KR20130046322A - 식중독 세균 Salmonella enterica 탐지용 탐침자 및 그를 포함한 DNA 칩 - Google Patents

식중독 세균 Salmonella enterica 탐지용 탐침자 및 그를 포함한 DNA 칩 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식중독 세균 Salmonella enterica 탐지용 DNA 칩을 위한 올리고뉴클레오티드 탐침자 및 그를 포함한 DNA 칩에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면, 종래 방법에 비하여 식중독 세균 Salmonella enterica를 훨씬 신속하고도 정확하게 탐지하는 게 가능해진다.
상기와 같은 본 발명은 서열목록 40 내지 50 중 적어도 어느 하나를 포함하는, 식중독 세균 Salmonella enterica 탐지용 DNA 칩을 위한 올리고뉴클레오티드 탐침자인 것을 특징으로 한다.
또한 서열목록 40 내지 50 중 적어도 어느 하나의 탐침자를 포함하는, 식중독 세균 Salmonella enterica 탐지용 DNA 칩인 것을 특징으로 한다.

Description

식중독 세균 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ 탐지용 탐침자 및 그를 포함한 ＤＮＡ 칩{The probe for Salmonella enterica, and the DNA chip using the probe}
본 발명은 식중독 세균 Salmonella enterica 탐지용 DNA 칩을 위한 올리고뉴클레오티드 탐침자 및 그를 포함한 DNA 칩에 관한 것이다.
S. enterica는 오염된 물이나 음식을 통해 감염되어 위장질병(gastroenteritis) 등의 증상을 유발하는 식중독 세균이다.
식품의약품안전청의 통계자료에 따르면 매년 최대 510건의 식중독이 발생하며 약 1만여 명이 식중독 미생물에 감염된다고 한다(식약청, 식중독 통계시스템). 또한 2006년 OCAP 식품분과위원회 세미나에서 한국소비자보호원 시험검사소는 식중독으로 인한 사회 경제적 손실액이 1조 3107억원이라 밝혔다.
현재까지 식중독 세균의 탐지법 중에 가장 많이 사용되어온 방법은 배양법으로, 정확도는 높지만 최소 24시간 이상의 농화배양(enrichment culture)을 필요로 하며 농화배양 후에도 선택 배양, 확정 시험 단계를 필요로 하기 때문에, 이러한 전통적인 배양법은 노동 집약적이며 많은 시간이 소요된다는 단점이 있다.
이 외에도 최근에 PCR 및 항체를 이용한 면역학적 탐지법이 개발되었지만, 면역학적 방법은 실험과정이 간편한 반면 민감도가 낮고(약 105 cell/reaction), PCR 방법역시 PCR 후에 전기영동법으로 결과를 확인해야 한다는 문제점이 있다.
또한 전통적인 배양법은 물론 PCR 및 면역학적 방법에 있어서의 가장 큰 문제점은 다수의 식중독 세균을 검출하기 위한 방법으로 적절치 않다는 것이다.
한편 16S rRNA 유전자 서열을 기반으로 설계하는 탐침자(probe)의 가장 이상적인 조건은 대상 종에 속하는 여러 스트레인(strain)들을 모두 탐지하면서 타깃으로 하지 않는(non-target) 종들은 탐지하지 않는, 높은 특이성(specificity)을 갖는 것이다. 하지만 현재까지 사용되어 온 대부분의 탐침자들 중 이 조건을 충족하는 탐침자는 매우 적은 수준이다.
따라서 본 발명의 목적은 식중독 세균 Salmonella enterica 탐지에 있어서 특이성과 민감성이 대폭 향상된, 탐침자(probe)를 제공하는 것이다.
발명자들은 상기 언급한 과제를 해결하기 위해서 DNA 마이크로어레이(microarray)를 이용한 식중독 세균의 검출법을 개발하였다.
발명자들은 i) 식중독 세균 S. enterica의 16S rRNA 유전자를 대상으로 종-특이적 탐침자(probe) 서열을 파악하고, ii) 설계한 탐침자(probe)의 성능을 파악하기 위한 DNA 마이크로어레이 실험을 수행하여 제작된 탐침자(probe)의 특이성과 민감도를 확인하였다. 특히 기존의 DNA 마이크로어레이를 이용한 탐지법 연구와는 달리 RDP-II 데이터베이스 수록된 92만개의 16S rRNA 유전자 서열(gene sequence)들을 모두 탐침자(probe) 설계에 포함하고 대상 종에 대한 다수의 탐침자(probe)들을 사용함으로써 위양성(false positive) 및 위음성(false negative)율을 줄이는 알고리즘으로 탐지법의 정확도를 향상시켰다.
상기와 같은 본 발명은, 식중독 세균 Salmonella enterica 탐지용 DNA 칩을 위한 올리고뉴클레오티드 탐침자로서 서열목록 40 내지 50 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 서열목록 40 내지 50 중 적어도 어느 하나의 탐침자를 포함하는 식중독 세균 Salmonella enterica 탐지용 DNA 칩인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 종래 방법에 비하여 식중독 세균 Salmonella enterica를 훨씬 신속하고도 정확하게 탐지하는 게 가능해진다.
도면 1. 타깃 분류군(Target taxon)의 계통수(phylogenetic tree)
도면 2. 후보 올리고뉴클레오티드 서열(각각 서열목록 1 내지 50으로 첨부함)
도면 3. (상) 후보 oligonucleotide 탐침자(probe) 중 cutoff 20 이상의 S/N ratio
(하) 후보 oligonucleotide 탐침자(probe)의 S/N ratio
도면 4. 특이성이 확인된 올리고뉴클레오티드 서열(서열목록 40 내지 50)
이하 본 발명을 구체적인 실시예와 함께 상세히 설명한다.
＜재료 및 방법＞
1. 균주
본 발명에서 사용된 Salmonella enterica strain은 ATCC(American Type Culture collection)으로부터 얻은 것이다(ATCC14028). Salmonella 균주는 DifcoTM Nutrient Agar에서 계대배양 하였으며 conventional PCR의 주형(template)으로 사용할 게노믹 DNA(genomic DNA)의 추출은 Sambrook과 Russell의 방법을 따랐다.
2. S. enterica 의 계통분석학적 위치 파악 및 탐침자(probe) 선별
16S rRNA 유전자 서열을 이용한 식중독 세균의 검출용 DNA 칩 제작에 필요한 탐침자(probe)를 디자인하기 위해, RDP II 데이터베이스(버전 10)에서 759,000개의 16S rRNA 유전자 서열(gene sequence)을 검색했다. 759,000개의 16S rRNA 유전자 서열(gene sequence) 중에서 분리(isolate) 되었으며 사이즈가 1.2 kb 이상인 기준에 적합한 서열(sequence)을 선택한 후 pintail algorithm으로 sequence quality를 확인하였다.
선택된 서열을 정렬(alignment)함으로써 각 탐침자(probe) 그룹별로 공통 배열(consensus sequence)을 확보하며, 서열 보존부위 중에서 모호하지 않은(unambiguous) 부분을 탐침자(probe) 디자인에 사용했다.
계통수(phylogenetic tree)를 작성함으로써 선정된 서열(sequence)의 진화적 거리(evolutionary distance)를 확인하였으며 탐침자(probe) 그룹 내에서, 탐침자(probe) 그룹 사이의, 관련된 종(species) 간에, 관련된 속(genera)에 대해 진화적 거리(evolutionary distance)를 계산했다.
3. PCR-라벨링(Labeling)
칩 혼성화(hybridization)에 사용될 PCR 주형(template)은 PCR 중에 Cy3-dUTP로 라벨링 하였다. 1μl의 주형 DNA, Cy3-dUTP 0.5 μl, LA Taq 1μl, 25μl의 2X GC buffer I, dNTPs 8μl, 0.5μl(5pmole)씩의 PCR primer(8F, 1392R, 23F, 1492R), 1μl의 BSA(20mg/ml, Bovine Serum Albumin, Roche, Germany)에 12μl의 증류수를 넣은 총 50μl의 PCR mixture로 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 5분간 초기 변성기 후에, 95℃에서 30초간 변성-50℃에서 30초간 결합(annealing)-72℃에서 1분 30초간 신장(extension)하는 과정을 35회 반복하였다. PCR thermocycler는 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems, Calif. USA)을 사용하였다.
4. 칩 혼성화(chip hybridization)
DNA 혼성화(hybridization)에는 CombiMatrix사의 CustomArray 4X2 칩을 사용하였다. 30μl의 nuclease-free water로 65℃의 hybridization chamber에서 10분간 인큐베이션(incubation)한 후 30μl의 pre-hybridization solution으로 50℃의 hybridization chamber에서 30분간 인큐베이션(incubation)하였다. Pre-hybridization solution을 제거한 뒤 정제된(QIAquick PCR purification kit) PCR product를 포함한 hybridization solution을 넣고 16시간 동안 혼성화 하였다.
＜결과＞
1. S. enterica 의 계통분석학적 위치 파악 및 탐침자(probe) 선별
50개의 서열을 정렬(alignment)하여 계통수(phylogenetic tree)를 그려봄으로써 선정된 서열의 진화적 거리(evolutionary distance)를 확인하였다(도면 1). DE (evolutionary distance)가 99.5％ 이하인 것을 기준으로 OTU(operational taxonomic unit)를 결정하였다. 진화적 거리(evolutionary distance)는 탐침자(probe) 그룹 내에서, 탐침자(probe) 그룹 사이의, 관련된 종(species) 간에, 관련된 속(genera)에 대해 각각 계산되었다.
그 결과 탐침자(probe) 그룹 내의 진화적 거리(evolutionary distance)는 0.0003이었고 편차는 0.0003, 관련된 종(species)과의 진화적 거리(evolutionary distance)는 0.0253 편차는 0.0035 이었고 관련된 속(genera)과의 진화적 거리(evolutionary distance)는 0.0390 편차는 0.0038으로 계산되었다.
수집된 서열을 정렬(alignment)함으로써 공통 배열(consensus sequence)을 찾을 수 있었고 일정하게 보존되어 있는 공통 배열(consensus sequence) 중에서도 오직 모호하지 않은(unambiguous) 지역을 탐침자(probe) 디자인에 사용하였다.
설계 가능한 25-mer oligonucleotide는 1317개로 확인되었으며 Tm(melting temperature)은 65.9 ± 3.2, GC content[(G+C)％]는 55.1 ± 7.9 이었다. 이 중 Primrose software를 이용한 생물정보학적 분석을 통해 타깃 종(target species, S. enterica)에만 특이성이 있는 것으로 확인된 probe는 없었으며 모든 probe 들이 적어도 Escherichia coli, Shegella dysenteriae, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter koseri 4개의 non-target을 동시에 탐지하는 것으로 확인 되었다.
2. DNA 칩 제작 및 특이성(specificity) 검증
발굴된 모든 탐침자(probe) 서열들을 이용하여 Combimatrix사의 CombiChip 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) DNA 칩을 제작하였다. 제작된 DNA 칩은 타깃 미생물에 특이적인 PCR로부터 얻어진 PCR 산물(product)과 혼성화(hybridization)하여 타깃 미생물의 검출/동정에 필요한 특이성을 갖추었는지를 검증한다.
타깃 DNA는 16S rRNA 유전자에 대한 universal primer를 이용하여 PCR 증폭하며, PCR 증폭 반응 중에 형광감쇄성이 낮은 Cy3를 이용하여 표지하며, 혼성화 반응 후, 형광신호를 수집하여 음성대조군과 반응하지 않으며 배경 신호에 비해 통계학적으로 유의미한 수준 이상의 형광신호를 발생하는지 여부에 따라 제작된 DNA 칩의 특이성을 S. enterica에 대하여 평가하였다.
3. 선별된 탐침자(probe)의 성능 확인
제작된 50개의 탐침자(도면 2)의 성능은 DNA 혼성화(hybridization)에서 발생한 형광 신호값을 노이즈 시그널(noise signal)의 평균값으로 나누어 준 S/N 값으로 확인하였다. 50개의 탐침자(probe) 서열은 칩 상에 triplicate로 spotting 되었으며, 발생한 시그널(signal)은 그 평균값을 사용하였다.
50개 탐침자(probe)의 S/N 값 중 유의미한 수준의 값을 기준(cutoff)으로 하여 탐침자(probe)의 성능을 평가하였으며, 그 결과 11개의 탐침자(probe)가 S. enterica의 탐지에 특이적인 탐침자(probe)임을 확인하였다(도면 3 및 도면 4).
이로써 종래 방법에 비하여 식중독 세균 Salmonella enterica를 훨씬 신속하고도 정확하게 탐지할 수 있게 된다.

Claims (2)

  1. 서열목록 40 내지 50 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식중독 세균 Salmonella enterica 탐지용 DNA 칩을 위한 올리고뉴클레오티드 탐침자.
  2. 서열목록 40 내지 50 중 적어도 어느 하나의 탐침자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식중독 세균 Salmonella enterica 탐지용 DNA 칩.
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