CN105899536A - 用抗cxcr4抗体治疗c1013g/cxcr4相关的华氏巨球蛋白血症 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于治疗患有华氏巨球蛋白血症(WM)的主体的方法，所述方法包括向所述主体施用治疗有效量的特异性结合表达于WM细胞表面上的CXCR4受体的抗体或其抗原结合部分。本公开还提供用于治疗患有C1013G/CXCR4相关的WM的患者的治疗方案。

Description

用抗CXCR4抗体治疗C1013G/CXCR4相关的华氏巨球蛋白血症
在整个本申请中，多个出版物在括号中通过作者姓名和日期或通过专利号或公开号来引用。这些出版物的完整引用可以见于在权利要求之前紧接的说明书的结尾。这些出版物的公开内容以其整体通过引用并入本申请中以更完整地描述在本文描述和要求保护的本发明的日期时本领域技术人员所知的现有技术。然而，本文参考的引用不应解释为承认此类参考是本发明的现有技术。
发明领域
本公开涉及特异性结合人CXCR4的单克隆抗体在治疗C1013G/CXCR4相关的华氏巨球蛋白血症的方法中的用途。
发明背景
C-X-C趋化因子受体4型(CXCR4)在胚胎发生过程中在生理条件中起关键作用，诸如淋巴细胞生成和骨髓（BM）髓细胞生成。在出生后的生命过程中，CXCR4及其配体调节CD341细胞返回至BM微环境(BM niches)以及淋巴细胞运输。CXCR4已显示在患有遗传性杂合常染色体显性疾病的患者中被突变，所述疾病特征在于异常功能免疫，已知为疣、低丙球蛋白血症、感染和先天性骨髓粒细胞缺乏症（WHIM）综合征，这是由于尤其存在由C1013G变体所代表的CXCR4基因的激活突变(Balabanian 等人, 2005; Balabanian 等人, 2008)。近期证据支持在华氏巨球蛋白血症中存在CXCR4体细胞畸变(WM；淋巴浆细胞淋巴瘤) (Hunter 等人, 2014; Treon 等人, 2014)。之前尚未描述该变体在支持淋巴浆细胞淋巴瘤的进展中的功能作用以及是否相比于其他B细胞淋巴组织增生实体其对于WM是独特的或其在IgM意义未明的单克隆丙球病（MGUS）阶段发生。
WM是罕见的B细胞病症，在美国每年有每百万人中约3例的发病率。在美国每年约1,000至1,500人被诊断为WM。全基因组测序近来已揭示可能对该疾病的发病机理起作用的分子机制。具体而言，L265P/MYD88已被描述为WM患者中的普遍的体细胞突变(Treon 等人,2012)。体外研究已证实L265P/MYD88变体可以导致增加的肿瘤细胞增殖(Yang 等人,2013)；这可以至少部分通过MYD88依赖性核因子κB (NF-κB)的激活（一种已知的介导肿瘤B细胞存活、生长和对治疗抗性的信号传导途径）来解释 (Leleu 等人, 2008)。这些观察结果还与之前的发现一致，即在克隆WM细胞中过表达致癌的微RNA-155导致原代WM细胞中NF-κB的激活。实际上，微RNA-155功能缺失研究导致抑制NF-κB和体外及体内肿瘤生长的减少(Leleu 等人, 2008; Roccaro等人, 2009)。然而，MYD88突变在若干公开的研究中没有预示进展或对治疗的抗性，表明其他基因改变可能对于肿瘤进展和向远端器官的扩散是关键的。
在低级B细胞淋巴瘤中，WM代表这样的淋巴浆细胞亚型，其特征在于BM浸润淋巴浆细胞和分泌血清单克隆免疫球蛋白M（IgM）蛋白，这可以导致高粘血症、出血和外周神经病的并发症(Ghobrial 等人, 2003; Vijay和Gertz, 2007)。在诊断时BM广泛参与的证据暗示克隆B细胞向BM中的细胞运输。在该背景下，肿瘤B细胞返回至BM的主要调节物之一由CXCR4经与其相关的配体间质衍生的因子-1 (SDF-1/CXCL12)的相互作用而表现。
完整基因组测序的初步报道已表明CXCR4可能在29％(16/55)的患有WM的患者中被突变 (Cao 等人, 2012)。C1013/CXCR4变体的存在和作用因此在患有WM和不同的B细胞淋巴增生性障碍的患者中进行研究，旨在确定该变体在WM以及对于用抗CXCR4抗体治疗的C1013/CXCR4相关的WM患者的应答中的体内功能作用。
在治疗癌症中展示治疗效力的抗CXCR4单克隆抗体之前已在PCT公开号WO 2008/060367和WO 2013/071068中描述。这两个申请的公开内容因此均以其整体通过引用并入本申请。完全人单克隆抗体ulocuplumab（在WO 2008/060367中命名为F7，之前也称为BMS-936564或MDX-1338，所有四种命名在本文中可互换使用）在实体瘤和血液癌症的临床前研究中均展示出出人意料有利的抗肿瘤特性。Ulocuplumab目前在患有复发性/难治性B细胞恶性肿瘤的患者中正进行I期临床研究(NCT01120457; 参见Clinical Trials Website,http://www.clinicaltrials.gov)。
发明概述
本公开提供了用于治疗患有C1013G/CXCR4相关的华氏巨球蛋白血症的主体的方法，所述方法包括向所述主体施用治疗有效量的特异性结合表达于WM细胞表面的CXCR4受体的抗体或其抗原结合部分。在优选的实施方案中，主体是人并且抗体或其抗原结合部分结合表达于细胞表面的人CXCR4受体，优选携带C1013G突变的人CXCR4。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分是嵌合的、人源化的或人抗体或其抗原结合部分。优选地，抗体或其抗原结合部分是人抗体或其抗原结合部分。
本公开还提供了用于治疗患有C1013G/CXCR4-相关的WM的主体的方法，所述方法包括：（a）选择作为合适治疗候选者的主体，所述选择包括：（i）任选提供获自所述主体中的WM组织的测试组织样品；（ii）进行测定以确定WM测试组织样品中的细胞是否携带CXCR4基因中的C1013G突变；和（iii）基于确定WM细胞携带CXCR4基因中的C1013G突变来选择主体为合适的候选者；和（b）向所选的主体施用治疗有效量的特异性结合表达于C1013G/CXCR4-相关的WM细胞的表面上的CXCR4受体的抗体或其抗原结合部分。
本公开进一步提供用于治疗患有C1013G/CXCR4-相关的WM的主体的方法，所述方法包括向所述主体施用治疗有效量的特异性结合表达于C1013G/CXCR4-相关的WM细胞的表面上的CXCR4受体的抗体或其抗原结合部分，所述主体已基于确定主体的WM细胞携带CXCR4基因中的C1013G突变来进行选择。
本公开还提供用于选择WM患者用于用特异性结合表达于WM细胞的表面上的CXCR4受体的抗体或其抗原结合部分治疗的方法，所述方法包括：（a）提供获自患者中的WM组织的测试组织样品；（b）进行测定以确定WM测试组织样品中的细胞是否携带CXCR4基因中的C1013G突变；和（c）基于确定WM细胞携带CXCR4基因中的C1013G突变来选择患者用于治疗。
此外，本公开提供了用于确定包括用于治疗主体中的C1013G/CXCR4-相关的WM的抗CXCR4抗体或其抗原结合部分的治疗方案的方法，所述方法包括：（a）提供获自主体中的WM组织的测试组织样品；（b）进行测定以确定WM测试组织样品中的细胞是否携带CXCR4基因中的C1013G突变；和（c）基于确定WM细胞携带CXCR4基因中的C1013G突变来确定包括抗CXCR4抗体或其抗原结合部分的治疗方案。在一个方面，本公开还提供了用于治疗患有C1013G/CXCR4-相关的WM的患者的治疗方案，所述方案通过本方法确定。
在任何上述方法的某些实施方案中，WM患者中C1013G/CXCR4-突变细胞展示对常规使用的抗WM剂（包括雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)、布鲁顿氏酪氨酸激酶（BTK）、和/或磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制剂）的抗性。在某些优选的实施方案中，C1013G/CXCR4-突变细胞对BTK抑制剂依鲁替尼(IMBRUVICA®)是抗性的。因此，在某些实施方案中，在患有C1013G/CXCR4-相关的WM的主体用mTOR、BTK和/或PI3K抑制剂治疗失败后，优选用依鲁替尼治疗失败后，向所述主体施用治疗有效量的抗CXCR4抗体或其抗原结合部分。在其他的实施方案中，用治疗有效量的抗CXCR4抗体或其抗原结合部分和治疗有效量的mTOR、BTK或PI3K抑制剂的组合治疗主体。在某些优选的实施方案中，用抗CXCR4抗体、ulocuplumab和治疗有效量的BTK抑制剂依鲁替尼的组合治疗主体。
在任何上述方法的某些实施方案中，抗CXCR4 抗体或其抗原结合部分包含：包含连续连接的氨基酸的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3结构域，其序列描述于SEQ ID NO:25；和包含连续连接的氨基酸的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3结构域，其序列描述于SEQ ID NO:29。
在其他实施方案中，抗CXCR4 抗体或其抗原结合部分包含：包含连续连接的氨基酸的重链可变区，其序列描述于SEQ ID NO:25；和包含连续连接的氨基酸的轻链可变区，其序列描述于SEQ ID NO:29。
在进一步的实施方案中，抗CXCR4抗体或其抗原结合部分包含：包含具有描述于SEQ ID NO:1的序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR1，包含具有描述于SEQ ID NO:5的序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR2，包含具有描述于SEQ ID NO:9的序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR3，包含具有描述于SEQ ID NO:13的序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR1，包含具有描述于SEQ ID NO:17的序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR2，和包含具有描述于SEQ ID NO:21的序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR3。在优选的实施方案中，抗体是ulocuplumab。
在另一方面，本公开提供了用于在主体中治疗C1013G/CXCR4-相关的WM的药剂盒，所述药剂盒包含：(a) 抗CXCR4抗体或其抗原结合部分的剂量；和(b) 用于在任一上述方法中使用抗CXCR4抗体的说明书。用于药剂盒中的示例性的抗CXCR4 抗体包括人单克隆抗体F7 (ulocuplumab)、F9和D1，其描述于WO 2008/060367。在优选的实施方案中，药剂盒中的抗CXCR4抗体是ulocuplumab。
本公开的其他特征和优点从以下详述和实施例中将变得显而易见，其不应解释为限制性的。整个本申请中引用的所有参考、GENBANK®条目、专利和公开的专利申请的内容通过引用明确地并入本文。
附图简述
图1显示F7 (ulocuplumab)人单克隆抗体的重链可变区（A）的核苷酸序列(SEQ ID NO:33)和氨基酸序列(SEQ ID NO: 25)。重链CDR1 (SEQ ID NO: 1)、CDR2 (SEQ ID NO: 5)和CDR3 (SEQ ID NO: 9)区域进行描绘并且显示V、D和J种系来源(germline derivation)。F7的轻链可变区（B）的核苷酸序列(SEQ ID NO: 37)和氨基酸序列(SEQ ID NO: 29)也显示。轻链CDR1 (SEQ ID NO: 13)、CDR2 (SEQ ID NO: 17)和CDR3 (SEQ ID NO: 21)区域进行描绘并且显示V和J种系来源(germline derivation)。
图2显示鉴定WM患者中的体细胞C1013G/CXCR4变体。携带C1013G/CXCR4变体的原代WM样品相比于野生型（WT）原代WM样品以更高的CXCR4表面表达呈现，如通过对CD191 BM来源的WM细胞的流式细胞术所显示的。
图3显示WM细胞中CXCR4过表达的效力。BCWM.1细胞用精确LentiORF/CXCR4/GFP(CXCR4+)或用空载体/RFP对照进行感染。人CXCR4表达水平通过qRT-PCR进行评价，使用△△Ct方法，对GAPDH进行均一化。P代表P值。
图4显示过表达CXCR4的WM细胞体内扩散的增强的能力。BCWM.1细胞用精确LentiORF/CXCR4/GFP (CXCR4+)或用空载体/RFP（对照）进行感染并静脉内注射到SCID/Bg小鼠(n = 5/组)。3周后，将小鼠安乐死并收获器官。对股骨BM (A)、肝脏（B）和肾脏（C）进行对人CD20和人CXCR4的苏木精-曙红免疫组织化学染色。进行CD20和CXCR4染色的定量，显示相比于对照细胞注射的小鼠，在CXCR4+细胞注射的小鼠中CXCR4/CD20+细胞的更高数目。P代表P值。（D）在第三周将小鼠安乐死并收获血清，通过ELISA测试人IgM水平。（E）通过qRT-PCR (ΔΔCt方法)对从BM股骨离体(ex vivo)分离的细胞进行人CXCR4水平的检测。未注射的小鼠（n=3）和合并的对照细胞注射的小鼠(n=4)用作对照。P代表P值。柱代表标准差。
图5显示在WM细胞中过表达CXCR4导致体外降低的存活率和增强的黏着特性和生长。相比于相关的空载体感染的细胞，过表达CXCR4的细胞(CXCR4+)呈现向BM (A)、肝脏(B)和肾脏(C)扩散更具侵袭性的能力(苏木精曙红 X10, 抗体染色X20和X10, 放大率)。人CD20和CXCR4染色的定量显示于图4中。（D）卡普兰-迈耶曲线显示相比于空载体细胞注射的小鼠在CXCR4+细胞注射的小鼠中降低的存活率（n=7/组）。P代表P值（对数秩检验）。（E、F）CXCR4过表达导致当相比于CXCR4沉默的WM细胞(CXCR4-K.D.)（其中观察到对BM-MSC降低的黏着和降低的细胞增殖）时，对原代骨髓间充质干细胞（BM-MSC）增加的WM细胞黏着和增加的细胞增殖。柱代表标准差。DAPI, 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；NS, 不显著。
图6显示感染的WM细胞中CXCR4敲低的效力。BCWM.1细胞用CXCR4-shRNA/GFP(CXCR4 K.D.)或作为对照的混杂探针(scramble probe)/GFP感染。人CXCR4表达水平通过qRT-PCR进行评价，使用ΔΔCt方法，对GAPDH进行均一化。P代表P值。
图7显示CXCR4功能丧失和功能获得对WM细胞黏着特性的影响。BCWM.1细胞用LentiORF/CXCR4 (CXCR4+) (A)或CXCR4 shRNA (CXCR4 K.D.) (B)和各自的混杂探针稳定感染。使用BSA包被的（负对照）、聚D-赖氨酸包被的（正对照）和纤连蛋白包被的孔测试黏着。柱代表标准差。
图8显示诱变在经感染的WM细胞中的效率和在注射有C1013G/CXCR4-突变的WM细胞的小鼠中缺乏脑损害。从经感染的BCWM.1细胞中分离基因组DNA(gDNA; A)和cDNA (B)。将空/对照载体感染的细胞用作对照（对照细胞）。通过使用等位基因特异性的PCR评价C1013G等位基因的检测。P代表P值。柱代表标准差。（C）使用Sanger测序评价C1013G突变的检测。（D）将SCID/Bg小鼠用携带C1013G/CXCR4突变的BCWM.1细胞或对照细胞静脉内注射。（E）对脑进行人CD20和人CXCR4的苏木精-曙红免疫组织化学染色（H.E.），显示不存在肿瘤细胞浸润。（提供4X放大率）。
图9显示CXCR4/C1013G突变对体内扩散和WM细胞存活的影响。携带CXCR4/C1013G变体的WM细胞具有mRNA水平的改变连同增加的细胞黏着和细胞增殖。用携带CXCR4/C1013G变体的WM细胞静脉内注射的SCID/Bg小鼠具有（A）BM、（B）淋巴结、（C）肝脏、（D）肺和（E）肾脏的明显损害（X4、X10和20X放大率）。人CD20和CXCR4染色的定量显示于图10中。（F）卡普兰-迈耶曲线显示相比于对照载体细胞注射的小鼠（右图），C1013G/CXCR4细胞注射的小鼠（左图）中降低的存活率（n=7/组）。对照载体细胞注射的小鼠在第37、48和62天观察到死亡。P代表P值（对数秩检验）。
图10显示从注射有C1013G/CXCR4突变的WM细胞的小鼠收获的组织中的人CD20和CXCR4表达的定量。将SCID/Bg小鼠用携带C1013G/CXCR4变体的BCWM.1细胞或空/对照载体感染的细胞（对照细胞）静脉内注射。3周后，将小鼠安乐死并收获器官。对股骨BM、淋巴结、肝脏、肺和肾脏进行对人CD20和人CXCR4的苏木精-曙红免疫组织化学染色(Nikon,Melville, NY)。进行CD20和CXCR4染色的定量(NIS Elements软件, Nikon, Melville,NY)。P代表P值。使用T检验来分析股骨、肝脏、肾脏和肺，并使用Anova检验来分析淋巴结。
图11显示CXCR4/C1013G突变对体内WM细胞的黏着和增殖的影响。在静脉内注射有C1013G/CXCR4-WM细胞的SCID/Bg小鼠中，C1013G/CXCR4变体单独或在BM-MSC背景下增加WM细胞的黏着（A）和增殖（B）。（C、D）C1013G/CXCR4变体单独或在BM-MSC背景中增加MWCL1细胞的黏着和增殖。将空/对照载体感染的细胞用作对照。柱代表标准差。P代表P值。
图12显示C1013G/CXCR4突变的细胞在基因水平上与对照细胞不同。（A）在C1013G/CXCR4突变的细胞相比于对照载体感染的细胞（对照细胞）中肿瘤侵袭性、细胞增殖、抗细胞凋亡和致癌标记基因(oncogenic signature gene)的基因集合富集分析（GSEA）富集曲线。所绘制的曲线显示富集评分并反映每一基因（垂直线）表示在所排列的基因列表的顶部或底部的程度。热图表示在突变细胞中和相比于对照细胞特异性富集的基因的相对丰度（左至右）。所有基因集合在C1013G/CXCR4突变细胞中富集，并且错误发现率（FDR）始终< 0.25。分析的每一基因集合显示标准化的富集评分（NES）和FDR。（C）在C1013G/CXCR4突变细胞相比于对照载体感染的细胞（对照细胞）中，表3中列出的上调基因的GSEA富集曲线。相比于对照细胞，相同基因在突变细胞中富集。
图13显示携带C1013G/CXCR4体细胞变体的WM细胞呈现药物抗性。（A）分别在C1013G/CXCR4突变细胞和对照载体感染的细胞（对照细胞）中对药物标记基因的多药抗性和应答的GSEA富集曲线。所绘制的曲线显示富集评分并反映每一基因（垂直线）表示在所排列的基因列表的顶部或底部的程度。热图表示相比于对照细胞在突变细胞中特异性富集的基因的相对丰度（左至右）。认为基因集合是富集的，且FDR始终为< 0.25。分析的每一基因集合显示标准化的富集评分（NES）和FDR。（B-F）将C1013G/CXCR4-WM细胞系(BCWM1; MWCL1)或对照载体感染的细胞（对照）暴露于依维莫司、依鲁替尼、idelalisib、硼替佐米、和卡非佐米持续48小时。通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑来测定细胞毒性。
图14显示BMS-936564体外对WM细胞的迁移的影响。使用经孔(transwell)迁移测定来测试WM细胞系(BCWM.1; MWCL.1)其迁移特性。将细胞暴露于渐增浓度的BMS-936564并在5小时后测定迁移。在存在原代WM BM-MSCs (A)的情况下或存在SDF-1α (B)的情况下进行经孔迁移测定。在两种情况下，观察到WM细胞迁移的BMS-936564依赖性的抑制。
图15显示BMS-936564体外对WM细胞的黏着和增殖的影响。（A）WM细胞系用BMS-636564处理4小时并随后测试对原代WM BM-MSC的黏着。评价2小时后的黏着显示WM细胞黏着的BMS-936564依赖性的抑制。（B、C）WM细胞系(BCWM.1; MWCL.1)在存在或不存在原代WMBMMSC的情况下用对照培养基和用BMS-936564培养48小时。使用[3H]-胸苷摄入测定评估细胞增殖。柱代表标准差。P代表P值。所有数据表示三次实验的平均值(± sd)。将CXCR4拮抗剂、AMD3110 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)用作对照。
图16显示BMS-936564对WM细胞信号传导的影响。将BCWM.1细胞在存在或不存在原代WM BM-MSC的情况下暴露于BMS-936564持续6小时。随后收获BCWM.1细胞并将细胞裂解物进行使用抗磷酸(p)-ERK1/2、抗ERK1/2、抗p-Akt、抗Akt、抗p-SRC和抗SRC抗体的蛋白质印迹分析。将在不存在WM BM-MSC的情况下培养的BCWM.1细胞用作对照。柱代表标准差。
图17显示对照抗体不影响体外WM细胞系的黏着（A）或迁移（B）。
图18显示WM细胞中BMS-936564对细胞凋亡相关蛋白的影响。将BCWM.1细胞暴露于BMS-936564持续14小时。随后收获全细胞裂解物并进行使用抗胱天蛋白酶9、抗PARP、抗p-β连环蛋白、抗β-连环蛋白、抗p-GSK3β、和抗微管蛋白抗体的蛋白质印迹分析。
图19显示体内BMS-936564靶向WM细胞中的C1013G/CXCR4突变的细胞。（A-E）BMS-936564抑制体内C1013G/CXCR4突变的WM细胞的扩散。相比于同种型对照处理的小鼠（未处理的），人CD20和CXCR4染色在从用BMS-936564处理的小鼠移植的组织中显著降低。P代表P值。
图20显示体内BMS-936564对WM细胞中C1013G/CXCR4-突变的细胞的影响的代表性组织化学图像。将SCID/Bg小鼠用携带C1013G/CXCR4变体的BCWM.1细胞或空/对照载体感染的细胞（对照细胞）静脉内注射。用BMS-936564或对照抗体处理小鼠 (10 mg/kg, 腹膜内地; x3/4/周; 小鼠:5/组)。3周后，将小鼠安乐死并收获器官。对股骨BM(A)、肝脏（B）、肾脏（C）、肺（D）和淋巴结（E）进行人CD20和CXCR4的苏木精-曙红免疫组织化学染色(Nikon,Melville, NY; 显示4X、10X或20X放大率)。
图21显示在BM背景下BMS-936564靶向WM细胞中的C1013G/CXCR4突变的细胞。使用经孔(transwell)迁移测定来测试C1013G/CXCR4-感染的BCWM.1细胞其迁移特性。将细胞暴露于渐增浓度的BMS-936564并在5小时后测定迁移。在存在原代WM BM-MSCs (A)或SDF-1α(B)的情况下进行经孔迁移测定。在两种情况下，观察到WM细胞迁移的BMS-936564依赖性的抑制。（C）将C1013G/CXCR4-感染的BCWM.1细胞用BMS-636564处理4小时并随后测试对原代WM BM-MSC的黏着。评价2小时后的黏着显示WM细胞黏着的BMS-936564依赖性的抑制。（D）将C1013G/CXCR4-感染的BCWM.1细胞在存在或不存在原代WM BM-MSC的情况下用对照培养基和用BMS-936564培养48小时。使用[3H]-胸苷摄入测定评估细胞增殖。柱代表标准差。P代表P值。所有数据表示三次实验的平均值(± sd)。柱代表标准差。
图22显示C1013G/CXCR4-WM细胞中BMS-936564对存活和细胞凋亡相关信号蛋白的影响。将C1013G/CXCR4-突变的细胞在存在或不存在BMS-936564的情况下培养6小时，显示抑制磷酸(p)-ERK、ERK、p-Akt、Akt、p-Src。类似地，将细胞暴露于化合物14小时，并观察细胞凋亡相关途径的诱导(p-GSK3β、p-β-连环蛋白、PARP和胱天蛋白酶-9)。
图23显示体内BMS-936564抑制WM返回并在体内和体外协同增强对硼替佐米的WM化学敏感性。（A、B）将BCWM.1-mCherry+ 细胞静脉内注射到SID/Bg小鼠。将小鼠用对照抗体或BMS-936564 (10 mg/kg, 腹膜内; x3/4/周)；硼替佐米 (0.5mg/kg, 腹膜内 x2/周)；或BMS-936564 + 硼替佐米(如上相同剂量, x2/周)处理。在研究结束时收获BM细胞并使用荧光板读数器评价。对照旨在为从对照抗体处理的小鼠的BM中鉴定的mCherry+细胞的数目。在研究结束时收集血清。使用人IgM ELISA试剂盒评价血清IgM分泌。（C、D）单独地或在组合方案中，将WM细胞系(BWM.1; MWCL.1)暴露于BMS-936564或硼替佐米持续48小时。通过MTT进行细胞毒性。通过使用Calcusyn软件评价协同作用：显示了BMS-936564和硼替佐米的组合的等效应图、复合指数(C.I.)和受影响的部分(fractions affected，F.A.)。柱代表标准差。
发明详述
本公开涉及使用特异性结合表达在细胞表面上的天然人CXCR4的单克隆抗体来调节患有华氏巨球蛋白血症的患者中的CXCR4活性或另外治疗所述患者的方法。这些方法特别可用于在CXCR4基因中携带激活的C1013G突变的WM患者。在某些实施方案中，将抗CXCR4抗体作为单一治疗或作为联合治疗（例如与mTOR、BTK和/或PI3K抑制剂组合）的部分作为第一（“前”）线治疗例如初始或第一治疗来施用。在其他实施方案中，将抗CXCR4抗体作为第二或第三线治疗施用，例如在用相同或一种或多种不同疗法的初始治疗后，包括复发后和/或其中第一治疗已失败。因此，在某些实施方案中，在另一抗WM剂例如mTOR、BTK和/或PI3K抑制剂治疗失败后施用抗CXCR4抗体。
定义
为了使本公开可以更易于理解，首先定义某些术语。如本申请中所用，除非本文另外明确提供，以下术语的每一个应具有下文所示含义。另外的定义描述于整个本申请。
“施用”指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统的任何向主体身体引入包含治疗剂的组合物。施用本发明的抗体的优选途径包括静脉内、皮下、肌内、腹膜内、脊椎或其他肠胃外施用途径，例如，通过注射或输注。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指除了肠内和局部施用之外的施用模式。施用还可以例如一次、多次、和/或经一个或多个延长的周期来进行。
“抗体”（Ab）应包括但不限于特异性结合抗原并包含通过二硫键相互连接的至少两个重（H）链和两个轻（L）链的糖蛋白免疫球蛋白、或其抗原结合部分。每一H链包含重链可变区（本文缩写为VH）和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每一轻链包含轻链可变区（本文缩写为VL）和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补性决定区域（CDR）的高变的区域，其散布于由称为框架区（FR）的更保守的区域。每一VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基端向羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞（例如，效应细胞）和经典补体系统的第一组分（Clq）的结合。
抗体通常以高亲和力特异性结合其同源抗原，通过10-5-10-11 M-1或更低的解离常数(KD)来反映。任何大于约10-4 M-1的KD通常被认为表明非特异性结合。如本文所用，“特异性结合”抗原的抗体指以高亲和力结合抗原和实质上相同的抗原但不以高亲和力结合不相关抗原的抗体，所述高亲和力意指具有约10-7 M或更低、优选约10-8 M或更低、更优选约5 x10-9 M或更低、甚至更优选约5 x 10-10 M或更低、且最优选约10-9 M至约10-11 M或更低的KD。如果抗原展示出与给定抗原高度的序列同一性，例如，如果其展示出与给定抗原序列至少80％、至少90％、优选至少95％、更优选至少97％、或甚至更优选至少99的序列同一性，则所述抗原与给定抗原是“实质上相同的”。借助于实例，特异性结合人CXCR4的抗体还可以具有与来自某些灵长类动物物种的CXCR4抗原的交叉反应性，但不与来自某些啮齿类动物物种的CXCR4抗原或与CXCR4之外的抗原例如人PD-1抗原交叉反应。
免疫球蛋白可以来源于任何通常已知的同种型，包括但不限于IgA，分泌型IgA、IgG和IgM。IgG亚类对于本领域技术人员也是熟知的且包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。“同种型”指通过重链恒定区基因编码的抗体类别（例如IgM或IgG1）。“抗体”包括例如天然存在的和非天然存在的抗体；单克隆和多克隆抗体；嵌合和人源化抗体；人或非人抗体；全合成抗体；和单链抗体。非人抗体可以通过重组方法来降低其在人中的免疫原性而人源化。
未明确陈述时，且除非上下文另外指出，否则术语“抗体”还包括任何上述免疫球蛋白的抗原结合部分。抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”指保留特异性结合由完整抗体结合的抗原的能力的抗体的一个或多个片段。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的实例包括Fab、F(ab′)2 Fd、Fv和单链可变片段(scFv)、二价或二价(divalentor bivalent)scFv、双抗体或其他抗体多聚体（例如三价的三抗体或四价的四抗体）、微抗体、和甚至分离的CDR，其可以展示抗原结合功能。抗体的所有上述蛋白水解和工程化的片段及相关变体(进一步细节参见Hollinger 等人, 2005; Olafsen 等人, 2010)均涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”中。
术语“单克隆抗体”("mAb")指单一分子组成的抗体分子的制备物，即，其一级序列基本上相同且展示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力的抗体分子。单克隆抗体可以通过杂交瘤、重组、转基因或本领域技术人员已知的其他技术来产生。
“人”抗体（HuMAb）指具有其中框架区和CDR区域均来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如，通过体外随机或位点定向诱变或通过体内体细胞突变引入的突变）。然而，如本文所用，术语“人抗体”并不旨在包括这样的抗体，其中来源于另一哺乳动物物种诸如小鼠的种系的CDR序列已经连接至人框架序列上。术语“人”抗体和“完全人”抗体同义使用。
“人源化”抗体指这样的抗体，所述抗体中一些、大部分或所有非人抗体的CDR结构域外面的氨基酸被来源于人免疫球蛋白的相应氨基酸所替代。在抗体的人源化形式的一个实施方案中，CDR结构域外部的一些、大部分或所有氨基酸已被来自人免疫球蛋白的氨基酸所替代，而一个或多个CDR区内的一些、大部分或所有氨基酸没有改变。氨基酸的小的添加、缺失、插入、取代或修改是容许的，只要它们没有消除抗体结合特定抗原的能力。“人源化”抗体保留与原始抗体类似的抗原特异性。
“嵌合抗体”指这样的抗体，其中可变区来源于一个物种且恒定区来源于另一物种，诸如其中可变区来源于小鼠抗体且恒定区来源于人抗体的抗体。
“癌症”指特征在于体内异常细胞不受控的生长的各种疾病的宽范围的组。不受调节的细胞分裂和生长分裂和生长导致形成侵入邻近组织的恶性肿瘤并还可以经淋巴系统或血流转移至身体的远端部分。癌症包括实体瘤和血液恶性肿瘤。
实体瘤是由血液、BM或淋巴细胞外的身体组织细胞的异常生长形成的赘生物（细胞的新生长）或损伤（解剖结构的受损或生理机能紊乱）。其由异常的细胞团块组成，其可能来源于不同的组织类型诸如肝、结肠、乳腺或肺，且其初始在其细胞起源的器官中生长。然而，实体瘤可以经在疾病的晚期的转移性肿瘤生长而传播至其他器官。
血液恶性肿瘤是影响血液、BM、脾脏和/或淋巴结的癌症类型，并包括淋巴瘤、白细胞、骨髓瘤和淋巴系统恶性肿瘤。血液恶性肿瘤可以来源于两种主要血液细胞谱系即骨髓和淋巴样细胞系的任一者。骨髓细胞系一般产生粒细胞、红细胞、血细胞、巨噬细胞和肥大细胞，而淋巴样细胞系产生B、T、NK和浆细胞。淋巴瘤（例如，霍奇金氏淋巴瘤）、淋巴细胞性白血病和骨髓瘤来源于淋巴样细胞系，而急性和慢性髓细胞性白血病（AML、CML）、骨髓增生异常综合征和骨髓增生性疾病是骨髓起源。华氏巨球蛋白血症（WM）是B细胞淋巴瘤的实例，且在本文显示为对用抗CXCR4抗体治疗是顺从的。
术语“CXCR4”（“C-X-C”趋化因子受体4）包括变体、同工型、同源物、直向同源物和侧向同源物。例如，对于CXCR4特异性的抗体可以在某些情况下与来自人以外的物种的CXCR4交叉反应。在其他实施方案中，对于人CXCR4特异性的抗体可以对于人CXCR4是完全特异性的且可以不展示物种或其他类型的交叉反应性。术语“人CXCR4”指人序列CXCR4，诸如具有GENBANK®检索号P61073的人CXCR4的完整氨基酸序列(SEQ ID NO:51)。CXCR4还在本领域已知为例如LESTR、融合素或CD184。人CXCR4序列可以与SEQ ID NO: 51的人CXCR4的不同之处在于具有例如保守突变或非保守区域中的突变，且CXCR4具有与SEQ ID NO: 51的人CXCR4实质上相同的生物功能。
“表达CXCR4的癌症”或“CXCR4+癌症”是这样的癌症，其中表征该癌症的恶性肿瘤细胞在细胞表面上表达CXCR4，优选表达高水平的CXCR4。CXCR4基因中C1013G突变（其之前已与WHIM综合征相关）在本文公开为存在于28％的WM患者中但在其他B细胞淋巴瘤中不存在或仅以7％存在。C1013G/CXCR4-相关的WM指其中存在C1013G突变的WM。
“主体”包括人或任何非人动物诸如非人灵长类动物（例如，猴）、犬、兔、啮齿类动物或鸡。在优选的实施方案中，主体是人癌症患者诸如WM患者。术语“主体”、“患者”和“个体”本文可以互换使用。
药物或治疗剂诸如抗CXCR4抗体的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是这样的药物的任何量，当单独或与另一治疗剂组合使用时，所述量促进由疾病症状严重度降低所证明的疾病消退、无疾病症状的时期的频率和持续时间的增加、或防止由于疾病折磨的损伤或失能。药物的治疗有效量或剂量包括“预防有效量”或“预防有效剂量”，其是药物的任何量，当单独或与另一治疗剂组合施用于处于发生疾病或患有疾病复发的风险的主体时，所述量抑制疾病的发生或复发。治疗剂促进疾病消退的能力可以使用从业医师已知的多种方法来评价，诸如在临床试验过程中在人主体中，在预测在人中的效力的动物模型系统中，或通过测定体外测定中药剂的活性。
此外，关于治疗的术语“有效的”和“有效性”包括药理有效性和生理安全性。药理有效性指药物促进患者中癌症消退的能力。生理安全性指由于施用药物导致的毒性水平、或其他细胞、器官和/或生物体水平的不利生理效应（不良作用）。
主体的“治疗”或“疗法”指向主体进行的任何类型的干预或处理，或对主体施用活性药剂，目标在于逆转、减轻、改善、抑制、减缓或防止与疾病相关的症状、并发症、病况或生物化学指标的起始、进展、发生、严重性或复发。
使用替代物（例如“或”）应理解为意指替代物中的任一者、两者或其任何组合。如本文所用，不定冠词“一个/种(a或an)”应理解为指任何记述或列举组分的“一个/种或多个/种”。
术语“约”、“基本上”或“基本上包含”指在如本领域普通技术人员所确定的具体值或组成的可接受的误差范围内的值或组成，其将部分取决于该值或组成如何测量或测定，即，测量系统的限制。例如，“约”、“基本上”或“基本上包含”可以意指在1之内或在多于1标准差/本领域实践之内。可选地，“约”、“基本上”或“基本上包含”可以意指正负20％的范围，更通常指正负10％的范围。此外，具体关于生物系统或方法，术语可以意指高至值的一个数量级或高至值的5倍。当在申请和权利要求中提供具体值或组成时，除非另有说明，否则“约”、“基本上”或“基本上包含”的含义应假定在具体值或组成的可接受的误差范围内。
如本文所述，任何浓度范围、百分比范围、比例范围或整数范围应理解为包括在所述范围内的任何整数的值，且当合适时，其分数（诸如整数的十分之一和百分之一），除非另有说明。
本公开的各个方面在以下子部分中进一步详述。
治疗性抗CXCR4抗体
用于本治疗方法的示例性抗CXCR4抗体（包括人单克隆抗体F7 (ulocuplumab; BMS-936564; MDX-1338)、F9、D1和E2）的产生详细描述于WO 2008/060367。使用这些抗体来治疗血液恶性肿瘤的方法还描述于WO 2008/060367和WO 2013/071068。本公开的抗CXCR4抗体可以是嵌合的、人源化的或优选地全人抗体，且特征在于特定的功能特征或特性。例如，抗体结合表达于细胞表面上的天然人CXCR4。优选地，本公开的抗体以高亲和力结合CXCR4，例如以1 x 10-8 M或更低的KD。本公开的抗CXCR4抗体优选展示对于治疗性应用是期望的以下特征的一种或多种：
（a）结合表达于细胞表面上的人CXCR4；
（b）抑制SDF-1与CXCR4的结合；
（c）抑制表达CXCR4细胞中的SDF-1诱导的钙流；
（d）抑制表达CXCR4的细胞的SDF-1诱导的迁移；
（e）抑制通过人脐静脉内皮细胞的毛细管形成；
（f）以1 x 10-8 M或更低的KD结合人CXCR4；
（g）诱导表达CXCR4的细胞中的细胞凋亡；
（h）抑制体外CXCR4+肿瘤细胞的增殖；
（i）抑制CXCR4+肿瘤细胞增殖和/或诱导体内CXCR4+肿瘤细胞凋亡；
（j）抑制CXCR4+肿瘤细胞的转移；和
（k）增加携带CXCR4+肿瘤主体的存活时间。
在优选的实施方案中，本公开的抗CXCR4抗体以1 x 10-8 M或更低的KD结合人CXCR4，诱导表达CXCR4细胞中的凋亡，并展示上文列出的其他特性中的至少五种。在更优选的实施方案中，本公开的抗CXCR4抗体展示所有上文列出的特性。
在某些实施方案中，用于本公开的方法的抗CXCR4抗体以5 x 10-8 M或更低的KD结合人CXCR4，以2 x 10-8 M或更低、5 x 10-9 M或更低、4 x 10-9 M或更低、3 x 10-9 M或更低、或2 x 10-9 M或更低的KD结合人CXCR4。在优选的实施方案中，抗CXCR4抗体是ulocuplumab(BMS-936564)。
在一方面，本公开的抗CXCR4抗体包含F7、F9、D1或E2的重链和轻链CDR1’s、CDR2’s和CDR3’s，或其组合。F7、F9、D1和E2的VH CDR1’s的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NOs.1-4。F7、F9、D1和E2的VH CDR2’s的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NOs.5-8。F7、F9、D1和E2的VHCDR3’s的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NOs.9-12。F7、F9、D1和E2的Vk CDR1’s的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NOs.13-16。F7、F9、D1和E2的Vk CDR2’s的氨基酸序列分别显示于SEQID NOs.17-20。F7、F9、D1和E2的Vk CDR3’s的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NOs.21-24。F7(ulocuplumab)人单克隆抗体的重链可变区、轻链可变区和6个CDR的氨基酸序列还显示于图1中。整个本公开中鉴定的CDR区使用Kabat系统进行描述 (Kabat 等人, 1991)。
在另一方面，本公开的抗CXCR4抗体包含：
(a)具有SEQ ID NO: 25或41中描述的序列的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3结构域，和具有SEQ ID NO: 29或45中描述的序列的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3结构域；
(b)具有SEQ ID NO: 26或42中描述的序列的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3结构域，和具有SEQ ID NO: 30或46中描述的序列的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3结构域；
(c)具有SEQ ID NO: 27或43中描述的序列的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3结构域，和具有SEQ ID NO: 31或47中描述的序列的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3结构域；或
(d)具有SEQ ID NO: 28或44中描述的序列的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3结构域，和具有SEQ ID NO: 32或48中描述的序列的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在另一优选的实施方案中，本公开的抗CXCR4抗体包含：
（a）包含具有描述于SEQ ID NO:1的序列或其保守更改的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR1；包含具有描述于SEQ ID NO:5的序列或其保守更改的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR2；包含具有描述于SEQ ID NO:9的序列或其保守更改的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR3；包含具有描述于SEQ ID NO:13的序列或其保守更改的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR1；包含具有描述于SEQ ID NO:17的序列或其保守更改的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR2；和包含具有描述于SEQ ID NO:21的序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR3；
（b）包含具有描述于SEQ ID NO:2的序列或其保守更改的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR1；包含具有描述于SEQ ID NO:6的序列或其保守更改的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR2；包含具有描述于SEQ ID NO:10的序列或其保守更改的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR3；包含具有描述于SEQ ID NO:14的序列或其保守更改的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR1；包含具有描述于SEQ ID NO:18的序列或其保守更改的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR2；和包含具有描述于SEQ ID NO:22的序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR3；
（c）包含具有描述于SEQ ID NO:3的序列或其保守更改的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR1；包含具有描述于SEQ ID NO:7的序列或其保守更改的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR2；包含具有描述于SEQ ID NO:11的序列或其保守更改的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR3；包含具有描述于SEQ ID NO:15的序列或其保守更改的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR1；包含具有描述于SEQ ID NO:19的序列或其保守更改的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR2；和包含具有描述于SEQ ID NO:23的序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR3；或
（d）包含具有描述于SEQ ID NO:4的序列或其保守更改的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR1；包含具有描述于SEQ ID NO:8的序列或其保守更改的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR2；包含具有描述于SEQ ID NO:12的序列或其保守更改的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR3；包含具有描述于SEQ ID NO:16的序列或其保守更改的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR1；包含具有描述于SEQ ID NO:20的序列或其保守更改的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR2；和包含具有描述于SEQ ID NO:24的序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR3。
在优选的实施方案中，抗CXCR4抗体或其抗原结合部分包含：包含具有描述于SEQID NO:1的序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR1，包含具有描述于SEQ ID NO:5的序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR2，包含具有描述于SEQ ID NO:9的序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR3，包含具有描述于SEQ ID NO:13的序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR1，包含具有描述于SEQ ID NO:17的序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR2，和包含具有描述于SEQ ID NO:21的序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR3。
F7的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列显示于图1A和分别SEQ ID NOs. 33和25中。F7的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列显示于图1B和分别SEQ ID NOs. 37和29中。使用CDR区确定的Kabat系统分析F7 VH序列产生描绘如图1A和分别SEQ ID NOs:1、5和9中所述的重链CDR1、CDR2和CD3区，以及如图1B和分别SEQ ID NOs:13、17和21中所示的轻链CDR1、CDR2和CD3区。
F9的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列显示于分别SEQ ID NOs. 34和26中，且对于F9轻链可变区显示于分别SEQ ID NOs. 38和30中。序列F9重链CDR1、CDR2和CD3区如分别SEQ ID NOs. 2、6和10中所示，且F9轻链CDR1、CDR2和CD3序列如分别SEQ ID NOs. 14、18和22中所示。
D1的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列显示于分别SEQ ID NO：35和27中，且对于D1轻链可变区显示于分别SEQ ID NOs. 39和31中。序列D1重链CDR1、CDR2和CD3区如分别SEQ ID NOs. 3、7和11中所示，且F9轻链CDR1、CDR2和CD3序列如分别SEQ ID NOs. 15、19和23中所示。
E2的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列显示于分别SEQ ID NO：36和28中，且对于E2轻链可变区显示于分别SEQ ID NOs. 40和32中。序列E2重链CDR1、CDR2和CD3区如分别SEQ ID NOs. 4、8和12中所示，且F9轻链CDR1、CDR2和CD3序列如分别SEQ ID NOs. 16、20和24中所示。
另外，产生F7、F9、D1和E2的可选形式，其中某些框架残基被种系残基所取代，并将其在本文称为F7GL、F9GL、D1GL和E2GL。F7GL、F9GL、D1GL和E2GL的VH氨基酸序列显示于分别SEQ ID NOs.41、42、43、和44。F7GL、F9GL、D1GL和E2GL的VL氨基酸序列显示于分别SEQ IDNOs.45、46、47、和48。
在一方面，用于本公开的方法的抗CXCR4抗体与以下中的任何交叉竞争结合CXCR4：mAb F7 (ulocuplumab; 具有分别如SEQ ID NOs: 25和29中所示的VH和VL序列)、mAbF9 (具有分别如SEQ ID NOs: 26和30中所示的VH和VL序列)、mAb D1 (具有分别如SEQ IDNOs: 27和31中所示的VH和VL序列)、和mAb E2 (具有分别如SEQ ID NOs: 28和32中所示的VH和VL序列)。交叉竞争结合CXCR4的抗体结合CXCR4上相同的表位区域（即相同或重叠的表位）。
在某些实施方案中，交叉竞争性抗CXCR4单克隆抗体包含含有具有来源于如SEQID NO: 49中所示的人VH 3-48种系序列的序列的连续连接的氨基酸的VH区和/或含有具有来源于如SEQ ID NO: 50中所示的人VK L15种系序列的序列的连续连接的氨基酸的VL区。交叉竞争性抗体可以基于其与ulocuplumab (F7)、F9、D1、E2或标准CXCR4结合测定中的任何其他参考抗CXCR4抗体交叉竞争的能力来鉴定，例如用CEM细胞的流式细胞术，其中参考抗体用FITC标记并且评价测试抗体抑制FITC标记的参考抗体结合CEM细胞的能力。
药物组合物
在另一方面，本公开提供组合物，例如药物组合物，其包含本公开的单克隆抗体或其抗原结合部分（连同药学上可接受的载体一起配制）之一或组合。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、涂料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，其是生理学上可接受的。优选地，载体适合于静脉内、皮下、肌内、肠胃外、脊椎或表皮施用（例如通过注射或输注）。本发明的药物组合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐、抗氧化剂、含水和不含水载体、和/或辅药诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。
给药方案可以进行调整以提供最佳的期望应答（例如，治疗性应答或最低不良作用）。
对于施用人抗CXCR4抗体，剂量范围为约0.0001-100 mg/kg，优选约0.01-约20mg/kg，且更优选0.1-10 mg/kg主体体重。例如，剂量可以为 0.1、0.3、1、3、5或10 mg/kg，且更优选地，0.3、1、3或10 mg/kg体重。通常将给药时间表设计以实现基于抗体的典型药代动力学特性产生持续受体占据的暴露。示例性治疗方案包括每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次、每四周施用一次、每月一次、每3个月一次或每3-6个月一次。考虑到IgG4抗体通常具有2-3周的半衰期，因此本公开的抗CXCR4抗体的优选剂量方案包括0.3-20 mg/kg体重，优选1-10 mg/kg体重，经静脉内施用，且在高至6周、8周或12周的周期中每7天或14天给予抗体直至完全应答或确认的进行性疾病。
剂量和时间安排可以在疗程中改变。例如，本公开的抗CXCR4抗体的给药方案包括经静脉内（IV）施用的1、3或10 mg/kg体重，且使用以下给药时间表之一给予抗体：(i)在高至6周的周期中每7天；(ii)每两周持续高至6个剂量，随后每三个月；(iii)每三周；(iv)1-10 mg/kg体重一次随后为1 mg/kg体重每2-3周。
在28％的WM患者中发现的C1013G/CXCR4突变在WM细胞中起激活作用，如被显著的肿瘤增殖和扩散至髓外器官导致疾病进展和降低的存活所证实的。施用抗CXCR4抗体BMS-936564导致在C1013G/CXCR4 WM模型中体内显著的肿瘤减小和髓外扩散的消除（参见实施例6和7）。在本发明的某些实施方案中，患有C1013G/CXCR4-相关的WM的患者用包括以下的治疗方案进行治疗：以在治疗携带野生型CXCR4基因的WM患者中所施用的剂量的至少两倍、至少三倍或至少五倍的剂量，和/或以在治疗携带野生型CXCR4基因的WM患者中所施用的频率的至少两倍、至少三倍或至少五倍的频率向患者施用抗CXCR4抗体或其抗原结合部分。
本公开的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以改变，从而获得这样的活性成分的量，其有效地实现对特定患者、组合物和施用模式而言的期望的治疗应答，而无对患者的毒性。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所用的本公开的具体组合物、或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径、施用时间、所用的具体化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，被治疗的患者的年龄、性别、体重、病况、一般健康和早期医疗史，和医疗领域熟知的其他因素。本发明的组合物可以使用本领域熟知的多种方法的一种或多种经一种或多种施用途径来施用。如本领域技术人员将理解的，施用途径和/或模式将根据期望的结果而不同。
本发明的用途和方法
本公开提供用于治疗患有WM的主体的方法，所述方法包括向主体施用治疗有效量的特异性结合CXCR4受体并展示对于治疗用途期望的某些功能特性的抗体。
本公开还提供用于治疗患有C1013G/CXCR4-相关的WM的主体的方法，所述方法包括向主体施用治疗有效量的抗CXCR4抗体。
已知CXCR4表达在许多种肿瘤细胞类型上，涉及肿瘤转移、HIV感染、炎症病况和血管发生或新血管形成 (参见例如WO 2008/060367和WO 2013/071068)。因此，本文公开的抗CXCR4抗体可以用于多种临床情形中，但本公开关注这些抗体用于治疗癌症尤其是WM的用途。
CXCR4在癌症中的作用
过表达CXCR4已证实在约75％的癌症中，并且在某些情况下在CXCR4表达和患者预后或存活之间已建立起负相关。与CXCR4表达或CXCR4/CXCL12途径相关的癌症类型的非限制性实例包括实体瘤诸如乳腺癌(Muller 等人, 2001)、卵巢癌(Scotton 等人, 2001)、前列腺癌(Taichman 等人, 2002)、非小细胞肺癌(Spano 等人, 2004)、胰腺癌(Koshiba 等人,2000)、结肠直肠癌(Zeelenberg 等人, 2003)、肾癌(Schrader 等人, 2002)和甲状腺癌(Hwang 等人, 2003)、鼻咽癌(Wang 等人, 2005)、黑素瘤(Scala 等人, 2005)、肾细胞癌(Staller 等人, 2003)、成神经细胞瘤(Geminder 等人, 2001)、成胶质细胞瘤(Rempel 等人, 2000)、横纹肌肉瘤(Libura 等人, 2002)和骨肉瘤(Laverdiere 等人, 2005)以及血液恶性肿瘤诸如急性成淋巴细胞性白血病(Crazzolara 等人, 2001)、急性髓细胞样白血病(AML) (Mohle 等人, 1998; Rombouts 等人, 2004)、多发性骨髓瘤(MM) (Alsayed 等人, 2007; Azab 等人, 2009)、慢性淋巴细胞白血病(Mohle 等人,1999; Burger 等人,1999)、慢性髓细胞样白血病(Jin 等人, 2008), WM (Ngo 等人, 2008)和非霍奇金氏淋巴瘤(NHL) (Bertolini 等人, 2002; Weng 等人, 2003)。
另外，该途径涉及刺激多发性肿瘤中的转移过程(Murphy, 2001)。在临床研究中，CXCR4已与增加的转移倾向和降低的存活相关且已鉴定为AML、乳腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和胰腺癌的预后指标，其中更高的CXCR4表达与疾病严重性相关(Spoo 等人, 2007; Hiller 等人, 2011; Ottaiano 等人, 2006; Spano 等人, 2004; Jiang 等人; 2006; Marechal 等人, 2009)。
BM-MSC分泌CXCL12 (SDF-1)和与CXCR4相互作用对于在BM微环境中返回和维持造血干细胞是必需的(Mohle 等人, 1998)。白血病细胞表达高水平的CXCR4，且途径在白血病细胞迁移至BM（其继而支持它们的生长的存活）中起关键作用。CXCR4对于转移传播至器官诸如其中CXCL12表达的BM是必需的。共同地，CXCR4在BM中造血干细胞的返回和保留中起重要作用并且CXCR4拮抗剂动员干细胞进入血流中，如用小分子CXCR4拮抗剂AMD3100(plerixafor; Mozobil)（其由FDA批准与用于NHL和MM患者中的自体移植物的粒细胞-集落刺激因子组合使用）所证实的。另一CXCR4抑制剂AMD3465显示拮抗CXCL12和间质诱导的趋化作用并抑制白细胞细胞中促存活(prosurvival)信号传导途径的CXCL12诱导的激活(Zeng 等人, 2009)。此外，证实AMD3465单独或与粒细胞-集落刺激因子组合可诱导动员AML细胞和祖细胞进入循环和增强的化学疗法和索拉非尼的抗白细胞效应，导致动物的显著降低的白细胞负担和延长的存活(Zeng 等人, 2009)。此类发现表明CXCR4/CXCL12相互作用的破坏可以用于通过靶向其保护性BM微环境而使白细胞细胞对于化学疗法增敏。
如WO 2008/060367和WO 2013/071068中所述，已经开发了针对CXCR4的新颖的首创人治疗性单克隆抗体。这些单克隆抗体以低纳摩尔亲和力结合表达CXCR4的细胞，以低纳摩尔EC50值阻断CXCL12结合表达CXCR4的细胞并抑制CXCL12诱导的迁移和钙流。因为CXCR4在癌症的多个基本方面包括增殖、迁移/侵袭和血管发生中起作用，因此拮抗剂可能具有多种方式来干涉其中表达CXCR4的恶性肿瘤。显著地，除了阻断CXCL12诱导的钙流和迁移，WO2013/071068还教导了表达CXCR4的肿瘤细胞的凋亡的抗体依赖性诱导是这些人抗CXCR4抗体的作用机制。抗体诱导的凋亡导致在多个造血肿瘤异种移植模型中有力的体内效力。相反，小分子CXCR4拮抗剂诸如AMD3100增加CXCR4+肿瘤细胞从BM的动员并由此增加化学增敏，但不直接杀死此类肿瘤细胞，其表明抗CXCR4抗体相比于小分子CXCR4拮抗剂在杀死癌症细胞中的增强的效力。
华氏巨球蛋白血症
WM，也称为淋巴浆细胞淋巴瘤，是非霍奇金氏淋巴瘤（NHL）的一种无痛的（缓慢生长的）亚型。该疾病特征在于末端分化的B淋巴细胞（即，在BM和淋巴结中形成的白细胞）的不受控的克隆性增殖。该疾病的独特特征在于B细胞产生过量的单克隆IgM，其可以导致称为高粘血症的血液变稠。该IgM蛋白可以导致许多症状，包括疲劳、无法解释的体重减轻、增大的淋巴结或脾脏、受损的肾功能、系统性淀粉样变性、虚弱和无法解释的出血。B细胞增殖还干扰红细胞的产生，导致贫血。
WM是罕见病，在美国每年仅约1500例。不存在单一认可的WM治疗，但包括刺激免疫系统的生物制剂和化学疗法的组合的治疗方案已提供了有希望的结果(Treon, 2009)。目前用于治疗WM患者的组合疗法的一些实例包括BDR: 硼替佐米(VELCADE®)、地塞米松和利妥昔单抗(RITUXAN®) (Treon 等人, 2009); RCD: 环磷酰胺(CYTOXAN®; NEOSAR®)、地塞米松和利妥昔单抗(Dimopoulos 等人, 2007); R-CHOP: 环磷酰胺、多柔比星(ADRIAMYCIN®)、长春新碱(ONCOVIN®)、泼尼松和利妥昔单抗; CPR: 环磷酰胺、泼尼松和利妥昔单抗； VR: 硼替佐米和利妥昔单抗；FR: 氟达拉滨(FLUDARA®)和利妥昔单抗；和TR: 沙利度胺(THALOMID®)和利妥昔单抗。目标应答率高(> 80%)但完全应答率低(0-15%)。正在研究的疗法包括依鲁替尼(IMBRUVICA®)，选择性的布鲁顿氏酪氨酸激酶（BTK）抑制剂；阿仑单抗(CAMPATH®)，其靶向WM细胞表面上的CD52；奥法木单抗 (ARZERRA®)，其靶向B细胞表面上的CD20分子；苯达莫司汀(TREANDA®)，其攻击癌细胞的DNA并破坏细胞分裂周期；mTOR抑制剂依维莫司(AFINITOR®, ZORTRESS®)，其抑制细胞生长和分离；和卡非佐米(KYPROLISTM)，一种选择性蛋白酶体抑制剂。在本文公开的用于治疗WM或C1013G/CXCR4-相关的WM的方法的某些实施方案中，任何前述药剂或其任何组合可以与本公开的抗CXCR4抗体组合使用。在其他实施方案中，在WM患者对用于治疗WM的任何这些抗WM疗法（已使用或在开发中）的进展后，使用抗CXCR4抗体。
CXCR4和C1013G/CXCR4突变在华氏巨球蛋白血症中的作用
之前已显示WM细胞表达高水平的趋化因子和黏着受体，包括CXCR4和VLA-4，以及CXCR4对于CXCL12诱导的WM细胞的迁移和经内皮迁移是必需的 (Ngo 等人, 2008)。显示CXCR4敲低或CXCR4抑制剂AMD3100显著抑制WM细胞的迁移以及其黏着纤连蛋白、基质细胞和内皮细胞。由AMD3100诱导的WM细胞对基质细胞降低的黏着导致这些细胞对由硼替佐米的细胞毒性即抑制增殖的敏感性增加。进一步证实CXCR4和VLA-4响应于CXCL12直接相互作用。因此，已显示CXCR4/CXCL12轴与VLA-4相互作用，调节WM细胞在BM微环境中的迁移和黏着(Ngo 等人, 2008)。
如本文描述的具有B细胞淋巴增生性障碍的418位患者的检查（参见实施例1；表1）揭示具有低级淋巴浆细胞淋巴瘤（WM）的患者中28％具有 C1013G/CXCR4变体。因此进行研究以分析 C1013G/CXCR4变体的功能关联，使用体内模型以评价其在介导WM细胞扩散和疾病进展中的假定作用，并鉴定可以靶向C1013G/CXCR4-突变的淋巴浆细胞的新颖的治疗方法。这些研究证实CXCR4对支持WM细胞返回BM以及WM扩散至远端器官中起关键作用，如使用CXCR4功能获得研究体内所示（实施例2）。重要的是，携带C1013G/CXCR4变体的WM细胞相比于过表达CXCR4的细胞产生相似表型（实施例3），表明C1013G/CXCR4变体可以代表功能活性突变。此外，C1013G/CXCR4-突变的细胞显示相比于对照细胞或CXCR4过表达的WM细胞的体内向淋巴结的扩散（实施例3），表明产生的C1013G/CXCR4变体能够概括在患者中临床观察到的情形。显著地，C1013G/CXCR4突变的细胞能够定殖髓外组织，诸如体内肺和肾脏（实施例3），反映出在具有髓外WM的患者中观察到的表型，其中所述变体已在所有肺和肾脏损害的情况中均被检测到。
观察的C1013G/CXCR4变体是WHIM综合征中原始描述的突变之一。这是罕见的、遗传性的、杂合的、常染色体显性疾病，特征为异常功能的免疫力。这由CXCR4突变引起，这负责削弱其胞内运输的受体的羧基末端尾(talk)（C尾）的截短，导致对趋化因子配体的增加的应答性和BM中的中性粒细胞的保留(Balabanian 等人, 2005; 2008; Hernandez 等人,2003; Taniuchi 等人, 2005)。近期研究已证实在WM患者中存在WHIM样C1013G/CXCR4 突变(Hunter 等人, 2014)，但该突变在WM中的体内功能后遗症和是否体细胞变体存在于其他B细胞淋巴组织增殖性疾病（其中CXCR4介导肿瘤细胞运输和扩散）在本研究之前尚未进行描述。导致疾病进展的C1013G/CXCR4突变的细胞体内扩散的增加的能力通过涉及细胞侵袭性、抗凋亡、细胞增殖和肿瘤生成的基因的富集而得到支持（实施例3）。这导致相比于对照细胞在突变细胞中促存活途径的上调。这些效应当用C1013G/CXCR4突变的细胞或对照细胞注射的携带WM的小鼠时用抗CXCR4抗体ulocuplumab处理时发生逆转，如下文所述。
携带C1013G/CXCR4-突变的华氏巨球蛋白血症细胞对常规使用的抗WM剂的改变的敏感性
通常用于治疗WM的药物包括药剂诸如利妥昔单抗、苯丁酸氮芥(LEUKERAN®)、克拉屈滨(LEUSTATIN®)、氟达拉滨、硼替佐米、苯达莫司汀（单独地或以各种组合）。用于治疗难治性/复发性WM的额外疗法包括奥法木单抗（用于对于利妥昔单抗过敏的患者）、依维莫司、阿仑单抗和高剂量的化学疗法与自体或同种异体干细胞移植。若干新型药物或药物组合在WM的临床试验中进行研究（一些用于难治性/复发性疾病），包括卡非佐米、依鲁替尼和帕比司他（LBH-589）。
依鲁替尼，一种口服施用的酶布鲁顿氏酪氨酸激酶的抑制剂，近期由美国食品药品监管局（FDA）批准用于治疗外套细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病，并于2013年2月由FDA授予作为用于WM患者的单一疗法的突破性疗法认定。依鲁替尼已报道在患有复发性或难治性WM的患者中是高度活性的且良好耐受的(Treon 等人, 2013)，并于2014年10月补充新药申请（sNDA）提交至FDA，其基于来自依鲁替尼在之前用至少一种全身性WM方案治疗治疗的WM患者中的2期临床试验（临床试验政府标识号(ClinicalTrials.gov Identifier)：NCT01614821）的数据。然而，存在WHIM样CXCR4突变已显示赋予对WM细胞中依鲁替尼介导的生长抑制的降低的敏感性(Cao 等人, 2013; Treon 等人, 2013)，并且相比于具有野生型CXCR4的患者中77％的应答率，在具有WHIM样CXCR4突变的患者中仅30％的主要应答率(Treon 等人, 2013)。
此外，本文（实施例4）已显示C1013G/CXCR4体细胞变体与对常规使用的抗WM小分子包括BTK抑制剂、依鲁替尼、mTOR抑制剂、依维莫司和磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）抑制剂、idelalisib (ZYDELIG®)的WM细胞抗性相关，支持了该变体在介导药物抗性中的作用。这一结果表明mTOR、BTK和PI3K抑制剂可能在治疗其WM细胞携带C1013G/CXCR4-突变的患者中不是有效的。相反，C1013G/CXCR4-突变的WM细胞和未突变的对照细胞对于蛋白酶体抑制剂药物卡非佐米和硼替佐米同样敏感（实施例4），因此说明在携带C1013G/CXCR4体细胞突变的WM患者中ulocuplumab和蛋白酶体抑制剂的可能的组合方案。
不受任何具体理论的束缚，提出BTK、PI3K和mTOR抑制剂针对C1013G/CXCR4-突变的细胞不是有效的，这是因为与那些特定途径相关基因的上调。此外，证实突变的CXCR4细胞存在RAF以及促分裂原激活的蛋白激酶/促分裂原激活的蛋白激酶激酶和mTOR途径的富集，因此进一步表明在RAF和促分裂原激活的蛋白激酶激酶/ERK/mTOR途径之间的存在串音(crosstalk)(Downward, 2003; Lim和Counter, 2005)。相反，NF-κB和NF-κB-相关的凋亡基因在CXCR4突变的细胞中相比于对照细胞没有差异调节（数据未显示）。这可以（至少部分地）解释相比于野生型细胞在突变的WM细胞中存在BTK、mTOR和PI3K抑制剂抗性和对蛋白酶体抑制剂的敏感性。
用抗CXCR4抗体治疗华氏巨球蛋白血症
抗CXCR4抗体BMS-936564本文显示抑制WM细胞系朝向原代WM骨髓间充质基质细胞（BM-MSC）或CXCR4配体CXCL12的迁移（参见实施例5）。该抗CXCR4抗体还抑制WM细胞黏着WM BM-MSC并抑制在存在WM BM-MSC的情况下WM细胞增殖。此外，还提供抗体可以直接在WM细胞中诱导凋亡的证据（实施例5）。因此，本公开提供了用于治疗患有WM的主体的方法，所述方法包括向所述主体施用治疗有效量的特异性结合表达于细胞（包括WM细胞）表面的CXCR4受体的抗体或其抗原结合部分。在优选的实施方案中，本方法中所用的抗体为本公开的抗CXCR4抗体，其特异性结合CXCR4受体并展示对于治疗用途期望的某些功能特性。此类功能特性包括对表达于细胞表面上的人CXCR4的高亲和力结合、抑制在细胞表达CXCR4的细胞中SDF-1诱导的钙流和细胞表达CXCR4的细胞的迁移、体内抑制CXCR4+肿瘤细胞增殖和/或诱导CXCR4+肿瘤细胞凋亡、增加携带CXCR4+肿瘤的主体的存活时间、和/或本文描述的其他功能特性。
本公开还提供以下实验证据，即CXCR4基因中C1013G突变存在于约28％的WM患者中和约20％的IgM-MGUS患者中，但在测试的若干其他B细胞癌症中是罕见的或不存在（参见实施例1）。因此，在B细胞淋巴组织增殖性疾病中，WM患者的特征为C1013G/CXCR4突变。还提供显示CXCR4过表达促进体内WM细胞生长和扩散的数据（实施例2）。显示存在C1013G/CXCR4突变增加在存在原代WM BM-MSC的情况下WM细胞的黏着和增殖，概述了CXCR4过表达在WM细胞中的作用（实施例3）。因此，C1013G/CXCR4突变在WM细胞中为激活突变，如被显著的肿瘤增殖和扩散至髓外器官导致疾病进展和降低的存活所证实的。
显著地，ulocuplumab显示在体外和体内在BM微环境的背景中有效靶向CXCR4突变的WM细胞的黏着、迁移和增殖特性（参见实施例6）。施用ulocuplumab导致在C1013G/CXCR4WM模型中体内显著的肿瘤减小和髓外扩散的消除。这些发现证实CXCR4是WM分子致病的关键调节子并且是重要的治疗靶点。使用抗CXCR4抗体成功地靶向野生型和C1013G/CXCR4突变的WM细胞（如实施例5-7中所述）提供了将这些观察结果翻译为WM患者的临床试验的可靠基础。
因此，本公开提供了用于治疗患有WM（包括C1013G/CXCR4-相关的WM）的主体的方法，所述方法包括向所述主体施用治疗有效量的特异性结合表达于细胞（包括WM细胞）表面的CXCR4受体的抗体或其抗原结合部分。在本方法的某些实施方案中，主体为人WM患者，优选患有C1013G/CXCR4-相关的WM的人患者。在某些优选的实施方案中，抗体或其抗原结合部分结合表达于细胞表面上的人CXCR4受体，诸如表达于细胞表面的携带C1013G突变的人CXCR4受体。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的。在某些其他实施方案中，抗体或其抗原结合部分为IgG1同种型的。在其他实施方案中，抗体或其抗原结合部分为IgG4同种型的。在进一步的实施方案中，抗体或其抗原结合部分是单克隆抗体或其抗原结合部分。在仍某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分是嵌合的、人源化的或人抗体或其抗原结合部分。优选地，抗体或其抗原结合部分是人抗体或其抗原结合部分。在更优选的实施方案中，抗体或其片段是ulocuplumab或其结合CXCR4的片段。
重要的是，本文已公开C1013G/CXCR4突变的WM细胞对于用于治疗B细胞恶性肿瘤的重要的三类药物是抗性的，所述三类药物正在积极地测试用于治疗WM，即，BTK抑制剂（由依鲁替尼示例）、mTOR抑制剂（由依维莫司示例）和PI3K抑制剂（由idelalisib示例）（实施例4）。相反，显示抗CXCR4抗体在抑制C1013G/CXCR4突变的和未突变的WM细胞两者的增殖和迁移中是有效的。这些结果表明mTOR、BTK和PI3K抑制剂将无法高效治疗其WM细胞携带C1013G/CXCR4突变的患者，并且强调了抗CXCR4抗体用于治疗此类C1013G/CXCR4-WM变体的效用。
本文已显示Ulocuplumab靶向WM细胞，而与其突变状态无关，这通过抑制促存活信号传导途径的激活、刺激促凋亡级联并抑制体内WM细胞扩散（实施例5和6）。因此，在所公开的治疗方法的某些实施方案中，筛选WM患者的C1013G/CXCR4突变的存在，从而鉴定对于BTK、mTOR、或PI3K抑制剂药物治疗不合适的患者，其中此类患者适合于用抗CXCR4抗体治疗。此类WM患者可能不是用BTK、mTOR或PI3K抑制剂药物治疗的好的候选者，并且可以取而代之用本公开的抗CXCR4抗体作为一线单一疗法来治疗。在本方法的某些优选的实施方案中，抗CXCR4抗体是ulocuplumab。在其他实施方案中，患有C1013G/CXCR4-WM的患者用抗CXCR4抗体诸如ulocuplumab和抗WM剂诸如依鲁替尼、依维莫司、idelalisib、卡非佐米和/或硼替佐米治疗。在进一步的实施方案中，C1013G/CXCR4-WM患者用抗CXCR4抗体单独或与另一抗WM剂的组合来治疗，作为患者已对一种或多种治疗失败后的第二或第三线疗法。例如，抗CXCR4抗体可以在WM患者已对用依鲁替尼的一线治疗失败后施用，或者抗体可以在患者已对用化学治疗BDR（硼替佐米、地塞米松和利妥昔单抗）或RCD（环磷酰胺、地塞米松和利妥昔单抗）方案的一线治疗和用依鲁替尼的第二线治疗失败后施用。
用于华氏巨球蛋白血症中单一疗法的抗CXCR4抗体
WM细胞暴露于BMS-936564导致胱天蛋白酶-9和PARP切割的增加（实施例5）。用BMS-936564中和CXCR4还增加磷酸(p)-GSK3-β和p-β-连环蛋白上调的水平，导致β-连环蛋白降解。BMS-936564类似地增加C1013G/CXCR4-相关的WM细胞中的胱天蛋白酶-9切割和PARP切割并调节GSK3-β/β-连环蛋白信号传导，导致p-GSK3-β/p-β-连环蛋白的上调和β-连环蛋白降解（实施例6）。BMS-936564的这些作用与在WM和C1013G/CXCR4相关的WM细胞中的凋亡途径的激活一致，且反映了在其他B细胞恶性肿瘤中证实的BMS-936564的促凋亡作用(WO2013/071068; Kuhne 等人, 2013)。因此，在用于治疗WM患者的这些方法的某些实施方案中，抗CXCR4抗体或其片段诱导表达CXCR4或C1013G/CXCR4的细胞的凋亡。
公开的抗CXCR4抗体的凋亡作用（一种由小分子CXCR4拮抗剂例如AMD3100未展现的特性）表明这些抗体可以单独作为单一疗法使用来治疗患有癌症的患者。对于CXCR4拮抗剂在体内AML和MM肿瘤模型中的作用的之前研究已证明这些拮抗剂在增强肿瘤细胞对于化学疗法的敏感性中是有效的(Azab 等人, 2009; Zeng 等人, 2009)。此外，本文实施例6中呈现的数据证实ulocuplumab（作为单一疗法施用）抑制在注射有C1013G/CXCR4 WM细胞的小鼠中的WM扩散，这通过在经治疗的小鼠中相比于对照抗体治疗的小鼠中的在股骨、肝脏、肾脏和肺中CXCR4+/CD20+ 细胞浸润的显著降低所证明。类似地，实施例7显示ulocuplumab抑制体内野生型WM细胞扩散。这些结果与当ulocuplumab在各种各样的AML、NHL、和MM模型中作为单一疗法施用时取得的显著的肿瘤生长抑制是一致的(WO 2013/071068; Kuhne 等人, 2013)。
因此，在用于治疗野生型WM或C1013G/CXCR4相关的WM的本治疗方法的某些实施方案中，抗CXCR4抗体或其片段作为单一疗法施用。在优选的实施方案中，抗体或其片段诱导表达CXCR4或C1013G/CXCR4的细胞的凋亡。因此，本公开还提供诱导表达CXCR4或C1013G/CXCR4的WM细胞的凋亡的方法，所述方法包括向WM主体施用治疗有效量的本公开的抗CXCR4抗体。
用于治疗华氏巨球蛋白血症的抗CXCR4和抗癌疗法的组合
如实施例7中所述，BMS-936564和硼替佐米的每一种显著降低在BM中的肿瘤细胞和血清IgM的水平。然而，BMS-936564和硼替佐米的组合协同作用以引起肿瘤细胞和血清IgM水平中甚至更显著的降低。这些结果与之前的证明即CXCR4/CXCL12轴在MM细胞向BM的返回和运输中起主要作用并且破坏MM癌细胞与BM的相互作用使这些细胞对治疗剂变得敏感是一致的(Alsayed 等人, 2007; Azab 等人, 2009; Kuhne 等人, 2013; WO 2013/071068)。
在本方法的某些实施方案中，抗CXCR4抗体或其抗原结合片段结合CXCR4受体并抑制受体的活性。这破坏了WM干细胞在BM微环境中的返回和维持和/或增加WM细胞从BM向周围的动员，并由此增加WM癌细胞对一种或多种抗癌治疗诸如放射治疗或施用化学治疗剂的敏感性。
因此，在某些实施方案中，本公开的抗CXCR4抗体与其他癌症治疗诸如手术和/或放射组合使用，和/或可以与一种或其他多种治疗剂例如细胞毒性剂、放射毒剂或免疫抑制剂共施用，这增强或增加抗CXCR4抗体的治疗作用。抗体可以与药剂连接（作为免疫缀合物）或可以与药剂分开施用。在后一种情况下（分开施用），抗体可以在药剂之前、之后或与药剂同时施用，或者可以与其他已知的治疗剂包括常规化学治疗药物和结合肿瘤相关抗原或免疫调节靶标的抗体共施用。
用于这些方法的抗癌药物包括，尤其是，硼替佐米、 卡非佐米、依鲁替尼、idelalisib、帕比司他、地塞米松、利妥昔单抗、沙利度胺、环磷酰胺、来那度胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松、氟达拉滨、苯丁酸氮芥、苯达莫司汀、克拉屈滨、阿仑单抗、奥法木单抗、依维莫司、顺铂、硫酸博来霉素、卡莫司汀、米托蒽醌、依托泊苷、阿糖胞苷、异环磷酰胺、卡铂和依托泊苷。本文证实C1013G/CXCR4突变的和未突变的WM细胞均对于蛋白酶体抑制剂卡非佐米和硼替佐米同样敏感（实施例4）。此外，ulocuplumab和硼替佐米的组合在降低BM内WM肿瘤细胞和降低体内血清IgM水平以及诱导体外WM细胞中的毒性中协同作用（实施例7）。总之，这些数据强烈表明ulocuplumab与蛋白酶体抑制剂例如硼替佐米或卡非佐米的组合方案在治疗携带有野生型CXCR4或C1013G/CXCR4体细胞变体的WM患者中是高度有效的。共施用本公开的抗CXCR4抗体或其抗原结合片段与抗肿瘤剂提供至少两种抗癌剂，其经不同机制运作以对人肿瘤实施细胞毒性作用。除了抗CXCR4抗体和其他药剂的可能的协同相互作用外，此类共施用可以帮助克服由于发展出对药物的抗性或肿瘤细胞的抗原性中的改变（这将使其对用抗CXCR4抗体无反应性）而产生的问题。
因此，本公开的抗CXCR4抗体可以通过其从BM的保护性环境中释放恶性肿瘤细胞的能力而用于发挥化学治疗剂的作用。如上所述，除了动员WM细胞和增加其化学增敏外，这些抗体已显示具有通过凋亡而直接杀死MM细胞的额外作用并因此（当作为单一疗法施用时）在治疗WM包括C1013G/CXCR4相关的WM中是有效的。
剂量
在所公开的用于治疗WM的方法的某些实施方案中，治疗有效量的抗CXCR4抗体或其抗原结合部分包含范围为0.1-20 mg/kg体重的剂量。例如，在某些实施方案，治疗有效量的抗体或其抗原结合部分包含0.1、0.3、0.5、1、3、5、10或20 mg/kg的剂量。在优选的实施方案中，剂量为1、3或10 mg/kg。在其他实施方案中，抗体或其抗原结合部分以每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次的剂量时间表施用。在优选的实施方案中，抗体或其抗原结合部分以每7-14天一次的剂量时间表施用。在某些实施方案中，抗CXCR4抗体作为单一疗法施用持续治疗的持续时间。在其他实施方案中，抗CXCR4抗体每周施用，在周期1中作为单一疗法持续前两周，并随后与包括例如硼替佐米、地塞米松和利妥昔单抗（BDR）或环磷酰胺、地塞米松和利妥昔单抗（RCD）的化学疗法方案组合。在某些优选的实施方案中，抗体或其抗原结合部分静脉内施用。在其他优选的实施方案中，抗体或其抗原结合部分皮下施用。
例如，对于用ulocuplumab和BDR组合治疗WM，示例性剂量方案包括：(1)ulocuplumab (1、3或10 mg/kg)，作为在第1、8、15、22和29天（周期1）和第1、8和15天（周期2和随后周期）的单一60分钟静脉输注施用；(2)硼替佐米(1.3 mg/m2)，作为在第15、18、22和25天（周期1）和第1、4、8、11天（周期2和随后的周期）的3-5第二静脉推注施用；(3)地塞米松(20或40 mg)，在第15、16、18、19、22、23、25和26天(周期1)和在1、2、4、5、8、9、11和12天（周期2和随后的周期）施用；和(4)利妥昔单抗(375 mg/m2)，在第25天（周期1）和在第11天（周期2和随后的周期）通过缓慢静脉输注例如经90分钟施用。
当抗CXCR4抗体在与其他抗WM剂的组合疗法中使用时，这些药剂通常以其批准的或标准剂量使用。例如，用依鲁替尼的示例性剂量方案包含每天一次口服以420 mg（三个140-mg胶囊）给药直至无法接受的毒性或疾病进展。
在另一实施方案中，抗CXCR4抗体的剂量为统一固定剂量(flat-fixed dose)，其是固定的而与患者体重无关。例如，抗CXCR4抗体可以以5、20、35、75、200、350、750或1500mg的固定剂量施用，而与患者体重无关。如本文所用，术语“固定剂量”、“统一剂量(flatdose)”和“统一固定剂量”可互换使用并指向患者施用的而与患者的体重或体表面积（BSA）无关的剂量。因此，固定剂量或统一剂量不作为mg/kg剂量提供，而是作为药剂（例如抗CXCR4抗体）的绝对量提供。
包括患者选择步骤的C1013G/CXCR4相关的华氏巨球蛋白血症的治疗
本文显示C1013G/CXCR4突变是WM中的激活突变（实施例3）。尽管相比于野生型WM细胞的C1013G/CXCR4突变的细胞的更具侵袭性的表型，但发现BMS-936564在靶向CXCR4突变的细胞的黏着、迁移和增殖特性中是同样有活性的（实施例5）。因此，本公开的抗CXCR4抗体可以在治疗C1013G/CXCR4相关的WM中具有特定的可应用性，并且治疗方案可以包括用于鉴定携带C1013G突变的患者的步骤。因此，在一方面，本公开提供用于治疗患有C1013G/CXCR4相关的WM的主体的方法，其包括（a）选择作为治疗的合适候选者的主体，所述选择包括：（i）提供获自所述主体中的WM组织的测试组织样品；（ii）评价WM测试组织样品中的细胞是否携带CXCR4基因中的C1013G突变；和（iii）基于确定WM细胞携带CXCR4基因中的C1013G突变来选择主体为合适的候选者；和（b）向所选的主体施用治疗有效量的特异性结合表达于C1013G/CXCR4-相关的WM细胞的表面上的CXCR4受体的本公开的抗体或其抗原结合部分。在本方法的某些实施方案中，抗CXCR4抗体与抗WM剂例如硼替佐米或卡非佐米（其对于治疗携带C1013G/CXCR4体细胞变体的WM患者也是有效的）组合施用。在本方法的任一种中，测试组织样品包含肿瘤组织的活检样品或发现于周围的肿瘤细胞样品。
本公开还提供用于治疗患有C1013G/CXCR4-相关的WM的主体的方法，所述方法包括向所述主体施用治疗有效量的特异性结合表达于C1013G/CXCR4-相关的WM细胞的表面上的CXCR4受体的本公开的抗体或其抗原结合部分，所述主体已基于确定主体的WM细胞携带CXCR4基因中的C1013G突变来进行选择。
本公开进一步提供用于选择WM患者用于用特异性结合表达于WM细胞的表面上的CXCR4受体的本公开的抗体或其抗原结合部分治疗的方法，所述方法包括：（a）任选地提供获自患者中的WM组织的测试组织样品；（b）评价WM测试组织样品中的细胞是否携带CXCR4基因中的C1013G突变；和（c）基于确定WM细胞携带CXCR4基因中的C1013G突变来选择患者用于治疗。
在另一方面，本公开提供了用于确定包括用于治疗主体中C1013G/CXCR4-相关的WM的本公开的抗CXCR4抗体或其抗原结合部分的治疗方案的方法，所述方法包括：（a）任选地提供获自主体中的WM组织的测试组织样品；（b）评价WM测试组织样品中的细胞是否携带CXCR4基因中的C1013G突变；和（c）基于确定WM细胞携带C1013G突变来确定治疗方案。
在本方法的某些实施方案中，C1013G突变通过聚合酶链反应（PCR）测定、逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）测定、核酸杂交测定或通过DNA测序来检测。在进一步的实施方案中，PCR测定为实时等位基因特异性PCR (AS-PCR)测定。在进一步的实施方案中，DNA测序为全基因组DNA测序。
在包括筛选测试组织样品中的C1013G/CXCR4突变的任何所公开的方法中，应理解包括提供来自患者的测试组织样品的步骤为任选步骤。即，在某些实施方案中所述方法包括该步骤，而在其他实施方案中，该步骤不包括在所述方法中。还应理解在某些实施方案中，确定WM测试组织样品中的细胞是否携带C1013G突变的“评价”步骤通过测定突变的存在的变化的方法来进行，例如通过进行聚合酶链反应（PCR）测定。在其他实施方案中，不涉及变化的方法并且突变的存在通过例如参阅来自实验室的测试结果的报告来评价。在某些实施方案中，直至且包括评价细胞是否携带C1013G/CXCR4突变的方法的步骤提供中间结果，所述中间结果可以提供给医师或其他医疗从业人员用于选择治疗的合适候选者和/或向患者施用治疗剂。在某些实施方案中，提供中间结果的步骤可以由医疗从业人员或在医疗从业人员指导下工作的某些人来进行。在其他实施方案中，这些步骤通过独立实验室或通过独立的人诸如实验室技术员来进行。
本公开的另一方面涉及用于治疗患有C1013G/CXCR4相关的WM的患者的治疗方案，所述方案通过上述方法来确定，所述方法包括（a）任选提供获自主体的WM组织的测试组织样品；（b）评价所述WM测试组织样品中的细胞是否携带CXCR4基因中的C1013G突变；和（c）基于确定WM细胞携带C1013G突变来确定治疗方案。在某些实施方案中，治疗方案包括向患者以以下剂量和频率施用本公开的抗CXCR4抗体或其抗原结合部分：（a）在治疗携带野生型CXCR4基因的WM患者中施用的剂量的至少两倍、至少三倍、或至少五倍的剂量；和/或（b）在治疗携带野生型CXCR4基因的WM患者中施用的频率的至少两倍、至少三倍、或至少五倍的频率。
用于治疗华氏巨球蛋白血症的优选的抗CXCR4抗体
本文公开的治疗方法包括向WM患者施用本公开的抗CXCR4抗体。该抗体特异性结合表达于WM细胞表面上的野生型CXCR4或C1013G/CXCR4变体，并展示对于治疗效力有利的某些结构和功能特性。例如，期望的结构特征是抗体包含F7 (ulocuplumab)、F9、D1或E2 (如WO2008/060367中标识的)的CDR或可变区，或与这些抗体的任何交叉竞争结合CXCR4的相同表位区。期望的功能特征包括与表达于细胞表面上的人CXCR4高亲和力结合，体内抑制CXCR4+肿瘤细胞增殖和/或诱导CXCR4+肿瘤细胞凋亡。在所公开的治疗方法的某些优选的实施方案中，抗CXCR4 抗体或其部分包含：包含连续连接的氨基酸的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3结构域，其序列描述于SEQ ID NO:25；和包含连续连接的氨基酸的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3结构域，其序列描述于SEQ ID NO:29。
在其他优选的实施方案中，抗CXCR4 抗体或其部分包含：包含连续连接的氨基酸的重链可变区，其序列描述于SEQ ID NO:25；和包含连续连接的氨基酸的轻链可变区，其序列描述于SEQ ID NO:29。
在仍其他优选的实施方案中，根据由Kabat系统的CDR序列的描述(Kabat 等人,1991; Johnson和Wu, 2000)，抗CXCR4抗体或其部分包含：包含具有描述于SEQ ID NO:1的序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR1，包含具有描述于SEQ ID NO:5的序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR2，包含具有描述于SEQ ID NO:9的序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR3，包含具有描述于SEQ ID NO:13的序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR1，包含具有描述于SEQ ID NO:17的序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR2，和包含具有描述于SEQ ID NO:21的序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR3。在更优选的实施方案中，抗体或其片段是ulocuplumab或其结合CXCR4的片段。
所公开的本发明的一个方面为本公开的抗CXCR4抗体或其抗原结合部分用于制备用于治疗患有WM或C1013G/CXCR4相关的WM的主体的药物的用途。这公开了本公开的抗CXCR4抗体或其抗原结合部分，其用于治疗患有WM或C1013G/CXCR4相关的WM的主体。
治疗药剂盒
还在本公开范围内的是包含抗CXCR4抗体或抗原结合片段或其组合物以及使用说明书（例如包括允许医疗从业人员或患者向WM患者施用抗体或其组合物的施用时间表的说明书）的药剂盒。因此，本公开提供用于治疗主体中C1013G/CXCR4-相关的WM的药剂盒，所述药剂盒包含（a）一种或多种剂量的本公开的任何的抗CXCR4抗体或其抗原结合部分和（b）用于在任何本文所述的治疗方法中使用抗CXCR4抗体或其片段的说明书。例如，在某些实施方案中，药剂盒中的抗CXCR4抗体或其抗原结合部分包含具有SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3结构域，和具有SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在优选的实施方案中，抗CXCR4抗体是ulocuplumab。任选地，药剂盒包括单一剂量的药物组合物的多个包装，每个包含有效量的用于根据本文所述方法单次施用的抗CXCR4抗体。药剂盒可以进一步包含一种或多种额外的本文所述的治疗剂，诸如化学治疗剂或放射性毒剂，或一种或多种额外的靶向不同抗原的抗体。在某些实施方案中，抗CXCR4抗体与一种或多种其他治疗剂以单位剂型共同包装。
用于施用药物组合物所需的仪器或设备也可以包含在药剂盒中。例如，药剂盒可以包含一个或多个注射器。在某些实施方案中，一个或多个注射器预先填充有抗CXCR4抗体的量。药剂盒还通常包括连同使用说明书的标明药剂盒的内含物的预期用途的标签。术语标签包括任何提供于药剂盒上或连同药剂盒提供的或以其他方式伴随药剂盒提供的任何书写的或记录的材料。
本发明进一步通过以下实施例来说明，所述实施例仅为说明性的且不应解释为以任何方式限制本公开的范围，因为许多改变和等同方案对于本领域技术人员而言在阅读本公开后将变得显而易见。整个本申请中引用的所有附图和所有参考、GenBank条目、专利和公开的专利申请的内容通过引用明确地并入本文。
实施例1
筛选患有B细胞淋巴组织增殖性疾病患者的C1013/CXCR4突变
筛选患有不同的B细胞淋巴组织增殖性疾病的患者的C1013/CXCR4变体的存在。
临床样品
从患有不同的B细胞淋巴组织增殖性疾病（B-LPD）的418位患者收集肿瘤样品，所述患者分布如下：WM (n = 131); IgM MGUS (n = 40); 弥散性大B细胞淋巴瘤(n = 75); 脾边缘区淋巴瘤(n = 14); B细胞慢性淋巴细胞性淋巴瘤(n = 37, 包括具有M组分的16位);毛细胞性白血病(n = 35); MM (n = 36, IgM同种型中的3位); IgA/IgG MGUS (n = 22);不具有WM标准的淋巴浆细胞淋巴瘤(n = 13); 淀粉样变(n = 6); 和没有另外具体说明的B-LPD(n = 9)。根据造血和淋巴组织肿瘤的最新WHO分类进行诊断(Campo 等人, 2011)。研究中还包括32位健康志愿者作为对照。
诊断组织中的免疫表型分析和克隆细胞定量
使用之前描述的单克隆抗体组(Paiva 等人, 2013)并按照EuroFlow组用于血液恶性肿瘤的免疫表型评价的一般推荐(van Dongen 等人, 2012)来常规完成免疫表型评价。这些病例使用包括除表面IgM（sIgM）和胞质Igλ和κ(cyIgλ和cyIgκ)外高至20种不同抗原的4色组合来进行免疫表型分析。克隆细胞的百分比用包括sIgM/CD25/CD19/CD38 MoAb的试管来计数。数据采集在FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson Biosciences [BDB] SanJose, CA)使用FACSDiva 软价(版本6.1; BDB)和用于所有事件和仅CD19+-事件的两步骤采集程序来进行。使用Infinicyt软件(Cytognos; Salamanca, Spain)进行数据分析。诊断组织中的免疫表型分析和克隆细胞定量后，使用实时等位基因特异性PCR（AS-PCR）进行C1013G/CXCR4变体的检测。十例髓外WM也包括在这些研究中。对于这些研究从Dana-FarberCancer Institute和University Hospital of Salamanca Institutional ReviewBoards获得许可。根据赫尔辛基宣言提供知情同意。
用于鉴定CXCR4 C1013G突变的实时AS-PCR
基于使用两条反向引物（区别在于最后两个核苷酸（在3'位）从而每一引物对于野生型或突变的等位基因是特异性的）开发实时AS-PCR测定，如所述的(Paiva 等人, 2013)。为了防止未匹配引物的扩增（由此提高特异性），向紧邻突变核苷酸处引入额外的核苷酸错配(C> G)。引物的具体长度和位置用Oligo 6.0软件(Molecular Biology Insights, Cascade,CO)进行计算。反向引物为：
5’-GACTCAGACTCAGTGGAAACAGATG-3’ (反向野生型引物)和
5’-GACTCAGACTCAGTGGAAACAGAAC-3’ (反向突变引物)。通用正向引物为5’-TTTCTTCCACTGTTGTCTGAACC-3’，用于产生165 bp的PCR产物。此外，使用Primer Express®Software v3.0.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)设计特异性TaqMan®探针，其产生以下报道分子、序列和猝灭剂：6FAM:5’-TATGCTTTCCTTGGAGCCA-3’:NFQ-MGB。
对于实时AS-PCR开发，每一实验需要两种不同的PCR反应：一种用于检测CXCR4C1013G突变（用突变的反向引物）和另一种作为DNA质量的对照（使用野生型反向引物）。每一反应在20 μl的终体积中进行，其包含300 nM的每一引物、200 nM的探针、1x的TaqMan®Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)和20 ng的基因组DNA。实验在StepOnePlus® Real-Time PCR System (Applied Biosystems)中进行并由以下组成：95℃下10 min的起始变性步骤；随后为95℃15 s和60℃60 s，50个循环。用StepOne™ Software v2.1 (Applied Biosystems)分析数据，其提供CT值，所述CT值被认为是其中荧光开始区别于背景的循环。
结果
在患有WM的患者中存在C1013G/CXCR4变体
C1013G/CXCR4突变在28.2％的WM患者（37/131）和在20％的IgM-MGUS患者（8/40）中检测到。参见表1。此外，变体在7％的患有脾边缘区淋巴瘤的患者（1/14）和1.3％的患有弥散性大B细胞淋巴瘤的患者（1/75）中被检测到，而它在B细胞慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞性白血病、MM和IgG/IgA MGUS中不存在（表1），表明该变体在支持WM的分子致病以及IgM-MGUS前体阶段中的潜在作用。C1013G/CXCR4变体引起CXCR4中单一核苷酸改变C→G，导致预测的终止密码子替代了氨基酸位置338处的丝氨酸（S338X）。这已经之前联系到CXCR4的C末端结构域的截短(Alapi K 等人, 2007)，导致其削弱的胞内易位。
为了进一步证实观察到的变体可能的确诱导WM细胞表面上的CXCR4改变，评价了独立的原代WM患者BM衍生的CD191细胞上的CXCR4表面表达（其携带变体（n=3）或不携带变体（n=8）），并且相比于野生型/CXCR4患者，在携带C1013G/CXCR4变体的患者中发现更高的表面表达（图2）。此外，证实髓外WM组织学诊断的10位患者也评价了体细胞变体的存在：肺损害（3/3）和肾脏损害（1/1）的患者存在突变的C1013G/CXCR4，但该突变在小肠（2/2）和软组织（4/4）中不存在，如通过AS-PCR对基因组DNA所检测的（表2），表明该突变可能在涉及髓外损害的患者中是更普遍的。
表1：华氏巨球蛋白血症患者存在C1013G/CXCR4体细胞突变
C1013G/CXCR4变体存在于28％的具有WM的患者中，在患有B细胞淋巴组织增殖性疾病的少数患者中不存在或者存在。
B-CLL，B细胞慢性淋巴细胞性白血病；MGUS，意义未明的单克隆丙种球蛋白病；NOS，未另外说明。
表2：C1013G/CXCR4变体存在于患有髓外WM疾病的患者的肺和肾脏组织中
实施例2
CXCR4过表达对WM细胞生长和扩散的作用
为了解析C1013G/CXCR4变体在支持WM生物学的体内功能关联性，过表达CXCR4 (GFP+)的WM细胞(CXCR4+)首先提供对CXCR4在体内WM中的作用的探究。
免疫组织化学
分析鼠组织（BM、肝脏、肾脏、肺和淋巴结）并定量人CD20和人CXCR4的表达。这些组织用福尔马林10％固定，将乙醇70％用作储存溶液；并包埋于石蜡。将石蜡切片与抗人CXCR4(Abcam, Cambridge, MA)和抗人CD20 (Dako, Carpinteria, CA)单克隆抗体孵育，使用Leica Bond III自动染色平台(Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL)。二级抗体作为Bond III Refine Detection Kit (Leica Biosystems)的部分提供并且切片与提供于Bond III Refine Detection Kit中的二氨基联苯(DAB)-过氧化物酶底物孵育，用苏木精-曙红复染，脱水，封固并数字照相(Nikon Eclipse 80i, Nikon, Melville, NY)。使用NISElements软件(Nikon, Melville, NY)进行CD20和CXCR4染色的定量。
组织免疫荧光
进行组织免疫荧光成像用于评价收获自小鼠的股骨、肝脏和肾脏的过表达GFP+/CXCR4的WM细胞或RFP+/混杂(scramble)WM细胞，如所述的(Hsieh 等人, 2012)。目标细胞为BCWM.1-GFP+或BCWM.1-RFP+。核染料DAPI加入每一载玻片。使用荧光显微镜(NikonEclipse 80i; 物镜40X plan fluor 0.75NA)分析载玻片。从4个分开区域/载玻片计数MM.1S-GFP+细胞。使用Hamamatsu OrcaER照相机和NISElement软件获取图像。使用Image J合并两个不同的通道。
ELISA
通过使用人IgM ELISA测定(ZeptoMetrix, Buffalo, NY)根据制造商方案测定人血清IgM水平。
体外细胞黏着、迁移和增殖研究
WM细胞黏着至原代WM BM-MSC通过使用钙黄绿素AM标记的MM细胞的体外黏着测定来评价。使用分光光度计(485-520)如之前所述测量荧光程度(Roccaro 等人, 2010)。WM细胞黏着至纤连蛋白通过使用与纤连蛋白的体外黏着测定按照制造商推荐(EMD Biosciences,San Diego, CA)来评价，如所述的(Roccaro 等人, 2013)。WM细胞系向SDF-1α或原代WMBM-MSCs的迁移使用经孔迁移板(Corning Life Sciences, Tewksbury, MA)来评价，如之前所述的(Roccaro 等人, 2010; Sacco 等人, 2011; Azab 等人, 2012)。WM细胞增殖通过在与原代BM-MSC共培养48小时后评价DNA合成来评估，通过[3H]-胸苷 ([3H]-TdR;Perkin Elmer, Boston, MA)摄入来测量，如之前所述的(Roccaro 等人, 2010; Sacco 等人, 2011; Azab 等人, 2012)。细胞毒性通过测量3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑来评价(Chemicon International, Temecula, CA)，如所述的(Roccaro 等人,2010; Sacco 等人, 2011; Azab 等人, 2012)。
功能丧失和功能获得研究
CXCR4功能获得或功能丧失研究已使用WM细胞系(BCWM.1; MWCL1)（单独地或在原代WMBM-MSC背景下）进行，如之前所述的(Roccarro 等人, 2010; Sacco 等人, 2011)。简言之，使用短发夹RNA（shRNA); 克隆171、649）和慢病毒介导的感染在WM细胞中敲低CXCR4；将混杂探针用作包含靶序列（克隆171、649）的对照或混杂对照，这根据制造商的说明书(ThermoScientific, Waltham, MA)。转导效率通过定量逆转录PCR（qRT-PCR）并通过使用荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i, Nikon, Melville, NY)评价表达GFP的细胞的检测来验证。
WM细胞中的CXCR4过表达使用精密LentiORF/CXCR4/GFP (CXCR4+)或用作对照的混杂探针/RFP (Thermo Scientific)来获得。过表达效率通过qRT-PCR并通过用荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i, Nikon, Melville, NY)检测表达GFP和RFP的细胞来证实。
统计学
描述的某些统计学方法还用于其他实施例中。体外测定提供的P值基于T检验（双尾的；α 0.05）或ANOVA。每一图片提供P值。使用CalcuSyn软件程序(Biosoft, Ferguson, MO)通过等效应图分析来分析药物协同作用，如25-27所述。卡普兰-迈耶曲线使用GraphPadPrism获得并且P值基于对数秩检验来计算(Roccaro 等人, 2010; Sacco 等人, 2011;Roccaro 等人, 2008)。
结果
体内CXCR4在WM中的功能关联
将CXCR4+/GFP+细胞和空载体/RFP+细胞注射入SCID/Bg小鼠中。注射效率通过qRT-PCR（图3）和免疫荧光成像（数据未显示；Roccaro 等人, 2014）来验证。将CXCR4+/GFP+细胞和空载体/RFP+细胞注射入SCID/Bg小鼠中。由于疾病进展，3周后将小鼠安乐死，证明WM细胞中CXCR4的过表达导致更具侵袭性的表型，如相比于空载体细胞注射的小鼠在CXCR4+细胞注射的小鼠中器官的显著更高的损害 (P < 0.01；图4A-C)。
先体外后体内研究证实CXCR4+ WM细胞在BM和包括肝脏和肾脏在内的其他器官中扩散和增殖更快（图4；图5A-C）。这些发现还被免疫荧光成像所证实，其显示相比于RFP+细胞，GFP+更高的浸润，RFP+细胞和GFP+细胞分别代表空载体感染的细胞和CXCR4+感染的细胞（数据未显示；Roccaro 等人, 2014）。重要的是，在携带CXCR4+细胞的小鼠中（相比于空载体细胞注射的小鼠）观察到降低的存活(P = 0.02；图5D)。此外，相比于未注射的或空载体细胞注射的小鼠，注射CXCR4+细胞的小鼠具有增加的血清IgM分泌(P = 0.02；图4D)。先体外后体内CXCR4+细胞的存在还通过对收获自CXCR4+细胞或空载体注射的小鼠的股骨的BM细胞进行qRTPCR来证实（图4E）。
由于WM细胞中CXCR4功能获得的体外后遗症也通过比较CXCR4+细胞与CXCR4敲低细胞而描述。感染效率在mRNA水平（图6）和通过免疫荧光成像（数据未显示；Roccaro 等人,2014）来证实。当在BM-MSC背景下时WM细胞黏着原代WM BM基质细胞（BM-MSC）和增殖的能力显示在CXCR4+ WM细胞中增强，并在CXCR4敲低的WM细胞的情况下被抑制（图5E、F）。类似地，CXCR4过表达导致WM细胞与纤连蛋白增加的黏着能力，这与CXCR4沉默的细胞相反，所述CXCR4沉默的细胞存在受抑制的WM细胞与纤连蛋白的黏着（图7A、B）。总之，这些发现表明CXCR4对于促进体内WM细胞生长和扩散是关键的。
实施例3
C1013G/CXCR4突变对于WM致病的作用
解释了C1013G/CXCR4变体是否积极支持WM致病导致疾病进展的问题。
C1013G/CXCR4诱变
使用QuickChange XL基因定点诱变试剂盒(Stratagene, Agilent Technologies,Santa Clara, CA)根据制造商说明书通过基因定点诱变在WM细胞系(BCWM.1; MWCL1)中产生C1013G/CXCR4变体。用对照载体感染的细胞考虑为对照并在本文描述为“对照细胞”。WM感染的细胞中C1013G/CXCR4的检测通过进行对分离自感染的细胞的基因组DNA或cDNA的等位基因特异性PCR来评价。（正向引物：
5’-TTTCTTCCACTGTTGTCTGAACC-3’；反向野生型引物：
5’-GACTCAGACTCAGTGGAAACAGATG-3’；反向突变引物：
5’- GACTCAGACTCAGTGGAAACAGAAC-3’）。通过DNA测序进一步证实数据。
基因表达研究
使用HG-U133加2测定(GSE50683)对C1013G/CXCR4-突变的BCWM.1细胞进行基因表达概况分析。使用RNeasy试剂盒(Qiagen)分离RNA。使用d-Chip软件将数据标准化。使用GeneSet Enrichment Analysis (GSEA)如之前所报道的分析差异表达的基因标签(Subramanian 等人, 2005)。从公开可得的来源下载数据集(Broad Institute,Cambridge, MA)。
结果
产生稳定的C1013G突变的WM细胞(C1013G/CXCR4-WM)并将对照载体感染的WM细胞用作对照。分别通过定量PCR（qPCR）和qRT-PCR在基因组DNA和互补DNA（cDNA）水平证实诱变效率，并进一步通过Sanger DNA测序验证（图8A-C）。
由携带突变的WM细胞诱导的体内表型随后检查。注射有C1013G/CXCR4-WM细胞的小鼠存在向远端器官的显著的肿瘤细胞的扩散和增加的血清IgM分泌（图8D），因此概括了在注射有过表达CXCR4+的WM细胞的小鼠中观察到的作用。除了已证实的肝脏、肾脏和BM的损害之外，C1013G/CXCR4-WM细胞注射的小鼠还存在增大的淋巴结和肺损害。未观察到向中枢神经系统的扩散。组织病理学分析显示在检查的所有组织中均存在CXCR4和CD20阳性细胞，例外是脑（图8E；图9A-E），并且CXCR4和CD20阳性率相比于对照细胞注射的小鼠在C1013G/CXCR4-WM细胞注射的小鼠中更高 (P < 0.05; 图10)。重要的是，C1013G/CXCR4-WM细胞注射的小鼠存在降低的总体存活(P = 0.003; 图9F)。
体外对C1013G/CXCR4-WM细胞(BCWM.1)进一步表征，显示在存在原代WM BM-MSC的情况下增加的黏着和细胞增殖，因此证实C1013G/CXCR4变体能够在WM细胞中再现CXCR4过表达的作用（图11A、B）。使用不同的WM细胞系证实了相似的发现(MWCL1; 图11C、D)。
表3：C1013G/CXCR4-WM患者中基因的上调
携带C1013G/CXCR4突变的WM患者（n=10）中基因的上调与CXCR4/野生型WM患者相比（n=30）。
为了更好地解释C1013G/CXCR4变体促进体内WM细胞扩散的能力，将突变的细胞在mRNA水平上表征。使用GSEA，证明涉及侵袭性、细胞增殖、抗凋亡和致肿瘤性的基因(RizkiA 等人, 2008; Wang 等人, 2007)相比于WM对照载体感染的细胞，在C1013G/CXCR4-WM细胞中均被富集，这与突变的细胞相比于对照细胞更具侵袭性的表型（图12A）是一致的。这些体内观察结果连同在mRNA水平上观察到的改变表明C1013G/CXCR4-WM变体作为WM细胞中的激活突变而起作用。
使用qRT-PCR在mRNA水平上对WM患者进行概况分析，并且若干涉及促分裂素激活的蛋白激酶BTK和PI3K途径的基因（其已知支持WM生物学(Chng 等人, 2008; Gutiérrez等人, 2007)）被发现相比于CXCR4/野生型WM患者（n=30）在C1013G/CXCR4突变的WM患者（n=10）中显著上调（表3）。重要的是，相比于对照载体感染的细胞，那些改变在C1013G/CXCR4突变的BCWM1细胞中同样富集，因此进一步证实C1013G/CXCR4工程化的BCWM.1细胞对于在原代WM肿瘤细胞中所观察到的结果是代表性的（图12B）。
实施例4
C1013G/CXCR4-WM变体对于常规抗WM剂的抗性
研究了携带C1013G/CXCR4变体的WM细胞对于常规使用的抗WM小分子的敏感性。
材料和方法
试剂
依维莫司、idelalisib、依鲁替尼、硼替佐米和卡非佐米购自Selleck Chemicals(Houston, TX)。将药物溶解于二甲亚砜并随后马上使用前稀释于细胞培养基（10％胎牛血清）。二甲亚砜（0.1％）的最大终浓度不影响细胞增殖并且不诱导对所测试的细胞系的细胞毒性。
BMS936564/MDX-1338和对照人IgG4同种型获自Bristol-Myers Squibb (RedwoodCity, CA)。
基因集合富集分析
GSEA如实施例3中所述进行。
结果
GSEA研究显示涉及药物抗性的基因在携带突变的WM细胞系中富集，而涉及药物应答性的基因在WM对照细胞中富集（图13A）。这促进对于新颖的抗WM剂是否可以改变其在CXCR4突变的WM细胞背景下的抗肿瘤效力的研究。发现携带C1013G/CXCR4体细胞突变的WM细胞存在对BTK以及PI3K和mTOR抑制剂的抗性（图12B-D）。这些数据支持表明具有WHIM样突变的CXCR4的WM患者存在对基于依鲁替尼疗法的抗性的近期数据(Cao 等人, 2013; Treon 等人, 2013)。重要的是，蛋白酶体抑制剂在施加针对C1013G/CXCR4突变的WM细胞和对照细胞的毒性中同样有效（图13E-F）。
实施例5
通过抗CXCR4抗体BMS-936564靶向WM细胞
基于CXCR4支持WM进展的生物关联，测试了抗CXCR4人单克隆抗体BMS-936564 (在WO2008/060367中命名为F7；也称为ulocuplumab或MDK-1338)的靶向WM细胞的活性。如实施例2中所述进行测量WM细胞的黏着、迁移和增殖的测定，并且如实施例3中所述进行基因表达研究。
免疫印迹
蛋白裂解物通过在非变性条件下在补充有5 mM NaF、2 mM Na3VO4、1 mM PMSF （苯甲基磺酰氟(polymethilsulfonyl fluoride)）、5 μg/mL亮抑酶肽(leupeptine)和5 μg/mL抑酞酶的裂解缓冲液中匀浆化从WM细胞获得。将全细胞裂解物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）并转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad Laboratories,Hercules, CA)上。用于免疫印迹的抗体包括：抗磷酸(p)-ERK、抗ERK、抗p-Akt、抗Akt、抗p-Src、抗Src、抗胱天蛋白酶-9、抗PARP、抗p-β-连环蛋白、抗β-连环蛋白、抗p-GSK3、抗GAPDH和抗α-微管蛋白抗体(Cell Signaling, Danvers, MA)。
结果
BMS-936564显示抑制WM细胞系向原代WM BM-MSC或SDF-1的迁移（图14A、B）。
类似地，在WM BM-MSC存在的情况下WM细胞向WM BM-MSC黏着的BMS-936564-依赖性抑制和WM细胞增殖的抑制也被证实（图15A-C）。
为了解析BMS-936564在影响WM信号传导中的可能作用，将WM细胞在不存在或存在原代WM BM-MSC的情况下并具有渐增浓度的抗CXCR4抗体下培养。在BM-MSC背景下培养的WM细胞中观察到p-Akt、p-ERK、和p-Src的药物依赖性的抑制，表明BMS-936564即使在BM环境的背景下靶向WM细胞的能力（图16）。
同种型对照没有对WM细胞体外的黏着和迁移施加任何作用（图17A、B）。
BMS-936564可以在B细胞恶性肿瘤中施加促凋亡作用(WO 2013/071068; Kuhne等人, 2013)。因此，将WM细胞暴露于BMS-936564，这导致胱天蛋白酶-9和PARP切割的增加（图18）。
之前已在转移性实体瘤的模型中显示了SDF1/CXCR4和β-连环蛋白之间的相互作用(Wang 等人, 2011)。此外，已知磷酸化的GSK3β促进β-连环蛋白降解(Wang 等人, 2011;Polakis, 2001)。BMS-936564对β-连环蛋白的作用因此进行研究。发现通过用BMS-936564中和CXCR4，WM细胞存在增加的磷酸(p)-GSK3-β和p-β-连环蛋白上调，导致β-连环蛋白降解（图19）。这些发现可以（至少部分地）解释WM细胞中BMS-936564诱导的凋亡的可能机制。
实施例6
体外和体内BMS-936564对C1013G/CXCR4-WM细胞的作用
体内研究
将SCID/Bg小鼠(n = 5/组)注射感染有精密LentiORF/CXCR4/GFP (CXCR4+)的BCWM.1或空载体探针/RFP（对照）感染的BCWM.1细胞。3周后，将小鼠安乐死并收获器官。对移植的器官进行人CD20和CXCR4的苏木精-曙红染色、免疫组织化学。进行独立实验来评价存活差异(SCID/Bg小鼠，n = 7/组)。使用C1013G/CXCR4突变的细胞和对照载体感染的细胞（对照细胞）进行类似研究。使用BCWM.1-mCherry+ 细胞进行体内返回研究：将细胞静脉内注射入SID/Bg小鼠并用BMS-936564或对照抗体处理（10mg/kg，腹膜内；每周3-4次持续3周）。BMS-936564调节WM返回BM、脾和淋巴结的能力在第三周对移植的组织通过使用荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i, Melville, NY)进行离体(ex vivo)评价(Roccaro 等人, 2013)。
在注射有C1013G/CXCR4突变细胞的SCID/Bg小鼠中测试BMS-936564的活性。将小鼠对照用同种型对照抗体(n = 5 小鼠/组；BMS-936564或对照抗体(10mg/kg, 腹膜内；每周3-4次持续3周)处理。
结果
体内检查BMS-936564对CXCR4-突变的WM细胞的作用。如由相比于对照抗体处理的小鼠在处理小鼠中的股骨、肝脏、肾脏和肺中CXCR4+/CD20+细胞浸润的显著降低所示，BMS-936564抑制注射有C1013G/CXCR4 WM细胞的小鼠中的WM扩散（图19A-E；图20A-D）。重要的是，淋巴结损害在用BMS-936564处理的小鼠中不存在（图20E）。
这些发现在体外进一步证实。发现BMS-936564在BM微环境的背景下在靶向CXCR4突变的细胞的黏着、迁移和增殖特性中同样有活性（图21A-D）。
重要的是，BMS-936564增加CXCR4-突变的WM细胞中的胱天蛋白酶-9切割和PARP切割；并还调节GSK3-β/β-连环蛋白信号传导，导致p-GSK3-β/p-β-连环蛋白的上调和β-连环蛋白降解（图22）。此外，BMS-936564诱导携带C1013G/CXCR4突变的WM细胞中p-ERK、p-Akt和p-Src的剂量依赖性抑制（图22）。
实施例7
体内BMS-936564对野生型WM细胞的作用
BMS-936564的抗WM活性还使用野生型WM细胞体内测试。将BCWM.1-mCherry+ 细胞静脉内注射入SCID/Bg小鼠并用BMS-936564或对照抗体处理小鼠。收获的BM、脾和淋巴结的免疫荧光成像证实BMS-936564离体抑制WM细胞扩散的能力（数据未显示；Roccaro 等人,2014）。
由于认为CXCR4抑制诱导干细胞和肿瘤细胞动员，因此假设BMS-936564还可能诱导WM细胞的动员，导致对抗WM剂增加的化学敏感性。因此，对BMS-936564作为单一疗法或与硼替佐米的组合在体内调节肿瘤进展和WM细胞向远端BM环境的扩散中的作用进行评估。（硼替佐米获自Hospital Pharmacy，在DMSO中稀释并储存于-20℃直至使用，随后临使用前在培养基中稀释。DMSO的最大终浓度（< 0.1％）不影响细胞增殖并且不诱导对所测试的细胞系的细胞毒性（数据未显示）。）
BMS-936564处理的小鼠存在BM中肿瘤细胞的显著降低，并且具有在硼替佐米处理的小鼠中观察到的相似作用，且在用BMS-936564和硼替佐米的组合处理的小鼠中具有更显著的抑制(P < 0.05; 图23A)。类似地，血清IgM水平当小鼠用BMS-936564或硼替佐米处理时显著降低，但在暴露于BMS-936564和硼替佐米两者的小鼠中甚至更为显著地降低(P < 0.05;图23B)。BMS-936564和硼替佐米在诱导在WM细胞中的毒性中的组合效应的进一步检查证实体外的协同相互作用（图23C、D）。

Claims (14)

1.用于治疗患有C1013G/CXCR4相关的华氏巨球蛋白血症的主体的方法，所述方法包括向所述主体施用治疗有效量的特异性结合表达于华氏巨球蛋白血症细胞表面上的C-X-C趋化因子受体4型（CXCR4）受体的抗体或其抗原结合部分。
2.权利要求1的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分作为单一疗法施用。
3.权利要求1的方法，其进一步包括施用组合有所述抗体或其抗原结合部分的至少一种抗癌剂。
4.权利要求3的方法，其中所述至少一种抗癌剂是利妥昔单抗、硼替佐米、卡非佐米、依鲁替尼、idelalisib、帕比司他、沙利度胺、来那度胺、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松、氟达拉滨、苯达莫司汀、地塞米松和/或克拉屈滨。
5.权利要求1的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分在华氏巨球蛋白血症的前期治疗失败后施用于所述主体。
6.权利要求1的方法，其中所述治疗有效量的抗体或其抗原结合部分包含以每周一次、每两周一次、每三周一次、或每月一次的给药时间表施用的0.1、0.3、0.5、1、3、5、10或20mg/kg体重的剂量。
7.用于治疗患有C1013G/CXCR4相关的华氏巨球蛋白血症的主体的方法，所述方法包括：
（a）选择作为合适治疗候选者的主体，所述选择包括：
（i）任选地提供获自所述主体中华氏巨球蛋白血症组织的测试组织样品；
（ii）评估所述华氏巨球蛋白血症测试组织样品中的细胞是否携带C-X-C趋化因子受体4型(CXCR4)基因中的C1013G突变；和
（iii）基于确定所述华氏巨球蛋白血症细胞携带CXCR4基因中的C1013G突变而选择所述主体为合适的候选者；和
（b）向所选择的主体施用治疗有效量的特异性结合表达于C1013G/CXCR4相关的华氏巨球蛋白血症细胞的表面上的CXCR4受体的抗体或其抗原结合部分。
8.用于治疗患有C1013G/CXCR4相关的华氏巨球蛋白血症的主体的方法，所述方法包括向所述主体施用治疗有效量的特异性结合表达于C1013G/CXCR4相关的华氏巨球蛋白血症细胞的表面上的CXCR4受体的抗体或其抗原结合部分，所述主体已基于确定主体的华氏巨球蛋白血症细胞携带C-X-C趋化因子受体4型(CXCR4)基因中的C1013G突变来进行选择。
9.用于选择华氏巨球蛋白血症患者用于用特异性结合表达于华氏巨球蛋白血症细胞的表面上的C-X-C趋化因子受体4型(CXCR4)受体的抗体或其抗原结合部分治疗的方法，所述方法包括：
（a）任选地提供获自所述患者中华氏巨球蛋白血症组织的测试组织样品；
（b）评估所述华氏巨球蛋白血症测试组织样品中的细胞是否携带CXCR4基因中的C1013G突变；和
（c）基于确定所述华氏巨球蛋白血症细胞携带CXCR4基因中的C1013G突变而选择所述患者用于治疗。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述抗CXCR4 抗体或其部分包含：具有SEQ IDNO:25中所示的氨基酸序列的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3结构域、和具有SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3结构域。
11.权利要求19中任一项的方法，其中所述抗CXCR4抗体或其部分包含：包含具有描述于SEQ ID NO:25的序列的连续连接的氨基酸的重链可变区、和包含具有描述于SEQ ID NO:29的序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区。
12.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述抗CXCR4抗体或其部分包含：包含具有描述于SEQ ID NO:1的序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR1、包含具有描述于SEQ IDNO:5的序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR2、包含具有描述于SEQ ID NO:9的序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR3、包含具有描述于SEQ ID NO:13的序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR1、包含具有描述于SEQ ID NO:17的序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR2、和包含具有描述于SEQ ID NO:21的序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR3。
13.用于治疗主体中的C1013G/CXCR4相关的华氏巨球蛋白血症的药剂盒，所述药剂盒包含：
（a）一个或多个剂量的抗C-X-C趋化因子受体4型(CXCR4)抗体或其抗原结合部分；和
（b）用于在权利要求1-9中任一项的方法中使用抗CXCR4抗体的说明书。
14.权利要求13的药剂盒，其中所述抗CXCR4 抗体或其抗原结合部分包含：具有SEQ IDNO:25中所示的氨基酸序列的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3结构域、和具有SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3结构域。
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