JP2019054798A - Cxcr4に結合するヒト抗体およびその使用 - Google Patents
Cxcr4に結合するヒト抗体およびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】CXCR4に高親和性で特異的に結合する単離モノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体を提供すること。【解決手段】単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで抗体は、(a)細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合し、(b)SDF−1のヒトCXCR4への結合を阻害し、(c)ヒトCXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束を阻害し、(d)ヒトCXCR4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走を阻害し、および(e)ヒト臍静脈内皮細胞による毛細管形成を阻害する。【選択図】なし
Description
ケモカインは、細胞輸送および血管新生を調節する約50の小タンパク質のファミリーであり、さらに腫瘍微環境内で重要な役割を担う非特許文献1)。ケモカインは、それらの構造に依存し、(システイン−システインモチーフを有する)C−Cケモカインまたは(システイン−X−システインモチーフを有する)C−X−Cケモカインとして分類される。したがって、かかるケモカインに結合する各受容体は、CCRファミリーまたはCXCRファミリーのメンバーとして分類される。CXCRファミリーの1つのメンバーは、主にリンパ球上に発現されかつ化学走性を活性化する7回膜貫通型Gタンパク質共役受容体のCXCR4である。CXCR4はケモカインCXCL12(SDF−1)に結合する。
CXCR4は、胚形成、ホメオスタシスおよび炎症において役割を担う。CXCR4またはSDF−1が欠損するように改変されたマウスを用いる試験には、器官の血管新生ならびに免疫系および造血系におけるCXCR4/SDF−1経路が関与する(非特許文献2)。さらに、CXCR4はTリンパ増殖性HIV−1単離体における共受容体として機能することが示されている(非特許文献3)。CXCR4はまた、多種多様な癌細胞種上に発現されることが示されている。さらに、CXCR4/SDF−1経路は、多種多様な新生物における転移プロセスの刺激に関与することが示されている(非特許文献4)。例えば、CXCR4およびSDF−1は、原発性腫瘍部位と転移部位との間に走化性勾配(chemotactic gradient)をもたらすことによって器官特異的な転移を媒介することが示されている(非特許文献5;非特許文献6;非特許文献7)。
(ヴィカリ A.P.(Vicari A.P.)およびコー C.(Caux C.)(2002年)Cytokine Growth Factor Rev.13:143−154頁
タチバナ K.(Tachibana K.)ら(1998年)Nature 393:591−594頁
フェン Y.(Feng Y.)ら(1996年)Science 272:872−877頁
マーフィ P.M.(Murphy P.M.)(2001年)N.Engl.J.Med.345:833−835頁
ミュラー A.(Muller A.)ら(2001年)Nature 410:50−56頁
ムラカミ T.(Murakami T.)ら(2002年)Cancer Res.62:7328−7334頁
ハナハン D.(Hanahan D.)ら(2003年)Cancer Res.63:3005−3008頁
本開示は、ヒトCXCR4に結合しかつ極めて多数の所望の特性を示す単離モノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体を提供する。これらの特性は、細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に対する結合能、SDF−1のヒトCXCR4への結合に対する阻害能、CXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束に対する阻害能、CXCR4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走に対する阻害能、ヒト臍静脈内皮細胞(HuVEC)による毛細管形成に対する阻害能、CXCR4を発現する細胞内でのアポトーシスに対する誘発能、インビトロでの腫瘍細胞増殖に対する阻害能、インビボでの腫瘍細胞増殖に対する阻害能、CXCR4+腫瘍細胞転移に対する阻害能および/またはCXCR4+腫瘍を担持する対象の生存時間を増加させる能力を含む。
一態様では、本開示は、単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで抗体は細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合する。一実施形態では、抗体はまた、好ましくは50nM以下、または30nM以下、または15nM以下、または10nM以下、または5nM以下、または3nM以下の阻害に対するEC50(例えば、28.60nM以下、または12.51nM以下、または2.256nM以下の阻害に対するEC50)でSDF−1のヒトCXCR4への結合を阻害する。別の実施形態では、抗体は細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合するが、SDF−1のヒトCXCR4への結合を阻害することはない。さらに他の実施形態では、抗体はまた、ヒトCXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束を、好ましくは3nM以下、または2nM以下、または1nM以下、または0.9nM以下、または0.8nM以下、または0.7nM以下、または0.6nM以下、または0.5nM以下、または0.4nM以下(例えば、0.9046nM以下、0.5684nM以下、または0.3219nM以下)の阻害に対するEC50で阻害する。さらに他の実施形態では、抗体はまた、ヒトCXCR4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走を、好ましくは50nM以下、または30nM以下、または20nM以下、または15nM以下(例えば、18.99nM以下、または12.44nM以下)の阻害に対するEC50で阻害する。さらに他の実施形態では、抗体はまた、HuVECによる毛細管形成を阻害し、CXCR4を発現する細胞のアポトーシスを誘発し、インビトロで腫瘍細胞増殖を阻害し、インビボで腫瘍細胞増殖を阻害するかまたは腫瘍細胞のアポトーシスを誘発し、CXCR4+腫瘍細胞転移を阻害し、および/またはCXCR4+腫瘍を担持する対象の生存時間を増加させる。
好ましくは、抗体は、ヒトCXCR4に高親和性、例えば1×10−7M以下のKDまたは5×10−8M以下のKDで結合する。好ましくは、本開示の抗体は完全長抗体(すなわち可変および定常領域を含む)である。さらに、本開示の抗体は、好ましくは、宿主細胞上または人工膜内にその天然の立体構造で発現される完全長ヒトCXCR−4に対して産生される。
好ましい態様では、本開示は、単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで抗体は、
(a)細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合し、
(b)SDF−1のヒトCXCR4への結合を阻害し、
(c)ヒトCXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束を阻害し、
(d)ヒトCXCR4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走を阻害し、および
(e)ヒト臍静脈内皮細胞による毛細管形成を阻害する。
(a)細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合し、
(b)SDF−1のヒトCXCR4への結合を阻害し、
(c)ヒトCXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束を阻害し、
(d)ヒトCXCR4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走を阻害し、および
(e)ヒト臍静脈内皮細胞による毛細管形成を阻害する。
さらにより好ましくは、抗体はまた、ヒトCXCR4を発現する細胞のアポトーシスを誘発し、および/またはCXCR4+腫瘍細胞成長を阻害し、および/またはインビボで腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する。
別の態様では、本開示は、単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで抗体はCXCR4への結合に対して参照抗体と交差競合し、ここで参照抗体は、
(a)配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号29のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(b)配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(c)配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号31のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(d)配列番号28のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号32のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
(a)配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号29のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(b)配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(c)配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号31のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(d)配列番号28のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号32のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ヒトVH3−48遺伝子の産物であるかまたはそれから誘導される重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はヒトCXCR4に特異的に結合する。他の実施形態では、本開示は、ヒトVKL15遺伝子の産物であるかまたはそれから誘導される軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はヒトCXCR4に特異的に結合する。さらに他の実施形態では、本開示は、ヒトVH3−48遺伝子の産物であるかまたはそれから誘導される重鎖可変領域およびヒトVKL15遺伝子の産物であるかまたはそれから誘導される軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はヒトCXCR4に特異的に結合する。
別の態様では、本開示は、
CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域とCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここでは
(a)重鎖可変領域のCDR3配列は配列番号9〜12のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびにその保存的修飾を含み、
(b)軽鎖可変領域のCDR3配列は配列番号21〜24のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびにその保存的修飾を含み、
(c)抗体は細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合する。
CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域とCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここでは
(a)重鎖可変領域のCDR3配列は配列番号9〜12のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびにその保存的修飾を含み、
(b)軽鎖可変領域のCDR3配列は配列番号21〜24のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびにその保存的修飾を含み、
(c)抗体は細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合する。
好ましい実施形態では、本抗体はまた、SDF−1のCXCR4への結合を阻害し、CXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束を阻害し、CXCR−4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走を阻害し、HuVECによる毛細管形成を阻害し、(インビトロおよび/またはインビボで)CXCR4を発現する細胞内でのアポトーシスを誘発し、インビトロおよび/またはインビボでCXCR4+腫瘍細胞成長を阻害し、および/またはCXCR4+腫瘍細胞転移を阻害するといった特性のうちの1つ以上を有する。
好ましくは、重鎖可変領域CDR2配列は、配列番号5〜8のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のCDR2配列は、配列番号17〜20のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。好ましくは、重鎖可変領域のCDR1配列は、配列番号1〜4のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のCDR1配列は、配列番号13〜16のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。
好ましい組み合わせは、
(a)配列番号1を含む重鎖可変領域のCDR1
(b)配列番号5を含む重鎖可変領域のCDR2;
(c)配列番号9を含む重鎖可変領域のCDR3;
(d)配列番号13を含む軽鎖可変領域のCDR1;
(e)配列番号17を含む軽鎖可変領域のCDR2;および
(f)配列番号21を含む軽鎖可変領域のCDR3
を含む。
(a)配列番号1を含む重鎖可変領域のCDR1
(b)配列番号5を含む重鎖可変領域のCDR2;
(c)配列番号9を含む重鎖可変領域のCDR3;
(d)配列番号13を含む軽鎖可変領域のCDR1;
(e)配列番号17を含む軽鎖可変領域のCDR2;および
(f)配列番号21を含む軽鎖可変領域のCDR3
を含む。
別の好ましい組み合わせは、
(a)配列番号2を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号6を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号10を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号14を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号18を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号22を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む。
(a)配列番号2を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号6を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号10を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号14を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号18を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号22を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む。
別の好ましい組み合わせは、
(a)配列番号3を含む重鎖可変領域のCDR1;
(b)配列番号7を含む重鎖可変領域のCDR2;
(c)配列番号11を含む重鎖可変領域のCDR3;
(d)配列番号15を含む軽鎖可変領域のCDR1;
(e)配列番号19を含む軽鎖可変領域のCDR2;および
(f)配列番号23を含む軽鎖可変領域のCDR3
を含む。
(a)配列番号3を含む重鎖可変領域のCDR1;
(b)配列番号7を含む重鎖可変領域のCDR2;
(c)配列番号11を含む重鎖可変領域のCDR3;
(d)配列番号15を含む軽鎖可変領域のCDR1;
(e)配列番号19を含む軽鎖可変領域のCDR2;および
(f)配列番号23を含む軽鎖可変領域のCDR3
を含む。
別の好ましい組み合わせは、
(a)配列番号4を含む重鎖可変領域のCDR1;
(b)配列番号8を含む重鎖可変領域のCDR2;
(c)配列番号12を含む重鎖可変領域のCDR3;
(d)配列番号16を含む軽鎖可変領域のCDR1;
(e)配列番号20を含む軽鎖可変領域のCDR2;および
(f)配列番号24を含む軽鎖可変領域のCDR3
を含む。
(a)配列番号4を含む重鎖可変領域のCDR1;
(b)配列番号8を含む重鎖可変領域のCDR2;
(c)配列番号12を含む重鎖可変領域のCDR3;
(d)配列番号16を含む軽鎖可変領域のCDR1;
(e)配列番号20を含む軽鎖可変領域のCDR2;および
(f)配列番号24を含む軽鎖可変領域のCDR3
を含む。
本開示の他の好ましい抗体またはその抗原結合部分は、
(a)配列番号25〜28および41〜44からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号29〜32および45〜48からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み、ここで抗体はCXCR4に対して特異的に結合する。
(a)配列番号25〜28および41〜44からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号29〜32および45〜48からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み、ここで抗体はCXCR4に対して特異的に結合する。
好ましい組み合わせは、
(a)配列番号25または41のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号29または45のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
(a)配列番号25または41のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号29または45のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
別の好ましい組み合わせは、
(a)配列番号26または42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号30または46のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
(a)配列番号26または42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号30または46のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
別の好ましい組み合わせは、(a)配列番号27もしくは43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、(b)配列番号31もしくは47のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
別の好ましい組み合わせは、(a)配列番号28もしくは44のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、(b)配列番号32もしくは48のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
本開示の別の態様では、CXCR4への結合に対して上記抗体のいずれかと競合する抗体またはその抗原結合部分が提供される。
本開示の抗体は、例えばIgG1またはIgG4アイソタイプの例えば完全長抗体でありうる。あるいは、抗体は、抗体断片、例えばFab、Fab’またはFab’2断片、または一本鎖抗体でありうる。
本開示は、治療物質、例えば細胞毒素または放射性同位体に連結された本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体も提供する。本開示は、抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第2の機能部分に連結された本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む二重特異性分子も提供する。
本開示の抗体またはその抗原結合部分あるいは免疫複合体または二重特異性分子と医薬的に許容できる担体とを含む組成物も提供される。
本開示の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子、ならびにかかる核酸を含む発現ベクターおよびかかる発現ベクターを含む宿主細胞も本開示によって包含される。かかる発現ベクターを含む宿主細胞を用いて抗CXCR4抗体を調製するための方法も提供され、それは(i)宿主細胞内で抗体を発現するステップと、(ii)宿主細胞から抗体を単離するステップとを含みうる。
本開示の別の態様は細胞内でのCXCR4活性を調節する方法に関し、ここで細胞は本開示の抗体またはその抗原結合部分と接触される。細胞は、インビトロで細胞を抗体とともに培養することにより接触されうるか、または細胞はインビボで抗体を対象に投与することにより接触されうる。好ましい実施形態では、細胞はCXCR4を発現する腫瘍細胞であり、かつ本方法により腫瘍細胞成長の阻害および/または腫瘍細胞の転移の阻害がもたらされる。別の実施形態では、細胞はCXCR4を発現するT細胞であり、かつ本方法によりHIVの細胞への侵入の阻害がもたらされる。さらに別の実施形態では、細胞は炎症性障害におけるリンパ球であり、かつ本方法により炎症の阻害がもたらされる。さらに別の実施形態では、細胞は血管新生に関与し、かつ本方法により血管新生の調節がもたらされる。
別の態様では、本開示は、対象における骨髄から末梢血へのCD34+幹細胞の動員を刺激する方法であって、対象に本開示の抗体またはその抗原結合部分を骨髄から末梢血へのCD34+幹細胞の動員が刺激されるように投与するステップを含む、方法に関する。本方法は、例えば自家幹細胞移植での使用においては末梢血からCD34+幹細胞を回収するステップをさらに含みうる。
本開示の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および実施例から明白となり、それらは限定するものとして解釈されるべきではない。本願の全体を通じて言及されるあらゆる参考文献の内容、GenBank登録番号、特許および公開された特許出願は、参照により本明細書中に明示的に援用される。
本開示は、細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に特異的に結合する単離モノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体に関する。特定の実施形態では、本開示の抗体は、特定の重鎖および軽鎖生殖細胞系配列から誘導され、および/または特定のアミノ酸配列を含むCDR領域などの特定の構造的特徴を含む。本開示は、単離抗体、かかる抗体を作製する方法、かかる抗体を含む免疫複合体および二重特異性分子、ならびに本開示の抗体、免疫複合体または二重特異性分子を含有する医薬組成物を提供する。本開示は、抗体を用い、例えばCXCR4を検出するとともに、CXCR4の発現を伴うかまたはCXCR4/SDF−1経路を含む疾患または障害、例えば癌、腫瘍転移、HIV感染、炎症および血管新生におけるCXCR4活性を調節する方法にも関する。したがって、本開示は、本開示の抗CXCR4抗体を用い、癌を治療する、例えば、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、甲状腺癌、メラノーマ、鼻咽頭癌、腎細胞、リンパ腫、神経芽細胞腫、グリア芽腫、横紋筋肉腫、結腸直腸癌、腎臓癌、骨肉腫、急性リンパ芽球性白血病または急性骨髄性白血病などの癌を治療する方法も提供する。さらに、本開示は、本開示の抗CXCR4抗体を用いて腫瘍転移を阻害する方法を提供する。
定義
本開示がより容易に理解されうるように、最初に特定の用語が定義される。さらなる定義が詳細な説明を通じて示される。
本開示がより容易に理解されうるように、最初に特定の用語が定義される。さらなる定義が詳細な説明を通じて示される。
「CXCR4」という用語は、変異体、アイソフォーム、相同体、オーソログおよびパラログを含む。例えば、CXCR4に特異的な抗体は、特定の場合、ヒト以外の種由来のCXCR4と交差反応しうる。他の実施形態では、ヒトCXCR4に特異的な抗体は、ヒトCXCR4に完全に特異的でありうるとともに、交差反応の種または他のタイプを示す可能性はない。「ヒトCXCR4」という用語は、ヒト配列CXCR4、例えばGenbank登録番号P61073(配列番号51)を有するヒトCXCR4の完全なアミノ酸配列を示す。例えばLESTR、フシン(Fusin)またはCD184などのCXCR4も当該技術分野で既知である。ヒトCXCR4配列は、例えば保存された変異または非保存領域内の変異を有する点で配列番号51のヒトCXCR4と異なる場合があり、かつCXCR4は配列番号51のヒトCXCR4と実質的に同じ生物学的機能を有する。例えば、ヒトCXCR4の生物学的機能は、本開示の抗体により特異的に結合されたCXCR4の細胞外ドメイン内にエピトープを有することであるかまたはヒトCXCR4の生物学的機能は転移プロセスにおけるケモカインとの結合または関与である。
特定のヒトCXCR4配列は、一般にアミノ酸配列が配列番号51のヒトCXCR4と少なくとも90%同一であり、アミノ酸配列が他の種(例えばマウス)のCXCR4アミノ酸配列と比較される場合にヒトであることが同定されるアミノ酸残基を有する。特定の場合、ヒトCXCR4は、アミノ酸配列が配列番号51のCXCR4と少なくとも95%、またはさらに少なくとも96%、97%、98%、もしくは99%同一でありうる。特定の実施形態では、ヒトCXCR4配列は、配列番号51のCXCR4と10個以下のアミノ酸の違いを示す。特定の実施形態では、ヒトCXCR4は、配列番号51のCXCR4と5個以下、またはさらに4、3、2、もしくは1個以下のアミノ酸の違いを示すことになる。パーセント同一性は本明細書中に記載のように決定されうる。
「SDF−1」という用語は、CXCR4のリガンドである間質細胞由来因子1を示す。「SDF−1」という用語は、SDF−1の異なるアイソフォーム、例えばSDF−1αおよびSDF−1βを包含する。ヒトSDF−1αのアミノ酸配列は、Genbank登録番号NP_954637を有する。ヒトSDF−1βのアミノ酸配列は、Genbank登録番号NP_000600を有する。ヒトSDF−1は、米国特許第5,756,084号明細書にも記載されている。SDF−1はCXCL12としても既知である。ヒトSDF−1のアミノ酸配列は、CXCR4について本明細書中に記載のようにNP_954637またはNP_000600のSDF−1と異なる可能性がある。
「免疫応答」という用語は、侵入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合での正常なヒト細胞もしくは組織に対する選択的損傷、それらの破壊または人体からの除去をもたらす、例えば、(抗体、サイトカイン、および補体を含む)上記の細胞または肝臓によって生成されるリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および可溶性高分子の作用を示す。
「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達を担う種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を示す。本明細書で用いられる「細胞表面受容体」という語句は、例えばシグナルの受け取りおよび細胞の原形質膜を通過するかかるシグナルの伝達が可能な分子および分子の複合体を含む。本発明の「細胞表面受容体」の例として、CXCR4受容体が挙げられる。
本明細書で記載の「抗体」という用語は、全抗体および任意の抗原結合断片(すなわち「抗原結合部分」)またはその一本鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖またはその抗原結合部分を含む糖タンパク質を示す。各重鎖は重鎖可変領域(本明細書中でVHと略記)および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域はCH1、CH2およびCH3という3つのドメインからなる。各軽鎖は軽鎖可変領域(本明細書中でVLと略記)および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域はCLという1つのドメインからなる。VHおよびVL領域は、相補性決定領域(CDR)と称される超可変領域にさらに再分化され、フレームワーク領域(FR)と称されるより保存される領域が組み入れられうる。各VHおよびVLは3つのCDRおよび4つのFRからなり、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ配列される。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織または免疫系の様々な細胞(例えばエフェクター細胞)および古典的補体系の第1の成分(Clq)を含む因子への結合を媒介しうる。
本明細書で用いられる抗体の「抗原結合部分」(または単に「抗体部分」)という用語は、抗原(例えばCXCR4)に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つ以上の断片を示す。抗体の抗原結合機能が完全長抗体の断片により果たされうることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合断片の例として、(i)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価断片であるFab断片;(ii)ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結された2つのFab断片を含む二価断片であるF(ab’)2断片;(iii)本質的にヒンジ領域の一部を有するFabであるFab’断片(「基礎免疫学(FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY)」(ポール(Paul)編、第3版、1993年)を参照);(iv)VHおよびCH1ドメインからなるFd断片;(v)抗体の単一の腕のVLおよびVHドメインからなるFv断片、(vi)VHドメインからなるdAb断片(ワード(Ward)ら、(1989年)Nature 341:544−546頁);(vii)単離された相補性決定領域(CDR);ならびに(viii)1つの可変ドメインおよび2つの定常ドメインを有する重鎖可変領域であるナノボディ(nanobody)が挙げられる。さらに、Fv断片の2つのドメインのVLおよびVHが別々の遺伝子でコードされるが、VLおよびVH領域が、それらの一価分子を形成するように対をなす場合の単一のタンパク質鎖としての作製を可能にする合成リンカーによる組換え方法を用いて連結されうる(一本鎖Fv(scFv)として知られる;例えばバード(Bird)ら(1988年)Science 242:423−426頁、およびハストン(Huston)ら(1988年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879−5883頁を参照)。かかる一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含されるようにも意図されている。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技術を用いて得られ、断片における有用性が無傷抗体の場合と同様の方法でスクリーニングされる。
本明細書で用いられる「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を示すように意図されている(例えば、CXCR4に対して特異的に結合する単離抗体は、CXCR4以外の抗原に対して特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかし、CXCR4に対して特異的に結合する単離抗体は、他の抗原、例えば他の種由来のCXCR4分子に対する交差反応性を有しうる。さらに、単離抗体は、他の細胞材料および/または化学物質を実質的に含まない場合がある。
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一の分子組成物の抗体分子の調製物を示す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
本明細書で用いられる「ヒト抗体」という用語は、フレームワークおよびCDR領域の双方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から誘導される場合の可変領域を有する抗体を含むように意図されている。さらに、抗体が定常領域を有する場合、定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から誘導される。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされることのないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的な突然変異誘発またはインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異)を含みうる。しかし、本明細書で用いられる「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳類種、例えばマウスの生殖細胞系から誘導されたCDR配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている場合の抗体を含むように意図されていない。
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワークおよびCDR領域の双方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から誘導される場合の可変領域を有する単一の結合特異性を提示する抗体を示す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖トランス遺伝子および軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られるB細胞を含むハイブリドーマにより産生される。
本明細書で用いられる「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段により調製、発現、作製または単離されるすべてのヒト抗体、例えば(a)ヒト免疫グロブリン遺伝子におけるトランスジェニックまたはトランスクロモゾ−ム(transchromosomal)である動物(例えばマウス)あるいはそれから調製されるハイブリドーマから単離される抗体(さらに下記に記載)、(b)形質転換されることでヒト抗体を発現する宿主細胞、例えばトランスフェクトーマ(Transfectoma)から単離される抗体、(c)組換えられたコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離される抗体、および(d)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、作製または単離される抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、フレームワークおよびCDR領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から誘導される場合の可変領域を有する。しかし、特定の実施形態では、かかる組換えヒト抗体に対し、インビトロでの突然変異誘発(または、ヒトIg配列に対してトランスジェニックな動物が用いられる場合、インビボでの体細胞突然変異誘発)を実施可能であり、それ故、組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系VHおよびVL配列から誘導されかつそれらに関連する一方、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリーの範囲内に天然に存在することがない配列である。
本明細書で用いられる「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス(例えばIgMまたはIgGl)を示す。
「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」という語句は、本明細書中で「抗原に対して特異的に結合する抗体」という用語と同義的に用いられる。
「ヒト抗体誘導体」という用語は、ヒト抗体の任意の修飾形態、例えば抗体と別の作用物質または抗体との複合体を示す。
「ヒト化抗体」という用語は、別の哺乳類種、例えばマウスの生殖細胞系から誘導されるCDR配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている場合の抗体を示すように意図されている。さらなるフレームワーク領域の修飾がヒトフレームワーク配列内でなされうる。
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が1種から誘導されかつ定常領域配列が別種から誘導される場合の抗体、例えば可変領域配列がマウス抗体から誘導されかつ定常領域配列がヒト抗体から誘導される場合の抗体を示すように意図されている。
本明細書で用いられる「ヒトCXCR4に特異的に結合する」抗体は、ヒトCXCR4(および場合により1つ以上の非ヒト種に由来するCXCR4)に結合するが、非CXCR4タンパク質に実質的に結合することがない抗体を示すように意図されている。特定の実施形態では、本開示の抗体は配列番号51のヒトCXCR4またはその変異体に特異的に結合する。好ましくは、抗体は1×10−7M以下、より好ましくは5×10−8M以下、より好ましくは3×10−8M以下、より好ましくは1×10−8M以下、さらにより好ましくは5×10−9M以下のKDでヒトCXCR4に結合する。
本明細書で用いられる、タンパク質または細胞に「実質的に結合することのない」という用語は、タンパク質または細胞に高親和性で結合することのない、すなわちタンパク質または細胞に1×10−6M以上、より好ましくは1×10−5M以上、より好ましくは1×10−4M以上、より好ましくは1×10−3M以上、さらにより好ましくは1×10−2M以上のKDで結合することを示す。
本明細書で用いられる「Kassoc」または「Ka」という用語は特定の抗体−抗原相互作用の結合速度を示すように意図されている一方、本明細書で用いられる「Kdis」または「Kd」という用語は特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を示すように意図されている。本明細書で用いられる「KD」という用語は解離定数を示すように意図されており、それはKd対Kaの比(すなわちKd/Ka)から得られ、かつモル濃度(M)として表現されるものである。抗体におけるKD値は、当該技術分野で十分に確立された方法を用いて決定可能である。抗体のKDを決定するための好ましい方法は、表面プラスモン共鳴、好ましくはビアコア(Biacore)(登録商標)システムなどのバイオセンサーシステムの利用によるものである。
本明細書で用いられるIgG抗体における「高親和性」という用語は、標的抗原に対して1×10−7M以下、より好ましくは5×10−8M以下、さらにより好ましくは1×10−8M以下、さらにより好ましくは5×10−9M以下およびさらにより好ましくは1×10−9M以下のKDを有する抗体を示す。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに応じて変化しうる。例えば、IgMアイソタイプに対する「高親和性」結合は、10−6M以下、より好ましくは10−7M以下、さらにより好ましくは10−8M以下のKDを有する抗体を示す。
本明細書で用いられる「対象」という用語は任意のヒトまたは非ヒト動物を示す。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
本開示の様々な態様は、以下のサブセクションでさらに詳述される。
抗CXCR4抗体
本開示の抗体は、抗体の特定の機能特徴または特性により特徴づけられる。例えば、この抗体は細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合する。好ましくは、本開示の抗体は、高親和性、例えば1×10−7M以下のKDでCXCR4に結合する。本開示の抗CXCR4抗体は、好ましくは、
(a)細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合する、
(b)SDF−1のCXCR4への結合を阻害する、
(c)CXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束を阻害する、
(d)CXCR4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走を阻害する、
(e)ヒト臍静脈内皮細胞による毛細管形成を阻害する、
(f)ヒトCXCR4に1×10−7M以下のKDで結合する、
(g)CXCR4を発現する細胞内でのアポトーシスを誘発する、
(h)インビトロで腫瘍細胞増殖を阻害する、
(i)インビボで腫瘍細胞増殖を阻害する、および/または腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する、
(j)CXCR4+腫瘍細胞の転移を阻害する;および/または
(k)CXCR4+腫瘍を担持する対象の生存時間を増加させる、
といった特徴のうちの1つ以上を示す。
本開示の抗体は、抗体の特定の機能特徴または特性により特徴づけられる。例えば、この抗体は細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合する。好ましくは、本開示の抗体は、高親和性、例えば1×10−7M以下のKDでCXCR4に結合する。本開示の抗CXCR4抗体は、好ましくは、
(a)細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合する、
(b)SDF−1のCXCR4への結合を阻害する、
(c)CXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束を阻害する、
(d)CXCR4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走を阻害する、
(e)ヒト臍静脈内皮細胞による毛細管形成を阻害する、
(f)ヒトCXCR4に1×10−7M以下のKDで結合する、
(g)CXCR4を発現する細胞内でのアポトーシスを誘発する、
(h)インビトロで腫瘍細胞増殖を阻害する、
(i)インビボで腫瘍細胞増殖を阻害する、および/または腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する、
(j)CXCR4+腫瘍細胞の転移を阻害する;および/または
(k)CXCR4+腫瘍を担持する対象の生存時間を増加させる、
といった特徴のうちの1つ以上を示す。
特定の実施形態では、本開示の抗体は、細胞表面上で天然ヒトCXCR4に結合するが、SDF−1のCXCR4への結合を阻害することがなく、かつCXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束を阻害することがなく、かつCXCR4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走を阻害することがない。他の実施形態では、本開示の抗体は、細胞表面上で天然ヒトCXCR4に結合し、SDF−1のCXCR4への結合を阻害し、かつCXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束を阻害するが、CXCR4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走を阻害することがない。さらに他の実施形態では、本開示の抗体は、細胞表面上で天然ヒトCXCR4に結合し、かつSDF−1のCXCR4への結合を阻害し、かつCXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束を阻害し、かつCXCR4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走を阻害する。さらに他の実施形態では、本開示の抗体は、細胞表面上で天然ヒトCXCR4に結合し、SDF−1のCXCR4への結合を阻害し、CXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束を阻害し、CXCR4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走を阻害し、かつHuVECによる毛細管形成を阻害する。
好ましくは、本開示の抗体は、ヒトCXCR4に5×10−8M以下のKDで結合するか、ヒトCXCR4に2×10−8M以下のKDで結合するか、ヒトCXCR4に5×10−9M以下のKDで結合するか、ヒトCXCR4に4×10−9M以下のKDで結合するか、ヒトCXCR4に3×10−9M以下のKDで結合するか、またはヒトCXCR4に2×10−9M以下のKDで結合する。
好ましくは、本開示の抗体は、SDF−1のヒトCXCR4への結合を、50nM以下、より好ましくは30nM以下、または15nM以下、または10nM以下、または5nM以下、または3nM以下の阻害に対するEC50(例えば、28.60nM以下、または12.51nM以下、または2.256nM以下の阻害に対するEC50)で阻害する。
好ましくは、本開示の抗体は、ヒトCXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束を、3nM以下、より好ましくは2nM以下、または1nM以下、または0.9nM以下、または0.8nM以下、または0.7nM以下、または0.6nM以下、または0.5nM以下、または0.4nM以下(例えば、0.9046nM以下、0.5684nM以下、または0.3219nM以下)の阻害に対するEC50で阻害する。
好ましくは、本開示の抗体は、ヒトCXCR4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走を、50nM以下、より好ましくは30nM以下、または20nM以下、または15nM以下(例えば、18.99nM以下、または12.44nM以下)の阻害に対するEC50で阻害する。
細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に対する抗体の結合能を評価するための標準アッセイは、当該技術分野で既知であり、例えば天然CXCR4を天然に発現するかまたは形質移入により天然CXCR4を発現している細胞系を用いるフローサイトメトリー分析を含む。適切なアッセイについては実施例に詳述される。天然CXCR4を発現する好ましい細胞系はCEM T細胞系である。SDF−1の結合の阻害、SDF−1誘発性のカルシウム流束の阻害、SDF−1誘発性の細胞遊走の阻害、HuVECによる毛細管形成の阻害、インビトロおよび/またはインビボでのCXCR4を発現する細胞内でのアポトーシスの誘発、インビトロおよび/またはインビボでのCXCR4+腫瘍細胞の成長の阻害、および/またはCXCR4+腫瘍細胞の転移の阻害の評価に適するアッセイについても実施例に詳述される。また抗体の結合親和性は、標準の方法、例えばスカッチャード(Scatchard)分析により決定されうる。
モノクローナル抗体F7、F9、D1およびE2
本開示の好ましい抗体は、実施例1および2で記載のように単離されかつ構造的に特徴づけられるヒトモノクローナル抗体F7、F9、D1およびE2である。F7、F9、D1およびE2のVHアミノ酸配列は、それぞれ配列番号25、26、27および28で示される。F7、F9、D1およびE2のVLアミノ酸配列は、それぞれ配列番号29、30、31および32で示される。さらに、特定のフレームワーク残基が生殖細胞系残基で置換された、F7、F9、D1およびE2の他の形態が作製されたが、それらは本明細書中でF7GL、F9GL、D1GLおよびE2GLと称される。F7GL、F9GL、D1GLおよびE2GLのVHアミノ酸配列は、それぞれ配列番号41、42、43および44で示される。F7GL、F9GL、D1GLおよびE2GLのVLアミノ酸配列は、それぞれ配列番号45、46、47および48で示される。
本開示の好ましい抗体は、実施例1および2で記載のように単離されかつ構造的に特徴づけられるヒトモノクローナル抗体F7、F9、D1およびE2である。F7、F9、D1およびE2のVHアミノ酸配列は、それぞれ配列番号25、26、27および28で示される。F7、F9、D1およびE2のVLアミノ酸配列は、それぞれ配列番号29、30、31および32で示される。さらに、特定のフレームワーク残基が生殖細胞系残基で置換された、F7、F9、D1およびE2の他の形態が作製されたが、それらは本明細書中でF7GL、F9GL、D1GLおよびE2GLと称される。F7GL、F9GL、D1GLおよびE2GLのVHアミノ酸配列は、それぞれ配列番号41、42、43および44で示される。F7GL、F9GL、D1GLおよびE2GLのVLアミノ酸配列は、それぞれ配列番号45、46、47および48で示される。
これらの各抗体がCXCR4に結合しうると仮定すると、VHおよびVL配列が「混合されて一致する」ことで本開示の他の抗CXCR4結合分子の作製が可能である。かかる「混合されて一致する」抗体のCXCR4への結合については、上記や実施例における結合アッセイ(例えばCEM細胞でのフローサイトメトリー)を用いて試験可能である。好ましくは、VHおよびVL鎖が混合されて一致する場合、特定のVH/VL対からのVH配列が構造的に類似のVH配列と置換される。同様に、好ましくは特定のVH/VL対からのVL配列は構造的に類似のVL配列と置換される。
したがって、一態様では、本開示は、
(a)配列番号25〜28および41〜44からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号29〜32および45〜48からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はCXCR4、好ましくはヒトCXCR4に対して特異的に結合する。
(a)配列番号25〜28および41〜44からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号29〜32および45〜48からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はCXCR4、好ましくはヒトCXCR4に対して特異的に結合する。
好ましい重鎖および軽鎖の組み合わせは、
(a)配列番号25または41のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号29または45のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(b)配列番号26または42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号30または46のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(c)配列番号27または43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号31または47のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(d)配列番号28または44のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号32または48のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
(a)配列番号25または41のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号29または45のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(b)配列番号26または42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号30または46のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(c)配列番号27または43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号31または47のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(d)配列番号28または44のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号32または48のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
別の態様では、本開示は、F7、F9、D1またはE2の重鎖および軽鎖のCDR1、CDR2およびCDR3またはそれらの組み合わせを含む抗体を提供する。F7、F9、D1およびE2のVHCDR1のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号1〜4で示される。F7、F9、D1およびE2のVHCDR2のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号5〜8で示される。F7、F9、D1およびE2のVHCDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号9〜12で示される。F7、F9、D1およびE2のVKCDR1のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号13〜16で示される。F7、F9、D1およびE2のVKCDR2のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号17〜20で示される。F7、F9、D1およびE2のVKCDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号21〜24で示される。CDR領域は、カバト(Kabat)システム(カバト E.A.(Kabat E.A.)ら(1991年)「免疫学的利益に関するタンパク質配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)(第5版)」、米国保健福祉省(U.S.Department of Health and Human Services)、NIH Publication No.91−3242)を用いて図示される。
これらの各抗体がCXCR4に結合可能でありかつ抗原結合特異性が主にCDR1、CDR2、およびCDR3領域により提供されると仮定すると、VHCDR1、CDR2、およびCDR3配列とVKCDR1、CDR2、およびCDR3配列が「混合されて一致する」(すなわち、各抗体がVHCDR1、CDR2、およびCDR3とVKCDR1、CDR2、およびCDR3を有する必要があるが、異なる抗体由来のCDRが混合されて一致する)ことで、本開示の他の抗CXCR4結合分子の作製が可能である。かかる「混合されて一致する」抗体のCXCR4への結合は、上記や実施例に記載の結合アッセイ(例えば、ELISA、ビアコア(Biacore)(登録商標)分析)を用いて試験可能である。好ましくは、VHCDR配列が混合されて一致する場合、特定のVH配列由来のCDR1、CDR2および/またはCDR3配列は構造的に類似のCDR配列と置換される。同様に、VKCDR配列が混合されて一致する場合、特定のVK配列由来のCDR1、CDR2および/またはCDR3配列は、好ましくは構造的に類似のCDR配列と置換される。新規のVHおよびVL配列の作製が、1つ以上のVHおよび/またはVLCDR領域配列をモノクローナル抗体F7、F9、D1およびE2における本明細書中に開示されるCDR配列由来の構造的に類似の配列と置換することにより可能であることは当業者に容易に理解されるであろう。
したがって、別の態様では、本開示は、
(a)配列番号1〜4からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のCDR1;
(b)配列番号5〜8からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のCDR2;
(c)配列番号9〜12からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のCDR3;
(d)配列番号13〜16からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のCDR1;
(e)配列番号17〜20からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のCDR2;および
(f)配列番号21〜24からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のCDR3;
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はCXCR4、好ましくはヒトCXCR4に対して特異的に結合する。
(a)配列番号1〜4からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のCDR1;
(b)配列番号5〜8からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のCDR2;
(c)配列番号9〜12からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のCDR3;
(d)配列番号13〜16からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のCDR1;
(e)配列番号17〜20からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のCDR2;および
(f)配列番号21〜24からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のCDR3;
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はCXCR4、好ましくはヒトCXCR4に対して特異的に結合する。
好ましい実施形態では、抗体は、
(a)配列番号1を含む重鎖可変領域のCDR1;
(b)配列番号5を含む重鎖可変領域のCDR2;
(c)配列番号9を含む重鎖可変領域のCDR3;
(d)配列番号13を含む軽鎖可変領域のCDR1;
(e)配列番号17を含む軽鎖可変領域のCDR2;および
(f)配列番号21を含む軽鎖可変領域のCDR3
を含む。
(a)配列番号1を含む重鎖可変領域のCDR1;
(b)配列番号5を含む重鎖可変領域のCDR2;
(c)配列番号9を含む重鎖可変領域のCDR3;
(d)配列番号13を含む軽鎖可変領域のCDR1;
(e)配列番号17を含む軽鎖可変領域のCDR2;および
(f)配列番号21を含む軽鎖可変領域のCDR3
を含む。
別の好ましい実施形態では、抗体は、
(a)配列番号2を含む重鎖可変領域のCDR1;
(b)配列番号6を含む重鎖可変領域のCDR2;
(c)配列番号10を含む重鎖可変領域のCDR3;
(d)配列番号14を含む軽鎖可変領域のCDR1;
(e)配列番号18を含む軽鎖可変領域のCDR2;および
(f)配列番号22を含む軽鎖可変領域のCDR3
を含む。
(a)配列番号2を含む重鎖可変領域のCDR1;
(b)配列番号6を含む重鎖可変領域のCDR2;
(c)配列番号10を含む重鎖可変領域のCDR3;
(d)配列番号14を含む軽鎖可変領域のCDR1;
(e)配列番号18を含む軽鎖可変領域のCDR2;および
(f)配列番号22を含む軽鎖可変領域のCDR3
を含む。
別の好ましい実施形態では、抗体は、
(a)配列番号3を含む重鎖可変領域のCDR1;
(b)配列番号7を含む重鎖可変領域のCDR2;
(c)配列番号11を含む重鎖可変領域のCDR3;
(d)配列番号15を含む軽鎖可変領域のCDR1;
(e)配列番号19を含む軽鎖可変領域のCDR2;および
(f)配列番号23を含む軽鎖可変領域のCDR3
を含む。
(a)配列番号3を含む重鎖可変領域のCDR1;
(b)配列番号7を含む重鎖可変領域のCDR2;
(c)配列番号11を含む重鎖可変領域のCDR3;
(d)配列番号15を含む軽鎖可変領域のCDR1;
(e)配列番号19を含む軽鎖可変領域のCDR2;および
(f)配列番号23を含む軽鎖可変領域のCDR3
を含む。
別の好ましい実施形態では、抗体は、
(a)配列番号4を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号8を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号12を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号16を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号20を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号24を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む。
(a)配列番号4を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号8を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号12を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号16を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号20を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号24を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む。
CDR1および/またはCDR2ドメインから独立したCDR3ドメインが単独で抗体の同族抗原に対する結合特異性を決定しうることと、共通のCDR3配列に基づく同じ結合特異性を有する複数の抗体が予測どおりに産生されうることは、当該技術分野で周知である。例えば、(マウス抗CD30抗体Ki−4の重鎖可変ドメインCDR3のみを用いるヒト化抗CD30抗体の産生について記載する)クリムカ(Klimka)ら、British J.of Cancer 83(2):252−260頁(2000年);(親マウスMOC−31抗EGP−2抗体の重鎖CDR3配列のみを用いる組換え上皮糖タンパク質−2(EGP−2)抗体について記載する)ベイボアー(Beiboer)ら、J.Mol.Biol.296:833−849頁(2000年);(マウス抗インテグリンαvβ3抗体LM609の重鎖および軽鎖可変CDR3ドメインを用いる一群のヒト化抗インテグリンαvβ3抗体においては、各メンバー抗体は、CDR3ドメイン外部の異なる配列を含み、親マウス抗体と同じエピトープに親マウス抗体と同程度に高いまたはそれより高い親和性で結合可能である点について記載する)レイダー(Rader)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:8910−8915頁(1998年);(CDR3ドメインが抗原結合に対して最も有意な寄与をもたらす点を開示する)バーバス(Barbas)ら、J.Am.Chem.Soc.116:2161−2162頁(1994年);(ヒト胎盤DNAに対する3つのFab(SI−1、SI−40、およびSI−32)の重鎖CDR3配列の抗破傷風トキソイドFabの重鎖上への移植により既存の重鎖CDR3が置換される点を記載し、CDR3ドメインが単独で結合特異性を与えた点について示している)バーバス(Barbas)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:2529−2533頁(1995年);(単一特異性IgG破傷風トキソイドに結合するFab p313抗体の重鎖に対する親多重特異性Fab LNA3の重鎖CDR3のみの転移が親Fabの結合特異性を保持するのに十分であったという移植試験について記載する)ディッツェル(Ditzel)ら、J.Immunol.157:739−749頁(1996年)を参照のこと。(抗HER2モノクローナル抗体のCDR3に基づくペプチドミメティクスについて記載する)ベレゾフ(Berezov)ら、BIAjournal 8:Scientific Review 8(2001年);(抗ホスファチジルセリン抗体のCDR3ドメインに対応する12個のアミノ酸合成ポリペプチドについて記載する)五十嵐(Igarashi)ら、J.Biochem(Tokyo)117:452−7頁(1995年);(抗呼吸器合胞体ウイルス(RSV)抗体の重鎖CDR3ドメインから誘導される単一のペプチドがインビトロでウイルスを中和可能であることを示す)ブルジョア(Bourgeois)ら、J.Virol 72:807−10頁(1998年);(マウス抗HIV抗体の重鎖CDR3ドメインに基づくペプチドについて記載する)レビ(Levi)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:4374−8頁(1993年);(scFvの結合をZ−DNA結合抗体の重鎖CDR3領域の移植により可能にすることについて記載する)ポリメニス(Polymenis)およびストーラー(Stoller)、J.Immunol.152:5218−5329頁(1994年);ならびに(重鎖CDR3での多様性が通常では同一のIgM分子における種々のハプテンとタンパク質抗原との識別を可能にするのに十分であることについて記載する)シュー(Xu)およびデイビス(Davis)、Immunity 13:37−45頁(2000年)。さらに、単一のCDRドメインによって定義される特許化された抗体について記載する米国特許第6,951,646号明細書;米国特許第6,914,128号明細書;米国特許第6,090,382号明細書;米国特許第6,818,216号明細書;米国特許第6,156,313号明細書;米国特許第6,827,925号明細書;米国特許第5,833,943号明細書;米国特許第5,762,905号明細書および米国特許第5,760,185号明細書を参照のこと。これらの各参考文献はその全体が参照により本明細書中に援用される。
したがって、本開示は、ヒトまたは非ヒト動物から誘導される抗体由来の1つ以上の重鎖および/または軽鎖CDR3ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここでモノクローナル抗体はCXCR4に特異的に結合可能である。特定の態様の範囲内で、本開示は、非ヒト抗体、例えばマウスまたはラット抗体に由来する1つ以上の重鎖および/または軽鎖CDR3ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここでモノクローナル抗体はCXCR4に特異的に結合可能である。一部の実施形態の範囲内で、非ヒト抗体由来の1つ以上の重鎖および/または軽鎖CDR3ドメインを含む本発明の抗体は、(a)結合に対して競合可能であり、(b)機能特性を保持し、(c)同じエピトープに結合し、および/または(d)対応する親非ヒト抗体と類似の結合親和性を有する。
他の態様の範囲内で、本開示は、例えば非ヒト動物から得られるヒト抗体などのヒト抗体由来の1つ以上の重鎖および/または軽鎖CDR3ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここでヒト抗体はCXCR4に特異的に結合可能である。他の態様の範囲内で、本開示は、例えば非ヒト動物から得られるヒト抗体などの第1のヒト抗体由来の1つ以上の重鎖および/または軽鎖CDR3ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここで第1のヒト抗体はCXCR4に特異的に結合可能であり、かつ第1のヒト抗体由来のCDR3ドメインはCXCR4への結合特異性が欠如したヒト抗体内のCDR3ドメインを置き換えることでCXCR4に特異的に結合可能な第2のヒト抗体が産生される。一部の実施形態の範囲内で、第1のヒト抗体由来の1つ以上の重鎖および/または軽鎖のCDR3ドメインを含む本発明の抗体は、(a)結合に対して競合可能であり、(b)機能特性を保持し、(c)同じエピトープに結合し、および/または(d)対応する第1の親ヒト抗体と類似の結合親和性を有する。
特定の生殖細胞系配列を有する抗体
特定の実施形態では、本開示の抗体は、特定の生殖細胞系重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および/または特定の生殖細胞系軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。
特定の実施形態では、本開示の抗体は、特定の生殖細胞系重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および/または特定の生殖細胞系軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。
例えば、好ましい実施形態では、本開示は、ヒトVH3−48遺伝子の産物であるかまたはそれから誘導される重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はCXCR4に特異的に結合する。別の好ましい実施形態では、本開示は、ヒトVKL15遺伝子の産物であるかまたはそれから誘導される軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はCXCR4に特異的に結合する。さらに別の好ましい実施形態では、本開示は、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はヒトVH3−48遺伝子の産物であるかまたはそれから誘導される重鎖可変領域を含みかつヒトVKL15遺伝子の産物であるかまたはそれから誘導される軽鎖可変領域を含み、ここで抗体はCXCR4、好ましくはヒトCXCR4に特異的に結合する。かかる抗体は、上で詳述の機能特性、例えば細胞表面上に発現される天然CXCR4への結合、SDF−1のCXCR4への結合の阻害、CXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束の阻害、CXCR4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走の阻害、HuVECによる毛細管形成の阻害、インビトロおよび/またはインビボでのCXCR4を発現する細胞内でのアポトーシスの誘発、インビトロおよび/またはインビボでのCXCR4+腫瘍細胞の成長の阻害、および/またはCXCR4+腫瘍細胞の転移の阻害のうちの1つ以上も有しうる。
VH3−48のVHおよびVKL15のVKを有する抗体の例がF7、F9、D1およびE2抗体である。
本明細書で用いられるヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られる場合、特定の生殖細胞系配列「の産物」であるかまたはそれ「から誘導される」重鎖または軽鎖可変領域を含む。かかる系は、目的の抗原とともにヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを免疫するステップまたは目的の抗原とともにファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリをスクリーニングするステップを含む。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「から誘導される」ヒト抗体が、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、配列においてヒト抗体の配列に対して最も近い(すなわち最大の%同一性がある)ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を選択することにより、かかるものとして同定されうる。特定のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「から誘導される」ヒト抗体は、例えば自然発生的体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的導入に起因し、生殖細胞系配列と比べてアミノ酸の差を有しうる。しかし、選択されたヒト抗体は、典型的にはアミノ酸配列においてヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一であり、かつ、ヒト抗体が他種の生殖細胞系免疫グロブリンアミノ酸配列(例えばマウス生殖細胞系配列)と比較される場合にヒトであるものと同定されるアミノ酸残基を有する。特定の場合、ヒト抗体は、アミノ酸配列において生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも95%またはさらに少なくとも96%、97%、98%もしくは99%同一でありうる。典型的には、特定のヒト生殖細胞系配列から誘導されるヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列とは10個以下のアミノ酸の差を示すことになる。特定の場合、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列とは5個以下またはさらには4、3、2もしくは1個以下のアミノ酸の差を示しうる。
相同抗体
さらに別の実施形態では、本開示の抗体は、本明細書中に記載の好ましい抗体のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで抗体は本開示の抗CXCR4抗体の所望の機能特性を保持する。
さらに別の実施形態では、本開示の抗体は、本明細書中に記載の好ましい抗体のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで抗体は本開示の抗CXCR4抗体の所望の機能特性を保持する。
例えば、本開示は、
(a)重鎖可変領域は配列番号25〜28および41〜44からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%相同なアミノ酸配列を含み、
(b)軽鎖可変領域は配列番号29〜32および45〜48からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%相同なアミノ酸配列を含み
(c)抗体は細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合する、
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
(a)重鎖可変領域は配列番号25〜28および41〜44からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%相同なアミノ酸配列を含み、
(b)軽鎖可変領域は配列番号29〜32および45〜48からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%相同なアミノ酸配列を含み
(c)抗体は細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合する、
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
さらにまたはその他として、抗体は、(i)ヒトCXCR4に1×10−7M以下のKDで結合し、(ii)SDF−1のCXCR4への結合を阻害し、(iii)CXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束を阻害し、(iv)CXCR4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走を阻害し、(v)HuVECによる毛細管形成を阻害し、(vi)インビトロおよび/またはインビボでCXCR4を発現する細胞内でのアポトーシスを誘発し、(vii)インビトロおよび/またはインビボでCXCR4+腫瘍細胞の成長を阻害し、および/または(viii)CXCR4+腫瘍細胞の転移を阻害するといった機能特性のうちの1つ以上を有しうる。
様々な実施形態では、抗体は、例えばヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体でありうる。
他の実施形態では、VHおよび/またはVLアミノ酸配列は、上で示される配列に85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%相同でありうる。上で示される配列のVHおよびVL領域に対して高い(すなわち80%以上の)相同性を有するVHおよびVL領域を有する抗体が、配列番号25〜32または41〜48をコードする核酸分子の突然変異誘発(例えば、部位特異的またはPCR媒介性突然変異誘発)と、その後の本明細書中に記載の機能アッセイを用いてのコードされた改変抗体の保持された機能(すなわち上記に示される機能)についての試験により得られうる。
本明細書で用いられる2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、2つの配列間のパーセント同一性に相当する。2つの配列間のパーセント同一性は、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列で共有される同一位置の数の関数(すなわち%相同性=同一位置の数/位置の全体数×100)であり、2つの配列の最適なアラインメントにおいて導入される必要がある。配列の比較および2つの配列間のパーセント同一性の決定は、下記の非限定例にて記載のように数学的アルゴリズムを用いて行われうる。
2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、E.メイヤーズ(E.Meyers)およびW.ミラー(W.Miller)のアルゴリズム(Comput.Appl.Biosci.、4:11−17頁(1988年))を用いて決定可能であり、同アルゴリズムはPAM120重み残基テーブル(weight residue table)、12のギャップ長ペナルティ(Gap length penalty)および4のギャップペナルティを用いてALIGNプログラム(バージョン2.0)に導入されている。さらに、2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ニードルマン(Needleman)およびヴンシュ(Wunsch)(J.Mol.Biol.48:444−453頁(1970年))アルゴリズムを用いて決定可能であり、同アルゴリズムはブロッサム(Blossum)62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれかと、16、14、12、10、8、6もしくは4のギャップ重量および1、2、3、4、5もしくは6の長さ重量を用いてGCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで入手可能)内のGAPプログラム中に包含されている。
さらにまたはその他として、本開示のタンパク質配列をさらに「クエリー配列」として用い、公的データベースで探索を行い、例えば関連配列を同定することが可能である。かかる探索は、アルツシュル(Altschul)ら、(1990年)J.Mol.Biol.215:403−10頁のXBLASTプログラム(バージョン2.0)を用いて実行可能である。BLASTタンパク質の探索をXBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3を用いて行うことで、本開示の抗体分子に相同なアミノ酸配列が得られうる。比較目的でギャップドアラインメント(gapped alignments)を得るため、アルツシュル(Altschul)ら、(1997年)Nucleic Acids Res.25(17):3389−3402頁に記載のようにギャップドBLAST(Gapped BLAST)が用いられうる。BLASTおよびギャップドBLAST(Gapped BLAST)プログラムを用いる場合、各プログラムのデフォルトパラメータ(例えばXBLASTおよびNBLAST)が有用である。www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと。
保存的修飾を有する抗体
特定の実施形態では、本開示の抗体は、CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖可変領域およびCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここでこれらのCDR配列のうちの1つ以上は本明細書中に記載の好ましい抗体(例えば、F7、F9、D1またはE2)に基づく特定のアミノ酸配列またはその保存的修飾を含み、かつここで抗体は本開示の抗CXCR4抗体の所望の機能特性を保持する。抗原結合を除去することのない特定の保存的配列修飾の作製が可能であることは当該技術分野で理解されている。例えば、(サルモネラ(Salmonella)に特異的な抗体のCDR3重鎖ドメインにおける突然変異分析について記載する)ブルメル(Brummell)ら(1993年)Biochem 32:1180−8頁;(抗UA1抗体における突然変異試験について記載する)デ・ヴィルト(de Wildt)ら(1997年)Prot.Eng.10:835−41頁;(HCDR3の中央における変異が親和性の欠如または低下をもたらしたことを示す)コミッサロフ(Komissarov)ら(1997年)J.Biol.Chem.272:26864−26870頁;(CDR3領域内での単一のアミノ酸変化により結合活性が失われたことを記載する)ホール(Hall)ら(1992年)J.Immunol.149:1605−12頁;(抗原結合におけるTyr残基の寄与について記載する)ケリー(Kelley)およびオコンネル(O’Connell)(1993年)Biochem.32:6862−35頁;(結合における疎水性の効果について記載する)アディブ−コンキー(Adib−Conquy)ら(1998年)Int.Immunol.10:341−6頁;ならびに(HCDR3アミノ酸変異体について記載する)ビアズ(Beers)ら(2000年)Clin.Can.Res.6:2835−43頁を参照のこと。
特定の実施形態では、本開示の抗体は、CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖可変領域およびCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここでこれらのCDR配列のうちの1つ以上は本明細書中に記載の好ましい抗体(例えば、F7、F9、D1またはE2)に基づく特定のアミノ酸配列またはその保存的修飾を含み、かつここで抗体は本開示の抗CXCR4抗体の所望の機能特性を保持する。抗原結合を除去することのない特定の保存的配列修飾の作製が可能であることは当該技術分野で理解されている。例えば、(サルモネラ(Salmonella)に特異的な抗体のCDR3重鎖ドメインにおける突然変異分析について記載する)ブルメル(Brummell)ら(1993年)Biochem 32:1180−8頁;(抗UA1抗体における突然変異試験について記載する)デ・ヴィルト(de Wildt)ら(1997年)Prot.Eng.10:835−41頁;(HCDR3の中央における変異が親和性の欠如または低下をもたらしたことを示す)コミッサロフ(Komissarov)ら(1997年)J.Biol.Chem.272:26864−26870頁;(CDR3領域内での単一のアミノ酸変化により結合活性が失われたことを記載する)ホール(Hall)ら(1992年)J.Immunol.149:1605−12頁;(抗原結合におけるTyr残基の寄与について記載する)ケリー(Kelley)およびオコンネル(O’Connell)(1993年)Biochem.32:6862−35頁;(結合における疎水性の効果について記載する)アディブ−コンキー(Adib−Conquy)ら(1998年)Int.Immunol.10:341−6頁;ならびに(HCDR3アミノ酸変異体について記載する)ビアズ(Beers)ら(2000年)Clin.Can.Res.6:2835−43頁を参照のこと。
したがって、本開示は、CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域およびCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで
(a)重鎖可変領域のCDR3配列は、配列番号9〜12のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、
(b)軽鎖可変領域のCDR3配列は、配列番号21〜44のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ
(c)抗体は細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合する。
(a)重鎖可変領域のCDR3配列は、配列番号9〜12のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、
(b)軽鎖可変領域のCDR3配列は、配列番号21〜44のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ
(c)抗体は細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合する。
さらにまたはその他として、抗体は、(i)ヒトCXCR4に1×10−7M以下のKDで結合し、(ii)SDF−1のCXCR4への結合を阻害し、(iii)CXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束を阻害し、(iv)CXCR4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走を阻害し、(v)HuVECによる毛細管形成を阻害し、(vi)インビトロおよび/またはインビボでCXCR4を発現する細胞内でのアポトーシスを誘発し、(vii)インビトロおよび/またはインビボでCXCR4+腫瘍細胞の成長を阻害し、および/または(viii)CXCR4+腫瘍細胞の転移を阻害するといった機能特性のうちの1つ以上を有しうる。
好ましい実施形態では、重鎖可変領域のCDR2配列は、配列番号5〜8のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のCDR2配列は、配列番号17〜20からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。別の好ましい実施形態では、重鎖可変領域のCDR1配列は、配列番号1〜4のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のCDR1配列は、配列番号13〜16からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。
様々な実施形態では、抗体は、例えばヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体でありうる。
本明細書で用いられる「保存的配列修飾(conservative sequence modifications)」という用語は、アミノ酸配列を有する抗体の結合特性に対して有意に作用または改変することのないアミノ酸修飾を示すように意図されている。かかる保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、当該技術分野で既知の標準技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介性突然変異誘発により本開示の抗体に導入されうる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換される場合の置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーについては当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、β分岐側鎖を有するアミノ酸(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。したがって、本開示の抗体のCDR領域内の1つ以上のアミノ酸残基は同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置換可能であり、改変抗体は保持された機能(すなわち上記に示される機能)について本明細書中に記載の機能アッセイを用いて試験可能である。
抗CXCR4抗体と同じエピトープに結合する抗体
別の実施形態では、本開示は、本開示の抗CXCR4モノクローナル抗体のいずれかの場合と同じヒトCXCR4上のエピトープに結合する抗体(すなわちCXCR4への結合に対して本開示のモノクローナル抗体のいずれかと交差競合する能力を有する抗体)を提供する。好ましい実施形態では、交差競合試験における参照抗体は、モノクローナル抗体F7(VHおよびVL配列(各々、配列番号25および29で示される)を有する)またはモノクローナル抗体F9(VHおよびVL配列(各々、配列番号26および30で示される)を有する)またはモノクローナル抗体D1(VHおよびVL配列(各々、配列番号27および31で示される)を有する)またはモノクローナル抗体E2(VHおよびVL配列(各々、配列番号28および32で示される)を有する)でありうる。
別の実施形態では、本開示は、本開示の抗CXCR4モノクローナル抗体のいずれかの場合と同じヒトCXCR4上のエピトープに結合する抗体(すなわちCXCR4への結合に対して本開示のモノクローナル抗体のいずれかと交差競合する能力を有する抗体)を提供する。好ましい実施形態では、交差競合試験における参照抗体は、モノクローナル抗体F7(VHおよびVL配列(各々、配列番号25および29で示される)を有する)またはモノクローナル抗体F9(VHおよびVL配列(各々、配列番号26および30で示される)を有する)またはモノクローナル抗体D1(VHおよびVL配列(各々、配列番号27および31で示される)を有する)またはモノクローナル抗体E2(VHおよびVL配列(各々、配列番号28および32で示される)を有する)でありうる。
かかる交差競合抗体は、標準のCXCR4結合アッセイで、F7、F9、D1またはE2と交差競合するその能力に基づいて同定されうる。例えば、CEM細胞でフローサイトメトリーを用いることで、本開示の抗体との交差競合の実証が可能であり、ここで参照抗体はFITCで標識され、試験抗体におけるFITCで標識された参照抗体のCEM細胞への結合に対する阻害能が評価される。試験抗体の、例えば、F7、F9、D1またはE2のヒトCXCR4への結合に対する阻害能は、試験抗体がヒトCXCR4への結合に対してF7、F9、D1またはE2と競合可能であり、それ故にF7、F9、D1またはE2の場合と同じヒトCXCR4上のエピトープに結合することを示す。好ましい実施形態では、F7、F9、D1またはE2の場合と同じCXCR4上のエピトープに結合する抗体はヒトモノクローナル抗体である。かかるヒトモノクローナル抗体は、実施例に記載のように調製され、単離されうる。
改変され修飾された抗体
さらに、本開示の抗体を出発原料として本明細書中に開示されるVHおよび/またはVL配列のうちの1つ以上を有する抗体を用いて調製し、修飾抗体を改変することが可能であり、ここで修飾抗体は最初の抗体からの改変された特性を有しうる。抗体は、一方もしくは両方の可変領域(すなわちVHおよび/またはVL)内、例えば1つ以上のCDR領域内および/または1つ以上のフレームワーク領域内での1つ以上の残基の修飾によって改変可能である。さらにまたはその他として、抗体は、例えば定常領域内で残基を修飾し、抗体のエフェクター機能を改変することによって改変可能である。
さらに、本開示の抗体を出発原料として本明細書中に開示されるVHおよび/またはVL配列のうちの1つ以上を有する抗体を用いて調製し、修飾抗体を改変することが可能であり、ここで修飾抗体は最初の抗体からの改変された特性を有しうる。抗体は、一方もしくは両方の可変領域(すなわちVHおよび/またはVL)内、例えば1つ以上のCDR領域内および/または1つ以上のフレームワーク領域内での1つ以上の残基の修飾によって改変可能である。さらにまたはその他として、抗体は、例えば定常領域内で残基を修飾し、抗体のエフェクター機能を改変することによって改変可能である。
特定の実施形態では、CDR移殖を用いて抗体の様々な領域を改変することが可能である。抗体は、6つの重鎖および軽鎖の相補性決定領域(CDR)内に位置するアミノ酸残基全体に支配的な標的抗原と相互作用する。この理由のため、CDR内のアミノ酸配列は、各抗体間でCDR外部の配列よりも多様である。CDR配列が大部分の抗体−抗原相互作用に関与することから、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列上に移植された特定の天然抗体由来のCDR配列を含む発現ベクターの作成により発現することは可能である(例えば、リーヒマン L.(Riechmann L.)ら(1998年)Nature 332:323−327頁;ジョーンズ P.(Jones P.)ら(1986年)Nature 321:522−525頁;クイーン C.(Queen C.)ら(1989年)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86:10029−10033頁;ウインター(Winter)に交付された米国特許第5,225,539号明細書ならびにクイーン(Queen)らに交付された米国特許第5,530,101号明細書;米国特許第5,585,089号明細書;米国特許第5,693,762号明細書および米国特許第6,180,370号明細書を参照)。
したがって、本開示の別の実施形態は、CDR1、CDR2、およびCDR3配列(各々、配列番号1〜4、配列番号5〜8、ならびに配列番号9〜12からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む)を含む重鎖可変領域と、CDR1、CDR2、およびCDR3配列(各々、配列番号13〜16、配列番号17〜20、ならびに配列番号21〜24からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む)を含む軽鎖可変領域とを含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。したがって、かかる抗体は、モノクローナル抗体F7、F9、D1またはE2のVHおよびVL CDR配列を有し、これらはさらにこれらの抗体由来の異なるフレームワーク配列を有しうる。
かかるフレームワーク配列は、生殖細胞系の抗体遺伝子配列を含む公的なDNAデータベースまたは出版された参考文献から得られうる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子における生殖細胞系DNA配列は、(インターネット上のwww.mrc−cpe.cam.ac.uk/vbaseで入手可能な)「Vベース(VBase)」ヒト生殖細胞系配列データベースや、カバト E.A.(Kabat E.A.)ら(1991年)「免疫学的利益に関するタンパク質配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)(第5版)」、米国保健福祉省(U.S.Department of Health and Human Services)、NIH Publication No.91−3242;トムリンソン I.M.(Tomlinson I.M.)ら(1992年)「The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with different Hypervariable Loops」J.Mol.Biol.227:776−798;ならびにコックス J.P.L.(Cox J.P.L.)ら(1994年)「A Directory of Human Germ−line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage」Eur.J.Immunol.24:827−836頁(これら各々の内容は参照により本明細書中に明示的に援用される)において見出されうる。別の例として、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子における生殖細胞系DNA配列は、Genbankデータベース内に見出されうる。例えば、HCo7 HuMAbマウス内で見出される以下の重鎖生殖細胞系配列は、付属のGenbank登録番号:1−69(NG_0010109、NT_024637およびBC070333)、3−33(NG_0010109およびNT_024637)ならびに3−7(NG_0010109およびNT_024637)にて入手可能である。別の例として、HCo12 HuMAbマウス内で見出される以下の重鎖生殖細胞系配列は、付属のGenbank登録番号:1−69(NG_0010109、NT_024637およびBC070333)、5−51(NG_0010109およびNT_024637)、4−34(NG_0010109およびNT_024637)、3−30.3(CAJ556644)ならびに3−23(AJ406678)にて入手可能である。ヒト重鎖および軽鎖生殖細胞系配列のさらに別の供給源は、IMGT(http://imgt.cines.fr)から利用可能なヒト免疫グロブリン遺伝子のデータベースである。
抗体タンパク質配列は、当業者に周知のギャップドBLAST(Gapped BLAST)と称される配列類似性を探索する方法(アルツシュル(Altschul)ら(1997年)Nucleic Acids Research 25:3389−3402頁)の1つを用いて集められたタンパク質配列データベースに対して比較される。BLASTは、抗体配列とデータベース配列の間での統計的に有意なアラインメントが整列されたワードの高スコアリングセグメント対(HSP)を有する傾向が高いという点でヒューリスティックアルゴリズムである。スコアが延長またはトリミングにより改善されえないセグメント対はヒットと称される。つまり、Vベース(VBASE)由来のヌクレオチド配列(http://vbase.mrc−cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php)が翻訳され、かつFR1〜FR3フレームワーク領域の間の領域および同領域を含む領域が保持される。データベース配列は平均98残基長を有する。タンパク質の全長にわたり正確に一致する二重配列が除去される。オフの低複雑性フィルタを除くデフォルトの標準パラメータおよびBLOSUM62の置換マトリックスを備えたblastpプログラムを用いるタンパク質におけるBLAST探索では、配列一致をもたらす上位5つのヒットがフィルタにかけられる。ヌクレオチド配列は全部で6つのフレームで翻訳され、データベース配列の一致するセグメント内に停止コドンを全く有しないフレームはヒットの可能性があると考えられる。次いで、これはBLASTプログラムtblastxを用いて確認され、これにより全部で6つのフレーム内で抗体配列が翻訳され、全部で6つのフレーム内で動的に翻訳されたVベース(VBASE)ヌクレオチド配列に対する翻訳が比較される。例えばIMGT(http://imgt.cines.fr)から利用可能な他のヒト生殖細胞系配列データベースでは、上記のVBASEと同様に検索可能である。
同一性は、抗体配列と配列の全長にわたるタンパク質データベースとの間の正確なアミノ酸の一致である。正(同一性+置換の一致)は同一ではなく、BLOSUM62置換行列によって導かれるアミノ酸置換である。抗体配列がデータベース配列のうちの2つと同じ同一性で一致する場合、大部分の正を伴うヒットであれば一致する配列ヒットであることが決定されることになる。
本開示の抗体で用いられる好ましいフレームワーク配列は、本開示の選択される抗体により用いられるフレームワーク配列、例えば本開示の好ましいモノクローナル抗体により用いられるVH3−48フレームワーク配列(配列番号49)および/またはVKL15フレームワーク配列(配列番号50)と構造的に類似する配列である。VHCDR1、CDR2、およびCDR3配列、ならびにVKCDR1、CDR2、およびCDR3配列はフレームワーク配列の元となる生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子内に見出される配列と同一の配列を有するフレームワーク領域上に移植されうるか、あるいはCDR配列は生殖細胞系配列と比べて1つ以上の突然変異を有するフレームワーク領域上に移植されうる。例えば、特定の例ではフレームワーク領域内の残基を突然変異させ、抗原の抗体への結合能を維持または促進することが有益であることが見出されている(例えば、クイーン(Queen)らに交付された米国特許第5,530,101号明細書;米国特許第5,585,089号明細書;米国特許第5,693,762号明細書および米国特許第6,180,370号明細書を参照)。
可変領域修飾の別のタイプは、アミノ酸残基をVHおよび/またはVKのCDR1、CDR2および/またはCDR3領域内で変異させ、それにより目的の抗体の1つ以上の結合特性(例えば親和性)を改善するものである。部位特異的突然変異誘発またはPCR媒介性突然変異誘発を行い、突然変異を導入可能であり、かつ、目的の抗体の結合または他の機能特性に対する効果が、本明細書中に記載されかつ実施例に提供されるインビトロまたはインビボアッセイにおいて評価されうる。好ましくは、(上で考察の)保存的修飾が導入される。突然変異は、アミノ酸の置換、付加または欠失でありうるが、好ましくは置換である。さらに典型的には、CDR領域内の1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つ以下の残基が改変される。
したがって、別の実施形態では、本開示は、(a)配列番号1〜4からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号1〜4と比べて1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むVHCDR1領域;(b)配列番号5〜8からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号5〜8と比べて1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むVHCDR2領域;(c)配列番号9〜12からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号9〜12と比べて1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むVHCDR3領域;(d)配列番号13〜16からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号13〜16と比べて1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むVKCDR1領域;(e)配列番号17〜20からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号17〜20と比べて1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むVKCDR2領域;ならびに(f)配列番号21〜24からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号21〜24と比べて1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むVKCDR3領域を含む重鎖可変領域を含む単離抗CXCR4モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
本開示の改変抗体は、例えば抗体の特性を改善するためにVHおよび/またはVK内のフレームワーク残基に修飾が施されている場合の抗体を含む。典型的には、かかるフレームワーク修飾を施すことで抗体の免疫原性が低下する。例えば、1つのアプローチは、1つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系配列に「復帰突然変異する(backmutate)」ことである。より詳細には、体細胞突然変異を経ている抗体は、抗体が誘導される生殖細胞系配列とは異なるフレームワーク残基を有しうる。かかる残基は、抗体フレームワーク配列を抗体が誘導される生殖細胞系配列と比較することにより同定されうる。
例えば、F7VH領域においては、(カバト(Kabat)番号付与システムを用いると)フレームワーク領域のアミノ酸位置1、6および25は生殖細胞系と異なる。これらの位置の1つ、2つもしくは3つ全部が、Q1E、Q6EおよびA25Sの置換のうちの1つ、2つもしくは3つ全部を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。F7VH領域の好ましい修飾形態は、F7GLVH(図5Aおよび配列番号41に示されるアミノ酸配列)であり、フレームワーク置換Q1EおよびQ6Eを有する。
さらに、F7VK領域においては、(カバト(Kabat)番号付与システムを用いると)フレームワーク領域のアミノ酸位置1、3および84は生殖細胞系と異なる。これらの位置の1つ、2つもしくは3つ全部が、A1D、R3QおよびV84Aの置換のうちの1つ、2つもしくは3つ全部を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。F7VK領域の好ましい修飾形態は、F7GLVK(図5Bおよび配列番号45に示されるアミノ酸配列)であり、A1DおよびR3Qのフレームワーク置換を有する。
さらに、F9VH領域においては、(カバト(Kabat)番号付与システムを用いると)フレームワーク領域のアミノ酸位置1、6および25は生殖細胞系と異なる。これらの位置の1つ、2つもしくは3つ全部が、Q1E、Q6EおよびA25Sの置換のうちの1つ、2つもしくは3つ全部を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。F9VH領域の好ましい修飾形態は、F9GLVH(図6Aおよび配列番号42に示されるアミノ酸配列)であり、Q1EおよびQ6Eのフレームワーク置換を有する。
さらに、F9VK領域においては、(カバト(Kabat)番号付与システムを用いると)フレームワーク領域のアミノ酸位置1、3、4および60は生殖細胞系と異なる。これらの位置の1つ、2つ、3つもしくは4つ全部が、E1D、V3Q、L4MおよびP60Sの置換のうちの1つ、2つ、3つもしくは4つ全部を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。F9VK領域の好ましい修飾形態は、F9GLVK(図6Bおよび配列番号46に示されるアミノ酸配列)であり、E1D、V3QおよびL4Mのフレームワーク置換を有する。
さらに、D1VH領域においては、(カバト(Kabat)番号付与システムを用いると)フレームワーク領域のアミノ酸位置6、25および76は生殖細胞系と異なる。これらの位置の1つ、2つもしくは3つ全部が、Q6E、A25SおよびR76Kの置換のうちの1つ、2つもしくは3つ全部を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。D1VH領域の好ましい修飾形態は、D1GLVH(図7Aおよび配列番号43に示されるアミノ酸配列)であり、Q6Eのフレームワーク置換を有する。
さらに、D1VK領域においては、(カバト(Kabat)番号付与システムを用いると)フレームワーク領域のアミノ酸位置1、3、4、45および46は生殖細胞系と異なる。これらの位置の1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つ全部が、V1D、W3Q、V4M、E45KおよびL46Sの置換のうちの1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つ全部を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。D1VK領域の好ましい修飾形態は、D1GLVK(図7Bおよび配列番号47に示されるアミノ酸配列)であり、V1D、W3QおよびV4Mのフレームワーク置換を有する。
さらに、E2VH領域においては、(カバト(Kabat)番号付与システムを用いると)フレームワーク領域のアミノ酸位置6および25は生殖細胞系と異なる。これらの位置の一方もしくは双方が、Q6EおよびA25Sの置換のうちの一方もしくは双方を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。E2VH領域の好ましい修飾形態は、E2GLVH(図8Aおよび配列番号44に示されるアミノ酸配列)であり、Q6Eのフレームワーク置換を有する。
さらに、E2VK領域においては、(カバト(Kabat)番号付与システムを用いると)フレームワーク領域のアミノ酸位置1、3および4は生殖細胞系と異なる。これらの位置の1つ、2つもしくは3つ全部が、E1D、V3QおよびL4Mの置換のうちの1つ、2つもしくは3つ全部を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。E2VK領域の好ましい修飾形態は、E2GLVK(図8Bおよび配列番号48に示されるアミノ酸配列)であり、E1D、V3QおよびL4Mのフレームワーク置換を有する。
フレームワーク修飾の別のタイプは、フレームワーク領域内またはさらに1つ以上のCDR領域内で1つ以上の残基を変異させ、T細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。このアプローチは、「脱免疫(deimmunization)」とも称され、カー(Carr)らによる米国特許出願公開第20030153043号明細書にさらに詳述されている。
フレームワークまたはCDR領域内でなされる修飾に加えまたはその他として、本開示の抗体は、Fc領域内で修飾を含み、典型的には抗体の1つ以上の機能特性、例えば血清半減期、補体固定、Fc受容体結合性および/または抗原依存性の細胞毒性を変化させるように改変されうる。さらに、本開示の抗体は、化学的に修飾されうる(例えば1つ以上の化学的部分が抗体に付着されうる)か、または修飾によりそのグリコシル化が改変されさらに抗体の1つ以上の機能特性が改変されうる。これらの各実施形態は下記にさらに詳述されている。Fc領域内の残基の番号付与はカバト(Kabat)のEU指数のものである。
一実施形態では、CH1のヒンジ領域が、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化する、例えば増加または減少するように修飾される。このアプローチは、ボドマー(Bodmer)らによる米国特許第5,677,425号明細書にさらに記載されている。CH1のヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化することで、例えば軽鎖および重鎖の構築が促進されるかあるいは抗体の安定性が増大または低下する。
別の実施形態では、抗体のFcヒンジ領域の突然変異により抗体の生物学的半減期が減少する。より詳細には、抗体により天然Fc−ヒンジドメインSpA結合に対するブドウ球菌(Staphylococcyl)プロテインA(SpA)結合が低下している程度に、1つ以上のアミノ酸変異がFc−ヒンジ断片のCH2−CH3ドメイン界面領域に導入される。このアプローチは、ワード(Ward)らによる米国特許第6,165,745号明細書にさらに詳述されている。
別の実施形態では、抗体の修飾によりその生物学的半減期が増加する。様々なアプローチが可能である。例えば、ワード(Ward)に交付された米国特許第6,277,375号明細書に記載のように、1つ以上の以下の変異、すなわちT252L、T254S、T256Fが導入可能である。あるいは、プレスタ(Presta)らによる米国特許第5,869,046号明細書および米国特許第6,121,022号明細書に記載のように、生物学的半減期を増加させるため、抗体はIgGのFc領域のCH2ドメインの2つのループから得られるサルベージ(salvage)受容体結合エピトープを有するようにCH1またはCL領域内で改変されうる。
さらに他の実施形態では、Fc領域は少なくとも1つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換し、抗体のエフェクター機能を改変することによって改変される。例えば、アミノ酸残基234、235、236、237、297、318、320および322から選択される1つ以上のアミノ酸が、抗体がエフェクターリガンドに対して改変された親和性を有しても親抗体の抗原への結合能を保持する程度に異なるアミノ酸残基と置換されうる。親和性が改変される対象のエフェクターリガンドは、例えばFc受容体または補体のC1成分でありうる。このアプローチは、米国特許第5,624,821号明細書および米国特許第5,648,260号明細書(いずれもウインター(Winter)らによる)にさらに詳述されている。
別の例では、アミノ酸残基329、331および322から選択される1つ以上のアミノ酸が、抗体がC1q結合を改変しおよび/または補体依存性の細胞毒性(CDC)を低減または根絶している程度に異なるアミノ酸残基と置換されうる。このアプローチは、米国特許第6,194,551号明細書(イドゥソギー(Idusogie)らによる)にさらに詳述されている。
別の例では、アミノ酸位置231および239内の1つ以上のアミノ酸残基が改変されることにより、抗体の補体を固定する能力が改変される。このアプローチは、ボドマー(Bodmer)らによるPCT公開、国際公開第94/29351号パンフレットにさらに記載されている。
さらに別の例では、以下の位置、すなわち238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438もしくは439での1つ以上のアミノ酸の修飾によるFc領域の修飾により、抗体の抗体依存性細胞毒性(ADCC)を媒介する能力が増大しおよび/または抗体のFcγ受容体に対する親和性が増大する。このアプローチは、PCT公開、国際公開第00/42072号パンフレット(プレスタ(Presta)による)にさらに記載されている。さらに、ヒトIgG1上のFcγR1、FcγRII、FcγRIIIおよびFcRnに対する結合部位がマッピングされており、かつ結合が改善された変異体についての記載がなされている(シールズ R.L.(Shields R.L.)ら(2001年)J.Biol.Chem.276:6591−6604頁を参照)。位置256、290、298、333、334および339での特異的変異がFcγRIIIに対する結合を改善することが示された。さらに、以下の変異体の組み合わせ、すなわちT256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224AおよびS298A/E333A/K334AがFcγRIIIに対する結合を改善することが示された。
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、アグリコシル化(aglycosylated)抗体が作製されうる(すなわち抗体におけるグリコシル化が失われる)。グリコシル化の改変により、例えば抗体の抗原に対する親和性が増大しうる。かかる炭水化物修飾は、例えば抗体配列内の1つ以上のグリコシル化部位を改変することによりなされうる。例えば、1つ以上のアミノ酸置換がなされうる結果、1つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去によりその部位でのグリコシル化が失われる。かかるアグリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性が増大しうる。かかるアプローチは、米国特許第5,714,350号明細書および米国特許第6,350,861号明細書(コ(Co)らによる)にさらに詳述されている。
さらにまたはその他として、グリコシル化の改変タイプを有する抗体、例えば減量されたフコシル残基を有する低フコシル化(hypofucosylated)抗体または増強されたGlcNac二分構造を有する抗体が作製されうる。かかる改変されたグリコシル化パターンにより、抗体のADCC能力が増大することが示されている。かかる炭水化物修飾は、例えばグリコシル化機構が改変された宿主細胞内で抗体を発現することにより行われうる。グリコシル化機構が改変された細胞については当該技術分野で記載がなされており、本開示の組換え抗体を発現することによりグリコシル化が改変抗体が産生される宿主細胞として用いられうる。例えば、細胞系Ms704、Ms705およびMs709は、Ms704、Ms705およびMs709細胞系内で発現される抗体がその炭水化物上にフコースを含まないように、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8(α(1、6)フコシルトランスフェラーゼ)を含まない。Ms704、Ms705およびMs709 FUT8−/−細胞系は、2つの置換ベクターを用いたCHO/DG44細胞内での標的化されたFUT8遺伝子の破壊により作製された(ヤマネ(Yamane)らによる米国特許出願公開第20040110704号明細書およびヤマネ−オオヌキ(Yamane−Ohnuki)ら(2004年)Biotechnol Bioeng 87:614−22頁を参照)。別の例として、ハナイ(Hanai)らによる欧州特許第1,176,195号明細書は、機能的に破壊されたフコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子を有する細胞系について記載している。かかる細胞系内で発現される抗体は、α1,6結合に関連した酵素の低減または除去により低フコシル化(hypofucosylation)を示す。花井(Hanai)らは、フコースを抗体のFc領域に結合するN−アセチルグルコサミンに添加するのに低い酵素活性を有するかまたは酵素活性を有することのない細胞系、例えばラット骨髄腫細胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)についても記載している。プレスタ(Presta)によるPCT公開、国際公開第03/035835号パンフレットには、フコースをAsn(297)に連結された炭水化物に付着させる能力が低下した(その宿主細胞内で発現される抗体の低フコシル化ももたらす)変異CHO細胞系、Lec13細胞について記載されている(シールズ R.L.(Shields R.L.)ら(2002年)J.Biol.Chem.277:26733−26740頁も参照)。米国特許出願第PCT/US06/05853号明細書に記載のように、修飾されたグリコシル化特性を有する抗体は鶏卵内でも産生されうる。あるいは、修飾されたグリコシル化特性を有する抗体は、植物細胞、例えばレムナ(Lemna)内で産生されうる。植物系内で抗体を産生するための方法は、2006年8月11日に出願されたアルストン・アンド・バード LLP(Alston&Bird LLP)代理人整理番号040989/314911に対応する米国特許出願に開示されている。ウマナ(Umana)らによるPCT公開、国際公開第99/54342号パンフレットには、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ(例えばβ(1,4)−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII))を、改変された細胞系内で発現される抗体が抗体のADCC活性の増大をもたらすGlcNac二分構造の増大を示すように発現するように改変された細胞系について記載されている(ウマナ(Umana)ら(1999年)Nat.Biotech.17:176−180頁も参照)。あるいは、抗体のフコース残基はフコシダーゼ酵素を用いて切断されうる。例えば、フコシダーゼのα−L−フコシダーゼはフコシル残基を抗体から除去する(タランティーノ A.L.(Tarentino A.L.)ら(1975年)Biochem.14:5516−23頁)。
本開示で検討される本明細書中の抗体の別の修飾がペグ化(pegylation)である。抗体をペグ化することで、例えば抗体の生物学的(例えば血清)半減期が増加されうる。抗体をペグ化するため、抗体またはその断片は典型的にはポリエチレングリコール(PEG)、例えばPEGの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、1つ以上のPEG基が抗体または抗体断片に付着した状態になるという条件下で反応する。好ましくは、ペグ化は、反応性PEG分子(または類似反応性の水−可溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行われる。本明細書で用いられる「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質、例えばモノ(C1−C10)アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを誘導体化するのに用いられているPEGの形態のいずれかを包含するように意図されている。特定の実施形態では、ペグ化されるべき抗体はアグリコシル化(aglycosylated)抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当該技術分野で既知であり、本開示の抗体に適用可能である。例えば、ニシムラ(Nishimura)らによる欧州特許第0154316号明細書およびイシカワ(Ishikawa)らによる欧州特許第0401384号明細書を参照のこと。
抗体断片および抗体模倣体
本発明は、従来の抗体に限定されることなく、抗体断片および抗体模倣体の使用を通じて実施可能である。下記に詳述のように、多種多様な抗体断片および抗体模倣技術が現在では開発されており、当該技術分野で広く知られている。多数のこれら技術、例えばドメイン抗体、ナノボディ、およびユニボディでは従来の抗体構造の断片またはそれに対する他の修飾が用いられる一方、他の技術、例えば従来の抗体結合を模倣する一方、異なる機序から産生され、それを介して機能する結合構造を用いるアフィボディ、ダルピン、アンチカリン、アビマー、およびバーサボディも存在する。
本発明は、従来の抗体に限定されることなく、抗体断片および抗体模倣体の使用を通じて実施可能である。下記に詳述のように、多種多様な抗体断片および抗体模倣技術が現在では開発されており、当該技術分野で広く知られている。多数のこれら技術、例えばドメイン抗体、ナノボディ、およびユニボディでは従来の抗体構造の断片またはそれに対する他の修飾が用いられる一方、他の技術、例えば従来の抗体結合を模倣する一方、異なる機序から産生され、それを介して機能する結合構造を用いるアフィボディ、ダルピン、アンチカリン、アビマー、およびバーサボディも存在する。
ドメイン抗体(dAb)は抗体の最小の機能結合単位であり、ヒト抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)のいずれかの可変領域に対応するものである。ドメイン抗体は約13kDaの分子量を有する。ドマンティス(Domantis)は、完全ヒトVHおよびVL dAbにおける一連の大規模かつ高度に機能的なライブラリ(各ライブラリ内に100億超の異なる配列)を開発しており、これらのライブラリを用いて治療標的に特異的なdAbを選択する。多数の従来の抗体に対し、ドメイン抗体は細菌、酵母、および哺乳類細胞系内で十分に発現される。ドメイン抗体およびその産生方法のさらなる詳細については、米国特許第6,291,158号明細書;米国特許第6,582,915号明細書;米国特許第6,593,081号明細書;米国特許第6,172,197号明細書;米国特許第6,696,245号明細書;米国特許出願公開第2004/0110941号明細書;欧州特許出願第1433846号明細書および欧州特許第0368684号明細書および欧州特許第0616640号明細書;国際公開第05/035572号パンフレット、国際公開第04/101790号パンフレット、国際公開第04/081026号パンフレット、国際公開第04/058821号パンフレット、国際公開第04/003019号パンフレットおよび国際公開第03/002609号パンフレットの参照により得られうる(これら各々はその全体が参照により本明細書中に援用される)。
ナノボディは、天然の重鎖抗体の固有の構造および機能特性を有する抗体由来の治療タンパク質である。これらの重鎖抗体は、単一の可変ドメイン(VHH)および2つの定常ドメイン(CH2およびCH3)を有する。重要なことには、クローン化され、単離されたVHHドメインは、元の重鎖抗体の完全な抗原結合能を内在する完全に安定的なポリペプチドである。ナノボディは、ヒト抗体のVHドメインとの高い相同性を有し、かつ活性の任意の低下を伴うことなくさらにヒト化されうる。重要なことには、ナノボディは免疫原性の低い可能性を有し、霊長動物試験でナノボディのリード化合物を用いて確認されている。
ナノボディでは、従来の抗体の利点を小分子薬物の重要な特徴と組み合わされる。ナノボディは、従来の抗体と同様、その標的および低い固有の毒性に対し、高い標的特異性、高親和性を示す。しかし、ナノボディは、小分子薬物と同様、酵素を阻害し、受容体のクレフトに容易に接近可能である。さらに、ナノボディは極めて安定的であり、注射以外の手段で投与可能であり(例えば国際公開第04/041867号パンフレットを参照(その全体が参照により本明細書中に援用される)、製造が容易である。ナノボディの他の利点は、小さいサイズに起因するまれであるかまたは隠されたエピトープの認識、タンパク質標的の空洞または活性部位へのその固有の三次元構造に起因する高い親和性および選択性による結合性、薬物形式の柔軟性、半減期の調整ならびに薬物発見の容易性および速度を含む。
ナノボディは、単一の遺伝子によりコードされ、ほぼすべての原核生物および真核生物宿主、例えば大腸菌(E.coli)(例えば米国特許第6,765,087号明細書を参照(その全体が参照により本明細書中に援用される))、かび(例えばコウジカビ属(Aspergillus)またはトリコデルマ(Trichoderma))ならびに酵母(例えば、サッカロマイセス(Saccharomyces)、クリベロマイセス(Kluyveromyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)またはピヒア(Pichia))(例えば米国特許第6,838,254号明細書を参照(その全体が参照により本明細書中に援用される))において効率的に産生される。産生プロセスは拡張可能であり、数キログラム量のナノボディが産生されている。ナノボディは、従来の抗体と比べて優れた安定性を示すことから、貯蔵寿命が長く即使用可能な溶液として調合可能である。
ナノクローン(Nanoclone)法(例えば国際公開第06/079372号パンフレットを参照(その全体が参照により本明細書中に援用される))は、B細胞の自動化された高スループットな選択に基づき所望の標的に対するナノボディを産生するための独自の方法であり、場合により本発明との関連で用いられうる。
ユニボディは別の抗体断片技術であるが、この技術はIgG4抗体のヒンジ領域の除去に基づくものである。ヒンジ領域の欠失により、従来のIgG4抗体に対して本質的に半分のサイズでありかつIgG4抗体の二価結合領域ではなく一価結合領域を有する分子が生成される。IgG4抗体が不活性であることから免疫系と相互作用することがないことも周知であり、これは免疫応答が望ましくない場合の疾患の治療において有利な場合があり、この利点はユニボディ上に受け継がれる。例えば、ユニボディは、その結合対象の細胞を殺滅することなく阻害または沈黙するように機能しうる。さらに、癌細胞に結合するユニボディは、それらを刺激して増殖させることはない。さらに、ユニボディが従来のIgG4抗体の約半分のサイズであることから、それは大きい固形腫瘍全体により適切な分布を示すとともに有利な有効性を発揮する可能性がある。ユニボディは、全IgG4抗体と同様の速度で身体から除去され、その抗原に対して全抗体と同様の親和性で結合可能である。ユニボディのさらなる詳細は、特許国際公開第2007/059782号パンフレット(その全体が参照により本明細書中に援用される)の参照により得られうる。
アフィボディ(Affibody)分子は、スタフィロコッカル(staphylococcal)プロテインAのIgG結合ドメインのうちの1つから誘導される、58−アミノ酸残基のタンパク質ドメインに基づく親和性タンパク質の新しいクラスを表す。この3つのヘリックスバンドル(helix bundle)ドメインはコンビナトリアルファージミドライブラリの作成物における足場として用いられており、それから所望の分子を標的にするアフィボディ変異体がファージディスプレイ技術を用いて選択されうる(ノード K.(Nord K.)、ガンネリュッソン E.(Gunneriusson E.)、リングダール J.(Ringdahl J.)、スタール S.(Stahl S.)、ウーレン M.(Uhlen M.)、ナイグレン P.A.(Nygren P.A.)、「Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α−helical bacterial receptor domain」、Nat Biotechnol 1997年;15:772−7頁、ロンマーク J.(Ronmark J.)、グロンルンド H.(Gronlund H.)、ウーレン M.(Uhlen M.)、ナイグレン P.A.(Nygren P.A.)、「Human immunoglobulin A(IgA)−specific ligands from combinatorial engineering of protein A」、Eur J Biochem 2002年;269:2647−55頁)。アフィボディ分子におけるその低い分子量(6kDa)とともに単純で強固な構造により、それが例えば検出試薬のような多種多様な用途に適するようになり(ロンマーク J.(Ronmark J.)、ハンソン M.(Hansson M.)、ナイグレン T.(Nygren T.)ら、「Construction and characterization of affibody−Fc chimeras produced in Escherichia coli」、J Immunol Methods 2002年;261:199−211頁)、かつ受容体相互作用が阻害される(サンドストーム K.(Sandstorm K.)、スー Z.(Xu Z.)、フォルスバーグ G.(Forsberg G.)、ナイグレン P.A.(Nygren P.A.)、「Inhibition of the CD28−CD80 co−stimulation signal by a CD28−binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering」、Protein Eng 2003年;16:691−7頁)。アフィボディおよびそれを産生する方法のさらなる詳細が、米国特許第5831012号明細書により得られうる(その全体が参照により本明細書中に援用される)。
標識されたアフィボディは、多数のアイソフォームを判定するためのイメージング用途においても有用でありうる。
ダルピン(設計されたアンキリンリピートタンパク質)は、非抗体ポリペプチドの結合能を用いるように開発された抗体模倣DRP(設計されたリピートタンパク質)技術の一例である。アンキリンまたはロイシンリッチのリピートタンパク質などのリピートタンパク質は、偏在する結合分子であり、抗体と異なり細胞内および細胞外に生じる。それら固有のモジュール構造は、構造単位の反復(リピート)を特徴とし、共に蓄積され、可変でかつモジュール式の標的に結合する表面を示す伸長されたリピートドメインが形成される。このモジュール性に基づき、非常に多様化された結合特異性を有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリが生成されうる。この方法は、可変の表面残基およびリピートドメインへのランダムアセンブリを示す自家和合性リピートに共通の設計を含む。
ダルピンは、細菌発現系内で極めて高収量に産生可能であり、既知の最も安定なタンパク質に属する。ヒト受容体、サイトカイン、キナーゼ、ヒトプロテアーゼ、ウイルスおよび膜タンパク質を含む広範囲の標的タンパク質に対して極めて特異的な高親和性のダルピンが選択されている。1桁のナノモル〜ピコモルの範囲内の親和性を有するダルピンが得られうる。
ダルピンは、ELISA、サンドイッチELISA、フローサイトメトリー分析(FACS)、免疫組織化学(IHC)、チップ用途、親和性精製またはウエスタンブロッティングを含む広範囲の用途で用いられている。ダルピンは、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)に融合された細胞内マーカータンパク質としての細胞内区画内で活性が高いことも判明した。ダルピンは、pM範囲内のIC50でウイルスの侵入を阻害するのにさらに用いられた。ダルピンは、タンパク質−タンパク質相互作用の遮断に望ましいだけでなく酵素の阻害に望ましい。プロテアーゼ、キナーゼおよびトランスポーターの阻害に奏功しており、ほとんどの場合、アロステリック阻害様式である。腫瘍に対する極めて迅速で特異的な濃縮および極めて好ましい腫瘍対血液比により、インビボでの診断的または治療的アプローチに十分に適合するダルピンが作製される。
ダルピンおよび他のDRP技術に関するさらなる情報が、米国特許出願公開第2004/0132028号明細書および国際特許出願公開、国際公開第02/20565号パンフレットに見出されうる(それら双方はそれら全体が参照により本明細書中に援用される)。
アンチカリンはさらなる抗体模倣技術であるが、この場合、結合特異性は、ヒト組織内および体液中で自然にかつ豊富に発現される低分子量タンパク質のファミリーであるリポカリンから誘導される。リポカリンは、進化することで、化学的感受性があるかまたは不可溶性の化合物の生理的輸送および保存に関連したインビボでの機能の範囲を果たしている。リポカリンは、タンパク質の一末端で4つのループを支持する高度に保存されたβ−バレルを含む強固な固有の構造を有する。これらのループは結合ポケットに対する入口(entrance)を形成し、分子のこの部分における高次構造上の差は各リポカリン間の結合特異性におけるばらつきを示している。
保存されたβシートフレームワークにより支持される超可変ループの全体構造から免疫グロブリンが連想されるが、リポカリンはサイズの観点で抗体とはかなり異なり、単一の免疫グロブリンドメインよりもわずかに大きい160−180個のアミノ酸の単一のポリペプチド鎖からなる。
リポカリンはクローン化され、アンチカリンの作製のため、そのループには改変がなされる。構造的に多様なアンチカリンのライブラリが生成されており、アンチカリンの提示は、結合機能の選択およびスクリーニング、それに続く、原核系または真核系におけるさらなる分析のための可溶性タンパク質の発現および産生を可能にする。試験によると、仮想的に任意のヒト標的タンパク質に特異的なアンチカリンの開発が可能で、その単離が可能であり、ナノモルのまたはより高い範囲での結合親和性が得られうることを示すことに奏功している。
アンチカリンは、二重標的化された(dual targeting)タンパク質、いわゆるデュオカリンとしても形式化されうる。デュオカリンは、標準の作製プロセスを用いて1つの容易に生成される単量体タンパク質内の2つの別々の治療標的に結合する一方、その2つの結合ドメインの構造的方向性にかかわらず標的の特異性および親和性を保持する。
単一の分子を通じての複数の標的の調節は、2つ以上の病原因子を含むことで知られる疾患において特に有利である。さらに、デュオカリンなどの二価または多価の結合形式は、疾患における細胞表面分子の標的化において有意な可能性を有し、シグナル伝達経路に対して作動効果を媒介するか、または細胞表面受容体の結合およびクラスタリングを介して内在化効果の増大を誘発する。さらに、デュオカリンの固有の高い安定性は単量体アンチカリンに匹敵し、デュオカリンに対して柔軟な製剤および送達の可能性をもたらす。
アンチカリンに関するさらなる情報が、米国特許第7,250,297号明細書および国際特許出願公開番号、国際公開第99/16873号パンフレットに見出されうる(それら双方はそれら全体が参照により本明細書中に援用される)。
本発明との関連で有用な別の抗体模倣技術がアビマーである。アビマーは、インビトロでのエクソンシャッフリングおよびファージディスプレイによりヒト細胞外受容体ドメインの大きいファミリーから進化したものであり、結合および阻害特性を備えた多重ドメインタンパク質を生成する。複数の独立した結合ドメインの連結により結合活性がもたらされることが示されており、結果として従来の単一のエピトープ結合タンパク質に対して親和性および特異性が改善される。他の有望な利点として、大腸菌(Escherichia coli)内での多重標的に特異的な分子の単純かつ効率的な産生、プロテアーゼに対する改善された熱安定性および耐性が挙げられる。ナノメートル以下の親和性を有するアビマーが種々の標的に対して得られている。
アビマーに関するさらなる情報が、米国特許出願公開第2006/0286603号明細書、米国特許出願公開第2006/0234299号明細書、米国特許出願公開第2006/0223114号明細書、米国特許出願公開第2006/0177831号明細書、米国特許出願公開第2006/0008844号明細書、米国特許出願公開第2005/0221384号明細書、米国特許出願公開第2005/0164301号明細書、米国特許出願公開第2005/0089932号明細書、米国特許出願公開第2005/0053973号明細書、米国特許出願公開第2005/0048512号明細書、米国特許出願公開第2004/0175756号明細書に見出されうる(それらすべてはそれら全体が参照により本明細書中に援用される)。
バーサボディは、本発明との関連で利用可能な別の抗体模倣技術である。バーサボディは、15%を超えるシステインを有する3〜5kDaの小さいタンパク質であり、高いジスルフィド密度の足場を形成し、典型的なタンパク質が有する疎水性コアの代わりとなる。疎水性コアを含む多数の疎水性アミノ酸の少数のジスルフィドとの置換により、より小さくより親水性が高く(低下した凝集および非特異的結合)、プロテアーゼおよび熱に対してより耐性があり、かつMHC提示の大部分に寄与する残基が疎水性であることからより低いT細胞エピトープの密度を有するタンパク質が生成される。これらの特性の4つすべてが免疫原性に作用することで周知であり、それらは共に免疫原性の大幅な低下の原因になると予想される。
バーサボディについての着想は、ヒル、ヘビ、クモ、サソリ、カタツムリ、およびアネモネにより生成される天然の注射可能な生物医薬品から得られるものであり、予想外に低い免疫原性を示すことが知られている。選択された天然タンパク質ファミリーから、サイズの設計およびスクリーニングにより、疎水性、タンパク質分解の抗原プロセシング、およびエピトープ密度が注射可能な天然タンパク質における平均を大幅に下回るレベルまで最小化される。
バーサボディの構造を仮定すると、これらの抗体模倣体は多価、多重特異性、半減期機構の多様性、組織標的化モジュールおよび抗体Fc領域の非存在を含む多目的形式を提供する。さらに、バーサボディは、高収量で大腸菌(E.coli)内で作製され、かつ、バーサボディはその親水性および小サイズ故に可溶性が高く、高濃度に調合されうる。バーサボディは、特に熱安定的であり(それは沸騰可能であり)、長い貯蔵寿命をもたらす。
バーサボディに関するさらなる情報が、米国特許出願公開第2007/0191272号明細書に見出されうる(その全体が参照により本明細書中に援用される)。
上で提供された抗体断片および抗体模倣技術の詳細な説明は、本明細書との関連で用いられうるあらゆる技術の包括的リストであるように意図されていない。例えば、また限定を目的としない場合、他のポリペプチドに基づく技術、例えばクイ(Qui)ら、Nature Biotechnology、25(8)921−929頁(2007年)(その全体が参照により本明細書中に援用される)で概説された相補性決定領域の融合、ならびに核酸に基づく技術、例えば米国特許第5,789,157号明細書、米国特許第5,864,026号明細書、米国特許第5,712,375号明細書、米国特許第5,763,566号明細書、米国特許第6,013,443号明細書、米国特許第6,376,474号明細書、米国特許第6,613,526号明細書、米国特許第6,114,120号明細書、米国特許第6,261,774号明細書、および米国特許第6,387,620号明細書(これらのすべては参照により本明細書中に援用される)に記載のRNAアプタマー技術を含む種々のさらなる技術が本発明との関連で利用可能である。
抗体の物理的特性
本開示の抗体は、抗CXCR4抗体の様々な物理的特性によりさらに特徴づけられうる。様々なアッセイを用い、これらの物理的特性に基づいて抗体の異なるクラスの検出および/または識別が可能である。
本開示の抗体は、抗CXCR4抗体の様々な物理的特性によりさらに特徴づけられうる。様々なアッセイを用い、これらの物理的特性に基づいて抗体の異なるクラスの検出および/または識別が可能である。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかにおいて1つ以上のグリコシル化部位を有しうる。可変領域内に1つ以上のグリコシル化部位が存在する結果、抗原結合の改変により抗体の免疫原性または抗体のpKの変化が増大しうる(マーシャル(Marshall)ら(1972年)Annu Rev Biochem 41:673−702頁;ガラ F.A.(Gala F.A.)およびモリソン S.L.(Morrison S.L.)(2004年) J Immunol 172:5489−94頁;ワリック(Wallick)ら(1988年)J Exp Med 168:1099−109頁;スピロ R.G.(Spiro R.G.)(2002年)Glycobiology 12:43R−56R;パレク(Parekh)ら(1985年)Nature 316:452−7頁;ミムラ(Mimura)ら(2000年)Mol Immunol 37:697−706頁)。グリコシル化はN−X−S/T配列を有するモチーフで生じることが知られている。可変領域のグリコシル化はグライコブロット(Glycoblot)アッセイを用いて試験可能であり、同アッセイでは、抗体の切断によりFabが産生され、次いで過ヨウ素酸酸化およびシッフ(Schiff)塩基形成を測定するアッセイを用いてグリコシル化が試験される。あるいは、可変領域のグリコシル化はディオネックス(Dionex)光クロマトグラフィー(ディオネックス−LC(Dionex−LC))を用いて試験可能であり、そこでは糖類がFabから切断されて単糖類にされ、各糖類の含量が分析される。いくつかの例では、可変領域のグリコシル化を有することのない抗CXCR4抗体を有することが好ましい。これは、可変領域内にグリコシル化モチーフを有することのない抗体を選択するかまたはグリコシル化モチーフ内の残基を当該技術分野で周知の標準技術を用いて突然変異させることにより実現されうる。
好ましい実施形態では、本開示の抗体はアスパラギン異性部位を有することがない。脱アミドまたはイソアスパラギン酸効果が各々、N−GまたはD−G配列上で生じうる。脱アミドまたはイソアスパラギン酸効果の結果、主鎖ではなく側鎖のカルボキシ末端から離れてキンク構造を生成することにより抗体の安定性を低下させるイソアスパラギン酸が生成される。イソアスパラギン酸の生成は等量(iso−quant)アッセイを用いて測定可能であり、そこでは逆相HPLCを用いてイソアスパラギン酸についての試験が行われる。
各抗体は特有の等電点(pI)を有することになるが、一般に抗体は6〜9.5のpH範囲に収まることになる。IgG1抗体におけるpIは典型的には7〜9.5のpH範囲内に収まり、かつIgG4抗体におけるpIは典型的には6〜8のpH範囲内に収まる。抗体はこの範囲外のpIを有する場合がある。効果は一般に未知であるが、正常な範囲外のpIを有する抗体がインビボ条件下である程度のアンフォールディングおよび不安定性を有しうることが推定される。等電点はキャピラリー等電点電気泳動アッセイを用いて試験可能であり、それはpH勾配を生成し、そこでは精度向上のためにレーザー集光が用いられうる(ジャニニ(Janini)ら(2002年)Electrophoresis 23:1605−11頁;マ(Ma)ら(2001年)Chromatographia 53:S75−89頁;ハント(Hunt)ら(1998年)J Chromatogr A 800:355−67頁)。いくつかの例では、正常な範囲内に収まるpI値を有する抗CXCR4抗体を有することが好ましい。これは正常な範囲内のpIを有する抗体を分泌するかまたは帯電した表面残基を当該技術分野で周知の標準の技術を用いて突然変異することによりなされうる。
各抗体は、熱安定性を示す融解温度を有することになる(クリシュナムルティ R.(Krishnamurthy R.)およびマニング M.C.(Manning M.C.)(2002年) Curr Pharm Biotechnol 3:361−71頁)。より高い熱安定性は、インビボで全体的により高い抗体安定性を示す。抗体の融解点は、示差走査熱量測定などの技術を用いて測定されうる(チェン(Chen)ら(2003年)Pharm Res 20:1952−60頁;ガーランド(Ghirlando)ら(1999年)Immunol Lett 68:47−52頁)。TM1は抗体の初期のアンフォールディングの温度を示す。TM2は抗体の完全なアンフォールディングの温度を示す。一般に、本開示の抗体のTM1が60℃超、好ましくは65℃超、さらにより好ましくは70℃超であることが好ましい。あるいは、抗体の熱安定性は円二色性を用いて測定されうる。(マレイ(Murray)ら(2002年)J.Chromatogr Sci 40:343−9頁)。
好ましい実施形態では、急速に分解することのない抗体が選択される。抗CXCR4抗体の断片化は、当該技術分野で十分に理解されているようにキャピラリー電気泳動(CE)およびMALDI−MSを用いて測定されうる(アレキサンダー A.J.(Alexander A.J.)およびヒュー D.E.(Hughes D.E.)(1995年)Anal Chem 67:3626−32頁)。
別の好ましい実施形態では、最小の凝集効果を有する抗体が選択される。凝集が、望ましくない免疫応答および/または改変されるかもしくは好ましくない薬物動態学的特性の誘因となりうる。一般に、抗体では、25%以下、好ましくは20%以下、さらにより好ましくは15%以下、さらにより好ましくは10%以下およびさらにより好ましくは5%以下の凝集が許容される。凝集は、単量体、二量体、三量体または多量体を同定するためのサイズ排除カラム(SEC)高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)および光散乱を含む、当該技術分野で周知のいくつかの技術により測定されうる。
抗体を改変する方法
上で考察のように、本明細書中に開示されるVHおよびVK配列を有する抗CXCR4抗体を用い、VHおよび/またはVK配列またはそれらに付着される定常領域を修飾することにより新しい抗CXCR4抗体の作製が可能である。したがって、本開示の別の態様では、本開示の抗CXCR4抗体、例えばF7、F9、D1またはE2の構造的特徴を用い、本開示の抗体の少なくとも1つの機能特性、例えばヒトCXCR4への結合性を保持する構造的に関連のある抗CXCR4抗体が作製される。上で考察のように、例えばF7、F9、D1もしくはE2の1つ以上のCDR領域またはその変異を既知のフレームワーク領域および/または他のCDRと組換え的に組み合わせて、さらなる組換え操作された本開示の抗CXCR4抗体の作製が可能である。修飾の他のタイプとして、前セクションに記載のタイプが挙げられる。改変方法における出発原料は、本明細書中に提供される1つ以上のVHおよび/もしくはVK配列またはそれらの1つ以上のCDR領域である。改変抗体を作製するのに、本明細書中に提供される1つ以上のVHおよび/もしくはVK配列またはそれらの1つ以上のCDR領域を有する抗体を実際に調製する(すなわちタンパク質として発現させる)必要はない。それに対し、配列内に含まれる情報を出発原料として用い、元の配列から誘導される「第二世代」配列が作製され、次いで「第二世代」配列が調製され、タンパク質として発現される。
上で考察のように、本明細書中に開示されるVHおよびVK配列を有する抗CXCR4抗体を用い、VHおよび/またはVK配列またはそれらに付着される定常領域を修飾することにより新しい抗CXCR4抗体の作製が可能である。したがって、本開示の別の態様では、本開示の抗CXCR4抗体、例えばF7、F9、D1またはE2の構造的特徴を用い、本開示の抗体の少なくとも1つの機能特性、例えばヒトCXCR4への結合性を保持する構造的に関連のある抗CXCR4抗体が作製される。上で考察のように、例えばF7、F9、D1もしくはE2の1つ以上のCDR領域またはその変異を既知のフレームワーク領域および/または他のCDRと組換え的に組み合わせて、さらなる組換え操作された本開示の抗CXCR4抗体の作製が可能である。修飾の他のタイプとして、前セクションに記載のタイプが挙げられる。改変方法における出発原料は、本明細書中に提供される1つ以上のVHおよび/もしくはVK配列またはそれらの1つ以上のCDR領域である。改変抗体を作製するのに、本明細書中に提供される1つ以上のVHおよび/もしくはVK配列またはそれらの1つ以上のCDR領域を有する抗体を実際に調製する(すなわちタンパク質として発現させる)必要はない。それに対し、配列内に含まれる情報を出発原料として用い、元の配列から誘導される「第二世代」配列が作製され、次いで「第二世代」配列が調製され、タンパク質として発現される。
したがって、別の実施形態では、本開示は、抗CXCR4抗体を調製するための方法であって、
(a)(i)配列番号1〜4からなる群から選択されるCDR1配列、配列番号5〜8からなる群から選択されるCDR2配列、および/または配列番号9〜12からなる群から選択されるCDR3配列を含む重鎖可変領域抗体配列;ならびに/あるいは(ii)配列番号13〜16からなる群から選択されるCDR1配列、配列番号17〜20からなる群から選択されるCDR2配列、および/または配列番号21〜24からなる群から選択されるCDR3配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供するステップと、
(b)重鎖可変領域抗体配列および/または軽鎖可変領域抗体配列の内部の少なくとも1つのアミノ酸残基を改変し、少なくとも1つの改変抗体配列を作製するステップと、
(c)改変抗体配列をタンパク質として発現するステップと、
を含む方法を提供する。
(a)(i)配列番号1〜4からなる群から選択されるCDR1配列、配列番号5〜8からなる群から選択されるCDR2配列、および/または配列番号9〜12からなる群から選択されるCDR3配列を含む重鎖可変領域抗体配列;ならびに/あるいは(ii)配列番号13〜16からなる群から選択されるCDR1配列、配列番号17〜20からなる群から選択されるCDR2配列、および/または配列番号21〜24からなる群から選択されるCDR3配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供するステップと、
(b)重鎖可変領域抗体配列および/または軽鎖可変領域抗体配列の内部の少なくとも1つのアミノ酸残基を改変し、少なくとも1つの改変抗体配列を作製するステップと、
(c)改変抗体配列をタンパク質として発現するステップと、
を含む方法を提供する。
標準の分子生物学技術を用い、改変抗体配列の調製および発現が可能である。
好ましくは、改変された抗体配列によりコードされる抗体は、本明細書中に記載の抗CXCR4抗体の機能特性のうちの1つ、一部または全部を保持する抗体であり、ここでの機能特性は、限定はされないが、
(i)細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合し、
(ii)SDF−1のCXCR4への結合を阻害し、
(iii)CXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束を阻害し、
(iv)CXCR4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走を阻害し、
(v)HuVECによる毛細管形成を阻害し、
(vi)ヒトCXCR4に1×10−7M以下のKDで結合し、
(vii)CXCR4を発現する細胞内でのアポトーシスを誘発し、
(viii)インビトロで腫瘍細胞増殖を阻害し、
(ix)インビボで腫瘍細胞増殖を阻害し、および/または腫瘍細胞のアポトーシスを誘発し、
(x)CXCR4+腫瘍細胞の転移を阻害し、および/または
(xi)CXCR4+腫瘍を担持する対象の生存時間を増加させる
といった機能特性を含む。
(i)細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合し、
(ii)SDF−1のCXCR4への結合を阻害し、
(iii)CXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束を阻害し、
(iv)CXCR4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走を阻害し、
(v)HuVECによる毛細管形成を阻害し、
(vi)ヒトCXCR4に1×10−7M以下のKDで結合し、
(vii)CXCR4を発現する細胞内でのアポトーシスを誘発し、
(viii)インビトロで腫瘍細胞増殖を阻害し、
(ix)インビボで腫瘍細胞増殖を阻害し、および/または腫瘍細胞のアポトーシスを誘発し、
(x)CXCR4+腫瘍細胞の転移を阻害し、および/または
(xi)CXCR4+腫瘍を担持する対象の生存時間を増加させる
といった機能特性を含む。
改変抗体の機能特性は、当該技術分野で使用可能でありおよび/または本明細書中に記載の標準アッセイ、例えば実施例で示されるアッセイ(例えば、フローサイトメトリー、結合アッセイ、機能アッセイ)を用いて評価可能である。
本開示の抗体を改変する方法の特定の実施形態では、変異が、抗CXCR4抗体のコード配列の全部もしくは一部に沿ってランダムまたは選択的に導入可能であり、かつ、得られる修飾された抗CXCR4抗体における結合活性および/または本明細書中に記載の他の機能特性についてスクリーニング可能である。突然変異方法については当該技術分野で記載がなされている。例えば、ショート(Short)によるPCT公開、国際公開第02/092780号パンフレットでは、抗体変異を飽和突然変異誘発、合成的ライゲーションアセンブリー(synthetic ligation assembly)またはそれらの組み合わせを用いて作製しスクリーニングするための方法が記載されている。あるいは、レーザー(Lazar)らによるPCT公開、国際公開第03/074679号パンフレットでは、コンピュータによるスクリーニング方法を用いて抗体の生理化学的特性を最適化する方法が記載されている。
本開示の抗体をコードする核酸分子
本開示の別の態様は、本開示の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞内に、細胞溶解液中にまたは部分精製形態もしくは実質的に純粋な形態で存在しうる。核酸は、当該技術分野で周知のアルカリ/SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動およびその他を含む標準技術により、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば他の細胞核酸もしくはタンパク質から除去精製される場合、「単離される」かまたは「実質的に純粋な状態にされる」。F.アウスベル(F.Ausubel)ら編(1987年)「分子生物学の最新プロトコル(Current Protocol in Molecular Biology)」、ニューヨーク(New York)のグリーン・パブリッシング・アンド・ワイリー・インターサイエンス(Greene Publishing and Wiley Interscience)を参照のこと。本開示の核酸が例えばDNAまたはRNAでありうるとともに、イントロン配列を有するかまたは有しない場合がある。好ましい実施形態では核酸はcDNA分子である。
本開示の別の態様は、本開示の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞内に、細胞溶解液中にまたは部分精製形態もしくは実質的に純粋な形態で存在しうる。核酸は、当該技術分野で周知のアルカリ/SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動およびその他を含む標準技術により、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば他の細胞核酸もしくはタンパク質から除去精製される場合、「単離される」かまたは「実質的に純粋な状態にされる」。F.アウスベル(F.Ausubel)ら編(1987年)「分子生物学の最新プロトコル(Current Protocol in Molecular Biology)」、ニューヨーク(New York)のグリーン・パブリッシング・アンド・ワイリー・インターサイエンス(Greene Publishing and Wiley Interscience)を参照のこと。本開示の核酸が例えばDNAまたはRNAでありうるとともに、イントロン配列を有するかまたは有しない場合がある。好ましい実施形態では核酸はcDNA分子である。
本開示の核酸は、標準の分子生物学技術を用いて得られうる。ハイブリドーマ(例えばさらに下記のヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ)により発現される抗体においては、ハイブリドーマにより作製される抗体の軽鎖および重鎖をコードするcDNAが標準のPCR増幅またはcDNAクローニング技術により得られうる。(例えばファージディスプレイ技術を用いる)免疫グロブリン遺伝子ライブラリから得られる抗体については、かかる抗体をコードする核酸が遺伝子ライブラリから回収されうる。
本開示の好ましい核酸分子は、F7、F9、D1およびE2モノクローナル抗体のVHおよびVL配列をコードするものである。F7、F9、D1およびE2のVH配列をコードするDNA配列はそれぞれ配列番号33〜36で示される。F7、F9、D1およびE2のVL配列をコードするDNA配列はそれぞれ配列番号37〜40で示される。
一旦VHおよびVLセグメントをコードするDNA断片が得られると、これらのDNA断片を標準の組換えDNA技術によりさらに操作することで、例えば可変領域遺伝子が完全長抗体鎖遺伝子、Fab断片遺伝子またはscFv遺伝子に変換されうる。これらの操作では、VLもしくはVHをコードするDNA断片が別のタンパク質、例えば抗体の定常領域またはフレキシブルリンカー(flexible linker)をコードする別のDNA断片に作動可能に連結される。これに関連して用いられる「作動可能に連結される」という用語は、2つのDNA断片が2つのDNA断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームに保持するように連結されることを意味するように意図されている。
VH領域をコードする単離DNAは、VHをコードするDNAを重鎖定常領域(CH1、CH2、およびCH3)をコードする別のDNA分子に作動可能に連結することにより完全長重鎖遺伝子に変換されうる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で既知であり(例えばカバト E.A.(Kabat E.A.)ら(1991年)「免疫学的利益に関するタンパク質配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」、第5版、米国保健福祉省(U.S.Department of Health and Human Services)、NIH Publication No.91−3242を参照)、これらの領域を包含するDNA断片が標準のPCR増幅により得られうる。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgMまたはIgD定常領域でありうるが、最も好ましくはIgG1またはIgG4定常領域である。Fab断片重鎖遺伝子については、VHをコードするDNAは重鎖CH1定常領域のみをコードする別のDNA分子に作動可能に連結されうる。
VL領域をコードする単離DNAは、VLをコードするDNAを、軽鎖定常領域CLをコードする別のDNA分子に作動可能に連結することにより完全長軽鎖遺伝子(およびFab軽鎖遺伝子)に変換されうる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で既知であり(例えばカバト E.A.(Kabat E.A.)ら(1991年)「免疫学的利益に関するタンパク質配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」、第5版、米国保健福祉省(U.S.Department of Health and Human Services)、NIH Publication No.91−3242を参照)、これらの領域を包含するDNA断片は標準のPCR増幅により得られうる。好ましい実施形態では、軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域でありうる。
scFv遺伝子を作製するのに、VHおよびVLをコードするDNA断片がフレキシブルリンカー、例えばアミノ酸配列(Gly4−Ser)3をコードする別の断片に作動可能に連結されることで、VHおよびVL配列はフレキシブルリンカーで連結されたVLおよびVH領域を有する隣接した一本鎖タンパク質として発現されうる(例えば、バード(Bird)ら(1988年)Science 242:423−426頁;ハストン(Huston)ら(1988年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883頁;およびマッカファーティ(McCafferty)ら(1990年)、Nature 348:552−554頁を参照)。
本開示のモノクローナル抗体の産生
本開示のモノクローナル抗体(mAb)は、従来のモノクローナル抗体の方法、例えばコーラー(Kohler)およびミルスタイン(Milstein)(1975年)Nature 256:495頁の標準の体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む種々の技術により産生可能である。原理上、体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、モノクローナル抗体を産生するための他の技術、例えばBリンパ球のウイルス性または発癌性の形質転換が用いられうる。
本開示のモノクローナル抗体(mAb)は、従来のモノクローナル抗体の方法、例えばコーラー(Kohler)およびミルスタイン(Milstein)(1975年)Nature 256:495頁の標準の体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む種々の技術により産生可能である。原理上、体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、モノクローナル抗体を産生するための他の技術、例えばBリンパ球のウイルス性または発癌性の形質転換が用いられうる。
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ生成は極めて十分に確立された方法である。融合のために免疫された脾細胞を単離するための免疫プロトコルおよび技術は当該技術分野で既知である。融合相手(例えばマウス骨髄腫細胞)および融合方法についても既知である。
本開示のキメラまたはヒト化抗体は、上記のように調製される非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づいて調製されうる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするDNAは、目的の非ヒトハイブリドーマから得られ、標準の分子生物学技術を用いて非マウス(例えばヒト)免疫グロブリン配列を有するように改変されうる。例えば、キメラ抗体を作製するため、マウス可変領域は当該技術分野で既知の方法を用いてヒト定常領域に連結されうる(例えばキャビリー(Cabilly)らに交付された米国特許第4,816,567号明細書)。ヒト化抗体を作製するため、マウスCDR領域は当該技術分野で既知の方法を用いてヒトフレームワークに挿入されうる(例えば、ウインター(Winter)に交付された米国特許第5,225,539号明細書ならびにクイーン(Queen)らに交付された米国特許第5,530,101号明細書;米国特許第5,585,089号明細書;米国特許第5,693,762号明細書および米国特許第6,180,370号明細書を参照)。
好ましい実施形態では、本開示の抗体はヒトモノクローナル抗体である。CXCR4に特異的なかかるヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックまたはトランスクロモゾ−ムマウスを用いて産生されうる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモゾ−ムマウスは、本明細書中で各々HuMAbマウス(登録商標)およびKMマウス(登録商標)と称されるマウスを含み、本明細書中で総称して「ヒトIgマウス」と称される。
HuMAbマウス(登録商標)(メダレックス(Medarex(登録商標),Inc.))は、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化された変異とともに未転位のヒト重鎖(μおよびγ)ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座(miniloci)を有する(例えば、ロンバーグ(Lonberg)ら 1994年)Nature 368(6474):856−859頁を参照)。したがって、マウスは、マウスIgMまたはκの発現の低下を示し、免疫に応答し、導入されたヒト重鎖および軽鎖トランス遺伝子がクラススイッチおよび体細胞突然変異を受け、高親和性のヒトIgGκモノクローナル抗体が産生される(ロンバーグ N.(Lonberg N.)ら(1994年)上記;ロンバーグ N.(Lonberg N.)(1994年)「Handbook of Experimental Pharmacology」113:49−101頁にレビュー;ロンバーグ N.(Lonberg N.)およびハスザー D.(Huszar D.)(1995年)Intern.Rev.Immunol.13:65−93頁;ならびにハーディング F.(Harding F.)およびロンバーグ N.(Lonberg N.)(1995年)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536−546頁)。HuMabマウス(登録商標)の調製および使用ならびにかかるマウスにより保有されるゲノム修飾については、テイラー L.(Taylor L.)ら(1992年)Nucleic Acids Research 20:6287−6295頁;チェン J.(Chen J.)ら(1993年)International Immunology 5:647−656頁;テュアイヨン(Tuaillon)ら(1993年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720−3724頁;チョイ(Choi)ら(1993年)Nature Genetics 4:117−123頁;チェン J.(Chen J.)ら(1993年)EMBO J.12:821−830頁;テュアイヨン(Tuaillon)ら(1994年)J.Immunol.152:2912−2920頁;テイラー L.(Taylor L.)ら(1994年)International Immunology 6:579−591頁;ならびにフィッシュワイルド D.(Fishwild D.)ら(1996年)Nature Biotechnology 14:845−851頁にさらに記載されている(これらすべての内容はそれら全体が参照により本明細書中に具体的に援用される)。さらに、米国特許第5,545,806号明細書;米国特許第5,569,825号明細書;米国特許第5,625,126号明細書;米国特許第5,633,425号明細書;米国特許第5,789,650号明細書;米国特許第5,877,397号明細書;米国特許第5,661,016号明細書;米国特許第5,814,318号明細書;米国特許第5,874,299号明細書;および米国特許第5,770,429号明細書(すべてはロンバーグ(Lonberg)およびケイ(Kay)に交付)、スラニ(Surani)らに交付された米国特許第5,545,807号明細書;PCT公開、国際公開第92/03918号パンフレット、国際公開第93/12227号パンフレット、国際公開第94/25585号パンフレット、国際公開第97/13852号パンフレット、国際公開第98/24884号パンフレットおよび国際公開第99/45962号パンフレット(すべてはロンバーグ(Lonberg)およびケイ(Kay)に交付)、ならびにコーマン(Korman)らに交付されたPCT公開、国際公開第01/14424号パンフレットを参照のこと。
別の実施形態では、本開示のヒト抗体は、トランス遺伝子およびトランスクロモゾ−ム上でヒト免疫グロブリン配列を保有するマウス、例えばヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランスクロモゾ−ムを保有するマウスを用いて産生されうる。このマウスは、本明細書中で「KMマウス(登録商標)」と称され、イシダ(Ishida)らに交付されたPCT公開、国際公開第02/43478号パンフレットに詳述されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する他のトランスジェニック動物系は当該技術分野で使用可能であり、その使用により、本開示の抗CXCR4抗体が産生されうる。例えば、キセノマウス(Xenomouse)(アブジェニクス社(Abgenix,Inc.))として称される他のトランスジェニック系の使用が可能であり、かかるマウスは、例えばクチャーラパティ(Kucherlapati)らに交付された米国特許第5,939,598号明細書;米国特許第6,075,181号明細書;米国特許第6,114,598号明細書;米国特許第6,150,584号明細書および米国特許第6,162,963号明細書に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する他のトランスクロモゾ−ム動物系は当該技術分野で使用可能であり、その使用により、本開示の抗CXCR4抗体の産生が可能である。例えば、「TCマウス」と称される、ヒト重鎖トランスクロモゾ−ムとヒト軽鎖トランスクロモゾ−ムとの双方を保有するマウスの使用が可能であり、かかるマウスについてはトミヅカ(Tomizuka)ら(2000年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722−727頁に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモゾ−ムを保有するウシについての記載が当該技術分野でなされており(例えば、クロイワ(Kuroiwa)ら(2002年)Nature Biotechnology 20:889−894頁およびPCT出願の国際公開第2002/092812号パンフレット)、その使用により、本開示の抗CXCR4抗体の産生が可能である。
本開示のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を用いても調製可能である。ヒト抗体を単離するためのかかるファージディスプレイ法は、当該技術分野で確立されたものである。例えば、ラドナー(Ladner)らに交付された米国特許第5,223,409号明細書;米国特許第5,403,484号明細書;および米国特許第5,571,698号明細書;ドワー(Dower)らに交付された米国特許第5,427,908号明細書および米国特許第5,580,717号明細書;マッカファーティ(McCafferty)らに交付された米国特許第5,969,108号明細書および米国特許第6,172,197号明細書;ならびにグリフィス(Griffiths)らに交付された米国特許第5,885,793号明細書;米国特許第6,521,404号明細書;米国特許第6,544,731号明細書;米国特許第6,555,313号明細書;米国特許第6,582,915号明細書および米国特許第6,593,081号明細書を参照のこと。
本開示のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト抗体反応が免疫時に生成されうるようにヒト免疫細胞が再構成されているSCIDマウスを用いて調製されうる。かかるマウスは、例えばウィルソン(Wilson)らに交付された米国特許第5,476,996号明細書および米国特許第5,698,767号明細書に記載されている。
特に好ましい実施形態では、ヒト抗CXCR4抗体が、ブエクラー(Buechler)らによる米国特許第6,794,132号明細書に記載のようにヒトIgマウスとファージディスプレイ技術を併用して調製される。より詳細には、本方法は最初に、(上記のHuMabマウスまたはKMマウスなどの)ヒトIgマウスにおけるマウスのCXCR4抗原での免疫による抗CXCR4抗体応答の生成と、その後のマウスのリンパ細胞由来のヒト抗体鎖をコードする核酸の単離およびこれらの核酸のディスプレイベクター(例えばファージ)への導入によるディスプレイパッケージのライブラリの提供を含む。したがって、各ライブラリメンバーはヒト抗体鎖をコードする核酸を含み、各抗体鎖がディスプレイパッケージから提示される。次いで、ライブラリを、CXCR4抗原を用いてスクリーニングし、CXCR4に特異的に結合するライブラリメンバーが単離される。次いで、選択されたライブラリメンバーの核酸挿入物が単離され、標準の方法により配列決定され、選択されたCXCR4結合剤の軽鎖および重鎖可変配列が決定される。可変領域は、標準の組換えDNA技術、例えば可変領域のヒト重鎖および軽鎖定常領域をVH領域がCH領域に動作可能に連結されかつVL領域がCL領域に動作可能に連結されるように保有する発現ベクターへのクローニングにより、完全長抗体鎖に変換されうる。この組み合わされたトランスジェニックマウス/ファージディスプレイシステムを用いるヒト抗CXCR4抗体の調製に関するさらなる説明については実施例1を参照のこと。
ヒトIgマウスの免疫
ヒトIgマウスの使用により本開示のヒト抗体が産生される場合、かかるマウスは、ロンバーグ N.(Lonberg N.)ら(1994年)Nature 368(6474):856−859頁;フィッシュワイルド D.(Fishwild D.)ら(1996年)Nature Biotechnology 14:845−851頁;ならびにPCT公開の国際公開第98/24884号パンフレットおよび国際公開第01/14424号パンフレットに記載のように、CXCR4抗原および/または組換えCXCR4、またはCXCR4を発現する細胞、またはCXCR4融合タンパク質の精製または濃縮された調製物で免疫されうる。好ましくは、マウスは1回目の注入時には6〜16週齢となる。例えば、CXCR4抗原の精製または組換え調製物(5〜50μg)を用い、ヒトIgマウスの腹腔内での免疫が可能である。最も好ましくは、本開示の抗体の産生に用いられる免疫原は、膜内のその天然立体構造にヒトCXCR4を含み、その非限定例として、形質移入によりCXCR4を細胞表面上に発現する細胞、CXCR4を天然に発現する細胞(例えばCEM細胞)、およびCXCR4が内包されている人工膜(例えばリポソーム)、例えばCXCR4を内包するマグネティックプロテオリポソーム(magnetic proteoliposome)(MPL)が挙げられる(実施例1にさらに記載)。
ヒトIgマウスの使用により本開示のヒト抗体が産生される場合、かかるマウスは、ロンバーグ N.(Lonberg N.)ら(1994年)Nature 368(6474):856−859頁;フィッシュワイルド D.(Fishwild D.)ら(1996年)Nature Biotechnology 14:845−851頁;ならびにPCT公開の国際公開第98/24884号パンフレットおよび国際公開第01/14424号パンフレットに記載のように、CXCR4抗原および/または組換えCXCR4、またはCXCR4を発現する細胞、またはCXCR4融合タンパク質の精製または濃縮された調製物で免疫されうる。好ましくは、マウスは1回目の注入時には6〜16週齢となる。例えば、CXCR4抗原の精製または組換え調製物(5〜50μg)を用い、ヒトIgマウスの腹腔内での免疫が可能である。最も好ましくは、本開示の抗体の産生に用いられる免疫原は、膜内のその天然立体構造にヒトCXCR4を含み、その非限定例として、形質移入によりCXCR4を細胞表面上に発現する細胞、CXCR4を天然に発現する細胞(例えばCEM細胞)、およびCXCR4が内包されている人工膜(例えばリポソーム)、例えばCXCR4を内包するマグネティックプロテオリポソーム(magnetic proteoliposome)(MPL)が挙げられる(実施例1にさらに記載)。
CXCR4に対する完全ヒトモノクローナル抗体を産生するための詳細な方法が下記の実施例1に記載されている。様々な抗原を用いる試験を重ねることで、トランスジェニックマウスが、最初に完全フロインドアジュバント中の抗原で腹腔内(IP)に免疫され、それに続き、不完全フロインドアジュバント中の抗原で隔週、最大で全6回IP免疫される時、応答することが示されている。しかし、フロインド以外のアジュバントについても有効であることが見出されている。さらに、アジュバントの非存在下では全細胞における免疫原性が高いことが見出されている。免疫応答は、後眼窩(retroorbital)の出血により得られる血漿試料を用いる免疫プロトコルを通して監視可能である。血漿はELISAでスクリーニング可能であり(後述するように)、十分な力価の抗CXCR4ヒト免疫グロブリンを有するマウスが融合において用いられうる。マウスは、殺滅および脾臓摘出の3日前、抗原で静脈内に追加免疫されうる。免疫ごとに2〜3の融合がなされる必要がありうることが想定される。典型的にはマウス6〜24匹が各抗原に対して免疫される。通常、HCo7およびHCo12株の双方が用いられる。さらに、HCo7およびHCo12トランス遺伝子は共に2つの異なるヒト重鎖トランス遺伝子(HCo7/HCo12)を有する単一のマウスに育種されうる。その他としてまたはさらに、KMマウス(登録商標)株が実施例1に記載のように用いられうる。
本開示のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成
本開示のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するため、免疫されたマウス由来の脾細胞および/またはリンパ節細胞が単離され、適切な不死化細胞系、例えばマウス骨髄腫細胞系に融合されうる。生成されたハイブリドーマでは、抗原特異的な抗体の産生についてスクリーニング可能である。例えば、免疫されたマウス由来の脾臓リンパ球の単一の細胞懸濁液が、50%PEGとともにP3X63−Ag8.653非分泌マウス骨髄腫細胞(ATCC、CRL1580)の数の1/6に融合されうる。あるいは、免疫マウス由来の脾臓リンパ球の単一の細胞懸濁液は、サイトパルス(CytoPulse)大型チャンバ細胞融合エレクトロポレーター(メリーランド州グレンバーニー(Glen Burnie)のサイト・パルス・サイエンシズ(CytoPulse Sciences,Inc.))を用いる、電場に基づく電気融合法を用いて融合されうる。細胞は、平底マイクロタイタープレート内に約2×105でプレーティング後、20%胎仔クローン血清、18%「653」馴化培地、5%オリゲン(origen)(IGEN)、4mMのL−グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、5mMのヘペス、0.055mMの2−メルカプトエタノール、50単位/mlのペニシリン、50mg/mlのストレプトマイシン、50mg/mlのゲンタマイシンおよび1×HAT(シグマ(Sigma);HATは融合の24時間後に添加される)を含有する選択培地内で2週間インキュベートされる。約2週間後、細胞はHATがHTと交換された培地内で培養されうる。次いで、各ウェルにおけるヒトモノクローナルIgMおよびIgG抗体についてはELISAによりスクリーニング可能である。一旦多数のハイブリドーマの成長が生じると、培地は通常10〜14日後に観察されうる。抗体を分泌するハイブリドーマは、再プレーティングされ、再びスクリーニングされ、依然としてヒトIgG陽性である場合、モノクローナル抗体は限界希釈により少なくとも2回サブクローニングされうる。次いで、特徴づけのため、安定なサブクローンをインビトロで培養することで、組織培地内に少量の抗体が産生されうる。
本開示のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するため、免疫されたマウス由来の脾細胞および/またはリンパ節細胞が単離され、適切な不死化細胞系、例えばマウス骨髄腫細胞系に融合されうる。生成されたハイブリドーマでは、抗原特異的な抗体の産生についてスクリーニング可能である。例えば、免疫されたマウス由来の脾臓リンパ球の単一の細胞懸濁液が、50%PEGとともにP3X63−Ag8.653非分泌マウス骨髄腫細胞(ATCC、CRL1580)の数の1/6に融合されうる。あるいは、免疫マウス由来の脾臓リンパ球の単一の細胞懸濁液は、サイトパルス(CytoPulse)大型チャンバ細胞融合エレクトロポレーター(メリーランド州グレンバーニー(Glen Burnie)のサイト・パルス・サイエンシズ(CytoPulse Sciences,Inc.))を用いる、電場に基づく電気融合法を用いて融合されうる。細胞は、平底マイクロタイタープレート内に約2×105でプレーティング後、20%胎仔クローン血清、18%「653」馴化培地、5%オリゲン(origen)(IGEN)、4mMのL−グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、5mMのヘペス、0.055mMの2−メルカプトエタノール、50単位/mlのペニシリン、50mg/mlのストレプトマイシン、50mg/mlのゲンタマイシンおよび1×HAT(シグマ(Sigma);HATは融合の24時間後に添加される)を含有する選択培地内で2週間インキュベートされる。約2週間後、細胞はHATがHTと交換された培地内で培養されうる。次いで、各ウェルにおけるヒトモノクローナルIgMおよびIgG抗体についてはELISAによりスクリーニング可能である。一旦多数のハイブリドーマの成長が生じると、培地は通常10〜14日後に観察されうる。抗体を分泌するハイブリドーマは、再プレーティングされ、再びスクリーニングされ、依然としてヒトIgG陽性である場合、モノクローナル抗体は限界希釈により少なくとも2回サブクローニングされうる。次いで、特徴づけのため、安定なサブクローンをインビトロで培養することで、組織培地内に少量の抗体が産生されうる。
ヒトモノクローナル抗体を精製するため、選択されたハイブリドーマはモノクローナル抗体の精製用の2リットルのスピナーフラスコ内で成長されうる。親和性クロマトグラフィー前、上清がプロテインA−セファローズ(ニュージャージー州ピスカタウェイ(Piscataway)のファルマシア(Pharmacia))を用いて濾過され、濃縮される。溶出されたIgGをゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーで検査することで純度が保証されうる。緩衝溶液はPBSに交換可能であり、濃度は1.43の減衰係数を用い、OD280により判定可能である。モノクローナル抗体は、一定量に分割され、−80℃で保存されうる。
本開示のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの生成
本開示の抗体は、例えば当該技術分野で周知のように組換えDNA技術と遺伝子形質移入方法を併用し、宿主細胞のトランスフェクトーマ内でも産生されうる(例えば、モリソン(Morrison),S.(1985年)Science 229:1202頁)。
本開示の抗体は、例えば当該技術分野で周知のように組換えDNA技術と遺伝子形質移入方法を併用し、宿主細胞のトランスフェクトーマ内でも産生されうる(例えば、モリソン(Morrison),S.(1985年)Science 229:1202頁)。
例えば、抗体またはその抗体断片を発現するため、部分長または完全長の軽鎖および重鎖をコードするDNAが標準の分子生物学技術(例えば目的の抗体を発現するハイブリドーマを用いるPCR増幅またはcDNAクローニング)により得られ、DNAは、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように発現ベクターに挿入されうる。これに関連し、「作動可能に連結される」という用語は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図された機能を果たすようにベクターにライゲートされることを意味するように意図されている。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いられる発現宿主細胞と適合可能であるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は別々のベクターに挿入されうるかまたは、より典型的には両遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準の方法(例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上での相補的制限部位のライゲーションまたは制限部位が全く存在しない場合での平滑末端ライゲーション)により発現ベクターに挿入される。本明細書中に記載の抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用い、それらを、所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターに、VHセグメントがベクター内のCHセグメントに作動可能に連結されかつVKセグメントがベクター内のCLセグメントに作動可能に連結されるように挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作製可能である。さらにまたはその他として、組換え発現ベクターは、抗体鎖の宿主細胞からの分泌を促進するシグナルペプチドをコードしうる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームに連結されるようにベクターにクローン化されうる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種のシグナルペプチド(すなわち非免疫グロブリンンパク質由来のシグナルペプチド)でありうる。
抗体鎖遺伝子に加え、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞内で抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保有する。「調節配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御因子(例えばポリアデニル化シグナル)を含むように意図されている。かかる調節配列は、例えばゲッデル(Goeddel)(「遺伝子発現技術(Gene Expression Technology)」Methods in Enzymology 185、アカデミック・プレス(Academic Press)、カリフォルニア州サンディエゴ(San Diego)(1990年))に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が形質転換対象の宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの要素に依存しうることが当業者により理解されるであろう。哺乳類宿主細胞の発現における好ましい調節配列は、哺乳類細胞内で高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルス因子、例えばサイトメガロウイルス(CMV)、サルウイルス40(SV40)、アデノウイルス(例えばアデノウィルスメジャー後期プロモーター(AdMLP))およびポリオーマに由来するプロモーターおよび/またはエンハンサーを含む。あるいは、非ウイルス調節配列、例えばユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターが用いられうる。さらに、異なる供給源由来の配列からなる調節因子、例えばSRαプロモーター系は、ヒトT細胞白血病ウイルスタイプ1のSV40初期プロモーターおよび長い末端リピートに由来する配列を有するものである(武部(Takebe),Y.ら(1988年)、Mol.Cell.Biol.8:466−472頁)。
抗体鎖遺伝子および調節配列に加え、本開示の組換え発現ベクターは、追加配列、例えば宿主細胞内でのベクターの複製(例えば複製の起点)を調節する配列および選択可能マーカー遺伝子を保有しうる。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する(例えば、米国特許第4,399,216号明細書、米国特許第4,634,665号明細書および米国特許第5,179,017号明細書(いずれもアクセル(Axel)らによる)を参照)。例えば典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞上で薬物、例えばG418、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートに耐性を与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、(メトトレキセートの選択/増幅の場合にdhfr−宿主細胞内で用いられる)ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子および(G418の選択用の)ネオ遺伝子を含む。
軽鎖および重鎖の発現においては、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは、標準技術により宿主細胞に形質移入される。「形質移入」という用語の様々な形態は、外因性DNAの原核または真核宿主細胞への導入のための一般に用いられる多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、カルシウム−リン酸塩の沈降、DEAE−デキストランによる形質移入などを包含するように意図されている。原核または真核宿主細胞のいずれかにおいて本開示の抗体を発現することは理論的に可能であるが、真核細胞内および最も好ましくは哺乳類宿主細胞内での抗体の発現が、かかる真核細胞および特に哺乳類細胞が適切に折り畳まれ免疫学的に活性な抗体を構築し分泌する可能性が原核細胞よりも高いことから最も好ましい。原核生物での抗体遺伝子の発現は、高収量の活性抗体の産生にとって無効であることが報告されている(ボス(Boss),M.A.およびウッド(Wood),C.R.(1985年)、Immunology Today 6:12−13頁)。
本開示の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)(例えばR.J.カウフマン(Kaufman)およびP.A.シャープ(Sharp)(1982年)Mol.Biol.159:601−621頁に記載のように、DHFR選択可能マーカーとともに用いられる、ウアラウブ(Urlaub)およびチェイシン(Chasin)(1980年)、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:4216−4220頁に記載のdhfr−CHO細胞を含む)、NSO骨髄腫細胞、COS細胞およびSP2細胞を含む。特に、NSO骨髄腫細胞の場合の使用においては、別の好ましい発現系は、国際公開第87/04462号パンフレット(ウィルソン(Wilson)に付与)、国際公開第89/01036号パンフレット(ベビントン(Bebbington)に付与)および欧州特許第338,841号明細書(ベビントン(Bebbington)に付与)に開示されるGS遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞内での抗体の発現またはより好ましくは抗体の宿主細胞が成長される培地への分泌を実現するのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより産生される。抗体は、標準のタンパク質精製方法を用いて培地から回収されうる。
抗原に結合する抗体の特徴づけ
本開示の抗体のCXCR4への結合については、例えば標準のフローサイトメトリー法により試験可能である。本開示の抗体が好ましくはCXCR4を膜内のその天然立体構造で認識することから、CXCR4への結合についての試験は、好ましくはCXCR4の天然立体構造を発現する試薬を用いるアッセイ(例えばフローサイトメトリー)で行われる。結合アッセイで用いられうるCXCR4の天然立体構造を発現する試薬の非限定例として、CXCR4を天然に発現する細胞(例えばCEM細胞)、CXCR4を発現するように形質移入されている細胞(例えば、CXCR4発現ベクターが形質移入されたR1610細胞)ならびにCXCR4が内包されているリポソーム(例えばCXCR4を内包するマグネティックプロテオリポソーム)が挙げられ、それら各々は実施例にさらに詳述される。つまり、フローサイトメトリーアッセイにおいては、CXCR4を発現する細胞は、試験抗体とともにインキュベートされ、洗浄され、試験抗体に結合可能な標識二次試薬とともにインキュベートされ、再洗浄され、(例えばFACS機器を用いて)二次試薬の細胞への結合の検出を目的に分析がなされる。好ましくは、フローサイトメトリーによる評価で最高の滴定濃度を生じさせるマウスが、融合かまたは(例えばマウスのB細胞から作製される抗体ライブラリのファージディスプレイスクリーニングによる)抗体のさらなる選択において用いられることになる。
本開示の抗体のCXCR4への結合については、例えば標準のフローサイトメトリー法により試験可能である。本開示の抗体が好ましくはCXCR4を膜内のその天然立体構造で認識することから、CXCR4への結合についての試験は、好ましくはCXCR4の天然立体構造を発現する試薬を用いるアッセイ(例えばフローサイトメトリー)で行われる。結合アッセイで用いられうるCXCR4の天然立体構造を発現する試薬の非限定例として、CXCR4を天然に発現する細胞(例えばCEM細胞)、CXCR4を発現するように形質移入されている細胞(例えば、CXCR4発現ベクターが形質移入されたR1610細胞)ならびにCXCR4が内包されているリポソーム(例えばCXCR4を内包するマグネティックプロテオリポソーム)が挙げられ、それら各々は実施例にさらに詳述される。つまり、フローサイトメトリーアッセイにおいては、CXCR4を発現する細胞は、試験抗体とともにインキュベートされ、洗浄され、試験抗体に結合可能な標識二次試薬とともにインキュベートされ、再洗浄され、(例えばFACS機器を用いて)二次試薬の細胞への結合の検出を目的に分析がなされる。好ましくは、フローサイトメトリーによる評価で最高の滴定濃度を生じさせるマウスが、融合かまたは(例えばマウスのB細胞から作製される抗体ライブラリのファージディスプレイスクリーニングによる)抗体のさらなる選択において用いられることになる。
上記のフローサイトメトリーアッセイを用い、CXCR4免疫原と陽性の反応性を示すハイブリドーマについてのスクリーニングも可能である。高い結合活性でCXCR4に結合する抗体を発現するハイブリドーマのサブクローニングと、さらなる特徴づけが行われる。各ハイブリドーマ由来の1つのクローンは、(フローサイトメトリーにより)親細胞の反応性を保持し、−140℃で保存された5〜10のバイアルの細胞バンクの作製および抗体精製のために選択されうる。
抗CXCR4抗体を精製するため、選択されたハイブリドーマを2リットルのスピナーフラスコ内で成長させ、モノクローナル抗体の精製を行ってもよい。上清を、プロテインA−セファローズ(ニュージャージー州ピスカタウェイ(Piscataway)のファルマシア(Pharmacia))を用いる親和性クロマトグラフィー前に濾過し、濃縮してもよい。溶出されたIgGをゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーにより検査し、純度を保証してもよい。緩衝溶液をPBSに交換し、濃度を、1.43消衰係数を用いるOD280によって決定してもよい。モノクローナル抗体を一定量に分割し、−80℃で保存してもよい。
選択された抗CXCR4モノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するか否かを判定するため、各抗体が市販の試薬(イリノイ州ロックフォード(Rockford)のピアス(Pierce))を用いてビオチン化されうる。未標識のモノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を用いる競合試験が、ELISAプレートがCXCR4を発現する細胞でコートされる全細胞ELISAアッセイを用いて実施可能であり、未標識抗体におけるCXCR4発現細胞への結合に対するビオチン化抗体との競合能が試験される。ビオチン化mAbの結合がストレプトアビジン−アルカリホスファターゼプローブで検出可能である。
精製抗体アイソタイプを判定するため、アイソタイプELISAを特定のアイソタイプの抗体に対して特異的な試薬を用いて行ってもよい。例えば、ヒトモノクローナル抗体アイソタイプを判定するため、マイクロタイタープレートのウェルを1μg/mlの抗ヒト免疫グロブリンで4℃で一晩コートしてもよい。1% BSAでブロック後、プレートは1μg/ml以下の試験モノクローナル抗体または精製されたアイソタイプ対照と周囲温度で1〜2時間反応される。次いで、ウェルをヒトIgG1またはヒトIgMのいずれかに特異的なアルカリホスファターゼと複合されたプローブと反応させてもよい。プレートは展開され、上記のように分析される。
抗CXCR4ヒトIgGでは、ウエスタンブロッティングにより、CXCR4抗原との反応性についてさらに試験してもよい。つまり、CXCR4に対し、調製し、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ってもよい。電気泳動後、分離された抗原はニトロセルロース膜に移され、10%ウシ胎仔血清でブロックされ、試験対象のモノクローナル抗体でプローブされる。ヒトIgGの結合性を、抗ヒトIgGアルカリホスファターゼを用いて検出し、BCIP/NBT基質タブレット(ミズーリ州セントルイス(St.Louis)のシグマ・ケミカル(Sigma Chem.Co.))を用いて展開してもよい。
本開示の抗体の結合特異性は、例えばフローサイトメトリーにより、抗体のCXCR4を発現する細胞への結合を監視することによっても判定可能である。典型的には、細胞系、例えばCHO細胞系には、CXCR4の膜貫通形態をコードする発現ベクターの形質移入が可能である。タグに対する抗体を用いる検出においては、形質移入されたタンパク質は、好ましくはN末端にタグ、例えばmyc−tagを含みうる。本開示の抗体のCXCR4への結合性は、形質移入細胞を抗体とともにインキュベートし、結合抗体を検出することにより判定可能である。形質移入されたタンパク質上での抗体のタグへの結合は、陽性対照として用いられうる。
免疫複合体
別の態様では、本開示は、治療的部分、例えば細胞毒素、薬剤(例えば免疫抑制剤)または放射性毒素に複合された、抗CXCR4抗体、またはそれらの断片を特徴とする。かかる複合体は本明細書中で「免疫複合体」と称される。1つ以上の細胞毒素を含む免疫複合体は「免疫毒素」と称される。細胞毒素または細胞毒性物質は、細胞に対して有害な(例えば細胞を殺滅する)任意の作用物質を含む。例として、タクソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド(tenoposide)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン(dihydroxy anthracin dione)、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにそれらの類似体または相同体が挙げられる。治療物質は、例えば、代謝拮抗物質(例えば、メトトレキセート、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン、5−フルオロウラシルデカルバジン(5−fluorouracil decarbazine))、アルキル剤(例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロトスファミド(cyclothosphamide)、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンCおよびシス−ジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(旧ダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(旧アクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン(AMC))ならびに抗有糸分裂剤(例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)も含む。
別の態様では、本開示は、治療的部分、例えば細胞毒素、薬剤(例えば免疫抑制剤)または放射性毒素に複合された、抗CXCR4抗体、またはそれらの断片を特徴とする。かかる複合体は本明細書中で「免疫複合体」と称される。1つ以上の細胞毒素を含む免疫複合体は「免疫毒素」と称される。細胞毒素または細胞毒性物質は、細胞に対して有害な(例えば細胞を殺滅する)任意の作用物質を含む。例として、タクソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド(tenoposide)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン(dihydroxy anthracin dione)、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにそれらの類似体または相同体が挙げられる。治療物質は、例えば、代謝拮抗物質(例えば、メトトレキセート、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン、5−フルオロウラシルデカルバジン(5−fluorouracil decarbazine))、アルキル剤(例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロトスファミド(cyclothosphamide)、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンCおよびシス−ジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(旧ダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(旧アクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン(AMC))ならびに抗有糸分裂剤(例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)も含む。
本開示の抗体に複合可能な細胞毒素治療薬の他の好ましい例として、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、メイタンシンおよびオーリスタチン(auristatins)およびそれらの誘導体が挙げられる。カリケアマイシン抗体複合体の例として市販のもの(ミロターグ(Mylotarg)(登録商標);アメリカン・ホーム・プロダクツ(American Home Products))が挙げられる。
細胞毒素は、当該技術分野で利用可能なリンカー技術を用いて本開示の抗体に複合されうる。細胞毒素を抗体に複合させるのに用いられているリンカータイプの例として、限定はされないが、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチドを含有するリンカーが挙げられる。例えば、リソソーム区画内で低いpHにより切断を受けやすいかまたはプロテアーゼ、例えばカテプシン(例えば、カテプシンB、C、D)などの腫瘍組織内で優先的に発現されるプロテアーゼにより切断を受けやすいリンカーを選択してもよい。
細胞毒素のタイプ、リンカーおよび治療物質を抗体に複合させるための方法についてのさらなる考察としては、斉藤 G.(Saito G.)ら(2003年)Adv.Drug Deliv.Rev.55:199−215頁;トレイル P.A.(Trail P.A.)ら(2003年)Cancer Immunol.Immunother.52:328−337頁;ペイン G.(Payne G.)(2003年)Cancer Cell 3:207−212頁;アレン T.M.(Allen T.M.)(2002年)Nat.Rev.Cancer 2:750−763頁;パスタン I.(Pastan I.)およびクレイトマン R.J.(Kreitman R.J.)(2002年)Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089−1091頁;センター P.D.(Senter P.D.)およびスプリンガー C.J.(Springer C.J.)(2001年)Adv.Drug Deliv.Rev.53:247−264頁も参照のこと。
本開示の抗体を、放射性同位体にも複合し、放射性免疫複合体とも称される細胞毒性のある放射性医薬品を生成してもよい。診断または治療用途として抗体に複合可能な放射性同位体の例として、限定はされないが、ヨウ素131、ヨウ素125、インジウム111、イットリウム90およびルテチウム177が挙げられる。放射性免疫複合体を調製するための方法は、当該技術分野で確立されている。放射性免疫複合体の例は、ゼバリン(Zevalin)(登録商標)(IDECファーマシューティカルズ(IDEC Pharmaceuticals))およびベクサール(Bexxar)(登録商標)(コリクサ・ファーマシューティカルズ(Corixa Pharmaceuticals))などが市販されており、同様の方法を用い、本開示の抗体を用いて放射性免疫複合体を調製してもよい。
本開示の抗体複合体を用いて所与の生物学的応答を修飾可能であり、薬剤部分は従来の化学治療物質に限定されるものとして解釈されるべきではない。例えば、薬剤部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドでありうる。かかるタンパク質は、例えば、酵素活性毒素またはその活性断片、例えばアブリン、リシンA、シュードモナスエキソトキシンまたはジフテリア毒素;腫瘍壊死因子またはインターフェロン−γなどのタンパク質;あるいは、例えばリンホカイン、インターロイキン−1(「IL−1」)、インターロイキン−2(「IL−2」)、インターロイキン−6(「IL−6」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM−CSF」)、顆粒球コロニー刺激因子(「G−CSF」)または他の成長因子などの生物学的応答修飾因子を含みうる。
かかる治療部分を抗体に複合させるための技術は周知であり、例えば、アーノン(Arnon)ら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、レイスフェルド(Reisfeld)ら(編)、243−56頁(アラン・アール・リス(Alan R.Liss,Inc.)1985年);ヘルストローム(Hellstrom)ら、「Antibodies For Drug Delivery」Controlled Drug Delivery(第2版)、ロビンソン(Robinson)ら(編)、623−53頁(マーセル・デッカー(Marcel Dekker,Inc.)1987年);ソルペ(Thorpe)、「Antibodies Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review」Monoclonal Antibodies’84:Biological and Clinical Applications、ピンチエラ(Pinchera)ら(編)、475−506頁(1985年);「Analysis,Results and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、ボールドウィン(Baldwin)ら(編)、303−16頁(アカデミック・プレス(Academic Press)1985年);ならびにソルペ(Thorpe)ら、Immunol.Rev.62:119−58頁(1982年)を参照のこと。
二重特異性分子
別の態様では、本開示は、本開示の抗CXCR4抗体またはその断片を含む二重特異性分子を特徴とする。本開示の抗体またはその抗原結合部分が別の機能分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質(例えば別の抗体または受容体にのリガンド)に誘導体化または連結され、少なくとも2つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子が生成されうる。本開示の抗体が実際に2つ以上の他の機能分子に誘導体化または連結され、3つ以上の異なる結合部位および/または標的分子に結合する多重特異性分子が生成される可能性があり、かかる多重特異性分子は本明細書で用いられる「二重特異性分子」という用語に包含されるようにも意図されている。本開示の二重特異性分子を作製するため、本開示の抗体は、二重特異性分子が生成されるように、1つ以上の他の結合分子、例えば別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣体(binding mimetic)に(例えば化学共役、遺伝子融合、非共有結合またはその他により)機能的に連結されうる。
別の態様では、本開示は、本開示の抗CXCR4抗体またはその断片を含む二重特異性分子を特徴とする。本開示の抗体またはその抗原結合部分が別の機能分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質(例えば別の抗体または受容体にのリガンド)に誘導体化または連結され、少なくとも2つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子が生成されうる。本開示の抗体が実際に2つ以上の他の機能分子に誘導体化または連結され、3つ以上の異なる結合部位および/または標的分子に結合する多重特異性分子が生成される可能性があり、かかる多重特異性分子は本明細書で用いられる「二重特異性分子」という用語に包含されるようにも意図されている。本開示の二重特異性分子を作製するため、本開示の抗体は、二重特異性分子が生成されるように、1つ以上の他の結合分子、例えば別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣体(binding mimetic)に(例えば化学共役、遺伝子融合、非共有結合またはその他により)機能的に連結されうる。
したがって、本開示は、CXCR4に対する少なくとも1つの第1の結合特異性および第2の標的エピトープに対する第2の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。本開示の特定の実施形態では、第2の標的エピトープはFc受容体、例えばヒトFcγRI(CD64)またはヒトFcα受容体(CD89)である。したがって、本開示は、FcγRまたはFcαRを発現するエフェクター細胞(例えば、単球、マクロファージまたは多形核球細胞(PMN))とCXCR4を発現する標的細胞の双方に結合可能な二重特異性分子を含む。これらの二重特異性分子は、エフェクター細胞に対するCXCR4発現細胞を標的にし、かつ、Fc受容体媒介性のエフェクター細胞活性、例えばCXCR4発現細胞の食作用、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)、サイトカイン放出あるいはスーパーオキシドアニオンの生成を引き起こす。
二重特異性分子が多重特異性である場合の本開示の実施形態では、同分子は、抗Fc結合特異性および抗CXCR4結合特異性に加え、第3の結合特異性をさらに含みうる。一実施形態では、第3の結合特異性は、抗促進因子(anti−enhancement factor)(EF)部分、例えば細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合し、それにより標的細胞に対する免疫応答を高める分子である。「抗促進因子部分」は、所与の分子、例えば抗原または受容体に結合し、それによりFc受容体または標的細胞抗原における結合決定因子の効果の促進をもたらす抗体、機能抗体断片またはリガンドでありうる。「抗促進因子部分」はFc受容体または標的細胞抗原に結合しうる。あるいは、抗促進因子部分は、第1および第2の結合特異性の結合対象である実体とは異なる実体に結合しうる。例えば、抗促進因子部分は、(例えば標的細胞に対する免疫応答の増大をもたらすCD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM−1または他の免疫細胞を介して)細胞毒性T細胞に結合しうる。
一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、結合特異性として、例えばFab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fd、dAb、または一本鎖Fvを含む、少なくとも1つの抗体またはその抗体断片を含む。ラドナー(Ladner)らに交付された米国特許第4,946,778号明細書(その全体は参照により明示的に援用される)に記載のように、抗体は、Fvまたは一本鎖コンストラクトなどの軽鎖または重鎖二量体またはその任意の最小断片でもありうる。
一実施形態では、Fcγ受容体に対する結合特異性はモノクローナル抗体により提供され、その結合はヒト免疫グロブリンG(IgG)により遮断されることはない。本明細書で用いられる「IgG受容体」という用語は、染色体1上に位置する8つのγ鎖遺伝子のいずれかを示す。これらの遺伝子は、3つのFcγ受容体クラス:FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)およびFcγRIII(CD16)にグループ化された全部で12の膜貫通または可溶性受容体アイソフォームをコードする。好ましい一実施形態では、Fcγ受容体はヒト高親和性FcγRIである。ヒトFcγRIは72kDaの分子であり、単量体IgGに対して高い親和性を示す(108−109M−1)。
特定の好ましい抗Fcγモノクローナル抗体の産生および特徴づけについては、ファンガー(Fanger)らに交付されたPCT公開、国際公開第88/00052号パンフレットおよび米国特許第4,954,617号明細書において記載されており、それらの教示内容は参照により本明細書中に十分に援用される。これらの抗体は受容体のFcγ結合部位から離れた部位でFcγRI、FcγRIIまたはFcγRIIIのエピトープに結合することから、それらの結合がIgGの生理的レベルにより実質的に遮断されることはない。本開示で有用な特異的な抗FcγRI抗体は、mAb22、mAb32、mAb44、mAb62およびmAb197である。mAb32を産生するハイブリドーマは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)、ATCC登録番号HB9469から入手可能である。他の実施形態では、抗Fcγ受容体抗体はモノクローナル抗体22のヒト化形態である(H22)。H22抗体の産生および特徴づけについては、グラジアノ(Graziano),R.F.ら(1995年)J.Immunol155(10):4996−5002頁およびテンペスト(Tempest)らに交付されたPCT公開、国際公開第94/10332号パンフレットに記載されている。H22抗体産生細胞系は、HA022CL1の指定の下でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)に寄託されたものであり、登録番号CRL11177を有する。
さらに他の好ましい実施形態では、Fc受容体に対する結合特異性はヒトIgA受容体、例えばFc−α受容体(FcαRI(CD89))に結合する抗体により提供され、その結合は好ましくはヒト免疫グロブリンA(IgA)により遮断されることはない。「IgA受容体」という用語は、染色体19上に位置する1つのα遺伝子の遺伝子産物(FcαRI)を含むように意図されている。この遺伝子は、5〜110kDaの数種の交互にスプライスされた膜貫通アイソフォームをコードすることが知られている。FcαRI(CD89)は、単球/マクロファージ、好酸性および好中性顆粒球上に構成的に発現されるが、非エフェクター細胞集団上に発現されることはない。FcαRIは、IgA1およびIgA2の双方に対して中程度の親和性(約5×107M−1)を有し、G−CSFまたはGM−CSFなどのサイトカインへの暴露時に増加する(モートン(Morton),H.C.ら(1996年)、Critical Reviews in Immunology 16:423−440頁)。A3、A59、A62およびA77として同定された4つのFcαRIに特異的なモノクローナル抗体は、IgAリガンド結合ドメイン外部のFcαRIに結合するものであり、記載がなされている(モンテイロ(Monteiro),R.C.ら(1992年)、J.Immunol.148:1764頁)。
FcαRIおよびFcγRIは、(1)主に免疫エフェクター細胞、例えば単球、PMN、マクロファージおよび樹状細胞の上で発現され、(2)高レベルで発現され(例えば1細胞当たり5,000−100,000)、(3)細胞毒性活性のメディエーター(例えばADCC、食作用)であり、かつ(4)それらに対して標的とされる、自己抗原を含む抗原の抗原提示の促進を媒介することから、本開示の二重特異性分子において用いられる要因となる好ましい誘発受容体である。
ヒトモノクローナル抗体が好ましい一方、本開示の二重特異性分子において用いられうる他の抗体がマウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
本開示の二重特異性分子は、構成要素の結合特異性、例えば抗FcRおよび抗CXCR4結合特異性を当該技術分野で既知の方法を用いて複合することにより調製されうる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性は、別々にもたらされ、次いで互いに複合されうる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、種々の共役剤または架橋剤が共有結合に用いられうる。架橋剤の例として、プロテインA、カルボジイミド、N−スクシンイミジル−S−アセチル−チオアセテート(SATA)、5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)(DTNB)、o−フェニレンジマレイミド(oPDM)、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)およびスルホスクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(スルホ−SMCC)が挙げられる(例えば、カルボウスキー(Karpovsky)ら(1984年)J.Exp.Med.160:1686頁;リウ M.A.(Liu M.A.)ら(1985年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648頁を参照)。他の方法として、パウルス(Paulus)(1985年)Behring Ins.Mitt.No.78:118−132頁;ブレナン(Brennan)ら(1985年)Science 229:81−83頁およびグレニー(Glennie)ら(1987年)J.Immunol.139:2367−2375頁に記載の方法が挙げられる。好ましい複合剤はSATAおよびスルホ−SMCCであり、いずれもピアス・ケミカル(Pierce Chemical Co.)(イリノイ州ロックフォード(Rockford))から入手可能である。
結合特異性が抗体である場合、それらは2つの重鎖のC末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して複合されうる。特に好ましい実施形態では、ヒンジ領域は、複合に先立ち、奇数、好ましくは1つのスルフヒドリル残基を有するように修飾される。
あるいは、両方の結合特異性は同じベクター内にコードされ、かつ同じ宿主細胞内で発現され、構築されうる。この方法は、二重特異性分子がmAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab’)2またはリガンド×Fab融合タンパク質である場合に特に有用である。本開示の二重特異性分子は、1つの一本鎖抗体および結合決定因子を含む一本鎖分子、または2つの結合決定因子を含む一本鎖二重特異性分子でありうる。二重特異性分子は、少なくとも2つの一本鎖分子を含みうる。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば米国特許第5,260,203号明細書;米国特許第5,455,030号明細書;米国特許第4,881,175号明細書;米国特許第5,132,405号明細書;米国特許第5,091,513号明細書;米国特許第5,476,786号明細書;米国特許第5,013,653号明細書;米国特許第5,258,498号明細書;および米国特許第5,482,858号明細書に記載されている(これらのすべては参照により本明細書中に明示的に援用される)。
二重特異性分子のその特異的な標的に対する結合は、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、FACS分析、バイオアッセイ(例えば成長阻害)またはウエスタンブロットアッセイによって確認されうる。これらの各アッセイでは、一般に、特別な目的のタンパク質−抗体複合体の存在が目的の複合体に対して特異的な標識試薬(例えば抗体)の使用により検出される。例えば、FcR−抗体複合体は、例えば、抗体−FcR複合体を認識しかつそれに対して特異的に結合する酵素結合抗体または抗体断片を用いて検出されうる。あるいは、複合体は種々の他のイムノアッセイのいずれかを用いて検出されうる。例えば、抗体は放射活性物質で標識され、ラジオイムノアッセイ(RIA)で用いられうる(例えば、ワイントラウブ B.(Weintraub B.)、「Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques」、米国内分泌学会(The Endocrine Society)、1986年3月(参照により本明細書中に援用される)を参照)。放射性同位体は、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用などの手段あるいはオートラジオグラフィーにより検出されうる。
医薬組成物
別の態様では、本開示は、組成物、例えば医薬的に許容できる担体とともに調合された本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分のうちの1つまたは組み合わせを含有する医薬組成物を提供する。かかる組成物は、本開示の(例えば2種もしくは3種以上の異なる)抗体または免疫複合体または二重特異性分子のうちの1つまたはそれらの組み合わせを含有しうる。例えば、本開示の医薬組成物は、標的抗原上で異なるエピトープに結合するかまたは相補的活性を有する抗体(または免疫複合体または二重特異性抗体)の組み合わせを含有しうる。
別の態様では、本開示は、組成物、例えば医薬的に許容できる担体とともに調合された本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分のうちの1つまたは組み合わせを含有する医薬組成物を提供する。かかる組成物は、本開示の(例えば2種もしくは3種以上の異なる)抗体または免疫複合体または二重特異性分子のうちの1つまたはそれらの組み合わせを含有しうる。例えば、本開示の医薬組成物は、標的抗原上で異なるエピトープに結合するかまたは相補的活性を有する抗体(または免疫複合体または二重特異性抗体)の組み合わせを含有しうる。
本開示の医薬組成物は、併用療法、すなわち他の作用物質との併用であっても投与可能である。例えば、併用療法は、本開示の抗CXCR4抗体と、少なくとも1つの他の抗炎症物質または免疫抑制剤との併用を含みうる。併用療法で用いられうる治療物質の例が、本開示の抗体の使用に関する下記セクションにおいてより詳細に記載される。
本明細書で用いられる「医薬的に許容できる担体」は、生理学的に適合可能な、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与(例えば注射または注入による)に適する。投与経路に依存し、活性化合物、すなわち抗体、免疫複合体または二重特異性分子は、化合物を酸の活性および化合物を不活性化しうる他の天然条件から保護するための材料でコートされうる。
本開示の医薬品化合物は、1つ以上の医薬的に許容できる塩を含む。「医薬的に許容できる塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持する塩を示し、任意の望ましくない毒物学的効果を与えることがない(例えば、ベルゲ(Berge),S.M.ら(1977年)、J.Pharm.Sci.66:1−19頁を参照)。かかる塩の例として、酸添加塩および塩基添加塩が挙げられる。酸添加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの非毒性無機酸や、脂肪族モノカルボキシル酸およびジカルボキシル酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸から誘導される塩を含む。塩基添加塩は、アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどや、非毒性有機アミン、例えばN,N’−ジベンジルエチレンジアミン、N−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどから誘導される塩を含む。
本開示の医薬組成物は、医薬的に許容できる酸化防止剤も含有しうる。医薬的に許容できる酸化防止剤の例として、(1)水溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど;(2)油可溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど;および(3)金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン4酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
本開示の医薬組成物中に用いられうる適切な水性および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール(グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)およびそれらの適切な混合物、植物オイル、例えばオリーブオイルならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。適切な液性が、例えば、コーティング材、例えばレシチンの使用、分散の場合に必要とされる粒径の維持ならびに界面活性剤の使用により維持されうる。
これらの組成物は、防腐剤、浸潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含有しうる。微生物の出現の防止は、上記の滅菌法と、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの封入との双方により保証されうる。組成物中に等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを含めることも望ましい場合がある。さらに、注射可能な医薬形態の吸収遅延がモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる作用物質の封入によりもたらされうる。
医薬的に許容できる担体は、注射可能な無菌溶液または分散系の即時調製のための無菌水溶液または分散系および無菌粉末を含む。医薬活性物質におけるかかる媒体および作用物質の使用については当該技術分野で既知である。任意の従来の媒体または作用物質が活性化合物と混合できない場合を除き、本開示の医薬組成物におけるそれらの使用が検討される。補助活性化合物も組成物中に組み込み可能である。
治療組成物は、典型的には製造および保存の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、高い薬物濃度に適する溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは他の規則的構造として調合されうる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散系でありうる。適切な液性が、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用、分散の場合に必要とされる粒径の維持ならびに界面活性剤の使用により維持されうる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコールまたは塩化ナトリウムを含めることが好ましいことになる。注射可能な組成物の遅延された吸収は、組成物中に吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアレート塩(monostearate salts)およびゼラチンを含めることによりもたらされうる。
注射可能な無菌溶液は、必要に応じ、上掲の原料の1つもしくは組み合わせを有する適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、その後に滅菌および精密ろ過を施すことにより調製されうる。一般に、分散系は、塩基性分散系および上掲の原料由来の必要な他の原料を含有する無菌溶媒に活性化合物を組み込むことにより調製される。注射可能な無菌溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末に加え任意の所望の追加原料をその予め無菌濾過された溶液から生成する真空乾燥およびフリーズドライ(凍結乾燥)である。
担体材料と組み合わせることで単一の剤形を生成可能な活性成分の量は、治療される対象および特定の投与方法に依存して変化することになる。単一の剤形を生成するための担体材料と併用可能な活性成分の量は、一般に治療効果をもたらす組成物の量となる。一般に、この量は、医薬的に許容できる担体との併用で、100%のうち、活性成分の約0.01%〜約99%、好ましくは活性成分の約0.1%〜約70%、最も好ましくは活性成分の約1%〜約30%の範囲となる。
投与計画を調節することで最適な所望の応答(例えば治療応答)がもたらされる。例えば、単回ボーラスが投与されうるか、数回の分割用量が長期にわたり投与されうるかまたは同用量が治療状況の要件で示されるように比例的に漸減または増加されうる。投与の容易さおよび用量の均一性を意図し、非経口組成物を投与単位形態で調製することが特に有利である。本明細書で用いられる投与単位形態は、試験されるべき対象に対する単一の用量として適合する物理的に別々の単位であり、各単位は必要とされる医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された既定量の活性化合物を有する。本開示の投与単位形態における仕様は、(a)活性化合物固有の特性および達成されるべき特定の治療効果と、(b)個体における感受性を治療するためにかかる活性化合物を化合する当該技術分野に内在する制限により決定づけられ、かつそれらに直接依存している。
抗体の投与においては、用量は、宿主体重の約0.0001〜100mg/kg、およびより一般的には0.01〜5mg/kgの範囲である。例えば用量は、0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重もしくは10mg/kg体重または1−10mg/kgの範囲内であってもよい。典型的な治療計画では、毎週1回、2週ごとに1回、3週ごとに1回、4週ごとに1回、1か月に1回、3か月ごとに1回または3〜6か月ごとに1回の投与が必要とされる。本開示の抗CXCR4抗体に対する好ましい投与計画は、抗体の静脈内投与を介した1mg/kg体重または3mg/kg体重を含み、ここで抗体は(i)6回投与を4週ごと、次いで3か月ごと;(ii)3週ごと;(iii)1回の3mg/kg体重、次いで3週ごとに1mg/kg体重といった投与計画のうちの1つを用いて投与される。
いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する、2つ以上のモノクローナル抗体が同時投与され、いずれの場合でも投与される各抗体の用量は指定範囲内に含まれる。多くの場合、抗体が通常投与される。単回投与間の間隔は、例えば、週単位、月単位、3か月単位または年単位であってもよい。患者における抗体の標的抗原に対する血中濃度の測定により示されるように、間隔は不規則であってもよい。用量は、ある方法では約1〜1000μg/ml、またある方法では約25〜300μg/mlの血漿抗体濃度を得るように調節される。
あるいは、抗体は徐放製剤として投与可能であり、いずれの場合でも低頻度の投与が必要とされる。用量および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変化する。一般に、ヒト抗体は最長の半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体がそれに続く。投与の用量および頻度は、治療が予防的であるかまたは治療的であるかに依存して変化しうる。予防的適用においては、比較的低用量が長期にわたり比較的低頻度の間隔で投与される。一部の患者が、余生にわたって治療を受け続けている。治療的適用においては、疾患の進行が低下または終結されるまで、好ましくは患者が疾患の徴候の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量が必要とされる場合がある。その後、患者は予防計画通りに投与されうる。
本開示の医薬組成物中での活性成分の実際の用量レベルは、患者に毒性をもたらすことなく、特定の患者、組成物および投与様式について所望の治療応答を得るのに有効な活性成分の量を得るように変化しうる。選択される用量レベルは、用いられる本開示の特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、用いられる特定の化合物の投与経路、投与時間、排出速度、用いられる特定の組成物と併用される治療薬、他の薬物、化合物および/または材料の持続時間、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般健康および過去の病歴、ならびに医術において周知の要素のようなものを含む種々の薬物動態学的因子に依存することになる。
本開示の抗CXCR4抗体の「治療有効用量」は、好ましくは疾患徴候の重症度の低下、疾患徴候のない期間の頻度および持続時間の増大あるいは疾患の苦しみに起因する機能障害または身体障害の予防をもたらす。例えば、CXCR4+腫瘍の治療における「治療有効用量」は、好ましくは細胞成長または腫瘍成長を、未治療の対象に対し、少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約40%、さらにより好ましくは少なくとも約60%、およびさらにより好ましくは少なくとも約80%阻害する。化合物の腫瘍成長に対する阻害能は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価可能である。あるいは、組成物のこの特性は、化合物の細胞成長に対する阻害能の試験により評価可能であり、かかる阻害は当業者に既知のアッセイによりインビトロで測定可能である。治療有効量の治療化合物により、腫瘍サイズが低減しうるかまたはそうでなくても対象における徴候が改善しうる。当業者であれば、対象の大きさ、対象の徴候の重症度および選択された投与における特定の組成物または経路などの要素に基づき、かかる量を決定できるであろう。
本開示の組成物は、種々の当該技術分野で既知の方法のうちの1つ以上を用い、1つ以上の投与経路を介して投与されうる。当業者に理解されるように、投与の経路および/または方法は所望の結果に応じて変化することになる。本開示の抗体における好ましい投与経路は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路、例えば注射もしくは注入によるものを含む。本明細書で用いられる「非経口投与」という語句は、経腸および局所投与以外の投与方法、通常は注射によるものを意味し、限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内への注射および注入を含む。
あるいは、本開示の抗体は、非経口でない(non−parenteral)経路、例えば局所経路、表皮または粘膜の投与経路を介し、例えば、経鼻的、経口的、経膣的、経直腸的、舌下的または局所的に投与されうる。
活性化合物は、迅速な放出に対する化合物、例えばインプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤を保護することになる担体とともに調製されうる。生体分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が用いられうる。かかる製剤を調製するための多数の方法が特許化されているかまたは一般に当業者に既知である。例えば、「Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems」、J.R.ロビンソン(J.R.Robinson)編、マーセル・デッカー社(Marcel Dekker,Inc.)、ニューヨーク(New York)、1978年を参照のこと。
治療組成物は、当該技術分野で既知の医療器具を用いて投与可能である。例えば、好ましい実施形態では、本開示の治療組成物は、ニードルレス皮下注射器具、例えば米国特許第5,399,163号明細書;米国特許第5,383,851号明細書;米国特許第5,312,335号明細書;米国特許第5,064,413号明細書;米国特許第4,941,880号明細書;米国特許第4,790,824号明細書;または米国特許第4,596,556号明細書に開示された器具を用いて投与可能である。本開示において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例として、薬物を制御された速度で小出しするための埋め込み式マイクロ注入ポンプを開示する米国特許第4,487,603号明細書、皮膚を通してメディカント(medicants)を投与するための治療器具を開示する米国特許第4,486,194号明細書、薬物を正確な注入速度で送達するための薬物注入ポンプを開示する米国特許第4,447,233号明細書、連続的薬物送達のための流量可変の埋め込み式注入装置を開示する米国特許第4,447,224号明細書、マルチチャンバ式の区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第4,439,196号明細書、ならびに浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第4,475,196号明細書が挙げられる。これらの特許は参照により本明細書中に援用される。多数の他のかかるインプラント、送達システムおよびモジュールは当業者に既知である。
特定の実施形態では、本開示のヒトモノクローナル抗体を調合し、インビボで適切な分布を保証することが可能である。例えば、血液脳関門(BBB)は多数の親水性の高い化合物を排除する。(必要に応じて)本開示の治療化合物がBBBを通過することを保証するため、それらを例えばリポソームの形で調合してもよい。リポソームを作製する方法については、例えば米国特許第4,522,811号明細書;米国特許第5,374,548号明細書;および米国特許第5,399,331号明細書を参照のこと。リポソームは特定の細胞または器官に選択的に輸送される1つ以上の部分を含みうることから、標的化された薬剤送達が促進される(例えば、V.V.ラナーデ(V.V.Ranade)(1989年)J.Clin.Pharmacol.29:685頁を参照)。典型的な標的化部分は、葉酸塩またはビオチン(例えばロウ(Low)らに交付された米国特許第5,416,016号明細書を参照);マンノシド(ウメザワ(Umezawa)ら(1988年)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038頁);抗体(P.G.ブロエマン(P.G.Bloeman)ら(1995年)FEBS Lett.357:140頁;M.オワイス(M.Owais)ら(1995年)Antimicrob.Agents Chemother.39:180頁);界面活性剤のプロテインA受容体(ブリスコエ(Briscoe)ら(1995年)Am.J.Physiol.1233:134頁);p120(シュライアー(Schreier)ら(1994年)J.Biol.Chem.269:9090頁)を含み、K.ケイナネン(K.Keinanen);M.L.ラウッカネン(M.L.Laukkanen)(1994年)FEBS Lett.346:123頁;J.J.キリオン(J.J.Killion);I.J.フィドラー(I.J.Fidler)(1994年)Immunomethods4:273頁も参照のこと。
使用および方法
本開示の抗体、特にヒト抗体、抗体組成物および方法は、CXCR4媒介性の障害の診断および治療を含む、極めて多数のインビトロおよびインビボでの診断的および治療的有用性を有する。例えば、これらの分子を、インビトロまたは生体外で培地内の細胞にまたは例えばインビボでヒト対象に投与し、種々の障害を治療し、予防し、かつ診断してもよい。本明細書で用いられる「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むように意図されている。非ヒト動物は、あらゆる脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類および爬虫類を含む。好ましい対象は、CXCR4活性に媒介されるかまたは調節される障害を有するかあるいはCXCR4/SDF−1経路を含むヒト患者を含む。CXCR4に対する抗体が別の作用物質とともに投与される場合、2剤は順次投与または同時投与のいずれであってもよい。
本開示の抗体、特にヒト抗体、抗体組成物および方法は、CXCR4媒介性の障害の診断および治療を含む、極めて多数のインビトロおよびインビボでの診断的および治療的有用性を有する。例えば、これらの分子を、インビトロまたは生体外で培地内の細胞にまたは例えばインビボでヒト対象に投与し、種々の障害を治療し、予防し、かつ診断してもよい。本明細書で用いられる「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むように意図されている。非ヒト動物は、あらゆる脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類および爬虫類を含む。好ましい対象は、CXCR4活性に媒介されるかまたは調節される障害を有するかあるいはCXCR4/SDF−1経路を含むヒト患者を含む。CXCR4に対する抗体が別の作用物質とともに投与される場合、2剤は順次投与または同時投与のいずれであってもよい。
本開示の抗体がCXCR4に対して特異的に結合することを仮定すると、本開示の抗体を用い、細胞の表面上でのCXCR4の発現の特異的検出が可能であり、さらにそれを用い、免疫親和性精製を介するCXCR4の精製が可能である。
本開示の抗体組成物(例えばヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫複合体)をインビボおよびインビトロで投与する適切な経路は当該技術分野で周知であり、当業者により選択されうる。例えば、抗体組成物を注射(例えば静脈内または皮下)により投与してもよい。用いられる分子の適切な用量は、対象の年齢および体重ならびに抗体組成物の濃度および/または調合に依存することになる。
上記のように、本開示のヒト抗CXCR4抗体を、1つもしくは他の複数の治療物質、例えば細胞毒性物質、放射性毒性物質(radiotoxic agent)または免疫抑制剤と同時投与してもよい。抗体を(免疫複合体としての)作用物質に連結するかまたは作用物質とは別々に投与してもよい。後者(別々の投与)の場合、作用物質の前、後またはそれと同時に抗体を投与するかまたは他の既知の治療、例えば抗癌治療、例えば放射線と併せて同時投与してもよい。かかる治療物質は、特にドキソルビシン(アドリアマイシン)、シスプラチンブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシルおよびシクロホスファミドヒドロキシウレア(cyclophosphamide hydroxyurea)などの抗悪性腫瘍薬を含み、それら単独では患者に対して毒性または亜毒性のレベルでのみ有効である。シスプラチンは、4週ごとに1回、100mg/kg用量で静脈内投与され、アドリアマイシンは、21日ごとに1回、60−75mg/ml用量で静脈内投与される。本開示のヒト抗CXCR4抗体またはそれらの抗原結合断片と化学療法剤の同時投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞毒性効果をもたらす異なる機序を介して作用する2つの抗癌剤を提供する。かかる同時投与は、抗体に反応しなくなる薬剤に対する耐性または腫瘍細胞の抗原性における変化が生じることによる問題を解決しうる。
標的特異的なエフェクター細胞、例えば本開示の組成物(例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子)に連結したエフェクター細胞は、治療物質としても用いられうる。標的化のためのエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球または単球などのヒト白血球でありうる。他の細胞は、好酸球、ナチュラルキラー細胞および他のIgG−もしくはIgA−受容体担持細胞を含む。必要に応じ、エフェクター細胞を試験されるべき対象から得てもよい。標的特異的なエフェクター細胞を生理学的に許容できる溶液中の細胞の懸濁液として投与してもよい。投与される細胞の数は108−109程度でありうるが、治療目的に応じて変化することになる。一般に、数は、標的細胞、例えばCXCR4を発現する腫瘍細胞で局在化を得、かつ例えば食作用による細胞死を有効にするのに十分な数となる。投与経路もまた変化しうる。
標的特異的なエフェクター細胞による治療を、標的化細胞を除去するための他の技術と併せて行ってもよい。例えば、本開示の組成物(例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子)および/またはこれらの組成物が備えられたエフェクター細胞を用いる抗腫瘍療法を化学療法と併用してもよい。さらに、併用免疫療法を用い、2つの異なる細胞毒性のあるエフェクター集団を指令し、腫瘍細胞を拒絶することが可能である。例えば、抗Fc−γ RIまたは抗CD3に連結された抗CXCR4抗体は、IgG−またはIgA−受容体に特異的な結合剤と併用可能である。
本開示の二重特異性および多重特異性分子を用い、エフェクター細胞上のFcγRまたはFcγRレベルの例えば細胞表面上の受容体のキャッピングおよび除去による調節も可能である。抗Fc受容体の混合物もこの目的で用いられうる。
補体結合部位、例えば補体に結合するIgG1、IgG2、IgG3、またはIgM由来の部分を有する本開示の組成物(例えばヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫複合体)も補体の存在下で用いられうる。一実施形態では、本開示の結合剤および適切なエフェクター細胞による標的細胞を含む細胞の集団の生体外治療は、補体または補体を含有する血清の添加により補完されうる。本開示の結合剤でコートされた標的細胞の食作用は補体タンパク質の結合により改善されうる。別の実施形態では、本開示の組成物(例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子)でコートされた標的細胞も補体により溶解されうる。さらに別の実施形態では、本開示の組成物は補体を活性化することがない。
本開示の組成物(例えばヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫複合体)はまた、補体とともに投与可能である。したがって、ヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子および血清または補体を含有する組成物は本開示の範囲内に含まれる。これらの組成物は、補体がヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子の近接位置に存在する点で有利である。あるいは、本開示のヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子と補体または血清を別々に投与してもよい。
本開示の抗体は、1つ以上の追加の治療抗体または他の結合剤、例えばIg融合タンパク質とも併用可能である。投与可能な本開示の抗CXCR4抗体との併用対象の他の抗体または結合剤の非限定例として、CTLA−4、PSMA、CD30、IP−10、IFN−γ、CD70、PD−1、PD−L1、TNF、TNF−R、VEGF、VEGF−R、CCR5、IL−1、IL−18、IL−18R、CD19、キャンパス−1(Campath−1)、EGFR、CD33、CD20、Her−2、CD25、gpIIb/IIIa、IgE、CD11a、α4インテグリン、IFNαおよびIFNAR1に対する抗体または結合剤が挙げられる。
本開示の抗体組成物(例えば、ヒト抗体、二重特異性または多重特異性分子または免疫複合体)と使用説明書を含むキットも本開示の範囲内に含まれる。キットは、1つ以上の追加試薬、例えば免疫抑制試薬、細胞毒性物質または放射性毒性物質あるいは1つ以上の追加の本開示のヒト抗体(例えば、第1のヒト抗体とは異なる、異なるCXCR4抗原内のエピトープに対して結合する相補活性を有するヒト抗体)をさらに含みうる。
したがって、本開示の抗体組成物で治療される患者に、別の治療物質、例えばヒト抗体の治療効果を促進または増強する細胞毒性物質または放射性毒性物質を(本開示のヒト抗体の投与の前、投与と同時または投与後に)さらに投与してもよい。
他の実施形態では、対象をさらに、FcγまたはFcγ受容体の発現または活性を調節する、例えば促進または阻害する作用物質で治療する、例えば対象をサイトカインで治療することが可能である。多重特異性分子による治療の間での投与における好ましいサイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、インターフェロン−γ(IFN−γ)および腫瘍壊死因子(TNF)を含む。
本開示の組成物(例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子)を用い、CXCR4を発現する細胞を、例えばかかる細胞を標識する目的で標的にすることも可能である。かかる使用においては、結合剤を検出可能な分子に連結してもよい。したがって、本開示は、CXCR4を発現する細胞を生体外またはインビトロで局在化するための方法を提供する。検出可能な標識は、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素共同因子でありうる。
特定の実施形態では、本開示は、試料中のCXCR4抗原の存在を検出するか、またはCXCR4抗原の量を測定するための方法であって、試料および対照試料を、CXCR4に、抗体またはその一部とCXCR4との複合体の形成を可能にする条件下で特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と接触させるステップを含む方法を提供する。次いで、複合体の形成が検出され、ここで対照試料と比べた場合の試料間での複合体形成の差は試料中でのCXCR4抗原の存在を示す。
さらに別の実施形態では、本開示の免疫複合体を用い、化合物(例えば治療物質、標識、細胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剤など)を、CXCR4細胞表面受容体を有する細胞に対し、かかる化合物を抗体に連結することによって標的にすることが可能である。したがって、本開示は、CXCR4を発現する細胞を(例えば検出可能な標識、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素共同因子を用いて)生体外またはインビボで局在化するための方法も提供する。あるいは、免疫複合体を用い、CXCR4細胞表面受容体を有する細胞を、細胞毒素または放射性毒素をCXCR4に対して標的化することにより殺滅することが可能である。
CXCR4は、多種多様な腫瘍細胞タイプ上で発現されることが知られ、また腫瘍転移に関与することが知られている。さらに、HIVのT細胞への侵入における共受容体として、CXCR4はHIV感染に関与することが知られている。さらに、CXCR4/SDF−1経路は炎症状態に関与することが示されている。さらに、CXCR4/SDF−1経路は血管新生または新血管新生(neovascularization)に関与することが示されている。したがって、本開示の抗CXCR4抗体(および免疫複合体および二重特異性分子)を用い、以下のようなこれらの各臨床症状においてCXCR4活性を調節することが可能である。
A.癌
CXCR4は、種々の癌タイプにより発現されることが示されており、特定の状況ではCXCR4の発現と患者の予後または生存の間に逆相関が成立することが明らかにされている。CXCR4の発現を伴う癌タイプの非限定例として、乳癌(ミュラー A.(Muller A.)ら(2001年)Nature 410:50−56頁);卵巣癌(スコットン C.(Scotton C.)ら(2001年)Br.J.Cancer 85:891−897頁;前立腺癌(タイチマン R.S.(Taichman R.S.)ら(2002年)Cancer Res.62:1832−1837頁;非小細胞肺癌(スパノ J.P.(Spano J.P.)ら(2004年)Ann.Oncol.15:613−617頁);膵臓癌(コシバ T.(Koshiba T.)ら(2000年)Clin.Cancer Res.6:3530−3535頁);甲状腺癌(フワン J.H.(Hwang J.H.)ら(2003年)J.Clin.Endocrinol.Metab.88:408−416頁);鼻咽頭癌(ワン N.(Wang N.)ら(2005年)J.Transl.Med.3:26−33頁);メラノーマ(スカラ S.(Scala S.)ら(2005年)Clin.Cancer Res.11:1835−1841頁);腎細胞癌(ストーラー P.(Staller P.)ら(2003年)Nature 425:307−311頁);リンパ腫(ベルトリーニ F.(Bertolini F.)ら(2002年)Cancer Res.62:3530−3535頁);神経芽細胞腫(ゲマインダー H.(Geminder H.)ら(2001年)J.Immunol.167:4747−4757頁);グリア芽腫(レムペル S.A.(Rempel S.A.)ら(2000年)Clin.Cancer Res.6:102−111頁);横紋筋肉腫(リブラ J.(Libura J.)ら(2002年)Blood 100:2597−2606頁);結腸直腸癌(ツェーレンベルグ I.S.(Zeelenberg I.S.)ら(2003年)Cancer Res.63:3833−3839頁);腎臓癌(シュレイダー A.J.(Schrader A.J.)ら(2002年)Br.J.Cancer 86:1250−1256頁);骨肉腫(ラバーディエール C.(Laverdiere C.)ら(2005年)Clin.Cancer Res.11:2561−2567頁);急性リンパ性白血病(クラッゾララ R.(Crazzolara R.)ら(2001年)Br.J.Haematol.115:545−553頁);ならびに急性骨髄性白血病(ロンバウツ E.J.C.(Rombouts E.J.C.)ら(2004年)Blood 104:550−557頁)が挙げられる。
CXCR4は、種々の癌タイプにより発現されることが示されており、特定の状況ではCXCR4の発現と患者の予後または生存の間に逆相関が成立することが明らかにされている。CXCR4の発現を伴う癌タイプの非限定例として、乳癌(ミュラー A.(Muller A.)ら(2001年)Nature 410:50−56頁);卵巣癌(スコットン C.(Scotton C.)ら(2001年)Br.J.Cancer 85:891−897頁;前立腺癌(タイチマン R.S.(Taichman R.S.)ら(2002年)Cancer Res.62:1832−1837頁;非小細胞肺癌(スパノ J.P.(Spano J.P.)ら(2004年)Ann.Oncol.15:613−617頁);膵臓癌(コシバ T.(Koshiba T.)ら(2000年)Clin.Cancer Res.6:3530−3535頁);甲状腺癌(フワン J.H.(Hwang J.H.)ら(2003年)J.Clin.Endocrinol.Metab.88:408−416頁);鼻咽頭癌(ワン N.(Wang N.)ら(2005年)J.Transl.Med.3:26−33頁);メラノーマ(スカラ S.(Scala S.)ら(2005年)Clin.Cancer Res.11:1835−1841頁);腎細胞癌(ストーラー P.(Staller P.)ら(2003年)Nature 425:307−311頁);リンパ腫(ベルトリーニ F.(Bertolini F.)ら(2002年)Cancer Res.62:3530−3535頁);神経芽細胞腫(ゲマインダー H.(Geminder H.)ら(2001年)J.Immunol.167:4747−4757頁);グリア芽腫(レムペル S.A.(Rempel S.A.)ら(2000年)Clin.Cancer Res.6:102−111頁);横紋筋肉腫(リブラ J.(Libura J.)ら(2002年)Blood 100:2597−2606頁);結腸直腸癌(ツェーレンベルグ I.S.(Zeelenberg I.S.)ら(2003年)Cancer Res.63:3833−3839頁);腎臓癌(シュレイダー A.J.(Schrader A.J.)ら(2002年)Br.J.Cancer 86:1250−1256頁);骨肉腫(ラバーディエール C.(Laverdiere C.)ら(2005年)Clin.Cancer Res.11:2561−2567頁);急性リンパ性白血病(クラッゾララ R.(Crazzolara R.)ら(2001年)Br.J.Haematol.115:545−553頁);ならびに急性骨髄性白血病(ロンバウツ E.J.C.(Rombouts E.J.C.)ら(2004年)Blood 104:550−557頁)が挙げられる。
上記の観点から、本開示の抗CXCR4抗体は、限定はされないが、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、甲状腺癌、鼻咽頭癌、メラノーマ、腎細胞癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、グリア芽腫、横紋筋肉腫、結腸直腸癌、腎臓癌、骨肉腫、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病からなる群から選択される癌を含む癌の治療において用いられうる。抗体は、単独で用いられうるか、あるいは、他の癌治療、例えば手術および/または放射線、および/または他の抗新生物剤、例えば化学療法剤および他の抗腫瘍抗原抗体、例えばCD20、Her2、PSMA、キャンパス−1、EGFRなどに結合するものを含む、上で考察され示された抗新生物剤と併用されうる。
B.HIV感染を含むウイルス感染
CXCR4がHIVのT細胞への侵入における共受容体であることが示され、さらに特定のマウス抗CXCR4抗体がHIV単離体のT細胞への侵入を阻害可能であることが示されている(ホウ T.(Hou T.)ら(1998年)J.Immunol.160:180−188頁;カルネック X.(Carnec X.)ら(2005年)J.Virol.79:1930−1938頁を参照)。したがって、CXCR4はウイルスによる細胞への侵入に対する受容体として使用可能であり、CXCR4に対する抗体を用い、受容体としてCXCR4を用いるかかるウイルスの細胞侵入の阻害が可能である。したがって、本開示のヒト抗CXCR4抗体を用い、ウイルスの細胞への侵入の阻害が可能であり、ここでウイルスはウイルス感染が阻害されるようにCXCR4を細胞侵入に対する受容体として用いる。好ましい実施形態では、抗体を用い、例えばHIV/AIDSの治療または予防においてHIVのT細胞への侵入が阻害される。抗体は、単独で用いられうるかまたは他の抗ウイルス剤、例えばAZTもしくはプロテアーゼ阻害剤などの抗レトロウイルス薬と併用されうる。
CXCR4がHIVのT細胞への侵入における共受容体であることが示され、さらに特定のマウス抗CXCR4抗体がHIV単離体のT細胞への侵入を阻害可能であることが示されている(ホウ T.(Hou T.)ら(1998年)J.Immunol.160:180−188頁;カルネック X.(Carnec X.)ら(2005年)J.Virol.79:1930−1938頁を参照)。したがって、CXCR4はウイルスによる細胞への侵入に対する受容体として使用可能であり、CXCR4に対する抗体を用い、受容体としてCXCR4を用いるかかるウイルスの細胞侵入の阻害が可能である。したがって、本開示のヒト抗CXCR4抗体を用い、ウイルスの細胞への侵入の阻害が可能であり、ここでウイルスはウイルス感染が阻害されるようにCXCR4を細胞侵入に対する受容体として用いる。好ましい実施形態では、抗体を用い、例えばHIV/AIDSの治療または予防においてHIVのT細胞への侵入が阻害される。抗体は、単独で用いられうるかまたは他の抗ウイルス剤、例えばAZTもしくはプロテアーゼ阻害剤などの抗レトロウイルス薬と併用されうる。
C.炎症状態
CXCR4/SDF−1経路は、限定はされないが、炎症性肝疾患(テラダ R.(Terada R.)ら(2003年)Lab.Invest.83:665−672頁);自己免疫性関節炎(autoimmune joint inflammation)(マチス P.(Matthys P.)ら(2001年)J.Immunol.167:4686−4692頁);アレルギー性気管疾患(ゴンザロ J.A.(Gonzalo J.A.)ら(2000年)J.Immunol.165:499−508頁);および歯周病(ホソカワ Y.(Hosokawa Y.)ら(2005年)Clin.Exp.Immunol.141:467−474頁)を含む種々の炎症状態において役割を担うことが示されている。
CXCR4/SDF−1経路は、限定はされないが、炎症性肝疾患(テラダ R.(Terada R.)ら(2003年)Lab.Invest.83:665−672頁);自己免疫性関節炎(autoimmune joint inflammation)(マチス P.(Matthys P.)ら(2001年)J.Immunol.167:4686−4692頁);アレルギー性気管疾患(ゴンザロ J.A.(Gonzalo J.A.)ら(2000年)J.Immunol.165:499−508頁);および歯周病(ホソカワ Y.(Hosokawa Y.)ら(2005年)Clin.Exp.Immunol.141:467−474頁)を含む種々の炎症状態において役割を担うことが示されている。
したがって、SDF−1のCXCR4への結合を阻害する本開示のヒト抗CXCR4抗体を用い、炎症性肝疾患、自己免疫性関節炎、アレルギー性気管疾患、歯周病、関節リウマチ、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、I型糖尿病、炎症性皮膚疾患(例えば、乾癬、扁平苔癬)、自己免疫性甲状腺疾患、シェーグレン症候群、肺炎症(例えば、慢性閉塞性肺疾患、肺サルコイドーシス、リンパ球性肺胞炎)および炎症性腎疾患(例えば、IgA腎症、糸球体腎炎)からなる群から選択される障害を含む炎症性疾患における炎症の阻害が可能である。抗体は、単独で用いられうるかまたは他の抗炎症剤、例えば非ステロイド抗炎症薬(NSAID)、コルチコステロイド(例えば、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン)、メトトレキセート、COX−2阻害剤、TNF拮抗剤(例えば、エタナーセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ)および免疫抑制剤(6−メルカプトプリン、アザチオプリンおよびシクロスポリンAなど)と併用されうる。
D.血管新生
SDF−1がCXCR4を発現する造血前駆細胞(hemangiocytes)の補充を通じて新血管新生を誘発することが示されている(ジン D.K.(Jin D.K.)ら(2006年)Nat.Med.12:557−567頁)。さらに、SDF−1/CXCR4経路を遮断し、血管新生をVEGFに依存しない様式で阻害することにより、腫瘍成長がインビボで低下しうる(グレン B.(Guleng B.)ら(2005年)Cancer Res.65:5864−58−71)。さらに、実施例2で示されるように、本開示の抗体はインビトロで毛細管形成を阻害しうる。したがって、SDF−1のCXCR4への結合を阻害する本開示の抗CXCR4抗体を用い、SDF−1/CXCR4経路との干渉による血管新生の阻害が可能である。血管新生の阻害を用い、例えば(腫瘍がCXCR4+であるか否かとは無関係に)腫瘍成長または腫瘍転移の阻害が可能である。抗体は、単独で用いられうるかまたは他の抗血管新生薬(anti−angiogenic agent)、例えば抗VEGF抗体と併用されうる。
SDF−1がCXCR4を発現する造血前駆細胞(hemangiocytes)の補充を通じて新血管新生を誘発することが示されている(ジン D.K.(Jin D.K.)ら(2006年)Nat.Med.12:557−567頁)。さらに、SDF−1/CXCR4経路を遮断し、血管新生をVEGFに依存しない様式で阻害することにより、腫瘍成長がインビボで低下しうる(グレン B.(Guleng B.)ら(2005年)Cancer Res.65:5864−58−71)。さらに、実施例2で示されるように、本開示の抗体はインビトロで毛細管形成を阻害しうる。したがって、SDF−1のCXCR4への結合を阻害する本開示の抗CXCR4抗体を用い、SDF−1/CXCR4経路との干渉による血管新生の阻害が可能である。血管新生の阻害を用い、例えば(腫瘍がCXCR4+であるか否かとは無関係に)腫瘍成長または腫瘍転移の阻害が可能である。抗体は、単独で用いられうるかまたは他の抗血管新生薬(anti−angiogenic agent)、例えば抗VEGF抗体と併用されうる。
E.自家幹細胞移植
末梢血幹細胞は、例えば特定の血液悪性疾患(hematological malignancies)の治療における自家幹細胞移植で用いられる幹細胞の好ましい供給源である。幹細胞の末梢血からの採取には、骨髄から末梢血へのCD34+幹細胞の動員が必要とされる。様々なサイトカイン、ケモカインおよび接着分子は、CXCR4とSDF−1の相互作用を含む、このプロセスの調節に関与している(ガジット Y.(Gazitt Y.)(2001年)J.Hematother.Stem Cell Res.10:229−236頁にてレビュー)。さらに、小分子CXCR4拮抗剤は、骨髄から末梢血へのCD34+幹細胞の迅速な動員を刺激することが示されている(例えば、デビン S.M.(Devine S.M.)ら(2004年)J.Clin.Oncol.22:1095−1102頁;ブロクスメイヤー H.E.(Broxmeyer H.E.)ら(2005年)J.Exp.Med.201:1307−1318頁;フロメンバーグ N.(Flomenberg N.)ら(2005年)Blood 106:1867−1874頁を参照)。したがって、CXCR4活性を阻害する本開示の抗CXCR4抗体(すなわちアンタゴニスト抗体)を用い、骨髄から末梢血へのCD34+幹細胞の動員が刺激されうることで、例えば血液疾患、例えば多発性骨髄腫および非ホジキンリンパ腫の治療における移植(例えば自家移植)でのかかる幹細胞の使用が可能になる。抗体は、単独で用いられうるかまたは幹細胞の動員を刺激するのに用いられる他の作用物質、例えばG−CSFおよび/またはGM−CSFと併用されうる。したがって、別の実施形態では、本発明は、対象において骨髄から末梢血へのCD34+幹細胞の動員を刺激する方法であって、骨髄から末梢血へのCD34+幹細胞の動員が刺激されるように本発明の抗CXCR4抗体を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。本方法は、例えば自家幹細胞移植での使用において末梢血からCD34+幹細胞を採取するステップをさらに含みうる。
末梢血幹細胞は、例えば特定の血液悪性疾患(hematological malignancies)の治療における自家幹細胞移植で用いられる幹細胞の好ましい供給源である。幹細胞の末梢血からの採取には、骨髄から末梢血へのCD34+幹細胞の動員が必要とされる。様々なサイトカイン、ケモカインおよび接着分子は、CXCR4とSDF−1の相互作用を含む、このプロセスの調節に関与している(ガジット Y.(Gazitt Y.)(2001年)J.Hematother.Stem Cell Res.10:229−236頁にてレビュー)。さらに、小分子CXCR4拮抗剤は、骨髄から末梢血へのCD34+幹細胞の迅速な動員を刺激することが示されている(例えば、デビン S.M.(Devine S.M.)ら(2004年)J.Clin.Oncol.22:1095−1102頁;ブロクスメイヤー H.E.(Broxmeyer H.E.)ら(2005年)J.Exp.Med.201:1307−1318頁;フロメンバーグ N.(Flomenberg N.)ら(2005年)Blood 106:1867−1874頁を参照)。したがって、CXCR4活性を阻害する本開示の抗CXCR4抗体(すなわちアンタゴニスト抗体)を用い、骨髄から末梢血へのCD34+幹細胞の動員が刺激されうることで、例えば血液疾患、例えば多発性骨髄腫および非ホジキンリンパ腫の治療における移植(例えば自家移植)でのかかる幹細胞の使用が可能になる。抗体は、単独で用いられうるかまたは幹細胞の動員を刺激するのに用いられる他の作用物質、例えばG−CSFおよび/またはGM−CSFと併用されうる。したがって、別の実施形態では、本発明は、対象において骨髄から末梢血へのCD34+幹細胞の動員を刺激する方法であって、骨髄から末梢血へのCD34+幹細胞の動員が刺激されるように本発明の抗CXCR4抗体を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。本方法は、例えば自家幹細胞移植での使用において末梢血からCD34+幹細胞を採取するステップをさらに含みうる。
本開示は以下の実施例によりさらに例示され、実施例はさらに限定するものとして解釈されるべきでない。本願を通して言及されるあらゆる図面およびあらゆる参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書中に明示的に援用される。
実施例1:CXCR4に対するヒトモノクローナル抗体の産生
第1にヒト抗体遺伝子を発現するマウスを免疫し、マウスにおいてヒトCXCR4に特異的なヒト免疫グロブリンのレパートリーを産生し、次いで第2にマウスの脾臓細胞からヒト抗体ライブラリを調製し、ファージ上に提示し、ここでCXCR4に対する特異性を有する抗体の発現についてファージのスクリーニングを行うという複合的アプローチを用い、抗CXCR4ヒトモノクローナル抗体を産生した。この複合的アプローチは、一般にブエクラー(Buechler)らによる米国特許出願公開第20030091995号明細書において記載されている。
第1にヒト抗体遺伝子を発現するマウスを免疫し、マウスにおいてヒトCXCR4に特異的なヒト免疫グロブリンのレパートリーを産生し、次いで第2にマウスの脾臓細胞からヒト抗体ライブラリを調製し、ファージ上に提示し、ここでCXCR4に対する特異性を有する抗体の発現についてファージのスクリーニングを行うという複合的アプローチを用い、抗CXCR4ヒトモノクローナル抗体を産生した。この複合的アプローチは、一般にブエクラー(Buechler)らによる米国特許出願公開第20030091995号明細書において記載されている。
抗原
R1610細胞(チャイニーズハムスター肺細胞系、最初にサリオン J.P.(Thirion J.P.)ら(1976年)Genetics 83:137−147頁に記載)に完全長ヒトCXCR4タンパク質をコードする発現ベクターを、タンパク質が細胞の表面上に発現されるように形質移入した。CXCR4 cDNAのコドンが最適化された形態を発現ベクターで用い、それをミルザベコフ T.(Mirzabekov T.)ら(1999年)J.Biol.Chem.274:28745−28750頁に記載のように調製した。細胞の免疫原性を高めるため、細胞を、5%溶液として市販のトリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)の水溶液(シグマ(Sigma)、カタログ番号P2297)とのインキュベーションにより、トリニトロフェノール(TNP)でコートした。より詳細には、1×108個の細胞を無菌PBSで1回洗浄し、市販の5%TNBS溶液50μlとともに暗所、室温で1時間インキュベートし、次いでPBSで3回洗浄した。得られたTNPでコートされたCXCR−4を発現するR1610細胞を免疫のための抗原として用いた。最終の免疫原は、TNPでコートされ洗浄された細胞(1×107個の細胞)100μlとリビ(Ribi)アジュバント100μlとの混合物であった。マウスは免疫原の投与を長期間にわたり6回受けた。
R1610細胞(チャイニーズハムスター肺細胞系、最初にサリオン J.P.(Thirion J.P.)ら(1976年)Genetics 83:137−147頁に記載)に完全長ヒトCXCR4タンパク質をコードする発現ベクターを、タンパク質が細胞の表面上に発現されるように形質移入した。CXCR4 cDNAのコドンが最適化された形態を発現ベクターで用い、それをミルザベコフ T.(Mirzabekov T.)ら(1999年)J.Biol.Chem.274:28745−28750頁に記載のように調製した。細胞の免疫原性を高めるため、細胞を、5%溶液として市販のトリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)の水溶液(シグマ(Sigma)、カタログ番号P2297)とのインキュベーションにより、トリニトロフェノール(TNP)でコートした。より詳細には、1×108個の細胞を無菌PBSで1回洗浄し、市販の5%TNBS溶液50μlとともに暗所、室温で1時間インキュベートし、次いでPBSで3回洗浄した。得られたTNPでコートされたCXCR−4を発現するR1610細胞を免疫のための抗原として用いた。最終の免疫原は、TNPでコートされ洗浄された細胞(1×107個の細胞)100μlとリビ(Ribi)アジュバント100μlとの混合物であった。マウスは免疫原の投与を長期間にわたり6回受けた。
トランスジェニックトランスクロモゾームKMマウス(登録商標)株
CXCR4に対する完全ヒトモノクローナル抗体を、まずヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックトランスクロモゾームマウスのKM株を免疫することにより調製した。このマウス株では、チェン(Chen)ら(1993年)EMBO J.12:811−820頁に記載のように内因性マウスκ軽鎖遺伝子のホモ接合が破壊されており、PCT公開の国際公開第01/09187号パンフレットの実施例1に記載のように内因性マウス重鎖遺伝子のホモ接合が破壊されている。さらに、このマウス株は、(フィッシュワイルド(Fishwild)ら(1996年)Nature Biotechnology 14:845−851頁に記載のように)ヒトκ軽鎖トランス遺伝子KCo5を保有し、さらにPCT公開の国際公開第02/43478号パンフレットに記載のように、ヒトIg重鎖遺伝子座を保有するSC20トランスクロモゾームを有する。KMマウスは、米国特許出願公開第20020199213号明細書にも詳述されている。
CXCR4に対する完全ヒトモノクローナル抗体を、まずヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックトランスクロモゾームマウスのKM株を免疫することにより調製した。このマウス株では、チェン(Chen)ら(1993年)EMBO J.12:811−820頁に記載のように内因性マウスκ軽鎖遺伝子のホモ接合が破壊されており、PCT公開の国際公開第01/09187号パンフレットの実施例1に記載のように内因性マウス重鎖遺伝子のホモ接合が破壊されている。さらに、このマウス株は、(フィッシュワイルド(Fishwild)ら(1996年)Nature Biotechnology 14:845−851頁に記載のように)ヒトκ軽鎖トランス遺伝子KCo5を保有し、さらにPCT公開の国際公開第02/43478号パンフレットに記載のように、ヒトIg重鎖遺伝子座を保有するSC20トランスクロモゾームを有する。KMマウスは、米国特許出願公開第20020199213号明細書にも詳述されている。
KM免疫
CXCR4に対する完全ヒトモノクローナル抗体を産生するため、(抗原について上記のように)KMマウス(登録商標)株のマウスを形質移入されたR1610細胞で免疫してCXCR4を発現し、TNPでコートした。ヒト抗体遺伝子を保有するマウス株においてヒト抗体を産生するための一般の免疫スキームは、ロンバーグ N.(Lonberg N.)ら(1994年)Nature 368(6474):856−859頁;フィッシュワイルド D.(Fishwild D.)ら(1996年)Nature Biotechnology 14:845−851頁およびPCT公開の国際公開第98/24884号パンフレットに記載されている。マウスは1回目の抗原注入時に6〜16週齢であった。
CXCR4に対する完全ヒトモノクローナル抗体を産生するため、(抗原について上記のように)KMマウス(登録商標)株のマウスを形質移入されたR1610細胞で免疫してCXCR4を発現し、TNPでコートした。ヒト抗体遺伝子を保有するマウス株においてヒト抗体を産生するための一般の免疫スキームは、ロンバーグ N.(Lonberg N.)ら(1994年)Nature 368(6474):856−859頁;フィッシュワイルド D.(Fishwild D.)ら(1996年)Nature Biotechnology 14:845−851頁およびPCT公開の国際公開第98/24884号パンフレットに記載されている。マウスは1回目の抗原注入時に6〜16週齢であった。
KMマウスを腹腔内(IP)、皮下(Sc)または足蹠(FP)を介してリビ(Ribi)アジュバント中の抗原で免疫して3〜21日後、IP、ScまたはFPにリビ(Ribi)アジュバント中の抗原で再免疫した(全部で6回の免疫)。免疫応答を眼窩後方からの採血(retroorbital bleed)により監視した。血漿については、CXCR4を発現するR1610細胞のFACS染色によりスクリーニングした(形質移入されていない親R1610細胞に対して)。脾臓の摘出においては、抗CXCR4ヒト免疫グロブリンの十分な滴定濃度でマウスを用いた。
ファージディスプレイライブラリの調製および抗CXCR4抗体についてのスクリーニング
上記の免疫マウスから摘出した脾臓を用い、ヒト抗体の重鎖および軽鎖を発現するファージディスプレイライブラリを作製した。より詳細には、本質的にブエクラー(Buechler)らによる米国特許出願公開第20030091995号明細書に記載のように、全RNAを脾臓から単離し、cDNAをRNAから調製し、ヒト抗体可変領域cDNAをPCRにより特異的に増幅した。さらに本質的にブエクラー(Buechler)らによる米国特許出願公開第20030091995号明細書に記載のように、ヒト抗体可変領域のライブラリをファージ発現ベクターにクローニングした。ファージディスプレイライブラリにおけるCXCR4に対して親和性を有するライブラリメンバーについてマグネティックプロテオリポソームに組み込まれたヒトCXCR4(CXCR4−MPL)でのパニングによりスクリーニングした。CXCR4を発現するMPL、または他の7回膜貫通(7TM)受容体(例えばCCR5)において7TM受容体の天然立体構造が維持されることについて、過去に記載がなされている(例えば、ミルザベコフ T.(Mirzabekov T.)ら(2000年)Nat.Biotechnol.18:649−654頁;バブコック G.J.(Babcock G.J.)ら(2001年)J.Biol.Chem.276:38433−38440頁;PCT公開の国際公開第01/49265号パンフレット;米国特許出願公開第20010034432号明細書を参照)。つまり、エピトープタグを有する組換えヒトCXCR4は、洗剤チャプソ(CHAPSO)を用い、形質移入されたCXCR4発現細胞系から可溶化され、タンパク質がエピトープタグを介して磁気ビーズ上に捕捉された。洗剤を除去する間に脂質膜がCXCR4の天然膜の高次構造が維持されるように再構成され、CXCR4−MPLが作製された。CXCR4−MPLに対する3回のファージディスプレイライブラリのパニングにより、CXCR4結合剤がバックグラウンドに対して30倍に濃縮された。目的の可変領域断片がFab発現ベクターに再クローン化され、形質移入されたCXCR4発現細胞に対するFabの抗原結合性が再試験された。次いで、標準の分子生物学技術を用い、全抗体がFabから産生された。
上記の免疫マウスから摘出した脾臓を用い、ヒト抗体の重鎖および軽鎖を発現するファージディスプレイライブラリを作製した。より詳細には、本質的にブエクラー(Buechler)らによる米国特許出願公開第20030091995号明細書に記載のように、全RNAを脾臓から単離し、cDNAをRNAから調製し、ヒト抗体可変領域cDNAをPCRにより特異的に増幅した。さらに本質的にブエクラー(Buechler)らによる米国特許出願公開第20030091995号明細書に記載のように、ヒト抗体可変領域のライブラリをファージ発現ベクターにクローニングした。ファージディスプレイライブラリにおけるCXCR4に対して親和性を有するライブラリメンバーについてマグネティックプロテオリポソームに組み込まれたヒトCXCR4(CXCR4−MPL)でのパニングによりスクリーニングした。CXCR4を発現するMPL、または他の7回膜貫通(7TM)受容体(例えばCCR5)において7TM受容体の天然立体構造が維持されることについて、過去に記載がなされている(例えば、ミルザベコフ T.(Mirzabekov T.)ら(2000年)Nat.Biotechnol.18:649−654頁;バブコック G.J.(Babcock G.J.)ら(2001年)J.Biol.Chem.276:38433−38440頁;PCT公開の国際公開第01/49265号パンフレット;米国特許出願公開第20010034432号明細書を参照)。つまり、エピトープタグを有する組換えヒトCXCR4は、洗剤チャプソ(CHAPSO)を用い、形質移入されたCXCR4発現細胞系から可溶化され、タンパク質がエピトープタグを介して磁気ビーズ上に捕捉された。洗剤を除去する間に脂質膜がCXCR4の天然膜の高次構造が維持されるように再構成され、CXCR4−MPLが作製された。CXCR4−MPLに対する3回のファージディスプレイライブラリのパニングにより、CXCR4結合剤がバックグラウンドに対して30倍に濃縮された。目的の可変領域断片がFab発現ベクターに再クローン化され、形質移入されたCXCR4発現細胞に対するFabの抗原結合性が再試験された。次いで、標準の分子生物学技術を用い、全抗体がFabから産生された。
さらなる分析のため、FabクローンF7、F9、D1およびE2を選択した。
実施例2:ヒト抗CXCR4モノクローナル抗体F7、F9、D1およびE2の構造的特徴づけ
実施例1に記載のファージディスプレイライブラリのスクリーニングから得られたF7、F9、D1およびE2 Fabクローンの重鎖および軽鎖可変領域をコードするcDNA配列を、標準のDNA配列決定技術を用いて配列決定した。
実施例1に記載のファージディスプレイライブラリのスクリーニングから得られたF7、F9、D1およびE2 Fabクローンの重鎖および軽鎖可変領域をコードするcDNA配列を、標準のDNA配列決定技術を用いて配列決定した。
F7の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図1Aと配列番号33および25に各々示される。
F7の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図1Bと配列番号37および29に各々示される。
F7重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、F7重鎖ではヒト生殖細胞系VH3−48由来のVHセグメント、ヒト生殖細胞系4−23由来のDセグメント、およびヒト生殖細胞系JH6B由来のJHセグメントが用いられることが示された。CDR領域決定のカバト(Kabat)システムを用いてのF7VH配列のさらなる分析により、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域を図示するに至った(各々、図1Aと配列番号1、5および9に示される)。
F7軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、F7軽鎖ではヒト生殖細胞系VKL15由来のVLセグメントおよびヒト生殖細胞系JK1由来のJKセグメントが用いられることが示された。CDR領域決定のカバト(Kabat)システムを用いてのF7VL配列のさらなる分析により、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域を図示するに至った(各々、図1Bと配列番号13、17および21に示される)。
F9の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ図2Aと配列番号34および26に示される。
F9の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ図2Bと配列番号38および30に示される。
F9重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、F9重鎖ではヒト生殖細胞系VH3−48由来のVHセグメント、ヒト生殖細胞系4−23由来のDセグメント、およびヒト生殖細胞系JH6B由来のJHセグメントが用いられることが示された。CDR領域決定のカバト(Kabat)システムを用いてのF9VH配列のさらなる分析により、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域を図示するに至った(各々、図2Aと配列番号2、6および10に示される)。
F9軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、F9軽鎖ではヒト生殖細胞系VKL15由来のVLセグメントおよびヒト生殖細胞系JK1由来のJKセグメントが用いられることが示された。CDR領域決定のカバト(Kabat)システムを用いてのF9VL配列のさらなる分析により、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域を図示するに至った(各々、図2Bと配列番号14、18および22に示される)。
D1の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ図3Aと配列番号35および27に示される。
D1の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ図3Bと配列番号39および31に示される。
D1重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、D1重鎖ではヒト生殖細胞系VH3−48由来のVHセグメント、ヒト生殖細胞系4−23由来のDセグメント、およびヒト生殖細胞系JH6B由来のJHセグメントが用いられることが示された。CDR領域決定のカバト(Kabat)システムを用いてのD1VH配列のさらなる分析により、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域を図示するに至った(各々、図3Aと配列番号3、7および11に示される)。
D1軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、D1軽鎖ではヒト生殖細胞系VKL15由来のVLセグメントおよびヒト生殖細胞系JK1由来のJKセグメントが用いられることが示された。CDR領域決定のカバト(Kabat)システムを用いてのD1VL配列のさらなる分析により、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域を図示するに至った(各々、図3Bと配列番号15、19および23に示される)。
E2の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ図4Aと配列番号36および28に示される。
E2の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ図4Bと配列番号40および32に示される。
E2重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、E2重鎖ではヒト生殖細胞系VH3−48由来のVHセグメント、ヒト生殖細胞系4−23由来のDセグメント、およびヒト生殖細胞系JH6B由来のJHセグメントが用いられることが示された。CDR領域決定のカバト(Kabat)システムを用いてのE2VH配列のさらなる分析により、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域を図示するに至った(各々、図4Aと配列番号4、8および12に示される)。
E2軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、E2軽鎖ではヒト生殖細胞系VKL15由来のVLセグメントおよびヒト生殖細胞系JK1由来のJKセグメントが用いられることが示された。CDR領域決定のカバト(Kabat)システムを用いてのE2VL配列のさらなる分析により、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域を図示するに至った(各々、図4Bと配列番号16、20および24に示される)。
F7、F9、D1およびE2のVHおよびVL領域のフレームワーク配列とその元となる生殖細胞系配列との比較による分析では、生殖細胞系と異なる様々なフレームワークアミノ酸残基が同定された。「復帰突然変異」を意図してVHおよびVLセグメントのN末端領域内の特定のフレームワーク残基を選択し、フレームワーク残基を生殖細胞系配列に回復させたが、これはN末端部分におけるこれらの非生殖細胞系残基が実施例1に記載のファージディスプレイライブラリの作製に用いられるプライマーによりコードされることが理由であった。特に、F7、F9、D1およびE2のVHおよびVLセグメントの以下の修飾形態(生殖細胞系においては「GL」形態と称される)を標準の分子生物学技術を用いて作製し、生殖細胞系アミノ酸残基を指定されるフレームワーク位置で置換した。
F7GLVH:Q1E、Q6E
F7GLVK:A1D、R3Q
F9GLVH:Q1E、Q6E
F9GLVK:E1D、V3Q、L4M
D1GLVH:Q6E
D1GLVK:V1D、W3Q、V4M
E2GLVH:Q6E
E2GLVK:E1D、V3Q、L4M
F7GLVH:Q1E、Q6E
F7GLVK:A1D、R3Q
F9GLVH:Q1E、Q6E
F9GLVK:E1D、V3Q、L4M
D1GLVH:Q6E
D1GLVK:V1D、W3Q、V4M
E2GLVH:Q6E
E2GLVK:E1D、V3Q、L4M
図5Aは、F7(配列番号25)およびF7GL(配列番号41)の重鎖可変アミノ酸配列と生殖細胞系VH3−48がコードされるアミノ酸配列(配列番号49)とのアラインメントを示す。CDR1、CDR2およびCDR3領域が図示される。
図5Bは、F7(配列番号29)およびF7GL(配列番号45)の軽鎖可変アミノ酸配列と生殖細胞系VKL15がコードされるアミノ酸配列(配列番号50)とのアラインメントを示す。CDR1、CDR2およびCDR3領域が図示される。
図6Aは、F9(配列番号26)およびF9GL(配列番号42)の重鎖可変アミノ酸配列と生殖細胞系VH3−48がコードされるアミノ酸配列(配列番号49)とのアラインメントを示す。CDR1、CDR2およびCDR3領域が図示される。
図6Bは、F9(配列番号30)およびF9GL(配列番号46)の軽鎖可変アミノ酸配列と生殖細胞系VKL15がコードされるアミノ酸配列(配列番号50)とのアラインメントを示す。CDR1、CDR2およびCDR3領域が図示される。
図7Aは、D1(配列番号27)およびD1GL(配列番号43)の重鎖可変アミノ酸配列と生殖細胞系VH3−48がコードされるアミノ酸配列(配列番号49)とのアラインメントを示す。CDR1、CDR2およびCDR3領域が図示される。
図7Bは、D1(配列番号31)およびD1GL(配列番号47)の軽鎖可変アミノ酸配列と生殖細胞系VKL15がコードされるアミノ酸配列(配列番号50)とのアラインメントを示す。CDR1、CDR2およびCDR3領域が図示される。
図8Aは、E2(配列番号28)およびE2GL(配列番号44)の重鎖可変アミノ酸配列と生殖細胞系VH3−48がコードされるアミノ酸配列(配列番号49)とのアラインメントを示す。CDR1、CDR2およびCDR3領域が図示される。
図8Bは、E2(配列番号32)およびE2GL(配列番号48)の軽鎖可変アミノ酸配列と生殖細胞系VKL15がコードされるアミノ酸配列(配列番号50)とのアラインメントを示す。CDR1、CDR2およびCDR3領域が図示される。
F7、F9、D1およびE2 Fab断片は、標準の組換えDNA技術を用いて完全長抗体に変換される。例えば、Fab断片のうちの1つのVHおよびVK領域をコードするDNAは、重鎖および軽鎖の定常領域を可変領域が定常領域に作動可能に連結されるように保有する発現ベクターにクローン化されうる。あるいは、完全長重鎖および完全長軽鎖の発現には別々のベクターが用いられうる。完全長抗体の作製における使用に適する発現ベクターの非限定例として、ブラック(Black)による米国特許出願公開第20050153394号明細書に記載のpIEベクターが挙げられる。
実施例3:抗CXCR4ヒトモノクローナル抗体の結合特性
本実施例では、抗CXCR4抗体の結合特性をフローサイトメトリーにより試験した。
本実施例では、抗CXCR4抗体の結合特性をフローサイトメトリーにより試験した。
天然ヒトCXCR4を細胞表面上に発現するヒトT細胞系CEMを用い、F7、F9、D1およびE2抗体の天然の細胞表面CXCR4に対する結合能について試験した。完全長F7、F9、D1およびE2を1:3の段階希釈で滴定した結果、300nM〜5pMの濃度範囲が得られた。次いで、FITCと複合された抗ヒトIgG二次抗体で検出する前に、抗体をCEM細胞と混合し、結合させた。次いで、細胞を蛍光サイトメトリーで分析した。得られた平均蛍光強度を図9のグラフに示し、それは全部で4つの抗CXCR4抗体がCEM細胞に結合することを示す。F7、F9、D1およびE2への結合に対する各EC50は、21nM、14nM、80nMおよび290nMであった。
一群の抗CXCR4抗体のCXCR4への結合に対する競合能を測定するため、競合試験を実施した。4つのヒト抗CXCR4抗体F9、F7、E2およびD1を、4つの市販のマウスモノクローナル抗CXCR4抗体(12G5、708、716および717;各々、R&Dシステムズ(R&D Systems)カタログ番号:MAB170、MAB171、MAB172およびMAB173)とともに用いた。抗CXCR4抗体を1:3の段階希釈で滴定した結果、一定濃度のFITC標識抗CXCR4抗体F9の存在下で300nM〜5pMの濃度範囲が得られた。次いで、抗体の混合物をCEM細胞に添加し、結合させた。各抗体のCEM細胞への結合に対するF9との競合能を蛍光サイトメトリーおよびFITCの検出により評価した。得られた平均蛍光強度を図10のグラフに示し、それは試験対象の全部で7つの抗体(F7、E2、D1、12G5、708、716および717)がCEM細胞への結合に対してF9と競合可能であることを示すが、E2抗体のみは他の抗体に対し、高濃度で部分的阻害を示した。
別の組の実験では、F7 mAbの種々の異なる細胞系に対する結合能を、FACS適定の実施によるフローサイトメトリーにより試験した。漸増するmAb(0.001μg/ml未満から100μg/ml超)を100,000個の細胞とともにインキュベートし、結合をフローサイトメトリーで評価した。Bmax値も測定し、それはおよそ何個のCXCR4分子が各細胞上に存在するかを示す。結合曲線に基づき、抗体結合に対するEC50を判定し、その結果を下記の表1にまとめる。
結果は、F7 mAbが6つの試験対象の細胞系の各々に有効に結合可能であり、ラモスおよびラジ(Raji)細胞系の場合、最低のEC50が観察されることを示す。これらのデータは、CXCR4受容体の発現がラモスおよびナマルバ(Namalwa)細胞において最高でありかつMDA−MB−231細胞およびDMS79細胞において最低であることも示す。
別の結合実験では、F7 mAbのヒト末梢血単核球(PBMC)の異なるサブセットに対する結合能について試験した。ヒトPBMCを標準の方法により単離し、異なる細胞のサブセットをFACSにより単離した。特に、以下の細胞のサブセット、すなわち(i)CD3+、(ii)CD20+;(iii)CD11b+および(iv)CD14+を単離した。F7 mAb(33μg/ml)の場合に行ったフローサイトメトリー実験によると、F7 mAbがアイソタイプが一致した対照抗体と比べて4つの各サブセットに有効に結合可能であることが示された。
実施例4:抗CXCR4抗体によるSDF−1のCXCR4への結合に対する阻害
抗CXCR4ヒト抗体におけるSDF−1のCXCR4への結合に対する阻害能を測定するため、CXCR4を天然に発現する125Iで標識されたSDF−1およびCEM細胞を用いて競合試験を行った。SDF−1のCEM細胞への結合に対する遮断についての抗CXCR4抗体の比較を、標準の放射線標識リガンド結合アッセイにより行った。抗CXCR4抗体を1:3に段階希釈し、300nM〜137pMの濃度範囲を得た。抗体を、2000Ci/mmoleの比活性での100pM 125I−SDF−1(アムシャム(Amersham)、カタログ番号IM314−25UCI)の存在下で、100μl中の750,000個のCEM細胞に添加した。同じアイソタイプの無関係抗体を陰性対照として用いた。生じうる結合された放射線標識リガンド全体を、抗体の非存在下で4℃で2時間、125I−SDF−1をCEM細胞と結合させて測定した。放射線標識リガンドの非特異的結合を、125I−SDF−1を1μMの未標識SDF−1(ペプロテック(Peprotech)、カタログ番号300−28A)の存在下で結合させて測定した。細胞に関連した125I−SDF−1の量を標準の方法により測定した。結果を図11に示し、それはF7抗体がSDF−1のCEM細胞上に発現されるCXCR4への結合に対して最も有効な遮断をもたらすことを示す。F9およびD1抗体は、F7よりも穏やかであるがSDF−1の結合も遮断した。E2抗体は、(実施例3に示されるように)CEM細胞上のCXCR4に結合するが、SDF−1のCEM細胞上のCXCR4への結合を有効に遮断しなかった。F7、F9およびD1によるSDF−1の遮断に対するEC50は、それぞれ2.3nM、12.5nMおよび28.6nMであった。
抗CXCR4ヒト抗体におけるSDF−1のCXCR4への結合に対する阻害能を測定するため、CXCR4を天然に発現する125Iで標識されたSDF−1およびCEM細胞を用いて競合試験を行った。SDF−1のCEM細胞への結合に対する遮断についての抗CXCR4抗体の比較を、標準の放射線標識リガンド結合アッセイにより行った。抗CXCR4抗体を1:3に段階希釈し、300nM〜137pMの濃度範囲を得た。抗体を、2000Ci/mmoleの比活性での100pM 125I−SDF−1(アムシャム(Amersham)、カタログ番号IM314−25UCI)の存在下で、100μl中の750,000個のCEM細胞に添加した。同じアイソタイプの無関係抗体を陰性対照として用いた。生じうる結合された放射線標識リガンド全体を、抗体の非存在下で4℃で2時間、125I−SDF−1をCEM細胞と結合させて測定した。放射線標識リガンドの非特異的結合を、125I−SDF−1を1μMの未標識SDF−1(ペプロテック(Peprotech)、カタログ番号300−28A)の存在下で結合させて測定した。細胞に関連した125I−SDF−1の量を標準の方法により測定した。結果を図11に示し、それはF7抗体がSDF−1のCEM細胞上に発現されるCXCR4への結合に対して最も有効な遮断をもたらすことを示す。F9およびD1抗体は、F7よりも穏やかであるがSDF−1の結合も遮断した。E2抗体は、(実施例3に示されるように)CEM細胞上のCXCR4に結合するが、SDF−1のCEM細胞上のCXCR4への結合を有効に遮断しなかった。F7、F9およびD1によるSDF−1の遮断に対するEC50は、それぞれ2.3nM、12.5nMおよび28.6nMであった。
実施例5:抗CXCR4抗体によるSDF−1誘発性のカルシウム流束の阻害
抗CXCR4ヒト抗体のSDF−1により誘発されるCEM細胞内でのカルシウム流束に対する阻害能を測定するため、CEM細胞をまず蛍光色素カルシウム3(モレキュラー・デバイシーズ(Molecular Devices))で標識した。抗CXCR4抗体を1:3の段階希釈で滴定した結果、100nM〜1pMの濃度範囲が得られ、この抗体を200μl中の200,000個のCEM細胞と統合させ、フレックスステーション(Flexstation)機器(モレキュラー・デバイシーズ(Molecular Devices))への負荷に先立ち、室温で10分間インキュベートした。陰性対照として、同じアイソタイプの無関係抗体を用いた。次いで、細胞を50nMの組換えヒトSDF−1α(ペプロテック(Peprotech))の最終濃度で刺激し、222μlの最終容量に対して22μlの容量で500nMとして添加した。得られたカルシウム流束を1ウェル当たり200秒間測定した。陽性対照として、抗体の非存在下での細胞を(0.1%のBSAまたはHBSを有するハンクス(Hank’s)緩衝生理食塩水(HBS)中で作製した)SDF−1αで刺激し、最大と考えられるカルシウム流束シグナルが得られた。ベースラインを測定するため、細胞を、0.1%BSAを有するHBSで刺激した。SDF−1α刺激性のカルシウムの放出を、カルシウム依存性の蛍光の発光により経時的に測定した。得られた蛍光トレースの曲線下の面積はカルシウム流束を示すものとして報告された。抗CXCR4抗体により得られたカルシウム流束の阻害を図12に示す。データをプロットし、EC50をグラフパッドプリズム(GraphPad Prism)ソフトウェアおよび非線形曲線フィット、S字形用量応答の式(sigmoidal dose response formula)を用いて計算した。抗体F7、F9およびD1は、SDF−1α誘発性のカルシウム流束を阻害した。抗体E2は、(実施例3に示されるように)CXCR4に結合したが、SDF−1α誘発性のカルシウム流束を有意に阻害しなかった。F7、F9およびD1によるSDF−1誘発性のカルシウム流束の阻害に対するEC50は、それぞれ0.90nM、0.32nMおよび0.57nMであった。
抗CXCR4ヒト抗体のSDF−1により誘発されるCEM細胞内でのカルシウム流束に対する阻害能を測定するため、CEM細胞をまず蛍光色素カルシウム3(モレキュラー・デバイシーズ(Molecular Devices))で標識した。抗CXCR4抗体を1:3の段階希釈で滴定した結果、100nM〜1pMの濃度範囲が得られ、この抗体を200μl中の200,000個のCEM細胞と統合させ、フレックスステーション(Flexstation)機器(モレキュラー・デバイシーズ(Molecular Devices))への負荷に先立ち、室温で10分間インキュベートした。陰性対照として、同じアイソタイプの無関係抗体を用いた。次いで、細胞を50nMの組換えヒトSDF−1α(ペプロテック(Peprotech))の最終濃度で刺激し、222μlの最終容量に対して22μlの容量で500nMとして添加した。得られたカルシウム流束を1ウェル当たり200秒間測定した。陽性対照として、抗体の非存在下での細胞を(0.1%のBSAまたはHBSを有するハンクス(Hank’s)緩衝生理食塩水(HBS)中で作製した)SDF−1αで刺激し、最大と考えられるカルシウム流束シグナルが得られた。ベースラインを測定するため、細胞を、0.1%BSAを有するHBSで刺激した。SDF−1α刺激性のカルシウムの放出を、カルシウム依存性の蛍光の発光により経時的に測定した。得られた蛍光トレースの曲線下の面積はカルシウム流束を示すものとして報告された。抗CXCR4抗体により得られたカルシウム流束の阻害を図12に示す。データをプロットし、EC50をグラフパッドプリズム(GraphPad Prism)ソフトウェアおよび非線形曲線フィット、S字形用量応答の式(sigmoidal dose response formula)を用いて計算した。抗体F7、F9およびD1は、SDF−1α誘発性のカルシウム流束を阻害した。抗体E2は、(実施例3に示されるように)CXCR4に結合したが、SDF−1α誘発性のカルシウム流束を有意に阻害しなかった。F7、F9およびD1によるSDF−1誘発性のカルシウム流束の阻害に対するEC50は、それぞれ0.90nM、0.32nMおよび0.57nMであった。
実施例6:抗CXCR4抗体によるCEM細胞のSDF−1誘発性の遊走の阻害
抗CXCR4ヒト抗体のSDF−1誘発性のCEM細胞の遊走に対する阻害能を測定するため、CEM細胞をまずBATDA試薬(パーキンエルマー(Perkin Elmer))で標識した。抗CXCR4抗体を1:3段階希釈で滴定した結果、100nM〜1pMの濃度範囲が得られ、この抗体を1ml当たり1000万個の細胞の密度で標識CEM細胞と結合させた。陰性対照として、同じアイソタイプの無関係抗体を用いた。組換えヒトSDF−1α(ペプロテック(Peprotech))を、1ウェル当たり30μl、5nMで、1ウェル当たり直径5.7mmのフィルタを有する96ウェルのニューロプローブ(Neuroprobe)泳動プレートの下部チャンバに添加した。各ウェルは5μMの孔を有する。抗体を伴う場合と伴わない場合で、標識CEM細胞を、容量50μl中、1ウェル当たり50万個の細胞の濃度でフィルタ上に負荷した。泳動プレートを37℃で2.5時間インキュベートした。泳動細胞をプレートの下部チャンバ内に捕捉し、溶解し、ユウロピウム検出溶液(パーキンエルマー(Perkin Elmer))で検出した。化学発光標識シグナルをフュージョン(Fusion)の機器上で記録した。抗CXCR4抗体により得られたSDF−1α誘発性の遊走の阻害について図13に示す。結果では、抗体F7およびF9が遊走を有効に阻害する一方、抗体D1およびE2が遊走を有意に阻害しないことが示された。F7およびF9によるSDF−1誘発性のCEM細胞の遊走の阻害に対するEC50は、それぞれ12.44nMおよび18.99nMであった。
抗CXCR4ヒト抗体のSDF−1誘発性のCEM細胞の遊走に対する阻害能を測定するため、CEM細胞をまずBATDA試薬(パーキンエルマー(Perkin Elmer))で標識した。抗CXCR4抗体を1:3段階希釈で滴定した結果、100nM〜1pMの濃度範囲が得られ、この抗体を1ml当たり1000万個の細胞の密度で標識CEM細胞と結合させた。陰性対照として、同じアイソタイプの無関係抗体を用いた。組換えヒトSDF−1α(ペプロテック(Peprotech))を、1ウェル当たり30μl、5nMで、1ウェル当たり直径5.7mmのフィルタを有する96ウェルのニューロプローブ(Neuroprobe)泳動プレートの下部チャンバに添加した。各ウェルは5μMの孔を有する。抗体を伴う場合と伴わない場合で、標識CEM細胞を、容量50μl中、1ウェル当たり50万個の細胞の濃度でフィルタ上に負荷した。泳動プレートを37℃で2.5時間インキュベートした。泳動細胞をプレートの下部チャンバ内に捕捉し、溶解し、ユウロピウム検出溶液(パーキンエルマー(Perkin Elmer))で検出した。化学発光標識シグナルをフュージョン(Fusion)の機器上で記録した。抗CXCR4抗体により得られたSDF−1α誘発性の遊走の阻害について図13に示す。結果では、抗体F7およびF9が遊走を有効に阻害する一方、抗体D1およびE2が遊走を有意に阻害しないことが示された。F7およびF9によるSDF−1誘発性のCEM細胞の遊走の阻害に対するEC50は、それぞれ12.44nMおよび18.99nMであった。
実施例7:抗CXCR4抗体によるHuVEC毛細管形成の阻害
本実施例では、抗CXCR4ヒト抗体のヒト臍静脈内皮細胞(HuVEC)による毛細管形成に対する阻害能を試験した。マトリゲルをRPMIで1:1に希釈し、96ウェルプレートのウェル上にプレーティングし、37℃で30分間重合させた。80%コンフルエンスでのHuVEC(キャンブレックス(Cambrex)、カタログ番号CC−2519から入手)をトリプシン処理し、0.5%FBSを有するRPMI中、1ml当たり1×106個の細胞で再懸濁した。抗体を3μg/mlの最終濃度でHuVECと十分に混合し、室温で30分間インキュベートしておいた。同じアイソタイプまたは媒体の無関係抗体を単独で陰性対照として用いた。毛細管形成の阻害の陽性対照として、マウス抗ヒトαvβ3(CD51/CD61)抗体(R&Dシステムズ(R&D Systems)、カタログ番号MAB3050)を用いた。抗体を伴う場合と伴わない場合で、HuVECをマトリゲルでコートしたウェル上にプレーティングし、37℃で18時間インキュベートした。
本実施例では、抗CXCR4ヒト抗体のヒト臍静脈内皮細胞(HuVEC)による毛細管形成に対する阻害能を試験した。マトリゲルをRPMIで1:1に希釈し、96ウェルプレートのウェル上にプレーティングし、37℃で30分間重合させた。80%コンフルエンスでのHuVEC(キャンブレックス(Cambrex)、カタログ番号CC−2519から入手)をトリプシン処理し、0.5%FBSを有するRPMI中、1ml当たり1×106個の細胞で再懸濁した。抗体を3μg/mlの最終濃度でHuVECと十分に混合し、室温で30分間インキュベートしておいた。同じアイソタイプまたは媒体の無関係抗体を単独で陰性対照として用いた。毛細管形成の阻害の陽性対照として、マウス抗ヒトαvβ3(CD51/CD61)抗体(R&Dシステムズ(R&D Systems)、カタログ番号MAB3050)を用いた。抗体を伴う場合と伴わない場合で、HuVECをマトリゲルでコートしたウェル上にプレーティングし、37℃で18時間インキュベートした。
媒体単独またはアイソタイプが一致した対照抗体とともにインキュベートしたHuVECは、毛細管を形成する結果、連結された細胞が1細胞当たり3〜5ポイントの連結点または分枝点でプレートを通過する様相が見られた。抗CXCR4ヒト抗体または抗αvβ3抗体のいずれかとともにインキュベートしたHuVECは毛細管を形成しなかった。細胞は、単離されかつ分枝点がほとんど存在しないように見られた。SDF−1の結合、SDF−1誘発性のカルシウム流束およびSDF−1誘発性の遊走の遮断に最も有効な抗CXCR4抗体、すなわちF7およびF9は、毛細管形成の阻害にも最も有効であった。CXCR4に結合してもSDF−1の結合またはSDF−1誘発性の効果を遮断しない抗CXCR4抗体E2は、毛細管形成を阻害しなかった。
実施例8:抗CXCR4抗体によるインビトロでの腫瘍細胞増殖の阻害
本実施例では、インビトロでの抗CXCR4ヒト抗体のラモス腫瘍細胞(ヒトバーキットリンパ腫細胞系)の増殖に対する阻害能を試験した。アッセイでは、1×104個の細胞/ウェルを漸増用量(10−3〜300nM)のF7 IgG4抗体、F9 IgG1抗体、E2 IgG1抗体、F9 Fab’抗体またはアイソタイプ対照とともにインキュベートした。細胞を抗体とともに72時間インキュベートし、インキュベーションの最後の24時間、3H−チミジンを添加することで、細胞増殖の監視を可能にした。インキュベーション後、細胞による3H−チミジンの取り込みを標準技術により測定した。結果を図14のグラフに示す。結果は、F7 IgG4、F9 IgG1およびE2 IgG1抗体の各々が、3H−チミジンの取り込みがこれら抗体とともにインキュベートされる場合に低下したことから示されるように、ラモス細胞の増殖を阻害できた一方、F9 Fab’断片が細胞増殖を阻害しなかったことを示す。これらの結果は、抗CXCR4ヒト抗体がインビトロで腫瘍細胞に対する直接的な抗増殖効果を有することから抗増殖効果を得るのに二次架橋を必要としないことを示す。
本実施例では、インビトロでの抗CXCR4ヒト抗体のラモス腫瘍細胞(ヒトバーキットリンパ腫細胞系)の増殖に対する阻害能を試験した。アッセイでは、1×104個の細胞/ウェルを漸増用量(10−3〜300nM)のF7 IgG4抗体、F9 IgG1抗体、E2 IgG1抗体、F9 Fab’抗体またはアイソタイプ対照とともにインキュベートした。細胞を抗体とともに72時間インキュベートし、インキュベーションの最後の24時間、3H−チミジンを添加することで、細胞増殖の監視を可能にした。インキュベーション後、細胞による3H−チミジンの取り込みを標準技術により測定した。結果を図14のグラフに示す。結果は、F7 IgG4、F9 IgG1およびE2 IgG1抗体の各々が、3H−チミジンの取り込みがこれら抗体とともにインキュベートされる場合に低下したことから示されるように、ラモス細胞の増殖を阻害できた一方、F9 Fab’断片が細胞増殖を阻害しなかったことを示す。これらの結果は、抗CXCR4ヒト抗体がインビトロで腫瘍細胞に対する直接的な抗増殖効果を有することから抗増殖効果を得るのに二次架橋を必要としないことを示す。
実施例9:抗CXCR4抗体によるインビボでの固形腫瘍細胞増殖の阻害
本実施例では、インビボでの抗CXCR4ヒト抗体の、確立された固形腫瘍の増殖に対する阻害能を、ラモス皮下腫瘍細胞モデルを用いて試験した。このアッセイでは、10×106個のラモス細胞/マウスを各マウスの横腹領域に移植し、腫瘍の長さ×幅×高さ/2により計算された40mm3の平均サイズまで成長させておいた。次いで、マウスは、1回目の用量の抗体の腹腔内(i.p.)注射を受け(治療の0日目で表される)、7日目に2回目の腹腔内用量の抗体を受けた。Fab’断片抗体で治療したマウスは、3日目および10日目にも腹腔内用量の抗体を受けた。マウス群(n=8)を、(i)媒体;(ii)アイソタイプ対照(15mg/kg);(iii)F7 IgG4(15mg/kg);(iv)F9 IgG1(15mg/kg);(v)F9 Fab’(10mg/kg);または(vi)抗CD20陽性対照(15mg/kg)のいずれかで治療した。腫瘍体積およびマウス体重を、投与後の0日目と30日目の間で定期的に(約2〜3回/週で)測定した。実験の結果を図15A、15Bおよび15Cに示し、それらは平均腫瘍体積(図15A)、腫瘍体積中央値(図15B)および%体重変化中央値(図15C)を示す。結果は、腫瘍体積の増大での測定によると、F7 IgG4およびF9 IgG1抗体が陽性対照のように有意に腫瘍細胞成長を阻害する一方、F9 Fab’断片がアイソタイプ対照と比べて腫瘍細胞成長を阻害しないことを示した。あらゆる治療が、全く有意でない体重変化で示されるように十分な耐容性を示した。治療間での体重差が腫瘍の重量に起因する可能性が最も高かった。結果は、抗CXCR4ヒト抗体がインビボで確立された固形腫瘍の成長を阻害可能であることを示す。
本実施例では、インビボでの抗CXCR4ヒト抗体の、確立された固形腫瘍の増殖に対する阻害能を、ラモス皮下腫瘍細胞モデルを用いて試験した。このアッセイでは、10×106個のラモス細胞/マウスを各マウスの横腹領域に移植し、腫瘍の長さ×幅×高さ/2により計算された40mm3の平均サイズまで成長させておいた。次いで、マウスは、1回目の用量の抗体の腹腔内(i.p.)注射を受け(治療の0日目で表される)、7日目に2回目の腹腔内用量の抗体を受けた。Fab’断片抗体で治療したマウスは、3日目および10日目にも腹腔内用量の抗体を受けた。マウス群(n=8)を、(i)媒体;(ii)アイソタイプ対照(15mg/kg);(iii)F7 IgG4(15mg/kg);(iv)F9 IgG1(15mg/kg);(v)F9 Fab’(10mg/kg);または(vi)抗CD20陽性対照(15mg/kg)のいずれかで治療した。腫瘍体積およびマウス体重を、投与後の0日目と30日目の間で定期的に(約2〜3回/週で)測定した。実験の結果を図15A、15Bおよび15Cに示し、それらは平均腫瘍体積(図15A)、腫瘍体積中央値(図15B)および%体重変化中央値(図15C)を示す。結果は、腫瘍体積の増大での測定によると、F7 IgG4およびF9 IgG1抗体が陽性対照のように有意に腫瘍細胞成長を阻害する一方、F9 Fab’断片がアイソタイプ対照と比べて腫瘍細胞成長を阻害しないことを示した。あらゆる治療が、全く有意でない体重変化で示されるように十分な耐容性を示した。治療間での体重差が腫瘍の重量に起因する可能性が最も高かった。結果は、抗CXCR4ヒト抗体がインビボで確立された固形腫瘍の成長を阻害可能であることを示す。
実施例10:抗CXCR4抗体での治療によるマウス全身性腫瘍細胞モデルでの生存時間の増加
本実施例では、抗CXCR4ヒト抗体の、マウスの生存時間を増加させる能力を、ラモス全身性腫瘍細胞モデルを用いて試験した。このアッセイでは、0日目、1×106個のラモス細胞/マウスを各マウスに静脈内(i.v.)注射した。次いで、マウスは、1日目(すなわち腫瘍細胞の静脈内投与の1日後)、1回目の用量の抗体の腹腔内(i.p.)注射を受け、5、8、15および22日目、さらに4回の腹腔内用量の抗体を受けた(陽性対照抗体で治療されるマウスは1日目のみに治療を受けた)。マウス群(n=8)を、(i)媒体;(ii)アイソタイプ対照(15mg/kg);(iii)F9 IgG1(15mg/kg);または(iv)抗CD19陽性対照(15mg/kg)のいずれかで治療した。パーセント生存率を、投与後の0日目と50日目の間で定期的に測定した(後肢麻痺を実験のエンドポイントとして用いた)。実験の結果を図16に示し、それは経時的なパーセント生存率を示す。媒体またはアイソタイプ対照のいずれかで治療されたマウスにおける生存日数中央値はそれぞれ23日および25.5日である一方、1つの用量の抗CD19陽性対照で治療されたマウスの生存日数中央値は39日であった。有意に、5つの用量のF9 IgG1抗体で治療された群中の100%のマウスが実験の終了まで生存した。これらの結果は、抗CXCR4ヒト抗体が全身性腫瘍細胞モデルにおいてマウスの生存時間を増加させうることを示す。
本実施例では、抗CXCR4ヒト抗体の、マウスの生存時間を増加させる能力を、ラモス全身性腫瘍細胞モデルを用いて試験した。このアッセイでは、0日目、1×106個のラモス細胞/マウスを各マウスに静脈内(i.v.)注射した。次いで、マウスは、1日目(すなわち腫瘍細胞の静脈内投与の1日後)、1回目の用量の抗体の腹腔内(i.p.)注射を受け、5、8、15および22日目、さらに4回の腹腔内用量の抗体を受けた(陽性対照抗体で治療されるマウスは1日目のみに治療を受けた)。マウス群(n=8)を、(i)媒体;(ii)アイソタイプ対照(15mg/kg);(iii)F9 IgG1(15mg/kg);または(iv)抗CD19陽性対照(15mg/kg)のいずれかで治療した。パーセント生存率を、投与後の0日目と50日目の間で定期的に測定した(後肢麻痺を実験のエンドポイントとして用いた)。実験の結果を図16に示し、それは経時的なパーセント生存率を示す。媒体またはアイソタイプ対照のいずれかで治療されたマウスにおける生存日数中央値はそれぞれ23日および25.5日である一方、1つの用量の抗CD19陽性対照で治療されたマウスの生存日数中央値は39日であった。有意に、5つの用量のF9 IgG1抗体で治療された群中の100%のマウスが実験の終了まで生存した。これらの結果は、抗CXCR4ヒト抗体が全身性腫瘍細胞モデルにおいてマウスの生存時間を増加させうることを示す。
実施例11:抗CXCR4モノクローナル抗体F7によるアポトーシスの誘発
本実施例では、抗CXCR4 mAb F7の異なる細胞内でのアポトーシスに対する誘発能を試験した。アポトーシスアッセイでは、10μg/mlでのF7 mAbを、ラモス細胞(500,000個の細胞)、ナマルバ細胞(500,000個の細胞)または形質移入によりCXCR4を発現するR1610細胞(100,000個の細胞)のいずれかとともにインキュベートした。形質移入されていないR1610細胞を陰性対照として用いた。抗CXCR4 mAb F7またはアイソタイプ対照抗体を、細胞とともに37℃でインキュベートし、試料250μlを24、48および72時間後に取り出した。アポトーシスを評価するため、様々な時点で得られた細胞を、アネキシン(Annexin)V−FITC−FL1およびヨウ化プロピジウム−FL3とともにインキュベートした後、フローサイトメトリーを行った。FL1、FL3およびFL1−FL3の二重陽性の象限において採集された細胞の合計百分率をアポトーシスと見なした。バックグラウンドを除去するため、アイソタイプ抗体誘発性のアポトーシス細胞の百分率をF7 mAb誘発性のアポトーシス細胞の百分率から差し引いた。
本実施例では、抗CXCR4 mAb F7の異なる細胞内でのアポトーシスに対する誘発能を試験した。アポトーシスアッセイでは、10μg/mlでのF7 mAbを、ラモス細胞(500,000個の細胞)、ナマルバ細胞(500,000個の細胞)または形質移入によりCXCR4を発現するR1610細胞(100,000個の細胞)のいずれかとともにインキュベートした。形質移入されていないR1610細胞を陰性対照として用いた。抗CXCR4 mAb F7またはアイソタイプ対照抗体を、細胞とともに37℃でインキュベートし、試料250μlを24、48および72時間後に取り出した。アポトーシスを評価するため、様々な時点で得られた細胞を、アネキシン(Annexin)V−FITC−FL1およびヨウ化プロピジウム−FL3とともにインキュベートした後、フローサイトメトリーを行った。FL1、FL3およびFL1−FL3の二重陽性の象限において採集された細胞の合計百分率をアポトーシスと見なした。バックグラウンドを除去するため、アイソタイプ抗体誘発性のアポトーシス細胞の百分率をF7 mAb誘発性のアポトーシス細胞の百分率から差し引いた。
結果を下記の表2にまとめる。
結果は、F7 mAbが、ラモス、ナマルバおよびR1610−CXCR4細胞内でのアポトーシスを誘発可能である一方、F7が親R1610細胞のアポトーシスの誘発に対して全く効果を与えず、これは応答がCXCR4に特異的であったことを示す。
実施例12:抗CXCR4抗体によるインビボでの固形腫瘍細胞増殖の阻害を示す追加試験
本実施例では、抗CXCR4ヒト抗体の、増殖に対する阻害能またはインビボで確立された固形腫瘍のアポトーシスに対する誘発能を、上記の実施例9におけるラモスモデルに類似のさらなる腫瘍細胞モデルを用いて試験した。種々の腫瘍細胞系を試験した。典型的な実験および結果は以下の通りである。
本実施例では、抗CXCR4ヒト抗体の、増殖に対する阻害能またはインビボで確立された固形腫瘍のアポトーシスに対する誘発能を、上記の実施例9におけるラモスモデルに類似のさらなる腫瘍細胞モデルを用いて試験した。種々の腫瘍細胞系を試験した。典型的な実験および結果は以下の通りである。
一実験では、7.5×106個のMDA−MB231ヒト乳癌細胞/マウスを各マウスの横腹領域に移植し、移植の7日後、腫瘍の長さ×幅×高さ/2により計算された100mm3の平均サイズまで成長させておいた。マウスは異なる治療群に無作為化され、移植の7日後、1回目の用量の抗体の腹腔内(i.p.)注射を受け、移植の14日後、2回目の腹腔内用量の抗体を受け、次いで移植の46日後、3回目の用量を受けた。マウス群(n=9)を、(i)媒体(PBS)、(ii)IgG1アイソタイプ対照(15mg/kg)、(iii)IgG4アイソタイプ対照(15mg/kg)、(iv)F7 IgG1(15mg/kg)、または(v)F7 IgG4(15mg/kg)のいずれかで治療した。腫瘍体積を定期的に測定し、各治療群における平均腫瘍体積および腫瘍体積中央値を各間隔で測定した。この実験の結果は下記の表3にまとめられ、52日目の平均腫瘍体積(mm3)および%腫瘍成長阻害(TGI)と、移植の59日後の腫瘍体積中央値(mm3)および%TGIを示す。
さらに、59日目、F7 IgG4治療群中のマウスの1匹には腫瘍が見られなかった。結果は、F7 mAbがインビボでMDA−MB231乳癌細胞の成長を阻害可能であることを示す。
第2の実験では、5×106個のDMS79ヒト小細胞肺癌細胞/マウスを各マウスの横腹領域に移植し、移植の7日後、腫瘍の長さ×幅×高さ/2により計算された160mm3の平均サイズまで成長させておいた。マウスは異なる治療群に無作為化され、Q3Dx5の投与計画で(3日ごとで5回)抗体の腹腔内(i.p.)注射を受けた。マウス群(n=10)を、(i)媒体(PBS)、(ii)IgG1アイソタイプ対照(10mg/kg)、(iii)F7 IgG4(10mg/kg)のいずれかで治療した。腫瘍体積を定期的に測定し、各治療群における平均腫瘍体積および腫瘍体積中央値を各間隔で測定した。この実験の結果は下記の表4にまとめられ、移植の34日後の平均腫瘍体積および腫瘍体積中央値(mm3)と%腫瘍成長阻害(TGI)を示す。
結果は、F7 mAbがインビボでDMS79ヒト小細胞肺癌細胞の成長を阻害可能であることを示す。
上記や実施例9に記載と同様の実験では、追加の皮下異種移植片腫瘍モデルにおける抗CXCR4抗体の、腫瘍成長に対する阻害能を試験した。SU−DHL−6 B細胞リンパ腫細胞を用いる実験では、結果は、15mg/kgのF7 IgG4 mAbでの治療により約60%の腫瘍成長阻害がもたらされることを示した。同様に、ナマルババーキットリンパ腫細胞を用いる実験では、結果は、3mg/kgのF7 IgG4 mAbでの治療により約70%の腫瘍成長阻害がもたらされることを示した。それに対し、NIH−H226肺癌細胞またはHPACヒト膵腺癌細胞を用いる実験では、F7 mAbによる腫瘍成長阻害は全く観察されなかった。しかし、フローサイトメトリー実験におけるF7 mAbによるこれらの細胞の染色によると、最低限のインビトロ発現が示された。腫瘍細胞がインビボで免疫組織化学によりmAbによって染色可能であったが、その腫瘍成長のどのステージでCXCR4の発現が開始したかは不明確である。これは、これら2つの細胞系によるCXCR4の発現が抗CXCR4治療によるインビボでの腫瘍成長阻害またはアポトーシスの誘発を可能にするのに不十分であったことを示唆している。
実施例13:抗CXCR4抗体によるインビボでの肺転移の阻害
この実施例では、F7抗CXCR4 mAbの肺転移に対する阻害能を、C57マウス全身性腫瘍モデルを用いて試験した。より詳細には、0.4×106個のB16−CXCR4細胞(ヒトCXCR4を発現するように形質移入されたB16細胞)をC57株の30匹の各マウスに静脈内注射した。マウスを各々がマウス10匹からなる3つの群に無作為化し、次いでそれを、(i)媒体(PBS)、(ii)IgG4アイソタイプ対照(5mg/kg)、または(iii)F7 IgG4(5mg/kg)のいずれかで治療した。B16−CXCR4細胞が静脈内注射されて30分後、抗体または媒体を腹腔内注射した。14日目、肺を採取し、肺転移の結節数を定量した。結果は、下記の表5にまとめられ、各群における肺転移の平均数および数の中央値を示す。
この実施例では、F7抗CXCR4 mAbの肺転移に対する阻害能を、C57マウス全身性腫瘍モデルを用いて試験した。より詳細には、0.4×106個のB16−CXCR4細胞(ヒトCXCR4を発現するように形質移入されたB16細胞)をC57株の30匹の各マウスに静脈内注射した。マウスを各々がマウス10匹からなる3つの群に無作為化し、次いでそれを、(i)媒体(PBS)、(ii)IgG4アイソタイプ対照(5mg/kg)、または(iii)F7 IgG4(5mg/kg)のいずれかで治療した。B16−CXCR4細胞が静脈内注射されて30分後、抗体または媒体を腹腔内注射した。14日目、肺を採取し、肺転移の結節数を定量した。結果は、下記の表5にまとめられ、各群における肺転移の平均数および数の中央値を示す。
結果は、F7 mAbによる治療が56%の肺転移の結節の平均数の低下をもたらす一方でアイソタイプ対照抗体の場合の低下が15%にすぎなかったことを示し、これは全身性腫瘍モデルにおいてF7 mAbが肺転移を阻害可能であることを示す。
Claims (49)
- 細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合する単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
- 前記抗体がSDF−1のヒトCXCR4への結合を阻害する、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体がSDF−1のヒトCXCR4への結合を阻害しない、請求項1に記載の抗体。
- ヒトCXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束を阻害する、請求項1に記載の抗体。
- ヒトCXCR4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走を阻害する、請求項1に記載の抗体。
- ヒト臍静脈内皮細胞による毛細管形成を阻害する、請求項1に記載の抗体。
- ヒトCXCR4を発現する細胞内でのアポトーシスを誘発する、請求項1に記載の抗体。
- インビボでCXCR4+腫瘍細胞の成長を阻害するかまたはアポトーシスを誘発する、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体がヒトCXCR4に1×10−7M以下のKDで結合する、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体がヒトCXCR4に5×10−8M以下のKDで結合する、請求項9に記載の抗体。
- (a)細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合し、
(b)SDF−1のヒトCXCR4への結合を阻害し、
(c)ヒトCXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束を阻害し、
(d)ヒトCXCR4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走を阻害し、および
(e)ヒト臍静脈内皮細胞による毛細管形成を阻害する、
単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。 - ヒトCXCR4を発現する細胞内でのアポトーシスを誘発する、請求項11に記載の抗体。
- インビボでCXCR4+腫瘍細胞の成長を阻害するかまたはアポトーシスを誘発する、請求項11に記載の抗体。
- SDF−1のヒトCXCR4への結合を50nM以下のEC50で阻害する、請求項11に記載の抗体。
- ヒトCXCR4を発現する細胞内でのSDF−1誘発性のカルシウム流束を3nM以下のEC50で阻害する、請求項11に記載の抗体。
- ヒトCXCR4を発現する細胞のSDF−1誘発性の遊走を50nM以下のEC50で阻害する、請求項11に記載の抗体。
- CXCR4への結合に対し、
(a)配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号29のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(b)配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(c)配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号31のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(d)配列番号28のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号32のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む参照抗体と交差競合する、単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。 - ヒトCXCR4に特異的に結合する、ヒトVH3−48遺伝子の産物であるかまたはそれから誘導される重鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
- ヒトCXCR4に特異的に結合する、ヒトVKL15遺伝子の産物であるかまたはそれから誘導される軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
- ヒトCXCR4に特異的に結合する、ヒトVH3−48遺伝子の産物であるかまたはそれから誘導される重鎖可変領域およびヒトVKL15遺伝子の産物であるかまたはそれから誘導される軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
- (a)配列番号1を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号5を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号9を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号13を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号17を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号21を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む、請求項1に記載の抗体。 - (a)配列番号2を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号6を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号10を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号14を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号18を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号22を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む、請求項1に記載の抗体。 - (a)配列番号3を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号7を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号11を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号15を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号19を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号23を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む、請求項1に記載の抗体。 - (a)配列番号4を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号8を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号12を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号16を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号20を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号24を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む、請求項1に記載の抗体。 - ヒトCXCR4に特異的に結合する、
(a)配列番号25〜28および41〜44からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号29〜32および45〜48からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。 - (a)配列番号25または41のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号29または45のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項25に記載の抗体。 - (a)配列番号26または42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号30または46のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項25に記載の抗体。 - (a)配列番号27または43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号31または47のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項25に記載の抗体。 - (a)配列番号28または44のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号32または48のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項25に記載の抗体。 - 請求項1に記載の抗体またはその抗原結合部分および医薬的に許容できる担体を含む組成物。
- 治療物質に連結された、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体。
- 請求項31に記載の免疫複合体および医薬的に許容できる担体を含む組成物。
- 前記治療物質が細胞毒素である、請求項31に記載の免疫複合体。
- 請求項33に記載の免疫複合体および医薬的に許容できる担体を含む組成物。
- 前記治療物質が放射性同位体である、請求項31に記載の免疫複合体。
- 請求項35に記載の免疫複合体および医薬的に許容できる担体を含む組成物。
- 請求項1に記載の抗体またはその抗原結合部分をコードする単離核酸分子。
- 請求項37に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項38に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 抗CXCR4抗体を調製するための方法であって、請求項39に記載の宿主細胞内で前記抗体を発現するステップと、前記宿主細胞から前記抗体を単離するステップと、を含む方法。
- 細胞内でCXCR4活性を調節する方法であって、前記細胞を請求項1に記載の抗体またはその抗原結合部分と前記細胞内でのCXCR4活性が調節されるように接触させるステップを含む方法。
- CXCR4活性がインビトロで前記細胞を前記抗体またはその抗原結合部分とともに培養することにより調節される、請求項41に記載の方法。
- 対象におけるCXCR4活性がインビボで前記対象に前記抗体またはその抗原結合部分を投与することにより調節される、請求項41に記載の方法。
- 前記細胞がCXCR4を発現する腫瘍細胞であり、かつ前記方法が前記腫瘍細胞の成長の阻害または前記腫瘍細胞の転移の阻害をもたらす、請求項41に記載の方法。
- 前記細胞がCXCR4を発現するT細胞であり、かつ前記方法がHIVの前記細胞への侵入の阻害をもたらす、請求項41に記載の方法。
- 前記細胞が炎症性疾患におけるリンパ球であり、かつ前記方法が炎症の阻害をもたらす、請求項41に記載の方法。
- 前記細胞が血管新生に関与し、かつ前記方法が血管新生の調節をもたらす、請求項41に記載の方法。
- 対象における骨髄から末梢血へのCD34+幹細胞の動員を刺激する方法であって、前記対象に請求項1に記載の抗体またはその抗原結合部分を骨髄から末梢血へのCD34+幹細胞の動員が刺激されるように投与するステップを含む方法。
- 前記CD34+幹細胞を前記末梢血から採取するステップをさらに含む、請求項48に記載の方法。
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