JP6097650B2 - Ｃｘｃｒ４に結合するヒト抗体およびその使用 - Google Patents

Ｃｘｃｒ４に結合するヒト抗体およびその使用 Download PDF

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Description

ケモカインは、細胞輸送および血管新生を調節する約５０の小タンパク質のファミリーであり、さらに腫瘍微環境内で重要な役割を担う非特許文献１）。ケモカインは、それらの構造に依存し、（システイン−システインモチーフを有する）Ｃ−Ｃケモカインまたは（システイン−Ｘ−システインモチーフを有する）Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインとして分類される。したがって、かかるケモカインに結合する各受容体は、ＣＣＲファミリーまたはＣＸＣＲファミリーのメンバーとして分類される。ＣＸＣＲファミリーの１つのメンバーは、主にリンパ球上に発現されかつ化学走性を活性化する７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体のＣＸＣＲ４である。ＣＸＣＲ４はケモカインＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）に結合する。
ＣＸＣＲ４は、胚形成、ホメオスタシスおよび炎症において役割を担う。ＣＸＣＲ４またはＳＤＦ−１が欠損するように改変されたマウスを用いる試験には、器官の血管新生ならびに免疫系および造血系におけるＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１経路が関与する（非特許文献２）。さらに、ＣＸＣＲ４はＴリンパ増殖性ＨＩＶ−１単離体における共受容体として機能することが示されている（非特許文献３）。ＣＸＣＲ４はまた、多種多様な癌細胞種上に発現されることが示されている。さらに、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１経路は、多種多様な新生物における転移プロセスの刺激に関与することが示されている（非特許文献４）。例えば、ＣＸＣＲ４およびＳＤＦ−１は、原発性腫瘍部位と転移部位との間に走化性勾配（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｇｒａｄｉｅｎｔ）をもたらすことによって器官特異的な転移を媒介することが示されている（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。
（ヴィカリ Ａ．Ｐ．（Ｖｉｃａｒｉ Ａ．Ｐ．）およびコー Ｃ．（Ｃａｕｘ Ｃ．）（２００２年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．１３：１４３−１５４頁 タチバナ Ｋ．（Ｔａｃｈｉｂａｎａ Ｋ．）ら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：５９１−５９４頁 フェン Ｙ．（Ｆｅｎｇ Ｙ．）ら（１９９６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８７２−８７７頁 マーフィ Ｐ．Ｍ．（Ｍｕｒｐｈｙ Ｐ．Ｍ．）（２００１年）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４５：８３３−８３５頁 ミュラー Ａ．（Ｍｕｌｌｅｒ Ａ．）ら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ ４１０：５０−５６頁 ムラカミ Ｔ．（Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｔ．）ら（２００２年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：７３２８−７３３４頁 ハナハン Ｄ．（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ．）ら（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：３００５−３００８頁
本開示は、ヒトＣＸＣＲ４に結合しかつ極めて多数の所望の特性を示す単離モノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体を提供する。これらの特性は、細胞表面上に発現される天然ヒトＣＸＣＲ４に対する結合能、ＳＤＦ−１のヒトＣＸＣＲ４への結合に対する阻害能、ＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束に対する阻害能、ＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘発性の遊走に対する阻害能、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨｕＶＥＣ）による毛細管形成に対する阻害能、ＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのアポトーシスに対する誘発能、インビトロでの腫瘍細胞増殖に対する阻害能、インビボでの腫瘍細胞増殖に対する阻害能、ＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞転移に対する阻害能および／またはＣＸＣＲ４＋腫瘍を担持する対象の生存時間を増加させる能力を含む。
一態様では、本開示は、単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで抗体は細胞表面上に発現される天然ヒトＣＸＣＲ４に結合する。一実施形態では、抗体はまた、好ましくは５０ｎＭ以下、または３０ｎＭ以下、または１５ｎＭ以下、または１０ｎＭ以下、または５ｎＭ以下、または３ｎＭ以下の阻害に対するＥＣ５０（例えば、２８．６０ｎＭ以下、または１２．５１ｎＭ以下、または２．２５６ｎＭ以下の阻害に対するＥＣ５０）でＳＤＦ−１のヒトＣＸＣＲ４への結合を阻害する。別の実施形態では、抗体は細胞表面上に発現される天然ヒトＣＸＣＲ４に結合するが、ＳＤＦ−１のヒトＣＸＣＲ４への結合を阻害することはない。さらに他の実施形態では、抗体はまた、ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束を、好ましくは３ｎＭ以下、または２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下、または０．９ｎＭ以下、または０．８ｎＭ以下、または０．７ｎＭ以下、または０．６ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下、または０．４ｎＭ以下（例えば、０．９０４６ｎＭ以下、０．５６８４ｎＭ以下、または０．３２１９ｎＭ以下）の阻害に対するＥＣ５０で阻害する。さらに他の実施形態では、抗体はまた、ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘発性の遊走を、好ましくは５０ｎＭ以下、または３０ｎＭ以下、または２０ｎＭ以下、または１５ｎＭ以下（例えば、１８．９９ｎＭ以下、または１２．４４ｎＭ以下）の阻害に対するＥＣ５０で阻害する。さらに他の実施形態では、抗体はまた、ＨｕＶＥＣによる毛細管形成を阻害し、ＣＸＣＲ４を発現する細胞のアポトーシスを誘発し、インビトロで腫瘍細胞増殖を阻害し、インビボで腫瘍細胞増殖を阻害するかまたは腫瘍細胞のアポトーシスを誘発し、ＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞転移を阻害し、および／またはＣＸＣＲ４＋腫瘍を担持する対象の生存時間を増加させる。
好ましくは、抗体は、ヒトＣＸＣＲ４に高親和性、例えば１×１０−７Ｍ以下のＫＤまたは５×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合する。好ましくは、本開示の抗体は完全長抗体（すなわち可変および定常領域を含む）である。さらに、本開示の抗体は、好ましくは、宿主細胞上または人工膜内にその天然の立体構造で発現される完全長ヒトＣＸＣＲ−４に対して産生される。
好ましい態様では、本開示は、単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで抗体は、
（ａ）細胞表面上に発現される天然ヒトＣＸＣＲ４に結合し、
（ｂ）ＳＤＦ−１のヒトＣＸＣＲ４への結合を阻害し、
（ｃ）ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束を阻害し、
（ｄ）ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘発性の遊走を阻害し、および
（ｅ）ヒト臍静脈内皮細胞による毛細管形成を阻害する。
さらにより好ましくは、抗体はまた、ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞のアポトーシスを誘発し、および／またはＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞成長を阻害し、および／またはインビボで腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する。
別の態様では、本開示は、単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで抗体はＣＸＣＲ４への結合に対して参照抗体と交差競合し、ここで参照抗体は、
（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ヒトＶＨ３−４８遺伝子の産物であるかまたはそれから誘導される重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合する。他の実施形態では、本開示は、ヒトＶＫＬ１５遺伝子の産物であるかまたはそれから誘導される軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合する。さらに他の実施形態では、本開示は、ヒトＶＨ３−４８遺伝子の産物であるかまたはそれから誘導される重鎖可変領域およびヒトＶＫＬ１５遺伝子の産物であるかまたはそれから誘導される軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合する。
別の態様では、本開示は、
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域とＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここでは
（ａ）重鎖可変領域のＣＤＲ３配列は配列番号９〜１２のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびにその保存的修飾を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列は配列番号２１〜２４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびにその保存的修飾を含み、
（ｃ）抗体は細胞表面上に発現される天然ヒトＣＸＣＲ４に結合する。
好ましい実施形態では、本抗体はまた、ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害し、ＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束を阻害し、ＣＸＣＲ−４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘発性の遊走を阻害し、ＨｕＶＥＣによる毛細管形成を阻害し、（インビトロおよび／またはインビボで）ＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのアポトーシスを誘発し、インビトロおよび／またはインビボでＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞成長を阻害し、および／またはＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞転移を阻害するといった特性のうちの１つ以上を有する。
好ましくは、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号５〜８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号１７〜２０のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。好ましくは、重鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号１〜４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号１３〜１６のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。
好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号１を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１
（ｂ）配列番号５を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号９を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１３を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１７を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２１を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号２２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号３を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号７を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１１を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１５を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１９を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２３を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号４を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号８を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１２を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１６を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２０を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２４を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
本開示の他の好ましい抗体またはその抗原結合部分は、
（ａ）配列番号２５〜２８および４１〜４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号２９〜３２および４５〜４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み、ここで抗体はＣＸＣＲ４に対して特異的に結合する。
好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号２５または４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号２９または４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号２６または４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号３０または４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号２７もしくは４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号３１もしくは４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号２８もしくは４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号３２もしくは４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
本開示の別の態様では、ＣＸＣＲ４への結合に対して上記抗体のいずれかと競合する抗体またはその抗原結合部分が提供される。
本開示の抗体は、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプの例えば完全長抗体でありうる。あるいは、抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦａｂ’２断片、または一本鎖抗体でありうる。
本開示は、治療物質、例えば細胞毒素または放射性同位体に連結された本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体も提供する。本開示は、抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第２の機能部分に連結された本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む二重特異性分子も提供する。
本開示の抗体またはその抗原結合部分あるいは免疫複合体または二重特異性分子と医薬的に許容できる担体とを含む組成物も提供される。
本開示の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子、ならびにかかる核酸を含む発現ベクターおよびかかる発現ベクターを含む宿主細胞も本開示によって包含される。かかる発現ベクターを含む宿主細胞を用いて抗ＣＸＣＲ４抗体を調製するための方法も提供され、それは（ｉ）宿主細胞内で抗体を発現するステップと、（ｉｉ）宿主細胞から抗体を単離するステップとを含みうる。
本開示の別の態様は細胞内でのＣＸＣＲ４活性を調節する方法に関し、ここで細胞は本開示の抗体またはその抗原結合部分と接触される。細胞は、インビトロで細胞を抗体とともに培養することにより接触されうるか、または細胞はインビボで抗体を対象に投与することにより接触されうる。好ましい実施形態では、細胞はＣＸＣＲ４を発現する腫瘍細胞であり、かつ本方法により腫瘍細胞成長の阻害および／または腫瘍細胞の転移の阻害がもたらされる。別の実施形態では、細胞はＣＸＣＲ４を発現するＴ細胞であり、かつ本方法によりＨＩＶの細胞への侵入の阻害がもたらされる。さらに別の実施形態では、細胞は炎症性障害におけるリンパ球であり、かつ本方法により炎症の阻害がもたらされる。さらに別の実施形態では、細胞は血管新生に関与し、かつ本方法により血管新生の調節がもたらされる。
別の態様では、本開示は、対象における骨髄から末梢血へのＣＤ３４＋幹細胞の動員を刺激する方法であって、対象に本開示の抗体またはその抗原結合部分を骨髄から末梢血へのＣＤ３４＋幹細胞の動員が刺激されるように投与するステップを含む、方法に関する。本方法は、例えば自家幹細胞移植での使用においては末梢血からＣＤ３４＋幹細胞を回収するステップをさらに含みうる。
本開示の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および実施例から明白となり、それらは限定するものとして解釈されるべきではない。本願の全体を通じて言及されるあらゆる参考文献の内容、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号、特許および公開された特許出願は、参照により本明細書中に明示的に援用される。
Ｆ７ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号３３）およびアミノ酸配列（配列番号２５）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１）、ＣＤＲ２（配列番号５）およびＣＤＲ３（配列番号９）領域が図示され、かつＶ、ＤおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。 Ｆ７ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号３７）およびアミノ酸配列（配列番号２９）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１７）およびＣＤＲ３（配列番号２１）領域が図示され、かつＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。 Ｆ９ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号３４）およびアミノ酸配列（配列番号２６）を示す。ＣＤＲ１（配列番号２）、ＣＤＲ２（配列番号６）およびＣＤＲ３（配列番号１０）領域が図示され、かつＶ、ＤおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。 Ｆ９ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号３８）およびアミノ酸配列（配列番号３０）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１４）、ＣＤＲ２（配列番号１８）およびＣＤＲ３（配列番号２２）領域が図示され、かつＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。 Ｄ１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号３５）およびアミノ酸配列（配列番号２７）を示す。ＣＤＲ１（配列番号３）、ＣＤＲ２（配列番号７）およびＣＤＲ３（配列番号１１）領域が図示され、かつＶ、ＤおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。 Ｄ１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号３９）およびアミノ酸配列（配列番号３１）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１５）、ＣＤＲ２（配列番号１９）およびＣＤＲ３（配列番号２３）領域が図示され、かつＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。 Ｅ２ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号３６）およびアミノ酸配列（配列番号２８）を示す。ＣＤＲ１（配列番号４）、ＣＤＲ２（配列番号８）およびＣＤＲ３（配列番号１２）領域が図示され、かつＶ、ＤおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。 Ｅ２ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４０）およびアミノ酸配列（配列番号３２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１６）、ＣＤＲ２（配列番号２０）およびＣＤＲ３（配列番号２４）領域が図示され、かつＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。 Ｆ７（配列番号２５）およびＦ７ＧＬ（配列番号４１）の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶＨ３−４８アミノ酸配列（配列番号４９）とのアラインメントを示す（配列番号５２として開示されるＪＨ６ｂ生殖細胞系）。 Ｆ７（配列番号２９）およびＦ７ＧＬ（配列番号４５）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶＫＬ１５アミノ酸配列（配列番号５０）とのアラインメントを示す（配列番号５３として開示されるＪＫ１生殖細胞系）。 Ｆ９（配列番号２６）およびＦ９ＧＬ（配列番号４２）の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶＨ３−４８アミノ酸配列（配列番号４９）とのアラインメントを示す（配列番号５２として開示されるＪＨ６ｂ生殖細胞系）。 Ｆ９（配列番号３０）およびＦ９ＧＬ（配列番号４６）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶＫＬ１５アミノ酸配列（配列番号５０）とのアラインメントを示す（配列番号５３として開示されるＪＫ１生殖細胞系）。 Ｄ１（配列番号２７）およびＤ１ＧＬ（配列番号４３）の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶＨ３−４８アミノ酸配列（配列番号４９）とのアラインメントを示す（配列番号５２として開示されるＪＨ６ｂ生殖細胞系）。 Ｄ１（配列番号３１）およびＤ１ＧＬ（配列番号４７）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶＫＬ１５アミノ酸配列（配列番号５０）とのアラインメントを示す（配列番号５３として開示されるＪＫ１生殖細胞系）。 Ｅ２（配列番号２８）およびＥ２ＧＬ（配列番号４４）の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶＨ３−４８アミノ酸配列（配列番号４９）とのアラインメントを示す（配列番号５２として開示されるＪＨ６ｂ生殖細胞系）。 Ｅ２（配列番号３２）およびＥ２ＧＬ（配列番号４８）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶＫＬ１５アミノ酸配列（配列番号５０）とのアラインメントを示す（配列番号５３として開示されるＪＫ１生殖細胞系）。 抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２の、細胞表面上に天然ヒトＣＸＣＲ４を発現するＣＥＭ細胞への結合を示すグラフである。 ＦＩＴＣ標識抗ＣＸＣＲ４抗体Ｆ９と一群の未標識抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体との間でのＣＥＭ細胞への結合に対する抗体競合を示すグラフである。 抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体Ｆ７、Ｆ９およびＤ１による１２５Ｉ標識ＳＤＦ−１のＣＥＭ細胞への結合の阻害を示すグラフである。 抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体Ｆ７、Ｆ９およびＤ１によるＣＥＭ細胞内でのＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束の阻害を示すグラフである。 抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体Ｆ７およびＦ９によるＣＥＭ細胞のＳＤＦ−１誘発性の遊走の阻害を示すグラフである。 抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体Ｆ７、Ｆ９およびＥ２によるインビトロでのラモス（Ｒａｍｏｓ）腫瘍細胞増殖の阻害を示すグラフである。 抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体Ｆ７およびＦ９による皮下腫瘍モデルでのインビボでのラモス腫瘍細胞増殖の阻害を示すグラフである。平均腫瘍体積成長曲線を示す。 抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体Ｆ７およびＦ９による皮下腫瘍モデルでのインビボでのラモス腫瘍細胞増殖の阻害を示すグラフである。腫瘍体積中央値成長曲線を示す。 抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体Ｆ７およびＦ９による皮下腫瘍モデルでのインビボでのラモス腫瘍細胞増殖の阻害を示すグラフである。％体重変化の中央値を示す。 ラモス全身性腫瘍細胞モデルでの抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体Ｆ９で治療されたマウスの％生存率を示すグラフである。
本開示は、細胞表面上に発現される天然ヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合する単離モノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体に関する。特定の実施形態では、本開示の抗体は、特定の重鎖および軽鎖生殖細胞系配列から誘導され、および／または特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域などの特定の構造的特徴を含む。本開示は、単離抗体、かかる抗体を作製する方法、かかる抗体を含む免疫複合体および二重特異性分子、ならびに本開示の抗体、免疫複合体または二重特異性分子を含有する医薬組成物を提供する。本開示は、抗体を用い、例えばＣＸＣＲ４を検出するとともに、ＣＸＣＲ４の発現を伴うかまたはＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１経路を含む疾患または障害、例えば癌、腫瘍転移、ＨＩＶ感染、炎症および血管新生におけるＣＸＣＲ４活性を調節する方法にも関する。したがって、本開示は、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体を用い、癌を治療する、例えば、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、甲状腺癌、メラノーマ、鼻咽頭癌、腎細胞、リンパ腫、神経芽細胞腫、グリア芽腫、横紋筋肉腫、結腸直腸癌、腎臓癌、骨肉腫、急性リンパ芽球性白血病または急性骨髄性白血病などの癌を治療する方法も提供する。さらに、本開示は、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体を用いて腫瘍転移を阻害する方法を提供する。
定義
本開示がより容易に理解されうるように、最初に特定の用語が定義される。さらなる定義が詳細な説明を通じて示される。
「ＣＸＣＲ４」という用語は、変異体、アイソフォーム、相同体、オーソログおよびパラログを含む。例えば、ＣＸＣＲ４に特異的な抗体は、特定の場合、ヒト以外の種由来のＣＸＣＲ４と交差反応しうる。他の実施形態では、ヒトＣＸＣＲ４に特異的な抗体は、ヒトＣＸＣＲ４に完全に特異的でありうるとともに、交差反応の種または他のタイプを示す可能性はない。「ヒトＣＸＣＲ４」という用語は、ヒト配列ＣＸＣＲ４、例えばＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ６１０７３（配列番号５１）を有するヒトＣＸＣＲ４の完全なアミノ酸配列を示す。例えばＬＥＳＴＲ、フシン（Ｆｕｓｉｎ）またはＣＤ１８４などのＣＸＣＲ４も当該技術分野で既知である。ヒトＣＸＣＲ４配列は、例えば保存された変異または非保存領域内の変異を有する点で配列番号５１のヒトＣＸＣＲ４と異なる場合があり、かつＣＸＣＲ４は配列番号５１のヒトＣＸＣＲ４と実質的に同じ生物学的機能を有する。例えば、ヒトＣＸＣＲ４の生物学的機能は、本開示の抗体により特異的に結合されたＣＸＣＲ４の細胞外ドメイン内にエピトープを有することであるかまたはヒトＣＸＣＲ４の生物学的機能は転移プロセスにおけるケモカインとの結合または関与である。
特定のヒトＣＸＣＲ４配列は、一般にアミノ酸配列が配列番号５１のヒトＣＸＣＲ４と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸配列が他の種（例えばマウス）のＣＸＣＲ４アミノ酸配列と比較される場合にヒトであることが同定されるアミノ酸残基を有する。特定の場合、ヒトＣＸＣＲ４は、アミノ酸配列が配列番号５１のＣＸＣＲ４と少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一でありうる。特定の実施形態では、ヒトＣＸＣＲ４配列は、配列番号５１のＣＸＣＲ４と１０個以下のアミノ酸の違いを示す。特定の実施形態では、ヒトＣＸＣＲ４は、配列番号５１のＣＸＣＲ４と５個以下、またはさらに４、３、２、もしくは１個以下のアミノ酸の違いを示すことになる。パーセント同一性は本明細書中に記載のように決定されうる。
「ＳＤＦ−１」という用語は、ＣＸＣＲ４のリガンドである間質細胞由来因子１を示す。「ＳＤＦ−１」という用語は、ＳＤＦ−１の異なるアイソフォーム、例えばＳＤＦ−１αおよびＳＤＦ−１βを包含する。ヒトＳＤＦ−１αのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿９５４６３７を有する。ヒトＳＤＦ−１βのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００６００を有する。ヒトＳＤＦ−１は、米国特許第５，７５６，０８４号明細書にも記載されている。ＳＤＦ−１はＣＸＣＬ１２としても既知である。ヒトＳＤＦ−１のアミノ酸配列は、ＣＸＣＲ４について本明細書中に記載のようにＮＰ＿９５４６３７またはＮＰ＿０００６００のＳＤＦ−１と異なる可能性がある。
「免疫応答」という用語は、侵入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合での正常なヒト細胞もしくは組織に対する選択的損傷、それらの破壊または人体からの除去をもたらす、例えば、（抗体、サイトカイン、および補体を含む）上記の細胞または肝臓によって生成されるリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および可溶性高分子の作用を示す。
「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達を担う種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を示す。本明細書で用いられる「細胞表面受容体」という語句は、例えばシグナルの受け取りおよび細胞の原形質膜を通過するかかるシグナルの伝達が可能な分子および分子の複合体を含む。本発明の「細胞表面受容体」の例として、ＣＸＣＲ４受容体が挙げられる。
本明細書で記載の「抗体」という用語は、全抗体および任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）またはその一本鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖またはその抗原結合部分を含む糖タンパク質を示す。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書中でＶＨと略記）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３という３つのドメインからなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書中でＶＬと略記）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域はＣＬという１つのドメインからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域にさらに再分化され、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存される領域が組み入れられうる。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ配列される。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織または免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む因子への結合を媒介しうる。
本明細書で用いられる抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えばＣＸＣＲ４）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を示す。抗体の抗原結合機能が完全長抗体の断片により果たされうることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合断片の例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂであるＦａｂ’断片（「基礎免疫学（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）」（ポール（Ｐａｕｌ）編、第３版、１９９３年）を参照）；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｖ）抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（ワード（Ｗａｒｄ）ら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６頁）；（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；ならびに（ｖｉｉｉ）１つの可変ドメインおよび２つの定常ドメインを有する重鎖可変領域であるナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインのＶＬおよびＶＨが別々の遺伝子でコードされるが、ＶＬおよびＶＨ領域が、それらの一価分子を形成するように対をなす場合の単一のタンパク質鎖としての作製を可能にする合成リンカーによる組換え方法を用いて連結されうる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばバード（Ｂｉｒｄ）ら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６頁、およびハストン（Ｈｕｓｔｏｎ）ら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３頁を参照）。かかる一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含されるようにも意図されている。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技術を用いて得られ、断片における有用性が無傷抗体の場合と同様の方法でスクリーニングされる。
本明細書で用いられる「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を示すように意図されている（例えば、ＣＸＣＲ４に対して特異的に結合する単離抗体は、ＣＸＣＲ４以外の抗原に対して特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ＣＸＣＲ４に対して特異的に結合する単離抗体は、他の抗原、例えば他の種由来のＣＸＣＲ４分子に対する交差反応性を有しうる。さらに、単離抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一の分子組成物の抗体分子の調製物を示す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
本明細書で用いられる「ヒト抗体」という用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の双方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から誘導される場合の可変領域を有する抗体を含むように意図されている。さらに、抗体が定常領域を有する場合、定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から誘導される。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされることのないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的な突然変異誘発またはインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）を含みうる。しかし、本明細書で用いられる「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳類種、例えばマウスの生殖細胞系から誘導されたＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている場合の抗体を含むように意図されていない。
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の双方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から誘導される場合の可変領域を有する単一の結合特異性を提示する抗体を示す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖トランス遺伝子および軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される。
本明細書で用いられる「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段により調製、発現、作製または単離されるすべてのヒト抗体、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子におけるトランスジェニックまたはトランスクロモゾ−ム（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えばマウス）あるいはそれから調製されるハイブリドーマから単離される抗体（さらに下記に記載）、（ｂ）形質転換されることでヒト抗体を発現する宿主細胞、例えばトランスフェクトーマ（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離される抗体、（ｃ）組換えられたコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離される抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、作製または単離される抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から誘導される場合の可変領域を有する。しかし、特定の実施形態では、かかる組換えヒト抗体に対し、インビトロでの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物が用いられる場合、インビボでの体細胞突然変異誘発）を実施可能であり、それ故、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ配列から誘導されかつそれらに関連する一方、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリーの範囲内に天然に存在することがない配列である。
本明細書で用いられる「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えばＩｇＭまたはＩｇＧｌ）を示す。
「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」という語句は、本明細書中で「抗原に対して特異的に結合する抗体」という用語と同義的に用いられる。
「ヒト抗体誘導体」という用語は、ヒト抗体の任意の修飾形態、例えば抗体と別の作用物質または抗体との複合体を示す。
「ヒト化抗体」という用語は、別の哺乳類種、例えばマウスの生殖細胞系から誘導されるＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている場合の抗体を示すように意図されている。さらなるフレームワーク領域の修飾がヒトフレームワーク配列内でなされうる。
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が１種から誘導されかつ定常領域配列が別種から誘導される場合の抗体、例えば可変領域配列がマウス抗体から誘導されかつ定常領域配列がヒト抗体から誘導される場合の抗体を示すように意図されている。
本明細書で用いられる「ヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合する」抗体は、ヒトＣＸＣＲ４（および場合により１つ以上の非ヒト種に由来するＣＸＣＲ４）に結合するが、非ＣＸＣＲ４タンパク質に実質的に結合することがない抗体を示すように意図されている。特定の実施形態では、本開示の抗体は配列番号５１のヒトＣＸＣＲ４またはその変異体に特異的に結合する。好ましくは、抗体は１×１０−７Ｍ以下、より好ましくは５×１０−８Ｍ以下、より好ましくは３×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは５×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＣＸＣＲ４に結合する。
本明細書で用いられる、タンパク質または細胞に「実質的に結合することのない」という用語は、タンパク質または細胞に高親和性で結合することのない、すなわちタンパク質または細胞に１×１０−６Ｍ以上、より好ましくは１×１０−５Ｍ以上、より好ましくは１×１０−４Ｍ以上、より好ましくは１×１０−３Ｍ以上、さらにより好ましくは１×１０−２Ｍ以上のＫＤで結合することを示す。
本明細書で用いられる「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」という用語は特定の抗体−抗原相互作用の結合速度を示すように意図されている一方、本明細書で用いられる「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」という用語は特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を示すように意図されている。本明細書で用いられる「ＫＤ」という用語は解離定数を示すように意図されており、それはＫｄ対Ｋａの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、かつモル濃度（Ｍ）として表現されるものである。抗体におけるＫＤ値は、当該技術分野で十分に確立された方法を用いて決定可能である。抗体のＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラスモン共鳴、好ましくはビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムの利用によるものである。
本明細書で用いられるＩｇＧ抗体における「高親和性」という用語は、標的抗原に対して１×１０−７Ｍ以下、より好ましくは５×１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは１×１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは５×１０−９Ｍ以下およびさらにより好ましくは１×１０−９Ｍ以下のＫＤを有する抗体を示す。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに応じて変化しうる。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合は、１０−６Ｍ以下、より好ましくは１０−７Ｍ以下、さらにより好ましくは１０−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を示す。
本明細書で用いられる「対象」という用語は任意のヒトまたは非ヒト動物を示す。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
本開示の様々な態様は、以下のサブセクションでさらに詳述される。
抗ＣＸＣＲ４抗体
本開示の抗体は、抗体の特定の機能特徴または特性により特徴づけられる。例えば、この抗体は細胞表面上に発現される天然ヒトＣＸＣＲ４に結合する。好ましくは、本開示の抗体は、高親和性、例えば１×１０−７Ｍ以下のＫＤでＣＸＣＲ４に結合する。本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体は、好ましくは、
（ａ）細胞表面上に発現される天然ヒトＣＸＣＲ４に結合する、
（ｂ）ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害する、
（ｃ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束を阻害する、
（ｄ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘発性の遊走を阻害する、
（ｅ）ヒト臍静脈内皮細胞による毛細管形成を阻害する、
（ｆ）ヒトＣＸＣＲ４に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合する、
（ｇ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのアポトーシスを誘発する、
（ｈ）インビトロで腫瘍細胞増殖を阻害する、
（ｉ）インビボで腫瘍細胞増殖を阻害する、および／または腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する、
（ｊ）ＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の転移を阻害する；および／または
（ｋ）ＣＸＣＲ４＋腫瘍を担持する対象の生存時間を増加させる、
といった特徴のうちの１つ以上を示す。
特定の実施形態では、本開示の抗体は、細胞表面上で天然ヒトＣＸＣＲ４に結合するが、ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害することがなく、かつＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束を阻害することがなく、かつＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘発性の遊走を阻害することがない。他の実施形態では、本開示の抗体は、細胞表面上で天然ヒトＣＸＣＲ４に結合し、ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害し、かつＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束を阻害するが、ＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘発性の遊走を阻害することがない。さらに他の実施形態では、本開示の抗体は、細胞表面上で天然ヒトＣＸＣＲ４に結合し、かつＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害し、かつＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束を阻害し、かつＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘発性の遊走を阻害する。さらに他の実施形態では、本開示の抗体は、細胞表面上で天然ヒトＣＸＣＲ４に結合し、ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害し、ＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束を阻害し、ＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘発性の遊走を阻害し、かつＨｕＶＥＣによる毛細管形成を阻害する。
好ましくは、本開示の抗体は、ヒトＣＸＣＲ４に５×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合するか、ヒトＣＸＣＲ４に２×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合するか、ヒトＣＸＣＲ４に５×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するか、ヒトＣＸＣＲ４に４×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するか、ヒトＣＸＣＲ４に３×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するか、またはヒトＣＸＣＲ４に２×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する。
好ましくは、本開示の抗体は、ＳＤＦ−１のヒトＣＸＣＲ４への結合を、５０ｎＭ以下、より好ましくは３０ｎＭ以下、または１５ｎＭ以下、または１０ｎＭ以下、または５ｎＭ以下、または３ｎＭ以下の阻害に対するＥＣ５０（例えば、２８．６０ｎＭ以下、または１２．５１ｎＭ以下、または２．２５６ｎＭ以下の阻害に対するＥＣ５０）で阻害する。
好ましくは、本開示の抗体は、ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束を、３ｎＭ以下、より好ましくは２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下、または０．９ｎＭ以下、または０．８ｎＭ以下、または０．７ｎＭ以下、または０．６ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下、または０．４ｎＭ以下（例えば、０．９０４６ｎＭ以下、０．５６８４ｎＭ以下、または０．３２１９ｎＭ以下）の阻害に対するＥＣ５０で阻害する。
好ましくは、本開示の抗体は、ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘発性の遊走を、５０ｎＭ以下、より好ましくは３０ｎＭ以下、または２０ｎＭ以下、または１５ｎＭ以下（例えば、１８．９９ｎＭ以下、または１２．４４ｎＭ以下）の阻害に対するＥＣ５０で阻害する。
細胞表面上に発現される天然ヒトＣＸＣＲ４に対する抗体の結合能を評価するための標準アッセイは、当該技術分野で既知であり、例えば天然ＣＸＣＲ４を天然に発現するかまたは形質移入により天然ＣＸＣＲ４を発現している細胞系を用いるフローサイトメトリー分析を含む。適切なアッセイについては実施例に詳述される。天然ＣＸＣＲ４を発現する好ましい細胞系はＣＥＭ Ｔ細胞系である。ＳＤＦ−１の結合の阻害、ＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束の阻害、ＳＤＦ−１誘発性の細胞遊走の阻害、ＨｕＶＥＣによる毛細管形成の阻害、インビトロおよび／またはインビボでのＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのアポトーシスの誘発、インビトロおよび／またはインビボでのＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の成長の阻害、および／またはＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の転移の阻害の評価に適するアッセイについても実施例に詳述される。また抗体の結合親和性は、標準の方法、例えばスカッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）分析により決定されうる。
モノクローナル抗体Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２
本開示の好ましい抗体は、実施例１および２で記載のように単離されかつ構造的に特徴づけられるヒトモノクローナル抗体Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２である。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶＨアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５、２６、２７および２８で示される。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶＬアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２９、３０、３１および３２で示される。さらに、特定のフレームワーク残基が生殖細胞系残基で置換された、Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２の他の形態が作製されたが、それらは本明細書中でＦ７ＧＬ、Ｆ９ＧＬ、Ｄ１ＧＬおよびＥ２ＧＬと称される。Ｆ７ＧＬ、Ｆ９ＧＬ、Ｄ１ＧＬおよびＥ２ＧＬのＶＨアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４１、４２、４３および４４で示される。Ｆ７ＧＬ、Ｆ９ＧＬ、Ｄ１ＧＬおよびＥ２ＧＬのＶＬアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４５、４６、４７および４８で示される。
これらの各抗体がＣＸＣＲ４に結合しうると仮定すると、ＶＨおよびＶＬ配列が「混合されて一致する」ことで本開示の他の抗ＣＸＣＲ４結合分子の作製が可能である。かかる「混合されて一致する」抗体のＣＸＣＲ４への結合については、上記や実施例における結合アッセイ（例えばＣＥＭ細胞でのフローサイトメトリー）を用いて試験可能である。好ましくは、ＶＨおよびＶＬ鎖が混合されて一致する場合、特定のＶＨ／ＶＬ対からのＶＨ配列が構造的に類似のＶＨ配列と置換される。同様に、好ましくは特定のＶＨ／ＶＬ対からのＶＬ配列は構造的に類似のＶＬ配列と置換される。
したがって、一態様では、本開示は、
（ａ）配列番号２５〜２８および４１〜４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号２９〜３２および４５〜４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＣＸＣＲ４、好ましくはヒトＣＸＣＲ４に対して特異的に結合する。
好ましい重鎖および軽鎖の組み合わせは、
（ａ）配列番号２５または４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号２９または４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ｂ）配列番号２６または４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号３０または４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ｃ）配列番号２７または４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号３１または４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ｄ）配列番号２８または４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３２または４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
別の態様では、本開示は、Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１またはＥ２の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはそれらの組み合わせを含む抗体を提供する。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１〜４で示される。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号５〜８で示される。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号９〜１２で示される。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶＫＣＤＲ１のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１３〜１６で示される。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶＫＣＤＲ２のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１７〜２０で示される。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶＫＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２１〜２４で示される。ＣＤＲ領域は、カバト（Ｋａｂａｔ）システム（カバト Ｅ．Ａ．（Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．）ら（１９９１年）「免疫学的利益に関するタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（第５版）」、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）を用いて図示される。
これらの各抗体がＣＸＣＲ４に結合可能でありかつ抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域により提供されると仮定すると、ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列とＶＫＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列が「混合されて一致する」（すなわち、各抗体がＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３とＶＫＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を有する必要があるが、異なる抗体由来のＣＤＲが混合されて一致する）ことで、本開示の他の抗ＣＸＣＲ４結合分子の作製が可能である。かかる「混合されて一致する」抗体のＣＸＣＲ４への結合は、上記や実施例に記載の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）（登録商標）分析）を用いて試験可能である。好ましくは、ＶＨＣＤＲ配列が混合されて一致する場合、特定のＶＨ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は構造的に類似のＣＤＲ配列と置換される。同様に、ＶＫＣＤＲ配列が混合されて一致する場合、特定のＶＫ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、好ましくは構造的に類似のＣＤＲ配列と置換される。新規のＶＨおよびＶＬ配列の作製が、１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲ領域配列をモノクローナル抗体Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２における本明細書中に開示されるＣＤＲ配列由来の構造的に類似の配列と置換することにより可能であることは当業者に容易に理解されるであろう。
したがって、別の態様では、本開示は、
（ａ）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号５〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号９〜１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１３〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１７〜２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２１〜２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３；
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＣＸＣＲ４、好ましくはヒトＣＸＣＲ４に対して特異的に結合する。
好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号１を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号５を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号９を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１３を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１７を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２１を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
別の好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号２を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号６を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１０を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１４を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１８を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２２を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
別の好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号３を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号７を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１１を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１５を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１９を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２３を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
別の好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号２４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメインから独立したＣＤＲ３ドメインが単独で抗体の同族抗原に対する結合特異性を決定しうることと、共通のＣＤＲ３配列に基づく同じ結合特異性を有する複数の抗体が予測どおりに産生されうることは、当該技術分野で周知である。例えば、（マウス抗ＣＤ３０抗体Ｋｉ−４の重鎖可変ドメインＣＤＲ３のみを用いるヒト化抗ＣＤ３０抗体の産生について記載する）クリムカ（Ｋｌｉｍｋａ）ら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ８３（２）：２５２−２６０頁（２０００年）；（親マウスＭＯＣ−３１抗ＥＧＰ−２抗体の重鎖ＣＤＲ３配列のみを用いる組換え上皮糖タンパク質−２（ＥＧＰ−２）抗体について記載する）ベイボアー（Ｂｅｉｂｏｅｒ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３−８４９頁（２０００年）；（マウス抗インテグリンαｖβ３抗体ＬＭ６０９の重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ３ドメインを用いる一群のヒト化抗インテグリンαｖβ３抗体においては、各メンバー抗体は、ＣＤＲ３ドメイン外部の異なる配列を含み、親マウス抗体と同じエピトープに親マウス抗体と同程度に高いまたはそれより高い親和性で結合可能である点について記載する）レイダー（Ｒａｄｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０−８９１５頁（１９９８年）；（ＣＤＲ３ドメインが抗原結合に対して最も有意な寄与をもたらす点を開示する）バーバス（Ｂａｒｂａｓ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１−２１６２頁（１９９４年）；（ヒト胎盤ＤＮＡに対する３つのＦａｂ（ＳＩ−１、ＳＩ−４０、およびＳＩ−３２）の重鎖ＣＤＲ３配列の抗破傷風トキソイドＦａｂの重鎖上への移植により既存の重鎖ＣＤＲ３が置換される点を記載し、ＣＤＲ３ドメインが単独で結合特異性を与えた点について示している）バーバス（Ｂａｒｂａｓ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：２５２９−２５３３頁（１９９５年）；（単一特異性ＩｇＧ破傷風トキソイドに結合するＦａｂ ｐ３１３抗体の重鎖に対する親多重特異性Ｆａｂ ＬＮＡ３の重鎖ＣＤＲ３のみの転移が親Ｆａｂの結合特異性を保持するのに十分であったという移植試験について記載する）ディッツェル（Ｄｉｔｚｅｌ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９−７４９頁（１９９６年）を参照のこと。（抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体のＣＤＲ３に基づくペプチドミメティクスについて記載する）ベレゾフ（Ｂｅｒｅｚｏｖ）ら、ＢＩＡｊｏｕｒｎａｌ ８：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ８（２００１年）；（抗ホスファチジルセリン抗体のＣＤＲ３ドメインに対応する１２個のアミノ酸合成ポリペプチドについて記載する）五十嵐（Ｉｇａｒａｓｈｉ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１７：４５２−７頁（１９９５年）；（抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗体の重鎖ＣＤＲ３ドメインから誘導される単一のペプチドがインビトロでウイルスを中和可能であることを示す）ブルジョア（Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２：８０７−１０頁（１９９８年）；（マウス抗ＨＩＶ抗体の重鎖ＣＤＲ３ドメインに基づくペプチドについて記載する）レビ（Ｌｅｖｉ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４３７４−８頁（１９９３年）；（ｓｃＦｖの結合をＺ−ＤＮＡ結合抗体の重鎖ＣＤＲ３領域の移植により可能にすることについて記載する）ポリメニス（Ｐｏｌｙｍｅｎｉｓ）およびストーラー（Ｓｔｏｌｌｅｒ）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５２１８−５３２９頁（１９９４年）；ならびに（重鎖ＣＤＲ３での多様性が通常では同一のＩｇＭ分子における種々のハプテンとタンパク質抗原との識別を可能にするのに十分であることについて記載する）シュー（Ｘｕ）およびデイビス（Ｄａｖｉｓ）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：３７−４５頁（２０００年）。さらに、単一のＣＤＲドメインによって定義される特許化された抗体について記載する米国特許第６，９５１，６４６号明細書；米国特許第６，９１４，１２８号明細書；米国特許第６，０９０，３８２号明細書；米国特許第６，８１８，２１６号明細書；米国特許第６，１５６，３１３号明細書；米国特許第６，８２７，９２５号明細書；米国特許第５，８３３，９４３号明細書；米国特許第５，７６２，９０５号明細書および米国特許第５，７６０，１８５号明細書を参照のこと。これらの各参考文献はその全体が参照により本明細書中に援用される。
したがって、本開示は、ヒトまたは非ヒト動物から誘導される抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここでモノクローナル抗体はＣＸＣＲ４に特異的に結合可能である。特定の態様の範囲内で、本開示は、非ヒト抗体、例えばマウスまたはラット抗体に由来する１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここでモノクローナル抗体はＣＸＣＲ４に特異的に結合可能である。一部の実施形態の範囲内で、非ヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む本発明の抗体は、（ａ）結合に対して競合可能であり、（ｂ）機能特性を保持し、（ｃ）同じエピトープに結合し、および／または（ｄ）対応する親非ヒト抗体と類似の結合親和性を有する。
他の態様の範囲内で、本開示は、例えば非ヒト動物から得られるヒト抗体などのヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここでヒト抗体はＣＸＣＲ４に特異的に結合可能である。他の態様の範囲内で、本開示は、例えば非ヒト動物から得られるヒト抗体などの第１のヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここで第１のヒト抗体はＣＸＣＲ４に特異的に結合可能であり、かつ第１のヒト抗体由来のＣＤＲ３ドメインはＣＸＣＲ４への結合特異性が欠如したヒト抗体内のＣＤＲ３ドメインを置き換えることでＣＸＣＲ４に特異的に結合可能な第２のヒト抗体が産生される。一部の実施形態の範囲内で、第１のヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ３ドメインを含む本発明の抗体は、（ａ）結合に対して競合可能であり、（ｂ）機能特性を保持し、（ｃ）同じエピトープに結合し、および／または（ｄ）対応する第１の親ヒト抗体と類似の結合親和性を有する。
特定の生殖細胞系配列を有する抗体
特定の実施形態では、本開示の抗体は、特定の生殖細胞系重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖細胞系軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。
例えば、好ましい実施形態では、本開示は、ヒトＶＨ３−４８遺伝子の産物であるかまたはそれから誘導される重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＣＸＣＲ４に特異的に結合する。別の好ましい実施形態では、本開示は、ヒトＶＫＬ１５遺伝子の産物であるかまたはそれから誘導される軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＣＸＣＲ４に特異的に結合する。さらに別の好ましい実施形態では、本開示は、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はヒトＶＨ３−４８遺伝子の産物であるかまたはそれから誘導される重鎖可変領域を含みかつヒトＶＫＬ１５遺伝子の産物であるかまたはそれから誘導される軽鎖可変領域を含み、ここで抗体はＣＸＣＲ４、好ましくはヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合する。かかる抗体は、上で詳述の機能特性、例えば細胞表面上に発現される天然ＣＸＣＲ４への結合、ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合の阻害、ＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束の阻害、ＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘発性の遊走の阻害、ＨｕＶＥＣによる毛細管形成の阻害、インビトロおよび／またはインビボでのＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのアポトーシスの誘発、インビトロおよび／またはインビボでのＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の成長の阻害、および／またはＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の転移の阻害のうちの１つ以上も有しうる。
ＶＨ３−４８のＶＨおよびＶＫＬ１５のＶＫを有する抗体の例がＦ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２抗体である。
本明細書で用いられるヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られる場合、特定の生殖細胞系配列「の産物」であるかまたはそれ「から誘導される」重鎖または軽鎖可変領域を含む。かかる系は、目的の抗原とともにヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを免疫するステップまたは目的の抗原とともにファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリをスクリーニングするステップを含む。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「から誘導される」ヒト抗体が、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、配列においてヒト抗体の配列に対して最も近い（すなわち最大の％同一性がある）ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を選択することにより、かかるものとして同定されうる。特定のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「から誘導される」ヒト抗体は、例えば自然発生的体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的導入に起因し、生殖細胞系配列と比べてアミノ酸の差を有しうる。しかし、選択されたヒト抗体は、典型的にはアミノ酸配列においてヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であり、かつ、ヒト抗体が他種の生殖細胞系免疫グロブリンアミノ酸配列（例えばマウス生殖細胞系配列）と比較される場合にヒトであるものと同定されるアミノ酸残基を有する。特定の場合、ヒト抗体は、アミノ酸配列において生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一でありうる。典型的には、特定のヒト生殖細胞系配列から誘導されるヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列とは１０個以下のアミノ酸の差を示すことになる。特定の場合、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列とは５個以下またはさらには４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸の差を示しうる。
相同抗体
さらに別の実施形態では、本開示の抗体は、本明細書中に記載の好ましい抗体のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで抗体は本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体の所望の機能特性を保持する。
例えば、本開示は、
（ａ）重鎖可変領域は配列番号２５〜２８および４１〜４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域は配列番号２９〜３２および４５〜４８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み
（ｃ）抗体は細胞表面上に発現される天然ヒトＣＸＣＲ４に結合する、
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
さらにまたはその他として、抗体は、（ｉ）ヒトＣＸＣＲ４に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合し、（ｉｉ）ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害し、（ｉｉｉ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束を阻害し、（ｉｖ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘発性の遊走を阻害し、（ｖ）ＨｕＶＥＣによる毛細管形成を阻害し、（ｖｉ）インビトロおよび／またはインビボでＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのアポトーシスを誘発し、（ｖｉｉ）インビトロおよび／またはインビボでＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の成長を阻害し、および／または（ｖｉｉｉ）ＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の転移を阻害するといった機能特性のうちの１つ以上を有しうる。
様々な実施形態では、抗体は、例えばヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体でありうる。
他の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、上で示される配列に８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％相同でありうる。上で示される配列のＶＨおよびＶＬ領域に対して高い（すなわち８０％以上の）相同性を有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体が、配列番号２５〜３２または４１〜４８をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的またはＰＣＲ媒介性突然変異誘発）と、その後の本明細書中に記載の機能アッセイを用いてのコードされた改変抗体の保持された機能（すなわち上記に示される機能）についての試験により得られうる。
本明細書で用いられる２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、２つの配列間のパーセント同一性に相当する。２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列で共有される同一位置の数の関数（すなわち％相同性＝同一位置の数／位置の全体数×１００）であり、２つの配列の最適なアラインメントにおいて導入される必要がある。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、下記の非限定例にて記載のように数学的アルゴリズムを用いて行われうる。
２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｅ．メイヤーズ（Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ）およびＷ．ミラー（Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４：１１−１７頁（１９８８年））を用いて決定可能であり、同アルゴリズムはＰＡＭ１２０重み残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ（Ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ）および４のギャップペナルティを用いてＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に導入されている。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびヴンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３頁（１９７０年））アルゴリズムを用いて決定可能であり、同アルゴリズムはブロッサム（Ｂｌｏｓｓｕｍ）６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかと、１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４のギャップ重量および１、２、３、４、５もしくは６の長さ重量を用いてＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）内のＧＡＰプログラム中に包含されている。
さらにまたはその他として、本開示のタンパク質配列をさらに「クエリー配列」として用い、公的データベースで探索を行い、例えば関連配列を同定することが可能である。かかる探索は、アルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０頁のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行可能である。ＢＬＡＳＴタンパク質の探索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことで、本開示の抗体分子に相同なアミノ酸配列が得られうる。比較目的でギャップドアラインメント（ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）を得るため、アルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２頁に記載のようにギャップドＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ）が用いられうる。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ）プログラムを用いる場合、各プログラムのデフォルトパラメータ（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）が有用である。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
保存的修飾を有する抗体
特定の実施形態では、本開示の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここでこれらのＣＤＲ配列のうちの１つ以上は本明細書中に記載の好ましい抗体（例えば、Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１またはＥ２）に基づく特定のアミノ酸配列またはその保存的修飾を含み、かつここで抗体は本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体の所望の機能特性を保持する。抗原結合を除去することのない特定の保存的配列修飾の作製が可能であることは当該技術分野で理解されている。例えば、（サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に特異的な抗体のＣＤＲ３重鎖ドメインにおける突然変異分析について記載する）ブルメル（Ｂｒｕｍｍｅｌｌ）ら（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２：１１８０−８頁；（抗ＵＡ１抗体における突然変異試験について記載する）デ・ヴィルト（ｄｅ Ｗｉｌｄｔ）ら（１９９７年）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５−４１頁；（ＨＣＤＲ３の中央における変異が親和性の欠如または低下をもたらしたことを示す）コミッサロフ（Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ）ら（１９９７年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４−２６８７０頁；（ＣＤＲ３領域内での単一のアミノ酸変化により結合活性が失われたことを記載する）ホール（Ｈａｌｌ）ら（１９９２年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５−１２頁；（抗原結合におけるＴｙｒ残基の寄与について記載する）ケリー（Ｋｅｌｌｅｙ）およびオコンネル（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ）（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２−３５頁；（結合における疎水性の効果について記載する）アディブ−コンキー（Ａｄｉｂ−Ｃｏｎｑｕｙ）ら（１９９８年）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１−６頁；ならびに（ＨＣＤＲ３アミノ酸変異体について記載する）ビアズ（Ｂｅｅｒｓ）ら（２０００年）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５−４３頁を参照のこと。
したがって、本開示は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで
（ａ）重鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、配列番号９〜１２のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、配列番号２１〜４４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ
（ｃ）抗体は細胞表面上に発現される天然ヒトＣＸＣＲ４に結合する。
さらにまたはその他として、抗体は、（ｉ）ヒトＣＸＣＲ４に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合し、（ｉｉ）ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害し、（ｉｉｉ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束を阻害し、（ｉｖ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘発性の遊走を阻害し、（ｖ）ＨｕＶＥＣによる毛細管形成を阻害し、（ｖｉ）インビトロおよび／またはインビボでＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのアポトーシスを誘発し、（ｖｉｉ）インビトロおよび／またはインビボでＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の成長を阻害し、および／または（ｖｉｉｉ）ＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の転移を阻害するといった機能特性のうちの１つ以上を有しうる。
好ましい実施形態では、重鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号５〜８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号１７〜２０からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。別の好ましい実施形態では、重鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号１〜４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号１３〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。
様々な実施形態では、抗体は、例えばヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体でありうる。
本明細書で用いられる「保存的配列修飾（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）」という用語は、アミノ酸配列を有する抗体の結合特性に対して有意に作用または改変することのないアミノ酸修飾を示すように意図されている。かかる保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、当該技術分野で既知の標準技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性突然変異誘発により本開示の抗体に導入されうる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換される場合の置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーについては当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、本開示の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置換可能であり、改変抗体は保持された機能（すなわち上記に示される機能）について本明細書中に記載の機能アッセイを用いて試験可能である。
抗ＣＸＣＲ４抗体と同じエピトープに結合する抗体
別の実施形態では、本開示は、本開示の抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体のいずれかの場合と同じヒトＣＸＣＲ４上のエピトープに結合する抗体（すなわちＣＸＣＲ４への結合に対して本開示のモノクローナル抗体のいずれかと交差競合する能力を有する抗体）を提供する。好ましい実施形態では、交差競合試験における参照抗体は、モノクローナル抗体Ｆ７（ＶＨおよびＶＬ配列（各々、配列番号２５および２９で示される）を有する）またはモノクローナル抗体Ｆ９（ＶＨおよびＶＬ配列（各々、配列番号２６および３０で示される）を有する）またはモノクローナル抗体Ｄ１（ＶＨおよびＶＬ配列（各々、配列番号２７および３１で示される）を有する）またはモノクローナル抗体Ｅ２（ＶＨおよびＶＬ配列（各々、配列番号２８および３２で示される）を有する）でありうる。
かかる交差競合抗体は、標準のＣＸＣＲ４結合アッセイで、Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１またはＥ２と交差競合するその能力に基づいて同定されうる。例えば、ＣＥＭ細胞でフローサイトメトリーを用いることで、本開示の抗体との交差競合の実証が可能であり、ここで参照抗体はＦＩＴＣで標識され、試験抗体におけるＦＩＴＣで標識された参照抗体のＣＥＭ細胞への結合に対する阻害能が評価される。試験抗体の、例えば、Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１またはＥ２のヒトＣＸＣＲ４への結合に対する阻害能は、試験抗体がヒトＣＸＣＲ４への結合に対してＦ７、Ｆ９、Ｄ１またはＥ２と競合可能であり、それ故にＦ７、Ｆ９、Ｄ１またはＥ２の場合と同じヒトＣＸＣＲ４上のエピトープに結合することを示す。好ましい実施形態では、Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１またはＥ２の場合と同じＣＸＣＲ４上のエピトープに結合する抗体はヒトモノクローナル抗体である。かかるヒトモノクローナル抗体は、実施例に記載のように調製され、単離されうる。
改変され修飾された抗体
さらに、本開示の抗体を出発原料として本明細書中に開示されるＶＨおよび／またはＶＬ配列のうちの１つ以上を有する抗体を用いて調製し、修飾抗体を改変することが可能であり、ここで修飾抗体は最初の抗体からの改変された特性を有しうる。抗体は、一方もしくは両方の可変領域（すなわちＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば１つ以上のＣＤＲ領域内および／または１つ以上のフレームワーク領域内での１つ以上の残基の修飾によって改変可能である。さらにまたはその他として、抗体は、例えば定常領域内で残基を修飾し、抗体のエフェクター機能を改変することによって改変可能である。
特定の実施形態では、ＣＤＲ移殖を用いて抗体の様々な領域を改変することが可能である。抗体は、６つの重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基全体に支配的な標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、各抗体間でＣＤＲ外部の配列よりも多様である。ＣＤＲ配列が大部分の抗体−抗原相互作用に関与することから、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列上に移植された特定の天然抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターの作成により発現することは可能である（例えば、リーヒマン Ｌ．（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．）ら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７頁；ジョーンズ Ｐ．（Ｊｏｎｅｓ Ｐ．）ら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５頁；クイーン Ｃ．（Ｑｕｅｅｎ Ｃ．）ら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｅ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３頁；ウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）に交付された米国特許第５，２２５，５３９号明細書ならびにクイーン（Ｑｕｅｅｎ）らに交付された米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書および米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
したがって、本開示の別の実施形態は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列（各々、配列番号１〜４、配列番号５〜８、ならびに配列番号９〜１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む）を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列（各々、配列番号１３〜１６、配列番号１７〜２０、ならびに配列番号２１〜２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む）を含む軽鎖可変領域とを含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。したがって、かかる抗体は、モノクローナル抗体Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１またはＥ２のＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ配列を有し、これらはさらにこれらの抗体由来の異なるフレームワーク配列を有しうる。
かかるフレームワーク配列は、生殖細胞系の抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベースまたは出版された参考文献から得られうる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子における生殖細胞系ＤＮＡ配列は、（インターネット上のｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで入手可能な）「Ｖベース（ＶＢａｓｅ）」ヒト生殖細胞系配列データベースや、カバト Ｅ．Ａ．（Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．）ら（１９９１年）「免疫学的利益に関するタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（第５版）」、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２；トムリンソン Ｉ．Ｍ．（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ Ｉ．Ｍ．）ら（１９９２年）「Ｔｈｅ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ ＶＨ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａｂｏｕｔ Ｆｉｆｔｙ Ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ＶＨ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｌｏｏｐｓ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；ならびにコックス Ｊ．Ｐ．Ｌ．（Ｃｏｘ Ｊ．Ｐ．Ｌ．）ら（１９９４年）「Ａ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ ＶＨ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｓｔｒｏｎｇ Ｂｉａｓ ｉｎ ｔｈｅｉｒ Ｕｓａｇｅ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６頁（これら各々の内容は参照により本明細書中に明示的に援用される）において見出されうる。別の例として、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子における生殖細胞系ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース内に見出されうる。例えば、ＨＣｏ７ ＨｕＭＡｂマウス内で見出される以下の重鎖生殖細胞系配列は、付属のＧｅｎｂａｎｋ登録番号：１−６９（ＮＧ＿００１０１０９、ＮＴ＿０２４６３７およびＢＣ０７０３３３）、３−３３（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）ならびに３−７（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）にて入手可能である。別の例として、ＨＣｏ１２ ＨｕＭＡｂマウス内で見出される以下の重鎖生殖細胞系配列は、付属のＧｅｎｂａｎｋ登録番号：１−６９（ＮＧ＿００１０１０９、ＮＴ＿０２４６３７およびＢＣ０７０３３３）、５−５１（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）、４−３４（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）、３−３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）ならびに３−２３（ＡＪ４０６６７８）にて入手可能である。ヒト重鎖および軽鎖生殖細胞系配列のさらに別の供給源は、ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）から利用可能なヒト免疫グロブリン遺伝子のデータベースである。
抗体タンパク質配列は、当業者に周知のギャップドＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ）と称される配列類似性を探索する方法（アルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：３３８９−３４０２頁）の１つを用いて集められたタンパク質配列データベースに対して比較される。ＢＬＡＳＴは、抗体配列とデータベース配列の間での統計的に有意なアラインメントが整列されたワードの高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）を有する傾向が高いという点でヒューリスティックアルゴリズムである。スコアが延長またはトリミングにより改善されえないセグメント対はヒットと称される。つまり、Ｖベース（ＶＢＡＳＥ）由来のヌクレオチド配列（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ１／ｌｉｓｔ２．ｐｈｐ）が翻訳され、かつＦＲ１〜ＦＲ３フレームワーク領域の間の領域および同領域を含む領域が保持される。データベース配列は平均９８残基長を有する。タンパク質の全長にわたり正確に一致する二重配列が除去される。オフの低複雑性フィルタを除くデフォルトの標準パラメータおよびＢＬＯＳＵＭ６２の置換マトリックスを備えたｂｌａｓｔｐプログラムを用いるタンパク質におけるＢＬＡＳＴ探索では、配列一致をもたらす上位５つのヒットがフィルタにかけられる。ヌクレオチド配列は全部で６つのフレームで翻訳され、データベース配列の一致するセグメント内に停止コドンを全く有しないフレームはヒットの可能性があると考えられる。次いで、これはＢＬＡＳＴプログラムｔｂｌａｓｔｘを用いて確認され、これにより全部で６つのフレーム内で抗体配列が翻訳され、全部で６つのフレーム内で動的に翻訳されたＶベース（ＶＢＡＳＥ）ヌクレオチド配列に対する翻訳が比較される。例えばＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）から利用可能な他のヒト生殖細胞系配列データベースでは、上記のＶＢＡＳＥと同様に検索可能である。
同一性は、抗体配列と配列の全長にわたるタンパク質データベースとの間の正確なアミノ酸の一致である。正（同一性＋置換の一致）は同一ではなく、ＢＬＯＳＵＭ６２置換行列によって導かれるアミノ酸置換である。抗体配列がデータベース配列のうちの２つと同じ同一性で一致する場合、大部分の正を伴うヒットであれば一致する配列ヒットであることが決定されることになる。
本開示の抗体で用いられる好ましいフレームワーク配列は、本開示の選択される抗体により用いられるフレームワーク配列、例えば本開示の好ましいモノクローナル抗体により用いられるＶＨ３−４８フレームワーク配列（配列番号４９）および／またはＶＫＬ１５フレームワーク配列（配列番号５０）と構造的に類似する配列である。ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、ならびにＶＫＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列はフレームワーク配列の元となる生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子内に見出される配列と同一の配列を有するフレームワーク領域上に移植されうるか、あるいはＣＤＲ配列は生殖細胞系配列と比べて１つ以上の突然変異を有するフレームワーク領域上に移植されうる。例えば、特定の例ではフレームワーク領域内の残基を突然変異させ、抗原の抗体への結合能を維持または促進することが有益であることが見出されている（例えば、クイーン（Ｑｕｅｅｎ）らに交付された米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書および米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
可変領域修飾の別のタイプは、アミノ酸残基をＶＨおよび／またはＶＫのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内で変異させ、それにより目的の抗体の１つ以上の結合特性（例えば親和性）を改善するものである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介性突然変異誘発を行い、突然変異を導入可能であり、かつ、目的の抗体の結合または他の機能特性に対する効果が、本明細書中に記載されかつ実施例に提供されるインビトロまたはインビボアッセイにおいて評価されうる。好ましくは、（上で考察の）保存的修飾が導入される。突然変異は、アミノ酸の置換、付加または欠失でありうるが、好ましくは置換である。さらに典型的には、ＣＤＲ領域内の１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ以下の残基が改変される。
したがって、別の実施形態では、本開示は、（ａ）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号１〜４と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号５〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号５〜８と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｃ）配列番号９〜１２からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号９〜１２と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域；（ｄ）配列番号１３〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号１３〜１６と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ１領域；（ｅ）配列番号１７〜２０からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号１７〜２０と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ２領域；ならびに（ｆ）配列番号２１〜２４からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号２１〜２４と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含む単離抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
本開示の改変抗体は、例えば抗体の特性を改善するためにＶＨおよび／またはＶＫ内のフレームワーク残基に修飾が施されている場合の抗体を含む。典型的には、かかるフレームワーク修飾を施すことで抗体の免疫原性が低下する。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系配列に「復帰突然変異する（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅ）」ことである。より詳細には、体細胞突然変異を経ている抗体は、抗体が誘導される生殖細胞系配列とは異なるフレームワーク残基を有しうる。かかる残基は、抗体フレームワーク配列を抗体が誘導される生殖細胞系配列と比較することにより同定されうる。
例えば、Ｆ７ＶＨ領域においては、（カバト（Ｋａｂａｔ）番号付与システムを用いると）フレームワーク領域のアミノ酸位置１、６および２５は生殖細胞系と異なる。これらの位置の１つ、２つもしくは３つ全部が、Ｑ１Ｅ、Ｑ６ＥおよびＡ２５Ｓの置換のうちの１つ、２つもしくは３つ全部を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。Ｆ７ＶＨ領域の好ましい修飾形態は、Ｆ７ＧＬＶＨ（図５Ａおよび配列番号４１に示されるアミノ酸配列）であり、フレームワーク置換Ｑ１ＥおよびＱ６Ｅを有する。
さらに、Ｆ７ＶＫ領域においては、（カバト（Ｋａｂａｔ）番号付与システムを用いると）フレームワーク領域のアミノ酸位置１、３および８４は生殖細胞系と異なる。これらの位置の１つ、２つもしくは３つ全部が、Ａ１Ｄ、Ｒ３ＱおよびＶ８４Ａの置換のうちの１つ、２つもしくは３つ全部を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。Ｆ７ＶＫ領域の好ましい修飾形態は、Ｆ７ＧＬＶＫ（図５Ｂおよび配列番号４５に示されるアミノ酸配列）であり、Ａ１ＤおよびＲ３Ｑのフレームワーク置換を有する。
さらに、Ｆ９ＶＨ領域においては、（カバト（Ｋａｂａｔ）番号付与システムを用いると）フレームワーク領域のアミノ酸位置１、６および２５は生殖細胞系と異なる。これらの位置の１つ、２つもしくは３つ全部が、Ｑ１Ｅ、Ｑ６ＥおよびＡ２５Ｓの置換のうちの１つ、２つもしくは３つ全部を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。Ｆ９ＶＨ領域の好ましい修飾形態は、Ｆ９ＧＬＶＨ（図６Ａおよび配列番号４２に示されるアミノ酸配列）であり、Ｑ１ＥおよびＱ６Ｅのフレームワーク置換を有する。
さらに、Ｆ９ＶＫ領域においては、（カバト（Ｋａｂａｔ）番号付与システムを用いると）フレームワーク領域のアミノ酸位置１、３、４および６０は生殖細胞系と異なる。これらの位置の１つ、２つ、３つもしくは４つ全部が、Ｅ１Ｄ、Ｖ３Ｑ、Ｌ４ＭおよびＰ６０Ｓの置換のうちの１つ、２つ、３つもしくは４つ全部を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。Ｆ９ＶＫ領域の好ましい修飾形態は、Ｆ９ＧＬＶＫ（図６Ｂおよび配列番号４６に示されるアミノ酸配列）であり、Ｅ１Ｄ、Ｖ３ＱおよびＬ４Ｍのフレームワーク置換を有する。
さらに、Ｄ１ＶＨ領域においては、（カバト（Ｋａｂａｔ）番号付与システムを用いると）フレームワーク領域のアミノ酸位置６、２５および７６は生殖細胞系と異なる。これらの位置の１つ、２つもしくは３つ全部が、Ｑ６Ｅ、Ａ２５ＳおよびＲ７６Ｋの置換のうちの１つ、２つもしくは３つ全部を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。Ｄ１ＶＨ領域の好ましい修飾形態は、Ｄ１ＧＬＶＨ（図７Ａおよび配列番号４３に示されるアミノ酸配列）であり、Ｑ６Ｅのフレームワーク置換を有する。
さらに、Ｄ１ＶＫ領域においては、（カバト（Ｋａｂａｔ）番号付与システムを用いると）フレームワーク領域のアミノ酸位置１、３、４、４５および４６は生殖細胞系と異なる。これらの位置の１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ全部が、Ｖ１Ｄ、Ｗ３Ｑ、Ｖ４Ｍ、Ｅ４５ＫおよびＬ４６Ｓの置換のうちの１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ全部を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。Ｄ１ＶＫ領域の好ましい修飾形態は、Ｄ１ＧＬＶＫ（図７Ｂおよび配列番号４７に示されるアミノ酸配列）であり、Ｖ１Ｄ、Ｗ３ＱおよびＶ４Ｍのフレームワーク置換を有する。
さらに、Ｅ２ＶＨ領域においては、（カバト（Ｋａｂａｔ）番号付与システムを用いると）フレームワーク領域のアミノ酸位置６および２５は生殖細胞系と異なる。これらの位置の一方もしくは双方が、Ｑ６ＥおよびＡ２５Ｓの置換のうちの一方もしくは双方を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。Ｅ２ＶＨ領域の好ましい修飾形態は、Ｅ２ＧＬＶＨ（図８Ａおよび配列番号４４に示されるアミノ酸配列）であり、Ｑ６Ｅのフレームワーク置換を有する。
さらに、Ｅ２ＶＫ領域においては、（カバト（Ｋａｂａｔ）番号付与システムを用いると）フレームワーク領域のアミノ酸位置１、３および４は生殖細胞系と異なる。これらの位置の１つ、２つもしくは３つ全部が、Ｅ１Ｄ、Ｖ３ＱおよびＬ４Ｍの置換のうちの１つ、２つもしくは３つ全部を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。Ｅ２ＶＫ領域の好ましい修飾形態は、Ｅ２ＧＬＶＫ（図８Ｂおよび配列番号４８に示されるアミノ酸配列）であり、Ｅ１Ｄ、Ｖ３ＱおよびＬ４Ｍのフレームワーク置換を有する。
フレームワーク修飾の別のタイプは、フレームワーク領域内またはさらに１つ以上のＣＤＲ領域内で１つ以上の残基を変異させ、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。このアプローチは、「脱免疫（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」とも称され、カー（Ｃａｒｒ）らによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号明細書にさらに詳述されている。
フレームワークまたはＣＤＲ領域内でなされる修飾に加えまたはその他として、本開示の抗体は、Ｆｃ領域内で修飾を含み、典型的には抗体の１つ以上の機能特性、例えば血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合性および／または抗原依存性の細胞毒性を変化させるように改変されうる。さらに、本開示の抗体は、化学的に修飾されうる（例えば１つ以上の化学的部分が抗体に付着されうる）か、または修飾によりそのグリコシル化が改変されさらに抗体の１つ以上の機能特性が改変されうる。これらの各実施形態は下記にさらに詳述されている。Ｆｃ領域内の残基の番号付与はカバト（Ｋａｂａｔ）のＥＵ指数のものである。
一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域が、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化する、例えば増加または減少するように修飾される。このアプローチは、ボドマー（Ｂｏｄｍｅｒ）らによる米国特許第５，６７７，４２５号明細書にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化することで、例えば軽鎖および重鎖の構築が促進されるかあるいは抗体の安定性が増大または低下する。
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域の突然変異により抗体の生物学的半減期が減少する。より詳細には、抗体により天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合に対するブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合が低下している程度に、１つ以上のアミノ酸変異がＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入される。このアプローチは、ワード（Ｗａｒｄ）らによる米国特許第６，１６５，７４５号明細書にさらに詳述されている。
別の実施形態では、抗体の修飾によりその生物学的半減期が増加する。様々なアプローチが可能である。例えば、ワード（Ｗａｒｄ）に交付された米国特許第６，２７７，３７５号明細書に記載のように、１つ以上の以下の変異、すなわちＴ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆが導入可能である。あるいは、プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）らによる米国特許第５，８６９，０４６号明細書および米国特許第６，１２１，０２２号明細書に記載のように、生物学的半減期を増加させるため、抗体はＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）受容体結合エピトープを有するようにＣＨ１またはＣＬ領域内で改変されうる。
さらに他の実施形態では、Ｆｃ領域は少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換し、抗体のエフェクター機能を改変することによって改変される。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸が、抗体がエフェクターリガンドに対して改変された親和性を有しても親抗体の抗原への結合能を保持する程度に異なるアミノ酸残基と置換されうる。親和性が改変される対象のエフェクターリガンドは、例えばＦｃ受容体または補体のＣ１成分でありうる。このアプローチは、米国特許第５，６２４，８２１号明細書および米国特許第５，６４８，２６０号明細書（いずれもウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）らによる）にさらに詳述されている。
別の例では、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸が、抗体がＣ１ｑ結合を改変しおよび／または補体依存性の細胞毒性（ＣＤＣ）を低減または根絶している程度に異なるアミノ酸残基と置換されうる。このアプローチは、米国特許第６，１９４，５５１号明細書（イドゥソギー（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ）らによる）にさらに詳述されている。
別の例では、アミノ酸位置２３１および２３９内の１つ以上のアミノ酸残基が改変されることにより、抗体の補体を固定する能力が改変される。このアプローチは、ボドマー（Ｂｏｄｍｅｒ）らによるＰＣＴ公開、国際公開第９４／２９３５１号パンフレットにさらに記載されている。
さらに別の例では、以下の位置、すなわち２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８もしくは４３９での１つ以上のアミノ酸の修飾によるＦｃ領域の修飾により、抗体の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力が増大しおよび／または抗体のＦｃγ受容体に対する親和性が増大する。このアプローチは、ＰＣＴ公開、国際公開第００／４２０７２号パンフレット（プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）による）にさらに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上のＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対する結合部位がマッピングされており、かつ結合が改善された変異体についての記載がなされている（シールズ Ｒ．Ｌ．（Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｒ．Ｌ．）ら（２００１年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４頁を参照）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９での特異的変異がＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善することが示された。さらに、以下の変異体の組み合わせ、すなわちＴ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４ＡがＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善することが示された。
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、アグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体が作製されうる（すなわち抗体におけるグリコシル化が失われる）。グリコシル化の改変により、例えば抗体の抗原に対する親和性が増大しうる。かかる炭水化物修飾は、例えば抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を改変することによりなされうる。例えば、１つ以上のアミノ酸置換がなされうる結果、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去によりその部位でのグリコシル化が失われる。かかるアグリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性が増大しうる。かかるアプローチは、米国特許第５，７１４，３５０号明細書および米国特許第６，３５０，８６１号明細書（コ（Ｃｏ）らによる）にさらに詳述されている。
さらにまたはその他として、グリコシル化の改変タイプを有する抗体、例えば減量されたフコシル残基を有する低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体または増強されたＧｌｃＮａｃ二分構造を有する抗体が作製されうる。かかる改変されたグリコシル化パターンにより、抗体のＡＤＣＣ能力が増大することが示されている。かかる炭水化物修飾は、例えばグリコシル化機構が改変された宿主細胞内で抗体を発現することにより行われうる。グリコシル化機構が改変された細胞については当該技術分野で記載がなされており、本開示の組換え抗体を発現することによりグリコシル化が改変抗体が産生される宿主細胞として用いられうる。例えば、細胞系Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９は、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９細胞系内で発現される抗体がその炭水化物上にフコースを含まないように、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（α（１、６）フコシルトランスフェラーゼ）を含まない。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９ ＦＵＴ８−／−細胞系は、２つの置換ベクターを用いたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞内での標的化されたＦＵＴ８遺伝子の破壊により作製された（ヤマネ（Ｙａｍａｎｅ）らによる米国特許出願公開第２００４０１１０７０４号明細書およびヤマネ−オオヌキ（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ）ら（２００４年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７：６１４−２２頁を参照）。別の例として、ハナイ（Ｈａｎａｉ）らによる欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、機能的に破壊されたフコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系について記載している。かかる細胞系内で発現される抗体は、α１，６結合に関連した酵素の低減または除去により低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を示す。花井（Ｈａｎａｉ）らは、フコースを抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンに添加するのに低い酵素活性を有するかまたは酵素活性を有することのない細胞系、例えばラット骨髄腫細胞系ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）についても記載している。プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）によるＰＣＴ公開、国際公開第０３／０３５８３５号パンフレットには、フコースをＡｓｎ（２９７）に連結された炭水化物に付着させる能力が低下した（その宿主細胞内で発現される抗体の低フコシル化ももたらす）変異ＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃ１３細胞について記載されている（シールズ Ｒ．Ｌ．（Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｒ．Ｌ．）ら（２００２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０頁も参照）。米国特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／０５８５３号明細書に記載のように、修飾されたグリコシル化特性を有する抗体は鶏卵内でも産生されうる。あるいは、修飾されたグリコシル化特性を有する抗体は、植物細胞、例えばレムナ（Ｌｅｍｎａ）内で産生されうる。植物系内で抗体を産生するための方法は、２００６年８月１１日に出願されたアルストン・アンド・バード ＬＬＰ（Ａｌｓｔｏｎ＆Ｂｉｒｄ ＬＬＰ）代理人整理番号０４０９８９／３１４９１１に対応する米国特許出願に開示されている。ウマナ（Ｕｍａｎａ）らによるＰＣＴ公開、国際公開第９９／５４３４２号パンフレットには、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えばβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を、改変された細胞系内で発現される抗体が抗体のＡＤＣＣ活性の増大をもたらすＧｌｃＮａｃ二分構造の増大を示すように発現するように改変された細胞系について記載されている（ウマナ（Ｕｍａｎａ）ら（１９９９年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０頁も参照）。あるいは、抗体のフコース残基はフコシダーゼ酵素を用いて切断されうる。例えば、フコシダーゼのα−Ｌ−フコシダーゼはフコシル残基を抗体から除去する（タランティーノ Ａ．Ｌ．（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ Ａ．Ｌ．）ら（１９７５年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６−２３頁）。
本開示で検討される本明細書中の抗体の別の修飾がペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）である。抗体をペグ化することで、例えば抗体の生物学的（例えば血清）半減期が増加されうる。抗体をペグ化するため、抗体またはその断片は典型的にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１つ以上のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着した状態になるという条件下で反応する。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似反応性の水−可溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行われる。本明細書で用いられる「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質、例えばモノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを誘導体化するのに用いられているＰＥＧの形態のいずれかを包含するように意図されている。特定の実施形態では、ペグ化されるべき抗体はアグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当該技術分野で既知であり、本開示の抗体に適用可能である。例えば、ニシムラ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ）らによる欧州特許第０１５４３１６号明細書およびイシカワ（Ｉｓｈｉｋａｗａ）らによる欧州特許第０４０１３８４号明細書を参照のこと。
抗体断片および抗体模倣体
本発明は、従来の抗体に限定されることなく、抗体断片および抗体模倣体の使用を通じて実施可能である。下記に詳述のように、多種多様な抗体断片および抗体模倣技術が現在では開発されており、当該技術分野で広く知られている。多数のこれら技術、例えばドメイン抗体、ナノボディ、およびユニボディでは従来の抗体構造の断片またはそれに対する他の修飾が用いられる一方、他の技術、例えば従来の抗体結合を模倣する一方、異なる機序から産生され、それを介して機能する結合構造を用いるアフィボディ、ダルピン、アンチカリン、アビマー、およびバーサボディも存在する。
ドメイン抗体（ｄＡｂ）は抗体の最小の機能結合単位であり、ヒト抗体の重鎖（ＶＨ）または軽鎖（ＶＬ）のいずれかの可変領域に対応するものである。ドメイン抗体は約１３ｋＤａの分子量を有する。ドマンティス（Ｄｏｍａｎｔｉｓ）は、完全ヒトＶＨおよびＶＬ ｄＡｂにおける一連の大規模かつ高度に機能的なライブラリ（各ライブラリ内に１００億超の異なる配列）を開発しており、これらのライブラリを用いて治療標的に特異的なｄＡｂを選択する。多数の従来の抗体に対し、ドメイン抗体は細菌、酵母、および哺乳類細胞系内で十分に発現される。ドメイン抗体およびその産生方法のさらなる詳細については、米国特許第６，２９１，１５８号明細書；米国特許第６，５８２，９１５号明細書；米国特許第６，５９３，０８１号明細書；米国特許第６，１７２，１９７号明細書；米国特許第６，６９６，２４５号明細書；米国特許出願公開第２００４／０１１０９４１号明細書；欧州特許出願第１４３３８４６号明細書および欧州特許第０３６８６８４号明細書および欧州特許第０６１６６４０号明細書；国際公開第０５／０３５５７２号パンフレット、国際公開第０４／１０１７９０号パンフレット、国際公開第０４／０８１０２６号パンフレット、国際公開第０４／０５８８２１号パンフレット、国際公開第０４／００３０１９号パンフレットおよび国際公開第０３／００２６０９号パンフレットの参照により得られうる（これら各々はその全体が参照により本明細書中に援用される）。
ナノボディは、天然の重鎖抗体の固有の構造および機能特性を有する抗体由来の治療タンパク質である。これらの重鎖抗体は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）および２つの定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を有する。重要なことには、クローン化され、単離されたＶＨＨドメインは、元の重鎖抗体の完全な抗原結合能を内在する完全に安定的なポリペプチドである。ナノボディは、ヒト抗体のＶＨドメインとの高い相同性を有し、かつ活性の任意の低下を伴うことなくさらにヒト化されうる。重要なことには、ナノボディは免疫原性の低い可能性を有し、霊長動物試験でナノボディのリード化合物を用いて確認されている。
ナノボディでは、従来の抗体の利点を小分子薬物の重要な特徴と組み合わされる。ナノボディは、従来の抗体と同様、その標的および低い固有の毒性に対し、高い標的特異性、高親和性を示す。しかし、ナノボディは、小分子薬物と同様、酵素を阻害し、受容体のクレフトに容易に接近可能である。さらに、ナノボディは極めて安定的であり、注射以外の手段で投与可能であり（例えば国際公開第０４／０４１８６７号パンフレットを参照（その全体が参照により本明細書中に援用される）、製造が容易である。ナノボディの他の利点は、小さいサイズに起因するまれであるかまたは隠されたエピトープの認識、タンパク質標的の空洞または活性部位へのその固有の三次元構造に起因する高い親和性および選択性による結合性、薬物形式の柔軟性、半減期の調整ならびに薬物発見の容易性および速度を含む。
ナノボディは、単一の遺伝子によりコードされ、ほぼすべての原核生物および真核生物宿主、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば米国特許第６，７６５，０８７号明細書を参照（その全体が参照により本明細書中に援用される））、かび（例えばコウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ））ならびに酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）またはピヒア（Ｐｉｃｈｉａ））（例えば米国特許第６，８３８，２５４号明細書を参照（その全体が参照により本明細書中に援用される））において効率的に産生される。産生プロセスは拡張可能であり、数キログラム量のナノボディが産生されている。ナノボディは、従来の抗体と比べて優れた安定性を示すことから、貯蔵寿命が長く即使用可能な溶液として調合可能である。
ナノクローン（Ｎａｎｏｃｌｏｎｅ）法（例えば国際公開第０６／０７９３７２号パンフレットを参照（その全体が参照により本明細書中に援用される））は、Ｂ細胞の自動化された高スループットな選択に基づき所望の標的に対するナノボディを産生するための独自の方法であり、場合により本発明との関連で用いられうる。
ユニボディは別の抗体断片技術であるが、この技術はＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の除去に基づくものである。ヒンジ領域の欠失により、従来のＩｇＧ４抗体に対して本質的に半分のサイズでありかつＩｇＧ４抗体の二価結合領域ではなく一価結合領域を有する分子が生成される。ＩｇＧ４抗体が不活性であることから免疫系と相互作用することがないことも周知であり、これは免疫応答が望ましくない場合の疾患の治療において有利な場合があり、この利点はユニボディ上に受け継がれる。例えば、ユニボディは、その結合対象の細胞を殺滅することなく阻害または沈黙するように機能しうる。さらに、癌細胞に結合するユニボディは、それらを刺激して増殖させることはない。さらに、ユニボディが従来のＩｇＧ４抗体の約半分のサイズであることから、それは大きい固形腫瘍全体により適切な分布を示すとともに有利な有効性を発揮する可能性がある。ユニボディは、全ＩｇＧ４抗体と同様の速度で身体から除去され、その抗原に対して全抗体と同様の親和性で結合可能である。ユニボディのさらなる詳細は、特許国際公開第２００７／０５９７８２号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）の参照により得られうる。
アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）分子は、スタフィロコッカル（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのうちの１つから誘導される、５８−アミノ酸残基のタンパク質ドメインに基づく親和性タンパク質の新しいクラスを表す。この３つのヘリックスバンドル（ｈｅｌｉｘ ｂｕｎｄｌｅ）ドメインはコンビナトリアルファージミドライブラリの作成物における足場として用いられており、それから所望の分子を標的にするアフィボディ変異体がファージディスプレイ技術を用いて選択されうる（ノード Ｋ．（Ｎｏｒｄ Ｋ．）、ガンネリュッソン Ｅ．（Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ Ｅ．）、リングダール Ｊ．（Ｒｉｎｇｄａｈｌ Ｊ．）、スタール Ｓ．（Ｓｔａｈｌ Ｓ．）、ウーレン Ｍ．（Ｕｈｌｅｎ Ｍ．）、ナイグレン Ｐ．Ａ．（Ｎｙｇｒｅｎ Ｐ．Ａ．）、「Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ ａｎ α−ｈｅｌｉｃａｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｏｍａｉｎ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９７年；１５：７７２−７頁、ロンマーク Ｊ．（Ｒｏｎｍａｒｋ Ｊ．）、グロンルンド Ｈ．（Ｇｒｏｎｌｕｎｄ Ｈ．）、ウーレン Ｍ．（Ｕｈｌｅｎ Ｍ．）、ナイグレン Ｐ．Ａ．（Ｎｙｇｒｅｎ Ｐ．Ａ．）、「Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａ（ＩｇＡ）−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ」、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００２年；２６９：２６４７−５５頁）。アフィボディ分子におけるその低い分子量（６ｋＤａ）とともに単純で強固な構造により、それが例えば検出試薬のような多種多様な用途に適するようになり（ロンマーク Ｊ．（Ｒｏｎｍａｒｋ Ｊ．）、ハンソン Ｍ．（Ｈａｎｓｓｏｎ Ｍ．）、ナイグレン Ｔ．（Ｎｙｇｒｅｎ Ｔ．）ら、「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｆｆｉｂｏｄｙ−Ｆｃ ｃｈｉｍｅｒａｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００２年；２６１：１９９−２１１頁）、かつ受容体相互作用が阻害される（サンドストーム Ｋ．（Ｓａｎｄｓｔｏｒｍ Ｋ．）、スー Ｚ．（Ｘｕ Ｚ．）、フォルスバーグ Ｇ．（Ｆｏｒｓｂｅｒｇ Ｇ．）、ナイグレン Ｐ．Ａ．（Ｎｙｇｒｅｎ Ｐ．Ａ．）、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ２８−ＣＤ８０ ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｂｙ ａ ＣＤ２８−ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｆｆｉｂｏｄｙ ｌｉｇａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ２００３年；１６：６９１−７頁）。アフィボディおよびそれを産生する方法のさらなる詳細が、米国特許第５８３１０１２号明細書により得られうる（その全体が参照により本明細書中に援用される）。
標識されたアフィボディは、多数のアイソフォームを判定するためのイメージング用途においても有用でありうる。
ダルピン（設計されたアンキリンリピートタンパク質）は、非抗体ポリペプチドの結合能を用いるように開発された抗体模倣ＤＲＰ（設計されたリピートタンパク質）技術の一例である。アンキリンまたはロイシンリッチのリピートタンパク質などのリピートタンパク質は、偏在する結合分子であり、抗体と異なり細胞内および細胞外に生じる。それら固有のモジュール構造は、構造単位の反復（リピート）を特徴とし、共に蓄積され、可変でかつモジュール式の標的に結合する表面を示す伸長されたリピートドメインが形成される。このモジュール性に基づき、非常に多様化された結合特異性を有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリが生成されうる。この方法は、可変の表面残基およびリピートドメインへのランダムアセンブリを示す自家和合性リピートに共通の設計を含む。
ダルピンは、細菌発現系内で極めて高収量に産生可能であり、既知の最も安定なタンパク質に属する。ヒト受容体、サイトカイン、キナーゼ、ヒトプロテアーゼ、ウイルスおよび膜タンパク質を含む広範囲の標的タンパク質に対して極めて特異的な高親和性のダルピンが選択されている。１桁のナノモル〜ピコモルの範囲内の親和性を有するダルピンが得られうる。
ダルピンは、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、チップ用途、親和性精製またはウエスタンブロッティングを含む広範囲の用途で用いられている。ダルピンは、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合された細胞内マーカータンパク質としての細胞内区画内で活性が高いことも判明した。ダルピンは、ｐＭ範囲内のＩＣ５０でウイルスの侵入を阻害するのにさらに用いられた。ダルピンは、タンパク質−タンパク質相互作用の遮断に望ましいだけでなく酵素の阻害に望ましい。プロテアーゼ、キナーゼおよびトランスポーターの阻害に奏功しており、ほとんどの場合、アロステリック阻害様式である。腫瘍に対する極めて迅速で特異的な濃縮および極めて好ましい腫瘍対血液比により、インビボでの診断的または治療的アプローチに十分に適合するダルピンが作製される。
ダルピンおよび他のＤＲＰ技術に関するさらなる情報が、米国特許出願公開第２００４／０１３２０２８号明細書および国際特許出願公開、国際公開第０２／２０５６５号パンフレットに見出されうる（それら双方はそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。
アンチカリンはさらなる抗体模倣技術であるが、この場合、結合特異性は、ヒト組織内および体液中で自然にかつ豊富に発現される低分子量タンパク質のファミリーであるリポカリンから誘導される。リポカリンは、進化することで、化学的感受性があるかまたは不可溶性の化合物の生理的輸送および保存に関連したインビボでの機能の範囲を果たしている。リポカリンは、タンパク質の一末端で４つのループを支持する高度に保存されたβ−バレルを含む強固な固有の構造を有する。これらのループは結合ポケットに対する入口（ｅｎｔｒａｎｃｅ）を形成し、分子のこの部分における高次構造上の差は各リポカリン間の結合特異性におけるばらつきを示している。
保存されたβシートフレームワークにより支持される超可変ループの全体構造から免疫グロブリンが連想されるが、リポカリンはサイズの観点で抗体とはかなり異なり、単一の免疫グロブリンドメインよりもわずかに大きい１６０−１８０個のアミノ酸の単一のポリペプチド鎖からなる。
リポカリンはクローン化され、アンチカリンの作製のため、そのループには改変がなされる。構造的に多様なアンチカリンのライブラリが生成されており、アンチカリンの提示は、結合機能の選択およびスクリーニング、それに続く、原核系または真核系におけるさらなる分析のための可溶性タンパク質の発現および産生を可能にする。試験によると、仮想的に任意のヒト標的タンパク質に特異的なアンチカリンの開発が可能で、その単離が可能であり、ナノモルのまたはより高い範囲での結合親和性が得られうることを示すことに奏功している。
アンチカリンは、二重標的化された（ｄｕａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）タンパク質、いわゆるデュオカリンとしても形式化されうる。デュオカリンは、標準の作製プロセスを用いて１つの容易に生成される単量体タンパク質内の２つの別々の治療標的に結合する一方、その２つの結合ドメインの構造的方向性にかかわらず標的の特異性および親和性を保持する。
単一の分子を通じての複数の標的の調節は、２つ以上の病原因子を含むことで知られる疾患において特に有利である。さらに、デュオカリンなどの二価または多価の結合形式は、疾患における細胞表面分子の標的化において有意な可能性を有し、シグナル伝達経路に対して作動効果を媒介するか、または細胞表面受容体の結合およびクラスタリングを介して内在化効果の増大を誘発する。さらに、デュオカリンの固有の高い安定性は単量体アンチカリンに匹敵し、デュオカリンに対して柔軟な製剤および送達の可能性をもたらす。
アンチカリンに関するさらなる情報が、米国特許第７，２５０，２９７号明細書および国際特許出願公開番号、国際公開第９９／１６８７３号パンフレットに見出されうる（それら双方はそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。
本発明との関連で有用な別の抗体模倣技術がアビマーである。アビマーは、インビトロでのエクソンシャッフリングおよびファージディスプレイによりヒト細胞外受容体ドメインの大きいファミリーから進化したものであり、結合および阻害特性を備えた多重ドメインタンパク質を生成する。複数の独立した結合ドメインの連結により結合活性がもたらされることが示されており、結果として従来の単一のエピトープ結合タンパク質に対して親和性および特異性が改善される。他の有望な利点として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）内での多重標的に特異的な分子の単純かつ効率的な産生、プロテアーゼに対する改善された熱安定性および耐性が挙げられる。ナノメートル以下の親和性を有するアビマーが種々の標的に対して得られている。
アビマーに関するさらなる情報が、米国特許出願公開第２００６／０２８６６０３号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２３４２９９号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２２３１１４号明細書、米国特許出願公開第２００６／０１７７８３１号明細書、米国特許出願公開第２００６／０００８８４４号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２２１３８４号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１６４３０１号明細書、米国特許出願公開第２００５／００８９９３２号明細書、米国特許出願公開第２００５／００５３９７３号明細書、米国特許出願公開第２００５／００４８５１２号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１７５７５６号明細書に見出されうる（それらすべてはそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。
バーサボディは、本発明との関連で利用可能な別の抗体模倣技術である。バーサボディは、１５％を超えるシステインを有する３〜５ｋＤａの小さいタンパク質であり、高いジスルフィド密度の足場を形成し、典型的なタンパク質が有する疎水性コアの代わりとなる。疎水性コアを含む多数の疎水性アミノ酸の少数のジスルフィドとの置換により、より小さくより親水性が高く（低下した凝集および非特異的結合）、プロテアーゼおよび熱に対してより耐性があり、かつＭＨＣ提示の大部分に寄与する残基が疎水性であることからより低いＴ細胞エピトープの密度を有するタンパク質が生成される。これらの特性の４つすべてが免疫原性に作用することで周知であり、それらは共に免疫原性の大幅な低下の原因になると予想される。
バーサボディについての着想は、ヒル、ヘビ、クモ、サソリ、カタツムリ、およびアネモネにより生成される天然の注射可能な生物医薬品から得られるものであり、予想外に低い免疫原性を示すことが知られている。選択された天然タンパク質ファミリーから、サイズの設計およびスクリーニングにより、疎水性、タンパク質分解の抗原プロセシング、およびエピトープ密度が注射可能な天然タンパク質における平均を大幅に下回るレベルまで最小化される。
バーサボディの構造を仮定すると、これらの抗体模倣体は多価、多重特異性、半減期機構の多様性、組織標的化モジュールおよび抗体Ｆｃ領域の非存在を含む多目的形式を提供する。さらに、バーサボディは、高収量で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で作製され、かつ、バーサボディはその親水性および小サイズ故に可溶性が高く、高濃度に調合されうる。バーサボディは、特に熱安定的であり（それは沸騰可能であり）、長い貯蔵寿命をもたらす。
バーサボディに関するさらなる情報が、米国特許出願公開第２００７／０１９１２７２号明細書に見出されうる（その全体が参照により本明細書中に援用される）。
上で提供された抗体断片および抗体模倣技術の詳細な説明は、本明細書との関連で用いられうるあらゆる技術の包括的リストであるように意図されていない。例えば、また限定を目的としない場合、他のポリペプチドに基づく技術、例えばクイ（Ｑｕｉ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５（８）９２１−９２９頁（２００７年）（その全体が参照により本明細書中に援用される）で概説された相補性決定領域の融合、ならびに核酸に基づく技術、例えば米国特許第５，７８９，１５７号明細書、米国特許第５，８６４，０２６号明細書、米国特許第５，７１２，３７５号明細書、米国特許第５，７６３，５６６号明細書、米国特許第６，０１３，４４３号明細書、米国特許第６，３７６，４７４号明細書、米国特許第６，６１３，５２６号明細書、米国特許第６，１１４，１２０号明細書、米国特許第６，２６１，７７４号明細書、および米国特許第６，３８７，６２０号明細書（これらのすべては参照により本明細書中に援用される）に記載のＲＮＡアプタマー技術を含む種々のさらなる技術が本発明との関連で利用可能である。
抗体の物理的特性
本開示の抗体は、抗ＣＸＣＲ４抗体の様々な物理的特性によりさらに特徴づけられうる。様々なアッセイを用い、これらの物理的特性に基づいて抗体の異なるクラスの検出および／または識別が可能である。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかにおいて１つ以上のグリコシル化部位を有しうる。可変領域内に１つ以上のグリコシル化部位が存在する結果、抗原結合の改変により抗体の免疫原性または抗体のｐＫの変化が増大しうる（マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）ら（１９７２年）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４１：６７３−７０２頁；ガラ Ｆ．Ａ．（Ｇａｌａ Ｆ．Ａ．）およびモリソン Ｓ．Ｌ．（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ．Ｌ．）（２００４年） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：５４８９−９４頁；ワリック（Ｗａｌｌｉｃｋ）ら（１９８８年）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６８：１０９９−１０９頁；スピロ Ｒ．Ｇ．（Ｓｐｉｒｏ Ｒ．Ｇ．）（２００２年）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：４３Ｒ−５６Ｒ；パレク（Ｐａｒｅｋｈ）ら（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ ３１６：４５２−７頁；ミムラ（Ｍｉｍｕｒａ）ら（２０００年）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７：６９７−７０６頁）。グリコシル化はＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を有するモチーフで生じることが知られている。可変領域のグリコシル化はグライコブロット（Ｇｌｙｃｏｂｌｏｔ）アッセイを用いて試験可能であり、同アッセイでは、抗体の切断によりＦａｂが産生され、次いで過ヨウ素酸酸化およびシッフ（Ｓｃｈｉｆｆ）塩基形成を測定するアッセイを用いてグリコシル化が試験される。あるいは、可変領域のグリコシル化はディオネックス（Ｄｉｏｎｅｘ）光クロマトグラフィー（ディオネックス−ＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ−ＬＣ））を用いて試験可能であり、そこでは糖類がＦａｂから切断されて単糖類にされ、各糖類の含量が分析される。いくつかの例では、可変領域のグリコシル化を有することのない抗ＣＸＣＲ４抗体を有することが好ましい。これは、可変領域内にグリコシル化モチーフを有することのない抗体を選択するかまたはグリコシル化モチーフ内の残基を当該技術分野で周知の標準技術を用いて突然変異させることにより実現されうる。
好ましい実施形態では、本開示の抗体はアスパラギン異性部位を有することがない。脱アミドまたはイソアスパラギン酸効果が各々、Ｎ−ＧまたはＤ−Ｇ配列上で生じうる。脱アミドまたはイソアスパラギン酸効果の結果、主鎖ではなく側鎖のカルボキシ末端から離れてキンク構造を生成することにより抗体の安定性を低下させるイソアスパラギン酸が生成される。イソアスパラギン酸の生成は等量（ｉｓｏ−ｑｕａｎｔ）アッセイを用いて測定可能であり、そこでは逆相ＨＰＬＣを用いてイソアスパラギン酸についての試験が行われる。
各抗体は特有の等電点（ｐＩ）を有することになるが、一般に抗体は６〜９．５のｐＨ範囲に収まることになる。ＩｇＧ１抗体におけるｐＩは典型的には７〜９．５のｐＨ範囲内に収まり、かつＩｇＧ４抗体におけるｐＩは典型的には６〜８のｐＨ範囲内に収まる。抗体はこの範囲外のｐＩを有する場合がある。効果は一般に未知であるが、正常な範囲外のｐＩを有する抗体がインビボ条件下である程度のアンフォールディングおよび不安定性を有しうることが推定される。等電点はキャピラリー等電点電気泳動アッセイを用いて試験可能であり、それはｐＨ勾配を生成し、そこでは精度向上のためにレーザー集光が用いられうる（ジャニニ（Ｊａｎｉｎｉ）ら（２００２年）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２３：１６０５−１１頁；マ（Ｍａ）ら（２００１年）Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ ５３：Ｓ７５−８９頁；ハント（Ｈｕｎｔ）ら（１９９８年）Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ ８００：３５５−６７頁）。いくつかの例では、正常な範囲内に収まるｐＩ値を有する抗ＣＸＣＲ４抗体を有することが好ましい。これは正常な範囲内のｐＩを有する抗体を分泌するかまたは帯電した表面残基を当該技術分野で周知の標準の技術を用いて突然変異することによりなされうる。
各抗体は、熱安定性を示す融解温度を有することになる（クリシュナムルティ Ｒ．（Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ Ｒ．）およびマニング Ｍ．Ｃ．（Ｍａｎｎｉｎｇ Ｍ．Ｃ．）（２００２年） Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３：３６１−７１頁）。より高い熱安定性は、インビボで全体的により高い抗体安定性を示す。抗体の融解点は、示差走査熱量測定などの技術を用いて測定されうる（チェン（Ｃｈｅｎ）ら（２００３年）Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２０：１９５２−６０頁；ガーランド（Ｇｈｉｒｌａｎｄｏ）ら（１９９９年）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ６８：４７−５２頁）。ＴＭ１は抗体の初期のアンフォールディングの温度を示す。ＴＭ２は抗体の完全なアンフォールディングの温度を示す。一般に、本開示の抗体のＴＭ１が６０℃超、好ましくは６５℃超、さらにより好ましくは７０℃超であることが好ましい。あるいは、抗体の熱安定性は円二色性を用いて測定されうる。（マレイ（Ｍｕｒｒａｙ）ら（２００２年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｓｃｉ ４０：３４３−９頁）。
好ましい実施形態では、急速に分解することのない抗体が選択される。抗ＣＸＣＲ４抗体の断片化は、当該技術分野で十分に理解されているようにキャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて測定されうる（アレキサンダー Ａ．Ｊ．（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ａ．Ｊ．）およびヒュー Ｄ．Ｅ．（Ｈｕｇｈｅｓ Ｄ．Ｅ．）（１９９５年）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ６７：３６２６−３２頁）。
別の好ましい実施形態では、最小の凝集効果を有する抗体が選択される。凝集が、望ましくない免疫応答および／または改変されるかもしくは好ましくない薬物動態学的特性の誘因となりうる。一般に、抗体では、２５％以下、好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１５％以下、さらにより好ましくは１０％以下およびさらにより好ましくは５％以下の凝集が許容される。凝集は、単量体、二量体、三量体または多量体を同定するためのサイズ排除カラム（ＳＥＣ）高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および光散乱を含む、当該技術分野で周知のいくつかの技術により測定されうる。
抗体を改変する方法
上で考察のように、本明細書中に開示されるＶＨおよびＶＫ配列を有する抗ＣＸＣＲ４抗体を用い、ＶＨおよび／またはＶＫ配列またはそれらに付着される定常領域を修飾することにより新しい抗ＣＸＣＲ４抗体の作製が可能である。したがって、本開示の別の態様では、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体、例えばＦ７、Ｆ９、Ｄ１またはＥ２の構造的特徴を用い、本開示の抗体の少なくとも１つの機能特性、例えばヒトＣＸＣＲ４への結合性を保持する構造的に関連のある抗ＣＸＣＲ４抗体が作製される。上で考察のように、例えばＦ７、Ｆ９、Ｄ１もしくはＥ２の１つ以上のＣＤＲ領域またはその変異を既知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組換え的に組み合わせて、さらなる組換え操作された本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体の作製が可能である。修飾の他のタイプとして、前セクションに記載のタイプが挙げられる。改変方法における出発原料は、本明細書中に提供される１つ以上のＶＨおよび／もしくはＶＫ配列またはそれらの１つ以上のＣＤＲ領域である。改変抗体を作製するのに、本明細書中に提供される１つ以上のＶＨおよび／もしくはＶＫ配列またはそれらの１つ以上のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すなわちタンパク質として発現させる）必要はない。それに対し、配列内に含まれる情報を出発原料として用い、元の配列から誘導される「第二世代」配列が作製され、次いで「第二世代」配列が調製され、タンパク質として発現される。
したがって、別の実施形態では、本開示は、抗ＣＸＣＲ４抗体を調製するための方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号１〜４からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号５〜８からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号９〜１２からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域抗体配列；ならびに／あるいは（ｉｉ）配列番号１３〜１６からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１７〜２０からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号２１〜２４からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供するステップと、
（ｂ）重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列の内部の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変し、少なくとも１つの改変抗体配列を作製するステップと、
（ｃ）改変抗体配列をタンパク質として発現するステップと、
を含む方法を提供する。
標準の分子生物学技術を用い、改変抗体配列の調製および発現が可能である。
好ましくは、改変された抗体配列によりコードされる抗体は、本明細書中に記載の抗ＣＸＣＲ４抗体の機能特性のうちの１つ、一部または全部を保持する抗体であり、ここでの機能特性は、限定はされないが、
（ｉ）細胞表面上に発現される天然ヒトＣＸＣＲ４に結合し、
（ｉｉ）ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害し、
（ｉｉｉ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束を阻害し、
（ｉｖ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘発性の遊走を阻害し、
（ｖ）ＨｕＶＥＣによる毛細管形成を阻害し、
（ｖｉ）ヒトＣＸＣＲ４に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合し、
（ｖｉｉ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのアポトーシスを誘発し、
（ｖｉｉｉ）インビトロで腫瘍細胞増殖を阻害し、
（ｉｘ）インビボで腫瘍細胞増殖を阻害し、および／または腫瘍細胞のアポトーシスを誘発し、
（ｘ）ＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の転移を阻害し、および／または
（ｘｉ）ＣＸＣＲ４＋腫瘍を担持する対象の生存時間を増加させる
といった機能特性を含む。
改変抗体の機能特性は、当該技術分野で使用可能でありおよび／または本明細書中に記載の標準アッセイ、例えば実施例で示されるアッセイ（例えば、フローサイトメトリー、結合アッセイ、機能アッセイ）を用いて評価可能である。
本開示の抗体を改変する方法の特定の実施形態では、変異が、抗ＣＸＣＲ４抗体のコード配列の全部もしくは一部に沿ってランダムまたは選択的に導入可能であり、かつ、得られる修飾された抗ＣＸＣＲ４抗体における結合活性および／または本明細書中に記載の他の機能特性についてスクリーニング可能である。突然変異方法については当該技術分野で記載がなされている。例えば、ショート（Ｓｈｏｒｔ）によるＰＣＴ公開、国際公開第０２／０９２７８０号パンフレットでは、抗体変異を飽和突然変異誘発、合成的ライゲーションアセンブリー（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）またはそれらの組み合わせを用いて作製しスクリーニングするための方法が記載されている。あるいは、レーザー（Ｌａｚａｒ）らによるＰＣＴ公開、国際公開第０３／０７４６７９号パンフレットでは、コンピュータによるスクリーニング方法を用いて抗体の生理化学的特性を最適化する方法が記載されている。
本開示の抗体をコードする核酸分子
本開示の別の態様は、本開示の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞内に、細胞溶解液中にまたは部分精製形態もしくは実質的に純粋な形態で存在しうる。核酸は、当該技術分野で周知のアルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動およびその他を含む標準技術により、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば他の細胞核酸もしくはタンパク質から除去精製される場合、「単離される」かまたは「実質的に純粋な状態にされる」。Ｆ．アウスベル（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編（１９８７年）「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）のグリーン・パブリッシング・アンド・ワイリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）を参照のこと。本開示の核酸が例えばＤＮＡまたはＲＮＡでありうるとともに、イントロン配列を有するかまたは有しない場合がある。好ましい実施形態では核酸はｃＤＮＡ分子である。
本開示の核酸は、標準の分子生物学技術を用いて得られうる。ハイブリドーマ（例えばさらに下記のヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ）により発現される抗体においては、ハイブリドーマにより作製される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡが標準のＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により得られうる。（例えばファージディスプレイ技術を用いる）免疫グロブリン遺伝子ライブラリから得られる抗体については、かかる抗体をコードする核酸が遺伝子ライブラリから回収されうる。
本開示の好ましい核酸分子は、Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードするものである。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶＨ配列をコードするＤＮＡ配列はそれぞれ配列番号３３〜３６で示される。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列はそれぞれ配列番号３７〜４０で示される。
一旦ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、これらのＤＮＡ断片を標準の組換えＤＮＡ技術によりさらに操作することで、例えば可変領域遺伝子が完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換されうる。これらの操作では、ＶＬもしくはＶＨをコードするＤＮＡ断片が別のタンパク質、例えば抗体の定常領域またはフレキシブルリンカー（ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。これに関連して用いられる「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡ断片が２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームに保持するように連結されることを意味するように意図されている。
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより完全長重鎖遺伝子に変換されうる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で既知であり（例えばカバト Ｅ．Ａ．（Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．）ら（１９９１年）「免疫学的利益に関するタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、第５版、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片が標準のＰＣＲ増幅により得られうる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域でありうるが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子については、ＶＨをコードするＤＮＡは重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結されうる。
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより完全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換されうる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で既知であり（例えばカバト Ｅ．Ａ．（Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．）ら（１９９１年）「免疫学的利益に関するタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、第５版、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準のＰＣＲ増幅により得られうる。好ましい実施形態では、軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域でありうる。
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するのに、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片がフレキシブルリンカー、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片に作動可能に連結されることで、ＶＨおよびＶＬ配列はフレキシブルリンカーで連結されたＶＬおよびＶＨ領域を有する隣接した一本鎖タンパク質として発現されうる（例えば、バード（Ｂｉｒｄ）ら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６頁；ハストン（Ｈｕｓｔｏｎ）ら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３頁；およびマッカファーティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら（１９９０年）、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４頁を参照）。
本開示のモノクローナル抗体の産生
本開示のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体の方法、例えばコーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５頁の標準の体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む種々の技術により産生可能である。原理上、体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、モノクローナル抗体を産生するための他の技術、例えばＢリンパ球のウイルス性または発癌性の形質転換が用いられうる。
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ生成は極めて十分に確立された方法である。融合のために免疫された脾細胞を単離するための免疫プロトコルおよび技術は当該技術分野で既知である。融合相手（例えばマウス骨髄腫細胞）および融合方法についても既知である。
本開示のキメラまたはヒト化抗体は、上記のように調製される非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づいて調製されうる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的の非ヒトハイブリドーマから得られ、標準の分子生物学技術を用いて非マウス（例えばヒト）免疫グロブリン配列を有するように改変されうる。例えば、キメラ抗体を作製するため、マウス可変領域は当該技術分野で既知の方法を用いてヒト定常領域に連結されうる（例えばキャビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）らに交付された米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。ヒト化抗体を作製するため、マウスＣＤＲ領域は当該技術分野で既知の方法を用いてヒトフレームワークに挿入されうる（例えば、ウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）に交付された米国特許第５，２２５，５３９号明細書ならびにクイーン（Ｑｕｅｅｎ）らに交付された米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書および米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
好ましい実施形態では、本開示の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ＣＸＣＲ４に特異的なかかるヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックまたはトランスクロモゾ−ムマウスを用いて産生されうる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモゾ−ムマウスは、本明細書中で各々ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）およびＫＭマウス（登録商標）と称されるマウスを含み、本明細書中で総称して「ヒトＩｇマウス」と称される。
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（メダレックス（Ｍｅｄａｒｅｘ（登録商標），Ｉｎｃ．））は、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化された変異とともに未転位のヒト重鎖（μおよびγ）ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｉ）を有する（例えば、ロンバーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）ら １９９４年）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９頁を参照）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の低下を示し、免疫に応答し、導入されたヒト重鎖および軽鎖トランス遺伝子がクラススイッチおよび体細胞突然変異を受け、高親和性のヒトＩｇＧκモノクローナル抗体が産生される（ロンバーグ Ｎ．（Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ．）ら（１９９４年）上記；ロンバーグ Ｎ．（Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ．）（１９９４年）「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」１１３：４９−１０１頁にレビュー；ロンバーグ Ｎ．（Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ．）およびハスザー Ｄ．（Ｈｕｓｚａｒ Ｄ．）（１９９５年）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３頁；ならびにハーディング Ｆ．（Ｈａｒｄｉｎｇ Ｆ．）およびロンバーグ Ｎ．（Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ．）（１９９５年）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６頁）。ＨｕＭａｂマウス（登録商標）の調製および使用ならびにかかるマウスにより保有されるゲノム修飾については、テイラー Ｌ．（Ｔａｙｌｏｒ Ｌ．）ら（１９９２年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７−６２９５頁；チェン Ｊ．（Ｃｈｅｎ Ｊ．）ら（１９９３年）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７−６５６頁；テュアイヨン（Ｔｕａｉｌｌｏｎ）ら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３７２０−３７２４頁；チョイ（Ｃｈｏｉ）ら（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１１７−１２３頁；チェン Ｊ．（Ｃｈｅｎ Ｊ．）ら（１９９３年）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：８２１−８３０頁；テュアイヨン（Ｔｕａｉｌｌｏｎ）ら（１９９４年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０頁；テイラー Ｌ．（Ｔａｙｌｏｒ Ｌ．）ら（１９９４年）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９−５９１頁；ならびにフィッシュワイルド Ｄ．（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ Ｄ．）ら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１頁にさらに記載されている（これらすべての内容はそれら全体が参照により本明細書中に具体的に援用される）。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号明細書；米国特許第５，５６９，８２５号明細書；米国特許第５，６２５，１２６号明細書；米国特許第５，６３３，４２５号明細書；米国特許第５，７８９，６５０号明細書；米国特許第５，８７７，３９７号明細書；米国特許第５，６６１，０１６号明細書；米国特許第５，８１４，３１８号明細書；米国特許第５，８７４，２９９号明細書；および米国特許第５，７７０，４２９号明細書（すべてはロンバーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）およびケイ（Ｋａｙ）に交付）、スラニ（Ｓｕｒａｎｉ）らに交付された米国特許第５，５４５，８０７号明細書；ＰＣＴ公開、国際公開第９２／０３９１８号パンフレット、国際公開第９３／１２２２７号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９７／１３８５２号パンフレット、国際公開第９８／２４８８４号パンフレットおよび国際公開第９９／４５９６２号パンフレット（すべてはロンバーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）およびケイ（Ｋａｙ）に交付）、ならびにコーマン（Ｋｏｒｍａｎ）らに交付されたＰＣＴ公開、国際公開第０１／１４４２４号パンフレットを参照のこと。
別の実施形態では、本開示のヒト抗体は、トランス遺伝子およびトランスクロモゾ−ム上でヒト免疫グロブリン配列を保有するマウス、例えばヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランスクロモゾ−ムを保有するマウスを用いて産生されうる。このマウスは、本明細書中で「ＫＭマウス（登録商標）」と称され、イシダ（Ｉｓｈｉｄａ）らに交付されたＰＣＴ公開、国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに詳述されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する他のトランスジェニック動物系は当該技術分野で使用可能であり、その使用により、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体が産生されうる。例えば、キセノマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ）（アブジェニクス社（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．））として称される他のトランスジェニック系の使用が可能であり、かかるマウスは、例えばクチャーラパティ（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ）らに交付された米国特許第５，９３９，５９８号明細書；米国特許第６，０７５，１８１号明細書；米国特許第６，１１４，５９８号明細書；米国特許第６，１５０，５８４号明細書および米国特許第６，１６２，９６３号明細書に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する他のトランスクロモゾ−ム動物系は当該技術分野で使用可能であり、その使用により、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体の産生が可能である。例えば、「ＴＣマウス」と称される、ヒト重鎖トランスクロモゾ−ムとヒト軽鎖トランスクロモゾ−ムとの双方を保有するマウスの使用が可能であり、かかるマウスについてはトミヅカ（Ｔｏｍｉｚｕｋａ）ら（２０００年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：７２２−７２７頁に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモゾ−ムを保有するウシについての記載が当該技術分野でなされており（例えば、クロイワ（Ｋｕｒｏｉｗａ）ら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：８８９−８９４頁およびＰＣＴ出願の国際公開第２００２／０９２８１２号パンフレット）、その使用により、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体の産生が可能である。
本開示のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を用いても調製可能である。ヒト抗体を単離するためのかかるファージディスプレイ法は、当該技術分野で確立されたものである。例えば、ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）らに交付された米国特許第５，２２３，４０９号明細書；米国特許第５，４０３，４８４号明細書；および米国特許第５，５７１，６９８号明細書；ドワー（Ｄｏｗｅｒ）らに交付された米国特許第５，４２７，９０８号明細書および米国特許第５，５８０，７１７号明細書；マッカファーティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）らに交付された米国特許第５，９６９，１０８号明細書および米国特許第６，１７２，１９７号明細書；ならびにグリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）らに交付された米国特許第５，８８５，７９３号明細書；米国特許第６，５２１，４０４号明細書；米国特許第６，５４４，７３１号明細書；米国特許第６，５５５，３１３号明細書；米国特許第６，５８２，９１５号明細書および米国特許第６，５９３，０８１号明細書を参照のこと。
本開示のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト抗体反応が免疫時に生成されうるようにヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを用いて調製されうる。かかるマウスは、例えばウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）らに交付された米国特許第５，４７６，９９６号明細書および米国特許第５，６９８，７６７号明細書に記載されている。
特に好ましい実施形態では、ヒト抗ＣＸＣＲ４抗体が、ブエクラー（Ｂｕｅｃｈｌｅｒ）らによる米国特許第６，７９４，１３２号明細書に記載のようにヒトＩｇマウスとファージディスプレイ技術を併用して調製される。より詳細には、本方法は最初に、（上記のＨｕＭａｂマウスまたはＫＭマウスなどの）ヒトＩｇマウスにおけるマウスのＣＸＣＲ４抗原での免疫による抗ＣＸＣＲ４抗体応答の生成と、その後のマウスのリンパ細胞由来のヒト抗体鎖をコードする核酸の単離およびこれらの核酸のディスプレイベクター（例えばファージ）への導入によるディスプレイパッケージのライブラリの提供を含む。したがって、各ライブラリメンバーはヒト抗体鎖をコードする核酸を含み、各抗体鎖がディスプレイパッケージから提示される。次いで、ライブラリを、ＣＸＣＲ４抗原を用いてスクリーニングし、ＣＸＣＲ４に特異的に結合するライブラリメンバーが単離される。次いで、選択されたライブラリメンバーの核酸挿入物が単離され、標準の方法により配列決定され、選択されたＣＸＣＲ４結合剤の軽鎖および重鎖可変配列が決定される。可変領域は、標準の組換えＤＮＡ技術、例えば可変領域のヒト重鎖および軽鎖定常領域をＶＨ領域がＣＨ領域に動作可能に連結されかつＶＬ領域がＣＬ領域に動作可能に連結されるように保有する発現ベクターへのクローニングにより、完全長抗体鎖に変換されうる。この組み合わされたトランスジェニックマウス／ファージディスプレイシステムを用いるヒト抗ＣＸＣＲ４抗体の調製に関するさらなる説明については実施例１を参照のこと。
ヒトＩｇマウスの免疫
ヒトＩｇマウスの使用により本開示のヒト抗体が産生される場合、かかるマウスは、ロンバーグ Ｎ．（Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ．）ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９頁；フィッシュワイルド Ｄ．（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ Ｄ．）ら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１頁；ならびにＰＣＴ公開の国際公開第９８／２４８８４号パンフレットおよび国際公開第０１／１４４２４号パンフレットに記載のように、ＣＸＣＲ４抗原および／または組換えＣＸＣＲ４、またはＣＸＣＲ４を発現する細胞、またはＣＸＣＲ４融合タンパク質の精製または濃縮された調製物で免疫されうる。好ましくは、マウスは１回目の注入時には６〜１６週齢となる。例えば、ＣＸＣＲ４抗原の精製または組換え調製物（５〜５０μｇ）を用い、ヒトＩｇマウスの腹腔内での免疫が可能である。最も好ましくは、本開示の抗体の産生に用いられる免疫原は、膜内のその天然立体構造にヒトＣＸＣＲ４を含み、その非限定例として、形質移入によりＣＸＣＲ４を細胞表面上に発現する細胞、ＣＸＣＲ４を天然に発現する細胞（例えばＣＥＭ細胞）、およびＣＸＣＲ４が内包されている人工膜（例えばリポソーム）、例えばＣＸＣＲ４を内包するマグネティックプロテオリポソーム（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｏｓｏｍｅ）（ＭＰＬ）が挙げられる（実施例１にさらに記載）。
ＣＸＣＲ４に対する完全ヒトモノクローナル抗体を産生するための詳細な方法が下記の実施例１に記載されている。様々な抗原を用いる試験を重ねることで、トランスジェニックマウスが、最初に完全フロインドアジュバント中の抗原で腹腔内（ＩＰ）に免疫され、それに続き、不完全フロインドアジュバント中の抗原で隔週、最大で全６回ＩＰ免疫される時、応答することが示されている。しかし、フロインド以外のアジュバントについても有効であることが見出されている。さらに、アジュバントの非存在下では全細胞における免疫原性が高いことが見出されている。免疫応答は、後眼窩（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ）の出血により得られる血漿試料を用いる免疫プロトコルを通して監視可能である。血漿はＥＬＩＳＡでスクリーニング可能であり（後述するように）、十分な力価の抗ＣＸＣＲ４ヒト免疫グロブリンを有するマウスが融合において用いられうる。マウスは、殺滅および脾臓摘出の３日前、抗原で静脈内に追加免疫されうる。免疫ごとに２〜３の融合がなされる必要がありうることが想定される。典型的にはマウス６〜２４匹が各抗原に対して免疫される。通常、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２株の双方が用いられる。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２トランス遺伝子は共に２つの異なるヒト重鎖トランス遺伝子（ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２）を有する単一のマウスに育種されうる。その他としてまたはさらに、ＫＭマウス（登録商標）株が実施例１に記載のように用いられうる。
本開示のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成
本開示のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するため、免疫されたマウス由来の脾細胞および／またはリンパ節細胞が単離され、適切な不死化細胞系、例えばマウス骨髄腫細胞系に融合されうる。生成されたハイブリドーマでは、抗原特異的な抗体の産生についてスクリーニング可能である。例えば、免疫されたマウス由来の脾臓リンパ球の単一の細胞懸濁液が、５０％ＰＥＧとともにＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）の数の１／６に融合されうる。あるいは、免疫マウス由来の脾臓リンパ球の単一の細胞懸濁液は、サイトパルス（ＣｙｔｏＰｕｌｓｅ）大型チャンバ細胞融合エレクトロポレーター（メリーランド州グレンバーニー（Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ）のサイト・パルス・サイエンシズ（ＣｙｔｏＰｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．））を用いる、電場に基づく電気融合法を用いて融合されうる。細胞は、平底マイクロタイタープレート内に約２×１０５でプレーティング後、２０％胎仔クローン血清、１８％「６５３」馴化培地、５％オリゲン（ｏｒｉｇｅｎ）（ＩＧＥＮ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｍＭのヘペス、０．０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）；ＨＡＴは融合の２４時間後に添加される）を含有する選択培地内で２週間インキュベートされる。約２週間後、細胞はＨＡＴがＨＴと交換された培地内で培養されうる。次いで、各ウェルにおけるヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてはＥＬＩＳＡによりスクリーニング可能である。一旦多数のハイブリドーマの成長が生じると、培地は通常１０〜１４日後に観察されうる。抗体を分泌するハイブリドーマは、再プレーティングされ、再びスクリーニングされ、依然としてヒトＩｇＧ陽性である場合、モノクローナル抗体は限界希釈により少なくとも２回サブクローニングされうる。次いで、特徴づけのため、安定なサブクローンをインビトロで培養することで、組織培地内に少量の抗体が産生されうる。
ヒトモノクローナル抗体を精製するため、選択されたハイブリドーマはモノクローナル抗体の精製用の２リットルのスピナーフラスコ内で成長されうる。親和性クロマトグラフィー前、上清がプロテインＡ−セファローズ（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）のファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いて濾過され、濃縮される。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーで検査することで純度が保証されうる。緩衝溶液はＰＢＳに交換可能であり、濃度は１．４３の減衰係数を用い、ＯＤ２８０により判定可能である。モノクローナル抗体は、一定量に分割され、−８０℃で保存されうる。
本開示のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの生成
本開示の抗体は、例えば当該技術分野で周知のように組換えＤＮＡ技術と遺伝子形質移入方法を併用し、宿主細胞のトランスフェクトーマ内でも産生されうる（例えば、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ），Ｓ．（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２頁）。
例えば、抗体またはその抗体断片を発現するため、部分長または完全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡが標準の分子生物学技術（例えば目的の抗体を発現するハイブリドーマを用いるＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング）により得られ、ＤＮＡは、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように発現ベクターに挿入されうる。これに関連し、「作動可能に連結される」という用語は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図された機能を果たすようにベクターにライゲートされることを意味するように意図されている。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いられる発現宿主細胞と適合可能であるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は別々のベクターに挿入されうるかまたは、より典型的には両遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準の方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上での相補的制限部位のライゲーションまたは制限部位が全く存在しない場合での平滑末端ライゲーション）により発現ベクターに挿入される。本明細書中に記載の抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用い、それらを、所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターに、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結されかつＶＫセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作製可能である。さらにまたはその他として、組換え発現ベクターは、抗体鎖の宿主細胞からの分泌を促進するシグナルペプチドをコードしうる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームに連結されるようにベクターにクローン化されうる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種のシグナルペプチド（すなわち非免疫グロブリンンパク質由来のシグナルペプチド）でありうる。
抗体鎖遺伝子に加え、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞内で抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保有する。「調節配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御因子（例えばポリアデニル化シグナル）を含むように意図されている。かかる調節配列は、例えばゲッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）（「遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）（１９９０年））に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が形質転換対象の宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの要素に依存しうることが当業者により理解されるであろう。哺乳類宿主細胞の発現における好ましい調節配列は、哺乳類細胞内で高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルス因子、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えばアデノウィルスメジャー後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。あるいは、非ウイルス調節配列、例えばユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターが用いられうる。さらに、異なる供給源由来の配列からなる調節因子、例えばＳＲαプロモーター系は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ１のＳＶ４０初期プロモーターおよび長い末端リピートに由来する配列を有するものである（武部（Ｔａｋｅｂｅ），Ｙ．ら（１９８８年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２頁）。
抗体鎖遺伝子および調節配列に加え、本開示の組換え発現ベクターは、追加配列、例えば宿主細胞内でのベクターの複製（例えば複製の起点）を調節する配列および選択可能マーカー遺伝子を保有しうる。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号明細書、米国特許第４，６３４，６６５号明細書および米国特許第５，１７９，０１７号明細書（いずれもアクセル（Ａｘｅｌ）らによる）を参照）。例えば典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞上で薬物、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートに耐性を与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、（メトトレキセートの選択／増幅の場合にｄｈｆｒ−宿主細胞内で用いられる）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子および（Ｇ４１８の選択用の）ネオ遺伝子を含む。
軽鎖および重鎖の発現においては、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは、標準技術により宿主細胞に形質移入される。「形質移入」という用語の様々な形態は、外因性ＤＮＡの原核または真核宿主細胞への導入のための一般に用いられる多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、カルシウム−リン酸塩の沈降、ＤＥＡＥ−デキストランによる形質移入などを包含するように意図されている。原核または真核宿主細胞のいずれかにおいて本開示の抗体を発現することは理論的に可能であるが、真核細胞内および最も好ましくは哺乳類宿主細胞内での抗体の発現が、かかる真核細胞および特に哺乳類細胞が適切に折り畳まれ免疫学的に活性な抗体を構築し分泌する可能性が原核細胞よりも高いことから最も好ましい。原核生物での抗体遺伝子の発現は、高収量の活性抗体の産生にとって無効であることが報告されている（ボス（Ｂｏｓｓ），Ｍ．Ａ．およびウッド（Ｗｏｏｄ），Ｃ．Ｒ．（１９８５年）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ６：１２−１３頁）。
本開示の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えばＲ．Ｊ．カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）およびＰ．Ａ．シャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８２年）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１頁に記載のように、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに用いられる、ウアラウブ（Ｕｒｌａｕｂ）およびチェイシン（Ｃｈａｓｉｎ）（１９８０年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７：４２１６−４２２０頁に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞の場合の使用においては、別の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号パンフレット（ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）に付与）、国際公開第８９／０１０３６号パンフレット（ベビントン（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ）に付与）および欧州特許第３３８，８４１号明細書（ベビントン（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ）に付与）に開示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞内での抗体の発現またはより好ましくは抗体の宿主細胞が成長される培地への分泌を実現するのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより産生される。抗体は、標準のタンパク質精製方法を用いて培地から回収されうる。
抗原に結合する抗体の特徴づけ
本開示の抗体のＣＸＣＲ４への結合については、例えば標準のフローサイトメトリー法により試験可能である。本開示の抗体が好ましくはＣＸＣＲ４を膜内のその天然立体構造で認識することから、ＣＸＣＲ４への結合についての試験は、好ましくはＣＸＣＲ４の天然立体構造を発現する試薬を用いるアッセイ（例えばフローサイトメトリー）で行われる。結合アッセイで用いられうるＣＸＣＲ４の天然立体構造を発現する試薬の非限定例として、ＣＸＣＲ４を天然に発現する細胞（例えばＣＥＭ細胞）、ＣＸＣＲ４を発現するように形質移入されている細胞（例えば、ＣＸＣＲ４発現ベクターが形質移入されたＲ１６１０細胞）ならびにＣＸＣＲ４が内包されているリポソーム（例えばＣＸＣＲ４を内包するマグネティックプロテオリポソーム）が挙げられ、それら各々は実施例にさらに詳述される。つまり、フローサイトメトリーアッセイにおいては、ＣＸＣＲ４を発現する細胞は、試験抗体とともにインキュベートされ、洗浄され、試験抗体に結合可能な標識二次試薬とともにインキュベートされ、再洗浄され、（例えばＦＡＣＳ機器を用いて）二次試薬の細胞への結合の検出を目的に分析がなされる。好ましくは、フローサイトメトリーによる評価で最高の滴定濃度を生じさせるマウスが、融合かまたは（例えばマウスのＢ細胞から作製される抗体ライブラリのファージディスプレイスクリーニングによる）抗体のさらなる選択において用いられることになる。
上記のフローサイトメトリーアッセイを用い、ＣＸＣＲ４免疫原と陽性の反応性を示すハイブリドーマについてのスクリーニングも可能である。高い結合活性でＣＸＣＲ４に結合する抗体を発現するハイブリドーマのサブクローニングと、さらなる特徴づけが行われる。各ハイブリドーマ由来の１つのクローンは、（フローサイトメトリーにより）親細胞の反応性を保持し、−１４０℃で保存された５〜１０のバイアルの細胞バンクの作製および抗体精製のために選択されうる。
抗ＣＸＣＲ４抗体を精製するため、選択されたハイブリドーマを２リットルのスピナーフラスコ内で成長させ、モノクローナル抗体の精製を行ってもよい。上清を、プロテインＡ−セファローズ（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）のファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いる親和性クロマトグラフィー前に濾過し、濃縮してもよい。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーにより検査し、純度を保証してもよい。緩衝溶液をＰＢＳに交換し、濃度を、１．４３消衰係数を用いるＯＤ２８０によって決定してもよい。モノクローナル抗体を一定量に分割し、−８０℃で保存してもよい。
選択された抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するか否かを判定するため、各抗体が市販の試薬（イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）のピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））を用いてビオチン化されうる。未標識のモノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を用いる競合試験が、ＥＬＩＳＡプレートがＣＸＣＲ４を発現する細胞でコートされる全細胞ＥＬＩＳＡアッセイを用いて実施可能であり、未標識抗体におけるＣＸＣＲ４発現細胞への結合に対するビオチン化抗体との競合能が試験される。ビオチン化ｍＡｂの結合がストレプトアビジン−アルカリホスファターゼプローブで検出可能である。
精製抗体アイソタイプを判定するため、アイソタイプＥＬＩＳＡを特定のアイソタイプの抗体に対して特異的な試薬を用いて行ってもよい。例えば、ヒトモノクローナル抗体アイソタイプを判定するため、マイクロタイタープレートのウェルを１μｇ／ｍｌの抗ヒト免疫グロブリンで４℃で一晩コートしてもよい。１％ ＢＳＡでブロック後、プレートは１μｇ／ｍｌ以下の試験モノクローナル抗体または精製されたアイソタイプ対照と周囲温度で１〜２時間反応される。次いで、ウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭのいずれかに特異的なアルカリホスファターゼと複合されたプローブと反応させてもよい。プレートは展開され、上記のように分析される。
抗ＣＸＣＲ４ヒトＩｇＧでは、ウエスタンブロッティングにより、ＣＸＣＲ４抗原との反応性についてさらに試験してもよい。つまり、ＣＸＣＲ４に対し、調製し、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ってもよい。電気泳動後、分離された抗原はニトロセルロース膜に移され、１０％ウシ胎仔血清でブロックされ、試験対象のモノクローナル抗体でプローブされる。ヒトＩｇＧの結合性を、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを用いて検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質タブレット（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）のシグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．））を用いて展開してもよい。
本開示の抗体の結合特異性は、例えばフローサイトメトリーにより、抗体のＣＸＣＲ４を発現する細胞への結合を監視することによっても判定可能である。典型的には、細胞系、例えばＣＨＯ細胞系には、ＣＸＣＲ４の膜貫通形態をコードする発現ベクターの形質移入が可能である。タグに対する抗体を用いる検出においては、形質移入されたタンパク質は、好ましくはＮ末端にタグ、例えばｍｙｃ−ｔａｇを含みうる。本開示の抗体のＣＸＣＲ４への結合性は、形質移入細胞を抗体とともにインキュベートし、結合抗体を検出することにより判定可能である。形質移入されたタンパク質上での抗体のタグへの結合は、陽性対照として用いられうる。
免疫複合体
別の態様では、本開示は、治療的部分、例えば細胞毒素、薬剤（例えば免疫抑制剤）または放射性毒素に複合された、抗ＣＸＣＲ４抗体、またはそれらの断片を特徴とする。かかる複合体は本明細書中で「免疫複合体」と称される。１つ以上の細胞毒素を含む免疫複合体は「免疫毒素」と称される。細胞毒素または細胞毒性物質は、細胞に対して有害な（例えば細胞を殺滅する）任意の作用物質を含む。例として、タクソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにそれらの類似体または相同体が挙げられる。治療物質は、例えば、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）も含む。
本開示の抗体に複合可能な細胞毒素治療薬の他の好ましい例として、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、メイタンシンおよびオーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓ）およびそれらの誘導体が挙げられる。カリケアマイシン抗体複合体の例として市販のもの（ミロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）（登録商標）；アメリカン・ホーム・プロダクツ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｏｍｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））が挙げられる。
細胞毒素は、当該技術分野で利用可能なリンカー技術を用いて本開示の抗体に複合されうる。細胞毒素を抗体に複合させるのに用いられているリンカータイプの例として、限定はされないが、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチドを含有するリンカーが挙げられる。例えば、リソソーム区画内で低いｐＨにより切断を受けやすいかまたはプロテアーゼ、例えばカテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）などの腫瘍組織内で優先的に発現されるプロテアーゼにより切断を受けやすいリンカーを選択してもよい。
細胞毒素のタイプ、リンカーおよび治療物質を抗体に複合させるための方法についてのさらなる考察としては、斉藤 Ｇ．（Ｓａｉｔｏ Ｇ．）ら（２００３年）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１９９−２１５頁；トレイル Ｐ．Ａ．（Ｔｒａｉｌ Ｐ．Ａ．）ら（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８−３３７頁；ペイン Ｇ．（Ｐａｙｎｅ Ｇ．）（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：２０７−２１２頁；アレン Ｔ．Ｍ．（Ａｌｌｅｎ Ｔ．Ｍ．）（２００２年）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ２：７５０−７６３頁；パスタン Ｉ．（Ｐａｓｔａｎ Ｉ．）およびクレイトマン Ｒ．Ｊ．（Ｋｒｅｉｔｍａｎ Ｒ．Ｊ．）（２００２年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ ３：１０８９−１０９１頁；センター Ｐ．Ｄ．（Ｓｅｎｔｅｒ Ｐ．Ｄ．）およびスプリンガー Ｃ．Ｊ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｃ．Ｊ．）（２００１年）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５３：２４７−２６４頁も参照のこと。
本開示の抗体を、放射性同位体にも複合し、放射性免疫複合体とも称される細胞毒性のある放射性医薬品を生成してもよい。診断または治療用途として抗体に複合可能な放射性同位体の例として、限定はされないが、ヨウ素１３１、ヨウ素１２５、インジウム１１１、イットリウム９０およびルテチウム１７７が挙げられる。放射性免疫複合体を調製するための方法は、当該技術分野で確立されている。放射性免疫複合体の例は、ゼバリン（Ｚｅｖａｌｉｎ）（登録商標）（ＩＤＥＣファーマシューティカルズ（ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））およびベクサール（Ｂｅｘｘａｒ）（登録商標）（コリクサ・ファーマシューティカルズ（Ｃｏｒｉｘａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））などが市販されており、同様の方法を用い、本開示の抗体を用いて放射性免疫複合体を調製してもよい。
本開示の抗体複合体を用いて所与の生物学的応答を修飾可能であり、薬剤部分は従来の化学治療物質に限定されるものとして解釈されるべきではない。例えば、薬剤部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドでありうる。かかるタンパク質は、例えば、酵素活性毒素またはその活性断片、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナスエキソトキシンまたはジフテリア毒素；腫瘍壊死因子またはインターフェロン−γなどのタンパク質；あるいは、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）または他の成長因子などの生物学的応答修飾因子を含みうる。
かかる治療部分を抗体に複合させるための技術は周知であり、例えば、アーノン（Ａｒｎｏｎ）ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、レイスフェルド（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ）ら（編）、２４３−５６頁（アラン・アール・リス（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）１９８５年）；ヘルストローム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）ら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）ら（編）、６２３−５３頁（マーセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）１９８７年）；ソルペ（Ｔｈｏｒｐｅ）、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ピンチエラ（Ｐｉｎｃｈｅｒａ）ら（編）、４７５−５０６頁（１９８５年）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、ボールドウィン（Ｂａｌｄｗｉｎ）ら（編）、３０３−１６頁（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）１９８５年）；ならびにソルペ（Ｔｈｏｒｐｅ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８頁（１９８２年）を参照のこと。
二重特異性分子
別の態様では、本開示は、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体またはその断片を含む二重特異性分子を特徴とする。本開示の抗体またはその抗原結合部分が別の機能分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（例えば別の抗体または受容体にのリガンド）に誘導体化または連結され、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子が生成されうる。本開示の抗体が実際に２つ以上の他の機能分子に誘導体化または連結され、３つ以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子が生成される可能性があり、かかる多重特異性分子は本明細書で用いられる「二重特異性分子」という用語に包含されるようにも意図されている。本開示の二重特異性分子を作製するため、本開示の抗体は、二重特異性分子が生成されるように、１つ以上の他の結合分子、例えば別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｉｍｅｔｉｃ）に（例えば化学共役、遺伝子融合、非共有結合またはその他により）機能的に連結されうる。
したがって、本開示は、ＣＸＣＲ４に対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。本開示の特定の実施形態では、第２の標的エピトープはＦｃ受容体、例えばヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）またはヒトＦｃα受容体（ＣＤ８９）である。したがって、本開示は、ＦｃγＲまたはＦｃαＲを発現するエフェクター細胞（例えば、単球、マクロファージまたは多形核球細胞（ＰＭＮ））とＣＸＣＲ４を発現する標的細胞の双方に結合可能な二重特異性分子を含む。これらの二重特異性分子は、エフェクター細胞に対するＣＸＣＲ４発現細胞を標的にし、かつ、Ｆｃ受容体媒介性のエフェクター細胞活性、例えばＣＸＣＲ４発現細胞の食作用、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、サイトカイン放出あるいはスーパーオキシドアニオンの生成を引き起こす。
二重特異性分子が多重特異性である場合の本開示の実施形態では、同分子は、抗Ｆｃ結合特異性および抗ＣＸＣＲ４結合特異性に加え、第３の結合特異性をさらに含みうる。一実施形態では、第３の結合特異性は、抗促進因子（ａｎｔｉ−ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ）（ＥＦ）部分、例えば細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合し、それにより標的細胞に対する免疫応答を高める分子である。「抗促進因子部分」は、所与の分子、例えば抗原または受容体に結合し、それによりＦｃ受容体または標的細胞抗原における結合決定因子の効果の促進をもたらす抗体、機能抗体断片またはリガンドでありうる。「抗促進因子部分」はＦｃ受容体または標的細胞抗原に結合しうる。あるいは、抗促進因子部分は、第１および第２の結合特異性の結合対象である実体とは異なる実体に結合しうる。例えば、抗促進因子部分は、（例えば標的細胞に対する免疫応答の増大をもたらすＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ−１または他の免疫細胞を介して）細胞毒性Ｔ細胞に結合しうる。
一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、結合特異性として、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、または一本鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体またはその抗体断片を含む。ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）らに交付された米国特許第４，９４６，７７８号明細書（その全体は参照により明示的に援用される）に記載のように、抗体は、Ｆｖまたは一本鎖コンストラクトなどの軽鎖または重鎖二量体またはその任意の最小断片でもありうる。
一実施形態では、Ｆｃγ受容体に対する結合特異性はモノクローナル抗体により提供され、その結合はヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）により遮断されることはない。本明細書で用いられる「ＩｇＧ受容体」という用語は、染色体１上に位置する８つのγ鎖遺伝子のいずれかを示す。これらの遺伝子は、３つのＦｃγ受容体クラス：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）にグループ化された全部で１２の膜貫通または可溶性受容体アイソフォームをコードする。好ましい一実施形態では、Ｆｃγ受容体はヒト高親和性ＦｃγＲＩである。ヒトＦｃγＲＩは７２ｋＤａの分子であり、単量体ＩｇＧに対して高い親和性を示す（１０８−１０９Ｍ−１）。
特定の好ましい抗Ｆｃγモノクローナル抗体の産生および特徴づけについては、ファンガー（Ｆａｎｇｅｒ）らに交付されたＰＣＴ公開、国際公開第８８／０００５２号パンフレットおよび米国特許第４，９５４，６１７号明細書において記載されており、それらの教示内容は参照により本明細書中に十分に援用される。これらの抗体は受容体のＦｃγ結合部位から離れた部位でＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩのエピトープに結合することから、それらの結合がＩｇＧの生理的レベルにより実質的に遮断されることはない。本開示で有用な特異的な抗ＦｃγＲＩ抗体は、ｍＡｂ２２、ｍＡｂ３２、ｍＡｂ４４、ｍＡｂ６２およびｍＡｂ１９７である。ｍＡｂ３２を産生するハイブリドーマは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ９４６９から入手可能である。他の実施形態では、抗Ｆｃγ受容体抗体はモノクローナル抗体２２のヒト化形態である（Ｈ２２）。Ｈ２２抗体の産生および特徴づけについては、グラジアノ（Ｇｒａｚｉａｎｏ），Ｒ．Ｆ．ら（１９９５年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１５５（１０）：４９９６−５００２頁およびテンペスト（Ｔｅｍｐｅｓｔ）らに交付されたＰＣＴ公開、国際公開第９４／１０３３２号パンフレットに記載されている。Ｈ２２抗体産生細胞系は、ＨＡ０２２ＣＬ１の指定の下でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されたものであり、登録番号ＣＲＬ１１１７７を有する。
さらに他の好ましい実施形態では、Ｆｃ受容体に対する結合特異性はヒトＩｇＡ受容体、例えばＦｃ−α受容体（ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９））に結合する抗体により提供され、その結合は好ましくはヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）により遮断されることはない。「ＩｇＡ受容体」という用語は、染色体１９上に位置する１つのα遺伝子の遺伝子産物（ＦｃαＲＩ）を含むように意図されている。この遺伝子は、５〜１１０ｋＤａの数種の交互にスプライスされた膜貫通アイソフォームをコードすることが知られている。ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）は、単球／マクロファージ、好酸性および好中性顆粒球上に構成的に発現されるが、非エフェクター細胞集団上に発現されることはない。ＦｃαＲＩは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２の双方に対して中程度の親和性（約５×１０７Ｍ−１）を有し、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインへの暴露時に増加する（モートン（Ｍｏｒｔｏｎ），Ｈ．Ｃ．ら（１９９６年）、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６：４２３−４４０頁）。Ａ３、Ａ５９、Ａ６２およびＡ７７として同定された４つのＦｃαＲＩに特異的なモノクローナル抗体は、ＩｇＡリガンド結合ドメイン外部のＦｃαＲＩに結合するものであり、記載がなされている（モンテイロ（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ），Ｒ．Ｃ．ら（１９９２年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１７６４頁）。
ＦｃαＲＩおよびＦｃγＲＩは、（１）主に免疫エフェクター細胞、例えば単球、ＰＭＮ、マクロファージおよび樹状細胞の上で発現され、（２）高レベルで発現され（例えば１細胞当たり５，０００−１００，０００）、（３）細胞毒性活性のメディエーター（例えばＡＤＣＣ、食作用）であり、かつ（４）それらに対して標的とされる、自己抗原を含む抗原の抗原提示の促進を媒介することから、本開示の二重特異性分子において用いられる要因となる好ましい誘発受容体である。
ヒトモノクローナル抗体が好ましい一方、本開示の二重特異性分子において用いられうる他の抗体がマウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
本開示の二重特異性分子は、構成要素の結合特異性、例えば抗ＦｃＲおよび抗ＣＸＣＲ４結合特異性を当該技術分野で既知の方法を用いて複合することにより調製されうる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性は、別々にもたらされ、次いで互いに複合されうる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、種々の共役剤または架橋剤が共有結合に用いられうる。架橋剤の例として、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、カルボウスキー（Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ）ら（１９８４年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６頁；リウ Ｍ．Ａ．（Ｌｉｕ Ｍ．Ａ．）ら（１９８５年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：８６４８頁を参照）。他の方法として、パウルス（Ｐａｕｌｕｓ）（１９８５年）Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．Ｎｏ．７８：１１８−１３２頁；ブレナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）ら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１−８３頁およびグレニー（Ｇｌｅｎｎｉｅ）ら（１９８７年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７−２３７５頁に記載の方法が挙げられる。好ましい複合剤はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、いずれもピアス・ケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ））から入手可能である。
結合特異性が抗体である場合、それらは２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して複合されうる。特に好ましい実施形態では、ヒンジ領域は、複合に先立ち、奇数、好ましくは１つのスルフヒドリル残基を有するように修飾される。
あるいは、両方の結合特異性は同じベクター内にコードされ、かつ同じ宿主細胞内で発現され、構築されうる。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本開示の二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体および結合決定因子を含む一本鎖分子、または２つの結合決定因子を含む一本鎖二重特異性分子でありうる。二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含みうる。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば米国特許第５，２６０，２０３号明細書；米国特許第５，４５５，０３０号明細書；米国特許第４，８８１，１７５号明細書；米国特許第５，１３２，４０５号明細書；米国特許第５，０９１，５１３号明細書；米国特許第５，４７６，７８６号明細書；米国特許第５，０１３，６５３号明細書；米国特許第５，２５８，４９８号明細書；および米国特許第５，４８２，８５８号明細書に記載されている（これらのすべては参照により本明細書中に明示的に援用される）。
二重特異性分子のその特異的な標的に対する結合は、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば成長阻害）またはウエスタンブロットアッセイによって確認されうる。これらの各アッセイでは、一般に、特別な目的のタンパク質−抗体複合体の存在が目的の複合体に対して特異的な標識試薬（例えば抗体）の使用により検出される。例えば、ＦｃＲ−抗体複合体は、例えば、抗体−ＦｃＲ複合体を認識しかつそれに対して特異的に結合する酵素結合抗体または抗体断片を用いて検出されうる。あるいは、複合体は種々の他のイムノアッセイのいずれかを用いて検出されうる。例えば、抗体は放射活性物質で標識され、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で用いられうる（例えば、ワイントラウブ Ｂ．（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ Ｂ．）、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、米国内分泌学会（Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、１９８６年３月（参照により本明細書中に援用される）を参照）。放射性同位体は、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用などの手段あるいはオートラジオグラフィーにより検出されうる。
医薬組成物
別の態様では、本開示は、組成物、例えば医薬的に許容できる担体とともに調合された本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分のうちの１つまたは組み合わせを含有する医薬組成物を提供する。かかる組成物は、本開示の（例えば２種もしくは３種以上の異なる）抗体または免疫複合体または二重特異性分子のうちの１つまたはそれらの組み合わせを含有しうる。例えば、本開示の医薬組成物は、標的抗原上で異なるエピトープに結合するかまたは相補的活性を有する抗体（または免疫複合体または二重特異性抗体）の組み合わせを含有しうる。
本開示の医薬組成物は、併用療法、すなわち他の作用物質との併用であっても投与可能である。例えば、併用療法は、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体と、少なくとも１つの他の抗炎症物質または免疫抑制剤との併用を含みうる。併用療法で用いられうる治療物質の例が、本開示の抗体の使用に関する下記セクションにおいてより詳細に記載される。
本明細書で用いられる「医薬的に許容できる担体」は、生理学的に適合可能な、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば注射または注入による）に適する。投与経路に依存し、活性化合物、すなわち抗体、免疫複合体または二重特異性分子は、化合物を酸の活性および化合物を不活性化しうる他の天然条件から保護するための材料でコートされうる。
本開示の医薬品化合物は、１つ以上の医薬的に許容できる塩を含む。「医薬的に許容できる塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持する塩を示し、任意の望ましくない毒物学的効果を与えることがない（例えば、ベルゲ（Ｂｅｒｇｅ），Ｓ．Ｍ．ら（１９７７年）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９頁を参照）。かかる塩の例として、酸添加塩および塩基添加塩が挙げられる。酸添加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの非毒性無機酸や、脂肪族モノカルボキシル酸およびジカルボキシル酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸から誘導される塩を含む。塩基添加塩は、アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどや、非毒性有機アミン、例えばＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどから誘導される塩を含む。
本開示の医薬組成物は、医薬的に許容できる酸化防止剤も含有しうる。医薬的に許容できる酸化防止剤の例として、（１）水溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油可溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
本開示の医薬組成物中に用いられうる適切な水性および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物、植物オイル、例えばオリーブオイルならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。適切な液性が、例えば、コーティング材、例えばレシチンの使用、分散の場合に必要とされる粒径の維持ならびに界面活性剤の使用により維持されうる。
これらの組成物は、防腐剤、浸潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含有しうる。微生物の出現の防止は、上記の滅菌法と、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの封入との双方により保証されうる。組成物中に等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを含めることも望ましい場合がある。さらに、注射可能な医薬形態の吸収遅延がモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる作用物質の封入によりもたらされうる。
医薬的に許容できる担体は、注射可能な無菌溶液または分散系の即時調製のための無菌水溶液または分散系および無菌粉末を含む。医薬活性物質におけるかかる媒体および作用物質の使用については当該技術分野で既知である。任意の従来の媒体または作用物質が活性化合物と混合できない場合を除き、本開示の医薬組成物におけるそれらの使用が検討される。補助活性化合物も組成物中に組み込み可能である。
治療組成物は、典型的には製造および保存の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、高い薬物濃度に適する溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは他の規則的構造として調合されうる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散系でありうる。適切な液性が、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用、分散の場合に必要とされる粒径の維持ならびに界面活性剤の使用により維持されうる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコールまたは塩化ナトリウムを含めることが好ましいことになる。注射可能な組成物の遅延された吸収は、組成物中に吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアレート塩（ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ ｓａｌｔｓ）およびゼラチンを含めることによりもたらされうる。
注射可能な無菌溶液は、必要に応じ、上掲の原料の１つもしくは組み合わせを有する適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、その後に滅菌および精密ろ過を施すことにより調製されうる。一般に、分散系は、塩基性分散系および上掲の原料由来の必要な他の原料を含有する無菌溶媒に活性化合物を組み込むことにより調製される。注射可能な無菌溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末に加え任意の所望の追加原料をその予め無菌濾過された溶液から生成する真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
担体材料と組み合わせることで単一の剤形を生成可能な活性成分の量は、治療される対象および特定の投与方法に依存して変化することになる。単一の剤形を生成するための担体材料と併用可能な活性成分の量は、一般に治療効果をもたらす組成物の量となる。一般に、この量は、医薬的に許容できる担体との併用で、１００％のうち、活性成分の約０．０１％〜約９９％、好ましくは活性成分の約０．１％〜約７０％、最も好ましくは活性成分の約１％〜約３０％の範囲となる。
投与計画を調節することで最適な所望の応答（例えば治療応答）がもたらされる。例えば、単回ボーラスが投与されうるか、数回の分割用量が長期にわたり投与されうるかまたは同用量が治療状況の要件で示されるように比例的に漸減または増加されうる。投与の容易さおよび用量の均一性を意図し、非経口組成物を投与単位形態で調製することが特に有利である。本明細書で用いられる投与単位形態は、試験されるべき対象に対する単一の用量として適合する物理的に別々の単位であり、各単位は必要とされる医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された既定量の活性化合物を有する。本開示の投与単位形態における仕様は、（ａ）活性化合物固有の特性および達成されるべき特定の治療効果と、（ｂ）個体における感受性を治療するためにかかる活性化合物を化合する当該技術分野に内在する制限により決定づけられ、かつそれらに直接依存している。
抗体の投与においては、用量は、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、およびより一般的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば用量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重または１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。典型的な治療計画では、毎週１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、１か月に１回、３か月ごとに１回または３〜６か月ごとに１回の投与が必要とされる。本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体に対する好ましい投与計画は、抗体の静脈内投与を介した１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、ここで抗体は（ｉ）６回投与を４週ごと、次いで３か月ごと；（ｉｉ）３週ごと；（ｉｉｉ）１回の３ｍｇ／ｋｇ体重、次いで３週ごとに１ｍｇ／ｋｇ体重といった投与計画のうちの１つを用いて投与される。
いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する、２つ以上のモノクローナル抗体が同時投与され、いずれの場合でも投与される各抗体の用量は指定範囲内に含まれる。多くの場合、抗体が通常投与される。単回投与間の間隔は、例えば、週単位、月単位、３か月単位または年単位であってもよい。患者における抗体の標的抗原に対する血中濃度の測定により示されるように、間隔は不規則であってもよい。用量は、ある方法では約１〜１０００μｇ／ｍｌ、またある方法では約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を得るように調節される。
あるいは、抗体は徐放製剤として投与可能であり、いずれの場合でも低頻度の投与が必要とされる。用量および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変化する。一般に、ヒト抗体は最長の半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体がそれに続く。投与の用量および頻度は、治療が予防的であるかまたは治療的であるかに依存して変化しうる。予防的適用においては、比較的低用量が長期にわたり比較的低頻度の間隔で投与される。一部の患者が、余生にわたって治療を受け続けている。治療的適用においては、疾患の進行が低下または終結されるまで、好ましくは患者が疾患の徴候の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量が必要とされる場合がある。その後、患者は予防計画通りに投与されうる。
本開示の医薬組成物中での活性成分の実際の用量レベルは、患者に毒性をもたらすことなく、特定の患者、組成物および投与様式について所望の治療応答を得るのに有効な活性成分の量を得るように変化しうる。選択される用量レベルは、用いられる本開示の特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、用いられる特定の化合物の投与経路、投与時間、排出速度、用いられる特定の組成物と併用される治療薬、他の薬物、化合物および／または材料の持続時間、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般健康および過去の病歴、ならびに医術において周知の要素のようなものを含む種々の薬物動態学的因子に依存することになる。
本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体の「治療有効用量」は、好ましくは疾患徴候の重症度の低下、疾患徴候のない期間の頻度および持続時間の増大あるいは疾患の苦しみに起因する機能障害または身体障害の予防をもたらす。例えば、ＣＸＣＲ４＋腫瘍の治療における「治療有効用量」は、好ましくは細胞成長または腫瘍成長を、未治療の対象に対し、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約８０％阻害する。化合物の腫瘍成長に対する阻害能は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価可能である。あるいは、組成物のこの特性は、化合物の細胞成長に対する阻害能の試験により評価可能であり、かかる阻害は当業者に既知のアッセイによりインビトロで測定可能である。治療有効量の治療化合物により、腫瘍サイズが低減しうるかまたはそうでなくても対象における徴候が改善しうる。当業者であれば、対象の大きさ、対象の徴候の重症度および選択された投与における特定の組成物または経路などの要素に基づき、かかる量を決定できるであろう。
本開示の組成物は、種々の当該技術分野で既知の方法のうちの１つ以上を用い、１つ以上の投与経路を介して投与されうる。当業者に理解されるように、投与の経路および／または方法は所望の結果に応じて変化することになる。本開示の抗体における好ましい投与経路は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路、例えば注射もしくは注入によるものを含む。本明細書で用いられる「非経口投与」という語句は、経腸および局所投与以外の投与方法、通常は注射によるものを意味し、限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内への注射および注入を含む。
あるいは、本開示の抗体は、非経口でない（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）経路、例えば局所経路、表皮または粘膜の投与経路を介し、例えば、経鼻的、経口的、経膣的、経直腸的、舌下的または局所的に投与されうる。
活性化合物は、迅速な放出に対する化合物、例えばインプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤を保護することになる担体とともに調製されうる。生体分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が用いられうる。かかる製剤を調製するための多数の方法が特許化されているかまたは一般に当業者に既知である。例えば、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｊ．Ｒ．ロビンソン（Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）編、マーセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９７８年を参照のこと。
治療組成物は、当該技術分野で既知の医療器具を用いて投与可能である。例えば、好ましい実施形態では、本開示の治療組成物は、ニードルレス皮下注射器具、例えば米国特許第５，３９９，１６３号明細書；米国特許第５，３８３，８５１号明細書；米国特許第５，３１２，３３５号明細書；米国特許第５，０６４，４１３号明細書；米国特許第４，９４１，８８０号明細書；米国特許第４，７９０，８２４号明細書；または米国特許第４，５９６，５５６号明細書に開示された器具を用いて投与可能である。本開示において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例として、薬物を制御された速度で小出しするための埋め込み式マイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号明細書、皮膚を通してメディカント（ｍｅｄｉｃａｎｔｓ）を投与するための治療器具を開示する米国特許第４，４８６，１９４号明細書、薬物を正確な注入速度で送達するための薬物注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号明細書、連続的薬物送達のための流量可変の埋め込み式注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号明細書、マルチチャンバ式の区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号明細書、ならびに浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号明細書が挙げられる。これらの特許は参照により本明細書中に援用される。多数の他のかかるインプラント、送達システムおよびモジュールは当業者に既知である。
特定の実施形態では、本開示のヒトモノクローナル抗体を調合し、インビボで適切な分布を保証することが可能である。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多数の親水性の高い化合物を排除する。（必要に応じて）本開示の治療化合物がＢＢＢを通過することを保証するため、それらを例えばリポソームの形で調合してもよい。リポソームを作製する方法については、例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書；米国特許第５，３７４，５４８号明細書；および米国特許第５，３９９，３３１号明細書を参照のこと。リポソームは特定の細胞または器官に選択的に輸送される１つ以上の部分を含みうることから、標的化された薬剤送達が促進される（例えば、Ｖ．Ｖ．ラナーデ（Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ）（１９８９年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５頁を参照）。典型的な標的化部分は、葉酸塩またはビオチン（例えばロウ（Ｌｏｗ）らに交付された米国特許第５，４１６，０１６号明細書を参照）；マンノシド（ウメザワ（Ｕｍｅｚａｗａ）ら（１９８８年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８頁）；抗体（Ｐ．Ｇ．ブロエマン（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ）ら（１９９５年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０頁；Ｍ．オワイス（Ｍ．Ｏｗａｉｓ）ら（１９９５年）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０頁）；界面活性剤のプロテインＡ受容体（ブリスコエ（Ｂｒｉｓｃｏｅ）ら（１９９５年）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４頁）；ｐ１２０（シュライアー（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ）ら（１９９４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０頁）を含み、Ｋ．ケイナネン（Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ）；Ｍ．Ｌ．ラウッカネン（Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ）（１９９４年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１２３頁；Ｊ．Ｊ．キリオン（Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ）；Ｉ．Ｊ．フィドラー（Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ）（１９９４年）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ４：２７３頁も参照のこと。
使用および方法
本開示の抗体、特にヒト抗体、抗体組成物および方法は、ＣＸＣＲ４媒介性の障害の診断および治療を含む、極めて多数のインビトロおよびインビボでの診断的および治療的有用性を有する。例えば、これらの分子を、インビトロまたは生体外で培地内の細胞にまたは例えばインビボでヒト対象に投与し、種々の障害を治療し、予防し、かつ診断してもよい。本明細書で用いられる「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むように意図されている。非ヒト動物は、あらゆる脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類および爬虫類を含む。好ましい対象は、ＣＸＣＲ４活性に媒介されるかまたは調節される障害を有するかあるいはＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１経路を含むヒト患者を含む。ＣＸＣＲ４に対する抗体が別の作用物質とともに投与される場合、２剤は順次投与または同時投与のいずれであってもよい。
本開示の抗体がＣＸＣＲ４に対して特異的に結合することを仮定すると、本開示の抗体を用い、細胞の表面上でのＣＸＣＲ４の発現の特異的検出が可能であり、さらにそれを用い、免疫親和性精製を介するＣＸＣＲ４の精製が可能である。
本開示の抗体組成物（例えばヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫複合体）をインビボおよびインビトロで投与する適切な経路は当該技術分野で周知であり、当業者により選択されうる。例えば、抗体組成物を注射（例えば静脈内または皮下）により投与してもよい。用いられる分子の適切な用量は、対象の年齢および体重ならびに抗体組成物の濃度および／または調合に依存することになる。
上記のように、本開示のヒト抗ＣＸＣＲ４抗体を、１つもしくは他の複数の治療物質、例えば細胞毒性物質、放射性毒性物質（ｒａｄｉｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔ）または免疫抑制剤と同時投与してもよい。抗体を（免疫複合体としての）作用物質に連結するかまたは作用物質とは別々に投与してもよい。後者（別々の投与）の場合、作用物質の前、後またはそれと同時に抗体を投与するかまたは他の既知の治療、例えば抗癌治療、例えば放射線と併せて同時投与してもよい。かかる治療物質は、特にドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチンブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシルおよびシクロホスファミドヒドロキシウレア（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）などの抗悪性腫瘍薬を含み、それら単独では患者に対して毒性または亜毒性のレベルでのみ有効である。シスプラチンは、４週ごとに１回、１００ｍｇ／ｋｇ用量で静脈内投与され、アドリアマイシンは、２１日ごとに１回、６０−７５ｍｇ／ｍｌ用量で静脈内投与される。本開示のヒト抗ＣＸＣＲ４抗体またはそれらの抗原結合断片と化学療法剤の同時投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞毒性効果をもたらす異なる機序を介して作用する２つの抗癌剤を提供する。かかる同時投与は、抗体に反応しなくなる薬剤に対する耐性または腫瘍細胞の抗原性における変化が生じることによる問題を解決しうる。
標的特異的なエフェクター細胞、例えば本開示の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）に連結したエフェクター細胞は、治療物質としても用いられうる。標的化のためのエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球または単球などのヒト白血球でありうる。他の細胞は、好酸球、ナチュラルキラー細胞および他のＩｇＧ−もしくはＩｇＡ−受容体担持細胞を含む。必要に応じ、エフェクター細胞を試験されるべき対象から得てもよい。標的特異的なエフェクター細胞を生理学的に許容できる溶液中の細胞の懸濁液として投与してもよい。投与される細胞の数は１０８−１０９程度でありうるが、治療目的に応じて変化することになる。一般に、数は、標的細胞、例えばＣＸＣＲ４を発現する腫瘍細胞で局在化を得、かつ例えば食作用による細胞死を有効にするのに十分な数となる。投与経路もまた変化しうる。
標的特異的なエフェクター細胞による治療を、標的化細胞を除去するための他の技術と併せて行ってもよい。例えば、本開示の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）および／またはこれらの組成物が備えられたエフェクター細胞を用いる抗腫瘍療法を化学療法と併用してもよい。さらに、併用免疫療法を用い、２つの異なる細胞毒性のあるエフェクター集団を指令し、腫瘍細胞を拒絶することが可能である。例えば、抗Ｆｃ−γ ＲＩまたは抗ＣＤ３に連結された抗ＣＸＣＲ４抗体は、ＩｇＧ−またはＩｇＡ−受容体に特異的な結合剤と併用可能である。
本開示の二重特異性および多重特異性分子を用い、エフェクター細胞上のＦｃγＲまたはＦｃγＲレベルの例えば細胞表面上の受容体のキャッピングおよび除去による調節も可能である。抗Ｆｃ受容体の混合物もこの目的で用いられうる。
補体結合部位、例えば補体に結合するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＭ由来の部分を有する本開示の組成物（例えばヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫複合体）も補体の存在下で用いられうる。一実施形態では、本開示の結合剤および適切なエフェクター細胞による標的細胞を含む細胞の集団の生体外治療は、補体または補体を含有する血清の添加により補完されうる。本開示の結合剤でコートされた標的細胞の食作用は補体タンパク質の結合により改善されうる。別の実施形態では、本開示の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）でコートされた標的細胞も補体により溶解されうる。さらに別の実施形態では、本開示の組成物は補体を活性化することがない。
本開示の組成物（例えばヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫複合体）はまた、補体とともに投与可能である。したがって、ヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子および血清または補体を含有する組成物は本開示の範囲内に含まれる。これらの組成物は、補体がヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子の近接位置に存在する点で有利である。あるいは、本開示のヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子と補体または血清を別々に投与してもよい。
本開示の抗体は、１つ以上の追加の治療抗体または他の結合剤、例えばＩｇ融合タンパク質とも併用可能である。投与可能な本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体との併用対象の他の抗体または結合剤の非限定例として、ＣＴＬＡ−４、ＰＳＭＡ、ＣＤ３０、ＩＰ−１０、ＩＦＮ−γ、ＣＤ７０、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＮＦ、ＴＮＦ−Ｒ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ、ＣＣＲ５、ＩＬ−１、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ、ＣＤ１９、キャンパス−１（Ｃａｍｐａｔｈ−１）、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、ＣＤ２０、Ｈｅｒ−２、ＣＤ２５、ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＩｇＥ、ＣＤ１１ａ、α４インテグリン、ＩＦＮαおよびＩＦＮＡＲ１に対する抗体または結合剤が挙げられる。
本開示の抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性または多重特異性分子または免疫複合体）と使用説明書を含むキットも本開示の範囲内に含まれる。キットは、１つ以上の追加試薬、例えば免疫抑制試薬、細胞毒性物質または放射性毒性物質あるいは１つ以上の追加の本開示のヒト抗体（例えば、第１のヒト抗体とは異なる、異なるＣＸＣＲ４抗原内のエピトープに対して結合する相補活性を有するヒト抗体）をさらに含みうる。
したがって、本開示の抗体組成物で治療される患者に、別の治療物質、例えばヒト抗体の治療効果を促進または増強する細胞毒性物質または放射性毒性物質を（本開示のヒト抗体の投与の前、投与と同時または投与後に）さらに投与してもよい。
他の実施形態では、対象をさらに、ＦｃγまたはＦｃγ受容体の発現または活性を調節する、例えば促進または阻害する作用物質で治療する、例えば対象をサイトカインで治療することが可能である。多重特異性分子による治療の間での投与における好ましいサイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。
本開示の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）を用い、ＣＸＣＲ４を発現する細胞を、例えばかかる細胞を標識する目的で標的にすることも可能である。かかる使用においては、結合剤を検出可能な分子に連結してもよい。したがって、本開示は、ＣＸＣＲ４を発現する細胞を生体外またはインビトロで局在化するための方法を提供する。検出可能な標識は、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素共同因子でありうる。
特定の実施形態では、本開示は、試料中のＣＸＣＲ４抗原の存在を検出するか、またはＣＸＣＲ４抗原の量を測定するための方法であって、試料および対照試料を、ＣＸＣＲ４に、抗体またはその一部とＣＸＣＲ４との複合体の形成を可能にする条件下で特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と接触させるステップを含む方法を提供する。次いで、複合体の形成が検出され、ここで対照試料と比べた場合の試料間での複合体形成の差は試料中でのＣＸＣＲ４抗原の存在を示す。
さらに別の実施形態では、本開示の免疫複合体を用い、化合物（例えば治療物質、標識、細胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剤など）を、ＣＸＣＲ４細胞表面受容体を有する細胞に対し、かかる化合物を抗体に連結することによって標的にすることが可能である。したがって、本開示は、ＣＸＣＲ４を発現する細胞を（例えば検出可能な標識、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素共同因子を用いて）生体外またはインビボで局在化するための方法も提供する。あるいは、免疫複合体を用い、ＣＸＣＲ４細胞表面受容体を有する細胞を、細胞毒素または放射性毒素をＣＸＣＲ４に対して標的化することにより殺滅することが可能である。
ＣＸＣＲ４は、多種多様な腫瘍細胞タイプ上で発現されることが知られ、また腫瘍転移に関与することが知られている。さらに、ＨＩＶのＴ細胞への侵入における共受容体として、ＣＸＣＲ４はＨＩＶ感染に関与することが知られている。さらに、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１経路は炎症状態に関与することが示されている。さらに、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１経路は血管新生または新血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）に関与することが示されている。したがって、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体（および免疫複合体および二重特異性分子）を用い、以下のようなこれらの各臨床症状においてＣＸＣＲ４活性を調節することが可能である。
Ａ．癌
ＣＸＣＲ４は、種々の癌タイプにより発現されることが示されており、特定の状況ではＣＸＣＲ４の発現と患者の予後または生存の間に逆相関が成立することが明らかにされている。ＣＸＣＲ４の発現を伴う癌タイプの非限定例として、乳癌（ミュラー Ａ．（Ｍｕｌｌｅｒ Ａ．）ら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ ４１０：５０−５６頁）；卵巣癌（スコットン Ｃ．（Ｓｃｏｔｔｏｎ Ｃ．）ら（２００１年）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８５：８９１−８９７頁；前立腺癌（タイチマン Ｒ．Ｓ．（Ｔａｉｃｈｍａｎ Ｒ．Ｓ．）ら（２００２年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：１８３２−１８３７頁；非小細胞肺癌（スパノ Ｊ．Ｐ．（Ｓｐａｎｏ Ｊ．Ｐ．）ら（２００４年）Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．１５：６１３−６１７頁）；膵臓癌（コシバ Ｔ．（Ｋｏｓｈｉｂａ Ｔ．）ら（２０００年）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６：３５３０−３５３５頁）；甲状腺癌（フワン Ｊ．Ｈ．（Ｈｗａｎｇ Ｊ．Ｈ．）ら（２００３年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８８：４０８−４１６頁）；鼻咽頭癌（ワン Ｎ．（Ｗａｎｇ Ｎ．）ら（２００５年）Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．３：２６−３３頁）；メラノーマ（スカラ Ｓ．（Ｓｃａｌａ Ｓ．）ら（２００５年）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１：１８３５−１８４１頁）；腎細胞癌（ストーラー Ｐ．（Ｓｔａｌｌｅｒ Ｐ．）ら（２００３年）Ｎａｔｕｒｅ ４２５：３０７−３１１頁）；リンパ腫（ベルトリーニ Ｆ．（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ Ｆ．）ら（２００２年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：３５３０−３５３５頁）；神経芽細胞腫（ゲマインダー Ｈ．（Ｇｅｍｉｎｄｅｒ Ｈ．）ら（２００１年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：４７４７−４７５７頁）；グリア芽腫（レムペル Ｓ．Ａ．（Ｒｅｍｐｅｌ Ｓ．Ａ．）ら（２０００年）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６：１０２−１１１頁）；横紋筋肉腫（リブラ Ｊ．（Ｌｉｂｕｒａ Ｊ．）ら（２００２年）Ｂｌｏｏｄ １００：２５９７−２６０６頁）；結腸直腸癌（ツェーレンベルグ Ｉ．Ｓ．（Ｚｅｅｌｅｎｂｅｒｇ Ｉ．Ｓ．）ら（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：３８３３−３８３９頁）；腎臓癌（シュレイダー Ａ．Ｊ．（Ｓｃｈｒａｄｅｒ Ａ．Ｊ．）ら（２００２年）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８６：１２５０−１２５６頁）；骨肉腫（ラバーディエール Ｃ．（Ｌａｖｅｒｄｉｅｒｅ Ｃ．）ら（２００５年）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１：２５６１−２５６７頁）；急性リンパ性白血病（クラッゾララ Ｒ．（Ｃｒａｚｚｏｌａｒａ Ｒ．）ら（２００１年）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１１５：５４５−５５３頁）；ならびに急性骨髄性白血病（ロンバウツ Ｅ．Ｊ．Ｃ．（Ｒｏｍｂｏｕｔｓ Ｅ．Ｊ．Ｃ．）ら（２００４年）Ｂｌｏｏｄ １０４：５５０−５５７頁）が挙げられる。
上記の観点から、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体は、限定はされないが、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、甲状腺癌、鼻咽頭癌、メラノーマ、腎細胞癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、グリア芽腫、横紋筋肉腫、結腸直腸癌、腎臓癌、骨肉腫、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病からなる群から選択される癌を含む癌の治療において用いられうる。抗体は、単独で用いられうるか、あるいは、他の癌治療、例えば手術および／または放射線、および／または他の抗新生物剤、例えば化学療法剤および他の抗腫瘍抗原抗体、例えばＣＤ２０、Ｈｅｒ２、ＰＳＭＡ、キャンパス−１、ＥＧＦＲなどに結合するものを含む、上で考察され示された抗新生物剤と併用されうる。
Ｂ．ＨＩＶ感染を含むウイルス感染
ＣＸＣＲ４がＨＩＶのＴ細胞への侵入における共受容体であることが示され、さらに特定のマウス抗ＣＸＣＲ４抗体がＨＩＶ単離体のＴ細胞への侵入を阻害可能であることが示されている（ホウ Ｔ．（Ｈｏｕ Ｔ．）ら（１９９８年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１８０−１８８頁；カルネック Ｘ．（Ｃａｒｎｅｃ Ｘ．）ら（２００５年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１９３０−１９３８頁を参照）。したがって、ＣＸＣＲ４はウイルスによる細胞への侵入に対する受容体として使用可能であり、ＣＸＣＲ４に対する抗体を用い、受容体としてＣＸＣＲ４を用いるかかるウイルスの細胞侵入の阻害が可能である。したがって、本開示のヒト抗ＣＸＣＲ４抗体を用い、ウイルスの細胞への侵入の阻害が可能であり、ここでウイルスはウイルス感染が阻害されるようにＣＸＣＲ４を細胞侵入に対する受容体として用いる。好ましい実施形態では、抗体を用い、例えばＨＩＶ／ＡＩＤＳの治療または予防においてＨＩＶのＴ細胞への侵入が阻害される。抗体は、単独で用いられうるかまたは他の抗ウイルス剤、例えばＡＺＴもしくはプロテアーゼ阻害剤などの抗レトロウイルス薬と併用されうる。
Ｃ．炎症状態
ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１経路は、限定はされないが、炎症性肝疾患（テラダ Ｒ．（Ｔｅｒａｄａ Ｒ．）ら（２００３年）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８３：６６５−６７２頁）；自己免疫性関節炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｊｏｉｎｔ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）（マチス Ｐ．（Ｍａｔｔｈｙｓ Ｐ．）ら（２００１年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：４６８６−４６９２頁）；アレルギー性気管疾患（ゴンザロ Ｊ．Ａ．（Ｇｏｎｚａｌｏ Ｊ．Ａ．）ら（２０００年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：４９９−５０８頁）；および歯周病（ホソカワ Ｙ．（Ｈｏｓｏｋａｗａ Ｙ．）ら（２００５年）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４６７−４７４頁）を含む種々の炎症状態において役割を担うことが示されている。
したがって、ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害する本開示のヒト抗ＣＸＣＲ４抗体を用い、炎症性肝疾患、自己免疫性関節炎、アレルギー性気管疾患、歯周病、関節リウマチ、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、炎症性皮膚疾患（例えば、乾癬、扁平苔癬）、自己免疫性甲状腺疾患、シェーグレン症候群、肺炎症（例えば、慢性閉塞性肺疾患、肺サルコイドーシス、リンパ球性肺胞炎）および炎症性腎疾患（例えば、ＩｇＡ腎症、糸球体腎炎）からなる群から選択される障害を含む炎症性疾患における炎症の阻害が可能である。抗体は、単独で用いられうるかまたは他の抗炎症剤、例えば非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン）、メトトレキセート、ＣＯＸ−２阻害剤、ＴＮＦ拮抗剤（例えば、エタナーセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ）および免疫抑制剤（６−メルカプトプリン、アザチオプリンおよびシクロスポリンＡなど）と併用されうる。
Ｄ．血管新生
ＳＤＦ−１がＣＸＣＲ４を発現する造血前駆細胞（ｈｅｍａｎｇｉｏｃｙｔｅｓ）の補充を通じて新血管新生を誘発することが示されている（ジン Ｄ．Ｋ．（Ｊｉｎ Ｄ．Ｋ．）ら（２００６年）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２：５５７−５６７頁）。さらに、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４経路を遮断し、血管新生をＶＥＧＦに依存しない様式で阻害することにより、腫瘍成長がインビボで低下しうる（グレン Ｂ．（Ｇｕｌｅｎｇ Ｂ．）ら（２００５年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：５８６４−５８−７１）。さらに、実施例２で示されるように、本開示の抗体はインビトロで毛細管形成を阻害しうる。したがって、ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害する本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体を用い、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４経路との干渉による血管新生の阻害が可能である。血管新生の阻害を用い、例えば（腫瘍がＣＸＣＲ４＋であるか否かとは無関係に）腫瘍成長または腫瘍転移の阻害が可能である。抗体は、単独で用いられうるかまたは他の抗血管新生薬（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔ）、例えば抗ＶＥＧＦ抗体と併用されうる。
Ｅ．自家幹細胞移植
末梢血幹細胞は、例えば特定の血液悪性疾患（ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ）の治療における自家幹細胞移植で用いられる幹細胞の好ましい供給源である。幹細胞の末梢血からの採取には、骨髄から末梢血へのＣＤ３４＋幹細胞の動員が必要とされる。様々なサイトカイン、ケモカインおよび接着分子は、ＣＸＣＲ４とＳＤＦ−１の相互作用を含む、このプロセスの調節に関与している（ガジット Ｙ．（Ｇａｚｉｔｔ Ｙ．）（２００１年）Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１０：２２９−２３６頁にてレビュー）。さらに、小分子ＣＸＣＲ４拮抗剤は、骨髄から末梢血へのＣＤ３４＋幹細胞の迅速な動員を刺激することが示されている（例えば、デビン Ｓ．Ｍ．（Ｄｅｖｉｎｅ Ｓ．Ｍ．）ら（２００４年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：１０９５−１１０２頁；ブロクスメイヤー Ｈ．Ｅ．（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ Ｈ．Ｅ．）ら（２００５年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１：１３０７−１３１８頁；フロメンバーグ Ｎ．（Ｆｌｏｍｅｎｂｅｒｇ Ｎ．）ら（２００５年）Ｂｌｏｏｄ １０６：１８６７−１８７４頁を参照）。したがって、ＣＸＣＲ４活性を阻害する本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体（すなわちアンタゴニスト抗体）を用い、骨髄から末梢血へのＣＤ３４＋幹細胞の動員が刺激されうることで、例えば血液疾患、例えば多発性骨髄腫および非ホジキンリンパ腫の治療における移植（例えば自家移植）でのかかる幹細胞の使用が可能になる。抗体は、単独で用いられうるかまたは幹細胞の動員を刺激するのに用いられる他の作用物質、例えばＧ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦと併用されうる。したがって、別の実施形態では、本発明は、対象において骨髄から末梢血へのＣＤ３４＋幹細胞の動員を刺激する方法であって、骨髄から末梢血へのＣＤ３４＋幹細胞の動員が刺激されるように本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。本方法は、例えば自家幹細胞移植での使用において末梢血からＣＤ３４＋幹細胞を採取するステップをさらに含みうる。
本開示は以下の実施例によりさらに例示され、実施例はさらに限定するものとして解釈されるべきでない。本願を通して言及されるあらゆる図面およびあらゆる参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書中に明示的に援用される。
実施例１：ＣＸＣＲ４に対するヒトモノクローナル抗体の産生
第１にヒト抗体遺伝子を発現するマウスを免疫し、マウスにおいてヒトＣＸＣＲ４に特異的なヒト免疫グロブリンのレパートリーを産生し、次いで第２にマウスの脾臓細胞からヒト抗体ライブラリを調製し、ファージ上に提示し、ここでＣＸＣＲ４に対する特異性を有する抗体の発現についてファージのスクリーニングを行うという複合的アプローチを用い、抗ＣＸＣＲ４ヒトモノクローナル抗体を産生した。この複合的アプローチは、一般にブエクラー（Ｂｕｅｃｈｌｅｒ）らによる米国特許出願公開第２００３００９１９９５号明細書において記載されている。
抗原
Ｒ１６１０細胞（チャイニーズハムスター肺細胞系、最初にサリオン Ｊ．Ｐ．（Ｔｈｉｒｉｏｎ Ｊ．Ｐ．）ら（１９７６年）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８３：１３７−１４７頁に記載）に完全長ヒトＣＸＣＲ４タンパク質をコードする発現ベクターを、タンパク質が細胞の表面上に発現されるように形質移入した。ＣＸＣＲ４ ｃＤＮＡのコドンが最適化された形態を発現ベクターで用い、それをミルザベコフ Ｔ．（Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ Ｔ．）ら（１９９９年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２８７４５−２８７５０頁に記載のように調製した。細胞の免疫原性を高めるため、細胞を、５％溶液として市販のトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の水溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号Ｐ２２９７）とのインキュベーションにより、トリニトロフェノール（ＴＮＰ）でコートした。より詳細には、１×１０８個の細胞を無菌ＰＢＳで１回洗浄し、市販の５％ＴＮＢＳ溶液５０μｌとともに暗所、室温で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳで３回洗浄した。得られたＴＮＰでコートされたＣＸＣＲ−４を発現するＲ１６１０細胞を免疫のための抗原として用いた。最終の免疫原は、ＴＮＰでコートされ洗浄された細胞（１×１０７個の細胞）１００μｌとリビ（Ｒｉｂｉ）アジュバント１００μｌとの混合物であった。マウスは免疫原の投与を長期間にわたり６回受けた。
トランスジェニックトランスクロモゾームＫＭマウス（登録商標）株
ＣＸＣＲ４に対する完全ヒトモノクローナル抗体を、まずヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックトランスクロモゾームマウスのＫＭ株を免疫することにより調製した。このマウス株では、チェン（Ｃｈｅｎ）ら（１９９３年）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：８１１−８２０頁に記載のように内因性マウスκ軽鎖遺伝子のホモ接合が破壊されており、ＰＣＴ公開の国際公開第０１／０９１８７号パンフレットの実施例１に記載のように内因性マウス重鎖遺伝子のホモ接合が破壊されている。さらに、このマウス株は、（フィッシュワイルド（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ）ら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１頁に記載のように）ヒトκ軽鎖トランス遺伝子ＫＣｏ５を保有し、さらにＰＣＴ公開の国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに記載のように、ヒトＩｇ重鎖遺伝子座を保有するＳＣ２０トランスクロモゾームを有する。ＫＭマウスは、米国特許出願公開第２００２０１９９２１３号明細書にも詳述されている。
ＫＭ免疫
ＣＸＣＲ４に対する完全ヒトモノクローナル抗体を産生するため、（抗原について上記のように）ＫＭマウス（登録商標）株のマウスを形質移入されたＲ１６１０細胞で免疫してＣＸＣＲ４を発現し、ＴＮＰでコートした。ヒト抗体遺伝子を保有するマウス株においてヒト抗体を産生するための一般の免疫スキームは、ロンバーグ Ｎ．（Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ．）ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９頁；フィッシュワイルド Ｄ．（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ Ｄ．）ら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１頁およびＰＣＴ公開の国際公開第９８／２４８８４号パンフレットに記載されている。マウスは１回目の抗原注入時に６〜１６週齢であった。
ＫＭマウスを腹腔内（ＩＰ）、皮下（Ｓｃ）または足蹠（ＦＰ）を介してリビ（Ｒｉｂｉ）アジュバント中の抗原で免疫して３〜２１日後、ＩＰ、ＳｃまたはＦＰにリビ（Ｒｉｂｉ）アジュバント中の抗原で再免疫した（全部で６回の免疫）。免疫応答を眼窩後方からの採血（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ ｂｌｅｅｄ）により監視した。血漿については、ＣＸＣＲ４を発現するＲ１６１０細胞のＦＡＣＳ染色によりスクリーニングした（形質移入されていない親Ｒ１６１０細胞に対して）。脾臓の摘出においては、抗ＣＸＣＲ４ヒト免疫グロブリンの十分な滴定濃度でマウスを用いた。
ファージディスプレイライブラリの調製および抗ＣＸＣＲ４抗体についてのスクリーニング
上記の免疫マウスから摘出した脾臓を用い、ヒト抗体の重鎖および軽鎖を発現するファージディスプレイライブラリを作製した。より詳細には、本質的にブエクラー（Ｂｕｅｃｈｌｅｒ）らによる米国特許出願公開第２００３００９１９９５号明細書に記載のように、全ＲＮＡを脾臓から単離し、ｃＤＮＡをＲＮＡから調製し、ヒト抗体可変領域ｃＤＮＡをＰＣＲにより特異的に増幅した。さらに本質的にブエクラー（Ｂｕｅｃｈｌｅｒ）らによる米国特許出願公開第２００３００９１９９５号明細書に記載のように、ヒト抗体可変領域のライブラリをファージ発現ベクターにクローニングした。ファージディスプレイライブラリにおけるＣＸＣＲ４に対して親和性を有するライブラリメンバーについてマグネティックプロテオリポソームに組み込まれたヒトＣＸＣＲ４（ＣＸＣＲ４−ＭＰＬ）でのパニングによりスクリーニングした。ＣＸＣＲ４を発現するＭＰＬ、または他の７回膜貫通（７ＴＭ）受容体（例えばＣＣＲ５）において７ＴＭ受容体の天然立体構造が維持されることについて、過去に記載がなされている（例えば、ミルザベコフ Ｔ．（Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ Ｔ．）ら（２０００年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：６４９−６５４頁；バブコック Ｇ．Ｊ．（Ｂａｂｃｏｃｋ Ｇ．Ｊ．）ら（２００１年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３８４３３−３８４４０頁；ＰＣＴ公開の国際公開第０１／４９２６５号パンフレット；米国特許出願公開第２００１００３４４３２号明細書を参照）。つまり、エピトープタグを有する組換えヒトＣＸＣＲ４は、洗剤チャプソ（ＣＨＡＰＳＯ）を用い、形質移入されたＣＸＣＲ４発現細胞系から可溶化され、タンパク質がエピトープタグを介して磁気ビーズ上に捕捉された。洗剤を除去する間に脂質膜がＣＸＣＲ４の天然膜の高次構造が維持されるように再構成され、ＣＸＣＲ４−ＭＰＬが作製された。ＣＸＣＲ４−ＭＰＬに対する３回のファージディスプレイライブラリのパニングにより、ＣＸＣＲ４結合剤がバックグラウンドに対して３０倍に濃縮された。目的の可変領域断片がＦａｂ発現ベクターに再クローン化され、形質移入されたＣＸＣＲ４発現細胞に対するＦａｂの抗原結合性が再試験された。次いで、標準の分子生物学技術を用い、全抗体がＦａｂから産生された。
さらなる分析のため、ＦａｂクローンＦ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２を選択した。
実施例２：ヒト抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２の構造的特徴づけ
実施例１に記載のファージディスプレイライブラリのスクリーニングから得られたＦ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２ Ｆａｂクローンの重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を、標準のＤＮＡ配列決定技術を用いて配列決定した。
Ｆ７の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図１Ａと配列番号３３および２５に各々示される。
Ｆ７の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図１Ｂと配列番号３７および２９に各々示される。
Ｆ７重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、Ｆ７重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ３−４８由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系４−２３由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ６Ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のカバト（Ｋａｂａｔ）システムを用いてのＦ７ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を図示するに至った（各々、図１Ａと配列番号１、５および９に示される）。
Ｆ７軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、Ｆ７軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ１５由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ１由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のカバト（Ｋａｂａｔ）システムを用いてのＦ７ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を図示するに至った（各々、図１Ｂと配列番号１３、１７および２１に示される）。
Ｆ９の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ図２Ａと配列番号３４および２６に示される。
Ｆ９の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ図２Ｂと配列番号３８および３０に示される。
Ｆ９重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、Ｆ９重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ３−４８由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系４−２３由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ６Ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のカバト（Ｋａｂａｔ）システムを用いてのＦ９ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を図示するに至った（各々、図２Ａと配列番号２、６および１０に示される）。
Ｆ９軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、Ｆ９軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ１５由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ１由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のカバト（Ｋａｂａｔ）システムを用いてのＦ９ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を図示するに至った（各々、図２Ｂと配列番号１４、１８および２２に示される）。
Ｄ１の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ図３Ａと配列番号３５および２７に示される。
Ｄ１の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ図３Ｂと配列番号３９および３１に示される。
Ｄ１重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、Ｄ１重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ３−４８由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系４−２３由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ６Ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のカバト（Ｋａｂａｔ）システムを用いてのＤ１ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を図示するに至った（各々、図３Ａと配列番号３、７および１１に示される）。
Ｄ１軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、Ｄ１軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ１５由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ１由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のカバト（Ｋａｂａｔ）システムを用いてのＤ１ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を図示するに至った（各々、図３Ｂと配列番号１５、１９および２３に示される）。
Ｅ２の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ図４Ａと配列番号３６および２８に示される。
Ｅ２の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ図４Ｂと配列番号４０および３２に示される。
Ｅ２重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、Ｅ２重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ３−４８由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系４−２３由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ６Ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のカバト（Ｋａｂａｔ）システムを用いてのＥ２ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を図示するに至った（各々、図４Ａと配列番号４、８および１２に示される）。
Ｅ２軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、Ｅ２軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ１５由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ１由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のカバト（Ｋａｂａｔ）システムを用いてのＥ２ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を図示するに至った（各々、図４Ｂと配列番号１６、２０および２４に示される）。
Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶＨおよびＶＬ領域のフレームワーク配列とその元となる生殖細胞系配列との比較による分析では、生殖細胞系と異なる様々なフレームワークアミノ酸残基が同定された。「復帰突然変異」を意図してＶＨおよびＶＬセグメントのＮ末端領域内の特定のフレームワーク残基を選択し、フレームワーク残基を生殖細胞系配列に回復させたが、これはＮ末端部分におけるこれらの非生殖細胞系残基が実施例１に記載のファージディスプレイライブラリの作製に用いられるプライマーによりコードされることが理由であった。特に、Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶＨおよびＶＬセグメントの以下の修飾形態（生殖細胞系においては「ＧＬ」形態と称される）を標準の分子生物学技術を用いて作製し、生殖細胞系アミノ酸残基を指定されるフレームワーク位置で置換した。

Ｆ７ＧＬＶＨ：Ｑ１Ｅ、Ｑ６Ｅ
Ｆ７ＧＬＶＫ：Ａ１Ｄ、Ｒ３Ｑ

Ｆ９ＧＬＶＨ：Ｑ１Ｅ、Ｑ６Ｅ
Ｆ９ＧＬＶＫ：Ｅ１Ｄ、Ｖ３Ｑ、Ｌ４Ｍ

Ｄ１ＧＬＶＨ：Ｑ６Ｅ
Ｄ１ＧＬＶＫ：Ｖ１Ｄ、Ｗ３Ｑ、Ｖ４Ｍ

Ｅ２ＧＬＶＨ：Ｑ６Ｅ
Ｅ２ＧＬＶＫ：Ｅ１Ｄ、Ｖ３Ｑ、Ｌ４Ｍ
図５Ａは、Ｆ７（配列番号２５）およびＦ７ＧＬ（配列番号４１）の重鎖可変アミノ酸配列と生殖細胞系ＶＨ３−４８がコードされるアミノ酸配列（配列番号４９）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図５Ｂは、Ｆ７（配列番号２９）およびＦ７ＧＬ（配列番号４５）の軽鎖可変アミノ酸配列と生殖細胞系ＶＫＬ１５がコードされるアミノ酸配列（配列番号５０）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図６Ａは、Ｆ９（配列番号２６）およびＦ９ＧＬ（配列番号４２）の重鎖可変アミノ酸配列と生殖細胞系ＶＨ３−４８がコードされるアミノ酸配列（配列番号４９）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図６Ｂは、Ｆ９（配列番号３０）およびＦ９ＧＬ（配列番号４６）の軽鎖可変アミノ酸配列と生殖細胞系ＶＫＬ１５がコードされるアミノ酸配列（配列番号５０）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図７Ａは、Ｄ１（配列番号２７）およびＤ１ＧＬ（配列番号４３）の重鎖可変アミノ酸配列と生殖細胞系ＶＨ３−４８がコードされるアミノ酸配列（配列番号４９）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図７Ｂは、Ｄ１（配列番号３１）およびＤ１ＧＬ（配列番号４７）の軽鎖可変アミノ酸配列と生殖細胞系ＶＫＬ１５がコードされるアミノ酸配列（配列番号５０）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図８Ａは、Ｅ２（配列番号２８）およびＥ２ＧＬ（配列番号４４）の重鎖可変アミノ酸配列と生殖細胞系ＶＨ３−４８がコードされるアミノ酸配列（配列番号４９）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図８Ｂは、Ｅ２（配列番号３２）およびＥ２ＧＬ（配列番号４８）の軽鎖可変アミノ酸配列と生殖細胞系ＶＫＬ１５がコードされるアミノ酸配列（配列番号５０）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２ Ｆａｂ断片は、標準の組換えＤＮＡ技術を用いて完全長抗体に変換される。例えば、Ｆａｂ断片のうちの１つのＶＨおよびＶＫ領域をコードするＤＮＡは、重鎖および軽鎖の定常領域を可変領域が定常領域に作動可能に連結されるように保有する発現ベクターにクローン化されうる。あるいは、完全長重鎖および完全長軽鎖の発現には別々のベクターが用いられうる。完全長抗体の作製における使用に適する発現ベクターの非限定例として、ブラック（Ｂｌａｃｋ）による米国特許出願公開第２００５０１５３３９４号明細書に記載のｐＩＥベクターが挙げられる。
実施例３：抗ＣＸＣＲ４ヒトモノクローナル抗体の結合特性
本実施例では、抗ＣＸＣＲ４抗体の結合特性をフローサイトメトリーにより試験した。
天然ヒトＣＸＣＲ４を細胞表面上に発現するヒトＴ細胞系ＣＥＭを用い、Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２抗体の天然の細胞表面ＣＸＣＲ４に対する結合能について試験した。完全長Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２を１：３の段階希釈で滴定した結果、３００ｎＭ〜５ｐＭの濃度範囲が得られた。次いで、ＦＩＴＣと複合された抗ヒトＩｇＧ二次抗体で検出する前に、抗体をＣＥＭ細胞と混合し、結合させた。次いで、細胞を蛍光サイトメトリーで分析した。得られた平均蛍光強度を図９のグラフに示し、それは全部で４つの抗ＣＸＣＲ４抗体がＣＥＭ細胞に結合することを示す。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２への結合に対する各ＥＣ５０は、２１ｎＭ、１４ｎＭ、８０ｎＭおよび２９０ｎＭであった。
一群の抗ＣＸＣＲ４抗体のＣＸＣＲ４への結合に対する競合能を測定するため、競合試験を実施した。４つのヒト抗ＣＸＣＲ４抗体Ｆ９、Ｆ７、Ｅ２およびＤ１を、４つの市販のマウスモノクローナル抗ＣＸＣＲ４抗体（１２Ｇ５、７０８、７１６および７１７；各々、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）カタログ番号：ＭＡＢ１７０、ＭＡＢ１７１、ＭＡＢ１７２およびＭＡＢ１７３）とともに用いた。抗ＣＸＣＲ４抗体を１：３の段階希釈で滴定した結果、一定濃度のＦＩＴＣ標識抗ＣＸＣＲ４抗体Ｆ９の存在下で３００ｎＭ〜５ｐＭの濃度範囲が得られた。次いで、抗体の混合物をＣＥＭ細胞に添加し、結合させた。各抗体のＣＥＭ細胞への結合に対するＦ９との競合能を蛍光サイトメトリーおよびＦＩＴＣの検出により評価した。得られた平均蛍光強度を図１０のグラフに示し、それは試験対象の全部で７つの抗体（Ｆ７、Ｅ２、Ｄ１、１２Ｇ５、７０８、７１６および７１７）がＣＥＭ細胞への結合に対してＦ９と競合可能であることを示すが、Ｅ２抗体のみは他の抗体に対し、高濃度で部分的阻害を示した。
別の組の実験では、Ｆ７ ｍＡｂの種々の異なる細胞系に対する結合能を、ＦＡＣＳ適定の実施によるフローサイトメトリーにより試験した。漸増するｍＡｂ（０．００１μｇ／ｍｌ未満から１００μｇ／ｍｌ超）を１００，０００個の細胞とともにインキュベートし、結合をフローサイトメトリーで評価した。Ｂｍａｘ値も測定し、それはおよそ何個のＣＸＣＲ４分子が各細胞上に存在するかを示す。結合曲線に基づき、抗体結合に対するＥＣ５０を判定し、その結果を下記の表１にまとめる。
結果は、Ｆ７ ｍＡｂが６つの試験対象の細胞系の各々に有効に結合可能であり、ラモスおよびラジ（Ｒａｊｉ）細胞系の場合、最低のＥＣ５０が観察されることを示す。これらのデータは、ＣＸＣＲ４受容体の発現がラモスおよびナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞において最高でありかつＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＤＭＳ７９細胞において最低であることも示す。
別の結合実験では、Ｆ７ ｍＡｂのヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の異なるサブセットに対する結合能について試験した。ヒトＰＢＭＣを標準の方法により単離し、異なる細胞のサブセットをＦＡＣＳにより単離した。特に、以下の細胞のサブセット、すなわち（ｉ）ＣＤ３＋、（ｉｉ）ＣＤ２０＋；（ｉｉｉ）ＣＤ１１ｂ＋および（ｉｖ）ＣＤ１４＋を単離した。Ｆ７ ｍＡｂ（３３μｇ／ｍｌ）の場合に行ったフローサイトメトリー実験によると、Ｆ７ ｍＡｂがアイソタイプが一致した対照抗体と比べて４つの各サブセットに有効に結合可能であることが示された。
実施例４：抗ＣＸＣＲ４抗体によるＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合に対する阻害
抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体におけるＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合に対する阻害能を測定するため、ＣＸＣＲ４を天然に発現する１２５Ｉで標識されたＳＤＦ−１およびＣＥＭ細胞を用いて競合試験を行った。ＳＤＦ−１のＣＥＭ細胞への結合に対する遮断についての抗ＣＸＣＲ４抗体の比較を、標準の放射線標識リガンド結合アッセイにより行った。抗ＣＸＣＲ４抗体を１：３に段階希釈し、３００ｎＭ〜１３７ｐＭの濃度範囲を得た。抗体を、２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅの比活性での１００ｐＭ １２５Ｉ−ＳＤＦ−１（アムシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、カタログ番号ＩＭ３１４−２５ＵＣＩ）の存在下で、１００μｌ中の７５０，０００個のＣＥＭ細胞に添加した。同じアイソタイプの無関係抗体を陰性対照として用いた。生じうる結合された放射線標識リガンド全体を、抗体の非存在下で４℃で２時間、１２５Ｉ−ＳＤＦ−１をＣＥＭ細胞と結合させて測定した。放射線標識リガンドの非特異的結合を、１２５Ｉ−ＳＤＦ−１を１μＭの未標識ＳＤＦ−１（ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、カタログ番号３００−２８Ａ）の存在下で結合させて測定した。細胞に関連した１２５Ｉ−ＳＤＦ−１の量を標準の方法により測定した。結果を図１１に示し、それはＦ７抗体がＳＤＦ−１のＣＥＭ細胞上に発現されるＣＸＣＲ４への結合に対して最も有効な遮断をもたらすことを示す。Ｆ９およびＤ１抗体は、Ｆ７よりも穏やかであるがＳＤＦ−１の結合も遮断した。Ｅ２抗体は、（実施例３に示されるように）ＣＥＭ細胞上のＣＸＣＲ４に結合するが、ＳＤＦ−１のＣＥＭ細胞上のＣＸＣＲ４への結合を有効に遮断しなかった。Ｆ７、Ｆ９およびＤ１によるＳＤＦ−１の遮断に対するＥＣ５０は、それぞれ２．３ｎＭ、１２．５ｎＭおよび２８．６ｎＭであった。
実施例５：抗ＣＸＣＲ４抗体によるＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束の阻害
抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体のＳＤＦ−１により誘発されるＣＥＭ細胞内でのカルシウム流束に対する阻害能を測定するため、ＣＥＭ細胞をまず蛍光色素カルシウム３（モレキュラー・デバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ））で標識した。抗ＣＸＣＲ４抗体を１：３の段階希釈で滴定した結果、１００ｎＭ〜１ｐＭの濃度範囲が得られ、この抗体を２００μｌ中の２００，０００個のＣＥＭ細胞と統合させ、フレックスステーション（Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ）機器（モレキュラー・デバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ））への負荷に先立ち、室温で１０分間インキュベートした。陰性対照として、同じアイソタイプの無関係抗体を用いた。次いで、細胞を５０ｎＭの組換えヒトＳＤＦ−１α（ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））の最終濃度で刺激し、２２２μｌの最終容量に対して２２μｌの容量で５００ｎＭとして添加した。得られたカルシウム流束を１ウェル当たり２００秒間測定した。陽性対照として、抗体の非存在下での細胞を（０．１％のＢＳＡまたはＨＢＳを有するハンクス（Ｈａｎｋ’ｓ）緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）中で作製した）ＳＤＦ−１αで刺激し、最大と考えられるカルシウム流束シグナルが得られた。ベースラインを測定するため、細胞を、０．１％ＢＳＡを有するＨＢＳで刺激した。ＳＤＦ−１α刺激性のカルシウムの放出を、カルシウム依存性の蛍光の発光により経時的に測定した。得られた蛍光トレースの曲線下の面積はカルシウム流束を示すものとして報告された。抗ＣＸＣＲ４抗体により得られたカルシウム流束の阻害を図１２に示す。データをプロットし、ＥＣ５０をグラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェアおよび非線形曲線フィット、Ｓ字形用量応答の式（ｓｉｇｍｏｉｄａｌ ｄｏｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆｏｒｍｕｌａ）を用いて計算した。抗体Ｆ７、Ｆ９およびＤ１は、ＳＤＦ−１α誘発性のカルシウム流束を阻害した。抗体Ｅ２は、（実施例３に示されるように）ＣＸＣＲ４に結合したが、ＳＤＦ−１α誘発性のカルシウム流束を有意に阻害しなかった。Ｆ７、Ｆ９およびＤ１によるＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束の阻害に対するＥＣ５０は、それぞれ０．９０ｎＭ、０．３２ｎＭおよび０．５７ｎＭであった。
実施例６：抗ＣＸＣＲ４抗体によるＣＥＭ細胞のＳＤＦ−１誘発性の遊走の阻害
抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体のＳＤＦ−１誘発性のＣＥＭ細胞の遊走に対する阻害能を測定するため、ＣＥＭ細胞をまずＢＡＴＤＡ試薬（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））で標識した。抗ＣＸＣＲ４抗体を１：３段階希釈で滴定した結果、１００ｎＭ〜１ｐＭの濃度範囲が得られ、この抗体を１ｍｌ当たり１０００万個の細胞の密度で標識ＣＥＭ細胞と結合させた。陰性対照として、同じアイソタイプの無関係抗体を用いた。組換えヒトＳＤＦ−１α（ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））を、１ウェル当たり３０μｌ、５ｎＭで、１ウェル当たり直径５．７ｍｍのフィルタを有する９６ウェルのニューロプローブ（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ）泳動プレートの下部チャンバに添加した。各ウェルは５μＭの孔を有する。抗体を伴う場合と伴わない場合で、標識ＣＥＭ細胞を、容量５０μｌ中、１ウェル当たり５０万個の細胞の濃度でフィルタ上に負荷した。泳動プレートを３７℃で２．５時間インキュベートした。泳動細胞をプレートの下部チャンバ内に捕捉し、溶解し、ユウロピウム検出溶液（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））で検出した。化学発光標識シグナルをフュージョン（Ｆｕｓｉｏｎ）の機器上で記録した。抗ＣＸＣＲ４抗体により得られたＳＤＦ−１α誘発性の遊走の阻害について図１３に示す。結果では、抗体Ｆ７およびＦ９が遊走を有効に阻害する一方、抗体Ｄ１およびＥ２が遊走を有意に阻害しないことが示された。Ｆ７およびＦ９によるＳＤＦ−１誘発性のＣＥＭ細胞の遊走の阻害に対するＥＣ５０は、それぞれ１２．４４ｎＭおよび１８．９９ｎＭであった。
実施例７：抗ＣＸＣＲ４抗体によるＨｕＶＥＣ毛細管形成の阻害
本実施例では、抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体のヒト臍静脈内皮細胞（ＨｕＶＥＣ）による毛細管形成に対する阻害能を試験した。マトリゲルをＲＰＭＩで１：１に希釈し、９６ウェルプレートのウェル上にプレーティングし、３７℃で３０分間重合させた。８０％コンフルエンスでのＨｕＶＥＣ（キャンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ）、カタログ番号ＣＣ−２５１９から入手）をトリプシン処理し、０．５％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ中、１ｍｌ当たり１×１０６個の細胞で再懸濁した。抗体を３μｇ／ｍｌの最終濃度でＨｕＶＥＣと十分に混合し、室温で３０分間インキュベートしておいた。同じアイソタイプまたは媒体の無関係抗体を単独で陰性対照として用いた。毛細管形成の阻害の陽性対照として、マウス抗ヒトαｖβ３（ＣＤ５１／ＣＤ６１）抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、カタログ番号ＭＡＢ３０５０）を用いた。抗体を伴う場合と伴わない場合で、ＨｕＶＥＣをマトリゲルでコートしたウェル上にプレーティングし、３７℃で１８時間インキュベートした。
媒体単独またはアイソタイプが一致した対照抗体とともにインキュベートしたＨｕＶＥＣは、毛細管を形成する結果、連結された細胞が１細胞当たり３〜５ポイントの連結点または分枝点でプレートを通過する様相が見られた。抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体または抗αｖβ３抗体のいずれかとともにインキュベートしたＨｕＶＥＣは毛細管を形成しなかった。細胞は、単離されかつ分枝点がほとんど存在しないように見られた。ＳＤＦ−１の結合、ＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束およびＳＤＦ−１誘発性の遊走の遮断に最も有効な抗ＣＸＣＲ４抗体、すなわちＦ７およびＦ９は、毛細管形成の阻害にも最も有効であった。ＣＸＣＲ４に結合してもＳＤＦ−１の結合またはＳＤＦ−１誘発性の効果を遮断しない抗ＣＸＣＲ４抗体Ｅ２は、毛細管形成を阻害しなかった。
実施例８：抗ＣＸＣＲ４抗体によるインビトロでの腫瘍細胞増殖の阻害
本実施例では、インビトロでの抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体のラモス腫瘍細胞（ヒトバーキットリンパ腫細胞系）の増殖に対する阻害能を試験した。アッセイでは、１×１０４個の細胞／ウェルを漸増用量（１０−３〜３００ｎＭ）のＦ７ ＩｇＧ４抗体、Ｆ９ ＩｇＧ１抗体、Ｅ２ ＩｇＧ１抗体、Ｆ９ Ｆａｂ’抗体またはアイソタイプ対照とともにインキュベートした。細胞を抗体とともに７２時間インキュベートし、インキュベーションの最後の２４時間、３Ｈ−チミジンを添加することで、細胞増殖の監視を可能にした。インキュベーション後、細胞による３Ｈ−チミジンの取り込みを標準技術により測定した。結果を図１４のグラフに示す。結果は、Ｆ７ ＩｇＧ４、Ｆ９ ＩｇＧ１およびＥ２ ＩｇＧ１抗体の各々が、３Ｈ−チミジンの取り込みがこれら抗体とともにインキュベートされる場合に低下したことから示されるように、ラモス細胞の増殖を阻害できた一方、Ｆ９ Ｆａｂ’断片が細胞増殖を阻害しなかったことを示す。これらの結果は、抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体がインビトロで腫瘍細胞に対する直接的な抗増殖効果を有することから抗増殖効果を得るのに二次架橋を必要としないことを示す。
実施例９：抗ＣＸＣＲ４抗体によるインビボでの固形腫瘍細胞増殖の阻害
本実施例では、インビボでの抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体の、確立された固形腫瘍の増殖に対する阻害能を、ラモス皮下腫瘍細胞モデルを用いて試験した。このアッセイでは、１０×１０６個のラモス細胞／マウスを各マウスの横腹領域に移植し、腫瘍の長さ×幅×高さ／２により計算された４０ｍｍ３の平均サイズまで成長させておいた。次いで、マウスは、１回目の用量の抗体の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を受け（治療の０日目で表される）、７日目に２回目の腹腔内用量の抗体を受けた。Ｆａｂ’断片抗体で治療したマウスは、３日目および１０日目にも腹腔内用量の抗体を受けた。マウス群（ｎ＝８）を、（ｉ）媒体；（ｉｉ）アイソタイプ対照（１５ｍｇ／ｋｇ）；（ｉｉｉ）Ｆ７ ＩｇＧ４（１５ｍｇ／ｋｇ）；（ｉｖ）Ｆ９ ＩｇＧ１（１５ｍｇ／ｋｇ）；（ｖ）Ｆ９ Ｆａｂ’（１０ｍｇ／ｋｇ）；または（ｖｉ）抗ＣＤ２０陽性対照（１５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで治療した。腫瘍体積およびマウス体重を、投与後の０日目と３０日目の間で定期的に（約２〜３回／週で）測定した。実験の結果を図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃに示し、それらは平均腫瘍体積（図１５Ａ）、腫瘍体積中央値（図１５Ｂ）および％体重変化中央値（図１５Ｃ）を示す。結果は、腫瘍体積の増大での測定によると、Ｆ７ ＩｇＧ４およびＦ９ ＩｇＧ１抗体が陽性対照のように有意に腫瘍細胞成長を阻害する一方、Ｆ９ Ｆａｂ’断片がアイソタイプ対照と比べて腫瘍細胞成長を阻害しないことを示した。あらゆる治療が、全く有意でない体重変化で示されるように十分な耐容性を示した。治療間での体重差が腫瘍の重量に起因する可能性が最も高かった。結果は、抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体がインビボで確立された固形腫瘍の成長を阻害可能であることを示す。
実施例１０：抗ＣＸＣＲ４抗体での治療によるマウス全身性腫瘍細胞モデルでの生存時間の増加
本実施例では、抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体の、マウスの生存時間を増加させる能力を、ラモス全身性腫瘍細胞モデルを用いて試験した。このアッセイでは、０日目、１×１０６個のラモス細胞／マウスを各マウスに静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。次いで、マウスは、１日目（すなわち腫瘍細胞の静脈内投与の１日後）、１回目の用量の抗体の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を受け、５、８、１５および２２日目、さらに４回の腹腔内用量の抗体を受けた（陽性対照抗体で治療されるマウスは１日目のみに治療を受けた）。マウス群（ｎ＝８）を、（ｉ）媒体；（ｉｉ）アイソタイプ対照（１５ｍｇ／ｋｇ）；（ｉｉｉ）Ｆ９ ＩｇＧ１（１５ｍｇ／ｋｇ）；または（ｉｖ）抗ＣＤ１９陽性対照（１５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで治療した。パーセント生存率を、投与後の０日目と５０日目の間で定期的に測定した（後肢麻痺を実験のエンドポイントとして用いた）。実験の結果を図１６に示し、それは経時的なパーセント生存率を示す。媒体またはアイソタイプ対照のいずれかで治療されたマウスにおける生存日数中央値はそれぞれ２３日および２５．５日である一方、１つの用量の抗ＣＤ１９陽性対照で治療されたマウスの生存日数中央値は３９日であった。有意に、５つの用量のＦ９ ＩｇＧ１抗体で治療された群中の１００％のマウスが実験の終了まで生存した。これらの結果は、抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体が全身性腫瘍細胞モデルにおいてマウスの生存時間を増加させうることを示す。
実施例１１：抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体Ｆ７によるアポトーシスの誘発
本実施例では、抗ＣＸＣＲ４ ｍＡｂ Ｆ７の異なる細胞内でのアポトーシスに対する誘発能を試験した。アポトーシスアッセイでは、１０μｇ／ｍｌでのＦ７ ｍＡｂを、ラモス細胞（５００，０００個の細胞）、ナマルバ細胞（５００，０００個の細胞）または形質移入によりＣＸＣＲ４を発現するＲ１６１０細胞（１００，０００個の細胞）のいずれかとともにインキュベートした。形質移入されていないＲ１６１０細胞を陰性対照として用いた。抗ＣＸＣＲ４ ｍＡｂ Ｆ７またはアイソタイプ対照抗体を、細胞とともに３７℃でインキュベートし、試料２５０μｌを２４、４８および７２時間後に取り出した。アポトーシスを評価するため、様々な時点で得られた細胞を、アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ−ＦＩＴＣ−ＦＬ１およびヨウ化プロピジウム−ＦＬ３とともにインキュベートした後、フローサイトメトリーを行った。ＦＬ１、ＦＬ３およびＦＬ１−ＦＬ３の二重陽性の象限において採集された細胞の合計百分率をアポトーシスと見なした。バックグラウンドを除去するため、アイソタイプ抗体誘発性のアポトーシス細胞の百分率をＦ７ ｍＡｂ誘発性のアポトーシス細胞の百分率から差し引いた。
結果を下記の表２にまとめる。
結果は、Ｆ７ ｍＡｂが、ラモス、ナマルバおよびＲ１６１０−ＣＸＣＲ４細胞内でのアポトーシスを誘発可能である一方、Ｆ７が親Ｒ１６１０細胞のアポトーシスの誘発に対して全く効果を与えず、これは応答がＣＸＣＲ４に特異的であったことを示す。
実施例１２：抗ＣＸＣＲ４抗体によるインビボでの固形腫瘍細胞増殖の阻害を示す追加試験
本実施例では、抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体の、増殖に対する阻害能またはインビボで確立された固形腫瘍のアポトーシスに対する誘発能を、上記の実施例９におけるラモスモデルに類似のさらなる腫瘍細胞モデルを用いて試験した。種々の腫瘍細胞系を試験した。典型的な実験および結果は以下の通りである。
一実験では、７．５×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞／マウスを各マウスの横腹領域に移植し、移植の７日後、腫瘍の長さ×幅×高さ／２により計算された１００ｍｍ３の平均サイズまで成長させておいた。マウスは異なる治療群に無作為化され、移植の７日後、１回目の用量の抗体の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を受け、移植の１４日後、２回目の腹腔内用量の抗体を受け、次いで移植の４６日後、３回目の用量を受けた。マウス群（ｎ＝９）を、（ｉ）媒体（ＰＢＳ）、（ｉｉ）ＩｇＧ１アイソタイプ対照（１５ｍｇ／ｋｇ）、（ｉｉｉ）ＩｇＧ４アイソタイプ対照（１５ｍｇ／ｋｇ）、（ｉｖ）Ｆ７ ＩｇＧ１（１５ｍｇ／ｋｇ）、または（ｖ）Ｆ７ ＩｇＧ４（１５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで治療した。腫瘍体積を定期的に測定し、各治療群における平均腫瘍体積および腫瘍体積中央値を各間隔で測定した。この実験の結果は下記の表３にまとめられ、５２日目の平均腫瘍体積（ｍｍ３）および％腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）と、移植の５９日後の腫瘍体積中央値（ｍｍ３）および％ＴＧＩを示す。
さらに、５９日目、Ｆ７ ＩｇＧ４治療群中のマウスの１匹には腫瘍が見られなかった。結果は、Ｆ７ ｍＡｂがインビボでＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌細胞の成長を阻害可能であることを示す。
第２の実験では、５×１０６個のＤＭＳ７９ヒト小細胞肺癌細胞／マウスを各マウスの横腹領域に移植し、移植の７日後、腫瘍の長さ×幅×高さ／２により計算された１６０ｍｍ３の平均サイズまで成長させておいた。マウスは異なる治療群に無作為化され、Ｑ３Ｄｘ５の投与計画で（３日ごとで５回）抗体の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を受けた。マウス群（ｎ＝１０）を、（ｉ）媒体（ＰＢＳ）、（ｉｉ）ＩｇＧ１アイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ）、（ｉｉｉ）Ｆ７ ＩｇＧ４（１０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで治療した。腫瘍体積を定期的に測定し、各治療群における平均腫瘍体積および腫瘍体積中央値を各間隔で測定した。この実験の結果は下記の表４にまとめられ、移植の３４日後の平均腫瘍体積および腫瘍体積中央値（ｍｍ３）と％腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を示す。
結果は、Ｆ７ ｍＡｂがインビボでＤＭＳ７９ヒト小細胞肺癌細胞の成長を阻害可能であることを示す。
上記や実施例９に記載と同様の実験では、追加の皮下異種移植片腫瘍モデルにおける抗ＣＸＣＲ４抗体の、腫瘍成長に対する阻害能を試験した。ＳＵ−ＤＨＬ−６ Ｂ細胞リンパ腫細胞を用いる実験では、結果は、１５ｍｇ／ｋｇのＦ７ ＩｇＧ４ ｍＡｂでの治療により約６０％の腫瘍成長阻害がもたらされることを示した。同様に、ナマルババーキットリンパ腫細胞を用いる実験では、結果は、３ｍｇ／ｋｇのＦ７ ＩｇＧ４ ｍＡｂでの治療により約７０％の腫瘍成長阻害がもたらされることを示した。それに対し、ＮＩＨ−Ｈ２２６肺癌細胞またはＨＰＡＣヒト膵腺癌細胞を用いる実験では、Ｆ７ ｍＡｂによる腫瘍成長阻害は全く観察されなかった。しかし、フローサイトメトリー実験におけるＦ７ ｍＡｂによるこれらの細胞の染色によると、最低限のインビトロ発現が示された。腫瘍細胞がインビボで免疫組織化学によりｍＡｂによって染色可能であったが、その腫瘍成長のどのステージでＣＸＣＲ４の発現が開始したかは不明確である。これは、これら２つの細胞系によるＣＸＣＲ４の発現が抗ＣＸＣＲ４治療によるインビボでの腫瘍成長阻害またはアポトーシスの誘発を可能にするのに不十分であったことを示唆している。
実施例１３：抗ＣＸＣＲ４抗体によるインビボでの肺転移の阻害
この実施例では、Ｆ７抗ＣＸＣＲ４ ｍＡｂの肺転移に対する阻害能を、Ｃ５７マウス全身性腫瘍モデルを用いて試験した。より詳細には、０．４×１０６個のＢ１６−ＣＸＣＲ４細胞（ヒトＣＸＣＲ４を発現するように形質移入されたＢ１６細胞）をＣ５７株の３０匹の各マウスに静脈内注射した。マウスを各々がマウス１０匹からなる３つの群に無作為化し、次いでそれを、（ｉ）媒体（ＰＢＳ）、（ｉｉ）ＩｇＧ４アイソタイプ対照（５ｍｇ／ｋｇ）、または（ｉｉｉ）Ｆ７ ＩｇＧ４（５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで治療した。Ｂ１６−ＣＸＣＲ４細胞が静脈内注射されて３０分後、抗体または媒体を腹腔内注射した。１４日目、肺を採取し、肺転移の結節数を定量した。結果は、下記の表５にまとめられ、各群における肺転移の平均数および数の中央値を示す。
結果は、Ｆ７ ｍＡｂによる治療が５６％の肺転移の結節の平均数の低下をもたらす一方でアイソタイプ対照抗体の場合の低下が１５％にすぎなかったことを示し、これは全身性腫瘍モデルにおいてＦ７ ｍＡｂが肺転移を阻害可能であることを示す。

Claims (41)

  1. 細胞表面上に発現されるヒトＣＸＣＲ４に５×１０−８Ｍ以下のＫＤで特異的に結合し、配列番号２５に示されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号２９に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む参照抗体またはその抗原結合部分と同じヒトＣＸＣＲ４上のエピトープに結合する、モノクローナル抗体またはその部分であって、前記モノクローナル抗体またはその部分は、
    （ａ）ヒトＶＨ３−４８生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされる配列番号４９に示されている配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびヒトＶＫＬ１５生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされる配列番号５０に示されている配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
    （ｂ）配列番号９に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む、
    （ｃ）ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのアポトーシスを誘発する、および
    （ｄ）インビボでＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の成長を阻害する、および／またはアポトーシスを誘発する、
    モノクローナル抗体またはその部分。
  2. 配列番号１に示されているアミノ酸配列またはその１つの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５に示されているアミノ酸配列またはその１つの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号９に示されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１３に示されているアミノ酸配列またはその１つの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１７に示されているアミノ酸配列またはその１つの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および／または、配列番号２１に示されているアミノ酸配列またはその１つの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、ただし、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のいずれか１以上に保存的アミノ酸置換を有する、
    を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその部分であって、
    保存的修飾を有する１つ以上のＣＤＲを含む抗体は、未修飾抗体のエピトープ結合特性を保持している、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその部分。
  3. 配列番号２５または４１に示されているアミノ酸配列の１つ以上の保存的修飾を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号２９または４５に示されているアミノ酸配列の１つ以上の保存的修飾を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項２に記載のモノクローナル抗体またはその部分。
  4. 重鎖可変領域配列が、ヒトＶＨ３−４８生殖細胞系遺伝子によりコードされる配列と少なくとも９５％同一である、および／または軽鎖可変領域配列が、ヒトＶＫＬ１５生殖細胞系遺伝子によりコードされる配列と少なくとも９５％同一である、
    請求項１から３のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分。
  5. ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプまたはそれらの抗原結合部分である、請求項１−４のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分。
  6. ＳＤＦ−１のヒトＣＸＣＲ４への結合を阻害する、請求項１−５のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分。
  7. ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束を阻害する、請求項１−６のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分。
  8. ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘発性の遊走を阻害する、請求項１−７のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分。
  9. ヒト臍静脈内皮細胞による毛細管形成を阻害する、請求項１−８のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分。
  10. ＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の転移を阻害する、請求項１−９のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分。
  11. ＣＸＣＲ４＋腫瘍を担持する対象の生存時間を増加させる、請求項１−１０のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分。
  12. ＳＤＦ−１のヒトＣＸＣＲ４への結合を５０ｎＭ以下のＥＣ５０で阻害する、請求項１−１１のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分。
  13. ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束を３ｎＭ以下のＥＣ５０で阻害する、請求項１２に記載のモノクローナル抗体またはその部分。
  14. ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘発性の遊走を５０ｎＭ以下のＥＣ５０で阻害する、請求項１−１３のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分。
  15. （ａ）ＳＤＦ−１のヒトＣＸＣＲ４への結合を阻害し、
    （ｂ）ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束を阻害し、
    （ｃ）ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘発性の遊走を阻害し、および
    （ｄ）ヒト臍静脈内皮細胞による毛細管形成を阻害する、
    請求項１−１４のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分。
  16. ＳＤＦ−１のヒトＣＸＣＲ４への結合を５０ｎＭ以下のＥＣ５０で阻害する、請求項１５に記載のモノクローナル抗体またはその部分。
  17. ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞内でのＳＤＦ−１誘発性のカルシウム流束を３ｎＭ以下のＥＣ５０で阻害する、請求項１５に記載のモノクローナル抗体またはその部分。
  18. ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘発性の遊走を５０ｎＭ以下のＥＣ５０で阻害する、請求項１５に記載のモノクローナル抗体またはその部分。
  19. Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ＦｖおよびｄＡｂ断片、ナノボディおよび一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）から選択される、請求項１−１８のいずれかに記載の抗体部分。
  20. 請求項１−１９のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分および医薬的に許容できる担体を含む組成物。
  21. 治療物質に連結された、請求項１−１９のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分を含む免疫複合体。
  22. 治療物質が細胞毒素または放射性同位体である、請求項２１に記載の免疫複合体。
  23. 請求項２１または２２に記載の免疫複合体および医薬的に許容できる担体を含む組成物。
  24. モノクローナル抗体またはその部分とは異なる結合特異性を有する第２の機能部分に連結された、請求項１−１９のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分を含む二重特異性分子。
  25. 請求項２４に記載の二重特異性分子および医薬的に許容できる担体を含む組成物。
  26. 請求項１−１９のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分をコードする単離核酸。
  27. 請求項２６に記載の核酸を含む発現ベクター。
  28. 請求項２７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  29. 抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合部分を調製するための方法であって、請求項２８に記載の宿主細胞内で前記抗体またはその抗原結合部分を発現するステップと、前記宿主細胞から前記抗体またはその抗原結合部分を単離するステップと、を含む方法。
  30. ＣＸＣＲ４受容体を発現する細胞内でＣＸＣＲ４活性を調節するインビトロでの方法であって、前記細胞を請求項１−１９のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分と前記細胞内でのＣＸＣＲ４活性が調節されるように接触させるステップを含む方法。
  31. 細胞がＣＸＣＲ４を発現する腫瘍細胞であり、かつ方法が前記腫瘍細胞の成長の阻害または前記腫瘍細胞の転移の阻害をもたらす、請求項３０に記載の方法。
  32. 細胞がＣＸＣＲ４を発現するＴ細胞であり、かつ方法がＨＩＶの前記細胞への侵入の阻害をもたらす、請求項３０に記載の方法。
  33. 対象の細胞内のＣＸＣＲ４活性を調節するための医薬組成物の製造のための、請求項１−１９のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分の使用。
  34. 対象の細胞内のＣＸＣＲ４活性を調節するための医薬組成物であって、請求項１−１９のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む、医薬組成物。
  35. 対象の腫瘍細胞の成長または転移を阻害するための医薬組成物の製造のための、請求項１−１９のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分の使用。
  36. 腫瘍細胞が、Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳癌および転移性肺癌から選択される、請求項３５に記載の使用。
  37. ＨＩＶの対象のＴ細胞への侵入を阻害するための医薬組成物の製造のための、請求項１−１９のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分の使用であって、前記ＨＩＶがＴ細胞への侵入のために共受容体としてＣＸＣＲ４を使用する、使用。
  38. 炎症性疾患に罹患している対象において炎症を阻害するための医薬組成物の製造のための、請求項１−１９のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分の使用。
  39. 対象の血管新生を阻害するための医薬組成物の製造のための、請求項１−１９のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分の使用。
  40. 対象における骨髄から末梢血へのＣＤ３４＋幹細胞の動員を刺激するための医薬組成物の製造のための、請求項１−１９のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその部分の使用。
  41. 請求項１−１９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分を含む、対象における骨髄から末梢血へのＣＤ３４＋幹細胞の動員を刺激するための組成物。
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