DE60035369T2

DE60035369T2 - Proteoliposomen, die ein integral membranprotein mit einer oder memhreren transmembrandomänen enthalten

Info

Publication number: DE60035369T2
Application number: DE60035369T
Authority: DE
Inventors: Joseph G. Medford SODROSKI; Tajib Newton MIRZABEKOV
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 1999-12-30
Filing date: 2000-12-27
Publication date: 2008-02-28
Anticipated expiration: 2020-12-28
Also published as: ATE365539T1; CA2395882C; DE60035369D1; ES2288886T3; EP1246607A1; US6761902B2; WO2001049265A1; EP1246607A4; US20010034432A1; CA2395882A1; EP1246607B1

Description

Diese Erfindung wurde von den National Institutes of Health, Grant AI41851, gefördert, und die Regierung der Vereinigten Staaten hat gewisse Rechte an ihr inne.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung zielt auf Proteoliposomen, ihre Konstruktion und ihre Verwendung ab. Vorzugsweise enthält das Proteoliposom ein integrales Membranprotein mit wenigstens einer Transmembrandomäne.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Fortschritte auf dem Genomics-Gebiet haben zur Entdeckung und Identifizierung zahlreicher Proteine geführt. Diese Fortschritte haben es möglich gemacht, Transkripte und DNA zu gewinnen, die für verschiedene Proteine codieren, einschließlich von vermutlichen integralen Membranproteinen mit multiplen Transmembrandomänen, sowie die Proteine selbst. Die Verfügbarkeit derartiger Proteine macht es möglich, Liganden zu identifizieren, die mit diesen Proteinen in Wechselwirkung treten, was es einem ermöglicht, die Biologie dieser Proteine besser zu verstehen und/oder auf Verbindungen zu screenen, die die Funktion solcher Proteine modulieren. Jedoch gibt es zunehmend Probleme bezüglich der Kenntnisse, was ein spezifisches Protein tatsächlich tut und/oder bezüglich des Findens einfacher und genauer Verfahren, die tatsächlich die Liganden, die mit einem bestimmten Protein in Wechselwirkung treten, identifizieren. Zum Beispiel wird ein Protein wie ein Rezeptorprotein, für das noch kein Ligand identifiziert worden ist, als ein „Orphan-Protein" bezeichnet. Solche Orphan-Proteine werden in dem Maße häufiger, in dem mehr DNA-Sequenzen, einschließlich von DNA-Sequenzen, die für vermutete Rezeptoren codieren, verfügbar werden. In diesen Fällen werden die DNA und die Proteine auf der Basis von Homologien mit bekannten Proteinen klassifiziert. Zum Beispiel kann man konservierte Sequenzen erkennen, die einer bekannten Domäne ähneln, wie einer Transmembrandomäne, was anzeigt, dass das identifizierte Protein in einer Membran sitzt (d.h. ein integrales Membranprotein ist).
Transmembranproteine oder integrale Membranproteine sind amphipathisch, d.h. sie haben hydrophobe Domänen, die sich durch die Membran erstrecken und mit den hydrophoben Lipidmolekülen im Inneren der Doppelschicht interagieren, und hydrophile Domänen, die der wässrigen Umgebung auf den beiden Seiten der Membran ausgesetzt sind (z.B. den wässrigen Umgebungen im Inneren und außerhalb der Zelle). Die biologischen Aktivitäten integraler Membranproteine (z.B. die Ligandenbindung) hängen von den hydrophilen Domänen ab; in bestimmten Fällen tragen die sich durch die Membran erstreckenden Bereiche zur Funktion bei.
Wir sind zwar fähig, Proteinbereiche außerhalb von Membranen mit einer gewissen Zuverlässigkeit vorherzusagen, aber die Vorhersage der tatsächlichen Struktur dieser Bereiche und der an sie gebundenen Liganden ist viel schwieriger. Größtenteils ist die Identifizierung natürlicher und unnatürlicher Liganden von integralen Membranproteinen ein empirischer Prozess.
Die Identifizierung von Liganden und die Untersuchung ihrer Bindungseigenschaften sind für integrale Membranproteine komplizierter als für wasserlösliche Proteine. Wasserlösliche Proteine können leicht in wässrigen Puffern gereinigt und unter solchen Bedingungen in einer nativen Konformation gehalten werden. Integrale Membranproteine können nicht in wässrigen Puffern solubilisiert werden, sondern sie müssen in einer Umgebung gehalten werden, die es dem durch die Membran reichenden Abschnitt ermöglicht, hydrophobe Kontakte aufrechtzuerhalten. Das wird am häufigsten erreicht, indem man Detergenzien zum Solubilisierungspuffer gibt. Beim Mischen mit integralen Membranproteinen binden die hydrophoben Bereiche des Detergens die Transmembranregion des Proteins, wobei sie die Lipidmoleküle der Membran verdrängen.
Auch wenn die Solubilisierung von Transmembranproteinen in Detergenzien theoretisch ihre Reinigung ermöglicht, ist es in der Praxis schwierig, diese Proteine auf wirksame Weise von anderen Membranproteinen abzutrennen und gleichzeitig für längere Zeiträume die native Konformation aufrechtzuerhalten. Zum Beispiel kann die Calciumpumpe aus dem sarkoplasmatischen Retikulum nur mit ihrer intakten nativen Struktur isoliert werden, wenn sie im Kontext der Membran des sarkoplasmatischen Retikulums gehalten wird (Zhang et al. (1998), Nature 392: 835-39). Ähnlich konnte eine dreidimensionale Darstellung der H⁺-ATPase der Plasmamembran nur erhalten werden, wenn zweidimensionale Kristalle direkt auf Elektronenmikroskopgittern gezüchtet wurden (Auer et al. (1998), Nature 392: 840-3). Für viele andere Transmembranproteine, einschließlich des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), ist es noch nicht möglich gewesen, das Protein unter Aufrechterhaltung seiner Wildtyp-Konformation über längere Zeiträume im gereinigten Zustand zu halten.
Außerdem ist die Identifizierung der tatsächlichen Liganden, die mit einem derartigen Transmembranprotein interagieren, zwar extrem wichtig, aber mit vielen Schwierigkeiten verbunden. Zum Beispiel muss das Transmembranprotein in der richtigen Konformation vorliegen, um mit Liganden interagieren zu können. Jedoch erhalten die Transmembranproteine ihre Konformation zum Teil dadurch aufrecht, dass sie ein Teil der Zellmembran sind. Die derzeitigen Lösungen für dieses Problem sind weniger als optimal. Für einige integrale Membranproteine, die nur einmal durch die Membran treten, können die extrazellulären und/oder intrazellulären Domänen als unabhängige Einheiten synthetisiert werden, und in einigen Fällen falten sie sich auf die richtige Art und Weise. Das ist allerdings nicht immer der Fall. Außerdem unterscheiden sich die posttranslationalen Modifikationen, die an den löslichen Versionen der extrazellulären oder intrazellulären Domänen vorliegen, häufig von denjenigen des vollständigen membrangebundenen Proteins. Diese Unterschiede können profunde Wirkungen auf die Ligandenbindung oder andere funktionelle Eigenschaften ausüben. Für die überwiegende Zahl der integralen Membranproteine, die mehr als einmal durch die Membran treten, ist nicht einmal diese weniger als ideale Lösung möglich. Typischerweise werden zellbasierte Screens zur Identifizierung interessanter Liganden für diese Proteine eingesetzt. Zelllinien, die das interessante integrale Membranprotein exprimieren, werden etabliert und mit einer parentalen Zelllinie verglichen, die das Protein nicht exprimiert. Jedoch ist es in derartigen Fällen schwierig, das interessante Protein effektiv von den anderen Proteinen, die ebenfalls in der Zellmembran vorliegen, abzutrennen. In vielen Fällen wird das interessante Protein in geringeren Mengen exprimiert als andere integrale Membranproteine. Dadurch kann es zu einer Störung kommen, die dadurch verursacht wird, dass eine Verbindung oder ein Ligand mit einem völlig anderen Protein interagiert. Bei phänotypischen Screens kann es sein, dass ein Protein an einem Schritt eines großen Pathways, an dem mehrere Proteine beteiligt sind, beteiligt ist. In derartigen Fällen kann das Ergebnis des Screeningtests beeinflusst sein, obwohl das interessante Protein nicht direkt beeinflusst ist. Demgemäß wäre es wünschenswert, über ein Verfahren zu verfügen, mit dem man sich ein spezifisches integrales Membranprotein in seiner nativen Konformation ansehen kann, in der es von anderen konkurrierenden Proteinen abgetrennt werden kann.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren („G Protein coupled-receptors", GPCR) mit sieben Transmembranabschnitten machen ungefähr 1-2 % aller Proteine aus, die vom menschlichen Genom codiert werden, und sie sind wichtige Ziele von Pharmazeutika. GPCR haben sieben Transmembrandomänen, und zu ihnen gehören auch Chemokin-Rezeptoren wie CCR5 und CXCR4, die als Kofaktoren für das Eindringen des humanen Immunschwächevirus (HIV) in menschliche Zellen identifiziert wurden. Im Allgemeinen haben die niedrige Expression und die Abhängigkeit der nativen Konformation der GPCR von der hydrophoben Umgebung in der Membran die Untersuchung dieser Proteine verkompliziert. Die Analyse der Wechselwirkungen von Liganden mit GPCR und das Screenen auf Inhibitoren derartiger Wechselwirkungen werden üblicherweise unter Einsatz lebender Zellen oder intakter Zellmembranen durchgeführt. Typischerweise wird die Bindung radioaktiv markierter Liganden an die Zellen oder die Erhöhung intrazellulärer Calciumspiegel durch den Liganden als Parameter in derartigen Screens eingesetzt. Ein signifikanter Nachteil derartiger Tests besteht in der extrem großen Zahl von Zellen, die für ein High-Throughput-Screening benötigt werden. Weiterhin können derartige Untersuchungen durch das Vorliegen zahlreicher Zelloberflächenproteine verkompliziert werden, von denen viele in viel größerer Menge als der interessante GPCR exprimiert werden. Somit sind bestimmte Ansätze, wie die Verwendung der GPCR-exprimierenden Zellen zur Identifizierung entweder natürlicher oder synthetischer Liganden in einer komplexen Mischung, ausgeschlossen. Außerdem ist die Generierung monospezifischer Antikörper gegen einen bestimmten GPCR in der komplexen Umgebung der Zellmembran ineffizient. Weiterhin gilt für einige GPCR, wie die Chemokin-Rezeptoren, dass multiple Liganden an einen einzigen Rezeptor binden, und umgekehrt kann ein einziger Ligand an multiple Rezeptoren binden. Deshalb kann es sein, dass, wenn die Zelle mehr als einen Rezeptor für den untersuchten Liganden exprimiert, die Interpretation der Ergebnisse kompliziert ist.
Herkömmliche Verfahren zur Synthese und Isolierung eines rekombinanten Proteins und die anschließende Testung in verschiedenen Tests haben sich für integrale Membranproteine mit multiplen durch die Membran reichenden Domänen als schwierig erwiesen, da die Proteine im typischen Fall die Wildtyp-Konformation unter Standardbedingungen nicht über längere Zeiträume beibehalten. Zum Beispiel verwendeten Bieri et al. (1997), Nature Biotechnology 17: 1105-1108 einen mit einer Schicht aus einem gemischten, sich spontan anordnenden Lipid-Monolayer bedeckten Sensor-Chip zur Stabilisierung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors (GPCR) Rhodopsin. Im Gegensatz zu den meisten GPCR kann Rhodopsin leicht gereinigt werden, und dessen Funktion ist gut bekannt. Weiterhin wird es in großer Menge exprimiert, und es wird in starken Detergenzien nicht so leicht denaturiert wie andere GPCR. Sogar unter diesen Umständen war das Protein nur für einige Stunden stabil. Weiterhin analysiert das zum Nachweis des Liganden, mit dem es interagiert, eingesetzte Verfahren, die Oberflächen-Plasmonresonanz („Surface Plasmon Resonance", SPR) die Entkopplung der Liganden über Veränderungen des Molekulargewichts des Ligand-Rezeptor-Komplexes. Wenn die Masse des Liganden ungefähr derjenigen der G-Proteine entspricht, wird der Verlust des gekoppelten G-Proteins, der durch die Bindung eines Proteinliganden induziert wird, nur zu einer geringen Veränderung der Gesamtmasse des Komplexes führen und nicht nachgewiesen werden. Somit bleibt für die meisten GPCR die Etablierung zellfreier Systeme für ein Screening auf agonistische und antagonistische Liganden ein schwer erreichbares Ziel.
Dementsprechend wäre es wünschenswert, diese Proteine mit multiplen Transmembrandomänen so zu erzeugen und in gereinigter Form zu isolieren, dass sie ihre Wildtyp-Konformation beibehalten. Es wäre wünschenswert, wenn diese Proteine in ihrer Wildtyp-Konformation über längere Zeiträume gehalten werden können, und zwar unter Bedingungen, die üblicherweise in vivo vorliegen. Es wäre auch wünschenswert, wenn das auf eine große Zahl integraler Membranproteine angewandt werden könnte. Die Reinigung integraler Membranproteine, insbesondere solcher, die mehr als einmal durch die Membran treten, in einer funktionell relevanten Konformation sollte die Suche sowohl nach natürlichen als auch unnatürlichen Liganden, die an diese Proteine binden, erleichtern.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Wir haben nun ein Verfahren zur Expression integraler Membranproteine in großen Mengen und zu ihrer Reinigung und Abtrennung von anderen Proteinen, wobei sie gleichzeitig über längere Zeiträume in ihrer Wildtyp-Konformation gehalten werden, entwickelt.
Vorzugsweise weist das integrale Membranprotein (das manchmal als Transmembranprotein bezeichnet wird) eine Vielzahl von Transmembrandomänen auf. Die bekannten integralen Membranproteine können die Membran nur einmal oder zum Beispiel bis zu 16mal durchqueren. Diese Proteine können auf einfache Weise über die Zahl der Transmembrandomänen klassifiziert werden (Tabelle 1, unten). Zu bevorzugten Proteinen gehören G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR), Ionenkanäle, Aminosäuretransporter, Glucosetransporter, Phosphattransporter, CFTR und Proteine von Komplexen nukleärer Rezeptoren. Vorzugsweise sind die Proteine eukaryotische, bakterielle oder virale Membranproteine. Noch bevorzugter sind die Proteine Membranproteine von Säugetieren.
Das gewünschte Protein ist um ein kurzes Peptid-Epitop-Tag verlängert, zum Beispiel das C9-Tag, das von einem Antikörper erkannt werden kann (zum Beispiel dem 1D4-Antikörper). Das Tag kann an den N-Terminus oder den C-Terminus des Proteins angefügt werden, in Abhängigkeit von der gewünschten letztlichen Orientierung des Proteins im Proteoliposom. Das gewünschte Protein wird in einer Zelle exprimiert. Es kann eine Codon-Optimierung eingesetzt werden, um das Expressionsniveau des Proteins zu erhöhen. Das Protein wird dann aus der Zelle mittels eines Solubilisierungsmittels isoliert, das die Konformation des Proteins bewahrt. Vorzugsweise ist das Solubilisierungsmittel ein Detergens. Zu bevorzugten Detergenzien gehören Alkylglucopyranoside (wie C8CP, C10-M, C12-M, Cymal-5, Cymal-6 und Cymal-7), Alkylsaccharosen (wie HECAMEG), Digitonin, CHAPSO, Hydroxyethylglucamide (wie HEGA-10), Derivate von Oligoethylenglykol (wie C8ES, C8E_n und C12E8), Dodecylmaltopyranosid und Phenylpolyoxyethylene (wie Triton X-100).
Das Detergens-solubilisierte Protein wird dann von den anderen Zelltrümmern über eine Bindung an eine feste Oberfläche (z.B. ein sphärisches oder elliptoides Kügelchen) abgetrennt. Das Kügelchen trägt auf seiner Oberfläche einen Antikörper oder einen anderen spezifischen Liganden, der das Protein auf der Oberfläche des Kügelchens fängt, ausrichtet und konzentriert. Dieses isolierte Protein wird in seiner Wildtyp-Konformation erhalten. Danach wird es mit einer Lipidkomponente gemischt. Man kann auch ein Mittel, das das Lipid anzieht, zur Oberfläche des Kügelchens geben. Zum Beispiel kann das Kügelchen mit Streptavidin beschichtet sein, und eine bestimmte Lipidkomponente (z.B. Biotinyl-DPPE) kann kovalent an das Biotin konjugiert werden. Das Kügelchen mit der Mischung wird dann zur Bildung des Proteoliposoms einem bekannten Verfahren, wie einer Dialyse, unterzogen. Die in diesem Beispiel genannte Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung unterstützt die Haftung der Lipidschicht an der Oberfläche des Kügelchens, wenn das Detergens entfernt wird. Das resultierende Proteoliposom hält das integrale Membranprotein in isolierter und/oder gereinigter Form über längere Zeiträume in seiner nativen Konformation.
Diese Proteoliposomen können als Immunogene zur Auslösung von Immunreaktionen eingesetzt werden. Alternativ können sie zum Screenen von Antikörperbibliotheken auf einen Antikörper eingesetzt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform können die stabilen Proteoliposomen als Antigene für das Screenen von Antikörperbibliotheken, einschließlich von Phage-Display-Antikörperbibliotheken, eingesetzt werden.
Diese Proteoliposomen können auch in Screening-Tests, zum Beispiel bei einem Arzneimittelscreening und zur Identifizierung von Liganden, eingesetzt werden.
Diese Proteoliposomen können auch zur Bestimmung der Struktur des Proteins eingesetzt werden.
Diese Proteoliposomen können auch als ein Impfstoff eingesetzt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 ist eine schematische Darstellung der Erzeugung eines paramagnetischen CCR5-Proteoliposoms. Die Oberfläche nicht-poröser, paramagnetischer Kügelchen wurde kovalent mit Streptavidin und einem Antikörper konjugiert, der das mittels gentechnologischer Verfahren angefügte C-terminale C9-Tag am CCR5 erkennt. Die konjugierten Kügelchen wurden zur Bindung des C9-markierten CCR5 im Zelllysat eingesetzt. Nach einem extensiven Waschen wurden die Kügelchen mit Detergens-solubilisiertem Lipid, das ungefähr 0,1-1 % Biotinyl-DPPE enthielt, gemischt. Bei der Entfernung des Detergens durch Dialyse ordnet sich die Membran der Lipiddoppelschicht spontan um die Kügelchen herum an, und CCR5 wird wieder in seine native Lipidumgebung gebracht.
Die 2A und 2B zeigen die Aufrechterhaltung der nativen Konformation des CCR5 in Puffern, die unterschiedliche Detergenzien enthalten. Ungefähr 4 × 10⁶ [³⁵S]Met/Cysmarkierte Cf2Th/PACH/synCCR5-Zellen wurden in 1 ml eiskaltem Solubilisierungspuffer (100 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 % Glycerol), der mit einer Mischung von Proteaseinhibitoren und 1 % (Gew./Vol.) unterschiedlicher Detergenzien supplementiert war, lysiert. Nach 30minütiger Solubilisierung und 30minütigem Zentrifugieren wurden die geklärten Zelllysate in zwei gleiche Portionen aufgeteilt. Eine Portion wurde mit 2D7 (einem konformationsabhängigen Antikörper gegen CCR5) ausgefällt, und die andere Portion mit 1D4 (einem Antikörper, der das lineare C9-Epitop-Tag erkennt). Man ließ die Präzipitate auf SDS-Polyacrylamid-Gelen laufen, und zwei Parameter wurden untersucht: 1) die Gesamtmenge des mit dem 1D4-Antikörper ausgefällten CCR5 und 2) das Verhältnis des CCR5, das vom 2D7-Antikörper im Vergleich zum 1D4-Antikörper ausgefällt wurde. Die 2A zeigt Präzipitate von Zellen, die in Puffer lysiert wurden, der Cymal^TM-5, DHPC und Fos-Cholin^TM-14 enthielt. Es wurden ähnliche Mengen an CCR5 mit dem 1D4-Antikörper aus diesen Lysaten ausgefällt, aber der prozentuale Anteil des CCR5 mit intakter Konformation variierte (98 % in Cymal^TM-5, 10 % in DHPC und 13 % in Fos-Cholin^TM-14). Die Probe, die man in der rechten Spur (Stern) laufen ließ, war die gleiche wie in der mit 1D4 markierten Spur, aber sie wurde, ehe man sie auf dem Gel laufen ließ, gekocht, ein Verfahren, das zur Bildung von Multimeren des CCR5 mit hohem Molekulargewicht führt. Die 2B zeigt die Mengen an CCR5, die mittels der Antikörper 1D4 (O) und 2D7 (•) aus Zelllysaten, die unterschiedliche Detergenzien enthielten, bei verschiedenen pH-Werten ausgefällt wurden.
Die 3 zeigt die Quantifizierung des durch paramagnetische CCR5-Proteoliposomen-Kügelchen gebundenen Lipids. Ungefähr 10⁸ 1D4/Streptavidin-konjugierte Kügelchen wurden mit CCR5 und unterschiedlichen Lipidmengen rekonstituiert. Die Lipidmischungen enthielten POPC/POPE/DPPA in einem Molverhältnis von 6: 3: 1 sowie 1 Gew.-% von jeweils Biotinyl-DPPE und Rhodamin-DOPE. Die Intensität der Lissamin-Rhodamin-B-Fluoreszenz, die mittels FACS bestimmt wurde, hatte einen Mittelwert von 20 000 Counts. Die gezeigten Messwerte repräsentieren den Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten, wobei die Standardabweichungen angegeben sind. Im Insert ist die Formel gezeigt, mittels derer die ungefähre Masse des Gesamtlipids (m) berechnet wurde, die für die vollständige Verkapselung einer vorgegebenen Anzahl von Kügelchen (n) mit einer Membran aus einer einfachen Lipiddoppelschicht erforderlich war. S ist die ermittelte effektive Oberfläche des Dynal-Kügelchens von 2,5 µm Durchmesser. Die ungefähre Oberfläche (P), die von einem Lipidmolekül in der Doppelschichtmembran besetzt wurde, wurde zu 60 A² angenommen. N_A ist die Avogadro-Zahl, und M ist das mittlere Molekulargewicht der Lipide, die für die Rekonstitution der Membran eingesetzt wurden.
Die 4 zeigt die Zusammensetzung der zellulären Proteine der CCR5-Proteoliposomen. Das mit ³⁵S-Cystein/Methionin markierte Lysat aus Cf2Th-CCR5-Zellen wurde zur Bildung der CCR5-Proteoliposomen verwendet. Ungefähr 3 × 10⁷ CCR5-Proteoliposomen wurden mit SDS-Probenpuffer 1 Stunde bei 55 °C inkubiert und dann auf ein 11 %iges SDS-Polyacrylamid-Minigel geladen, das man unter reduzierenden Bedingungen laufen ließ. Das Gel wurde 1 Stunde mit Enhance (NEN) behandelt, getrocknet und dann einer Autoradiographie unterzogen.
Die 5A-F zeigten mittels konfokaler Mikroskopie erhaltene Aufnahmen fluoreszenzmarkierter CCR5-Proteoliposomen. Mit Ausnahme der Kontrollkügelchen (5A) waren alle Kügelchen mit der POPC/POPE/DMPA-Lipidmischung (in einem Molverhältnis von 6: 3: 1), die 1 % Biotinyl-DPPE enthielt, rekonstituiert worden. (5B) Die Lipidmembran um die CCR5-Proteoliposomen herum wurde mittels des fluoreszierenden Lipids Rho-DOPE sichtbar gemacht, das während der Bildung der Proteoliposomen in einer Konzentration von 1 % zugesetzt worden war. (5D) CCR5-Proteoliposomen wurden mit dem Anti-CCR5-Antikörper 2D7, der mit Phycoerythrin markiert war (2D7-PE), markiert. In einem Kontrollexperiment (5C) wurden CCR5-Proteoliposomen mit einem irrelevanten Antikörper gegen CXCR4, 12G5-PE, behandelt. Kontrollkügelchen, die lediglich die Membran enthielten (5E) und CCR5-Proteoliposomen (5F) wurden mit dem Komplex aus JR-FL gp120-löslichem CD4, dem C11-Antikörper gegen gp120 und Ziege-anti-Mensch-IgG-FITC inkubiert. Die Proben wurden mittels des umgekehrten konfokalen Mikroskops Diaphot 300 von Nikon und der Oncor-Image-Software analysiert.
Die 6A und 6B zeigen die Ligandenbindungseigenschaften von CCR5-Proteoliposomen. Die 6A zeigt die reversible Bindung des konformationsabhängigen Antikörpers 2D7 an CCR5-Proteoliposomen. CCR5-Proteoliposomen wurden 1 Stunde bei 22 °C mit einem irrelevanten Kontrollantikörper, IgG-PE (Kontrolle), oder dem Phycoerythrinkonjugierten 2D7-Antikörper gegen CCR5 (+2D7-PE) inkubiert. Ein Teil der Proteoliposomen mit gebundenem 2D7-PE wurde 15 Minuten in 100 mM Glycin-HCl (pH 3,0) inkubiert, zweimal mit dem gleichen Puffer gewaschen und dann in FACS-Puffer (PBS + 5 % fötales Kälberserum) resuspendiert und mittel FACS (Wash) analysiert. Ein Teil dieser CCR5-Proteoliposomen wurde erneut 1 Stunde bei 22 °C mit 2D7-PE inkubiert und mittels FACS analysiert. Die Ergebnisse zeigen eine im Wesentlichen vollständige erneute Bindung des 2D7-PE-Antikörpers an die säurebehandelten CCR5-Proteoliposomen. Die 6B zeigt die Bindung von ³⁵S-Cystein/Methionin-markiertem gp120 an die CCR5-Proteoliposomen. Äquivalente Mengen des ³⁵S-Cystein/Methionin-markierten gp120-Glykoproteins aus den CXCR4-verwendenden HXBc2-Isolat oder dem CCR5-verwendenden ADA-Isolat wurden mit CCR5-Proteoliposomen in Abwesenheit oder Gegenwart von löslichem CD4 (sCD4) inkubiert. In einem Experiment wurden die CCR5-Proteoliposomen mit dem 2D7-anti-CCR5-Antikörper vor der Inkubation mit den ADA-gp120/sCD4-Komplexen inkubiert. Es sind die an die CCR5-Proteoliposomen gebundenen Proteine gezeigt, wobei die Molekulargewichtsmarker (in kDa) auf der linken Seite angegeben sind.
Die 7 ist eine FACS-Analyse von Cf2Th-Zellen mit oder ohne synCCR5.
Die 8A-D zeigen die Expression von CCR5. Die 8A und 8C zeigen die Expression von CCR5 auf der Zelloberfläche mit einer erhöhten Expression von CCR5 nach Behandlung der Zellen mit Natriumbutyrat (8C). Die 8B zeigt die Expression von CCR5 in Zelllysaten, nachgewiesen über eine Immunpräzipitation oder mittels einer Färbung mit Coomassie-Blau (8D).
Die 9 zeigt die Bindung des 12G5-Antikörpers an CXCR4-Proteoliposomen und CXCR4-exprimierende Zellen. CXCR4-Proteoliposomen wurden wie im Text beschrieben aus Zellen präpariert, die das humane CXCR4 mit einem C-terminalen C9-Tag exprimieren. Es ist die Bindung des 12G5-Antikörpers, der eine konformationsabhängige Struktur auf CXCR4 erkennt, an die CXCR4-exprimierenden Zellen und die CXCR4-Proteoliposomen gezeigt. Die apparente Affinität des 12G5-Antikörpers für das CXCR4 auf der Oberfläche der Proteoliposomen ist mindestens so gut wie die für CXCR4 auf Zellen. Ein ähnliches Ergebnis wurde für den konformationsabhängigen, gegen CXCR4 gerichteten Antikörper FAB173 erhalten (Daten nicht gezeigt).
Die 10 zeigt die Bindung von SDF-1I an CXCR4 auf Zellen und Proteoliposomen. Radioaktiv markiertes SDF-1I, der natürliche Ligand von CXCR4, wurde mit entweder CXCR4-exprimierenden Zellen oder Proteoliposomen, die CXCR4 oder CCR5 trugen, inkubiert. Unmarkiertes (kaltes) SDF-1I wurde in zunehmenden Mengen zugesetzt, und es wurde die an die Zellen oder Proteoliposomen gebundene Menge an radioaktiv markiertem SDF-1I gemessen. Das SDF-1I band mit hoher Affinität an die CXCR4-exprimierenden Zellen und die CXCR4-Proteoliposomen, aber nicht an die CCR5-Proteoliposomen.
Die 11 zeigt eine schematische Darstellung der rekonstituierten gp160-Proteoliposomen.
Die 12A-B zeigen die Analyse der gp160-Proteoliposomen. Die 12A zeigt eine FACS-Analyse der mit Antikörpern, einschließlich von Seren von AIDS-Patienten, gefärbten Proteoliposomen. Die 12B zeigt die Analyse des Proteingehalts der gp160-Proteoliposomen auf SDS-Polacrylamid-Gelen.
Die 13 zeigt die FACS-Analyse von Proteoliposomen mit und ohne eine rekonstituierte Membran. Der Peak A ist eine gp160-Proteoliposomen-Kontrolle, die mit einem humanen FITC gefärbt wurde; der Peak B ist das gp160-Proteoliposom mit einer rekonstituierten Membran, das mit einem Maus-IgG-PE gefärbt wurde; der Peak C umfasst gp160-Glycoproteine auf Kügelchen ohne Membran, die mit einem Maus-IgG-PE gefärbt wurden.
Die 14A-B zeigen mittels FACS generierte Bindungskurven. Die 14A zeigt die mittels FACS generierten Bindungskurven des IgGbl2-Antikörpers an gp160-exprimierende 293T-Zellen oder gp160-Proteoliposomen. Die 14B zeigt die mittels FACS generierten Bindungskurven des Antikörpers C11 an gp160-exprimierende 293T-Zellen oder gp160-Proteoliposomen. Zum besseren Vergleich wurden die Werte auf die maximale Bindung normalisiert.
Die 15A-B zeigen die FACS-Analyse einzelkettiger. Antikörper. Die Färbung der 293T-Zellen, die gp160 exprimieren, ist mit schattierten Peaks dargestellt, und die nicht-exprimierenden Kontrollzellen sind als nicht-schattierte Peaks dargestellt. Die 15A zeigt die Färbung mit dem polyklonalen α-gp120-Mausserum und α-Maus-PE. Die 15B zeigt die Färbung mit einem Bakterienmedium, das Phagen/einzelkettige Antikörper (Verdünnung 1: 2), α-Phagen-Maus-IgG- und α-Maus-PE enthielt.
Die 16 zeigt einen ELISA mit Seren von Mäusen, die mit gp160-Proteoliposomen immunisiert worden waren, und mit Kontrollseren. Seren von Tieren vor der Immunisierung wurden als negative Kontrollseren verwendet. PADRE-Serum bezieht sich auf Mäuse, die zuvor mit gp120-PADRE-Glycoproteinen immunisiert worden waren und als Positivkontrolle dienten.
Die 17A-17B zeigen fluoreszenzmikroskopische Bilder der gp160-Proteoliposomen. Die 17A zeigt die Autofluoreszenz. Die 17B zeigt gp160-Proteoliposomen, die mit einer Lipidpräparation, die 1 % DOPE-Rhodamin enthielt, rekonstituiert worden waren.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wir haben nun ein Verfahren zur Expression integraler Membranproteine in großen Mengen, zu ihrer Reinigung und Abtrennung von anderen Proteinen, wobei sie für längere Zeit in ihrer Wildtyp-Konformation gehalten werden, gefunden. Für das interessierende Protein kann bekannt sein, dass ein integrales Membranprotein ist, oder es kann vermutet werden, dass es ein integrales Membranprotein ist, und zwar aufgrund von Strukturvorhersagen aufgrund der Verteilung hydrophober Aminosäuren. Vorzugsweise hat das integrale Membranprotein multiple Transmembrandomänen. Bevorzugter hat das Protein wenigstens drei Transmembrandomänen. Transmembrandomänen weisen bestimmte und konservierte Eigenschaften auf. Zum Beispiel bestehen die Teile der Polypeptidkette, die in der hydrophoben Umgebung der Zellmembran (z.B. der Lipiddoppelschicht) enthalten sind, im Wesentlichen aus Aminosäureresten mit unpolaren Seitenketten. Um durch die Membran treten zu können, müsste jeder Abschnitt aus hydrophoben Resten 10-25 Aminosäuren lang sein. Das Vorliegen derartiger charakteristischer Aminosäureabschnitte bedeutet, dass die generelle Organisation eines Transmembranproteins oft aus der Verteilung seiner hydrophoben Aminosäuren in einer abgeleiteten Aminosäuresequenz vorhergesagt werden kann. Bei einer Ausführungsform können Proteine mit nur einer Domäne Multimere bilden (z.B. virale Hüll-Lipoproteine). Damit hat das resultierende Protein komplexe Eigenschaften bezüglich seiner Konformation, die durch die Membran bewirkt werden. Die vorliegende Erfindung funktioniert auch gut mit derartigen multimeren Proteinen.
So, wie der Begriff hier verwendet wird, bedeutet „ein längerer Zeitraum" wenigstens 12 Stunden, vorzugsweise wenigstens einen Tag und noch bevorzugter wenigstens eine Woche. Sogar noch bevorzugter bedeutet ein längerer Zeitraum wenigstens einen Monat. Und noch bevorzugter wenigstens zwei Monate.
Es kann jedes beliebige Expressionsverfahren zur Expression des gewünschten integralen Membranproteins in einer Zelle vor seiner Reinigung mittels der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Die Liste integraler Membranproteine, die manchmal auch als Transmembranproteine bezeichnet werden, ist sehr lang. Transmembranproteine können nur einmal oder mehr als 20mal durch die Membran treten. Viele Transmembranproteine assoziieren mit anderen Transmembranproteinen unter Bildung großer Komplexe. Solche Komplexe können aus zwei identischen Untereinheiten (wie Homodimere) oder zwei verschiedenen Protein-Untereinheiten (wie Heterodimere) zusammengesetzt sein. Es gibt Beispiele für sogar noch größere Komplexe aus drei (Natriumionenkanal, Na⁺/K⁺-ATPase), vier (Aquaporin), fünf (Kationenkanäle von nikotinischen Rezeptoren, Anionenkanäle von Glycinrezeptoren) oder mehr (Photoreaktionszentrum, mitochondriale Atmungskette) homologen oder heterologen Untereinheiten.
Transmembranproteine tragen zu einer großen Vielzahl zellulärer Funktionen bei, einschließlich des Transports von Molekülen und Ionen in Zellen oder aus Zellen heraus, der Zellerkennung, der interzellulären Kommunikation und der Zelladhäsion. Ein einfacher Weg zur Klassifizierung von Transmembranproteinen basiert auf ihrer Zahl von Transmembrandomänen (Tabelle 1).
Die Gruppe der Transmembranproteine, die die Membran nur einmal durchqueren (auch bekannt als Single-Pass-Proteine) ist besonders umfangreich, und zwar sowohl strukturell als auch funktionell. Zu dieser Klasse gehört eine große Zahl von Zelloberflächen-Rezeptorproteinen. Zum Beispiel bindet der EGF-Rezeptor den Epidermal Growth Factor, was zur Aktivierung der Tyrosinkinaseaktivität des Rezeptors führt. Andere Beispiele für Single-Pass-Transmembranproteine sind Integrine und Cadherine, die über die Bindung an extrazelluläre Moleküle eine Funktion bei der interzellulären Kommunikation ausüben.
Eine weitere große Klasse von Zelloberflächenrezeptoren bilden die G-Proteingekoppelten Rezeptoren (GPCR), die siebenmal durch die Membran treten. Im Gegensatz zu vielen der Single-Pass-Rezeptoren haben diese Proteine selbst keine enzymatische Aktivität, sind aber stattdessen funktionell mit Signalproteinen, die als G-Proteine bekannt sind, verknüpft. Der Chemokin-Rezeptor CCR5, der als der prinzipielle Korezeptor für HIV-1 dient, ist ein typisches Beispiel für einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor.
Zu weiteren gut untersuchten Mitgliedern dieser Klasse gehören Transducin, das ein Lichtsensor ist, und der Acetylcholin-Rezeptor, der Neurotransmitter an Nervensynapsen bindet.
Aufgrund ihres hydrophoben Inneren ist die Plasmamembran in hohem Maße undurchlässig für die meisten polaren Moleküle, einschließlich kleiner Moleküle wie Ionen, Zucker, Aminosäuren, Nukleotiden und vieler zelluläre Metaboliten. Membrantransportproteine können in zwei generelle Klassen unterteilt werden: a) Carrier-Proteine, die den spezifischen gelösten Stoff, der transportiert werden soll, binden und eine Konformationsänderung durchlaufen, die ihren Durchtritt ermöglicht, und b) Kanalproteine, die es spezifischen gelösten Stoffen, am häufigsten anorganischen Ionen, ermöglichen, die Membran zu durchqueren, wenn sie offen sind und einen Kanal bilden.
Zu gut untersuchten Carrier-Proteinen gehören die ABC-Transporter (die 6mal durch die Membran treten), die gelöste Stoffe sowie ATP binden und bei der Hydrolyse des ATP zu ADP ihre Konformation ändern. Viele Ionenpumpen sind Beispiele für gesteuerte Carrier-Proteine, wie die 10mal durch die Membran tretende katalytische Untereinheit der Calciumpumpe.
Ionen treten auch in Kanalproteinen durch die Membran, die typischerweise so gesteuert sind, dass sie nur als Reaktion auf ein spezifisches Signal (wie eine Veränderung der Membranspannung) geöffnet sind. Beispiele sind einige Kaliumkanäle (z.B. der Kcs-K⁺-Kanal), der zweimal durch die Membran tritt, und spannungsabhängige Kaliumkanäle, wie das Shaker-Protein von Drosophila (das 6mal durch Membran tritt).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Transmembranproteine Hüllproteine. Noch bevorzugter sind die Proteine lentivirale Proteine. Zu den lentiviralen Proteinen können zum Beispiel Proteine des humanen Immunschwächevirus (HIV), des Katzen-Immunschwächevirus (FIC) oder des Visna-Virus gehören. Vorzugsweise ist das Transmembranprotein aus Multimeren der grundlegenden Einheit, wie aus den trimeren Spikes, die von HIV-1- oder HIV-2-Hüllproteinen gebildet werden, zusammengesetzt.
Das lentivirale Protein stammt vorzugsweise von einem Primaten-Lentivirus, noch bevorzugter von einem humanen Immunschwächevirus (HIV-1), z.B. dem HIV-1-gp120 oder dem HIV-1-gp160.
Oligomere Komplexe, die lentivirale Proteine enthalten, können beliebige lentivirale Proteine und beliebige Proteine, die an lentivirale Proteine binden, einschließen. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das Proteoliposom das lentivirale Hüll Glycoprotein und einen zellulären Rezeptor wie CD4. Bei einer weiteren Ausführungsform enthält das Proteoliposom das lentivirale Hüll-Glycoprotein CD4 und einen Chemokin-Rezeptor wie CCR5 oder CXCR4.

Weitere Beispiele für virale Hüllproteine sind zum Beispiel Hüllproteine von Filoviren (wie des Ebola-Virus), Orthomyxoviren (wie des Influenza-Virus), VSV-G, Alphaviren (wie des Semliki-Forest-Virus und des Sindbis-Virus), Arenaviren (wie des lymphozytischen Choriomeningitis-Virus), Flaviviren (wie des Zeckenenzephalitis-Virus und des Dengue-Virus), Rhabdoviren (wie des Vesicular-Stomatitis-Virus und des Tollwut-Virus), des Moloney-Leukämie-Virus, des HSV-, des VZV- und des Mumpsvirus, der Rhinoviren, Masern- und Rubellaviren, des Arbovirus, der Enteroviren (wie der Polio-, Coxsackie- und Echoviren), des Poliovirus, des Coxsackie-B-, -A- und des Echovirus, der Rhinoviren, Hepatitisviren, des Norwalk-Virus, der Astroviren, des Togavirus, der Alphaviren, Pestiviren, des Coronavirus, des Parainfluenzavirus, des Mumpsvirus, des Masernvirus, des Respiratory-Syncytial-Virus (RSV), der Bunyaviridae, Reoviridae, Reoviren, Rotaviren, des HTLV, der Polyomaviren, Papillomviren, Adenoviren, Parvoviren, des EBV, CMV, des Varicella-Zoster-Virus, der Herpesviren und der Poxviren.

Proteinklasse	Spezifisches Beispiel	Zahl der TM-Domänen	Literaturstelle
Rezeptorguanylcyclasen	Spermienrezeptor	1	MBOC S. 759-60
Rezeptortyrosinkinasen	EGF-Rezeptor	1	MBOC S. 759-60
Proteintyrosinphosphatasen	CD45	1	MBOC S. 768
Integrine	Alpha-, Beta-Kette	1	MBOC S. 996-7
Cadherine	E-Cadherin	1	MBOC S. 996-7
Chemotaxis-Rezeptoren einige Kaliumkanäle	Kcs-K⁺-Kanal	2	MBOC S. 775-6
Chemotaxis-Rezeptoren einige Kaliumkanäle	Kcs-K⁺-Kanal	2	Doyle et al.
Connexine		4	MBOC S. 959
Photosynthetisches Reaktionszentrum	L-, M-Untereinheit	5	MBOC S. 498
einige ABC-Transporter spannungsabhängige K⁺-Kanäle	Shaker	6	Reimann & Ashcroft
einige ABC-Transporter spannungsabhängige K⁺-Kanäle	Shaker	6	Reimann & Ashcroft
G-gekoppelte Rezeptoren	Transducin	7
	Chemokin-Rezeptoren	7
	Acetylcholin-Rezeptor	7
Ionenpumpen	Ca⁺⁺-Pumpe, katalytische Untereinheit	10	MBOC S. 516
Ionenpumpen	Na⁺-K⁺-Pumpe, katalytische Untereinheit	10	MBOC S. 516
CIC-Kanäle	CIC-1 des Skelettmuskels	11	Valverde
ABC-Transporter	MDR-ATPase	12	MBOC S. 522
	Peptidpumpe	12	MBOC S. 522
	CFTR	12	MBOC S. 522
Anionentransporter	Band-3-Protein	14	MBOC S.

MBOC: Alberts, B. et al. (1998), Molecular Biology of the Cell, 3. Auflage, Garland Publishing Inc., New York
Doyle, D.A. et al. (1998), Science 280: 69-77
Reimann, F. und Ashcroft, F.M. (1999), Cur. Op. Cell Biol. 11: 503-8
Valverde, M.A. (1999), Cur. Op. Cell Biol. 11: 509-16

Die Sequenzen dieser Proteine sind in der Literatur und in Computerdatenbanken wie Genbank leicht zugänglich. So kann man das Gen, das für ein bestimmtes interessierendes Protein codiert, leicht erhalten. Dieses Gen kann mittels jedes beliebigen Verfahrens exprimiert werden. Zu diesen gehört das Erzeugen einer Expressionskassette, bei der das Gen funktionsfähig mit einem Promotor verknüpft ist. Es sind weitere Enhancer-Elemente bekannt, und sie können ebenfalls verwendet werden. Die Codons, die für die Synthese des interessierenden Proteins eingesetzt werden, können optimiert werden, indem sie in Codons überführt werden, die bevorzugt in Säugerzellen verwendet werden. Die optimalen Codons für die Expression von Proteinen in Nicht-Säugerzellen sind ebenfalls bekannt, und sie können verwendet werden, wenn der Wirt keine Sängerzelle ist (zum Beispiel bei Insektenzellen, Hefezellen, Bakterien).
Das Gen wird dann in eine Zelle eingeführt, um es mittels bekannter Verfahren zu exprimieren. Zu diesen können zum Beispiel Vektoren, Liposomen, nackte DNA, Adjuvansunterstützte DNA, eine Gene-Gun, Katheter etc. gehören. Zu Vektoren gehören chemische Konjugate, Plasmide, Phagen etc. Die Vektoren können chromosomal, nicht-chromosomal oder synthetisch sein. Kommerzielle Expressionsvektoren sind auf diesem Gebiet gut bekannt, zum Beispiel pcDNA3.1, pcDNA4 HisMax, pACH, pMT4, PND etc. Promotoren, die für die Expression des Gens eingesetzt werden können, sind auf diesem Gebiet gut bekannt. Der Promotor wird in Abhängigkeit von der Wirtszelle, in der das Protein exprimiert wird, ausgewählt. Zu den Promotoren gehören der Intermediate-Early-Promotor des Cytomegalovirus (CMV), ein virales LTR wie das LTR des Rous-Sarkom-Virus, das HIV-LTR, das HTLV-1-LTR, der Early Promotor des Simian-Virus 40 (SV40), der lac-UV5-Promotor von E. coli und der Promotor des Herpes-Simplex-tk-Virus.
Zu bevorzugten Vektoren gehören virale Vektoren, Fusionsproteine und chemische Konjugate. Zu retroviralen Vektoren gehören Moloney-Mausleukämie-Viren. Zu anderen Vektoren gehören Pocken-Vektoren wie die Orthopox- oder Avipox-Vektoren, Herpesvirus-Vektoren wie der Herpes-simplex-I-Virus (HSV)-Vektor (Geller, A.I. et al. (1995), J. Neurochem. 64: 487, Lim, F. et al. (1995) in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Hrsg., Oxford Univ. Press, Oxford, England, Geller, A.I. et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7603, Geller, A.I. et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1149), Adenovirus-Vektoren (LeGal LaSalle et al. (1993), Science 259: 988, Davidson et al. (1993), Nat. Genet. 3: 219, Yang et al. (1995), J. Virol. 69: 2004) und Vektoren adenoassoziierter Viren (Kaplitt, M.G. et al. (1994), Nat. Genet. 8: 148).
Die Wahl des jeweiligen Vektors hängt von der eingesetzten Wirtszelle ab.
Die Einführung des Gens in die Wirtszelle kann mittels Standardverfahren erfolgen, zum Beispiel über eine Infektion, Transfektion, Transduktion oder Transformation. Beispiele für Arten des Gentransfers sind nackte DNA, eine CaPO₄-Präzipitation, DEAE-Dextran, eine Elektroporation, Protoplastenfusion, Lipofektion, eine Mikroinjektion in Zellen und virale Vektoren.
Es kann ein antigenisches Tag in das Protein eingefügt werden, um die Reinigung und die Ausrichtung des Proteins auf der festen Oberfläche zu unterstützen. Vorzugsweise liegt das Tag entweder am N-terminalen Ende oder am C-terminalen Ende des Proteins vor. Das Tag hat vorzugsweise eine Länge von 6 bis 15 Aminosäuren, noch bevorzugter von ungefähr 6 bis 9 Aminosäuren. Die Auswahl des Tags und die Einführung seiner codierenden Sequenz in das für das Protein codierende Gen erfolgen so, dass die gesamte Konformation oder Funktion des Proteins nicht beeinflusst wird. Zu den Tags können HA, Polyoma, C9, FLAG etc. gehören.
Die Zelle, die das integrale Membranprotein exprimiert, wird dann in einem Puffer mit dem geeigneten Detergens und Proteaseinhibitoren lysiert, so dass das Protein von anderen Zelltrümmern mittels herkömmlicher Verfahren ohne eine Schädigung des Proteins abgetrennt werden kann.
Generell können Transmembranproteine aufgrund ihrer amphipathischen Eigenschaften nur durch Mittel solubilisiert werden, die hydrophobe Wechselwirkungen aufheben und die Lipiddoppelschicht der Membran zerstören. Die typischerweise verwendeten Agenzien sind kleine amphipathische Moleküle, die dazu neigen, in Wasser Mizellen zu bilden. Vorzugsweise ist das Mittel ein Detergens. Wenn es mit Membranen gemischt wird, binden die hydrophoben Bereiche des Detergens an die Transmembrandomäne von Proteinen und verdrängen die Lipidmoleküle. Die polaren Enden der Detergenzien können entweder geladen (ionisch) oder ungeladen (nichtionisch) sein. Integrale Membranproteine können zwar in einer Detergenslösung in einer nativen Konformation erhalten werden, aber mit der Zeit denaturieren und aggregieren viele der so solubilisierten Proteine.
Wenn ein Detergens in Abwesenheit von Phospholipid aus einem Transmembranprotein-Detergens-Komplex entfernt wird, denaturieren die Membranproteine im Allgemeinen, sie aggregieren und fallen aus der Lösung aus. Wenn das gereinigte Protein jedoch, ehe das Detergens entfernt wird, mit Phospholipid gemischt wird, kann sich das aktive Protein in die von den Phospholipiden gebildete Lipiddoppelschicht einfügen. Auf diese Weise können funktionell aktive Membranproteine aus gereinigten Komponenten rekonstituiert werden. Ein integrales Membranprotein, das auf geeignete Weise in seine native Lipidumgebung rekonstituiert wurde, ist für längere Zeit stabil.
Außerdem ist die Wahl des Detergens, das zur Solubilisierung des Proteins eingesetzt wird, ein kritischer Faktor für die Aufrechterhaltung einer funktionellen Konformation eines Membranproteins während seiner Reinigung. Das für ein gegebenes Membranprotein am besten geeignete Detergens wird typischerweise empirisch ermittelt. Wenn das Protein zuvor untersucht wurde, werden erfolgreiche Detergenzien der Literatur zu entnehmen seien. Außerdem kann man bei der Bestimmung von Detergenzien, die mit anderen Proteinen erfolgversprechend sind, auf die Ergebnisse zurückgreifen, die mit verwandten Proteinen erhalten wurden. Somit geht aus der Forschung über ein verwandtes Protein die Art des Detergens hervor, das höchstwahrscheinlich das Protein in aktiver Form extrahiert.
Detergenzien können in Abhängigkeit von der Art ihrer polaren Enden generell in die Gruppen nichtionisch, zwitterionisch und ionisch eingeteilt werden. Starke ionische Detergenzien (wie SDS) können die meisten Membranproteine solubilisieren, aber sie neigen dazu, das Protein in diesem Prozess zu entfalten, was sie für die Rekonstituierung aktiver Konformationen weniger nützlich macht. Im Allgemeinen werden mildere nichtionische Detergenzien bevorzugt.
Zu Detergenzien, die für eine sanfte Solubilisierung von Membranproteinen empfohlen werden, gehören Alkylglucopyranoside (wie C8-GP und C9-GP), Alkylthioglucopyranoside (wie C8-tGP, C10-M, C12-M, Cymal-5, Cymal-6 und Cymal-7), Alkylsaccharosen (wie HECAMEG), Digitonin, CHAPSO, Hydroxyethylglucamide (wie HEGA-10), Oligoethylenglykol-Derivate (wie C8E5, C8En und C12E8), Dodecylmaltopyranosid und Phenylpolyoxyethylene (wie Triton X-100).
Zu bevorzugten Detergenzien gehören Alkylthioglucopyranoside, Dodecylmaltopyranosid und Phenylpolyoxyethylene, bevorzugter Cymal-5, Cymal-6, Cymal-7, HEGA-10, Digitonin, CHAPSO, Dodecylmaltopyranosid und Triton X-100, und noch bevorzugter Cymal-5, Cymal-6, Cymal-7, CHAPSO und Dodecylmaltopyranosid.
Es sind auch kommerzielle Kits für die Hilfe bei der Auswahl eines für ein gegebenes Membranprotein geeigneten Detergens verfügbar. Zum Beispiel bieten sowohl Anatrace als auch Calbiochem verschiedene Kits an, die Mischungen verschiedener Detergenzien enthalten.
Es gibt viele bekannte Beispiele für Detergenzien, die erfolgreich zur Reinigung funktionell aktiver Membranproteine eingesetzt wurden. Zum Beispiel wurde Decylmaltosid zur Reinigung des K⁺-Kanals (KscK⁺) aus Streptomyces lividans eingesetzt, was es ermöglichte, seine Struktur mittels Röntgenkristallographie zu bestimmen (Doyle et al., Science (1998) 280: 69-77). Cymal-5, Cymal-6, Cymal-7, CHAPSO und Dodecylmaltopyranosid sind bevorzugte Detergenzien für GCPR, bevorzugter für Chemokin-Rezeptoren (Mirzabekov, T. et al. (1999), J. Biol. Chem. 274: 28745-50).
Das geklärte Zelllysat, das alle solubilisierten Membranproteine und anderen wasserlöslichen zellulären Proteine enthält, kann mittels herkömmlicher Verfahren von den Zelltrümmern abgetrennt werden. Zum Beispiel mittels einer Ultrazentrifugation, beispielsweise bei 150 000 × g. Antikörper, die gegen das Epitop-Tag auf dem interessierenden Protein gerichtet sind, wurden zur Abfangung des Proteins aus dem Zelllysat mittels eines festen Trägers (z.B. Kügelchen) eingesetzt. Nach der Bindung der solubilisierten integralen Membranproteine an die auf dem festen Träger immobilisierten Antikörper wird der feste Träger gewaschen. Danach wird die gereinigte Mischung aus Detergens und Protein wie unten beschrieben in ein Proteoliposom überführt.
Das Proteoliposom hat eine sphärische oder elliptoide Form wie ein Kügelchen oder ein anderes Pellet. Vorzugsweise hat das Kügelchen oder Pellet wenigstens ungefähr 15 % der Größe einer eukaryotischen Zelle; bevorzugter hat es wenigstens ungefähr 20 % der Größe einer solchen Zelle, und noch bevorzugter hat es wenigstens ungefähr 25 % der Größe einer solchen Zelle. Die Form ist dreidimensional, so dass sie auf allen Seiten beschichtet werden kann. Die genaue Form, die eingesetzt wird, kann jedoch beträchtlich variieren. Die genaue Form, die gewählt wird, hängt von der Art ab, auf die das Proteoliposom eingesetzt wird. So sind bei bestimmten Ausführungsformen Flocken den Kügelchen vorzuziehen, zum Beispiel bei einem Immunogen, und in anderen Fällen kann ein dickeres Ellipsoid vorzuziehen sein.
Die sphärische oder elliptoide Form, z.B. das Kügelchen, wird vorzugsweise mit einer Substanz beschichtet, die hilft, eine Lipidschicht anzuziehen und zu verankern. Das ist jedoch nicht notwendig. Zum Beispiel kann man eine Verbindung wie Streptavidin oder Avidin dazu verwenden, die sphärische oder elliptoide Form, wie ein Kügelchen, zu beschichten, und eine geringe Menge eines biotinylierten Lipids zur Lipidmischung geben. Zum Beispiel kann man ein Kopfgruppen-modifiziertes synthetisches Lipid, wie Dipalmitoylphosphoethanolamin-N-Biotinyl (Biotinyl-DPPE) oder Dioleylphosphoethanolamin-Lissamin-Rhodamin-B (Rho-DOPE) in einer Lösung mit Lipiden einsetzen. Eine derartige Mischung bildet eine stabile, gleichmäßige Beschichtung zum Beispiel auf einem Streptavidin-beschichteten Kügelchen.
Die sphärische oder elliptoide Form (wie ein Kügelchen) hat auch einen Verankerungsliganden, wie einen an sie gebundenen Antikörper, der spezifisch entweder das antigenische Tag oder einen bekannten spezifischen Abschnitt des integralen Membranproteins, das an das Kügelchen gebunden werden soll, bindet, wodurch das Protein ausgerichtet wird. Die Lipidlösung, die biotinyliertes Lipid enthält, wird zu den Kügelchen mit dem gebundenen interessierenden Protein gegeben. Danach wird das Detergens langsam mittels bekannter Verfahren entfernt, zum Beispiel durch eine Dialyse von wenigstens 24 Stunden. Das resultierende Proteoliposom, das das integrale Membranprotein enthält, ist für einen längeren Zeitraum stabil. So, wie der Begriff hier verwendet wird, bedeutet ein „längerer Zeitraum" wenigstens 12 Stunden, bevorzugter wenigstens einen Tag, noch bevorzugter wenigstens eine Woche, noch bevorzugter wenigstens einen Monat und sogar noch bevorzugter wenigstens zwei Monate. Nicht nur wird das Protein seine Konformation für längere Zeiträume in diesem Proteoliposom beibehalten, sondern es wird es auch unter verschiedensten Bedingungen, wie bezüglich des pH und der Temperatur, tun.
Vorzugsweise ist die eingesetzte sphärische oder elliptoide Oberfläche ein magnetisches Kügelchen. Magnetkügelchen sind in diesem Gebiet gut bekannt und können kommerziell bezogen werden, zum Beispiel tosylaktivierte Dynabeads^® M (Bikker, J.A., Trumpp-Kallmeyer, S. und Humblet, C. (1998), J. Med. Chem. 41: 2911-2927) (Dynal Inc., Lake Success, New York). Diese sind besonders für die Unterstützung der Reinigung des Proteins nützlich. Man kann solche Proteoliposomen als Zwischenprodukte einsetzen und das stabilisierte Proteoliposom auf eine andere Oberfläche transferieren, zum Beispiel eine Flocke. Wenn das Proteoliposom für eine Injektion in ein Individuum eingesetzt wird, wird es vorgezogen, dass die Oberfläche aus einem biologisch abbaubaren Material besteht.
Das Proteoliposom wird zwar typischerweise nur das interessierende integrale Membranprotein enthalten, aber es gibt Fälle, in denen es sein kann, dass man mehr als ein Protein verwenden möchte. Zum Beispiel ist bekannt, dass der Chemokin-Rezeptor CCR5 mit dem Protein CD4, das nur einmal durch die Membran tritt, bei der Wechselwirkung mit dem HIV-gp120-Protein kooperiert. Somit kann man Proteoliposomen präparieren, die CD4 sowie das Hüll-Glycoprotein enthalten. Bei einer weiteren Ausführungsform können sowohl CCR5 und CD4 als auch das Hüll-Glycoprotein vorliegen. Das kann leicht dadurch erreicht werden, dass die Proteine mit dem gleichen Epitop-Tag am C-Terminus markiert werden und Kügelchen mit dem geeigneten Antikörper, der mit dem Tag reagiert, präpariert werden. Alternativ können die Proteine mit unterschiedlichen Tags markiert werden, und man kann Kügelchen präparieren, die Mischungen unterschiedlicher Antikörper aufweisen. Das würde es ermöglichen, die Verhältnisse der beiden Proteine im Proteoliposom zu variieren.
Die verwendeten integralen Membranproteine weisen vorzugsweise eine Vielzahl von Transmembrandomänen auf. Zu bevorzugten Proteinen gehören GPCR (wie Chemokin-Rezeptoren), Ionenkanäle, Aminosäuretransporter, Glucosetransporter, Phosphattransporter, Transport-ATPasen, CFTR und Proteine aus Komplexen nukleärer Rezeptoren. Bevorzugte Ionenkanäle, wie Kaliumkanäle, Calciumkanäle und Chloridkanäle, Aquaporin-Kanäle, intrazelluläre Organellen, wie der mitochondriale Porinkanal oder VDAC, der Calciumkanal des endoplasmatischen Retikulums, der Porinkanal des Chloroplasten und die Porinkanäle von Bakterien. Vorzugsweise sind die Proteine eukaryotische, bakterielle und virale Membranproteine. Bevorzugter stammen die Proteine von Säugetieren.
Die stabilen Proteoliposomen können unter Verwendung von Kits erzeugt werden. Ein bevorzugter Kit enthält Ampullen, die Reagenzien enthalten, um die Lipidmembran zu bilden, einen Behälter, der sphärische und Ellipsoid-Formen enthält, vorzugsweise Detergenzien zum Extrahieren des Proteins von Interesse und noch weiter bevorzugt Reagenzien, um Zellen zu erhalten, die das Protein von Interesse exprimieren. Ein Kit enthält vorzugsweise Anweisungen für die Herstellung der Proteoliposomen.
Die stabilisierten Proteoliposomen können in einer Vielzahl unterschiedlicher Verfahren eingesetzt werden.
Zum Beispiel kann man aufgrund der Homogenität des rekonstituierten Proteins die Proteoliposomen für eine Charakterisierung der Struktur des rekonstituierten Proteins verwenden.
Man kann hohe Konzentrationen des Proteins auf dem Kügelchen erzielen. Auf diese Weise kann man das Proteoliposom als ein Immunogen für die Gewinnung von Antikörpern gegen die native Konformation des Proteins einsetzen. Man kann die Proteoliposomen zur Gewinnung von Antikörpern gegen unterschiedliche Epitope, die von unterschiedlichen Konformationen eines Proteins exponiert werden, verwenden. Zum Beispiel kann sich ein Protein zu verschiedenen unterschiedlichen multimeren Komplexen anordnen, und zwar zum Beispiel in Abhängigkeit von der Verfügbarkeit unterschiedlicher Bindungspartner. Proteoliposomen, die unterschiedliche Komplexe tragen, können als Immunogene eingesetzt werden, wodurch Antikörper gegen unterschiedliche Epitope auf einem einzigen Protein, die in Abhängigkeit von seiner Bindung an andere Proteine differenziell exponiert werden, generiert werden.
Die Proteoliposomen können zur Gewinnung und auch zur Identifizierung verschiedener Antikörper eingesetzt werden, zum Beispiel von Antikörpern gegen gp120 und gp41. Zum Beispiel kann direkt auf Antikörper, die die Wechselwirkung mit den Rezeptor-bindenden Stellen beeinflussen, gescreent werden, beispielsweise über den Einsatz eines direkten Bindungstests. Zum Beispiel kann man einen radioaktiven oder fluoreszierenden Marker zur Markierung des gp120-Proteoliposoms einsetzen und lösliches CD4 zugeben, oder bevorzugter ein Proteoliposom, das CD4 enthält. Es sind verschiedene lösliche CD4 auf diesem Gebiet bekannt, einschließlich einer Version mit zwei Domänen (D1D2 sCD4) und einer mit vier Domänen. Die CD4-Proteoliposomen können zum Medium gegeben werden, das das gp120-Proteoliposom enthält, und es kann auf einen Antikörper gescreent werden, der die Bindung zwischen den beiden Proteoliposomen blockiert. Bei einem weiteren Beispiel kann das Proteoliposom sowohl gp120 als auch CD4 enthalten, und man kann sich die Wechselwirkungen mit CCR5 ansehen. Alternativ würde man, wenn man ein Derivat eines T-Zell-trophischen gp120 ansieht, ein CXCR4-haltiges Proteoliposom verwenden. Die Bindung kann dann direkt gemessen werden. Der interessierende Antikörper kann vor oder nach der Zugabe des markierten Proteoliposoms zugesetzt werden, und die Wirkung des Antikörpers auf die Bindung kann bestimmt werden, indem das Ausmaß der Bindung in dieser Situation mit derjenigen eines Kontroll-Standards des Proteoliposoms in Abwesenheit des Antikörpers verglichen wird.
Ein bevorzugter Test setzt das markierte Proteoliposom ein, das zum Beispiel ein gp120-Trimer enthält, das von einem M-trophischen Stamm wie JR-FL stammt und iodiert ist, zum Beispiel mittels einer Festphasen-Lactoperoxidase (wobei es in einem Beispiel eine spezifische Aktivität von 20 µCi/µg hat). Das den Chemokin-Rezeptor enthaltende Proteoliposom würde in diesem Beispiel CCR5 enthalten. Lösliches CD4 könnte vorhanden sein.
Derivate von gp120
Das Proteoliposom kann verschiedene Derivate von gp120 enthalten.
Bei einer Ausführungsform besteht das gp120-Trimer aus gp120 ohne den variablen Bereich oder aus gp125, wie es in den US-Patenten Nr. 5 858 366 und 5 817 316 beschrieben wurde. Zum Beispiel sollte der konformationelle gp120-Teil eine ausreichende Anzahl von Aminosäureresten enthalten, so dass die Bindungsstelle des gp120 für den Chemokin-Rezeptor definiert ist (z.B. die Reste 415-425 und die V3-Schleife), sowie eine ausreichende Anzahl von Aminosäureresten, um die Konformation des Peptids in einer Konformation zu halten, die bezüglich der Bindungsstelle für den Chemokin-Rezeptor angenähert derjenigen des an das lösliche CD4 gebundenen Wildtyp-gp120 ist. Bei anderen Ausführungsformen kann die V3-Schleife zur Entfernung maskierender Aminosäurereste entfernt werden. Zur Aufrechterhaltung der Konformation der Polypeptids kann man Linkerreste einfügen, die potenzielle Knicke in der Polypeptidstruktur ermöglichen, beispielsweise Aminosäurereste wie Gly, Pro und Ala. Gly wird bevorzugt. Vorzugsweise ist der Linkerrest so klein wie möglich, damit die Gesamtkonfiguration beibehalten wird. Er sollte typischerweise kleiner als die Zahl der Aminosäurerest im variablen Bereich, der deletiert ist, sein. Vorzugsweise weist der Linker 8 Aminosäurereste oder weniger auf, bevorzugter 7 Aminosäurereste oder weniger. Sogar noch bevorzugter weist die Linkersequenz 4 Aminosäurereste oder weniger auf. Bei einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Linkersequenz aus einem Rest. Vorzugsweise ist der Linkerrest Gly.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält der gp120-Anteil auch eine Bindungsstelle für CD4 (z.B. die Reste 368 und 370 der C3-Region und die Reste 427 und 457 der C4-Region). Die Chemokin-Bindungsstelle ist eine diskontinuierliche Bindungsstelle, die Teile der C2-, C3-, C4- und V3-Regionen einschließt. Durch die Deletion nicht-essenzieller Teile des gp120-Polypeptids – wie Deletionen von Teilen der nicht-essenziellen variablen Bereiche (z.B. V1/V2) oder von Teilen der konstanten Bereiche (z.B. C1, C5) – kann man die Exposition der CD4-Bindungsstelle erhöhen. Eine weitere Ausführungsform zielt auf einen gp120-Teil ab, der eine Chemokin-Bindungsstelle enthält. Ähnlich kann man durch das Deletieren der nicht-essenziellen Teile des Proteins die Exposition der Chemokin-Bindungsstelle erhöhen. Die erhöhte Exposition verstärkt die Fähigkeit zur Generierung eines Antikörpers gegen den CD4- Rezeptor oder den Chemokin-Rezeptor, durch den der Eintritt von Viren gehemmt wird. Die Entfernung dieser Bereiche erfolgt, während es gleichzeitig erforderlich ist, dass das Derivat eine Gesamtkonformation beibehält, die derjenigen des Wildtyp-Proteins bezüglich der nativen gp120-Bindungsstelle annähernd ähnlich ist, z.B. der Chemokin-Bindungsstelle, wenn es als Komplex mit CD4 vorliegt. Außerdem kann man Glycosylierungsstellen entfernen, die für eine richtige Faltung entbehrlich sind. Die Aufrechterhaltung der Konformation kann über die Verwendung der oben beschriebenen Linkerreste erreicht werden, die potenzielle Knicke in der Struktur des gp120-Derivats für die Aufrechterhaltung der gesamten dreidimensionalen Struktur ermöglichen. Zu bevorzugten Aminosäureresten, die als Linker eingesetzt werden können, gehören Gly und Pro. Andere Aminosäuren können ebenfalls als Teil des Linkers eingesetzt werden, zum Beispiel Ala. Beispiele dafür, wie derartige Peptide hergestellt werden, werden vollständiger bei Wyatt, R. et al., J. Virol. 69: 5723-5733, 1995, Thali, M. et al., J. Virol. 67: 3978-3988, 1993, und in den US-Patenten Nr. 5 858 366 und 5 817 316 beschrieben, die hier mit der entsprechenden Literaturangabe aufgenommen werden.
Ein alternatives gp120-Derivat ist eines, bei dem die verwendeten Linker zu einer solchen Konformation des Derivats führen, dass die diskontinuierliche Bindungsstelle für den Chemokin-Rezeptor in etwa die Konformation der diskontinuierlichen Bindungsstelle für den Chemokin-Rezeptor im Komplex aus Wildtyp-gp120/CD4 annimmt. Diese Derivate können leicht von einem Fachmann auf diesem Gebiet auf der Basis der oben beschriebenen Verfahren hergestellt und in den hier vorgestellten Tests gescreent werden, um sicherzustellen, dass eine richtige Bindung erhalten wird.
Bei einer Ausführungsform ist wenigstens eine Stelle für die Anfügung eines Zuckers deletiert. Vorzugsweise liegt die Stelle für die Zuckeranfügung in der Nähe des koformationellen Epitops. Das kann mittels bekannter Verfahren erreicht werden. Zum Beispiel kann die Aminosäure deletiert werden. Bei einer Ausführungsform kann diese deletierte Aminosäure durch einen anderen Rest ersetzt werden, der keine Stelle für die Anfügung eines Zuckers mehr darstellt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform können multiple Stellen für die Anfügung von Zuckern deletiert sein. Bei einer bevorzugteren Ausführungsform können die Stellen für die Zuckeranfügung von den Monomeren mit deletierter variabler Schleife deletiert sein.
Generierung von Antikörpern
Die Proteoliposomen können zur Bewirkung einer Immunreaktion in einem Wirt mittels Standardverfahren eingesetzt werden. Zum Beispiel kann man das Proteoliposom in einem Adjuvans verabreichen.
Das Proteoliposom wird vorzugsweise mit einem Adjuvans verabreicht. Adjuvantien sind in diesem Gebiet gut bekannt, und zu ihnen gehören Aluminiumhydroxid, das Ribi-Adjuvans etc. Vorzugsweise umfasst das Proteoliposom ein biologisch abbaubares Material.
Man kann diese Proteoliposomen Individuen auf verschiedenen Wegen verabreichen. Zum Beispiel können sie in Vaginalschäumen oder Gelen enthalten sein, die in Verhütungsmitteln zur Verhinderung einer Infektion enthalten sind und angewandt werden, ehe die Personen einen sexuellen Kontakt haben.
Die Proteoliposomen werden, wenn sie für eine Verabreichung eingesetzt werden, unter aseptischen Bedingungen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel hergestellt.
Die Dosierungen der pharmazeutischen Zusammensetzungen variieren in Abhängigkeit vom Subjekt und von der jeweiligen Art der Verabreichung. Die Dosierungen können von 0,1 bis 100 000 µg/kg pro Tag reichen, bevorzugter von 1 bis 10 000 µg/kg.
Zu den Verabreichungswegen gehören eine orale, parenterale, rektale, intravaginale, topische, nasale und ophthalmische Verabreichung, eine direkte Injektion etc.
Eine beispielhafte pharmazeutische Zusammensetzung ist eine therapeutisch wirksame Menge eines Oligomers, Antikörpers etc., die zum Beispiel die Fähigkeit des Rezeptors zur Erleichterung einer HIV-Infektion beeinflusst oder die eine Immunreaktion bewirken und dadurch als prophylaktisches Immunogen wirken kann, und die gegebenenfalls in einem pharmazeutisch annehmbaren und kompatiblen Träger enthalten ist. Der Begriff „pharmazeutisch annehmbarer und kompatibler Träger", wie er hier verwendet wird und weiter unten genau beschrieben wird, schließt ein oder mehrere kompatible(s) feste(s) oder flüssige(s) Verdünnungsmittel oder Verkapselungssubstanz(en) ein, das bzw. die für die Verabreichung an einen Menschen oder ein anderes Tier geeignet ist bzw. sind. In der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „Träger" somit einen organischen oder anorganischen Inhaltsstoff, natürlich oder synthetisch, mit dem die erfindungsgemäßen Moleküle zur Erleichterung der Verabreichung kombiniert werden können. Der Begriff „therapeutisch wirksame Menge" bezeichnet diejenige Menge der vorliegenden pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein erwünschtes Ergebnis hervorruft oder einen gewünschten Einfluss auf die jeweils behandelte Erkrankung hat, zum Beispiel die Menge, die für die Hervorrufung einer Immunreaktion zur Bereitstellung eines prophylaktischen Schutzes erforderlich ist. Typischerweise wird, wenn die Zusammensetzung als ein prophylaktisches Immunogen verwendet wird, wenigstens eine „Boosterung" in einem regelmäßigen Abstand nach der anfänglichen Verabreichung verabreicht werden. Es können bei der Herstellung von Zusammensetzungen, die den gleichen Inhaltsstoff enthalten, verschiedene Konzentrationen verwendet werden, um Variationen bezüglich des Alters des zu behandelnden Patienten, der Schwere der Erkrankung, der Dauer der Behandlung und der Art der Verabreichung bereitzustellen.
Bei einem bevorzugten Immunisierungsverfahren würde man mit einem Proteoliposom primen, das ein gp120-Trimer mit deletierter variabler Schleife enthält, und dann mit einem Proteoliposom boostern, das ein gp120-Trimer enthält, das stärker dem viralen Wildtyp des Glycoproteins angenähert ist, und schließlich wurde eine abschließende Boosterung mit Proteoliposomen durchgeführt, die das stabilisierte Wildtyp-Trimer enthalten. Zum Beispiel würde, wenn multiple variable Bereiche und Stellen für die Anfügung von Zuckern aus dem für das Primen eingesetzte Trimer deletiert sind, die nächste Boosterung mit einem Trimer erfolgen, bei dem mehr Aminosäuren des variablen Bereichs vorliegen und/oder Stellen für die Anfügung von Zuckern vorliegen. Jede Boosterung nähert sich der Wildtyp-Konfiguration stärker an, bis diese Konfiguration erreicht ist.
Die Dosierungen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen variieren in Abhängigkeit vom Subjekt und vom jeweils eingesetzten Verabreichungsweg. Die Dosierungen können von 0,1 bis 100 000 µg/kg pro Tag reichen, bevorzugter von 1 bis 10 000 µg/kg. Es könnte, um nur ein Beispiel zu nennen, ein Bereich der Gesamtdosis von zum Beispiel ungefähr 1 µg bis ungefähr 300 µg für die Anwendung am Menschen eingesetzt werden. Diese Dosis kann in periodischen Abständen in Abhängigkeit von der Zusammensetzung zugeführt werden, zum Beispiel an wenigstens zwei verschiedenen Zeitpunkten, die vorzugsweise ungefähr 4 Wochen auseinander liegen. Bei der Ausführungsform, bei der das Prime das Proteoliposom ist, das die gp120-Trimere mit deletierter variabler Schleife enthält, und die Boosterung mit Proteoliposomen, die natives gp120 enthalten, oder mit nativem gp120 erfolgt, wird es derzeit bevorzugt, eine Reihe von wenigstens 2 Boosterungen, vorzugsweise 3 bis 5 Boosterungen, die über ein Jahr verteilt sind, einzusetzen. Andere Verbindungen könnten täglich verabreicht werden. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können einem Subjekt auch gemäß einer Vielzahl anderer, gut charakterisierter Protokolle verabreicht werden. Zum Beispiel können zu bestimmten derzeit akzeptierten Immunisierungsschemata die folgenden gehören: (i) Die Verabreichungszeiten umfassen eine erste Dosis zu einem gewählten Zeitpunkt, eine zweite Dosis einen Monat nach der ersten Dosis und eine dritte Dosis an einem späteren Zeitpunkt, z.B. 5 Monate nach der zweiten Dosis, siehe Product Information, Physician's Desk Reference, Merck Sharp & Dohme (1990), S. 1442-43 (z.B. das Protokoll für den Impfstoff vom Hepatitis-B-Typ). (ii) Für andere Impfstoffe umfasst zum Beispiel die empfohlene Verabreichung an Kinder eine ersten Dosis zu einem gewählten Zeitpunkt (im Alter von 6 Wochen oder älter), eine zweite Dosis 4-8 Wochen nach der ersten Dosis, eine dritte Dosis 4-8 Wochen nach der zweiten Dosis, eine vierte Dosis 6-12 Monate nach der dritten Dosis, eine fünfte Dosis im Alter von 4-6 Jahren, und zusätzliche Boosterungen alle 10 Jahre nach der letzten Dosis, siehe Product Information, Physician's Desk Reference, Merck Sharp & Dohme (1990), Seite 879 (z.B. Protokolle für Impfstoffe vom Diphtherie-, Tetanus- und Keuchhusten-Typ). Gewünschte Zeitabstände für die Verabreichung multipler Dosen einer bestimmten Zusammensetzung können von einem durchschnittlichen Fachmann auf diesem Gebiet bestimmt werden, ohne dass mehr als Routineexperimente erforderlich sind.
Antikörper
Der Begriff „Antikörper" soll monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper und mittels rekombinanter Nukleinsäuretechniken hergestellte Antikörper, die selektiv mit Polypeptiden reagieren, die von erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen codiert werden, umfassen. Der Begriff „selektiv reagieren" bezieht sich auf diejenigen Antikörper, die mit einer oder mehreren antigenischen Determinante(n) auf z.B. gp120 reagieren und nicht mit anderen Polypeptiden reagieren. Antigenische Determinanten bestehen gewöhnlich aus chemisch aktiven Molekülgruppen, wie Aminosäuren oder Zucker-Seitenketten, auf Oberflächen, und sie haben spezifische Eigenschaften bezüglich ihrer dreidimensionalen Struktur sowie spezifische Ladungseigenschaften. Antikörper können für diagnostische Anwendungen oder für Forschungszwecke sowie zur Blockierung von Bindungswechselwirkungen eingesetzt werden.
Für die Präparation von Antikörpern, die gegen die immunogenen Proteoliposomen gerichtet sind, kann jede beliebige Technik eingesetzt werden, die für die Erzeugung von Antikörpermolekülen geeignet ist.
Zum Beispiel können Mäuse zweimal intraperitoneal mit ungefähr 50 µg des Proteoliposomen-Immunogens pro Maus immunisiert werden. Seren von derartigen immunisierten Mäusen können immunhistologisch oder immunzytologisch mit jedem beliebigen Wirtssystem, das dieses Polypeptid exprimiert, oder gegen ein anderes Proteoliposom oder mittels eines ELISA mit dem exprimierten Polypeptid auf eine Antikörperaktivität getestet werden. Bezüglich der Immunhistologie können erfindungsgemäße aktive Antikörper unter Einsatz eines Biotin-konjugierten Anti-Maus-Immunglobulins gefolgt von Avidin-Peroxidase und einem chromogenen Peroxidase-Substrat identifiziert werden. Präparationen dieser Reagenzien sind kommerziell erhältlich, zum Beispiel von Zymed Corp., San Francisco, Kalifornien. Mäuse, deren Seren nachweisbare aktive Antikörper gemäß der Erfindung enthalten, können drei Tage später getötet und ihre Milzen für die Fusion und die Erzeugung von Hybridomen entnommen werden. Positive Überstände dieser Hybridome können mittels der oben beschriebenen Tests und, zum Beispiel, mittels einer Western-Blot-Analyse identifiziert werden.
Ein weiteres Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern beinhaltet die Verwendung von Hybridom-mRNA oder Milz-mRNA als Matrize für eine PCT-Amplifizierung derartiger Gene (Huse et al., Science 246: 1276 (1989)). Zum Beispiel können Intrabodies von monoklonalen Maus-Hybridomen gewonnen werden (Richardson, J.H. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 197: 422-427 (1993), Mhashilkar, A.M. et al., EMBO J. 14: 1542-1551 (1995). Diese Hybridome stellen eine zuverlässige Quelle für gut charakterisierte Reagenzien für die Konstruktion von Antikörpern bereit, und sie sind besonders nützlich, wenn ihre Epitopreaktivität und Affinität zuvor charakterisiert worden sind. Zu weiteren Quellen für eine derartige Konstruktion gehört die Verwendung von Zelllinien, die humane monoklonale Antikörper produzieren (Marasco, W.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893 (1993), Chen, S.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5932-5936 (1944). Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung der Antikörper-Phage-Display-Technologie für die Konstruktion neuer Antikörper gegen verschiedene Epitope auf einem Zielmolekül (Burton, D.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10134-10137 (1991), Hoogenboom, H.R. et al., Immunol. Rev. 130: 41-68 (1992), Winter, G. et al., Ann. Rec. Immunol. 12: 433-355 (1994), Marks, D.J. et al., J. Biol. Chem. 267: 16007-16010 (1992), Nissim, A. et al., EMBO J. 13: 692-698 (1994), Vaughan, T.J. et al., Nature Bio. 14: 309-314 (1996), Marks, C. et al., New Eng. J. Med. 335: 730-733 (1996)). Zum Beispiel sind sehr große humane sFV-Bibliotheken erzeugt worden und können erzeugt werden, die eine umfangreiche Quelle für rearrangierte Gene von Antikörpern gegen eine Unzahl von Zielmolekülen bereitstellen. Kleinere Bibliotheken können für Individuen mit Autoimmunerkrankungen (Portolano, S. et al., J. Immunol. 151: 2839-2851 (1993), Barbas, S.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 2529-2533 (1995)) oder mit Infektionskrankheiten (Barbas, C.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9339-9343 (1992), Zebedee, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3175-3179 (1992)) konstruiert werden, um krankheitsspezifische Antikörper zu isolieren.
Zu weiteren Quellen gehören transgene Mäuse, die einen humanen Immunglobulin-Locus anstelle des entsprechenden Maus-Locus enthalten, sowie stabile Hybridome, die Antikörper sezernieren, die spezifisch für humane Antigene sind (Lonberg, N. et al., Nature 368: 856-859 (1994), Green, L.L. et al., Nat. Genet. 7: 13-21 (1994)). Derartige transgene Tiere stellen eine weitere Quelle für humane Antikörpergene bereit, und zwar entweder über die herkömmliche Hybridomtechnologie oder über die Kombination mit der Phage-Display-Technologie. In-vitro-Verfahren zur Manipulation der Affinität und zur Auffindung der Spezifität der antigenbindenden Stelle sind berichtet worden, einschließlich des Repertoire-Cloning (Clackson, T. et al., Nature 352: 624-628), Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993)], der In-vitro-Affinitätsreifung (Marks, J.D. et al., Biotech. 10: 779-783 (1992), Gram, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580 (1992)), semisynthetischer Bibliotheken [Hoogenboom, H.R., oben, Barbas, C.F., oben, Akamatsu, Y. et al., J. Immunol. 151: 4631-4659 (1993)) und einer gelenkten Selektion (Jespers, L.S. et al., Bio Tech 12: 899-902 (1994)). Zu den Ausgangsmaterialien für diese auf rekombinanter DNA basierenden Strategien gehören die RNA aus der Mäusemilz [Clackson, T., oben] und humane periphere Lymphozyten des Bluts (Portolano, S. et al., oben; Barbas, C.F. et al., oben, Marks J.D. et al., oben, Barbas, C.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982 (1991)) und lymphoide Organe und das Knochenmark von HIV-1-infizierten Spendern (Burton, D.R. et al., oben, Barbas, C.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9339-9343 (1992)).
Für die Präparation monoklonaler, gegen die Proteoliposomen gerichteter Antikörper kann jede beliebige Technik eingesetzt werden, die die Produktion von Antikörpermolekülen mittels kontinuierlicher Zelllinien erlaubt. Zum Beispiel sind die Hybridomtechnik, die ursprünglich von Köhler und Milstein entwickelt wurde (Nature 256: 495-7, 1973), sowie die Triom-Technik, die humane B-Zell-Hybridom-Technik (Kozbor et al., Immunology Today 4: 72) und die EBV-Hybridom-Technik zur Erzeugung humaner monoklonaler Antikörper und dergleichen im Umfang der Erfindung eingeschlossen; siehe allgemein Larrick et al., US-Patent 5 001 065 und dort zitierte Literaturstellen. Weiterhin sind Verfahren unter Verwendung einzelkettiger Antikörper („Single-chain Antibodies", SCA) für die Produktion von Antikörpern gegen Polypeptide verfügbar, die durch eine erfindungsgemäße eukaryotische Nukleotidsequenz codiert werden (Lander et al., US-Patente 4 704 694 und 4 976 778 ).
Die monoklonalen Antikörper können humane monoklonale Antikörper oder monoklonale schimärische Mensch-Maus-(oder andere Spezies)-Antikörper sein. Die vorliegende Erfindung stellt Antikörpermoleküle sowie Fragmente solcher Antikörpermoleküle bereit.
Fachleuten auf diesem Gebiet wird klar sein, dass eine große Vielzahl möglicher Gruppen an die resultierenden Antikörper oder, vorzugsweise, an die stabilisierten Trimere oder an andere erfindungsgemäße Moleküle gekoppelt werden kann; siehe zum Beispiel „Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J.M. Cruse und R.E. Lewis Jr. (Hrsg.), Carger Press, New York, 1989, wobei der gesamte Inhalt dieser Arbeit hier mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen wird.
Die Kopplung kann mittels einer beliebigen chemischen Reaktion erzielt werden, die die beiden Moleküle miteinander verbindet, solange der Antikörper und die andere Gruppe ihre jeweiligen Aktivitäten behalten. Diese Verknüpfung kann viele chemische Mechanismen umfassen, zum Beispiel eine kovalente Bindung, eine Affinitätsbindung, eine Interkalation, eine koordinative Bindung und eine Komplexierung. Die bevorzugte Bindung ist jedoch die kovalente Bindung. Die kovalente Bindung kann entweder durch eine direkte Kondensation vorhandener Seitenketten oder über die Inkorporation externer Verbrückungsmoleküle erreicht werden. Viele bivalente oder polyvalente Verknüpfungsmittel sind für die Kopplung von Proteinmolekülen, wie der erfindungsgemäßen Antikörper, an andere Moleküle nützlich. Zum Beispiel können zu repräsentativen Kopplungsmitteln organische Verbindungen wie Thioester, Carbodiimide, Succinimidester, Diisocyanate, Glutaraldehyde, Diazobenzole und Hexamethylendiamine gehören. Diese Auflistung soll nicht erschöpfend für die verschiedenen Klassen von Kopplungsmitteln, die in diesem Gebiet bekannt sind, sein, sondern sie stellt die üblicheren Kopplungsmittel exemplarisch dar (siehe Killen und Lindstrom, J. Immunol. 133: 1335-2549, 1984, Jansen, F.K. et al., Imm. Rev. 62: 185-216, 1982, und Vitetta et al., oben).
Bevorzugte Linker werden in der Literatur beschrieben. Siehe zum Beispiel Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44: 201-208 (1984), die die Verwendung von MBS (M-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester) beschreiben. Siehe auch Umemoto et al., US-Patent 5 030 719 , die die Verwendung eines halogenierten Acetylhydrazid-Derivats, das über einen Oligopeptidlinker an einen Antikörper gekoppelt ist, beschreiben. Zu besonders bevorzugten Linkern gehören: (i) EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid, (ii) SMPT (4-Succinimidyloxycarbonyl-alpha-methyl-alpha-(2-pyridyl-dithio)-toluol (Pierce Chem. Co., Kat.-Nr. 21558G), (iii) SPDP (Succinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)propion amido]hexanoat (Pierce Chem. Co., Kat.-Nr. 21651G), (iv) Sulfo-LC-SPDP (Sulfosuccinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)propionamid]hexanoat (Pierce Chem. Co., Kat.-Nr. 2165-G) und (v) Sulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccimimid (Pierce Chem. Co., Kat.-Nr. 24510) konjugiert an EDC.
Die oben beschriebenen Linker enthalten Komponenten, die unterschiedliche Eigenschaften haben und so zu Konjugaten mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften führen. Zum Beispiel sind Sulfo-NHS-Ester von Alkylcarboxylaten stabiler als Sulfo-NHS-Ester von aromatischen Carboxylaten. Linker, die NHS-Ester enthalten, sind weniger löslich als Linker, die Sulfo-NHS-Ester enthalten. Weiterhin enthält der Linker SMPT eine sterisch gehinderte Disulfidbindung und kann Konjugate mit erhöhter Stabilität bilden. Disulfidbindungen sind generell weniger stabil als andere Bindungen, da die Disulfidbindung in vitro gespalten wird, was dazu führt, dass weniger Konjugat verfügbar ist. Insbesondere Sulfo-NHS kann die Stabilität von Carbodiimid-Kopplungen erhöhen. Carbodiimid-Kopplungen (wie EDC) bilden, wenn sie zusammen mit Sulfo-NHS eingesetzt werden, Ester, die gegen eine Hydrolyse resistenter sind als die Carbodiimid-Kopplung allein.
Komplexe, die sich mit erfindungsgemäßen Molekülen bilden, können mittels geeigneter Tests nachgewiesen werden, wie mittels des zuvor diskutierten direkten Bindungstests und anderer herkömmlicher Typen von Immunoassays.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform könnte man Phage-Display-Bibliotheken auf der Suche nach Antikörpern gegen ein gegebenes Protein oder auf der Suche nach Liganden, die an das Protein binden, screenen.
Man kann diese Proteoliposomen auch für ein Screening von Bibliotheken auf eine bestimmte Verbindung einsetzen. Man kann diese Proteoliposomen auch zum Screenen komplexer chemischer Bibliotheken aus Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht (<1000 Dalton) zur Identifizierung hochaffiner Liganden verwenden. Diese Verbindungen könnten als Leitverbindungen für die Entdeckung agonistischer und antagonistischer Arzneimittel dienen.
Wenn man einen Liganden kennt, der mit dem Protein interagiert, kann man diese Proteoliposomen in Tests zum Screenen auf Verbindungen, die diese Wechselwirkungen mit dem Protein modulieren, einsetzen. Zum Beispiel kann man bei den zuvor erwähnten CCR5/CD4-haltigen Proteoliposomen gp120 zur Mischung geben und weitere Verbindungen zugeben, um ihre Wirkung auf die Bildung oder Stabilität des CD4/gp120/CCR5-Komplexes zu untersuchen.
Man kann das Antikörper-Tag auch dazu verwenden, das Proteoliposom umgekehrt zu orientieren. So, wie der Begriff hier verwendet wird, hat ein „umgekehrt orientiertes" Protein den Teil des Proteins, der normalerweise intrazellulär vorliegt, auf der Oberfläche des Proteoliposoms vorliegen. Dann kann man auf Verbindungen oder Proteine screenen, die intrazelluläre Wechselwirkungen bewirken. Zum Beispiel kann man sich die Bindung intrazellulärer und extrazellulärer Liganden ansehen sowie von Verbindungen oder Proteinen, die die intrazelluläre und die extrazelluläre Bindung beeinflussen.
Das vorliegende Verfahren ist nicht auf Proteine, die kleine Liganden binden, mit multiplen Transmembranbereichen beschränkt. Es kann praktisch jedes beliebige integrale Membranprotein untersucht werden.
Man kann dieses Verfahren auch zur Identifizierung kleiner Antagonisten in einem Test einsetzen, der sich mit Verbindungen beschäftigt, die die Bindung eines bekannten Liganden beeinflussen. Zum Beispiel erfordert der Eintritt des humanen Immunschwächevirus (HIV-1) in Wirtszellen typischerweise die aufeinanderfolgenden Wechselwirkungen des äußeren Hüll-Glycoproteins gp120 mit dem CD4-Glycoprotein und einem Chemokin-Rezeptor auf der Zellmembran. Die Bindung von CD4 induziert im gp120 Konformationsänderungen, die eine hochaffine Bindung an den Chemokin-Rezeptor ermöglichen. Der φ-Chemokin-Rezeptor CCR5 ist der wichtigste HIV-1-Korezeptor, der während der natürlichen Infektion und Transmission verwendet wird. Individuen mit homozygoten Defekten im CCR5 sind gesund, aber relativ resistent gegen eine HIV-1-Infektion. Zwar können einige HIV-1-Isolate in Gewebekultur so verändert werden, dass sie in Zellen replizieren, die kein CD4 aufweisen, aber die Bindung an den Chemokin-Rezeptor scheint für den Viruseintritt in die Wirtszelle essentiell zu sein. Diese Beobachtungen legen nahe, dass die Hemmung der gp120-CCR5-Wechselwirkung ein nützlicher therapeutischer oder prophylaktischer Ansatz gegen die HIV-1-Infektion sein könnte. Es sind ein Chemokin-Analoges, AOP-RANTES (Simmons, G. et al. (1997), Science 276: 276-279), und eine niedermolekulare Verbindung (TaKeda) (Babe, M. et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 5698-5703) identifiziert worden, die an CCR5 binden und eine HIV-1-Infektion in Gewebekultur verhindern, auch wenn die Nützlichkeit für die Klinik erst noch gezeigt werden muss.
Nach der Solubilisierung unter Einsatz spezifischer Detergens- und Salzbedingungen kann der humane CCR5 seine Fähigkeit zur Bindung von HIV-1-gp120-CD4-Komplexen und konformationsabhängigen monoklonalen Antikörpern beibehalten (Mirzabekov et al., JBC). Der Detergens-solubilisierte CCR5 zeigt dagegen sehr stringente Anforderungen bezüglich der Bedingungen, unter denen die native Konformation beibehalten wird, und er hat nur beschränkte Lebensdauer. Somit ist es nicht machbar, gereinigte Präparationen von solubilisiertem CCR5 in Screening-Tests einzusetzen. CCR5-Proteoliposomen weisen homogenen, nativen CCR5 auf, der orientiert auf der Oberfläche eines paramagnetischen Kügelchens befestigt ist. Die Präparation der CCR5-Proteoliposomen ist relativ unabhängig von der CCR5-Dichte auf der Oberfläche der Zellen, die als Quelle für den Chemokin-Rezeptor eingesetzt werden, und sie erlaubt auch die Konzentrierung von CCR5 auf der Oberfläche der Kügelchen. Eine Lipiddoppelschicht wie die, die um das Kügelchen herum rekonstituiert wurde, stellt eine natürliche Membranumgebung für das CCR5 bereit und ermöglicht die langfristige Aufrechterhaltung der nativen Konformation des CCR5.
Somit erzeugt das vorliegende Verfahren eine leicht manipulierbare sphärische Lipiddoppelschicht, die eine relativ große Menge eines reinen, orientierten und stabilen integralen Membranproteins enthält. Das ermöglicht es, diese Proteine in Anwendungen einzusetzen, die bisher auf die Verwendung löslicher gereinigter Proteine beschränkt waren.
Als ein spezifisches Beispiel können paramagnetische nicht-poröse Kügelchen, die von einer Lipidmembrandoppelschicht, die humanes CCR5 in einer nativen Konformation enthält, umgeben sind, wie im Folgenden beschrieben präpariert werden. Der humane CCR5 kann in Cf2Th-Hundethymozyten exprimiert werden, die mit einem Codon-optimierten CCR5-Gen transfiziert wurden. Das CCR5-Protein enthält ein C-terminales Nonapeptid-Tag (C9), das von dem monoklonalen Antikörper 1D4 erkannt wird. In einem ersten Ansatz wurden Lysate von CCR5-exprimierenden Cf2Th-Zellen (Cf2Th-CCR5) mittels der Detergenzien präpariert, für die gezeigt worden war, dass sie die Beibehaltung der nativen CCR5-Konformation ermöglichen. CCR5 wurde aus den Lysaten unter Verwendung von 1D4-Sepharosekügelchen affinitätsgereinigt und mittels des C9-Nonapeptids, das dem C-terminalen Epitop-Tag entsprach, eluiert. Es wurde der CCR5 in Detergens-Lösung zusammen mit einer Detergenssolubilisierten Lipidmischung, die 1 % Biotin-DPPE enthielt, zu Streptavidin-beschichteten Kügelchen gegeben. Während der nachfolgenden Entfernung des Detergens durch Dialyse wurden die CCR5-Moleküle in die Lipidmembran inkorporiert, die sich spontan um das Kügelchen herum ausbildete. Eine FACS-Analyse dieser Kügelchen ergab eine äquivalente Erkennung des CCR5 durch zwei Antikörper, den gegen ein lineares N-terminales CCR5-Epitop gerichteten 5C7-Antikörper und den gegen das C-terminale Epitop-Tag gerichteten 1D4-Antikörper (Daten nicht gezeigt). Da für die 5C7- und 1D4-Epitope erwartet wird, dass sie im nativen CCR5 auf gegenüberliegenden Seiten der Membran vorliegen, legt dieses Ergebnis eine zufällige Orientierung (50 % innen-hinein, 50 % innen-hinaus) des CCR5 in der Lipidmembran nahe. Zur Untersuchung des Konformationszustandes des CCR5 in der Membran wurde die Erkennung durch den 5C7-Antikörper mit der durch den 2D7-Antikörper, der ein konformationsabhängiges Epitop in der CCR5-Ectodomäne erkennt, verglichen. Die Erkennung des rekonstituierten CCR5 durch 2D7 war geringer als die durch 5C7 (Daten nicht gezeigt), was anzeigte, dass nur ein Teil des CCR5 eine native Konformation beibehielt.
In einem zweiten Ansatz wurde Detergens-solubilisierter CCR5 auf paramagnetischen Kügelchen gefangen, die mit dem 1D4-Antikörper konjugiert waren. Nach der Zugabe von Detergens-solubilisierten Lipiden und einer Dialyse wurde die Membran ausschließlich auf der Basis der Anziehung von Lipidmolekülen durch die hydrophoben, durch die Membran reichenden Bereiche des CCR5 rekonstituiert. Es wurden Analysen dieser Proteoliposomen mittels FACS und konfokaler Mikroskopie unter Verwendung der mit Phycoerythrin konjugierten 5C7- und 2D7-Antikörper durchgeführt. In einigen Experimenten wurde die Lipidmembrandoppelschicht durch das Präparieren der Proteoliposomen mit Rhodaminkonjugiertem DOPE sichtbar gemacht. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Kügelchen mit viel geringerer Wirksamkeit als in dem oben beschriebenen Verfahren eine Membran aufbauten. Außerdem war offenbar ein Anteil des CCR5 denaturiert (Daten nicht gezeigt).
In einem dritten Ansatz wurde das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt (1). Paramagnetische Kügelchen wurden sowohl mit dem 1D4-Antikörper als auch mit Streptavidin konjugiert. Der 1D4-Antikörper ermöglichte eine einfache Reinigung und Konzentrierung des CCR5 aus Zelllysaten sowie seine Orientierung auf der Oberfläche der Kügelchen. Das Streptavidin ermöglichte eine stabile und sättigende Membranrekonstitution um das Kügelchen herum. Es wurde gefunden, dass ein Molverhältnis von 1D4-Antikörper: Streptavidin von 10: 1 bezüglich der höchsten Dichte des rekonstituierten CCR5 und der Vollständigkeit der Membran in den paramagnetischen Proteoliposomen optimal war (Daten nicht gezeigt). Es ist möglich, das Verhältnis von Antikörper zu Streptavidin in unterschiedlichen Anwendungen, wenn es erforderlich ist, von 100: 1 bis 1: 1000 oder weniger zu variieren.
Bezüglich der drei eingesetzten Ansätze zeigten die mittels des dritten Ansatzes präparierten CCR5-Proteoliposomen die wirksamste Erkennung durch den konformationsabhängigen Antikörper 2D7. Tatsächlich war die Erkennung durch den 2D7- Antikörper praktisch gleich der durch den 5C7-Antikörper (Daten nicht gezeigt), was anzeigte, dass der überwiegende Teil des CCR5 in diesen Proteoliposomen-Präparationen in einer nativen Konformation vorliegt.
Die Eigenschaften dieser Proteoliposomen und die Verfahren, in denen diese Proteoliposomen verwendet werden können, werden im Folgenden diskutiert:

a) Reinheit des rekonstituierten Proteins. Das Verfahren zur Erzeugung des Proteoliposoms, z.B. von CCR5-Proteoliposomen, ermöglicht die Reinigung des Proteins vor der Rekonstitution in Lipidmembranen. Dieses Merkmal ermöglichte es uns, die Ligandenbindung, wie die Bindung von HIV-1-gp120 an praktisch reines CCR5 in der proteoliposomalen Membran zu untersuchen. In diesem Falle waren offenbar keine anderen zellulären Proteine als das sCD4-Glycoprotein in stöchiometrischen Mengen für die effiziente Bindung von gp120 an CCR5 erforderlich. Demgemäß kann man diese Proteoliposomen-Technologie dazu verwenden, die Frage anzugehen, ob zelluläre Proteine (zum Beispiel Proteine, bei denen es sich nicht um CD4 oder CCR5 handelt) für die von den Hüll-Glycoproteinen des HIV-1 vermittelte Membranfusion notwendig sind. Die Reinheit des rekonstituierten Proteins ist für die Verwendung paramagnetischer Proteoliposomen zur Identifizierung von Liganden aus Bibliotheken rekombinanter Proteine oder chemischer Verbindungen vorteilhaft. Zum Beispiel haben wird kürzlich gegen CCR5 gerichtete Antikörper durch den Einsatz der paramagnetischen CCR5-Proteoliposomen zum Screenen einer Phage-Display-Bibliothek einzelkettiger Antikörperfragmente selektiert (Kontos et al., unveröffentlichte Daten). Ähnlich ist ein Screening von Bibliotheken chemischer Verbindungen über die Inkubation paramagnetischer Proteoliposomen mit komplexen Mischungen gefolgt von der Entfernung und Analyse der Gruppen, die mit dem rekonstituierten interessierenden Membranprotein interagieren, möglich. In einem weiteren Format können paramagnetische Proteoliposomen, die das interessierende Target-Membranprotein fluoreszenzmarkiert enthalten, dazu eingesetzt werden, Liganden in einer großen Vielzahl chemischer Verbindungen, die auf einem festen Träger verankert sind, aufzuspüren. Das Vorliegen von reinem Proteinantigen in den paramagnetischen Proteoliposomen fördert die Auslösung spezifischerer Immunreaktionen bei Tieren, die mit diesen Präparationen immunisiert werden. Die Reinheit des rekonstituierten Membranproteins in den Proteoliposomen kann für einige Anwendungen ein Nachteil sein. Wenn zum Beispiel die Bindung eines interessierenden Liganden von anderen zellulären Einheiten abhängig ist, kann es sein, dass Untersuchungen mit Proteoliposomen die Bindungsereignisse, die auf der Oberfläche einer Zelle ablaufen, nicht perfekt nachahmen. Zum Beispiel waren wir nicht in der Lage, eine effiziente Bindung des β-Chemokins MIP-1α an unsere CCR5-Proteoliposomen zu zeigen (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass die Anforderungen an die Bindung des HIV-1-gp120 und von MIP-1α an CCR5 unterschiedlich sein könnten. Es wurde vorgeschlagen, dass die wirksame Bindung einiger Chemokine an ihre Rezeptoren von Proteoglycanen auf der Zelloberfläche oder von einer Dimerisierung des Rezeptors oder dessen Kopplung an G-Proteine abhängt (Zeng, F.Y. et al. (1999), J. Biol. Chem. 274: 19487-19497). Man kann jedoch CCR5-Proteoliposomen erzeugen, die diese zusätzlichen Faktoren enthalten, um ihre Rolle bei der Ligandenbindung zu bestätigen.
b) Homogenität des rekonstituierten Proteins. Unser bevorzugtes Protokoll setzt Kügelchen ein, die sowohl mit Streptavidin als auch mit einem Antikörper, wie dem 1D4-Antikörper gegen das C-terminale Epitop-Tag auf CCR5, konjugiert sind. Die Verwendung von Streptavidin ermöglicht die Befestigung von biotinyliertem Lipid an der Oberfläche des Kügelchens und führt zu einer stabileren und vollständigeren Umschließung des Kügelchens durch eine Membran. Zum Beispiel zeigte das in diesen Membranen rekonstituierte CCR5 eine bessere Homogenität bezüglich der Konformation, wie anhand der relativen Erkennung durch die 5C7- und 2D7-Antikörper bestimmt wurde. Die Homogenität des rekonstituierten Proteins in den Proteoliposomen kann für die Charakterisierung der Struktur des rekonstituierten Proteins wichtig sein.
c) Konzentration des rekonstituierten Proteins. Die Konzentration des rekonstituierten Proteins in den Proteoliposomen wird anhand der Dichte des konjugierten Capture-Antikörpers auf der Oberfläche der Kügelchen und der Konzentration des interessierenden Proteins in den Zelllysaten bestimmt. Diese beiden Parameter können mittels bekannter Verfahren manipuliert werden, um eine angemessene Konzentration des interessierenden Proteins zu ermöglichen, das in den produzierenden Zellen nur in mäßigen Mengen erzeugt wird.
d) Orientierung des rekonstituierten Proteins. Die Konjugation bestimmter Antikörper, die die extrazellulären oder intrazytoplasmatischen Anteile des interessierenden rekonstituierten Proteins erkennen, ermöglicht dessen Orientierung in der Proteoliposomen-Membran. Zum Beispiel kann man auch zusätzlich zur Verwendung des 1D4-Antikörpers gegen das C-terminale Epitop-Tag des CCR5 auch den 2D7-Antikörper mit der Oberfläche des Kügelchens konjugieren, was eine von innen nach außen gerichtete (umgekehrte) Orientierung des CCR5 im Proteoliposom ermöglicht (Daten nicht gezeigt). Die Fähigkeit, beide Orientierungen des Proteins in den paramagnetischen Proteoliposomen zu erzielen, ermöglicht es, die Bindung intrazellulärer sowie extrazellulärer Liganden zu untersuchen.

Die paramagnetischen Proteoliposomen sind über längere Zeiträume stabil. Die Integrität des konformationsabhängigen CCR5-Epitops, das vom 2D7-Antikörper erkannt wird, blieb nach der Exposition der CCR5-Proteoliposomen gegen extreme Bedingungen (hohen oder niedrigen pH, extreme Ionenstärke, Temperaturbereiche) erhalten. Da für verschiedene dieser Bedingungen gezeigt worden ist, dass sie Detergens-solubilisierten CCR5 denaturieren (Mirzabekov), zeigt die beobachtete Stabilität der Konformation, dass sich der CCR5 in den Proteoliposomen in einer Umgebung befindet, wahrscheinlich innerhalb der Lipidmembran, die die Bewahrung der nativen Struktur stark begünstigt. Diese Eigenschaft ermöglicht den schnellen Wechsel externer Puffer, was für funktionelle Untersuchungen verschiedener Typen integraler Membranproteine nützlich ist. Die langfristige Lagerung der Proteoliposomen wird auch durch die Stabilität der nativen Konformation des interessierenden Proteins in diesem Zusammenhang erleichtert.
BEISPIELE
Beispiel 1: CCR5-haltige Proteoliposomen
Konstruktion und Expression von Codon-optimiertem CCR5 (synCCR5)
Die Analyse der Codonverwendung für 45 GPCR, die verschiedene Protein-Unterfamilien repräsentierten, wurde mit den GenBank^TM-Daten und einer Software durchgeführt, die von der Genome Sequence Group der Universität von Wisconsin entwickelt worden war. Die für das humane CCR5 codierende Sequenz wurde für die Codonverwendung von Säugetierzellen optimiert (Andre, S. et al. (1999), J. Virology 72: 1497-1503), wobei die folgenden Codons verwendet wurden: Alanin (GCC), Arginin (CGC), Asparagin (AAC), Asparaginsäure (GAC), Cystein (TGC), Glutaminsäure (GAG), Glutamin (CAG), Glycin (GGC), Histidin (CAC), Isoleucin (ATC), Leucin (CTG), Lysin (AAG), Methionin (ATG), Phenylalanin (TTC), Prolin (CCC), Serin (TCC), Threonin (ACC), Tryptophan (TGG), Tyrosin (TAC) und Valin (GTG). Die Sequenzen, die die für CCR5-codierende Sequenz 5' und 3' flankieren, wurden modifiziert. Nach den Restriktionsstellen für EcoRV, EcoRI und HindIII wurde die Kozak-Konsensus-Sequenz (GCCGCCACCATGG) (SEQ ID NO: 1) unmittelbar 5'-ständig zum Leserahmen des CCR5 angeordnet. Es wurde eine für einen einzelnen Glycinrest codierende Sequenz gefolgt vom Rinderrhodopsin-C9-Peptid-Tag (TETSQVAPA) (SEQ ID NO: 2) unmittelbar 5'-ständig zum natürlichen Stopp-Codon des CCR5 eingeführt. Am 3'-Ende des Epitop-markierten CCR5-Gens wurden Restriktionsstellen für XbaI, SalI und NotI eingeführt. Analoge Konstrukte wurden für das humane CCR5-Wildtyp-Gen und das Rhodopsin-Gen des Rindes erzeugt, außer dass die Codons nicht verändert wurden und im letzteren Falle die C-terminale C9-Sequenz von Haus aus vorlag.
Insgesamt wurden 35 Oligonukleotide, die jeweils eine Länge von ungefähr 70 Nukleotiden hatten und den vollständigen Sense- und Antisense-Strängen des synCCR5-Gens und den flankierenden Sequenzen entsprachen, konstruiert, so dass ungefähr 50 % ihrer Sequenzen zu denjenigen der zwei komplementären Oligonukleotide des gegenüberliegenden Stranges komplementär waren. Die Oligonukleotide wurden in reinem Ammoniumhydroxid bei 65 °C 4 Stunden entschützt, und danach wurde das Ammoniumhydroxid abgezogen, und die Oligonukleotide wurden in einer Endkonzentration von 2 nM in Wasser gelöst. Für die Gen-Synthese wurden die 34 Oligonukleotide in fünf Gruppen eingeteilt (6 oder 8 Oligonukleotide pro Gruppe), und 25 Zyklen einer Polymerasekettenreaktion wurden unter Einsatz der Pfu-Polymerase (Stratagene, La Jolla, Kalifornien) und eines 3fachen molaren Überschusses der 5'- und 3'-terminalen Oligonukleotide in jeder Gruppe durchgeführt. Dieser Schritt erzeugte fünf kleine Segmente des synCCR5-Gens mit komplementären und überlappenden Enden. Gleiche Mengen eines jeden Produkts der Polymerasekettenreaktion wurden mit einem dreifachen molaren Überschuss der 5'- und 3'-terminalen Oligonukleotide der vollständigen synCCR5-Sequenz vereinigt. Eine zweite Runde der Polymerasekettenreaktion von 25 Zyklen ergab die vollständige synCCR5-Sequenz. Das Produkt wurde zur Sicherstellung, dass die Sequenz richtig war, sequenziert.
Die Sequenzen des synCCR5, des CCR5 vom Wildtyp und des Rinderrhodopsins wurden in die folgenden Vektoren kloniert: PMT4 (bereitgestellt von Dr. Reeves, Massachusetts Institute of Technology), PACH (bereitgestellt von Dr. Velan, Israel Institute for Biological Research), pcDNA3.1(+) und pcDNA4/HisMax (Invitrogen) und PND (bereitgestellt von Dr. Rhodes, University of California, Davis). Nach dem Klonieren des synCCR5-Gens in den pcDNA4/HisMax-Vektor wurde die Sequenz, die für die N-terminale His/Max-Region codiert, über eine QuikChange-Mutagenese (Stratagene) entfernt. Verschiedene Zelllinien wurden mit dem synCCR-Gen und dem CCR5-Gen vom Wildtyp unter Verwendung des GenePorter-Transfektionsreagens (San Diego, Kalifornien) transfiziert. Nach der Transfektion wurden CCR5-exprimierende Zellen mit 0,8 mg/ml Neomycin (G418) selektiert. Zellen, die die höchsten Mengen an CCR5 auf der Oberfläche exprimierten, wurden mittels FACS nach Färben der Zellen mit dem R-Phycoerythrin-konjugierten Anti-CCR5-Antikörper 2D7-PE (Pharmingen, San Diego, Kalifornien) selektiert. Unter allen getesteten Zellen (Hunde-Thymozyten Cf2Th, humane embryonale Nierenzellen HEK-293T, COS-1 und HeLa (American Type Culture Collection)) wurden die höchsten Expressionsniveaus des CCR5 in Cf2Th- und HEK-293T-Zellen gefunden, die mit dem synCCR5-Gen im PACH-Vektor transfiziert worden waren. Die Klone, die synCCR5 am stärksten exprimierten, wurden mittels FACS aus insgesamt 76 Klonen von Cf2Th-Zellen und 62 Klonen von HEK-293T-Zellen selektiert.
Radioaktive Markierung und Immunpräzipitation von CCR5
Ungefähr 4 × 10⁶ CCR5-exprimierende Cf2Th- oder HEK-293T-Zellen, die man in 100-mm-Platten bis zur vollständigen Konfluenz hatte wachsen lassen, wurden zweimal mit PBS gewaschen, und dann ließ man sie 1 Stunde bei 37 °C in Dulbecco's modified Eagle's-Medium ohne Cystein oder Methionin (Sigma) oder in sulfatfreiem Medium (ICN, Cost Mesa, Kalifornien) hungern. Das Hungermedium wurde entfernt, und es wurden jeweils 200 TCi [³⁵S]Methionin und [³⁵S]Cystein oder 500 TCi [³⁵S]Sulfat (NEN Life Science Products) in 4 ml Medium für unterschiedliche Zeiten für Pulse-Chase-Experimente oder, in allen anderen Fällen, über Nacht (12 Stunden) zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und in 1 ml eines Solubilisierungsmediums lysiert, das aus 100 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 % Glycerol, 1 % (Gew./Vol.) Detergens (siehe unten) und einer Mischung von Protease-Inhibitoren (eine Tablette Complete^TM (Roche Molecular Biochemicals) pro 25 ml) bestand. Das Lysat wurde bei 4 °C 30 min auf einer sich hin- und herbewegenden Plattform inkubiert, und die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugieren bei 14 000 × g für 30 min entfernt. CCR5 wurde mit 20 µl 1D4-Sepharose-Kügelchen (Reeves, P., Thurmond, R.L. und Khorana, G.G. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 4: 7784-90) über Nacht präzipitiert, und danach wurden die Kügelchen sechsmal im Solubilisierungsmedium gewaschen und abzentrifugiert. Es wurde das gleiche Volumen an 2X SDS-Probenpuffer zu den Kügelchen gegeben, und danach wurden sie resuspendiert und 1 Stunde bei 55 °C inkubiert. Man ließ die Proben auf 11 %igen SDS-Polyacrylamid-Minigelen laufen, und die Gele wurden autoradiographisch oder mittels eines Phosphorlmager SI von Molecular Dynamics (Sunnyvale, Kalifornien) analysiert.
Insgesamt wurden 18 Detergenzien in den Solubilisierungspuffern getestet. Die Detergenzien, deren Abkürzungen und kritischen Mizellenkonzentrationen in Klammern angegeben werden, waren n-Octyl-β-D-glucopyranosid (23,4 mM), n-Decyl-β-D-maltosid (1,8 mM), n-Dodecyl-β-D-maltosid (DDM), (0,17 mM), Cyclohexyl-butyl-β-D-maltosid (Cymal^TM-4, 7,6 mM), Cyclohexyl-pentyl-β-D-maltosid (Cymal^TM-5, 2,4 mM), Cyclohexyl-hexyl-β-D-maltosid (Cymal^TM-6, 0,56 mM), Cyclohexyl-heptyl-β-D-maltosid (Cymal^TM-7, 0,19 mM), Cyclohexyl-propanoyl-N-hydroxyethylglucamid (108 mM), Cyclohexylbutanoyl-N-hydroxyethylglucamid (35 mM), Cyclohexylpentanoyl-N-hydroxyethylglucamid (11,5 mM), N-Octylphosphocholin (Fos-Cholin^TM 8, 114 mM), N-Decylphosphocholin (Fos-Cholinj^TM 10, 11 mM), N-Dodecylphosphocholin (Fos-Cholin^TM 12, 1,5 mM), N-Tetradecylphosphocholin (Fos-Cholin^TM 14, 0,12 mM), Triton X-100 (0,02 mM), CHAPS (8 mM), Nonidet P-40 (0,02 mM) und Diheptanoyl-phosphocholin (DHPC) (1,4 mM). Alle Detergenzien wurden von Anatrace (Maumee, Ohio) bezogen, mit Ausnahme von DHPC, das von Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama) bezogen wurde.
Reinigung von CCR5
Stabile Cf2Th/PACH/synCCR5-Zellen, die in einer 150-mm-Platte bis zur vollständigen Konfluenz gezüchtet worden waren, wurden mit Medium, das 4 mM Natriumbutyrat enthielt, 40 Stunden inkubiert, in PBS gewaschen, durch Behandlung mit 5 mM EDTA/PBS abgelöst, abzentrifugiert und erneut in PBS gewaschen. Die Zellen wurden 30 min mit 3 ml des Solubilisierungsmediums, das Cymal^TM-5 enthielt, solubilisiert und 30 min bei 14 000 × g zentrifugiert. Das Zelllysat wurde mir 50 µl 1D4-Sepharose-Kügelchen auf einer Schüttelplattform bei 4 °C 10-12 Stunden inkubiert. Die Sepharose-Kügelchen wurden 5mal mit dem Waschpuffer (100 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 % Glycerol und 1 % Cymal^TM-5) gewaschen und einmal mit dem Waschpuffer plus 500 mM MgCl₂. CCR5 wurde durch drei aufeinanderfolgende Waschungen mit 50 µl Medium, das 200 µM C9-Peptid (SEQ ID NO: 2) (TETSQVAPA), 500 mM MgCl₂, 100 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 % Glycerol und 0,5 % Cymal^TM-5 enthielt, von den Kügelchen isoliert. Die Gesamtmenge des gewonnenen CCR5 wurde über einen Lauf auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel und eine Färbung mit Coomassie Blue unter Verwendung von Rinderserumalbumin-Standards bestimmt.
Bindung des HIV-1-gp120-Hüll-Glycoproteins an solubilisierten CCR5
Ungefähr 4 × 10⁶ Cf2Th/PACH/synCCR5-Zellen wurden 12 Stunden mit [³⁵S]Met/Cys markiert und in Solubilisierungspuffer, der 1 % Cymal^TM-5 enthielt, solubilisiert. 1 ml des geklärten Zelllysats wurde mit 100-500 µl der gp120-haltigen Lösungen inkubiert. Das unmarkierte JR-FL-gp120 wurde in Drosophila-Zellen erzeugt (Wu, L. et al. (1996), Nature 384: 179-183), und die ADA- und 190/197-R/S-gp120-Glycoproteine wurden mit transient transfizierten 293T-Zellen erzeugt, die über Nacht mit [³⁵S]Met/Cys radioaktiv markiert worden waren. Außer im Falle der CD4-unabhängigen gp120-Variante 190/197-R/S wurden die gp120-Glycoproteine (2-4 µg) vor der Zugabe zu den CCR5-haltigen Lysaten mit sCD4 (2-4 µg) in 20 ml PBS 1 Stunde bei 22 °C vorinkubiert. Nach 12 Stunden bei 4 °C wurde die gp120-CCR5-Komplexe entweder mit dem Anti-gp120-Antikörper C11 (freundlicherweise bereitgestellt von Dr. James Robinson, Tulan University Medical School) oder mit dem 1D4-Antikörper präzipitiert.
Expression von CCR5 in Säugerzellen
Wir verglichen die Codon-Verwendung für Opsine, der einzigen GPCR, die natürlicherweise hoch exprimiert werden, mit der Codon-Verwendung von 45 anderen GPCR, die ein Spektrum verschiedener GPCR-Unterfamilien repräsentierten. Die Opsin-Codons haben einen Bias in Richtung derjenigen, für die gezeigt wurde, dass sie für eine effiziente Translation in Sängerzellen optimal sind (Andre, S. et al. (1998), J. Virol. 72: 1497-1503), während andere GPCR, einschließlich von CCR5, mit Codons assoziiert sind, die zufälliger sind und in vielen Fällen ineffizient translatiert werden (Daten nicht gezeigt). Es wurde ein Codon-optimiertes CCR5-Gen entworfen, mittels der Polymerasekettenreaktion synthetisiert und transient in verschiedenen Zelllinien unter Verwendung von fünf verschiedenen Expressionsvektoren (pcDNA 3.1, PACH, PND, PMT4 und pCDNA4/HisMax) exprimiert. Das Ausmaß der vom Codon-optimierten Gen gesteuerten CCR5-Expression lag beim 2- bis 5fachen der vom Wildtyp-Gen des CCR5 gesteuerten Expression. Bei den getesteten Zelllinien war die CCR5- Expression am höchsten in den Cf2Th-Hundethymozyten (Daten nicht gezeigt), und deshalb wurden diese Zellen zur Generierung stabiler Zelllinien verwendet. Der PACH-Vektor wurde zur Expression des Codon-optimierten Gens, das für das humane CCR5 mit einem C-terminalen Epitop-Tag (dem C9-Tag), das vom Rinder-Rhodopsin stammte, codiert, eingesetzt. Das Vorliegen des C9-Tags ermöglicht die Erkennung des CCR5-Proteins durch den 1D4-Antikörper (Oprian, D.D. et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8874-8878). Die CCR5-Expression in der stabilen Zelllinie, die Cf2Th/PACH/synCCR5 genannt wurde, konnte durch die Behandlung der Zellen mit Natriumbutyrat 2- bis 3fach gesteigert werden. Nach dieser Behandlung konnten ungefähr 3-5 µg an hochreinem CCR5 aus 10⁷ Cf2Th/PACH/synCCR5-Zellen mittels der unten beschriebenen Techniken gereinigt werden.
Vorläuferformen und reife Formen von CCR5
Die Synthese und der Turnover von CCR5 in Cf2Th-Zellen wurden mittels einer Pulse-Chase-Analyse untersucht. Ein Vorläufer von ungefähr 40 kDa wurde durch den Chase in die reife Form von CCR5 überführt, die als eine breite Bande von ungefähr 43 kDa wanderte. Der CCR5-Vorläufer hatte eine Halbwertszeit von ungefähr 25 min. Die Halbwertszeit der reifen Form von CCR5 lag bei 11-14 Stunden, unabhängig davon, ob die Expression von CCR5 durch das Wildtyp-Gen oder durch das Codon-optimierte CCR5-Gen gesteuert wurde. Die Halbwertszeiten der Vorläuferformen und der reifen Formen von CCR5 in HEK-293-Zellen waren denjenigen in Cf2Th-Zellen ähnlich (Daten nicht gezeigt). In mehreren verschiedenen Zelllinien tauchte eine Form des CCR5 mit niedrigerer Molekülmasse (ungefähr 36 kDa) parallel zum reifen Protein auf. Diese Form des CCR5 mit niedriger Molekülmasse wurde in geringeren Mengen als die reife Form des CCR5 exprimiert und ist nicht vollständig charakterisiert worden. Ihre Identität als eine CCR5-Isoform wurde durch ihre Fällung mit dem 1D4-Antikörper und den Anti-CCR5-Antikörper 2D7 und mittels Massenspektrometrie bestätigt (2 und nicht gezeigte Daten).
Solubilisierung des nativen CCR5
Die Reinigung eines Membranproteins erfordert eine Solubilisierung der Membranen, typischerweise über den Einsatz von Detergenzien. Es wurde ein breites Spektrum an Bedingungen untersucht, bis die Zusammensetzung des Puffers feststand, der die Solubilisierung und Isolierung des nativen CCR5 ermöglichte. Diese Optimierung wurde von dem Vergleich der Menge an solubilisiertem CCR5, die mit dem 2D7-Antikörper, der ein konformationsabhängiges CCR5-Epitop erkennt (Wu, L. et al. (1997), J. Exp. Med. 186: 1373- 1381), gefällt werden konnte, mit derjenigen Menge, die von dem 1D4-Antikörper, der gegen das lineare C9-Epitop-Tag gerichtet ist, gefällt werden konnte, geleitet. Auf diese Weise konnte der prozentuale Anteil des solubilisierten CCR5, der in der nativen Konformation verblieben war, bestimmt werden (2A). Achtzehn Detergenzien, von denen die meisten spezifisch für die Extraktion und die Reinigung von Membranproteinen entworfen worden waren, wurden untersucht. Bezüglich der Menge an isoliertem CCR5-Protein und des Prozentsatzes des Proteins in einer Konzentration, die vom 2D7-Antikörper erkannt wurde, waren die effektivsten Detergenzien DDM, Cymal^TM-5 und Cymal^TM-6 (2B). Von diesen Detergenzien weist Cymal^TM-5 die höchste kritische Mizellenkonzentration auf (2,4 mM), was die Entfernung des Detergens aus der Proteinlösung über eine Dialyse zum Zwecke einer Membranrekonstitution und/oder einer Kristallisation erleichtert. Wir fanden auch, dass eine CCR5-Konformation, die kompetent bezüglich der Bindung des HIV-1-gp120 war, am besten in Puffern, die Cymal^TM-5 enthielten, erhalten blieb (siehe unten). Deshalb wurde Cymal^TM-5 für die weitere Verbesserung des Protokolls zur Solubilisierung/Isolierung von CCR5 eingesetzt, wobei verschiedene Variable (Salzzusammensetzung und -konzentration, pH, Temperatur und quantitativ geringfügigere Zusätze) untersucht wurden, von denen bekannt ist, dass sie die Stabilität solubilisierter Proteine beeinflussen (Hamaguchi, K. (1992), The Protein Molecule. Conformation, Stability and Folding, Japan Scientific Societies Press, Springer-Verlag, New York). Für Ammoniumsulfat und Glycerol wurde gefunden, dass sie die Existenz einer CCR5-Konformation verlängerten, die imstande war, vom 2D7-Antikörper erkannt zu werden (Daten nicht gezeigt). Der optimierte Solubilisierungspuffer für CCR5 bestand aus 100 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 % Glycerol und 1 % Cymal^TM-5.
CCR5-exprimierende Zellen
Die Zelllinie Cf2Th/CCR5, die ungefähr 10⁶ Moleküle CCR5 pro Zelle stabil exprimiert, wurde über die Transfektion von Cf2Th-Hundethymozyten mit dem oben beschriebenen Codonoptimierten CCR5-Gen generiert. Der C-Terminus des exprimierten CCR5 besteht aus einem Glycinrest, an den sich das C9-Nonapeptid TETSQVAPA (SEQ ID NO: 2) anschließt, das das Epitop für den 1D4-Antikörper enthält. Für das CCR5-Molekül vom Wildtyp und das C-terminal markierte CCR5-Molekül wurde gezeigt, dass sie funktionell vergleichbar sind. Cf2Th/CCR5-Zellen, die bis zur vollständigen Konfluenz in 150-mm-Platten gezüchtet worden waren, wurden mit 5 mM EDTA in PBS geerntet, in PBS gewaschen, abzentrifugiert und bis zur Verwendung eingefroren.
Radioaktive Markierung von CCR5- oder gp120-exprimierenden Zellen
Cf2Th/CCR5-Zellen wurden in 150-mm-Platten 12 Stunden mit 10 ml/Platte Met-Cysfreiem DMEM, das mit jeweils 400 µCi ³⁵S-Methionin und ³⁵S-Cystein supplementiert war (NEN Life Science Products, Boston, Massachusetts), radioaktiv markiert. Die markierten Zellen wurden mit 5 mM EDTA in PBS geerntet, abzentrifugiert und bis zur Verwendung eingefroren.
Zur Markierung des HIV-1-gp120-Hüll-Glycoproteins wurden HEK-293T-Zellen (American Type Culture Collection) bis zu einer Konfluenz von 70-80 % gezüchtet und dann mit Plasmiden, die das sekretierte gp120 der HIV-1-Stämme ADA und HXBc2 (Lit. Kolchinsky) exprimieren, transfiziert (Transfektionsreagens Geneporter, Gene Therapy Systems, San Diego, Kalifornien). 24 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium durch Markierungsmedium, wie es oben beschrieben wurde, ersetzt. Die Zellüberstände, die mit ³⁵S-Cystein/Methionin markiertes gp120 enthielten, wurden insgesamt dreimal alle 48 Stunden geerntet. Das markierte gp120 wurde wie beschrieben (Lit. Wu et al.) aus den gepoolten Überständen mittels einer Protein-A-Sepharose-F105-Antikörper-Säule gereinigt.
Beschichtung von Dynabeads mit Antikörpern und Streptavidin
Tosylaktivierte Dynabeads^® M-280 (Dynal, Inc., Lake Success, New York) wurden mit 1D4-Antikörpern (National Cell Culture Center, Minneapolis, Minnesota) und Streptavidin (Vector Laborstories Inc., Burlingame, Kalifornien) in einem Molverhältnis von 10: 1, sofern nichts anderes angegeben ist, konjugiert. Ungefähr 6 × 10⁸ Kügelchen in einem Volumen von 1 ml wurden gemischt, auf einem Magnetseparator (Dynal) pelletiert und in 1 ml Bindungspuffer (0,1 M Natriumphosphat, pH 7,4), der 1 mg 1D4-Antikörper und 30 µg Streptavidin enthielt, resuspendiert. Nach dem Inkubieren auf einer Schüttelplattform für 20 Stunden bei 37 °C wurden die nicht gebundenen reaktiven Gruppen auf der Oberfläche der Kügelchen durch eine vierstündige Behandlung mit 0,2 M Tris-HCl (pH 8,5) bei 37 °C inaktiviert. Die nicht kovalent adsorbierten Proteine wurden durch eine einstündige Inkubation in einem Medium entfernt, das 1 % Cyclohexyl-pentyl-β-D-maltosid (Cymal^TM-5) (Anatrace, Maumee, Ohio), 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM (NH₄)₂SO₄ und 1 M NaCl enthielt. Dann wurden die 1D4/Streptavidin-Kügelchen zweimal gewaschen und bei 4 °C in PBS gelagert. Die Effizienz der Konjugation des Antikörpers an die Kügelchen, die mittels FACS unter Verwendung von Anti-Maus-R-Phycoerythrin-konjugiertem IgG (IgG-PE) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) bestimmt wurde, lag bei ungefähr 5 × 10⁴ Antikörpermolekülen/Kügelchen. Die 2D7/Streptavidin-Konjugation erfolgte mit dem gleichen Protokoll.
Präparation von Lipidlösungen für die Rekonstitution liposomaler Membranen
Alle Lipide wurden als Chloroformlösungen von Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama) bezogen. Insgesamt 10 mg der in Chloroform gelösten Lipide 1-Palmitoyl-2-oleyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC), 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (POPE) und Dimyristoylphosphatidsäure (DMPA), gemischt in einem Molverhältnis von 6: 3: 1, wurden in einem 2-ml-Polyethylenröhrchen im Vakuum getrocknet, bis das Lösemittel vollständig entfernt war. Ein Milliliter PBS wurde zu dem Röhrchen gegeben, und eine Liposomenlösung wurde durch eine 1- bis 2minütige Ultraschallbehandlung in einem Eisbad mit Hilfe des Ultrasonic Processors (Heat Systems Inc., Farmingdale, New York) erhalten. Liposomenlösungen der Gesamtlipide aus Membranen von Cf2Th-Zellen, die mit Chloroform/Methanol (Lit. Folch) extrahiert worden waren, wurden auf ähnliche Weise hergestellt, wobei eine Endkonzentration der Lipide von 10 mg/ml verwendet wurde. Liposomenlösungen der Kopfgruppen-modifizierten synthetischen Lipide Dipalmitoylphosphoethanolamin-N-Biotinyl (Biotinyl-DPPE) und Dioleoylphosphoethanolamin-Lissamin-Rhodamin-B (Rho-DOPE) in einer Endkonzentration von 1 mg/ml wurden separat mittels des gleichen Protokolls hergestellt. Alle Liposomenlösungen wurden bis zur Verwendung in flüssigem N₂ gelagert.
Bildung von Proteoliposomen mit gereinigtem CCR5
Ungefähr 10⁸ Cf2Th/CCR5-Zellen wurden in 10 ml Solubilisierungspuffer (S-Puffer) lysiert, der aus 100 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 % Glycerol, 0,5 % (Gew./Vol.) Cymal^TM-5 und einer Mischung von Protease-Inhibitoren (eine Tablette Complete^TM (Boehringer Mannheim) pro 50 ml) bestand, 30 Minuten bei 4 °C lysiert. Zelltrümmer wurden durch eine 30minütige Zentrifugation bei 150 000 × g entfernt. Ungefähr 5 × 10⁸ in S-Puffer gewaschene 1D4/Streptavidin-beschichtete Kügelchen wurden zu dem geklärten Zelllysat gegeben und in diesem 1 Stunde bei 4 °C auf einer sich hin- und herbewegenden Plattform inkubiert. Die CCR5-gebundenen Kügelchen wurden dann aus dem Zelllysat entfernt und extensiv in S-Puffer gewaschen. Zur Bildung der Lipidmembran um die CCR5-haltigen Kügelchen herum wurde 1 mg Liposomen, die entweder aus synthetischen Lipidmischungen oder Lipiden der Cf2Th-Zellen bestanden, mit 10 µg Liposomen vereinigt, die aus Biotinyl-DPPE hergestellt worden waren, und in 1 ml S-Puffer solubilisiert. Wenn eine Fluoreszenzmarkierung der Lipidmembran gewünscht war, wurden 10 µg Rho-DOPE zu der Mischung gegeben. Diese detergenshaltige Mischung wurde zu CCR5-haltigen Kügelchen gegeben, und nach einer einstündigen Inkubation bei 4 °C wurde das Detergens langsam durch eine 24stündige Dialyse bei 4 °C in 12 000-kDa-Dialyseschläuchen gegen 100 mM (NH₂)₂SO₄, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 10 % Glycerol entfernt. Der Überschuss an ungebundenem Lipid und restliches Detergens wurden auf einem Magnetseparator entfernt, und die Proteoliposomen wurden bis zu zwei Monate bei 4 °C in PBS gelagert.
Die Proteinzusammensetzung der CCR5-Proteoliposomen wurde über eine Silberfärbung oder, wenn ³⁵S-Cystein/Methionin-markiertes CCR5 verwendet worden war, über eine Autoradiographie analysiert. Für diese Zwecke wurden 10⁷ Proteoliposomen in 2 % SDS-Probenpuffer resuspendiert, und nach einstündiger Inkubation bei 55 °C ließ man die eluierte Probe auf einem 11 %igen Polyacrylamid-Minigel unter reduzierenden Bedingungen laufen.
Bindung von Liganden an CCR5-Proteoliposomen
Die Bindung des Anti-CCR5-Antikörpers 2D7 wurde mittels FACS und konfokaler Mikroskopie mit Hilfe von R-Phycoerythrin-konjugiertem 2D7 (2D7-PE) analysiert. Die CCR5-Proteoliposomen wurden in 5 % BSA, fötalem Kälberserum in PBS oder, in einigen Experimenten, in Bindungspuffer (siehe unten) suspendiert und 1 Stunde bei 22 °C mit 2D7-PE inkubiert. Die Proteoliposomen wurden dann im gleichen Puffer gewaschen, in 2 % Formaldehyd in PBS fixiert und mittels FACS oder konfokaler Mikroskopie analysiert.
Die Bindung des HIV-1-gp120-Glycoproteins an CCR5-Proteoliposomen wurde mittels FACS unter Verwendung von unmarkiertem gp120 (Stamm JR-FL) oder mittels SDS-Polyacrylamid-Gelanalyse gebundener, radioaktiv markierter gp120-Proteine analysiert. Für die FACS-Analyse wurden die CCR5-Proteoliposomen in 0,5 ml Bindungspuffer suspendiert (150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 20 mM Tris, pH 7,5) und eine Stunde bei 22 °C mit 3-5 µg JR-FL-gp120 oder mit JR-FL-gp120, das eine Stunde bei 37 °C mit einer äquimolaren Konzentration von sCD4 vorinkubiert worden war, inkubiert. Danach wurden der Anti-gp120-Antikörper C11 (freundlicherweise bereitgestellt von Dr. James Robinson, Tulan University) und ein Fluorescein-konjugiertes Ziege-Anti-Mensch-IgG (Pharmingen) zugegeben, und zwar beide in einer Endkonzentration von 3-5 µg/ml. Nach einer einstündigen Inkubation bei 22 °C wurden die CCR5-Proteoliposomen im Bindungspuffer gewaschen, in 2 % Formaldehyd in PBS fixiert und für die FACS-Analyse und die konfokale Mikroskopie eingesetzt.
Für die Untersuchungen zur Bindung von radioaktiv markierten HIV-1-gp120 an CCR5-Proteoliposomen wurden die metabolisch markierten gp120-Glycoproteine eines CCR5-einsetzenden HIV-1-Stammes, ADA, und eines CXCR4-einsetzenden HIV-1-Stammes, HXBc2, verwendet. Die gp120-Glycoproteine wurden entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit von sCD4 (Endkonzentration 10 nM) eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Ungefähr 10⁷ CCR5-Proteoliposomen wurden in 1 ml Bindungspuffer resuspendiert und eine Stunde bei 22 °C mit den gp120-Glycoproteinen inkubiert. Die Proteoliposomen wurden extensiv in Bindungspuffer gewaschen und dann in SDS-Probenpuffer, der 5 % β-Mercaptoethanol enthielt, resuspendiert. Nach zweiminütigem Kochen wurden die Proben auf 10 %ige Polyacrylamid-Minigele geladen und mittels Autoradiographie analysiert.
Proteinzusammensetzung von CCR5-Proteoliposomen
Zur Bestimmung der zellulären Proteine, die in die Proteoliposomen inkorporiert wurden, wurden Cf2Th-CCR5-Zellen metabolisch mit ³⁵S-Cystein und ³⁵S-Methionin markiert und zur Bildung der Proteoliposomen eingesetzt. Die Proteoliposomen wurden in SDS-Probenpuffer bei 55 °C eine Stunde inkubiert, und die markierten Proteine wurden auf Polacrylamid-Gelen analysiert (3). Es wurden dicke Banden, die mit dem reifen CCR5 (43 kDa) und einem bereits früher beobachteten CCR5-Derivat (35 kDa) assoziiert waren, sowie schwache Banden, die mit Aggregaten von CCR5 mit höherem Molekulargewicht assoziiert waren, beobachtet. Andere zelluläre Proteine waren offenbar nur in Spurenmengen vorhanden. Diese Ergebnisse zeigen, dass CCR5 das Hauptprotein der Zellen in den Proteoliposomen ist.
Die Proteine in den paramagnetischen Proteoliposomen wurden auch mittels einer Silberfärbung von Polyacrylamidgelen der SDS-Lysate untersucht. Die einzigen anderen Banden, die zusätzlich zu den oben beschriebenen CCR5-Banden sichtbar waren, waren diejenigen, die mit den schweren und leichten Ketten (55 bzw. 25 kDa) des 1D4-Antikörpers und mit Streptavidin (60 kDa) assoziiert waren (Daten nicht gezeigt). Das zeigt, dass offenbar keine anderen zellulären Proteine als CCR5 stöchiometrisch in die paramagnetischen Proteoliposomen inkorporiert werden.
Analyse der Lipiddoppelschichtmembran in CCR5-Proteoliposomen
Es wurde die Gesamtmenge an Lipid, die in die Proteoliposomen inkorporiert wurde, bestimmt. Eine FACS-Analyse von CCR5-Proteoliposomen, die mit steigenden Mengen an Lipid, das 1 % Rhodamin-DOPE enthielt, erzeugt worden waren, zeigte, dass ungefähr 80 bis 90 Tg Lipid pro 10⁸ Kügelchen gebunden wurden (4). Das ist mehr als die Lipidmenge (ungefähr 40 Tg), die theoretisch benötigt wird, um Doppelschichten um Kügelchen von 2,8 Tm Durchmesser herum zu bilden (siehe Formel in 4, Insert). Dieser Unterschied kann mit der Unregelmäßigkeit der Oberfläche der Kügelchen erklärt werden, die mittels Rasterelektronenmikroskopie dokumentiert wurde (Daten nicht gezeigt), und die zur Bildung kleiner mizellenartiger Strukturen in den Falten der Oberfläche der Kügelchen beitragen könnte. Außerdem könnte es sein, dass ein Teil des eingesetzten Lipids während der Dialyse verloren ging.
Die CCR5-Proteoliposomen wurden auch mittels konfokaler Mikroskopie untersucht (5A und 5B). Die als Kontrollen eingesetzten paramagnetischen Kügelchen zeigten keine Fluoreszenz, die eine Rhodamin-DOPE-Inkorporation anzeigte. Im Gegensatz dazu fluoreszierten die CCR5-Proteoliposomen, die mit 1 % Rhodamin-DOPE gebildet worden waren, intensiv und gleichmäßig. Es wurden keine Lipidvesikel oder andere Strukturen von mehr als 0,1 µm auf der Oberfläche der Fluoreszenz-markierten CCR5-Proteoliposomen beobachtet. Diese Daten stimmen damit überein, dass die CCR5-Proteoliposomen von einer einzigen Lipiddoppelschichtmembran mit höchstens geringen Unregelmäßigkeiten umgeben sind.
Ligandenbindungseigenschaften von CCR5-Proteoliposomen
Die CCR5-Proteoliposomen banden effektiv den 2D7-Antikörper, der ein konformationsabhängiges Epitop auf der CCR5-Ectodomäne erkennt (5C und 5D).
Zur Untersuchung der Fähigkeit der CCR5-Proteoliposomen, das äußere Hüll-Glycoprotein des HIV-1 zu binden, wurde das gp120-Glycoprotein des CCR5-einsetzenden Stammes JR-FL mit einer löslichen Form von CD4 (sCD4) inkubiert, um die hochaffine Wechselwirkung mit CCR5 zu induzieren. Der gp120/sCD4-Komplex wurde mit CCR5-Proteoliposomen inkubiert, und danach wurden die gebundenen Komplexe über die Bindung des gp120-Antikörpers C11 nachgewiesen. Die Bindung der gp120-Glycoprotein/sCD4-Komplexe an die CCR5-Proteoliposomen, aber nicht an Kontroll-Proteoliposomen ohne CCR5, konnte leicht nachgewiesen werden (5E und 5F).
Die Bindung des gp120-Glycoproteins des HIV-1 an die CCR5-Proteoliposomen wurde auch in einem anderen Test untersucht. Äquivalente Mengen eines metabolisch markierten gp120-Glycoproteins eines HIV-1-Stammes, HXBc2, der das CCR5-Protein nicht als Korezeptor verwendet, und des ADA-Stammes, der CCR5 als Korezeptor verwendet, wurden zu den CCR5-Proteoliposomen gegeben. Nur das gp120-Glycoprotein von ADA band nachweisbar an die CCR5-Proteoliposomen (6A). Diese Bindung wurde durch die Zugabe von sCD4 verstärkt. Die Bindung des ADA-gp120/sCD4-Komplexes an die CCR5-Proteoliposomen wurde durch die Vorinkubation der Proteoliposomen mit dem Anti-CCR5-Antikörper 2D7 gehemmt. Diese Ergebnisse zeigen, dass das gp120-Glycoprotein von einem CCR5-einsetzenden HIV-1-Stamm spezifisch an CCR5 in den Proteoliposomen bindet und dass die Bindung von CD4 die gp120-CCR5-Wechselwirkung verstärkt, wie es mit CCR5 auf der Zelloberfläche beobachtet wurde (Wu, L. et al. (1996), Nature 384: 179-183, Trkola, A. et al. (1996), Nature 384: 184-187).
Stabilität von CCR5-Proteoliposomen
Es wurden die Auswirkungen von Veränderungen des pH, der Ionenstärke und der Temperatur auf die Stabilität der CCR5-Proteoliposomen untersucht. Rhodamin-DOPE-markierte CCR5-Proteoliposomen wurden 30 Minuten sauren (pH = 3) oder basischen (pH = 10) Bedingungen ausgesetzt und danach in eine pH-neutrale Umgebung zurück gebracht. Die mittels FACS bestimmte Fluoreszenzintensität war derjenigen vergleichbar, die für unbehandelte Kontroll-CCR5-Proteoliposomen beobachtet wurde (Daten nicht gezeigt). Die Fluoreszenzintensität wurde auch durch die Inkubation in Lösungen unterschiedlicher Ionenstärken, die von weniger als 1 mM bis 3M NaCl reichten, nicht beeinflusst (Daten nicht gezeigt). Die Bindung des 2D7-Antikörpers an CCR5-Proteoliposomen wurde durch die Inkubation des Antikörper-Proteoliposomen-Komplexes bei pH 3,0 für 30 Minuten vollständig zerstört (5B). Die Fähigkeit des 2D7-Antikörpers, erneut an die CCR5-Proteoliposomen zu binden, wurde jedoch durch die Wiederherstellung des pH von 7,0 vollständig wieder hergestellt. Die CCR5-Proteoliposomen waren bei Temperaturen bis zu 50 °C für kürzere Zeiträume (weniger als 2 Stunden) stabil und konnten wenigstens 2 Monate in PBS bei 4 °C ohne einen Verlust der Bindungseigenschaften gelagert werden.
Wir haben somit gezeigt, dass ein integrales Membranprotein wie der GPCR CCR5 in annehmbar hohen Mengen in Säugerzellen exprimiert werden und in seinem nativen Zustand in Detergens-haltigen Lösungen gereinigt werden kann. Wir haben gezeigt, dass der gereinigte CCR5 in einer Umgebung aus einer nativen Lipidmembran, die auf der Oberfläche paramagnetischer Kügelchen gebildet wurde, rekonstituiert werden kann. Demnach ist der Ansatz mit geringen Abänderungen auf viele integrale Membranproteine anwendbar.
Beispiel 2: CXCR4-haltige Proteoliposomen
Reinigung von CXCR4-Proteoliposomen
CXCR4-Cf2Th-Zellen wurden bis zur vollständigen Konfluenz in 100-mm-Zellkulturschalen gezüchtet. Die Zellen wurden mit 1 × PBS/5 mM EDTA von der Platte abgelöst und in Mikrozentrifugenröhrchen in einer Dichte von 1 × 10⁸ Zellen/Pellet abzentrifugiert. Das Pellet wurde in einem eiskalten Puffer resuspendiert, der 100 mM (NH₄)₂SO₄ 20 mM Tris pH 7,5, 20 % Glycerol, 1 × Complete-Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche) und 1 % an CHAPSO (Anatrace) oder Cymal-7 (Anatrace) enthielt. Die resuspendierten Zellen wurden 5 Minuten auf Eis inkubiert, woran sich 25 Minuten bei 4 °C auf einem Nutator (Fisher Scientific) anschlossen. Nach der Inkubation wurden die Zelltrümmer durch Zentrifugieren bei 14 000 × g für 30 Minuten bei 4 °C entfernt. Der Überstand wurde in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen transferiert, und es wurden 5 × 10⁸ 1D4-konjugierte M-280-Dynal-Kügelchen zugegeben. Das Zelllysat wurde mit den Kügelchen 2,5 Stunden bei 4 °C auf einem Nutator inkubiert. Das Röhrchen wurde dann zur Entfernung der Kügelchen in einen Dynal-MPC-S-Magneten gesetzt. Die Kügelchen wurden zweimal mit eiskaltem Puffer gewaschen (entweder 1 % CHAPSO oder Cymal-7, 100 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris, pH 7,5, und 20 % Glycerol). Nach dem Waschen wurden die mit CHAPSO hergestellten Kügelchen in 2,5 ml eiskaltem CHAPSO-Waschpuffer suspendiert, der 1,5 mg 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, 0,75 mg 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin, 0,225 mg 1,2 Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphat und 0,025 mg Biotinyl-Phosphoethanolamin enthielt. Die mit Cymal-7 hergestellten Kügelchen wurden in eiskaltem Waschpuffer mit 1 % Cymal-5, der die oben beschriebenen Lipide enthielt, resuspendiert. Die Lösung wurde dann in einem Slide-A-Lyzer (Pierce, Ausschlussmolekulargewicht 10 kDa) injiziert und 24 Stunden bei 4 °C gegen Waschpuffer ohne Detergens dialysiert. Die Proben wurden in einer speziell konstruierten Apparatur dialysiert, die permanent den Slide-A-Lyzer rotierte, um ein Absetzen der Kügelchen zu verhindern. Nach der Dialyse wurden die paramagnetischen Proteoliposomen aus dem Slide-A-Lyzer entnommen und zweimal in 1 × PBS/2 % FKS gewaschen, um nicht gebundenes Lipid und möglicherweise noch vorhandenes Detergens zu entfernen. Die Proteoliposomen wurden in 1 × PBS/2 % FKS/0,02 % Natriumazid bis zu 2 Monate bei 4 °C gelagert.
Beispiel 3: gp160-haltige Proteoliposomen
Konstruktion und Expression von gp160
Wir haben aus einer festen Phase bestehende, paramagnetische gp120-gp41-Proteoliposomen mittels des folgenden Verfahrens hergestellt. Hüll-Glycoproteine von HIV-1, die aus dem YU2-HIV-1-Primärisolat stammten, wurden transient vom pSVIII-Expressionsplasmid in 293T-Zellen exprimiert. Die Glycoproteine wurden durch die Abänderung von zwei R-Aminosäuren in S-Aminosäuren in Nachbarschaft zur gp120-gp41-Spaltstelle „cleavage-defective" gemacht, um cleavage-defective gp120-Glycoproteine zu generieren. Die Glycoproteine wurden weiter durch eine Verkürzung des cytoplasmatischen Schwanzes modifiziert, was die Expression auf der Zelloberfläche um ein Mehrfaches erhöhte (Daten nicht gezeigt), sowie durch das Anfügen eines C-terminalen C9-Epitop-Tags, das vom C-Terminus des Rhodopsins stammte.
Präparation von gp160-Proteoliposomen
Zellen, die die gp160-Glycoproteine auf ihrer Zelloberfläche exprimierten, wurden in Puffer lysiert, der 1 % des Detergens Cymal-5 enthielt. Die Proteine wurden dann an paramagnetische, tosylaktivierte Dynal-Kügelchen gebunden, an die kovalent der C9-spezifische Maus-Antikörper 1D4 gekoppelt worden war. Während des Prozesses wurde gleichzeitig auch Streptavidin in einem Molverhältnis von IgG zu Streptavidin von 10: 1 an das Kügelchen gekoppelt. Nach mehreren Waschungen in Lysierpuffer wurden die affinitätsgebundenen Proteine in Gegenwart polarer Lipide gegen PBS dialysiert. Die Lipidmischung enthielt 1 % biotinylierte Lipide, um eine Anheftung an dem auf der Oberfläche des Kügelchens derivatisierten Streptavidin zu ermöglichen. Dieser Prozess war so ausgelegt, dass eine verankerte, rekonstituierte Lipiddoppelschicht, die das Kügelchen und den Transmembranbereich der gp160-Moleküle umgab, nukleiert wurde. Eine schematische Darstellung der gp160-Proteoliposomen ist in der 11 gezeigt.
Zusammensetzung der Proteine und der Lipiddoppeischichtmembran der gp160-Proteoliposomen
Wir haben eine gründliche Analyse der gp160-Proteoliposomen durchgeführt um zu bestätigen, dass sowohl die gp160-Moleküle in einem nativen Zustand gebunden waren als auch tatsächlich eine Lipidmembran auf der Oberfläche der Kügelchen rekonstituiert worden war. Die Kügelchen wurden mittels FACS analysiert um zu bestätigen, dass die gp160-Oligomere auf der Oberfläche der Kügelchen sowohl von Seren von Patienten mit AIDS, vom CD4BS-Antikörper-IgGb12, von verschiedenen anderen konformationsempfindlichen monoklonalen Antikörpern und von CD4-IgG erkannt wurden (10A und nicht gezeigte Daten). Die Seren der AIDS-Patienten erkannten das gp160 auf der Oberfläche effizienter als jeder einzelne monoklonaler Antikörper (12A). Dieser Effekt beruht wahrscheinlich auf der polyklonalen Mischung der im Serum vorhandenen Anti-gp160-Antikörper, die viele hüllspezifische Epitope erkennt. Wir bestätigten auch, dass die gebundenen gp160-Glycoproteine relativ rein waren, indem wir die rekonstituierten gp160-Proteoliposomen kochten und den Proteingehalt der Kügelchen auf SDS-Polyacrylamid-Gelen analysierten (12B).
Wir bestätigten, dass die Lipiddoppelschicht rekonstituiert worden war, indem wir die Inkorporation von Rhodamin-konjugiertem Lipid (Rhodamin-DOPE) in die Proteoliposomenmembranen mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar machten (16). Ohne eine vorherige Membranrekonstitution der Kügelchen war keine Fluoreszenzfärbung der Kügelchen durch das Rhodamin-DOPE nachweisbar (Daten nicht gezeigt).
Außerdem wurden Kügelchen, die gebundene gp160-Glycoproteine entweder mit einer oder ohne eine rekonstituierte(n) Membran enthielten, mit einem sekundären Anti-Maus-IgG-Antikörper untersucht um zu bestimmen, ob die Membran den Zutritt des sekundären Antikörpers zu dem mit dem Kügelchen konjugierten Maus-Antikörper 1D4 verhinderte. Eine FACS-Analyse zeigte, dass der PE-konjugierte sekundäre Antikörper die Kügelchen, die eine rekonstituierte Membran enthielten, in signifikant geringerem Ausmaß erkannte als gp160-Kügelchen, die keine Membran enthielten (11, Peak B im Vergleich zu Peak C). Nach unserer Interpretation bedeuten diese Daten, dass eine Membran in signifikantem Ausmaß um die Oberfläche des Kügelchens rekonstituiert worden war.
Um zu bestätigen, dass die Konformation der gp160-Oligomere gegenüber derjenigen auf der Zelloberfläche durch das Verfahren der Proteoliposomenbindung und -rekonstitution nicht verändert wurde, haben wir eine vergleichende Bindungsstudie mittels FACS durchgeführt. Diese Analyse zeigte, dass die Erkennung der oligomeren Hüll-Glycoproteine durch IgGb12 auf der Zelloberflächen und der Oberfläche der gp160-Proteoliposomen gleich war (12A). Eine halbmaximale Bindung des IgGb12-Antikörpers wurde bei einer Antikörperkonzentration von unter 1 µg/ml erhalten. Diese Konzentration stimmt mit früheren Abschätzungen überein, dass die Affinität des IgG b12 für das sehr neutralisierungsresistente YU2-Virus im unteren nanomolaren Bereich liegt (Burton et al., Science (1994) 266: 1024-1027). Im Gegensatz dazu erforderte der nicht neutralisierende C1/C5-konformationelle Antikörper C11 wenigstens 10- bis 15fach höhere Konzentrationen, um eine geschätzte halbmaximale Bindung zu erzielen (12B). Das könnte eine Unterschätzung der zur Erzielung der halbmaximalen Bindung erforderlichen Antikörperkonzentration darstellen, da in diesem Experiment keine Sättigungsbindung erreicht wurde. Auf jeden Fall heben diese Ergebnisse die Tatsache hervor, dass sich die Proteoliposomen auf eine Weise verhalten, die mit der Annahme konsistent ist, dass sich die gp160-Glycoproteine auf der Oberfläche der Kügelchen in einer nativen Konformation befinden, die der Konformation der Hüll-Glycoproteine des Virus entspricht.
Beispiel 4: Screening einer Phage-Display-Bibliothek mit gp160-haltigen Proteoliposomen
Die definierten, rekonstituierten gp160-Proteoliposomen wurden dazu eingesetzt, eine hochkomplexe Phage-Display-Bibliothek humaner einzelkettiger Antikörper zu analysieren, die im Labor von Dr. Wayne Marasco am Dana-Faber Cancer Institute generiert worden war. Nach fünf Panning-Runden wurden 96 Klone analysiert. 87 der 96 Klone waren für gp120 spezifisch, wie mittels eines ELISA bestimmt wurde (Daten nicht gezeigt). Die 9 nicht-reaktiven Klone könnten Oligomer-spezifische Antikörper oder irrelevante Reaktivitäten repräsentieren. Um zu bestätigen, dass der isolierte Phage einzelkettige Antikörper besaß, die spezifisch für gp160 sind, wurde eine FACS-Analyse der Zellen, die gp160 exprimierten durchgeführt, wobei anti-gp120-spezifisches Serum mit dem bakteriellen Überstand, einem Maus-Anti-M13-Phagen-IgG und Anti-Maus-PE verglichen wurde (15). Eine weitere Analyse der löslichen, vom Phagen präsentierten einzelkettigen Antikörper zur Bestimmung ihrer Spezifität ist im Gange. Auf jeden Fall zeigen diese faszinierenden vorläufigen Daten das Potenzial der gp160-Proteoliposomen zur Selektion und möglicherweise Bewirkung einzigartiger, gegen die Hülle gerichteter Reaktivitäten.
Beispiel 5: Antikörper gegen gp160-haltige Proteoliposomen
Um zu bestätigen, dass die gp160-Proteoliposomen für Hüll-Glycoproteine spezifische Antikörper hervorrufen können, wurden Balb/c-Mäuse i.p. mit 5 × 10⁷ Proteoliposomen immunisiert. Über eine Gelanalyse schätzten wir, dass jede Maus 1-2 µg Hüll-Glycoprotein pro Inokulation erhielt. Um sicherzustellen, dass das Adjuvans nicht die Integrität der rekonstituierten Membran zerstören würde, präimmunisierten wir in einem Experiment Mäuse 24 Stunden vor der Inokulation der Kügelchen i.p. mit Ribi-Adjuvans. Anschließend führten wir Studien zur Membranstabilität durch, indem wir Rhodamin-DOPE-gefärbte gp160-Proteoliposomen 2 und 24 Stunden in Ribi-Adjuvans inkubierten. Die Kügelchen wurden fluoreszenzmikroskopisch dargestellt, und es wurde keine Abnahme des Rhodamin-DOPE-Signals auf Kügelchen gefunden, die dem Adjuvans ausgesetzt worden waren (Daten nicht gezeigt). Weitere Mäuse können zur Optimierung quantitativer Antikörperreaktionen mit Kügelchen in Ribi-Adjuvans über verschiedene Wege immunisiert werden.
Für die initiale Studie wurden 2 µg monomeres YU2-gp120 in Ribi-Adjuvans als Positivkontrolle verwendet, und Membran-rekonstituierte Kügelchen ohne gp160-Glycoprotein wurden als Negativkontrollen verwendet. Nach 3 Inokulationen haben wir Anti-gp120-Antikörper sowohl in den Seren der Mäuse der Kontrollgruppe mit monomerem gp120 als auch der Gruppe mit gp160-Kügelchen nachgewiesen, aber nicht in den Seren der Mäuse der Negativkontrolle (17). Diese Studie demonstriert, dass es machbar ist, gp160-Proteoliposomen als Immunogene zur Bestimmung einzusetzen, ob sie besser neutralisierende Antikörper hervorrufen oder ob sie Trimer-spezifische Antikörper hervorrufen, die isoliert und mittels einer monoklonalen Analyse charakterisiert werden können. Solche Reagenzien sind unschätzbare Werkzeuge für die weitere Aufklärung der Struktur höherer Ordnung von HIV-1-Hüll-Glycoproteinen.

Claims

Stabiles Proteoliposom, umfassend: eine sphärische oder ellipsoide Form mit einem Liganden für ein integrales Membranprotein, der an der Form verankert ist, wobei die Oberfläche der Form von einer Lipidmembran umgeben ist, wobei die Lipidmembran eine Lipid-Doppelschicht ist; und ein isoliertes integrales Membranprotein, das an den Liganden gebunden ist, wobei die Transmembrandomäne(n) des integralen Membranproteins in der Lipidmembran angeordnet ist (sind), und wobei das integrale Membranprotein seine Wildtyp-Konformation aufweist.
Stabiles Proteoliposom nach Anspruch 1, das außerdem ein Haftmittel für einen Bestandteil der Lipid-Doppelschicht aufweist, wobei sich das Haftmittel auf der Oberfläche der Form befindet und die Lipidmembran durch Beschichten der Oberfläche der Form mit einer Lipidlösung ausgebildet ist, die den Bestandteil enthält, der an das Haftmittel bindet.
Stabiles Proteoliposom nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Konformation des integralen Membranproteins für wenigstens einen Tag stabil ist.
Stabiles Proteoliposom nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem das integrale Membranprotein wenigstens zwei Transmembrandomänen aufweist.
Stabiles Proteoliposom nach Anspruch 2 oder 3, bei dem das Haftmittel Streptavidin oder Avidin ist und der Bestandteil der Lipidmembran Biotin ist.
Stabiles Proteoliposom nach Anspruch 5, bei dem der Ligand ein Antikörper ist.
Stabiles Proteoliposom nach Anspruch 5, bei dem das integrale Membranprotein wenigstens zwei Transmembrandomänen aufweist.
Stabiles Proteoliposom nach Anspruch 6 oder 7, bei dem das integrale Membranprotein aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus G-Protein gekoppelten Rezeptoren, Ionenkanälen, Aminosäuretransportern, Glukosetransportern, Phosphattransportern, Chemotaxisrezeptoren, Connexinen, CIC-Kanälen und cystische-Fibrose-Transmembran-Regulatoren.
Stabiles Proteoliposom nach Anspruch 8, bei dem das integrale Membranprotein ein G-Protein gekoppelter Rezeptor ist.
Proteoliposom nach Anspruch 8 zur Verwendung als ein Antigen.
Verfahren zur Herstellung eines stabilen Proteoliposoms nach Anspruch 1, das umfasst: a) Isolieren eines integralen Membranproteins aus einer Zelle, die das integrale Membranprotein exprimiert, mit einem Detergens unter Bedingungen, bei denen die Wildtyp-Konformation des integralen Membranproteins erhalten bleibt; b) Hinzufügen des Detergens, das das isolierte integrale Membranprotein enthält, zu einer sphärischen oder ellipsoiden Form, wobei die Form einen Liganden für das integrale Membranprotein aufweist, der an der Oberfläche der Form verankert ist; c) Hinzufügen einer Lipidlösung zu der Form von Schritt (b), um eine Lipidmembran zu bilden; und d) Entfernen des Detergens von der mit der Lipidmembran umgebenen Form von Schritt (c) unter Bedingungen, bei denen Konformation des integralen Membranproteins nicht verändert wird.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Form mit einem Haftmittel für einen Bestandteil der Lipidmembran beschichtet ist, wobei die Lipidmembran durch Beschichten der Oberfläche der Form mit einer Lipidlösung ausgebildet wird, die den Bestandteil enthält, der an das Haftmittel bindet, und wobei die Lipidlösung einen Bestandteil aufweist, der an das Haftmittel bindet, wobei eine von der Lipidmembran umgebene Form ausgebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das gebildete Proteoliposom die Konformation des integralen Membranproteins für eine Zeitdauer von wenigstens einem Tag stabil hält.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das integrale Membranprotein wenigstens zwei Transmembrandomänen aufweist.
Verfahren nach Anspruch 11, 12, 13 oder 14, bei dem der Ligand ein Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 11, 12, 13 oder 14, bei dem das Detergens aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus CHAPSO, Alkylglucopyranosiden, Alkylsaccharosen, Digitonin, Hydroxyethylglucamiden, Oligoethylenglycolderivaten, Dodecylmaltopyranosid und Phenylpolyoxethylenen besteht.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem das Haftmittel Streptavidin oder Avidin ist und der Bestandteil der Lipidlösung Biotin ist.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das Detergens Cyclohexyl-pentyl-β-D-maltosid, Cyclohexyl-hexyl-β-D-maltosid oder Cyclohexyl-heptyl-β-D-maltosid ist.
Verfahren nach Anspruch 18, bei dem das integrale Membranprotein ein G-Protein gekoppelter Rezeptor ist.