BRPI0620553A2

BRPI0620553A2 - anticorpo monoclonal humano isolado ou uma porção ligante ao antìgeno do mesmo, composição, imunoconjugado, molécula de ácido nucléico isolada, vetor de expressão, célula hospedeira, método para preparar um anticorpo anti-fucosil-gm1 e método para tratar ou prevenir uma doença definida pelo crescimento de células tumorais expressando fucosil-gm1

Info

Publication number: BRPI0620553A2
Application number: BRPI0620553-4A
Authority: BR
Inventors: Cynthia A Vistica; Eric H Holmes; Peter Brams; Alison Witte; Josephine M Cardarelli
Original assignee: Medarex Inc
Priority date: 2005-12-08
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2011-11-16
Also published as: US9631025B2; SI1960434T1; US9138475B2; WO2007067992A3; HRP20120701T1; PL1960434T3; US20130142789A1; US20170190785A1; WO2007067992A2; PT1960434E; NO20083062L; JP2009518050A; JP5512128B2; AU2006321554B2; EA200870021A1; US20190315881A1; WO2007067992A9; US8383118B2; DK1960434T3; IL191610A0

Abstract

ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO ISOLADO OU UMA PORçãO LIGANTE AO ANTìGENO DO MESMO, COMPOSIçãO, IMUNOCONJUGADO, MOLéCULA DE áCIDO NUCLéICO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSãO, CéLULA HOSPEDEIRA, MéTODO PARA PREPARAR UM ANTICORPO ANTI-FUCOSIL-GM1 E MéTODO PARA TRATAR OU PREVENIR UMA DOENçA DEFINIDA PELO CRESCIMENTO DE CéLULAS TUMORAIS EXPRESSANDO FUCOSIL-GM1. A presente descrição provê anticorpos monoclonais isolados, particularmente, anticorpos monoclonais humanos, que se liqam especificamente ao Fucosil-GMl com alta afinidade. Moléculas de ácido nucléico que codificam os anticorpos da presente descrição, vetores de expressão, células hospedeiras e métodos para expressar os anticorpos da presente descrição são também providos. São também providos imunoconjugados, moléculas biespecíficas e composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos da invenção. A descrição também provê métodos para detectar Fucosil-GM1, bem como métodos para tratar várias doenças, incluindo câncer, usando anticorpos anti-Fucosil-GM1.

Description

"ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO ISOLADO OU UMA PORÇÃO LIGANTE AO ANTÍGENO DO MESMO, COMPOSIÇÃO, IMUNOCONJUGADO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PREPARAR UM ANTICORPO ANTI-FUC0SIL-GM1 E MÉTODO PARA TRATAR OU PREVENIR UMA DOENÇA DEFINIDA PELO CRESCIMENTO DE CÉLULAS TUMORAIS EXPRESSANDO FUC0SIL-GM1".

Histórico da invenção

Fucosil-GMl é um monosialogangliosídeo esfingolipídio composto de um componente de lipídeo ceramídeo, o qual ancora a molécula na membrana celular, e um componente carboidrato que é exposto na superfície celular. Os antígenos carboidratos são os antígenos mais abundantement expressos na superfície celular dos cânceres (Feizi T. (1985) "Nature", 314:53-7) . Em alguns tipos de tumor, tais como as pequenas células no câncer de pulmão (SCLC) , a resposta inicial ã quimioterapia são impressionante, mas a recaída quimio-refratária ocorre rapidamente a seguir. A intervenção com os novos imunoterapêuticos pode conseguir contornar a recaída na resistência aos fármacos (Johnson DH. (1995), "Lung Câncer", 12 Suppl. 3:S71-5). Muitos antígenos de carboidrato, tais como gangliosídeos (GD3 e GD2) , têm demonstrado uma função como alvos eficazes para a imunoterapia passiva com MAbs (Irie RF e Morton DL. (1986) PNAS 82:8694-8698; Houghton NA et al. (1985), PNAS 8_2:1242-1246) . Os antígenos gangliosídeos também têm demonstrado ser alvos eficazes para a imunoterapia ativa com vacinas em triagem clínica (Krug LM et al. , (2004), "Clinicai Câncer Research", 3^:6094-6100; Dickler MN et al., (1999) "Clinicai Câncer Research", 5:2773-2779; Livingston PO7 et al. , (1994), "J. Clin. Oncol.", 12:1036-44). Ao contrário, o soro derivado dos pacientes SCLC que desenvolveram títulos de anticorpos para Fucosil-GMl após a vacinação com o antígeno conjugado KLH, demonstraram ligação específica às células do tumor e uma citotoxidade dependenta do complemento específico do tumor (CDC). 0 título de anti-Fucosil-GMl associado com a toxicidade foram médios e transitórios e três pacientes com SCLC em estágio limitado ficaram livres de recída durante 18, 24 e 30 meses (Krug et al., supra; Dickler et al., supra).

A expressão de Fucosil-GMl tem demonstrado uma alta porcentagem de casos SCLC e diferente de outros antígenos de gangliosídeo, Fucosil-GMl teve uma pequena ou nenhuma expressão nos tecidos noramis (Nilsson et al., (1984), "Glycoconjugate", J. ]1:43-9; Krug et al., supra; Brezicka et al., (1989), "Câncer Res.", 49^:1300-5, Zhangyi et al., (1997), "Int. J. Câncer", 73:42-49; Brezicka et al., (2000), "Lung Câncer", 28:29-36; Fredman et al., (1986), "Biochim. Biophys. Acta", 875:316-23 ; Brezicka et al., (1991) "APMIS", 99:797-802; Nilsson et al., (1986) "Câncer Res.", 46:1403-7). A presença de Fucosil-GMl tem demonstrado em meio de cultura a partir das linhas celulares SCLC, em extratos de tumores e soro de xenoenxertos em camundongos pelados e em soro de pacientes SCLC com doença em estágio-extensivo (Vangsted et al., (1991), "Câncer Res.", 51:2879-84; Vangsted et al., (1994), "Câncer Detect. Prev.", 18:221-9). Estes relatórios provêem uma evidência convicta para o Fucosil- GMl como um antígeno de tumor altamente específico, que podem ser identificado por um imunoterapêutico.

Consequentmente, os agentes que reconhecem o Fucosil-GMl, e métodos de uso dos referidos agentes, são desejados.

Sumário da invenção

A presente invenção prove anticorpos monoclonais isolados, em particular anticorpos monoclonais humanos, que se ligam ao Fucosil-GMl e que exibem numerosas propriedades desejáveis. Essas propriedades incluem ligação de alta afinidade ao Fucosil-GMl e ligação a linha de célula de câncer de células pequenas de pulmão DMS-79 humanas ("SCLC humano", ATCC # CRL-2049). Também são providos métodos para tratar uma variedade de doenças mediadas por Fucosil-GMl usando os anticorpos e as composições desta invenção.

Em um aspecto, esta invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, sendo que o anticorpo (a) liga-se ao Fucosil-GM1; e (b) liga-se a linha de célula de câncer de pquenas células do pulmão DMS-79 humanas (SCLC Humano - ATCC # CRL-2049).

Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo humano, embora em configurações alternativas o anticorpo possa ser um anticorpo murino, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado.

Em uma outra configuração, esta invenção provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, de modo que o anticorpo faz competição cruzada para ligar-se ao Fucosil-GM1 com um anticorpo de referência, de modo que o anticorpo de referência: (a) liga-se especificamente ao Fucosil-GM1; e (b) liga-se às linhas de células de câncer de pequenas células do pulmão DMS-7 9 humanas (SCLC humana - ATCC # CRL-2049) . Em determinadas configurações, o anticorpo de referência compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:1; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Ainda em uma configuração, o anticorpo de referência compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:2; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:8. Em outras configurações, o anticorpo de referência compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:3; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Ainda em uma outra configuração adicional, o anticorpo de referência compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:4; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:10. Ainda uma outra configuração, o anticorpo de referência compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:5; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:11. Ainda uma configuração adicional, o anticorpo de referência compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:6; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:12.

Em um aspecto, esta invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou a uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que é o produto ou derivada de um gene Vh 3-48 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao Fucosil- GMl. Esta descrição também provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivada de um gene Vk Ll5 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao Fucosil-GMl. Uma combinação preferida compreende:

(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 13;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:19;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 25;

(d) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:31;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:37; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:43.

Uma outra combinação preferida compreende:

(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 14;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:20;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 26;

(d) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:32;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:38; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:44.

Uma outra combinação preferida compreende:

(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 15;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:21;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 27;

(d) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:33;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:39; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:45.

Uma outra combinação preferida compreende:

(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 16;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:22;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 28;

(d) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:34;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:40; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:46.

Uma outra combinação preferida compreende:

(a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 17;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:23;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 29;

(d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:35;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:41; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:47.

Uma outra combinação preferida compreende:

(a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 18;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:24;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 30;

(d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:36;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:42; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:48.

Outros anticorpos preferidos da invenção ou porções de ligação ao antígeno do mesmo compreendem:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:1; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7.

Uma outra combinação preferida compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:2; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:8. Uma outra combinação preferida compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:3; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:9. Uma outra combinação preferida compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:4; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:10. Uma outra combinação preferida compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:5; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:11. Uma outra combinação preferida compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:6; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:12.

Os anticorpos da invenção podem ser, por exemplo, anticorpos de extensão completa, por exemplo, de um isotipo IgG1 ou IgG4. Alternativamente, os anticorpos podem ser fragmentos de anticorpos, tais como fragmentos Fab ou Fab'2, ou anticorpos de cadeia simples.

A invenção também provê um imunoconjugado compreendendo um anticorpo desta descrição, ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, ligada a um agente terapêutico, tais como uma citotoxina ou um isótopo radioativo. A descrição também provê uma molécula biespecífica compreendendo um anticorpo ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, da descrição, ligada a uma segunda porção funcional tendo uma especificidade de ligação diferente àquela do citado anticorpo, ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo. As composições compreendendo um anticorpo ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, ou imunoconjugado ou molécula biespecíifica desta invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável são também provida.

As moléculas de ácido nucléico codificando os anticorpos ou porções ligantes ao antígeno dos mesmos, da invenção, são também abrangidas pela invenção, bem como os vetores de expressão compreendendo tais ácidos nucleicos e células hospedeiras compreendendo tais vetores de expressão. Além disso, esta invenção provê um camundongo transgênico compreendendo transgene de cadeia leve e pesada da imunoglobulina humana, onde os camundongos expressam um anticorpo desta invenção, bem como hibridomas preparados a partir dos referidos camundgons, onde o hibridoma produz o anticorpo desta invenção.

Em ainda um outro aspecto, a invenção provê um método para tratar ou prevenir uma doença caracterizada pelo crescimento de células de tumor expressando Fucosil-GM1, compreendendo administrar ao indivíduo o anticorpo, ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, da invenção em uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir a doença. A doença pode ser, por exemplo, câncer, por exemplo, um câncer de pulmão (incluindo câncer de pulmão de pequenas células).

Em uma configuração preferida, esta invenção provê um método para tratar câncer in vivo usando um anticorpo anti-Fucosil-GM1. O anticorpo anti-Fucosil-GM1 pode ser um anticorpo murino, quimérico, ou um anticorpo humano ou humanizado. Exemplos de outros cânceres que podem ser tratados usando os métodos da presente invenção podem incluir câncer de pulmão, incluindo câncer de células pequenas de pulmão e câncer de células não-pequenas de pulmão, câncer renal (por exemplo, carcinoma de célula renal), glioblastoma, tumor cerebral, leucemias crônica ou aguda, incluindo leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia de célula T adulta (T-ALL), leucemia mielóide crônica, leucemia Iinfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, linfomas (por exemplo, linfoma de Hodgkin e não-Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma CNS mprimário, linfoma de célula T, linfoma de Burkitt, linfomas de célula grande anaplástica (ALCL), linfoma de célula T cutânea, linfoma de célula clivada de pequenos nódulos, linfomas de célula T periférica, linfomas de Lennert, linfomas imunoblásticos, Iinfoma/leucemia de célula T (ATLL), cânceres de linfoma folicular entroblástico/centrocítico (cb/cc), linfomas de células grandes difusas de linhagem de célula B, linfoma de célula T do tipo (AILD) Iinfadenopatia angioimunoblástica e linfomas baseados na cavidade corpórea associada com HIV), carcinomas embrionário, carcinomas não- diferenciados de rinofaringe (por exemplo, tumor de Schmincke) doença de Castleman, Sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom e outros linfomas de célula B, carcinomas nasofaringeal, câncer ósseo, câncer de pele, câncer de cabeça e pescoço, melamona maligno cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer testicular, câncer uterino, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinona da cervix, carcinoma da vagina, carcionma da vulva, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireóide, câncer da glândula paratireóide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer de pênis, tumores sólidos de crianças, câncer de bexiga, câncer de rim e ureteres, carcinoma da pélvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (CNS), tumores angiogenesis, tumor do eixo espinal, glioma do tronco cerebral, adenoma pituitário, câncer epidermóide, câncer de célula escamosa, cânceres induzidos pelo ambiente, incluindo àqueles induzidos por amianto, por exemplo, mesotelioma e combinações dos referidos tumores.

Outras características e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição e exemplos que não devem ser interpretados como restritivos. 0 conteúdo de todas as referências, registros no Genbank, patentes e pedidos de patentes publicados citados em toda a descrição são expressamente incorporados aqui por referência.

Breve descrição dos desenhos

A Figura IA mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO:4 9) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:l) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 5B1. São descritas regiões CDRl (SEQ ID NO:13), CDR2 (SEQ ID NO: 19) e CDR3 (SEQ ID NO: 25) e indicadas às derivações de linha germinal V, D e J;

A Figura IB mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO:55) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:7) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 5B1. São descritas as regiões CDRl (SEQ ID N0:31), CDR2 (SEQ ID NO:37) e CDR3 (SEQ ID NO:43) e indicadas às derivações de linha germinal V e J;

A Figura 2A mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 50) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 5bla. São descritas as regiões CDRl (SEQ ID NO: 14), CDR2 (SEQ ID N0:20) e CDR3 (SEQ ID NO:26) e indicadas às derivações de linha germinal V, D e J; A Figura 2B mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO:56) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:8) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 5Bla. São descritas as regiões CDRl (SEQ ID NO: 3 2), CDR2 (SEQ ID NO:38) e CDR3 (SEQ ID NO:44) e indicadas as derivações de linha germinal V e J;

A Figura 3A mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO:51) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:3) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 7D4. São descritas as regiões CDRl (SEQ ID N0:51), CDR2 (SEQ ID NO:21) e CDR3 (SEQ ID NO:27) e indicadas as derivações de linha germinal V, D e J;

A Figura 3B mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO:57) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:9) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 7D4. São descritas as regiões CDRl (SEQ ID NO:33), CDR2 (SEQ ID NO:3 9) e CDR3 (SEQ ID NO:45) e indicadas às derivações de linha germinal V e J;

A Figura 4A mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 52) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:4) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 7E4. São descritas as regiões CDRl (SEQ ID N0:16), CDR2 (SEQ ID NO: 22) e CDR3 (SEQ ID NO: 28) e indicadas às derivações de linha germinal V, D e J;

A Figura 4B mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO:58) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:10) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 7E4. São descritas as regiões CDRl (SEQ ID NO:34), CDR2 (SEQ ID NO:40) e CDR3 (SEQ ID NO:46) e indicadas às derivações de linha germinal V e J;

A Figura 5A mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO:53) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:5) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 13B8. São descritas as regiões CDRl (SEQ ID NO: 17), CDR2 (SEQ ID NO:23) e CDR3 (SEQ ID NO:29) e indicadas às derivações de linha germinal V, D e J;

A Figura 5B mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 59) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 11) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 13B8. São descritas as regiões CDRl (SEQ ID NO: 3 5) , CDR2 (SEQ ID NO:41) e CDR3 (SEQ ID NO:47) e indicadas as derivações de linha germinal V e J;

A Figura 6A mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 54) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 18D5. São descritas as regiões CDRl (SEQ ID NO: 18),CDR2(SEQ ID NO:24) e CDR3 (SEQ ID N0:30) e indicadas às derivações de linha germinal V, D e J;

A Figura 6B mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO:60) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:12) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 13B8. São descritas as regiões CDR1 (SEQ ID NO: 36), CDR2 (SEQ ID NO:42) e CDR3 (SEQ ID NO:48) e indicadas às derivações de linha germinal V e J;

A Figura 7 mostra o alinhamento da seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 5B1, 5Bla, 7D4, 7E8 e 18D5 com a seqüência de aminoácidos Vh 3-4 8 da linha germinal humana (SEQ ID NO:61);

A Figura 8 mostra o alinhamento da seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 5B1, 5Bla, 7D4, 7E8 e 18D5 com a seqüência de aminoácidos Vh 3-48 da linha germinal humana (SEQ ID NO:62);

As Figuras 9A a 9F mostram os resultados dos experimentos de ELISA demonstrando que o anticorpo monoclonal humano contra Fucosil-GMl liga-se especficamente ao Fucosil-GMl;

As Figuras 10A a 10E mostram os resultados dos experimentos de ELISA com toda a célula demonstrando que o anticorpo monoclonal humano contra Fucosil-GMl liga-se especficamente as células expressando Fucosil-GMl;

As Figuras 11A a 10C mostram os resultados dos experimentos de citometria de fluxo demonstrando que (A E B) os anticorpos monoclonais humanos contra FUC0SIL-GM1 liga-se a superfície da célula das linhas de célula DMS79 e H-4-II-E expresando Fucosil-GM1, e que (C) as células DMS79 foram descobertas por continuar expressando Fucosil-GM1 in vitro (ou seja, após o implante em um camundongo);

As Figuras 12A e 12B mostram os resultados de experimentos de internaiização de Hum-Zap demonstrando que os anticorpos monoclonais humanos contra Fucosil-GMl humano podem internalizar-se dentro das células Fucosil-GM1+;

As Figuras 13A e 13B mostram os resultados de ensaios de proliferação celular (CDC) com a citotoxidade dependente do complemento demonstrando que os anticorpos anti- FUCOSIL-GM1 monoclonais humanos matam as linhas de células (A) DMS7 69 e (B) H-4-II-E que expressam Fucosil- GM1 ;

As figuras 14A e 14B mostram os resultados do ensaio da proliferação celular (ADCC) citotoxicidade celular dependente do anticorpo demonstrando que os anticorpos anti-Fucosil-GM1 monoclonais humanos matam as linhas celulares expressando o Fucosil-GM1 em ausência de CD16 bloqueado.

As figuras 15A a 15F mostram o volume do tumor sobre o tempo nos indivíduos camundongos SCID que foram implantados com DMS79 com células de tumor de câncer de células pequenas de pulmão (Fucosil-GM1+) . Após o tumor ter sido estabelecido, o camundongo foi tratado cinco vezes com uma das terapias a seguir: (A) PBS (veículo controle); (B) IgG1 humana (isotipo controle) em uma dose de 30 mg/kg por camundongo; (C) anticorpo monocolonal anti-Fucosil-GM1 5B1 em uma dose de 10 mg/kg por camundongo; (D) anticorpo monocolonal anti-Fucosil- GM1 5B1 em uma dose de 3 0 mg/kg por camundongo; (E) anticorpo monocolonal anti-Fucosil-GM1 7E4 em uma dose de 10 mg/kg por camundongo; (F) anticorpo monocolonal anti- Fucosil -GM1 7E4 em uma dose de 3 0 mg/kg por camundongo. 0 volume do tumor no primeiro dia de tratamento foi de 2 00 mm3 ;

As figuras 16A e 16B mostramo que o volue do tumor principal e médio, respectivamente, dos camuncongos mostrados na figura 15; e

A figura 17 mostra o grupo principal pesado, dos camundongos mostrados na figura 15.

Descrição detalhada da invenção

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais isolados, particularmente anticorpos monoclonais humanos que se ligam, especificamente, ao Fucosil-GM1. Em certas configurações, os anticorpos da invenção exibem um ou mais propriedades funcionais desejadas, tais como alta afinidade de ligação ao Fucosil-GM1 e/ou a capacidade de inibir o crescimento das células do tumor in vitro ou in vivo. Em determinadas configurações, os anticorpos desta invenção são derivados de seqüências de linhas germinais de cadeia pesada e leve e/ou compreendem características estruturais particulares tais como regiões CDR compreendendo seqüências de aminoácidos particulares. Esta descrição provê anticorpos isolados, métodos para fazer os referidos anticorpos, imunoconjugados e moléculas biespecíficas compreendendo os referidos anticorpos e composições farmacêuticas contendo os anticorpos, imunoconjugados ou moléculas biespecíficas da descrição. Esta descrição também se refere aos métodos de uso dos anticorpos, tais como para tratar doenças como câncer.

De modo que a presente descrição' possa ser mais facilmente entendida, determinados termos são definidos. Definições adicionais estão representadas durante a descrição detalhada da invenção.

O termo "resposta imune" refere-se a ação de, por exemplo, linfócitos, células apresentando antígenos, células fagocítica, granulócitos, e macromoléculas solúveis, produzidas pelas células acima ou pelo fígado (incluindo anticorpos, citocinas, e complemento) que resulta em danos seletivos para, destruição de, ou eliminação a partir do corpo humano de patógenos invasores, células ou tecidos infectados com patógenos, células cancerígenas, ou, em casos de autoimunidade ou inflamação patológica, células humans normais ou tecidos. Uma "via de transdução de sinal" refere-se à relação bioquímica entre uma variedade de moléculas de transdução de sinal que desempenham um papel na transmissão de um sinal de uma porção de uma célula para outra porção de uma célula. Conforme aqui utilizado, a frase "receptor de superfície celular" inclui, por exemplo, moléculas e complexos de moléculas capazes de receber um sinal e a transmissão de tal sinal através da membrana plasmática de uma célula. Um exemplo de um "receptor de superfície celular" da presente invenção é o receptor Fucosil-GMl.

O termo "anticorpo", conforme aqui citado, inclui anticorpos inteiros e qualquer fragmento ligante ao antígeno (ou seja, "porção ligante ao antígeno") ou cadeias simples dos mesmos. Um "anticorpo" refere-se a uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações bissulfeto ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo. Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada compreende três domínios, Ch1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve compreende um único domínio, Cl. As regiões Vh e Vl podem ainda, ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada Vh e Vl é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas de terminal-amino para terminal-carboxi na seguinte ordem: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis de cadeias leves e pesadas contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo diversas células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.

O termo "porção ligante ao antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo"), conforme aqui utilizado, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que mantém a capacidade de ligar-se especificamente a um antígeno (ex: Fucosil-GMl). Foi demonstrado que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser realizada através de fragmentos de um anticorpo de extensão completa. Exemplos de fragmentos ligantes abrangidos pelo termo "porção ligante ao antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo dos domínios VL, VH, Cl e ChI ; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por 5 uma ponte de bissulfeto na região de dobra ("hinge");

(iii) um fragmento Fd, consistindo de domínios Vh e CHi;

(iv) um fragmento Fv consistindo de domínios Vl e Vh de um braço único de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) "Nature" 341:544-546) , que consiste de um domínio Vh ; e (vi) uma região determinante da complementaridade isolada (CDR). Além disso, apesar dos dois domínios do fragmento Fv, Vl e VH, são codificadas por genes separados, eles podem ser ligados, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que o capacita a ser feito como uma proteína de cadeia simples na qual os pares de regiões Vl e Vh para formar moléculas monovalentes (conhecidas como cadeia simples Fv (scFv); ver, por exemplo, Bird et al(1988) Science 2^2:423-426; e Huston et al.(1988) Proc. Natl.Acad.Sci.USA 85:5879- 5883) . Tais anticorpos de cadeia simples também pretendem estar abrangidos pelos termos "porção ligante ao antígeno" de um anticorpo. Esses fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando-se técnicas convencionais conhecidas pelos técnicos no assunto, e os fragmentos são identificados quanto à utilidade da mesma forma que os anticorpos intactos.

Um "anticorpo isolado", conforme aqui utilizado, pretende se referir a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos tendo especificidades antigênicas diferentes (ex: um anticorpo isolado que especificamente liga-se ao Fucosil-GMl é substancialmente livre de anticorpos que se ligam, especificamente, aos antígenos que não o Fucosil-GMl). Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou substâncias químicas.

O termo "anticorpo humano", conforme aqui utilizado, pretende incluir anticorpos que possuem regiões variáveis nas quais tanto as regiões estruturais como as regiões CDR são derivadas de seqüências de imunoglobulina de linha germinal humana. Além disso, se o anticorpo tiver uma região constante, a região constante também é derivada de seqüências de imunoglobulina de linha germinal humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por seqüências de imunoglobulina de linha germinal humana (ex: mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou através de mutação somática in vivo) . Porém, o termo "anticorpo humano", conforme aqui utilizado, não pretende incluir anticorpos nos quais as seqüências CDR derivadas da linha germinal de outras espécies de mamíferos, tal como um camundongo, foi enxertado em seqüências estruturais humanas.

O termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos que exibem uma especificidade de ligação simples que possuem regiões variáveis nas quais tanto as regiões estruturais como as regiões CDR são derivadas de seqüências de imunoglobulina de linha germinal humana. Em uma configuração, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não-humano transgênico, como por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo um transgene humano de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve humano fundido com uma célula imortalizada.

O termo "anticorpo recombinante humano", conforme aqui utilizado, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados através de meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados de um animal (ex: um camundongo), que é transgênico ou transcromossômico para genes de imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado com o mesmo (descrito abaixo), (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, como por exemplo, um transfectoma,(c) anticorpos isolados de um banco de anticorpo humano combinatorial recombinante, e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados através de quaisquer outros meios que envolvem alinhamento de seqüências gênicas de imunoglobulina humana com outras seqüências de DNA. Tais anticorpos recombinantes humanos possuem regiões variáveis nas quais as regiões estruturais e as regiões CDR são derivadas de seqüências de imunoglobulina de linha germinal humana. Em certas configurações, porém, tais anticorpos recombinantes humanos podem ser submetidos à mutagênese in vitro (ou quando for utilizado um animal transgênico para seqüências Ig humana, mutagênese somática in vivo) e assim as seqüências de aminoácido das regiões Vh e VL dos anticorpos recombinantes são seqüências que, embora derivadas de e relacionadas com seqüências Vh e VL de linha germinal humana, não podem existir naturalmente dentro do repertório de linha germinal de anticorpo humano in vivo.

Conforme aqui utilizado, "isotipo" refere-se à classe de anticorpo (ex: IgM ou IgGl) que é codificada pelos genes da região constante de cadeia pesada.

As frases "um anticorpo reconhecendo um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são utilizadas intercambiadamente na presente invenção com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno".

0 termo "derivado de anticorpo humano" refere-se a qualquer forma modificada do anticorpo humano, como por exemplo, um conjugado do anticorpo e outro agente ou anticorpo.

O termo "anticorpo humanizado" pretende referir-se a anticorpos nos quais as seqüências CDR derivadas da linha germinal de outra espécie mamífera, tal como, um camundongo foram enxertadas em seqüências estruturais humanas. Modificações adicionais da região estrutural podem ser feitas nas seqüências estruturais humanas.

0 termo "anticorpo quimérico" pretende se referir a anticorpos nos quais as seqüências de região variável são derivadas de uma espécie e as seqüências de região constante são derivadas de outra espécie, tal como um anticorpo no qual as seqüências de região variável são derivadas de um anticorpo de camundongo e as seqüências de região constante são derivadas de um anticorpo humano. Conforme aqui utilizado, um anticorpo que "liga-se especificamente ao Fucosil-GM1 humano" pretende referir- se a um anticorpo que se liga ao Fucosil-GMl humano com um Kd de 5x1 CT7M ou menos, mais preferivelmente 1 χ 10-8M ou menos, mais pref erivelmente 1 χ 10-8M ou menos, mais pref erivelmente 5 χ 10-9M ou menos.

O termo "KassOc" ou "Ka", conforme aqui utilizado, pretende se referir à taxa de associação de uma interação anticorpo-antígeno específica, ao passo que o termo "KdIs" ou "Kd" conforme aqui utilizado, pretende se referir à taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno específica. 0 termo "KD" conforme aqui utilizado, pretende se referir à constante de dissociação, que é obtida da relação de Kd para Ka (ou seja, KdZKa) e é expressa como uma concentração molar (M). Valores K0 para anticorpos podem ser determinados utilizando-se métodos estabelecidos no estado da técnica. Um método preferido para determinar o Kd de um anticorpo consiste em utilizar ressonância de plásmon de superfície, preferivelmente, utilizando um sistema biosensor tal como um sistema Biacore®.

Conforme aqui utilizado, o termo "alta afinidade" por um anticorpo IgG refere-se a um anticorpo tendo um K0 de 10-8M ou menos, mais pref erivelmente 10-9M ou menos e ainda mais pref erivelmente 10-10M ou menos. Porém, a ligação de "alta afinidade" pode variar para outros isotipos de anticorpo. Por exemplo, ligação de "alta afinidade" por um isotipo IgM refere-se a um anticorpo com um Kd de 10-7M ou menos, mais pref erivelmente 10-8M ou menos, ainda mais preferivelmente 10-9M ou menos.

Conforme aqui utilizado, o termo "indivíduo" inclui qualquer animal humano ou não-humano. O termo "animal não-humano" inclui todos os vertebrados, como por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não-humanos, ovelhas, cães, gatos, cavalos, vacas, frangos, anfíbios e répteis, etc.

Diversos aspectos do relatório são descritos em maiores detalhes nas subseções seguintes.

Anticorpos Anti-Fucosil-GMl

Os anticorpos da invenção são caracterizados por características ou propriedades funcionais particulares dos anticorpos. Por exemplos, os anticorpos ligam-se especificamente ao Fucosil-GMl humano, preferivelmente, um Fúcosil-GMl. Preferivelmente, um anticopro desta invenção liga-se ao Fucosil-GMl corri alta afinidade, por exemplo, com um K0 de 1 χ IO-7M ou menos. Os anticorpos anti-Fucosil-GMl desta invenção, exibem, preferivelmente um ou mais das seguintes características:

(a) liga-se especificamente ao Fucosil-GMl; e

(b) liga-se a linha celular de câncer de células pequenas do pulmão humano DMS-79 (SCLC humano - ATCC # CRL-2049).

Preferivelmente, o anticorpo liga-se ao Fucosil-GMl com um Kd de 5 X10-8M ou menos, liga-se ao Fucosil-GMl com um Kd de 1 X10-8M ou menos, liga-se ao Fucosil-GMl com um Kd de 5 X10-9M ou menos, ou liga-se ao Fucosil-GMl com um Kd de 1 X10-8M ou menos. Ensaios padrão para avaliar a capacidade de ligação dos anticorpos para Fucosil-GMl são conhecidos na técnica, incluindo por exemplo, ELISAs, Western blots e RIAs. A cinética de ligação (por exemplo, afinidade de ligação) dos anticorpos também podem ser avaliadas por ensaios padrões conhecidos da técnica, tais como por ELISA, análise de Scatchard e análise Biacore. Anticorpos Monoclonais 5B1, 5B1a, 7D4, 13B8 e 18D5. Anticorpos preferidos da invenção são os anticorpos monoclonais humanos 5B1, 5Bla, 7D4, 13B8 e 18D5, isolados e estruturalmente caracterizados conforme descrito nos Exemplos 1 e 2. As seqüências de aminoácido Vh de 5B1, 5Bla, 7D4, 13B8 e 18D5 são mostradas nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 e 6, respectivamente. As seqüências de aminoácido Vl de 5B1, 5Bla, 7D4 , 13B8 e 18D5 são mostradas nas SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11 e 12, respectivamente.

Dado que cada um desses anticorpos pode ligar-se ao Fucosil-GMl, as seqüências Vh e Vl podem ser "misturas e combinadas" para criar outras moléculas de ligação ao anti-Fucosil-GMl da invenção. A ligação ao Fucosil-GMl de tais anticorpos "mistos e combinados" pode ser testada utilizando-se os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (ex: ELISAs). Preferivelmente, quando as cadeias Vh e Vl são mistas e combinadas, uma seqüência Vh de um emparelhamento VH/VL particular é substituída por uma seqüência Vh de estrutura similar. Da mesma forma, pref erivelmente uma seqüência Vl de um emparelhamento VH/VL particular é substituída por uma seqüência Vl de estrutura similar.

Conseqüentemente, em um aspecto, a invenção provê um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo compreendendo:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 e 6; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11 e 12;

sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao Fucosil- GMl. Combinações preferidas de cadeia pesada e leve incluem:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:1; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:7; ou

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:2, e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:8; ou (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:3; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:9; ou

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:4; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:10; ou

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:5; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:11; ou

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:6; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:12.

Em outro aspecto, a invenção provê anticorpos que compreendem a cadeia pesada e a cadeia leve CDRls, CDR2s e CDR3s de 5B1, 5Bla, 7D4, 13B8 e 18D5, ou combinações das mesmas. As seqüências de aminoácido de CDRls Vh de 5B1, 5Bla, 7D4, 13B8 e 18D5, são mostradas nas SEQ ID NOs: 13,14, 15, 16, 17 e 18, respectivamente. As seqüências de aminoácido das CDR2s Vh de 5B1, 5Bla, 7D4, 13B8 e 18D5, são mostradas nas SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 23 e 24, respectivamente. As seqüências de aminoácido de CDR3s Vh de 5B1, 5Bla, 7D4, 13B8 e 18D5, são mostradas nas SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29 e 30, respectivamente. As seqüências de aminoácido das CDRls Vk de 5B1, 5Bla, 7D4, 13B8 e 18D5, são mostradas nas SEQ ID NOs: 31, 32, 33, 43 4, 35 e 36, respectivamente. As seqüências de aminoácido de CDR2s Vk de 5B1, 5Bla, 7D4, 13B8 e 18D5, são mostradas nas SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 40, 41 e 42, respectivamente. As seqüências de aminoácido das CDR3s Vk de 5B1, 5Bla, 7D4, 13B8 e 18D5, são mostradas nas SEQ ID NOs: 43, 44, 45, 46, 47 e 48, respectivamente. As regiões CDR são delineadas utilizando o sistema Kabat (Kabat, E. A. et al.(1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Fifth Edition, U.S.Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242). Dado que cada um desses anticorpos pode ligar-se ao Fucosil-GMl e que a especificidade de ligação a antígeno é provida principalmente pelas regiões CDRl, CDR2 e CDR3, as seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 Vh e as seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 Vk podem ser "misturadas e combinadas" (ou seja, as CDRs de anticorpos diferentes podem ser misturadas e combinadas, embora cada anticorpo deva conter uma CDRl, CDR2 e CDR3 Vh e uma CDRl, CDR2 e CDR3 VK) para criar outras moléculas ligantes ao anti-Fucosil- GMl da invenção. A ligação ao Fucosil-GMl de tais anticorpos "misturados e combinados" pode ser testada utilizando os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (ex: ELISAs, análise Biacore®). Preferivelmente, quando as seqüências CDR Vh são misturadas e combinadas, a seqüência CDRl, CDR2 e/ou CDR3 de uma seqüência Vh específica é substituída por uma seqüência(s) CDR de estrutura similar. Da mesma forma, quando seqüências CDR Vk são misturadas e combinadas, a seqüência CDRl, CDR2 e/ou CDR3 de uma seqüência Vk específica é preferivelmente substituída por uma seqüência (s) CDR de estrutura similar. Será evidente para o habilitado na técnica que seqüências Vh e Vl novas podem ser criadas substituindo-se uma ou mais seqüências da região CDR Vh e/ou V1 por seqüências de estrutura similar das seqüências CDR aqui descritas para os anticorpos monoclonais 5B1, 5Bla, 7D4, 13B8 e 18D5,.

Conseqüentemente, em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo:

(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17 e 18; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 23 e 24; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28 e 29;

(d) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do

grupo consistindo de SEQ ID NOs: 31, 32, 33, 34, 35 e 36;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 40, 41 e 42;

e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 43, 44, 45, 46, 47 e 48; sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao Fucosil- GMl, preferivelmente Fucosil-GMl.

Em uma configuração preferida, o anticorpo compreende:

(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 13;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 19;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 25;

(d) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 31;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 37; e

(f) uma CDR 3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 43.

Em outra configuração preferida, o anticorpo compreende: (a) uma CDRl de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 14;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 20;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 26;

(d) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 32; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 38; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 44.

Em outra configuração preferida, o anticorpo compreende:

(a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 15;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 21;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 27;

(d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 33;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve 15 compreendendo SEQ ID NO: 39; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 45.

Em outra configuração preferida, o anticorpo compreende:

(a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 16;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 22;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 28;

(d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 34;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 40; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 46.

Em outra configuração preferida, o anticorpo compreende:

(a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 17;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 23;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 29; (d) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 35;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 41; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 47.

Em uma outra configuração preferida, o anticorpo compreende:

(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 18;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 24;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 30;

(d) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 36;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 42; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 48.

É bastante conhecido no estado da técnica que o domínio CDR3, independentemente do(s) domínio(s) CDRl e/ou CDR2, isoladamente pode determinar a especificidade de ligação de um anticorpo por um antígeno cognato e que anticorpos múltiplos podem previsivelmente ser gerados tendo a mesma especificidade de ligação baseada numa seqüência CDR3 comum. Vide, por exemplo, Klimka et al., British J. of Câncer 83^(2) :252-260 (2000) (descrevendo a produção de um anticorpo anti-CD30 humanizado utilizando apenas o domínio variável de cadeia pesada CDR3 de anticorpo anti- CD30 murino Ki-4); Beiboer et al.,J.Mol.Biol. 296:833-849 (2000) (descrevendo anticorpos de glicoproteína-2 epitelial recombinante (EGP-2) utilizando apenas a seqüência CDR3 de cadeia pesada do anticorpo anti-EGP-2 MOC-31 murino parental); Rader et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 9J5: 8910-8915 (1998) (descrevendo um painel de anticorpos avβ3 anti-integrina humanizados utilizando um domínio CDR3 variável de cadeia leve e pesada de um anticorpo LM60 9 ανβ3 anti-integrina murino, sendo que cada anticorpo membro compreende uma seqüência distinta fora do domínio CDR3 e capaz de ligar o mesmo epítopo como o anticorpo murino parental com afinidades tão altas ou mais altas que o anticorpo murino parental); Barbas et al., J.Am.Chem.Soc. 116:2161-2162 (1994) (revelando que o domínio CDR3 provê a contribuição mais significativa para ligação ao antígeno) ; Barbas et al., Proc .Natl .Acad. Sci .U. S .A. 9^2:2529-2533 (1995) (descrevendo o enxerto de seqüências CDR3 de cadeia pesada de três Fabs (SI-1, SI-40 e SI-32) contra DNA placentário humano sobre a cadeia pesada de um Fab toxóide anti-tetânico, substituindo assim a CDR3 de cadeia pesada existente e demonstrando que o domínio CDR3 isoladamente conferiu a especificidade de ligação); e Ditzel et al. , J.Immunol., 157-739-749 (1996) (descrevendo estudos de enxerto em que a transferência apenas de CDR3 de cadeia pesada de um Fab LNA3 poliparticular parental para uma cadeia pesada de um anticorpo Fab p313 ligante ao toxóide tetânico IgG monoparticular foi suficiente para reter a especificidade de ligação do Fab parental). Cada uma dessas referências é aqui incorporada por referência em sua íntegra.

Conseqüentemente, em certos aspectos, a presente invenção provê anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo não-humano, tais como um anticorpo de camundongo ou de rato, sendo que o anticorpo monoclonal é capaz de ligar- se especificamente ao Fucosil-GMl. Dentro de algumas configurações, tais anticorpos compreendem um ou mais domínios CDR3 de cadeia leve e/ou pesada a partir de um anticorpo não-humano (a) capazes de competir para ligação com; (b) reter as características funcionais; (c) ligar- se ao mesmo epítopo; e/ou (d) ter uma afinidade de ligação similar como a do anticorpo parental não-humano correspondente. Dentro de outros aspectos, a presente invenção provê anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um primeiro anticorpo humano, tal como, por exemplo, um anticorpo humano obtido de um animal não-humano, sendo que o primeiro anticorpo humano é capaz de ligar-se especificamente ao Fucosil-GMl e onde o domínio CDR3 a partir de um primeiro anticorpo humano substituindo um domínio CDR3 em um anticorpo humano no qual falta especificidade de ligação para o Fucosil-GMl para gerar um segundo anticorpo humano que seja capaz de ligar-se especificamente ao Fucosil-GMl. Em algumas configurações, os anticorpos da presente descrição compreendem um ou mais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve do primeiro anticorpo humano (a) são capazes de competir para ligar-se com; (b) manter as características funcionais; (c) ligar-se ao mesmo epítopo; e/ou (d) possuem uma afinidade de ligação similar à do primeiro anticorpo humano parental correspondente.

Anticorpos tendo Seqüências de Linha Germinal Específicas Em certas configurações, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada de um gene de imunoglobulina de cadeia pesada de linha germinal particular e/ou uma região variável de cadeia leve de um gene de imunoglobulina de cadeia leve de linha germinal particular.

Por exemplo, em uma configuração preferida, a invenção provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivada de um gene Vh 3-48 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao Fucosil-GMl, preferivelmente

FucosilGMl. Em uma outra configuração preferida, a invenção provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivada de um gene Vk L15 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao Fucosil-GMl, preferivelmente, Fucosil-GMl. Ainda, em outra configuração preferida, a invenção provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, onde o anticorpo: (a) compreende uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivada de um gene Vh 3-48 (que codifica as seqüências de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 61);

(b) compreende uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivada de um gene Vk L15 (que codifica as seqüências de aminoácido estabelecida nas SEQ ID NOs: 62); e

(c) liga especificamente ao Fucosil-GM1. Exemplos de anticorpo tendo Vh e Vk de Vh 3-4 8 e Vk Ll5, respectivamente são 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5.

Conforme aqui utilizado, um anticorpo humano compreende regiões variáveis de cadeia pesada ou leve que é "o produto de" ou "derivado de" uma seqüência de linha germinal específica se as regiões variáveis do anticorpo forem obtidas de um sistema que utiliza genes de imunoglobulina de linha germinal humana. Tais sistemas incluem imunizar um camundongo transgênico portando genes de imunoglobulina humana com o antígeno de interesse ou identificar um banco de gene de imunoglobulina humana exibindo um fago com o antígeno de interesse. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma seqüência de imunoglobulina de linha germinal humana pode ser identificado como tal comparando-se a seqüência de aminoácidos do anticorpo humano com as seqüências de aminoácidos de imunoglobulinas de linha germinal humana e selecionando-se a seqüência de imunoglobulina de linha germinal humana que está mais próxima em seqüencia (ou seja, com a maior % de identidade) da seqüência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma seqüência de imunoglobulina de linha germinal humana particular pode conter diferenças de aminoácidos se comparada com a seqüência de linha germinal devido, por exemplo, a mutações somáticas de ocorrência natural ou a introdução intencional de mutação sítio-direcionada. Porém, um anticorpo humano selecionado é tipicamente pelo menos 90% idêntico em seqüência de aminoácidos a uma seqüência de aminoácidos codificada por um gene de imunoglobulina de linha germinal humana e contém resíduos de aminoácidos que identificam o anticorpo humano como sendo humano quando comparado com as seqüências de aminoácido de imunoglobulina de linha germinal de outras espécies (ex: seqüências de linha germinal de murino). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 95%, ou ainda pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico em seqüência de aminoácidos à seqüência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinal. Tipicamente, um anticorpo humano derivado de uma seqüência de linha germinal humana particular poderá exibir não mais que 10 aminoácidos diferentes da seqüência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinal.

Em certos casos, o anticorpo humano pode apresentar não mais que 5 ou ainda não mais que 4, 3, 2 ou 1 aminoácido diferente daquela seqüência de aminoácidos codificada pelo gene da imunoglobulina de linha germinal.

Anticorpos Homólogos

Em outra configuração ainda, um anticorpo da invenção compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo seqüências de aminoácidos que são homólogas às seqüências de aminoácido dos anticorpos preferidas aqui descritas, e sendo que os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-

Fucosil-GMl desta invenção.

Por exemplo, a invenção provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, sendo que:

(a) a região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80% homóloga à seqüência de aminoácidos, selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 e 6;

(b) a região variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80% homóloga à seqüência de aminoácidos, selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11 e 12; Os anticorpos apresentam um ou mais das propriedades a seguir:

(c) o anticorpo liga-se especificamente ao Fucosil-GMl com um Kd de 1 χ IO-7M ou menos;

(d) o anticorpo liga-se a linha de célula de câncer das pequenas células de pulmão DMS-79 humanas (SCLC humano - ATCC # CRL-2049).

Em outras configurações, as seqüências de aminoácido Vh e/ou Vl podem ser 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homólogas às seqüências acima citadas. Um anticorpo tendo regiões Vh e Vl com alta homologia (ou seja, de 80% ou mais) com as regiões Vh e Vl das seqüências acima citadas, pode ser obtido através de mutagênese (ou seja, mutagênese sítio-direcionada ou mediada por PCR) de moléculas de ácido nucléico codificando SEQ ID NOs: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 e 60, seguido de teste do anticorpo codificado alterado quanto à função retida (ou seja, as funções representadas em (c) e (d) usando os ensaios funcionais descritos aqui).

Conforme aqui utilizada, a homologia percentual entre as seqüências de aminoácidos é equivalente ao percentual de identidade entre as duas seqüências. 0 percentual de identidade entre as duas seqüências é função do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências (ou seja, % homologia = # de posições idênticas/total de # de posições χ 100), levando em consideração o número de intervalos ("gaps") e a extensão de cada intervalo, que precisam ser introduzidos para alinhamento ótimo das duas seqüências. A comparação das seqüências e a determinação do percentual de identidade, entre as duas seqüências, podem ser realizadas utilizando-se um algoritmo matemático, conforme descrito nos exemplos não restritivos abaixo.

0 percentual de identidade entre as duas seqüências de aminoácidos pode ser determinado utilizando-se o algoritmo de E.Meyers e W.Miller (Comput. Appl .Biosci .Jl: 11-17 (1988) ) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) utilizando a tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de extensão de intervalos de 12 e uma penalidade por inserção de intervalos de 4. Além disso, o percentual de identidade entre as duas seqüências de aminoácidos pode ser determinado utilizando-se o algoritmo de Needleman e Wunsch (J.Mol.Biol.48:444-453 (1970)) que foi incorporado ao programa GAP no pacote de software CGC (disponível em www.gcg.com), utilizando ou uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250 e um peso de intervalos de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de extensão de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. Adicional ou alternativamente, as seqüências de proteína da presente descrição podem ser ainda utilizadas como "seqüência de pesquisa/consulta ("query")" para realizar uma busca em bancos de dados públicos para, por exemplo, identificar seqüências relacionadas. Tais buscas podem ser efetuadas utilizando-se o programa XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al.(1990) J.Mol.Biol.215:403-10. As buscas BLAST de proteína podem ser efetuadas com o programa XBLAST, escore=50, extensão de palavra=3 para obter seqüências de aminoácido homólogas às moléculas de anticorpo da invenção. Para obter alinhamentos com intervalos para fins de comparação, o "Gapped BLAST" pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al., (1997) "Nucleic Acids Res"., 25 (17) : 3389-3402. Ao utilizar os programas BLAST e "Gapped BLAST", podem ser utilizados os parâmetros de valor padrão dos respectivos programas (ex: XBLAST e NBLAST). Vide www.ncbi.nlm.nih.gov.

Anticorpos com Modificações Conservativas

Em certas configurações, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo seqüências CDR1, CDR2 e CDR3, sendo que uma ou mais dessas seqüências CDR compreendem seqüências de aminoácidos especificadas com base nos anticorpos preferidos aqui descritos (ex: 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8, ou 18D5) ou suas modificações conservativas, e sendo que os anticorpos mantêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti- Fucosil-GMl da invenção. Conseqüentemente, a invenção provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo seqüências CDRl, CDR2 e CDR3, onde:

(a) a seqüência CDR3 da região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de seqüências de aminoácido de SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29 e 30, e suas modificações conservativas;

(b) a seqüência CDR3 da região variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 43, 44, 45, 46, 47 e 48 e suas modificações conservativas; e

O anticorpo exibe uma ou mais das seguintes propriedades:

(c) liga-se especificamente ao Fucosil-GMl; e

(d) o anticorpo liga=se a linha de célula de câncer de pequenas células DMS-79 de pulmão humano (SCLC humano - ATCC # CRL-2049).

Em uma configuração preferida, a seqüência CDR2 da região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de seqüências de aminoácido de SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 23 e 24 e suas modificações conservat ivas; e a seqüência CDR2 da região variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de seqüências de aminoácido de SEQ ID NOS: 37, 38, 39, 40, 41 e 42 e suas modificações conservativas. Em outra configuração preferida, a seqüência CDRl da região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de seqüências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17 e 18, e suas modificações conservativas; e a seqüência CDR1 da região variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de seqüências de aminoácido de SEQ ID NOs: 31, 32, 33, 34, 35 e 36 e suas modificações conservativas. Conforme aqui utilizado, o termo "modificações conservativas de seqüência" pretende se referir a modificações de aminoácidos que não afetam nem alteram significativamente as características de ligação do anticorpo contendo a seqüência de aminoácidos. Tais modificações conservativas incluem substituições, adições e deleções de aminoácidos. As modificações podem ser introduzidas em um anticorpo da invenção através de técnicas padrão conhecidas no estado da técnica, tais como mutagênese sítio-direcionada e mutagênese mediada por PCR. Substituições conservativas de aminoácidos são aquelas em que o resíduo aminoácido é substituído por um resíduo aminoácido que possui uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas no estado da técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (ex: lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (ex: ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (ex: glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não-polares (ex: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais com ramificação beta (ex: treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (ex: tirosina, fenilalanina, triptofato, histidina). Assim, um ou mais resíduos aminoácido dentro das regiões CDR de um anticorpo da invenção podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácidos da mesma família de cadeia lateral e o anticorpo alterado pode ser testado quanto à função retida (ou seja, a função estabelecida em (c) e (d) acima) utilizando os ensaios funcionais aqui descritos.

Anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo como anticorpos anti-Fucosil-GMl desta invenção

Em uma outra configuração, a invenção provê anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo em Fucosil-GMl humano como qualquer um dos anticorpos monoclonais Fucosil-GMl da invenção (ou seja, anticorpos que possuem a capacidade de fazer competição cruzada para ligar-se ao Fucosil-GMl com qualquer um dos anticorpos monoclonais da invenção). Em configurações preferidas, o anticorpo de referência para estudos de competição cruzada pode ser o anticorpo monoclonal 5B1 (tendo seqüências Vh e Vl conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 1 e 7, respectivamente), ou o anticorpo monoclonal 5Bla (tendo seqüências Vh e V1 conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 2 e 8, respectivamente), ou o anticorpo monoclonal 7D4 (tendo seqüências Vh e Vl conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 3 e 9, respectivamente), ou o anticorpo monoclonal 7E4 (tendo seqüências Vh e Vl conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 4 e 10 respectivamente), ou o anticorpo monoclonal 13B8 (tendo seqüências Vh e Vl conforme mostrado nas SEQ ID NOs:5 e 11, respectivamente), ou o anticorpo monoclonal 18D5 (tendo seqüências Vh e Vl conforme mostrado nas SEQ ID NOs:6 e 12, respectivamente). Tais anticorpos de competição cruzada podem ser identificados com base em sua capacidade de fazer competição cruzada com 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 ou 18D5 em ensaios padrão de ligação ao Fucosil-GMl. Por exemplo, a análise BIAcore®, ensaios ELISA ou a citometria de fluxo podem ser usados para demonstrar a competição cruzada com os anticorpos da presente invenção. A capacidade de um anticorpo de teste inibir a ligação, por exemplo, de 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13Β8 ou 18D5 ao Fucosil-GM1 humano demonstra que o anticorpo de teste pode competir com 5B1, 5Bla, 7D4 , 7E4, 13B8 ou 18D5 para ligar-se ao Fucosil-GM1 humano e assim liga-se ao mesmo epítopo em Fucosil-GM1 humano como 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 ou 18D5. Em uma configuração preferida, o anticorpo que se liga ao mesmo epítopo em Fucosil-GM1 humano como 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 ou 18D5é um anticorpo monoclonal humano. Tais anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados e isolados conforme descrito nos Exemplos.

Anticorpos Construídos e Modificados

Um anticorpo da invenção pode ser ainda preparado utilizando-se um anticorpo que possua uma ou mais das seqüências VH e/ou VL aqui descritas pode ser usado como material de partida para construir um anticorpo modificado que pode ter propriedades alteradas em relação ao anticorpo de partida. Um anticorpo pode ser construído modificando-se um ou mais resíduos dentro de uma ou de ambas as regiões variáveis (ou seja, Vh e/ou VL) , por exemplo, dentro de uma ou mais regiões CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões estruturais. Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser construído modificando-se resíduos dentro da região(s) constante(s) , por exemplo, para alterar a função(ões) efetora(s) do anticorpo.

Um tipo de construção em região variável que pode ser realizada é o enxerto em CDR. Os anticorpos interagem com os antígenos alvo predominantemente através de resíduos aminoácidos que estão localizados nas seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada e leve. Por essa razão, as seqüências de aminoácidos dentro das CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que as seqüências fora das CDRs. Uma vez que as seqüências de CDR são responsáveis pela maioria das interações anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitem as propriedades de anticorpos específicos de ocorrência natural construindo-se vetores de expressão que incluam seqüências CDR do anticorpo específico de ocorrência natural enxertado nas seqüências estruturais de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (vide, por exemplo, Riechmann, L.et al.(1998) "Nature" 332:323- 327; Jones, P.et al.(1986) "Nature" 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) "Proc.Natl.Acad." vide U.S.A. 86 :10029- 10033; Patente americana 5.225.539 a Winter, e patentes americanas Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 a Queen et al.).

Conseqüentemente, uma outra configuração da invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou a uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que compreende seqüências CDRl, CDR2, e CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17 e 18, SEQ ID NOS: 19, 20, 21, 22, 23 e 24, e SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29 e 30, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve compreendendo seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 31, 32, 33, 34, 35 e 36, SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 40, 41 e 42, e SEQ ID NOs: 43, 44, 45, 46, 47 e 48, respectivamente. Assim, tais anticorpos contêm as seqüências CDR Vh e Vl de anticorpos monoclonais 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 ou 18D5, podendo ainda conter seqüências estruturais diferentes desses anticorpos. Tais seqüências estruturais podem ser obtidas de bancos de dados públicos de DNA ou de referências publicadas que incluam seqüências gênicas de anticorpo de linha germinal. Por exemplo, as seqüências de DNA de linha germinal para genes humanos da região variável de cadeia pesada e leve podem ser encontradas no banco de dados de seqüência de linha germinal humana "VBase" (disponível na internet no www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), bem como em Kabat, E.A. et al.(1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Fifth Edition, U.S.Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I.M.,et al.(1992) "The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments with Different Hypervariable Loops" J.Mol.Biol.227:776-798; e Cox, J.P.L.et al . (1994) "A Directory of Human Germ-Iine Vh segments Reveals a Strong Bias in Their Usage" Eur.J.Immunol. Z4: 827-836; cujo conteúdo de cada um foi aqui expressamente incorporado por referência. Como um outro exemplo, as seqüências de DNA de linha germinal para os genes de regiões variáveis de cadeias pesadas e leves podem ser encontradas em bancos de dados de seqüências Genbank. Por exemplo, as seqüências da linha germinal de cadeia pesada a seguir podem ser encontradas em HCo7 HuMAb de camundongo disponíves sob o número de acesso de acompanhamento do GenBank: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 e BC070333), 3-33 (NG_0 01010 9 e NT_024637) e 3-7 (NG_0010109 e NT_024637). Como um outro exemplo, as seqüências de cadeia pesada de linha germinal a seguir encontradas em Hcol2 HuMAb de camundongos estão disponíveis em bancos de seqüências GenBank acompanhando o número de acesso: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 e BC070333), 5-51 (NG_0010109 e NT_024637), 4-34 (NG_0010109 e NT_024637) , 3-30,3 (?) e 3- 23 (AJ406678).

Seqüências estruturais preferidas para uso nos anticorpos da invenção são estruturalmente similares às seqüências estruturais utilizadas por anticorpos selecionados da invenção, por exemplo, similares às seqüências estruturais Vh 3-48 (SEQ ID NO: 61) e/ou as seqüências estruturais Vk L15 (SEQ ID NO: 62) utilizadas por anticorpos monoclonais preferidos da invenção. As seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 Vh e as seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 Vk podem ser enxertadas em regiões estruturais que possuam a seqüência idêntica à encontrada no gene de imunoglobulina de linha germinal do qual deriva a seqüência estrutural, ou as seqüências de CDR podem ser enxertadas em regiões estruturais que contenham uma ou mais mutações se comparadas com as seqüências de linha germinal. Por exemplo, descobriu-se que em certos casos, é benéfico alterar resíduos dentro das regiões estruturais para manter ou aumentar a capacidade de ligação do anticorpo ao antígeno (vide, por exemplo, as patentes americanas 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 de Queen et al).

Outro tipo de modificação na região variável consiste em mutar os resíduos aminoácidos dentro das regiões CDRl, CDR2 e/ou CDR3 Vh e/ou Vk melhorando, assim, uma ou mais propriedades de ligação (ex: afinidade) do anticorpo de interesse. A mutagênese sítio-direcionada ou a mutagênese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a(s) mutação(ões) e o efeito sobre a ligação ao anticorpo, ou em outra propriedade funcional de interesse, pode ser avaliado em ensaios in vitro ou in vivo, conforme aqui descrito e fornecido nos Exemplos. São introduzidas modificações conservativas preferidas (conforme discutido acima). As mutações podem ser substituições, adições ou deleções de aminoácidos, mas são preferivelmente substituições. Além disso, tipicamente não são alterados mais que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região CDR.

Conseqüentemente, em uma outra configuração, a invenção provê anticorpos monoclonais anti-Fucosil-GMl isolados ou porções ligantes ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo: (a) uma região CDRl Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17 ou 18, ou uma seqüência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido, se comparada com as SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17 ou 18; (b) uma região CDR2 Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOS: 19, 20, 21, 22, 23 e 24, ou uma seqüência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos, se comparada com as SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 23 e 24; (c) uma região CDR3 Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29 e 30, ou uma seqüência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos se comparada com SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29 e 30; (d) uma região CDR1 Vk compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 31, 32, 33, 34, 35 e 36, ou uma seqüência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos se comparada com SEQ ID NOs: 31, 32, 33, 34, 35 e 36; (e) uma região CDR2 Vk compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 40, 41 e 42, ou uma seqüência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos, se comparada com SEQ ID NOS: 37, 38, 39, 40, 41 e 42; e (f) uma região. CDR3 Vk compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 43, 44, 45, 46, 47 e 48, ou uma seqüência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos, se comparada com SEQ ID NOS: 43, 44, 45, 46, 47 e 48. Anticorpos construídos da invenção incluem aqueles cujas modificações foram efetuadas em resíduos estruturais em Vh e/ou VK( por exemplo, para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente, tais modificações estruturais são feitas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, um método consiste em fazer retro-mutação ("backmutate") em um ou mais resíduos estruturais para a seqüência de linha germinal correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que tiver sido submetido à mutação somática poderá conter resíduos estruturais que diferem da seqüência da linha germinal da qual deriva o anticorpo. Tais resíduos podem ser identificados comparando-se as seqüências estruturais do anticorpo com as seqüências de linha germinal da qual deriva o anticorpo.

Por exemplo, para 7E4, o resíduo de aminoácido #11 (dentro de FRl) de Vh é uma serina sendo que este resíduo na seqüência de linha germinal Vh 3-48 correspondente é uma leucina. Para retornar as seqüências de região estrutural para sua configuração de linha germinal, às mutações somáticas podem ser retro-mutadas ("backmutated") para a seqüência de linha germinal, por exemplo, através de mutagênese sítio-direcionada ou mediada por PCR (ex: resíduo #11 de FRl de Vh de 7E4 podem ser retro-mutadas de serina para leucina).

Como outro exemplo, para 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5, o resíduo aminoácido #16 (dentro de FRl) de Vh é um ácido glutâmico, sendo que esse resíduo na seqüência de linha germinal Vh 3-48 correspondente é uma glicina. Para retornar as seqüências da região estrutural à sua configuração de linha germinal, por exemplo, o resíduo #16 do Vh de 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5, pode ser retro-mutado ("backmutated") de ácido glutâmico para glicina. Os referidos anticorpos "retro-mutados" também estão abrangidos por esta invenção.

Como um outro exemplo, para 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5, o resíduo aminoácido #23 (dentro de FRl) de Vh é uma valina, sendo que esse resíduo na seqüência de linha germinal Vh 3-48 correspondente é uma alanina. Para retornar as seqüências da região estrutural à sua configuração de linha germinal, por exemplo, o resíduo #23 de FR1 de Vh de 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5, pode ser retro-mutado de valina para alanina. Os referidos anticorpos "retro-mutados" também estão abrangidos por esta invenção.

Como outro exemplo, para 7D4, o resíduo aminoácido #24 (dentro de FRl) de Vh é uma valina, sendo que esse resíduo na seqüência de linha germinal Vh 3-48 correspondente é uma alanina. Para retornar as seqüências da região estrutural à sua configuração de linha germinal, por exemplo, o resíduo #24 de VH de 7D4 pode ser retro-mutado de valina para alanina. Os referidos anticorpos "retro-mutados" também estão abrangidos por esta invenção.

Como outro exemplo, para 13B8, o resíduo aminoácido #2 9 (dentro de FRl) de VH é uma leucina, sendo que esse resíduo na seqüência de linha germinal VH 3-48 correspondente é uma tirosina. Para retornar as seqüências da região estrutural à sua configuração de linha germinal, por exemplo, o resíduo #29 deVH de 13B8 pode ser retro-mutado de serina para tirosina. Os referidos anticorpos "retro-mutados" também estão abrangidos por esta invenção.

Como outro exemplo, para 7D4, 13B8 e 18D5, o resíduo aminoácido #4 8 (dentro de FR2) de VH é uma isoleucina, sendo que esse resíduo na seqüência de linha germinal VH 3-48 correspondente é uma valina. Para retornar as seqüências da região estrutural à sua configuração de linha germinal, por exemplo, o resíduo #48 (resíduo #13 dentro de FR2) de VH de 7D4, 13B8 e 18D5, pode ser retro- mutado de isoleucina para valina. Os referidos anticorpos "retro-mutados" também estão abrangidos por esta invenção.

Como um outro exemplo, para 7D4 E 18D5, o resíduo aminoácido #84 (dentro de FR3) de VH é uma serina, sendo que esse resíduo na seqüência de linha germinal VH 3-48 correspondente é uma asparagina. Para retornar as seqüências da região estrutural à sua configuração de linha germinal, por exemplo, o resíduo #84 (resíduo #18 dentro de FR3) de VH de 7D4 e 18D5 pode ser retro-mutado de serina para asparagina. Os referidos anticorpos "retro-mutados" também estão abrangidos por esta invenção.

Outros tipos de modificação estrutural envolvem mutar um ou mais resíduos dentro da região estrutural, ou até mesmo dentro de uma ou mais regiões CDR, para remover os epítopos de célula T para assim reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Esse método é também designado "desimunização" e está descrito em maiores detalhes na publicação de patente americana No. 2003/0153043 por Carr et al.

Adicionalmente ou alternativamente às modificações efetuadas dentro das regiões estruturais ou CDR, os anticorpos da invenção podem ser construídos para incluir modificações dentro da região Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tal como a meia-vida sérica, fixação de complemento, ligação a receptor Fc, e/ou citotoxicidade celular antígeno-dependente. Além disso, um anticorpo da invenção pode ser quimicamente modificado (ex: uma ou mais porções químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou modificado para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma dessas configurações é descrita em maiores detalhes abaixo. A numeração dos resíduos na região Fc é àquela do índice EU de Kabat.

Em uma configuração, a região de dobra de CH1 é modificada de forma tal que o número de resíduos cisteína na região de dobra é alterado, como por exemplo, aumentado ou reduzido. Esse método é descrito mais detalhadamente na patente americana No. 5.677.425 de Bodmer et al. 0 número de resíduos de cisteína na região de dobra de CH1 é alterado, por exemplo, para facilitar a montagem das cadeias leve e pesada ou para aumentar ou reduzir a estabilidade do anticorpo.

Em outra configuração, a região de dobra Fc de um anticorpo é mutada para reduzir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são introduzidas na região de interface do domínio CH2-CH3 do fragmento de dobra-Fc, até que o anticorpo tenha danificado a ligação da proteína A estafilocócica (SpA) em relação à ligação a SpA de domínio de dobra Fc nativo. Esse método é descrito mais detalhadamente na patente americana No. US 6.165.745 de Ward et al.

Em outra configuração, o anticorpo é modificado para aumentar sua meia-vida biológica. Diversos métodos são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F, conforme descrito na patente americana No. 6.277.375 de Ward. Alternativamente, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CHl ou Cl para conter um epítopo ligante ao receptor de resgate tomado de duas alças de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG, conforme descrito nas patentes americanas Nos. 5.869.046 e 6.121.022, de Presta et al.

Ainda em uma outra configuração, a região Fc é alterada substituindo-se pelo menos um resíduo de aminoácid com um resíduo de aminoácido diferente para alterar a(s) função(ões) efetoras do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente, de forma que o anticorpo tenha uma afinidade alterada por um ligante efetor, mas que mantenha a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo parental. 0 ligante efetor no qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor Fc ou o componente Cl de complemento. Esse método é descrito com maiores detalhes nas patentes americanas Nos. 5.624.821 e 5.648.260, ambas de Winter et al.

Em outro exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácidos 329, 331 e 322 podem ser substituídos por um resíduo aminoácido diferente, de forma que o anticorpo altere a ligação a Clq e/ou reduza ou anule a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) . Esse método é descrito com maiores detalhes na patente americana No. 6.194.551 de Idusogie et al. Em outro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido nas posições de aminoácido 231 e 239 são alterados para assim alterar a capacidade de o anticorpo fixar o complemento. Esse método é descrito na publicação PCT WO 94/29351 de Bodmer et al.

Em outro exemplo ainda, a região Fc é modificada para aumentar a capacidade de o anticorpo mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou aumentar a afinidade do anticorpo por um receptor Fcy modificando um ou mais aminoácidos nas seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 OU 439. Esse método é descrito mais detalhadamente na Publicação PCT WO 00/42072 de Presta.

Além disso, os sítios de ligação em IgGl humana para FcyRl, FcyRI I, FcyRIII e FcRn foram mapeados e as variantes com ligação melhorada foram descritas (vide Shields, R.L.et al.(2001) J.Biol.Chem 276 -.6591-6604). Mutações específicas nas posições 256, 290, 298, 333, 334 e 33 9 demonstraram melhorar a ligação a FcyRIII. Além disso, as seguintes combinações de mutantes demonstraram melhorar a ligação a FcyRIII : T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A e S298A/E333A/K334A.

Ainda em uma outra configuração, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, pode-se preparar um anticorpo aglicosilado (ou seja, o anticorpo carece de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada, por exemplo, para aumentar a afinidade do anticorpo pelo antígeno. Tais modificações de carboidrato podem ser realizadas, por exemplo, alterando-se um ou mais sítios de glicosilação dentro da seqüência do anticorpo. Por exemplo, podem ser feitas uma ou mais substituições de aminoácido que resultem em eliminação de um ou mais sítios de glicosilação na região estrutural variável para assim eliminar a glicosilação naquele sítio. Essa aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo pelo antígeno. Tal método é descrito mais detalhadamente nas patentes americanas Nos. 5.714.350 e 6.350.861 de Co et al.

Adicional ou alternativamente, um anticorpo pode ser feito de modo que um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosildo tendo quantidades reduzidas de resíduos fucosil ou um anticorpo tendo estruturas GlcNac bisegmentantes aumentadas. Tais padrões de glicosilação alterada demonstraram aumentar a capacidade de ADCC dos anticorpos. Tais modificações de carboidrato podem ser efetuadas, por exemplo, expressando-se o anticorpo numa célula hospedeira com maquinário de glicosilação alterada. As células, com o maquinário de glicosilação alterado, foram descritas no estado da técnica e, podem ser usadas como células hospedeiras nas quais são expressos os anticorpos recombinantes da invenção, para assim produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, as linhagens celulares Ms704, Ms705 e Ms709 carecem do gene fucosiltransferase, FUT8 (alfa(1,6) fucosiltransferase), de forma que os anticorpos expressos nas linhagens celulares Ms704, Ms705, e Ms709 carecem de fucose em seus carboidratos. As linhagens celulares Ms704, Ms705, e Ms709FUT8-/- foram criadas pelo rompimento direcionado do gene FUT8 em células CHO/DG44 utilizando dois vetores de substituição (vide Publicação de patente americana No. 20040110704 de Yamana et al e Yamame-Ohnuki et al (2004) Biotechnol Bioeng. 87:614-22). Outro exemplo, EP 1.176.195 de Hanai et al. descreve uma linhagem celular com um gene FUT8 funcionalmente rompido, que codifica uma fucosil transferase, de forma que os anticorpos expressados em tal linhagem celular exibem hipofucosilção mediante redução ou eliminação da enzima relacionada à ligação alfa 1,6. Hanai et al. também descrevem as linhagens celulares que possuem baixa atividade enzimática para adicionar fucose à N- acetilglucosamina que se liga à região Fc do anticorpo ou que não possuem a atividade enzimática, por exemplo a linhagem celular de mieloma de rato YB2/0(ATCC CRL 1662).

A Publicação PCT WO 03/035835 de Presta descreve uma linhagem celular CHO variante, células Lecl3, com capacidade reduzida de ligar fucose a carboidratos ligados a Asn(2 97), o que também resulta em hipofucosilção de anticorpos expressos naquela célula hospedeira (vide também Shields, R.L. et al(2002) J.Biol.Chem. 2 77 :2 673 3-2 674 0) . A publicação PCT WO 99/54342 de Umana et al. , descreve linhagens celulares construídas para expressar glicosil transferases modificadoras de glicoproteína (ex: beta(l,4)-N- acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII) de forma que os anticorpos expressos nas linhagens celulares construídas exibam estruturas GlcNac bisegmentantes aumentadas, o que resulta em atividade aumentada de ADCC dos anticorpos (vide também Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 11_: 176-180) . Alternativamente, os resíduos de fucose do anticorpo podem ser clivados utilizando-se uma enzima fucosidase. Por exemplo, a fucosidase alfa-L- fucosidase remove resíduos fucosil de anticorpos (Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23).

Outra modificação dos anticorpos prevista na presente invenção é a peglicosilação ("pegylation"). Um anticorpo pode ser submetido à peglicosilação para, por exemplo, aumentar a meia-vida biológica (ex: sérica) do anticorpo. Para tratar com peglicosilação o anticorpo, o anticorpo ou o fragmento do mesmo é tipicamente reagido com polietileno glicol (PEG), tal como um éster reativo ou derivado de aldeído de PEG, sob condições nas quais um ou mais grupos PEG ficam ligados ao anticorpo ou ao fragmento de anticorpo. Preferivelmente, a peglicosilação é conduzida via reação de acilação ou reação de alquilação com uma molécula de PEG reativo (ou um polímero reativo análogo solúvel em água). Conforme aqui utilizado, o termo "polietileno glicol" pretende abranger qualquer uma das formas de PEG que tenha sido utilizada para derivatizar outras proteínas, tais como mono (C1- C10) alcoxi- ou ariloxi-polietileno glicol ou polietileno-glicol-maleimida. Em certas configurações, o anticorpo a ser tratado com PEG é um anticorpo aglicosilado. Métodos para tratar proteínas com PEGlicosilação são conhecidos no estado da técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da invenção. Vide, por exemplo, EP 0 154 316 de Nishimura et al. e EP 0 401 384 de Ishikawa et al.

Métodos para Construir Anticorpos

Conforme discutido acima, os anticorpos anti-Fucosil-GMl tendo seqüências Vh e Vk aqui descritos podem ser usados para criar novos anticorpos anti-Fucosil-GMl modificando- se as seqüências Vh e/ou VK, ou a(s) região (ões) constantes a elas ligadas. Assim, em outro aspecto da invenção, as características estruturais de um anticorpo anti-Fucosil-GMl da invenção, por exemplo, 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 ou 18D5, são usadas para criar anticorpos anti-Fucosil-GMl estruturalmente relacionados que retenham pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos da invenção, tal como ligação ao Fucosil-GMl humano. Por exemplo, uma ou mais regiões CDR de 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 ou 18D5, ou suas mutações, podem ser combinadas recombinantemente com regiões estruturais conhecidas e/ou com outras CDRs conhecidas para criar anticorpos anti-Fucosil-GMl adicionais recombinantemente construídos da invenção, conforme discutido acima. Outros tipos de modificações incluem aquelas descritas na seção anterior. O material de partida para o método de construção é uma ou mais das seqüências Vh e/ou Vk aqui providas, ou uma ou mais de suas regiões CDR. Para criar o anticorpo construído, não é necessário efetivamente preparar (ou seja, expressar como proteína) um anticorpo tendo uma ou mais das seqüências Vh e/ou Vk aqui providas, ou uma ou mais de suas regiões CDR. Em vez disso, as informações contidas na(s) seqüência(s) são utilizadas como o material de partida para criar uma seqüência(s) de "segunda geração" derivada(s) da seqüência(s) original e então a seqüência(s) de "segunda geração" é preparada e expressa como uma proteína.

Conseqüentemente, em outra configuração, a invenção provê um método para preparar um anticorpo anti-Fucosil-GMl compreendendo:

(a) prover: (i) uma seqüência de anticorpo de região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência

CDRl selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17 e 18, uma seqüência CDR2 selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22 23 e 24 e/ou uma seqüência CDR3 selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29 e 30; e/ou (ii) uma seqüência de anticorpo de região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência CDRl selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 31, 32, 33, 34, 35 e 36, uma seqüência CDR2 selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 40, 41 e 42 e/ou uma seqüência CDR3 selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 43, 44, 45, 46, 47 e 48;

(b) alterar pelo menos um resíduo aminoácido dentro da seqüência de anticorpo da região variável de cadeia pesada e/ou da seqüência de anticorpo da região variável

de cadeia leve para criar pelo menos uma seqüência de anticorpo alterado; e

(c) expressar a seqüência de anticorpo alterado como uma proteína.

Técnicas padrão de biologia molecular podem ser usadas para preparar e expressar a seqüência de anticorpo alterado.

Preferivelmente, o anticorpo codificado pela(s) seqüência (s) de anticorpo alterado(s) é aquele que retêm

uma, algumas ou todas as propriedades funcionais dos

anticorpos anti-Fucosil-GMl aqui descritos, cujas propriedades funcionais incluem, porém não se restringem a:

(a) o anticorpo ligar-se ao Fucosil-GMl com um KD de 1 χ IO-7M ou menos;

(b) ligar-se a uma linha de célula de câncer de células pequenas de pulmão DMS-79 do pulmão (SCLC humana - ATCC #

CRL-2049).

As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem ser avaliadas utilizando-se ensaios padrão disponíveis no estado da técnica e/ou aqui descritos, tais como os estabelecidos nos Exemplos (ex: citometria de fluxo, ensaios de ligação).

Em certas configurações dos métodos para construir anticorpos da invenção, mutações podem ser introduzidas aleatória ou seletivamente ao longo de toda ou de parte de uma seqüência de codificação de anticorpo anti- Fucosil-GMl e os anticorpos anti-Fucosil-GMl modificados resultantes podem ser identificados quanto à atividade de ligação e/ou outras propriedades funcionais conforme aqui descrito. Métodos mutacionais foram descritos no estado da técnica. Por exemplo, a publicação PCT WO 02/092780 de Short descreve métodos para criar e identificar mutações de anticorpos utilizando mutagênese de saturação, montagem de ligação sintética, ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, a Publicação PCT WO 03/074679 de Lazar et al. , descreve métodos para utilizar métodos computacionais de identificação para otimizar as propriedades físico-químicas dos anticorpos. Moléculas de ácido nucléico que codificam anticorpos da invenção

Um outro aspecto da invenção refere-se a moléculas de ácido nucléico que codificam os anticorpos da invenção. Os ácidos nucléicos podem estar presentes em células completas, num lisado de células, ou numa forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucléico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificado separadamente de outros componentes celulares ou outros contaminantes, como por exemplo, outros ácidos nucléicos celulares ou proteínas, através de técnicas padrão, incluindo o tratamento alcalino/SDS, bandeamento CsCl, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de agarose e outros muito conhecidos no estado da técnica. Vide, F.Ausubel et al. , ed. (1987) "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Um ácido nucléico da invenção pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode ou não conter seqüências intrônicas. Em uma configuração preferida, o ácido nucléico é uma molécula de cDNA.

Os ácidos nucléicos da invenção podem ser obtidos utilizando-se técnicas padrão de biologia molecular. Para anticorpos expressos por hibridomas (ex: hibridomas preparados a partir de camundongos transgênicos portando genes de imunoglobulina humana conforme descrito logo abaixo) cDNAs codificando as cadeias leve e pesada do anticorpo produzido pelo hibridoma podem ser obtidos através de técnicas de amplificação PCR padrão de clonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos de um banco de gene de imunoglobulina (ex: utilizando técnicas de exibição de fago), o ácido nucléico codificador do anticorpo pode ser recuperado do banco.

As moléculas preferidas de ácido nucléico da invenção são àquelas codif icadoras das seqüências VH e VL dos anticorpos monoclonais5Bl, 5Bla, 7D4 , 7E4, 13B8 e 18D5. As seqüências de DNA codificantes das seqüências VH de 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 ou 18D5 estão mostradas nas seqüências SEQ ID Nos: 49, 50, 51, 52, 53 e 54, respectivamente. As seqüências de DNA codificantes das seqüências VL de 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 ou 18D5 estão mostradas nas SEQ ID Nos: 55, 56, 57, 58 59 e 60, respectivamente.

Uma vez que os fragmentos de DNA codificantes dos segmentos VH e VL são obtidos, estes fragmentos de DNA podem ser então manipulados por técnicas de DNA recombinantes padrão, por exemplo, para converter os genes da região variável para os genes da cadeia de extensão completa do anticorpo, para o gene do fragmento Fab ou para um gene scFv. Nestas manipulações, um fragmento de DNA codificante de VL ou VH é operativamente ligado a um outro fragmento de DNA codificante de uma outra proteína, tal como uma região constante do anticorpo ou um ligante flexível. O termo "operativamente ligado" como utilizado neste contexto significa que os dois fragmentos de DNA estão ligados de modo que as seqüências de aminoácidos, codificadas pelos dois fragmentos de DNA que permanecem na estrutura. O DNA isolado codificante da região VH pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de extensão completa por ligação operativa com o DNA codificante de VH em uma outra molécula de DNA codificante das regiões constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As seqüências dos genes de região constante de cadeia pesada humana são conhecidas do estado da técnica (ver, por exemplo, Kabat, E.A., et al., (1991), 11Sequences of Proteins of Immunological Interest", Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e fragmentos de DNA abrangendo estas regiões podem ser obtidos por amplificação por PCR padrão. A região constante da cadeia pesada pode ser uma região constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD mas, mais preferivelmente, é uma região constante de IgGl ou IgG4. Para o gene de cadeia pesada do fragmento Fab, o DNA codificante de VH pode ser ligado operativamente a uma outra molécula de DNA codificante apenas da região constante de CH1 de cadeia pesada.

O DNA isolado codificante da região de VL pode ser convertido em um gene de cadeia leve de extensão completa (bem como um gene de cadeia leve do fragmento Fab) por ligação operativa do DNA codificante de VL a uma outra molécula de DNA codificante da região constante de cadeia leve, CL. As seqüências de genes de região constante de cadeia leve humana são conhecidas do estado da técnica (ver, por exemplo, Kabatf E.A. et al., (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e fragmentos de DNA abrangendo estas regiões podem ser obtidos por amplificação por PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante Kappa ou Lambda, mas mais preferivelmente, é uma região constante de Kappa.

Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNA codificantes de VH e VL são operativamente ligados a um outro fragmento codificante de uma ligação flexível, por exemplo, codificante de seqüência de aminoácidos (Gly4- Ser) 3, de modo que as seqüências VH e VL possam ser expressas como uma proteína de cadeia única contínua, com as regiões VH e VL ligadas por uma ligação flexível (ver, por exemplo, Bird et al., (1988) "Science" 242:423-426; Huston et al. , (1988) "Proc. Natl. Acad. Sci.", USA 85:5879-5883; Mc Cafferty et al., (1990) "Nature" 348 : 552-554) .

Produção de anticorpos monoclonais da invenção

Os anticorpos monoclonais (mAbs) da presente invenção podem ser produzidos através de uma variedade de técnicas, incluindo a metodologia convencional de anticorpo monoclonal, como por exemplo, a técnica padrão de hibridação de célula somática de Kohler e Milstein (1975) "Nature" 256:495. Embora os procedimentos de hibridação de célula somática sejam preferidos, em princípio, outras técnicas para produzir anticorpo monoclonal podem ser empregadas, como por exemplo, a transformação viral ou oncogênica de linfócitos B.

O sistema animal preferido para preparar hibridomas é o sistema murino. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento muito bem estabelecido. Os protocolos e técnicas de imunização para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos no estado da técnica. Pares de fusão (ex: células de mieloma murino) e procedimentos de fusão são também conhecidos. Anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invenção podem ser preparados com base na seqüência de um anticorpo monoclonal murino preparado conforme acima descrito. 0 DNA que codifica as imunoglobulinas de cadeia leve e pesada pode ser obtido do hibridoma murino de interesse e construído para conter seqüências de imunoglobulina não-murina (ex: humana) utilizando as técnicas de biologia molecular padrão. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, regiões murinas variáveis podem ser ligadas a regiões humanas constantes utilizando os métodos conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, a patente americana No. 4.816.567 de Cabilly et al. ) . Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDR murinas podem ser inseridas em uma estrutura humana utilizando os métodos conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, a patente americana No. 5.22 5.53 9 de Winter, e as patentes americanas Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 de Queen et al.). Em uma configuração preferida, os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra Fucosil-GMl podem ser gerados utilizando camundongos transgênicos ou transcromossômicos que carregam partes do sistema imune humano em vez do sistema camundongo. Esses camundongos transgênicos e transcromossômicos incluem camundongos designados como camundongos HuMAb® e KM mice®, respectivamente, e são coletivamente designados na presente invenção como "camundongos contendo Ig humana". 0 camundongo HuMAb® (Medarex, Inc.) contém minilocais ("miniloci") de gene de imunoglobulina humana que codificam seqüências de imunoglobulina humana não re- arranjadas de cadeia pesada (μ e γ) e leve κ, juntamente com mutações direcionadas que inativam os locais de cadeia μ e κ endógena (vide, por exemplo, Lonberg, et al. (1994) "Nature" 368 (6474) :856-859) . Conseqüentemente, os camundongos exibem expressão reduzida de IgM ou κ de camundongo e, em resposta à imunização, os transgenes humanos de cadeia pesada e leve introduzidos sofrem mudança de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais humanos Ig Gk de alta afinidade (Lonberg, N.et al. (1994), supra; revisado em Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49- 101; Lonberg N. e Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13 :65-93 e Harding, F. e Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci., 764:536-546) . A preparação e o uso de camundongos HuMAb bem como as modificações genômicas carregadas por tais camundongos, são ainda descritas em Taylor, L. et al.(1992) Nucleic Acids Research 20 :6287- 6295; Chen, JH.et al.(1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al.(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720-3724; Choi et al.(1993) Nature Genetics 4:117- 123; Chen, J.et al.(1993) EMBO J.12:821-830; Tuaillon et al.(1994) J.Immunol.152:2912-292 0; Taylor, L.et al.(1994) International Immunology 6:579-591; e Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851, cujos conteúdos foram aqui incorporados especificamente por referência em sua totalidade. Vide, ainda, as patentes americanas Nos. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; e 5.770.429; todos de Lonberg e Kay; patente americana No. 5.545.807 de Surani et al. ; Publicação PCT 25 Nos. WO 92/03918, W093/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todos de Lonberg e Kay; e Publicação PCT No. WO 01/14424 de Korman et al. Em outra configuração, os anticorpos humanos da invenção podem ser produzidos utilizando um camundongo que carrega seqüências de imunoglobulina humana em transgenes e transcromossomos, tal como um camundongo que carrega um transgene humano de cadeia pesada e um transcromossomo humano de cadeia leve. Tais camundongos, aqui designados camundongos "KM mice™" são descritos detalhadamente na Publicação PCT WO 02/43478 de Ishida et al.

Os sistemas animais transgênicos alternativos expressando genes de imunoglobulina humana estão disponíveis no estado da técnica e podem ser usados para produzir anticorpos anti-Fucosil-GMl da invenção. Por exemplo, um sistema transgênico alternativo designado Xenomouse (Abgenix, Inc.) pode ser usado; tais camundongos são descritos, por exemplo, nas patentes americanas Nos. 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 e 6.162.963 de Kucherlapati et al.

Além disso, sistemas animais transcromossômicos alternativos expressando genes de imunoglobulina humana estão disponíveis no estado da técnica e podem ser usados para produzir anticorpos anti-Fucosil-GMl da invenção. Por exemplo, camundongos carregando tanto um transcromossomo humano de cadeia pesada como um transcromossomo humano de cadeia leve, designados como "camundongos TC" podem ser usados; tais camundongos são descritos em Tomizuka et al. (2000) Proc.

Natl.Acad.Sci.USA 97:722-727. Além disso, vacas portando os transcromossomos humanos de cadeia leve e pesada foram descritas no estado da técnica (Kuroiwa et al.(2002) Nature Biotechnology 2_0: 889-894) e podem ser usadas para produzir anticorpos anti-Fucosil-GMl da invenção. Anticorpos monoclonais humanos da invenção também podem ser preparados utilizando métodos de exibição de fago para identificar bancos de genes de imunoglobulina humana. Tais métodos de exibição de fago para isolar anticorpos humanos são estabelecidos no estado da técnica. Vide, por exemplo, as patentes americanas Nos. 5.223.409; 5.403.484; e 5.571.698 de Ladner et al; Patentes americanas Nos. 5.427.908 e 5.580.717 de Dower et al. ; Patentes Americanas Nos. 5.9698.108 e 6.172.197 de McCafferty et al. ; e patentes americanas Nos. 5 . 885 . 793 ; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915, e 6.593.081 de Griffiths et al.

Os anticorpos monoclonais humanos da invenção também podem ser preparados utilizando camundongos SCID nos quais as células imunes humanas foram reconstituídas de forma que uma resposta do anticorpo humano possa ser gerada quando da imunização. Tais camundongos são descritos, por exemplo, nas patentes americanas NOs. 5.476.996 e 5.698.767 de Wilson et al.

Imunização de Camundongos com Ig Humana

Quando camundongos com Ig humana são utilizados para produzir anticorpos humanos da invenção, tais camundongos podem ser imunizados com uma preparação purificada ou uma enriquecida de antígeno Fucosil-GMl e/ou um Fucosil-GMl recombinante, ou uma proteína de fusão Fucosil-GMl, conforme descrito por Lonberg N.et al.(1994) Nature 368 (6474) : 856-859; Fishwild, D.et al.(1996) Nature Biotechnology 14:845-851; e publicação PCT WO 98/24884 e WO 01/14424. Preferivelmente, os camundongos terão de 6- 16 semanas de vida quando da primeira infusão. Por exemplo, uma preparação purificada ou recombinante (5- 50 μg) de antígeno Fucosil-GMl pode ser utilizada para imunizar o camundongo com Ig humana intraperitonealmente. Procedimentos detalhados para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para Fucosil-GMl são descritos no Exemplo 1 abaixo. A experiência cumulativa com diversos antígenos tem demonstrado que os camundongos transgênicos respondem, quando inicialmente imunizados intraperitonealmente (IP), com o antígeno adjuvante de Freund completo, seguido de imunizações IP semana sim, semana não, (até um total de 6) com antígeno em adjuvante de Freund incompleto. Porém, adjuvantes outros que não o de Freund também se mostram eficazes. Além disso, células completas na ausência do adjuvante demonstraram ser altamente imunogênicas. A resposta imune pode ser monitorada durante o curso do protocolo de imunização com amostras de plasma sendo obtidas por sangramentos retro- orbitais. 0 plasma pode ser identificado através de teste ELISA (como descrito abaixo), e camundongos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-Fucosil-GMl podem ser usados para as fusões. Os camundongos podem receber antígeno intravenosamente 3 dias antes do sacrifício e remoção do baço. Espera-se que precisem ser realizadas de 2-3 fusões para cada imunização. Entre 6 e 24 camundongos são tipicamente imunizados para cada antígeno. Geralmente, são utilizadas tanto as cepas HCo7 como HCol2. Em adição, ambos os transgenes Hco7 e Hcol2 podem ser produzir juntos dentro de um camundongo único tendo dois transgenes de cadeia pesada humana diferente (Hco7/HCol2). Alternativamente ou adicionalmente, a cepa do KM Mouse™ pode ser usada, como descrito no exemplo 1.

Geração de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais humanos da invenção

Para gerar hibridomas que produzam os anticorpos monoclonais humanos da invenção, esplenócitos e/ou células de nódulos linfáticos de camundongos imunizados podem ser isolados e fundidos a uma linhagem celular imortalizada apropriada, tal como uma linhagem celular de mieloma de camundongo. Os hibridomas resultantes podem ser identificados quanto à produção de anticorpos antígeno-específicos. Por exemplo, suspensões celulares simples de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados podem ser fundidas até um sexto do número de células de mieloma de camundongo não-secretoras P3X63- Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) com PEG a 50%.

Alternativamente, a suspensão de células dos linfócitos esplênicos de camundongos imunizados pode ser fundida usando um método de eletrofusão baseado em campo elétrico, usando um eletroporador de fusão celular com uma câmara de Cyto Pulse grande ("Cyto Pulse Sciences", Inc., Glen Burnie, MD). As células são plaqueadas em aproximadamente 2 χ 10"5 em uma placa de microtitulação de fundo plano, seguido de incubação por duas semanas em um meio de DMEM com alto teor de glicose com L-glutamina e pirivato de sódio (Mediatech, Inc., Herndon, VA) e ainda um meio contendo soro fetal Bovino a 20% (Hyclone, Logan, UT), 18% de meio condicional P388DI, 5% de fator de clonagem Origen Hybridoma (Bio Veris, Gaithersburg, VA), 4mM L-glutamina, 5mM HEPES, 0,055 mM β-mercaptoetanol, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml estreptomicina e 1X de Hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) (Sigma; the HAT é adicionado 24 horas após a fusão) . Após uma semana, as células cultivadas em meio no qual HAT foi utilizado foi substituído com HT. Os poços individuais podem então ser identificados através de ELISA quanto aos anticorpos monoclonais humanos IgM e IgG. Ocorrido o crescimento extensivo do hibridoma, o meio pode ser observado geralmente após 10-14 dias. Os hibridomas secretores de anticorpos podem ser re-plaqueados, identificados novamente, e se ainda forem positivos para IgG humana, os anticorpos monoclonais podem ser subclonados pelo menos duas vezes limitando-se a diluição. Os subclones estáveis podem então ser cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização.

Para purificar os anticorpos monoclonais humanos, hibridomas selecionados podem ser crescidos em frascos tipo "spinner" de dois litros para purificação de anticorpo monoclonal. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia por afinidade com proteína A-sefarose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). A IgG eluída pode ser examinada através de eletroforese em gel e cromatografia líquida de alto desempenho para garantir a pureza. A solução tampão pode ser trocada por PBS e a concentração pode ser determinada por OD2So utilizando coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80°C.

Geração de anticorpos monoclonais Produtores de transfectomas da invenção

Os anticorpos da invenção podem ser também produzidos em um transfectoma de célula hospedeira utilizando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção gênica conforme é conhecido no estado da técnica (ex: Morrison, S.(1985) Science 229 : 1202). Por exemplo, para expressar anticorpos, ou os fragmentos de anticorpos dos mesmos, os DNAs que codificam cadeias leves e pesadas de extensão parcial ou completa, podem ser obtidos através de técnicas padrão de biologia molecular (ex: amplificação PCR ou clonagem CDNA utilizando um hibridoma que expresse o anticorpo de interesse) e os DNAs podem ser inseridos em vetores de expressão de forma que os genes sejam operativamente ligados às seqüências de controle transcricionais e translacionais. Neste contexto, o termo "operativamente ligado" pretende significar que um gene de anticorpo é ligado num vetor de forma que as seqüências de controle transcricionais e translacionais dentro do vetor realizem sua função pretendida de regular a transcrição e translação do gene de anticorpo. O vetor de expressão e as seqüências de controle de expressão são selecionados para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene de cadeia leve do anticorpo e o gene de cadeia pesada do anticorpo pode ser inserido em vetor separado ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vetor de expressão através de métodos padrão (ex: ligação de sítios de restrição complementares no fragmento de gene de anticorpo e vetor, ou ligação da extremidade enfraquecida ("blunt-end ligation") se nenhum sítio de restrição estiver presente). As regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos aqui descritos podem ser utilizadas para criar genes de anticorpo de extensão completa de qualquer isotipo de anticorpo inserindo-os em vetores de expressão que já codificam regiões constantes de cadeia pesada e de cadeia leve do isotipo desejado, de forma que o segmento Vh seja operativamente ligado ao(s) segmento(s) Ch dentro do vetor e o segmento Vk seja operativamente ligado ao segmento Cl dentro do vetor. Adicionalmente ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo sinal que facilite a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. 0 gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor de forma que o peptídeo sinal seja ligado na estrutura ("in- frame") ao terminal amino do gene de cadeia de anticorpo.

0 peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal de imunoglobulina ou um peptídeo sinal heterólogo (ou seja, um peptídeo sinal de uma proteína não de imunoglobulina). Além dos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de expressão recombinantes da invenção carregam seqüências regulatórias que controlam a expressão dos genes de cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. O termo "seqüência regulatória" pretende incluir promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (ex: sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou translação dos genes de cadeia de anticorpo. Tais seqüências regulatórias são descritas, por exemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Será apreciado pelos habilitados na técnica que o desenho do vetor de expressão, incluindo a seleção de seqüências regulatórias, podem depender de fatores tais como a seleção da célula hospedeira a ser transformada, do nível de expressão da proteína desejada, etc. As seqüências regulatórias preferidas para expressão de célula hospedeira de mamífero incluem os elementos virais que dirigem altos níveis de expressão de proteína em células de mamífero, tais como os promotores e/ou intensificadores derivados de citomagalovírus (CMV), Vírus Símio (SV40), adenovírus (ex: o promotor tardio maior do adenovírus (AdMLP)e polioma). Alternativamente, as seqüências regulatórias não-virais podem ser usadas, tal como o promotor de ubiquitina ou promotor de β- globina. Outrossim, os elementos regulatórios compostos de seqüências de fontes diferentes, tal como o sistema promotor SRa, que contém seqüências do promotor precoce SV40 e o terminal de repetição longa do vírus de leucemia de célula T humana do tipo 1 (Takebe, Y. et al.(1988) Mol Cell Biol.8:466-472).

Além dos genes de cadeia de anticorpo e das seqüências regulatórias, os vetores de expressão recombinante da invenção podem carregar seqüências adicionais, tais como seqüências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (ex: origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (vide, por exemplo, as patentes americanas Nos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todos de Axel et al.). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o gene de dihidrofolato reductase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr com seleção/amplificação de metotrexato) e o neo-gene (para seleção de G418).

Para expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor(es) de expressão que codificam as cadeias leve e pesada é transfectado numa célula hospedeira através de técnicas padrão. As diversas formas do termo "transfecção" pretendem abranger uma ampla variedade de técnicas comumente utilizadas para a introdução de DNA exógeno dentro de uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, como por exemplo, eletroporação, precipitação cálcio-fosfato, transfecção DEAE-dextrano e similares. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas, e mais preferivelmente em células hospedeiras de mamífero, é a mais preferida pois tais células eucarióticas e, em especial, células de mamífero, têm mais probabilidade de montar e secretar um anticorpo adequadamente revelado e imunologicamente ativo do que as células procarióticas. A expressão procariótica de genes de anticorpo foi reportada como ineficaz para produção de altos rendimentos de anticorpo ativo (Boss, M.A. e Wood, C.R.(1985) Immunology Today 6:12-13). Células hospedeiras de mamífero preferidas para expressar os anticorpos recombinantes da invenção incluem células de Ovário de Hamster Chinês (células CHO) (incluindo células CHO dhfr-, descritas em Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl.Acad.Sci. USA 77:16-4220, utilizadas com um marcador selecionável DHFR, como por exemplo, conforme descrito em R.J.Kaufman e P.A.Sharp (1982) J.Mol.Biol.159 : 601-621) , células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Em especial, para uso com células de mieloma NSO, outro sistema de expressão preferido é o sistema de expressão gênica GS descrito em WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338.841. Quando os vetores de expressão recombinante codificando genes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos cultivando-se as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são crescidas. Os anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura utilizando-se métodos padrão de purificação de proteína.

Caracterização de Ligação do Anticorpo a Antígeno Os anticorpos da invenção podem ser testados quanto à ligação ao Fucosil-GMl por, por exemplo, ELISA padrão. Resumidamente, as placas de microtitulação foram revestidas com Fucosil-GMl purificadao em 0,25 μg/ml em PBS, e então bloqueadas com 5% de albumina de soro bovino em PBS. Diluições de anticorpo (por exemplo, diluições de plasma a partir de camundongos imunizados com Fucosil- GMl) são adicionadas para cada poço e incubada por 1-2 horas a 37°C. As placas foram lavadas com PBS/Tween e então incubadas com um reagente secundário (por exemplo, anticorpos jumanos, um reagente pliclonal IgG Fc específico anti-humano de cabra) conjugado com fosfatase alcalina por 1 hora a 37°C. Após a lavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato pNPP (1 mg/ml), e analisadas em um OD de 405-650. Preferivelmente, os camundongos que desenvolveram os maiores títulos serão utilizados para fusão.

Um ensaio ELISA, conforme acima descrito, pode também ser usado para identificar hibridomas que mostram reatividade positiva com imunógeno Fucosil-GMl. Hibridomas que se ligam com alta avidez ao Fucosil-GMl são subclonados e então caracterizados. Um clone de cada hibridoma, que retém a reatividade das células parentais (através de ELISA) pode ser selecionado para preparar um banco de células de 5-10 frascos armazenados a -140°C e para purificação de anticorpo.

Para purificar anticorpos anti-Fucosil-GMl, hibridomas selecionados podem ser crescidos em frascos tipo "spinner" de dois litros para purificação de anticorpos monoclonais. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com a proteína A-sefarose (Pharmacia Piscataway, NJ) . A IgG eluída pode ser verificada através de eletroforese em gel e cromatografia líquida de alto desempenho para garantir a pureza. A solução tampão pode ser trocada por PBS e a concentração pode ser determinada por OD2so utilizando coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80°C.

Para determinar se os anticorpos monoclonais anti- Fucosil-GMl selecionados ligam-se a um único epítopo, cada anticorpo pode ser biotinilado utilizando reagentes disponíveis no mercado (Pierce, Rockford, IL). Os estudos de competição utilizando anticorpos monoclonais não marcados e anticorpos monoclonais biotinilados podem ser conduzidos utilizando-se placas de ELISA revestidas com Fucosil-GMl conforme acima descrito. A ligação a mAb biotinilado pode ser detectada com uma sonda de estrepavidina-fosfatase alcalina.

Para determinar o isótipo de anticorpos purificados, ensaios ELISA de isótipo podem ser conduzidos utilizando reagentes específicos para anticorpos de um isótipo específico. Por exemplo, para determinar o isotipo de um anticorpo monoclonal humano, os poços das placas de microtitulação podem ser revestidas com 1μg/ml de imunoglobulina anti-humana durante a noite a 4°C. Após o bloqueio com BSA 1%, as placas são reagidas com 1μg/ml ou menos de anticorpos monoclonais de teste ou controles de isotipos purificados, à temperatura ambiente por uma ou duas horas. Os poços podem então ser reagidos com IgGl humana ou sondas de conjugado de fosfatase alcalina IgM- específica humana. As placas são desenvolvidas e analisadas conforme descrito acima.

IgGs anti-Fucosil-GMl humanas podem ainda ser testadas quanto à reatividade com o antígeno Fucosil-GMl através do método de Western Blotting. Resumidamente, o Fucosil- GM1 pode ser preparado e submetido à eletroforese em gel de dodecil sulfato de poliacrilamida. Após a eletroforese, os antígenos separados são transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com soro fetal bovino a 10%, e sondadas com os anticorpos monoclonais a serem testados. A ligação a IgG humana pode ser detectada utilizando fosfatase alcalina de IgG anti- humana e desenvolvida com comprimidos de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem.Cp., St.Louis, Mo).

Imunoconjugados

Em outro aspecto, a presente invenção caracteriza um anticorpo anti-Fucosil-GMl ou um fragmento do mesmo, conjugado a uma porção terapêutica, tal como uma citotoxina, um fármaco (por exemplo, um imunossupressor) ou uma radiotoxina. Tais conjugados são aqui designados "imunoconjugados". Os imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são designados "imunotoxinas". Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja nocivo (por exemplo, que mate) às células.

Exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- dehidrostestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol, e puromicina e seus análogos ou homólogos. Agentes terapêuticos também incluem, por exemplo, antimetabólitos (por exemplo: metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes, (por exemplo: mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo: daunorubicina (anteriormente denominada daunomicina) e doxorubicina), antibióticos (por exemplo: dactinomicina (anteriormente denominada Actinomicina), bleomicina, mitramicina, e antramicina (AMC) e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).

Outros exemplos preferidos de citotoxinas terapêuticas que podem ser conjugadas a um anticorpo da invenção incluem duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas e auristatinas, e seus derivados. Um exemplo de conjugado de anticorpo de caliqueamicina está disponível no mercado (Mylotarg®; Wyeth-Ayerst). Exemplos de citotoxinas terapêuticas podem ser encontrados, por exemplo, nas patentes americanas U.S. Nos.: 6548530 e 6281354 e o pedido de patente norte-americano Nos>: US. 2003/0064984, US 2003/0073852 e US 2003/0050331.

As citotoxinas podem ser conjugadas a anticorpos da invenção utilizando tecnologia de ligante disponível no estado da técnica. Exemplos de tipos de ligante que foram utilizados para conjugar uma citotoxina a um anticorpo incluem, porém não se restringem a hidrazonas, tioéteres, ésteres, bissulfetos, e ligantes contendo peptídeo. Pode- se selecionar um ligante que seja, por exemplo, suscetível à clivagem por pH baixo dentro do compartimento lisossômico ou suscetível à clivagem por proteases, tais como proteases, preferencialmente, expressa em tecido tumoral tal como catepsinas (por exemplo, catepsinas B, C, D).

Para mais discussão sobre os tipos de citotoxinas, ligantes e métodos para conjugar agentes terapêuticos a anticorpos, vide também Saito7 G. et al. (2003) Adv Drug Deliv.Rev. S5:199-215; Trail, P.A.et al.(2003) Câncer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne G.(2003) Câncer Cell 3:207-212 ; AlIen, T.M. (2002) Nat Rev.Câncer 2:750- 763; Pastan, I. e Kreitman, R.J. (2002) Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. e Springer, C.J.(2001) Adv.Drug Delivery Rev. 53 :247-264. Os anticorpos da presente invenção podem também ser conjugados a um isótopo radioativo para gerar radiofarmacêuticos citotóxicos, também designados radioimunoconjugados. Exemplos de isótopos radioativos que podem ser conjugados a anticorpos para uso diagnóstico ou terapêutico incluem, porém não se restringem a iodo131, índio111, ítrio90 e lutécio177. O método para preparar radioimunoconjugados está estabelecido no estado da técnica. Exemplos de radioimunoconjugados estão disponíveis no mercado, inclusive Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) e Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals) e métodos similares podem ser usados para preparar radioimunoconjugados utilizando os anticorpos da invenção.

Os conjugados de anticorpo da invenção podem ser usados para modificar uma determinada resposta biológica e, a porção de fármaco não deve ser interpretada como limitada aos agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção de fármaco pode ser uma proteína ou um polipeptídio que possua uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa, ou um fragmento ativo da mesma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina de difteria; uma proteína tal como fator de necrose tumoral ou interferon-γ; ou modificadores de resposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator estimulante de colônias de macrófagos e granulócitos ("GM-CSF"), fator estimulante de colônia de granulócitos ("G-CSF") ou outros fatores de crescimento.

Técnicas para conjugar tal porção terapêutica a anticorpos são conhecidas, vide, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Câncer Therapy" in Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Reisfeld et al., (eds), pp.243-56 (Alan R.Liss, Inc.1985); Hellstrom et al., "Antibodies for Drug Delivery" in Controlled Drug Delivery (2nd.ed), Robinson et al.(eds.), pp.623-53 (Mareei Dekker, Inc.1987); Thorpe, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Câncer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinicai Applications, Pinchera et al (eds), pp.475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Câncer Therapy", in Monoclonal Antibodies for Câncer Detection and Therapy, Baldwin et al.(eds.) pp.303-16 (Academic Press 1985) e Thorpe et al., "The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates," Immunol.Rev. 62^:119-58 (1982).

Moléculas Biespecíficas

Em outro aspecto, a presente invenção caracteriza moléculas biespecíficas compreendendo um anticorpo anti- Fucosil-GMl, ou um fragmento do mesmo, da invenção. Um anticorpo desta invenção ou porções ligantes ao antígeno do mesmo pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional, como por exemplo, a outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que se ligue à, pelo menos, dois sítios de ligação diferentes ou a moléculas alvo. O anticorpo da invenção pode, de fato, ser derivatizado ou ligado a mais de uma outra molécula funcional para gerar moléculas multiespecíficas que se ligam a mais de dois sítios de ligação diferentes e/ou a moléculas alvo; tais moléculas multiespecíficas também pretendem serem abrangidas pelo termo "moléculas biespecíficas" conforme aqui utilizado. Para criar uma molécula biespecífica da invenção, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não- covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras moléculas ligantes, tal como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mimética de ligação, de forma a resultar numa molécula biespecífica.

Conseqüentemente, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação para Fucosil-GMl e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítopo alvo. Em uma configuração específica da invenção, o segundo epítopo alvo é um receptor Fc, como por exemplo, FcyRI humano (CD64) ou um receptor Fca humano (CD8 9). Portanto, a invenção inclui moléculas biespecíficas capazes de ligar-se a células efetoras expressando tanto FcyR quanto

FcaR (por exemplo, monócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares (PMNs)) e a células alvo expressando Fucosil-GMl. Essas moléculas biespecíficas direcionam as células expressando Fucosil-GMl à célula efetora e disparam atividades de célula efetora mediada por receptor Fc, tal como a fagocitose de células expressando Fucosil-GMl, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), liberação de citocinas, ou geração de ânion superóxido.

Em uma configuração da invenção, na qual a molécula biespecífica é multiespecífica, a molécula pode ainda incluir uma terceira especificidade de ligação, além de uma especificidade de ligação anti-Fc e uma especificidade de ligação anti-Fucosil-GMl. Em uma configuração, a terceira especificidade de ligação é uma porção de fator anti-intensificador (EF), como por exemplo, uma molécula que se liga a uma proteína superficial envolvida em atividade citotóxica e assim aumenta a resposta imune contra a célula alvo. A "porção de fator anti-intensificador" pode ser um anticorpo, um fragmento de anticorpo funcional ou um ligante que se liga a uma determinada molécula, como por exemplo, um antígeno ou um receptor, e assim resulta numa intensificação no efeito dos determinantes de ligação para o receptor Fc ou para o antígeno de célula alvo. A "porção de fator anti-intensificador" pode ligar-se a um receptor Fc ou a um antígeno de célula alvo.

Alternativamente, a porção de fator anti-intensificador pode ligar-se a uma entidade que seja diferente da entidade à qual a primeira e segunda especificidades de ligação se ligam. Por exemplo, a porção de fator anti- intensificador pode ligar-se a uma célula T citotóxica (por exemplo, via CD2, CD3, CD8, CD2 8, CD4, CD4 0, ICAM-I ou outra célula imune que resulte numa resposta imune aumentada contra a célula alvo).

Em uma configuração, as moléculas biespecíficas da invenção compreendem como especificidade de ligação a pelo menos um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo do mesmo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ou um Fv de cadeia simples. 0 anticorpo pode também ser um dímero de cadeia leve ou de cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo do mesmo, tal como um Fv ou um construto de cadeia simples, conforme descrito na patente americana No. 4.94 6.778 de Ladner et al. cujo conteúdo foi aqui incorporado expressamente por referência.

Em uma configuração, a especificidade de ligação para um receptor Fcy é provida por um anticorpo monoclonal, cuja ligação não é bloqueada pela imunoglobulina G humana (IgG). Conforme aqui utilizado, o termo "receptor de IgG" refere-se a qualquer um dos oito genes de cadeia-γ localizados no cromossomo 1. Esses genes codificam um total de doze isoformas transmembrânicas ou de receptor solúvel que são agrupadas em três classes de receptor Fcy: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16). Em uma configuração preferida, o receptor Fcy é um FcyRI humano de alta afinidade. 0 FcyRI humano é uma molécula de 72 kDa, que mostra alta afinidade pela IgG monomérica (IO8 - 10"9 M"1) .

A produção e caracterização de certos anticorpos monoclonais anti-Fcy preferidos são descritas na Publicação PCT WO 88/00052 e na patente americana No. 4.954.617 de Fanger et al. , cujos ensinamentos são aqui totalmente incorporados por referência. Esses anticorpos ligam-se a um epítopo de FcyRI, FcyRII ou FcyRIII em um sítio que é distinto do sitio de ligação Fcy do receptor e, assim, sua ligação não é bloqueada substancialmente por níveis fisiológicos de IgG. Anticorpos anti-FcyRI específicos úteis na presente invenção são mAb 22, mAb32, mAB 44, mAb 62 e mAb 197. 0 hibridoma que produz mAb 32 está disponível na American Type Culture Collection, registro ATCC No. HB9469. Em outras configurações, o anticorpo de receptor anti-Fcy é uma forma humanizada de anticorpo monoclonal 22 (H22). A produção e a caracterização do anticorpo H22 é descrita em Graziano, R.F.et al. (1995) J.Immunol 155(10):4996-5002 e Publicação PCT WO 94/10332. A linhagem celular produtora de anticorpo H22 foi depositada no "American Type Culture Collection" sob a designação HA022CL1 e tem o número de registro CRL 11177.

Em outras configurações preferidas ainda, a especificidade de ligação para um receptor Fc é provida por um anticorpo que se liga a um receptor de IgA humana, como por exemplo, receptor Fc-alfa (FcaRI(CD89)), cuja ligação é preferivelmente não bloqueada por imunoglobulina A humana (IgA). 0 termo "receptor de IgA" pretende incluir o produto gênico de um α-gene (FcaRI) localizado no cromossomo 19. Esse gene é conhecido por codificar diversas isoformas transmembrânicas alternativamente alinhadas de 55 a 110 kDa. FcaRI (CD89) é constitutivamente expresso em monócitos/macrófagos, granulócitos eosinofílicos e neutrofílicos, porém não em populações de células não-efetoras. O FcaRi possui uma afinidade pelo meio (= 5 χ 10^7M"1) tanto para IgAl como para IgA2, que aumenta mediante exposição a citocinas tais como G-CSF ou GM-CSF (Morton, H.C. et al (1996) Criticai Review in Immunology 16 :423-440). Quatro anticorpos monoclonais FcaRI-específicos, identificados como A3 , A59, A62 e A77, que se ligam a FcaRI fora do domínio de ligação a ligante IgA, foram descritos (Monteiro, R.C. et al.(1992) J.Immunol., 148:1764). FcaRI e FcyRI são receptores de ativação para uso nas moléculas biespecíficas da invenção, pois (1) são expressas principalmente em células efetoras imunes como, por exemplo, monócitos, PMNs, macrófagos, e células dendríticas; (2) são expressas em altos níveis (por exemplo, 5.000-100.000 por célula); (3) são mediadores de atividades citotóxicas (ex: ADCC, fagocitose); e (4) mediam a apresentação aumentada de antígenos, incluindo os auto-antígenos, a eles direcionados.

Embora os anticorpos monoclonais humanos sejam preferidos, outros anticorpos que podem ser empregados nas moléculas biespecíficas da invenção são anticorpos monoclonais murinos, quiméricos e humanizados. As moléculas biespecíficas da presente invenção podem ser preparadas conjugando-se as especificidades de ligação constituintes, como, por exemplo, as especificidades de ligação anti-FcR e anti-Fucosil-GMl, utilizando métodos conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e então conjugada entre si.

Quando as especificidades de ligação forem proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes acoplantes ou reticuladores pode ser usada para conjugação covalente.

Exemplos de agentes reticuladores incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(2-ácido nitrobenzóico) (DTNB), o- fenilenodimaleimida (oPDM) , N-succinimidil-3-(2- piridiltio)propionato (SPDP) e sulfosuccinimidil 4-(N- maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato(sulfo-SMCC) (ver por exemplo, Karpovsky et al.(1984) J.Exp.Med 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648). Outros métodos incluem os descritos em Paulus (1985) Behring Ins.Mitt.No. 78, 118-132; Brennan et al.(1985) Science 229:81-83, e Glennie et al.(1987) J.Immunol., 139:2367-2375. Agentes conjugantes preferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis na Pierce Chemical Co.(Rockford, IL).

Quando as especificidades de ligação forem anticorpos, eles podem ser conjugados via ligação de sulfidrila das regiões de dobra de terminal C das duas cadeias pesadas. Em uma configuração especialmente preferida, a região de dobra é modificada para conter um número ímpar de resíduos sulfidrila, preferivelmente um, antes da conjugação.

Alternativamente, ambas especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Esse método é especialmente útil quando a molécula biespecífica for um mAb χ mAb, mAb χ Fab, Fab χ F(ab')2 ou ligante χ proteína de fusão Fab. Uma molécula biespecífica da invenção pode ser uma molécula de cadeia simples compreendendo um anticorpo de cadeia simples e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia simples compreendendo dois determinantes de ligação. As moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia simples. Métodos para preparar moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, nas patentes americanas Nos. 5.260.203; 5.455.030; 4.881.175; 5.132.405; 5.091.513; 5.476.786; 5.013.653; 5.258.498; e 5.482.858.

A ligação das moléculas biespecíficas aos seus alvos específicos pode ser confirmada, por exemplo, através do ensaio por enzimas imuno-adsorvidas (ELISA), radioimunoensaio (RIA), análise FACS, bioensaio (por exemplo, inibição de crescimento) ou ensaio Western Blot. Cada um desses ensaios geralmente detecta a presença de complexo proteína-anticorpo de interesse específico empregando um reagente marcado (por exemplo, um anticorpo) especifico para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos de anticorpo FcR podem ser detectados utilizando, por exemplo, um anticorpo ligado à enzima ou um fragmento de anticorpo que reconheça e que especificamente ligue-se aos complexos de anticorpo-FcR. Alternativamente, os complexos podem ser detectados utilizando-se qualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser radioativamente marcado e utilizado em um radioimunoensaio (RIA) (vide, por exemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, aqui incorporado por referência). O isótopo radioativo pode ser detectado pelos referidos meios, tal como o uso de contador γ ou um contador de cintilação ou através de autoradiografia.

Composições Farmacêuticas

Em outro aspecto, a presente invenção provê uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combinações de anticorpos monoclonais, ou porção(ões) ligantes ao antígeno dos mesmos, da presente invenção, formulada juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem incluir um ou uma combinação de (por exemplo, dois ou mais diferentes) anticorpos, ou imunoconjugados ou moléculas biespecíficas da invenção. Por exemplo, uma composição farmacêutica da invenção pode compreender uma combinação de anticorpos (ou imunoconjugados ou biespecíficos) que se ligam a diferentes epítopos no antígeno alvo ou que tenham atividades complementares. Composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradas em terapias combinadas, ou seja, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um anticorpo anti-Fucosil-GMl da presente invenção combinado com pelo menos um outro agente antiinflamatório ou imunossupressor. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser usados na terapia de combinação são descritos em maiores detalhes abaixo na seção que trata dos usos dos anticorpos da invenção.

Conforme aqui utilizado, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e agentes retardantes de absorção, e similares que sejam fisiologicamente compatíveis. Preferivelmente, o veículo é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (ex: por injeção ou infusão). Dependendo da rota de administração, o composto ativo, ou seja, o anticorpo, imunoconjugado, ou molécula biespecífica, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e de outras condições naturais que possam inativar o composto. Os compostos farmacêuticos da invenção podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto parental e que não causa nenhum efeito toxicológico indesejado (vide, por exemplo, Berge, S.M.et al (1977) J.Pharm.Sci. 66:1- 19) . Exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Sais de adição de ácido incluem os derivados de ácidos inorgânicos atóxicos, tais como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, fosforoso e similares, bem como de ácidos orgânicos atóxicos tais como os ácidos alifáticos mono- e dicarboxílicos, ácidos alcanóicos substituídos com fenila, ácido hidroxi alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e similares. Sais de adição de base incluem os derivados de sais metálicos alcalinos terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio, e similares, bem como de aminas orgânicas atóxicas, tais como N,N'- dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e similares.

Uma composição farmacêutica da invenção pode também incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável.

Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e similares; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil gaiato, alfa-tocoferol, e similares; e (3) agentes quelantes metálicos, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e similares.

Exemplos de veículoes aquosos e não-aquosos apropriados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e similares), e misturas apropriadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, mediante o uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersões, e mediante o uso de surfactantes. Essas composições podem também conter adjuvante, tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microorganismos pode ser garantida tanto pelos procedimentos de esterilização acima citados como pela inclusão de diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol ácido sórbico, e similares. Pode também ser desejável 35 incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto sódio, e similares nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser obtida pela inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como o monoestearato de alumínio e a gelatina.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pó estéril para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. 0 uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido no estado da técnica. Exceto se qualquer meio ou agente convencional for incompatível com o composto ativo, é previsto o uso dos mesmos nas composições farmacêuticas da invenção. Compostos ativos suplementares podem também ser incorporados âs composições.

As composições terapêuticas devem ser tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada na forma de uma solução, microemulsão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de fármaco. 0 veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido e similares) e suas misturas apropriadas. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, mediante o uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e mediante o uso de surfactantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoóis, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser obtida incluindo-se na composição um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina. Soluções estéreis injetáveis podem ser preparadas incorporando-se o composto ativo na quantidade requerida num solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de microfiltração para esterilização. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando-se o composto ativo num veículo estéril que contenha um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles citados acima. No caso de pós-estéreis para a preparação de soluções estéreis injetáveis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer outro ingrediente desejado de uma solução previamente filtrada-esterilizada do mesmo.

A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do indivíduo a ser tratado, e do modo específico de administração. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única será geralmente aquela quantidade da composição que produza um efeito terapêutico. Geralmente, em 100(cem) por cento, essa quantidade variará de cerca de 0,01 por cento a cerca de noventa e nove por cento do ingrediente ativo, preferivelmente de cerca de 0,1 por cento a cerca de 70 por cento, ou mais preferivelmente de cerca de 1 por cento a cerca de 3 0 por cento de ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Regimes de dosagem são ajustados para prover a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica).

Por exemplo, um bolus simples pode ser administrado, diversas doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma unitária de dosagem para facilitar a administração e a uniformidade de dosagem. A forma unitária de dosagem, conforme aqui utilizada, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada do composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o veículo farmacêutico requerido. A especificação para as formas unitárias de dosagem da invenção é ditada por e diretamente dependente(s) (a) das características inéditas do composto ativo e o efeito terapêutico específico a ser obtido, e (b) das limitações inerentes à técnica de se combinar tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

Para administração do anticorpo, a dosagem varia de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg e mais usualmente de 0,01 a 5 mg/kg do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento representativo envolve a administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada três meses, ou uma vez a cada três a 6 meses. Regimes de dosagem particulares para um anticorpo anti-Fucosil-GMl da invenção incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal via administração intravenosa, com o anticorpo sendo administrado utilizando-se um dos seguintes esquemas de dosagem: (i) a cada quatro semanas para seis dosagens, e então a cada três meses; (ii) a cada três semanas; (iii) 3 mg/kg peso corporal uma vez seguida de 1 mg/kg de peso corporal a cada três semanas.

Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente, e neste caso a dosagem de cada anticorpo administrado enquadra-se nas faixas indicadas. O anticorpo é geralmente administrado em ocasiões múltiplas. Intervalos entre dosagens únicas podem ser, por exemplo, semanalmente, mensalmente, a cada três meses ou anualmente. Os intervalos podem ser também irregulares conforme indicado medindo-se os níveis sangüíneos de anticorpo em relação ao antígeno alvo no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para alcançar uma concentração plasmática de anticorpo de cerca de 1-1000 μg/ml e em alguns métodos de cerca de 25- 300 μg/ml.

Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada, onde é necessária a administração menos freqüente. A dosagem e a freqüência variam dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, anticorpos humanos mostram a meia-vida mais longa, seguido dos anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, e anticorpos não-humanos. A dosagem e freqüência de administração podem variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente não freqüentes durante um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento pelo resto da vida. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é às vezes necessária até que a progressão da doença seja reduzida ou extinta, e preferivelmente, até que o paciente mostre melhora parcial ou completa dos sintomas da doença. Em seguida, o paciente pode receber um regime profilático.

Os níveis de dosagem atuais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem variar de forma a se obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente em particular, composição e modo de administração, sem ser tóxica para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições específicas da presente invenção empregadas, ou do és ter, sal ou amida das mesmas, da rota de administração, do tempo de administração, da taxa de excreção do composto específico que estiver sendo empregado, da duração do tratamento, de outros fármacos, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com as composições específicas empregadas, da faixa etária, do sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico prévio do paciente sendo tratado, e fatores similares bastante conhecidos na área médica.

Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" de um anticorpo anti-Fucosil-GM1 da invenção preferivelmente resulta em redução na severidade dos sintomas da doença, em um aumento na freqüência e duração dos períodos livres de sintomas da doença, ou na prevenção de deficiência ou incapacidade devido à aflição causada pela doença. Por exemplo, para o tratamento de tumores, uma "dosagem terapeuticamente eficaz" preferivelmente inibe o crescimento celular ou o crescimento tumoral em cerca de pelo menos 20%, mais pref erivelmente em cerca de pelo menos 40%, ainda mais pref erivelmente em cerca de pelo menos 60%, e ainda mais preferivelmente em cerca de pelo menos 80% em relação aos indivíduos não tratados. A capacidade de um composto inibir o crescimento tumoral pode ser avaliada num sistema de modelo animal previsível de eficácia em tumores humanos. Alternativamente, essa propriedade de uma composição poder ser avaliada examinando-se a capacidade de o composto inibir, tal como por uma inibiação in vitro por um ensaio conhecido, de um técnico no assunto. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode reduzir o tamanho do tumor, ou de outra forma melhorar sintomas num indivíduo. Um técnico no assunto seria capaz de determinar tais quantidades com base em fatores tais como, tamanho do indivíduo, severidade dos sintomas do indivíduo, e a composição específica ou via de administração escolhida.

Uma composição da presente invenção pode ser administrada através de uma ou mais vias de administração utilizando um ou mais de uma variedade de métodos conhecidos no estado da técnica. Conforme será apreciado por um técnico no assunto, a rota e/ou o modo de administração variarão dependendo dos resultados desejados. As rotas preferidas de administração para anticorpos da invenção incluem as vias intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outras vias parenterais de administração, como por exemplo, através de injeção ou infusão. A expressão "administração parenteral" conforme aqui utilizada significa os modos de administração que não a administração enteral e tópica, geralmente através de injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaraquinóide, intraespinhal, epidural e intraesternal.

Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser administrado através de uma via não parenteral, tal como a via de administração tópica, epidérmica ou mucosal, por exemplo, por via intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual ou tópica.

Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protejam o composto contra liberação rápida, tal como formulação de liberação controlada, incluindo os implantes, adesivos transdérmicos, e sistemas de liberação microencapsulados. Polímeros biodegradáveis e biocompatíveis podem ser usados, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos no estado da técnica. Vide, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.Robinson, ed. Mareei Dekker, Inc.New York, 1978.

As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, em uma configuração preferida, uma composição farmacêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tais como os dispositivos descritos nas patentes americanas Nos. 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; ou 4.596.556. Exemplos de implantes e módulos bem conhecidos e úteis na presente invenção incluem: patente americana No. 4.487.603 que descreve uma bomba de micro-infusão implantável para dispensar medicação a uma taxa controlada; a patente americana No. 4.486.194, que descreve um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos através da pele; a patente americana No. 4.447.233, que descreve uma bomba de infusão de medicação para liberar medicação a uma taxa de infusão precisa; a patente americana 4.447.224 que descreve um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para liberação contínua de fármaco; a patente americana No. 4.43 9.196 que descreve um sistema osmótico de liberação de fármaco tendo compartimentos de câmaras múltiplas; e a patente americana No. 4.475.196, que descreve um sistema osmótico de liberação de fármaco. Essas patentes são aqui incorporadas por referência. Muitos outros desses implantes, sistemas de liberação, e módulos são conhecidos no estado da técnica.

Em certas configurações, os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser formulados para garantir a distribuição apropriada in vivo. Por exemplo, a barreira hemato-encefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para garantir que os compostos terapêuticos da invenção atravessem a barreira hemato-encefálica (BBB) (se desejado) eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de preparação de lipossomas, vide, por exemplo, as patentes americanas Nos. 4.522.811; 5.374.548 e 5.399.331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais porções que são seletivamente transportadas para dentro de células ou órgãos específicos, para assim aumentar a liberação direcionada de fármaco (vide, por exemplo, V.V.Ranade (1989) J.Clin.Pharmacol.29:685). Porções direcionadoras representativas incluem o folato ou a biotina (vide, por exemplo, a patente americana No. 5.416.016 de Low et al.) ; manosídeos (Umezawa et al.,(1988) Biochem.Biophys.Res.Commun. 153:1038);

anticorpos (P.G.Bloeman et al.(1995) FEBS Lett.357:140; M.Owais et al.(1995) Antimicrob.Agents Chemother. 3_9:180) ; receptor de proteína A de surfactante (Briscoe et al. (1995) Am.J.Physiol., 1233 :134) ; pl20 (Schreier et al. (1994) J.Biol.Chem., 269 : 9090) ; vide também K.Keinanen; M.L.Laukkanen (1994) FEBS Lett., 346 :123; J.J.Killion; I.J.Fidler (1994) Immunomethods 4:273. Usos e Métodos da Invenção

Os anticorpos, composições de anticorpos e métodos da presente invenção possuem numerosas utilidades terapêuticas e de diagnásticos in vitro e in vivo, envolvendo o diagnóstico e o tratamento do distúrbio mediado por Fucosil-GM1. Por exemplo, estas moléculas podem ser administradas a células em cultura, in vitro ou ex vivo, ou em indivíduos humanos, por exemplo, in vivo, para tratar, para prevenir e para diagnosticar uma variedade de distúrbios. Conforme aqui utilizado, o termo "indivíduo" pretende incluir animais humanos e não- humanos. O termo "animais não-humanos" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não-mamíferos, tais como primatas não-humanos, carneiros, cães, gatos, vacas, cavalos, frangos, anfíbios e répteis. Indivíduos preferidos incluem pacientes humanos tendo distúrbios mediados pela ativadade Fucosil-GM1. Os métodos são especialmente apropriados para tratar pacientes humanos que apresentam um distúrbio associado com uma expressão anormal de Fucosil-GM1. Quando os anticorpos ao Fucosil- GMl são administrados juntamente com um outro agente, os dois podem ser administrados em qualquer ordem ou simultaneamente. 35 Dada a ligação específica dos anticorpos da invenção para o Fucosil-GMl, os anticorpos da invenção podem ser utilizados para detectar, especificamente, a expressão de Fucosil-GM1 na superfície das células e, além disso, podem ser utilizados para purificação do Fucosil-GM1, através da purificação por imunoafinidade.

Esta invenção provê adicionalmente méodos para detectar a presença do antígeno Fucosil-GM1 em uma amostra, ou medida da quantidade do antígeno Fucosil-GM1, compreendendo contatar a amostra, e uma amostra controle, com um anticorpo monoclonal humano, ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente ao Fucosil-GM1, sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo ou a porção do mesmo e Fucosil-GM1. A formação de um complexo é então detectada, onde uma formação diferente do complexo entre a amostra comparada à amostra controle é indicativa da presença do antígeno Fucosil-GM1 na amostra.

O Fucosil-GM1 é expresso em câncer de pulmão de céulas pequenas, mas não detectado em um pulmão normal ou outros tecidos, (Nilsson et al., (1984) Glycoconjugate J. 1:43- 9; Krug ET all, (2004) Clin. Câncer Res. 10:6094-100). Um anticorpo anti-Fucosil-GM1 pode ser utilizado sozinho para inibir o crescimento dos tumores cancerígenos. Alternativamente, um anticorpo anti-Fucosil-GM1 pode ser utilizado em conjunto com outros agentes imunogênicos, tratamentos de câncer padrão ou outros anticorpos, como descrito abaixo.

Os anticorpos monoclonais anti-Fucosil-GM1 foram demonstrados para mediar o CDC potente dirigido contra as linhas de células positivas para Fucosil-GM1 (Livingston PO et al. (1994) J. Clin. Oncol. 12:1036-44; Brezicka et al. (2000) Câncer Immunol Immunother 49:235-42). Adicionalmente, foi relatado que a ativação do complement, induzido por anticorpos monoclonais específicos para a Fucosil-GM1, em combinação com fármacos citostáticos resulta em um efeito sinergistico citotóxico nas linhas de células expressando Fucosil-GM1 (Brezicka e Einbeigi (2001) Tumour Bio. 22:97-103). Finalmente, os anticorpos monoclonais anti-Fucosil-GMl também foram relatados por inibir o enxerto de células de tumor expressando Fucosil-GMl em camundongos pelados (Brezicka et al., (1991) Int. J. Câncer, 49:911-8). Estes dados suportam o desenvolvimento de um anticorpo monoclonal completamente humano para o Fucosil-GMl como um imunoterapêutico para o tratamento de SCLC tanto sozinho quanto em combinação com os agentes quimioterapêuticos.

Cânceres preferidos cujo crescimento pode ser inibido utilizando-se os anticorpos da invenção incluem cânceres tipicamente responsivos a imunoterapia. Exemplos não restritivos de cânceres preferidos para tratamento incluem câncer de pulmão (incluindo, câncer de pulmão das células pequenas e câncer de pulmão de células não- pequenas). Exemplos de outros cânceres que podem ser tratados usando os métodos desta invenção incluem câncer de cólon (incluindo câncer do intestino delgado) , câncer de pulmão, câncer de mama, câncer pancreático, melanoma (por exemplo, melanoma maligno metastático) , leucemia mielóide aguda, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de ovário e câncer de próstata, câncer renal (por exemplo, carcinoma de célula renal), glioblastoma, tumores de cérebro, leucemia crônica ou aguda incluindo leucemia Iinfoblástica aguda (ALL), leucemia de célula T adulta (T-ALL), leucemia mielóide crônica, leucemia linflobástica aguda, leucemia linfocítica crônica, linfornas (por exemplo, Iinfoma de Hodgkin e não-Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma CNS primário, linfoma de célula T, linfoma Burkitt, linfomas de células grandes anaplásticas (ALCL), linfomas de célula T cutânea, linfama de célula clivada e nódulos pequenos, linfomas de célula T periférica, linfoma de Lennerts, linfomas imunoblásticas, leucemia de célula T/linfomas (ATLL), cânceres de linfomas foliculares entroblásticos/centrocíticos (cb/cc), linfomas de células grandes difusas da linhagem B, linfoma de célula T do tipo linfadenopatia angioimunoblástica (AILD) e linfomas baseados na cavidade corpórea associado com HIV) , carcinomas embrionários, carcinomas não-diferenciados da rinofaringe (por exemplo, tumor de Schmincke), doença de Castleman, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom e outros Iinfornas de célula B, carcinoma nasofaringeal, carcinoma ósseo, câncer de pele, câncer de cabeça e pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer testicular, câncer uterino, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, câncer de esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireóide, câncer da glândula paratireóide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer de uretra, câncer de pênis, tumores sólidos de crianças, câncer de bexiga, câncer de rim ou uretere, carcinoma da pelve renal, neoplasma do sistema nervoso central (CNS), angiogenesi tumoral, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenoma pituitário, câncer epidermóide, câncer de células escamosas, cânceres induzidos pelo ambiente, incluindo os induzidos por amianto, por exemplo, mesotelioma e combinações dos referidos cânceres.

Além disso, dada a expressão de Fucosil-GMl em várias células tumorais, os anticorpos humanos, composições de anticorpos e métodos da presente invenção podem ser utilizados para tratar um indivíduo com um distúrbio tumorigênico, por exemplo, um distúrbio caracterizado pela presença de células tumorais expressando Fucosil-GMl incluindo, por exemplo, câncer de pulmão (incluindo câncer de pulmão de células pequenas e câncer de pulmão de células não-pequenas), câncer de cólon (incluindo câncer de intestino delgado), melanoma (por exemplo, melanoma maligno metastático), leucemia mielóide aguda, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer de ovário e câncer de próstata. Exemplos de outros indivíduos com um distúrbio tumorigênico incluem, os indivíduos tendo câncer renal (por exemplo, carcionomas de célula renal), glioblastoma, tumor cerebral, leucemia crônica ou aguda incluindo leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia de célula T adulta (T-ALL), leucemia mielóide crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, Iinfornas (por exemplo, Iinfornas de Hodgkin e não- Hodgkins, linfoma linfocítico, linfoma CNS primário, linfoma de célula T, linfoma de Burkitt, linfomas de célula grande anaplástica (ALCL), linfoma de célula T cutânea, linfoma de célula clivada de pequenos nódulos, linfomas de célula T periférica, linfomas de Lennert, linfomas imunoblásticos, linfoma/leucemia de célula T (ATLL),câncer de linfomas foliculares entroblástico/centrocítico (cb/cc), linfomas de células grandes difusas de linhagem de célula B, linfoma de célula T do tipo (AILD)linfadenopatia angioimunoblástica, linfomas baseados na cavidade corpórea associada com HIV) , carcinomas embrionários, carcinomas não-diferenciados de rinofaringe (por exemplo, tumor de Schmincke) doença de Castleman, Sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom e outros linfomas de célula B, carcinoma nasofaringeal, câncer ósseo, câncer de pele, câncer de cabeça e pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer testicular, câncer uterino, carcinoma da tuba de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma da cérvix, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, câncer de esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireóide, câncer da glândula paratireóide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer de uretra, câncer de pênis, tumores sólidos de crianças, câncer de bexiga, câncer de rim ou uretere, carcinoma da pelve renal, neoplasma do sistema nervoso central (CNS), angiogenesis tumoral, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenoma pituitário, câncer epidermóide, câncer de células escamosas, cânceres induzidos pelo ambiente, incluindo os induzidos por amianto, por exemplo, mesotelioma e combinações dos referidos cânceres.

Conseqüentemente, em uma configuração, a invenção provê um método para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-Fucosil-GMl ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo anti-Fucosil-GMl humano (tal como qualquer um dos anticorpos anti-humano Fucosil-GMl humano descritos aqui) . Adicional ou alternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo anti-Fucosil-GMl quimérico ou humanizado.

Em uma configuração, os anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e composições) da invenção podem ser utilizados para detectar os níveis de Fucosil-GMl ou os níves de células que contém Fucosil-GMl em sua superfície de membrana, cujos níveis podem então estar ligados a determinados sintomas de doenças.

Alternativamente, os anticorpos podem ser utilizados para inibir ou bloquear a função Fucosil-GMl que, ao contrário, pode estar ligado para prevenir ou melhorar determinados sintomas de doenças, implicando, desse modo, no Fucosil-GMl como um mediador da doença. Isto pode ser conseguido pelo contato com uma amostra experimental e com a amostra controle com o anticorpo anti-Fucosil-GMl sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo e o Fucosil-GMl. Qualquer complexo formado entre o anticorpo e o Fucosil-GMl pode ser detectado e comparado na amostra experimental e na controle.

Em uma outra configuração, os anticorpos (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas e composições multiespecíficas e biespecíficas) desta invenção podem ser testados inicialmente para ligação da atividade associada com o uso terapêutico ou de diagnóstico in vitro. Por exemplo, as composições desta invenção podem ser testadas usando os ensaios de citometria de fluxo descrita nos Exemplos abaixo.

Os anticorpos (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e composições) da invenção têm uma utilidade adicional na terapia e diagnóstico de doenças relacionadas ao Fucosil-GMl. Por exemplo, os anticorpos monoclonais humanos, as moléculas multiespecíficas ou biespecíficas e os imunoconjugados podem ser utilizados para extrair in vivo ou in vitro um ou mais das seguintes atividades biológicas: inibir o crescimento de e/ou matar uma célula expressando Fucosil- GMl; mediar a fagocitose ou ADCC de uma célula expressando Fucosil-GMl em presença de células efeturas humanas; ou bloquear o ligante do Fucosil-GMl na ligação ao Fucosil-GMl.

Em uma configuração particular, os anticorpos (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e composições) da inventção são usados in vivo para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de doenças relacionadas ao Fucosil-GMl. Exemplos de doenças relacionados ao Fucosil-GMl incluem, dentre outros, câncer de pulmão (incluindo câncer de pulmão de células pequenas e câncer de pulmão de células não pequenas).

Rotas apropriadas de administração das composições de anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e imunoconjugados) da invenção, in vivo e in vitro, são bem conhecidas do estado da técnica e podem ser selecionadas pelos técnicos no assunto. Por exemplo, as composições de anticorpos podem ser administradas por injeção (por exemplo, intravenosa ou subcutânea). As dosagens apropriadas das moléculas utilizadas dependerão da idade e do peso do indivíduo e da concentração e/ou formulação da composição de anticorpos.

Como previamente descrito, os anticorpos anti-Fucosil-GMl humanos da invenção podem ser co-adminisrados com um ou mais de outros agentes terapêuticos, por exemplo, um agente citotóxico, um agente radiotóxico ou um agente imunosupressivo. O anticorpo pode estar ligado ao agente (como um imunocomplexo) ou pode ser administrado se forma separada do agente. No último caso (administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes, após ou concomitantemente com o agente ou, pode ser co- administrado com outras terapias conhecidas, por exemplo, terapia anticâncer, por exemplo, radiação. Os referidos agentes terapêuticos incluem, dentre outros, agentes anti-neoplásicos, tais como doxorubicina (adriamicina), sulfato de bleomicina cisplatina, carmustina, clorambucil e hidroxiuréia de ciclofosfamida, que, por si mesmas, são eficazes apenas em níveis que são tóxicos ou subtóxicos ao paciente. A cisplatina é administrada intravenosamente em uma dosagem de 100 mg/dose uma vez a cada quatro semanas e a adriamicina é administrada intravenosamente em uma dosagem de 60-75 mg/dose uma vez a cada 21 dias. A co-administração dos anticorpos anti-Fucosil-GMl humanos ou dos fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, da presente invenção com os agentes quimioterapêuticos provêem dois agentes anticancer, que operam via mecanismos diferentes o que resulta em um efeito citotóxico para as células tumorais humanas. A referida co-administração pode resolver o problema devido ao desenvolvimento de resistência ao fármaco ou a uma alteração na antigenicidade das células tumorais que resultariam em uma não-reatividade deles com o anticorpo. As células efetoras alvo-específicas, por exemplo, as células efetoras ligadas à composição (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da descrição também podem ser utilizadas como agentes terapêuticos. As células efetoras para alvo podem ser leucócitos humanos tais como, macrófagos, neutrófilos ou monócitos. Outras células incluem eosinófilos, células assassinas naturais e outras células influentes dos receptores IgG- ou IgA. Se desejado, as células efetoras podem ser obtidas a partir do indivíduo a ser tratado. As células efetoras alvo-específicas podem ser administradas como uma suspensão de células em uma solução fisiologicamente aceitável. 0 número de células administradas pode ser da ordem de 10^8-10^9, mas variará dependendo do propósito terapêutico. Em geral, a quantidade será suficiente para obter localização da célula alvo, por exemplo, uma célula tumoral expressando Fucosil-GMl e para agir na morte celular por, por exemplo, fagocitose. As rotas de administração também podem variar.

A terapia com as células efetoras alvo-específicas podem ser conduzida em conjunto com outras técnicas para remoção das células alvo. Por exemplo, a terapia anti- tumor usando as composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção e/ou células efetoras armadas com estas composições podem ser utilizadas em conjunto com a quimioterapia. Adicionalmente, a imunoterapia combinada pode ser utilizada para dirigir duas populações efetoras citotóxicas distintas em relação à rejeição da célula tumoral. Por exemplo, os anticorpos anti-Fucosil-GMl ligados ao RI anti-Fc-gama ou anti-CD3 podem ser utilizados em conjunto com os agentes de ligação específica ao receptor de IgG- ou IgA-.

As moléculas biespecíficas e multiespecíficas da descrição também podem ser utilizadas para modular FcyR ou os níveis de FcyR nas células efetoras, tais como por capeado e eliminação de receptores na superfície celular. Misturas de receptores anti-Fc também podem ser utilizados para este propósito.

As composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e imunoconjugados) da invenção que tem sítios de ligação do complento, tais como porções de IgGl, -2, ou -3 ou IgM que se liga ao complemento, também podem ser utilizado sem presença do complemento. Em uma configuração, o tratamento ex vivo de uma população de células compreende as células alvo com um agente de ligação da invenção e as células efetoras apropriadas podem ser suplementadas pela adição do complemento ou do soro contendo o complemento. A fagocitose das células alvo revestidas com um agente de ligação da invenção pode ser melhorada pela ligação das proteínas do complemento. Em uma outra configuração, as células alvo revestidas com as composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção também podem ser lisadas pelo complemento. Ainda em uma outra configuração, as composições da invenção não ativam o complemento. As composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas biespecíficas ou multiespecíficas e imunoconjugados) da invenção também podem ser administradas junto com o complemento. Conseqüentemente, dentro do escopo da invenção estão às composições compreendendo anticorpos humanos, moléculas biespecíficas ou multiespecí ficas e o soro ou o complemento. Estas composições são vantajosas já que o complemento está localizado próximo à vizinhança dos anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas.

Alternativamente, os anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas da invenção e o complemento ou o soro podem ser administrados separadamente.

Conseqüentemente, os pacientes tratados com as composições de anticorpo da invenção também podem ser administrados adicionalmente (antes de, simultaneamente com ou uma administração seqüencial de um anticorpo humano da invenção) com um outro agente terapêutico, tal como um agente citotóxico ou radiotóxico, que melhora ou aumenta o efeito terapêutico dos anticorpos humanos. Em uma outra configuração, o indivíduo pode ser adicionalmente tratado com um agente que modula, por exemplo, melhora ou inibe, a expressão ou atividade Fcy ou dos receptores de Fcy, por exemplo, pelo tratamento do indivíduo com a citocina. As citocinas preferidas para administração durante o tratamento com as moléculas multiespecífica incluindo o fator estimulante de colônias de granulócitos (G-CSF), fator estimulante de colônias de macrófagos-granulócitos (GM-CSF), interferon-γ (IFN-γ) e fator de necrose tumoral (TNF).

As composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção também podem ser utilizadas para as células alvo expressando FcyR ou Fucosil-GMl, por exemplo, para marcar as referidas células. Para tal uso, o agente de ligação pode estar ligado a uma molécula que pode ser detectada. Assim, a invenção provê métodos para localizar ex vivo ou in vivo as células expresando os receptores Fc, tais como FcyR ou Fucosil-GMl. O marcador detectável pode ser, por exemplo, um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um co-fator da enzima.

Também dentro do escopo da presente invenção estão os kits compreendendo as composições de anticorpo da invenção (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas biespecíficas e multiespecíficas, ou imunoconjugados) e instruções para uso. O kit pode conter inada um ou mais reagentes adicionais, tais como um reagente imunosupressivo, um agente citotóxico ou um agente radiotóxico ou um ou mais anticorpos humanos adicionais da invenção (por exemplo, anticorpo humano, tendo uma atividade complementar que se liga a um epítopo no antígeno Fucosil-GMl distinto do primeiro anticorpo humano). Os kits incluem tipicamente um marcador indicando o uso pretendido do conteúdo do kit. O termo marcador inclui qualquer material escrito, ou registrado fornecido no ou com o kit, ou que de outra forma acompanha o kit. A presente invenção é ainda ilustrada pelos exemplos a seguir que não devem ser interpretados como restritivos. O conteúdo de todas as figuras e todas as referências, patentes, e pedidos de patente publicados citados em todo o pedido são aqui expressamente incorporados por referência.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Geração de Anticorpos Monoclonais Humanos contra Fucosil-GMl Antígeno

Protocolos de imunização utilizados como antígeno de Salmonella minnesota adsorvido com Fucosil-GMl (Northwest Biotherapeutics, Inc.).

Camundongo Transgênico KM-Mouse® e HuMAb-Mouse® Anticorpos monoclonais totalmente humanos para Fucosil- GMl foram preparados utilizando as cepas HCo7, HCol2, HCo7+HCol2 do camundongo transgênico HuMab e a cepa KM de camundongos transcromossômicos transgênicos, cada uma delas expressando os genes de anticorpo humano. Em cada uma dessas cepas de camundongo, o gene de cadeia leve kappa de camundongo endógeno foi homozigotamente rompido conforme descrito em Chen et al.(1993) EMBO J.12:811-820 e o gene de cadeia pesada de camundongo endógeno foi homozigotamente rompido conforme descrito no Exemplo 1 da Publicação PCT WO 01/09187. Além disso, essa cepa de camundongo carrega um transgene de cadeia leve kappa humano, o KCo5, conforme descrito em Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. As cepas HCo7 carregam o transgene de cadeia pesada HCo7 humano como descrito na Patente US Nos.: 5,770,429; 5,545,806; 5,625,825; e 5,545,807. As cepas HCol2 carregam os trangenes de cadeia pesada HCol2 humano como descrito no Exemplo 2 do documento WO 01/09187 ou no exemplo 2, WO 01/14424. A cepa HCo7+HCol2 carrega ambos os transgene de cadeia pesada HCo7 e HCol2. A cepa KM contém o transcromossomo SC2 0 como descrito na publicação do pedido de patente internacional WO 02/43478. Todas estas cepas são relacionadas aqui como camundongo HuMAb.

Imunizações KM e HuMab

Para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para Fucosil-GM1, camundongos HuMAb-MOUSE™ e KM-MOUSE™ foram imunizados com Fucosil-GM1 adsorvido por liofilização sobre a superfície de Salmonella minnesota tratado com ácido (Northweas Beiotherapeutics, Inc.). Esquemas gerais de imunicação para camundongos HuMab estão descritos em Lonberg, N. et al.(1994) Nature 368 (6474) : 856-859; Fishwild, D. et al.(1996) Nature Biotechnology 14:845-851 e publicação PCT WO 98/24884. Os camundongos tinham de 6- 16 semanas de vida quando da primeira infusão de antígeno.

Os camundongos transgênicos foram imunizados intraperitonealmente (IP) ou subcutaneamente (Sc) com o antígeno em um adjuvante de Freund completo duas vezes, seguido de 2-4 dias IP (até um total de 8 imunizações) com o antígeno em adjuvante de Freund incompleto. A resposta imune foi monitorada por ELISA (descrito abaixo) de soro obtido a partir de sangramentos retroorbitais. 0 camundongo com títulos suficientes da imunoglobulina anti-Fucosil-GM1 humana foram usados para as fusões. Os camundongos foram estimulados intrevenosamente com o antígeno 3 e 2 dias antes do sacrifício e remoção do baço.

Seleção de um HuMab-MOUS E™ ou KM-MOUSE™ Produtor de Anticorpos Anti-Fucosil-GM1

Para selecionar camundongos HuMab-Mouse™ ou KM-MOUSE™ produtores de anticorpos que se ligam ao Fucosil-GM1, os soros de camundongos imunizados foram testados por ELISA como descrito por Fishwild, D. et al. (1996) . Resumidamente, Fucosil-GMl natural purificada a partir tanto das linhas de célula transfectante fucosil transferase (Northwest Biotherapeutics, Inc.) ou a partir de cérebro bovino (Matreya, Inc.) foi solubilizada em metanol em 1 mg/ml e passivamente adsovido sobre placas de microtitulação de polipropileno, 50 ml/poço, por ar- seco em temperatura ambiente durante 1-2 horas. Similarmente, as placas revestidas com antígenos controle relacionados tais como GMl foram preparados como um contra-corante para os anticorpos de reatividade cruzada.

As placas de ensaio foram então bloqueadas com 250 μ9/ροςο com ovolbumina a 1% em PBS durante 1 hora em temperatura ambiente. As diluições de plasma a partir de camuncongos imunizados com Fucosil-GMl foram adicionadas em cada poço e incubadas durante 1-2 horas em temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS e então incubadas por 1 hora em temperatura ambiente tanto com uma IgG Fc anti-humana de cabra quanto com um anticorpo policlonal IgM Fc anti-humano de cabra cada um conjugado a peroxidade de rábano silvestre (HRP). Após a lavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato TMB e analisadas por espectrofotômetro em OD 450 nm.

Os camundongos que desenvolveram os títulos mais elevados de anticorpos ao anti-Fucosil-GMl foram usados para as fusões. As fusões foram realizadas conforme descrito abaixo e os sobrenadantes de hibridoma foram testados quanto à atividade anti-Fucosil-GMl através do ELISA. Geração de Hibridomas Produtores de Anticorpos

Monoclonais Humanos para Fucosil-GMl

Os esplenócitos foram isolados a partir de camundongo HuMab-mouse® e/ou KM-mouse®, e foram fundidos em uma linha de célula com mieloma de camundongo tanto com PEG baseado em protocolos padrão ou em campo elétrico baseado em eletrofusão usando uma câmara grande de Pulso Cyto, para fusão celular com o eletroporador (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD). Os hibridomas resultantes foram então examinados quanto à produção de anticorpos antígeno-específicos .

Suspensões de células simples de esplenócitos de camundongos imunizados foram fundidas a um quarto do número de células de mieloma de camundongo não-secretoras P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) ou células de mieloma de camundongo não secretoras SP2/0 (ATCC, CRL 1581) usando 50% de PEG (Sigma). As células foram plaqueadas em uma densidade de aproximadamente lxl05/poço em placas de microtitulação de fundo plano, e incubadas por por aproximadamente 2 semanas em meio seletivo contendo soro bovino fetal a 10%, 10% de P388D1 (ATCC, CRL TIB-63), meio de condionamento, origem 3-5% (IGEN) em DMEM (Mediatech, CRL-10013, com alto teor de glicose com L- glutamina e piruvato de sódio) mais 5mM HEPES, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 mg/ml de gentamicina e 1x HAT (Sigma, CRL P-7185). Após 1-2 semanas, as células foram cultivadas em um meio no qual o HAT foi replaqueado com HT. Os poços individuais foram então examinadas através de ELISA (descrito acima) para detectar os anticorpos IgG e IgM anti-Fucosil-GMl humanos.

Os hibridomas com atividade de ligação específica no ensaio ELISA examinados foram testados ainda por FACS (descrito abaixo) quanto a ligação específica ao Fucosil- GMl adsorvido para células de mamíferos. Os hibridomas apresentando alta especificidade de ligação por ELISA e FACS foram sub-clonadas pelo menos duas vezes por diluição limitadas. Os sub-clones estáveis resultantes foram então cultivados in vitro para gerar quantidades pequenas de anticorpo monoclonal no meio de cultura de tecido. 0 exame por ELISA foi repetido para confirmar a atividade dos sub-clones. Os sub-clones com alta atividade em ELISA foram escamados para produzir meio condicionado suficiente (tipicamente 1L) para purificação do anti-Fucosil-GMl monoclonal para caracterização adicional.

Os clones de hibridoma 5B1, 5Bla, 7D4 , 7E4, 13B8, 13B8a e 18D5, foram selecionados para análise adicional.

Exemplo 2 : Caracterização Estrutural de Anticorpos Monoclonais Humanos 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5.

As seqüências de cDNA codificando as regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos anticorpos monoclonais 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5 foram obtidas dos hibridomas 5B1, 5Bla, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5 respectivamente, utilizando-se as técnicas PCR padrão e foram seqüenciadas utilizando técnicas de seqüenciamento de DNA padrão. As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 5B1 são mostradas na Figura 1A e em SEQ ID NO: 49 e 1, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeo e de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 5B1 são mostradas na Figura IB e em SEQ ID NO: 55 e 7, respectivamente.

A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada 5B1 com as conhecidas seqüências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada 5B1 utiliza um segmento Vh de linha germinal humana Vh 3-48, um segmento D a partir da linha germinal 1-1 humana, e um segmento Jh a partir da linha germinal humana JH 6b. O alinhamento da seqüência Vh 5B1 para a linha germinal da seqüência Vh 3-4 8 mostrado na Figura 7. Outra análise da seqüência Vh 5B1 utilizando o sistema Kabat de determinação da região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia pesada CDRl, CDR2 e CDR3, conforme mostrado nas Figuras IA e 7, e nas SEQ ID NOs: 13, 19, e 25, respectivamente.

A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia leve 5B1 com as conhecidas seqüências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia leve 5B1 utiliza um segmento Vl da linha germinal humana Vk Ll5 e um segmento Jk de linha germinal humana JK 4. O alinhamento da seqüência 5B1 VL com a seqüência Vk L15 de linha germinal é mostrado na Figura 8. Outra análise da seqüência Vl 5B1 utilizando o sistema Kabat de determinação da região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia leve CDRl, CDR2 e CDR3 conforme mostram as Figuras IB e 8, e nas SEQ ID NOs: 31, 3 7 e 43, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 5Bla são mostradas na Figura 2A e na SEQ ID No.:50 e 2, respectivamente. As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 5Bla são mostradas na Figura 2B e na SEQ ID NO: 56 e 8, respectivamente. A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada 5B1a com as conhecidas seqüências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada 5B1a utiliza um segmento Vh da linha germinal humana Vh 3-48, um segmento D da linha germinal humana 4-1, e um segmento Jh da linha germinal humana JH 6b. O alinhamento da seqüência 5Bla Vh com a seqüência VH 3-48 de linha germinal é mostrado na Figura 7. Outra análise da seqüência VH 5B1a utilizando o sistema Kabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 conforme mostram as Figuras 2A e 7, e as SEQ ID NOs: 14, 20, e 26, respectivamente.

A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia leve 5B1a com as conhecidas seqüências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia leve 5B1a utiliza um segmento VL da linha germinal humana Vk L015 e um segmento Jk da linha germinal humana JK 4. O alinhamento da seqüência VL 5B1a com a seqüência de linha germinal Vk L15 é mostrado na Figura 8. Outra análise da seqüência VL 5B1a utilizando o sistema Kabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 conforme mostram as Figuras 2B e 8, e as SEQ ID NOs: 32, 38 e 44, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da região variável de cadeia pesada de 7D4 são mostradas na Figura 3A e nas SEQ ID NO.:51 e 3, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da região variável de cadeia leve de 7D4 são mostradas na Figura 3B e SEQ ID NO: 57 e 9, respectivamente.

A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada 7D4 com as conhecidas seqüências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada 7D4 utiliza um segmento VH da linha germinal humana VH 3-48, um segmento D da linha germinal humana 1-1, e um segmento Jh da linha germinal humana JH 6b. O alinhamento da seqüência VH 7D4 com a seqüência VH 3-48 de linha germinal é mostrado na Figura 7. Outra análise da seqüência Vh 7D4 utilizando o sistema Kabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 conforme mostrado nas Figuras 3A e 7, e nas SEQ ID NOs: 15, 21 e 27, respectivamente.

A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia leve 7D4 com as conhecidas seqüências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia leve 7D4 utiliza um segmento Vl de linha germinal humana Vk Ll5 e um segmento JK de linha germinal humana JK 4. O alinhamento da seqüência VL 7D4 com a seqüência de linha germinal Vk L15 é mostrado na Figura 8. Outra análise da seqüência Vl 7D4 utilizando o sistema Kabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 conforme mostram as Figuras 3B e 8, e as SEQ ID NOs: 33, 39 e 45, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da região variável de cadeia pesada de 7E4 são mostradas na Figura 4A e nas SEQ ID NOs: 52 e 4, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da região variável de cadeia leve de 7E4 são mostradas na Figura 4B e nas SEQ ID NOs: 58 e 10, respectivamente. A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada 7E4 com as conhecidas seqüências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada 7E4 utiliza um segmento Vh de linha germinal humana Vh 3-48, um segmento D da linha germinal humana 1-1, e um segmento JH de linha germinal humana JH 6b. O alinhamento da seqüência VH 7E4 com a seqüência da linha germinal Vh 3-48 é mostrado na Figura 7. Outra análise da seqüência Vh 7E4 utilizando o sistema Kabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 nas Figuras 4A e 7, e nas SEQ ID NOs: 16, 22, e 28, respectivamente. A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia leve 7E4 com as conhecidas seqüências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia leve 7E4 utiliza um segmento VL de linha germinal humana VK Ll5 e um segmento JK de linha germinal humana JK 4. O alinhamento da seqüência VL 7E4 com a seqüência VK L15 de linha germinal é mostrado na Figura 8. Outra análise da seqüência VL 7E4 utilizando o sistema Kabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 conforme mostram as Figuras 4B e 8, e as SEQ ID NOs: 34, 40 e 46, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 13B8, são mostradas na Figura 5A e nas SEQ ID NOs: 53 e 5, respectivamente. As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da região variável de cadeia leve de 13B8, são mostradas na Figura 5B e nas SEQ ID NOs: 59 e 11, respectivamente.

A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada 13B8 com as conhecidas seqüências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada 13B8 utiliza um segmento Vh de linha germinal humana VH 3-48, um segmento D da linha germinal humana 1-1, e um segmento JH de linha germinal humana JH 6b. 0 alinhamento da seqüência VH 69A7 com a seqüência VH 3-48 de linha germinal é mostrado na Figura 7. Outra análise da seqüência VH 13B8 utilizando o sistema Kabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 conforme mostram as Figuras 5A e 7, e as SEQ ID NOs: 11, 17 e 23, respectivamente.

A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia leve 13B8 com as conhecidas seqüências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia leve 13B8 utiliza um segmento VL de linha germinal humana Vk Ll5 e um segmento JK de linha germinal humana JK 4. O alinhamento da seqüência Vl 13B8 com a seqüência Vk L15 da linha germinal é mostrado na Figura 8. Outra análise da seqüência Vl 13B8 utilizando o sistema Kabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia leve CDRl, CDR2 e CDR3 conforme mostram as Figuras 5B e 8, e as SEQ ID NOs: 35, 41 e 47, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 18D5, são mostradas na Figura 6A e nas SEQ ID NOs: 54 e 6, respectivamente. As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da região variável de cadeia leve de 18D5, são mostradas na Figura 6B e nas SEQ ID NOs: 60 e 12, respectivamente. A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada 18D5 com as conhecidas seqüências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada 18D5 utiliza um segmento Vh de linha germinal humana Vh 3-48, um segmento D da linha germinal humana 1-1, e um segmento Jh de linha germinal humana JH 6b. 0 alinhamento da seqüência Vh 18D5 com a seqüência Vh 3-48 de linha germinal é mostrado na Figura 7. Outra análise da seqüência Vh 18D5 utilizando o sistema Kabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia pesada CDRl, CDR2 e CDR3 conforme mostram as Figuras 6A e 7, e as SEQ ID NOs: 18, 24 e 30, respectivamente.

A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia leve 13D5 com as conhecidas seqüências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia leve 18D5 utiliza um segmento Vl de linha germinal humana Vk Ll5 e um segmento JK de linha germinal humana JK 4. 0 alinhamento da seqüência Vl 18D5 com a seqüência Vk L15 da linha germinal é mostrado na Figura 8. Outra análise da seqüência Vl 18D5 utilizando o sistema Kabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia leve CDRl, CDR2 e CDR3 conforme mostram as Figuras 6B e 8, e as SEQ ID NOs: 36, 42 e 48, respectivamente.

Exemplo 3: Preparação de células dopadas com Fucosil-GM1.

As células foram preparadas contendo Fucosil-GMl embebido na membrana plasmática para uso em ensaios de ligação. Fucosil-GMl purificado foi solubilizado em uma mistura de 1:1 de clorofórmio: metanol em um tubo de vidro e evaporado para secagem sob nitrogênio. PBS sem Ca ou Mg foi adicionado ao Fucosil-GMl seco de modo que a concentração do antígeno foi de 200 μg/ml; uma emulsão foi criada por agitação durante 5 minutos seguido por sonificação durante 5 minutos. Uma suspensão de células alvo, tipicamente HEK-293 (rim humano, ATCC # CRL-1573) ou Daudi (linfoma de Burkitt humano, ATCC # CCL-213) foi preparado em PBS em 2 χ IO6 células/ml. Volumes iguais de uma emulsão de Fucosil-GMl e uma suspensão de célula foram misturados em uma concentração final de 100 μg de antígeno/106 células/ml. As células mais o antígeno foram incubadas para permitir a intercalação de Fucosil-GMl dentro da membrana durante 15 minutos a 37°C, seguido por 30 minutos a temperatura ambiente com uma mistura ocasional durante. As células foram centrifugadas em 1000 rpm durante 10 minutos. 0 sobrenadante foi descartado e as células "dopadas" foram resuspensas em uma densidade de 4 χ IO6 células/ml em tampão FACS (PBS sem Ca ou Mg+ 1% de soro humano + 2% de PBS + 2 mM de EDTA).

Similarmente, as células controle foram preparadas "dopando" com um antígeno relacionado tal como GMl ou sem antígeno.

Exemplo 4: Caracterização de Especificidade de Ligação e cinética de ligação dos Anticorpos Monoclonais Humanos Anti-Fucosil-GMl.

Especificidade de ligação por ELISA

Os anticorpos anti-Fucosil-GMl humanos, monoclonais purificados foram testados quanto a sua ligação específica para o Fucosil-GMl purificado, por ambos, antígeno recombinante e células dopadas. Todos os procedimentos foram realizados em gelo. Meio de condicionamento a partir do ELISA de culturas de hibridomas positivos foram misturadas com antígenos ou com células em uma placa de fundo em "V" e foram incubadas durante uma hora. As células foram lavadas e o anticorpo ligado foi detectado com um anticorpo secundário Fc IgG anti-humano de camundongo conjugado com HRP. Após a lavagem as placas foram desenvolvidas em um substrato colorimétrico, pelotizada por centrifugação e o sobrenadante foi transferido para um ensaio de microtitulação em uma placa de fundo plano para análise por espectrofotômetro. Os resultados são mostrados na figura 9 (antígeno ELISA) e 10 (toda a célula - ELISA). Os anticorpos anti-Fucosil-GMl foram mostrados quanto a especificidade de ligação para o Fucosil-GMl.

Especificidade de ligação por citometria de fluxo As linhas de célula positivas expressando naturalmente Fucosil-GMl tal como H-4-II-E (hepatoma de rato ATCC 3 CRL-1548) , ou DMS-79 (SCLC humano - ATCC 3 CRL-2049) , foram utilizadas para determinar a especificade dos anticorpos monoclonais Fucosil-GMl humano por citometria de fluxo. Todos os procedimentos de coloração foram realizados em gelo. A ligação de um anticorpo monoclonal anti-Fucosil-GMl humano foi analisado por incubação das células transfectadas com o anticorpo monoclonal anti- Fucosil-GMl humano em uma concentração de 10 μg/ml. As células foram lavadas e a ligação foi detectada com uma IgG Ab anti-humana marcada com FITC. A análise de citometria de fluxo foi realizada usando uma citometria de fluxo FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA) . Os resultados estão representados na figura 11. 0 anticorpo monoclonal anti-Fucosil-GMl humano ligou-se as linhas de células H-4-II-E e DMS-79. Estes dados demonstram a especificidade do anticorpo monoclonal anti-Fucosil-GMl humano para o Fucosil-GMl.

Exemplo 5: Internalização dos anticorpos monoclonais anti-Fucosil-GMl. Os HuMAbs anti-Fucosil-GMl foram testados quanto a capacidade de internalizar dentro das linhas de células expressando Fucosil-GMl usando um ensaio de internalização Hum-Zap. Os testes dos ensaios Hum-Zap para internalização de um anticorpo humano primário através da ligação de um segundo anticorpo com afinidade para o conjugado de IgG humano a uma toxina saporina. A linha de célula expressando Fucosil-GM1 (H-4-II-E ou DMS 79) foi suspensa em um meio de cultura e dispensada dentro de placas de cultura de célula com microtitulação em 7500 células/poço. Diluições seriais dos anticorpos de teste e dos isotipos constrole foram preparadas em um meio de cultura e misturadas com um excesso de anticorpo secundário conjugado com saporina de 2:1 molares (Hum- Zap™, Advanced Targeting Sytems, San Diego, CA, IT-22-25) durante uma hora em gelo. Os anticorpos mais as misturas conjugadas com saporina foram então misturadas com as células e foram incubadas a 37°C, por 48-72 horas. A viabilidade celular foi medida com a adição de MTS (Promega), O.D. foi lido após uma incubação adicional de 4 horas, com absorbância inversamente proporcional à internalização. Os resultados estão mostrados na figura 12. Estes dados demonstram que os anticorpos anti- Fucosil-GM humanos podem internalizar dentro das linhas de células expressando Fucosil-GM1.

Exemplo 6: Efeito da citotoxidade dependente do complemento dos anticorpos anti-Fucosil-GM1.

As células alvo, tanto as linhas de célula expressando naturalmente ou as "dopadas" foram suspensas em 106/mL em tampão CDC (RPMI1640). O complemento humano (HC) foi diluído em 1:3 em linha de célula em meio de crescimento. Diluições seriais dos anticorpos de teste e do isotipo controle foram preparadas. As células, complemento e anticorpos foram misturados em volumes iguais em uma placa de ensaio de microtitulação e incubados a 37°C, durante 72 horas. Alamar blue foi adicionado em cada poço e as placas foram incubadas durante 21 horas adicionais a 37°C. As placas foram lidas em um leitor de placas fluorescentes usando um perfil de emissão de 53 0 nm e absorção/590, com a viabilidade da célula sendo proporcional às unidades fluorescentes. Os resultados estão mostrados na Figura 13. Os anticorpos controle humano e de camundongo apresentaram-se robustos, a atividade CDC dependente da dose em ambas as células DMS 79 e H-4-II-E. Os anticorpos isotipo controle não demonstraram uma citotoxicidade significante. A atividade CDC nas linhas de célula Fucosil-GMl negativas, tal como Ramos e ARH77 foi insignificante.

Exemplo 7: Avaliação da atividade ADCC do anticorpo anti- Fucosil-GMl.

Neste exemplo, os anticorpos monoclonais anti-Fucosil-GMl foram testados quanto à capacidade de matar as linhas de célula GMl em presença das células efetoras via anticorpo dependente da citotoxicidade celular (ADCC) em um ensaio de citotoxicidade por fluorescência.

A atividade ADCC foi medida usando o Sistema Delfia (Perkin-Elmer). Resumidamente, as células efetoras foram cultivadas a partir de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) por estímulo noturno com 200 u/ml de IL-2 e foram suspensas em 2 x 107/ml. As células alvo foram diluídas em 106/ml e foram carregadas com um ligante intensificador de fluorescência (BATDA) por incubação durante 20 minutos e foram diluídas para 2 x 107 células/ml. As células efetoras e as alvo foram combinadas em uma proporção de 100:1 em uma placa de ensaio de microtitulação e misturadas com uma diluição serial do anticorpo teste e do controle isotipo. As placas foram incubadas durante 1 hora a 370C, centrifugadas para pelotizar e 20 ul do sobrenadante foi removido e misturado com uma solução Eu (Perkin-Elmer). A fluorescência resultante do ligante liberado combinado com Eu foi medida em um leitor de placa Fusion (Perkin- Elmer) e é proporcional para a Iise celular. Os poços do ensaio com as células efetoras na ausência do anticorpo com o controle detergente para a lise antecedente e a lise completa, respectivamente, permitiu a especificidade do anticorpo para Iise a ser calculada. Os resultados estão mostrados na figura 14. Estes dados demonstram que os anticorpos anti-Fucosil-GM1 sãocitotóxicos para as células expressando Fucosil-GM1 em sua superfície.

Exemplo 8: Imunohistoquímica de carcinoma de pulamão. A capacidade do HuMAb 7E4 anti-Fucosil-GMl em reconhecer o Fucosil-GMl por IHC foi examinada usando biópsia clínica a partir do carcinoma de pulmão de células pequenas (SCLC) e carcionam de pulmão de células não pequenas (NSCLC).

Para a imunohistoquímica, 5 mm de secções congeladas (Ardais, Inc., USA) foram preparadas a partir de biópsias clínicas de carcinoma de pulmão de pequenas células (SCLC) e carcinoma de pulmão de células não-pequenas (NSCLC). Após a secagem durante 30 minutos, as secções foram fixadas com metanol (em temperatura ambiente durante 10 minutos) e secas ao ar durante 5 minutos. As lâminas foram lavadas em PBS e então, pré-incubadas com 10% de soro normal de cabra em PBS durante 20 minutos e, subseqüentemente, incubadas com 10 mg/ml de 7E4 biotinilado em PBS com 10% de soro de cabra normal durante 30 minutos em temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas três vezes com PBS e então incubadas durante 30 minutos com estreptavidin-FITC (DAKO) em temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas novamente com PBS e incubadas com conjugado HRP anti-FITC de cabra (DAKO) durante 30 minutos a temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas novamente 3x com PBS. A diaminobenzidina (Sigma) foi utilizada como substrato HRP, resultando em uma coloração marrom dos tecidos positivos paa a ligação ao 7E4. Após a lavagem com água destilada, as lâminas foram contra-coradas com hematoxilina por 1 minuto para mostrar a estrutura do tecido. Subseqüentemente, as lâminas foram lavadas durante 10 segundos em uma corrida com água destilada e montada em glicergel (DAKO). A imunohistoquímica da biópsia clínica corada revelou coloração positiva nas colorações das secções de ambos SCL e NSCL. Apenas as células malignas foram positivas em cada caso, o tecido de pulmão normal adjacente não foi corado. Toda a prevalecência no carcinoma de pulmão foi de 5/13 das amostras testadas (2/6 de SCLC e 3/7 de NSCLC). 0 IHC foi negativo para a ligação de 7E4 ao tecido de pulmão normal.

Exemplo 9: Produção de HuMAbs não-fucosildo Os anticorpos com quantidades reduzidas de resíduos fucosil demonstraram um aumento na capacidade de ADCC do anticorpo. Neste exemplo, um HuMAb anti-fucosil GMl que foi produzido perdeu os resíduos de fucosil.

A linha de célula CHO Ms704-F, que perde o gene fucosiltransferase, FUT 8 (Biowa, Inc., Princeton, NJ) foi eletroporada com um vetor que expressa as cadeias pesada e leve do HuMAb anti-Fucosil GMl. Os clones fármaco-resistentes foram selecionados pelo crescimento no meio Ex-Cell 325-PF CHO (JRH Biosciences, Lenexa, KS) com 6 mM de L-glutamina e 500 μg/ml G418 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Os clones foram classificados quanto a expressão de IgG pelo ensaio ELISA padrão.

Exemplo 10: Eficácia in vivo dos anticorpos monoclonais anti-Fucosil-GMl humano.

As células de câncer de pulmão de pequenas células DMS79 (Fucosil-GMl+) foram implantadas subcutaneamente em camundongos SCID machos (5 x 10"6 células/camundongo) por um tempo suficiente (cerca de 8 dias) para permitir a formação de tumores. No 8 o dia após o implante, as medidas do tumor foram tomadas e os camundongos aleatórios baseados no volume do tumor principal (cerca de 2 00 mm3) dentro de seis grupos de oito camundongos cada para a terapia do anticorpo subseqüente. Nos dias 8, 11, 15, 18, e 22 após o implante, os camundongos foram injetados intraperitonealmente (i.p.) como nos grupos a seguir: (A) PBS (controle veículo); (B) IgG1 humano (controle isotipo) em 30 mg/kg por camundongo; (C) anticorpo monoclonal anti-Fucosil-GMl 5B1 em 10 mg/kg por camundongo; (D) anticorpo monoclonal anti-Fucosil-GM1 5B1 em 30 mg/kg por camundongo; (E) anticorpo monoclonal anti-Fucosil-GM1 7E4 em 10 mg/kg por camundongo; ou (F) anticorpo monoclonal anti-Fucosil-GM1 7E4 em 30 mg/kg por camundongo. As composições de anticorpos moncolonais utilizadas nestes experimentos tivaram níveis baixos de endotoxina e não agregaram significativamente. Usando um calibrador eletrônico de precisão, os tumores foram tridimensionalmente medidos (altura χ largura χ comprimento) e o volume do tumor foi calculado. As medidas dos tumores foram tomadas duas vezes na semana durante o tempo deste experimento (61 dias). Os camundongos foram eutanizados quando so tumores alcançaram um tamanho-limite designado para o tumor (um volume de tumor particular tal como 1500 mm3 e/ou quando o camundongo demonstrou sinal de desconforto ou uma perda de peso maior que cerca de 15%).

Para examinar se os anticorpos monoclonais anti-Fucosil- GMl retardaram o crescimento do tumor, o dia em que o tumor alcançou um volume de 1000 mm3 foi monitorado. Ambos os anticorpos monoclonais anti-Fucosil-GMl 7E4 e 5B1 retardaram, significativamente, o crescimento do tumor quando comparado ao veículo e aos controles isotipos (ver tabela 1). A eficácia do anticorpo parece ser dose-dependente com os grupos de tratamento 30 mg/kg mostrando uma resposta maior em cada caso. Além disso, os volumes dos tumores em camundongos tratados com o anticorpo 7E4 em 30 mg/kg nunca alcançando 1000 mm2 e teve um volume médio de 600 mm3 ao término do estudo no 61° dia.

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Para examinar se o Fucosil-GMl continuou a ser expresso pelas células DMS79 in vivo, a ligação dos anticorpos monoclonais 7E4 e 5B1 às células DMS79 foi analizada por FACS antes do implante e após a recuperação das células DMS79 a partir dos tumores não-tratados. Os anticorpos ligados pré- e pós-implante das células DMS79 demonstraram que os níveis de expressão de Fucosil-GMl foram mantidos in vivo (Figura 11C).

A figura 15A mostra que todos os camundongos controle (Grupos AeB) exceto um alcançaram o tamanho final do umor bem antes do dia 61. A figura 15B mostra que o grupo tratado com 10 mg/kg do anticorpo anti-Fucosil-GMl 5B1 (Grupo C) teve dois camundongos que alcançaram o tamanho final do tumor e seis camundongos com tumores tendo um volume variando de cerca de 600 mm3 a 1000 mm3, embora nenhum dos oito camundongos no grupo tratado com 3 0 mg/kg do anticorpo anti-Fucosil-GMl 5B1 (Grupo D) alcançou o tamanho final do tumor no 61 dia (tendo um volume de 1000 mm3 ou menos). A figura 15C mostra que nenhum dos oito camundongos no grupo tratado com 10 mg/kg do anticorpo monoclonhal anti-Fucosil-GMl 7E4 (Grupo E) alcançou o tamanho final do tumor no 61° dia (tendo um volume de 1200 mm3 ou menos, e um camundongo estando livre do tumor) . A figura 15C também mostra que nenhum dos oito camundongos no grupo tratado com 3 0 mg/kg do anticorpo monoclonal anti-Fucosil-GMl 7E4 (Grupo F) alcançou o tamanho final do tumor no 61° dia (tendo um volume de 800 mm3 ou menos, e dois camundongos estando livres do tumor) . A figura 16 mostra o volume médio (A) e o volume mediano (B) do tumor medido no 61° dia. A eficácia do anticorpo parece ser dose dependente com os grupos de tratamento com 3 0 mg/kg mostrando uma resposta maior em cada um dos casos quando comparado aos controles. <table>table see original document page 113</column></row><table>

Este estudo indicou que, em um modelo de tumor em murino, o tratamento com anticorpo anti-Fucosil-GMl as funções são de uma maneira dose-dependente e tiveram um efeito significativamente maior no crescimento do tumor do que nos controles de veículo e isotipo. 0 tratamento com o anticorpo anti-Fucosil-GMl também não causou no camundongo uma perda de peso ou resultou em qualquer outro efeito colateral significativo, indicando que estes anticorpos são seguros e bem tolerados (Figura 17) . Ao contrário, o anticorpo anti-Fucosil-GMl demonstrou um percentual de inibição de crescimento do tumor (TGI %) variando de 81 a 90% no dia 32 (Tabela 2) . Em adição, o tratamento com o anticorpo 7E4 em uma dose de 3 0 mg/kg resultou em 2 5% dos camundongos estando livres do tumor. A presente descrição não está limitada ao escopo das configurações específicas descritas aqui. Ao contrário, várias modificações desta invenção, em adição àquelas descritas aqui tornado-se aparente aos técnicos no assunto, a partir da descrição anterior e que acompanham as figuras. As referidas modificações estão abrangidas dentro do escopo de proteção das reivindicações anexas. Esta invenção está, portanto, limitada apenas aos termos das reivindicações anexas e ao longo de todo o escopo de equivalentes aos quais as reivindicações estão dirigidas. Listagem de Seqüências

<table>table see original document page 114</column></row><table> LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Medarex Inc.

Vistica, Cynthia A Brams, Peter Holmes, Eric H Witte, Alison Cardarelli, Josephine M

<120> "ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO ISOLADO OU UMA PORÇÃO LIGANTE AO ANTÍGENO DO MESMO, COMPOSIÇÃO, IMUNOCONJUGADO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PREPARAR UM ANTICORPO ANTI-FUCOSIL-GMl E MÉTODO PARA TRATAR OU PREVENIR UMA DOENÇA DEFINIDA PELO CRESCIMENTO DE CÉLULAS TUMORAIS EXPRESSANDO FUCOSIL-GMl".

<130> 077375.0427

<140> PCT/US06/61817 <141> 2006-12-08

<150> 60/748,915 <151> 2005-12-08

<160> 70

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu 1 5

Ser Leu Arg Leu Ser Cys 20

Lys Met Asn Trp Val Arg 35

Ser Tyr Ile Ser Arg Ser 50

Lys Gly Arg Phe Thr Ile 65 70

Leu Gln Met Asn Ser Leu

85

Ala Gly Thr Val Thr Thr 100

Gly His Gly Thr Thr Val 115

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 10 15 Val Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Arg Tyr Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45 Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 55 60 Ser Arg Asp Asn Ala 75 Lys Asn Ser Leu Tyr 80 Arg Asp Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Tyr Tyr Tyr 105 Tyr Phe Gly Met Asp 110 Val Trp Thr Val 120 Ser Ser <210> 2

<211> 121

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Glu Val Gln 1

Ser Leu Arg

Lys Met Asn 35

Ser Tyr Ile 50

Lys Gly Arg 65

Leu Gln Met

Ala Gly Thr

His Gly Thr 115

<210> 3

<211> 122

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu 1 5

Ser Leu Arg Leu Ser Cys 20

Lys Met Asn Trp Val Arg 35

Ser Tyr Ile Ser Arg Ser 50

Lys Gly Arg Phe Thr Ile 65 70

Leu Gln Met Ser Ser Leu

85

Ala Gly Thr Val Thr Thr 100

Gly Leu Gly Thr Thr Val 115

Leu Val Glu 5

Leu Ser Cys 20

Trp Val Arg

Ser Arg Ser

Phe Thr Ile 70

Asn Ser Leu 85

Val Thr Thr 100

Thr Val Thr

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 10 15 Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 25 30 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45 Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 55 60 Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 75 80 Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95 Tyr Tyr Tyr Phe Gly Met Asp Val Trp Gly 105 110 Val Ser Ser 120 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 10 15 Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 25 30 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 40 45 Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 55 60 Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 75 80 Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95 Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Gly Met Asp Val Trp 105 110 Thr Val Ser Ser 120 <210 > 4

<211> 122

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 1 5

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala 20

Lys Met Asn Trp Val Arg Gln Ala

35 40

Ser Tyr Ile Ser Arg Ser Gly Arg

50 55

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp

85

Ala Gly Thr Val Thr Thr Tyr Tyr 100

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 115 120

Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Glu 10 15 Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45 Asp Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 60 Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 75 80 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95 Tyr Asp Phe Gly Met Asp Val Trp 105 110 Ser Ser

<210 > 5

<211> 122

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<4 0 0 > 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Val Ala Ser 25 Gly Phe Thr Leu Ser 30 Arg Tyr Lys Met Asn 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Ile Ser Tyr 50 Ile Ser Arg Ser Gly 55 Arg Asp Ile Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Arg Asp Glu Asp 90 Ser Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Gly Thr Val Thr Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly 115 Thr Thr Val Thr Val 120 Ser Ser

I <210> 6

<211> 122

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Lys Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Arg Ser Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Thr Val Thr Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Leu Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 7

<211> 107

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 1 5 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 20 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 35 40 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 50 55 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val

100

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

10 15

Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 25 30

Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 45

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

75 80

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro

90 95

Glu Ile Lys 105

<210 > 8

<211> 107

<212 > PRT

<213> Homo sapiens <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> 1 Homo sapiens <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210 > 13

<211> 5

<212 > PRT

<213 > Homo sapiens

<400> 13

Arg Tyr Lys Met Asn 1 5

<210> 14

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Arg Tyr Lys Met Asn 1 5

<210> 15

<211> 5

<212 > PRT

<213 > Homo sapiens

<4 0 0 > 15

Arg Tyr Lys Met Asn 1 5

<210> 16

<211> 5

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Arg Tyr Lys Met Asn 1 5

<210 > 17

<211> 5

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

Arg Tyr Lys Met Asn 1 5 <210> 18

<211> 5

<212 > PRT

<213 > Homo sapiens

<4 0 0 > 18

Arg Tyr Lys Met Asn 1 5

<210> 19

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

Tyr Ile Ser Arg Ser Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

<210 > 20

<211 > 16

<212 > PRT

<213 > Homo sapiens

<400 > 20

Tyr Ile Ser Arg Ser Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

<210 > 21

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

Tyr Ile Ser Arg Ser Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 22

<211> 16

<212 > PRT

<213 > Homo sapiens

<400 > 22

Tyr Ile Ser Arg Ser Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 <210 > 23

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

Tyr Ile Ser Arg Ser Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210 > 24

<211> 17

<212 > PRT

<213 > Homo sapiens <400> 24

Tyr Ile Ser Arg Ser Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 25

<211> 13

<212 > PRT

<213 > Homo sapiens

<400> 25

Thr Val Thr Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Gly Met Asp Val 15 10

<210 > 26

<211> 13

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

Thr Val Thr Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Gly Met Asp Val 1 5 10

<210 > 27

<211> 13

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

Thr Val Thr Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Gly Met Asp Val 15 10 <210 > 28

<211> 13

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

Thr Val Thr Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Gly Met Asp Val 15 10

<210> 29

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

Thr Val Thr Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Gly Met Asp Val 15 10

<210> 30

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

Thr Val Thr Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Gly Met Asp Val 15 10

<210 > 31

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 15 10

<210> 32

<211> 11

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400 > 32

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser- Trp Leu Ala 15 10 <210> 33

<211> 11

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10

<210> 34

<211> 11

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10

<210 > 35

<211> 11

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10

<210 > 36

<211> 11

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10

<210> 37

<211> 7

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 38

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5

<210> 40

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5

<210> 41

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 41

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5

<210> 42

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 42

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210 > 43

<211> 9

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5

<210 > 44

<211> 9

<212 > PRT

<213 > Homo sapiens

<400> 44

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5

<210> 45

<211> 9

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5

<210 > 46

<211> 9

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400 > 46

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5

<210 > 47

<211> 9

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 47

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5 <210> 48

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 48

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5

<210> 49

<211> 350

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 49

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcctgtgtag cctctggatt tactttcagt ccagggaagg gactggaatg ggtttcatac gcagactctg tgaagggccg attcaccatc ctgcaaatga acagcctgag agacgaggac acttcggtat ggacgtctgg ggccacggga

ttggtgcagc ctggggagtc cctgagactc 60 agatataaga tgaactgggt tcgccaggct 12 0 atcagtcgta gtggccgtga catttactac 180 tccagagata atgccaagaa ctcactgtat 240 acggctgtat attactgtgc gggtactact 3 00 ccacggtcac cgtctcctca 350

<210> 50

<211> 347

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 50

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcctgtgtag cctctggatt tactttcagt ccagggaagg gactggaatg ggtttcatac gcagactctg tgaagggccg attcaccatc ctgcaaatga acagcctgag agacgaggac tcggtatgga cgtctggggc cacgggacca

ttggtgcagc ctggggagtc cctgagactc 60 agatataaga tgaactgggt tcgccaggct 120 atcagtcgta gtggccgtga catttactac 180 tccagagata atgccaagaa ctcactgtat 240 acggctgtat attactgtgc gggtactact 300 cggtcaccgt ctcctca 347

<210> 51

<211> 366

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 51

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcctgtgtag tctctggatt caccttcagt ccagggaagg gactggaatg gatttcatac gcagactctg tgaagggccg attcaccatc ctgcaaatga gcagcctgag agacgaggac acgacatatt attattactt cggtatggac tcctca

ttggtacagc ctggggagtc cctgagactc 60 aggtataaga tgaactgggt ccgccaggct 12 0 attagtcgta gtggtcgtga catatactac 180 tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240 acggctgtgt attactgtgc gggaactgta 300 gtctggggcc tagggaccac ggtcaccgtc 360

366 <210 > 52

<211> 366

<212 > DNA

<213 > Homo sapiens

<400> 52

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcctgtgtag cctctggatt caccttcagt ccagggaagg gactggaatg ggtttcatac gcagactctg tgaagggccg attcaccatc ctgcaaatga acagcctgag agacgaggac acgacatact actacgactt cggtatggac tcctca

tcggtacagc ctggggagtc cctgagactc 60 aggtacaaga tgaactgggt ccgccaggct 120 attagtcgta gtggtcgtga catatactac 180 tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240 acggctgtgt attactgtgc gggaactgta 3 00 gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360

366

<210> 53

<211> 366

<212 > DNA

<213> Homo sapiens

<400> 53

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcgtgtgtag cctctggatt caccctcagt ccagggaagg gactggaatg gatttcatac gcagactctg tgaagggccg attcaccatc ctgcaaatga acagcctgcg agacgaggac acgacatact actactactt cggtatggac tcctca

ttggtacagc ctggggagtc cctgagactc 60 aggtataaga tgaactgggt ccgccaggct 12 0 atcagtcgta gtggtcgtga catatactac 180 tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240 tcggctgtgt attactgtgc gggaactgta 300 gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360

366

<210 > 54

<211> 366

<212 > DNA

<213> Homo sapiens

<400> 54

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcctgtgtag cctctggatt caccttcagt ccagggaagg gactggaatg gatttcatac gcagactctg tgaagggccg attcaccatc ctgcaaatga gcagcctgag agacgaggac acgacatatt attattactt cggtatggac tcctca

ttggtacagc ctggggagtc cctgagactc 60 aggtataaga tgaactgggt ccgccaggct 120 attagtcgta gtggtcgtga catatactac 180 tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240 acggctgtgt attactgtgc gggaactgtc 300 gtctggggcc tagggaccac ggtcaccgtc 3 60

366

<210> 55

<211> 321

<212> DNA

<213 > Homo sapiens

<400> 55

gacatccaga tgacccagtc atcacttgtc gggcgagtca gagaaagccc ctaagtccct

tccatcctca ctgtctgcat gggtattagc agctggttag gatctatgct gcatccagtt

ctgtaggaga cagagtcacc 60 cctggtatca gcagaaacca 120 tgcaaagtgg ggtcccatca 18 0 aggttcagcg gcagtggatc gaagattttg caacttatta gggaccaagg tggagatcaa

tgggacagat ttcactctca ctgccaacag tataatagtt a

ccatcagcag cctgcagcct 240 accctcccac tttcggcgga 300

321

<210> 56

<211> 321

<212 > DNA

<213> Homo sapiens

<400> 56

gacatccaga tgacccagtc tccatcctca atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat gaagattttg caacttatta ctgccaacag gggaccaagg tggagatcaa a

ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 agctggttag cctggtatca gcagaaacca 12 0 gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 tataatagtt accctcccac tttcggcgga 300

321

<210> 57

<211> 321

<212 > DNA

<213> Homo sapiens

<400> 57

gacatccaga tgacccagtc tccatcctca atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat gaagattttg cgacttatta ctgccaacag gggaccaagg tggagatcaa a

ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 agctggttag cctggtatca gcagaaacca 12 0 gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ttcactctca ccatcagctg cctgcagcct 240 tataatagtt accctcccac tttcggcgga 300

321

<210> 58

<211> 321

<212 > DNA

<213> Homo sapiens

<400> 58

321

<210> 59

<211> 321

<212 > DNA

<213> Homo sapiens

<400> 59 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat gaagattttg caacttatta ctgccaacag gggaccaagg tggagatcaa a

321

<210> 60

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 60

321

<210> 61

<211> 98

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr Ser Met Asn 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ser Tyr 50 Ile Ser Ser Ser Ser 55 Ser Thr Ile Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Arg Asp Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys

Ala Arg

<210 > 62

<211> 95

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 62

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 20

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

35 40

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

50 55

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

85

Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 25 30

Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

45

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

75 80

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro 90 95

<210 > 63

<211> 121

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 63

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Val Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Arg Tyr Lys Met Asn 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Ile Ser Tyr 50 Ile Ser Arg Ser Gly 55 Arg Asp Ile Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser 85 Leu Arg Asp Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Gly Thr Val Thr Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Leu Gly 115 Thr Thr Val Thr Val 120 Ser

<210 > 64

<211> 107

<212 > PRT

<213 > Homo sapiens

<400> 64

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 65

<211> 5

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

Arg Tyr Lys Met Asn 1 5

<210 > 66

<211> 17

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 66

Tyr Ile Ser Arg Ser Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210 > 67

<211> 13

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 67

Thr Val Thr Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Gly Met Asp Val 1 5 10

<210> 68

<211> 11

<212 > PRT

<213 > Homo sapiens

<400> 68

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 69

<211> 7

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 69

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5

<210 > 70

<211> 9

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 70

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5

Claims

1. Anticorpo monoclonal humano isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de: (a) ligar-se ao especificamente ao Fucosil-GMl; e (b) ligar-se a uma linha de célula cancerígena de células pequenas de pulmão DMS-79 humanas (SCLC ATCC # CRL-2049).

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo de extensão completa de um isotipo IgGl ou IgG4.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia simples.

4. Anticorpo monoclonal humano isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de o anticorpo fazer competição cruzada para ligar-se a Fucosil-GMl com um anticorpo de referência, sendo que o anticorpo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs:1, 2, 3, 4, 5 e 6; e (b) uma região variável de cadeia leve uma seqüência de aminoácidos, selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11 e 12.

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de a região variável de cadeia pesada humana compreender a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; e a região variável de cadeia leve humana compreender a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:7.

6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de a região variável de cadeia pesada compreender a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e a região variável de cadeia leve compreender a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:8.

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de a região variável de cadeia pesada compreender a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e a região variável de cadeia leve compreender a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:9.

8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de a região variável de cadeia pesada compreender a SEQ ID NO:4; e a região variável de cadeia leve compreender a SEQ ID NO:10.

9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de a região variável de cadeia pesada compreender a SEQ ID NO:5; e a região variável de cadeia leve compreender a SEQ ID NO:11.

10. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de a região variável de cadeia pesada compreender a SEQ ID NO:6; e a região variável de cadeia leve compreender a SEQ ID NO:12.

11. Anticorpo monoclonal humano isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivada de um gene Vh 3-4 8 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao Fucosil-GM1.

12. Anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivada de um gene Vk L15 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao Fucosil-GMl.

13. Anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 12, caracterizado pelo fato de compreender ainda uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivada de um gene Vh 3-48.

14. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO:13; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO:19; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO:25; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO:31; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO:37; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO:43.

15. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma CDRl de região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO:14; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO:20; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO:26; (d) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO:32; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO:38; e (f) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO:44.

16. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma CDRl de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:15; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 21; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 27; (d) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:33; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:39; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:45.

17. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma CDRl de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:16; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:22; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:28; (d) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:34; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:40; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:46.

18. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada, compreendendo a SEQ ID NO: 17; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:23; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:29; (d) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:35; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:41; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:47.

19. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma CDRl de região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 18; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:24; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:30; (d) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:36; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:42; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:48.

20. Anticorpo monoclonal humano isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada, compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

21. Anticorpo monoclonal isolado ou porção ligante ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada, compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

22. Anticorpo monoclonal isolado ou porção ligante ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada, compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

23. Anticorpo monoclonal isolado ou porção ligante ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada, compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

24. Anticorpo monoclonal isolado ou porção ligante ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada, compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

25. Anticorpo monoclonal isolado ou porção ligante ao antigeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada, compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

26. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o anticorpo ou a porção ligante ao antigeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

27. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato de compreender o anticorpo ou uma porção ligante ao antigeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, ligado a um agente terapêutico.

28. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o imunoconjugado, conforme definido na reivindicação 2 7 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

29. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de o agente terapêutico ser uma citotoxina.

30. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o imunoconjugado, conforme definido na reivindicação 2 9 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

31. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de o agente terapêutico ser um isótopo radioativo.

32. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o imunoconjugado, conforme definido na reivindicação 31 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

33. Molécula de ácido nucléico isolada, caracterizada pelo fato de codificar o anticorpo ou a porção ligante ao antigeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1.

34. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender a molécula de ácido nucléico conforme definida na reivindicação 33.

35. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de compreender um vetor de expressão conforme definido na reivindicação 34.

36. Método para preparar um anticorpo anti-Fucosil-GMl, caracterizado pelo fato de compreender a expressão do anticorpo na célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 35, e o isolamento do anticorpo a partir da célula hospedeira.

37. Método para tratar ou prevenir uma doença, definida pelo crescimento de células tumorais expressando Fucosil- GM1, caracterizado pelo fato de compreender administrar ao indivíduo o anticorpo ou a porção ligante ao antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1 em uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir a doença.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de a doença ser o câncer.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de o câncer ser câncer de pulmão.