EA029602B1 - Применение белков р3 бактериофага в качестве агентов, связывающих амилоид - Google Patents

Применение белков р3 бактериофага в качестве агентов, связывающих амилоид Download PDF

Info

Publication number
EA029602B1
EA029602B1 EA201491063A EA201491063A EA029602B1 EA 029602 B1 EA029602 B1 EA 029602B1 EA 201491063 A EA201491063 A EA 201491063A EA 201491063 A EA201491063 A EA 201491063A EA 029602 B1 EA029602 B1 EA 029602B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
amyloid
protein
binding
mutant
variant
Prior art date
Application number
EA201491063A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201491063A1 (ru
Inventor
Раджараман Кришнан
Original Assignee
Проклара Байосайенсиз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Проклара Байосайенсиз, Инк. filed Critical Проклара Байосайенсиз, Инк.
Publication of EA201491063A1 publication Critical patent/EA201491063A1/ru
Publication of EA029602B1 publication Critical patent/EA029602B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/162—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A61K47/665—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells the pre-targeting system, clearing therapy or rescue therapy involving biotin-(strept) avidin systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/60—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances involving radioactive labelled substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/14011—Details ssDNA Bacteriophages
    • C12N2795/14111—Inoviridae
    • C12N2795/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/14011—Details ssDNA Bacteriophages
    • C12N2795/14111—Inoviridae
    • C12N2795/14133—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/14011—Details ssDNA Bacteriophages
    • C12N2795/14111—Inoviridae
    • C12N2795/14171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/18011—Details ssRNA Bacteriophages positive-sense
    • C12N2795/18022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/18011—Details ssRNA Bacteriophages positive-sense
    • C12N2795/18033—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7047—Fibrils-Filaments-Plaque formation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

В изобретении предложены агенты и фармацевтические композиции для уменьшения образования амилоида и/или усиления дезагрегации амилоидных белков. Композиции также можно применять для детектирования амилоида.

Description

изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим белок д3р нитевидного бактериофага, амилоидсвязывающие фрагменты д3р и амилоидсвязывающие мутанты и варианты д3р, а также к применению указанных композиций в качестве терапевтических средств, чтобы уменьшить амилоидную нагрузку, связанную с заболеваниями, например системными и периферическими амилоидозами, нейродегенеративными заболеваниями, включая нейродегенеративные таупатиии и трансмиссивные губчатые энцефалопатии (заболевания, связанные с прионами). В область настоящего изобретения также включено применение указанных композиций для предотвращения накопления амилоидной нагрузки, связанной с указанными заболеваниями, и применение указанных композиций в качестве диагностических средств для обнаружения амилоида и таким образом диагностики таких заболеваний.
Нитевидный бактериофаг М13 и родственные нитевидные фаги продемонстрировали свою полезность на животных моделях заболеваний, связанных с нарушением сворачивания белков, и, следовательно, представляют собой потенциальный класс терапевтических средств для лечения заболеваний, связанных с нарушением формирования структуры белков (см. публикацию патента США 2011/0142803, которая полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки). В частности, было обнаружено, что нитевидные бактериофаги способны вызывать клиренс амилоида, который уже образовался в головном мозге (см., например, АО 2008083795 и АО 2010080073, которые полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки).
Заболевания, сопровождающиеся образованием амилоида, характеризуются дегенерацией нейронов и наличием неправильно свернутых агрегированных белков в головном мозге. Такие неправильно свернутые и агрегированные белки различаются при разных заболеваниях, но в большинстве случаев они имеют кросс-в-складчатую структуру, которая связывает краситель Конго красный и проявляет двойное лучепреломление светло-зеленого цвета. Ожидается, что удаление амилоида снизит или замедлит прогрессирование или даже обратит симптомы, связанные с различными заболеваниями, характеризующимися накоплением амилоида.
Потенциальные терапевтические подходы для предотвращения и/или обращения патологий и/или симптомов, связанных с заболеваниями, которые сопровождаются образованием амилоидных отложений, включают, например, ингибирование образования амилоида, усиление клиренса амилоида и ингибирование агрегации амилоида (см., например, Λβΐιζζί апй О'Соппог, ЫаШге Рсу1С\у Эгид О|5соусгу (2010) 9:237-48). Удаление и/или предотвращение образования токсичных олигомеров также может подходить для лечения и профилактики заболеваний, сопровождающихся образованием амилоида.
Нейродегенеративные заболевания, которые, как известно, связаны с неправильно свернутыми и/или агрегированными белками, включают болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, прионные заболевания, нейродегенеративные таупатии, боковой амиотрофический склероз (БАС), спиноцеребеллярную атаксию (8СА1), (8СА3), (8СА6), (8СА7), болезнь Хантингтона, дентато-рубро-паллидо-льюисову атрофию, бульбарную спинно-мозговую мышечную атрофию, наследственную церебральную амилоидную ангиопатию, семейный амилоидоз, лобно-височную долевую дегенерацию (РТЬО), включая лобновисочную деменцию, британскую/датскую деменцию и семейную энцефалопатию. Другие заболевания включают неправильно свернутые и/или агрегированные белки в периферических отделах, так называемые периферические амилоидозы (см., например, СЫН аий ЭоЬзоп. Аппи Рсу ВюсНет (2006) 75:333-66; и 1о8ер18 е1 а1., Ас1а №игораШо1 (2011) 122:137-153). Существует значительная потребность в предотвращении и/или уменьшении образования агрегатов амилоида (т.е. неправильно свернутых и/или агрегированных белков) для лечения или уменьшения симптомов и тяжести этих заболеваний.
Недавно Национальный институт по проблемам старения и Ассоциация по изучению болезни Альцгеймера опубликовали критерии диагностики деменции по всем причинам и деменции, вызванной болезнью Альцгеймера (см., МсКНапи е1 а1., АКНеипег'з апй Петепйа, (2011) 7(3):263-9). На основе этого руководства деменция по всем причинам диагностируется, если поведенческие или когнитивные симптомы удовлетворяют пяти тестам, которые включают, например, нарушение способности выполнять функции на работе или в повседневной деятельности, а также снижение функционального статуса и работоспособности относительно предыдущих уровней. Тесты включают комбинированное изучение анамнеза и объективную оценку когнитивного функционирования. Как описано в настоящей заявке, открытие того факта, что белок д3р нитевидного бактериофага, амилоидсвязывающие фрагменты д3р, и амилоидсвязывающие мутанты и варианты д3р связывают амилоид, обеспечивает дополнительные способы диагностики любого заболевания или деменции в результате образования амилоида, включая "по всем причинам" и деменции, вызванной болезнью Альцгеймера.
Нитевидные бактериофаги представляют собой группу структурно родственных вирусов, которые инфицируют бактериальные клетки и содержат кольцевую одноцепочечную геномную ДНК. Они не вызывают гибели своего хозяина во время продуктивной инфекции (КазсНей апй ОЬегег, МюгоЬю1 Рсу (1986) 50:401-427). Примеры нитевидных бактериофагов включают фаги семейства Р£ (например, М13, £1 и £й). Нуклеотидная последовательность £й была известна с 1978 года (Веск е1 а1., ШОею Аайз КезеагсН (1978) 5 (12):4495-4503). Полная последовательность М13 была опубликована в 1980 году. уап АеζепЬеек е1 а1., Сепе (1980) 11:129-148. Геном фага £1 был секвенирован в 1982 году (НШ апй Ре1ег8еп,
- 1 029602
1. νίΓοΙ. (1982) 44(1): 32-46). Геном Р1 состоит из 6407 нуклеотидов, на один меньше, чем у фага Гй. Он отличается от последовательности Гй по 188 нуклеотидам (включая удаление одного нуклеотида), что приводит к различию по 12 аминокислотам между белками фагов Г1 и Гй. Последовательность Г1 отличается от последовательности М13 по 52 нуклеотидам, что приводит к различию по 5 аминокислотам между соответствующими белками.
Последовательности ДНК М13 и Гй различаются по 192 (3%) нуклеотидам, но только 12 из этих различий приводят к изменениям в соответствующей аминокислотной последовательности (6,25%) (уап \\е/еиЪеек е! а1., Оепе (1980) 11:129-148).
Структура нитевидных фагов хорошо известна и описана, например, см. работы Магуш, Сигг. Ορίη. ίη Дгиск ΒίοΙ. (1998) 8:150-158; Каксйей апй ОЬегег, МюгоЬю1одюа1 Ре\ае\У5 (1986) 50(4):401-427. Нитевидные фаги имеют "оболочку", которая содержит тысячи копий основного белка капсида, кодируемого геном 8 (д8р, р8 или ρνΐΙΙ). Собранный комплекс д8р-ДНК образует характерную нитевидную форму фага. Минорные белки оболочки, т.е. те, которые присутствуют только в нескольких (3-5) копиях, расположены на концах нити. Один из этих концевых белков, §3р (также известный как р3 или ρΙΙΙ), необходим для связывания с бактерией-хозяином и инициирует инфицирование.
Зрелый белок д3р фага М13 состоит из 406 аминокислот. ОепВапк КеГ 8ед ΝΡ_510891.1 обеспечивает эталонную последовательность, которая включает 18 остатков Ν-концевой сигнальной последовательности. Распространены варианты, которые имеют аминокислотные различия по сравнению с опубликованными последовательностями. Нитевидные фаги из Ι-семейства имеют §3р, который отличается от §3р членов семейства РГ, но даже между семействами консервативность белка д3р достаточно высока (Да^еи е! а1., 1 Мо1 Ενο1 (1992) 34:141-52).
Доступна кристаллическая структура белка д3р (ЪиЪко\У5к1 е! а1., ЗКисШге (1998) 7(6) 711-722). Белок состоит из 3 свернутых доменов, разделенных гибкими линкерными последовательностями, которые обогащены остатками глицина. Имеются два Ν-концевых домена N1 и N2, содержащих 262 аминокислоты, которые взаимодействуют с образованием комплекса Ν1-Ν2. Карбоксиконцевой домен (СТ, также называемый Ν3) содержит 146 аминокислот и служит для закрепления §3р в фаговой частице посредством гидрофобных взаимодействий с д8р (Магупг Сиггей Орш. ш 81гис1ига1 Вю1о§у (1998) 8:150-158). Общедоступная ленточная структура, полученная с использованием гибридного белка Ν1Ν2-2§3]3 Холлигером и проч. (ИоШдег, 1 Мо1. Βίο1. (1999) 288 (4) :649-57), представлена на фиг. 1.
В отличие от большинства белков разворачивание доменов Ν1 и Ν2 из латентной "заблокированой" формы необходимо, чтобы д3р приобрел свою природную биологическую активность (Ескей апй 8сЬт1й, 1. Мо1. Βίο1. (2007) 373:452-461). На начальном этапе инфицирования Ν2 связывает бактериальные Рфимбрии посредством остатков на внешнем крае Ν2 (Иеп§ апй Регйат, 2002). Начальное связывание Ν2 "разблокирует" §3р путем "открывания" комплекса Ν1-Ν2, что затем позволяет домену Ν1 связываться с корецептором То1А. Тепловой переход во фрагменте Ν1-Ν2 белка д3р для осуществления начального этапа разблокирования, когда разворачивается Ν2, происходит при температуре плавления (Тпл) 48,1°С. Часть процесса включает изомеризацию пептидной связи О1п212-Рго213. Конвертация Рго213 представляет собой трансизомеризацию в разблокированном состоянии. Ν1 остается стабильно свернутым до второго этапа, который происходит при Тпл 60,2°С (описано в Ескей апй ЗсЬтк, 2007).
Мутации фрагмента Ν1-Ν2 были использованы для исследования стабильности и инфекционности различных мутантов (Ескей апй ЗсЬтк, 2007). Один вариант, обозначенный "3А", нарушал связывание с фимбриями и уменьшал стабильность домена Ν2. При этой мутации Тпл снижается до 42,6°С. Вариант 3А несет следующие мутации: \181 А, Р190А и Р194А. Другой мутант Ν2, О153И, дестабилизировал Ν2 за счет снижения Тпл до 44,4°С. Мутант Ο129Η стабилизировал Ν2 за счет увеличения Тпл до 51,4°С. Вариант ΙΥ содержит мутации Τ101Ι и Ό209Υ в шарнирной области и увеличивает стабильность фрагмента Ν1-Ν2 (Тпл=56,5°С). Вариант ΙΗΥ содержит мутации Τ101Ι, 012911 и Ό209Υ (Тпл=60,1°С). Вариант ΙΙΗΥ содержит мутации Τ13Ι, Τ101Ι, Ρ129Η и Ό209Υ (Тпл=61,8°С). Обе мутации Ρ129Υ и Τ13Ι являются стабилизирующими, и добавление этих мутаций дополнительно повышает температуру плавления Тпл. Инфекционность фага изменялась обратно пропорционально силе взаимодействия домена с д3р (Ескей апй 8сЬт1й, 2007). Удаление домена Ν2 (фаг Гй (ΔΝ2)) увеличивало инфекционность за счет устранения блокирующего действия домена Ν2 на связывание Ν1 с Το1Λ.
Настоящее изобретение частично основано на открытии, что д3р также опосредует связывание нитевидных фагов с амилоидом способом, который аналогичен процессу, с помощью которого фаг инфицирует бактерии. В патенте США № 7867487 выдвинуто предположение, что механизм, лежащий в основе терапевтической эффективности фагов при дезагрегации амилоида, который описан в указанном патенте, заключался в том, что длинные и тонкие структуры фага могли обеспечить структурирование фага вдоль амилоидных волокон. Помимо этого было предположено, что высокое содержание α-спиралей в д8р, основном белке оболочки, может нарушать β-складчатую структуру амилоида. Этот механизм согласуется с приведенными в патенте данными, что наномолярное количество фага может дезагрегировать микромолярное количество β-амилоида, это позволят предложить, что эффект обусловлен компонентом фага с большим количеством копий, т.е. д8р. Этот вывод также согласуется с данными, приве- 2 029602
денными в патенте США 2011/0182948, что вирус табачной мозаики, структура которого аналогична таковой нитевидных фагов, может вызвать дезагрегацию. Следовательно, результаты этой более ранней работы позволяют предположить, что интактная структура (длинная нить с высоким содержанием альфаспиралей) имела важное значение для терапевтического эффекта или что, если существенное значение имел конкретный белок оболочки, это был белок, представленный в оболочке фага в большом количестве копий, например д8р. Ни в одной из этих ранних работ не было выдвинуто какого-либо предположения, что выделенный компонент бактериофага в отличие от интактного фага мог связываться с амилоидом и/или вызывать его дезагрегацию. Более того, не было выдвинуто какого-либо предположения относительно того факта, что минорный белок оболочки нитевидного бактериофага играл роль в его способности связываться с амилоидом и дезагрегировать его.
Однако настоящее изобретение обеспечивает доказательства альтернативного (хотя необязательно взаимоисключающего) механизма действия. Автор настоящего изобретения обнаружил, что белок §3р фага непосредственно связывает амилоидные волокна, и что опосредованная фагом дезагрегация зависит от этой начальной стадии связывания. Определение автором настоящего изобретения того факта, что д3р отвечает за связывание амилоида, опосредованное нитевидным фагом, обеспечивает механизм терапевтической эффективности бактериофагов, а также обеспечивает основу для новых классов терапевтических и диагностических средств.
Дополнительные цели и преимущества настоящего изобретения будут изложены частично в описании, которое следует ниже, и частично будут очевидны из описания или могут быть изучены при практическом применении изобретения. Цели и преимущества изобретения будут реализованы и достигнуты посредством элементов и комбинаций, конкретно указанных в прилагаемой формуле изобретения.
Следует понимать, что предшествующее общее описание и последующее подробное описание являются исключительно иллюстративными и пояснительными и не ограничивают объем заявленного изобретения.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлена ленточная структура доменов N1 и N2 белка д3р и шарнирная область.
На фиг. 2А-2С приведено выравнивание последовательностей белков §3р из разных источников. На фиг. 2А приведено выравнивание последовательностей §3р из фага М13 (ЗЕЦ ГО N0:1), Ρά (ЗЕЦ ГО N0:2) и ί1 (ЗЕО ГО N0:3), включая консенсусную последовательность (ЗЕЦ ГО N0:4). На фиг. 2В приведено выравнивание последовательностей белка д3р из фага 12-2 (ЗЕЦ ГО N0:5) и 1ке (ЗЕЦ ГО N0:6), наряду с консенсусной последовательностью между 12-2 и 1ке (ЗЕЦ ГО N0:7). На фиг. 2С представлена аминокислотная последовательность §3р из фага Ιί (ЗЕЦ ГО N0:8).
На фиг. 3А представлены результаты исследования связывания фага методом поверхностного плазмонного резонанса (ЗРК). Связывание с фибриллами бета-амилоида (АЦ) сравнивали со связыванием с мономерами бета-амилоида, используя 1014 частиц фага/мл, протекающих через чип биосенсора. На фиг. 3В приведены величины Ка, Κά и Кс, рассчитанные на основании данных 8РК, представленных на фиг. 3А.
На фиг. 4А и 4В приведены результаты исследований связывания. На фиг. 4А приведены результаты исследования прямого связывания для двух дозировок фага (10п/мл и 1012/мл) с увеличением количества моль фибриллярной формы бета-амилоидного пептида 42 (ίΑβ42). На фиг. 4В приведены результаты исследования конкурентного связывания и предоставлен альтернативный способ определения К для связывания М13. Использовали конструкцию 1.
На фиг. 5 приведены результаты исследования конкурентного связывания с использованием денатурированного теплом М13 (квадраты - 90°С в течение 10 мин) в сравнении с М13 в нативной конформации (кружки) (конструкция 1) в исследовании конкурентного связывания с фибриллами амилоида.
На фиг. 6 приведены результаты флуоресцентного анализа с использованием тиофлавина Т (ТФТ), в котором ίΑβ42 инкубировали в присутствии 2-х концентраций фага М13 или без него (конструкция 1).
На фиг. 7А и 7В показано влияние изменения отдельных параметров в исследовании дезагрегации с использованием красителя тиофлафина Т. На фиг. 7А приведена величина дезагрегации в процентах в присутствии двух концентраций соли (0,15 и 1,5М). На фиг. 7В приведен процент растворимой формы бета-амилоида, оставшейся при двух температурах (4 и 37°С). Использовали конструкцию 1.
На фиг. 8А и 8В приведены результаты исследования связывания М13 с амилоидом, используя ίΑβ42. На фиг. 8А показано связывание М13 при использовании температур инкубации от 18 до 58°С в течение 3 ч. На фиг. 8В показана кинетика связывания для инкубации при 37°С по сравнению с инкубацией при 50°С.
На фиг. 9А-9С показано влияние протеолитического удаления §3р на взаимодействие фага и амилоида. Протеазу АгдС использовали для отщепления д3р от фага М13 (М13Дд3р). На фиг. 9А представлены результаты исследования конкурентного связывания бета-амилоида с использованием фага М13Д§3р по сравнению с нативным фагом (обработанным так же, как и АгдС-обработанный фаг, но без обработки протеазой). На фиг. 9В показано влияние обработки АгдС на инфекционность фага М13Д§3р по сравнению с нативным фагом. На фиг. 9С приведены результаты сравнения АгдС-обработанного фага
- 3 029602
с нативным фагом в исследовании дезагрегации.
На фиг. 10А и 10В представлены результаты исследования конкурентного связывания с использованием фрагмента Ν1-Ν2 белка д3р, именуемого ниже рекомбинантный растворимый Ν1Ν2 (гк§3ρ(Ν1Ν2); конструкция 3), М13Д§3р (обработанный АгдС) и М13 в качестве конкурентов меченого М13, связывающегося с ίΑβ42. На фиг. 10В приведены результаты повторного исследования конкурентного связывания.
На фиг. 11 приведены результаты исследования конкурентного связывания для фагов ίά, ΙΙΗΥ, ААА и М13. Фаги ίά, ААА и ΙΙΗΥ были предварительно активированы при 50°С в течение 1,5 ч, затем сравнивали способность активированных и неактивированных фагов ίά, ААА и ΙΙΗΥ конкурировать с меченым М13 за связывание с бета-амилоидом в течение 45-минутной инкубации при 37°С.
На фиг. 12А показана схема τκ-§3ρ(Ν1Ν2) (конструкция 3). На фиг. 12В представлен ионообменный профиль для ΓΚ-§3ρ(Ν1Ν2). На фиг. 12С приведены результаты исследования методом гель-фильтрации с использованием Сефакрил δ-300 и τκ-§3ρ(Ν1Ν2). На фиг. 12Ό приведены результаты вестерн-блоттинга ΓΚ-§3ρ(Ν1Ν2) вместе с контрольными белками §3р и §8р. Фаг М13 разделяли на дорожках 1 и 2 в качестве положительного контроля и детектировали с помощью поликлонального антитела к М13, которое детектирует §8р и §3р. Очищенный гк-д3р разделяли на дорожках 3 и 4 и детектировали с помощью того же поликлонального антитела к М13.
На фиг. 13 приведены результаты исследования методом δΡΡ с использованием ΓΚ-§3ρ(Ν1Ν2) (конструкция 3). ΓΚ-§3ρ(Ν1Ν2) активно связывает ίΑβ42 с Кс приблизительно 180 нМ, но не связывает мономеры.
На фиг. 14 представлены результаты флуоресцентного анализа с использованием ТФТ для измерения уровня амилоида, присутствующего в данном образце. 10 мкМ мономера Λβ42 инкубировали в присутствии 5 концентраций ΓΚ-§3ρ(Ν1Ν2) (конструкция 3) или без него при 37°С в течение 3 дней. Количество волокон, образованных в конце третьего дня, измеряли путем количественной оценки интенсивности флуоресценции связанного ТФТ. Величина ИК50 составляет примерно 20 нМ, это указывает на то, что ΓΚ-§3ρ(Ν1Ν2) активно ингибирует образование волокон Ав42. На фигуре также показано, что связывание зависит от дозы.
На фиг. 15А приведены результаты просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) после инкубации ίΑβ42 в присутствии или в отсутствие ΓΚ-§3ρ(Ν1Ν2) (конструкция 3). На фиг. 15В приведены результаты флуоресцентного анализа с использованием ТФТ, в котором Ав42 и 2 мкМ τκ-§3ρ(Ν1Ν2) (конструкция 3) инкубировали при 37°С в течение 7 дней. Ρκ-§3ρ(Ν1Ν2) блокирует образование ίΑβ42.
На фиг. 16 показано, что ΓΚ-§3ρ(Ν1Ν2) (конструкция 3) активно ингибирует образование волокон αсинуклеина. α-синуклеин в концентрации 25 мкМ агрегировали путем встряхивания при 300 об/мин в течение 4 дней при 37°С (см. столбик 1). Второй столбик на графике представляет мономеры αсинуклеина плюс 1 х 10-13 пентамерного фага М13 после встряхивания при 37°С в течение 3 дней. Результаты, приведенные на столбике 2, показывают, что пентамерный М13 блокирует сборку волокон αсинуклеина. Третий столбик на графике представляет мономеры а-синуклеина+83 нМ мономеров гкд3р. Результаты, приведенные на столбике 3, показывают, что мономеры менее эффективно ингибируют образование волокон α-синуклеина, чем пентамерный М13. Столбик 4 представляет собой отрицательный контроль, показывающий количество мономеров α-синуклеина в нулевой момент времени. На столбике 5 показаны мономеры §3р без волокон α-синуклеина, чтобы определить, происходит ли связывание д3р с политиофенуксусной кислотой (рТАА) и секвестрирование красителя, которое препятствует его связыванию с волокнами. Результаты, приведенные на столбике 5, показывают, что д3р не связывается с рТАА.
На фиг. 17 приведены результаты исследования конкурентного связывания для ΓΚ-§3ρ(Ν1Ν2) (конструкция 3), М13 (конструкция 2), гибридного белка гк-д3рЩШ2)-Ы§О4-Рс (конструкция 4) и отрицательного контроля Ι§04-Ρο.
На фиг. 18 приведены результаты исследования конкурентного связывания, в котором сравнивали М13 (конструкция 2; квадраты), ΓΚ-§3ρ(Ν1Ν2) (конструкция 3; треугольники), гибридный белок гк§3ρ(Ν1Ν2)-Μ§04-Ρο (конструкция 4; перевернутые треугольники) и отрицательный контроль рекомбинантный 1§04-Рс (ромбы).
На фиг. 19 приведены результаты исследования методом ловушки на фильтре, в котором сравнивали пять концентраций волокон Ав42 плюс или минус две концентрации М13 (конструкция 2), 800 нМ гк§3ρ(Ν1Ν2) (конструкция 3) и три концентрации гибридного белка гк-д3рЩШ2)-Ы§О4-Рс (конструкция 4).
На фиг. 20 приведены результаты исследования конкурентного связывания для τκ-^3ρ(Ν1Ν2) (конструкция 3; "мономер") и конъюгированного со стрептавидином τκ-§3ρ(Ν1Ν2) "δΑ[§3ρΝ1Ν2]η=2-4"; "δΑд3р"; "тетрамер"). Ρκ-§3ρ(Ν1Ν2) и δΑ-§3ρ сравнивали по их способности конкурировать с меченым М13 за связывание с бета-амилоидом в течение 3-часовой инкубации при 37°С.
На фиг. 21 приведены результаты исследования методом ловушки на фильтре, в котором сравнива- 4 029602
ли пять концентраций волокон Αβ42 плюс или минус две концентрации Γ8-§3ρ(Ν1Ν2) (конструкция 3; "мономер") и две концентрации 8А-д3р ("тетрамер").
На фиг. 22А и 22В приведены результаты исследования методом ПЭМ для ΕΑβ42 в нулевой момент времени (фиг. 22А) и через три дня после инкубации с 8А-§3р (фиг. 22В).
На фиг. 23 показана последовательность аминокислот одной конструкции г8-д3рЩШ2)-Ь1дО4-Ес, конструкции 4 (8ЕО ГО N0:9). Участок Ν1Ν2 конструкции 4 получен из участка Ν1Ν2 конструкции 1 (8ЕО ГО Ν0:10).
На фиг. 24 показана последовательность аминокислот другой конструкции г8-д3рЩШ2)-Ь1дО4-Ес, конструкции 5 (8Е0 ГО Ν0:11). Участок Ν1Ν2 конструкции 5 получен из участка Ν1Ν2 конструкции 2 (8ЕО ГО Ν0:12).
На фиг. 25 показана последовательность аминокислот одной конструкции г8-д3рЩШ2)-Ыд01-Рс, конструкции 8 (8Е0 ГО Ν0:13). Участок Ν1Ν2 конструкции 6 получен из участка Ν1Ν2 конструкции 2.
На фиг. 26 показано выравнивание аминокислотных последовательностей Ν2 из Ей (8Е0 ГО Ν0:14), Е1 (8 НО ГО Ν0:15), М13 (8ЕО ГО Ν0:16), 1ке (8ЕО ГО Ν0:17), 12-2 (8ЕО ГО Ν0:18) и 1Е1 (8ЕО Ό Ν0:19). Звездочка "*" обозначает положения, которые имеют один полностью консервативный остаток. Двоеточие ":" указывает консервативный участок между группами с очень близкими свойствами, где показатель согласно матрице сравнения аминокислот РАМ250 по Гонне выше 0,5. Десятичная точка указывает на консервативный остаток между группами с очень незначительно совпадающими свойствами, где показатель согласно матрице сравнения аминокислот РАМ250 по Гонне равен или меньше 0,5.
На фиг. 27А схематично показана конструкция 3. На фиг. 27В показана последовательность ДНК части §3р в конструкции 3 (8Е0 ГО Ν0:23). На фиг. 27С показана аминокислотная последовательность части §3р в конструкции 3 (8Е0 ГО Ν0:24).
На фиг. 28 приведены результаты эксперимента по исследованию двух гибридных белков Г8д3рЩШ2)-1§0 для определения их способности снижать уровень бета-амилоида в трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера. г8-д3рЩШ2)-Ы§04-Рс (конструкция 5) и г8-д3рЩШ2)-Ы§01-Рс (конструкция 6) значительно снижали уровень бета-амилоида в гиппокампе мышей, страдающих от болезни Альцгеймера.
На фиг. 29 приведены результаты эксперимента по исследованию двух гибридных белков Г8д3рЩШ2)-1§0 для определения их способности снижать уровень бета-амилоида в трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера. г8-д3рЩШ2)-Ы§04-Рс (конструкция 5) и г8-д3рЩШ2)-Ы§01-Рс (конструкция 6) существенно снижали уровень бета-амилоида в коре головного мозга мышей, страдающих от болезни Альцгеймера.
На фиг. 30 показано ингибирование сборки Ав42 при применении г8-д3рЩШ2)-Ы§01-Рс (конструкция 6). На фиг. 30А показаны результаты исследования конструкции в "нативном" агарозном геле, приготовленном без ДСН. Образцы разделяли в ТЕА буфере без ДСН и не кипятили. Результаты показывают, что конструкция 6 способна ингибировать сборку ΕΑβ42. На фиг. 30В приведены результаты флуоресцентного анализа с использованием ТФТ для оценки присутствия амилоида в образце. По 10 мкМ мономера А(!42 инкубировали в присутствии 2-х концентраций гибридного белка г8-д3рЩШ2)-Ы§О1-Ес (конструкция 6) или без него при 37°С в течение 1 дня. Количество волокон, образовавшихся в конце первого дня, измеряли путем количественной оценки интенсивности флуоресценции связанного ТФТ. Г8д3рЩШ2)-Ы§О1-Ес (конструкция 6) мощно ингибирует образование волокон А(!42. На фигуре также показано, что ингибирование образования волокон под действием конструкции 6 зависит от дозы.
На фиг. 31 приведены репрезентативные результаты исследования методом кругового дихроизма, показывающие, что г8-д3рЩШ2) (конструкция 3) ингибирует сборку А(!42. Используя метод кругового дихроизма оценивают содержание α-спиралей и β-листов в волокнах бета-амилоида. На фиг. 31 показана зависимость коэффициента эллиптичности от длины волны для А(!42 при Т=0, Т=24 ч и Т=48 ч. На фиг. 31В показана зависимость коэффициента эллиптичности от длины волны для Ав42+конструкция 3 при Т=0, Т=24 ч и Т=48 ч. На фиг. 31С приведены репрезентативные результаты флуоресцентного анализа с использованием ТФТ, где количество волокон, образованных в период между 24 и 48 ч, измеряли путем количественной оценки интенсивности флуоресценции связанного ТФТ. Конструкция 3 мощно ингибирует образование волокон А(!42. На фиг. 31Ό показана зависимость коэффициента эллиптичности от длины волны для конструкции 3 при Т=0, Т=24 ч и Т=48 ч. В совокупности эти данные подтверждают способность конструкции 3 ингибировать сборку А(!42.
На фиг. 32 приведены репрезентативные данные, показывающие, что М13 (конструкция 2) и Г8д3рЩШ2)-ЫдО1-Ес (конструкция 6) блокируют олигомер-индуцированную токсичность клеток Ν2α (см., например, 8йие е! а1. (2003) I ΒίοΙ. СЬет. 278(13): 11612-11622 и 8йие е! а1. (2011) Епк Ό. КоЬег8ОИ (ей.) А1/Ьеипег'8 Э|8еа8е апй Егоп1о1етрога1 Оетеийа, Ме!ЬоЙ8 ίη Мо1еси1аг Вю1оду, νοί. 670: 13-32). Клетки линии Ша дифференцировали с помощью сывороточного голодания в течение 48 ч перед обработкой. Олигомеры А(!42 (2 мкМ) предварительно инкубировали с конструкцией 2 и конструкцией 6 при 37°С в течение 3 ч перед добавлением к клеткам Ша Комплексы в нулевой момент времени ("ТО") не подвергали предварительной инкубации. После 24 ч инкубации контролировали высвобождение адени- 5 029602
латкиназы ("АК"). Высвобождение АК в среду указывает на гибель/лизис клеток. Олигомеры Αβ42 получали, как описано в 81ше е1.аР 2011. Результаты показывают, что М13 и Γ8-§3ρ(Ν1Ν2)-Μ§01-Ρο являются мощными ингибиторами токсичных олигомеров.
На фиг. 33 приведены результаты исследования методом ловушки на фильтре, в котором сравнивали шесть концентраций волокон Αβ42 плюс или минус 1х1012/мл М13 (конструкция 2); 80 и 800 нМ конструкции Γδ-§3ρ(Ν1Ν2)-Η§04-Ρο (конструкция 5) и 80 и 800 нМ Γ8-§3ρ(Ν1Ν2)-Μ§01-Ρο (конструкция 6). Волокна Αβ42 инкубировали с конструкциями 2, 5 и 6 при 37°С в течение 3 дней с последующим удержанием на фильтре. Фильтр детектировали с помощью моноклонального антитела (мАт) 6Е10 (1: 15000), которое распознает волокна Αβ42, захваченные на фильтре. 800 нМ конструкции 5 или конструкции 6 соответствуют 5х1014/мл конструкции 2 по количеству моль молекул. Результаты показывают, что конструкции 2, 5 и 8 вызывают активную дезагрегацию волокон бета-амилоида.
На фиг. 34А и 34В приведены репрезентативные результаты исследований, использованных для измерения количества М13 (конструкция 2), связанного с ΓΑβ42 после 3 ч инкубации с фибриллярным тау-белком (йаи). 5 мкМ мономера Αβ42, связанных с конструкцией 2, инкубировали в присутствии 4-х концентраций фибриллярного тау-белка или без него при 37°С в течение 3 ч. Поскольку комплекс ГА(РМ13-А1е\а488 осаждается, а комплекс фибриллярный тау-белок:М13-Α1еха488 не осаждается, оценка потери флуоресценции из осажденного материала указывает на то, что фибриллярный тау-белок конкурирует за связывание с ΓΑβ. В настоящей заявке количество Μ13-ΓΑβ, образующегося в конце 3-го часа, измеряли путем количественной оценки интенсивности флуоресценции Α1еха488 в реакции конкурентного связывания в осадке. Результаты показывают, что фибриллярный тау-белок способен конкурировать с М13^1еха488 (конструкция 2) за связывание с ΓΑβ42.
На фиг. 35 приведены репрезентативные результаты одного исследования методом 8РК способности Γ8-§3ρ(Ν1Ν2)-ΗΙ§04-Ρο (конструкция 4) связываться с фибриллярным тау-белком. Результаты показывают, что конструкция 4 активно связывает фибриллярный тау-белок.
На фиг. 36 показана способность Γ8-§3ρ(Ν1Ν2)-Μ^01-Ρο (конструкция 6) дезагрегировать фибриллярный тау-белок. Волокна тау-белка готовили путем разбавления 40 мкМ повторяющегося участка связывания с микротрубочками ("ΜΤΒΚ") тау-белка в растворе 50 мМ супероксиддисмутазы ("СОД"). Различные концентрации конструкции 6 и приготовленного фибриллярного тау-белка инкубировали в ацетатном буфере при рН 7,0, 37°С в течение 72 ч. Флуоресценцию ТФТ регистрировали в присутствии 5кратного избытка ТФТ. На фиг. 36Α приведены результаты репрезентативного флуоресцентного анализа с использованием ТФТ, демонстрирующие, что конструкция 6 способна дезагрегировать фибриллярный тау-белок. На фиг. 36В приведены результаты другого репрезентативного эксперимента, подтверждающего способность конструкции 6 дезагрегировать волокна тау-белка. Фиг. 36Α и 36В также показывают, что дезагрегация фибриллярного тау-белка под действием конструкции 6 зависит от дозы.
На фиг. 37 приведены результаты репрезентативных экспериментов, показывающие, что Г8§3ρ(Ν1Ν2)-Μ§01-Ρο (конструкция 6) и Γ8-§3ρ(Ν1Ν2) (конструкция 3) ингибируют агрегацию бетаамилоида с течением времени. Αβ42 растворяли в ДМСО и разводили в ФСБ, содержащем ΝαΝ3. Αβ42 агрегировал при 37°С в присутствии различных концентраций конструкции 3 и конструкции 6 или без них. Αгрегацию Αβ42 оценивали по изменению интенсивности флуоресценции ТФТ. На фиг. 37Α приведены результаты исследования образцов методом электрофореза в ДСН-ΠΑΑΓ. На фиг. 37В приведены результаты одного репрезентативного эксперимента. На фиг. 37С приведены результаты другого репрезентативного эксперимента. На фиг. 37Ό приведены обобщенные результаты.
На фиг. 38Α и 38В представлены результаты экспериментов, показывающих способность Г8§3ρ(Ν1Ν2)-ΗΙ§01-Ρο (конструкция 6) блокировать превращение РгР в РгР8с. Лизаты клеток, обработанных конструкцией 6 и 1§С, подвергали ультрацентрифугированию, чтобы отделить растворимые (супернатант) и нерастворимые (осадок) молекулы РгР. Молекулы РгР визуализировали биохимическим способом с применением моноклонального антитела к РгР (6Ό11). В присутствии 1дС существует разделение РгР на растворимую и нерастворимую фракции. В присутствии конструкции 6 имеется ограниченное количество нерастворимого РгР. Данные представлены для п=4.
На фиг. 39Α и 39В представлены результаты экспериментов, показывающих способность Г8§3ρ(Ν1Ν2)-Μ§01Το (конструкция 6) уменьшать накопление и агрегацию РгР8с в культуральной клеточной модели прионного заболевания. На фиг. 39Α приведены результаты биохимического разделения нерасщепленных и ПК-расщепленных лизатов клеток Н2а22Б8с после обработки конструкцией 6 и 1дС. Значительное снижение уровня РгР8с отчетливо наблюдается в клетках, обработанных увеличивающимися концентрациями конструкции 6. Снижение уровня РгР8с примерно на 50% достигается при обработке конструкцией 6 в концентрации приблизительно 0,08 мкг/мл. Обработка конструкцией 6 в концентрации приблизительно 10 мкг/мл снижает уровень РгР8с до 5,725%, р<0,0001. Не наблюдали заметных изменений уровня РгР8с в клетках Б2А22Ь8с, обработанных 1 мкг/мл мышиного 1дС. Для получения данных, приведенных на фиг. 39В, рентгеновские пленки были затем оцифрованы и изначально нормированы на величину эффекта в 1дО-обработанных клетках Б2а22Ь8с из того же пассажа, который принимали равным 100%. Данные денситометрического исследования, полученные из графиков для обработанных про- 6 029602
теиназой К клеток, затем сравнивали с данными, приведенными на графиках для необработанных лизатов, и выражали в виде процентного изменения РгР8с/РгРс. Данные представлены для п=4.
Описание вариантов реализации изобретения
Настоящее изобретение частично основано на обнаружении автором изобретения посреднической роли белка гена 3 ("§3р", также известного как "р3" или "ρΙΙΙ") в связывании амилоида и дезагрегации амилоидных агрегатов. Настоящее изобретение также основано на определении автором изобретения минимальной последовательности §3р, необходимой для связывания с амилоидом.
Таким образом, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены молекулы, в частности полипептиды, которые содержат минимальную консенсусную последовательность, связывающую амилоид, которая получена из д3р. Согласно одному аспекту указанных вариантов реализации настоящего изобретения молекулы являются растворимыми. Согласно другому аспекту указанных вариантов реализации настоящего изобретения молекулы дезагрегируют и/или предотвращают агрегацию амилоида (например, амилоидных бляшек). Согласно другому аспекту указанных вариантов реализации настоящего изобретения молекулы представляют собой гибридные белки. Согласно более конкретному аспекту указанных вариантов реализации настоящего изобретения молекулы гибридных белков дополнительно содержат аминокислотную последовательность цепи иммуноглобулина. Согласно еще более конкретному аспекту указанных вариантов реализации настоящего изобретения молекулы гибридных белков дополнительно содержат аминокислотную последовательность цепи иммуноглобулина С (например, 1дС) или иммуноглобулина М (например, 1дМ). Согласно еще одному аспекту указанных вариантов реализации настоящего изобретения молекула включает домен N2 белка д3р. Согласно более конкретному аспекту указанных вариантов реализации настоящего изобретения молекула содержит домен Ν1-Ν2 белка д3р. Согласно еще одному аспекту указанных вариантов реализации настоящего изобретения молекула содержит полноразмерный белок §3р. Согласно еще одному аспекту молекула представляет собой полипептид, который является фрагментом, мутантом или вариантом любого из вышеперечисленных.
Согласно другим аспектам настоящего изобретения предложены молекулы, которые связываются с То1А, такие как ингибирующие То1А молекулы, в частности полипептиды, которые содержат минимальную консенсусную последовательность, связывающую амилоид. То1А-связывающие молекулы и/или ингибиторы То1А согласно настоящему изобретению связывают, деполимеризуют, предотвращают агрегацию и дезагрегируют амилоид. То1А-связывающие молекулы и/или То1А-ингибирующие молекулы включают гибридные белки. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения То1Асвязывающая молекула и/или То1А-ингибирующая молекула представляет собой колицин или амилоидсвязывающий фрагмент колицина. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения колицин представляет собой колицин группы А (см., например, Сазса1е8 с1 а1., МюгоЪю1. Мо1. Вю1. Кеу. (2007) 71(1): 158-229). То1А-связывающие молекулы и То1А-ингибирующие молекулы согласно настоящему изобретению пригодны в качестве терапевтических средств для уменьшения амилоидной нагрузки, связанной с заболеваниями, такими как системные и периферические амилоидозы, нейродегенеративные заболевания, включая нейродегенеративные таупатии и трансмиссивные губчатые энцефалопатии (заболевания, ассоциированные с прионами). Также в область настоящего изобретения включено применение указанных композиций для предотвращения накопления амилоидной нагрузки, связанной с этими заболеваниями, и применение указанных композиций в качестве диагностических средств для обнаружения амилоида и, таким образом, диагностики таких заболеваний.
Согласно другому варианту изобретение относится к нитевидным бактериофагам, которые были модифицированы для гиперэкспрессии белка д3р по сравнению с фагами дикого типа, экспрессии амилоидсвязывающего фрагмента д3р, амилоидсвязывающего мутанта, или варианта д3р, или амилоидсвязывающего гибридного белка, содержащего д3р.
В настоящем изобретении предложены композиции веществ и/или фармацевтические композиции любых из вышеуказанных молекул или бактериофагов, а также их применение для связывания, дезагрегации и предотвращения агрегации амилоида, и их применение для детектирования амилоидных отложений и диагностики заболеваний и расстройств, характеризующихся накоплением амилоида.
Определения.
Термин "д3р" при использовании отдельно или в терминах, таких как "полученный из §3р", относится к любому белку §3р нитевидных фагов как дикого типа, так и рекомбинантных фагов (включая фрагменты, варианты и мутанты д3р). Термин не должен быть истолкован как относящийся только к §3р какого-либо конкретного нитевидного бактериофага. В качестве примера термин "д3р" включает 8ЕО ГО N0:1 и родственные белки, показанные на фиг. 2.
Термин "нитевидный бактериофаг" включает как нитевидный бактериофаг дикого типа, так и рекомбинантный нитевидный бактериофаг. В настоящей заявке "нитевидный бактериофаг" может также упоминаться как "бактериофаг", "фаг" или "М13".
В настоящей заявке термин "нитевидный бактериофаг дикого типа" относится к нитевидным фагам, обнаруживаемым в природе, нитевидным фагам, которые были указаны как фаги "дикого типа" в любой базе данных нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, нитевидным бактериофагам, которые являются коммерчески доступными и характеризуются как фаги "дикого типа", и нитевидным
- 7 029602
бактериофагам, которые приобрели нерекомбинантные мутации относительно любой из вышеперечисленных мутаций посредством перепассирования.
Термин "домен" означает область полипептида (включая белки), имеющую некоторые отличительные физические особенности или роль, включая, например, независимо свернутую структуру, состоящую из одной части полипептидной цепи. Домен может содержать последовательность с отличительной физической особенностью полипептида или он может содержать фрагмент последовательности с отличительной физической особенностью, который сохраняет свои характеристики связывания (т.е. он может связываться со вторым доменом). Домен может быть связан с другим доменом. Другими словами, первый домен может в природных условиях связываться со вторым доменом. Например, домен N2 белка д3р связывает Р-фимбрии, а домен N1 белка д3р связывает То1А.
В настоящей заявке термины "амилоид", "амилоидные фибриллы" и "амилоидные волокна" представляют собой общие термины для третичной структуры, которая образуется путем агрегации любого из нескольких различных белков и состоит из упорядоченно расположенных β-листов, которые уложены перпендикулярно оси волокна (8ипбе е1 а1., 1. Мо1. Βίο1. (1997) 273:72 9-39). Один типичный пример амилоида представляет собой агрегаты бета-амилоида, образующиеся при болезни Альцгеймера, которые состоят из бета-амилоидного пептида "βΑ", содержащего внутренние фрагменты из 39-43 аминокислот, образующиеся при расщеплении белка-предшественника амилоида человека (ТАРР). Существуют короткие формы, такие как Αβ40, и длинные формы, такие как более фибриллогенная изоформа бетаамилоида, Αβ42. Другие примеры амилоидных белков включают неправильно свернутый α-синуклеин (связанный с болезнью Паркинсона), хантингтин (связанный с болезнью Хантингтона), тау-белок (связанный с болезнью Альцгеймера), а также аномальную конформацию прионного белка РгР8с. Дополнительные примеры приведены в настоящем описании и известны специалистам в данной области (см., например, Αβίιζζί (2010) и ЕюЬиег апб КабРогб, Мо1. Се11 (2011) 43:8-18). Таким образом, если белок или пептид не указан, использование терминов "амилоид", "амилоидные фибриллы" или "амилоидные волокна" не следует истолковывать как ограниченные каким-либо конкретным белком или заболеванием.
Термин "бета-амилоидный пептид" является синонимом "β-амилоидного пептида", "βΑΡ", "βΑ" и "бета-амилоида". Эти термины относятся к образующему амилоид пептиду, который происходит из белка-предшественника амилоида человека (ПАРР).
Фаг, белок, гибридный белок, домен гибридного белка или мутант, фрагмент или вариант вышеуказанного, который "связывает фибриллы амилоида" или который является "амилоидсвязывающим", представляет собой такой белок, который является положительным в исследовании связывания амилоида. Связывание амилоида можно детектировать в условиях ίη уйго с помощью исследования прямого связывания, например, методом поверхностного плазмонного резонанса (8РК), в этом случае амилоидсвязывающий продукт в целом связывает амилоид с Кб по меньшей мере 10-8М, 10-9М, 10-10М или 10-11М. В другом случае связывание амилоида можно детектировать с помощью исследования связывания ΡΑβ42, описанного в примерах. Амилоидсвязывающие фрагменты, варианты и мутанты §3р также могут быть идентифицированы по их совместной локализации с амилоидом при введении в трансгенную мышиную модель любого заболевания, связанного с неправильным сворачиванием белков.
Любые из продуктов или композиций согласно настоящему изобретению, которые описаны как "дезагрегирующие" или "опосредующие дезагрегацию", снижают уровень агрегатов, которые уже образованы. Дезагрегацию можно измерить с помощью метода ловушки на фильтре (Аапкег е1 а1., МеШобк Еηζуто1 (1999) 309:375-86). Исследование методом ловушки на фильтре описано в настоящей заявке и может быть использовано как для детектирования агрегатов, так и для контроля дезагрегации, опосредованной композициями согласно изобретению. Дезагрегацию детектируют как снижение удержания амилоида на фильтре, на что указывает уменьшение окрашивания в присутствии возрастающих концентраций дезагрегирующего агента.
В настоящей заявке композиция, которая "снижает уровень амилоида", обладает одним или более из следующих видов активности: ингибирует образование амилоида, вызывает дезагрегацию амилоида, способствует клиренсу амилоида, ингибирует агрегацию амилоида, блокирует и/или предотвращает образование токсичных амилоидных олигомеров и/или способствует клиренсу токсичных амилоидных олигомеров.
Любые продукты или композиции согласно настоящему изобретению, описанные как "защищающие нейроны от повреждения амилоидом", предотвращают накопление нового амилоида и/или предотвращают образование токсичных амилоидных олигомеров. Продукты или композиции согласно настоящему изобретению, описанные как "защищающие нейроны от повреждения амилоидом", можно принимать в профилактических целях. Наличие защитного действия продукта или композиции на нейроны от повреждения амилоидом можно измерить с помощью исследования цитотоксичности в нейрональной клеточной культуре, описанного в настоящей заявке.
В настоящей заявке термины "белок РгР", "РгР" и "прион" относятся к полипептидам, которые способны при определенных условиях индуцировать образование агрегатов, приводящих к развитию заболеваний, связанных с нарушением сворачивания белков. Например, нормальный клеточный прионный
- 8 029602
белок (РгРс) превращается в таких условиях в соответствующую скрейпи-изоформу (РгР8с), которая участвует в патогенезе заболеваний, таких как, но не ограничиваясь указанными, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (ГЭКРС), или коровье бешенство, губчатая энцефалопатия кошек, куру, болезнь Крейтцфельда-Якоба (БКЯ), синдром Герстманна-Штраусслера-Шейнкера (088) и фатальная семейная бессонница (ΡΡΙ).
В настоящей заявке термин "вариант" в сочетании с термином бактериофаг, белок, полипептид или аминокислотная последовательность (например, вариант §3р или вариант амилоидсвязывающего фрагмента д3р) относится к соответствующему веществу, которое содержит по меньшей мере один отличающийся аминокислотный остаток (замена, вставка или делеция) по сравнению с эталонным веществом. В некоторых вариантах реализации "вариант" имеет высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей и/или консервативные аминокислотные замены, делеции и/или инсерции по сравнению с эталонной последовательностью. В некоторых вариантах реализации вариант имеет не более 75, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 различий по аминокислотным остаткам в сравнении с эталонной последовательностью. "Консервативная замена" относится к замене одной аминокислоты на другую аминокислоту, которая существенно не изменяет химических, физических и/или функциональных свойств белка д3р или амилоидсвязывающего фрагмента д3р (например, белок §3р или его амилоидсвязывающий фрагмент сохраняет тот же заряд, структуру, полярность, гидрофобность/гидрофильность и/или сохраняет функции, такие как способность распознавать, связывать и/или снижать уровень амилоида). Такие консервативные аминокислотные модификации основаны на относительном сходстве заместителей боковой цепи аминокислот, например, их гидрофобности, гидрофильности, заряде, размере и т.п. Примеры консервативных замен, в которых учитываются различные характеристики из перечисленных выше, хорошо известны специалистам в данной области техники и включают аргинин и лизин; глутамат и аспартат; серин и треонин; глютамин и аспарагин; валин, лейцин и изолейцин.
Термин "мутант" (например, "мутант §3р" или "мутант фрагмента, связывающего амилоид") относится к белку, который является мутированным по одному или более аминокислотным остаткам для модуляции его терапевтической или диагностической эффективности. В некоторых вариантах мутант содержит замену, делецию и/или вставку аминокислотного остатка, который, как известно, взаимодействует с амилоидом. В других вариантах реализации мутант содержит замену, делецию и/или вставку аминокислотного остатка, который является консервативным аминокислотным остатком, присутствующим в д3р дикого типа или его амилоидсвязывающем фрагменте. В некоторых вариантах реализации мутант имеет не более 75, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 различий по аминокислотным остаткам в сравнении с эталонной последовательностью. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения аминокислотные замены являются консервативными заменами. Термины "вариант" и "мутант" используются в настоящей заявке взаимозаменяемо, за исключением того, что "вариант", как правило, является нерекомбинантным в природных условиях, в то время как "мутант", как правило, является рекомбинантным.
В настоящей заявке термин "жесткие условия" включает условия, которые могут быть легко определены специалистом в данной области техники на основе, например, длины ДНК. В целом такие условия определены в работе 8атЬгоок с1 а1. Мо1еси1аг С1ошпд: А БаЬогаЮгу Мапиа1, 2 еЕ., νοί. 1, рр. 1.101104, Со1Е Зргшд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк (1989) и включают использование раствора для предварительной промывки нитроцеллюлозных фильтров 5х88С, 0,5% ДСН, 1,0 мМ ЭДТА (рН 8,0), проведение гибридизации в 50%-ном формамиде, 6х88С при 42°С (или другом аналогичном растворе для гибридизации, таком как раствор Старка, 50% формамид при 42°С) и промывку при температуре приблизительно 68°С, 0,2х88С, 0,1% ДСН. Специалисту в данной области техники будет понятно, что температуру и концентрацию соли в промывочном растворе при необходимости можно регулировать в зависимости от факторов, таких как длина зонда.
В настоящей заявке термин "умеренные условия" включает условия, которые могут быть легко определены специалистом с обычной квалификацией в данной области техники на основе, например, длины ДНК. Основные условия изложены в работе 8атЬгоок е1 а1. Мо1еси1аг С1отп§: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2Е еЕ., νο1. 1, рр. 1.101-104, Со1Е Зргтд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк (1989) выше и включают использование раствора для предварительной промывки нитроцеллюлозных фильтров 5х88С, 0,5% ДСН, 1,0 мМ ЭДТА (рН 8,0), гибридизации в 50%-ном формамиде, 6х88С при 42°С (или другом аналогичном растворе для гибридизации, таком как раствор Старка, 50% формамид при 42°С) и промывку при температуре 60°С, 0,5х88С, 0,1% ДСН.
Термин "высокая гомологичность последовательностей" означает по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% гомологичность аминокислотной последовательности с эталонной последовательностью, измеренную с использованием известных компьютерных программ, таких как программа ВекЕгЕ
"Гибридный белок" представляет собой неприродный белок, содержащий по меньшей мере два по- 9 029602
липептидных домена.
"Гибридный белок д3р" включает белок д3р, связанный со вторым доменом.
"Гибридный белок К1-Ы2" (также называемый "гибридный белок N1X2") включает домены N1 и N2 (или мутанты, фрагменты или варианты любого домена), но не домен N3/0', белка д3р, связанного со вторым доменом. Гибридный белок Ν1Ν2 может содержать шарнирную область или не содержать ее.
"Гибридный белок N2" включает домен N2 (или мутанты, фрагменты или варианты N2), но не содержит домены N1 или N3/07, белка д3р, связанного со вторым доменом. Гибридный белок N2 может содержать шарнирную область или не содержать ее.
В настоящей заявке конструкция 1 получена из М13 дикого типа (см., ОепЬапк Й1е: NС_003287.2, версия ОЙ56718463). В конструкции 1 по сравнению с М13 дикого типа 8ег378 (АОС) заменен на О1у(ООС), и 11е87 (АТТ) заменен на Азп(ААС).
Конструкция 1 содержит последовательность нуклеиновой кислоты, приведенную в δΕ^ ГО N0:10.
Конструкция 2 представляет собой изолят М13 дикого типа (ОепВапк 1X412914.1). Конструкция 2 содержит последовательность нуклеиновой кислоты, приведенную в δΕ^ ГО N0:12.
Конструкция 3 представляет собой рекомбинантный растворимый фрагмент д3р, включающий домены N1 и N2 белка д3р (г§-д3р(О№)), содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в δΕς ΙΌ N0:20.
Конструкция 4 представляет собой гибридный белок, содержащий рекомбинантный растворимый фрагмент д3р и 1дО4 Ее (г§-д3р^Ш2)-ЫдО4-Гс), содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в δΕ^ ГО N0:9. Участок №N2 конструкции 4 получен из участка №N2 конструкции 1.
Конструкция 5 представляет собой гибридный белок, содержащий рекомбинантный растворимый фрагмент д3р и 1дО4 Гс (г§-д3р^Ш2)-ЫдО4-Гс), содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в δΕ^ ГО N0:1. Участок №N2 конструкции 5 получен из участка №N2 конструкции 2.
Конструкция 6 представляет собой гибридный белок, содержащий рекомбинантный растворимый фрагмент д3р и 1дО1 Гс (г§-д3р^Ш2)-ЫдО1-Гс), содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в δΕ^ ГО N0:13. Участок №N2 конструкции 6 получен из участка №N2 конструкции 2.
Источники д3р.
Нитевидные бактериофаги представляют собой группу родственных вирусов, которые заражают грамотрицательные бактерии, такие как, например, Е. сой. См., например, Казсйей апй 0Ьегег, МюгоЬю1оду Не¥1е\У5 (1986) Иес:401-427. Примеры нитевидных бактериофагов, включают, но не ограничиваются указанными, фаги семейства Г£ (т.е. по меньшей мере М13, И и Ш) и фаги из Ι-семейства (т.е. по меньшей мере Ι22, 1ке и ΙΕ1).
Все природные нитевидные бактериофаги содержат белок д3р, который является минорным белком оболочки, присутствующим в 3-5 копиях в одном фаге. Таким образом, согласно одному аспекту настоящего изобретения выделенный белок д3р получают из любого природного нитевидного бактериофага. Также могут быть получены рекомбинантные формы белка д3р. Рекомбинантный д3р может соответствовать д3р дикого типа из любого природного нитевидного бактериофага. Таким образом, рекомбинантный выделенный белок д3р также включен в объем настоящего изобретения.
Один пример д3р из фага М13 представлен в δΕ^ ГО N0:1. Если иное конкретно не указано, то все описанные мутации д3р приведены по отношению к δΕ^ ГО N0:1, представленной ниже в очевидной и аннотированной форме
1 АЕТУЕЗСЬАК ΡΗΤΕΝ3ΕΤΝν ИКООКТЬОНУ ΑΝΥΕΟΟΕΜΝΑ ТСУУУСТСОЕ
ТОСУСТИУР!
61 61Α.ΙΡΕΝΕ66 СЗЕСССЗЕСС СЗЕСССТКРР Εγσϋτριρσγ τγίΝΡίωστγ
ΡΡΟΤΕ0ΝΡΑΝ 121 РЫРЗЬЕЕЗОР ΕΝΤΕΜΕΟΝΝΗ ЕКНК<2САЬТУ γτστντοστϋ ΡνΚΤΥΥΟΥΤΡ
ν33ΚΑΜΥϋΑΥ 181 ИЫСКЕНОСАЕ Η36ΕΝΕϋΡΕν СЕУ<2С<233ОЬ Ρζ)ΡΡνΝΑ666 ЗСССЗСССЗЕ
СССЗЕСССЗЕ 241 СССЗЕСССЗС 663636ϋΕϋΥ ΕΚΜΑΝΑΝΚ3Α ΜΤΕΝΑϋΕΝΑΕ ОЗОАКСКЬОЗ
νΑΤϋΥΟΑΑΙϋ 301 СЕ1С0УЗС1А. Ν6Ν6ΑΤ6ϋΕΑ СЗЫЗ<2МА<2УС ϋ6ϋΝ3ΡΕΜΝΝ ЕК<2УЬРЗЬР<2
ЗУЕСНРЕУЕЗ 361 Α6ΚΡΥΕΕ3ΙΏ СОКИЪЕКСУ ЕАЕЫАУАТЕ ΜΥνΕ3ΤΕΑΝΙ ЫШКЕЗ
Аннотированная δΕ^ ГО N0:1
10 029602
1 АЕТУЕЗСЬАК ΡΗΤΕΝ3ΕΤΝΥ ΜΚϋϋΚΤΕΟΚΥ ΑΝΥΕΟΟΠΝΝΑ ТСУУУСТСОЕ
ΤΟΟΥΟΤΝΥΡΙ
61 ΟΠΑΙΡΕΝΕΟΟ СЗЕССС5ЕСС С5ЕСССТКРР ΕΥΟϋΤΡΙΡΟΥ ΤΥΙΝΡΣϋΟΤΥ
ΡΡΟΤΕΩΝΡΑΝ 121 ΡΝΡ5ΣΕΕ5ζ2Ρ Ι,ΝΤΓΜΓφΝΝΚ. ΓΚΝΚβΟΑΙ,Τν γτστντςστϋ ΡνΚΤΥΥβΥΤΡ
νδδΚΑΜΥΌΑΥ 181 ΗΝΟΚΓΚΟΟΑΓ ΗδΟΓΝΕϋΡΕν ΟΕγςοςδδϋΣ ΡςΡΡνΝΑΟΟΟ зееезееезЕ
СССЗЕСССЗЕ 241 ееезЕееезе ссзсзсееее εκμανανκοα ΜΤΕΝΑϋΕΝΑΕ ОЗОАКСКЪОЗ
νΑΤϋΥΟΑΑΙϋ 301 СЕЮОУЗСЪА ΝΟΝΟΑΤΟΌΕΑ СЗИЗОМАОУС ΌΟΌΝ3ΡΕΜΝΝ ЕКОУЪРЗЪРО
ЗУЕСНРЕУЕЗ 3 61 Α0ΚΡΥΕΕ3ΙΌ СОКШЪЕКСУ ЕАЕЪЪУУАТЕ МУУЕЗТЕАШ ΕΚΝΚΕ3
Таблица 1
Ключ для аннотированной МТ) II) ΝΟ: 1
Участок Остатки Остаток при наличии сигнального пептида Ключ
N1 1-67 19-85 Подчеркнуто
01 68-86 86-104 Выделено
N2 87-217 105-235 Подчеркнуто, жирный шрифт
02 218-256 236-274 Курсив
N3 257-406 275-424 Выделено и подчеркнуто
Последовательность δΕ^ ГО N0:1 соответствует ОепБапк ΝΡ-510891.1 с удаленным 18аминокислотным сигнальным пептидом, следовательно, нумерация аминокислот приведена для зрелого д3р. Сигнальный пептид обычно включен в любую конструкцию для экспрессии, и незрелый д3р, который содержит сигнальный пептид, включен в объем различных вариантов реализации настоящего изобретения, если из контекста очевидно не следует, что он исключен. Последовательность δΕ^ ГО N0:1 приведена только в качестве эталонной последовательности. Она никоим образом не ограничивает сущность и объем настоящего изобретения.
Известны последовательности д3р из нескольких источников. Примеры аминокислотных последовательностей д3р для бактериофага семейства Е£ включают последовательности, найденные в ϋηΐΡΓοΐ под номерами доступа Р69169 (фаг Π), Ρ03681 (фага Ш) и Р69168 (фаг М13). Примеры аминокислотных последовательностей д3р для бактериофага 1-семейства включают Р15415 (фаг 122), Р03660 (фаг 1ке) и 080297 (фаг ΙΠ). Примеры выравнивания нескольких последовательностей д3р представлены на фиг. 2.
О3р, который можно применять согласно настоящему изобретению, также включает фрагменты, мутанты и/или варианты д3р. Мутанты или варианты могут быть описаны со ссылкой на полноразмерный д3р или со ссылкой на фрагмент д3р. Любой полноразмерный д3р или его фрагмент, включая его мутанты и/или варианты, которые сохраняют способность связываться с амилоидом, независимо от их способности дезагрегировать амилоид, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Любой белок, "содержащий" такой §3р0, также находится в пределах объема настоящего изобретения. Кроме того, белки, "включающие", "состоящие из", "состоящие, по существу, из" или "имеющие" такие д3р, также включены в область настоящего изобретения.
Фрагменты д3р, связывающие и дезагрегирующие амилоид.
Как уже упоминалось, д3р имеет два Ν-концевых домена, N1 и N2, которые взаимодействуют с образованием комплекса М-Ш, и один С-концевой домен, N3 (также называемый "СТ"). В фаге Е£ домен N1 содержит остатки 1-67, и домен N2 содержит остатки 87-217 зрелого д3р. Остатки 87-123 образуют шарнирную область, которая обеспечивает открытие и закрытие между N1 и N2. Иногда шарнирная область считается частью N2, тогда как в других случаях она рассматривается как отдельный элемент. N1 и N2 также связаны гибкой линкерной последовательностью, богатой глицином. В N1 имеются два дисульфидных мостика между Су§7 и Су§36 и между Су§46 и Су§53. В N2 существует один дисульфидный мостик между Су§188 и Су§201. Домен №/СТ содержит остатки с 257 по 406. НоШпдег, 1999; Матуш, 1998. В карбоксиконцевом домене имеется дисульфидный мостик между Су§354 и Су§371. Матуш, 1998. В д3р отсутствуют междоменные дисульфидные мостики.
Неограничивающие примеры амилоидсвязывающих фрагментов д3р включают домен N2 как с шарнирной областью (например, по меньшей мере остатки 87-217 в δΕ^ ГО N0:1), так и без шарнирной области (например, по меньшей мере остатки 124-217 в δΕ^ ГО N0:1); и домены №-N2 (например, по меньшей мере остатки 1-67 и 87-217 в δΕ^ ГО N0:1) с промежуточной линкерной последовательностью или без нее (например, включая или не включая остатки 68-86 в δΕ^ ГО N0:1) и с шарнирной областью
- 11 029602
или без нее. В любом из вышеприведенных примеров N2 или фрагменты Ν1Ν2 могут представлять собой N2 или N1, обнаруживаемые в нитевидном бактериофаге дикого типа, или рекомбинантные N2, или №N2. В любом из вышеуказанных примеров N2 или фрагменты УЮ могут представлять собой мутанты или варианты последовательности нитевидного бактериофага дикого типа.
Пригодные амилоидсвязывающие фрагменты §3р включают любой фрагмент §3р, в том числе N2 и фрагменты №N2, которые сохраняют способность связываться с амилоидом, независимо от способности фрагмента дезагрегировать амилоид. Любой белок, "содержащий" такой амилоидсвязывающий фрагмент (или мутант, или вариант), включен в область настоящего изобретения. Аналогичным образом, белки, "включающие", "состоящие из", "состоящие, по существу, из" или "имеющие" фрагмент или вариант §3р, также включены в область настоящего изобретения.
Мутанты и варианты N2 и полипептида N2.
Выравнивание первичных структур N2 из Гб, Г1, М13, 1ке, 12-2 и ΙΓ1 показано на фиг. 26. Аминокислотная последовательность Гб приведена в 5>ЕО ГО N0:14; аминокислотная последовательность Г1 приведена в 5>Е0 ГО N0:15; аминокислотная последовательность М13 приведена в 5>Е0 ГО N0:18; аминокислотная последовательность 1ке приведена в 5>Е0 ГО N0:17; аминокислотная последовательность Ι2-2 приведена в 5>Е0 ГО N0:18; и аминокислотная последовательность ΙΡ1 приведена в 5>Е0 ГО N0:19. Используя эту фигуру и выравнивание в качестве руководства, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен полипептид N2, мутанты полипептида N2 и варианты полипептида N2, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в 5>Е0 ГО N0:14, 15, 16, 17, 18 или 19, включая любые их амилоидсвязывающие фрагменты.
В других вариантах реализации настоящего изобретения полипептид N2 представляет собой мутант или вариант полипептида N2, который сохраняет способность связываться с амилоидом, и имеет аминокислотную последовательность, которая содержит не более 75, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 различий по аминокислотным остаткам при выравнивании с аминокислотной последовательностью любой из 5>Е0 ГО N0:14, 15, 16, 17, 18 или 19. На фиг. 26 звездочка "*" указывает положения, которые имеют один полностью консервативный остаток. Двоеточие ":" указывает на консервативность между группами с очень близкими свойствами, для которых показатель согласно матрице РАМ 250 по Гонне выше 0,5. Десятичная точка указывает на консервативность между группами с незначительно близкими свойствами, для которых показатель согласно матрице РАМ 250 по Гонне равен или меньше 0,5. Согласно некоторым аспектам указанных вариантов реализации настоящего изобретения мутант или вариант полипептида N2 не имеет различий по аминокислотным остаткам в любом положении, обозначенном "*" на фиг. 26. Согласно более конкретным аспектам мутант или вариант полипептида N2 не имеет различий по аминокислотным остаткам в любом положении, обозначенном и содержит ту же аминокислоту, что и по меньшей мере одна аминокислота в последовательностях 5>Е0 ГО N0:14, 15, 16, 17, 18 или 19 в каждом положении, указанном с помощью на фиг. 26. Согласно еще более конкретным аспектам мутант или вариант полипептида N2 не содержит различий по аминокислотным остаткам в любом положении, указанном с помощью "*", и содержит ту же аминокислоту, что и по меньшей мере одна аминокислота в последовательностях 5>Е0 ГО N0:14, 15, 16, 17, 18 или 19 в каждом положении, указанном с помощью ":", и каждом положении, указанном с помощью "." на фиг. 26.
Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения вариант полипептида N2 описан с указанием меры процентного сходства аминокислотной последовательности с последовательностями 5>Е0 ГО N0:14, 15, 16, 17, 18 или 19, снова с оговоркой, что вариант полипептида N2 связывает амилоид. Согласно этим вариантам реализации настоящего изобретения полипептид N2 обладает по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью с аминокислотной последовательностью эталонных последовательностей, приведенных в 5>Е0 ГО N0:14, 15, 16, 17, 18 или 19.
Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полипептид N2 описан с указанием меры процентного сходства аминокислотной последовательности с участком N2 в 5>Е0 ГО N0:1, снова с оговоркой, что вариант полипептида N2 связывает амилоид. Согласно этим вариантам реализации настоящего изобретения вариант полипептида N2 обладает по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью аминокислотной последовательности с последовательностью участка N2 в 5>Е0 ГО N0:1.
Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полипептид N2 описан с указанием вторичной или третичной структуры. Известно, что домены Гб-Ш и 1Г1-№ используют гомологичные части их поверхностей для связывания с одним и тем же сайтом на Р-фимбриях в Е.соП. Боген/ е! а1., I Мо1 Вю1. 405:989-1003 (2011), например, на с. 990. Аминокислотные остатки, а также вторичная и тре- 12 029602
тичная структуры, которые опосредуют связывание N2 с Р-фимбриями, также являются посредниками связывания N2 с амилоидом. Таким образом, аминокислотные остатки, а также вторичная и третичная структуры, которые имеют решающее значение для связывания N2 с Р-фимбриями, также имеют большое значение для связывания N2 с амилоидом. Варианты полипептида N2, содержащего аминокислоты, которые необходимы для поддержания вторичной и третичной структур в участке связывания N2 с Рфимбриями, включены в объем настоящего изобретения.
Мутанты и варианты №N2 и полипептида N£N2.
Выравнивание первичной структуры Гб, Γ1 и М13 показано на фиг. 2А, и выравнивание первичной структуры 1ке, 12-2 и ΙΓ1 приведено на фиг. 2В. Используя это выравнивание в качестве руководства, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен полипептид N£N2, мутант полипептида или вариант полипептида, содержащий аминокислоты, которые являются консервативными между Гб, Γ1 и М13 или между Ι2-2, 1бе и ΙΓ1, как указано со ссылкой на последовательности на фиг. 2. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полипептид N£N2 представляет собой мутант или вариант полипептида N£N2, который сохраняет свою способность связываться с амилоидом и имеет аминокислотную последовательность, которая содержит не более 75, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 различий по аминокислотным остаткам при выравнивании с аминокислотной последовательностью любой из 5>ЕС ГО N0:1, 2, 3, 5 или 6.
Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полипептид N£N2, мутант или вариант описан с указанием меры процентного сходства аминокислотной последовательности с участком N£N2 в 8ЕС ГО N0:1, снова с оговоркой, что вариант полипептида N£N2 связывает амилоид. Согласно этим вариантам реализации настоящего изобретения вариант полипептида N£N2 обладает по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью с последовательностями участков N1 и N2 в 8ЕС ГО N0:1.
Гибридные белки.
Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложены гибридные белки. Гибридный белок содержит д3р, амилоидсвязывающий фрагмент д3р, ΤοΙΑ-связывающую молекулу или ингибитор То1А. Гибридные белки, содержащие мутант, или вариант д3р, или фрагменты д3р, полностью включены в область настоящего изобретения. Гибридный белок связан, гибридизован, конъюгирован, соединен или ассоциирован по меньшей мере с одним дополнительным белком или доменом белка, с которым он обычно не связан. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок представляет собой гибридный белок д3р, который содержит белок д3р, связанный со вторым доменом. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок представляет собой амилоидсвязывающий фрагмент белка д3р, связанного со вторым доменом. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок представляет собой гибридный белок N£N2, который содержит домены N1 и N2, но не домен СТ, белка д3р. Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок представляет собой гибридный белок N2, который включает домен N2, но не домены N1 и СТ, белка д3р. Как уже отмечалось, некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к мутированному или модифицированному белку д3р или его амилоидсвязывающим фрагментам, а также к мутированным или модифицированным доменам N£N2 или N2, которые связывают амилоидные волокна. Таким образом, гибридные белки, содержащие эти мутированные или модифицированные формы, также включены в область настоящего изобретения.
Белок д3р или амилоидсвязывающий фрагмент и полипептидный партнер гибридного белка могут представлять собой часть непрерывной аминокислотной последовательности, в которой полипептидный партнер гибридного белка присоединен непосредственно или через короткий пептидный линкер к N концу или С-концу белка д3р или амилоидсвязывающего полипептидного фрагмента. В таких случаях д3р или его амилоидсвязывающий фрагмент и полипептидный партнер гибридного белка могут транслироваться в виде отдельного полипептида с кодирующей последовательности, которая кодирует как д3р, так и его амилоидсвязывающий фрагмент и полипептидный партнер гибридного белка.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит константную область иммуноглобулина в качестве второго домена. Гибридные белки, содержащие константные области иммуноглобулина, связанные с представляющим интерес белком или его фрагментом, были описаны (см., например, патенты США №№ 5480981 и 5808029; Са5сощпе е! а1. 1987, Ргос. №ιΐ1. Асаб. 8с1. И8А 84:2936; Сароп е! а1. 1989, №Циге 337:525; Тгаииескег е! а1. 1989, №Циге 339:68; 2ейте1551 е! а1. 1990, 1)\А Се11 Вю1. И8А 9:347; Вугп е! а1. 1990, ИаШге 344:667; \\а15ои е! а1. 1990, I. Се11. Вю1. 110:2221; \а!5ои е! а1. 1991, ХаПие 349:164; АгиГГо е! а1. 1990, Се11 61:1303; Ьш51еу е! а1. 1991, I. Ехр. Меб. 173:721; Ыи51еу е! а1. 1991, I. Ехр. Меб. 174:561; §!атеикоую е! а1., 1991, Се11 66:1133; А5Ькепа/1 е! а1. 1991, Ргос. Иа!1. Асаб. 8ск И8А 88:10535; Ье551аиег е! а1. 1991, Еиг. I. 1ттипо1. 27:2883; Рерре1 е! а1. 1991, I. Ехр. Меб. 174:1483; Веппе!! е! а1. 1991, I. Вю1. СЬет. 266:23060; КшъсЬиег е! а1. 1992, I. Вю1. СЬет. 267:9354; СЬа1ириу е! а1. 1992, Ргос. №6. Асаб. 8ск И8А 89:10360; Р|бдиау аиб Согтаи, 1991, I.
- 13 029602
Се11. ΒίοΙ. 115, АЬк1гас! Νο. 1448; ΖΗβη§ е! а1. 1995, 1. 1ттип. 154:5590). Эти молекулы обычно обладают как биологической активностью, ассоциированной со связанной молекулой, представляющей интерес, так и эффекторной функцией или какой-либо другой желаемой характеристикой, связанной с константной областью иммуноглобулина (например, биологической стабильностью, клеточной секрецией).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит фрагмент Рс константной области иммуноглобулина. Кассеты экспрессии Рс могут быть приобретены коммерческим путем. Фрагмент Рс может состоять из областей СН2 и СН3 иммуноглобулина и шарнирной области иммуноглобулина. Фрагмент Рс может представлять собой фрагмент Рс 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4. Согласно одному конкретному варианту реализации настоящего изобретения часть константной области иммуноглобулина представляет собой фрагмент Рс 1дС1. Согласно другому варианту часть константной области иммуноглобулина представляет собой фрагмент Рс 1дС4. Согласно еще одному варианту часть константной области иммуноглобулина представляет собой фрагмент Рс 1дМ.
Таким образом, в одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный растворимый белок §3р или его амилоидсвязывающий фрагмент гибридизуют с доменом Рс иммуноглобулина с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Рекомбинантный растворимый белок §3р или его амилоидсвязывающий фрагмент может быть мутирован или модифицирован. Например, амилоидсвязывающий фрагмент белка д3р, такой как домен Ν1Ν2 или домен N2, может быть клонирован в вектор экспрессии гибридного белка 1дСРс. Типичные векторы экспрессии гибридного белка 1дСРс включают, например, один из векторов рРИ8Е-Рс, доступных от 1пу1уоСеп. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полученный двухвалентный (например, д3рЩШ2)-1дОРс или д3рЩ2)-1дОРс) гибридный белок будет иметь более высокую авидность в отношении связывания амилоида, чем рекомбинантный растворимый белок §3р, поскольку он является двухвалентным.
Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит белок, не включающий область Рс, который связан с д3р или амилоидсвязывающим фрагментом §3р.
Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит по меньшей мере два полипептида д3р или его амилоидсвязывающих фрагмента. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит три или более полипептида д3р или его амилоидсвязывающих фрагмента. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит пять полипептидов §3р или его амилоидсвязывающих фрагментов. Такие димерные и мультимерные гибридные белки обеспечивают более высокую авидность взаимодействий, поскольку они включают более одного д3р или его амилоидсвязывающего фрагмента.
В других вариантах реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит альбумин (см., например, патент США № 6686179, автор Р1еег е! а1).
Во всех случаях §3р или амилоидсвязывающий фрагмент §3р в гибридном белке включает его мутанты и варианты.
В целом, гибридные белки связываются с амилоидом по меньшей мере так же эффективно, как и соответствующий несвязанный §3р или фрагмент §3р. Когда это применимо, гибридные белки, по меньшей мере, столь же эффективно вызывают дезагрегацию амилоида, усиливают клиренс амилоида, ингибируют агрегацию амилоида и/или удаляют или предотвращают образование токсичных олигомеров, как и соответствующий несвязанный §3р или его фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок связывает амилоид и, по меньшей мере, столь же эффективно вызывает дезагрегацию амилоида, усиливает клиренс амилоида, ингибирует агрегацию амилоида и/или удаляет или предотвращает образование токсичных олигомеров, как и рекомбинантный растворимый д3р, включающий 8ЕО ГО N0:1. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок связывает амилоид и, по меньшей мере, столь же эффективно вызывает дезагрегацию амилоида, усиливает клиренс амилоида, ингибирует агрегацию амилоида и/или удаляет или предотвращает образование токсичных олигомеров, как и фаг М13. Согласно другим вариантам реализации гибридный белок связывает амилоид и более эффективно вызывает дезагрегацию амилоида, усиливает клиренс амилоида, ингибирует агрегацию амилоида и/или удаляет или предотвращает образование токсичных олигомеров, чем фаг М13. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок связывает амилоид и, по меньшей мере, столь же эффективно снижает уровень амилоида при заболеваниях, связанных с нарушением сворачивания белка, как и фаг М13. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок связывает амилоид и является более эффективным в снижении уровня амилоида при заболеваниях, связанных с нарушением сворачивания белка, чем фаг М13. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок связывает амилоид и является, по меньшей мере, столь же или более эффективным в предотвращении образования амилоида по сравнению с фагом М13.
Гибридные белки могут быть синтезированы с использованием методик, хорошо известных в данной области техники. Например, гибридные белки согласно настоящему изобретению могут быть синтезированы в клетках, используя рекомбинантные методики (см., например, 8атЬгоок е! а1. 1989, Мо1еси1аг С1отпд А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬога!огу, Ν.Υ. и АикиЬе1 е! а1. 1989, Сиггеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Сгеепе РиЬйкЫпд Ак8оаа!е8 апб \УПеу Шегкаепсе, Ν.Υ.). В другом варианте гибрид- 14 029602
ные белки согласно настоящему изобретению могут быть синтезированы с использованием известных методов синтеза, таких как твердофазный синтез.
Методики синтеза хорошо известны в данной области техники (см., например, МегпЛе1й, 1973, СНетюа1 Ро1урерййе8, (КаЮуапшз апй Рапауойз ейз.) рр. 335-61; МегпЛе1й 1963, 1. Ат. СНет. 8ос. 85:2149; Ωηνίδ е! а1. 1985, ВюсНет. 1пИ. 10:394; Опп е! а1. 1976, ТНе РгоЮпъ (3й ей.) 2:105; Епкзоп е! а1. 1976, ТНе Рго!еш8 (3й ей.) 2:257; патент США № 3941763). Согласно другому варианту готовая конструкция может обладать, по существу, той же самой функцией, что и гибридный белок, полученный с помощью рекомбинантных методик, однако конструкция может быть получена с использованием нерекомбинантных методик, таких как химическое лигирование. Компоненты гибридных белков могут быть получены с использованием той же общей методологии, которая описана для экспрессии д3р и мутаций д3р.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения д3р или его амилоидсвязывающий фрагмент (или его мутантная форма, или вариант) могут быть гибридизованы с маркерной последовательностью, такой как пептид, который облегчает очистку гибридного полипептида (по отдельности или в дополнение к гибридизации с другим белком или включением молекулы-носителя). Маркерная аминокислотная последовательность может представлять собой гексагистидиновый пептид, такой как метка, предоставленная в векторе рОЕ (^адеп, Миссиссага, Онтарио, Канада), помимо прочих, многие из которых коммерчески доступны. Как описано в работе СепР е! а1., Ргос. Νηΐ1. Асай. 8сг (1989) 86:821-824, например, гексагистидин обеспечивает удобную очистку гибридного белка. Другая пептидная метка, которую можно применять для очистки, представляет собой гемагглютининовую метку (НА), которая соответствует эпитопу, полученному из белка НА вируса гриппа (Айзоп е! а1., (1984) Се11 37:767).
Фаги, гиперэкспрессирующие д3р.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен бактериофаг, модифицированный для увеличения количества копий д3р, экспрессируемых фагом, более чем до 3-5 копий, обычно обнаруживаемых в нитевидных бактериофагах дикого типа. Согласно одному варианту фаги, которые экспрессируют повышенное количество д3р, могут быть выбраны из природных вариантов. Согласно другому варианту для увеличения количества копий д3р используют рекомбинантные методики.
Согласно некоторым вариантам последовательность дикого типа, кодирующую д3р или амилоидсвязывающий фрагмент д3р (включая его мутанты или варианты), можно применять для замены одного из генов, кодирующих другой белок оболочки бактериофага. В зависимости от того, какой ген бактериофага был заменен, количество копий д3р может быть увеличено до 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 500, 1000 или даже почти 3000 копий (например, если последовательность, кодирующую ген 3, использовали, чтобы заменить последовательность, кодирующую ген 8, или гибридизовали с концом последовательности, кодирующей ген 8).
Для получения фага, экспрессирующего дополнительные копии д3р, последовательность, кодирующую д3р (или его мутантную форму, или вариант), клонируют как описано в другой части настоящего описания. Последовательность, кодирующую д3р (или его мутантную форму или вариант), можно затем применять для замены другого гена фага и экспрессировать в случае необходимости совместно со вспомогательным фагом.
Кроме того, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения последовательность, кодирующую д3р (или его мутантную форму, или вариант), гибридизуют с сохранением рамки считывания с кодирующей последовательностью другого гена фага с промежуточной спейсерной последовательностью либо без нее. Способы получения фаговых протеинов, с которыми гибридизуют другой белок или пептид, хорошо известны для методик фагового дисплея, и д3р или его амилоидсвязывающий фрагмент могут быть "экспрессированы" таким же образом, как, например, антигены или цепи антител (например, 8со!! апй 8тНН, 8с1епсе (1990) 249:386-90; ЭсуЮ е! а1., 8с1епсе (1990) 249:404-06). Когда желательна только экспрессия фрагмента д3р, кодирующая последовательность для фрагмента (или мутантной формы, или варианта) может быть соединена с другим геном так, что одна из природных 8ег/С1у линкерных последовательностей, присутствующих в д3р, служит в качестве линкера. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения только кодирующую последовательность доменов Ν2 или Ν1Ν2 (или мутантной формы, или варианта) гибридизуют с сохранением рамки считывания с другим геном.
Мутантный д3р и его амилоидсвязывающие фрагменты.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены мутантные белки д3р и их мутантные амилоидсвязывающие фрагменты. Гибридные белки и фаги, содержащие мутантные белки д3р и их амилоидсвязывающие фрагменты, также включены в область настоящего изобретения. Мутантный д3р и его мутантные амилоидсвязывающие фрагменты могут быть получены или выбраны исходя из свойств, которые способствуют терапевтической эффективности фармацевтических композиций, описанных в настоящей заявке. Например, д3р или его амилоидсвязывающие фрагменты могут быть мутированы с помощью рекомбинантных методик или выбраны иным образом так, чтобы обладать одним или более из следующих свойств по отношению к д3р фага М13: повышенной аффинностью связывания амилоида, сниженной Тпл шарнирной области, повышенной авидностью (авидность отличается от аффинности тем, что авидность используют для описания кооперативного доступного связывания амилоида, где д3р со- 15 029602
держит более одного сайта связывания амилоида), повышенной способностью дезагрегировать амилоидные агрегаты или повышенной способностью предотвращать агрегацию амилоидных фибрилл. Альтернативно или дополнительно мутантный §3р или его мутантные амилоидсвязывающие фрагменты могут обладать другими подходящими свойствами, описанными в других частях настоящей заявки.
Мутантные белки §3р могут быть получены путем мутагенеза фага или с помощью рекомбинантных методик, таких как сайт-направленный мутагенез на основе ПЦР или случайный мутагенез.
В некоторых вариантах мутантов с высокой аффинностью получают путем мутагенеза М13 и затем отбора клонов фага методом аффинной хроматографии на колонке для выделения амилоидсвязывающих белков в сочетании со строгими условиями промывки. Последовательные раунды связывания, промывки, элюирования, а затем размножения выбранного фага обеспечивают обогащение популяции клонами фага с высокой аффинностью связывания с амилоидом. После того как повышение аффинности популяции фага было достигнуто методом пэннинга с использованием амилоида, выбирают и исследуют индивидуальные клоны с высокой аффинностью. Используя этот способ можно выбрать мутанты фага с высокой аффинностью связывания после случайного мутагенеза.
Белок §3р или любые его амилоидсвязывающие фрагменты (например, домены №N2 или домен N2) можно также подвергать мутагенезу с использованием рекомбинантных методик. Например, вектор, как описано в настоящей заявке, несущий §3р или его амилоидсвязывающий фрагмент (например, №N2 или N2), можно мутировать с использованием стратегии мутагенеза на основе ПЦР. Кодируемый мутированный белок затем экспрессируют и оценивают связывание амилоида и аффинность мутантов, как описано.
Мутантные амилоидсвязывающие фрагменты §3р также могут быть получены из мутанта д3р. Например, путем мутирования §3р и/или выбора мутированного д3р с желаемыми свойствами, а затем получения из него желаемого амилоидсвязывающего фрагмента, например, методом протеолиза с последующей очисткой.
Скрининг фагов, несущих мутантный §3р, с целью выявления повышенной аффинности связывания амилоида, изменения температурной чувствительности связывания и т.д. можно использовать, чтобы идентифицировать фаги для дальнейшей характеристики §3р этих фагов. Для скрининга таких свойств, как температурная чувствительность связывания, можно использовать аффинную хроматографию на колонке для выявления амилоидсвязывающих белков с одной или несколькими стадиями связывания, промывки или элюирования, проведенных термочувствительным способом.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мутантный §3р или амилоидсвязывающий фрагмент §3р связывает амилоид с аффинностью, которая по меньшей мере в 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 или даже 1000 раз выше по сравнению с аффинностью связывания соответствующего немутированного д3р или фрагмента д3р из М13. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения мутантный §3р или амилоидсвязывающий фрагмент §3р сохраняет способность к связыванию амилоида, причем сила связывания составляет по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% от силы связывания соответствующего немутированного д3р или амилоидсвязывающего фрагмента д3р из М13. Согласно некоторым вариантам мутантный §3р или его амилоидсвязывающий фрагмент, который демонстрирует более низкую аффинность связывания амилоида, чем соответствующая немутированная форма, также обладает другим желаемым биологическим (например, большей способностью дезагрегировать амилоид; большей способностью предотвращать агрегацию амилоидных фибрилл) или фармацевтическим (например, большей метаболической стабильностью, благоприятным фармакокинетическим профилем, большей растворимостью) свойством, которое улучшается по сравнению с соответствующей немутированной формой. Связывание амилоида можно оценить с помощью поверхностного плазмонного резонанса или конкурентного ИФА, как описано в примерах.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты и/или мутанты §3р можно идентифицировать путем скрининга библиотеки ДНК с помощью гибридизации с д3р из М13, чтобы выбрать связанные ДНК, которые гибридизуются с д3р М13 в очень строгих или умеренных условиях.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мутантный §3р представляет собой полученный с помощью рекомбинантных методик §3р или его амилоидсвязывающий фрагмент, который отличается от зрелого белка д3р М13 (8ЕЦ ГО N0:1) по меньшей мере на один аминокислотный остаток, но все еще связывает амилоид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отдельные точечные мутации обозначены путем указания аминокислоты §3р М13 в определенном остатке зрелого белка и замены аминокислоты в этом остатке. Например, "Ρ194Α" означает, что фенилаланин в положении 194 последовательности зрелого М13 был заменен на аланин. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения мутантный §3р описан с указанием меры процентного сходства аминокислотной последовательности с 8ЕЦ ГО N0:1, снова с оговоркой, что мутантный §3р связывает амилоидные фибриллы. Согласно этим вариантам мутантный §3р обладает по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%,
- 16 029602
по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по всей длине последовательности 8ЕО ГО N0:1. В вариантах, включающих мутированный амилоидсвязывающий фрагмент §3р, мутантный амилоидсвязывающий фрагмент обладает по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по всей длине соответствующего фрагмента 8Е0 ГО N0:1.
С практической точки зрения удобно определить, является ли какой-либо конкретный полипептид по меньшей мере на 70, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичным последовательности 8Е0 ГО N0:1, можно с помощью известных компьютерных программ, таких как программа Вс51П1. При использовании ВеШЬ или другой программы для выравнивания последовательностей, чтобы определить, является ли конкретная последовательность, например, на 95% идентичной эталонной последовательности в соответствии с настоящим изобретением, параметры устанавливают так, что процент идентичности вычисляется по всей длине части эталонной аминокислотной последовательности, которая гомологична интересующей последовательности.
В некоторых вариантах различных аспектов мутантный §3р и его амилоидсвязывающие фрагменты не содержат мутации в аминокислотном остатке, который является консервативным среди §3р семейства РЕ, Ι-семейства или обоих РЕ- и Ι-семейств. Согласно другим вариантам мутантный §3р и его амилоидсвязывающие фрагменты содержат в большинстве мутаций 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных остатков, которые являются консервативными среди §3р семейства ЕЕ, Ι-семейства или обоих РЕ- и Iсемейств. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения мутантный §3р и его амилоидсвязывающие фрагменты содержат в большинстве мутаций 0, 1, 2, 3, 4, 5, 8, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных остатков, которые не являются консервативными среди §3р семейства РЕ, Ι-семейства или обоих РЕ- и Ι-семейств. Согласно еще одному варианту мутантный §3р и его амилоидсвязывающие фрагменты содержат в большинстве мутаций 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных остатков, которые не являются консервативными между одним или более из Ι22, Же и ЕЕ1. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения мутантный §3р и его амилоидсвязывающие фрагменты содержат в большинстве мутаций 1, 2, 3, 4, 5, 8, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных остатков, которые не являются консервативными среди §3р семейства РЕ, Ι-семейства или обоих РЕ- и Ι-семейств. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения не более 1, 2, 3, 4, 5, 8, 7, 8, 9 или 10 мутаций расположены в пределах домена N1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения не более 1, 2, 3, 4, 5, 8, 7, 8, 9 или 10 мутаций расположены в пределах домена N2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мутаций расположены в пределах домена N2 и не входят в шарнирную область.
Сайт-направленный мутагенез может быть нацелен на остатки, которые, как известно, имеют важное значение для стабильности §3р, ШШ или домена N2. Например, ранее было показано, что мутации, связанные с заменой на аланин в Ό94 и Т95; Е115; N122; Ь125; Е126 и Е127; Е127 и Е128; Р129; Р145; Т154 и Т156; Р157; Т159 и Ό160; К163 и Т164; Υ166; и Е196 и Ό197, не оказывают существенного влияния на связывание фага с Р-фимбриями ГОепд апб РегЬат, 2002). Соответственно эти положения являются толерантными в отношении мутаций, и мутации в одном или более из этих положений могут усилить или иметь нейтральный эффект на способность к связыванию амилоида белка д3р и амилоидсвязывающих фрагментов §3р согласно настоящему изобретению. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение включает §3р или амилоидсвязывающий фрагмент §3р, которые мутированы в одном или более Ό94, Т95, Е1 15, N122, Ь125, Е126, Е127, Е128, р129, Р145, Т154, Т156, Р157, Т159, Ό160, К163, Т164, Υ166, Е198 или Ό197 (по отношению к 8Е0 ГО N0:1). Согласно некоторым вариантам мутация в одном или более положений из Ό94, Т95, Е115, N122, Ь125, Е126, Е127, Е128, Р129, Ш45, Т154, Т156, Р157, Т159, Ό160, К163, Т164, Υ166, Е196 или Ό197 не является исключительно мутационной заменой на аланин.
Ранее было показано, что мутационные замены на аланин в положениях Р194; Р190 и Н191; К184, К186 и Ό187; К142 и К144 уменьшают связывание с Р-фимбриями ГОепд апб РегЬат, 2002). Соответственно согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мутацию выбирают из мутации, которая не включает один или более из следующих остатков: К142, К144, ^181, К184, К188, Ό187, Р190, Н191 или Р194 (нумерация относительно 8Е0 ГО N0:1). Однако замена К142, К144, ^181, К184, К188, Ό187, Р190, Н191 или Р194 на любой остаток, исключая аланин, может увеличить связывание амилоида. Таким образом, в одном варианте реализации настоящего изобретения мутация не является мутационной заменой на аланин в одном или более из К142, К144, ^181, К184, К186, Ό187, Р190, Н191 или Р194. В одном варианте мутация не является мутационной заменой на аланин в Р194. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения мутация не является мутационной заменой на аланин в Р190 и Н191. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения мутация не является мутационной заменой на аланин в К184, К186 и Ό187. Согласно другому варианту мутация не является мута- 17 029602
ционной заменой на аланин в ν181. Согласно другому варианту мутация не является мутационной заменой на аланин в Ρ142 и Ρ144. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мутация включает, но не ограничивается ими, одну, несколько или все из Τ13Ι, Τ101Ι, Ο129Η. Ο153Ό, ν181Α, Ρ190Α, Ρ194Α и Ό209Υ.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мутация присутствует в одном или более остатков, расположенных на поверхности домена Ν2, представляющего собой часть §3р, которая связывается с Р-фимбриями. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения мутация присутствует в одном или более остатков, расположенных на внешнем крае домена Ν2. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения мутация присутствует в одном или более остатков, расположенных на поверхности домена Ν1, который представляет собой часть §3р, связывающую Το1Α. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения мутация присутствует в одном или более остатков, расположенных на внешнем крае домена Ν1. Согласно другому варианту мутация присутствует в одном или более остатков §3р, доступных для растворителя. Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения мутация(и) смещает цис/транс равновесие в Рго213 более чем до 50, 60, 70, 80, 90 или 95% транс-конформации. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения §3р представляет собой мутированный §3р с цис/транс равновесием в остатке Рго213, который по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% находится в трансконформации.
Согласно некоторым вариантам мутантный §3р или его амилоидсвязывающий фрагмент не содержат мутаций в структурно консервативных остатках. Примеры структурно консервативных остатков включают остатки, которые несмотря на потенциальные вставки последовательностей участвуют в обеспечении доменной структуры у членов Ρί- и Ι-семейств.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любая внесенная мутация сохраняет связывание амилоида. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения мутация не замещает остаток пролина.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любая внесенная мутация сохраняет связывание амилоида и не замещает остаток цистеина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мутация сохраняет все: по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три или все четыре дисульфидных мостика, обнаруженных в §3р. Таким образом, в одном варианте реализации настоящего изобретения любая мутация сохраняет два дисульфидных мостика в Ν1 между Сук7 и Сук38 и между Сук46 и Сук53. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения любая мутация сохраняет любой, но не оба, из дисульфидных мостиков в Ν1 между Сук7 и Сук36 и между Сук46 и Сук53. Согласно одному варианту дисульфидный мостик между Сук188 и Сук201 сохраняется. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый из дисульфидных мостиков между Сук7 и Сук36, Сук46 и Сук53 и Сук188 и Сук201 сохраняется. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения мутации сохраняют дисульфидный мостик между Сук354 и Сук371. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мутации сохраняют дисульфидные мостики между Сук7 и Сук36, Сук46 и Сук53, Сук188 и Сук201 и Сук354 и Сук371.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любая внесенная мутация сохраняет связывание амилоида и снижает температуру плавления (Тпл) Ν1Ν2. Величина Тпл может быть измерена с помощью любого из способов, описанных в примерах. Мутанты, которые уменьшают Тпл Ν1Ν2, как ожидается, обладают лучшей аффинностью связывания с бета-амилоидом, ингибируют сборку бета-амилоида в большей степени и являются, по меньшей мере, столь же эффективными в исследованиях дезагрегации, как и §3р М13. Соответственно такие мутанты, а также гибридные белки и фаги, содержащие такие мутанты, как ожидается, являются, по меньшей мере, столь же эффективными терапевтически, как и соответствующие последовательности в М13, гибридные белки и интактный М13 соответственно для лечения одного или более заболеваний, связанных с нарушением сворачивания белков.
Мутанты также могут быть предназначены для включения нацеливающей последовательности. Такие нацеливающие последовательности могут быть вставлены в гибкие линкерные участки между Ν1Ν2 или между Ν2 и другим доменом в гибридном белке Ν2. Нацеливающие последовательности ядерной локализации (ΝΣδ) могут быть полезными при болезни Хантингтона. Нацеливание на эндосомы может быть полезным при болезни Паркинсона.
Помимо нацеливания на конкретные регионы в клетке, нацеленные последовательности можно применять для нацеливания на различные виды амилоида. Нуклеирующие последовательности могут увеличивать аффинность и направить мутантный белок к определенному виду амилоида. Могут быть получены другие мутанты, включающие пептидные последовательности, которые настолько гидрофобны, что они выпадают в осадок самостоятельно. Например, множественные ΑνΑΙ последовательности могут быть добавлены к §3р и/или его амилоидсвязывающим фрагментам (например, Ν2 и Ν1Ν2) и/или их гибридным белкам, чтобы получить химерные белки, которые имеют улучшенные, множественные связывающие последовательности. Некоторые примеры пептидов, которые связывают амилоид и могут быть включены в мутантные или химерные белки, содержащие д3р, Ν2 и Ν1Ν2 и/или их гибридные белки, представляют собой пептидные ингибиторы на основе каркаса ΟχΡχΟχΡ (5>ЕО ΙΌ ΝΟ:21), описанного
- 18 029602
в работе 8а!о, В1осЬет181гу (2006) 45:5503-16, и пептида КЬУРР (8Е0 ГО ΝΟ:22), описанного в работе Т)егпЬег§ е! а1., 1. ΒίοΙ. СЬет. (1996) 271:8545-48. Другие нацеливающие фрагменты известны в области техники и также могут применяться в настоящем изобретении (см., например, 8с1аггеЬа е! а1., Ме1ЬоЙ8 ίη Еп/уто1оду (2006) 413:273-312).
Носители и переносчики амилоидсвязывающего дисплея.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения §3ρ и его амилоидсвязывающие фрагменты (включая мутанты и варианты любого из вышеперечисленных), включая, но не ограничиваясь ими, домены Ν1Ν2 и домен Ν2, а также молекулы, полипептиды и гибридные белки, которые содержат их, можно комбинировать с другими органическими или даже неорганическими носителями, обеспечивающими молекулярные каркасы, которые сохраняют способность связывать амилоид, но обеспечивают дополнительные возможности.
Согласно некоторым вариантам §3ρ, или его амилоидсвязывающий фрагмент, или гибридный белок §3ρ и носитель ковалентно связаны с помощью нерекомбинантных способов, таких как, например, химическая связь, отличная от пептидной связи. Может быть использован любой подходящий химический сшивающий агент. Также могут быть использованы любые известные способы ковалентного связывания полипептидов с другими молекулами (например, носителями). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения §3ρ, или его амилоидсвязывающий фрагмент, или гибридный белок §3ρ и носитель могут быть гибридизованы с помощью линкера, который состоит по меньшей мере из одной аминокислоты или химического остатка.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения §3ρ, или его амилоидсвязывающий фрагмент, или гибридный белок §3ρ и носитель нековалентно связаны между собой. Согласно некоторым таким вариантам они могут быть связаны, например, с использованием связывающихся пар. Типичные связывающиеся пары включают, но не ограничиваются ими, биотин и авидин или стрептавидин, антитело и антиген и т.д.
Примеры носителей включают, но не ограничиваются указанными, вирусные частицы (включая фаг, см. ниже), в которых белок §3ρ или его амилоидсвязывающий фрагмент, не являющийся нативным для вируса, включен как часть вирусной структуры; полимеры независимо от того, являются они натуральными, синтетическими или смешанными; структуры с полимерным покрытием, такие как гранулы (включая гранулы с модифицированной поверхностью); полиаминокислоты, нуклеиновые кислоты и липосомы. Носитель может быть связан прямо или косвенно с §3ρ или его амилоидсвязывающим фрагментом. В зависимости от носителя промежуточные связи могут быть использованы, чтобы обеспечить соответствующий промежуток между носителем и амилоидсвязывающим доменом.
Полиаминокислота может представлять собой белок-носитель. Такие полиаминокислоты могут быть выбраны из сывороточного альбумина (например, СΑЧ), дополнительного антитела или его фрагмента, например области Рс, фетуина Α, фетуина В, ядерного фактора эритроидного происхождения с лейциновой молнией 2 (ΝΡΕ2), нейроретильной лейциновой молнии, тетранектина или других полиаминокислот, например полилизина. Полиаминокислоты могут прикрепляться на Ν-конце, или С-конце, или в других местах между ними, также они могут быть присоединены с помощью химического линкера к §3ρ или его амилоидсвязывающему фрагменту.
Согласно некоторым вариантам носители включают молекулы с доменами олигомеризации. Олигомеризация обеспечивает функциональные преимущества, если одной из функций белка или его фрагмента является связывание, включая поливалентность, увеличение прочности связывания и комбинированную функцию разных доменов. Эти отличительные черты наблюдаются в природных белках, а также могут быть введены методами белковой инженерии. Соответственно в изобретении также предложены §3ρ и его амилоидсвязывающие фрагменты (включая мутанты и варианты), такие как домены Ν1Ν2 и домен Ν2, содержащие домен олигомеризации, например домен димеризации. Подходящие домены олигомеризации включают биспиральные домены, включая альфа-биспиральные домены; коллагеновые домены; коллагенподобные домены и домены димерных иммуноглобулинов. Подходящие биспиральные полипептидные партнеры для гибридных белков согласно настоящему изобретению включают биспиральный домен тетранектина, биспиральный домен олигомерной белковой матрицы хряща; биспиральные домены ангиопоэтина и домены лейциновой молнии. При применении коллагена или коллагенподобных доменов олигомеризации они могут содержать, например, те, которые обнаруживают в коллагенах, связывающих маннозу лектине, белках Α и Ό легочного сурфактанта, адипонектине, фиколине, конглютинине, рецепторе связывания макрофагов и эмилине. Хотя некоторые из этих доменов могут быть включены в виде гибридных белков, во многих вариантах они нерекомбинантно связаны с §3ρ, доменом Ν1Ν2, доменом Ν2 или другими амилоидсвязывающими фрагментами, например, через ковалентные связи.
Кроме того, в настоящем изобретении предложены §3ρ, или его амилоидсвязывающие фрагменты, или гибридные белки §3ρ, связанные с полимером. Полимеры, применяемые согласно настоящему изобретению, будут фармацевтически приемлемыми для приготовления терапевтического продукта или композиции.
Полимеры, как правило, прикреплены к §3ρ или его амилоид связывающему фрагменту с учетом
- 19 029602
влияния на функциональные или антигенные домены полипептида. В целом, химическая дериватизация может быть выполнена в любом подходящем условии, применяемом для проведения реакции белка с активированной полимерной молекулой.
Активирующие группы, которые можно использовать для связи полимера с активными остатками, включают сульфон, малеимид, сульфгидрил, тиол, трифлат, трезилат, азидрин, оксиран и 5-пиридил.
Подходящие клинически приемлемые водорастворимые полимеры включают, но не ограничиваются указанными, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полиэтиленгликоль пропиональдегид, сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, монометоксиполиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт (ПВС), поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, этилен/малеиновый ангидрид, поли-ф-аминокислоты) (либо гомополимеры или статистические сополимеры), поли-(н-винилпирролидон) полиэтиленгликоль, гомополимеры полипропиленгликоля (ППГ) и другие оксиды полиалкиленов, сополимеры оксида полипропилена/оксида этилена, полиоксиэтилированные полиолы (РОС) (например, глицерин) и другие полиоксиэтилированные полиолы, полиоксиэтилированный сорбит или полиоксиэтилированную глюкозу, кислоты толстого кишечника или другие углеводные полимеры, фиколл или декстран и их смеси.
Остатки ПЭГ согласно настоящему изобретению могут представлять собой разветвленные или линейные полимеры. Согласно одному варианту реализации настоящее изобретение предусматривает химически модифицированный полипептид, который включает моно- или поли- (например, 2-4) остатки ПЭГ. Пегилирование может быть осуществлено с помощью любой из реакций пегилирования, известных в данной области техники. Способы получения пегилированного белкового продукта, как правило, известны в данной области техники. Оптимальные условия реакции будут определяться на индивидуальной основе в зависимости от известных параметров и желаемого результата.
Существует ряд способов присоединения ПЭГ, доступных специалистам в данной области техники, например, патент ЕР 0401384; Майк е! а1., Ехр. Нета!о1., (1992) 20:1028-1035; Ргаис18, Росик оп Сго\\Й1 РасЮгв, 3:4-10 (1992); ЕР 0154316; ЕР 0401384; \\'О 92/16221; \\'О 95/34326 и другие публикации, процитированные в настоящей заявке, которые относятся к пегилированию.
При пегилировании д3р, домена Ν1Ν2, домена N2 или другого амилоидсвязывающего фрагмента (а также их мутантов, вариантов и соединений, полипептидов и гибридных белков, содержащих любой из вышеуказанных) ПЭГ может быть присоединен путем химической дериватизации д3р, домена Ν1Ν2, домена Ν2 или другого амилоидсвязывающего фрагмента. Согласно другим вариантам аминокислотный остаток, подходящий для модификации молекулой ПЭГ, может быть введен рекомбинантно в д3р, домен Ν1Ν2, домен Ν2 или другой амилоидсвязывающий фрагмент.
Пегилирование может быть выполнено с помощью реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционоспособной молекулой полиэтиленгликоля. Таким образом, белковые продукты согласно настоящему изобретению включают пегилированные белки, в которых группы ПЭГ присоединены через ацильные или алкильные группы. Такие продукты могут быть монопегилированы или полипегилированы (например, те, которые содержат 2-6 или 2-5 групп ПЭГ). Примером подходящего активированного эфира ПЭГ является ПЭГ, этерифицированный с образованием Ν-гидроксисукцинимида (ΝΗδ).
Пегилирование путем алкилирования обычно включает взаимодействие концевого альдегидного производного ПЭГ с полипептидом в присутствии восстанавливающего агента. Для реакции восстановительного алкилирования выбранный полимер(ы) должен иметь одну реакционоспособную альдегидную группу. Примером реакционоспособного ПЭГ-альдегида является полиэтиленгликоль - пропионовый альдегид, который стабилен в воде, или его моно С1-С10 алкокси- или арилоксипроизводные (см., например, патент США № 5252714).
Согласно некоторым вариантам д3р домен Ν1Ν2, домен Ν2 или другой амилоидсвязывающий фрагмент экспрессируют как часть фага, и д3р, домен Ν1Ν2, домен Ν2 или другой амилоидсвязывающий фрагмент получают путем выделения его из частицы фага. В целом, однако, для получения д3р, амилоидсвязывающего фрагмента д3р (включая мутанты и варианты) используют рекомбинантные методики. В целом, полученный белок выделяют перед комбинированием с носителем.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения носителем дисплея является фаг. Согласно этим вариантам ген, кодирующий белок д3р, домен Ν1Ν2, домен Ν2 и другой амилоидсвязывающий фрагмент (включая мутанты и варианты вышеупомянутых) вводят в геном бактериофага и экспрессируют в виде части фага. Например, в одном варианте мутантный белок д3р с более высокой аффинностью связывания амилоида, чем у д3р из фага М13, применяют для замены д3р дикого типа из фага М13. Полученный фаг, таким образом, также имеет улучшенную способность к связыванию амилоида по сравнению с М13 дикого типа. Однако любой из описанных д3р или амилоидсвязывающих фрагментов может быть включен в фаг. В этих вариантах ген 3 дикого типа может быть полностью заменен на д3р согласно настоящему изобретению. В другом варианте, как обсуждалось для фага с увеличенным числом копий д3р, рекомбинантная молекула может быть гибридизована с геном, кодирующим белок оболочки фага (включая д3р дикого типа) и экспрессирована на фаге способом, аналогичным таковому для антигена и цепей антитела в библиотеках фагового дисплея. Любой нитевидный бактериофаг может быть модифицирован, чтобы экспрессировать д3р согласно настоящему изобретению, включая, но
- 20 029602
не ограничиваясь ими, М13, Гй, Г1, Ι22, 1ке или НТ. Согласно некоторым вариантам реализации вспомогательный фаг может применяться в комбинации с модифицированным фагом.
Рекомбинантные методики.
В целом, ДНК, кодирующую белок §3р или его амилоидсвязывающий фрагмент (включая его мутанты, варианты и соединения, полипептиды и гибридные белки, содержащие любой из вышеупомянутых), получают с использованием обычных методов рекомбинантных ДНК, таких как клонирование гена д3р, прямой синтез ДНК или путем выделения соответствующей ДНК из библиотеки с использованием, например, последовательности М13 в качестве зонда (см., например, ЗатЬгоок е! а1. 1989, Мо1еси1аг С1отпд А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1й Зрппд НагЬог ЬаЬога!огу, Ν.Υ. и АикиЬе1 е! а1. 1989, Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1о§у, Огеепе РиЬНкЫпд Аккоаакк апй \\Пеу Шегкаепсе, Ν.Υ.).
Для получения с помощью рекомбинантных методик последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую д3р или его амилоидсвязывающий фрагмент, вставляют в соответствующий вектор экспрессии, который содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции встроенной кодирующей последовательности, или в случае РНК-содержащего вирусного вектора необходимые элементы для репликации и трансляции. Кодирующую нуклеиновую кислоту вставляют в вектор в правильной рамке считывания.
Соответственно в настоящем изобретении предложены векторы, содержащие полинуклеотиды, которые кодируют §3р или его амилоидсвязывающий фрагмент (включая мутанты и варианты). В настоящем изобретении также предложены векторы, содержащие полинуклеотиды, которые кодируют §3р или гибридную молекулу д3р. Такие векторы включают, но не ограничиваются ими, ДНК-векторы, фаговые векторы, вирусные векторы, ретровирусные векторы и т.д.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выбирают вектор, который оптимизирован для экспрессии полипептидов в клетках линии СНО или клетках, полученных из линии СНО. Примеры таких векторов описаны, например, в работе Киптпд Иеег е! а1., Вю!есЬпо1. Ргод. (2004) 20:880-889.
Согласно некоторым вариантам вектор выбирают для экспрессии §3р, его амилоидсвязывающего фрагмента и/или гибридных молекул д3р в условиях ш νίνο у животных, включая человека. В некоторых таких вариантах реализации настоящего изобретения экспрессия полипептида находится под контролем промотора, который функционирует тканеспецифическим образом.
Векторы экспрессии трансфецируют или совместно трансфецируют в подходящую целевую клетку, которая будет экспрессировать полипептиды. Неограничивающие примеры способов трансфекции описаны, например, в 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1отпд, А ЬаЬога!огу Мапиа1, 3гй ей. Со1й Зрппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк (2001). Нуклеиновые кислоты могут быть временно или стабильно трансфецированы в желаемых клетках-хозяевах в соответствии со способами, известными в данной области техники. Разнообразные векторные системы экспрессии в хозяевах могут быть использованы для экспрессии белков, описанных в настоящей заявке, включая прокариотические и эукариотические клетки. Они включают, но не ограничиваются указанными, микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е.соП), трансформированные рекомбинантной ДНК бактериофага или ДНК плазмидных векторов экспрессии, содержащих соответствующую кодирующую последовательность; дрожжи или нитчатые грибы, трансформированные рекомбинантными дрожжевыми или грибковыми векторами экспрессии, содержащими соответствующую кодирующую последовательность; клеточные системы насекомых, инфицированные рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, бакуловирусом), содержащими соответствующую кодирующую последовательность; клеточные системы растений, инфицированные рекомбинантным вирусным вектором экспрессии (например, вирусом мозаики цветной капусты или вирусом табачной мозаики) или трансформированные рекомбинантными плазмидными векторами экспрессии (например, Τί плазмида), содержащими соответствующую кодирующую последовательность; или клеточные системы животных, включая клетки млекопитающих (например, клетки линий СНО, СО8, НеЬа). Белки также могут быть получены с помощью рекомбинантных методик из ряски (см., например, патент США № 8022270).
Векторы, применяемые для трансформации, как правило, содержат селектируемый маркер, используемый для идентификации трансформантов. В бактериальных системах это может быть ген устойчивости к антибиотику, такому как ампициллин или канамицин. Селектируемые маркеры для использования в культивируемых клетках млекопитающих включают гены, которые придают устойчивость к лекарствам, таким как неомицин, гигромицин и метотрексат. Селектируемый маркер может быть амплифицируемым селектируемым маркером. Один из амплифицируемых селективных маркеров представляет собой ген ДГФР. Другой амплифицируемый маркер представляет собой кДНК рДГФР (Зшопкеп апй Ьеушкоп, Ргос. №И. Асай. 8сг (И8А), (1983) 80:2495). Селектируемые маркеры рассматриваются в работе ΤΗί11\· (МаттаНап Се11 ΤесЬпο1ο§у, ВиНепуоПП РнЬИкПегк, 8!опеЬат, МА), и выбор селектируемых маркеров находится в пределах обычной квалификации в данной области техники.
Элементы экспрессии в системах экспрессии различаются по своей силе и специфичности. В зависимости от используемой системы хозяин/вектор любой из ряда подходящих элементов транскрипции и трансляции, включая конститутивные и индуцируемые промоторы, может быть использован в векторе
- 21 029602
экспрессии. Например, при клонировании в бактериальных системах могут быть использованы индуцируемые промоторы, такие как рЬ бактериофага А, р1ас, р1гр. р!ас (р1гр-1ас гибридный промотор) и т.п.; при клонировании в клеточных системах насекомых могут быть использованы промоторы, такие как промотор многогранника бакуловируса; при клонировании в клеточных системах растений могут быть использованы промоторы, полученные из генома клеток растений (например, промоторы теплового шока; промотор малой субъединицы КИВ18СО; промотор хлорофилл А/В-связывающего белка) или из вирусов растений (например, РНК 358 промотор СаМУ; промотор белка оболочки ВТМ); при клонировании в клеточных системах млекопитающих могут быть использованы промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеинов) или из вирусов млекопитающих (например, промотор поздних генов аденовируса; 7.5 К промотор вируса коровьей оспы); при получении клеточных линий, содержащих множественные копии продукта экспрессии, могут быть использованы векторы на основе 8У40, ВРУ и ЕВУ с соответствующим селектируемым маркером.
В тех случаях, когда используют векторы экспрессии растений, экспрессия последовательностей, кодирующих линейные или незамкнутые формы продукта экспрессии согласно настоящему изобретению, может быть направлена любым из множества промоторов. Например, могут быть использованы вирусные промоторы, такие как 358 РНК и 198 РНК промоторы СаМУ (Вг188оп е! а1., №Чиге (1984) 310:511-514), или промотор белка оболочки ВТМ (Таката!8и е! а1., ЕМВО ί. (1987) 6:307-311); в другом варианте могут быть использованы растительные промоторы, такие как малая субъединица КИВ18СО (Соп.^^1 е! а1., ЕМВО ί. (1984) 3:1671-1680; ВгодНе е! а1., 8аепсе (1984) 224:838-843), или могут быть использованы промоторы белков теплового шока, например 18р17.5-Е или 18р17.3-В сои (Оиг1еу е! а1., Мо1. Се11. Вю1. (1986) 6:559-565). Эти конструкции могут быть введены в клетки растений с помощью Τι плазмид, Κί плазмид, векторов на основе вирусов растений, прямой трансформации молекулой ДНК, микроинъекции, электропорации и т.д. Описание таких методов см., например, в работах Ае188ЬасН апб Ае188ЬасЬ 1988, МеШоб8 Рог Р1ап! Мо1еси1аг Вю1оду, Асабетк Рге88, ΝΥ, 8есйоп УШ, рр. 421-463 и Спег8оп апб Согеу 1988, Р1ап! Мо1еси1аг Вю1оду, 2б Еб., В1аск1е, Ьопбоп, С1. 7-9.
В одной системе экспрессии в клетках насекомых, которую можно применять для получения белков согласно настоящему изобретению, в качестве вектора экспрессии чужеродных генов используют вирус ядерного полиэдроза Аи!одгарЬа саПГогпка (Ас№У). Вирус размножается в клетках 8робор!ега Ргид1регба. Кодирующая последовательность может быть клонирована в некритичные участки (например, ген многогранника) вируса и помещена под контроль промотора Ас№У (например, промотор многогранника). Успешное введение кодирующей последовательности приведет к инактивации гена многогранника и производству "невкрапленного" рекомбинантного вируса (т.е. вируса, у которого отсутствует белковый слой, кодируемый геном многогранника). Такие рекомбинантные вирусы затем применяют для инфицирования клеток 8робор!ега Ргид1регба, в которых вставленный ген экспрессируется (см., например, 8тИЬ е! а1., ί. Уио1. (1983) 46:584; патент США № 4215051). Другие примеры этой системы экспрессии могут быть найдены в работе Аи8иЬе1 е! а1., еб8. 1989, Сштеп! Рго!осо18 ш Мо1еси1аг Вю1оду, уо1. 2, Сгеепе РнЬШН. А88ос. апб АПеу 1п!ег8с1епсе.
В клетках-хозяевах млекопитающих можно применять ряд систем экспрессии на основе вирусов. Если в качестве вектора экспрессии применяют аденовирус, кодирующую последовательность можно лигировать в управляющий комплекс транскрипции/трансляции аденовируса, например промотор поздних генов и трехкомпонентную лидерную последовательность. Этот гибридный ген может быть затем вставлен в геном аденовируса путем рекомбинации в условиях ш У1!го или ш У1уо. Вставка в некритичный участок вирусного генома (например, область Е1 или Е3) приведет к получению рекомбинантного вируса, который является жизнеспособным и способен экспрессировать пептид в инфицированном хозяине (см., например, Ьодап апб 81епк, Ргос. №!1. Асаб. 8сР (И8А) (1984) 81:3655). С другой стороны, можно использовать 7.5К промотор коровьей оспы (см., например, Маске!! е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8сР (И8А) (1982) 79:7415; Маске!! е! а1., ί. Уио1. (1984) 49:857; РапкаП е! а1., Ргос. №И. Асаб. 5ά. (И8А) (1982) 79:4927). Другие вирусные системы экспрессии включают аденоассоциированный вирус и лентивирусы.
Клетки-хозяева, содержащие конструкции ДНК, выращивают в соответствующей ростовой среде. В настоящей заявке термин "соответствующая ростовая среда" означает среду, содержащую питательные вещества, необходимые для выращивания клеток. Полученный с помощью рекомбинантных методик белок согласно настоящему изобретению может быть выделен из культуральной среды с использованием обычных методик в данной области техники.
Исследования в условиях ш У1!го.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения дезагрегацию амилоида можно контролировать с помощью исследования флуоресценции тиофлавина Т (ТФТ).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения дезагрегацию исследуют с помощью контроля солюбилизации ПАВ в присутствии или в отсутствие композиции согласно настоящему изобретению. Например, агрегированный α-синуклеин можно обрабатывать с применением композиции согласно настоящему изобретению. Композиция, которая вызывает дезагрегацию агрегированного α- 22 029602
синуклеина, приведет к более быстрой солюбилизации волокон α-синуклеина в ПАВ, таком как ДСН, по сравнению с необработанными волокнами. Такое превращение амилоидных волокон в растворимые формы можно контролировать путем включения доли меченых (например, с применением Су5) мономеров α-синуклеина во время агрегации.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предотвращение образования токсичных амилоидных олигомеров исследуют с помощью оценки цитотоксичности для нейрональной клеточной культуры. В этом исследовании дифференцированные клетки нейробластомы линии Ы2а или эквивалентные инкубируют с олигомерами Λβ42. Олигомеры связываются с мембранами и вызывают нарушение целостности мембраны и утечку цитозольных ферментов в культуральную среду. Длительная инкубация с высокой концентрацией олигомеров вызывает гибель клеток. Если олигомеры предварительно обрабатывают фагом или §3р перед инкубацией с клетками, олигомеры становятся менее токсичными и в некоторых случаях нетоксичными. Этот нейтрализующий эффект можно количественно оценить путем измерения высвобождения аденилаткиназы, одного из типичных цитозольных ферментов, который высвобождается нервными клетками после нарушения целостности мембраны.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиция согласно настоящему изобретению ингибирует превращение растворимого прионного белка в конформер, устойчивый к действию протеиназы К (ПК), в исследовании нарушения сворачивания белка с циклической амплификацией (РМСА) (\Уапд с1 а1., 8с1спсс. (2010) 327:1132-35). В этом исследовании рекомбинантный РгР смешивают с липидом РОРО и РНК в присутствии или в отсутствие композиции согласно настоящему изобретению. Затем материал подвергают многократным (например, 48) циклам обработки ультразвуком в течение 30 с с последующей инкубацией в течение 29,5 мин. Часть реакционной смеси затем используют в качестве затравки для другой пробирки с субстратом, и цикл повторяется. Образцы после каждого раунда исследуют на наличие материала, устойчивого к действию протеиназы К, что свидетельствует о инфекционной форме РгР. Снижение количества материала, устойчивого к действию протеиназы К, в присутствии композиции согласно настоящему изобретению указывает, что композиция ингибирует образование конформера, устойчивого к действию протеиназы К.
Как отмечалось выше, амилоидные формы определенных прионных белков, такие как прионный белок дрожжей ΝΜ, также можно детектировать методом ловушки на фильтре. Соответственно в зависимости от типа прионного белка в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способность композиции согласно настоящему изобретению дезагрегировать агрегаты прионного белка можно исследовать методом ловушки на фильтре.
Функциональные исследования в условиях ίη νίνο.
Помимо таких видов активности, как повышенная аффинность связывания с амилоидом или сниженная Тпл, которые можно продемонстрировать в исследованиях в условиях ίη νίνο, композиции согласно настоящему изобретению могут также снижать уровень амилоида в одном из нескольких исследований в условиях ίη νίνο. В одном из способов определения снижения уровня амилоида в условиях ίη νίνο применяют позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ) с визуализирующим агентом флорбетапиром (Р18-АУ-45, Ε1ί Ы11у) до и после обработки, чтобы сравнить количество и/или распределение бетаамилоида. Безусловно, поскольку выявлены дополнительные биомаркеры, они также могут быть использованы, чтобы оценить снижение уровня амилоида.
В другом способе определения снижения уровня амилоида под действием композиции в условиях ίη νίνο применяют мышиную модель ЬАРР (Κ^Εθηδΐθίη, 1 №иго5С1 Кек. (2001) 66(4):573-82). У этих мышей развиваются высокие уровни бета-амилоида в раннем возрасте (3-4 месяца). Способность композиции снижать уровень амилоида может быть определена с помощью инъекционного введения мышам композиции согласно настоящему изобретению с последующим сравнением уровней амилоида у этих мышей и контрольных животных, не получавших инъекций. Также можно вводить композицию только в одно полушарие мозга мышей ЬАРР, это позволяет сравнить уровень амилоида между инъецированным и неинъецированным полушариями головного мозга одной и той же мыши.
В другом примере композиции согласно настоящему изобретению исследуют в трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера (ТдАЭ), описанной в патенте США υδ 2011/0142803, Ηκίαο е1 а1., δαенсе (1996) 274:99-102 или ЭнускаеПк е1 а1., Ас1а №ιιγο]ρ·ι11ιο1 (2008) 115:5-38. В общих чертах, мышей дикого типа и трансгенных мышей сенсибилизируют. Чтобы оценить потенциальную способность композиции согласно настоящему изобретению действовать в качестве дезагрегирующего агента композицию вводят интракраниально трансгенным мышам (Татетс, АРР§^Е(2576), 10 мес). Например, для композиций, содержащих фаг, 2,5 мкл раствора нитевидого фага (1014 частиц фага/мл) вводят в течение 10 мин (брегма - 2,8 мм, латерально - 2,5 мм, вентрально - 2,5 мм) в одно полушарие, тогда как во второе полушарие вводят фосфатно-солевой буфер (ФСБ) в качестве контроля. Обработанных мышей умерщвляют в различные моменты времени, мозг фиксируют в течение ночи в 4%-ном параформальдегиде, и готовят срезы с помощью микротома. Окрашивание с применением тиофлавина δ (ТФС) выполняют для оценки нагрузки амилоидом. Срезы окрашивают гематоксилином Майера для тушения ядерной аутофлуоресценции, и после промывки применяют раствор ТФС (1%) в течение 3 мин. Дифференцирование
- 23 029602
проводят с использованием 1%-ной уксусной кислоты в течение 20 мин, и после промывки предметные стекла высушивают и монтируют с применением среды для монтирования, препятствующей выцветанию. Нагрузку амилоидом рассчитывают с использованием программы ЬЕ1СА Ο\νίη. В другом варианте нагрузку амилоидом можно оценить с применением антител к амилоиду.
Биораспределение радиоактивных (например, I125) или флуоресцентно-меченых композиций или немеченых композиций, включая нитевидные фаги, также можно измерить, чтобы показать, что композиция связывает амилоид в условиях ίη νί\Ό. Например, если композиция содержит фаг, то нитевидный фаг может быть помечен радиоактивной или флуоресцентной меткой. Мышей линии ВАЬВ/с разделяют на группы. Затем каждая мышь получает интраназально 100 мкл фага (12,5х 1012 фаговых частиц) в течение часа. Первую группу мышей умерщвляют через час после проведения внутрисердечной перфузии с применением 4%-ного параформальдегида. Вторую группу умерщвляют через 3 ч после обработки, и последнюю группу умерщвляют через 24 ч. После перфузии мозг, а также периферические органы удаляют, и оценивают содержание метки. Кроме того, связывание немеченых композиций или фагов можно оценить с использованием сходных методов, но окрашивая срезы головного мозга красителем, который распознает амилоид, и красителем, который распознает композицию или фаг.
Интраназальное введение нитевидных фагов также используют, чтобы полностью исследовать композиции, содержащие фаг, такой как фаг, содержащий мутантный §3р или амилоидсвязывающий фрагмент §3р, или фаг с увеличенным количеством копий §3р по отношению к фагу дикого типа, как это предусмотрено в настоящем изобретении. Например, фаг вводят интреназально трансгенным мышам 8\УЕ/АРР2576 (Тасошс, 10 месячным), которые представляют собой мышиную модель болезни Альцгеймера. 20 мкл раствора фага (5х1012/мл) вводят каждые две недели в течение от 4 до 12 месяцев, затем оценивают когнитивные функции. После периода лечения проводят тест на распознавание новых объектов, чтобы оценить влияние обработки фагом на улучшение памяти. В первый день мышей подвергают воздействию двух новых объектов в течение 20 мин. На следующий день один объект заменяют, и исследуют поисковое поведение мышей, направленное на исследование нового объекта. Индекс распознавания рассчитывают для каждой мыши путем деления времени, проведенного рядом с новым объектом, на общее время, проведенное рядом с обоими объектами. Таким образом, значения выше 0,5 являются показательными для распознавания старого объекта и проведения большего количества времени возле нового объекта для его исследования.
Другие трансгенные модели заболеваний, связанных с нарушением сворачивания белков, также можно применять, чтобы продемонстрировать, что композиция согласно настоящему изобретению снижает уровень амилоида. Неограничивающие примеры включают "Ό-линию" мышей, дефицитных по αсинуклеину (модель болезни Паркинсона, МакБаН е1 а1., 8с1епсе (2000) 287:1265-1269); мышей Т§2576 (модель болезни Альцгеймера, НЕао е1 а1., 8с1епсе (1996) 274:99-102 и Оиускаепк е1 а1., Ас1а ЫеигораШо1 (2008) 115:5-38 а! 9); различные линии мышей ί;·ι\® для исследования болезни Паркинсона (Заскюп ЬаЬога1опе5, Ваг НагЬог, МЕ); мышиные и крысиные модели, доступные от ί8\ν Ьйсбсюпсс, включая модели для исследований болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера и болезни Хантингтона.
Ожидается, что в этих исследованиях фаг, в котором §3р был инактивирован, будет неактивным, тогда как фаг дикого типа будет колокализован с амилоидом, снизит нагрузку амилоидом, предотвратит образование амилоида и/или удалит токсичные олигомеры и приведет к улучшению когнитивных функций. Фаг, содержащий §3р или его амилоидсвязывающий фрагмент, как это предусмотрено согласно настоящему изобретению, таким образом, можно исследовать в условиях ш νί\Ό для оценки активности по сравнению с отрицательными и положительными контролями.
Фармацевтические композиции.
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложены фармацевтически приемлемые композиции, содержащие любой из описанных выше агентов согласно настоящему изобретению (т.е. (а) д3р, амилоидсвязывающий фрагмент §3р, или его мутанты, или варианты, (б) соединения, полипептиды и гибридные белки, содержащие д3р, амилоидсвязывающий фрагмент §3р, или его мутанты, или варианты, (в) нитевидный бактериофаг, несущий увеличенное количество копий §3р по сравнению с фагом дикого типа, (г) носители для дисплея амилоидсвязывающих фрагментов, несущих §3р, амилоидсвязывающий фрагмент §3р, его мутанты, или варианты, или соединения, полипептиды и гибридные белки, содержащие д3р, амилоидсвязывающие фрагменты §3р, или его мутанты, или варианты, или (д) модифицированные нитевидные фаги, несущие варианты §3р, амилоидсвязывающие фрагменты §3р (не как часть экспрессируемого белка §3р), мутанты или варианты таких связывающих фрагментов, или гибридные белки, или другие гетерологичные полипептиды, которые содержат §3р, амилоидсвязывающие фрагменты §3р, или его мутанты, или варианты.
"Фармацевтическая композиция" относится к терапевтически эффективному количеству композиции, как описано в настоящей заявке, с физиологически приемлемым носителем и/или наполнителем. Фармацевтическая композиция не вызывает значительного раздражения в организме. Фразы "физиологически приемлемый носитель" и "фармацевтически приемлемый носитель", которые могут быть использованы взаимозаменяемо, относятся к носителю или разбавителю, который не вызывает значитель- 24 029602
ного раздражения в организме и не нарушает биологической активности и свойств вводимого состава.
Термин "наполнитель" относится к инертному веществу, добавленному к фармацевтической композиции, чтобы дополнительно облегчить введение активного ингредиента. Примеры, не ограничиваясь перечисленными, включают, например, физиологический раствор, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара и типы крахмала, производные целлюлозы, желатин, растительные масла, полиэтиленгликоли и поверхностно-активные вещества, включая, например, полисорбат 20.
Фармацевтические композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением могут быть приготовлены обычным способом с использованием одного или более физиологически приемлемых носителей, включая наполнители и вспомогательные вещества, которые облегчают переработку активных ингредиентов в композиции, которые могут быть использованы фармацевтически. Точный состав зависит от выбранного пути введения и характеристик доставляемого состава (например, белок в сравнении с фагом).
Подходящие пути введения фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению могут, например, включать введение через слизистую оболочку, в частности интраназальную доставку; парентеральную доставку, включая внутримышечную, подкожную, интрамедуллярную, интратекальную, интравентрикулярную, внутривенную, внутрибрюшинную, интраназальную или внутриглазную инъекции; пероральную; или ректальную доставку.
Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическую композицию вводят, как правило, локально, а не системно, например путем инъекции фармацевтической композиции непосредственно в мозг пациента. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения методика инъекции представляет собой любую методику, которая позволяет избежать гематоэнцефалического барьера, например, путем прямого интрамедуллярного, интратекального или внутрижелудочкового введения.
Для выполнения инъекций активные ингредиенты согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены в виде водных растворов, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. Для введения через слизистую в композиции применяют вещества, способствующие проникновению через соответствующий барьер. Такие облегчающие проникновение вещества в целом известны в данной области техники.
В некоторых вариантах реализации фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению вводят интраназальным путем. Сообщается, что интраназальная доставка позволяет осуществлять прямой ввод вирусов и макромолекул в спинно-мозговую жидкость (ликвор) или ЦНС (МаОйюп е! а1, 1998; С1юи е! а1, 1997; ЭгадЫа е! а1, 1995).
Для введения интраназальным путем композиции обычно доставляют в виде аэрозольного спрея из находящейся под давлением упаковки или распылителя с использованием подходящего пропеллента, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана или диоксида углерода. В случае аэрозоля под давлением единицу дозирования можно определить с помощью клапана для доставки дозированного количества. Капсулы и картриджи, например желатин для использования в распределительном устройстве, могут быть приготовлены с порошкообразной смесью соединения и пригодной порошковой основой, такой как лактоза или крахмал.
Различные белки, описанные в настоящей заявке в качестве компонентов фармацевтических композиций, также могут быть доставлены в мозг с помощью нейронов обонятельных рецепторов в качестве точки доставки. Например, аденовирусный вектор, содержащий ген, кодирующий любой из этих белков, может быть доставлен с помощью нейронов обонятельных рецепторов (ОгадЫа е! а1, 1995).
Композиции, описанные в настоящей заявке, могут быть приготовлены для парентерального введения, например, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы композиций в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии активных ингредиентов могут быть получены в масляных или водных суспензиях для инъекций. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, триглицериды или липосомы. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как натрий карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Необязательно, суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты (например, поверхностноактивные вещества, такие как полисорбат (Твин 20)), которые повышают растворимость активных ингредиентов, чтобы обеспечить приготовление высококонцентрированных растворов. Агент на основе белка, такой как, например, альбумин, может быть использован для предотвращения адсорбции М13 на поверхности системы для доставки (т.е. пакет для внутривенных инфузий, катетер, игла и т.д.).
Для перорального введения композиции могут быть легко приготовлены путем комбинирования активных соединений с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в данной области техники.
Составы могут быть представлены в стандартной лекарственной форме, например в флаконах, ампулах или в мультидозных контейнерах, возможно, с добавлением консерванта. Композиции могут быть в виде суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных носителях, а также могут содержать вспомогательные агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.
- 25 029602
Одиночные лекарственные формы могут быть в жидком или твердом виде. Единичные дозированные лекарственные формы могут быть прямо введены пациенту без модификации или могут быть разбавлены или восстановлены перед введением. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения единичные дозированные лекарственные формы могут быть введены в болюсной форме, например, в виде однократной инъекции, однократной дозы, включая дозу для приема внутрь, содержащую несколько таблеток, капсул, пилюль и т.д. В альтернативных вариантах единичные дозированные лекарственные формы могут быть введены в течение определенного периода времени, например, путем инфузии, или с помощью имплантированного насоса, такого как насос для интрацеребрального введения. В последнем варианте реализации настоящего изобретения единичная дозированная лекарственная форма может быть введена с помощью инфузионного мешка или резервуара насоса, предварительно заполненного указанным количеством нитевидного бактериофага. Кроме того, инфузионный мешок или резервуар насоса могут быть подготовлены непосредственно перед введением пациенту путем смешивания однократной дозы нитевидного бактериофага с раствором инфузионного мешка или резервуара насоса.
Другой аспект изобретения относится к способам получения фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Методики приготовления лекарственных препаратов могут быть найдены, например, в "РеттдЮпА РЬагтасеиЕса1 8с1епсе8" Маск РнЬГОЬтд Со., Еа8!оп, Ра., последнее издание, которое полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Фармацевтические композиции, подходящие для использования применительно к настоящему изобретению, включают композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в количестве, эффективном для достижения поставленной цели.
Определение терапевтически или диагностически эффективного количества находится в пределах возможностей специалиста в данной области техники, особенно с учетом подробного описания, приведенного в настоящей заявке.
Дозировку и интервал введения можно корректировать индивидуально, чтобы обеспечить в мозге необходимый уровень носителя фагового дисплея, который достаточен для лечения или диагностики конкретного заболевания головного мозга, расстройства или состояния (минимальная эффективная концентрация, МЭК). МЭК будет варьироваться для каждого препарата, но может быть оценена на основании данных, полученных в условиях ίη νίίτο. Дозировки, необходимые для достижения МЭК, будут зависеть от индивидуальных характеристик.
Интервалы дозирования также можно определить с использованием значения МЭК. Препараты должны быть введены с использованием схемы, которая обеспечивает поддержание уровня в мозге выше МЭК в течение 10-90% времени, предпочтительно от 30 до 90% и наиболее предпочтительно от 50 до 90%.
В зависимости от тяжести и восприимчивости заболевания, подлежащего лечению, дозирование может быть проведено с применением однократных или многократных введений, курс лечения может длиться от нескольких дней до нескольких недель или до тех пор, пока не будет достигнут лечебный эффект или уменьшение болезненного состояния.
Вводимое количество композиции будет зависеть от субъекта, подвергаемого лечению или диагностике, тяжести заболевания по мнению лечащего врача и т.д.
Композиции согласно настоящему изобретению, при желании, могут быть представлены в пакете или распределительном устройстве, например наборе, одобренном Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США, который может содержать одну или более стандартных дозированных форм, содержащих активный ингредиент. Пакет может, например, содержать металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистерная упаковка. Пакет или распределительное устройство может поставляться в комплекте с инструкцией по введению. Пакет или распределительное устройство может быть приспособлен для применения с использованием уведомления, связанного с контейнером, в форме, которая предписана правительственным учреждением, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов, чье уведомление отражает одобрение учреждением формы композиций или применения у человека, или применения в ветеринарии. Такое уведомление, например, может касаться маркировки, утвержденной Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США для лекарственных средств, отпускаемых по рецепту, или одобренного листка-вкладыша. Композиции, содержащие препарат согласно настоящему изобретению, приготовленный в совместимом фармацевтическом носителе, могут быть также приготовлены, помещены в соответствующий контейнер и маркированы как подходящие для лечения указанного заболевания, как подробно описано выше.
Следует понимать, что представленное выше и приведенное далее описание являются только иллюстративными и пояснительными и не ограничивают объем заявленного изобретения.
Терапевтическое применение.
Как уже отмечалось, было показано, что нитевидный бактериофаг М13 и родственные нитевидные фаги полезны в животных моделях заболеваний, связанных с нарушением сворачивания белков (см. публикацию патента США И8 2011/0142803, полностью включенную в настоящую заявку посредством ссылки). В частности, было обнаружено, что нитевидные бактериофаги способны дезагрегировать ами- 26 029602
лоид, который уже образовался в головном мозге.
Ожидается, что удаление амилоида снизит, замедлит прогрессирование или даже обратит симптомы, связанные с различными заболеваниями, характеризующимися неправильно свернутыми и/или агрегированными белками в головном мозге (см., например, \У0 2006083795 и \У0 2010060073, полностью включенные в настоящую заявку посредством ссылки).
Далее, было показано, что М13 дезагрегирует по меньшей мере четыре различных типа амилоидных волокон: волокна бета-амилоида 1-42 (ΓΑβ42), волокна α-синуклеина (Гакуп), волокна приона дрожжей NМ (ΓNМ) и волокна тау-белка (йаи).
Соответственно другой аспект настоящего изобретения относится к применению любой из композиций согласно настоящему изобретению, например, тех, которые содержат §3р, домен №N2, домен N2 или другие амилоидсвязывающие фрагменты (включая мутанты или варианты всех упомянутых выше белков), или гибридные белки §3р, носитель дисплея или фаг, содержащий любой из вышеперечисленных в лечении заболеваний, связанных с нарушением сворачивания белков, включая, но не ограничиваясь ими, заболевания, связанные с любым из ГА(/42. Гакуп, ГА1 или Паи.
Применительно к лечению термины "пациент", "субъект" и "реципиент" используются как синонимы и включают людей, а также других млекопитающих. Согласно некоторым вариантам реализации пациентом является человек, который является положительным на наличие биомаркера, ассоциированного с заболеванием, связанным с нарушением сворачивания белков. Согласно одному варианту пациент имеет отложения бета-амилоида, детектируемые ПЭТ с применением флорбетапира.
Термин "лечение" означает уменьшение, замедление или обращение прогрессирования заболевания у пациента, проявляющего один или более клинических симптомов заболевания. "Лечение" также означает уменьшение, замедление или обращение симптомов заболевания у пациента, проявляющего один или более клинических симптомов заболевания. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения пациент имеет отложения бета-амилоида, детектируемые ПЭТ с применением флорбетапира, и количество отложений бета-амилоида уменьшается с помощью лечения. В одном варианте реализации настоящего изобретения пациент имеет отложения бета-амилоида, детектируемые с помощью композиций, содержащих §3р, согласно настоящему изобретению, и количество отложений бета-амилоида уменьшается или поддерживается с помощью лечения. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пациент имеет любой тип отложений амилоида, детектируемый ПЭТ, и когнитивная функция пациента улучшается с помощью лечения. Улучшение когнитивной функции может быть исследовано с помощью методов и тестов, приведенных в работе МсКЬапп е! а1., АкЬешег'к апб Эетепйа (2011) Мау; 7(3):263-9.
"Профилактика" отличается от лечения и относится к введению композиции лицам до проявления каких-либо клинических симптомов. Профилактика с применением любой из композиций, содержащих д3р и/или То1А, согласно настоящему изобретению включена в объем настоящего изобретения. Профилактическое введение можно применять у лиц, которые, как известно, подвержены повышенному риску заболевания, или у которых заболевание вероятно разовьется исключительно на основе наличия одного или нескольких генетических маркеров. Многие генетические маркеры были выявлены для различных заболеваний, связанных с нарушением сворачивания белков. Например, лица с одной или более шведскими мутациями, мутацией Индианы или Лондонской мутацией в человеческом белке-предшественнике амилоида (ЬАРР) имеют повышенный риск раннего начала болезни Альцгеймера и поэтому являются кандидатами для профилактики. Кроме того, у лиц, в гене хантингтина которых присутствует тринуклеотидный повтор ОАО, в частности тех, у кого 36 или более повторов, в конечном итоге разовьется болезнь Хантингтона, поэтому они перспективны для профилактики.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения белок или фрагмент применяют непосредственно в качестве терапевтического средства. В этих вариантах д3р, домен №N2, домен N2 или другие амилоидсвязывающие фрагменты (включая мутанты или варианты любого из вышеуказанных) непосредственно включены в фармацевтическую композицию или состав. В других вариантах д3р, домен №N2, домен N2 или другой амилоидсвязывающий фрагмент (включая мутанты или варианты любого из вышеуказанных) являются частью гибридного белка или носителя дисплея, например фага, и в указанных вариантах предложен гибридный белок или носитель дисплея, который включен в фармацевтическую композицию или состав согласно настоящему изобретению. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит фаг, содержащий §3р или его амилоидсвязывающий фрагмент, который является более эффективным, чем §3р фага М13 дикого типа в снижении или поддержании уровня амилоида. Согласно некоторым вариантам фаг, который является более эффективным в снижении или поддержании уровня амилоида, чем М13, экспрессирует более 5 копий §3р.
Термин "нарушение формирования структуры (сворачивания) белка" относится к заболеваниям, характеризующимся образованием амилоидного белка путем агрегации белка амилоида (амилоид образующего пептида), такого как, но не ограничиваясь указанными, β-амилоид, сывороточный амилоид А, цистатин С, легкая каппа цепь 1§О или прионный белок. Заболевания, которые, как известно, связаны с неправильно свернутым и/или агрегированным амилоидным белком, включают болезнь Альцгеймера,
- 27 029602
которая включает раннее начало болезни Альцгеймера, позднее начало болезни Альцгеймера и предсимптомную форму болезни Альцгеймера, болезнь Паркинсона, амилоидоз САА цистатин С, наследственный исландский синдром, старость, множественную миелому, прионные заболевания, включая, но не ограничиваясь ими, куру, болезнь Крейтцфельдта-Якоба (СГО), синдром Герстманна-ШтраусслераШейнкера (088), фатальную семейную бессонницу (ΡΡΙ), скрейпи и губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (В8Е); боковой амиотрофический склероз (БАС), спиноцеребеллярную атаксию (8СΑ1), (8СΑ3), (8СΑ6), (8СΑ7), болезнь Хантингтона, дентато-рубро-паллидо-льюисову атрофию, спинномозговую мышечную атрофию, наследственную церебральную амилоидную ангиопатию, семейный амилоидоз, лобно-височную долевую дегенерацию (РТЬО), включая деменцию лобно-височной доли, британскую/датскую деменцию и семейную энцефалопатию. Композиции, содержащие д3р согласно настоящему изобретению, можно применять для лечения заболеваний, связанных с нарушением формирования структуры белков.
Многие из этих заболеваний, связанных с нарушением формирования структуры белка и/или агрегированным амилоидным белком, возникают в центральной нервной системе (ЦНС). Некоторые примеры заболеваний, протекающих в ЦНС, включают болезнь Паркинсона; болезнь Альцгеймера; лобновисочную деменцию (ΡΤΌ), включая пациентов, имеющих следующие клинические синдромы: поведенческий вариант ΡΤΌ φνΡΤΌ), прогрессивную, экспрессивную афазию (ΡΧΡΑ) и семантическую деменцию (80); лобно-височные долевые дегенерации (РТЬОк); и болезнь Хантингтона. Композиции, содержащие д3р согласно настоящему изобретению, можно применять для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением формирования структуры белка и/или агрегированным амилоидным белком, которые возникают в центральной нервной системе (ЦНС).
Нарушения формирования структуры и/или агрегации белков также могут происходить за пределами ЦНС. Амилоидоз А (АА) (при котором белок-предшественник представляет собой сывороточный аполипопротеин острой фазы, САА) и множественная миелома (белки-предшественники представляют собой легкую и/или тяжелую цепи иммуноглобулина) представляют собой два широко известных заболевания, связанных с нарушением сворачивания белков и/или агрегированными белками, которые возникают за пределами центральной нервной системы. Другие примеры включают заболевания, в патогенезе которых участвует амилоид, образованный Ц2-микроглобулином, транстиретином (семейная амилоидная полинейропатия (САП), семейная амилоидная кардиомиопатия (САК) и старческий системный амилоидоз (ССА)), сывороточным (аро)А А, аполипопротеинами ΑΙ, ΑΙΙ и Αίν, гельзолином (финская форма семейной амилоидной полинейропатии), лизоцимом, фибриногеном, цистатином С (церебральная амилоидная ангиопатия, наследственное внутримозговое кровоизлияние с амилоидозом, исландский тип), (про)кальцитонином, островковым амилоидным полипептидом (ΙΑΡΡ амилоидоз), предсердным натрийуретическим фактором, пролактином, инсулином, лактадгерином, кератоэпителином, лактоферрином, одонтогенным амелобластсвязанным белком и семеногелином Ι. Композиции, содержащие д3р согласно настоящему изобретению, можно применять для лечения заболеваний, связанных с неправильным формированием структуры и/или агрегацией белков, которые возникают вне ЦНС.
Нейродегенеративные заболевания могут также включать поражения тау-белком (рассматриваются в работе Ьее е! а1. (2001) Αηηιι. Ке\: №иго8С1. 24:1121-159). Тау-белки представляют собой ассоциированные с микротрубочками белки, экспрессирующиеся в аксонах нейронов центральной и периферической нервной системы. Нейродегенеративные таупатии (иногда называемые таупатии) включены в область настоящего изобретения. Примеры таупатий включают болезнь Альцгеймера, комплекс боковой амиотрофический склероз/паркинсонизм-деменция, деменцию с аргирофильными гранулами, кортикобазальную дегенерацию, болезнь Крейтцфельда-Якоба, деменцию боксеров, диффузные нейрофибриллярные клубки с кальцификацией, синдром Дауна, лобно-височную деменцию, включая лобно-височную деменцию с паркинсонизмом, связанным с хромосомой 17, синдром Герстманна-ШтраусслераШейнкера, болезнь Галлервордена-Шпатца, миотоническую дистрофию, болезнь Нимана-Пика типа С, негуамское заболевание двигательных нейронов с нейрофибриллярными клубками, болезнь Пика, постэнцефалитический паркинсонизм, прионную церебральную амилоидную ангиопатию, прогрессирующий подкорковый глиоз, прогрессирующий супрануклеарный паралич, подострый склерозирующий панэнцефалит и старческую деменцию только с нейрофибриллярными клубками. Некоторые из этих заболеваний могут также включать отложения фибриллярного бета-амилоидого пептида. Например, при болезни Альцгеймера выявляют как отложения бета-амилоида, так и поражения тау-белками. Аналогичным образом, опосредованные прионами заболевания, такие как болезнь Крейтцфельдта-Якоба, прионная церебральная амилоидная ангиопатия и синдром Герстманна-Штраусслера-Шейнкера, могут сопровождаться поражениями тау-белками. Таким образом, указание того, что заболевание представляет собой "таупатию" не следует толковать как исключающее заболевание из других классификаций нейродегенеративных заболеваний или групп, которые приведены исключительно для удобства. Композиции, содержащие д3р согласно настоящему изобретению, можно применять для лечения нейродегенеративных заболеваний, а также заболеваний, включающих поражения тау-белками.
В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция или состав предназначены для применения согласно способу снижения уровня амилоида у пациента, проявляющего
- 28 029602
симптомы, связанные с наличием амилоида, или у пациента, положительного в отношении биомаркера, ассоциированного с заболеванием, связанным с нарушением формирования стрктуры белков, такого как флорбетапир (АУ-45, Εΐί ЬШу), где способ включает введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции или состава, как описано в настоящей заявке. В одном варианте реализации настоящего изобретения способ введения выбирают из интратекальной инъекции, прямой внутрижелудочковой инъекции, интрапаренхимальной инъекции или интраназальной доставки.
В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция или состав предназначены для применения согласно способу поддержания уровня амилоида у пациента, проявляющего симптомы, связанные с наличием амилоида, или у пациента, положительного в отношении биомаркера, ассоциированного с заболеванием, связанным с нарушением формирования стрктуры белков, такого как флорбетапир (ЛУ-45, Εΐί ЬШу), где способ включает введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции или состава, как описано в настоящей заявке. В одном варианте реализации настоящего изобретения способ введения выбирают из интратекальной инъекции, прямой внутрижелудочковой инъекции, интрапаренхимальной инъекции или интраназальной доставки.
В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция или состав предназначены для применения согласно способу дезагрегации амилоида у пациента, включающему введение пациенту, имеющему амилоид, эффективного количества фармацевтической композиции или состава, как описано в настоящей заявке. В одном варианте реализации настоящего изобретения способ введения выбирают из интратекальной инъекции, прямой внутрижелудочковой инъекции, интрапаренхимальной инъекции или интраназальной доставки.
В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция или состав предназначены для применения согласно способу дезагрегации отложений бета-амилоида в головном мозге, включающему введение с помощью инъекции непосредственно в мозг пациента, нуждающегося в таком лечении, эффективного количества фармацевтической композиции, как описано в настоящей заявке, тем самым вызывая уменьшение отложений бета-амилоида в мозге.
В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция или состав предназначены для применения согласно способу уменьшения образования амилоида в головном мозге. Уменьшение образования амилоида в мозге может предотвратить, излечить или уменьшить симптомы или тяжесть заболевания, связанного с нарушением сворачивания белков, или нейродегенеративного заболевания. В одном варианте реализации настоящего изобретения способ введения выбирают из интратекальной инъекции, прямой внутрижелудочковой инъекции, интрапаренхимальной инъекции или интраназальной доставки.
В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция или состав согласно настоящему изобретению предназначены для применения согласно способу усиления клиренса амилоида в головном мозге. Усиление клиренса амилоида может предотвратить, излечить или уменьшить симптомы или тяжесть заболевания, связанного с нарушением сворачивания белков, или нейродегенеративного заболевания. В одном варианте реализации настоящего изобретения способ введения выбирают из интратекальной инъекции, прямой внутрижелудочковой инъекции, интрапаренхимальной инъекции или интраназальной доставки.
В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция или состав согласно настоящему изобретению предназначены для применения согласно способу ингибирования агрегации амилоида в головном мозге. Ингибирование агрегации амилоида в мозге может предотвратить, излечить или уменьшить симптомы или тяжесть заболевания, связанного с нарушением сворачивания белков, или нейродегенеративного заболевания. В одном варианте реализации настоящего изобретения способ введения выбирают из интратекальной инъекции, прямой внутрижелудочковой инъекции, интрапаренхимальной инъекции или интраназальной доставки.
В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция или состав согласно настоящему изобретению предназначены для применения согласно способу выведения токсичных амилоидных олигомеров в головном мозге. Выведение токсичных амилоидных олигомеров в мозге может предотвратить, излечить или уменьшить симптомы или тяжесть заболевания, связанного с нарушением сворачивания белков, или нейродегенеративного заболевания. В одном варианте реализации настоящего изобретения способ введения выбирают из интратекальной инъекции, прямой внутрижелудочковой инъекции, интрапаренхимальной инъекции или интраназальной доставки.
В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция или состав согласно настоящему изобретению предназначены для применения согласно способу предотвращения образования токсичных амилоидных олигомеров в головном мозге. Предотвращение образования токсичных олигомеров в мозге может предотвратить, излечить или уменьшить симптомы или тяжесть заболевания, связанного с нарушением сворачивания белков, или нейродегенеративного заболевания. В одном варианте реализации настоящего изобретения способ введения выбирают из интратекальной инъекции, прямой внутрижелудочковой инъекции, интрапаренхимальной инъекции или интраназальной доставки.
В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция или состав
- 29 029602
согласно настоящему изобретению предназначены для применения согласно способу защиты нейронов от повреждения амилоидом. Защита нейронов от повреждения амилоидом может предотвратить, излечить или уменьшить симптомы или тяжесть заболевания, связанного с нарушением сворачивания белков, или нейродегенеративного заболевания. В одном варианте реализации настоящего изобретения способ введения выбирают из интратекальной инъекции, прямой внутрижелудочковой инъекции, интрапаренхимальной инъекции или интраназальной доставки. В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическую композицию или состав согласно настоящему изобретению для применения для защиты нейронов от повреждения амилоидом вводят в профилактических целях.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения пациент является положительным в отношении биомаркера, ассоциированного с заболеванием, связанным с нарушением сворачивания и/или агрегацией белков. В одном варианте реализации биомаркер представляет собой флорбетапир (АУ45, Ε1ί ЬШу).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения пациент проявляет симптомы нейродегенеративного заболевания, связанного с наличием амилоида. В различных вариантах реализации настоящего изобретения амилоид представляет собой любой из ΓΛβ42, £азуп, £Νΐν1 или йаи.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера или болезнь Хантингтона. В одном варианте реализации настоящего изобретения нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера. В одном варианте реализации настоящего изобретения нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера, и пациент имеет бета-амилоид, детектируемый с помощью визуализирующего агента флорбетапира (Άν-45, Ε1ί ЬШу).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения пациент проявляет симптомы прионопосредованного заболевания.
Согласно некоторым вариантам прионопосредованное заболевание выбирают из болезни Крейтцфельдта-Якоба, куру, фатальной семейной бессонницы или синдрома Герстманна-ШтреусслераШейнкера.
Согласно некоторым вариантам пациент проявляет симптомы нейродегенеративной таупатии, кроме болезни Альцгеймера. Согласно некоторым вариантам заболевание, подлежащее лечению, выбирают из деменции с аргирофильными гранулами, кортикобазальной дегенерации, деменции боксеров, диффузных нейрофибриллярных клубков с кальцификацией, синдрома Дауна, лобно-височной деменции, включая лобно-височную деменцию с паркинсонизмом, связанным с хромосомой 17, болезни ГаллерворденаШпатца, миотонической дистрофии, болезни Ниман-Пика типа С, негуамовской болезни двигательных нейронов с нейрофибриллярными клубками, болезни Пика, постэнцефалитического паркинсонизма, прогрессирующего подкоркового глиоза, прогрессирующего супрануклеарного паралича, подострого склерозирующего панэнцефалита и старческой деменции только с нейрофибриллярными клубками.
Диагностика.
В другом аспекте изобретения композиции д3р и То1А, описанные в настоящей заявке, включая гибридные белки д3р, применяют в диагностических целях, связанных с различными заболеваниями, описанными в настоящей заявке. Например, связывание композиции согласно настоящему изобретению при применении в качестве визуализирующего агента в условиях 1п νί\Ό или 1п уПго может быть частью диагностики одного из описанных заболеваний, связанных с нарушением сворачивания белков.
Диагностические агенты, иначе упоминаемые в настоящей заявке как диагностические композиции, включены в область настоящего изобретения, и могут содержать любой из вышеописанных агентов согласно настоящему изобретению (т.е. (а) д3р, амилоидсвязывающие фрагменты д3р, или его мутанты, или варианты; (б) соединения, полипептиды и гибридные белки, содержащие д3р, амилоидсвязывающие фрагменты д3р, или его мутанты, или варианты; (в) нитевидный бактериофаг, несущий увеличенное количество копий д3р по сравнению с фагом дикого типа; (г) носитель для дисплея амилоидсвязывающих белков, несущий д3р, амилоидсвязывающие фрагменты д3р, его мутанты, или варианты, или соединения, полипептиды и гибридные белки, содержащие д3р, амилоидсвязывающие фрагменты д3р, или его мутанты, или варианты, или (д) модифицированный нитевидный фаг, несущий варианты д3р, амилоидсвязывающие фрагменты д3р (не как часть экспрессируемого белка д3р), мутанты или варианты таких связывающих фрагментов, или гибридные белки, или другие гетерологичные полипептиды, которые содержат д3р, амилоидсвязывающие фрагменты д3р, или его мутанты, или варианты. Диагностический агент может дополнительно содержать детектируемую метку или, в другом случае, может детектироваться в условиях ш У1Уо.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композицию согласно настоящему изобретению, например композицию, содержащую растворимый д3р или амилоидсвязывающий фрагмент (включая его мутанты и варианты), или гибридный белок д3р применяют в качестве агента, визуализирующего амилоид. Визуализирующий агент может детектировать амилоид и диагностировать заболевания, связанные с амилоидом.
Поскольку композиции согласно настоящему изобретению связывают амилоид независимо от типа волокна, их преимущество заключается в том, что они могут визуализировать любой агрегат амилоида
- 30 029602
(бета-амилоид, тау, α-синуклеин и т.д.), все с помощью одного визуализирующего агента. В настоящее время отсутствуют приемлемые визуализирующие агенты/методы для детектирования агрегатов таубелков или альфа-синуклеина в ЦНС. Хотя существуют визуализирующие агенты для бета-амилоида, все еще существует необходимость в дополнительных агентах, которые могут обеспечить улучшенную корреляцию между когнитивной функцией и результатами визуальных исследований и/или обеспечивают лучший прогноз того, состояние каких пациентов ухудшится в сопоставлении с сохранением стабильности (см. для обзора Кекшск апД 8о|коуа, Акйешег'к Кек ТНег. (2011) 3(1):3).
Диагностические композиции согласно настоящему изобретению можно применять в качестве визуализирующих агентов в комбинации с визуализирующим агентом, который является специфичным для бета-амилоида, таким как, например, Р18-АУ-45, Ε1Ϊ ЬШу. Поскольку в настоящее время нет известных визуализирующих агентов для агрегатов бета-амилоида, применение диагностической композиции согласно настоящему изобретению вместе с визуализирующим агентом приведет к детектированию агрегатов бета-амилоида на основе дифференциального детектирования. Таким образом, в одном варианте реализации настоящего изобретения диагностическую композицию согласно настоящему изобретению применяют в качестве визуализирующего агента в комбинации с визуализирующим агентом для бетаамилоида для детектирования агрегатов, не включающих бета-амилоид.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения диагностическую композицию согласно настоящему изобретению применяют в качестве визуализирующего агента для обнаружения бетаамилоида в центральной нервной системе, включая мозг.
Для диагностической композиции согласно настоящему изобретению обычно требуется, чтобы амилоидсвязывающий компонент был присоединен к одной или более детектируемых меток, когда он используется в качестве визуализирующего агента. Различные метки могут быть прикреплены к амилоидсвязывающему компоненту диагностической композиции, используя стандартные методы введения метки в пептиды. Примеры меток включают флуоресцентные метки и радиоактивные метки. Существуют самые разнообразные радиоактивные метки, которые можно применять, но в целом метку обычно
18 11 123
выбирают из радиоактивных меток, которые включают, но не ограничиваются указанными, Р, С и I. Эти и другие радиоизотопы могут быть присоединены к белку с использованием хорошо известных химических способов. В одном варианте реализации настоящего изобретения метку детектируют с использованием позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ).
Однако для детектирования радиоактивной метки можно использовать любую другую подходящую методику для детектирования радиоизотопов.
Диагностические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить, используя те же пути, которые описаны для терапевтических композиций. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения в качестве пути введения диагностической композиции применяют интратекальное введение. Согласно другому варианту в качестве пути для введения диагностической композиции применяют внутривенное введение.
Примеры
Несмотря на то что продемонстрированная терапевтическая эффективность нитевидных фагов в качестве связывающих и антиагрегационных агентов не зависит от какого-либо конкретного механизма действия, понимание механизма позволяет разрабатывать фаги с большей терапевтической эффективностью. Кроме того, он является основой для разработки дополнительных антиагрегационных агентов.
Как отмечалось ранее, было показано, что М13 связывается и вызывает дезагрегацию по меньшей мере четырех различных типов амилоидных волокон: волокон бета-амилоида 1-42 (ΓΛβ42), волокон асинуклеина (Гакуп), волокон приона дрожжей NМ (ГЫМ) и волокон тау-белка (Г!аи). Четыре белка, которые входят в состав этих амилоидных волокон, имеют неродственные первичные аминокислотные последовательности, но все четыре белка неправильно свернуты с образованием канонической амилоидой структуры (ЕюЬпег апД КаДГогД, 2011). Способность М13 связываться с этими белками и вызывать дезагрегацию каждого из них указывает на то, что М13 распознает структурный участок, такой как кроссбета-складчатая конформация или конформационный элемент, такой как гидрофобные щели, которые являются определяющими характеристиками всех амилоидных волокон.
Однако дезагрегация амилоида не является общим свойством всех фагов. Например, структурно отличный икосаэдрический фаг Т7 не вызывает дезагрегации ГАв42, даже когда Т7 инкубируют с ГА342 в течение 3 дней при 37°С. Бактериофаг Т7 не проявил какой-либо диссоциативной активности даже в концентрациях, при которых М13 диссоциирует более 70% амилоидных волокон, проинкубированных с ним. Напротив, бактериофаг ГД, который несет отрицательно заряженную аминокислоту в его д8р по сравнению с М13 (и, следовательно, отображает в 2800 больше отрицательных зарядов/фаг, чем М13, учитывая количество копий д8р), связывал и вызывал дезагрегацию ГА342 сходно с М13. Эти начальные исследования вместе с выводом, что дезагрегация амилоида может также быть опосредована вирусом табачной мозаики (ВТМ), фимбриями Е. Сой и трубками хвоста Т4, все из которых также имеют спиральную цилиндрическую форму и повторяющиеся блоки (см. патент США 2011/0182948), позволяют предположить, что форма фага может быть критической для его активности в отношении диссоциации
- 31 029602
волокон амилоида.
Однако следующие примеры описывают альтернативный (хотя и не взаимоисключающий) механизм обнаруженного связывания и антиагрегационных свойств нитевидных фагов. На основании данных примеров и механизма действия, который они поддерживают, в настоящем изобретении предложены модифицированные фаги с улучшенным связыванием с амилоидом наряду с новыми амилоидсвязывающими агентами.
Пример 1. Фаг М13 преимущественно связывает фибриллы бета-амилоида.
Связывание М13 с фибриллами бета-амилоида по сравнению с мономерами бета-амилоида определяли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (8РК).
Фаг М13 преимущественно связывает фибриллы бета-амилоида; он не связывает мономеры бетаамилоида. Результаты исследования методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием 1014 фага/мл раствора, протекающего через чип биосенсора с иммобилизованным ΓΑβ, приведены на фиг. 3. На фиг. 3 показано, что К связывания М13 составляет приблизительно 4 нМ, что сопоставимо со связыванием бета-амилоида моноклональным антителом. Это высокоаффинное взаимодействие показывает, что между фагом и амилоидным волокном происходит процесс специфического связывания.
Пример 2. Связывание М13 с волокнами бета-амилоида зависит от дозы.
Связывание М13 с ΓΑβ42 также зависит от дозы. На фиг. 4Α приведено сравнение связывания фагов, взятых в двух дозах, с ΓΑβ42 при увеличении количества моль амилоида. В этом исследовании связывания М13 с волокнами амилоида меченый М13-Л1еха488 смешивали с бета-амилоидом (ΓΑβ) в течение 2-3 ч, чтобы обеспечить образование комплекса, затем комплекс осаждали центрифугированием при 7500 об/мин в течение 10 мин. Интенсивность флуоресценции в осадке была пропорциональна количеству М13, связанному с амилоидом. Это исследование обеспечивает как количественную оценку связывания фага с ΓΑβ, так и систему для оценки способности других агентов конкурировать с фагом за связывание. На фиг. 4В показано, что величина Кс для конкурентного связывания М13 сопоставима с той, которую наблюдали для связывания с помощью поверхностного плазмонного резонанса.
Пример 3. Связывание М13 с волокнами бета-амилоида требует нативной конформации.
Когда фаг М13 нагревают при 90°С в течение 10 мин, его способность конкурировать за связывание, по существу, исчезает.
На фиг. 5 приведены результаты исследования конкурентного связывания с волокнами амилоида с использованием термически обработанных фагов М13 (квадраты) по сравнению с фагами в нативной конформации (кружки).
Пример 4. Температура коррелирует с взаимодействиями М13-амилоид.
М13 активно дезагрегирует амилоидные волокна. На фиг. 8 приведены результаты флуориметрического исследования с использованием тиофлавина Т (ТФТ) и ΓΑβ. В присутствии М13 волокна ΓΑβ42 подвергаются дезагрегации.
На фиг. 7Α показано, что 10-кратное изменение концентрации соли в исследовании флуоресценции ТФТ (от 0,15 до 1,5 М) приводит только к 2-3 кратному процентному изменению ΓΑβ, который подвергается дезагрегации. Это означает, что гидрофобные взаимодействия отвечают за большую часть наблюдаемой дезагрегации.
В отличие от относительно небольшого эффекта концентрации соли, как показано на фиг. 7В, изменения температуры от 4 до 37°С приводят к 8-10-кратному различию уровней дезагрегации.
Эти результаты показывают, что М13-индуцированная дезагрегация зависит от белка, который является более активным при более высокой температуре и относительно нечувствительна к воздействию соли в исследовании, что подразумевает гидрофобное взаимодействие. Фаг §3ρ соответствует этому определению. Его домены Ν1 и Ν2 связаны между собой гибким линкером, обогащенным глицином, который "открывается" после связывания Ν2 с бактериальными Р-фимбриями. Затем Ν1 становится доступным для связывания бактериального корецептора, как части инфекционного процесса. Повышение температуры в исследовании дезагрегации, как ожидается, "открывает" домены Ν2 и Ν1 белка §3ρ.
В то время как инактивация М13 при высокой температуре (90°С, 10 мин, см. фиг. 5) устраняет связывание, повышение температуры инкубации в исследовании связывания М13-амилоид оказывает положительное влияние на связывание. На фиг. 8Α показано, что увеличение температуры от 18 до 58°С приводит к прогрессивному улучшению, вплоть до разворачивания шарнирной области при Тпл около 50°С, в этой точке связывание начинает уменьшаться. Эта оптимальная температура связывания соответствует температуре разворачивания Ν1-Ν2 (так называемая температура плавления или Тпл) в §3ρ, которая составляет 48,1°С.
Повышение температуры инкубации до 50°С по сравнению с 37°С также приводит к более быстрому связыванию М13 с ΓΑβ42 (фиг. 8В).
Пример 5. Для взаимодействия М13 с бета-амилоидом требуется §3ρ.
Чтобы непосредственно проверить, требуется ли §3ρ для взаимодействия М13 с бета-амилоидом, §3ρ был удален из фага путем протеолитической обработки с применением ЛгдС (Μ13Δ§3ρ), и фаг МЕ^^^} сравнивали с повторно свернутым фагом для определения связывания с бета-амилоидом. Об- 32 029602
работка с применением Αγ§0 протеазы ВасШик, избирательно удаляет субъединицы §3р из фага. Результаты представлены на фиг. 9А. Повторно свернутый М13 по-прежнему конкурирует с М13 дикого типа в исследовании конкурентного связывания, хотя на сниженном уровне. Тем не менее, даже 15-кратный избыток М13Д§3р незначительно конкурирует либо вообще не конкурирует с М13 дикого типа. Эта неспособность конкурировать с М13 дикого типа согласуется с потерей инфицирующей способности фага М13Д§3р (фиг. 9В). Обработка Αγ§Ε также привела к потере дезагрегирующей активности (фиг. 9С).
Если §3р выступает в качестве посредника при связывании способом, который аналогичен его роли в инфицировании, то домены Ν1 и Ν2, которые важны для инфицирования, также должны конкурировать с М13 за связывание. Чтобы проверить это рекомбинантный растворимый Ν1Ν2 ("ΓΚ-§3ρ(Ν1Ν2)"; "Конструкция 3") получали и испытывали в исследовании конкурентного связывания. Как показано на фиг. 10А и 10В, М13 конкурирует с меченым М13 за связывание с ίΑβ42, тогда как М13Д§3р - нет. В противоположность этому ΓΚ-§3ρ(Ν1Ν2) был способен конкурировать с М13, это указывает на то, что наличия доменов Ν1 и Ν2 §3р достаточно для связывания бета-амилоида. Аналогичные результаты были получены при повторении исследования конкурентного связывании (фиг. 10В).
Пример 6. Мутации, вызывающие разворачивание шарнирной области §3р, модулируют связывание амилоида.
Мутации, которые влияют на способность шарнирной области между доменами Ν1 и Ν2 в §3р открываться, также должны повлиять на способность фага, несущего эти мутации, конкурировать с М13 дикого типа за связывание с бета-амилоидом. В работе Ескей αηά Αΐιιηίά, 2007 описаны несколько вариантов фагов, которые были использованы для проверки этой гипотезы. Вариант "ААА" (также известный как "3А") ухудшает связывание с фимбриями и уменьшает стабильность домена Ν2. ААА несет следующие мутации в §3р: ν181Α, Ρ190Α и Ρ194Α. ΙΙΗΥ содержит мутации Τ13Ι, Τ101Ι, Ρ129Η и Ό209Υ, которые стабилизируют домен Ν2 и увеличивают Тпл.
Конкурентное связывание оценивали для фага ίά, который имеет ту же аминокислотную последовательность, что и §3р М13 в доменах Ν1 и Ν2 (фиг. 2); ΙΙΗΥ, который имеет более высокую Тпл шарнирной области, чем М13 и ААА. Фаги ίά, ААА и ΙΙΗΥ предварительно активировали при 50°С в течение 1,5 ч, затем активированные и неактивированные ίά, ААА и ΙΙΗΥ сравнивали по их способности конкурировать с меченым М13. Результаты представлены на фиг. 11. Фаг ίά дикого типа имел лучшую конкурентную активность при активировании нагреванием. Напротив, нагрев оказывал незначительное влияние на ΙΙΗΥ, который имеет более высокую Тпл шарнирной области. ААА, который имеет сниженную стабильность домена Ν2 по сравнению с М13, демонстрировал лучшую конкурентную активность как с предварительной термической обработкой, так и без нее.
Эти данные подтверждают вывод о том, что взаимодействие М13 с бета-амилоидом осуществляется через механизм, аналогичный тому, с помощью которого М13 инфицирует бактерии. Во-первых, они показывают, что гидрофобные взаимодействия важны для взаимодействия М13 и бета-амилоида. Вовторых, температурная зависимость связывания М13 и дезагрегирующей активности отражает Тпл разворачивания шарнирной области Ν1-Ν2. В-третьих, селективный протеолиз д3р устраняет взаимодействие М13 и бета-амилоида.
Пример 7. Фрагмент §3р селективно и активно связывает амилоид, но не его мономеры.
Для того чтобы оценить, сохраняет ли фрагмент §3р способность к связыванию с амилоидом, получали фрагмент §3р, содержащий Ν1 и Ν2, и исследовали методом поверхностного плазмонного резонанса (8РР) его способность связывать фибриллы бета-амилоида по сравнению с мономерами бетаамилоида. Результаты показывают, что τκ-^3ρ(Ν1Ν2) преимущественно связывает фибриллы бетаамилоида, но не связывает мономеры бета-амилоида. Результаты исследования методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием 4 мкМ τκ-^3ρ(Ν1Ν2) приведены на фиг. 13, из которого следует, что К связывания τκ-^3ρ(Ν1Ν2) составляет около 160 нМ. Это высокоаффинное взаимодействие указывает на то, что между τκ-^3ρ(Ν1Ν2) и амилоидными волокнами происходит процесс специфического связывания.
Дополнительные конструкции исследовали методом поверхностного плазмонного резонанса. Результаты представлены в таблице ниже.
- 33 029602
Аналиты ка (1/М*с) кб (1/с) КЕ
Конструкция 1 М13 2, беЗ 9,2е-б 3,59 нМ
Конструкция 3 гз-СЗР(Ν1Ν2), 25°С 1,5еЗ 2,4е-4 0,15 мкМ
Конструкция 3 гз-СЗР(Ν1Ν2), предварительно нагревали при 37°С 4, 1еЗ 2е-4 0,05 мкМ
Конструкция 4 гибридный белок гз-дЗр (Ν1Ν2)-ЫдС4Рс, 25°С 1,75е4 1,28е-4 7,32 нМ
Конструкция 5 гибридный белок гз-дЗр (Ν1Ν2)-ЫдС4Рс, 25°С 1,52е4 1,ббе-4 10,9 нМ
Конструкция б гибридный белок ШЫ2-1дС1Рс, 25°С 1,71е4 1,58е-4 9,2 нМ
Пример 8. Фрагмент д3р активно дезагрегирует волокна Αβ42.
Для того чтобы проверить, может ли фрагмент д3р дезагрегировать амилоидные волокна, 㧧3ρ(Ν1Ν2) исследовали флуориметрическим методом с использованием ТФТ, чтобы оценить его способность разлагать образованные ранее фибриллы £Άβ42. Результаты показывают, что Γδ-§3ρ(Ν1Ν2) активно дезагрегирует £Άβ42. На фиг. 14А приведены результаты этого эксперимента, которые показывают, что Γδ-§3ρ(Ν1Ν2) дезагрегирует £Άβ42 дозозависимым образом. Как показано на фиг. 14В, величина ИК50 составляет приблизительно 20 нМ.
В отдельном эксперименте Αβ42 инкубировали в присутствии или в отсутствие Γδ-§3ρ(Ν1Ν2) в концентрации 2 мкМ в течение семи дней при 37°С, и целостность волокон Αβ42 оценивали с помощью просвечивающей электронной микроскопии. На фиг. 15А приведены результаты этого эксперимента, показывающие, что Γδ-§3ρ(Ν1Ν2) дезагрегирует волокна Αβ42. На фиг. 15В приведены результаты исследования с использованием ТФТ на этих же образцах. Κδ-§3ρ(Ν1Ν2) разрушал образованные ранее волокна Αβ42 в этом исследовании с использованием ТФТ.
Пример 9. Γδ-§3ρ(Ν1Ν2) блокирует сборку α-синуклеина и бета-амилоида и Γδ-§3ρ(Ν1Ν2)-ΗΙ§Θ1-Ρϋ блокирует сборку и ингибирует агрегацию бета-амилоида.
Чтобы определить, может ли §3ρ блокировать сборку волокон α-синуклеина, а также определить, имеет ли значение валентность §3ρ (то есть число копий §3ρ), было проведено исследование способности пентамерного §3ρ (5 копий §3ρ) и мономерного §3ρ (одна копия §3ρ) блокировать активность αсинуклеина.
Результаты показывают, что §3ρ блокирует сборку волокон α-синуклеина, и в отношении этого вида активности пентамерный §3ρ является более эффективным, чем мономерный §3ρ (см. фиг. 16).
Также была проведена оценка способности Γδ-§3ρ(Ν1Ν2) (конструкция 3) и Γδ-§3ρ(Ν1Ν2)-ΗΙ§Θ1-Ρϋ (конструкция 6) ингибировать сборку Αβ42. Как показано на фиг. 30 и 31, конструкция 3 и конструкция 6 способны дозазависимо ингибировать сборку Αβ42. Как показано на фиг. 37, конструкция 3 и конструкция 6 способны ингибировать агрегацию £Άβ42.
Пример 10. Гибридный белок Γδ-§3ρ(Ν1Ν2)-Ι§ связывает и дезагрегирует бета-амилоид.
Для того чтобы оценить, влияет ли валентность §3ρ на активность связывания §3ρ с амилоидом, был получен гибридный белок 1д, который двухвалентен в отношении Γδ-§3ρ(Ν1Ν2) (гибридный белок "§3ρ(Ν1Ν2)-Ι§"), и его способность связываться с волокнами бета-амилоида была сопоставлена с таковой для пятивалентного М13. Как показано на фиг. 17, гибридный белок Γδ-§3ρ(Ν1Ν2)-Ι§ связывается с бетаамилоидом с аффинностью, которая близка к таковой для М13, и является более активным, чем 㧧3ρ(Ν1Ν2) по отдельности, это указывает на то, что валентность §3ρ может иметь важное значение. Αι 1алогичные результаты были получены при повторении исследования конкурентного связывания (см. фиг. 18). На фиг. 18 квадраты представляют конструкцию 2 (М13); треугольники представляют конструкцию 3 (Γδ-§3ρ(Ν1Ν2)); перевернутые треугольников представляют конструкцию 4 (гибридный белок 㧧3ρ(Ν1Ν2)-Ι§); и ромбы представляют собой отрицательный контроль γ-Ι§Θ4 Ге.
Для того чтобы оценить, влияет ли валентность на дезагрегацию, бивалентный гибридный белок 㧧3ρ(Ν1Ν2)-Ι§ (конструкция 4) сравнивали с пентавалентным М13 с помощью метода ловушки на фильтре (см. фиг. 19). Результаты показывают, что как двухвалентный гибридный белок Γδ-§3ρ(Ν1Ν2)-Ι§, так и пентавалентный М13 активно дезагрегируют волокна бета-амилоида. Также показано, что валентность играет важную роль в активности дезагрегации, о чем свидетельствует способность 1,7 нМ пентавалент- 34 029602
ного М13 снижать уровень агрегатов до величины, близкой к таковой для 40 нМ гибридного белка Г8д3рЩШ2)-1д (см. фиг. 19).
В аналогичном исследовании 1х1012/мл М13 (конструкция 2); 80 и 800 нМ г8-д3рЩШ2)-Ы§О4-Ес (конструкция 5) и 80 и 800 нМ г8-д3рЩШ2)-Ы§О1-Ес (конструкция 6) исследовали с помощью метода ловушки на фильтре, чтобы определить их способность дезагрегировать волокна А(/42. Конструкции 2, 5, и 6 активно дезагрегируют волокна бета-амилоида (см. фиг. 33).
Пример 11. Тетрамерный белок стрептавидин-[биотин-§3рЩШ2)] связывает и дезагрегирует ίΑβ.
Для того чтобы дополнительно оценить влияние валентности на способность §3р связывать и дезагрегировать амилоид, тетрамерный стрептавидин, конъюгированный с д3рЩШ2), получали путем комбинирования г8-д3рЩШ2) с комплексом биотин-лизин-нитрилотриуксусная кислота в присутствии Νί804. Избыток лиганда удаляли с помощью мембраны МАС0 3 кДа. Добавляли стрептавидин, и избыток г8-д3рЩШ2)-биотин удаляли с помощью мембраны МАС0 100 кДа. Полученная конструкция §3р, стрептавидин-[биотин-§3рЩШ2)], имеет четыре фрагмента г8-д3рЩШ2). Стрептавидин-[биотинд3рЩШ2)] сравнивали с г8-д3рЩШ2) (конструкция 3) в исследовании конкурентного связывания (см. фиг. 20). Тетрамерный стрептавидин-[биотин-§3р (Ν1Ν2)] связывал ίΑβ более активно, чем мономерный г8-д3рЩШ2), это дополнительно подтверждает, что валентность имеет важное значение для активности связывания (см. фиг. 20). Тем не менее, даже мономерный г8-д3рЩШ2) связался с ίΑβ в терапевтически приемлемых концентрациях.
Для того чтобы оценить влияние валентности на дезагрегацию, мономерный г8-д3рЩШ2) сравнивали с тетрамерным стрептавидин-[биотин-д3рЩШ2)] с помощью метода ловушки на фильтре (см. фиг. 21). Результаты показывают, что как мономерный г8-д3рЩШ2), так и тетрамерный стрептавидин[биотин-§3рЩШ2)] активно дезагрегируют волокна ίΑβ. Также показано, что валентность может играть важную роль в активности дезагрегации, о чем свидетельствует более высокая способность 360 нМ тетрамерного стрептавидин-биотин-[§3рЩШ2)] устранять агрегаты ίΑβ массой до 200 нг по сравнению со сниженной активностью 2,5 мкМ мономерного г8-д3рЩШ2) дезагрегировать бета-амилоид (см. фиг. 21), ряд 2 по сравнению с рядом 4, например.
Дезагрегацию бета-амилоида под действием стрептавидин-[биотин-д3рЩШ2)] также оценивали с помощью ПЭМ. Стрептавидин-[биотин-§3р (Ν1Ν2)] полностью дезагрегировал ίΑβ42 после трех дней инкубации (см. фиг. 22).
Пример 12. Гибридный белок Ν1Ν2-Ι§ значительно снижает уровень бета-амилоида в мышиной модели болезни Альцгеймера.
Используя хорошо известную мышиную модель для исследования болезни Альцгеймера (Ныао е! а1., 8с1епсе (1996) 274:99-102; ЭнускаегЪ е! а1., Α^;·ι №игора!Ьо1 (2008) 115:5-38), самцов мышей Т§2576 выращивали до возраста более 500 дней, затем в гиппокамп билатерально вводили (2 мкл/инъекцию) два различных препарата гибридного белка Ν1Ν2-Ι§ (конструкцию 5 в концентрации 7,8 пг/инъекцию и конструкцию 6 в концентрации 8,2 г/инъекцию) или физиологический раствор в качестве отрицательного контроля, мышей умерщвляли на 7-й день. Ткань мозга собирали, готовили срезы и окрашивали для количественной оценки нагрузки амилоидными бляшками с использованием моноклональных антител к бета-амилоиду (82Е1; каталожный номер МВ8490005-Ш0323 от МуВю8оигсе). Как показано на фиг. 28, оба гибридных белка Ν1Ν2-Ι§ значительно уменьшали нагрузку бляшками, измеренную в гиппокампе, по сравнению с нагрузкой у мышей, которым вводили физиологический раствор. Как показано на фиг. 29, оба гибридных белка Ν1Ν2-Ι§ значительно уменьшали нагрузку бляшками, измеренную в коре головного мозга, по сравнению с нагрузкой у мышей, которым вводили физиологический раствор.
Пример 13. Гибридный белок Ν1Ν2-Ι§ блокирует цитотоксичность, индуцированную олигомерами бета-амилоида.
Олигомеры бета-амилоида вызывают высвобождение некоторых токсических ферментов в нервных клетках. Можно провести исследование высвобождения ферментов, чтобы определить, ингибирует ли соединение цитотоксичность, индуцированную олигомерами бета-амилоида. На фиг. 32 представлены репрезентативные данные, показывающие, что М13 (конструкция 2) и г8-д3рЩШ2)-Ы§О1-Ес (конструкция 6) блокируют цитотоксичность, индуцированную олигомерами бета-амилоида в клетках линии Ν2ϋ Поэтому фрагменты §3р являются мощными ингибиторами цитотоксичности, индуцированной олигомерами бета-амилоида.
Пример 14. Гибридный белок Ν1Ν2-Ι§ связывает и дезагрегирует тау-белок.
Для того чтобы оценить, связывается ли фрагмент §3р с тау-белком, был получен гибридный белок фрагмент §3р-[§, содержащий Ν1 и Ν2, и его способность связывать фибриллярный тау-белок оценивали методом поверхностного плазмонного резонанса (8РК). На фиг. 35 приведены результаты одного репрезентативного исследования методом 8РК, которые показывают, что г8-д3рЩШ2)-Ы§О4-Ес (конструкция 4) активно связывает фибриллярный тау-белок.
Чтобы проверить, может ли фрагмент §3р дезагрегировать тау-белок, гибридный белок фрагмент §3-Ι§, содержащий Ν1 и Ν2, исследовали флуориметрическим методом с использованием ТФТ, чтобы оценить его способность разрушать образованные ранее агрегаты фибриллярного тау-белка. Результаты
- 35 029602
показывают, что гибридный белок Ν1Ν2-Ι§ активно дезагрегирует фибриллярный тау-белок (см. фиг. 36А и 36В).
Пример 15. Гибридный белок Ν1Ν2-Ι§ ингибирует накопление РгР8с, агрегацию и образование РгР8с в клеточной модели прионного заболевания Щ2а22Ь8с).
Прионные заболевания характеризуются превращением нормального клеточного прионного белка (РгРс) в устойчивую к действию протеазы патологическую форму РгР8с. РгР8с отличают от РгРс на основании устойчивости к действию протеазы: протеаза частично разрушает РгР8с с образованием устойчивого к действию протеазы С-концевого основного фрагмента (РгРгек), который имеет негликозилированную форму с молекулярной массой 19-21 кДа. Ингибирование, реверсия и снижение уровня РгР8с представляют собой целесообразные терапевтические подходы к лечению ряда дегенеративных заболеваний.
Чтобы определить, нарушает ли гибридный белок фрагмент д3р-1д, содержащий N1 и N2 (конструкция 6), образование патологических прионных конформеров (РгР8с) в моделях прионных заболеваний ίη νί!το, а также для проверки степени дезагрегации или изменения растворимости РгР в клетках линии №а22Ь8с в присутствии или в отсутствие конструкции 6, клетки культивировали в течение 24 ч в отсутствие или в присутствии 1 мкг/мл конструкции 6 или 1дС и собирали в буфере для лизиса. 100 мкг общего белка ультрацентрифугировали при 4°С в течение 90 мин при 55000 об/мин в роторе ТЬА 100.1 в ультрацентрифуге Весктап Орйта ТЬ. По 25 мкл образцов солюбилизированной клеточной массы и супернатантов подвергали электрофорезу в ДСН-ПААГ и далее исследовали с помощью мАт антитела к РгР 6Ό11. Увеличение нерастворимости в детергенте предшествует приобретению устойчивости мутантами РгР8с или РгР к действию протеиназы К (ПК), поэтому была проведена оценка способности конструкции 6 изменять растворимость РгР. Клетки, обработанные конструкцией 6, демонстрировали существенно сниженное количество агрегированного/нерастворимого РгР по сравнению с обработанными 1дС клетками линии Ша22Ь8с (см. фиг. 38А и 38В).
Для экспериментов, результаты которых приведены на фиг. 38А и 38В, клетки №а22Ь8с получали, как описано ранее (Рап1<1е\У1с/ е! а1., Еиг. ί. №иго8ск (2006) 23:2635-2647). В общих чертах, мозг неизлечимо больных мышей СИ-1, инфицированных штаммом приона 22Ь, адаптированным для мышиной модели, гомогенизировали путем ультразвуковой обработки (10% мас./об.) в холодном фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с 5% декстрозы в стерильных условиях. Для инфицирования гомогенат мозга далее разбавляли до 2% в Орй-МЕМ и добавляли в 6-луночные планшеты с субконфлюентной культурой (Согшпд, Ас!оп, Массачусетс, США), 1 мл в 10 см2 лунку. Через 5 ч добавляли 1 мл обычной МЕМ, и клетки инкубировали в присутствии гомогената инфицированного головного мозга в течение еще 12 ч. Клетки промывали и добавляли стандартную ростовую среду МЕМ. Клетки выращивали до достижения конфлюентности и затем разделяли на разведения в соотношении 1:2 и переносили в 25 см2 колбы (Согшпд). Клетки, выращенные в одной из колб, разделяли в соотношении 1:2 каждые 4 дня, чтобы получить следующий пассаж, тогда как клетки, выращенные в другой колбе, собирали и гомогенизировали для контроля уровня РгР8с. На основании данных предыдущих исследований наличие РгР8с, происходящего из инокулята, детектируется только в первом и втором пассажах, поэтому для всех последующих исследований были использованы клетки 4-го пассажа 4 (Р4). Клетки лизировали в буфере для гомогенизации, содержащем 50 мМ Трис-НС1, рН 7,4, 150 мМ №С1, 1 мМ этиленгликоль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭГТА), 1 мМ №цУО4. 1 мМ NаΡ, 2,5 мМ №Т2О7, 1 мМ β-лицерофосфата, 1% №-40, 0,25% дезоксихолата натрия, 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторида (РМ8Р), 1 мМ лейпептина, 1 мМ пепстатина А, 1 мМ) или без РМ8Р для расщепления протеиназой К в течение 5 мин при 4°С, нерастворимый материал удаляли центрифугированием при 10000 д в течение 10 мин при 4°С. Для клеточного фракционирования по 100 мкг белка центрифугировали при 55000 об/мин в течение 90 мин, после чего осадок восстанавливали до исходного объема. 20% осадка клеточной массы и супернатанта разделяли и исследовали биохимические характеристики.
Для того чтобы проверить, изменяет ли конструкция 6 дозозависимым образом распространение РгР8с посредством дезагрегации или изменения его физико-химических свойств, клетки Х2а22Б8с культивировали в течение 24 ч в отсутствие или в присутствии возрастающих концентраций конструкции 6 или 1дС и собирали в буфере для лизиса. Аликвоты лизированных клеток как обработанных ПК, так и не обработанных протеиназой, подвергали электрофорезу в ДСН-ПААГ и далее исследовали с использованием мАт к РгР 6И11 и 6Н4. Иммунореактивность РгР оценивали в разделенных биохимическими методами лизатах как расщепленных ПК, так и не расщепленных ПК, которые получали из контрольных клеток, обработанных 1дС, и клеток, обработанных конструкцией 6. Типы обработок включали Ша22Ь8с+10, 3, 1, 0,333, 0,111, 0,037, 0,012 и 0,004 мкг/мл конструкции 6 или Ша22Ь8с+1 мкг/мл т1дС.
Результаты показывают значительное дозозависимое снижение РгР8с в присутствии конструкции 6, причем в присутствии 0,08 мкг/мл конструкции 6 образуется на 50% меньше РгР по сравнению с 1 мкг/мл 1дС (см. фиг. 39А и 39В).
Повторные эксперименты подтвердили эти результаты.
Для оценки устойчивого к протеиназе К (ПК) конформера РгР аликвоты лизированных клеток обрабатывали ПК (1 мкг/мкг) в разведении 1:50 при 37°С в течение 30 мин в соответствии с описанными ранее способами (Ретег е! а1., ί. №игоскет (2004) 84:454-463, Рапк1е\ую/ е! а1., 2006). После инкубации
- 36 029602
расщепление останавливали добавлением РМ8Р до конечной концентрации 4 мМ.
Концентрацию белка определяли с использованием набора для анализа белка ВСА (Р1егсе). Образцы разводили в буфере для образцов (250 мМ Трис-НС1, рН 6,8, 10% ДСН, 5 мМ β-меркаптоэтанола, 50% глицерина, 0,02% кумасси синего С250) и кипятили в течение 5 мин. Обработанные образцы разделяли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях.
Моноклональное антитело к РгР 6И11 (см. §айо№8к1 е! а1., №игоЬю1 Όίδ. (2009) 34(2): 267-278) и 6Н4 (см. Согйек е! а1., ί 1ттипо1 Ме1йоЙ8 (2008) 337:106-120), а также антитела к актину использовали, чтобы охарактеризовать образцы. Комплексы антиген-антитело детектировали с помощью конъюгированного с пероксидазой хрена антитела к мышиному 1дС (СЕ Неаййсаге ик Ытйей, Бакингемшир, Великобритания) и визуализировали с использованием системы ЕСЬ (СЕ Неаййсаге ИК Ытйей) в соответствии с инструкциями изготовителя. Количественное определение белковых полос проводили денситометрическим методом, исследуя пленки (1таде ί. Национальный институт здоровья, США).
В совокупности результаты представлены на фиг. 38А и 38В и фиг. 39А и 39В и демонстрируют способность гибридного белка, фрагмент §3р-1§, непосредственно ингибировать образование РгР8с в условиях ίη уйго.

Claims (20)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Фармацевтическая композиция, предназначенная для применения в лечении заболевания, связанного с неправильно свернутым и/или агрегированным амилоидным белком, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество либо а) полипептида, который связывается с амилоидом и содержит по меньшей мере один белок гена 3 дикого типа (§3р), мутант д3р, вариант д3р или связывающий амилоид фрагмент дикого типа, мутанта или варианта д3р; либо Ь) гибридного белка, содержащего полипептид, который гибридизован с доменом белка, с которым он обычно связан; причем указанная композиция не содержит бактериофага.
  2. 2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что полипептид содержит связывающий амилоид фрагмент домена Ν2 дикого типа, или мутанта, или варианта д3р.
  3. 3. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что полипептид содержит полный домен Ν2 дикого типа, мутанта или варианта д3р.
  4. 4. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что полипептид дополнительно содержит фрагмент домена Ν1 белка дикого типа, мутанта или варианта д3р.
  5. 5. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что полипептид содержит фрагмент Ν1-Ν2 дикого типа, или мутанта, или варианта д3р.
  6. 6. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что д3р дикого типа или связывающий амилоид фрагмент д3р дикого типа идентичен аминокислотной последовательности соответствующей части 8ЕО ГО ΝΟ:1.
  7. 7. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что аминокислотная последовательность мутанта, или варианта д3р, или его связывающего амилоид фрагмента по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности соответствующей части 8ЕО ГО ΝΟ:1.
  8. 8. Фармацевтическая композиция по п.7, отличающаяся тем, что полипептид содержит фрагмент Ν1-Ν2 мутанта или варианта д3р, где Ν1-Ν2 имеет сниженную Тпл и более высокую аффинность к амилоиду по сравнению с соответствующим полипептидом, содержащим фрагмент Ν1-Ν2 дикого типа.
  9. 9. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-8, отличающаяся тем, что полипептид, содержащий по меньшей мере один д3р дикого типа, связывающий амилоид фрагмент д3р дикого типа, мутант или вариант д3р или связывающий амилоид фрагмент мутанта или варианта д3р, гибридизован с фрагментом Рс константной области иммуноглобулина.
  10. 10. Фармацевтическая композиция по п.9, отличающаяся тем, что фрагмент Рс выбран из 1дС1, 1дС2, 1§С3, 1§С4 или 1дМ.
  11. 11. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-10, отличающаяся тем, что заболевание, подлежащее лечению, выбирают из болезни Альцгеймера, раннего начала болезни Альцгеймера, позднего начала болезни Альцгеймера, предсимптоматической болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, амилоидоза САА, наследственного исландского синдрома, старости, множественной миеломы, прионных заболеваний, куру, болезни Крейтцфельдта-Якоба (БКЯ), синдрома Герстманна-Штраусслера-Шейнкера (С88), фатальной семейной бессонницы (РР1), скрейпи, губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота (БФБ); бокового амиотрофического склероза (БАС), спиноцеребеллярной атаксии (8СА10, §СА3, §СА6 или СА7), болезни Хантингтона, дентато-рубро-паллидо-льюисовой атрофии, спинно-мозговой и бульбарной мышечной атрофии, наследственной церебральной амилоидной ангиопатии, семейного амилоидоза, лобно-височной долевой дегенерации (РТЬИ), британской/датской деменции и семейной энцефалопатии.
  12. 12. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-11, отличающаяся тем, что применение
    - 37 029602
    включает лечение пациента, который является положительным в отношении биомаркера флорбетапира, при использовании этого биомаркера в качестве визуализирующего агента в позитронно-эмиссионной томографии.
  13. 13. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-12, отличающаяся тем, что заболевание, подлежащее лечению, представляет собой болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера или болезнь Хантингтона.
  14. 14. Композиция, предназначенная для диагностики заболевания, связанного с неправильно свернутым и/или агрегированным амилоидным белком, содержащая детектируемую метку, присоединенную к эффективному количеству либо полипептида, который связан с амилоидом, либо гибридного белка, содержащего полипептид, который гибридизован с доменом белка, с которым он обычно не связан, отличающаяся тем, что полипептид содержит д3р дикого типа, связывающий амилоид фрагмент д3р дикого типа или мутант, вариант или связывающий амилоид фрагмент мутанта или варианта д3р.
  15. 15. Композиция по п.14, отличающаяся тем, что детектируемая метка представляет собой радиоак18 11 123
    тивную метку, выбранную из Г, С или I.
  16. 16. Композиция, содержащая связывающий амилоид полипептид, который гибридизован по меньшей мере с одним доменом белка, с которым он обычно не связан, отличающаяся тем, что полипептид содержит д3р дикого типа, связывающий амилоид фрагмент д3р дикого типа, который содержит полный домен N2 дикого типа, мутант, вариант, или связывающий амилоид фрагмент мутанта или варианта д3р, который содержит полный домен N2 д3р, причем мутант или вариант отличается от соответствующей части д3р дикого типа только аминокислотной заменой и/или вставкой.
  17. 17. Композиция по п.16, отличающаяся тем, что д3р дикого типа, мутант д3р, вариант д3р или связывающий амилоид фрагмент д3р дикого типа, мутант или вариант д3р гибридизован с белком, выбранным из:
    a) константной области иммуноглобулина;
    b) фрагмента Гс иммуноглобулина;
    c) фрагмента Гс 1дО или ά) фрагмента Гс 1дМ.
  18. 18. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и фармацевтически эффективное количество полипептида, который связывает амилоид, отличающаяся тем, что полипептид содержит д3р дикого типа, связывающий амилоид фрагмент д3р дикого типа, который содержит полный домен N2, мутант или вариант д3р, или связывающий амилоид фрагмент мутанта или варианта д3р, который содержит полный домен N2, причем мутант или вариант отличается от соответствующей части д3р дикого типа только аминокислотной заменой и/или вставкой, и где фармацевтическая композиция не содержит бактериофага.
  19. 19. Фармацевтическая композиция по п.18, отличающаяся тем, что аминокислотная последовательность мутанта, или варианта д3р, или связывающего амилоид фрагмента по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% идентична соответствующей части δΕρ ΙΌ N0:1.
  20. 20. Способ детектирования амилоида в биологическом образце, полученном от пациента, включающий следующие этапы:
    a) обеспечение контакта биологического образца с полипептидом, который связывает амилоид, причем указанный полипептид содержит детектируемую метку и по меньшей мере один д3р дикого типа, связывающий амилоид фрагмент д3р дикого типа, мутант или вариант д3р или связывающий амилоид фрагмент мутанта или варианта д3р, и причем полипептид не содержит бактериофага; и
    b) детектирование меченого конъюгата полипептид-амилоид.
EA201491063A 2011-11-29 2012-11-28 Применение белков р3 бактериофага в качестве агентов, связывающих амилоид EA029602B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161564602P 2011-11-29 2011-11-29
US201261708709P 2012-10-02 2012-10-02
US201261730316P 2012-11-27 2012-11-27
PCT/US2012/066793 WO2013082114A1 (en) 2011-11-29 2012-11-28 Use of p3 of bacteriophage as amyloid binding agents

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201491063A1 EA201491063A1 (ru) 2015-02-27
EA029602B1 true EA029602B1 (ru) 2018-04-30

Family

ID=47326403

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201792608A EA201792608A3 (ru) 2011-11-29 2012-11-28 Применение белков p3 бактериофага в качестве агентов, связывающих амилоид
EA201491063A EA029602B1 (ru) 2011-11-29 2012-11-28 Применение белков р3 бактериофага в качестве агентов, связывающих амилоид

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201792608A EA201792608A3 (ru) 2011-11-29 2012-11-28 Применение белков p3 бактериофага в качестве агентов, связывающих амилоид

Country Status (16)

Country Link
US (3) US9493515B2 (ru)
EP (1) EP2785364B1 (ru)
JP (2) JP6220344B2 (ru)
KR (1) KR20140100543A (ru)
CN (2) CN114748605A (ru)
AU (1) AU2012346056B2 (ru)
BR (1) BR112014013086A2 (ru)
CA (1) CA2857539C (ru)
EA (2) EA201792608A3 (ru)
IL (1) IL232867B (ru)
IN (1) IN2014CN04587A (ru)
MX (1) MX362175B (ru)
PH (1) PH12014501200B1 (ru)
SG (2) SG11201402425TA (ru)
WO (1) WO2013082114A1 (ru)
ZA (1) ZA201403863B (ru)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013082114A1 (en) 2011-11-29 2013-06-06 Neurophage Pharmaceuticals, Inc. Use of p3 of bacteriophage as amyloid binding agents
MX358755B (es) 2012-10-02 2018-09-03 Proclara Biosciences Inc Uso del p3 de proteinas de fusion de bacteriofago como agentes de union amiloides.
EA030389B1 (ru) * 2013-05-28 2018-07-31 Проклара Байосайенсиз, Инк. ПОЛИПЕПТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ИЗМЕНЕННУЮ АМИНОКИСЛОТНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ g3p БАКТЕРИОФАГА С ПОНИЖЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ
TW201632542A (zh) * 2014-12-03 2016-09-16 神經噬菌體製藥股份有限公司 包含缺乏醣基化信號之修飾噬菌體ｇ３ｐ胺基酸序列的多肽
CN108350436B (zh) * 2015-11-25 2021-07-16 伊莱利利公司 噬菌体展示载体和使用方法
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
CA3068880A1 (en) * 2017-07-14 2019-01-17 Gce Holding Ab Electronic gauge
MX2020013525A (es) 2018-06-15 2021-02-26 Proclara Biosciences Inc Motivo de interaccion amiloide general.
WO2024119183A1 (en) 2022-12-02 2024-06-06 Alzheon, Inc. Methods for treating neurodegenerative disorders with tramiprosate

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004018685A2 (de) * 2002-08-20 2004-03-04 Nemod Immuntherapie Ag Aktive fusionsproteine und verfahren zu ihrer herstellung
WO2006083795A1 (en) * 2005-02-01 2006-08-10 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Method for treating inflammation associated with amyloid deposits and brain inflammation involving activated microglia
US20090105090A1 (en) * 2006-04-06 2009-04-23 Fumiaki Uchiyama Phage Display By Novel Filamentous Bacteriophage
WO2009143465A1 (en) * 2008-05-22 2009-11-26 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Method of imaging abnormal deposits or plaques

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3941763A (en) 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
EP0417563B1 (de) 1989-09-12 2000-07-05 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
US6552170B1 (en) 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
SG47099A1 (en) 1991-03-15 1998-03-20 Amgen Boulder Inc Pegylation of polypeptides
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
ES2252732T3 (es) 1992-05-26 2006-05-16 Immunex Corporation Nueva citoquina que une cd30.
EP1724282B1 (en) 1997-05-21 2013-05-15 Merck Patent GmbH Method for the production of non-immunogenic proteins
CA2342967A1 (en) 1998-12-08 2000-06-15 Biovation Limited Modifying protein immunogenicity
US20020052311A1 (en) 1999-09-03 2002-05-02 Beka Solomon Methods and compostions for the treatment and/or diagnosis of neurological diseases and disorders
US8022270B2 (en) 2000-07-31 2011-09-20 Biolex Therapeutics, Inc. Expression of biologically active polypeptides in duckweed
HUP0303171A2 (hu) 2001-02-19 2003-12-29 Merck Patent Gmbh Csökkentett immunogenitású mesterséges fehérjék
KR20030082962A (ko) 2001-03-08 2003-10-23 메르크 파텐트 게엠베하 감소된 면역원성을 갖는 개질된과립구대식세포집락자극인자(ｇｍ-ｃｓｆ)
CA2496207A1 (en) 2002-08-20 2004-03-04 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Method for the production of zeaxanthin and/or the biosynthetic intermediates and/or subsequent products thereof
PT2361638E (pt) * 2005-12-12 2014-04-17 Ac Immune Sa Anticorpos monoclonais específicos beta 1-42 com propriedades terapêuticas
WO2007094003A2 (en) 2006-02-15 2007-08-23 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Viral display vehicles for treating multiple sclerosis
JP2009529320A (ja) 2006-02-15 2009-08-20 ラモット・アット・テルアビブ・ユニバーシティ 脳への送達のための抗体および免疫複合体のバインダーとしてのプロテインａをディスプレイする繊維状バクテリオファージ
WO2007109733A2 (en) * 2006-03-21 2007-09-27 The Johns Hopkins University Diagnostic and prognostic markers and treatment strategies for multiple sclerosis
CA2659032A1 (en) 2006-07-21 2008-01-24 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Method for inhibiting or treating a disease associated with intracellular formation of protein fibrillar inclusions or aggregates
SG10201502661SA (en) 2006-10-11 2015-05-28 Antitope Ltd T cell epitope databases
WO2010011947A2 (en) * 2008-07-25 2010-01-28 Abbott Laboratories AMYLOID ß PEPTIDE ANALOGUES, OLIGOMERS THEREOF, PROCESSES FOR PREPARING AND COMPOSITIONS COMPRISING SAID ANALOGUES OR OLIGOMERS, AND THEIR USES
WO2010036860A2 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Wyeth Llc Compatible display vector systems
JP2012509672A (ja) 2008-11-24 2012-04-26 ラモト アト テル−アヴィヴ ユニバーシティ リミテッド 繊維状バクテリオファージを使用してパーキンソン病を処置するための方法
WO2011084714A2 (en) 2009-12-17 2011-07-14 Biogen Idec Ma Inc. STABILIZED ANTI-TNF-ALPHA scFv MOLECULES OR ANTI-TWEAK scFv MOLECULES AND USES THEREOF
BR112013023040A2 (pt) 2011-03-11 2018-10-23 Univ Ramot bacteriófago filamentoso, composição farmacêutica, e, métodos para reduzir a formação de fibrilas de proteína tau ou para desagregar fibrilas pré-formadas de proteína tau em um paciente, e para tratar uma tauopatia degenerativa.
US8856364B2 (en) 2011-03-11 2014-10-07 Google Inc. Conducting opportunistic network updates on a mobile device
WO2013082114A1 (en) 2011-11-29 2013-06-06 Neurophage Pharmaceuticals, Inc. Use of p3 of bacteriophage as amyloid binding agents
MX358755B (es) 2012-10-02 2018-09-03 Proclara Biosciences Inc Uso del p3 de proteinas de fusion de bacteriofago como agentes de union amiloides.
EA030389B1 (ru) 2013-05-28 2018-07-31 Проклара Байосайенсиз, Инк. ПОЛИПЕПТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ИЗМЕНЕННУЮ АМИНОКИСЛОТНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ g3p БАКТЕРИОФАГА С ПОНИЖЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ
TW201632542A (zh) 2014-12-03 2016-09-16 神經噬菌體製藥股份有限公司 包含缺乏醣基化信號之修飾噬菌體ｇ３ｐ胺基酸序列的多肽

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004018685A2 (de) * 2002-08-20 2004-03-04 Nemod Immuntherapie Ag Aktive fusionsproteine und verfahren zu ihrer herstellung
WO2006083795A1 (en) * 2005-02-01 2006-08-10 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Method for treating inflammation associated with amyloid deposits and brain inflammation involving activated microglia
US20090105090A1 (en) * 2006-04-06 2009-04-23 Fumiaki Uchiyama Phage Display By Novel Filamentous Bacteriophage
WO2009143465A1 (en) * 2008-05-22 2009-11-26 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Method of imaging abnormal deposits or plaques

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KATHER, I. BIPPES, C.A. SCHMID, F.X.: "A Stable Disulfide-free Gene-3-protein of Phage fd Generated by In vitro Evolution", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, ACADEMIC PRESS, UNITED KINGDOM, vol. 354, no. 3, 2 December 2005 (2005-12-02), United Kingdom, pages 666 - 678, XP005165892, ISSN: 0022-2836, DOI: 10.1016/j.jmb.2005.09.086 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2785364A1 (en) 2014-10-08
US20140335016A1 (en) 2014-11-13
CN114748605A (zh) 2022-07-15
PH12014501200A1 (en) 2014-09-08
EA201792608A3 (ru) 2018-08-31
MX362175B (es) 2019-01-07
EP2785364B1 (en) 2019-01-09
AU2012346056B2 (en) 2018-02-22
JP2015505823A (ja) 2015-02-26
AU2012346056A1 (en) 2014-07-03
EA201792608A2 (ru) 2018-04-30
MX2014006337A (es) 2016-02-10
PH12014501200B1 (en) 2014-09-08
CA2857539A1 (en) 2013-06-06
WO2013082114A1 (en) 2013-06-06
US20170115311A1 (en) 2017-04-27
ZA201403863B (en) 2019-03-27
JP6220344B2 (ja) 2017-10-25
JP6440765B2 (ja) 2018-12-19
US10151762B2 (en) 2018-12-11
BR112014013086A2 (pt) 2020-10-27
US20160009766A1 (en) 2016-01-14
CN104093414A (zh) 2014-10-08
IL232867B (en) 2019-12-31
EA201491063A1 (ru) 2015-02-27
SG11201402425TA (en) 2014-06-27
JP2017122124A (ja) 2017-07-13
US9493515B2 (en) 2016-11-15
CA2857539C (en) 2021-08-03
IL232867A0 (en) 2014-07-31
SG10201709849TA (en) 2017-12-28
IN2014CN04587A (ru) 2015-09-18
US9493516B2 (en) 2016-11-15
KR20140100543A (ko) 2014-08-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA029602B1 (ru) Применение белков р3 бактериофага в качестве агентов, связывающих амилоид
US10526377B2 (en) Fusion proteins comprising P3 of bacteriophage
JP7549536B2 (ja) 全般的アミロイド相互作用モチーフ（ｇａｉｍ）
AU2019287623B2 (en) General amyloid interaction motif (GAIM)
EA046070B1 (ru) Общий амилоид-взаимодействующий мотив (gaim)