JP2020023499A - 抗cxcr4抗体によるc1013g/cxcr4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症の治療 - Google Patents

抗cxcr4抗体によるc1013g/cxcr4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症の治療 Download PDF

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Abstract

【課題】C1013G/CXCR4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症(WM)に罹患している対象を治療するための方法の提供。【解決手段】ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞の表面上に発現されるC−X−Cケモカイン受容体タイプ4(CXCR4)受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与する。また、本開示は、C1013G/CXCR4関連WMに罹患している患者を治療するための治療レジメンを提供する。【選択図】なし

Description

本出願全体にわたって、様々な刊行物は、著者名および日付により、または特許番号もしくは公開番号により括弧内に参照される。これらの刊行物の完全な引用は、本明細書の最後、特許請求の範囲の直前に見出すことができる。本明細書で説明し、特許請求される発明の日付時点で当業者に知られた技術水準をより完全に説明するために、これらの刊行物の開示は、その全体が出典明示により本出願に組み込まれる。しかし、本明細書における参考文献の引用は、このような参考文献が本発明の従来技術であることを自認するものと解釈されるべきではない。
発明の分野
本開示は、C1013G/CXCR4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症(Waldenstroem’s macroglobulinemia)を治療する方法における、ヒトCXCR4に特異的に結合するモノクローナル抗体の使用に関する。
発明の背景
C−X−Cケモカイン受容体タイプ4(CXCR4)は、胚発生中におけるリンパ球産生および骨髄(BM)骨髄造血などの生理学的状態において、重要な役割を果たす。出生後、CXCR4およびそのリガンドは、BMニッチにCD341細胞をホーミングすることだけでなく、リンパ球輸送(lymphocytic trafficking)を調節する。とりわけC1013Gバリアントに代表されるCXCR4遺伝子の活性化変異の存在が原因で、いぼ、低ガンマグロブリン血症、感染症、および骨髄性細胞貯留(WHIM)症候群として知られる異常に機能する免疫に特徴付けられる遺伝性ヘテロ接合性常染色体優性疾患を有する患者においてCXCR4は変異したことがこれまでに示されている(Balabanian et al.,2005;Balabanian et al.,2008)。最近の証拠は、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症(WM;リンパ形質細胞性リンパ腫)におけるCXCR4体細胞異常の存在を裏付けている(Hunter et al.,2014;Treon et al.,2014)。リンパ形質細胞性リンパ腫の進行、ならびに他のB細胞リンパ増殖の実体と比較して、WMにとって独特のものであるか、もしくは意義不明のIgMモノクローナル免疫グロブリン血症段階(IgM monoclonal gammopathy of undetermined significance)(MGUS)を発症するかどうかを裏付ける際のこの変異体の機能的役割は、これまでに記載されてこなかった。
WMは、米国では年間100万人あたり約3例の発生率を有する稀なB細胞疾患である。米国では、約1,000〜1,500人が、毎年WMと診断されている。全ゲノム配列決定は最近、この疾患の病因に寄与しうる分子メカニズムに光を当ててきた。特に、L265P/MYD88は、WM患者において優勢体細胞変異として記載されてきた(Treon et al.,2012)。インビトロ研究では、L265P/MYD88変異体が、腫瘍細胞の増殖の増大をもたらしうることが実証されており(Yang et al.,2013)、これは少なくとも部分的には、腫瘍B細胞の生存、増殖、および治療に対する抵抗性を調節する既知のシグナル伝達経路である、核因子κB(NF−κB)のMYD−88依存性活性化により、説明されうる(Leleu et al.,2008)。また、これらの観察は、クローン性WM細胞における発癌性のあるマイクロRNA−155の過剰発現が、初代WM細胞においてNF−κBの活性化をもたらすという以前の発見に一致する。実際、インビボおよびインビトロにおいて、マイクロRNA−155の機能喪失研究はNF−κBの阻害および腫瘍増殖の低減をもたらした(Leleu et al.,2008;Roccaro et al.,2009)。しかし、いくつかの公表された研究では、MYD88の変異は、進行または治療に対する抵抗性を予測せず、他の遺伝的変化が、腫瘍の進行と遠隔臓器への転移(dissemination)にとって、重要でありうるということを示している。
低悪性度B細胞リンパ腫のうち、WMは、過粘稠、出血ならびに末梢神経障害の合併症をもたらし得る、リンパ形質細胞のBM浸潤および血清モノクローナル免疫グロブリンM(IgM)タンパク質の分泌を特徴とするリンパ形質細胞性サブタイプを表す(Ghobrial et al.,2003;Vijay and Gertz,2007)。診断時のBMの広範な侵襲(involvement)の証拠は、クローン性B細胞のBMへの細胞輸送を示唆する。これに関連して、BMへの腫瘍B細胞のホーミングの主要なレギュレーターの1つは、関連リガンド間質由来因子1(SDF−1/CXCL12)との相互作用を介してCXCR4によって表される。
全ゲノムシーケンシングの予備報告は、CXCR4がWMを有する患者の29%(16/55)において変異されているであろうことを示した(Cao et al.,2012)。したがって、WMにおけるこの変異体のインビボにおける機能的な役割だけでなく、抗CXCR4抗体を用いる治療に対するC1013G/CXCR4関連WM患者の反応を明らかにすることを目的として、WMおよび種々のB細胞リンパ増殖性障害を有する患者において、C1013G/CXCR4変異体の存在および役割を調査した。
癌を治療する際に治療効果を示す抗CXCR4モノクローナル抗体は、PCT公開番号WO2008/060367およびWO2013/071068に既に記載されている。これらの両出願の開示は、その全体が出典明示により本出願に組み込まれる。完全なヒトモノクローナル抗体であるウロクプルマブ(ulocuplumab)(WO2008/060367ではF7と称され、また、既にBMS−936564またはMDX−1338とも称されており、4つの名称はすべて、本明細書で互換的に使用される)は、固形腫瘍および血液癌の両方での前臨床試験において予期しない有利な抗腫瘍特性を示した。また、ウロクプルマブは現在、再発/難治性B細胞悪性腫瘍を有する患者において第I相臨床試験を受けている(NCT01120457;Clinical Trials Website,http://www.clinicaltrials.govを参照のこと)。
発明の概要
本開示は、C1013G/CXCR4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症(WM)に罹患している対象を治療するための方法であって、WM細胞の表面上に発現されるCXCR4受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、対象はヒトであり、かつ抗体またはその抗原結合部分は、細胞表面上に発現されるヒトCXCR4受容体、好ましくはC1013G変異を有するヒトCXCR4に結合する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、キメラ、ヒト化もしくはヒト抗体またはそれらの抗原結合部分である。好ましくは、抗体またはその抗原結合部分は、ヒト抗体またはその抗原結合部分である。
また、本開示はC1013G/CXCR4関連WMに罹患している対象の治療のための方法であって、(a)治療のための適切な候補である対象を選択すること、ここで、当該選択が、(i)対象におけるWM組織から得られた試験組織試料を任意に提供すること;(ii)WM試験組織試料中の細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有するかどうかを決定するためにアッセイを行うこと;および(iii)WM細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有するという決定に基づいて適切な候補として対象を選択することを含み;ならびに(b)C1013G/CXCR4関連WM細胞の表面上に発現されるCXCR4受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を、選択された対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示は、C1013G/CXCR4関連WMに罹患している対象の治療のための方法であって、C1013G/CXCR4関連WM細胞の表面上に発現されるCXCR4受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含み、対象のWM細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有すると決定されているということに基づいて、対象が選択されている、方法をさらに提供する。
また、本開示は、WM細胞の表面上に発現されるCXCR4受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分による治療のためのWM患者を選択するための方法であって、(a)当該患者におけるWM組織から得られた試験組織試料を提供すること;(b)WM試験組織試料中の細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有するかどうかを決定するためにアッセイを行うこと;および(c)WM細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有するという決定に基づいて治療のために患者を選択することを含む、方法を提供する。
さらに、本開示は、対象におけるC1013G/CXCR4関連WMを治療するための抗CXCR4抗体またはその抗原結合部分を含む治療レジメンを決定するための方法であって、(a)対象におけるWM組織から得られた試験組織試料を提供すること;(b)WM試験組織試料中の細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有するかどうかを決定するためにアッセイを行うこと;および(c)WM細胞がCXCR4遺伝子中にC1013G変異を有するという決定に基づいて抗CXCR4抗体またはその抗原結合部分を含む治療レジメンを決定することを含む、方法を提供する。一態様では、本開示はまた、C1013G/CXCR4関連WMに罹患している患者を治療するための治療レジメンを提供し、そのレジメンは本方法により決定される。
上記の方法のいずれかの特定の実施形態では、WM患者におけるC1013G/CXCR4変異細胞は、ラパマイシンの哺乳動物標的(mTOR)、ブルトン型チロシンキナーゼ(BTK)、および/またはホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(PI3K)阻害剤を含む、従来使用されていた抗WM剤に対して抵抗性を示す。特定の好ましい実施形態では、C1013G/CXCR4変異細胞は、BTK阻害剤、イブルチニブ(IMBRUVICA(登録商標))に対して抵抗性がある。したがって、特定の実施形態では、対象がmTOR、BTKおよび/またはPI3K阻害剤による治療に失敗した後に、好ましくはイブルチニブによる治療の失敗後に、治療有効量の抗CXCR4抗体またはその抗原結合部分がC1013G/CXCR4関連WMに罹患している対象に投与される。他の実施形態では、対象は治療有効量の抗CXCR4抗体もしくはその抗原結合部分ならびに治療有効量のmTOR、BTKもしくはPI3K阻害剤の組み合わせにより治療される。特定の好ましい形態では、対象は抗CXCR4抗体、ウロクプルマブおよび治療有効量のBTK阻害剤、イブルチニブの組み合わせにより治療される。
上記の方法のいずれかの特定の実施形態では、抗CXCR4抗体またはその抗原結合部分は、配列が配列番号25に記載される、連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域中のCDR1、CDR2およびCDR3ドメイン、ならびに配列が配列番号29に記載される、連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域中のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む。
他の実施形態では、抗CXCR4抗体またはその抗原結合部分は、配列が配列番号25に記載される、連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域、および配列が配列番号29に記載される、連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含む。
さらなる実施形態では、抗CXCR4抗体またはその抗原結合部分は、配列番号1に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR1、配列番号5に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR2、配列番号9に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR3、配列番号13に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域CDR1、配列番号17に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域CDR2、および配列番号21に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域CDR3を含む。好ましい実施形態では、抗体はウロクプルマブである。
別の態様では、本開示は、対象におけるC1013G/CXCR4関連WMを治療するためのキットであって、;(a)抗CXCR4抗体もしくはその抗原結合部分の用量;および(b)上記の方法のいずれかひとつにおいて抗CXCR4抗体を使用するための指示書を含む、キットを提供する。キットで使用するための例示的な抗CXCR4抗体は、WO2008/060367に記載のヒトモノクローナル抗体F7(ウロクプルマブ)、F9、およびD1を含む。好ましい実施形態では、キットにおける抗CXCR4抗体は、ウロクプルマブである。
本開示のその他の特性および利点は、以下の詳細な説明および実施例から明らかとなるだろうが、それらを限定と解釈すべきではない。本出願全体にわたって引用される全参考文献、GENBANK(登録商標)登録、特許および公開された特許出願の内容は、出典明示により本明細書に明示的に組み込まれる。
図1は、F7(ウロクプルマブ)ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域(A)のヌクレオチド配列(配列番号33)およびアミノ酸配列(配列番号25)を示す。重鎖CDR1(配列番号1)、CDR2(配列番号5)、およびCDR3(配列番号9)領域が表され、かつV、D、およびJ生殖細胞系列誘導体(germline derivation)が示される。F7の軽鎖可変領域(B)のヌクレオチド配列(配列番号37)およびアミノ酸配列(配列番号29)も示されている。軽鎖CDR1(配列番号13)、CDR2(配列番号17)およびCDR3(配列番号21)領域が表され、かつVおよびJ生殖細胞系列誘導体が示される。 図2は、WM患者の体細胞C1013G/CXCR4バリアントの同定を示す。CD191BM由来WM細胞上のフローサイトメトリーにより示されるように、野生型(WT)初代WM試料と比較して、C1013G/CXCR4バリアントを有する初代WM試料はより高いCXCR4表面発現を提示する。 図3は、WM細胞におけるCXCR4過剰発現の効率を示す。BCWM.1細胞をprecision LentiORF/CXCR4/GFP(CXCR4)または空ベクター/RFPコントロールのいずれかに感染させた。ΔΔCt法を用いて、GAPDHに対する正規化により、ヒトCXCR4発現レベルをqRT−PCRにより評価した。PはP値を示す。 図4は、CXCR4過剰発現WM細胞のインビボで転移する強化された能力を示す。BCWM.1細胞を、precision LentiORF/CXCR4/GFP(CXCR4)または空ベクター/RFP(コントロール)に感染させ、SCID/Bgマウス(N=5/グループ)に静脈内注射した。3週間後、マウスを安楽死させ、臓器を採取した。ヒトCD20およびヒトCXCR4に対するヘマトキシリン−エオシン免疫組織化学的染色を、大腿骨BM(A)、肝臓(B)および腎臓(C)で実施した。CD20およびCXCR4染色の定量を行い、コントロール細胞を注入したマウスと比較して、CXCR4細胞を注入したマウスにおいてより高い数のCXCR4/CD20+細胞を示した。PはP値を示す。(D)マウスを安楽死させ、3週目に採取された血清、およびヒトIgMレベルをELISAによって試験した。(E)ヒトCXCR4レベルの検出を、BM大腿骨からエキソビボで単離された細胞でqRT−PCR(ΔΔCt法)により実施した。非注入マウス(n=3)およびプールされたコントロール細胞を注入したマウス(n=4)をコントロールとして使用した。PはP値を示す。バーは標準偏差を示す。 図5は、WM細胞におけるCXCR4の過剰発現が、生存の減少、ならびにインビトロにおける接着性および増殖の強化をもたらすことを示す。CXCR4過剰発現細胞(CXCR4)は、関連する空ベクター感染細胞に比べ、BM(A)、肝臓(B)および腎臓(C)に転移する、より積極的な能力を提供する(ヘマトキシリンエオシン×10、抗体染色×20と×10倍率)。ヒトCD20およびCXCR4染色の定量は、図4に示されている。(D)空ベクター細胞を注入したマウスに対する、CXCR4細胞を注入したマウスにおける減少した生存を示す、カプラン−マイヤー曲線(n=7/群)。PはP値を示す(ログランク検定)。(E、F)CXCR4の過剰発現は、初代骨髄間葉系間質細胞(BM−MSCs)への減少した接着性、および減少した細胞増殖が観察されたCXCR4がサイレンシングされたWM細胞(CXCR4−K.D.)と比較した場合、初代骨髄間葉系間質細胞(BM−MSCs)への増加したWM細胞接着、および増加した細胞増殖につながった。バーは標準偏差を示す。DAPI、4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール;NS、有意でない。 図6は、感染したWM細胞におけるCXCR4ノックダウンの効率を示す。BCWM.1細胞をCXCR4−shRNA/GFP(CXCR4 K.D.)またはコントロールとしてのスクランブルプローブ/GFPのいずれかに感染させた。ΔΔCt法を用いて、GAPDHに対する正規化により、ヒトCXCR4発現レベルをqRT−PCRにより評価した。PはP値を示す。 図7は、WM細胞接着特性に対するCXCR4機能喪失および機能獲得の効果を示す。BCWM.1細胞を、LentiORF/CXCR4(CXCR4)(A)もしくはCXCR4 shRNA(CXCR4 K.D.)(B)ならびにそれぞれのスクランブルプローブのいずれかに安定に感染させた。接着性は、BSA−(ネガティブコントロール)、ポリ−D−リジン(ポジティブコントロール)、およびフィブロネクチン−コートウェルを使用して試験された。バーは標準偏差を示す。 図8は、感染したWM細胞における変異誘導効率、およびC1013G/CXCR4変異WM細胞を注入したマウスの脳の侵襲の欠如を示す。ゲノムDNA(gDNA;A)およびcDNA(B)を感染させたBCWM.1から単離した。空/コントロールベクター−感染細胞をコントロール(コントロール細胞)として使用した。C1013Gアレルの検出を、アレル特異的PCRを用いて評価した。PはP値を示す。バーは標準偏差を示す。(C)C1013G変異の検出を、サンガーシーケンシングを用いて評価した。(D)SCID/Bgマウスに、C1013G/CXCR4変異を有するBCWM.1細胞またはコントロール細胞のいずれかを静脈内注射した。(E)ヒトCD20およびヒトCXCR4に対するヘマトキシリン−エオシン免疫組織化学的染色(H.E.)を脳で行い、腫瘍細胞浸潤の欠如を示した。(4×倍率が提供されている。) 図9は、インビボでのWM細胞の転移および生存に対するCXCR4/C1013G変異の効果を示す。C1013G/CXCR4バリアントを有するWM細胞は、増加した細胞接着および細胞増殖と共に、mRNAレベルでの変化を提示する。C1013G/CXCR4バリアントを有するWM細胞を静脈内注射したSCID/Bgマウスは、(A)BM、(B)リンパ節、(C)肝臓、(D)肺、および(E)腎臓(×4、×10および20×倍率)の有意な侵襲を提示する。ヒトCD20およびCXCR4染色の定量は、図10に示される。(F)カプラン−マイヤー曲線は、コントロールベクター細胞を注入したマウス(右方向プロット)に対する、C1013G/CXCR4細胞を注入したマウス(左方向プロット)における減少した生存を示す(n=7/グループ)。コントロールベクター細胞を注入したマウスの死亡は37、48および62日に観察された。PはP値を示す。(ログランク検定) 図10は、C1013G/CXCR4変異WM細胞を注入したマウスから採取された組織におけるヒトCD20およびCXCR4発現の定量を示す。SCID/Bgマウスに、C1013G/CXCR4バリアントを有するBCWM.1細胞または空/コントロールベクター感染細胞(コントロール細胞)のいずれかを静脈内注射した。3週間後、マウスを安楽死させ、臓器を採取した。ヒトCD20およびヒトCXCR4に対するヘマトキシリン−エオシン免疫組織化学的染色を、大腿骨BM、リンパ節、肝臓、肺および腎臓で実施した(Nikon,Melville,NY)。CD20およびCXCR4染色の定量を行った(NIS Elements software,Nikon,Melville,NY)。PはP値を示す。T検定を、大腿骨、肝臓、腎臓および肺を分析するために使用し、そして分散分析試験をリンパ節を分析するために使用した。 図11は、インビボでのWM細胞の接着および増殖に対するCXCR4/C1013G変異の効果を示す。C1013G/CXCR4−WM細胞を静脈内注射したSCID/Bgマウスにおいて、C1013G/CXCR4バリアントは、単独で、またはBM−MSCsとの関連のいずれかでWM細胞の接着(A)および増殖(B)を増加させた。(C、D)C1013G/CXCR4バリアントは、単独で、またはBM−MSCsとの関連のいずれかでMWCL1細胞の接着および増殖を増加させた。空/コントロールベクター−感染細胞をコントロールとして用いた。バーは標準偏差を示す。PはP値を示す。 図12は、C1013G/CXCR4変異細胞は、遺伝子レベルでコントロール細胞と異なることを示す。(A)C1013G/CXCR4変異細胞対コントロールベクター−感染細胞(コントロール細胞)における腫瘍侵襲性(invasiveness)、細胞増殖、抗アポトーシスおよび発癌性特徴(oncogenic signature)遺伝子のジーンセットエンリッチメント解析(GSEA)濃縮プロット。プロットされた曲線は、濃縮スコアを示し、各遺伝子(縦線)がランク付けされた遺伝子リストの最上部または最下部に示されている程度を反映する。ヒートマップは、変異細胞において特異的に濃縮され、コントロール細胞と比較された、遺伝子の相対的な存在量(左から右)を示す。すべての遺伝子セットは、常に偽陽性率(FDR)<0.25で、C1013G/CXCR4変異細胞中で濃縮された。正規化された濃縮スコア(NES)およびFDRは、分析された各遺伝子セット毎に示される。(C)C1013G/CXCR4変異細胞対コントロールベクター感染細胞(コントロール細胞)における、表3に記載されたアップレギュレートされた遺伝子に関するGSEA濃縮プロット。同遺伝子を、コントロール細胞と比較して、変異した細胞において濃縮した。 図13は、C1013G/CXCR4体細胞バリアントを有するWM細胞は、薬剤抵抗性を与えることを示す。(A)それぞれ、C1013G/CXCR4変異細胞およびコントロールベクター感染細胞(コントロール細胞)における、多剤耐性および薬物応答性特徴遺伝子に対するGSEA濃縮プロット。プロットされた曲線は、濃縮スコアを示し、各遺伝子(縦線)がランク付けされた遺伝子リストの最上部または最下部に示されている程度を反映する。ヒートマップは、変異細胞において特異的に濃縮され、コントロール細胞と比較された、遺伝子の相対的な存在量(左から右)を示す。遺伝子セットは、FDRが常に<0.25で濃縮されたと考えられた。正規化された濃縮スコア(NES)とFDRは、分析された各遺伝子セット毎に示されている。(B−F)C1013G/CXCR4−WM細胞株(BCWM1;MWCL1)またはコントロールベクター感染細胞(コントロール)を、エベロリムス、イブルチニブ、イデラリシブ、ボルテゾミブ、およびカーフィルゾミブに48時間曝露した。細胞毒性は、3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミドにより決定した。 図14はインビトロにおけるWM細胞の遊走に対するBMS−936564の効果を示す。WM細胞株(BCWM.1;MWCL.1)を、トランスウェル遊走アッセイを使用して、それらの遊走特性について試験した。細胞を、増加する濃度のBMS−936564に曝露し、5時間後、遊走を測定した。トランスウェル遊走アッセイを、初代WM BM−MSCsの存在下(A)またはSDF−1αの存在下(B)で行った。両方の場合において、WMの細胞遊走のBMS−936564依存性阻害が観察された。 図15は、インビトロにおけるWM細胞の接着および増殖に対するBMS−936564の効果を示す。(A)WM細胞株を4時間BMS−936564で処置し、続いて初代WM BM−MSCsへの接着について試験した。2時間後の接着の評価は、WM細胞接着のBMS−936564依存性阻害を示した。(B、C)WM細胞株(BCWM.1;MWCL.1)を、初代WM BMMSCsの存在下または非存在下で48時間、コントロール培地と共に、およびBMS−936564と共に培養した。細胞増殖を、[H]−チミジン取り込みアッセイを用いて評価した。バーは標準偏差を示す。PはP値を示す。すべてのデータは、3回の実験の平均値(±標準偏差)を表す。CXCR4アンタゴニスト、AMD3110(Sigma−Aldrich,St. Louis,MO)、を、コントロールとして使用した。 図16は、WM細胞シグナル伝達に対するBMS−936564の効果を示す。BCWM.1細胞を、初代WM BM−MSCsの存在下または非存在下で6時間、BMS−936564に曝露した。次いで、BCWM.1細胞を採取し、細胞溶解物を、抗ホスホ(p)−ERK1/2、抗ERK1/2、抗p−Akt、抗Akt、抗p−SRC、および抗SRC抗体を用いたウェスタンブロット分析に供した。WM BM−MSCsの非存在下で培養されたBCWM.1細胞をコントロールとして使用した。バーは標準偏差を示す。 図17は、インビトロで、WM細胞株の接着(A)または遊走(B)に対して、コントロール抗体が影響しなかったことを示す。 図18は、WM細胞におけるアポトーシス関連タンパク質に対するBMS−936564の効果を示す。BCWM.1細胞を14時間、BMS−936564に曝露した。次いで、全細胞溶解物を回収し、抗カスパーゼ−9、抗PARP、抗p−βカテニン、抗β−カテニン、抗p−GSK3β、および抗チューブリン抗体を用いたウェスタンブロット分析に供した。 図19は、BMS−936564が、インビボでWM細胞中のC1013G/CXCR4変異細胞を標的とすることを示す。(A−E)BMS−936564はインビボでC1013G/CXCR4変異WM細胞の転移を阻害した。ヒトCD20およびCXCR4染色は、アイソタイプコントロール処置マウス(未処置)と比較して、BMS−936564で処置したマウスから外植された組織において有意に減少した。PはP値を示す。 図20は、インビボでのWM細胞におけるC1013G/CXCR4変異細胞に対するBMS−936564の効果の代表的な組織化学的画像を示す。SCID/Bgマウスに、C1013G/CXCR4変異を有するBCWM.1細胞または空/コントロールベクター感染細胞(コントロール細胞)のいずれかを静脈内注射した。BMS−936564またはコントロール抗体(10mg/kg、腹腔内、×3/4/週;マウス:5/グループ)のいずれかでマウスを処置した。3週間後、マウスを安楽死させ、臓器を採取した。ヒトCD20およびCXCR4に対するヘマトキシリン−エオシン免疫組織化学的染色を、大腿骨BM(A)、肝臓(B)、腎臓(C)、肺(D)およびリンパ節(E)で実施した(Nikon,Melville,NY;4×、10×または20×の倍率が示される)。 図21は、BMS−936564が、BMとの関連で、WM細胞においてC1013G/CXCR4変異細胞を標的にすることを示す。C1013G/CXCR4感染BCWM.1細胞を、トランスウェル遊走アッセイを使用して、遊走特性について試験した。細胞を増加する濃度のBMS−936564に曝露し、5時間後、遊走を測定した。トランスウェル遊走アッセイを初代WM BM−MSCs(A)またはSDF−1α(B)いずれかの存在下において実施した。両方の場合において、WM細胞の遊走のBMS−936564依存的阻害が観察された。(C)C1013G/CXCR4感染BCWM.1細胞を、BMS−936564で4時間処置し、続いて初代WM BM−MSCsに対する接着について試験した。2時間後の接着の評価は、WM細胞接着のBMS−936564依存的阻害を示した。(D)C1013G/CXCR4感染BCWM.1細胞を、初代WM BM−MSCsの存在下または非存在下で48時間、コントロール培地と共に、およびBMS−936564と共に培養した。細胞増殖を、[H]−チミジン取り込みアッセイを用いて評価した。バーは標準偏差を示す。PはP値を示す。すべてのデータは、3回の実験の平均値(±標準偏差)を表す。バーは標準偏差を示した。 図22は、C1013G/CXCR4WM細胞における生存およびアポトーシス関連シグナル伝達タンパク質に対するBMS−936564の効果を示す。C1013G/CXCR4変異細胞は、BMS−936564の存在下または非存在下で6時間培養され、ホスホ(p)−ERK、ERK、p−Akt、Akt、p−Srcの阻害を示した。同様に、細胞を14時間、当該化合物に曝露し、アポトーシス関連経路(p−GSK3β、p−β−カテニン、PARPおよびカスパーゼ−9)の誘導を観察した。 図23は、BMS−936564がインビボでWMホーミングを阻害し、インビボおよびインビトロでボルテゾミブに対するWMの化学的感受性を相乗的に高めることを示す。(A,B)BCWM.1−mCherry細胞をSID/Bgマウスに静脈注射した。マウスを、コントロール抗体またはBMS−936564(10mg/kg腹腔内;×3/4/週)、ボルテゾミブ(0.5mg/kg腹腔内;×2/週)、もしくはBMS−936564+ボルテゾミブ(上記と同じ用量;×2/週)のいずれかで処置した。BM細胞を試験の終了時に採取し、蛍光プレートリーダーを用いて評価した。コントロールは、コントロール抗体−処置マウスのBMから同定されたmCherry細胞の数として意図される。血清を試験の終了時に採取した。血清IgM分泌を、ヒトIgM ELISAキットを用いて評価した。(C、D)WM細胞株(BMW.1;MWCL.1)を、単独または併用レジメンのいずれかを用いて、BMS−936564またはボルテゾミブに48時間曝露した。細胞毒性をMTTにより行った。相乗作用はCalcusynソフトウェアにより評価され、BMS−936564およびボルテゾミブの併用のアイソボログラム、併用指数(C.I.)、および影響割合(F.A.)が示されている。バーは標準偏差を示す。
発明の詳細な説明
本開示は、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に罹患している患者におけるCXCR4活性を調節する、あるいはかかる患者を治療するための、細胞表面上に発現される天然(native)ヒトCXCR4に特異的に結合するモノクローナル抗体の使用の方法に関する。これらの方法は、特に、CXCR4遺伝子中の活性化C1013G変異を有するWM患者に適用できる。特定の実施形態では、抗CXCR4抗体は、単剤療法として、または、治療のファースト(“フロント”)ライン、たとえば初期または第一の治療として、組み合わせ療法の一部(たとえばmTOR、BTKおよび/またはPI3K阻害剤との組み合わせにおける)として投与される。他の実施形態では、抗CXCR4抗体は、たとえば、再発後および/または第一の治療が失敗した場合を含む、同一のまたは1つ以上の異なる治療薬による初期治療後の、セカンド−またはサード−ライン治療として投与される。したがって、特定の実施形態では、抗CXCR4抗体は、別の抗WM剤、たとえばmTOR、BTKおよび/またはPI3K阻害剤による治療の失敗後に投与される。
定義
本発明がより容易に理解されてもよいように、特定の用語を最初に定義する。特に明確に本明細書で提供される場合を除き、本出願で使用されるように、以下の用語のそれぞれは、以下に記載する意味を有するものとする。さらなる定義は、本出願全体に記載されている。
「投与」は、当業者に知られた種々の方法および送達システムのいずれかを使用する、対象への治療薬を含む組成物の物理的な導入を指す。本発明の抗体のための好ましい投与経路は、たとえば注射または注入による、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、脊髄または投与の他の非経口経路を含む。本明細書で使用される語句「非経口投与」は、経腸および局所投与以外の投与様式を意味する。また、投与は、たとえば一回、複数回、および/または1回以上の延長された期間にわたって、行うことができる。
「抗体」(Ab)は、限定なく、抗原に特異的に結合し、ジスルフィド結合により相互接続した少なくとも2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖を含む、糖タンパク質免疫グロブリン、またはその抗原結合部分を含むものとする。各H鎖は、重鎖可変領域(本明細書中ではVと略される)および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、CH1、CH2およびCH3の3つのドメインを含む。各軽鎖は軽鎖可変領域(本明細書中ではVと略される)および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は1つのドメインCを含む。VおよびV領域はさらに、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域に細分化できる。各VおよびVは3つのCDRおよび4つのFRで構成され、それらはアミノ−末端からカルボキシ−末端に、以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系(たとえば、エフェクター細胞)の種々の細胞および古典的補体系の第1成分(C1q)を含む、宿主組織もしくは因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介しうる。
抗体は、典型的には、10−5〜10−11−1またはそれ以下の解離定数(K)により反映される高親和性で、それらの同族抗原に特異的に結合する。約10−4−1以上の任意のKは、一般的に非特異的な結合を示すと考えられる。本明細書で使用されるように、抗原に「特異的に結合する」抗体は、約10−7M以下、好ましくは約10−8M以下、より好ましくは約5×10−9M以下、さらにより好ましくは約5×10−10M以下、および最も好ましくは約10−9Mと約10−11M以下の間のKを有することを意味する高親和性で、抗原および実質的に同一な抗原に結合するが、関係のない抗原とは高い親和性で結合しない抗体を指す。ある抗原が、所与の抗原に対して高い配列同一性を示す場合、たとえば、所与の抗原の配列と少なくとも80%、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも97%、またはさらにより好ましくは少なくとも99の配列同一性を示す場合、所与の抗原に「実質的に同一」である。一例として、ヒトCXCR4に特異的に結合する抗体はまた、特定の霊長類種からのCXCR4抗原と交差反応性を有しうるが、特定のげっ歯動物種からのCXCR4抗原、またはCXCR4以外の抗原、たとえばヒトPD−1抗原と交差反応しなくてもよい。
免疫グロブリンは、IgA、分泌型IgA、IgG,およびIgMを含むがこれらに限定されない、一般的に知られるアイソタイプのいずれかに由来してもよい。また、IgGサブクラスは当業者に知られており、かつ、ヒトIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含むがこれらに限定されない。「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス(たとえばIgMまたはIgG1)を指す。「抗体」は、一例として、天然に生じるおよび非天然に生じる抗体;モノクローナルおよびポリクローナル抗体;キメラおよびヒト化抗体;ヒトまたは非ヒト抗体、完全合成抗体;ならびに一本鎖抗体である。非ヒト抗体はヒトにおける免疫原性を減少させるように組換え方法によりヒト化されてもよい。
明示されていない場合、および文脈がそうでないことを示さない限り、用語「抗体」はまた、前述の免疫グロブリンのいずれかの抗原結合部分を含む。抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合フラグメント」は、完全な抗体によって結合される抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の1つ以上のフラグメントを指す。抗体の「抗原結合部分」の用語内に包含される結合フラグメントの例は、Fab、F(ab’)Fd、Fv、および一本鎖可変フラグメント(scFv)、2価(divalent)のまたは2価(bivalent)のscFv、ダイアボディもしくは他の抗体の多量体(たとえば3価トリアボディまたは4価テトラボディ)、ミニボディ、ならびに単離されたCDRさえも含み、これらは抗原結合機能を示しうる。抗体および関連バリアントの上記のタンパク質分解性フラグメントおよび操作されたフラグメントの全ては(より詳しくはHollinger et al.,2005;Olafsen et al.,2010,を参照のこと)、抗体の「抗原結合部分」の用語内に包含される。
用語「モノクローナル抗体」(「mAb」)は、単一分子組成物の抗体分子の調製物、すなわち、抗体分子の一次配列が本質的に同一で、かつ特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す抗体分子を指す。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、トランスジェニック技術、または当業者に知られた他の技術により生産されてもよい。
「ヒト」抗体(HuMAb)は、フレームワークおよびCDR領域の両方がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。さらに、抗体が定常領域を含むならば、定常領域もまた、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基(たとえば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異導入、またはインビボにおける体細胞変異により導入された変異)を含んでもよい。しかしながら、本明細書中に使用される用語「ヒト抗体」は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖細胞系列由来CDR配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図していない。用語「ヒト」抗体および「完全ヒト」抗体は、同意語として使用されている。
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体のCDRドメイン外のアミノ酸の一部、大部分または全てがヒト免疫グロブリンに由来する対応するアミノ酸で置換された抗体を指す。抗体のヒト化形態の一実施形態では、CDRドメイン外のアミノ酸の一部、大部分または全てがヒト免疫グロブリンに由来する対応するアミノ酸で置換されている、一方、1つ以上のCDR領域内の一部、大部分または全てのアミノ酸は不変である。特定の抗原に結合する抗体の能力を抑止しない限りにおいて、アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換または改変は許容される。「ヒト化」抗体は、元の抗体と同様の抗原特異性を保持する。
「キメラ抗体」は、可変領域がマウス抗体に由来し、定常領域がヒト抗体に由来する抗体などの、可変領域がある種に由来し、定常領域が別種に由来する抗体を指す。
「癌」は、体内の異常細胞の制御不能な増殖によって特徴づけられる様々な疾患の幅広い群を指す。また、制御されない細胞分裂および増殖は、隣接組織に侵襲し、またリンパ系または血流を通して体の遠隔部分に転移(metastasize)しうる悪性腫瘍の形成をもたらす。癌は、固形腫瘍および血液悪性腫瘍を含む。
固形腫瘍は、血液、BMもしくはリンパ細胞以外の体組織細胞の異常な増殖により形成される新生物(細胞の新たな増殖)または病変(解剖学的構造の損傷や生理機能の乱れ)である。それは、肝臓、結腸、胸部、または肺などの異なる組織タイプに由来しうる、最初にその細胞起源の臓器において成長する、異常な細胞の塊から構成される。しかしながら、固形腫瘍は、疾患の進行した段階で転移性(metastatic)腫瘍増殖を通して他の臓器に広がってもよい。
血液悪性腫瘍は、血液、BM、脾臓および/またはリンパ節に影響し、かつリンパ腫、白血病、骨髄腫およびリンパ性悪性腫瘍を含む癌タイプである。血液悪性腫瘍は、2つの主要な血液細胞系統、すなわち、骨髄およびリンパ細胞株のいずれかに由来し得る。骨髄細胞株は、通常、顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージ、および肥満細胞を産生する、一方、リンパ系細胞株はB、T、NK、および形質細胞を産生する。リンパ腫(たとえば、ホジキンリンパ腫)、リンパ性白血病、および骨髄腫はリンパ球系に由来する、一方、急性および慢性骨髄性白血病(AML、CML)、骨髄異形成症候群ならびに骨髄増殖性疾患は、骨髄に起源がある。ワルデンシュトレームマクログロブリン血症(WM)はB細胞リンパ腫の例であり、抗CXCR4抗体による治療の影響を受けやすいことが本明細書に示されている。
用語「CXCR4」(「C−X−Cケモカイン受容体4」)は、バリアント、アイソフォーム、ホモログ、オルソログおよびパラログを含む。たとえば、CXCR4に特異的な抗体は、特定の場合では、ヒト以外の種由来のCXCR4と交差反応してもよい。他の実施形態では、ヒトCXCR4に特異的な抗体は完全にヒトCXCR4に特異的であってもよく、かつ交差反応性の種または他のタイプを示さなくてもよい。用語「ヒトCXCR4」は、GENBANK(登録商標)アクセッション番号P61073(配列番号51)を有するヒトCXCR4の完全なアミノ酸配列などのヒト配列CXCR4を指す。CXCR4はまた、たとえば、LESTER、FusinまたはCD184として当技術分野で知られている。ヒトCXCR4の配列は、たとえば、保存された変異または非保存領域の変異を有することにより配列番号51のヒトCXCR4と異なってもよく、CXCR4は配列番号51のヒトCXCR4と同じ生体機能を実質的に有する。
「CXCR4−発現癌」または「CXCR4癌」は、癌であって、この癌を特徴付ける悪性細胞が細胞表面上にCXCR4を発現し、好ましくは、CXCR4を高レベルで発現するものである。WHIM症候群に既に関連しているCXCR4遺伝子中のC1013G変異が、WM患者の28%に存在するが、他のB細胞リンパ腫では存在しないか、わずか7%に存在する、のいずれかであることが本明細書中に開示されている。C1013G/CXCR4関連WMはC1013G/CXCR4変異が存在するWMを指す。
「対象」は、ヒトまたは非ヒト霊長類(たとえば、サル)、イヌ、ウサギ、げっ歯類、もしくはニワトリなどの非ヒト動物を含む。好ましい実施形態では、当該対象はWM患者などのヒト癌患者である。用語「対象」、「患者」および「個人」は、本明細書中で互換的に使用される。
抗CXCR4抗体などの薬剤または治療薬の「治療有効量」または「治療有効用量」は、単独で、または別の治療薬と組み合わせて使用された場合に、疾患症状の重症度の減少、疾患症状のない期間の頻度および持続時間の増加、または疾患の苦痛による機能障害もしくは身体障害の予防によって証明される疾患の退行を促進する、薬剤の任意の量である。薬剤の治療有効量または治療有効用量は、疾患の発症または疾患の再発を被るリスクのある対象に、単独または別の治療薬と組み合わせて投与した場合に、疾患の進行または再発を阻害する、薬剤の任意の量である、「予防的有効量」または「予防有効用量」を含む。疾患の退行を促進する治療薬の能力は、臨床試験中のヒト対象における、ヒトでの有効性を予測できる動物モデル系におけるような、当業者に知られた様々な方法を用いて、またはインビトロアッセイにおいて薬剤の活性をアッセイすることにより、評価できる。
さらに、治療に関する用語「有効な」および「有効」は、薬理学的有効性および生理学的安全性の両方を含む。薬理学的有効性は、患者における癌の退行を促進する薬剤の能力を指す。生理学的安全性は、薬剤の投与に起因する、毒性レベルまたは細胞、臓器および/もしくは生物レベルでの他の有害な生理学的効果(副作用)を指す。
対象の「治療(treatment)」または「治療(therapy)」は、疾患に関連する症状、合併症、状態または生化学的兆候の発症、進行、発展、重症度または再発を、逆転、緩和、改善、阻害、減速または予防の目的を有する対象に対して実施された、任意のタイプの介入もしくは処理、またはかかる患者に活性薬剤を投与することを指す。
代替の使用(たとえば、「または」)は、1つ、両方または選択肢の任意のその組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用される不定冠詞「a」または「an」は任意の記載または列挙される成分の「1つ以上」を指すと理解されるべきである。
用語「約」、「本質的に」または「本質的に含む」は、どのように値もしくは組成が測定または決定されたかということ、すなわち、測定系の限界に部分的に依存するであろう、当業者によって決定された特定の値または組成のための許容誤差範囲内にある、値または組成を指す。たとえば「約」、「本質的に」または「本質的に含む」は、当技術における慣行につき、1以内または1より大きい標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」、「本質的に」または「本質的に含む」は、プラスまたはマイナス20%の範囲、より通常はプラスまたはマイナス10%の範囲を意味し得る。さらに、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、当該用語は値の一桁まで、または5倍まで意味し得る。本出願および特許請求の範囲で特定の値または組成が提供される場合、特に明示しない限り、「約」、「本質的に」または「本質的に含む」の意味は、その特定の値または組成のための許容誤差範囲内であると想定されるべきである。
本明細書に記載されるように、任意の濃度範囲、百分率範囲、比率範囲または整数範囲は、特に明示しない限り、記載された範囲内の任意の整数の値および適切な場合、その分数(ある整数の十分の一および百分の一など)を含むと理解されるべきである。
本開示の様々な態様は、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載される。
治療用抗CXCR4抗体
ヒトモノクローナル抗体F7(ウロクプルマブ;BMS−936564;MDX−1338)、F9、D1およびE2を含む、本発明の治療方法における使用のための例示的な抗CXCR4抗体の産生は、WO2008/060367において詳細に記載されている。また、血液悪性腫瘍を治療するためのこれらの抗体の使用方法は、WO2008/060367およびWO2013/071068に記載されている。本開示の抗CXCR4抗体は、キメラ、ヒト化または、好ましくは、完全ヒト抗体であってもよく、かつ特定の機能的特徴または特性により特徴づけられる。たとえば、抗体は、細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合する。好ましくは、本開示の抗体は、高い親和性で、たとえば1×10−8M以下のKで、CXCR4に結合する。本開示の抗CXCR4抗体は、好ましくは、治療用途のために望ましい、以下の特徴
(a)細胞表面上に発現されるヒトCXCR4に結合すること;
(b)SDF−1のCXCR4への結合を阻害すること;
(c)CXCR4を発現する細胞においてSDF−1誘導性カルシウムフラックスを阻害すること;
(d)CXCR4を発現する細胞のSDF−1誘導性遊走を阻害すること;
(e)ヒト臍帯静脈内皮細胞による毛細管形成を阻害すること;
(f)1×10−8M以下のKでヒトCXCR4に結合すること;
(g)CXCR4を発現する細胞におけるアポトーシスを誘導すること;
(h)インビトロでCXCR4腫瘍細胞の増殖を阻害すること;
(i)インビボでCXCR4腫瘍細胞増殖を阻害、および/もしくはCXCR4腫瘍細胞のアポトーシスを誘導すること;
(j)CXCR4腫瘍細胞の転移(metastases)を阻害すること;ならびに
(k)CXCR4腫瘍を有する対象の生存期間を増加させること;
の1つ以上を示す。
好ましい実施形態では、本開示の抗CXCR4抗体は、1×10−8M以下のKでヒトCXCR4に結合し、CXCR4発現細胞においてアポトーシスを誘導し、かつ上述した他の特性の少なくとも5つを示す。より好ましい実施形態では、本開示の抗CXCR4抗体は、上述した特性のすべてを示す。
特定の実施形態では、本開示の方法における使用のための抗CXCR4抗体は、5×10−8M以下のKでヒトCXCR4に結合し、2×10−8M以下、5×10−9M以下、4×10−9M以下、3×10−9M以下、または2×10−9M以下のKでヒトCXCR4に結合する。好ましい実施形態では、抗CXCR4抗体はウロクプルマブ(BMS−936564)である。
一態様では、本開示の抗CXCR4抗体は、F7、F9、D1、またはE2の重鎖および軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、またはそれらの組み合わせを含む。F7、F9、D1、またはE2のVCDR1のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号1〜4に示されている。F7、F9、D1、およびE2のVCDR2のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号5〜8に示されている。F7、F9、D1、およびE2のVCDR3のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号9〜12に示されている。F7、F9、D1、およびE2のVCDR1のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号13〜16に示されている。F7、F9、D1、およびE2のVCDR2のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号17〜20に示されている。F7、F9、D1、およびE2のVCDR3のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号21〜24に示されている。F7(ウロクプルマブ)ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域、および6つのCDRはまた、図1に示されている。本開示を通じて特定されたCDR領域は、Kabatシステムを使用して表された(Kabat et al.,1991)。
別の態様では、本開示の抗CXCR4抗体は:
(a)配列番号25もしくは41に記載の配列を有する重鎖可変領域におけるCDR1、CDR2、およびCDR3ドメインならびに配列番号29もしくは45に記載の配列を有する軽鎖可変領域におけるCDR1、CDR2、およびCDR3ドメイン;
(b)配列番号26もしくは42に記載の配列を有する重鎖可変領域におけるCDR1、CDR2、およびCDR3ドメインならびに配列番号30もしくは46に記載の配列を有する軽鎖可変領域におけるCDR1、CDR2、およびCDR3ドメイン;
(c)配列番号27もしくは43に記載の配列を有する重鎖可変領域におけるCDR1、CDR2、およびCDR3ドメインならびに配列番号31もしくは47に記載の配列を有する軽鎖可変領域におけるCDR1、CDR2、およびCDR3ドメイン;または
(d)配列番号28もしくは44に記載の配列を有する重鎖可変領域におけるCDR1、CDR2、およびCDR3ドメインならびに配列番号32もしくは48に記載の配列を有する軽鎖可変領域におけるCDR1、CDR2、およびCDR3ドメイン
を含む。
他の好ましい実施形態では、本開示の抗CXCR4抗体は:
(a)配列番号1に記載の配列もしくはその保存的改変を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR1;配列番号5に記載の配列もしくはその保存的改変を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR2;配列番号9に記載の配列もしくはその保存的改変を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR3;配列番号13に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域CDR1;配列番号17に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域CDR2;および配列番号21に記載の配列を含む軽鎖可変領域CDR3;
(b)配列番号2に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域CDR1;配列番号6に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域CDR2;配列番号10に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域CDR3;配列番号14に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域CDR1;配列番号18に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域CDR2;および配列番号22に記載の配列を含む軽鎖可変領域CDR3;
(c)配列番号3に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域CDR1;配列番号7に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域CDR2;配列番号11に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域CDR3;配列番号15に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域CDR1;配列番号19に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域CDR2;および配列番号23に記載の配列を含む軽鎖可変領域CDR3;または
(d)配列番号4に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域CDR1;配列番号8に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域CDR2;配列番号12に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域CDR3;配列番号16に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域CDR1;配列番号20に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域CDR2;および配列番号24に記載の配列を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む。
好ましい実施形態では、抗CXCR4抗体もしくはその抗原結合部分は、配列番号1に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR1、配列番号5に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR2、配列番号9に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR3、配列番号13に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域CDR1、配列番号17に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域CDR2、および配列番号21に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域CDR3を含む。
F7の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図1Aならびに配列番号33および25にそれぞれ示されている。F7の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図1Bならびに配列番号37および29にそれぞれ示されている。CDR領域決定のKabatシステムを用いるF7V配列の解析は、図1Aならびに配列番号1、5、および9にそれぞれ示されるような重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3領域の表示につながり、図1Bならびに配列番号:13、17、および21にそれぞれ示されるような軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3領域の表示につながった。
F9の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ配列番号34および26に示され、かつF9の軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号38および30に示されている。F9重鎖CDR1、CDR2およびCD3領域の配列は、配列番号2、6および10にそれぞれ示され、F9軽鎖CDR1、CDR2およびCD3配列は、配列番号14、18および22にそれぞれ示される。
D1の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ配列番号35および27に示され、かつD1の軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号39および31に示されている。D1重鎖CDR1、CDR2およびCD3領域の配列は、配列番号3、7および11にそれぞれ示され、F9軽鎖CDR1、CDR2およびCD3配列は、配列番号15、19および23にそれぞれ示される。
E2の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ配列番号36および28に示され、かつE2の軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号40および32に示されている。E2重鎖CDR1、CDR2およびCD3領域の配列は、配列番号4、8および12にそれぞれ示され、F9軽鎖CDR1、CDR2およびCD3配列は、配列番号16、20および24にそれぞれ示される。
さらに、特定のフレームワーク残基が生殖系列残基に置換されたF7、F9、D1およびE2の代替形態は、作成され、本明細書でF7GL、F9GL、D1GLおよびE2GLを指す。F7GL、F9GL、D1GLおよびE2GLのVアミノ酸配列は、それぞれ配列番号41、42、43および44に示されている。F7GL、F9GL、D1GLおよびE2GLのVアミノ酸配列は、それぞれ配列番号45、46、47および48に示されている。
一態様では、本開示の方法における使用のための抗CXCR4抗体は、mAb F7(ウロクプルマブ;配列番号25および29にそれぞれ示されるVおよびV配列を有する)、mAb F9(配列番号26および30にそれぞれ示されるVおよびV配列を有する)、mAb D1(配列番号27および31にそれぞれ示されるVおよびV配列を有する)、mAb E2(配列番号28および32にそれぞれ示されるVおよびV配列を有する)、のいずれかとCXCR4への結合について交差競合する。CXCR4への結合に関して交差競合する抗体は、CXCR4上の同じエピトープ(つまり同一またはオーバーラップするエピトープ)に結合する。
特定の実施形態では、交差競合する抗CXCR4モノクローナル抗体は、配列番号49に記載のヒトV3〜48生殖細胞系列配列由来の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含むV領域、および/または、配列番号50に記載のヒトVL15生殖細胞系列配列由来の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含むV領域を含む。交差競合をする抗体は、標準CXCR4結合アッセイ、たとえば、参照抗体がFITCで標識され、CEM細胞へのFITC標識参照抗体の結合を阻害する試験抗体の能力が評価される、CEM細胞とのフローサイトメトリーにおいて、ウロクプルマブ(F7)、F9、D1、E2または任意の他の基準の抗CXCR4抗体と交差結合する能力に基づいて同定できる。
医薬組成物
別の態様では、本開示は、組成物、たとえば、薬学的に許容可能な担体とともに処方される、本開示のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合部分の1つまたは組み合わせを含有する医薬組成物を提供する。本明細書で使用されるように、「薬学的に許容可能な担体」は、生理学的に適合性である溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などのいずれかならびに全てを含む。好ましくは、担体は、静脈内、皮下、筋肉内、非経口、脊髄または表皮投与(たとえば、注射または注入による)に適している。本発明の医薬組成物は、1つ以上の薬学的に許容可能な塩、抗酸化剤、水性および非水性の担体ならびに/または防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を含んでもよい。
投薬レジメンは、最適な所望の応答、たとえば治療応答または最小限の副作用を提供するように調整される。
ヒト抗CXCR4抗体の投与のために、用量は、対象の体重の約0.0001から100mg/kg、好ましくは約0.01から約20mg/kg、より好ましくは0.1から10mg/kgの範囲である。たとえば、用量は、0.1、0.3、1、3、5または10mg/kg体重、より好ましくは、0.3、1、3、または10mg/kg体重とすることができる。投与スケジュールは、典型的には、抗体の典型的な薬物動態学的特性に基づいた持続的な受容体占有率をもたらす曝露を達成するように設計されている。例示的な治療レジメンは、1週間毎に1回、2週間毎に1回、3週間毎に1回、4週間毎に1回、月に1回、3ヶ月毎に1回、または3〜6ヶ月毎に1回の投与を必要とする。IgG4抗体が典型的には2〜3週間の半減期を有することを考慮すると、本開示の抗CXCR4抗体のための好ましい投薬レジメンは、静脈内投与による0.3〜20mg/kg体重、好ましくは1〜10mg/kg体重を含み、完全な応答または確認された進行性疾患まで、最大6週間、8週間または12週間のサイクルで、7日または14日毎に抗体が与えられる。
用量およびスケジュールは、治療の経過中に変更されてもよい。たとえば、本開示の抗CXCR4抗体のための投薬レジメンは、静脈内(IV)投与による1、3または10mg/kg体重を含み、以下の投与スケジュール:(i)最大6週間のサイクルで7日毎;(ii)最大6回分について2週間に1回、その後3ヶ月毎;(iii)3週間毎;(iv)1〜10mg/kg体重1回、続いて2〜3週間毎に1mg/kg体重;の1つを用いて、抗体が与えられる。
WM患者の28%において見られたC1013G/CXCR4変異は、疾患の進行および減少した生存につながる、著しい腫瘍増殖および骨髄外臓器への転移により記載されたように、WM細胞中で活性化する役割を果たす。抗CXCR4抗体、BMS−936564の投与は、C1013G/CXCR4 WMモデルでは、インビボで有意な腫瘍縮小および骨髄外転移の抑止につながった(実施例6および7を参照のこと)。本発明の特定の実施形態では、C1013G/CXCR4関連WMに罹患している患者は、抗CXCR4抗体もしくはその抗原結合部分を患者に少なくとも2回、少なくとも3回、もしくは少なくとも5回の用量で投与すること、野生型CXCR4遺伝子を有するWM患者を治療する際に投与された用量、ならびに/または野生型CXCR4遺伝子を有するWM患者を治療する際に投与された頻度より多い、少なくとも2回、少なくとも3回、もしくは少なくとも5回の頻度を含む治療レジメンで治療される。
本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に対して有毒ではなく、特定の患者、組成物、および投与様式のための所望の治療応答を達成するために有効である活性成分の量を得るために、変化させてもよい。選択された用量レベルは、使用される本開示の特定の組成物またはそれらのエステル、塩、もしくはアミドの活性を含む種々の薬物動態学的因子、投与経路、投与時期、使用されている特定の化合物の排出率、治療の期間、他の薬物、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される化合物および/もしくは物質、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および以前の病歴、ならびに医学分野でよく知られた因子等に依存するだろう。本発明の組成物は、当技術分野でよく知られた様々な方法の1つ以上を用いて、1つ以上の投与経路を介して投与できる。当業者に理解されるように、投与経路および/または様式は、所望の結果に依存して変化するだろう。
本発明の使用および方法
本開示は、CXCR4受容体に特異的に結合し、かつ治療的使用のために望ましい特定の機能特性を示す、治療有効量の抗体を対象に投与することを含む、WMに罹患している対象を治療するための方法を提供する。
本開示はまた、治療有効量の抗CXCR4抗体を対象に投与することを含む、C1013G/CXCR4関連WMに罹患している対象を治療するための方法を提供する。
CXCR4は、広範囲の腫瘍細胞タイプに発現され、腫瘍転移(metastasis)、HIV感染、炎症状態、ならびに血管形成もしくは血管新生に関与することが知られている(たとえば2008/060367およびWO2013/071068を参照のこと)。したがって、本明細書に開示される抗CXCR4抗体は、様々な臨床状況で使用できるが、本開示は、癌および特にWMの治療のためのこれらの抗体の使用に焦点を当てている。
癌におけるCXCR4の役割
CXCR4の過剰発現はまた、癌の約75%で実証され、特定の状況では、CXCR4の発現と患者の予後もしくは生存との間で、逆相関が確立されてきた。CXCR4発現またはCXCR4/CXCL12経路に関連した癌の種類の非限定的な例は、乳癌(Muller et al.,2001)、卵巣癌(Scotton et al.,2001)、前立腺癌(Taichman et al.,2002)、非小細胞肺癌(Spano et al.,2004)、膵臓癌(Koshiba et al.,2000)、大腸癌(Zeelenberg et al.,2003)、腎臓癌(Schrader et al.,2002)、および甲状腺癌(Hwang et al.,2003)などの固形腫瘍、上咽頭癌(Wang et al.,2005)、黒色腫(Scala et al.,2005)、腎細胞癌(Staller et al.,2003)、神経芽細胞腫(Geminder et al.,2001)、グリア芽腫(Rempel et al.,2000)、横紋筋肉腫(Libura et al.,2002)、ならびに骨肉腫(Laverdiere et al.,2005)、ならびに急性リンパ芽球性白血病(Crazzolara et al.,2001)、急性骨髄性白血病(AML)(Mohle et al.,1998;Rombouts et al.,2004)、多発性骨髄腫(MM)(Alsayed et al.,2007;Azab et al.,2009)、慢性リンパ性白血病(Mohle et al.,1999;Burger et al.,1999)、慢性骨髄性白血病(Jin et al.,2008)などの血液悪性腫瘍、WM(Ngo et al.,2008)、および非ホジキンリンパ腫(NHL)(Bertolini et al.,2002;Weng et al.,2003)を含む。
さらに、この経路は、複数の腫瘍で転移プロセスの刺激に関与している(Murphy,2001)。臨床研究では、CXCR4が増加した転移の傾向および低下した生存に関連しており、CXCR4のより大きい発現が疾患の重症度と相関しているAML、胸部、結腸、非小細胞肺癌、卵巣および膵臓癌の予後指標として特定されてきた(Spoo et al.,2007;Hiller et al.,2011;Ottaiano et al.,2006;Spano et al.,2004;Jiang et al.;2006;Marechal et al.,2009)。
BM−MSCsはCXCL12(SDF−1)を分泌し、かつCXCR4との相互作用は、BM微小環境内で造血幹細胞のホーミングおよび保持に不可欠である(Mohle et al.,1998)。白血病細胞は、高レベルのCXCR4を発現し、かつ経路は、順に増殖と生存を裏付けるBMへの白血病細胞の遊走において重要な役割を果たす。CXCR4は、CXCL12が発現されるBMなどの臓器への転移性の拡散に不可欠である。まとめると、NHLおよびMM患者における自家移植のための顆粒球コロニー刺激因子と組み合わせた使用に関してFDAにより承認された小分子CXCR4アンタゴニスト、AMD3100(プレリキサフォル;モゾビル)で実証されたように(Dar et al.,2011)、CXCR4は、BM中の造血幹細胞のホーミングおよび保持の両方において重要な役割を果たし、かつCXCR4のアンタゴニストは幹細胞を血流へ移動させる。別のCXCR4阻害剤、AMD3465は、CXCL12−および間質−誘導性の化学遊走と拮抗することが示され、かつ白血病細胞における生存促進性のシグナル伝達経路のCXCL12−誘導性の活性化を阻害した(Zeng et al.,2009)。さらに、単独の、または顆粒球コロニー刺激因子と組み合わせたAMD3465は、AML細胞および前駆細胞の血流への移動を誘導し、かつ化学療法治療およびソラフェニブの抗白血病効果を増強し、白血病負荷の顕著な減少および動物の生存の延長をもたらすことが実証された(Zeng et al.,2009)。かかる発見は、CXCR4/CXCL12相互作用の崩壊が、保護的BM微小環境を標的にすることによって、白血病細胞を化学療法治療に対して感作するために使用されてもよいことを示唆する。
WO2008/060367およびWO2013/071068に記載されるように、CXCR4に対する新規なファースト−イン−クラスのヒト治療モノクローナル抗体が開発された。これらのモノクローナル抗体は低ナノモルの親和性でCXCR4を発現する細胞に結合し、CXCL12がCXCR4発現細胞に結合することを防ぎ、CXCL12誘導性遊走およびカルシウムフラックスを低ナノモルのEC50値で阻害する。CXCR4は増殖、遊走/侵襲および血管形成を含む癌の複数の基本的な側面において役割を果たすので、アンタゴニストはCXCR4が発現される悪性腫瘍に介入する複数の手段を潜在的に有する。有意なことに、CXCL12誘導性のカルシウムフラックスおよび遊走を防ぐことに加えて、WO2013/071068は、CXCR4を発現する腫瘍細胞のアポトーシスの抗体依存性誘導が、これらのヒト抗CXCR4抗体の作用機序であることを教示する。抗体誘導性アポトーシスは、複数の造血腫瘍異種移植モデル中で強固なインビボ有効性をもたらした。対照的に、AMD3100などの小分子CXCR4アンタゴニストは、BMからのCXCR4腫瘍細胞の移動を増加させ、それによって化学増感を高めるが、かかる腫瘍細胞を死滅させない、これは、癌細胞を死滅させる際に、小分子CXCR4アンタゴニストと比較して高められた抗CXCR4抗体の効果を示唆する。
ワルデンシュトレームマクログロブリン血症
リンパ形質細胞性リンパ腫とも称呼されるWMは、非ホジキンリンパ腫(NHL)の無痛性(増殖が遅い)サブタイプである。当該疾患は、最終分化したBリンパ球の制御されていないクローン増殖、すなわち、BMおよびリンパ節内に形成された白血球細胞により特徴付けられる。当該疾患の独特な特徴は、B細胞が過剰量のモノクローナルIgM抗体を生成し、過粘稠として知られている血液の増粘をもたらし得るということである。このIgMタンパク質は、疲労、原因不明の体重減少、肥大したリンパ節もしくは脾臓、腎機能障害、全身性アミロイドーシス、衰弱ならびに原因不明の出血を含む、多くの症状をもたらし得る。また、B細胞の増殖は、赤血球の産生を妨害し、貧血をもたらす。
WMは、米国では年間わずか約1500例の、稀な疾患である。WMのための単独の認可された治療はないが、免疫系を刺激する生物剤と化学療法の組合せを含む治療レジメンが、有望な結果を提供している(Treon,2009)。WM患者の治療に現在用いられる組み合わせ療法のいくつかの例は、BDR:ボルテゾミブ(VELCADE(登録商標))、デキサメタゾンおよびリツキシマブ(RITUXAN(登録商標))(Treon et al.,2009);RCD:シクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標);NEOSAR(登録商標))、デキサメタゾン、およびリツキシマブ(Dimopoulos et al.,2007);R−CHOP:シクロホスファミド、ドキソルビシン、(ADRIAMYCIN(登録商標))、ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))、プレドニゾンおよびリツキシマブ;CPR:シクロホスファミド、プレドニゾンおよびリツキシマブ;VR:ボルテゾミブおよびリツキシマブ;FR:フルダラビン(FLUDARA(登録商標))およびリツキシマブ;ならびにTR:サリドマイド(THALOMID(登録商標))およびリツキシマブを含む。奏効率は高い(>80%)が、完全寛解率は低い(0〜15%)。調査中の療法は、選択的ブルトン型チロシンキナーゼ(BTK)阻害剤のイブルチニブ(IMBRUVICA(登録商標))、WM細胞の表面上のCD52を標的とするアレムツズマブ(CAMPATH(登録商標))、B細胞表面上のCD20分子を標的とするオファツムマブ(ARZERRA(登録商標))、癌細胞のDNAを攻撃し、細胞分裂周期を破壊するベンダムスチン(TREANDA(登録商標))、細胞増殖および分裂を阻害するmTOR阻害剤のエベロリムス(AFINITOR(登録商標)、ZORTRESS(登録商標))、ならびに選択的プロテアソーム阻害剤のカーフィルゾミブ(KYPROLIS(商標))を含む。本明細書中で開示されるWMまたはC1013G/CXCR4関連WMの治療のための方法の特定の実施形態では、前述の薬剤のいずれか、またはそれらの任意の組み合わせが、本開示の抗CXCR4抗体と組み合わせて使用されてもよい。他の実施形態では、抗CXCR4抗体は、WMを治療するために、使用されている、または開発中であるこれらの抗WM療法のいずれかに、WM患者の進行後、使用される。
ワルデンシュトレームマクログロブリン血症におけるCXCR4およびC1013G/CXCR4変異の役割
WM細胞がCXCR4およびVLA−4を含むケモカインおよび接着受容体を高レベルで発現し、CXCR4がWM細胞のCXCL12誘導性遊走および経内皮遊走に不可欠であることが、以前から示されてきた(Ngo et al.,2008)。CXCR4のノックダウンまたはCXCR4阻害剤であるAMD3100は、WM細胞の遊走ならびにフィブロネクチン、間質細胞、および内皮細胞へのそれらの接着を著しく阻害することが示された。AMD3100により誘導された間質細胞へのWM細胞の減少した接着は、ボルテゾミブによる、細胞毒性に対するこれらの細胞の増加した感受性、すなわち、増殖の阻害につながった。さらに、CXCR4およびVLA−4は、直接、CXCL12に応じて相互作用することが示された。したがって、CXCR4/CXCL12軸は、BM微小環境でのWM細胞の遊走および接着を制御する際に、VLA−4と相互作用することが示された(Ngo et al.,2008)。
本明細書に記載されるように、B細胞リンパ増殖性障害を有する418人の患者の検査は(実施例1;表1を参照のこと)、低悪性リンパ形質細胞性リンパ腫(WM)を有する患者の28%が、C1013G/CXCR4バリアントを有していることを明らかにした。したがって、C1013G/CXCR4バリアントの機能的関連性を分析するため、インビボモデルを用いてWM細胞転移および疾患進行を媒介する際の推定上の役割を評価するため、ならびにC1013G/CXCR4−変異リンパ形質細胞を標的にしうる新規治療アプローチを特定するために、研究が行われた。これらの研究は、CXCR4機能獲得型研究を用いることによってインビボで示されるように、BMへのWM細胞のホーミングならびに遠隔臓器へのWM転移を裏付ける重要な役割をCXCR4が果たすことを示した(実施例2)。重要なことに、C1013G/CXCR4バリアントを有するWM細胞は、CXCR4過剰発現細胞(実施例3)と比較して類似の表現型を発現し、C1013G/CXCR4バリアントが機能的に活性な変異を表しうることを示唆している。さらに、C1013G/CXCR4変異細胞は、コントロール細胞またはCXCR4過剰発現WM細胞のいずれかと比較して、インビボで、リンパ節へ転移することを示し(実施例3)、生成されたC1013G/CXCR4バリアントが患者において臨床的に観察されたものを再現することができたことを示す。特に、C1013G/CXCR4変異細胞は肺や腎臓などの骨髄外組織をインビボでコロニー形成することができ(実施例3)、バリアントが、肺および腎臓侵襲のすべての場合に検出された、骨髄外WMを有する患者において観察された表現型を反映していた。
観察されたC1013G/CXCR4バリアントは、WHIM症候群において元々記載されている変異の1つである。これは異常に機能する免疫によって特徴づけられる、稀な、遺伝性ヘテロ接合性常染色体優性疾患である。これは、その細胞内輸送を損なう受容体のカルボキシ末端トーク(C末)のトランケーションを担うCXCR4の変異により引き起こされ、BMにおけるケモカインリガンドおよび好中球の保持に対する増加した応答性につながる(Balabanian et al.,2005;2008;Hernandez et al.,2003;Taniuchi et al.,2005)。最近の証拠は、WM患者におけるWHIM−様C1013G/CXCR4変異の存在が記載されているが(Hunter et al.,2014)、WMにおけるこの変異のインビボでの機能的な後遺症、ならびにCXCR4が腫瘍細胞輸送および転移を媒介する他のB細胞リンパ増殖性障害で体細胞バリアントが発生するかどうかは、本研究までに記載されなかった。疾患の進行につながるC1013G/CXCR4変異細胞のインビボで転移するための増加した能力は、細胞侵襲性、抗アポトーシス、細胞増殖、および腫瘍形成に関連した遺伝子の濃縮によって裏付けられた(実施例3)。これは、コントロール細胞と比較して変異細胞における生存促進経路のアップレギュレーションをもたらした。これらの効果は、C1013G/CXCR4変異細胞またはコントロール細胞のいずれかを注入したWM保有マウスが下記で説明されるように抗CXCR4抗体、ウロクプルマブで治療された場合では、逆転した。
従来使用の抗WM剤に対するC1013G/CXCR4変異を有するワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞の変化した感受性
一般的にWMを治療するために使用される薬剤は、リツキシマブ、クロラムブシル(LEUKERAN(登録商標))、クラドリビン(LEUSTATIN(登録商標))、フルダラビン、ボルテゾミブ、ベンダムスチンなどの薬剤の単独または様々な組み合わせを含む。難治性/再発WMを治療するさらなる療法は、リツキシマブにアレルギーのある患者のためのオファツムマブ、エベロリムス、アレムツズマブリ、ならびに自家もしくは同種幹細胞移植を伴う高用量化学療法を含む。カーフィルゾミブ、イブルチニブおよびパノビノスタット(LBH−589)を含む、新しい薬物および薬物の組み合わせのいくつかは、WMのための臨床試験(いくつかは難治性/再発疾患のため)で研究されている。
酵素ブルトン型チロシンキナーゼの経口投与される阻害剤であるイブルチニブは、最近アメリカ食品医薬品局(FDA)で、マントル細胞リンパ腫および慢性リンパ性白血病の治療のために承認され、2013年2月にはFDAによりWMを有する患者のための単剤療法として画期的治療薬指定が付与された。イブルチニブは、再発または難治性のWMを有する患者において、高活性および認容性が良好であると報告されており(Treon et al.,2013)、かつ2014年10月には医薬品承認事項変更申請(sNDA)が、少なくとも一つの全身性WMレジメンで既に治療されたWM患者におけるイブルチニブの第2相臨床試験からのデータ(ClinicalTrials.gov識別子:NCT01614821)に基づいてFDAに提出された。しかし、WHIM−様CXCR4変異の存在は、WM細胞におけるイブルチニブ媒介増殖抑制への感受性の低下を与えることが示され(Cao et al.,2013;Treon et al.,2013)、主要応答割合は、WHIM−様CXCR4変異を有する患者においてわずか30%であり、対して、野生型CXCR4を有する患者に対しては77%であった(Treon et al.,2013)。
さらに、C1013G/CXCR4体細胞バリアントは、BTK阻害剤、イブルチニブ、mTOR阻害剤、エベロリムス、およびホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(PI3K)阻害剤、イデラリシブ(ZYDELIG(登録商標))を含む、従来使用の抗WM小分子に対するWM細胞の抵抗性に関連し、薬剤抵抗性を媒介する際のこのバリアントの役割を裏付けることが、本明細書で示されている(実施例4)。この結果は、mTOR、BTKおよびPI3K阻害剤が、WM細胞がC1013G/CXCR4変異を有する患者を治療する際に、効果的でなくてもよいことを示唆する。対照的に、C1013G/CXCR4変異WM細胞および変異のないコントロール細胞はプロテアソーム阻害剤薬剤カーフィルゾミブ、およびボルテゾミブに対して同じように敏感であり(実施例4)、したがって、C1013G/CXCR4体細胞バリアントを有するWM患者におけるプロテアソーム阻害剤とウロクプルマブの可能な組み合わせレジメンを示唆した。
いかなる特定の理論に拘束されることなく、それらの特定の経路に関連した遺伝子のアップレギュレーションのため、BTK、PI3K、およびmTOR阻害剤は、C1013G/CXCR4変異細胞に対して効果的でなかったということが提案される。さらに、変異したCXCR4細胞は、RAFの濃縮ならびにマイトジェン−活性化タンパク質キナーゼ/マイトジェン−活性化タンパク質キナーゼキナーゼおよびmTOR経路を提示し、したがって、さらに、RAFおよびマイトジェン−活性化タンパク質キナーゼキナーゼ/ERK/mTOR経路間のクロストークの存在を示唆したということが確認された(Downward,2003;LimおよびCounter,2005)。対照的に、NF−κBおよびNF−κB−関連アポトーシス遺伝子は、コントロール細胞と比較してCXCR4変異細胞においては、差次的に調節されなかった(データ未掲載)。これは、少なくとも部分的には、野生型細胞と比較して変異したWM細胞におけるBTK−、mTOR−、およびPI3K−阻害剤の、プロテアソーム阻害剤に対する抵抗性および感受性の存在を説明しうる。
抗CXCR4抗体によるワルデンシュトレームマクログロブリン血症の治療
抗CXCR4抗体、BMS−936564は、WM細胞株の初代WM骨髄間葉系間質細胞(BM−MSCs)またはCXCR4リガンド、CXCL12のいずれかへの遊走を阻害することが明細書中で示されている。(実施例5を参照のこと)。この抗CXCR4抗体はまた、WM BM−MSCsへのWM細胞接着を阻害し、かつWM BM−MSCsの存在下でのWM細胞増殖を阻害する。さらに、また、当該抗体がWM細胞におけるアポトーシスを直接的に誘導しうるという証拠が提供された(実施例5)。したがって、本開示は、WM細胞を含む、細胞表面上に発現されるCXCR4受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、WMに罹患している対象を治療するための方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明の方法で使用される抗体は、CXCR4受容体に特異的に結合し、かつ治療的使用のために望ましい特定の機能特性を示す、本開示の抗CXCR4抗体である。かかる機能特性は、細胞表面上に発現されるヒトCXCR4への高親和性結合、CXCR4発現細胞におけるSDF−1−誘導性カルシウムフラックスおよびCXCR4発現細胞の遊走を阻害すること、インビボでCXCR4腫瘍細胞増殖を阻害および/もしくはCXCR4腫瘍細胞アポトーシスを誘導すること、CXCR4腫瘍−保有対象の生存期間を増加させること、ならびに/または本明細書中で記載される他の機能特性を含む。
また、本開示は、CXCR4遺伝子中のC1013G変異は、WM患者の約28%および約20%のIgM−MGUS患者において存在するが、いくつかの試験された他のB細胞癌においては稀である、または存在しないという実験的証拠を提供する(実施例1を参照のこと)。したがって、B細胞リンパ増殖性障害のうち、C1013G/CXCR4変異はWM患者を特徴付ける。また、CXCR4の過剰発現がインビボにおけるWM細胞の増殖および転移を容易にすることを示すデータが提供された(実施例2)。C1013G/CXCR4変異の存在は、初代WM BM−MSCsの存在下で、WM細胞の接着および増殖を増加させ、WM細胞におけるCXCR4の過剰発現の効果を再現することを示した(実施例3)。したがって、C1013G/CXCR4変異は、疾患の進行および減少した生存をもたらす、著しい腫瘍増殖および骨髄外臓器への転移により証明された、WM細胞における活性化変異である。
特に、ウロクプルマブは、インビトロおよびインビボ両方で、BM微小環境の状況でCXCR4変異WM細胞の接着、遊走および増殖特性を効率的に標的とすることが示された(実施例6を参照のこと)。ウロクプルマブの投与は、C1013G/CXCR4WMモデルにおけるインビボでの著しい腫瘍減少および骨髄外転移の抑止をもたらした。これらの発見は、CXCR4がWM分子病態の重要なレギュレーターであり、かつ重要な治療上の標的であるということを実証する。実施例5〜7に記載のように、野生型およびC1013G/CXCR4変異WM細胞の両方をうまく標的とするための抗CXCR4抗体の使用は、これらの観察を、WM患者のための臨床試験に変換するための健全な基盤を提供する。
したがって、本開示は、WM細胞を含む、細胞表面上に発現されるCXCR4受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、C1013G/CXCR4関連WMを含む、WMに罹患している対象を治療するための方法を提供する。本発明の方法の特定の実施形態では、対象は、ヒトWM患者、好ましくはC1013G/CXCR4関連WMに罹患しているヒト患者である。特定の好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、細胞表面上に発現されるC1013G変異を有するヒトCXCR4受容体などの、細胞表面上に発現されるヒトCXCR4受容体に結合する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分はIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4アイソタイプのものである。特定の他の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分はIgG1アイソタイプのものである。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分はIgG4アイソタイプのものである。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合部分はモノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。さらに他の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分はキメラ、ヒト化もしくはヒト抗体またはそれらの抗原結合部分である。好ましくは、抗体またはその抗原結合部分は、ヒト抗体またはその抗原結合部分である。さらに好ましい実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、ウロクプルマブまたはそのCXCR4結合フラグメントである。
重要なことに、C1013G/CXCR4変異WM細胞は、B細胞悪性腫瘍を治療するために使用され、かつWMの治療のために積極的に試験されている薬剤の3つの重要なクラス、すなわちイブルチニブにより例示されるBTK阻害剤、エベロリムスにより例示されるmTOR、およびイデラリシブによって例示されるPI3K阻害剤に対して抵抗性であることが本明細書中に開示された(実施例4)。対照的に、抗CXCR4抗体がC1013G/CXCR4変異および非変異WM細胞両方の増殖性および遊走を阻害する際に効果的であることが示された。これらの結果は、mTOR、BTKおよびPI3K阻害剤が、WM細胞がC1013G/CXCR4変異を有する患者を治療する際にあまり効果的ではなく、かつかかるC1013G/CXCR4バリアントを治療するための抗CXCR4抗体の実用性を強調するだろうと示唆する。
ウロクプルマブは、インビボにおいて、生存促進シグナル伝達経路の活性化を阻害し、アポトーシス促進のカスケードを刺激し、かつWM細胞の転移を阻害することにより、変異状態とは独立して、WM細胞を標的とすることが本明細書中に示されている(実施例5および6)。したがって、開示された治療方法の特定の実施形態では、WM患者をC1013G/CXCR4変異の存在についてスクリーニングして、それによってBTK、mTORまたはPI3K阻害剤薬剤での治療に適していない患者を特定する、かかる患者は抗CXCR4抗体で治療するのに適している。かかるWM患者は、BTK、mTORまたはPI3K阻害剤薬の治療のための良い候補ではなくてもよく、代わりにファーストラインの単剤療法として、本開示の抗CXCR4抗体で治療されてもよい。この方法の特定の好ましい実施形態では、抗CXCR4抗体はウロクプルマブである。他の実施形態では、C1013G/CXCR4−WMに罹患している患者は、ウロクプルマブなどの抗CXCR4抗体とイブルチニブ、エベロリムス、イデラリシブ、カーフィルゾミブ、および/またはボルテゾミブなどの抗WM剤との組み合わせにより治療される。さらなる実施形態では、C1013G/CXCR4−WM患者は、患者が1つ以上の治療に失敗した後に、セカンド−もしくはサード−ライン療法として、抗CXCR4抗体単独で、または別の抗WM剤との組み合わせにより治療される。たとえば、抗CXCR4抗体は、WM患者がイブルチニブによるファーストライン療法に失敗した後に投与されてもよく、あるいは、当該抗体は、患者が化学療法BDR(ボルテゾミブ、デキサメタゾン、およびリツキシマブ)もしくはRCD(シクロホスファミド、デキサメタゾン、およびリツキシマブ)レジメンのファーストライン治療ならびにイブルチニブによるセカンド−ライン治療の両方に失敗した後に投与されてもよい。
ワルデンシュトレームマクログロブリン血症における単剤療法のための抗CXCR4抗体
BMS−936564へのWM細胞の曝露は、カスパーゼ−9およびPARP切断の増加をもたらした(実施例5)。BMS−936564によるCXCR4の中和はまた、ホスホ(p)−GSK3−βおよびp−β−カテニンのアップレギュレーションのレベルを増加させ、β−カテニンの分解につながった。BMS−936564は、C1013G/CXCR4関連WM細胞におけるカスパーゼ−9−およびPARP切断を同様に増加させ、かつGSK3−β/β−カテニンシグナル伝達を調節し、p−GSK3−β/p−β−カテニンのアップレギュレーションおよびβ−カテニンの分解をもたらした(実施例6)。BMS−936564のこれらの効果は、WMおよびC1013G/CXCR4関連WM細胞におけるアポトーシス経路の活性化に一致し、かつ他のB細胞悪性腫瘍において実証されたBMS−936564のアポトーシス促進効果を反映する(WO2013/071068;Kuhne et al.,2013)。したがって、WM患者を治療するためのこれらの方法の特定の実施形態では、抗CXCR4抗体またはそのフラグメントはCXCR4−またはC1013G/CXCR4発現細胞のアポトーシスを誘導する。
開示された抗CXCR4抗体のアポトーシス効果、小分子CXCR4アンタゴニスト、たとえばAMD3100により示されない特性は、これらの抗体が、癌を有する患者を治療するために単剤療法として、単独で使用できることを示す。インビボAMLおよびMM腫瘍モデルにおけるCXCR4アンタゴニストの効果についての以前の研究は、これらのアンタゴニストは化学療法に対する腫瘍細胞の感受性を高める際に、効果的であることを示唆した(Azab et al.,2009;Zeng et al.,2009)。さらに、実施例6において本明細書に提示されたデータは、単剤療法として投与されたウロクプルマブが、C1013G/CXCR4WMを注入したマウスにおけるWM転移を阻害したことを実証し、コントロール抗体処置マウスと比較して、処置されたマウスにおける大腿骨、肝臓、腎臓および肺におけるCXCR4/CD20細胞浸潤の著しい減少によって証明された。同様に、実施例7は、ウロクプルマブがインビボで野生型WM細胞の転移を阻害したことを示す。これらの結果は、ウロクプルマブが多種多様なAML、NHLおよびMMモデルにおいて単剤療法として投与された時に達成された著しい腫瘍増殖阻害と一致する(WO2013/071068;Kuhne et al.,2013)。
したがって、野生型WMまたはC1013G/CXCR4関連WMを治療するための本発明の治療方法の特定の実施形態では、抗CXCR4抗体またはそのフラグメントは単剤療法として投与される。好ましい実施形態では、抗体およびそのフラグメントはCXCR4またはC1013G/CXCR4発現細胞のアポトーシスを誘導する。したがって、本開示はまた、本開示の治療有効量の抗CXCR4抗体をWM対象に投与することを含む、CXCR4−またはC1013G/CXCR4−発現WM細胞のアポトーシスを誘導する方法を提供する。
ワルデンシュトレームマクログロブリン血症の治療のための抗CXCR4および抗癌治療の組み合わせ
実施例7に記載のように、各BMS−936564およびボルテゾミブは、BM内の腫瘍細胞および血清IgM抗体のレベルを著しく減少させた。しかし、BMS−936564およびボルテゾミブの組み合わせは、腫瘍細胞および血清IgMレベルのより著しい減少を引き起こすよう、相乗的に作用した。これらの結果は、CXCR4/CXCL12軸が、BMへのMM細胞のホーミングおよび輸送において重要な役割を果たし、かつBMとのMM癌細胞の相互作用の崩壊が、これらの細胞を治療薬に対して感作するという以前の実証に一致する(Alsayed et al.,2007;Azab et al.,2009;Kuhne et al.,2013;WO 2013/071068)。
開示された方法の特定の実施形態では、抗CXCR4抗体または抗原結合フラグメントはCXCR4受容体に結合し、受容体の活性を阻害する。これは、BM微小環境内のWM幹細胞のホーミングおよび維持を破壊し、かつ/またはBMから末梢へのWM細胞の移動を増加させ、かつそれにより、放射線治療もしくは化学療法薬剤の投与などの1つ以上の抗癌治療に対するWM癌細胞の感受性を増加させる。
したがって、特定の実施形態では、本開示の抗CXCR4抗体は、手術および/もしくは放射線などの他の癌治療と組み合わせて使用され、かつ/または、たとえば細胞毒性薬剤、放射毒性剤もしくは免疫抑制性薬剤の1つまたは他のそれ以上の治療薬と同時投与でき、これは抗CXCR4抗体の治療的効果を高め、または補強する。抗体は、(免疫複合体として)薬剤に結合でき、または薬剤とは別々に投与され得る。後者の場合(別々の投与)、抗体は、薬剤の投与の以前、以降もしくは同時に投与でき、あるいは、従来の化学療法薬剤および腫瘍関連抗原もしくは免疫調節の標的に結合する抗体を含む、他の既知の治療薬と同時投与できる。
これらの方法での使用のための抗癌剤は、とりわけ、ボルテゾミブ、カーフィルゾミブ、イブルチニブ、イデラリシブ、パノビノスタット、デキサメタゾン、リツキシマブ、サリドマイド、シクロホスファミド、レナリドマイド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、フルダラビン、クロラムブシル、ベンダムスチン、クラドリビン、アレムツズマブ、オファツムマブ、エベロリムス、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、ミトキサントロン、エトポシド、シタラビン、イホスファミド、カルボプラチン、およびエトポシドを含む。C1013G/CXCR4変異細胞と非変異WM細胞の両方は、プロテアソーム阻害剤、カーフィルゾミブおよびボルテゾミブに対して同じように感受性であることが本明細書中で実証されている(実施例4)。さらに、ウロクプルマブおよびボルテゾミブの組み合わせは、インビボでBM内のWM腫瘍細胞を減少させる際かつ血清IgMレベルを減少させる際に、ならびにインビトロでWM細胞における毒性を誘導する際に、相乗的に作用した(実施例7)。まとめると、これらのデータは、プロテアソーム阻害剤、たとえばボルテゾミブまたはカーフィルゾミブとのウロクプルマブの組み合わせレジメンが、野生型CXCR4またはC1013G/CXCR4体細胞バリアントのいずれかを有するWM患者を治療する際に非常に有効であることを強く示唆する。抗新生物剤と、本開示の抗CXCR4抗体またはその抗原結合フラグメントの同時投与は、ヒト腫瘍細胞に対する細胞毒性効果を発揮するための、異なる機構を介して作動する少なくとも2つの抗癌剤を提供する。抗CXCR4抗体と他の薬剤の可能な相乗的相互作用に加えて、かかる同時投与は、薬剤に対する抵抗性の発展、または腫瘍細胞を抗CXCR4抗体に非反応性にする腫瘍細胞の抗原性の変化に起因する問題を克服することに役立つことができる。
したがって、本開示の抗CXCR4抗体は、化学療法の効果を増強するために、BMの保護環境から悪性細胞を放出するその能力によって、使用されてもよい。上述のように、WM細胞を移動させ、かつそれらの化学感作を増加させることに加えて、これらの抗体は、アポトーシスによってMM細胞を直接死滅させる付加的効果を有することが示されており、かつ、それゆえに、C1013G/CXCR4関連WMを含む、WMを治療する際に、単剤療法として投与される際に効果的である。
用量
WMを治療するための開示された方法の特定の実施形態では、治療有効量の抗CXCR4抗体またはその抗原結合部分は、0.1から20mg/kg体重の範囲の用量を含む。たとえば、特定の実施形態では、治療有効量の抗CXCR4抗体またはその抗原結合部分は、0.1、0.3、0.5、1、3、5、10または20mg/kgの用量を含む。好ましい実施形態では、用量は1、3または10mg/kgである。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、1週間毎に1回、2週間毎に1回、3週間毎に1回、または月に1回の投与スケジュールで投与される。好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は7日または14日毎に1回の投与スケジュールで投与される。特定の実施形態では、抗CXCR4抗体は、治療期間の間、単剤療法として投与される。他の実施形態では、抗CXCR4抗体は毎週投与され、単剤療法としてはじめの2週間のサイクル1で、その後、たとえばボルテゾミブ、デキサメタゾン、およびリツキシマブ(BDR)、またはシクロホスファミド、デキサメタゾン、およびリツキシマブ(RCD)を含む化学療法レジメンと組み合わせて投与される。特定の好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、静脈内投与される。他の好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、皮下投与される。
たとえば、BDRと組み合わせたウロクプルマブによるWMの治療では、例示的な投薬レジメンは:(1)1、8、15、22および29日目(サイクル1)ならびに1、8および15日目(サイクル2およびその後のサイクル)に単回60分静脈内注入として投与されたウロクプルマブ(1、3または10mg/kg);(2)15、18、22および25日目(サイクル1)ならびに1、4、8、11日目(サイクル2およびその後のサイクル)に3〜5秒の静脈内プッシュとして投与されたボルテゾミブ(1.3mg/m);(3)15、16、18、19、22、23、25および26日目(サイクル1)ならびに1、2、4、5、8、9、11および12日目(サイクル2およびその後のサイクル)に投与されたデキサメタゾン(20または40mg);ならびに(4)25日目(サイクル1)および11日目(サイクル2およびその後のサイクル)に、たとえば90分を超える遅い静脈内注入によって投与されたリツキシマブ(375mg/m)を含む。
抗CXCR4抗体が、他の抗WM剤による療法と組み合わせて使用される場合、これらの薬剤は典型的に、承認された、または標準の用量で使用される。たとえば、イブルチニブの例示的投薬レジメンは、許容できない毒性および疾患進行まで、420mg(140−mgカプセル3個)、経口で一日1回投与することを含む。
別の実施形態では、抗CXCR4抗体の用量は、患者の体重に関わらず固定されるフラット固定用量である。たとえば、抗CXCR4抗体は、患者の体重に関係なく、5、20、35、75、200、350、750または1500mgの固定用量で投与されてもよい。本明細書で使用されるように、用語「固定用量」、「フラット用量」および「フラット固定用量」は互換的に使用され、患者の体重または体表面積(BSA)に関わらず患者に投与される用量を指す。それゆえに、固定またはフラット用量はmg/kg用量として提供されないが、むしろ薬剤(たとえば抗CXCR4抗体)の絶対量として提供される。
患者選択工程を含む、C1013G/CXCR4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症の治療
C1013G/CXCR4変異は、WMにおける活性化変異であると本明細書中で示される(実施例3)。野生型WM細胞と比較して、C1013G/CXCR4変異細胞のより攻撃的な表現型にもかかわらず、BMS−936564は、CXCR4変異細胞の接着性、遊走および増殖特性を標的とする際に、同等に活性的であることがわかった(実施例5)。したがって、本開示の抗CXCR4抗体は、C1013G/CXCR4関連WMの治療における特定の適用性を有してもよく、治療レジメンは、C1013G変異を有する患者を特定するための工程を含んでもよい。したがって、一態様では、本開示は、C1013G/CXCR4関連WMに罹患している対象を治療するための方法であって、(a)治療のための適切な候補である対象を選択すること、ここで、当該選択が:(i)対象におけるWM組織から得られた試験組織試料を提供すること;(ii)WM試験組織試料中の細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有するかどうかを評価すること;および(iii)WM細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有するという決定に基づいて適切な候補として対象を選択することを含み;ならびに(b)C1013G/CXCR4関連WM細胞の表面上に発現されるCXCR4受容体に特異的に結合する、治療有効量の本開示の抗体またはその抗原結合部分を、選択された対象に投与することを含む、方法を提供する。本方法の特定の実施形態では、抗CXCR4抗体は、抗WM剤、たとえばボルテゾミブまたはカーフィルゾミブと組み合わせて投与され、C1013G/CXCR4体細胞バリアントを有するWM患者を治療する際に有効でもある。本方法のいずれかでは、試験組織試料は、腫瘍組織の生検試料または末梢で見られる腫瘍細胞の試料を含む。
また、本開示は、C1013G/CXCR4関連WMに罹患している対象を治療するための方法であって、C1013G/CXCR4関連WM細胞の表面上に発現されるCXCR4受容体に特異的に結合する、治療有効量の本開示の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含み、対象のWM細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有すると決定されていることに基づいて、対象が選択されている、方法を提供する。
本開示は、さらに、WM細胞の表面上に発現されるCXCR4受容体に特異的に結合する本開示の抗体またはその抗原結合部分で治療するためのWM患者を選択するための方法であって、(a)患者におけるWM組織から得られた試験組織試料を任意に提供すること;(b)WM試験組織試料中の細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有するかどうかを評価すること;および(c)WM細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有するという決定に基づいて治療のために患者を選択することを含む、方法を提供する。
別の態様では、本開示は、対象におけるC1013G/CXCR4関連WMを治療するための、本開示の抗CXCR4抗体またはその抗原結合部分を含む、治療レジメンを決定するための方法であって、(a)対象におけるWM組織から得られた試験組織試料を任意に提供すること;(b)WM試験組織試料中の細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有するかどうかを評価すること;および(c)WM細胞が、C1013G変異を有するという決定に基づいて治療レジメンを決定することを含む、方法を提供する。
本方法の特定の実施形態では、C1013G変異は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)アッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、またはDNAシーケンシングにより検出される。さらなる実施形態では、PCRアッセイは、リアルタイムアレル特異的PCR(AS−PCR)アッセイである。さらなる実施形態では、DNAシーケンシングは全ゲノムDNAシーケンシングである。
試験組織試料中のC1013G/CXCR4変異をスクリーニングすることを含む本開示の方法のいずれかでは、患者からの試験組織試料の提供を含む工程は、任意の工程であると理解されるべきである。つまり、特定の実施形態では、この方法はこの工程を含み、他の実施形態では、この工程は方法に含まれない。また、特定の実施形態では、WM試験組織試料中の細胞がC1013G変異を有するかどうかを決定するための「評価する」工程は、変異の存在をアッセイする変形的な方法により、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイを行うことにより実施されることを理解されるべきである。他の実施形態では、変形的な工程は含まれず、変異の存在は、たとえば、実験室からの試験結果の報告を検討することにより評価される。特定の実施形態では、細胞がC1013G/CXCR4変異を有するかどうかを評価することまで含む方法の工程は、治療のためのある適切な候補を選択および/または患者に対して治療薬を投与する際に使用するために、医師または他の医療従事者に提供されてもよい中間結果を提供する。特定の実施形態では、中間結果を提供する工程は、医療従事者または医療従事者の指揮下で行動する者によって行われてもよい。他の実施形態では、これらの工程は、独立した実験室または検査技師などの独立した者により行われてもよい。
本開示の別の態様は、C1013G/CXCR4関連WMに罹患している患者を治療するための治療レジメンであって、(a)対象におけるWM組織から得られた試験組織試料を任意に提供すること;(b)WM試験組織試料中の細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有するかどうかを評価すること;および(c)WM細胞が、C1013G変異を有するという決定に基づいて治療レジメンを決定することを含む、上記に記載の方法により決定される治療レジメンに関する。特定の実施形態では、治療レジメンは、本開示の抗CXCR4抗体またはその抗原結合部分を、患者に:(a)野生型CXCR4遺伝子を有するWM患者を治療する際に投与される、少なくとも2回、少なくとも3回、または少なくとも5回の用量;および/または(b)野生型CXCR4遺伝子を有するWM患者を治療する際に投与される頻度よりも、少なくとも2倍、少なくとも3倍、または少なくとも5倍高い頻度で、投与することを含む。
ワルデンシュトレームマクログロブリン血症を治療するための好ましい抗CXCR4抗体
本明細書で開示される治療方法は、WM患者に、本開示の抗CXCR4抗体を投与することを含む。この抗体は、WM細胞表面上に発現される野生型CXCR4またはC1013G/CXCR4バリアントに特異的に結合し、治療効果に有益な、特定の構造および機能特性を示す。たとえば、望ましい構造的特徴は、抗体がF7(ウロクプルマブ)、F9、D1もしくはE2(WO2008/060367により特定される)のCDRまたは可変領域を含み、または、CXCR4の同じエピトープ領域への結合について、これらの抗体のいずれかと交差競合することである。望ましい機能的特徴は、インビボにおいて、細胞表面上に発現されるヒトCXCR4に高い親和性で結合すること、CXCR4腫瘍細胞の増殖を阻害する、ことおよび/またはCXCR4腫瘍細胞アポトーシスを阻害することを含む。本開示の治療方法の特定の好ましい実施形態では、抗CXCR4抗体またはその部分は、配列が配列番号25に記載される連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域中のCDR1、CDR2およびCDR3ドメイン、ならびに配列が配列番号29に記載される連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域中のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む。
他の好ましい実施形態では、抗CXCR4抗体またはその部分は、配列が配列番号25に記載される連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域、および配列が配列番号29に記載される連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含む。
さらに他の好ましい実施形態では、Kabatシステム(Kabat et al.,1991;JohnsonおよびWu,2000)による、CDR配列の描写にしたがって、抗CXCR4抗体またはその部分は、配列番号1に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR1、配列番号5に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR2、配列番号9に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR3、配列番号13に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域CDR1、配列番号17に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域CDR2、および配列番号21に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域CDR3を含む。より好ましい実施形態では、抗体またはそのフラグメントはウロクプルマブまたはそのCXCR4結合フラグメントを含む。
本開示の一態様は、WMまたはC1013G/CXCR4関連WMに罹患している対象を治療するための医薬の調製のための、本開示の抗CXCR4抗体またはその抗原結合部分の使用である。これは、WMまたはC1013G/CXCR4関連WMに罹患している対象を治療する際の使用のための本開示の抗体またはその抗原結合部分を開示する。
治療キット
抗CXCR4抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはそれらの組成物ならびに使用のための指示書、たとえば、WM患者に対して抗体またはその組成物を投与することを医療従事者または患者に可能にする投与スケジュールを含む指示書、を含むキットもまた、本開示の範囲内である。したがって、本開示は、対象におけるC1013G/CXCR4関連WMを治療するためのキットであって、(a)本開示の抗CXCR4抗体またはその結合部分のいずれかの1回以上の用量、および(b)本明細書に記載される治療方法のいずれかにおいて抗CXCR4抗体またはそのフラグメントを使用するための指示書を含む、キットを提供する。たとえば、特定の実施形態では、キット中の抗CXCR4抗体またはその抗原結合部分は、配列番号25に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域におけるCDR1、CDR2およびCDR3ドメイン、ならびに配列番号29に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域におけるCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む。好ましい実施形態では、抗CXCR4抗体は、ウロクプルマブである。任意に、本明細書中に記載の方法に従って、単回投与のための有効量の抗CXCR4抗体をそれぞれ含む、単回用量の医薬組成物の複数のパッケージを含む。このキットはさらに、化学療法薬剤もしくは放射性毒性薬物、または異なる抗原を標的とする1つ以上のさらなる抗体などの本明細書に記載される1つ以上の追加的治療用試薬を含み得る。特定の実施形態では、抗CXCR4抗体は、単位用量剤形中に1つ以上の他の治療薬とともにパッケージされる。
医薬組成物を投与するために必要な装置または機械もまた、キット内に含まれてもよい。たとえば、キットは、1つ以上のシリンジを含んでもよい。特定の実施形態では、1つ以上のシリンジは、ある量の抗CXCR4抗体があらかじめ充填されている。また、キットは典型的に使用のための指示書とともにキットの内容物の用途を示すラベルを含む。ラベルという用語は、キット上で、もしくはキットと一緒に供給され、あるいはキットに付属する任意の文書もしくは記録物を含む。
本発明は、さらに、以下の実施例によって例示されるが、これらは単なる例示であり、多くの変形および等価物が、実施例は本開示を読むことによって当業者に明らかになるであろうが、いかなる方法であっても本開示の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本出願全体にわたって引用した全図面および全参考文献、GenBank登録、特許および公開された特許出願の内容は、出典明示により本明細書に明示的に組み込まれる。
C1013G/CXCR4変異についてのB細胞リンパ増殖性障害を有する患者のスクリーニング
様々なB細胞リンパ増殖性障害を有する患者が、C1013G/CXCR4変異体の存在についてスクリーニングされた。
臨床試料
腫瘍試料は、様々なB細胞リンパ増殖性障害(B−LPD)を有する418名の患者から採取され、以下のとおり割り振られた:WM(n=131);IgM MGUS(n=40);びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(n=75);脾辺縁帯リンパ腫(n=14);B細胞慢性リンパ球性リンパ腫(n=37、M成分を有する16を含む);有毛細胞白血病(n=35);MM(n=36、IgMアイソタイプのうち3);IgA/IgG MGUS(n=22);WM基準なしのリンパ形質細胞性リンパ腫(n=13);アミロイドーシス(n=6);および他に特定されないB−LPD(n=9)。診断は、造血およびリンパ組織の腫瘍の最新のWHOの分類にしたがって行った(Campo et al.,2011)。32名の健常者もまた、コントロールとして本研究に含まれた。
診断組織における免疫表現型分析およびクローン細胞定量
免疫表現型評価は、既に記載された従来のモノクローナル抗体のパネルを使用して(Paiva et al.,2013)、かつ血液悪性腫瘍の免疫表現評価のためEuroFlowグループの一般的な推奨事項にしたがって、従来どおりに行われた(van Dongen et al.,2012)。これらの症例は、表面IgM(sIgM)ならびに細胞質Igラムダおよびカッパ(cyIgλおよびcyIgκ)に加えて、最大20の異なる抗原を含む、4色の組み合わせを用いて、免疫表現型解析された。クローン細胞の割合は、sIgM/CD25/CD19/CD38 MoAbを含むチューブにより数えた。データ取得は、FACSCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson Biosciences [BDB] San Jose,CA)において、FACSDivaソフトウェア、ならびにトータルおよびCD19のみのイベントのための2段階の取得手順を用いて行われた。データ解析は、Infinicytソフトウェアを用いて行われた(Cytognos;Salamanca,Spain)。診断組織における免疫表現型分析およびクローン細胞の定量後、C1013G/CXCR4バリアントの検出が、リアルタイムアレル特異的PCR(AS−PCR)を用いて行われた。骨髄外WMの10例もまた、これらの研究に含まれた。これらの研究のためにダナ・ファーバー癌研究所および大学病院のサラマンカ施設内治験審査委員会から承認が得られた。インフォームドコンセントは、ヘルシンキ宣言にしたがって提供された。
CXCR4 C1013G変異を同定するためのリアルタイムAS−PCR
リアルタイムAS−PCRアッセイは、記載されるように(Paiva et al.,2013)、それぞれのプライマーが野生型または変異アレルのいずれかに特異的であるように、最後の2つのヌクレオチド(3’位)において異なる2つのリバースプライマーの使用に基づいて開発された。マッチングしないプライマーの増幅を阻害するために(それによる特異性を増加させる)、さらなるヌクレオチドミスマッチ(C>G)が変異ヌクレオチドの隣に導入された。プライマーの特異的な長さおよび位置は、オリゴ6.0ソフトウェア(Molecular Biology Insights,Cascade,CO)を用いて計算された。リバースプライマーは:5’−GACTCAGACTCAGTGGAAACAGATG−3’(リバース野生型プライマー)および5’−GACTCAGACTCAGTGGAAACAGAAC−3’(リバース変異型プライマー)であった。165bpのPCR産物を生成するための共通のフォワードプライマーは5’−TTTCTTCCACTGTTGTCTGAACC−3’であった。さらに、特異的TaqMan(登録商標)プローブが、Primer Express(登録商標)ソフトウェアv3.0.1(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)を使用して設計され、以下のレポーター、配列およびクエンチャー:6FAM:5’−TATGCTTTCCTTGGAGCCA−3’:NFQ−MGBを生成した。
リアルタイムAS−PCRの開発のために、各実験は2回の異なるPCR反応を必要とした:CXCR4 C1013G変異の検出のために1回(変異型リバースプライマーを用いる)、およびDNAクオリティのコントロールとしてのもう1回(野生型リバースプライマーを用いる)。各反応は、300nMの各プライマー、200nMのプローブ、1×のTaqMan(登録商標)ユニバーサルPCRマスターミックス(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)および20ngのゲノムDNAを含む、20μlの最終量で行われた。実験は、StepOnePlus(登録商標)リアルタイムPCR システム(Applied Biosystems)において行われ、10分95℃の第一の変成工程は、続いて95℃で15秒および60℃で60秒の50サイクルから構成された。データは、StepOne(商標)ソフトウェア2.1(Applied Biosystems)で解析され、蛍光がバックグラウンドから区別され始めるサイクルとして考えられるCT値を与える。
結果
C1013G/CXCR4バリアントは、WMを有する患者において生じる
C1013G/CXCR4変異は、WM患者の28.2%(37/131)、およびTgM−MGUS患者の20%(8/40)において検出された。表1を参照のこと。さらに、当該バリアントは、脾辺縁帯リンパ腫を有する患者の7%(1/14)、およびびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫を有する1.3%(1/75)において検出された一方、B細胞慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、MMおよびIgG/IgA MGUSでは存在せず(表1)、WMの分子病態およびIgM−MGUS前駆段階の分子病態を裏付ける際の、このバリアントの潜在的な役割を示唆している。C1013G/CXCR4バリアントは、CXCR4における単一ヌクレオチド変化C→Gをもたらし、アミノ酸位置338のセリンのかわりに推定終始コドン(S338X)をもたらす。これは、CXCR4のC末端ドメインのトランケーションに既に関連づけられていて(Alapi K et al.,2007)、障害された細胞内トランスロケーションを引き起こす。
観察されたバリアントが、たしかにWM細胞の表面上でCXCR4の変化を誘導し得ることをさらに証明するために、バリアントを有する(n=3)または有しない(n=8)、独立初代WM患者BM由来CD191細胞上のCXCR4表面発現が評価され、より高い表面発現が、野生型/CXCR4患者と比較して、C1013G/CXCR4変異体を有する患者において見られた(図2)。さらに、骨髄外WM組織学的診断で確認された10名の患者もまた、体細胞バリアントの存在について評価された:ゲノムDNAでのAS−PCRにより検出されるように(表2)、肺(3/3)および腎臓(1/1)の侵襲を有する患者は変異したC1013G/CXCR4を提示したが、この変異は小腸(2/2)および軟組織(4/4)では存在せず、この変異が骨髄外侵襲を有する患者においてより広く認められることを示唆した。
表1:C1013G/CXCR4体細胞バリアントを有するワルデンシュトレームマクログロブリン血症患者

C1013G/CXCR4バリアントは、WMを有する患者の28%において生じ、B細胞リンパ増殖異常症を有する患者では、存在しないまたは少数において存在する、のいずれかである。B−CLL、B細胞慢性リンパ球性白血病;MGUS、意義不明のモノクローナル免疫グロブリン血症;NOS、他に特定されない。
表2:C1013G/CXCR4バリアントは、骨髄外WM疾患を有する患者の肺および腎臓組織中に存在する
WM細胞の増殖および転移に対するCXCR4過剰発現の効果
WM生態を裏付ける際にC1013G/CXCR4バリアントのインビボでの機能的関連性を分析するために、CXCR4(GFP)過剰発現WM細胞(CXCR4)は、インビボでのWMにおけるCXCR4の役割への見識を最初に提供するものであった。
免疫組織化学
マウス組織(BM、肝臓、腎臓、肺およびリンパ節)を、ヒトCD20およびヒトCXCR4の発現について解析および定量した。マウスの組織は、ホルマリン10%で固定し、エタノール70%は保存液として使用し、パラフィンで包埋した。パラフィン切片を、ライカボンドIII自動染色プラットフォーム(Leica Biosystems,Buffalo Grove,IL)を用いて、抗ヒトCXCR4(Abcam,Cambridge,MA)および抗ヒト−CD20(Dako,Carpinteria,CA)モノクローナル抗体とインキュベートした。二次抗体は、ボンドIIIリファイン検出キット(Leica Biosystems)の一部として提供され、切片を、ボンドIIIリファイン検出キットで提供されるジアミノベンジジン(DAB)−ペルオキシダーゼ基質とインキュベートし、ヘマトキシリン−エオシンで対比染色し、脱水し、マウントし、およびデジタル写真を撮影した(Nikon Eclipse 80i,Nikon,Melville,NY)。CD20およびCXCR4染色の定量は、NISエレメントソフトウェア(Nikon,Melville,NY)を用いて行われた。
組織免疫蛍光
組織免疫蛍光イメージングが、記載されているように(Hsieh et al.,2012)、マウスから採取された大腿骨、肝臓および腎臓の、GFP/CXCR4過剰発現WM細胞またはRFP/スクランブルWM細胞の評価のために行われた。目的の細胞は、BCWM.1−GFPまたはBCWM.1−RFPのいずれかである。核染色DAPIを各スライドに追加した。スライドを、蛍光顕微鏡(Nikon Eclipse 80i;objective 40X plan fluor 0.75NA)を用いて分析した。MM.1S−GFP細胞を、スライドあたり4つの個別のフィールドからカウントした。画像は、浜松オルカERのカメラとNISエレメントソフトウェアを用いて撮影した。ImageJを、2つの異なるチャネルを併合するために使用した。
ELISA
ヒト血清IgMレベルは、製造元のプロトコルにしたがって、ヒト血清IgM ELISAアッセイ(ZeptoMetrix,Buffalo,NY)を用いて決定した。
インビトロでの細胞接着、遊走および増殖の研究
初代WM BM−MSCsに対するWM細胞の接着性は、カルセインAMで標識されたMM細胞を用いて、インビトロ接着性アッセイにより評価された。蛍光の程度は、既に記載されたように(Roccaro et al.,2010)、分光光度計(485〜520)を用いて測定された。フィブロネクチンへのWM細胞の接着は、製造元の推奨事項(EMD Biosciences,San Diego,CA)に従い、フィブロネクチンに対するインビトロ接着性アッセイを用いて、記載されたように評価した(Roccaro et al.,2013)。WM細胞株の遊走は、トランスウェル遊走プレート(Corning Life Sciences,Tewksbury,MA)を用いて、既に記載されたように(Roccaro et al.,2010;Sacco et al.,2011;Azab et al.,2012)、SDF−1αまたは初代WM BM−MSCsのいずれかに対して評価された。WM細胞増殖は、既に記載されたように(Roccaro et al.,2010;Sacco et al.,2011;Azab et al.,2012)、初代BM−MSCsとの共培養の48時間後に、[H]−チミジン([H]−TdR;Perkin Elmer,Boston,MA)取り込みによって測定されるDNA合成を評価することにより評価された。細胞毒性は、既に記載されているように(Roccaro et al.,2010;Sacco et al.,2011;Azab et al.,2012)、3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(Chemicon International,Temecula,CA)を測定することにより評価された。
機能の喪失および獲得研究
CXCR4の機能の獲得または喪失研究は、既に記載されたように(Roccarro et al.,2010;Sacco et al.,2011)、単独または初代WM BM−MSCsとの関連でのいずれかでWM細胞株(BCWM.1;MWCL1)を用いて行われてきた。簡潔には、CXCR4を、短ヘアピンRNA(shRNA);クローン171、649)およびレンチウイルス媒介感染を用いてWM細胞においてノックダウンし、製品仕様に従って(Thermo Scientific,Waltham,MA)、スクランブルプローブを、標的配列(クローン171、649)を含むコントロールまたはスクランブルコントロールとして使用した。導入効率を、定量的逆転写PCR(QRT−PCR)によって、および蛍光顕微鏡(Nikon Eclipse 80i,Nikon,Melville,NY)を用いるGFP発現細胞の検出を評価することによって、検証した。
CXCR4の過剰発現は、precision LentiORF/CXCR4/GFP(CXCR4)またはコントロールとして用いられたスクランブルプローブ/RFP(Thermo Scientific)のいずれかを使用して、WM細胞において得られた。過剰発現効率を、qRT−PCRにより、および蛍光顕微鏡(Nikon Eclipse 80i,Nikon,Melville,NY)でGFP−およびRFP−発現細胞を検出することにより、確認した。
統計
記載された特定の統計的手法はまた、他の実施例において使用される。インビトロアッセイのために与えられたP値はT検定(両側;α 0.05)またはANOVAに基づく。P値は各図のために与えられる。薬物相乗作用は、25〜27に記載されているように、CalcuSynソフトウェアプログラム(Biosoft,Ferguson,MO)を用いたアイソボログラム分析により解析された。カプラン−マイヤー曲線はグラフパッドプリズムを用いて得られ、P値をログランク検定(Roccaro et al.,2010;Sacco et al.,2011;Roccaro et al.,2008)に基づいて計算した。
結果
インビボでのCXCR4の機能的関連性
CXCR4/GFP細胞および空ベクター/RFP細胞の両方を、SCID/Bgマウスに注入した。感染効率をqRT−PCR(図3)および免疫蛍光イメージング(データ未掲載;Roccaro et al.,2014)により確認した。CXCR4/GFP細胞および空ベクター/RFP細胞の両方をSCID/Bgマウスに注入した。疾患の進行により、マウスを3週間後に安楽死させ、WM細胞中のCXCR4過剰発現が、空ベクター細胞を注入したマウスと比較してCXCR4細胞を注入したマウスにおいて著しく高い臓器の侵襲によって証明された、より攻撃的な表現型をもたらすことを実証した(P<0.01;図4A−C)。
エキソビボ研究は、CXCR4WM細胞が、BMならびに肝臓および腎臓を含む他の臓器でより急速に転移し、増殖したことを実証した(図4;図5A−C)。これらの発見をまた、免疫蛍光イメージングにより確認し、それぞれCXCR4および空ベクター感染細胞を代表する、RFP細胞と比較してより高いGFPの浸潤を示した(データ未掲載;Roccaro et al.,2014)。重要なことに、空ベクター細胞を注入したマウスと比較して、減少した生存がCXCR4細胞を有するマウスにおいて観察された(P=0.02;図5D)。さらに、CXCR4細胞を注入したマウスは、非注入または空ベクター細胞を注入したマウスのいずれかと比較して、増加した血清IgM分泌を提示した(P=0.02;図4D)。エキソビボのCXCR4細胞の存在をまた、CXCR4細胞または空ベクターのいずれかを注入したマウスの大腿骨から採取したBM細胞でqRTPCRを行うことにより確認した(図4E)。
WM細胞におけるCXCR4機能獲得によるインビトロの続発性を、CXCR4細胞をCXCR4−ノックダウン細胞と比較することにより表した。感染効率を、mRNAレベルで(図6)、および免疫蛍光イメージングにより(データ未掲載;Roccaro et al.,2014)確認した。初代WM−BM間質細胞(BM−MSCs)に接着し、BM−MSCsとの関連で増殖するWM細胞の能力は、CXCR4WM細胞で高められ、CXCR4ノックダウンWM細胞の場合では阻害されることが示された(図5E、F)。同様に、フィブロネクチンに対する阻害されたWM細胞の接着性を提示するCXCR4がサイレンシングされた細胞とは対照的に、CXCR4過剰発現は、フィブロネクチンに対するWM細胞の増加した接着能力をもたらした(図7A、B)。まとめると、これらの発見は、CXCR4がインビボのWM細胞の増殖および転移を容易にする際に重要であることを示す。
WM病理に対するC1013G/CXCR4変異の影響
C1013G/CXCR4バリアントは、疾患の進行をもたらすWM病理を積極的に裏付けるかどうかという疑問が解明された。
C1013G/CXCR4突然変異誘発
C1013G/CXCR4バリアントは、製造元の指示書に従い、QuickChange XL部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene,Agilent Technologies,Santa Clara,CA)を用いた部位特異的突然変異誘発により、WM細胞株(BCWM.1;MWCL1)において生成された。コントロールベクターで感染させた細胞はコントロールとして考えられ、本明細書中で「コントロール細胞」として記載されている。WM感染細胞におけるC1013G/CXCR4バリアントの検出は、感染細胞から単離したゲノムDNAまたはcDNAのいずれかでアレル特異的PCRを行うことによって評価した。(フォワードプライマー:5’−TTTCTTCCACTGTTGTCTGAACC−3’;リバース野生型プライマー:5’−GACTCAGACTCAGTGGAAACAGATG−3’;リバース変異型プライマー:5’−GACTCAGACTCAGTGGAAACAGAAC−3’)。データはDNAシーケンシングによりさらに確認された。
遺伝子発現研究
遺伝子発現プロファイリングは、HG−U133プラス2アレイ(GSE50683)を用いて、C1013G/CXCR4変異BCWM.1細胞で行われた。RNAはRNeasyキット(Qiagen)を用いて単離した。データは、d−Chipソフトウェアを用いて正規化した。差次的に発現した遺伝子の痕跡は、既に報告されているように(Subramanian et al.,2005)、ジーンセットエンリッチメント解析(GSEA)を用いて解析した。遺伝子セットは公衆に利用可能なソース(Broad Institute,Cambridge,MA)からダウンロードした。
結果
安定C1013G−変異WM細胞(C1013G/CXCR4−WM)が生成され、コントロールベクター−感染WM細胞がコントロールとして用いられた。突然変異誘発効率は、ゲノムDNAおよび相補的DNA(cDNA)レベルで、それぞれ定量的PCR(qPCR)およびqRT−PCRによって確認され、さらにサンガーDNAシークエンシングによって検証された(図8A−C)。
変異を有するWM細胞により誘導されたインビボ表現型は、その後調べられた。C1013G/CXCR4−WM細胞を注入したマウスは、腫瘍細胞の遠隔臓器への著しい転移および増加した血清IgM分泌を提示し(図8D)、したがって、CXCR4過剰発現WM細胞を注入したマウスで観察された効果を再現した。すでに実証された肝臓、腎臓およびBMの侵襲に加えて、C1013G/CXCR4−WM細胞を注入したマウスは、増大したリンパ節および肺の侵襲を提示した。中枢神経系への転移は観察されなかった。組織病理学解析は、脳を除くすべての調べられた組織においてCXCR4−およびCD20−陽性細胞の存在を示し(図8E;図9A−E)、CXCR4およびCD20陽性はコントロール細胞を注入したマウスと比較してC1013G/CXCR4−WM細胞を注入したマウスにおいて高かった(P<0.05;図10)。重要なことに、C1013G/CXCR4−WM細胞を注入したマウスは、減少した全生存を提示した(P=0.003;図9F)。
C1013G/CXCR4−WM細胞(BCWM.1)はさらにインビトロにおいて特徴付けられ、初代WM BM−MSCsの存在下における増加した接着性および細胞増殖性を示し、したがって、C1013G/CXCR4バリアントが、WM細胞におけるCXCR4の過剰発現の効果を再現できることが確認された(図11A、B)。同様の発見は、異なるWM細胞株を用いて検証された(MWCL1;図11C、D)。
表3:C1013G/CXCR4−WM患者における遺伝子のアップレギュレーション

C1013G/CXCR4変異を有するWM患者(n=10)における遺伝子のアップレギュレーションをCXCR4/野生型WM患者(n=30)と比較した。
WM細胞の転移をインビボで容易にするC1013G/CXCR4バリアントの能力をより説明するために、変異細胞はmRNAレベルで特徴付けられた。GSEAを用いて、侵襲性、細胞増殖、抗アポトーシスおよび発癌性に関する遺伝子(Rizki A et al.,2008;Wang et al.,2007)が、WMコントロールベクター−感染細胞と比較して、C1013/CXCR4−WM細胞において濃縮されており、コントロール細胞と比較した、変異細胞のより攻撃的な表現型に一致した(図12A)。mRNAレベルで観察された変化と共に、これらのインビボの観察は、C1013G/CXCR4−WMバリアントがWM細胞における活性化突然変異として作用することを示唆する。
WM患者を、qRT−PCRを用いてmRNAレベルでプロファイルし、WM生態を裏付けると知られているマイトジェン活性化プロテインキナーゼ、BTK、およびPI3K経路に関するいくつかの遺伝子(Chng et al.,2008;Gutierrez et al.,2007)が、CXCR4/野生型WM患者(n=30)と比較してC1013G/CXCR4−変異WM患者(n=10)において著しくアップレギュレートされることが発見された(表3)。重要なことに、それらの変化は、コントロールベクター−感染細胞と比較して、C1013G/CXCR4−変異BCWM1細胞において、同じように濃縮されており、したがって、C1013G/CXCR4−操作BCWM.1細胞が、初代WM腫瘍細胞で観察されたものを代表することをさらに確認した(図12B)。
従来の抗WM剤に対するC1013G/CXCR4−WMバリアントの抵抗性
従来使用の抗WM小分子に対する、1013G/CXCR4バリアントを有するWM細胞の感受性を調べた。
材料および方法
試薬
エベロリムス、イデラリシブ、イブルチニブ、ボルテゾミブ、およびカーフィルゾミブを、セレックケミカルズ(Houston,TX)より購入した。薬剤は、ジメチルスルホキシドに溶解し、その後、使用の直前に細胞培養培地中(10%ウシ胎仔血清)に希釈した。ジメチルスルホキシドの最大最終濃度(0.1%)は、細胞増殖に影響せず、かつ、試験された細胞株で細胞毒性を誘導しなかった。
BMS936564/MDX−1338およびコントロールヒトIgG4アイソタイプコントロールは、ブリストル−マイヤーズスクイブ(Redwood City,CA)から取得した。
ジーンセットエンリッチメント解析
GSEAは実施例3に記載されているように行った。
GSEA研究は、薬物抵抗性に関連する遺伝子が、変異を有するWM細胞株において濃縮された一方、薬剤反応性に関する遺伝子がWMコントロール細胞において濃縮されたことを示した(図13A)。これは、新規抗WM剤が、CXCR4−変異WM細胞との関連で、それらの抗腫瘍効果を変更し得るかどうかの調査を促した。C1013G/CXCR4体細胞バリアントを有するWM細胞がBTKおよびPI3KならびにmTOR阻害剤に対して抵抗性を提示することが見いだされた(図12B−D)。これらのデータは、WHIM−様変異CXCR4を有するWM患者が、イブルチニブベースの治療に対して抵抗性を提示することを示す最新のデータ(Cao et al.,2013;Treon et al.,2013)を裏付けるものである。重要なことに、プロテアソーム阻害剤は、C1013G/CXCR4変異WM細胞およびコントロール細胞の両方に対して毒性を及ぼす際に、同様に効果的だった(図13E−F)。
抗CXCR4抗体 BMS−935564によるWM細胞の標的化
WMの進行を裏付ける際にCXCR4の生物学的関連性に基づいて、抗CXCR4ヒトモノクローナル抗体BMS−935564(WO2008/060367においてF7で称され;ウロクプルマブまたはMDK−1338としても知られる)を、WM細胞の標的化における活性について試験した。WM細胞の接着性、遊走および増殖を測定するためのアッセイは、実施例2で記載されているように行い、遺伝子発現研究は、実施例3で記載されているように行った。
イムノブロッティング
タンパク質溶解物は、5mM NaF、2mM Na3VO4、1mM PMSF(ポリメチルスルホニルフルオライド)、5μg/ml ロイペプチン、および5μg/mL アプロチニンを補った溶解緩衝液(Cell Signaling Technology,Beverly,MA)中で、非変性条件下でホモジナイズすることによりWM細胞から得られた。全細胞溶解物を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)に供し、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレン(Bio−Rad Laboratories,Hercules,CA)に転写した。イムノブロッティングのために使用した抗体は:抗ホスホ(p)−ERK、抗ERK、抗p−Akt、抗Akt、抗p−Src、抗Src、抗カスパーゼ−9、抗PARP、抗p−β−カテニン、抗β−カテニン、抗p−GSK3、抗GAPDHおよび抗α−チューブリン抗体(Cell Signaling,Danvers,MA)を含んだ。
結果
BMS−936564は、初代WM BM−MSCsまたはSDF−1のいずれかに対してWM細胞株の遊走を阻害することが示された(図14A、B)。
同様に、WM BM−MSCsに対するWM細胞接着性のBMS−936564依存的阻害およびWM BM−MSCsの存在下におけるWM細胞の増殖阻害が実証された(図15A−C)。
WMシグナル伝達に影響を与える際のBMS−936564が果たし得る役割を分析するために、WM細胞を、増加する濃度の抗CXCR4抗体と共に、初代WM BM−MSCsの非存在下または存在下で培養した。p−Akt、p−ERK、およびp−Srcの薬剤依存的阻害がBM−MSCsとの関連で培養したWM細胞中で観察され、BM環境の関連でさえ、WM細胞を標的とするBMS−936564の能力を示唆した(図16)。
アイソタイプコントロールは、インビトロでWM細胞の接着および遊走に影響を及ぼさなかった(図17A、B)。
BMS−936564は、B細胞悪性腫瘍におけるアポトーシス促進性の効果を及ぼしうる(WO2013/071068;Kuhne et al.,2013)。したがって、WM細胞をBMS−936564に曝露し、カスパーゼ−9およびPARP開裂の増加を引き起こした(図18)。
SDF1/CXCR4とβ−カテニンの間の相互作用は、既に転移性固形腫瘍のモデルで示されてきた(Wang et al.,2011)。さらに、リン酸化GSK3βはβ−カテニンの分解を容易にすることが知られている(Wang et al.,2011;Polakis,2001)。したがってβ−カテニンに対するBMS−936564の効果を調査した。CXCR4をBMS−936564で中和することによって、WM細胞は、増加したホスホ(p)−GSK3−βおよびp−β−カテニンのアップレギュレーションを提示し、β−カテニンの分解をもたらした(図19)。これらの発見は、少なくとも部分的には、WM細胞におけるBMS−936564誘導アポトーシスの可能なメカニズムを説明しうる。
インビトロおよびインビボにおけるC1013G/CXCR4−WM細胞に対するBMS−936564の効果
インビボ研究
SCID/Bgマウス(n=5/グループ)に、precision LentiORF/CXCR4/GFP(CXCR4)−または空ベクタープローブ/RFP(コントロール)−感染BCWM.1細胞のいずれかに感染したBCWM.1細胞を注入した。3週間後、マウスを安楽死させ、臓器を採取した。ヒト−CD20および−CXCR4のためのヘマトキシリン−エオシン染色、免疫組織化学は、外植臓器で行った。生存の違いを評価するために、独立した実験を行った(SCID/Bgマウス、n=7/グループ)。同様の研究が、C1013G/CXCR4変異細胞およびコントロールベクター−感染細胞(コントロール細胞)を用いて行われた。インビボにおけるホーミングの研究は、BCWM.1−mCherry細胞を用いて行った:当該細胞を、SID/Bgマウスに静脈内注射し、かつBMS−936564またはコントロール抗体のいずれかで処置(10mg/kg、腹腔内;1週間あたり3〜4回を3週間)した。BM、脾臓およびリンパ節にホーミングするWMを調節するBMS−936564の能力を、外植組織上で、3週間目にエキソビボで蛍光顕微鏡(Nikon Eclipse 80i,Melville,NY)を用いて評価した(Roccaro et al.,2013)。
BMS−936564の活性は、C1013G/CXCR4変異細胞に感染したSCID/Bgマウスにおいて試験された。コントロールマウスは、アイソタイプコントロール抗体で処置した(n=5マウス/グループ;BMS−936564またはコントロール抗体(10mg/kg、腹腔内;1週間あたり3〜4回を3週間)。
結果
CXCR4変異WM細胞に対するBMS−936564の効果を、インビボで調べた。BMS−936564は、コントロール抗体で処置したマウスと比較して、処置したマウスにおける大腿骨、肝臓、腎臓および肺におけるCXCR4/CD20細胞の浸潤の著しい減少によって示されるように、C1013G/CXCR4WM細胞を注入したマウスでWM転移を阻害した(図19A−E;図20A−D)。重要なことに、リンパ節の侵襲はBMS−936564で処置したマウスにおいては存在しなかった(図20E)。
これらの発見をさらにインビトロにおいて確認した。BMS−936564はBM環境との関連で、CXCR4変異細胞の接着性、遊走および増殖特性を標的とする際に同様に活性であるということを発見した(図21A−D)。
重要なことに、BMS−936564は、CXCR4変異WM細胞において、カスパーゼ−9およびPARP開裂を増加させ、また、GSK3−β/β−カテニンシグナル伝達を調節し、p−GSK3−β/p−β−カテニンのアップレギュレーションおよびβ−カテニン分解をもたらした(図22)。さらに、BMS−936564は、C1013G/CXCR4変異を有するWM細胞におけるp−ERK、p−Akt、およびp−Srcの用量依存的阻害を誘導した(図22)。
インビボにおける野生型WM細胞に対するBMS−936564の効果
また、BMS−936564の抗WM活性を、野生型WM細胞を用いてインビボで調べた。BCWM.1−mCherry細胞はSCID/BgマウスならびにBMS−936564もしくはコントロール抗体のいずれかで処置したマウスに静脈内注射された。採取したBM、脾臓およびリンパ節の免疫蛍光イメージングは、エキソビボでのWM細胞の転移を阻害するBMS−936564の能力を実証した(データ未掲載;Roccaro et al.,2014)。
CXCR4阻害が幹細胞および腫瘍細胞の移動を誘導すると考えられているように、BMS−936564もまた、抗WM剤に対する増加した化学感受性をもたらすWM細胞の移動を誘導しうることが仮定された。したがって、腫瘍の進行およびインビボでの遠隔BMニッチへのWM細胞転移を調節する際のBMS−936564の効果を、単剤療法としてまたはボルテゾミブとの組み合わせで評価した。(ボルテゾミブを病院薬局から得、DMSOで希釈し、使用まで−20℃で保存し、そして、使用直前に培養培地で希釈した。DMSOの最大終濃度(<0.1%)は細胞増殖に影響を及ぼさず、試験した細胞株で細胞毒性を誘導しなかった(データ未掲載)。)
BMS−936564で処置したマウスは、BM内の腫瘍細胞の著しい減少、ボルテゾミブ処置マウスで観察された同様の効果、ならびにBMS−936564およびボルテゾミブの組み合わせで処置したマウスにおけるより著しい阻害を提示した(P<0.05;図23A)。同様に、マウスをBMS−936564またはボルテゾミブのいずれかで処置すると、血清IgMレベルは著しく減少したが、BMS−936564およびボルテゾミブの両方にマウスを曝露した場合は、さらにより著しく減少した(P<0.05;図23B)。WM細胞における毒性を誘導することにおける、BMS−936564およびボルテゾミブの組み合わせ効果のさらなる試験は、インビトロでの相乗作用を確認した(図23C、D)。
参考文献




Claims (14)

  1. ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞の表面上に発現されるC−X−Cケモカイン受容体タイプ4(CXCR4)受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、C1013G/CXCR4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に罹患している対象を治療するための方法。
  2. 抗体またはその抗原結合部分が、単剤療法として投与される、請求項1に記載の方法。
  3. 抗体またはその抗原結合部分と組み合わせて、少なくとも1つの抗癌剤を投与することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
  4. 少なくとも1つの抗癌剤が、リツキシマブ、ボルテゾミブ、カーフィルゾミブ、イブルチニブ、イデラリシブ、パノビノスタット、サリドマイド、レナリドマイド、クロラムブシル、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、フルダラビン、ベンダムスチン、デキサメタゾン、および/またはクラドリビンである、請求項3に記載の方法。
  5. 抗体またはその抗原結合部分が、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症のための前治療の失敗後に対象に投与される、請求項1に記載の方法。
  6. 治療有効量の抗体またはその抗原結合部分が、1週間毎に1回、2週間毎に1回、3週間毎に1回、または月に1回の投与スケジュールで投与される0.1、0.3、0.5、1、3、5、10または20mg/kg体重の用量を含む、請求項1に記載の方法。
  7. C1013G/CXCR4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に罹患している対象を治療するための方法であって、:
    (a)治療のための適切な候補である対象を選択すること、ここで、前記選択が
    (i)対象におけるワルデンシュトレームマクログロブリン血症組織から得られた試験組織試料を任意に提供すること;
    (ii)ワルデンシュトレームマクログロブリン血症試験組織試料中の細胞が、C−X−Cケモカイン受容体タイプ4(CXCR4)遺伝子中にC1013G変異を有するかどうかを評価すること;および
    (iii)ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有するという決定に基づいて適切な候補として対象を選択することを含み;ならびに
    (b)C1013G/CXCR4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞の表面上に発現されるCXCR4受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を、選択された対象に投与することを含む、方法。
  8. C1013G/CXCR4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に罹患している対象を治療するための方法であって、C1013G/CXCR4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞の表面上に発現されるCXCR4受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を、対象に投与することを含み、ここで、対象のワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞が、C−X−Cケモカイン受容体タイプ4(CXCR4)遺伝子中にC1013G変異を有すると決定されていることに基づいて、対象が選択されている、方法。
  9. ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞の表面上に発現されるC−X−Cケモカイン受容体タイプ4(CXCR4)受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分による治療のための、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症患者を選択するための方法であって、:
    (a)前記患者におけるワルデンシュトレームマクログロブリン血症組織から得られた試験組織試料を任意に提供すること;
    (b)ワルデンシュトレームマクログロブリン血症試験組織試料中の細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有するかどうかを評価すること;および
    (c)ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有するという決定に基づいて治療のために患者を選択することを含む、方法。
  10. 抗CXCR4抗体またはその部分が、配列番号25に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域中のCDR1、CDR2およびCDR3ドメイン、ならびに配列番号29に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域中のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 抗CXCR4抗体またはその部分が、配列番号25に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号29に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
  12. 抗CXCR4抗体またはその部分が、配列番号1に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR1、配列番号5に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR2、配列番号9に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR3、配列番号13に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域CDR1、配列番号17に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域CDR2、および配列番号21に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域CDR3を含む、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
  13. 対象におけるC1013G/CXCR4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症を治療するためのキットであって:
    (a)抗C−X−Cケモカイン受容体タイプ4(CXCR4)抗体もしくはその抗原結合部分の1以上の用量;および
    (b)請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法において抗CXCR4抗体を使用するための指示書を含む、キット。
  14. 抗CXCR4抗体またはその抗原結合部分が、配列番号25に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域中のCDR1、CDR2およびCDR3ドメイン、ならびに配列番号29に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域中のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む、請求項13に記載のキット。
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