TWI454482B - 在活體中具有延長之半生期以及提高之紅血球生成活性的重組人類紅血球生成素（ｅｐｏ)-ｆｃ融合蛋白 - Google Patents

在活體中具有延長之半生期以及提高之紅血球生成活性的重組人類紅血球生成素（ｅｐｏ)-ｆｃ融合蛋白 Download PDF

Info

Publication number
TWI454482B
TWI454482B TW096126612A TW96126612A TWI454482B TW I454482 B TWI454482 B TW I454482B TW 096126612 A TW096126612 A TW 096126612A TW 96126612 A TW96126612 A TW 96126612A TW I454482 B TWI454482 B TW I454482B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
fusion protein
sequence
rhuepo
amino acid
erythropoietin
Prior art date
Application number
TW096126612A
Other languages
English (en)
Other versions
TW200904829A (en
Inventor
Haitao Wang
Yong Du
Rui Zhang
Jing Xu
Longbin Liu
Original Assignee
Novagen Holding Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novagen Holding Corp filed Critical Novagen Holding Corp
Publication of TW200904829A publication Critical patent/TW200904829A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI454482B publication Critical patent/TWI454482B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

在活體中具有延長之半生期以及提高之紅血球生成活性的重組人類紅血球生成素(EPO)-FC融合蛋白 相關申請案
本申請案係有關以及主張於2006年1月27日提申之美國專利申請案案號11/340,661的利益，其之全體係藉此被併入以作為參考資料。
發明領域
本申請案係有關人類紅血球生成素融合蛋白。
 發明背景
人類紅血球生成素(EPO)，造血的生長因子家族的一個成員，係主要於成人腎和胎兒肝中對於由於下降的血氧可利用性之組織缺氧反應而被合成[1]。EPO之主要的功能是直接地作用於骨髓中之某些紅血球(RBC)前驅體和前驅物以刺激血紅素和成熟的RBC的合成。其也控制RBC的增殖、分化，和成熟。具有天然存在的EPO的胺基酸序列之重組型EPO已經被生產以及被認可來治療與貧血關聯的腎功能衰竭、癌和其他病理上的病況[2]。除其之紅血球生成性質之外，最近的研究[3]表示EPO也作用於非骨髓細胞，如神經元，暗示EPO於中樞神經系統(CNS)和其他的器官/系統中之其他可能的生理的/病理上的功能。因EPO受體已經於許多不同的器官中被發現，EPO可能具有多重的生物的效力，例如：作用為一種抗細胞凋亡劑。
人類EPO是一種具有30.4千道爾頓的分子量之醣蛋白。碳水化合物佔有其總質量的大概39%。該EPO基因係座落於染色體7q11－22以及橫跨一個具有5個外顯子和4個內含子的5.4kb區域[4]。EPO的前驅物係由193個胺基酸構成。藉由轉譯後修飾之前導序列和最後的胺基酸Arg之分裂係產生具有165個胺基酸之成熟的EPO。糖化作用，帶有在Asn 24、Asn38、Asn83之三個N連接位置和在Ser126之一個O連接位置，在生物合成、三級的結構和EPO之活體內的生物活性上扮演一個關鍵的角色[5]。EPO係藉由結合至一種紅血球生成素受體而作用，該受體係為一種具有72－78千道爾頓的分子量之經糖化且磷酸化的穿膜多肽。此結合觸發受體的同源二聚體化(homodimerization)，其導致數種信息傳導途徑的活化：JAK2/STAT5系統，G蛋白，鈣通道，以及激酶。需要EPO蛋白的2種分子同時地結合至1個受體分子以達到最佳的受體活化[6]。
作為人類療法認可的第一種造血的生長因子，重組型人類EPO(rHuEPO)已經被使用於起因於慢性腎衰竭、癌(主要化療關聯的貧血)、自體免疫疾病、AIDS、手術、骨髓移植和骨髓發育不良症候群，等等的貧血之治療。有趣地，近來的研究也已經觀察到rHuEPO具有非血液系統的功能以及顯示被使用作為大腦的局部缺血、腦部外傷、發炎疾病和神經退化性障礙之一種神經保護性藥物的潛力[7]。
現在，3種的rHuEPO或rHuEPO類似物是商業上可得的，即rHuEPO阿伐(α)、rHuEPO貝它(β)，和達比波廷阿伐(darbepoetin alfa)[8]。此等3種重組型蛋白結合至相同的紅血球生成素受體，但是於結構、糖化作用的程度、受體結合親和性以及活體內代謝上不同。因rHuEPO－阿伐(α)開始的引入是在1980s，臨床醫生迅速地認定該藥物的慣常劑量/注射要件為一種顯著的缺點。被靜脈內或皮下地投藥的rHuEPO阿伐(α)和rHuEPO貝它(β)之平均活體內的半生期各別地只有8.5和17小時[9,10]。病人因而需要一種每日，每週2次或每週3次的注射時間表，其對病人和健康照顧提供者均是一種負擔。因此，對於發展具有一種較長的活體內半生期及/或提高之紅血球生成活性之重組型EPO類似物有一種存在已久的需求。
於先前技藝中已經企圖在基因上改變或化學修飾天然的EPO蛋白的結構以減緩其之活體內代謝或者改良其之治療性質。舉例而言，介於EPO分子上的含有唾液酸之碳水化合物的量和其之活體內代謝與功能活性之間似乎有一種直接的相關性。EPO分子之增加的碳水化合物含量因而導致一種活體內較長的半生期以及提高的活性[11,12]。分子應用基因公司(Amgen)已經設計rHuEPO類似物達比波廷阿伐以包含5 N－連接碳水化合物鏈，比rHuEPO多2個。達比波廷阿伐也被知道為新型紅血球生成刺激蛋白(Novel Erythropoiesis Stimulating Protein)(NESP)以及以商標AranespTM 予以販售。達比波廷阿伐與天然的人類EPO在5個位置上不同(Ala30Asn,His32Thr,Pro87Val,Trp88Asn,Pro90Thr)，其允許在天冬醯胺酸殘基位置30和88之2個額外的N連接寡糖的連接。達比波廷阿伐係以如同天然的EPO之相同的方式而結合至EPO受體以引發涉及藉由JAK－2激酶以及相同的細胞內的分子Ras/MAP－k、P13－k和STAT－5之酪胺酸磷酸化的細胞內的訊息傳導。由於增加的碳水化合物含量，達比波廷阿伐於動物和人類2者體內的半生期幾乎是3倍更長於rHuEPO－阿伐的半生期(25.3小時對8.5小時)[9]。達比波廷阿伐(AranespTm )亦顯示展現出與活體內天然存在的或重組型人類EPO相比提高的生物活性[13]，以及已經由FDA認可為一種第二代rHuEPO藥物；此藥物只需要被每週1次予以投藥以達到rHuEPO的每週2－3次注射之完全相同的治療效力[10,14,15]。
其他的要延長EPO的半生期之企圖已經集中在經由和聚乙二醇(聚乙烯二醇化)與類似物的化學共軛而增加EPO蛋白的分子量。聚乙烯二醇化－EPO(PEGylated－EPO)具有一個大得多的分子量且被保護不自循環清除以及因而具有一種較長的血漿半生期[16]。然而，聚乙烯二醇化可能改變蛋白結構導致EPO部分的功能和特異性之未預料到的變化。也有藉由其他方法而增加EPO的分子量的報導，例如：連接EPO分子至一種載體蛋白(人類白蛋白)，或者藉由利用連接肽(3至17個胺基酸)或藉由化學交聯試劑而形成2個完整的EPO分子之同源二聚體化[17,18,19,20]。雖然全部的此等方法在延長半生期和提高EPO的活性上已經達到某些成功，如於本申請案中說明的組合EPO分子與一種融合蛋白內的人類免疫球蛋白(IgG)的Fc片段達到獨特的優點。
人類免疫球蛋白IgG係由藉著雙硫鍵而共價地連接的之4種多肽組成(2個同樣的輕鏈和重鏈複本)。IgG分子藉由木瓜酶之蛋白質水解產生2個Fab片段和1個Fc片段。Fc片段係由藉著雙硫鍵而連接在一起的2個多肽構成。各多肽，自N至C端，係由一種樞紐區(hinge region)、一種CH2領域和一種CH3領域組成。Fc片段結構在人類免疫球蛋白之全部的亞型之中幾乎是相同的。IgG是人類血液中最大量的蛋白的其中一種以及組成人類血清中之70至75%的總免疫球蛋白，IgG於循環中的半生期在全部的5種免疫球蛋白之中是最長的以及可以達到21天。
近代的生物工程技術已經成功地應用至由治療蛋白片段構成的融合蛋白的創造，例如：細胞激素和可溶的受體，以及人類IgG的Fc片段[21,22,23,24]。此等融合蛋白具有一種顯著地較長的活體內半生期，同時保持其等之生物和治療性質。到目前為止，包含一個Fc片段之二種融合蛋白已經成功地被發展為生物性藥物以及被FDA認可作為風濕性關節炎和慢性斑塊型牛皮癬(chronic plaque psoriasis)的治療[25,26]。
已經被顯示於先前技藝中的不論是藉由化學交聯或藉由一種多肽連接的2個EPO分子之二聚物展現出提高的活體內活性以及延長的半生期[17,19]。提高的活性可能由於EPO二聚物對於一個受體之更有效的結合，以及延長的活體內半生期係由於該二聚物蛋白的更大的尺寸。然而，化學交聯方法不是有效的以及難以控制。並且，於EPO的二聚物內之連接肽可能改變EPO分子的三維結構以及該肽本身可能刺激活體內免疫原性的反應。此等缺點削弱EPO二聚物的治療潛力，特別地因腎病人的EPO替代療法是終身的。
對於具有一種顯著地較長的活體內半生期和提高的紅血球生成活性，但不具有任何增加的免疫原性的性質之EPO類似物的需求因而升高。
 發明概要
依照本發明，一種包含一種被連接至一種免疫球蛋白肽部分的人類紅血球生成素肽部分之重組型融合蛋白係被說明。該融合蛋白與天然存在的或重組型天然的人類紅血球生成素相比具有一種活體內延長的半生期。於本發明的一個實施例中，該蛋白具有比天然的人類紅血球生成素更高至少3倍的活體內半生期。該融合蛋白與天然的人類紅血球生成素相比也可以展現出提高的紅血球生成生物活性。
於本發明的一個實施例中，免疫球蛋白肽部分是一種Fc片段，例如：一種IgG1片段。該Fc片段包括CH2和CH3領域以及一種樞紐區。EPO肽部分可以是被直接地連接至該樞紐區。較佳地，該樞紐區在長度上是至少9個胺基酸。於一個實施例中，EPO肽部分具有一個鄰近其之C端的半胱胺酸殘基以及該樞紐區包括一個座落於最接近該EPO肽部分的半胱胺酸殘基。較佳地，此等2個半胱胺酸殘基相距至少12個胺基酸。於一個實施例中，EPO肽部分可以包含一個直接地被連接至免疫球蛋白部分(換言之，沒有外部肽連接子(peptide linker)被插入介於EPO和免疫球蛋白部分之間)的完整的EPO分子。
本發明也有關多聚體的蛋白建構物，其等包含本發明的融合蛋白之多重的單元。舉例而言，二種融合蛋白可以被總成為一種二聚物，其中該等蛋白的樞紐區係藉由雙硫鍵予以連結。該二聚物具有一種IgG分子的一般形狀以及比游離的EPO分子更安定。
本發明亦有關編碼該融合蛋白的核酸和胺基酸序列以及用於產生該融合蛋白的轉染的細胞株與方法。本發明進一步包括包含該融合蛋白的藥學組成物以及利用該融合蛋白及/或該等藥學組成物，舉例而言以刺激於需要治療的個體體內之紅血球生成的方法。
圖式簡單說明
於圖示中闡釋本發明的各種實施例，但是不欲被解釋成為一種限制方式：第1A圖是一個結構圖，其顯示本發明的重組型人類EPO－Fc融合蛋白(rHuEPO－Fc)的一般結構。
第1B圖是一個序列表，其顯示rHuEPO－Fc蛋白的核苷酸序列和演繹的胺基酸(aa)的序列。DNA的全長是1281bp。於演繹的蛋白序列中的426個胺基酸包括信息肽的27個aa以及完整的rHuEPO－Fc蛋白之399個aa。完整的rHuEPO－Fc蛋白係由人類EPO領域(166 aa)，人類IgG1的Fc片段之樞紐區(16aa，下面劃線的)，以及CH2和CH3領域(217aa)構成。成熟的rHuEPO－Fc融合蛋白的多肽之計算的分子量是44.6kDa，由18.5kDa(41.4%)的EPO片段和26.1kDa(58.6%)的IgG1 Fc片段組成。一種同源二聚物係藉由在樞紐區之內的2個半胱胺酸殘基(被框起的)之2個雙硫鍵予以形成。在成熟的融合蛋白之殘基172(換言之，樞紐區的第6個胺基酸)，天然的半胱胺酸殘基已經被甘胺酸(粗體)取代。
第2圖是一種顯示哺乳動物表現質體pCD1的結構和特徵之結構圖，該質體係被使用來插入編碼rHuEPO－Fc融合蛋白的多肽之DNA序列，以及用來轉染表現rHuEPO－Fc融合蛋白的CHO細胞。
第3圖是一種SDS－PAGE影像，其顯示藉由SDS－PAGE分析、於非還原狀態中的純的rHuEPO－Fc蛋白之二聚體形式以及於還原狀態中的純的rHuEPO－Fc蛋白之單體形式的大小。來自表現rHuEPO－Fc之經培養的CHO細胞株的懸浮液之純化的rHuEPO－Fc蛋白主要地存在為二聚體形式，以及於非還原狀態中的8%雙三羥甲基氨基甲烷凝膠上具有大約180 kDa的分子量。於還原狀態中(100mM二硫蘇糖醇，DTT)打破雙硫鍵，二聚體被分離成2個具有75 kDa的分子量之完全相同的單體單元。
第4A和4B圖是顯示以每週3次rHuEPO－Fc或rHuEPO的皮下注射(s.c.)治療的正常小鼠內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加的圖。各點代表該組(6隻小鼠)的Hb位準。第0天位準代表在治療之前的Hb位準。A：以rHuEPO－Fc治療的小鼠。B：以天然的rHuEPO治療的小鼠。
第5A和5B圖是顯示以每週1次的rHuEPOFc或rHuEPO s.c.治療之正常小鼠內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加的圖。各點代表該組(6隻小鼠)的平均Hb位準。第0天位準代表在治療之前的Hb位準。A：以rHuEPO－Fc治療的小鼠。B：以天然的rHuEPO治療的小鼠。
第6A和6B圖是顯示以12.5 μg/kg的rHuEPO－Fc或rHuEPO之靜脈內注射(i.v.)治療的正常小鼠內之血紅素(Hb)位準的增加的圖。各點代表該組(6隻小鼠)的平均Hb位準。第0天位準代表在治療之前的Hb位準。A：以一週一次治療的之小鼠。B：以一週3次治療的小鼠。
第7圖是一個顯示於以每週1次s.c.的rHuEPO－Fc、rHuEPO或達比波廷阿伐(縮寫的Darbe.)治療的5/6腎切除的大鼠體內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加的圖。各點代表該組的平均Hb位準。正常的對照是以載體溶液的注射之正常的大鼠。模式的對照是以載體溶液的注射之5/6腎切除的大鼠。第0週位準代表在治療之前的Hb位準。＊ ：在治療之後的週數。
第8圖是一個顯示以每2週1次s.c.的rHuEPO－Fc、rHuEPO或達比波廷阿伐(縮寫的Darbe.)治療的5/6腎切除的大鼠體內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加的圖。各點代表該組的平均Hb位準。正常的對照是以載體溶液的注射之正常的大鼠。模式的對照是以載體溶液的注射之5/6腎切除的大鼠。第0週位準代表在治療之前的Hb位準。＊ ：在治療之後的週數。
第9圖是一個顯示以每2週1次i.v.的62.5 μg/kg之rHuEPO－Fc，或達比波廷阿伐(縮寫的Darbe.)治療的5/6腎切除的大鼠體內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加的圖。各點代表該組的平均Hb位準。正常的對照是以載體溶液的注射之正常的大鼠。模式的對照是以載體溶液的注射之5/6腎切除的大鼠。第0週位準代表在治療之前的Hb位準。＊ ：在治療之後的週數。
第10A－10C圖顯示用於刺激以不同的劑量和時間表治療的5/6腎切除的大鼠體內之CFU－E和BFU－E的群落形成的rHuEPO－Fc、rHuEPO和達比波廷阿伐之潛力的比較。rHuEPO－Fc和達比波廷阿伐(縮寫的Darbe.)治療顯示出刺激CFU－E和BFU－E的群落形成之相似的劑量依賴性潛力，然而rHuEPO是較不有效力的。A，每週1次s.c.。B，每2週1次s.c.。C.，每2週1次i.v.。
第11圖是一個顯示在5μg/kg的rHuEPO－Fc或rHuEPO之靜脈內注射至恆河猴之後，rHuEPO－Fc和rHuEPO的血清位準的圖(5隻猴的平均位準)。
第12圖是一個序列表，其顯示一種野生型rHuEPO－FcC蛋白的核苷酸序列和演繹的胺基酸(aa)的序列。該序列特點係與第1圖中所顯示的相同，除了一種天然的、野生型的半胱胺酸殘基係存在於成熟的融合蛋白的殘基172(換言之，樞紐區的第6個胺基酸)之外。
第13圖是一個圖，其顯示以每週3次的rHuEPO－Fc(本發明的突變的融合蛋白)、rHuEPO FcC(野生型融合蛋白)和rHuEPO之皮下注射(s.c.)治療的正常小鼠體內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加。各點代表該組(8)的平均Hb位準。正常的對照是以載體溶液的注射之正常的小鼠。第0天位準代表在治療之前的Hb位準。
第14圖是一個圖，其顯示以每週1次的rHuEPO－Fc、rHuEPO－FcC和rHuEPO之皮下注射(s.c.)治療的正常小鼠體內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加。各點代表該組(8)的平均Hb位準。正常的對照是以載體溶液的注射之正常的小鼠。第0天位準代表在治療之前的Hb位準。
 較佳實施例之詳細說明
在下列的各處中，明確的細節被提出俾以提供本發明的更徹底的瞭解。然而，本發明可以沒有此等細節予以實施。於其他的例子中，熟知的元件沒有被顯示或被詳盡地說明以避免不必要的混淆本發明。於是，說明書和圖示要被視為一種闡釋的，而非一種限制的意思。
本申請案係有關一種具有紅血球生成性質之新穎的融合蛋白。該融合蛋白，於本文中被提及為rHuEPO－Fc，包含一種被重組地連接至一種免疫球蛋白Fc片段的紅血球生成素(EPO)分子。如以下進一步被討論的，該融合蛋白可以是以由2個完全相同的多肽次單元構成之一種二聚物的形式。於被結構地顯示於第1A圖中的實施例中，各多肽次單元，自N端至C端，係由人類EPO分子的多肽序列和人類免疫球蛋白IgG1的Fc片段之樞紐區、CH2領域和CH3領域的多肽序列構成。2個多肽次單元係藉由介於各別的樞紐區之間的雙硫鍵而被連接在一起以形成二聚體結構。該二聚體因而具有如一種IgG分子相同的一般形狀以及如於以下的實施例中所討論的展現出比游離的EPO分子更好的安定性。
如同對於本技藝中具有技術的一個人是明顯的，一種完整無缺的免疫球蛋白之樞紐區提供蛋白有效的抗原抗體結合之充分的可撓性。同樣地，於本發明中，該樞紐區係被包括於rHuEPO－Fc融合蛋白的設計中以維持其之可撓性，尤其當該融合蛋白係於二聚體形式時。如下說明的，此允許rHuEPO－Fc融合蛋白的EPO部分正常的結合至EPO受體以活化EPO的生物功能。據信rHuEPO－FC融合蛋白的二聚體形式，藉由提供2個EPO分子，能夠誘導EPO受體之最佳的活化(舉例而言，藉由促進受體交聯)。
如於以下提出的實施例中所顯示的，rHuEPO－Fc融合蛋白已經成功地利用重組DNA技術予以合成。該融合蛋白已經被顯示於小鼠、大鼠和靈長類動物的研究中以展現出活體內延長的半生期和提高的紅血球生成性質，與天然存在的或重組型天然的人類EPO相比。如被使用於本專利申請案中的，術語"天然的人類紅血球生成素"和"天然的人類EPO"意指具有一種未經修飾的野生型結構之EPO。如會被本技藝中具有技術的一個人瞭解的，天然的人類EPO可以是天然存在的或重組地生產的(例如rHuEPO阿伐(α))。術語"天然的人類EPO"不包括rHuEPO類似物，例如：EPO結構已經被顯著地修飾，例如：藉由高糖化作用(hyperglycosylation)，之達比波廷阿伐(α)。
本發明的rHuEPO－Fc融合蛋白的核酸序列係被顯示於序列辨識編號：1內。對應的演繹的胺基酸序列係被顯示於序列辨識編號：2內。完整的rHuEPO－Fc融合蛋白在長度上是399個胺基酸。如第1B圖中所顯示的，完整的rHuEPO－Fc融合蛋白係由EPO領域(166個胺基酸)、樞紐區(16個胺基酸，下面劃線的)以及CH2和CH3領域(217個胺基酸)所構成。一種由27個胺基酸所構成的信息或前導肽序列也被顯示於第1B圖內。該信息肽係在rHuEPO－Fc的合成期間被分裂開。包括該信息或前導肽之rHuEPO－Fc的核酸和胺基酸序列係各別地被顯示於序列辨識編號：3和序列辨識編號：4內。
如最佳被顯示於第1B圖中以及序列辨識編號：2的，該EPO領域在胺基酸號碼161、接近其之C端具有一個半胱胺酸殘基。樞紐區包括2個半胱胺酸殘基，在第1B圖中被框起的胺基酸號碼178和181。樞紐區半胱胺酸殘基如上討論的形成介於同源二聚物的多肽次單元之間的雙硫鍵。一個人類IgG1片段之天然存在的樞紐區也在樞紐區部分的殘基號碼6(自N端測量)具有一個半胱胺酸。於本發明中，樞紐部分的半胱胺酸殘基6已經被一個非半胱胺酸殘基予以取代。特別地，於第1B圖和序列辨識編號：2的實施例中，胺基酸半胱胺酸已經由甘胺酸予以取代(在rHuEPO－Fc的胺基酸殘基172，其係對應於樞紐區的殘基6)。對於本技藝中具有技術的一個人會是明顯的，其他的非半胱胺酸殘基也能取代在此位置的半胱胺酸以避免一個雙硫鍵的形成。
在殘基172的胺基酸取代的結果，樞紐區的第一個半胱胺酸殘基(在殘基178)與上述的EPO領域的半胱胺酸殘基(在殘基161)相距17個胺基酸。本發明人相信介於EPO領域的半胱胺酸殘基161和樞紐區的第一個半胱胺酸殘基之間的最小間隔應該是至少12個胺基酸，以使得rHuEPO－Fc之一種同源二聚物成功的總成及/或EPO受體的結合。也就是，設若殘基172是一個半胱胺酸殘基，一種非所欲的雙硫鍵可以有可能地形成，例如：介於半胱胺酸殘基161和172之間。此可以改變EPO分子的三維結構，導致生物的不活化或降低的生物活性。
於本發明的一個實施例中，EPO領域係被直接地連接至融合蛋白的Fc片段部分。藉由避免提供一種外部連接肽，rHuEPO－Fc融合肽之較佳的三維結構被維持以及觸發一種非所欲的免疫原性反應的風險係被最小化。Fc片段的樞紐區在長度上較佳地是至少9個胺基酸，以及在長度上較佳地落在大約10－20個胺基酸的範圍內。
實施例
下列的實施例將進一步更詳盡地闡釋本發明，儘管會明瞭本發明不被限制於特定的5個實施例。
1.編碼HuEPO－Fc的融合蛋白之重組型質體pCdEpo－Fc的建構
編碼rHuEPO－Fc多肽的胺基酸序列之全長的DNA分子係藉由利用下列的寡引子(QIAGEN Inc.,US)之重疊PCR予以產生：EF5：5'－ccggaattcgccaccatgggggtgcacgaatgtcctgcct－3'；EF3：5'－ttttccttttgcggccgcttatttacccggagacagggagag－3'；EFL5：5'－aggcctgcaggacaggggacagagttgagcccaaatctggtgaca－3'；EFL3：5'－tgtcaccagatttgggctcaactctgtcccctgtcctgcaggcct－3'；以上提及的引子的序列係各別地被列於序列辨識編號：5－8中。
EcoR I和Not I位址係各別地被導入於EF5和EF3中。為了HuEPO－Fc蛋白於哺乳動物細胞內之最佳的表現，Kozak的序列(GCCACCATGG)也被導入於EF5中。EFL5和EFL3是互補序列，其等係由Epo的3'端DNA序列(23bp)和IgG1樞紐的5'端DNA序列(22bp)所構成。
首先，一種0.6 kb的EPO DNA片段係以來自含有全長的人類EPO cDNA之質體p9E、以引子EF5和EFL3，0.7 kb的Fc片段係由來自含有全長的人類IgG1 cDNA序列之質體pD、以引子EF3和EFL5，藉由PCR(Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity)各別地予以擴增(p9E和pD係來自本發明人自己的實驗室)。2個片段接而被純化以及以相等的量予以混合。利用該混合物作為模版，全長1.3 kb的rHuEPO－Fc DNA係藉由引子EF5和EF3予以擴增。經純化的1.3 kb片段係藉由EocR I和Not I(New England Biolab Inc.US)予以水解以及接而被選殖至EcoR I/Not I－水解的哺乳動物表現載體pCD 1(第2圖)之內。形成的重組型載體被命名為pCdEpo－Fc，以及編碼HuEPO－Fc蛋白的胺基酸序列之被插入的核酸序列係藉由DNA定序予以確認。
2. rHuEPO－Fc表現細胞株的建立
帶有二氫葉酸還原酶(dhFr)不全之中國倉鼠卵巢細胞(CHO/dhFr－ ,ATCC號碼CRL－9096)，其已經被FDA認可作為生物物質的生產，係被使用作為rHuEPO－Fc表現的宿主細胞。
CHO－dhFr－ 細胞係利用脂質體轉染試劑(LipoFectamine)(Gibco,目錄編號：18292－037,USA)而以重組型載體pCdEpo－Fc予以轉染。來自被選擇的純系的培養物之懸浮液係藉由ELISA(Roche,目錄編號：1－693417,加拿大)予以分析EPO的活性。陽性的純系係於增加的甲氨蝶呤(Methotrexate)(MTX)壓力下予以進一步地篩選。一種具有最高的rHuEPO－Fc蛋白表現之細胞株係被選擇為表現rHuEPO－Fc的CHO細胞株，以及逐漸地適應無血清的培養液(CD CHO培養液，Gibco，目錄編號：10743－029,USA)。此表現rHuEPO－Fc的CHO細胞株被使用於rHuEPOFc蛋白的生產。
3. rHuEPO－Fc蛋白的純化
rHuEPO－Fc蛋白分子，其等係被包含於自培養表現rHuEPO－Fc的CHO細胞收集的無血清的培養液之懸浮液內，係首先藉由蛋白A親和色譜法(Amersham,目錄編號：17－040201,加拿大)予以單離。經單離的蛋白係藉由於HiLoad 16/60 Superdex 200pg管柱(Amersham,目錄編號：17－1069－01,加拿大)之凝膠過濾予以進一步地純化。rHuEPO－Fc蛋白的純度係多於98%，當藉由電泳決定時。
4.純的rHuEPO－Fc蛋白的大小的決定
首先，SDS－PAGE被進行以決定純的rHuEPO－Fc蛋白的大小。如第3圖中所顯示的，於非還原條件，其測量在雙硫鍵的存在下之蛋白的全部的大小，之下的8%雙三羥甲基氨基甲烷(Bis－Tris)凝膠內見到一種具有大約180 kDa的分子量之單一的電泳帶。此指示多數的rHuEPO－Fc蛋白分子係以二聚體形式被生產，如融合蛋白的設計所預期的。當SDS－PAGE分析係於還原條件(100mM二硫蘇糖醇，DTI)下被實施以打斷雙硫鍵時，只有具有75Kda的分子量之電泳帶被辨識出，與HuEPO－樞紐區－CH2－CH3的單一多肽鏈之估計的分子量一致。
帶有糖化作用，其係藉由質譜(MALDI－TOF－MS)決定，之純的rHuEPO－Fc融合蛋白之準確的分子量是111099道爾頓(111.1 Kda)。於此分析中，只有一種單一的蛋白峰被觀察到，其指示經純化的rHuEPO－Fc蛋白是幾乎100%純的。純的rHuEPO－Fc蛋白的N端之15個胺基酸係藉由蛋白序列分析而決定為：APPRLICDSRVLERY。此與天然的人類EPO多肽之最前面的15個胺基酸的序列一致，以及確認經純化的rHuEPO－Fc蛋白不具有正確且完整的EPO分子序列，如由編碼rHuEPO－Fc融合蛋白的胺基酸序列之DNA序列所預測的一樣。
5. rHuEPO－Fc於正常小鼠內之提高的紅血球生成活性
小鼠體內之活體內實驗係被實施以確認rHuEPO－Fc蛋白之紅血球生成活性的保持，以及決定其之相較於rHuEPO和達比波廷－阿伐(α)的效力。為了比較的目的，被使用於本發明說明的動物實驗中之3種EPO：吾人的rHuEPO－Fc、rHuEPO(換言之，天然的人類EPO)以及達比波廷－阿伐(α)，的全部劑量是以克分子根據為基礎之EPO分子部分單獨的量。關於rHuEPO－Fc蛋白，EPO部分提供總rHuEPO－Fc的分子量的41.4%，當藉由EPO的胺基酸的重量於全部的rHuEPO－Fc分子的總胺基酸的重量中的比率予以計算時(在399個aa之中的166個aa)。rHuEPO－Fc之EPO的量接而被決定為rHuEPO－Fc蛋白的總量之41.4%。
rHuEPO－Fc(存貨濃度：0.5mg/ml，98.6%的純度)和天然的人類rHuEPO(換言之，具有天然的人類EPO結構)(6000 IU/0.5ml，由Kirin Brewery Co.，日本，所製造)係被稀釋於載體溶液(2.5mg/ml的人類血清白蛋白、5.8mg/ml的檸檬酸鈉、0.06mg/ml的檸檬酸和5.8mg/ml的氯化鈉，pH5.5－5.6)內。rHuEPO的劑量的量係依據其之活性/量之配給量來計算。BALB/c小鼠(6至8週大，稱重18－22g，等量的雄性與雌性，其等係購自於中國，AMMS，實驗動物中心)以6隻被隨機地分組於各組中。各組小鼠係以一個劑量(0.1,0.5,2.5,12.5,62.5 μg/kg)，一種注射途徑(經由尾靜脈之i.v.或者s.c.)以及一種注射時間表(每週3次或每週1次)的一種組合予以治療。小鼠的對照組係以等體積的載體溶液予以注射。該治療持續歷時3週以及總計的觀察時間是5週。供測量之周邊血液樣本(尾靜脈)係於治療之前、於每週的第4天和第7天歷時5週取得。Hb係藉由測量儀而被測量為指數。平均值±SD係由來自各組的數據予以計算以及t檢定(t test)係在不同組之中實施。
每週3次的EPO的投藥至小鼠，但有條件是該等EPO具有正常的紅血球生成活性，會誘導飽和的紅血球生成的刺激。如第4圖中所顯示的，以每週3次s.c.治療的2組具有顯著地Hb位準的提升，即使在2.5μg/kg的劑量。此實驗顯示出rHuEPO－Fc展現出一種像rHuEPO一樣有效的活體內的紅血球生成活性。於治療組中的Hb位準的提升是劑量依賴性的。然而，Hb位準飽和的提升係在12.5 μg/kg的rHuEPO－Fc之劑量於小鼠體內被誘導，反之相似的Hb位準飽和的提升只在62.5μg/kg的rHuEPO之劑量達到。由2.5μg/kg的rHuEPO－Fc誘導的Hb位準的提升亦大於由2.5 μg/kg的rHuEPO誘導的。此等結果暗示比起rHuEPO、藉由rHuEPOFc之更有效力的紅血球生成刺激。
rHuEPO－Fc的紅血球生成潛力進一步地藉由降低注射時間至每週1次皮下地方式予以探究。如第5圖中所顯示的，rHuEPO－Fc－治療組在12.5，或62.5μg/kg的劑量顯示出Hb位準之劑量依賴性的提升。12.5和62.5μg/kg的rHuEPO的劑量二者亦誘導Hb位準的提升至相似的程度，其係大大地低於由62.5μg/kg的rHuEPO－Fc誘導的。此強烈地指出rHuEPO－Fc具有活體內提高之紅血球生成活性。據推測係由於活體內rHuEPO－Fc之延長的半生期或藉由在rHuEPO－Fc蛋白內的二聚物EPO分子而被改良的EPO受體結合/活化，或者藉由二者之組合效力。
當相同劑量(12.5μg/kg)的rHuEPO－Fc或rHuEPO被靜脈內地投藥每週3次或每週1次時，Hb位準的提升係於全部的治療組中觀察到(第6圖)。然而，每週1次的rHuEPO－Fc之i.v.投藥誘導更大、更持續的Hb位準的提升，其在該治療結束之後持續較長久。此數據提供進一步地支持rHuEPO－Fc蛋白之提高的紅血球生成性質，與具有天然存在的EPO蛋白的結構之rHuEPO相比之下。
6.於5/6腎切除的大鼠體內之rHuEPO－Fc的提高的紅血球生成活性
於正常小鼠內之實驗證實活體內rHuEPO－Fc之提高的紅血球生成活性。為了進一步觀察rHuEPO－Fc刺激紅血球生成的效力，藥物動力學研究係被實施於藉由5/6腎切除術而造成的實驗性腎貧血之大鼠體內。rHuEPO－Fc的效力係與rHuEPO和達比波廷－阿伐(α)(60μg/ml，批號N079，由日本Kirin Brewery Co.所製造的)的效力相比較。
威斯達(Wistar)大鼠(等量的雄性與雌性，稱重160－180g，購自於Vitalriver Experiment Animal Inc.，北京，中國，執照號碼SCXK11－00－0008)係被使用於本發明中以創造由於藉由一種2個步驟的腎切除術之腎功能衰竭的貧血模式[27]。大鼠係以一般麻醉進行5/6腎切除術，其係於無菌狀態下、藉由2個獨立的手術完成。在2/3的左腎被切除之後，允許大鼠復原歷時20天。右腎接而小心地被切除。抗生素係在各手術之後被投藥以預防感染。總計最終腎臟組織的5/6被切除。腎切除的大鼠逐漸地發展腎功能不充分(dissufficiency)和貧血。該等大鼠在腎切除術50天之後進入安定的貧血狀態，以及接而被隨機地分組(9隻/組)以開始EPO的投藥。各組的大鼠係以一個劑量(2.5,12.5,62.5μg/kg)，一種注射途徑(經由尾靜脈之i.v.或s.c.)以及一種注射時間表(每週1次或每2週1次)的一種組合予以治療。對照組和模式組的大鼠係以等體積的載體溶液予以注射。治療持續歷時4週以及總計的觀察時間是6週。
被每週1次皮下投藥之rHuEPO－Fc的全部的劑量(2.5,12.5,62.5 μg/kg)係誘導Hb位準的劑量依賴性的提升，相較於沒有接受EPO治療之模式對照組。12.5和62.5μg/kg的rHuEPO 2者或者達比波廷，其等係被每週1次皮下地投藥，亦誘導Hb位準的提升。以12.5或62.5 μg/kg的rHuEPO－Fc治療的2組之Hb增加的位準係各別地比以12.5或62.5μg/kg的rHuEPO治療的顯著地更高。62.5 μg/kg的rHuEPO－Fc－治療組之Hb位準也比62.5μg/kg的達比波廷－治療組的Hb位準稍為地高。在停止治療之後，62.5μg/kg的rHuEPO－Fc－治療組之Hb位準的下降係緩慢的多以及該等Hb位準維持在比正常對照和模式對照組2組的Hb位準更高直到觀察的終了為止(在治療之後2週)，其指示一種更強的及/或一種延長的紅血球生成的刺激(總結於第7圖中)。
關於每2週1次的皮下注射治療，只有12.5或62.5μg/kg的3種EPO被投藥(第8圖)。12.5μg/kg的rHuEPO相較於模式對照組幾乎沒有增加的Hb位準，以及於62.5μg/kg的rHuEPO治療組的較弱的紅血球生成反應無法使Hb位準回到與正常對照組相比之正常位準。在12.5或62.5μg/kg的劑量之不論rHuEPO－Fc或是達比波廷的治療誘導Hb位準顯著的提升，其係更高於正常對照組的位準，指示藉由rHuEPO－Fc和達比波廷2者之有效的貧血狀態之修正。在效力方面的沒有顯著的差異在相同劑量的rHuEPO－Fc和達比波廷之間被觀察到。62.5μg/kg的高劑量導致紅血球生成的持續的增加直到觀察的終止(治療之後2週)。此進一步地暗示rHuEPO－Fc和達比波廷展現出活體內持久的刺激紅血球生成的性質，其依次能被轉換成臨床上對病人之投藥頻率的降低。
縱然達比波廷已經被認可為具有較少頻率的注射之臨床的應用以增加病人依從以及降低健康照顧提供者的工作負擔，此等實驗數據強烈地指出於本發明中揭示的rHuEPO－Fc具有至少相似的潛在好處如以上討論的，達比波廷，作為人類EPO分子之一種含有額外的糖化合物(增加的糖化作用)之突變的類似物，可能由於改變的三維結構而具有活體內誘導免疫發生(immunogenesis)之增加的風險。只有接受達比波廷治療的病人之長期觀察會對於達比波廷的免疫原性的風險提供一種決定性的答案。相對地，rHuEPO－Fc，沒有EPO分子部分的修飾，具有與天然的人類EPO完全相同的或者緊密地相似的一種碳水化合物含量。於本發明人之純的rHuEPO－Fc蛋白內之唾液酸的量是將近10.0 mmol/mmol EPO，與rHuEPO之報告的參數一致。rHuEPO－Fc的Fc部分，其不具有任何外來的胺基酸/連接肽，代表人類IgG1的一般結構，以及理論上將不導致一種免疫原性的反應。設若臨床上被認可，rHuEPO－Fc可以提供病人比現在可得的rHuEPO和EPO類似物之一種更好的選擇，尤其該等需要長期投藥的病人。
每2週1次靜脈內地注射1次，rHuEPO－Fc和達比波廷(62.5μg/kg)能夠誘導具有腎貧血的大鼠體內之Hb位準的完全相同的增加，遠在正常的對照大鼠之正常的Hb位準之上(第9圖)。此進一步顯示出由rHuEPO－Fc之紅血球生成的持續的刺激，如同達比波廷的效力已經在臨床上被證實一樣。
衍生自骨髓細胞，其等係收集自治療(每週1次或每2週，s.c.或i_v.)之後的5/6腎切除的大鼠體內，的細胞培養實驗之數據顯示出rHuEPO－Fc、rHuEPO以及達比波廷全部刺激CFU－E和BFU－E的形成。rHuEPO－Fc和達比波廷的潛力是相像的以及比rHuEPO的潛力更強(第10圖)。
於治療組和模式對照組中的血液尿素氮(BUN)和Crea的位準是相似的。於全部的治療組中的血清的Fe的位準是比模式對照組的更高。病理上的檢查觀察到於全部的EPO－治療的大鼠的骨髓和脾臟中之紅血球(RBC)相關的細胞的分佈之增加。
7.恆河猴體內之rHuEPO－Fc的藥物動力學研究
如以上討論的，本發明人已經以此方式設計rHuEPO－Fc，融合蛋白的EPO部分保持天然的EPO之功能性質，例如：刺激紅血球生成，以及人類IgG1的Fc片段允許融合蛋白於循環中安定的存在，從而延長其之活體內半生期。以上的動物研究已經顯示出rHuEPO－Fc的紅血球生成活性與rHuEPO相比是提高的。本發明人也已經實施藥物動力學研究以決定rHuEPO－Fc的活體內半生期，與rHuEPO的相比。靈長類動物係被使用以產生數據，因其等是生物學上非常相似於人類的。
研究設計係以文獻報告為基礎以及實驗係依據藥物動力學的一般指導方針予以實施。各組具有5隻猴(3－5kg，其等係購自於中國，AMMS，實驗動物中心)的2組恆河猴係各別地被靜脈內注射以5 μg/kg的rHuEPO－Fc或rHuEPO。血液樣本係在注射之前以及在注射後0.017,0.167,0.5,1,2,4,8,12,24,48,96,168,240 h取得。血清係藉由離心予以收集，以及血清的rHuEPO－Fc或rHuEPO位準係藉由利用紅血球生成素酵素連結免疫吸附分析分析(ELISA)套組(購自於R&D Systems,Minneapolis,MN)予以決定。靜脈內注射的rHuEPO－Fc和rHuEPO之平均的半生期(t1/2)各別地是35.24＋/－5.15h和8.72＋/－1.69 h(總結於第11圖中)。
為了觀察rHuEPO－Fc之生物可利用性，5 μg/kg的rHuEPO－Fc係被皮下地注射至5隻恆河猴。血液樣本係在注射之前以及在注射後1,2,5,8,10,12,15,24,48,72,96,168,240 h予以取得，以及rHuEPO－Fc的血清位準係藉由R&D套組予以決定。皮下注射之生物可利用性指數被計算為35.71＋/－5.37%。此與具有慢性腎衰竭的病人體內之達比波廷－阿伐(α)(AranespTM )的被報告的生物可利用性圖是完全相同的[9,15]。
此數據顯示出rHuEPO－Fc於靈長類動物體內具有一種顯著地延長的半生期，以及rHuEPO－Fc的活體內半生期是比由日本的Kirin Beer Brewing Co.所製造的rHuEPO的活體內半生期至少4倍更長。延長的半生期活體內很可能促成rHuEPO－Fc之提高的紅血球生成活性。
8.於長尾猴(Macaca fascicularis)體內之rHuEPO－Fc的免疫原性
如以上指示的，注意力被放在rHuEPO－Fc融合蛋白的設計以有意地避免或最小化rHuEPO－Fc融合蛋白的免疫原性的性質之變化。本發明人避免包括/加入任何外部的胺基酸或連接肽的序列於該融合蛋白內。第1B圖的實施例之發明的HuEPO－Fc融合蛋白只含有天然的EPO蛋白以及人類IgG1的Fc片段(樞紐區，CH2，CH3)的多肽序列，以及理論上不會誘導對抗rHuEPO－Fc蛋白之一種免疫原性的反應以及抗體的產生。如同本技藝中具有技術的一個人會明瞭的，具有任擇的結構之其他的實施例也被本發明所包含。
下列的靈長類動物研究係被實施以觀察rHuEPO－Fc蛋白的免疫原性。10隻食蟹獼猴(crab－eating macaque)(長尾猴(Macaca fascicularis))(雄性/雌性＝5/5，5歲大，雄性的平均重量4.0±0.3kg，雌性是2.9±0.4kg，購自於中國，AMMS，動物中心實驗室)係每週3次被皮下地注射5μg/kg的純化的rHuEPO－Fc歷時4週，以及2隻係以等體積的載體溶液予以注射作為對照動物。一週一次收集血清歷時5週(治療後1週)以及被測試對抗rHuEPO－Fc的專一性抗體，其係藉由利用經純化的rHuEPO－Fc(51μg/ml)作為塗覆抗原之ELISA。另外，周邊血液內的RBC計數和Hb位準也於實驗期間之內決定。
結果的數據顯示，儘管於rHuEPO－Fc－治療的獼猴內之經刺激的紅血球生成被觀察到(平均的RBC數目係自4.74x109 /ml增加至6.67x109 /ml以及平均的Hb位準係自12.2g/dl至13.7g/dl)，rHuEPO－Fc無法誘導可偵測的對抗該融合蛋白之專一性抗體。此等結果指出rHuEPO－Fc融合蛋白不造成靈長類動物體內的免疫原性。
9.於正常小鼠內之rHuEPO－Fc的急性毒性研究
為了評估rHuEPO－Fc融合蛋白的安全性，急性毒性研究係於動物體內實施。
2組的BALB/c小鼠(n＝20，等量的雄性與雌性，5－6週大，雌性的平均重量是15.8±0.4g，雄性是15.9±0.6g，購自於Chinese Academy of Medicine，中國)各別地經由其等之尾靜脈被靜脈內注射一次過量的純化的rHuEPO－Fc(雄性＝13.3mg/kg，雌性＝13.2mg/kg)或者等體積的載體溶液。在注射後除了觀察立即的反應之外，一般行為和狀態、活動、飲食和排便形態與變化被監測且被每天記錄歷時14天。全部的小鼠也在第7天和第14天稱重。在注射後第15天，小鼠之主要器官的解剖的檢查係被實施。設若器官之任何不尋常的變化或可疑的變化被觀察到時，病理學檢查會被實施。
2組中的全部的小鼠在注射後沒有任何立即的反應。於14天的期間內，沒有任何明顯的行為、活動、飲食和排便形態之變化被觀察到。並且，2組中小鼠的重量在測試的期間中是穩定地增加的，以及於注射後第7天或第14天，2組之間沒有任何明顯的差異。於腦、肺、心、肝和腎的組織內沒有偵測到任何不正常或病理的變化。此等結果指出過量的rHuEPO－Fc的投藥，遠多於需要用於展現正常紅血球生成功能的量，是安全的以及沒有任何明顯的毒性效力。
10.野生型和突變的EPO融合蛋白之比較
比較野生型和突變的形式之EPO蛋白的研究變化也被實施。如上所說明的，於本發明的一個實施例中包括在胺基酸殘基172之一種單一的胺基酸突變(C172G)。為了比較的目的，一種野生型融合蛋白也被製備以在殘基172具有一個半胱胺酸胺基酸(第12圖)。野生型融合蛋白係以如同以上的實施例1－3相同的方式予以製備。有關重組型質體的建構，下列的寡引子(QIAGEN Inc.,US)被使用(於EFL5w和EFL3w中改變的胺基酸被粗體化，與實施例1的引子相比)：EF5：5'－ccggaattcgccaccatgggggtgcacgaatgtcctgect－3'；EF3：5'－ttttccttttgcggccgcttatttacccggagacagggagag－3'；EFL5w：5'－aggcctgcaggacaggggacagagttgagcccaaatcttgtgaca－3'；EFL3w：5'－tgtcacaagatttgggctcaactctgtcccctgtcctgcaggect－3'。EFL5w和EFL3w的引子序列各別地被列於序列辨識編號：9－10中。
小鼠體內之活體內實驗係被實施以比較野生型融合蛋白(本文中被提及為rHuEPO－FcC)與突變的融合蛋白(換言之，如上說明的本發明的rHuEPO－Fc蛋白)以及與重組型人類EPO(rHuEPO)之紅血球生成活性。為了比較的目的，被使用於本實驗中之3種EPO，即rHuEPO－Fc、rHuEPO－FcC和rHuEPO，的全部劑量是以克分子根據為基礎之EPO分子部分單獨的量。關於rHuEPO－Fc和rHuEPO－FcC蛋白，EPO部分提供總分子量的41.4%，當藉由EPO的胺基酸的重量對於全部的rHuEPO－Fc和rHuEPO－FcC分子的總胺基酸的重量中的比率予以計算時(換言之，在399個aa之中的166個aa)。
rHuEPO－Fc(存貨濃度：300μg/ml)、rHuEPO－FcC(存貨濃度：90μg/ml)和具有天然的人類EPO結構之rHuEPO(6000 IU/0.5ml，由Kirin Brewery Co.，日本，所製造)係被稀釋於載體溶液(2.5mg/ml的人類血清白蛋白、5.8mg/ml的檸檬酸鈉、0.06mg/ml的檸檬酸和5.8mg/ml的氯化鈉，pH5.5－5.6)內。rHuEPO的劑量的量係依據其之活性/量之比率來計算。BALB/c小鼠(9至10週大，稱重18－22g，等量的雄性與雌性，購自於中國，AMMS，實驗動物中心)以8隻被隨機地分組於各組中。各組小鼠係以一個劑量(2.5,12.5,62.5 μg/kg)，一種注射途徑(s.c.)以及一種注射時間表(每週3次或每週1次)的一種組合予以治療。小鼠的對照組係以等體積的載體溶液予以注射。治療持續歷時26天。供測量之周邊血液樣本(尾靜脈)係於治療之前、於治療的第2、6、9、13、16、19、22和26天取得。Hb係藉由測量儀而被測量為指數。平均值±SD係由來自各組的數據予以計算以及t檢定係在不同組之中實施。
如第13圖中所顯示的，全部3種EPO蛋白以每週3次的間隔的投藥刺激紅血球生成。不論是2.5 μg/kg或12.5 μg/kg的劑量，rHuEPO－Fc誘導比rHuEPO更高的Hb位準的提升。Hb位準之最高的提升係由12.5 μg/kg劑量的rHuEPO－Fc達到。2.5 μg/kg和12.5 μg/kg劑量的rHuEPO－FcC均比等價劑量的rHuEPO和rHuEPO－Fc誘導微弱得多的紅血球生成，如藉由於rHuEPO－FcC－治療組中的Hb位準之顯著較低的提升所指出的。事實上，12.5 μg/kg的rHuEPO－FcC係誘導比2.5 μg/kg的rHuEPO更低的Hb位準提升。此等結果暗示rHuEPO－FcC具有活體內受損的紅血球生成活性，與具有天然的EPO分子序列之rHuEPO相比。相比之下，本發明的rHuEPO－Fc融合蛋白展現出更有效力的紅血球生成功能。3種EPO蛋白以每週3次的間隔的投藥大大地排除蛋白的半生期上的差異之影響。
rHuEPO－Fc和rHuEPO－FcC的紅血球生成潛力係藉由降低注射次數至皮下每週1次而予以進一步地評估。如第14圖中所顯示的，rHuEPO－Fc－治療組在12.5 μg/kg或62.5 μg/kg的劑量顯示出比rHuEPO－治療的個體更高的Hb位準的提升。相對地，rHuEPO－FcC係誘導比由rHuEPO所誘導的為更弱的Hb位準的提升。舉例而言，在多數的時間點，12.5μg/kg的rHuEPO係誘導比由62.5 μg/kg的rHuEPO－FcC所誘導的為更高的Hb位準的提升。此進一步指出藉由降低投藥次數以包括半生期的效力，rHuEPO－FcC展現出微弱得多的活體內紅血球生成功能，與具有天然的EPO分子序列之rHuEPO相比，以及與本發明的rHuEPO－Fc融合蛋白相比。
總之，此等結果顯示出rHuEPO－FcC，其係藉由人類EPO和人類Fc片段(樞紐，CH2和CH3)2者之天然的分子序列的融合形成的，展現出微弱得多的活體內紅血球生成功能，與具有天然的EPO分子序列之rHuEPO相比。特別地，rHuEPO－FcC融合蛋白的紅血球生成活性係低於1/5的天然的EPO分子的紅血球生成活性。此指出EPO分子和人類Fc片段的天然序列之間的融合削弱EPO分子的功能性質。藉由在Fc片段的樞紐區之第一個半胱胺酸殘基的單一的胺基酸取代，包含天然的EPO分子序列和突變的Fc片段之本發明的rHuEPO－Fc融合蛋白顯示出相較於天然的EPO分子為更有效力的活體內的紅血球生成功能。此數據暗示野生型Fc片段的樞紐區之第一個半胱胺酸殘基以某種方式干擾EPO分子，很可能藉由對EPO分子造成結構性的變化，以及依序削弱EPO分子於刺激紅血球生成的功能性質。
按照前述的揭示對於本技藝中具有技術的那些人將是明顯的，許多改變和修飾在本發明的實施上是可能的，而不背離其之精神與範疇。
圖式簡單說明
第1A圖是一個結構圖，其顯示本發明的重組型人類EPO－Fc融合蛋白(rHuEPO－Fc)的一般結構。
第1B圖是一個序列表，其顯示rHuEPO－Fc蛋白的核苷酸序列和演繹的胺基酸(aa)的序列。DNA的全長是1281bp。於演繹的蛋白序列中的426個胺基酸包括信息肽的27個aa以及完整的rHuEPO－Fc蛋白之399個aa。完整的rHuEPO－Fc蛋白係由人類EPO領域(166 aa)，人類IgG1的Fc片段之樞紐區(16aa，下面劃線的)，以及CH2和CH3領域(217 aa)構成。成熟的rHuEPO－Fc融合蛋白的多肽之計算的分子量是44.6kDa，由18.5kDa(41.4%)的EPO片段和26.1 kDa(58.6%)的IgG1 Fc片段組成。一種同源二聚物係藉由在樞紐區之內的2個半胱胺酸殘基(被框起的)之2個雙硫鍵予以形成。在成熟的融合蛋白之殘基172(換言之，樞紐區的第6個胺基酸)，天然的半胱胺酸殘基已經被甘胺酸(粗體)取代。
第2圖是一種顯示哺乳動物表現質體pCD1的結構和特徵之結構圖，該質體係被使用來插入編碼rHuEPO－Fc融合蛋白的多肽之DNA序列，以及用來轉染表現rHuEPO－Fc融合蛋白的CHO細胞。
第3圖是一種SDS－PAGE影像，其顯示藉由SDS－PAGE分析、於非還原狀態中的純的rHuEPO－Fc蛋白之二聚體形式以及於還原狀態中的純的rHuEPO－Fc蛋白之單體形式的大小。來自表現rHuEPO－Fc之經培養的CHO細胞株的懸浮液之純化的rHuEPO－Fc蛋白主要地存在為二聚體形式，以及於非還原狀態中的8%雙三羥甲基氨基甲烷凝膠上具有大約180 kDa的分子量。於還原狀態中(100mM二硫蘇糖醇，DTT)打破雙硫鍵，二聚體被分離成2個具有75 kDa的分子量之完全相同的單體單元。
第4A和4B圖是顯示以每週3次rHuEPO－Fc或rHuEPO的皮下注射(s.c.)治療的正常小鼠內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加的圖。各點代表該組(6隻小鼠)的Hb位準。第0天位準代表在治療之前的Hb位準。A：以rHuEPO－Fc治療的小鼠。B：以天然的rHuEPO治療的小鼠。
第5A和5B圖是顯示以每週1次的rHuEPOFc或rHuEPO s.c.治療之正常小鼠內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加的圖。各點代表該組(6隻小鼠)的平均Hb位準。第0天位準代表在治療之前的Hb位準。A：以rHuEPO－Fc治療的小鼠。B：以天然的rHuEPO治療的小鼠。
第6A和6B圖是顯示以12.5 μg/kg的rHuEPO－Fc或rHuEPO之靜脈內注射(i.v.)治療的正常小鼠內之血紅素(Hb)位準的增加的圖。各點代表該組(6隻小鼠)的平均Hb位準。第0天位準代表在治療之前的Hb位準。A：以一週一次治療的之小鼠。B：以一週3次治療的小鼠。
第7圖是一個顯示於以每週1次s.c.的rHuEPO－Fc、rHuEPO或達比波廷阿伐(縮寫的Darbe.)治療的5/6腎切除的大鼠體內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加的圖。各點代表該組的平均Hb位準。正常的對照是以載體溶液的注射之正常的大鼠。模式的對照是以載體溶液的注射之5/6腎切除的大鼠。第0週位準代表在治療之前的Hb位準。＊ ：在治療之後的週數。
第8圖是一個顯示以每2週1次s.c.的rHuEPO－Fc、rHuEPO或達比波廷阿伐(縮寫的Darbe.)治療的5/6腎切除的大鼠體內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加的圖。各點代表該組的平均Hb位準。正常的對照是以載體溶液的注射之正常的大鼠。模式的對照是以載體溶液的注射之5/6腎切除的大鼠。第0週位準代表在治療之前的Hb位準。＊ ：在治療之後的週數。
第9圖是一個顯示以每2週1次i.v.的62.5 μg/kg之rHuEPO－Fc，或達比波廷阿伐(縮寫的Darbe.)治療的5/6腎切除的大鼠體內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加的圖。各點代表該組的平均Hb位準。正常的對照是以載體溶液的注射之正常的大鼠。模式的對照是以載體溶液的注射之5/6腎切除的大鼠。第0週位準代表在治療之前的Hb位準。＊ ：在治療之後的週數。
第10A－10C圖顯示用於刺激以不同的劑量和時間表治療的5/6腎切除的大鼠體內之CFU－E和BFU－E的群落形成的rHuEPO－Fc、rHuEPO和達比波廷阿伐之潛力的比較。rHuEPO－Fc和達比波廷阿伐(縮寫的Darbe.)治療顯示出刺激CFU－E和BFU－E的群落形成之相似的劑量依賴性潛力，然而rHuEPO是較不有效力的。A，每週1次s.c.。B，每2週1次s.c.。C.，每2週1次i.v.。
第11圖是一個顯示在5μg/kg的rHuEPO－Fc或rHuEPO之靜脈內注射至恆河猴之後，rHuEPO－Fc和rHuEPO的血清位準的圖(5隻猴的平均位準)。
第12圖是一個序列表，其顯示一種野生型rHuEPO－FcC蛋白的核苷酸序列和演繹的胺基酸(aa)的序列。該序列特點係與第1圖中所顯示的相同，除了一種天然的、野生型的半胱胺酸殘基係存在於成熟的融合蛋白的殘基172(換言之，樞紐區的第6個胺基酸)之外。
第13圖是一個圖，其顯示以每週3次的rHuEPO－Fc(本發明的突變的融合蛋白)、rHuEPO－FcC(野生型融合蛋白)和rHuEPO之皮下注射(s.c.)治療的正常小鼠體內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加。各點代表該組(8)的平均Hb位準。正常的對照是以載體溶液的注射之正常的小鼠。第0天位準代表在治療之前的Hb位準。
第14圖是一個圖，其顯示以每週1次的rHuEPO－Fc、rHuEPO－FcC和rHuEPO之皮下注射(s.c.)治療的正常小鼠體內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加。各點代表該組(8)的平均Hb位準。正常的對照是以載體溶液的注射之正常的小鼠。第0天位準代表在治療之前的Hb位準。
參考資料
1. Cohen J,et al.Erythropoietin and its receptor：signaling and clinical manifestations.IMAJ 4.pp1072－1076(2002)
2. Blackwell K,et al.rHuEPO and improved treatment outcomes：potential modes of action.The Oncologist 9(suppl 5),pp41－47(2004).
3. Lappin TR,et al.EPO's alter ego：erythropoietion has multiple actions.stem Cells 20,pp485－492(2002).
4. Maiese K,et al.New avenues of exploration for erythropoietin.JAMA 293(1),pp90－95(2005).
5. Fisher JW.Erythropoietin：physiologic and pharmacologic aspects.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.216,pp358－369(1997).
6. Jelkmann W.Molecular biology of erythropoietin.Internal Med.43(8),pp649－659(2004).
7. Ng T,et al.Recombinant erythropoietin in clinical practice.Postgrad.Med.179,pp367－376(2005).
8. Weiss G,et al.Anemia of chronic disease.N.Engl.J.Med.352(10),pp10111023(2005).
9. Macdougall IC.An overview of the efficacy and safety of novel erythropoiesis stimulating protein(NESP).Nephrol.Dial.Transplant.16(suppl 3),pp 14－21(2001).
10. Joy MS.Darbepoetin－alfa：a novel erythropoiesis－stimulating protein.Ann.Pharmacother.36,pp1183－1192(2002).
11. Ellitt S,et al.Enhancement of therapeutic protein in vivo activities through glycoengineering.Nature Biotechnology 21,pp414－421(2003).
12. Elliott S,et al.Control of rHuEPO biological activity：the role of carbohydrate.Experimental Hematology 32,pp1146－1155(2004).
13. Egrie JC,et al.Darbepoetin－alfa has a longer circulating half－life and greater in vivo potency than recombinant human erythropoietin.Exp.Hematol.31,pp290－299(2003).
14. Egrie JC,et al.Development and characterization of novel erythropoiesis stimulating protein(NESP).British J.Caner.84(suppl 1),pp3－10(2001).
15. Macdougall IC,et al.Pharmacokinetics of novel erythropoiesis stimulating protein compared with epoetin alfa in dialysis patients.J.Am.Soc.Nephrol.50 10,pp2392－2395(1999).
16. Jolting K, et al.Population pharmacokinetic analysis of peglated human erythropoietin in rats.J.Pharm.Sci.93(12),pp3027－3038(2004)
17. Dalle B,et al.Dimeric erythropoietin fusion protein withe nhanced erythropoietic activity in vtro and in vivo.Blood 97(12),pp3776－3782(2001).
18. KochendoerFcr GG,et al.Design and chemical synthesis of a homogeneous polymer－modified erythropoiesis protein.Science 299 pp884－887(2003).
19. Sytkowski AS,et al.Human erythropoietin dimmers with markedly enhanced in vivo activity.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,pp1184－1188(1998).
20. Sytkowski AT,et al.An erythropoietin fusion protein comprised of identical repeating domains exhibits enhanced biological proterties.J.Biol.Chem.274(35),pp24773－24778(1999).
21. Jones TD,et al.The development of a modified human IFN－α2b linked to the Fc portion of human IgG1 as a novel potential therapeutic for the treatment of hepatitis C virus infection.J.Interferon.Cytokine.Res.24,pp560－572(2004).
22.Lo KM,et al.High level expression and secretion of Fc－X fusion proteins in mammalian cells.Protein engineering 11(6),pp495－500(1998).
23. Mohler KM,et al.Soluble tumor necrosis factor(TNF)receptors are efFcctive therapeutic agents in lethal endotoxemia and function simultaneously as both TNF carriers and TNF antabonists.J.Immunol.151(3),pp1548－1561(1993).
24. Way JC,et al.Improvement of Fc－erythropoietin structure and pharmacokinetics by modification at a disulfide bond.Protein Engineering,Design & Selection 18(3),pp 111－118(2005).
25. Goldenberg MM.Etanercept,a novel drug for the treatment of patients with severe,active rheumatoid arthritis.Clin_ Ther.21(1),pp75－87(1999)
26. Wong VK,et al.The use of alefacept in the treatment of psoriasis.Skin Therapy Lett.8(6),pp1－2(2003)
27. Chanutin A,et al.Experimental renal insufficiency produced by partial 40 nephrectomy.Arch.Intern.Med.49,pp767－787(1932).
<110> 諾華健控股公司
<120> 在活體中具有延長之半生期以及提高之紅血球生成活性的重組人類 EPO-FC融合蛋白
<130> N240 0002
<150> US 11/340,661
<151> 2006-01-27
<160> 10
<170> PatentIn版本3.3
<210> 1
<211> 1200
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> 編碼rHuEPO-Fc融合蛋白之DNA
<400> 1
<210> 2
<211> 399
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> rHuEPo-Fc融合蛋白之胺基酸序列
<400> 2
<210> 3
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> 編碼具有27個胺基酸信息肽的rHuEPO-Fc融合蛋白之DNA
<400> 3
<210> 4
<211> 426
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 具有27個胺基酸信息肽的rHuEPO-Fc融合蛋白之胺基酸序列
<400> 4
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 5
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 6
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 7
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 8
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 9
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 10
第1A圖是一個結構圖，其顯示本發明的重組型人類EPO-Fc融合蛋白(rHuEPO-Fc)的一般結構。
第1B圖是一個序列表，其顯示rHuEPO-Fc蛋白的核苷酸序列和演繹的胺基酸(aa)的序列。DNA的全長是1281bp。於演繹的蛋白序列中的426個胺基酸包括信息肽的27個aa以及完整的rHuEPO-Fc蛋白之399個aa。完整的rHuEPO-Fc蛋白係由人類EPO領域(166aa)，人類IgG1的Fc片段之樞紐區(16aa，下面劃線的)，以及CH2和CH3領域(217aa)構成。成熟的rHuEPO-Fc融合蛋白的多肽之計算的分子量是44.6kDa，由18.5kDa(41.4%)的EPO片段和26.1kDa(58.6%)的IgG1 Fc片段組成。一種同源二聚物係藉由在樞紐區之內的2個半胱胺酸殘基(被框起的)之2個雙硫鍵予以形成。在成熟的融合蛋白之殘基172(換言之，樞紐區的第6個胺基酸)，天然的半胱胺酸殘基已經被甘胺酸(粗體)取代。
第2圖是一種顯示哺乳動物表現質體pCD1的結構和特徵之結構圖，該質體係被使用來插入編碼rHuEPO-Fc融合蛋白的多肽之DNA序列，以及用來轉染表現rHuEPO-Fc融合蛋白的CHO細胞。
第3圖是一種SDS-PAGE影像，其顯示藉由SDS-PAGE分析、於非還原狀態中的純的rHuEPO-Fc蛋白之二聚體形式以及於還原狀態中的純的rHuEPO-Fc蛋白之單體形式的大小。來自表現rHuEPO-Fc之經培養的CHO細胞株的懸浮液之純化的rHuEPO-Fc蛋白主要地存在為二聚體形式，以及於 非還原狀態中的8%雙三羥甲基氨基甲烷凝膠上具有大約180kDa的分子量。於還原狀態中(100mM二硫蘇糖醇，DTT)打破雙硫鍵，二聚體被分離成2個具有75kDa的分子量之完全相同的單體單元。
第4A和4B圖是顯示以每週3次rHuEPO-Fc或rHuEPO的皮下注射(s.c.)治療的正常小鼠內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加的圖。各點代表該組(6隻小鼠)的Hb位準。第0天位準代表在治療之前的Hb位準。A：以rHuEPO-Fc治療的小鼠。B：以天然的rHuEPO治療的小鼠。
第5A和5B圖是顯示以每週1次的rHuEPOFc或rHuEPO s.c.治療之正常小鼠內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加的圖。各點代表該組(6隻小鼠)的平均Hb位準。第0天位準代表在治療之前的Hb位準。A：以rHuEPO-Fc治療的小鼠。B：以天然的rHuEPO治療的小鼠。
第6A和6B圖是顯示以12.5μg/kg的rHuEPO-Fc或rHuEPO之靜脈內注射(i.v.)治療的正常小鼠內之血紅素(Hb)位準的增加的圖。各點代表該組(6隻小鼠)的平均Hb位準。第0天位準代表在治療之前的Hb位準。A：以一週一次治療的之小鼠。B：以一週3次治療的小鼠。
第7圖是一個顯示於以每週1次s.c.的rHuEPO-Fc、rHuEPO或達比波廷阿伐(縮寫的Darbe.)治療的5/6腎切除的大鼠體內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加的圖。各點代表該組的平均Hb位準。正常的對照是以載體溶液的注射之正常的大鼠。模式的對照是以載體溶液的注射之5/6腎 切除的大鼠。第0週位準代表在治療之前的Hb位準。*：在治療之後的週數。
第8圖是一個顯示以每2週1次s.c.的rHuEPO-Fc、rHuEPO或達比波廷阿伐(縮寫的Darbe.)治療的5/6腎切除的大鼠體內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加的圖。各點代表該組的平均Hb位準。正常的對照是以載體溶液的注射之正常的大鼠。模式的對照是以載體溶液的注射之5/6腎切除的大鼠。第0週位準代表在治療之前的Hb位準。*：在治療之後的週數。
第9圖是一個顯示以每2週1次i.v.的62.5μg/kg之rHuEPO-Fc，或達比波廷阿伐(縮寫的Darbe.)治療的5/6腎切除的大鼠體內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加的圖。各點代表該組的平均Hb位準。正常的對照是以載體溶液的注射之正常的大鼠。模式的對照是以載體溶液的注射之5/6腎切除的大鼠。第0週位準代表在治療之前的Hb位準。*：在治療之後的週數。
第10A-10C圖顯示用於刺激以不同的劑量和時間表治療的5/6腎切除的大鼠體內之CFU-E和BFU-E的群落形成的rHuEPO-Fc、rHuEPO和達比波廷阿伐之潛力的比較。rHuEPO-Fc和達比波廷阿伐(縮寫的Darbe.)治療顯示出刺激CFU-E和BFU-E的群落形成之相似的劑量依賴性潛力，然而rHuEPO是較不有效力的。A，每週1次s.c.。B，每2週1次s.c.。C.，每2週1次i.v.。
第11圖是一個顯示在5μg/kg的rHuEPO-Fc或rHuEPO之 靜脈內注射至恆河猴之後，rHuEPO-Fc和rHuEPO的血清位準的圖(5隻猴的平均位準)。
第12圖是一個序列表，其顯示一種野生型rHuEPO-FcC蛋白的核苷酸序列和演繹的胺基酸(aa)的序列。該序列特點係與第1圖中所顯示的相同，除了一種天然的、野生型的半胱胺酸殘基係存在於成熟的融合蛋白的殘基172(換言之，樞紐區的第6個胺基酸)之外。
第13圖是一個圖，其顯示以每週3次的rHuEPO-Fc(本發明的突變的融合蛋白)、rHuEPO FcC(野生型融合蛋白)和rHuEPO之皮下注射(s.c.)治療的正常小鼠體內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加。各點代表該組(8)的平均Hb位準。正常的對照是以載體溶液的注射之正常的小鼠。第0天位準代表在治療之前的Hb位準。
第14圖是一個圖，其顯示以每週1次的rHuEPO-Fc、rHuEPO-FcC和rHuEPO之皮下注射(s.c.)治療的正常小鼠體內之血紅素(Hb)位準的劑量依賴性的增加。各點代表該組(8)的平均Hb位準。正常的對照是以載體溶液的注射之正常的小鼠。第0天位準代表在治療之前的Hb位準。

Claims (53)

  1. 一種與天然存在的或重組型天然的人類紅血球生成素相比具有活體內延長的半生期之融合蛋白，其包含：(a)一天然存在的人類紅血球生成素分子；及(b)一包含樞紐區之人類IgG Fc片段，其中該Fc片段之N端係耦合到該紅血球生成素分子的C端且之間不存在一胜肽連接子，且其中該樞紐區包含一突變，該突變係在對應序列辨識編號：2的第172個胺基酸殘基位置，藉此該樞紐區位於最靠近該N端的半胱胺酸殘基係以非半胱胺酸殘基取代，其中該融合蛋白具有序列辨識編號：2之胺基酸序列或者一與其具有98%序列同一性且包括該突變之序列。
  2. 如申請專利範圍第1項之融合蛋白，其中該蛋白包含序列辨識編號：2之胺基酸序列。
  3. 如申請專利範圍第1項之融合蛋白，其中該人類紅血球生成素分子具有一接近其C端的半胱胺酸分子，且其中位於最接近該N端的該樞紐區第一半胱胺酸殘基係與該紅血球生成素分子的該半胱胺酸殘基相距至少12個胺基酸。
  4. 如申請專利範圍第3項之融合蛋白，其中位於最接近該N端的該樞紐區第一半胱胺酸殘基係與該紅血球生成素分子的該半胱胺酸殘基相距至少17個胺基酸。
  5. 如申請專利範圍第1項之融合蛋白，其中該蛋白的半生期是比該天然的人類紅血球生成素更高至少3倍。
  6. 如申請專利範圍第5項之融合蛋白，其中該蛋白的半生期是比該天然的人類紅血球生成素更高至少4倍。
  7. 如申請專利範圍第5項之融合蛋白，其中該融合蛋白與該天然的人類紅血球生成素相比具有提高的紅血球生成生物活性。
  8. 如申請專利範圍第1項之融合蛋白，其中該Fc片段是一種IgG1片段。
  9. 如申請專利範圍第8項之融合蛋白，其中該Fc片段包含該樞紐區以及CH2和CH3領域。
  10. 如申請專利範圍第9項之融合蛋白，其中該樞紐區在長度上是至少9個胺基酸。
  11. 一種多聚體的蛋白建構物，其包含複數個如申請專利範圍第1項之融合蛋白。
  12. 如申請專利範圍第11項之多聚體的蛋白建構物，其中該建構物是一種二聚物。
  13. 一種包含複數個多肽的多聚體的蛋白，該等多肽各具有序列辨識編號：2的胺基酸序列或者一與其具有98%序列同一性之序列，該等多肽於對應序列辨識編號：2的第172個胺基酸殘基位置各具有一突變，藉此一半胱胺酸胺基酸係以一非半胱胺酸胺基酸取代。
  14. 如申請專利範圍第13項之蛋白，其中該蛋白是一種二聚物。
  15. 如申請專利範圍第14項之蛋白，其中該二聚物包含介於該等多肽的樞紐領域之間的雙硫鍵。
  16. 如申請專利範圍第13項之蛋白，其中該等多肽的各個具有大約75kDa的分子量。
  17. 如申請專利範圍第14項之蛋白，其中該二聚物具有大約180kDa的分子量。
  18. 一種藥學組成物，其包含一種如申請專利範圍第1項之融合蛋白連同一種藥學上可接受的載體、佐劑或稀釋劑。
  19. 一種核酸序列，其編碼一種與序列辨識編號：2具有至少90%的胺基酸序列同一性之多肽，其中該多肽在對應於序列辨識編號：2的第172個胺基酸殘基之位置具有一突變，藉此一半胱胺酸胺基酸係以一非半胱胺酸胺基酸取代，且其中該多肽與天然的人類紅血球生成素相比具有活體內延長的半生期。
  20. 一種重組型DNA分子，其包含序列辨識編號：1之核酸序列或者一與其具有98%序列同一性之序列，其中該序列編碼一多肽，該多肽在對應於序列辨識編號：2的第172個胺基酸殘基之位置具有一突變，藉此一半胱胺酸胺基酸係以一非半胱胺酸胺基酸取代。
  21. 一種細胞株，其係以如申請專利範圍第20項之重組型DNA分子予以轉染。
  22. 如申請專利範圍第21項之細胞株，其中該細胞株是CHO細胞株。
  23. 一種生產如申請專利範圍第1項之融合蛋白的方法，其包含培養一種以如申請專利範圍第20項之DNA分子轉 染的細胞株以生產該DNA分子所編碼之多肽，以及純化該多肽。
  24. 一種如申請專利範圍第1項之融合蛋白於製備一藥物之用途，該藥物係用於刺激哺乳動物體內的紅血球生成。
  25. 如申請專利範圍第24項之用途，其中該哺乳動物是靈長類動物。
  26. 如申請專利範圍第25項之用途，其中該靈長類動物是人類。
  27. 如申請專利範圍第24項之用途，其中於該哺乳動物體內之該蛋白的半生期是比天然的人類EPO更高至少3倍，當被靜脈內或皮下地投藥時。
  28. 如申請專利範圍第27項之用途，其中於該哺乳動物體內之該蛋白的半生期是比天然的人類EPO更高至少4倍，當被靜脈內或皮下地投藥時。
  29. 一種重組型融合蛋白，其包含：(a)一種紅血球生成素肽部分，其具有一鄰近其之C端的半胱胺酸殘基；以及(b)一種包含一樞紐區及CH2和CH3領域之人類IgG Fc片段，其中該樞紐區具有胺基酸序列VEPKSGDKTSTCPPCP，或者具有與其至少90%的序列同一性之序列且在自該Fc片段的N端測量起的第6個胺基酸之處具有一非半胱胺酸殘基，其中座落於最接近該紅血球生成素肽部分之該樞紐區的半胱胺酸殘基與該紅血球生成素肽部分的半胱胺酸殘基相距至少12個胺 基酸。
  30. 如申請專利範圍第29項之融合蛋白，其中該紅血球生成素肽部分是一完整的人類紅血球生成素分子。
  31. 如申請專利範圍第29項之融合蛋白，其中該IgG Fc片段是一種IgG1片段。
  32. 如申請專利範圍第29項之融合蛋白，其中該免疫球蛋白肽部分係被直接地耦合至該紅血球生成素肽部分。
  33. 如申請專利範圍第29項之融合蛋白，其中該樞紐區在長度上是至少9個胺基酸。
  34. 如申請專利範圍第29項之融合蛋白，其中該非半胱胺酸殘基是一個中性胺基酸。
  35. 如申請專利範圍第34項之融合蛋白，其中該非半胱胺酸殘基是甘胺酸。
  36. 如申請專利範圍第29項之融合蛋白，其中該蛋白的半生期，當被投藥至哺乳動物體內時，係比藉由相同的手段投藥至該哺乳動物體內的天然的人類紅血球生成素的半生期更高至少3倍。
  37. 如申請專利範圍第36項之融合蛋白，其中該蛋白的半生期，當被投藥至哺乳動物體內時，係比藉由相同的手段投藥至該哺乳動物體內的天然的人類紅血球生成素的半生期更高至少4倍。
  38. 如申請專利範圍第36項之融合蛋白，其中該哺乳動物是人類。
  39. 一種二聚物，其包含各如申請專利範圍第29項之第一與 第二融合蛋白，其中該第一融合蛋白的該樞紐區係藉由雙硫鍵而被結合至該第二融合蛋白的該樞紐區。
  40. 一種多聚體的蛋白建構物，其包含複數個各如申請專利範圍第29項之經連接的融合蛋白。
  41. 一種重組型DNA分子，其包含序列辨識編號：1之核酸序列。
  42. 一種二聚物，其包含各具有序列辨識編號：2之胺基酸序列之一對多肽。
  43. 一種與天然存在的或重組型天然的人類紅血球生成素相比具有活體內延長的半生期之融合蛋白，其包含：(a)一紅血球生成素肽部分；及(b)一免疫球蛋白肽部分，其連接至該紅血球生成素肽部分，且包含一具有非天然存在的胺基酸序列之樞紐區，其中該樞紐區包含一突變，該突變係在對應於序列辨識編號：2的第172個胺基酸殘基之位置，藉此位於最靠近該樞紐區N端的半胱胺酸殘基係以非半胱胺酸殘基取代，其中該融合蛋白具有序列辨識編號：2之胺基酸序列或者一與其具有98%序列同一性且包括該突變之序列。
  44. 如申請專利範圍第43項之融合蛋白，其中該蛋白包含序列辨識編號：2中所示的序列。
  45. 一種藥學組成物，其包含如申請專利範圍第29項之融合蛋白連同一藥學上可接受的載體、佐劑或稀釋劑。
  46. 一種藥學組成物，其包含如申請專利範圍第43項之融合 蛋白連同一藥學上可接受的載體、佐劑或稀釋劑。
  47. 一種與天然存在的或重組型天然的人類紅血球生成素相比具有活體內延長的半生期之融合蛋白，其包含：(a)一紅血球生成素肽部分；及(b)一人類免疫球蛋白肽分子的片段，其N端係連接至該紅血球生成素肽部分的C端，該片段包含一具有一突變之樞紐區，該突變係在對應於序列辨識編號：2的第172個胺基酸殘基之位置，藉此位於該樞紐區中最靠近N端的半胱胺酸胺基酸係以非半胱胺酸胺基酸取代，其中該融合蛋白具有序列辨識編號：2之序列或者一與其具有98%序列同一性且包括該突變之序列。
  48. 如申請專利範圍第47項之融合蛋白，其中該紅血球生成素肽部分係一天然存在的人類紅血球生成素分子。
  49. 一種藥學組成物，其包含如申請專利範圍第47項之融合蛋白連同一藥學上可接受的載體、佐劑或稀釋劑。
  50. 一種與天然存在的或重組型天然的人類紅血球生成素相比具有活體內延長的半生期之融合蛋白，其包含：(a)一種天然存在的人類紅血球生成素分子，其具有一最接近其C端的半胱胺酸殘基；以及(b)一包含一樞紐區的人類IgG Fc片段，其中該Fc片段的N端係連接至該紅血球生成素分子的C端，且其中該Fc片段具有一突變在該樞紐區中對應於序列辨識編號：2的第172個胺基酸殘基之位置，該突變係以非半胱胺酸殘基取代半胱胺酸殘基，藉此該樞紐區中最靠近該N端 之第一個半胱胺酸殘基與該紅血球生成素分子的半胱胺酸殘基相距至少17個胺基酸，其中該融合蛋白具有序列辨識編號：2之序列或者一與其具有98%序列同一性且包括該突變之序列。
  51. 一種包含二個多肽之二聚物蛋白，該二個多肽各包含如序列辨識編號：2的胺基酸序列或一具有與序列辨識編號：2至少98%相同性的胺基酸序列，該蛋白包含一連接至一包含一樞紐區之Fc片段之紅血球生成素分子，該樞紐區具有一突變於對應於序列辨識編號：2的第172個胺基酸殘基之位置，藉此該樞紐區中最靠近其N端之第一個半胱胺酸胺基基係以非半胱胺酸胺基酸取代。
  52. 一種與天然存在的或重組型天然的人類紅血球生成素相比具有活體內延長的半生期之融合蛋白，其包含：(a)一紅血球生成素肽部分；及(b)一人類免疫球蛋白分子的片段，其包含如序列辨識編號：2所載述的第167至399個殘基之胺基酸序列，其中該人類免疫球蛋白分子的片段之N端係連接至該紅血球生成素肽部分的C端，其中該片段包含一具有突變之樞紐區，該突變係位在對應於序列辨識編號：2的第172個胺基酸殘基之位置，藉此該樞紐區中最靠近其N端之第一個半胱胺酸胺基酸係以非半胱胺酸胺基酸取代，其中該融合蛋白具有序列辨識編號：2之胺基酸序列或者一與其具有98%序列同一性且包括該突變之序列。
  53. 如申請專利範圍第52項之融合蛋白，其中該紅血球生成 素肽部分係一天然存在的人類紅血球生成素分子。
TW096126612A 2006-01-27 2007-07-20 在活體中具有延長之半生期以及提高之紅血球生成活性的重組人類紅血球生成素（ｅｐｏ)-ｆｃ融合蛋白 TWI454482B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/340,661 US7625564B2 (en) 2006-01-27 2006-01-27 Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW200904829A TW200904829A (en) 2009-02-01
TWI454482B true TWI454482B (zh) 2014-10-01

Family

ID=38308802

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW096126612A TWI454482B (zh) 2006-01-27 2007-07-20 在活體中具有延長之半生期以及提高之紅血球生成活性的重組人類紅血球生成素（ｅｐｏ)-ｆｃ融合蛋白

Country Status (21)

Country Link
US (8) US7625564B2 (zh)
EP (2) EP2450373B1 (zh)
JP (3) JP5222153B2 (zh)
KR (2) KR20120014936A (zh)
CN (3) CN101321870B (zh)
AU (1) AU2007209722B2 (zh)
BR (1) BRPI0706742C1 (zh)
CA (1) CA2650072C (zh)
DK (2) DK2450373T3 (zh)
ES (2) ES2539759T3 (zh)
HK (2) HK1125673A1 (zh)
IL (1) IL192801A (zh)
MX (1) MX2008009322A (zh)
NZ (1) NZ569702A (zh)
PL (2) PL2450373T3 (zh)
PT (2) PT2450373E (zh)
RU (1) RU2433181C2 (zh)
SG (2) SG10201404308RA (zh)
TW (1) TWI454482B (zh)
WO (1) WO2007085084A1 (zh)
ZA (1) ZA200805920B (zh)

Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2887039T3 (es) 2004-04-21 2021-12-21 Alexion Pharma Inc Conjugados para administración ósea y procedimiento de uso de estos para dirigir proteínas al hueso
US20070081984A1 (en) 2005-10-11 2007-04-12 Shunji Tomatsu Compositions and methods for treating hypophosphatasia
US7625564B2 (en) * 2006-01-27 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
JP4356902B2 (ja) * 2006-12-28 2009-11-04 信広 益子 歯ブラシ
BRPI0814465B1 (pt) 2007-07-26 2021-11-23 Novagen Holding Corporation Proteína de fusão, dímero, método para produzir uma proteína de fusão, linhagem de célula, usos de uma proteína de fusão e de uma composição farmacêutica e composição farmacêutica
US8940501B2 (en) 2009-01-30 2015-01-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof
MX2011008936A (es) * 2009-02-24 2011-09-21 Alexion Pharma Inc Anticuerpos que contienen peptidos terapeuticos mimeticos de tpo/epo.
US20110016548A1 (en) * 2009-07-16 2011-01-20 University Of Southern California Control of endogenous dnmt1 gene expression by exogenous binary regulatory systems
SG185079A1 (en) 2010-04-30 2012-12-28 Alexion Pharma Internat Sarl Methods, compositions, and kits for the treatment of matrix mineralization disorders
CN102260343A (zh) 2010-05-25 2011-11-30 健能隆医药技术（上海）有限公司 重组人g-csf二聚体在治疗神经损伤疾病中的用途
CA2823066A1 (en) 2010-12-27 2012-07-05 Alexion Pharma International Sarl Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
WO2013003641A2 (en) 2011-06-28 2013-01-03 Inhibrx Llc Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
US10400029B2 (en) 2011-06-28 2019-09-03 Inhibrx, Lp Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
AU2012289433B2 (en) 2011-07-25 2017-07-27 Evive Biotechnology (Shanghai) Ltd Use of G-CSF dimer in preparation of medicament for treatment of neurodegenerative diseases
EP2561888A1 (en) * 2011-08-23 2013-02-27 Deutsches Krebsforschungszentrum Protein comprising NC-1 for treating angiogenesis-related diseases
WO2013027191A1 (en) * 2011-08-25 2013-02-28 Novartis Ag Methods and compositions using fgf23 fusion polypeptides
KR101183615B1 (ko) * 2011-12-28 2012-09-17 재단법인 경기과학기술진흥원 Ｗｎｔ에 결합하는 신규한 재조합 단백질
US9488664B2 (en) 2012-01-25 2016-11-08 Sbi Pharmaceuticals Co., Ltd. Diagnostic agent for tumor
US10052366B2 (en) 2012-05-21 2018-08-21 Alexion Pharmaceuticsl, Inc. Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof
SG11201500682WA (en) * 2012-09-07 2015-02-27 Sanofi Sa Fusion proteins for treating a metabolic syndrome
WO2014093387A1 (en) * 2012-12-10 2014-06-19 Kindred Biosciences, Inc. Vegf receptor fusion proteins for veterinary use
AR096890A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugando fc de inmunoglobulina, que mantiene la afinidad de unión del fragmento fc de la inmunoglobulina a fcrn
AR096891A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
RU2563175C1 (ru) * 2014-06-03 2015-09-20 государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Тюменская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО ТюмГМА Минздрава России) Способ стимуляции эритропоэза в предоперационном периоде
US10822596B2 (en) 2014-07-11 2020-11-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating craniosynostosis
EP3194429A4 (en) * 2014-09-18 2018-06-13 Askgene Pharma, Inc. Novel feline erythropoietin receptor agonists
WO2016090251A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treating seizure with recombinant alkaline phosphatase
CN114159552A (zh) * 2015-01-09 2022-03-11 格纳西尼有限公司 使用长效epo配制物治疗贫血的方法
EP3250227A2 (en) 2015-01-28 2017-12-06 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating a subject with an alkaline phosphatase deficiency
WO2016178087A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Biosourcing Sa Transgenic production of chorionic gonadotropin
US20180139938A1 (en) 2015-05-04 2018-05-24 Laboratoire Français du Fractionnement et des, Biotechnologies Transgenic production of fc fusion proteins
MX2018002121A (es) 2015-08-17 2018-06-18 Alexion Pharma Inc Elaboracion de fosfatasas alcalinas.
US11229686B2 (en) 2015-09-28 2022-01-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Reduced frequency dosage regimens for tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP)-enzyme replacement therapy of hypophosphatasia
CN105111315B (zh) * 2015-09-29 2018-05-22 海南医学院 MIP3α-Fc融合蛋白及其用途
KR101847169B1 (ko) * 2015-10-07 2018-04-09 주식회사 녹십자 지속형 에리트로포이에틴 함유 조성물
JP2018533571A (ja) 2015-10-30 2018-11-15 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 患者の頭蓋縫合早期癒合症を治療するための方法
US20190382439A1 (en) * 2015-11-16 2019-12-19 Ubiprotein, Corp. Method for extending half-life of a protein
EP3426286A4 (en) 2016-03-08 2019-12-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. METHODS OF TREATING HYPOPHOSPHATASE IN CHILDREN
EP3436020A4 (en) 2016-04-01 2019-12-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. METHOD FOR TREATING HYPOPHOSPHATASIE IN TEENS AND ADULTS
JP2019513711A (ja) 2016-04-01 2019-05-30 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド アルカリホスファターゼによって筋力低下を治療すること
US10988744B2 (en) 2016-06-06 2021-04-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of producing alkaline phosphatase
US11116821B2 (en) 2016-08-18 2021-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating tracheobronchomalacia
JP2019536823A (ja) * 2016-12-05 2019-12-19 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 免疫反応が弱化された結合体
EP3600383A4 (en) 2017-03-31 2020-10-28 Alexion Pharmaceuticals, Inc. METHODS FOR TREATMENT OF HYPOPHOSPHATASIA (HPP) IN ADULTS AND ADOLESCENTS
WO2018203582A1 (ko) * 2017-05-05 2018-11-08 주식회사 유비프로틴 단백질 반감기를 증가시키는 방법
CN110078817B (zh) * 2018-01-26 2021-02-19 重庆精准生物技术有限公司 一种改良的铰链区及其在构建car骨架中的应用
WO2019190752A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing of glycoproteins
WO2020053661A1 (en) 2018-09-13 2020-03-19 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Methods of purifying antibodies from the milk of transgenic non-human mammals comprising the use of chitosan
RU2696864C1 (ru) * 2018-09-24 2019-08-07 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") Способ профилактики нарушений микроциркуляции в почках асиалированным эритропоэтином в эксперименте
RU2678768C1 (ru) * 2018-09-25 2019-02-01 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") Способ профилактики ишемически-реперфузионных повреждений почек карбамилированным дарбэпоэтином в эксперименте
CN113493519B (zh) * 2020-03-19 2022-12-27 浙江道尔生物科技有限公司 一种半衰期显著延长的治疗眼部血管新生疾病的融合蛋白
EP4166574A1 (en) * 2020-06-10 2023-04-19 Bica Therapeutics Inc. Fusion protein containing erythropoietin polypeptide
US20230265407A1 (en) * 2020-07-02 2023-08-24 Northwestern University Human recombinant ace2-fc mutants that decouple anti-sars-cov-2 activity from cardiovascular effects
CN111704676A (zh) * 2020-07-17 2020-09-25 上海延立药业有限公司 一种长效重组促红细胞生成素及其制备方法和应用
WO2022080912A1 (ko) * 2020-10-16 2022-04-21 주식회사 아이엠바이오로직스 IgM 영역을 이용한 융합단백질 플랫폼

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999002709A1 (en) * 1997-07-10 1999-01-21 Beth Israel Deaconess Medical Center Recombinant erythropoietin / immunoglobulin fusion proteins
TW200510457A (en) * 2003-05-06 2005-03-16 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
CN1671863A (zh) * 2002-03-15 2005-09-21 布赖汉姆妇女医院 适合治疗剂全身性递送的中央气道给药

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
ES2120949T4 (es) * 1990-06-28 2011-12-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh 50% Proteinas de fusión con porciones de inmunoglobulinas, su preparación y empleo.
US7253264B1 (en) 1990-06-28 2007-08-07 Sanofi-Arentideutschland GmbH Immunoglobulin fusion proteins, their production and use
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
ITFI940106A1 (it) 1994-05-27 1995-11-27 Menarini Ricerche Sud Spa Molecola ibrida di formula gm-csf-l-epo o epo-l-gm-csf per la stimolaz ione eritropoietica
CA2205572A1 (en) 1994-12-12 1996-06-20 Beth Israel Hospital Association Chimeric cytokines and uses thereof
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US7696338B2 (en) 1995-10-30 2010-04-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Immunotoxin fusion proteins and means for expression thereof
US6936439B2 (en) 1995-11-22 2005-08-30 Amgen Inc. OB fusion protein compositions and methods
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6165476A (en) 1997-07-10 2000-12-26 Beth Israel Deaconess Medical Center Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker
AU751823B2 (en) 1998-05-14 2002-08-29 Merck Patent Gmbh Fused protein
US20050181482A1 (en) 2004-02-12 2005-08-18 Meade Harry M. Method for the production of an erythropoietin analog-human IgG fusion proteins in transgenic mammal milk
JP4087563B2 (ja) 1998-06-15 2008-05-21 ジーティーシー バイオセラピューティックス インコーポレイテッド エリスロポエチン類似体−ヒト血清アルブミン融合物
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
JP4944324B2 (ja) * 1999-07-13 2012-05-30 ボルダー バイオテクノロジー， インコーポレイテッド 免疫グロブリン融合タンパク質
WO2001030320A1 (en) 1999-10-22 2001-05-03 Amgen Inc. Biodegradable microparticles with novel erythropoietin stimulating protein
US6808902B1 (en) 1999-11-12 2004-10-26 Amgen Inc. Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules
CA2391080A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Erythropoietin forms with improved properties
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
AU5551601A (en) * 2000-04-21 2001-11-07 Amgen Inc Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia
WO2002048194A1 (en) 2000-12-11 2002-06-20 Cheil Jedang Corporation Fusion protein having the enhanced in vivo activity of erythropoietin
CA2433877C (en) 2001-01-17 2014-11-18 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CN1330664C (zh) * 2001-03-07 2007-08-08 默克专利有限公司 用于含杂合同种型抗体部分的蛋白质的表达技术
US6992174B2 (en) * 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
US6900292B2 (en) * 2001-08-17 2005-05-31 Lee-Hwei K. Sun Fc fusion proteins of human erythropoietin with increased biological activities
US6797493B2 (en) 2001-10-01 2004-09-28 Lee-Hwei K. Sun Fc fusion proteins of human granulocyte colony-stimulating factor with increased biological activities
KR100467750B1 (ko) 2001-11-29 2005-01-24 씨제이 주식회사 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질
KR100467751B1 (ko) 2001-12-03 2005-01-24 씨제이 주식회사 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질
US20040063912A1 (en) 2002-03-15 2004-04-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
DE10227606B3 (de) 2002-06-20 2004-01-22 Bionethos Holding Gmbh Verwendung von Thrombopoietin zur Kultivierung von Hepatozyten
WO2004004798A2 (en) 2002-07-03 2004-01-15 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
AU2003287345A1 (en) 2002-10-31 2004-06-07 Genentech, Inc. Methods and compositions for increasing antibody production
US7348004B2 (en) * 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
JP5087274B2 (ja) * 2003-06-30 2012-12-05 ドマンティス リミテッド ポリペプチド
US20050152894A1 (en) 2003-09-05 2005-07-14 Genentech, Inc. Antibodies with altered effector functions
US20060134105A1 (en) 2004-10-21 2006-06-22 Xencor, Inc. IgG immunoglobulin variants with optimized effector function
DK1699821T3 (da) 2003-12-31 2012-07-16 Merck Patent Gmbh Fc-ERYTHROPOIETIN-FUSIONSPROTEIN MED FORBEDREDE FARMAKOKINETIKKER
EP1586585A1 (de) 2004-04-14 2005-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Expressionssystem zur Herstellung von IL-15/Fc-Fusionsproteinen und ihre Verwendung
WO2006079169A1 (en) 2005-01-25 2006-08-03 Apollo Life Sciences Limited Parameter selected gm-csf, il-3, il-4, il-5 and chimeras thereof for therapeutic and diagnostic purposes
US20080260746A1 (en) 2005-11-24 2008-10-23 Laboratoires Serono Sa Erythropoietin Polypeptides and Uses Thereof
US7625564B2 (en) 2006-01-27 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
BRPI0814465B1 (pt) * 2007-07-26 2021-11-23 Novagen Holding Corporation Proteína de fusão, dímero, método para produzir uma proteína de fusão, linhagem de célula, usos de uma proteína de fusão e de uma composição farmacêutica e composição farmacêutica

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999002709A1 (en) * 1997-07-10 1999-01-21 Beth Israel Deaconess Medical Center Recombinant erythropoietin / immunoglobulin fusion proteins
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
CN1671863A (zh) * 2002-03-15 2005-09-21 布赖汉姆妇女医院 适合治疗剂全身性递送的中央气道给药
TW200510457A (en) * 2003-05-06 2005-03-16 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bitonti A. J. et al., Pulmonary delivery of an erythropoietin Fc fusion protein in non-human primates through an immunoglobulin transport pathway. PNAS, 2004 June 29, vol.101 no. 26, 9763–9768. *

Also Published As

Publication number Publication date
US7625564B2 (en) 2009-12-01
IL192801A (en) 2016-05-31
EP2450373B1 (en) 2015-03-18
BRPI0706742A2 (pt) 2011-04-05
CN102816242B (zh) 2017-10-20
NZ569702A (en) 2012-03-30
HK1125673A1 (en) 2009-08-14
JP2016006116A (ja) 2016-01-14
EP1994157A4 (en) 2009-11-11
CN102816242A (zh) 2012-12-12
EP1994157A1 (en) 2008-11-26
DK2450373T3 (da) 2015-06-22
JP6103579B2 (ja) 2017-03-29
PL1994157T3 (pl) 2015-08-31
CA2650072A1 (en) 2007-08-02
PT2450373E (pt) 2015-07-27
BRPI0706742B8 (pt) 2019-12-24
JP2009524415A (ja) 2009-07-02
JP2013066477A (ja) 2013-04-18
US20230265143A1 (en) 2023-08-24
PT1994157E (pt) 2015-07-22
US20170114110A1 (en) 2017-04-27
EP2450373A2 (en) 2012-05-09
CA2650072C (en) 2015-11-24
CN102516399B (zh) 2017-03-22
KR20080109739A (ko) 2008-12-17
WO2007085084A1 (en) 2007-08-02
MX2008009322A (es) 2008-10-17
ES2539759T3 (es) 2015-07-03
HK1170507A1 (zh) 2013-03-01
ZA200805920B (en) 2009-08-26
US20100098716A1 (en) 2010-04-22
RU2433181C2 (ru) 2011-11-10
US20070178112A1 (en) 2007-08-02
US20190070307A1 (en) 2019-03-07
US8431132B2 (en) 2013-04-30
CN102516399A (zh) 2012-06-27
US11279742B2 (en) 2022-03-22
US7964375B2 (en) 2011-06-21
DK1994157T3 (da) 2015-06-22
SG169351A1 (en) 2011-03-30
BRPI0706742C1 (pt) 2021-05-25
EP1994157B1 (en) 2015-03-18
SG10201404308RA (en) 2014-10-30
RU2008134389A (ru) 2010-03-10
US20090297522A1 (en) 2009-12-03
IL192801A0 (en) 2009-02-11
ES2539778T3 (es) 2015-07-06
US20130224198A1 (en) 2013-08-29
JP5222153B2 (ja) 2013-06-26
CN101321870B (zh) 2012-07-04
KR20120014936A (ko) 2012-02-20
EP2450373A3 (en) 2012-09-26
AU2007209722A1 (en) 2007-08-02
PL2450373T3 (pl) 2015-08-31
TW200904829A (en) 2009-02-01
US10117949B2 (en) 2018-11-06
BRPI0706742B1 (pt) 2019-12-03
US10233223B2 (en) 2019-03-19
KR101235124B1 (ko) 2013-03-07
AU2007209722B2 (en) 2012-07-26
US20100099145A1 (en) 2010-04-22
US9375487B2 (en) 2016-06-28
CN101321870A (zh) 2008-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230265143A1 (en) Recombinant human epo-fc-fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
US20220127623A1 (en) Fusion proteins having mutated immunoglobulin hinge region
TWI554520B (zh) 在活體中具有延長之半生期以及提高之紅血球生成活性的重組人類紅血球生成素（ｅｐｏ）-ｆｃ融合蛋白
CA2595013C (en) Fusion proteins comprising gm-csf and fc fragment with modified hinge region