprovado para terapia humana, EPO humana recombinante (rl-IuEPO) tem sido usada para o tratamento de anemia resultante de falha renal crônica, cânceres (primariamente anemia associada com quimioterapia), doenças autoimunes, AIDS, cirurgia, transplante de medula óssea e síndromes mielodisplásicas, etc. Como interessante, estudos recentes também observaram que rHuEPOs tem funções no sistema não sangue e mostraram o potencial de serem usados como um fármaco neuro-protetor para isquemia cerebral, trauma no cérebro, doença inflamatória e distúrbios degenerativos neurais [7].

Atualmente, três tipos de rl-IuEPO ou análogos de rHuEPO são comercialmente disponíveis, ou seja rHuEPO alfa, rEIuEPO beta e darbepoetina alfa [S]. Estas três proteínas recombinantes ligam no mesmo receptor de eritropoietina, mas diferem em estrutura, grau de glicosilação, afinidade de ligação ao receptor e metabolismo in vivo. Desde a introdução inicial de rEIuEPO-alfa nos anos SO, os clínicos rapidamente reconhecerem a exigência de dose/ injeção frequente do fármaco como um inconveniente significante. As meias-vidas in vivo médias de rlIuEPO-alfa e rHuEPO beta administradas intravenosamente ou subcutaneamente são de apenas 8,5 e 17 h, respectivamente [9, 10]. Os pacientes assim precisam de um esquema de injeção diário, duas vezes por semana ou três vezes por semana, o que impõe uma carga tanto para os pacientes como para o pessoal de saúde. Assim, se tem uma necessidade existente há muito tempo de desenvolver análogos de EPO recombinantes tendo uma meia-vida in vive» mais longa e/ou uma atividade eritropoiética melhorada.

Tentativas foram feitas na técnica anterior para mudar geneticamente ou modificar quimicamente a estrutura da proteína EPO nativa para ou retardar seu metabolismo in vivo como para melhorar as propriedades terapêuticas. Por exemplo, parece existi]· uma correlação direta entre as quantidades de carboidratos contendo ácido siálico na molécula de EPO e seu metabolismo in vivo e a atividade funcional. O aumento no teor de carboidrato da molécula de EPO assim resulta em uma meia-vida mais longa e atividades melhoradas in vivo [11, 12]. Amgen projetou o análogo de rHuEPO darbepoetina alfa para incluir 5 cadeias de carboidratos N-ligadas, duas a mais que rHuEPO. A darbepoetina alfa é também conhecida como proteína estimulante de eritropoiese nova (NESP) e é vendida sob a marca registrada Aranesp ™. A darbepoetina alfa difere da EPO humana nativa em cinco posições (AlaSOAsn, His32Thr, Pro87Val, TrpSSAsn, Pro90Thr) que peraiite a fixação de dois oligossacarídeos N-ligados adicionais nas posições de resíduo de asparagina 30 e S8. A darbepoetina alfa liga ao receptor de EPO em um modo idêntico como EPO nativo para induzir a sinalização intracelular envolvendo a fosforilação de tirosina por JAK-2 quinase e as mesmas moléculas intracelulares Ras/MAP-k, P13-k e STAT-5. Devido ao teor de carboidratos aumentado, a meia-vida de darbepoetina alfa em tanto animais como humanos é quase três vezes mais longa do que a de rHuEPO-alfa (25,3 h versus 8,5 h) [9]. A darbepoetina alfa (Aranesp ™) também parece demonstrar uma melhorada bioatividade em comparação com EPO humana recombinante ou de ocorrência natural in vivo [13] e foi aprovada pelo FDA como uma segunda geração de fármaco de rHuEPO; este fármaco somente precisa ser administrado uma vez por semana para obter os efeitos terapêuticos idênticos de injeções de 2-3 vezes por semana de rHuEPO [10, 14,15].

Outras tentativas para prolongar a meia-vida de EPO foram focalizadas no aumento do peso molecular da proteína EPO através de conjugação química com polietileno glicol (PEGuilação) e outros. EPO PEGuilado tem um peso molecular bem maior e é protegido de ser depurado da circulação e assim tem uma meia-vida no plasma mais longa [16]. No entanto, a PEGuilação pode alterar a estrutura de proteína resultando em mudanças não antecipadas de função e especificidade da porção de EPO. Existem também relatos de aumento do peso molecular de EPO por outros métodos, como para ligar a molécula de EPO a uma proteína veículo ( albumina humana), ou para formar a homodimerização de duas moléculas de EPO completas por uso de peptídeos de ligação (3 a 17 aminoácidos) ou por reagentes de reticulação química [17, 18, 19, 20]. Apesar destes métodos terem obtido algum sucesso para prolongar a meia-vida e melhorar as atividades de EPO, a combinação da molécula de EPO com o fragmento Fc de imunoglobulina humana (IgG) em uma proteína de fusão, como descrito no presente pedido, alcança vantagens singulares. A imunoglobulina humana IgG é composta de quatro polipeptídeos ligados cova!entemente por ligações dissulfeto (duas cópias idênticas de cadeia leve e cadeia pesada). A proteólise de molécula de IgG por papaína gera dois fragmentos de Fab e um fragmento de Fc. O fragmento de Fc consiste de dois polipeptídeos ligados juntos por ligações dissulfeto. Cada polipeptídeo, de N- a C-terminal, é composto de uma região de articulação, um domínio CII2 e um domínio CH3. A estrutura de fragmento de Fc é quase igual entre todos os sub-tipos de imunoglobulina humana. IgG está dentre uma das proteínas mais abundantes no corpo humano e perfaz até 70 a 75% das imunoglobulinas totais no soro humano. A meia -vida de IgG na circulação é a mais longa dentre todos os cinco tipos de imunoglobulina e pode alcançar 21 dias. A tecnologia de bioengenharia moderna tem sido aplicada com sucesso à criação de proteínas de fusão consistindo de fragmentos de proteína terapêutica, como citocinas e receptores solúveis, e o fragmento Fc de IgG humana [21, 22, 23, 24]. Estas proteínas de fusão tem uma meia vida in vivo significantemente mais longa enquanto retendo suas propriedades biológicas e terapêuticas. Até agora, duas proteínas de fusão compreendendo um fragmento de Fc foram desenvolvidas com sucesso como bio-remédios e aprovadas pelo FDA para o tratamento de artrite reumatóide e psoríase de placa crônica (25, 26].

Foi demonstrado na técnica anterior que os dímeros de duas moléculas de EPO ligados ou por reticulação química ou por polipeptídeo demonstram atividades in vivo melhoradas e uma meia-vida prolongada [17, 19]. A atividade melhorada pode ser devido à ligação mais eficiente do dímero de EPPO a um receptor, e a meia-vida in vivo prolongada devido ao tamanho maior da proteína de dímero. No entanto, o processo de reticulação química não é eficiente e é difícil de controlar. Além disso, o peptídeo de ligação no dímero de EPO pode alterar a estrutura tri-dimensional de molécula de EPO e o próprio peptídeo pode estimular as respostas imunogênicas in vivo. Estes inconvenientes afetam o potencial terapêutico de dímeros de EPO. particulamiente porque a terapia de substituição com EPO em pacientes renais ê para a vida toda. A necessidade assim fez surgir análogos de EPO que tem uma meia-vida significantemente mais longa e atividades eritropoiéticas melhoradas in vivo mas não tem propriedades imunogênicas aumentadas. Sumário da Invenção De acordo com a invenção, uma proteína de fusão recombinante compreendendo uma porção de peptídeo eritropoietina humana ligada a uma porção de peptídeo imunoglobulina é descrita. A proteína de fusão tem uma meia-vida in vivo prolongada em comparação com a eritropoietina humana nativa recombinante ou de ocorrência natural. Em uma forma de realização da invenção, a proteína tem uma meia-vida in vivo de pelo menos três vezes maior do que a eritropoietina humana nativa. A proteína de fusão também pode demonstrar bioatividade eritropoiética melhorada em comparação com a eritropoietina humana nativa.

Em uma forma de realização, a porção de peptídeo de imunoglobulina é um fragmento Fc, como um fragmento IgGl. O fragmento Fc inclui domínios CH2 e C1I3 e uma região de articulação. A porção de peptídeo EPO pode ser diretamente ligada à região de articulação. Preferivelmente, a região de articulação tem pelo menos 9 aminoácidos em comprimento. Em uma fonna de realização, a porção de peptídeo EPO tem um resíduo de cisteína próximo do C-terminal da mesma, e a região de articulação inclui um resíduo de cisteína localizado o mais próximo da porção de peptídeo EPO. Preferivelmente, estes dois resíduos de cisteína são espaçados em pelo menos 12 aminoácidos de distância. Em uma fonna de realização, a porção de peptídeo EPO pode compreender uma molécula de EPO completa diretamente ligada à porção de imunoglobulina (isto é, não são interpostos ligadores de peptídeo externos entre as porções de EPO e imunoglobulina. A invenção também refere-se a construções de proteína multimérica compreendendo unidades múltiplas da proteína de fusão da invenção, por exemplo, duas proteínas de fusão podem ser montadas como um dímero, em que as regiões de articulação das proteínas são ligadas por ligações dissulfeto. O dímero tem a forma geral de uma molécula de IgG e é mais estável do que as moléculas de EPO livres. A invenção também refere-se a seqüências de ácido nueleico e aminoácido codificando a proteína de fusão e linhagens de células transfectadas e métodos para produzir a proteína de fusão. A invenção também inclui composições farmacêuticas compreendendo a proteína de fusão e métodos de usar a proteína de fusão e/ou as composições farmacêuticas, por exemplo para estimular a eritropoiese em indivíduos em necessidade de terapia.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENI-IOS

Nos desenhos que ilustram várias formas de realização da invenção mas que não são destinadas a serem construídas em um modo limitativo: Figura IA é um diagrama esquemátieo mostrando a estrutura geral da de proteína de fusão EPO-Fc humana recombinante (rHuEPO-Fc) da invenção.

Figura IB é uma listagem de seqüência mostrando a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos deduzida (aa) da proteína rHuEPO-Fe. O comprimento total de DNA é 1281 bp. Os 426 aminoácidos na seqüência de proteína deduzida incluem 27 aa para o peptídeo de sinal e 399 aa para a proteína rHuEPO-Fc completa. A proteína rHuEPO-Fc completa consiste de domínio EPO humano (lóóaa), região de articulação (lóaa, sublinhado), e domínio CH2 e CHS (217 aa) do fragmento Fc de IgGl humano. O peso molecular calculado do polipeptídeo da proteína de fusão rHuEPO-Fc madura é 44.6kDa, composto de 18,5kDa (41,4%) de fragmento EPO e 26,lkDa(58,6%) de fragmento IgGl Fc. Um homodímero é fonnado por duas ligações dissulfeto via os dois resíduos de cisteína (em caixa, dentro da região de articulação. No resíduo 172 da proteína de fusão madura (isto é, o 6° aminoácido de região de articulação) o resíduo de cisteína nativo foi substituído por glicina (negrito).

Figura 2 é um diagrama esquemático mostrando a estrutura e aspectos do plasmídeo de expressão de mamífero pCDl usado para inserir a seqüência de DNA codificando o polipeptídeo da proteína de fusão rFIuEPO-Fc, e para transfectar as células CHO que expressam a proteína de fusão rFIuEPO-Fc.

Figura. 3 é uma imagem de SDS-PAGE mostrando os tamanhos da fonna dimérica de proteína rHuEPO-Fc pura em uma condição não reduzida e a fonna monomérica de proteína rFIuEPO-Fc pura em condição reduzida por análise SDS-PAGE. A proteína rFIuEPO-Fc purificada dos sobrenadantes da linhagens de células CITO cultivadas expressando rFIuEPO-FC existe principalmente como a fonna dimérica e tem um peso molecular de cerca de ISO kDa em sei Bis-Trisa 8% em condicão não reduzida. Em condição reduzida (100 mM ditiotreitol, DTT) para romper as ligações dissulfeto, o dímero é separado em duas unidades monoméricas idênticas com um peso molecular de 75 kDa.

Figura 4A e 4B são gráficos mostrando um aumento dependente da dose níveis de hemoglobina (FIb) em camundongos nonnais tratados com injeção subcutânea três vezes por semana (s.c.) de rHuEPO-Fc ou rFIuEPO. Cada ponto representa o nível médio de Hb do grupo (<5 camundongos). Níveis do dia 0 representam os níveis de Hb antes tratamento. A: Camundongos tratados com rHuEPO-Fc. B: Camundongos tratados com rFIuEPO nativo Figura 5A e 5B são gráficos mostrando o aumento dependente da dose de níveis de hemoglobina (Hb) em camundongos nonnais tratados com uma vez por semana s.c. com rHuEPO- Fc ou rHuEPO. Cada ponto representa o nível de Hb médio do grupo (6 camundongos). Níveis do dia 0 representam os níveis de Hb antes tratamento. A: Camundongos tratados com rFIuEPO-Fc. B: Camundongos tratados com rHuEPO nativo Figura 6A e 6B são gráficos mostrando o aumento dos níveis de hemoglobina (Hb) em camundongos nonnais tratados com injeção intravenosamente (i.v.) de 12,5pg/kg de rFIuEPO-Fc ou rHuEPO. Cada ponto representa o nível de Hb médio do grupo (6 camundongos). Níveis do dia 0 representam os níveis de Hb antes tratamento. A: Camundongos com tratamento uma vez a semana. B: Camundongos com tratamento 3 vezes por semana.

Figura 7 é um gráfico mostrando o aumento dependente da dose dos níveis de hemoglobina (Hb) em 5/6 ratos nefrectomizados tratados com uma vez por semana s.c. com rHuEPO-Fc, rHuEPO ou darbepoetina-alfa ( abreviado Darbe.). Cada ponto representa o nível de Hb médio do grupo. Os controles normais eram ratos nonnais com injeção de solução veículo. Controles de modelo eram os 5/6 ratos nefrectomizados com injeção de solução veiculo. Os níveis de semana 0 representam os níveis de Hb antes tratamento. *: semana ( s) após o tratamento.

Figura S é um gráfico mostrando o aumento dependente da dose dos níveis de hemoglobina (Hb) em 5/6 ratos nefrectomizados tratados uma vez a cada duas semanas s.c. com rHuEPO-Fc, rHuEPO ou darbepoetina-alfa ( abreviada Darbe.). Cada ponto representa o nível de Hb médio do grupo. Os controles normais eram ratos nonnais com injeção de solução veículo. Controles de modelo eram os 5/6 ratos nefrectomizados com injeção de solução veículo. Os níveis de semana 0 representam os níveis de Elb antes tratamento. *: semana(s) após o tratamento.

Figura 9 é um gráfico mostrando o aumento dependente da dose dos níveis de hemoglobina (Hb) em 5/6 ratos nefreetomizados tratados uma vez a cada duas semana s i.v. com 62,5pg/kg de rHuEPO-Fc, ou darbepoetina-alfa (abreviada Darbe.). Cada ponto representa o nível de FIb médio do grupo. Os controles nonnais eram normais ratos com injeção de solução veículo. Controles de modelo eram os 5/6 ratos nefreetomizados com injeção de solução veículo. Semana 0 níveis representam os níveis de Hb antes tratamento. *: semana (s) após tratamento.

Figura 10A- 10C mostram as comparações de potência de rHuEPO-Fe, rHuEPO e darbepoetina-alfa para estimulai· a formação de colônias de CFU-E e BFU-E em 5/6 ratos nefreetomizados tratados com doses e esquemas diferentes.O tratamento com rHuEPO-Fc e darbepoetina-alfa (abreviado Darbe. ) mostrou potências dependentes da dose similares para estimular a formação de colônias CFU-E e BFU-E, enquanto rHuEPO foi menos potente. A, s.c. uma vez a cada semana. B, s.c. uma vez a cada 2 semana s. C, i.v. uma vez a cada duas semanas.

Figura 11 é um sráfico mostrando os níveis séricos de rFIuEPO-Fc e rHuEPO após a injeção intravenosa de 5pg/kg de rHuEPO-Fc ou rHuEPO para macacos Rhesus (níveis médios de 5 macacos ).

Figura 12 é uma listagem de seqüências mostrando a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos deduzida (aa) de uma proteína rFIuEPO-FcC de tipo selvagem. Os particulares da seqüência são iguais como mostrado em Figura 1 exceto que um resíduo de cisteína de tipo selvagem, nativo, está presente no resíduo 172 da proteína de fusão madura (isto é, o 6° aminoácido de região de articulação) Figura 13 é um gráfico mostrando aumento dependente da dose de níveis de hemoglobina (Hb) em camundongos normais tratados com três vezes por semana injeção subcutânea (s. c.) de rHuEPO-Fc (a proteína de fusão mutante da presente invenção), rHuEPO- FcC (a proteína de fusão de tipo selvagem) e rHuEPO. Cada ponto representa o nível de Hb médio do grupo(S). Os controles nonnais eram camundongos normais com injeção de solução veículo. Níveis do dia 0 representam os níveis de Hb antes tratamento.

Figura 14 é um gráfico mostrando o aumento dependente da dose dos níveis de hemoglobina (Hb) em camundongos nonnais tratados com uma vez por semana com injeção subcutânea (s. c.) de rHuEPO-Fc, rFIuEPO-FeC e rHuEPO. Cada ponto representa o nível de Hb médio do grupo(S). Õs controles nonnais eram camundongos nonnais com injeção de solução veiculo. Níveis do dia 0 representam os níveis de Hb antes do tratamento. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Em toda a seguinte descrição os detalhes específicos são especificados a fim de provei· uma compreensão mais completa da invenção. No entanto, a invenção pode ser praticada sem estes aspectos particulares. Em outros casos, elementos bem conhecidos não foram mostrados ou descritos em detalhes para evitar confundir desnecessariamente a presente invenção. Conseqüentemente, o relatório e desenhos devem ser considerados em um sentido ilustrativo, em vez de restritivo.

Este pedido refere-se a uma nova proteína de fusão tendo propriedades eritropoiéticas. A proteína de fusão, referida aqui como rlIuEPO-Fc, compreende uma molécula de eritropoietina humana (EPO) ligada de modo recombinante a um fragmento Fc de imunoglobulina. Como discutido ainda abaixo, a proteína de fusão pode estar na forma de um dímero consistindo de duas subunidades de polipeptídeo idênticas. Na forma de realização mostrada em esquema na figura IA, cada subunidade de polipeptídeo, do N-terminal ao C-terminal, consiste da seqüência de polipeptídeo da molécula de EPO humana e a seqüência de polipeptídeo da região de articulação. O domínio CH2 e o domínio CHS do fragmento Fc da imunoglobulina humana IgGl. As duas subunidades de polipeptídeo são conectadas juntas por ligações dissulfeto entre as regiões de articulação respectivas para formar a estrutura de dímero. O dímero assim tem a mesma fonna geral como uma molécula de IgG e demonstra uma melhor estabilidade do que as moléculas de EPO livres, como discutido nos exemplos abaixo.

Como será evidente para um versado na técnica, a região de articulação de uma imunoglobulina intacta provê à proteína flexibilidade suficiente para uma ligação efetiva antígeno -anticorpo. Similannente, na presente invenção, a região de articulação está incluída no desenho da proteína de fusão rHuEPO-Fc de modo a manter sua flexibilidade, especialmente quando a proteína de fusão está na fonna dímero. Como descrito abaixo, isto permite a ligação nonnal da porção de EPO da proteína de fusão rFIuEPO-Fc para os receptores de EPO para ativai· as funções biológicas de EPO. Acredita-se que a forma dímero da proteína de fusão rHuEPO-FC, ao prover duas moléculas de EPO, é capaz de induzir a ativação ótima de receptores de EPO (por exemplo, ao facilitar a reticulação do receptor).

Como demonstrado nos exemplos especificados abaixo, a proteína de fusão rlTuEPO-Fc foi sintetizada com sucesso usando técnicas de DNA recombinantes. A proteína de fusão foi mostrada em estudos com camundongos, ratos e primatas para exibir uma meia-vida in vivo prolongada e melhoradas propriedades eritropoiéticas em comparação com EPO humano nativo recombinante ou de oconência natural. Como usado neste pedido de patente os termos "eritropoietina humana nativa" e "EPO humana nativa" significam EPO tendo uma estrutura de tipo selvagem não modificada. Como será evidente para o versado na técnica, EPO humana nativa pode ser produzida de modo recombinante ou de ocorrência natural (por exemplo rHuEPO alfa,. O termo "EPO humana nativa" não inclui os análogos de rHuEPO, como darbepoetina alfa onde a estrutura de EPO foi modificada de modo significante, como por hiperglicosilação. A seqüência de ácido nucleico da proteína de fusão rHuEPO - Fc da presente invenção é mostrada na SEQ ID NO: 1. A seqüência de aminoácido deduzida eoiTespondente é mostrada em SEQ ID NO: 2. A proteína de fusão rFIuEPO-Fe completa tem 399 aminoácidos de comprimento. Como mostrado na figura 1B, a proteína de fusão rFluEPO-Fc completa consiste de domínio de EPO (166 aminoácidos), a região de articulação (16 aminoácidos, sublinhados) e os domínios CI-I2 e CFI3 (217 aminoácidos). Uma seqüência de peptídeo de sinal ou líder consistindo de 27 aminoácidos é também mostrada na figura 1B. O peptídeo de sinal é clivado durante a síntese de rHuEPO-Fc. As seqüências de ácido nueleico e aminoácido de rHuEPO-Fc incluindo o peptídeo de sinalo ou líder são mostradas em SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente.

Como melhor visto nas figura 1B e SEQ ID NO: 2, o domínio de EPO tem um resíduo de cisteína próximo do C-terminal do mesmo em aminoácido número 161. A região de articulação inclui 2 resíduos de cisteína, em aminoácidos números 17S e 181, que estão em caixa na figura 1B. Os resíduos de cisteína da região de articulação formam as ligações dissulfeto entre as subunidades de polipeptídeo do homodímero, como discutido acima. A região de articulação de ocorrência natural de um fragmento de IgGl humano também tem uma cisteína no resíduo número 6 da porção de região de articulação (medida do N-terminal). Na presente invenção, o resíduo de cisteína 6 da porção de gancho foi substituído por um resíduo não cisteína. Em particular, na forma de realização da figura 1B e SEQ ID NO: 2, o aminoácido cisteína foi substituído por glicina (em resíduo de aminoácido 172 de rFluEPO-Fc, que corresponde ao resíduo 6 da região de articulação). Como será evidente para um versado na técnica, outros resíduos não cisteína também podem ser substituídos por cisteína neste local para evitar a formação de uma ligação dissulfeto.

Como um resultado da substituição de aminoácido em resíduo 172, o primeiro resíduo de cisteína da região de articulação (em resíduo 178) é espaçado 17 aminoácidos do resíduo de cisteína acima descrito do domínio EPO (em resíduo 161). Os inventores acreditam que o espaçamento mínimo entre o resíduo cisterna 161 do domínio de EPO e o primeiro resíduo de cisteína da região de articulação deve sei· de pelo menos 12 aminoácidos para permitir a montagem e/ou a ligação do receptor de EPO com sucesso de um homodímero de rHuEPO-Fc. Isto é, se o resíduo 172 for um resíduo de cisteína, uma ligação dissulfeto indesejável pode ser formada potencialmente, como entre os resíduos de cisteína 161 e 172. Isto pode alterar a estrutura tridimensional da molécula de EPO, resultando em inatividade biológica ou atividade biológica reduzida.

Em uma forma, de realização da invenção, o domínio de EPO é ligado diretamente à porção de fragmento de Fc da proteína de fusão. Ao evitar prover um peptídeo de ligador externo, a estmtura tri-dimensional preferida do peptídeo de fusão rHuEPO-Fc é mantida e o risco de desencadear uma resposta imunogênica indesejável é minimizado. A região de articulação do fragmento de Fc é preferivelmente pelo menos 9 aminoácidos de comprimento e está preferivelmente na faixa de cerca de 10 - 20 aminoácidos em comprimento.

Os seguintes exemplos ainda irão ilustrar a invenção em maiores detalhes, apesar de ser notado que a invenção não é limitada aos exemplos específicos. 1. Construção do pCdEpo-Fc plasmídeo recombinante codificando a proteína de fusão de rHuEPO-Fc A molécula de DNA de comprimento completo, que codifica a seqüência de aminoácido do polipeptídeo de rlIuEPO-Fc, foi gerada por PCR de sobreposição usando os seguintes iniciadores oligo (QIAGEN Inc., US): EF5: 5 ' -ccggaattcgeeaceatgggggtgcaegaatgtcctgcct-3 EF3: 5 '-ttttccttttgcggccgcttatttacccggagacagggagag-3'; EFL5: 5 ' -aggcctgcaggacaggggacagagttgagcccaaatetggtgaca-3 EFL3: 5 ' -tgtcaccagatttgggctcaactctgtcccctgtcctgcaggcct-3 As seqüências dos iniciadores acima notados são listadas em SEQ. LD. Nos. 5 - S respectivamente.

Os sítios EcoR I e Not I foram introduzidos em EF5 e EF3, respectivamente. Para a expressão ótima da proteína HuEPO-Fc em células de mamíferos, a seqüência de Kozak (GCCACCATGG) foi também introduzida em EF5. EFL5 e EFL3 são seqüências complementares consistindo de seqüência de DNA 3'-terminal de EPO (23bp) e seqüência de DNA 5 -terminal de gancho de IgGl (22bp).

Primeiro, um fragmento de DNA de EPO de 0,6 kb foi amplificado por PCR (Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity) com iniciadores EF5 e EFL3 de plasmídeo p9E contendo o comprimento completo de cDNA de EPO humana, fragmento Fc de 0,7 kb com iniciadores EF3 e EFL5 do plasmídeo pD contendo o comprimento completo de seqüência de cDNA de IgGl humana, respectivamente (p9E e pD são do próprio laboratório dos inventores). Os dois fragmentos foram então purificados e misturados em quantidade igual. Usando a mistura como gabarito, o DNA de rHuEPO-Fc de comprimento completo de 1,3 kb foi amplificado por iniciadores EF5 e EF3. O fragmento de 1,3 kb purificado foi digerido por EocR I e Not I (New England Biolab Inc. US) e então clonado em vetor de expressão pCD' de mamífero digerido com EcoR Ι/Not I (Figura 2). O vetor recombinante resultante foi chamado pCdEpo-Fc e a seqüência de ácido nucleico inserida codificando a seqüência de aminoácidos da proteína HuEPO-Fc proteína foi confirmada por seqüenciamento de DNA. 2. Estabelecimento da linhagem de células de expressão de rHuEPO-Fc A célula de ovário de hamster chinês com deficiência em diidrofolato reductase(dhfr) (CHO/dhír, ATCC No.CRL-9096), que foi aprovada pelo FDA para produção de substâncias biológicas, foi usada como a célula hospedeira para a expressão de rHuEPO-Fc.

As células CHO-dhlT foram transfectadas com o vetor recombinante pCdEpo-Fe usando Lipofectamine (Gibco, Cat.No: 18292-037, USA). Os sobrenadantes da cultura de clones selecionados foram testados por ELISA (Roche, Cat.No: 1 -693 417, Canadá) para atividade de EPO. Os clones positivos foram ainda triados sob pressões de Metotrexato crescentes (MTX). Uma linhagem de células com a maior expressão de proteína rHuEPO-Fc foi selecionada com a linhagem de células CHO expressando rEIuEPO-Fc, e gradualmente adaptada para meio isento de soro (meio CD CHO, Gibco, Cat.No: 10743-029, USA). Esta linhagem de células CHO expressando rHuEPO-Fc foi usada para a produção de proteína rHuEPO-Fc. 3. Purificação de proteína iHuEPO-Fc As moléculas de proteína rHuEPO-Fe contidas nos sobrenadantes coletados do meio isento de soro cultivando as células CEIO expressando rHuEPO-Fc· foram isoladas primeiro por cromatografia de afinidade de Proteína A (Amersham, Cat.No: 17-0402- 01, Canada). As proteínas isoladas foram ainda purificadas por filtragem em gel em coluna HiLoad 16/60 Superdex 200pg ( Amersham, Cat.No: 17- 1069-01, Canada). A pureza da proteína rHuEPO-Fc foi maior que 98% como determinado por eletroforese. 4. Determinação dos tamanhos da proteína rl-IuEPO-Fc pura Primeiro, SDS-PAGE foi realizado para determinar os tamanhos da proteína rHuEPO-Fc pura. Como mostrado em Figura 3, uma banda única com peso molecular de cerca de ISO kDa foi vista em gel a 8% Bis-Tris na condição não reduzida, que mediu o tamanho global d proteína com a existência das ligações dissulfeto. Isto indicou que a maior parte das moléculas de proteína rHuEPO-Fc eram produzidas como a forma dimérica, como esperado do projeto da proteína de fusão. Quando a análise SDS-PAGE foi conduzida na condição de redução (100 mM ditiotreitol, DTT) para romper as ligações dissulfeto, somente a banda com peso molecular de 75Kda foi identificada, consistente com o peso molecular estimado de cadeia de polipeptídeo única de HuEPO-gancho região-CH2-CH3. O peso molecular preciso da proteína de fusão pura rHuEPO-Fc com glicosilação, determinado por espectro de massa (MALDI-TOF-MS), foi 111,099 daltons (111,1 Kda). Neste teste, somente um pico único de proteína foi observado, indicando que a proteína rHuEPO-Fc purificada era quase que 100% pura. Os 15 aminoácidos do N-terminal da proteína rFIuEPO-Fc pura foram determinados por análise da seqüência de proteína como: APPRLICDSRVLERY. Isto foi consistente com a seqüência dos primeiros 15 aminoácidos do polipeptídeo de EPO humana nativa, e confirma que a proteína rHuEPO-Fc purificada de fato tem a seqüência de molécula de EPO direita e completa, como previsto pela seqüência de DNA codificando as seqüências de aminoácidos da proteína de fusão de rFIuEPO-Fc. 5. Atividades eritropoiéticas melhoradas de rHuEPO-Fc em camundongos normais As experiências in vivo camundongos foram conduzidas para confirmar a retenção da atividade eritropoiética da proteína rFIuEPO-Fc e determinar sua eficácia comparada a rHuEPO e darbepoetina-alfa. Para fins de comparação, todas as doses de três EPOs usadas nas experiências com animal descritas da invenção: rHuEPO-Fc dos requerentes, rFIuEPO (isto é, EPO humana nativa) e darbepoetina-alfa, eram as quantidades de porção de molécula de EPO sozinha com base na base molar. Com relação à proteína rHuEPO-Fc, a porção de EPO contribui a 41,4% do peso molecular de rHuEPO-Fc total, como calculado pela relação do peso de aminoácidos de EPO no peso de aminoácidos totais da molécula de rl-IuEPO-Fc completa (1(56 aa dentre 399 aa). A quantidade de EPO para rHuEPO-Fc- foi então decidida como 41,4% da quantidade total da proteína rEIuEPO-Fc. rHuEPO-Fc (concentração de carga: 0,5 mg/ml, pureza de 98, 6%) e rHuEPO humano nativo (isto é estrutura de EPO humana natural) ( <5000 IU/0,5 ml, fabricado por Kirin Brewery Co., Japão) foram diluídos em solução veículo (2,5mg/ml de albumina de soro humano, 5,Smg/ml de citrato de sódio, 0,0ómg/ml de ácido cítrico e 5,Smg/ml de cloreto de sódio, pH5,5-5,6). A dose de rHuEPO em quantidade foi calculada de acordo com sua relação de atividade / quantidade. Os camundongos BALB/c (6- a 8-semanas de idade, pesando 18-22g, números iguais de machos e fêmeas, adquiridos do Experiment Animal Center, AMMS, China, foram agrupados aleatoriamente com (5 em cada grupo. Cada grupo de camundongos foi tratado com uma combinação de uma dose (0,1, 0,5, 2,5,12,5, 62,5pg/kg), uma via de injeção ( i.v. pela veia da cauda ou s. c.) e um esquema de injeção (três vezes por semana ou uma vez por semana ). O grupo de controle e camundongos foi injetado com um volume igual de solução veículo. O tratamento durou 3 semanas e os tempos de observação totais foram de 5 semanas. As amostras de sangue periférico (veia da cauda) para medida foram tomadas antes do tratamento, no 4° dia e 7° dia de cada semana durante 5 semanas. Hb foi medido como o índice por absortiometria. MédiaA desvio padrão foi calculado a partir dos dados de cada grupo e o teste t foi conduzido dentre grupos diferentes. A administração de EPO três vezes por semana aos camundongos, desde que as EPOs tenham atividade eritropoiética nonnal, irá induzir uma estimulação saturada de eritropoiese. Como mostrado na figura 4, ambos os grupos tratados com 3 vezes por semana s.c. tinham uma elevação significante dos níveis de Hb mesmo na dose de 2,5 pg/kg. Esta experiência demonstrou que rHuEPO-Fc demonstrou uma atividade eritropoi ética in vivo tão efetiva como rHuEPO. A elevação dos níveis de Hb no grupo tratado foi dependente da dose. No entanto, a elevação saturada dos níveis de Hb foi induzida em camundongos na dose de 12,5 pg/kg de rHuEPO-Fc, enquanto uma elevação saturada similar dos níveis de Plb foi somente obtida na dose de 62,5pg/kg de rHuEPO. A elevação de níveis Elb induzida por 2,5pg/kg de rHuEPO-Fc foi também maior do que por 2,5pg/kg de rHuEPO. Estes resultados sugeriram uma estimulação eritropoiética mais potente por rHuEPO- Fc do que rHuEPO. A potência eritropoiética de rHuEPO-Fc foi ainda explorada por redução dos tempos de injeção a uma vez por semana subcutaneamente. Como mostrado em Figura 5, os grupos tratados com rHuEPO-Fc mostraram uma elevação dependente da dose de níveis de Hb nas doses de 12,5, ou 62,5pg/kg. Ambas as doses de 12,5 e 62,5pg/kg de rHuEPO também induziram a elevação de níveis de Hb na extensão similar, que é bem menor do que por 62,5pg/kg de rHuEPO-Fc. Isto indica fortemente que rHuEPO-Fe tem uma atividade eritropoiética melhorada in vivo. Isto é provavelmente devido ou à meia-vida prolongada de rHuEPO-Fc in vivo ou ligação de receptor/ ativação de EPO melhoradas pelas moléculas de EPO do dímero na proteína rHuEPO-Fc, ou pelos efeitos combinados de ambos.

Quando as mesmas doses (12,5pg/kg) de rFIuEPO-Fc ou rHuEPO foram administradas intravenosamente ou em três vezes por semana ou uma vez por semana, elevação dos níveis de Hb foi obseivada para todos os grupos tratados (Figura. 6). No entanto, a administração i.v. uma vez por semana de rHuEPO-Fc induziu uma elevação maior, mais persistente dos níveis de Hb, que continuou depois após ter terminado o tratamento. Estes dados ainda apoiam as propriedades eritropoiéticas melhoradas da proteína rHuEPO-Fc em comparação com rHuEPO tendo a estrutura de proteína EPO de ocorrência natural. 6. Atividades eritropoiéticas melhoradas de rHuEPO-Fc em 5/6 ratos nefreetomizados Experimentos em camundongos normais provaram as atividades eritropoiética melhoradas de rHuEPO-Fc in vivo. Para ainda observar a eficácia de rHuEPO-Fc em estimulação de eritropoiese, estudos farmaeodinâmicos foram conduzidos em ratos eom anemia renal experimental que foi feita por 5/6 nefrectomia. A eficácia de rl-IuEPO-Fc foi comparada com as de rHuEPO e darbepoetina-alfa (óOpg/ml, lote No.N079, fabricado por Kirin Brewery Co., Japão).

Os ratos Wistar (macho e fêmea em número igual, pesando 160-180 g, adquiridos de Vitalriver Experiment Animal Inc., Beijing, China. Licença No. SCXK1 1-00-0008) foram usado nesta invenção para criar o modelo de anemia devido à uma falha da função renal por nefrectomia de duas etapas. [27]. 5/6 nefrectomia foi feita em ratos com anestesia geral por duas operações separadas sob condição estéril. Após 2/3 do rim esquerdo serem resseccionados, os ratos foram deixados se recuperar durante vinte dias. O rim direito foi então resseccionado com cuidado. Antibióticos foram administrados para evitar infecção após cada operação. No total 5/6 do tecido do rim foi finalmente resseccionado. Os ratos nefrectomizados gradualmente desenvolveram dissuficiência da função renal e anemia. Os ratos entraram em um estado estável de anemia 50 dias após a nefrectomia, e foram agrupados aleatoriamente (9/giTipo) para iniciar a administração de EPOs. Cada grupo de ratos foi tratado com uma combinação de um esquema de dose (2,5,12,5, 62,5pg/kg), uma via de injeção ( i.v. através da veia do rabo ou s. c.) e uma injeção (uma vez por semana ou uma vez a cada 2 semanas). O grupo de controle e grupo de modelo de ratos foram injetados com volume igual de solução de veículo. O tratamento durou por 4 semanas e os tempos de observação total foram de 6 semanas.

Todas as doses (2,5, 12,5, 62,5pg/kg> de rHuEPO-Fc, administradas subcutaneamente uma vez por semana, induziram uma elevação dependente da dose dos níveis de Hb comparando ao grupo de controle de modelo que não receberam o tratamento com EPO. Tanto 12,5 como 62,5pg/kg de rHuEPO ou darbepoetina, administrados subcutaneamente uma vez por semana também induziu a elevação de níveis de Hb. Os níveis aumentados de Hb em ambos os grupos tratados com 12,5 ou 62,5 pg/kg de rHuEPO-Fc foram significantemente maiores do que os nos grupos tratados com 12,5 ou 62,5 pg/kg de rFIuEPO respectivamente. Os níveis de ITb em 62,5pg/kg de grupos tratados com rHuEPO-Fc foram também levemente maiores do que em 62,5 pg/kg de grupos tratados com darbepoetina. Após parar o tratamento, a diminuição de níveis de Hb em 62,5pg/kg de grupos tratados com rHuEPO-Fc foi bem mais lenta e os níveis de ITb permaneceram maiores do que os de tanto os gmpos de controle nonnais como de controle de modelo até o final da observação ( duas semanas após tratamento ), indicando uma estimulação eritropoiética mais forte 6 prolongada (resumida em Figura 7).

Para o tratamento de injeção subcutânea uma vez a cada duas semanas, somente 12,5 ou 62,5pg/kg de três EPOs foram administrados (Figura S). 12,5pg/kg de rFIuEPO raramente aumentou os níveis de ITb comparado ao grupo de controle de modelo, e a resposta eritropoiética fraca dos grupos tratados com 62,5p.g/kg de rHuEPO falharam em levar os níveis de ITb a nonnais em comparação com o grupo de controle nonnal. Tratamentos de ou rHuEPO-Fc ou darbepoetina nas doses de 12,5 ou 62,5pg/kg induziram uma significante elevação de níveis de Hb que foi maior do que no grupo de controle nonnal, indicando a coiTeção efetiva do estado de anemia por tanto rHuEPO-Fc como darbepoetina. Não foram observadas significante diferenças entre algumas doses de rFIuEPO-Fc e darbepoetina em tennos de eficácia. A dose elevada de 62,5 pg/kg resultou em um persistente aumento de eritropoiese até o ténnino da observação (duas semanas após tratamento). Isto ainda sugeriu que rlTuEPO-Fe e darbepoetina demonstram a propriedade de uma estimulação de longa duração de eritropoiese in vivo, que por sua vez pode ser transferida para a redução das freqüências de administração para os pacientes clinicamente.

Apesar de darbepoetina ter sido aprovada para aplicação clínica com injeções menos freqüentes para aumentar a adesão do paciente e reduzir a carga de trabalho do pessoal de saúde, estes dados experimentais indicam fortemente que rHuEPO-Fc descrito na presente invenção tem pelo menos efeitos em potencial similares. Como discutido acima, darbepoetina, como um análogo mutante da molécula de EPO humana contendo compostos de açúcar adicionais (aumentada glicosilação) pode ter um risco aumentado de induzir imunogênese in vivo devido às estruturas tri-dimensionais alteradas. Somente uma observação a longo prazo de pacientes sofrendo tratamento eom darbepoetina irá dai· uma resposta decisiva para os riscos imunogênicos de darbepoetina. Em contraste, rHuEPO-Fc, sem a medição da porção da molécula de EPO, tem um teor de carboidrato idêntico ou quase similar ao de EPO humana nativa. As quantidades de ácidos siálicos da proteína rHuEPO-Fc pura da invenção foram em torno de 10,0 mmol/mmol EPO, consistente com os parâmetros registrados de rEIuEPO. A parte Fe de rHuEPO-Fc, sem aminoácido(s)/ peptídeo de ligação externos, representa a estrutura geral de IgGl humana, e teoricamente não deve levar a uma resposta imunogênica. Se aprovada clinicamente, rHuEPO-Fc pode dar uma melhor escolha para os pacientes do que os análogos de rHuEPO e EPO atualmente disponíveis, especialmente os que precisam de uma administração a longo prazo.

Uma vez injetada intravenosamente uma vez a cada duas semanas, tanto rHuEPO-Fc como darbepoetina ((62,5pg/kg) foram capazes de induzir aumentos idênticos dos níveis de 11b em ratos com anemia renal bem acima dos níveis de Hb normais nos ratos de controle nonnais (figura 9). Isto ainda demonstra a estimulação persistente de eritropoiese por rHuEPO-Fc, como a eficácia de darbepoetina foi provada clinicamente.

Os dados derivados de experiências de cultura de células de células de medula óssea coletados de 5/6 ratos nefreetomizados após tratamentos (uma vez por semana ou por duas semanas, s.c. ou i.v.) mostraram que rHuEPO-Fc, rHuEPO e darbepoetina estimularam, todos, a formação de CFU-E e BFU-E. As potências de rEIuEPO-Fc e darbepoetina foram similares e mais fortes do que a de rHuEPO (figura 10).

Os níveis de urino nitrogênio (BUN) e Crea no sangue foram similares nos grupos tratados e grupo de controle de modelo. Os níveis de Fc séricos em todos os grupos tratados foram maiores do que os do grupo de controle de modelo. Os exames patológicos observaram o aumento de distribuição de células relacionadas com as células vermelhas do sangue (RBC) na medula óssea e baço de todos os ratos tratados com EPO. 7. Estudos farmacocinéticos de rFIuEPO-Fc em macacos Rhesus Como acima discutido, os inventores projetaram rEIuEPO-Fc em tal modo que a porção de EPO da proteína de fusão retém as propriedades funcionais de EPO natural, como estimulando a eritropoiese, e o fragmento Fc de IgGl humana permite a existência estável da proteína de fusão em circulação, assim prolongando sua meia-vida in vivo. Os estudos acima com animais demonstraram que as atividades de eritropoiese de rHuEPO-Fc são melhoradas em comparação com rHuEPO. Os inventores também conduziram estudos farmacocinéticos para determinar meia-vida in vivo de rFIuEPO-Fc em comparação com a de rHuEPO. Os primatas foram usados para gerar dadas porque eles são biologicamente muito similares aos seres humanos. O projeto do estudo foi baseado em relatos da literatura e as experiências foram conduzidas de acordo com as diretrizes gerais de farmacocinética. Dois grupos de macacos Rhesus com 5 macacos em cada grupo (3-5kg, adquirido do Experiment Animal Center, AMMS, China) foram injetados intravenosamente com 5 pg/kg de rHuEPO-Fc ou rHuEPO, respectivamente. As amostras de sangue foram tomadas antes e a 0,017, 0,167, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 96, 168, 240 h após injeção. Os soros foram coletados por centrifugação e os níveis séricos de rHuEPO-Fc ou rHuEPO foram determinados usando o teste imunossorvente ligado a enzima de eritropoietina humana (ELISA) kits (adquirido de R&D Systems, Minneapolis, MN). A meia vida média e (41/2) de rl-IuEPO-Fe e rHuEPO injetados intravenosamente foi 35,24+/-5,15 h e 8,72+/-1,69 h respectivamente (resumido em Figura 11).

Para observar a biodisponibilidade de rHuEPO-Fc, 5ug/kg de rFIuEPO-Fc foram injetados subcutaneamente a 5 macacos Rhesus. As amostras de sangue foram tomadas antes e 1, 2, 5, 8, 10, 12, 15, 24, 48, 72, 96, 168, 240 h após a injeção e os níveis séricos de rHuEPO-Fc foram determinados pelos kits de R&D. Õ índice de biodisponibilidade foi calculado como 35,71+/- 5,37% com a injeção subcutânea. Estas são cifras idênticas à biodisponibilidade registrada de darbepoetina-alfa (Aranesp™) em pacientes com falha renal crônica [9, 15].

Estes dados demonstram que rHuEPO-Fc tem uma meia-vida significantemente prolongada em primatas, e a meia vida in vivo de rFIuEPO-Fc é pelo menos quatro vezes mais longa do que a de rFIuEPO fabricado por Kirin Beer Brewing Co. de Japan. A meia-vida prolongada in vivo provavelmente contribui para a atividade eritropoiética melhorada de rHuEPO-Fc. 8. Imunogenicidade de rHuEPO-Fc em Macaca fascicularis Como indicado acima, atenção é dada ao projeto de uma proteína de fusão rPIuEPO-Fe para intencionalmente evitar ou minimizar as mudanças nas propriedades imunogênicas de proteína de lusâo rFIuEPO-Fc. Os inventores evitaram incluir/ adicionar quaisquer seqüências de aminoácido(s) ou peptídeo de ligação externas na proteína de fusão. A proteína de fusão rFIuEPO-Fc inventada da forma de realização da figura 1B somente contém as seqüências de polipeptídeos da proteína EPO natural e o fragmento Fc (região de articulação, CH2, CH3) de IgGl humana, e deve teoricamente não induzir uma resposta imunogênica e a produção de anticorpos contra proteína rlTuEPO-Fc. Como será notado por um versado na técnica, outras formas de realização tendo estruturas alternativas são também englobadas pela presente invenção.

Os seguintes estudos com primatas foram conduzidos para observar a imunogenicidade de proteína rHuEPO-Fc. Dez macacos comedores de caranguejos [Macaca fascicularis) (machos/ fêmeas = 5/5, aproximadamente 5 anos de idade, peso médio de machos 4.0±0,3kg, fêmeas 2,9±0,4kg, adquiridos do Laboratory Animal Center, AMMS, China) foram injetados subcutaneamente com 5pg/kg de rHuEPO-Fe purificado 3 vezes por semana durante 4 semana s, e dois injetados com volume igual de solução veículo como os animais de controle. Soros foram coletados uma vez a semana durante 5 semanas (1 semana após-tratamento ) e testados para os anticorpos específicos contra rHuEPO-Fc por ELISA usando o rHuEPO-Fc purificado (5pg/ml) como o antígeno de capa. Além disso, as contagens de RBC e níveis de Hb no sangue periféricos também foram determinados dentro do período experimental. Os dados resultantes mostram que, apesar da melhora da eritropoiese estimulada em macacos tratados com rFIuEPO-Fc ser obsei*vada (os números RBC médios aumentaram de 4.74x109/ml a 6,67xl09/ml e os níveis médios de Hb de 12,2g/dl a 13,7g/dl), rHuEPO-Fc falou em induzir anticorpos específicos detectáveis contra a proteína de fusão. Estes resultados indicam que a proteína de fusão rHuEPO-Fc não causa imunogenicidade em primatas. 9. Estudos de toxicidade aguda de rl-IuEPO-Fc em camundongos normais.

Para avaliar a segurança de proteína de fusão rHuEPO-Fc, estudos tóxicos agudos foram conduzidos em animais.

Dois grupos de camundongos BALB/c (n=20, números iguais de machos e fêmeas, 5-6 semanas de idade, o peso médio da fêmea é 15,8±0,4g, macho é 15,9±0,6g, adquiridos de Chinese Academy of Medicine, China) foram injetados intravenosamente uma vez com uma quantidade excessiva de rHuEPO-Fc purificado (maeho=13,3mg/kg, fêmea =13,2mg/kg) ou volume igual da solução veículo via suas veias da cauda respectivamente.

Além de observai· a presente reação após a injeção, o comportamento geral e estado, atividades, padrões de alimentação e defecação e mudanças foram monitorados e registrados diariamente durante 14 dias. Todos os camundongos também foram pesados no dia 7 e dia 14. No dia 15 após a injeção, o exame anatômico dos órgãos principais dos camundongos foram conduzidos. O exame patológico podería ser conduzido se fossem observadas mudanças incomuns ou mudanças suspeitas dos órgãos.

Todos os camundongos dos 2 grupos não tinham uma reação instantânea óbvia após a injeção. No período de 14 dias, não foram observadas mudanças óbvias de comportamento, atividades, padrões de alimentação e defecação. Além disso, o peso dos camundongos em ambos os grupos aumentou estavelmente durante o período de teste, sem diferenças aparentes entre os 2 grupos no dia 7 ou dia 14 após a injeção. Não foram detectadas mudanças anormais ou patológicas nos tecidos do cérebro, pulmão, coração fígado e rim. Estes resultados indicam que a administração de quantidade excessiva de rEIuEPO-Fc, bem mais do que requerida para demonstrar uma função de eritropoiese normal, é segura e não tem efeitos tóxicos aparentes. 10 - Comparação de proteínas de fusão de tipo selvagem e EPO mudado As investigações também foram conduzidas para comparar as versões de tipo selvagem e mudada de proteínas EPO. Como descrito acima, em uma forma de realização, a invenção inclui uma mutação de aminoácido única no resíduo de aminoácido 172 (C172G). Para fins de comparação, uma proteína de fusão de tipo selvagem foi também preparada tendo um aminoácido de cisteína no resíduo 172 ( figura 12). A proteína de fusão de tipo selvagem foi preparada do mesmo modo que nos exemplos 1-3 acima. Com relação à construção do plasmídeo recombinante, os seguintes oligo-iniciadores (QIAGEN Inc., US) foram usados (os aminoácidos alterados em EFL5w e EFL3w em comparação com os iniciadores de Exemplo 1 estão em negrito). EF5: 5 ' -ccggaattcgccaccatgggggtgcacgaatgtcctgcct-3 EF3: 5 ' -ttttecttttgcggccgettatttaeccggagacagggagag-3 EFL5 w: 5 ' -aggeetgeaggacaggggaeagagttgagcceaaatettgtgaca-3 EFL3w: 5 '-tgtcacaagatttgggcteaactctgtecectgtectgeaggect-3 '.

As seqüências de iniciadores EFL5w e EFL3w são listadas em SEQ. LD. Nos. 9-10 respectivamente.

As experiências in vivo em camundongos foram conduzidas para comparar a atividade eritropoiética da proteína de íusâo de tipo selvagem (aqui referida como rHuEPO-FdC) com a proteína de fusão mudada (isto é proteína rHuEPO-Fc da presente invenção descrita acima) e com EPO humana recombinante (rHuEPO). Para fim de comparação, todas as doses das três proteínas usadas neste exemplo, ou seja rHuEPO-Fc, rHuEPO-FcC e rFIuEPO, foram as quantidades da porção da molécula de EPO apenas em uma base molar. Com relação às proteínas rHuEPO-Fc e rHuEPO-FcC, a porção de EPO contribui para 41,4% do peso molecular total como calculado pela relação do peso de aminoácidos de EPO para o peso de aminoácidos totais das moléculas completas de rlTuEPO-Fc e rHuEPO-FcC (isto é, 166 aa dentre 399 aa). rHuEPO-Fc (concentração de carga: 300pg/ml, ), rHuEPO-FcC(concentração de carga: 90pg/ml) e rHuEPO com a estrutura de EPO natural humana ( 600010/0,5ml, fabricado por Kirin Brewery Co., Japan) foram diluídos em solução veículo (2,5mg/ml de albumina de soro humana, 5,8mg/ml de citrato de sódio, 0,06mg/ml de ácido cítrico e 5,8mg/ml de cloreto de sódio, pH5,5-5,6). A dose de rHuEPO em quantidade foi calculada de acordo com sua relação de atividade / quantidade. Os camundongos BALB/c (9- a 10-semanas de idade, pesando !S-22g, números iguais de machos e fêmeas, adquiridos de Experiment .Animal Center, AMMS, China) foram agrupados aleatoriamente com 8 em cada grupo. Cada grupo de camundongos foi tratado com uma combinação de uma dose ( 2,5,12,5, 62.5 pg/kg), uma via de injeção (s. c.) e um esquema de injeção (três vezes por semana ou uma vez por semana). O grupo de controle de camundongos foi injetado com um volume igual de solução veículo. O tratamento durou por 26 dias. As amostras de sangue periférico (via da cauda) para medida foram tomadas antes do tratamento, nos 2°, 62, 9°, 13a, 16°, 19-, 22a e 26a dias de tratamento. Hb foi medido como um índice por absortiometria. Média + desvio padrão foi calculado a partir dos dados de cada grupo e o teste t foi conduzido dentre grupos diferentes.

Como mostrado em Figura 13, administração de todas as três proteínas EPO em intervalos de três vezes por semana estimulou eritropoiese. Em ambas as doses de 2,5 pg/kg ou 12,5 pg/kg, rEIuEPO-Fc induziu uma maior elevação de níveis de Hb do que HuEPO. A maior elevação de níveis de FIb foi obtida pela dose de 12,5 pg/kg de rHuEPO- Fc. Ambas as doses de 2.5 pg/kg e 12,5 pg/kg de rFIuEPO-FcC induziram uma eritropoiese bem mais fraca do que as doses equivalentes de rHuEPO e rlluEPO-Fc como indicado pela menor elevação significante de níveis de Hb em grupos tratados com rHuEPO-FcC. De fato, 12,5 pg/kg de rHuEPO-FcC induziram uma menor elevação de níveis de Hb do que 2,5 pg/kg de rHuEPO. Estes resultados sugerem que rHuEPO-FcC tem uma atividade eritropoiética afetada in vivo em comparação com rEIuEPO tendo a seqüência molecular de EPO natural. Em contraste, a proteína de fusão rlluEPO-Fc da presente invenção demonstrou funções eritropoiéticas mais potentes. A administração das três proteínas EPO em intervalos de três vezes por semana excluiu em grande parte o impacto de diferenças na meia-vida das proteínas.

A potência eritropoiética de rHuEPO-Fc e rFIuEPO-FcC foi ainda avaliada por redução dos tempos de injeção a uma vez por semana subcutaneamente. Como mostrado em Figura 14, os grupos tratados eom rFIuEPO-Fes maiores maior elevação de níveis de FIb do que os tratados eom rHuEPO nas doses de 12,5 pg/kg ou 62,5 pg/kg. Em contraste, rHuEPO-FcC induziu uma elevação bem mais fraca dos níveis de Hb do que induzido por rHuEPO. Por exemplo, 12,5 pg kg de rHuEPO induziram uma maior elevação de níveis de Hb do que induzido por 62,5 pg/kg de rITuEPÜ-FcC na maior parte dos pontos de tempo. Isto ainda indica que por redução dos tempos de administração para incluir os efeitos de meia-vida, rHuEPO-FcC demonstrou funções eritropoi éticas bem mais fracas in vivo em comparação com rHuEPO tendo a seqüência molecular de EPO natural e em comparação com a proteína de fusão rEIuEPO-Fc da presente invenção.

Em resumo, estes resultados demonstram que rHuEPO-FcC, formado pela fusão de seqüências naturais moleculares de tanto EPO humana como fragmento de Fe humana (gancho, CFI2 e CH3), demonstra funções eritropoiéticas bem mais fracas in vivo em comparação com o rHuEPO tendo a seqüência molecular de EPO natural. Em particular, as atividades eritropoiéticas de proteína de fusão rHuEPO-FcC são menores do que 1/5 das da molécula de EPO natural. Isto indica que a Íusão entre a molécula de EPO e a seqüência natural de fragmento de Fc humano afeta as propriedades funcionais da molécula de EPO. Pela substituição do aminoácido único no primeirc» resíduo de cisteína em região de articulação de fragmento Fc, a proteína de fusão rHuEPO-Fc da presente invenção compreendendo a seqüência da molécula de EPO natural e o fragmento de Fc mutante mostra funções eritropoiéticas mais potentes in vivo comparado com a molécula de EPO natural. Estes dados sugerem que o primeiro resíduo de cisteína na região de articulação de fragmento de Fc tipo selvagem interfere de alguma forma com a molécula de EPO, provavelmente ao causar mudanças estruturais na molécula de EPO, e isto por sua vez prejudica as propriedades funcionais da molécula de EPO para estimular a eritropoiese.

Como será evidente para os versados na técnica à luz da descrição acima, muitas alterações e modificações são possíveis na prática desta invenção sem sair do espírito ou escopo da mesma.

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REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Proteína de fusão isolada, caracterizada pelo fato de que tem uma meia-vida prolongada in vivo em comparação à eritropoietina humana nativa recombinante ou de ocorrência natural, compreendendo: (a) uma molécula de eritropoietina humana de ocorrência natural tendo um resíduo de cisteína próximo a um terminal C do mesmo; e (b) um fragmento Fc de IgG humano compreendendo uma região de articulação, em que um terminal N de dita região de articulação está diretamente ligado ao dito terminal C de dita molécula de eritropoietina e em que dita região de articulação é de ocorrência natural exceto para uma mutação na posição do aminoácido 6, medido de dito terminal N, substituindo um resíduo de cisteína com um resíduo não cisteína, de modo que o primeiro resíduo de cisteína de dita região de articulação localizada mais próxima ao dito terminal N é separado em pelo menos 17 aminoácidos do dito resíduo de cisteína de dita molécula de eritropoietina, em que dita proteína tem a sequência de aminoácido presente na SEQ ID NO: 2 ou uma sequência tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com o mesmo, dita proteína tendo um resíduo de aminoácido não cisteína no resíduo 172.

2. Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a meia-vida da referida proteína é pelo menos três vezes maior do que a da referida eritropoietina humana nativa.

3. Proteína de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida meia-vida da referida proteína é pelo menos quatro vezes maior do que a da referida eritropoietina humana nativa.

4. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida proteína de fusão tem uma bioatividade eritropoiética melhorada em comparação com a referida eritropoietina humana nativa.

5. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que referido fragmento Fc é um fragmento de IgGl.

6. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que referido fragmento Fc compreende uma região de articulação e domínios CH2 e CH3.

7. Homodímero, caracterizado pelo fato de que compreende um par de proteínas de fusão como definidas na reivindicação 1.

8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender uma proteína como definida na reivindicação 1, junto com um veículo, adjuvante ou diluente farmaceuticamente aceitável.

9. Proteína homodimérica isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de polipeptídeos, cada um compreendendo a seqüência de aminoácido presente na SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência tendo pelo menos 98% de identidade de seqüência para a mesma, referida sequência tendo um resíduo de aminoácido não-cisteína no resíduo 172.

10. Proteína de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que referido dímero compreende ligações dissulfeto entre respectivos domínios de articulação de referidos polipeptídeos.

11. Proteína de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que cada um dos referidos polipeptídeos tem uma massa molecular de cerca de 75 kDa.

12. Proteína de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que referido dímero tem uma massa molecular de cerca de 180 kDa.

13. Proteína de fusão isolada, caracterizada pelo fato de que tem uma meia-vida prolongada in vivo em comparação à eritropoietina humana nativa recombinante ou de ocorrência natural, compreendendo: (a) uma porção de peptídeo de eritropoietina tendo um resíduo de cisteína próximo a um terminal C do mesmo; e (b) um fragmento Fc compreendendo uma região de articulação, em que um terminal N de dita região de articulação é diretamente ligado ao dito terminal C de dita porção de peptídeo de eritropoietina e em que dita região de articulação tem uma mutação em uma posição de aminoácido próxima ao dito terminal N substituindo um resíduo de cisteína com um resíduo não cisteína, de modo que o primeiro resíduo de cisteína de dita região de articulação localizada mais próxima ao dito terminal N é separado em pelo menos 12 aminoácidos do dito resíduo de cisteína de dita porção de peptídeo de eritropoietina, em que dita proteína compreende uma seqüência de aminoácido presente na SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência tendo pelo menos 98% de identidade de seqüência para a mesma.

14. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que dita porção de peptídeo de eritropoietina é uma molécula de eritropoietina humana completa.

15. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o fragmento Fc é um fragmento Fc de IgG humano compreendendo dita região de articulação e domínios CH2 e CH3.

16. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que dito fragmento Fc de IgG é um fragmento IgG1.

17. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que referida região de articulação tem pelo menos 9 aminoácidos de comprimento.

18. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que referida região de articulação tem um resíduo não cisteína no aminoácido 6 medido do N-terminal da referida região de articulação.

19. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que referido resíduo não cisteína é um aminoácido neutro.

20. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que referido resíduo não cisteína é glicina.

21. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que referida região de articulação é uma variante de fragmento Fc humano tendo um resíduo não cisteína no aminoácido 6 medido do N-terminal da referida região de articulação.

22. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que referida região de articulação tem a seqüência de aminoácido dos resíduos 167-182 de SEQ ID NO: 2, qual seja, VEPKSGDJKTSTCPPCP, ou uma seqüência tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência para a mesma e tendo um resíduo não-cisteína no aminoácido 6 medido do N-terminal da referida região de articulação.

23. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a meia-vida da referida proteína, quando administrada a um mamífero, é pelo menos três vezes maior do que a eritropoietina humana nativa administrada ao referido mamífero pelos mesmos meios.

24. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a meia-vida da referida proteína, quando administrada a um mamífero, é pelo menos quatro vezes maior do que a eritropoietina humana nativa administrada ao referido mamífero pelos mesmos meios.

25. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que referido mamífero é um humano.

26. Dímero isolado, caracterizado pelo fato de compreender primeira e segunda proteínas de fusão, cada uma como definida na reivindicação 13, em que referida região de articulação de referida primeira proteína de fusão é ligada à referida região de articulação de referida segunda proteína de fusão por ligações dissulfeto.

27. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que referida região de articulação tem pelo menos 9 aminoácidos de comprimento.

28. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que referida região de articulação é uma variante do fragmento Fc humano tendo um resíduo não cisteína no aminoácido 6 medido do N-terminal da referida região de articulação.

29. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que referida região de articulação tem a seqüência de aminoácido dos resíduos 167-182 de SEQ ID NO: 2, qual seja, VEPKSGDJKTSTCPPCP, ou uma seqüência tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência para a mesma.

30. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que dita porção de peptídeo de eritropoietina é uma molécula de eritropoietina humana completa.

31. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o fragmento Fc é um fragmento Fc de IgG humano compreendendo dita região de articulação e domínios CH2 e CH3.

32. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que dito fragmento Fc de IgG é um fragmento IgG1.

33. Homodímero purificado, caracterizado pelo fato de que compreende um par de polipeptídeos recombinantes cada um tendo a sequência de aminoácido presente na SEQ ID NO: 2 ou uma sequência tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com a mesma, cada um de dito polipeptídeo tendo um resíduo de aminoácido não-cisteína no resíduo 172.

34. Dímero isolado, caracterizado pelo fato de compreender um par de polipeptídeos cada um tendo a sequência de aminoácido presente na SEQ ID NO: 2.

35. Seqüência de polinucleotídeo isolada caracterizada pelo fato de ter uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão com pelo menos 90% de identidade de seqüência de aminoácido para SEQ ID NO: 2, referido polinucleotídeo codificando um aminoácido não-cisteína no resíduo 172 de referida sequência de aminoácido, em que referida proteína tem uma meia-vida prolongada in vivo em comparação com a eritropoietina humana nativa.

36. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que referida sequência de ácido nucleico codifica uma proteína tendo pelo menos 98% de identidade de seqüência de aminoácido com a SEQ ID NO: 2.

37. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de ter uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de seqüência de aminoácido para SEQ ID NO: 1, e que codifica uma proteína de fusão tendo uma potência eritropoiética pelo menos igual ao da eritropoietina humana nativa e tendo uma meia-vida prolongada in vivo em comparação com a eritropoietina humana nativa.

38. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de ter pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1.

39. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de ter pelo menos 98% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1.

40. Molécula de DNA recombinante isolada, caracterizada pelo fato de compreender a sequência de ácido nucleico presente na SEQ ID NO: 1 ou uma sequência tendo 98% de identidade de sequência com a mesma.

41. Método para produzir uma proteína como definida na reivindicação 35, caracterizado pelo fato de compreender cultivar uma linhagem de células transfectada com a molécula de DNA, como definida na reivindicação 40 e purificar o polipeptídeo assim codificado.

42. Molécula de DNA recombinante, caracterizado pelo fato de compreender a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1.

43. Molécula de ácido nucleico isolado, caracterizada pelo fato de codificar um polipeptídeo com pelo menos 98% de identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO: 2, em que dito polipeptídeo tem uma meia-vida prolongada in vivo em comparação à eritropoietina humana nativa, em que dito polipeptídeo compreende um fragmento de uma molécula de imunoglobulina humana cujo terminal N é diretamente ligado ao dito terminal C de uma molécula de eritropoietina, e em que a região de articulação é diretamente ligada a um terminal C de uma molécula de eritropoietina, e em que a região de articulação de referida molécula de imunoglobulina tem uma mutação por meio da qual um resíduo de cisteína próximo ao referido terminal N é substituído por um resíduo de não cisteína.

44. Uso de uma proteína de fusão compreendendo: (a) uma molécula de eritropoietina humana de ocorrência natural tendo um resíduo de cisteína próximo a um terminal C do mesmo; e (b) um fragmento Fc de IgG humano compreendendo uma região de articulação, em que um terminal N de dita região de articulação está diretamente ligado ao dito terminal C de dita molécula de eritropoietina e em que dita região de articulação compreende uma mutação por meio da qual um resíduo de cisteína de referida região de articulação localizada mais próxima ao referido N-terminal é substituído por um resíduo não cisteína, de modo que o primeiro resíduo de cisteína de dita região de articulação localizada mais próxima ao dito N-terminal é separado em pelo menos 17 aminoácidos do dito resíduo de cisteína de dita molécula de eritropoietina, em que dita proteína tem uma potência eritropoiética e uma meia-vida pelo menos igual à da eritropoietina humana e em que referida proteína tem uma sequência de aminoácido presente na SEQ ID NO: 2 ou uma sequência tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com o mesmo, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para estimular a eritropoiese em um mamífero.

45. Uso de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que referido mamífero é um primata.

46. Uso de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que referido primata é um humano.

47. Uso de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que referida sequência tem pelo menos 98% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2.

48. Uso de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a meia-vida in vivo de referida proteína em referido mamífero é pelo menos três vezes maior do que a da referida eritropoietina humana nativa quando administrada intravenosamente ou subcutaneamente.

49. Uso de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a meia-vida in vivo de referida proteína em referido mamífero é pelo menos quatro vezes maior do que a da referida eritropoietina humana nativa quando administrada intravenosamente ou subcutaneamente.

50. Uso de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o medicamento é administrado junto com um veículo, adjuvante ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.

51. Uso de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que referido mamífero é um primata.

52. Uso de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que referido primata é um humano.

53. Uso de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a meia-vida in vivo de referida proteína em referido mamífero é pelo menos três vezes maior do que a da referida eritropoietina humana nativa quando administrada intravenosamente ou subcutaneamente.

54. Uso de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a meia-vida in vivo de referida proteína em referido mamífero é pelo menos quatro vezes maior do que a da referida eritropoietina humana nativa quando administrada intravenosamente ou subcutaneamente.

55. Uso de um dímero compreendendo um par de polipeptídeos cada um tendo a sequência de aminoácido presente na SEQ ID NO: 2 ou uma sequência tendo 90% de identidade com o mesmo e tendo um aminoácido não-cisteína no resíduo 172, caracterizado pelo fato de ser para manufatura de um medicamento para estimular a eritropoiese em um mamífero.

56. Uso de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que referido mamífero é um primata.

57. Uso de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que referido primata é um humano.

58. Uso de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que referida sequência tem pelo menos 98% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2.

59. Uso de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a meia-vida in vivo de referida proteína em referido mamífero é pelo menos três vezes maior do que a da referida eritropoietina humana nativa quando administrada intravenosamente ou subcutaneamente.

60. Uso de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a meia-vida in vivo de referida proteína em referido mamífero é pelo menos quatro vezes maior do que a da referida eritropoietina humana nativa quando administrada intravenosamente ou subcutaneamente.

61. Uso de uma proteína de fusão compreendendo: (a) uma porção de peptídeo de eritropoietina tendo um resíduo de cisteína próximo a um terminal C do mesmo; e (b) um fragmento Fc de IgG humano compreendendo uma região de articulação, em que um terminal N de dita região de articulação está diretamente ligado ao dito terminal C de dita porção de peptídeo de eritropoietina e em que dita região de articulação tem uma mutação em uma posição próxima ao referido terminal N substituindo um resíduo de cisteína por um resíduo não cisteína, de modo que o primeiro resíduo de cisteína de dita região de articulação localizada mais próxima ao dito terminal N é separado em pelo menos 12 aminoácidos do dito resíduo de cisteína de dita porção de peptídeo de eritropoietina, em que dita proteína tem uma potência eritropoiética e uma meia-vida pelo menos igual à da eritropoietina humana e em que referida proteína tem uma sequência de aminoácido presente na SEQ ID NO: 2 ou uma sequência tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com o mesmo, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para estimular a eritropoiese em um mamífero.