CN105925596A - 基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物技术领域的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，包括如下步骤：构建表达免疫毒素中具有导向功能的多肽和具有毒性功能的多肽的载体DNA片段，将所述两种多肽的载体DNA片段与内含肽的N端或C端分别连接，形成融合表达载体；取步骤一所述的融合表达载体，表达，得到融合内含肽N端的融合多肽A以及融合内含肽C端的融合多肽B；取融合多肽A和融合多肽B，混合，在内含肽对应的反式剪接条件下，诱导，得到免疫毒素。本发明的方法只需要制备不同的导向部分多肽以及毒性部分多肽，就可以将其进行组合，进而产生可以针对不同靶点及拥有不同毒性机制的免疫毒素，具有显著的多样性及灵活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域的药用重组蛋白的合成方法，具体地讲，涉及一种基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法。
背景技术
免疫毒素是一种融合蛋白，包含导向多肽部分，毒性多肽部分，和/或接头多肽部分。自从单克隆抗体于1957年被Kohlor应用杂交瘤技术首次制备出来，其就在医学研究以及疾病的临床诊断和治疗领域展示出了广阔的应用前景。长期以来，人们致力于利用单克隆抗体治疗多种疾病，例如肿瘤、自身免疫疾病等等，然而单独使用单克隆抗体的效果有时并不理想。为了达到更有效的治疗效果，人们将一些具有细胞毒性的蛋白与单抗结合，形成了具有选择性杀伤与之相结合的细胞的“免疫毒素”，为疾病的靶向治疗的弹药库装备了新的弹药。
免疫毒素(immunotoxins,ITs)是指将具有导向功能的蛋白与毒素蛋白相结合而产生的一种蛋白分子。其中具有导向性功能的部分主要负责引导免疫毒素蛋白分子与靶细胞的特异性结合，而毒素蛋白部分则主要是起到对细胞进行杀伤的作用。
从免疫毒素发展演变的进程来看，免疫毒素的制备生产主要有化学偶联法和重组表达法两大类。化学偶联法制备免疫毒素首先需要单独制备抗体和毒素，随后通过化学偶联的方式将二者相连而制得免疫毒素。化学偶联法的偶联效率低，生产成本较高，且由于蛋白上可能发生偶联反应的位点众多而导致产品均一性差，另外偶联的化学键在体内循环时倾向于降解，使得裸毒素泄露而导致非特异性毒性，有较大的毒副作用风险，而降解产生的裸抗体则可能封闭抗原，使得治疗效果不佳。而随着基因工程的发展，使得免疫毒素的制备生产进入了新的时代。人们利用基因重组技术将编码导向功能多肽的基因与编码毒素多肽的基因相融合并在适当的表达系统中进行表达。采用这一技术方案生产的免疫毒素我们可以称之为基因工程免疫毒素，它相比化学偶联法制造的免疫毒素而言在产品均一性和稳定性上有了大幅提高，并且使得大量生产免疫毒素成为可能。但基因工程法生产免疫毒素也有其局限性：融合基因被限制在单一宿主中进行表达，而构成免疫毒素的导向部分和毒性部分往往需要不同的宿主表达环境这一矛盾往往导致采用单一的宿主表达目的免疫毒素不能获得很好的产量、收率、纯度以及随之而来的成本的提高。例如目前多采用大肠杆菌表达系统表达单链抗体免疫毒素，由于免疫毒素的导向部分在大肠杆菌表达系统中不能很好的折叠而往往形成包涵体，而包涵体的复性是一个非常复杂的过程，一般来说，蛋白质的复性效率在20％左右；而毒素蛋白对真核细胞具有致命毒性，若采用真核表达系统则可能对宿主细胞产生毒害，但是也有研究人员对利用真核表达系统表达免疫毒素做了大量的工作，如专利CN1863921公开了一种在毕赤酵母以及EF-2突变型毕赤酵母中表达免疫毒素的方法，虽然采用分泌表达的方式在毕赤酵母以及EF-2突变型(毒素免疫型)毕赤酵母表达系统中成功表达了免疫毒素，较长的发酵周期获得的较低的产量相比于原核表达系统而言并不具备竞争力，且毒素蛋白上的糖基化位点可能被宿主进行糖基化修饰，有可能引入产品不均一性；文献披露了一种在EF-2突变型的CHO细胞中表达免疫毒素的方法，该方法同样遭遇了表达量低下、发酵周期长、成本高昂以及潜在的糖基化的风险(Protein expression and purification,2000,19(2):304-311)。
内含肽是指存在于前体蛋白当中的一段序列，在前体蛋白转化为成熟蛋白质的过程中，依靠自剪接功能将内含肽两端的外显肽以肽键连接，同时将自身从前体蛋白中释放出来。内含肽从结构和功能上可以分割为N端和C端，当N端或C端单独存在时不能发生剪接反应，而只有当N端和C端在适合剪接的条件下接触时才能发生剪接反应。断裂内含肽可以是人为地将连续内含肽从适当位置断开成两个多肽片段，也可以是天然存在的。天然断裂内含肽是一类由两个分别转录和表达的基因编码的两个多肽片段，这些断裂内含肽在接触时会自组合并以反式剪接方式催化外显肽的连接。内含肽在生物技术应用中应用广泛，包括使用内含肽的剪接活性介导蛋白质连接(intein-mediated proteinligation,IPL)、蛋白质环化、蛋白质标记、毒性蛋白表达、引入非天然氨基酸、研究体内蛋白质互作等。利用内含肽及其变体介导蛋白质纯化并在大规模蛋白质生产中应用也日益受到关注。因此，本领域需要提供一种通用、易于操作、成本低廉获取融合免疫毒素的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法。本发明克服现有的利用化学偶联或融合表达方法制备免疫毒素技术中产品不均一、操作步骤多、目的蛋白对表达宿主有毒性等等不足，提供一种分别制备具有导向功能的多肽和具有细胞毒性的多肽并利用内含肽的反式剪接功能将其连接在一起，从而得到免疫毒素的方法。
本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明涉及一种基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一，构建表达免疫毒素中具有导向功能的多肽和具有毒性功能的多肽的载体DNA片段，将所述两种多肽的载体DNA片段与内含肽的N端或C端分别连接，形成融合表达载体；其中，所述含有内含肽N端的融合表达载体与含有内含肽C端的融合表达载体所表达的多肽需成对存在，以使得反式剪接反应能够发生；
步骤二，取步骤一所述的融合表达载体，分别在合适的宿主细胞中进行表达，得到融合内含肽N端的融合多肽A以及融合内含肽C端的融合多肽B；
步骤三，取融合多肽A和融合多肽B，混合，在内含肽对应的反式剪接条件下，诱导免疫毒素的导向功能的多肽以及具有毒性功能的多肽部分进行反式剪接，得到免疫毒素。
优选地，步骤一中，所述内含肽为人工断裂内含肽、或天然断裂内含肽，或具有剪接功能的内含肽突变体。
优选地，步骤一中，所述内含肽为Ssp DnaB、Ssp DnaE或Npu DnaE。
优选地，步骤一中，所述内含肽N端的C末端或C端的N末端还融合有功能性多肽。
优选地，所述功能性多肽为MBP或ChBD标签蛋白。
优选地，步骤一中，所述融合表达载体的构成为导向功能多肽-内含肽N端、或内含肽C端-毒性功能多肽，或毒性功能多肽-内含肽N端、或内含肽C端-导向功能多肽，或导向功能多肽-内含肽N端-功能多肽、或功能多肽-内含肽C端-毒性功能多肽，或毒性功能多肽-内含肽N端-功能多肽、功能多肽-内含肽C端-导向功能多肽。
优选地，步骤一中，所述具有导向功能的多肽为抗体、单链抗体scFv、二硫键稳定抗体dsFv、二硫键稳定单链抗体dsscFv、Fab抗体、细胞因子、或生长因子。
优选地，步骤一中，所述具有毒性功能的多肽为RIP型毒素；具体为蓖麻毒素、ADP核糖基化免疫毒素，白喉毒素、或绿脓杆菌外毒素部分的融合蛋白，或具有毒素生物活性的突变体。
优选地，步骤二中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、高扩酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、酵母、中国仓鼠卵巢细胞、或人肾胚细胞。
优选地，步骤三中，还包括分离纯化进而获得免疫毒素的步骤。
优选地，所述分离纯化的方法为亲和层析方法、离子交换层析方法、或疏水作用层析方法。
优选地，步骤三中，所述反式剪接条件为能够触发指定内含肽完成自剪接的条件。
优选地，当内含肽为Npu DnaE时，反式剪接条件为：0-55℃，pH为3-11，接触时间1s-60h，终浓度为0.05mM-100mM的亲核试剂。
优选地，所述亲核试剂为DTT，DTE，CYSTEINE，TCEP，或MESNA亲核性试剂。
本领域技术人员进一步知晓，本发明的制备方法中，步骤一中，所述的内含肽是具有自剪接功能的内含肽，可为野生型或可包含相对于野生型的变异，优选为具有反式剪接功能的内含肽，如人工断裂内含肽、天然断裂内含肽，优选为天然断裂内含肽，如SspDnaB、Ssp DnaE或Npu DnaE，优选为Npu DnaE；在涉及利用内含肽的剪接功能的实施方案中，内含肽与目的蛋白之间的接头可以包含天然外显肽序列。本文中所用术语“外显肽”是指天然发现的、与内含肽或内含肽结构域邻近的序列，例如对应野生型Npu DnaE，C端外显肽可以是CFNAS、CFNK，CFN，CF，C。步骤一中，所述的毒性功能多肽可以包括RIP型毒素如蓖麻毒素、ADP核糖基化免疫毒素，如白喉毒素、绿脓杆菌外毒素部分的融合蛋白等。毒素部分可以为截短型(truncated)部分和/或可包含相对于野生型毒素的变异。步骤一中，所述的表达载体是本领域技术人员已知的各种表达载体或其修改变体，本领域技术人员可根据常规手段来获得编码目标多肽的DNA分子，并通过本领域熟知的各种方法，将其与所述的表达载体中表达调控序列相连；步骤一中，所述的免疫毒素中具有导向功能的多肽可以是抗体、单链抗体scFv、二硫键稳定抗体dsFv、二硫键稳定单链抗体dsscFv、Fab抗体、细胞因子、生长因子等本领域技术人员所熟知的具有免疫亲和吸附能力的多肽，本领域技术人员可以根据靶细胞，选择在免疫毒素中使用何种多肽。
步骤二中，所述宿主细胞可以包括原核细胞和真核细胞，例如常用的原核宿主细胞大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等等，常用的真核宿主细胞高扩酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞等。本发明中所述的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、酵母、中国仓鼠卵巢细胞、人肾胚细胞等。本领域技术人员熟知，用表达载体转化/转染宿主细胞的方法有很多种，所用的转化方法和转化程序取决于待转化的宿主。例如原生质体融合、电穿孔、脂质体介导转染、阳离子介导转染等；在适合目的多肽表达的条件下，培养转化/转染获得的宿主细胞，随后根据目的多肽的性质以及定位，可以选择本领域技术人员熟知的各种蛋白纯化步骤，如亲和层析(包括但不限于Protein A、ProteinGProteinL、IMAC等)、疏水作用层析、离子交换层析、透析等分离纯化手段。
步骤三中，所述的分离纯化可采用常规的蛋白纯化步骤。步骤三中，混合是指将一种物质置于与另一种物质发生物理关联的条件下接触。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：传统生产免疫毒素的技术方法中存在诸多不足之处，如化学偶联法中需要加入化学试剂，由于导向多肽部分中修饰位点较多而导致的产品不均一，同时化学偶联键容易断裂而导致毒性渗漏等；而直接表达免疫毒素融合蛋白的策略中，若采用原核表达系统，则目的蛋白往往以包涵体形式存在，复性效率低且步骤繁琐过程复杂，若采用真核表达系统则免疫毒素的表达可能受限于其对宿主细胞存在的天然毒性。本发明的方法则克服了在免疫毒素生产的传统策略中存在的不足，实现了意想不到的技术效果：
1、本发明的方法只需要制备不同的导向部分多肽以及毒性部分多肽，就可以将其进行组合，进而产生可以针对不同靶点及拥有不同毒性机制的免疫毒素，具有显著的多样性及灵活性；
2、本发明的方法中，导向部分多肽和毒性部分多肽可以在适当的宿主细胞中分开表达，如需要特殊的折叠环境，特别是高级的翻译后修饰，可以在哺乳动物细胞中进行表达，而没有太多修饰需求的多肽可以在大肠杆菌中进行表达，在适合的表达系统中分别表达目的多肽可以获得较高的产量、收率以及纯度；
3、本发明的方法中，导向部分多肽和毒素部分多肽的连接是位点特异性的，不会生产副产物，得到的产物产品均一性高；
4、本发明的方法中，导向性部分多肽和毒素部分多肽经由内含肽的自剪接，是由肽键连接在一起，相比于化学偶联法等连接方式具有良好的稳定性；
5、本发明的方法中，自剪接反应条件温和、反应高效，易于与其他工艺进行整合、放大；反应过程无需加入有毒有害作用物质。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的利用内含肽制备免疫毒素的方法的实施例1中用SDS-PAGE检测经过Ni-Sepharose层析柱纯化的融合蛋白Nc-PE3KDEL的结果示意图。
图2为本发明的利用内含肽制备免疫毒素的方法的实施例1中用SDS-PAGE检测经过Ni-Sepharose层析柱纯化的融合蛋白dsscFv CD22-Nn-Fc的结果示意图。
图3为本发明的利用内含肽制备免疫毒素的方法的实施例1中用Western Blot检测dsscFv CD22-Nn-Fc与Nc-PE38KDEL反式剪接生成dsscFv CD22-PE38KDEL的结果示意图。
图4为本发明的利用内含肽制备免疫毒素的方法的实施例2中用SDS-PAGE检测经过Protein L层析柱纯化的融合蛋白Fab-Nn的结果示意图。
图5为本发明的利用内含肽制备免疫毒素的方法的实施例2中用SDS-PAGE检测Fab-Nn与Nc-PE38KDEL反式剪接生成Fab-PE38KDEL的结果示意图。
图6为本发明的利用内含肽制备免疫毒素的方法的实施例3用Western Blot检测Herceptin-Nn与Nc-PE38KDEL反式剪接生成Herceptin-PE38KDEL的结果示意图。
图7为实施例中涉及表达质粒的结构图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，例如萨姆布鲁克等分子克隆：实验手册第三版(科学出版社，2002)中所述的条件，或者按照各制造商所建议的条件。
实施例1、利用Npu DnaE的反式剪接功能制备免疫毒素dsscFv CD22-PE38KDEL
1、构建融合了断裂内含肽Npu DnaE C端的毒性多肽表达载体pET-28a(+)-Nc-PE38KDEL
利用表中引物分别克隆编码PE38KDEL毒素的基因以及Npu DnaE的C端基因，采用TaKaRa公司的PrimerStar Max进行扩增，PCR条件为94℃10s，55℃10s，72℃10s，30个循环，将得到的片段琼脂糖凝胶电泳回收后利用重叠PCR将编码Npu DnaE的C端基因与编码PE38KDEL的基因按Npu DnaE的C端在融合多肽N端的顺序合成，PCR条件为94℃10s，55℃10s，72℃10s，30个循环，将此基因片段用NdeI和NotI处理，并与同样经过NdeI和NotI处理的pET-28a(+)进行连接，质粒结构图如图7所示。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞涂布于含50μg/mL卡那霉素的琼脂平板培养过夜。挑取平板上长出的单克隆，于5mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中震荡培养过夜，并提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所构建的Nc-PE38KDEL序列正确。
表1
2、融合蛋白Nc-PE38KDEL的表达和纯化
将测序正确的质粒转化进大肠杆菌表达菌株BL21感受态中，37℃过夜培养出单菌落后，挑单菌落于含50μg/mL卡那霉素的5ml LB培养基中37℃，180rmp，过夜培养。
取5ml培养液加入500ml含50μg/mL卡那霉素的新鲜LB培养基中，37℃培养至OD600为0.6-0.8时加入终浓度为0.2mM的IPTG，在30℃下诱导16h后，4000rpm离心10min收集菌体。
将收集的菌体用结合缓冲液(20mM PBS、500mM NaCl、20mM咪唑、pH7.5，每1g菌体用20ml结合缓冲液)重悬，高压均质机破碎菌体，4℃下12000rpm离心30min，收集上清，上清用0.45μm过滤，准备用Ni2+NTA进行纯化。
装填Ni2+重力柱，柱床体积1ml，用5倍柱体积水洗之后用10倍柱体积结合缓冲液(20mM PBS、500mM NaCl、20mM咪唑、pH7.5)平衡，将收集到的上清上柱，流速为1ml/min，上柱完毕后，用5倍柱体积的Binding Buffer冲洗，随后用10倍柱体积包含60mM咪唑的洗脱缓冲液(20mM PBS、500mM NaCl、60mM咪唑、pH7.5)冲洗非特异性结合蛋白，随后用10倍柱体积150mM咪唑的洗脱缓冲液(20mM PBS、500mM NaCl、150mM咪唑、pH7.5)洗脱，分管收集，每管1ml，SDS-PAGE检测洗脱情况，合并目标蛋白，得到融合蛋白Nc-PE38KDEL。图1为本发明的利用内含肽制备免疫毒素的方法的实施例1中用SDS-PAGE检测经过Ni-Sepharose层析柱纯化的融合蛋白Nc-PE3KDEL的结果示意图。
3、构建融合了断裂内含肽Npu DnaE N端的CD22抗体表达载体pET-22b(+)-dsscFvCD22-Nn-Fc
利用表2中引物分别克隆Npu DnaE的N端基因以及人IgG的Fc片段，采用TaKaRa公司的PrimerStar Max进行扩增，PCR条件为94℃ 10s，55℃ 10s，72℃ 10s，30个循环，将得到的片段琼脂糖凝胶电泳回收后利用重叠PCR将按照Npu DnaE N端-Fc片段的顺序将扩增得到的片段进行合成，PCR条件为94℃ 10s，55℃ 10s，72℃10s，30个循环，将此基因片段用BamHI和NotI处理，并与同样经过BamHI和NotI处理的携带dsscFv CD22的pET-22b(+)进行连接，融合基因顺序为dsscFv CD22-Nn-Fc。
将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞涂布于含50μg/mL氨苄青霉素的琼脂平板培养过夜。挑取平板上长出的单克隆，于5mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中震荡培养过夜，并提取质粒，对其进行测序，测序结果明所构建的dsscFvCD22-Nn-Fc序列正确。图2为本发明的利用内含肽制备免疫毒素的方法的实施例1中用SDS-PAGE检测经过Ni-Sepharose层析柱纯化的融合蛋白dsscFv CD22-Nn-Fc的结果示意图。
表2
4、融合蛋白dsscFv-Nn-Fc的表达与纯化
将测序正确的质粒转化进大肠杆菌表达菌株BL21感受态中，37℃过夜培养出单菌落后，挑单菌落于含50μg/mL氨苄西林的5ml LB培养基中37℃，180rmp，过夜培养。
取5ml培养液加入500ml含50μg/mL氨苄西林的新鲜LB培养基中，37℃培养至OD600为0.6-0.8时加入终浓度为0.02mM的IPTG，在25℃下诱导16h后，4000rpm离心10min收集菌体。
将收集的菌体用结合缓冲液(20mM PBS、500mM NaCl、20mM咪唑、pH7.5，每1g菌体用20ml结合缓冲液)重悬，高压均质机破碎菌体，4℃下12000rpm离心30min，收集上清，上清用0.45μm过滤，准备用Ni2+NTA进行纯化。
装填Ni2+重力柱，柱床体积1ml，用5倍柱体积水洗之后用10倍柱体积结合缓冲液(20mM PBS、500mM NaCl、20mM咪唑、pH7.5)平衡，将收集到的上清上柱，流速为1ml/min，上柱完毕后，用5倍柱体积的Binding Buffer冲洗，随后用10倍柱体积包含60mM咪唑的洗脱缓冲液(20mM PBS、500mM NaCl、60mM咪唑、pH7.5)冲洗非特异性结合蛋白，随后用10倍柱体积150mM咪唑的洗脱缓冲液(20mM PBS、500mM NaCl、150mM咪唑、pH7.5)洗脱，分管收集，每管1ml，SDS-PAGE检测洗脱情况，合并目标蛋白，得到融合蛋白dsscFv-Nn-Fc。
5、利用Npu DnaE的反式剪接制备dsscFv CD22-PE38KDEL
将步骤2得到的融合多肽Nc-PE38KDEL与步骤4得到的融合多肽dsscFv CD22-Nn-Fc以摩尔比1:1进行混合，并加入终浓度为1mM的DTT，于25℃下保温60min，取样品进行SDS-PAGE以及Western Blot检测。图3为本发明的利用内含肽制备免疫毒素的方法的实施例1中用Western Blot检测dsscFv CD22-Nn-Fc与Nc-PE38KDEL反式剪接生成dsscFvCD22-PE38KDEL的结果示意图。
6、经由Npu DnaE反式剪接产生的dsscFv CD22-PE38KDEL的分离纯化
利用Ni2+NTA去除步骤5中为发生反式剪接反应的融合多肽以及反式剪接说产生的副产物来纯化dsscFv CD22-PE38KDEL。
装填Ni2+重力柱，柱床体积1ml，用5倍柱体积水洗之后用10倍柱体积结合缓冲液(20mM PBS、500mM NaCl、20mM咪唑、pH7.5)平衡，将步骤5得到的反应体系上柱，流速为1ml/min，收集流穿，上柱完毕后，用5倍柱体积包含40mM咪唑的洗脱缓冲液(20mM PBS、500mM NaCl、40mM咪唑、pH7.5)冲洗，随后用10倍柱体积包含150mM咪唑的洗脱缓冲液(20mM PBS、500mM NaCl、150mM咪唑、pH7.5)冲洗，SDS-PAGE检测收集的蛋白样品，依需要，可冷冻和在-20℃或-80℃保存，或者用于更高纯度的纯化，例如离子交换层析，疏水层析，以及分子排阻层析等。
实施例2、利用Npu DnaE的反式剪接功能制备免疫毒素Her Fab-PE38KDEL
1、构建融合了断裂内含肽Npu DnaE N端的Her VH-CH1表达载体pCEP4-Her VH-CH1-Nn
利用表3中引物分别克隆编码Herceptin重链VH-CH1部分的基因以及Npu DnaE的N端基因，采用TaKaRa公司的PrimerStar Max进行扩增，PCR条件为94℃10s，55°C10s，72℃10s，30个循环，将得到的片段琼脂糖凝胶电泳回收后利用重叠PCR将编码Herceptin重链VH-CH1部分的基因与编码Npu DnaE的N端基因Npu DnaE的N端在融合多肽C端的顺序合成，PCR条件为94℃10s，55℃10s，72℃10s，30个循环，将此基因片段用HindIII和BamHI处理，并与同样经过HindIII和BamHI处理的pCEP4进行连接，质粒结构图7如图所示。
将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞涂布于含50μg/mL氨苄西林的琼脂平板培养过夜。挑取平板上长出的单克隆，于5mL含50μg/mL氨苄西林的LB培养基中震荡培养过夜，并提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所构建的HerVH-CH1-Nn序列正确。
表3
2、构建Herceptin轻链的表达载体pCEP4-Her LC
利用表4中引物分别克隆编码Herceptin轻链的基因，采用TaKaRa公司的PrimerStar Max进行扩增，PCR条件为94℃10s，55℃10s，72℃10s，30个循环，将得到的片段琼脂糖凝胶电泳回收后用HindIII和BamHI处理，并与同样经过HindIII和BamHI处理的pCEP4进行连接，质粒结构图7如图所示。
将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞涂布于含50μg/mL氨苄西林的琼脂平板培养过夜。挑取平板上长出的单克隆，于5mL含50μg/mL氨苄西林的LB培养基中震荡培养过夜，并提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所构建的HerLC序列正确。
表4
3、融合多肽Her Fab-Nn的表达与纯化
本实施例中利用HEK293-E系统中的瞬时表达系统表达融合多肽Her Fab-Nn。
用SFM4HEK293培养基(HyClone)和Gibco Freestyle 293培养基(Gibco)以1:1的比例，添加100μg/ml遗传霉素(geneticin)(Gibco)培养HEK293-E细胞(表达EB病毒核抗原的人胚肾细胞系293；美国典型培养物中心，保藏号ATCC#CRL-10852，Lot.959218)，转染前一天用新鲜培养基将细胞稀释至1.5-2.5×106个细胞/ml，以37℃，120rpm，5％CO2培养，以待次日转染。
转染当日，按照每106个细胞用0.5μg DNA的用量，等质量比混合pCEP4-HerVH-CH1-Nn和pCEP4-Her LC，用Gibco Freestyle 293培养基稀释DNA至(40ng/μL)，DNA：PEI＝1:3加入混匀的DNA中室温孵育20min备用。同时1000rpm 5min离心收集细胞，经Gibco Freestyle 293培养基洗涤细胞1次，1000rpm 5min离心收集细胞，用150ml Gibco Freestyle 293培养基重悬细胞至细胞密度为4×106个细胞/ml置于新的1L摇瓶(Coming)中。
将孵育的DNA-PEI复合物加入细胞中，37℃，110rpm，5％CO2转染4小时，随后加入等体积预热的SFX4HEK293培养基，添加100μg/ml遗传霉素(geneticin)(Gibco)继续37℃，130rpm，5％CO2培养10天。直接收集上清纯化或者收集上清-80℃冷冻保存。
所收集的上清用PBS(20mM PBS，150mM NaCl，pH 6.8-7.4)1:1混合，上到预先用PBS平衡完毕的Protein L(蛋白L)亲和层析柱，上样完毕用5倍柱体积的PBS洗涤，用pH5.0的100mM柠檬酸缓冲液洗除去杂组份，用pH3.0的100mM柠檬酸缓洗脱抗体，用PH9.0的1M tris-Hcl缓冲液立即中和收集到的洗脱样品。
取小样进行SDS-PAGG分析，非还原样品60KD左右出现组装好的Her Fab-Nn，还原样品中出现35KD的VH+CH1+Nn链和25KD的轻链。图4为本发明的利用内含肽制备免疫毒素的方法的实施例2中用SDS-PAGE检测经过Protein L层析柱纯化的融合蛋白Fab-Nn的结果示意图。
合并含有目的蛋白的样品，以用于下一步断裂intein介导的体外剪接。如果需要，利用MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)超滤离心管浓缩，冷冻和在-20℃或-80℃保存。
4、利用Npu DnaE反式剪接制备Her Fab-PE38KDEL
将实施例1中所述步骤2得到之融合多肽Nc-PE38KDEL与步骤3得到的融合多肽HerFab-Nn以摩尔比1:1进行混合，并加入终浓度为1mM的DTT，于25℃下保温60min，取样品进行SDS-PAGE以及Western Blot检测。图5为本发明的利用内含肽制备免疫毒素的方法的实施例2中用SDS-PAGE检测Fab-Nn与Nc-PE38KDEL反式剪接生成Fab-PE38KDEL的结果示意图。
5、经由Npu DnaE反式剪接产生的Her Fab-PE38KDEL的分离纯化
利用Ni2+NTA捕获步骤4中未发生反式剪接反应的融合多肽以及反式剪接所产生的副产物来纯化Her Fab-PE38KDEL。
装填Ni2+重力柱，柱床体积1ml，用5倍柱体积水洗之后用10倍柱体积结合缓冲液(20mM PBS、500mM NaCl、20mM咪唑、pH7.5)平衡，将步骤4得到的反应体系上柱，流速为1ml/min，收集流穿，上柱完毕后，用5倍柱体积包含40mM咪唑的洗脱缓冲液(20mMPBS、500mM NaCl、40mM咪唑、pH7.5)冲洗，收集冲洗液，随后用10倍柱体积包含150mM咪唑的洗脱缓冲液(20mM PBS、500mM NaCl、150mM咪唑、pH7.5)冲洗，SDS-PAGE检测收集的蛋白样品，依需要，可冷冻和在-20℃或-80℃保存，或者用于更高纯度的纯化，例如离子交换层析，疏水层析，以及分子排阻层析等。
实施例3、利用Npu DnaE的反式剪接功能制备免疫毒素Herceptin-PE38KDEL
1、构建融合了断裂内含肽Npu DnaE N端的Her HC表达载体pCEP4-Her HC-Nn
利用下表5引物，以合成的包含编码信号肽基因的Herceptin重链核酸分子为模板利用表中引物克隆编码Herceptin重链的基因以合成的包含Npu DnaE的核酸分子为模板，克隆Npu DnaE的N端基因，采用TaKaRa公司的PrimerStar Max进行扩增，PCR条件为94℃10s，55℃10s，72℃10s，30个循环，将得到的片段琼脂糖凝胶电泳回收后利用重叠PCR将编码Herceptin重链的基因与编码Npu DnaE的N端基因Npu DnaE的N端在融合多肽C端的顺序合成，PCR条件为94℃10s，55℃10s，72℃10s，30个循环，将此基因片段用HindIII和BamHI处理，并与同样经过HindIII和BamHI处理的pCEP4进行连接，质粒结构图如图7所示。
将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞涂布于含50μg/mL氨苄西林的琼脂平板培养过夜。挑取平板上长出的单克隆，于5mL含50μg/mL氨苄西林的LB培养基中震荡培养过夜，并提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所构建的HerHC-Nn序列正确。
表5
2、融合多肽Herceptin-Nn的表达与纯化
本实施例中利用HEK293-E系统中的瞬时表达系统表达融合肽Herceptin-Nn。
用SFX4HEK293培养基(HyClone)和Gibco Freestyle 293培养基(Gibco)以1:1的比例，添加100μg/ml遗传霉素(geneticin)(Gibco)培养HEK293-E细胞(表达EB病毒核抗原的人胚肾细胞系293；美国典型培养物中心，保藏号ATCC#CRL-10852，Lot.959218)，转染前一天用新鲜培养基将细胞稀释至1.5-2.5×106个细胞/ml，以37℃，120rpm，5％CO2培养，以待次日转染。
转染当日，按照每106个细胞用0.5μg DNA的用量，等质量比混合pCEP4-Her HC-Nn和实施例3步骤2中构建的Herceptin轻链表达载体pCEP4-Her LC，用Gibco Freestyle293培养基稀释DNA至(40ng/μL)，DNA：PEI＝1:3加入混匀的DNA中室温孵育20min备用。同时1000rpm离心5min收集细胞，经Gibco Freestyle 293培养基洗涤细胞1次，1000rpm离心5min收集细胞，用150ml Gibco Freestyle 293培养基重悬细胞至细胞密度为4×106个细胞/ml置于新的1L摇瓶(Coming)中。
将孵育的DNA-PEI复合物加入细胞中，37℃，110rpm，5％CO2转染4小时，随后加入等体积预热的SFX4HEK293培养基，添加100μg/ml遗传霉素(geneticin)(Gibco)继续37℃，130rpm，5％CO2培养10天。
直接收集上清纯化或者收集上清-80℃冷冻保存。
所收集的上清用PBS(20mM PBS，150mM NaCl，pH 6.8-7.4)1:1混合，上到预先用PBS平衡完毕的Protein A(蛋白A)亲和层析柱，上样完毕用10倍柱体积的PBS洗涤，用pH3.0的100mM柠檬酸缓冲液洗脱抗体，用pH9.0的1M Tris-Hcl缓冲液立即中和收集到的洗脱样品。取小样进行SDS-PAGG分析，非还原样品于170kD左右出现组装好的Herceptin-Nn，还原样品中出现约70kD的Her HC-Nn链和25KD的轻链。合并含有目的蛋白的样品，以用于下一步断裂intein介导的体外剪接。如果需要，利用MILLIPOREAmicon Ultra(30MWCO)超滤离心管浓缩，冷冻和在-20℃或-80℃保存。
3、利用Npu DnaE反式剪接制备Herceptin-PE38KDEL
将实施例1中所述步骤2得到之融合多肽Nc-PE38KDEL与步骤3得到的融合多肽Herceptin-Nn以摩尔比1:1进行混合，并加入终浓度为1mM的DTT，于25℃下保温60min，取样品进行SDS-PAGE以及Western Blot检测。图6为本发明的利用内含肽制备免疫毒素的方法的实施例3用Western Blot检测Herceptin-Nn与Nc-PE38KDEL反式剪接生成Herceptin-PE38KDEL的结果示意图。
4、经由Npu DnaE反式剪接产生的Herceptin-PE38KDEL的分离纯化
利用Ni2+NTA捕获步骤3中未发生反式剪接反应的融合多肽以及反式剪接所产生的副产物来纯化Herceptin-PE38KDEL。装填Ni2+重力柱，柱床体积1ml，用5倍柱体积水洗之后用10倍柱体积结合缓冲液(20mM PBS、500mM NaCl、20mM咪唑、pH7.5)平衡，将步骤3得到的反应体系上柱，流速为1ml/min，收集流穿，上柱完毕后，用5倍柱体积包含40mM咪唑的洗脱缓冲液(20mM PBS、500mM NaCl、40mM咪唑、pH7.5)冲洗，收集冲洗液，随后用10倍柱体积包含150mM咪唑的洗脱缓冲液(20mM PBS、500mM NaCl、150mM咪唑、pH7.5)冲洗，SDS-PAGE检测收集的蛋白样品，依需要，可冷冻和在-20°C或-80℃保存，或者用于更高纯度的纯化，例如离子交换层析，疏水层析，以及分子排阻层析等。
可见，本发明的方法则克服了在免疫毒素生产的传统策略中存在的不足，实现了改善了传统生产免疫毒素的技术方法中存在诸多不足之处，如化学偶联法中需要加入化学试剂，由于导向多肽部分中修饰位点较多而导致的产品不均一，同时化学偶联键容易断裂而导致毒性渗漏等；而直接表达免疫毒素融合蛋白的策略中，若采用原核表达系统，则目的蛋白往往以包涵体形式存在，复性效率低且步骤繁琐过程复杂，若采用真核表达系统则免疫毒素的表达可能受限于其对宿主细胞存在的天然毒性。本发明的方法改善了现有技术的不足：1、本发明的方法只需要制备不同的导向部分多肽以及毒性部分多肽，就可以将其进行组合，进而产生可以针对不同靶点及拥有不同毒性机制的免疫毒素，具有显著的多样性及灵活性；2、本发明的方法中，导向部分多肽和毒性部分多肽可以在适当的宿主细胞中分开表达，如需要特殊的折叠环境，特别是高级的翻译后修饰，可以在哺乳动物细胞中进行表达，而没有太多修饰需求的多肽可以在大肠杆菌中进行表达，在适合的表达系统中分别表达目的多肽可以获得较高的产量、收率以及纯度；3、本发明的方法中，导向部分多肽和毒素部分多肽的连接是位点特异性的，不会生产副产物，得到的产物产品均一性高；4、本发明的方法中，导向性部分多肽和毒素部分多肽经由内含肽的自剪接，是有肽键连接在一起，相比于化学偶联法等连接方式具有良好的稳定性；5、本发明的方法中，自剪接反应条件温和、反应高效，易于与其他工艺进行整合、放大；反应过程无需加入有毒有害作用物质。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (15)
1.一种基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤一，构建表达免疫毒素中具有导向功能的多肽和具有毒性功能的多肽的载体DNA片段，将所述两种多肽的载体DNA片段与内含肽的N端或C端分别连接，形成融合表达载体；其中，所述含有内含肽N端的融合表达载体与含有内含肽C端的融合表达载体所表达的多肽需成对存在，以使得反式剪接反应能够发生；
步骤二，取步骤一所述的融合表达载体，分别在合适的宿主细胞中进行表达，得到融合内含肽N端的融合多肽A以及融合内含肽C端的融合多肽B；
步骤三，取融合多肽A和融合多肽B，混合，在内含肽对应的反式剪接条件下，诱导免疫毒素的导向功能的多肽以及具有毒性功能的多肽部分进行反式剪接，得到免疫毒素。
2.根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤一中，所述内含肽为人工断裂内含肽、或天然断裂内含肽，或具有剪接功能的内含肽突变体。
3.根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤一中，所述内含肽为Ssp DnaB、Ssp DnaE或Npu DnaE。
4.根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤一中，所述内含肽N端的C末端或C端的N末端还融合有功能性多肽。
5.根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，所述功能性多肽为MBP或ChBD标签蛋白。
6.根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤一中，所述融合表达载体的构成为导向功能多肽-内含肽N端、或内含肽C端-毒性功能多肽，或毒性功能多肽-内含肽N端、或内含肽C端-导向功能多肽，或导向功能多肽-内含肽N端-功能多肽、或功能多肽-内含肽C端-毒性功能多肽，或毒性功能多肽-内含肽N端-功能多肽、功能多肽-内含肽C端-导向功能多肽。
7.根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤一中，所述具有导向功能的多肽为抗体、单链抗体scFv、二硫键稳定抗体dsFv、二硫键稳定单链抗体dsscFv、Fab抗体、细胞因子、或生长因子。
8.根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤一中，所述具有毒性功能的多肽为RIP型毒素；具体为蓖麻毒素、ADP核糖基化免疫毒素，白喉毒素、或绿脓杆菌外毒素部分的融合蛋白，或具有毒素生物活性的突变体。
9.根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤二中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
10.根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，所述宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、高扩酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、酵母、中国仓鼠卵巢细胞、或人肾胚细胞。
11.根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤三中，还包括分离纯化进而获得免疫毒素的步骤。
12.根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，所述分离纯化的方法为亲和层析方法、离子交换层析方法、或疏水作用层析方法。
13.根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤三中，所述反式剪接条件为能够触发指定内含肽完成自剪接的条件。
14.根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，当内含肽为Npu DnaE时，反式剪接条件为：0-55℃，pH为3-11，接触时间1s-60h，终浓度为0.05mM-100mM的亲核试剂。
15.根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，所述亲核试剂为DTT，DTE，CYSTEINE，TCEP，或MESNA亲核性试剂。
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