DE60009269T2 - Immunogene zusammensetzungen, die als impfstoffe verwendbar sind - Google Patents

Immunogene zusammensetzungen, die als impfstoffe verwendbar sind Download PDF

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Description

  • Die Erfindung betrifft immunogene Zusammensetzungen, die bei Säugetieren gegen infektiöse Krankheitszustände, besonders als Impfstoffe, verwendbar sind.
  • Die erfindungsgemäß in Betracht gezogenen Krankheitszustände sind vom zellabhängigen Typ, d.h., daß der Infektionsprozeß sich nach der Bindung des pathogenen Agens an eine Zielzelle des Säugetiers entwickelt, ob darauf die Fusion folgt oder nicht.
  • Bekannt ist, daß bestimmte Regionen dieser pathogenen Agenzien die Hauptrolle in den von ihnen hervorgerufenen Infektionen spielen.
  • Was also beispielsweise HIV betrifft, haben verschiedene Arbeiten gezeigt, daß die Regionen, die in den Interaktionen mit den Rezeptoren der Zielzellen (Rezeptor CD4 und Rezeptoren von Chemokinen, wie CCR5 und CXCR4) beteiligt sind, Regionen sind, die von der Hülle des Virus konserviert sind.
  • Die Bildung von Antikörpern gegen diese Regionen stößt bisher auf das Problem des Zugangs zu den interessierenden Epitopen. Komplexe Interaktionen und Strukturveränderungen laufen während der Bindung des Virus an die Zielzelle und dann bei der Fusion ab, was im Ergebnis den Zugang zu den Epitopen der fusionierten Regionen hindert und diejenigen Regionen schwer zugänglich macht, welche den direkt in die Interaktion mit den Zielzellen verwickelten benachbart sind, deren Exposition außerdem von kurzer Dauer sein kann.
  • Mit einem experimentellen System, das in "Science", Bd. 283, 15. Januar 1999 beschrieben wurde, haben LaCasse et al. bei der Maus wahrscheinlich die Bildung von Antikörpern erhalten, die gegenüber infektiösen Isolaten von HIV neutralisierend sind, was also einem gewissen Grad von Zugänglichkeit der genannten Epitope entspricht. Das vorgeschlagene System wird erhalten durch Fusion von Affen-Fibroblasten, die modifiziert sind, um die funktionelle Hülle eines primären Isolats von HIV-1 (P168) zu exprimieren, mit humanen Neuroblastomen, welche den Rezeptor CD4 und den Corezeptor CCR5 exprimieren, und anschließende Fixierung des gebildeten Komplexes vier bis fünf Stunden nach dem Beginn der Fusion mit Formaldehyd. In Versuchen an der Maus hat sich ein solcher Komplex als fähig gezeigt, Antikörper zu bilden, die gegenüber infektiösen Isolaten von HIV neutralisierend sind, die von einem sehr großen Fächer von Untertypen stammen.
  • Jedoch ist ein solches System beim Menschen nicht verwendbar wegen der potentiel len Gefahr von zellularen Populationen, die den immunogenen Komplex bilden.
  • Außerdem garantieren die zur Ausarbeitung des Systems angewandten Bedingungen nicht die Aufrechterhaltung der Konformation der Epitope und den Zugang zu einer großen, interessierenden Region.
  • Durch Steuern des Fortschritts der Fusion und der Bedingungen der Realisierung der Fixierung haben die Erfinder Komplexe mit einem Zustand erhalten, wo die interessierenden Epitope, einschließlich der Epitope in der Nähe derjenigen, die in der Fusion eine Rolle spielen, in einer besonders befriedigenden Weise exponiert sind und in ihrer natürlichen Konformation erhalten bleiben müssen. Die bei solchen Komplexen nachgewiesenen, immunogenen Eigenschaften machen sie also zu Kandidaten der Wahl zur Ausarbeitung von Impfstoffen, wobei sie den erheblichen Vorteil aufweisen, daß sie beim Menschen verwendbar sind, wenn man zur Gewinnung der Komplexe die geeigneten Produkte einsetzt.
  • In vorteilhafter Weise haben sich solche Systeme als allgemein anwendbar für alle Typen von pathogenen Agenzien mit einem infektiösen Prozeß erwiesen, der eine Stufe der Bindung aufweist, auf welche die Fusion oder keine Fusion mit den Zielzellen folgt.
  • Die Erfindung hat daher zum Ziel, immunogene Zusammensetzungen und Impfstoffzusammensetzungen zu liefern, die bei Säugetieren gegen infektiöse Pathologien verwendbar sind, die von einer zellularen Infektion abhängen.
  • Die Erfindung betrifft auch die immunogenen Komplexe, die in diesen Zusammensetzungen eingesetzt werden, als neue Produkte sowie die Antikörper, die gegen die Epitope der Regionen des pathogenen Mittels in der Nachbarschaft und selbst die in der unmittelbaren Nähe der bei der Fusion mit der Zielzelle betroffenen gebildet werden.
  • Die erfindungsgemäßen Immunogenzusammensetzungen sind dadurch gekennzeichnet, daß sie gewonnen sind, ausgehend von Präparaten, die erhalten wurden durch:
    • – Inkubation von ersten Mitteln, welche den Zielrezeptor oder die Zielrezeptoren eines infektiösen, pathogenen Agens, wie oben definiert, exprimieren, mit zweiten Mitteln, die mindestens die Regionen des pathogenen Agens exprimieren, welche diese Ziele erkennen, unter Bedingungen, welche die Interaktion der ersten und zweiten Mittel zur Bildung eines Komplexes ermöglichen, wobei diese Inkubationsstufe über Zeiten von verschieden langer Dauer durchgeführt wird, um zu Komplexen zu führen, die verschiedenen Stadien der Fusion entsprechen und damit verschiedene Expositionen und Konformationen von neu demaskierten Epitopen zeigen, und
    • – In-Kontakt-Bringen der gebildeten Komplexe mit einem Fixationsmittel während ver schieden langer Zeiten, um Komplexe mit verschiedenen Expositionen und Konformationen der Epitope zu fixieren, gegen welche man Antikörper bilden möchte,
    wobei die ersten und zweiten Mittel aus Produkten gewählt werden, die von Säugetieren toleriert werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung sind die ersten Mittel autologe Zellen von Säugetieren. Es handelt sich um gesunde Zellen, die vom zu impfenden Säugetier stammen, besonders vom Menschen, beispielsweise totale PBMC, isolierte Lymphozyten oder Makrophagen.
  • Diese Zellen werden, falls erforderlich, so stimuliert, daß sie in genügender Menge den Rezeptor oder die Rezeptoren exprimieren, die für die gewünschte Interaktion erforderlich sind.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind die genannten, ersten Mittel Vektoren, welche den Zielrezeptor oder die Zielrezeptoren an ihrer Oberfläche exprimieren. Zu solchen Vektoren gehören beispielsweise virale Vektoren, wie der Baculovirus, der Semliki-Forest-Virus (SFV) oder auch Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae.
  • Nach einer noch anderen Ausführungsart der Erfindung sind die genannten, ersten Mittel Liposome, die an ihrer Oberfläche den oder die richtig präsentierten Zielrezeptoren tragen, und so die Zielzellen nachahmen.
  • Die transmembranen Zielrezeptoren (bei einer oder mehreren Passagen) werden in den Liposomen eingeschlossen, ausgehend von Rezeptoren, die dank Expressionsvektoren in großen Mengen an der Oberfläche von Zellen, ob von Insekten, Hefen oder Säugetieren, exprimiert werden (106 bis 107/Zelle). Die Passage von Rezeptoren von Zellen zu den Liposomen erfolgt nach Isolierung von Zellmembranen, ihrer Behandlung mit einem geeigneten Tensid nach den von J. L. Rigaud festgelegten Protokollen (siehe Referenz hiernach) und schließlich ihrem Einschluß in den geeigneten Membranen.
  • Erfindungsgemäß sind die zweiten, eingesetzten Mittel diejenigen, welche wenigstens die Regionen des infektiösen, pathogenen Agens exprimieren, die sich an die Zielzellen binden und mit diesen fusionieren können.
  • Zweite Mittel, die erfindungsgemäß eingesetzt werden, bestehen so aus Zellen, die zuvor mit einem Vektor transformiert wurden, der wenigstens eine Region der Bindung an mindestens einen Zielrezeptor trägt. Es handelt sich vorteilhafterweise um virale Vektoren, wie sie oben angesprochen wurden, nämlich den baculovirus, SFV oder auch Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae.
  • Als Variante bestehen die zweiten Mittel aus den viralen Vektoren selbst.
  • In einer anderen Variante sind die zweiten Mittel infizierte Zellen, welche die pathogenen Agenzien produzieren, oder bestehen aus den infektiösen, pathogenen Agenzien selbst.
  • Die oben angesprochenen, pathogenen Agenzien können Viren, besonders Retroviren, Bakterien, Mycobakterien oder Parasiten, wie Plasmodium sp, Leishmania sp, Trypanosoma cruzi und Trypanosoma brucei, sein.
  • Die Erfindung besitzt ein besonderes Interesse im Fall von HIV, wobei dieser Ausdruck in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird, um sowohl die Isolate verschiedener humaner oder animaler Stämme sowie den Virus mit einer natürlichen oder rekombinanten, gegebenenfalls mutierten Hülle zu bezeichnen.
  • Die Erfindung sieht so besonders immunogene Zusammensetzungen vor, in denen diese genannten Zubereitungen durch Inkubation von ersten Mitteln erhalten sind, welche den Rezeptor CD4 und/oder Co-Rezeptoren des HIV exprimieren, mit zweiten Mitteln, die wenigstens die konservierten Regionen der Hüllproteine gp120 oder gp160 exprimieren.
  • Der Ausdruck "Hüllprotein", wie in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, umfaßt sowohl das natürliche Protein, wie die rekombinanten Proteine, wie sie dem Fachmann bekannt sind, oder mutierte Proteine. Letztere weisen den Vorteil auf, daß sie die Identifizierung von Orten der Hülle ermöglichen, die in der Identifizierung durch die Antikörper eine Rolle spielen, so wie diese nach ihrer Fusion mit den Zielrezeptoren erzeugt wurden.
  • In solchen Zusammensetzungen bestehen die ersten, benutzten Mittel aus autologen Zellen von Säugetieren, wie oben angegeben. Diese Zellen sind so stimuliert, daß sie in einer für die gewünschte Interaktion genügenden Menge dem Rezeptor CD4 und/oder Co-Rezeptoren von CD4, wie CCR5, CXCR4, das Proteinband 3 oder andere, transmembrane Proteine exprimieren. Die Stimulation erfolgt beispielsweise mit PHA und/oder IL2.
  • Als Variante sind die genannten, ersten Mittel virale Vektoren, die an ihrer Oberfläche CD4- und/oder Co-Rezeptoren von HIV exprimieren. Wie oben angegeben, umfassen solche Vektoren das baculovirus, SFV oder auch Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae.
  • In noch einer anderen Variante sind diese ersten Mittel Liposome, die an ihrer Oberfläche den Rezeptor CD4 und/oder Co-Rezeptoren, wie oben angegeben, exprimieren. Diese Liposome können so den Rezeptor CD4 und/oder Co-Rezeptoren des HIV aufweisen.
  • In solchen Zusammensetzungen, die vorteilhafterweise eines der oben betrachteten, ersten Mittel aufweisen, exprimieren die benutzten, zweiten Mittel mindestens die konservierten Regionen der Hüllproteine gp120 oder gp160.
  • Diese zweiten Mittel bestehen aus Zellen, die zuvor mit einem Vektor der viralen Hülle des HIV transformiert wurden oder wenigstens aus konservierten Regionen der Proteine gp120 oder gp160. Es handelt sich vorteilhafterweise um virale Vektoren, wie oben angesprochen.
  • Als Variante bestehen die zweiten Mittel aus den viralen Vektoren selbst.
  • In einer anderen Variante sind die zweiten Mittel infizierte Zellen, die HIV produzieren oder bestehen aus dem HIV-Virus selbst. Man benutzt vorteilhafterweise einen fusogenen Virus, der von primären Isolaten stammt.
  • Es sei daran erinnert, daß erfindungsgemäß die Proteine gp120 oder gp160 oder die Proteine, welche mindestens konservierte Regionen der Proteine gp120 oder gp160 aufweisen, in natürlicher Form oder in rekombinanter Form oder in mutierter Form vorliegen.
  • In vorteilhafter Weise bestehen die zweiten Mittel aus solchen Proteinen und umfassen daher ein lösliches gp-120-Monomer, gegebenenfalls in rekombinanter Form, oder ein Oligomer von gp120 oder gp160, ebenfalls gegebenenfalls in rekombinanter Form. Es kann sich auch um Teile dieser Proteine handeln, die mindestens die konservierten Regionen aufweisen.
  • In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung umfassen die zweiten Mittel einen monoklonalen Anti-Co-Rezeptor-Antikörper. Es handelt sich beispielsweise um die monoklonalen Antikörper 17b, 48d oder CG10. Diese Maßnahme ermöglicht den Zugang zu interessierenden Epitopen in der Nähe des Bindungsortes an den Co-Rezeptor an gp120.
  • Bevorzugte Zusammensetzungen dieses Typs liegen in molekularer Form vor und weisen das lösliche CD4 als erstes Mittel, das lösliche Monomer gp120 als zweites Mittel und einen monoklonalen Antikörper, wie oben definiert, oder ein Fragment Fab eines solchen Antikörpers auf.
  • Die Inkubation der ersten und zweiten Mittel wird so durchgeführt, daß ein Komplex gebildet wird, in dem die ersten Mittel sich in einem Fusionsprozeß mit den zweiten Mitteln befinden.
  • Es ist vorteilhaft, diese Stufe mit verschiedener Dauer durchzuführen, wodurch man über verschiedene Stadien der Fusion verfügt und durch Test am Tier das Stadium wählen kann, das die besten Ergebnisse bezüglich der gewünschten, immunogenen Eigenschaften liefert.
  • Ganz allgemein arbeitet man mit Zeiten zwischen 15 Minuten bis 5 Stunden.
  • Die Konformationen dieser verschiedenen Stadien werden fixiert durch Zugabe eines Mittels, das die Fusion stoppen kann, ohne die interessierende, epitope Signifikanz zu denaturieren.
  • Ein in dieser Hinsicht ganz besonders bevorzugtes Fixierungsmittel besteht aus 2,2'-Dithiopyridin(Aldidrithiol-2 oder abgekürzt AT-2).
  • Andere Mittel können verwendet werden, besonders, wenn man Anwendungen in der Forschung im Blick hat, beispielsweise Formol.
  • Die Fixierung wird über verschiedene Zeitdauern vorgenommen, was es ermöglicht, die Effekte der Kinetik der Fixierung auf die Immobilisierung der präsentierten Epitope zu untersuchen.
  • Die erhaltenen Zubereitungen werden gewonnen, gewaschen und in einem geeigneten Puffer suspendiert.
  • Man bewertet anschließend am Tier die besten Zeiten der Fusion und Fixierung, um die beste Immunantwort zu induzieren und die Antikörper zu erzeugen, welche die Infektion verhindern.
  • Die Erfindung betrifft also als neue Produkte die Antigenkomplexe, die sich aus den Stufen der Fusion und Fixierung ergeben.
  • Diese Komplexe, besonders in kristallisierter Form, ermöglichen in vorteilhafter Weise die Untersuchung und den Nachweis der Interaktionsorte des gp120 und/oder gp41 der Hülle, jedoch auch der Region in unmittelbarer Nachbarschaft dieser Orte.
  • Im Bereich der Erfindung liegt auch das Verfahren zur Herstellung der oben definierten, immunogenen Zusammensetzungen. Dieses Verfahren umfaßt die Anwendung der ersten und zweiten Mittel, deren Fusion und deren Fixierung, wie oben definiert.
  • Die Untersuchung der immunologischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ermöglichte den Nachweis ihrer starken, immunogenen Wirkung.
  • So haben die Seren, die nach Verabreichung dieser Zusammensetzungen an transgenische Mäuse CD4+, CXCR5+ oder an Kaninchen erhalten wurden, hohe Grade an Antikörpern gezeigt.
  • Diese Seren sowie aus ihnen erhaltene Antikörper können nach üblichen Methoden gereinigt werden und bilden einen Teil der Erfindung.
  • Diese Antikörper sind so charakterisiert, daß sie gemäß einer Reaktion vom Typ Antigen-Antikörper ein infektiöses, pathogenes Agens erkennen und so seine Infektionsfähigkeit verhindern können.
  • Wie die in vivo an Säugetieren durchgeführten Untersuchungen zeigen, sind die Seren und gereinigten Antikörper in der Lage, die Infektionsfähigkeit eines großen Spektrums von primären Isolaten von HIV zu verhindern.
  • Die Erfindung schafft daher Impfstoffzusammensetzungen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine wirksame Menge von immunogenen Zusammensetzungen, wie oben definiert, mit einem inerten Träger, der für die Verabreichung an ein Säugetier annehmbar ist, gegebenenfalls zusammen mit einem Hilfsmittel umfassen.
  • Als Hilfsmittel, das in der Lage ist, die Immunreaktion des Organismus des zu impfenden Säugetiers zu verstärken, seien erwähnt die mineralischen Hilfsstoffe, wie Aluminiumphosphat, die öligen Hilfsstoffe, wie der unvollständige Freund-Hilfsstoff, Hilfsstoffe von bakterieller Herkunft, wie der vollständige Freund-Hilfsstoff. Ein besonders bevorzugter Hilfsstoff besteht aus dem Hilfsstoff Ribi.
  • Die Impfstoffzusammensetzung wird durch Injektion oder auch oral verabreicht mit einer Wiederholung drei Monate nach der Injektion.
  • Die Impfstoffzusammensetzungen werden in einer Menge und gemäß einem Protokoll verabreicht, daß sie dem Wirt eine Immunität hinsichtlich der Antigene des infektiösen, pathogenen Agens verleihen.
  • Die Erfindung wird mit weiteren Einzelheiten und Vorteilen erläutert durch die folgenden Beispiele.
  • Herstellung einer zellularen, immunogenen Zusammensetzung
  • Man verwendet einerseits autologe, humane Zellen, die dem zu impfenden Patienten entnommen wurden, und nach Stimulation mit PHA/IL2 während 3 bis 6 Tagen CD4/CCR5 und CXCR4 exprimieren, wobei man nach der Methode von Riley et al., "JVI", 1998, 71: S. 8273–8280 arbeitet, und andererseits ein primäres Isolat von HIV-1 oder von durch ein solches Isolat infizierten Zellen.
  • Man verteilt diese zwei Populationen in verschiedene Petrischalen für eine Inkubation bei 37°C während verschiedener Zeitdauern von jeweils 15, 30, 45, 60, 120, 180, 240 und 300 Minuten. Für jede Untersuchung verwendet man 3 × 106 bis 108 autologe Zellen und beispielsweise das Primärisolat 92 HT 593 oder ACH 168.10 des Aids Research and Reference Reagent Programm, NIH (USA), welche die zwei Co-Rezeptoren CXCR4 und CCR5 des HIV verwenden.
  • Am Ende der vorgesehenen Zeitdauer fügt man das AT-2 im Verhältnis von 600 bis 1000 μm, gelöst in PBS zu. Die Fixierung wird bei 4°C während einer Zeit, wie von Rossio et al., "JVI", 1998, 72, S. 7992 empfohlen, oder 1 bis 12 Stunden durchgeführt. Die gebildeten, zellularen Komplexe werden mit PBS gewaschen, gewonnen und im Verhältnis von 106 bis 108 zellulare Komplexe/0,1 ml in PBS/(DM50 10%) wieder suspendiert, um sie bei –80°C zu konservieren.
  • Das gefrorene Immunogen wird aufgetaut und mehrere Male gewaschen, dann mit der gleichen Menge eines Hilfsmittels, beispielsweise Ribi (R-700 oder R-730), versetzt.
  • Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung mit viralen Vektoren
  • Man arbeitete wie in Beispiel 1, verwendet jedoch einerseits ein baculovirus-System, das die Rezeptoren CD4 und CCR5 und/oder CXCR4 an seiner Oberfläche trägt, andererseits den Vaccinia-Virus oder den Semliki-Forest-Virus, der das Monomer gp120 oder das Oligomer von gp120 und gp41 trägt. In anderen Untersuchungen verwendet man ein Baculovirus-System, das die Expression von Proteinen in seiner eigenen Membran ermöglicht (Boublick et al., "Biotechnology", 1995, 13: S. 1079–84).
  • Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung auf der Basis von Liposomen
  • Man arbeitet, wie oben in Beispiel 1 angegeben, verwendet jedoch Liposome, die an ihrer Oberfläche CD4 und CCR5 und/oder CXCR4 tragen. Um diese Liposome herzustellen, wendet man die Erkenntnisse von Rigaud et al. in "Biochim. Acta Phys.", 1995, 1231: S. 223–246 oder von Pitard et al. in "Eur. J. Biochem.", 1996, 235, S. 3769–3778 an, welche Liposome beschreiben, die funktionelle Membran- oder Transmembranproteine tragen. Man läßt sie mit den Hüllen von HIV-1 oder HIV-2 mit dem Ziel der Fusion inkubieren. Es handelt sich entweder um HIV-Virus mit verschiedenen, rekombinanten Hüllen (Verwendung von pseudotypischen, komplementierten Viren) oder um virale Vektoren, welche die rekombinanten Hüllen von HIV tragen. Für die Passage von Transmembranrezeptoren von zellularen Membranen zu den Liposomen benutzt man Vektoren mit starker Expression, wie den Vaccinia-Virus, den baculovirus oder Saccharomyces cerevisiae, welche ermöglichen, 100 bis 107 Kopien des Rezeptors pro Zelle zu erhalten.
  • Impfstoffzubereitung, die einem Säugetier gegen eine HIV-1-Infektion verabreicht wird
  • Man verwendet eine immunogene Zusammensetzung nach Beispiel 3, die zuvor am Tier getestet wurde, um ihre Fähigkeit zur Erzeugung einer Antikörperantwort zu bewerten. Diese Zusammensetzung wird mehrere Male in PBS gewaschen, in einem physiologischen Serum suspendiert, und dann wird zu dieser Zusammensetzung als Hilfsmittel Ribi hinzugefügt.
  • Das Präparat wird im Verhältnis von 0,05 ml auf 1 ml Versuchstieren injiziert (Mäusen, Affen, Mensch, je nach dem Fall). Man führt eine Wiederholung 4 bis 6 Monate später durch.
  • Klonierung und Expression des Co-Rezeptors CCR5 und/oder des Rezeptors CD4 an der Oberfläche von Insektenzellen
  • Klonierung von CCR5/6-Histidin und Expression von baculovirus
    • 1. Das pcDNA3 CCR5 enthält die komplette Sequenz des humanen CCR5 (Zugangsnummer bei der Genbank: NM000579). Man amplifiziert die C-Endregion zwischen der Stelle Eco-R1 und TGA durch PCR. Ausgehend von ATG (+10) ist die Stelle EcoRI in Position 793 und das Stoppkodon in Position 1066.
    • 2. Dieses Fragment wird in einem Plasmid pUC18 kloniert, dann sequenziert; dann wird das Fragment wieder eingesetzt in pcDNA3 CCR5 in EcoRI-Xbal.
    • 3. So wird das Plasmid pcDNA3 CCR5 modifiziert und wird zu pcDNA3 CCR5-6HIS.
    • 4. Das Gen CCR5 mit seinem tag 6HIS in C-Endstellung wird vom pcDNA3 durch BamHI-BamHI-Schnitt extrahiert.
    • 5. Das Gen CCR5-6HIS wird dann durch BgI II-bg1 I dem Promotor p10 des (baculo)Transfervektors p119 nachfolgend eingeführt.
    • 6. Nachdem das Gen CCR5-6HIS dem Transfervektor p119 zugefügt wurde, wird er mit der DNA des Virus AcSLP10 in den Insektenzellen Sf9 (Autographa californica) co-transfiziert.
    • 7. Die Expression von CCR5-6HIS wird an der Oberfläche dieser Zellen erhalten. Die Dichte dieser CCR5-6HIS wird durch Scatchard bewertet (REF).
    • 8. Die funktionelle Charakterisierung dieses Rezeptors wird bewertet durch die Fähigkeit des HIV-Virus oder der gp120 von HIV, sich an diesen Zellen zu fixieren.
  • Klonierung von CD4
  • Man verfährt nach einem Protokoll des gleichen Typs:
    • 1. Zum Plasmid pGEM-T, welches das Gen CD4 enthält, wird das tag-6-Histidin hinzugefügt. Ausgehend vom ATG (+1) ist die Stelle Bsu361 in der Position 1087 und das Stoppcodon in der Position 1375.
    • 2. Das mit 6 Histidinen in C-Endstellung versetzte Gen CD4 wird auf den Promotor des Polyedrins folgend in den Transfervektor pGEMAc116T durch BgI II-bgI I eingeführt.
    • 3. Der Transfervektor pGEMAc116T CD4-6 HIS wird mit der DNA des AcSLP10-Virus in den Sf9-Insektenzellen (Autographa californica) co-transfiziert.
    • 4. Die Expression des CD4-6HIS wird an der Oberfläche dieser Zellen erhalten. Die Dichte dieser CCR5-6HIS wird bewertet durch Scatchard (Cahoreau et al., 1992, "Biochemie", 74, 1053–1065).
    • 5. Die funktionelle Charakterisierung dieses Rezeptors wird bewertet durch die Fähigkeit des Virus oder der gp120 des HIV, sich an diesen Zellen zu fixieren.
  • Expression des doppelt rekombinanten CD4 oder des CCR5
    • 1. Die Gene CCR5-6HIS und CD4-6HIS werden jeweils in den Vektoren p119 und pGEMAc116T kloniert.
    • 2. Die Expression von CCR5-6HIS wird unter Steuerung des Promotors p10 und des CD4-6HIS unter Steuerung des Promotors des Polyedrins bewirkt.
    • 3. Die 2 Transfervektoren werden mit der DNA des AcSLP10-Virus in Sf9-Insektenzellen (Autographa californica) co-transfiziert.
    • 4. Man erhält so Sf9-Zellen, die an ihrer Oberfläche ein rekombinantes Doppel-CCR5-6HIS und DC4-6HIS in gleichen Anteilen exprimieren.
  • Reinigung von an CCR5 oder CD4 angereicherten, zellularen Membranen und Herstellung entsprechender Proteoliposomen
  • Ausgehend von zellularen Membranen Sf9 kann man die Rezeptoren in Liposomen rekonstituieren, die enthalten:
    • 1. Nur CCR5.
    • 2. Nur CD4.
    • 3. CCR5 und CD4 in Anteilen, die gewählt sind, ausgehend von Zellen, die getrennt CCR5 und CD4 exprimieren.
    • 4. CCR5 und CD4 in Anteilen, die gewählt sind, ausgehend von Zellen, die gleichzeitig und in identischen Mengen CCR5 und CD4 exprimieren.
  • Es handelt sich darum, Hüllen von HIV zu erhalten, die mit dem Co-Rezeptor von HIV fusionieren, dann diese Fusion mittels eines Fixators, wie Paraformaldehyd oder Glutar aldehyd, zu stoppen und dieses immunisierende Paar transgenischen Mäusen huCD4/huCCR5 oder Modellen von Makaken oder anderen Affen zu injizieren. Entsprechend den Ergebnissen können die Präparate dann beim Menschen injiziert werden.
  • Das gleiche System wird realisiert für CXCR4.
  • Strategien für die Rekonstitution von transmembranen Proteinen in Proteoliposomen
  • Die Zellen Sf9 von Autographa californica, welche die Rezeptoren CCR5 (oder CXCR4) und/oder CD4 überexprimieren, werden mit geeigneten Tensiden digeriert, um Proteoliposome nach einem Verfahren zu erhalten, das abgeleitet ist von Rigaud et al., 1988, "Biochemistry", 27, S. 2677–2688; Paternostre et al., "Biochemistry", 1988, 28, S. 2668–2677; Gaymard et al., "J. Biol. Chem.", 1996, 271, S. 22863–22870.
  • Bewertung der funktionellen Kapazitäten von CCR5 und/oder CD4
  • 1. Exprimiert an der Oberfläche von Sf9-Zellen
  • a) Vorhandensein von Rezeptoren an der zellularen Oberfläche, analysiert durch FACS und konfokale Mikroskopie:
    • I. Mit spezifischen anti-CD4- oder anti-CCR5-Antikörpern.
    • II. Mit gp120, die mit spezifischen Antikörpern markiert sind.
    • III. Mit HIV-1, welcher die mutierten oder nicht-mutierten Hüllen trägt.
    • IV. In einem ersten Schritt charakterisiert man die Funktionalität der Rezeptoren an der Oberfläche der Sf9-Zellen und quantifiziert durch Scatchard (Cahoreau et al. oben) die Anzahl Moleküle pro Zelle, von der man die Lipidumgebung der Zellmembranen kennt.
  • b) Spezifische, konfokale Fluoreszenzanalyse der Fusion nach Methoden, abgeleitet von Robert Blumenthal (NIH, persönliche Mitteilung, 2000) und der von Vidal et al., 1996, "J. Biol. Chem.", 270, 17823–17829.
    • I. Nach Kontakt mit Zellen, die die Hülle von mutiertem oder nicht-mutiertem HIV-1 exprimieren.
    • II. Nach Kontakt mit HIV-1 (oder viralen Pseudotypen, welche die mutierten oder nicht-mutierten Hüllen tragen).
    • III. Mit viralen Pseudopartikeln.
  • 2. In den entsprechenden Proteoliposomen
    • a) Spezifische, konfokale Fluoreszenzanalyse nach den oben angegebenen Methoden.
    • b) Andere Methoden des Energietransfers (FRET: Fluoreszenzresonanzenergietransfer, (Mattjus et al., 1999, "Anal. Biochem.", 268, S. 297–304).
  • CCR5, Einführung von 6 Histidin-Resten am C-Ende
  • 1. Amplifizierung durch PCR der C-Endregion zwischen dem Ort EcoRI und dem TGA für CCR5
    Figure 00120001
  • Bac-CCR5
  • Einführung in dieses Oligonukleotid eines Ortes Stul (erzeugt durch Degenerierung des genetischen Codes) und eines Ortes Xbal für die Reintegration des mutierten Fragments in das ursprüngliche Plasmid.
    Figure 00120002
  • Das amplifizierte Fragment EcoRI-Xbal wird in einem Vektor pUC in EcoRI-Xbal kloniert, dann sequenziert. Das mutierte Fragment wird dann in das Ursprungsplasmid für EcoRI-Xbal wieder eingesetzt.
  • 2. Einführung von 6 Histidincodonen auf das C-Ende vom CCR5 folgend
  • Das so modifizierte Plasmid wird durch Stul und Xba geschnitten und dann mit dem unten beschriebenen DNA-Fragment Stul-Xbal verbunden. Dieses Fragment trägt 6 Histidincodone und ein Stopp-Codon TAA.
    Figure 00130001
  • Ein Ort Eco RI wird nachfolgend hinzugefügt, um die gepaarten Oligonukleotide in einem intermediären pUC-Vektor zu klonieren und so die Sequenz zu verifizieren.
  • Modifikation und Klonierung von CD4
  • 1 – Sequenzierung der C-Endregion des das Gen CD4 enthaltende Plasmids pGEM-T
  • Die C-Endregion des Plasmids wird durch Sequenzierung nach einer Stufe von PCR* verifiziert.
  • 2 – Addition von 6 Histidin-Resten am C-Ende von DC4
  • 1-Amplifizierung der Region Bsu361-Banim (im Polylinker) durch PCR
  • PCR-Oligonukleotid PCR
    Figure 00130002
  • 2-Addition von 6 His-Codons
    Figure 00130003
  • Oligonukleotid von PCR*
    Figure 00140001
  • Markierung mit Calcein von die Hülle von HIV-1 exprimierenden Zellen
  • Reagenzien
    • – Zellkultur.
    • – Calcein AM (Molecular Probe, INC) 1 μg/ml (~ 2,5 mM) (50 μg Calcein/20 μl DMSO, gelagert bei –20°C).
    • – DMSO (Dimethylsulfoxid).
    • – RPMI oder DMEM.
    • – PBS pH 7,4 (Dulb PBS von Gibco BRL).
    • – Zentrifugieren mit IEC Central MO4R.
  • Methode
    • 1. Zählen der Zellen im Kolben.
    • 2. Zentrifugieren bei 1000 UpM während 5 Minuten.
    • 3. Wiedersuspendieren der Zellen in 5 ml Milieu (z.B. 0,5 × 106 Zellen/ml).
    • 4. Zugabe von 1 μl Calcein/5 ml der Zellen (~ 2,5 mMol Calcein).
    • 5. Vortex, um eine gute Mischung zu erhalten.
    • 6. Inkubation während 45 Minuten bei 37°C, 5 bis 7% CO2 unter Lichtausschluß.
    • 7. Zentrifugieren bei 1000 UpM während 5 Minuten.
    • 8. Waschen zweimal mit 10 ml Milieu (oder PBS).
    • 9. Wiedersuspendieren der Zellen in 5 ml Milieu (oder PBS) oder bei einer Konzentration von 0,5 × 10–6 Zellen/ml.
    • 10. Inkubation 30 Minuten bei 37°C, 5–7% CO2 unter Lichtausschluß.
    • 11. Waschen zweimal mit 10 ml Milieu (oder PBS).
    • 12. Wiedersuspendieren der Zellen in 5 ml Milieu (oder PBS) oder mit einer Konzentration von 0,5–1 × 106 Zellen/ml, Vortex.
  • Markieren von Zielzellen mit CMTMR
  • Das CMTMR ist ein fluoreszierendes Derivat von Chlormethyl, das frei durch lebende Zellmembranen diffundiert. Wenn sie ins Innere der Zelle gelangt ist, unterliegt die leicht thiol-reaktive Sonde einer durch Glutathion-S-Transferase vermittelten Reaktion, um gefärbte, fluoreszierende Additionsprodukte zu liefern, die die Membran nicht durchdringen können.
  • Die Färbung der Zellen mit CMTMR liefert eine lebhafte Fluoreszenz, die aus der Reaktion mit den Proteinen in den perinuklearen Regionen folgt, ER und Golgi, die immobil sind, sowie eine schwächere Fluoreszenz, die zurückzuführen ist auf das Additionsprodukt des fluoreszierenden Glutathions (PM ~ 600 Da) im Cytosol, das in der Lage ist, durch die kleinen Poren der Fusion zu diffundieren.
    • 1. Man bringt die fluoreszierende, cytoplasmische Sonde CMTMR(5-(und 6-)-(((4-chlormethyl)benzoyl)amino)tetramethylrhodamin) (Molecular Probes cat #C-2927, ex/em 541/565 nm) mit einer Konzentration von 10 mM in DMSO in Lösung.
    • 2. Man entnimmt aliquote Mengen von 10 oder 20 μl, die man bei –20°C lagert. Man bereitet eine Lösung von CMTMR (1 : 500) in DMEM, ergänzt mit 10% SVF, das durch Wärme inaktiviert ist, 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin (D10).
    • 3. Man entfernt das Milieu der Zielzellen (auf Mikrovertiefungen) und eicht 1 ml einer verdünnten Lösung von CMTMR. Man läßt die Proben bei 37°C während 45 bis 60 Minuten inkubieren. Man ersetzt die färbende Lösung durch 1 ml D10 und setzt die Inkubierung während 15 bis höchstens 30 Minuten fort.
  • Durchführung der Fusion
    • 1. Man fügt effektive, mit Calcein (2 ml) markierte Zellen zu mit CMTMR markierten Zielzellen hinzu. Man läßt die zwei Zellpopulationen 3 bis 5 Stunden bei 37°C inkubieren.
    • 2. Am Ende der Inkubation ersetzt man das Milieu durch 1 ml D-PBS und nimmt Bilder der Phase und der Fluoreszenz mit Immersionslinsen in Öl 40 × auf. Um die mit dem Calcein gefärbten Zellen zu beobachten, verwendet man das FITC (Erreger: BP 470–490; Prisma DM 505; Emitter: BA 515–550), und für CMTMR verwendet man das Rhodamin (Erreger: BP 530–550, Prisma DM 570, Emitter BA 590). Man vermeidet so das Überlappen, das eintritt, wenn man die Fluoreszenz der Farb stoffe beobachtet. Man vereinigt die Bilder mit 6 bis 10 verschiedenen Filtern, die für jede Probe nach Zufall gewählt sind.
    • 3. Man analysiert die Daten unter Verwendung der Software Metamorph (Universal Image Inc.), indem man sie überlagert und die Bilder zählt. Man zählt die Gesamtzahl der für CMTMR positiven Zellen und diejenigen, die für die 2 Fluoreszenzsonden positiv sind. Man verwendet Bilder im Leuchtfeld, um die positiven Anteile zu unterscheiden, wo die markierten Zellen sich überdecken, jedoch nicht fusioniert sind. Man berechnet den Prozentanteil der Fusion wie folgt:
      Figure 00160001

Claims (21)

  1. Immunogene Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie gewonnen sind aus Präparaten, die erhalten wurden durch: – Inkubation von ersten Mitteln, welche den Zielrezeptor oder die Zielrezeptoren eines infektiösen, pathogenen Agens exprimieren, der oder die bei einem Säugetier Infektionen durch Bindung an und anschließende Verschmelzung mit Zielzellen bewirken, mit zweiten Mitteln, die mindestens die Regionen des pathogenen Agens exprimieren, welche diese Ziele erkennen, unter Bedingungen, welche die Interaktion der ersten und zweiten Mittel zur Bildung eines Komplexes ermöglichen, wobei diese Inkubationsstufe über Zeiten von verschieden langer Dauer durchgeführt wird, um zu Komplexen zu führen, die verschiedenen Stadien der Fusion entsprechen, und – Inkontaktbringen der gebildeten Komplexe mit einem Fixationsmittel während verschieden langer Zeiten, um Komplexe mit verschiedenen Expositionen und Konformationen der Epitope zu fixieren, gegen welche man Antikörper bilden möchte, wobei die ersten und zweiten Mittel von den Säugetieren toleriert werden.
  2. Zusammensetzungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten Mittel autologe Zellen von Säugetieren sind, besonders gesunde, humane Zellen, die von einem zu impfenden Patienten entnommen wurden.
  3. Zusammensetzungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten Mittel Vektoren sind, welche den oder die Zielrezeptoren an ihre Oberfläche exprimieren.
  4. Zusammensetzungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten Mittel Liposome sind, welche den Zielrezeptor oder die Zielrezeptoren an ihrer Oberfläche tragen, besonders an ihrer Oberfläche die Vektoren wie im Anspruch 3 definiert tragen.
  5. Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die zweiten Mittel Zellen sind, die zuvor durch einen Vektor transformiert wurden, der mindestens eine Bindungsregion mit mindestens einem Rezeptor trägt, besonders ein viraler Vektor.
  6. Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die zweiten Mittel aus viralen Vektoren bestehen, die mindestens eine Region der Bindung an mindestens einen Zielrezeptor tragen.
  7. Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die zweiten Mittel infizierte Zellen sind, welche die pathogenen Agenzien produzieren oder aus den infektiösen, pathogenen Agenzien bestehen.
  8. Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die pathogenen Agenzien Viren und besonders Retroviren, Bakterien, Mikrobakterien oder Parasiten, wie Plasmodium sp., Leishmania sp. Trypanosoma cruzi und Trypanosoma brucei sind.
  9. Zusammensetzungen nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das pathogene Agens VIH ist.
  10. Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Kombination mit Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparate erhalten werden durch Inkubation von ersten Mitteln, welche den Rezeptor CD4 und/oder Co-Rezeptoren des VIH exprimieren, mit zweiten Mitteln, welche mindestens die konservierten Bereiche der Hüllproteine gp120 oder gp160 exprimieren.
  11. Zusammensetzungen nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten, ersten Mittel aus autologen Säugetierzellen bestehen, die so stimuliert sind, daß sie den Rezeptor CD4 und/oder Co-Rezeptoren von VIH in genügender Menge für die gewünschte Interaktion exprimieren.
  12. Zusammensetzungen nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten Mittel virale Vektoren sind, die an ihrer Oberfläche CD4 und/oder Co-Rezeptoren von VIH exprimieren, wie der Baculovirus, der Semliki-Forest-Virus oder auch Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae.
  13. Zusammensetzungen nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten Mittel Liposome sind, welche an ihrer Oberfläche den Rezeptor CD4 und/oder Co-Rezeptoren von VIH exprimieren, wobei die Expression durch virale Vektoren gewährleistet wird.
  14. Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die zweiten Mittel aus Zellen bestehen, die zuvor mit einem viralen Vektor transformiert wurden, der mindestens die konservierten Bereiche der Hüllproteine gp120 oder gp160 aufweist, oder aus solchen viralen Vektoren bestehen.
  15. Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die zweiten Mittel infizierte Zellen sind, welche VIH produzieren oder aus dem VIH-Virus selbst bestehen.
  16. Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die zweiten Mittel aus den Hüllproteinen gp120 oder gp160 in natürlicher oder rekombinanter Form oder aus mindestens den konservierten Bereichen solcher Proteine bestehen.
  17. Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der eine der Co-Rezeptoren des VIH ersetzt ist durch einen monoklonalen Antikörper.
  18. Zusammensetzungen nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie als erstes Mittel lösliches CD4 und als zweites Mittel lösliches gp120 aufweisen, gegebenenfalls in rekombinanter Form, sowie einen monoklonalen Antikörper, der gegen den Bereich des gp120 gerichtet ist, der sich an den Co-Rezeptoren fixiert.
  19. Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparate nach der Inkubation mit Aldidrithiol-2 fixiert werden.
  20. Seren und Antikörper, die gegen die Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 19 gebildet sind.
  21. Impfstoffzusammensetzungen gegen eine infektiöse Pathologie, die für ein Säugetier bestimmt sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine wirksame Menge einer immunogenen Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19 mit einem inerten Vehikel, das für die Verabreichung an ein Säugetier annehmbar ist, gegebenenfalls mit einem Hilfsmittel umfassen.
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