JP2020023499A - 抗cxcr4抗体によるc1013g/cxcr4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症の治療 - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、C1013G/CXCR4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症(Waldenstroem’s macroglobulinemia)を治療する方法における、ヒトCXCR4に特異的に結合するモノクローナル抗体の使用に関する。
C−X−Cケモカイン受容体タイプ4(CXCR4)は、胚発生中におけるリンパ球産生および骨髄(BM)骨髄造血などの生理学的状態において、重要な役割を果たす。出生後、CXCR4およびそのリガンドは、BMニッチにCD341細胞をホーミングすることだけでなく、リンパ球輸送(lymphocytic trafficking)を調節する。とりわけC1013Gバリアントに代表されるCXCR4遺伝子の活性化変異の存在が原因で、いぼ、低ガンマグロブリン血症、感染症、および骨髄性細胞貯留(WHIM)症候群として知られる異常に機能する免疫に特徴付けられる遺伝性ヘテロ接合性常染色体優性疾患を有する患者においてCXCR4は変異したことがこれまでに示されている(Balabanian et al.,2005;Balabanian et al.,2008)。最近の証拠は、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症(WM;リンパ形質細胞性リンパ腫)におけるCXCR4体細胞異常の存在を裏付けている(Hunter et al.,2014;Treon et al.,2014)。リンパ形質細胞性リンパ腫の進行、ならびに他のB細胞リンパ増殖の実体と比較して、WMにとって独特のものであるか、もしくは意義不明のIgMモノクローナル免疫グロブリン血症段階(IgM monoclonal gammopathy of undetermined significance)(MGUS)を発症するかどうかを裏付ける際のこの変異体の機能的役割は、これまでに記載されてこなかった。
本開示は、C1013G/CXCR4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症(WM)に罹患している対象を治療するための方法であって、WM細胞の表面上に発現されるCXCR4受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、対象はヒトであり、かつ抗体またはその抗原結合部分は、細胞表面上に発現されるヒトCXCR4受容体、好ましくはC1013G変異を有するヒトCXCR4に結合する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、キメラ、ヒト化もしくはヒト抗体またはそれらの抗原結合部分である。好ましくは、抗体またはその抗原結合部分は、ヒト抗体またはその抗原結合部分である。
本開示は、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に罹患している患者におけるCXCR4活性を調節する、あるいはかかる患者を治療するための、細胞表面上に発現される天然(native)ヒトCXCR4に特異的に結合するモノクローナル抗体の使用の方法に関する。これらの方法は、特に、CXCR4遺伝子中の活性化C1013G変異を有するWM患者に適用できる。特定の実施形態では、抗CXCR4抗体は、単剤療法として、または、治療のファースト(“フロント”)ライン、たとえば初期または第一の治療として、組み合わせ療法の一部(たとえばmTOR、BTKおよび/またはPI3K阻害剤との組み合わせにおける)として投与される。他の実施形態では、抗CXCR4抗体は、たとえば、再発後および/または第一の治療が失敗した場合を含む、同一のまたは1つ以上の異なる治療薬による初期治療後の、セカンド−またはサード−ライン治療として投与される。したがって、特定の実施形態では、抗CXCR4抗体は、別の抗WM剤、たとえばmTOR、BTKおよび/またはPI3K阻害剤による治療の失敗後に投与される。
本発明がより容易に理解されてもよいように、特定の用語を最初に定義する。特に明確に本明細書で提供される場合を除き、本出願で使用されるように、以下の用語のそれぞれは、以下に記載する意味を有するものとする。さらなる定義は、本出願全体に記載されている。
ヒトモノクローナル抗体F7(ウロクプルマブ;BMS−936564;MDX−1338)、F9、D1およびE2を含む、本発明の治療方法における使用のための例示的な抗CXCR4抗体の産生は、WO2008/060367において詳細に記載されている。また、血液悪性腫瘍を治療するためのこれらの抗体の使用方法は、WO2008/060367およびWO2013/071068に記載されている。本開示の抗CXCR4抗体は、キメラ、ヒト化または、好ましくは、完全ヒト抗体であってもよく、かつ特定の機能的特徴または特性により特徴づけられる。たとえば、抗体は、細胞表面上に発現される天然ヒトCXCR4に結合する。好ましくは、本開示の抗体は、高い親和性で、たとえば1×10−8M以下のKDで、CXCR4に結合する。本開示の抗CXCR4抗体は、好ましくは、治療用途のために望ましい、以下の特徴
(a)細胞表面上に発現されるヒトCXCR4に結合すること;
(b)SDF−1のCXCR4への結合を阻害すること;
(c)CXCR4を発現する細胞においてSDF−1誘導性カルシウムフラックスを阻害すること;
(d)CXCR4を発現する細胞のSDF−1誘導性遊走を阻害すること;
(e)ヒト臍帯静脈内皮細胞による毛細管形成を阻害すること;
(f)1×10−8M以下のKDでヒトCXCR4に結合すること;
(g)CXCR4を発現する細胞におけるアポトーシスを誘導すること;
(h)インビトロでCXCR4+腫瘍細胞の増殖を阻害すること;
(i)インビボでCXCR4+腫瘍細胞増殖を阻害、および/もしくはCXCR4+腫瘍細胞のアポトーシスを誘導すること;
(j)CXCR4+腫瘍細胞の転移(metastases)を阻害すること;ならびに
(k)CXCR4+腫瘍を有する対象の生存期間を増加させること;
の1つ以上を示す。
(a)配列番号25もしくは41に記載の配列を有する重鎖可変領域におけるCDR1、CDR2、およびCDR3ドメインならびに配列番号29もしくは45に記載の配列を有する軽鎖可変領域におけるCDR1、CDR2、およびCDR3ドメイン;
(b)配列番号26もしくは42に記載の配列を有する重鎖可変領域におけるCDR1、CDR2、およびCDR3ドメインならびに配列番号30もしくは46に記載の配列を有する軽鎖可変領域におけるCDR1、CDR2、およびCDR3ドメイン;
(c)配列番号27もしくは43に記載の配列を有する重鎖可変領域におけるCDR1、CDR2、およびCDR3ドメインならびに配列番号31もしくは47に記載の配列を有する軽鎖可変領域におけるCDR1、CDR2、およびCDR3ドメイン;または
(d)配列番号28もしくは44に記載の配列を有する重鎖可変領域におけるCDR1、CDR2、およびCDR3ドメインならびに配列番号32もしくは48に記載の配列を有する軽鎖可変領域におけるCDR1、CDR2、およびCDR3ドメイン
を含む。
(a)配列番号1に記載の配列もしくはその保存的改変を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR1;配列番号5に記載の配列もしくはその保存的改変を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR2;配列番号9に記載の配列もしくはその保存的改変を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR3;配列番号13に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域CDR1;配列番号17に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域CDR2;および配列番号21に記載の配列を含む軽鎖可変領域CDR3;
(b)配列番号2に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域CDR1;配列番号6に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域CDR2;配列番号10に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域CDR3;配列番号14に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域CDR1;配列番号18に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域CDR2;および配列番号22に記載の配列を含む軽鎖可変領域CDR3;
(c)配列番号3に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域CDR1;配列番号7に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域CDR2;配列番号11に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域CDR3;配列番号15に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域CDR1;配列番号19に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域CDR2;および配列番号23に記載の配列を含む軽鎖可変領域CDR3;または
(d)配列番号4に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域CDR1;配列番号8に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域CDR2;配列番号12に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域CDR3;配列番号16に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域CDR1;配列番号20に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域CDR2;および配列番号24に記載の配列を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む。
別の態様では、本開示は、組成物、たとえば、薬学的に許容可能な担体とともに処方される、本開示のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合部分の1つまたは組み合わせを含有する医薬組成物を提供する。本明細書で使用されるように、「薬学的に許容可能な担体」は、生理学的に適合性である溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などのいずれかならびに全てを含む。好ましくは、担体は、静脈内、皮下、筋肉内、非経口、脊髄または表皮投与(たとえば、注射または注入による)に適している。本発明の医薬組成物は、1つ以上の薬学的に許容可能な塩、抗酸化剤、水性および非水性の担体ならびに/または防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を含んでもよい。
本開示は、CXCR4受容体に特異的に結合し、かつ治療的使用のために望ましい特定の機能特性を示す、治療有効量の抗体を対象に投与することを含む、WMに罹患している対象を治療するための方法を提供する。
CXCR4の過剰発現はまた、癌の約75%で実証され、特定の状況では、CXCR4の発現と患者の予後もしくは生存との間で、逆相関が確立されてきた。CXCR4発現またはCXCR4/CXCL12経路に関連した癌の種類の非限定的な例は、乳癌(Muller et al.,2001)、卵巣癌(Scotton et al.,2001)、前立腺癌(Taichman et al.,2002)、非小細胞肺癌(Spano et al.,2004)、膵臓癌(Koshiba et al.,2000)、大腸癌(Zeelenberg et al.,2003)、腎臓癌(Schrader et al.,2002)、および甲状腺癌(Hwang et al.,2003)などの固形腫瘍、上咽頭癌(Wang et al.,2005)、黒色腫(Scala et al.,2005)、腎細胞癌(Staller et al.,2003)、神経芽細胞腫(Geminder et al.,2001)、グリア芽腫(Rempel et al.,2000)、横紋筋肉腫(Libura et al.,2002)、ならびに骨肉腫(Laverdiere et al.,2005)、ならびに急性リンパ芽球性白血病(Crazzolara et al.,2001)、急性骨髄性白血病(AML)(Mohle et al.,1998;Rombouts et al.,2004)、多発性骨髄腫(MM)(Alsayed et al.,2007;Azab et al.,2009)、慢性リンパ性白血病(Mohle et al.,1999;Burger et al.,1999)、慢性骨髄性白血病(Jin et al.,2008)などの血液悪性腫瘍、WM(Ngo et al.,2008)、および非ホジキンリンパ腫(NHL)(Bertolini et al.,2002;Weng et al.,2003)を含む。
リンパ形質細胞性リンパ腫とも称呼されるWMは、非ホジキンリンパ腫(NHL)の無痛性(増殖が遅い)サブタイプである。当該疾患は、最終分化したBリンパ球の制御されていないクローン増殖、すなわち、BMおよびリンパ節内に形成された白血球細胞により特徴付けられる。当該疾患の独特な特徴は、B細胞が過剰量のモノクローナルIgM抗体を生成し、過粘稠として知られている血液の増粘をもたらし得るということである。このIgMタンパク質は、疲労、原因不明の体重減少、肥大したリンパ節もしくは脾臓、腎機能障害、全身性アミロイドーシス、衰弱ならびに原因不明の出血を含む、多くの症状をもたらし得る。また、B細胞の増殖は、赤血球の産生を妨害し、貧血をもたらす。
WM細胞がCXCR4およびVLA−4を含むケモカインおよび接着受容体を高レベルで発現し、CXCR4がWM細胞のCXCL12誘導性遊走および経内皮遊走に不可欠であることが、以前から示されてきた(Ngo et al.,2008)。CXCR4のノックダウンまたはCXCR4阻害剤であるAMD3100は、WM細胞の遊走ならびにフィブロネクチン、間質細胞、および内皮細胞へのそれらの接着を著しく阻害することが示された。AMD3100により誘導された間質細胞へのWM細胞の減少した接着は、ボルテゾミブによる、細胞毒性に対するこれらの細胞の増加した感受性、すなわち、増殖の阻害につながった。さらに、CXCR4およびVLA−4は、直接、CXCL12に応じて相互作用することが示された。したがって、CXCR4/CXCL12軸は、BM微小環境でのWM細胞の遊走および接着を制御する際に、VLA−4と相互作用することが示された(Ngo et al.,2008)。
一般的にWMを治療するために使用される薬剤は、リツキシマブ、クロラムブシル(LEUKERAN(登録商標))、クラドリビン(LEUSTATIN(登録商標))、フルダラビン、ボルテゾミブ、ベンダムスチンなどの薬剤の単独または様々な組み合わせを含む。難治性/再発WMを治療するさらなる療法は、リツキシマブにアレルギーのある患者のためのオファツムマブ、エベロリムス、アレムツズマブリ、ならびに自家もしくは同種幹細胞移植を伴う高用量化学療法を含む。カーフィルゾミブ、イブルチニブおよびパノビノスタット(LBH−589)を含む、新しい薬物および薬物の組み合わせのいくつかは、WMのための臨床試験(いくつかは難治性/再発疾患のため)で研究されている。
抗CXCR4抗体、BMS−936564は、WM細胞株の初代WM骨髄間葉系間質細胞(BM−MSCs)またはCXCR4リガンド、CXCL12のいずれかへの遊走を阻害することが明細書中で示されている。(実施例5を参照のこと)。この抗CXCR4抗体はまた、WM BM−MSCsへのWM細胞接着を阻害し、かつWM BM−MSCsの存在下でのWM細胞増殖を阻害する。さらに、また、当該抗体がWM細胞におけるアポトーシスを直接的に誘導しうるという証拠が提供された(実施例5)。したがって、本開示は、WM細胞を含む、細胞表面上に発現されるCXCR4受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、WMに罹患している対象を治療するための方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明の方法で使用される抗体は、CXCR4受容体に特異的に結合し、かつ治療的使用のために望ましい特定の機能特性を示す、本開示の抗CXCR4抗体である。かかる機能特性は、細胞表面上に発現されるヒトCXCR4への高親和性結合、CXCR4発現細胞におけるSDF−1−誘導性カルシウムフラックスおよびCXCR4発現細胞の遊走を阻害すること、インビボでCXCR4+腫瘍細胞増殖を阻害および/もしくはCXCR4+腫瘍細胞アポトーシスを誘導すること、CXCR4+腫瘍−保有対象の生存期間を増加させること、ならびに/または本明細書中で記載される他の機能特性を含む。
BMS−936564へのWM細胞の曝露は、カスパーゼ−9およびPARP切断の増加をもたらした(実施例5)。BMS−936564によるCXCR4の中和はまた、ホスホ(p)−GSK3−βおよびp−β−カテニンのアップレギュレーションのレベルを増加させ、β−カテニンの分解につながった。BMS−936564は、C1013G/CXCR4関連WM細胞におけるカスパーゼ−9−およびPARP切断を同様に増加させ、かつGSK3−β/β−カテニンシグナル伝達を調節し、p−GSK3−β/p−β−カテニンのアップレギュレーションおよびβ−カテニンの分解をもたらした(実施例6)。BMS−936564のこれらの効果は、WMおよびC1013G/CXCR4関連WM細胞におけるアポトーシス経路の活性化に一致し、かつ他のB細胞悪性腫瘍において実証されたBMS−936564のアポトーシス促進効果を反映する(WO2013/071068;Kuhne et al.,2013)。したがって、WM患者を治療するためのこれらの方法の特定の実施形態では、抗CXCR4抗体またはそのフラグメントはCXCR4−またはC1013G/CXCR4発現細胞のアポトーシスを誘導する。
実施例7に記載のように、各BMS−936564およびボルテゾミブは、BM内の腫瘍細胞および血清IgM抗体のレベルを著しく減少させた。しかし、BMS−936564およびボルテゾミブの組み合わせは、腫瘍細胞および血清IgMレベルのより著しい減少を引き起こすよう、相乗的に作用した。これらの結果は、CXCR4/CXCL12軸が、BMへのMM細胞のホーミングおよび輸送において重要な役割を果たし、かつBMとのMM癌細胞の相互作用の崩壊が、これらの細胞を治療薬に対して感作するという以前の実証に一致する(Alsayed et al.,2007;Azab et al.,2009;Kuhne et al.,2013;WO 2013/071068)。
WMを治療するための開示された方法の特定の実施形態では、治療有効量の抗CXCR4抗体またはその抗原結合部分は、0.1から20mg/kg体重の範囲の用量を含む。たとえば、特定の実施形態では、治療有効量の抗CXCR4抗体またはその抗原結合部分は、0.1、0.3、0.5、1、3、5、10または20mg/kgの用量を含む。好ましい実施形態では、用量は1、3または10mg/kgである。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、1週間毎に1回、2週間毎に1回、3週間毎に1回、または月に1回の投与スケジュールで投与される。好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は7日または14日毎に1回の投与スケジュールで投与される。特定の実施形態では、抗CXCR4抗体は、治療期間の間、単剤療法として投与される。他の実施形態では、抗CXCR4抗体は毎週投与され、単剤療法としてはじめの2週間のサイクル1で、その後、たとえばボルテゾミブ、デキサメタゾン、およびリツキシマブ(BDR)、またはシクロホスファミド、デキサメタゾン、およびリツキシマブ(RCD)を含む化学療法レジメンと組み合わせて投与される。特定の好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、静脈内投与される。他の好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、皮下投与される。
C1013G/CXCR4変異は、WMにおける活性化変異であると本明細書中で示される(実施例3)。野生型WM細胞と比較して、C1013G/CXCR4変異細胞のより攻撃的な表現型にもかかわらず、BMS−936564は、CXCR4変異細胞の接着性、遊走および増殖特性を標的とする際に、同等に活性的であることがわかった(実施例5)。したがって、本開示の抗CXCR4抗体は、C1013G/CXCR4関連WMの治療における特定の適用性を有してもよく、治療レジメンは、C1013G変異を有する患者を特定するための工程を含んでもよい。したがって、一態様では、本開示は、C1013G/CXCR4関連WMに罹患している対象を治療するための方法であって、(a)治療のための適切な候補である対象を選択すること、ここで、当該選択が:(i)対象におけるWM組織から得られた試験組織試料を提供すること;(ii)WM試験組織試料中の細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有するかどうかを評価すること;および(iii)WM細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有するという決定に基づいて適切な候補として対象を選択することを含み;ならびに(b)C1013G/CXCR4関連WM細胞の表面上に発現されるCXCR4受容体に特異的に結合する、治療有効量の本開示の抗体またはその抗原結合部分を、選択された対象に投与することを含む、方法を提供する。本方法の特定の実施形態では、抗CXCR4抗体は、抗WM剤、たとえばボルテゾミブまたはカーフィルゾミブと組み合わせて投与され、C1013G/CXCR4体細胞バリアントを有するWM患者を治療する際に有効でもある。本方法のいずれかでは、試験組織試料は、腫瘍組織の生検試料または末梢で見られる腫瘍細胞の試料を含む。
本明細書で開示される治療方法は、WM患者に、本開示の抗CXCR4抗体を投与することを含む。この抗体は、WM細胞表面上に発現される野生型CXCR4またはC1013G/CXCR4バリアントに特異的に結合し、治療効果に有益な、特定の構造および機能特性を示す。たとえば、望ましい構造的特徴は、抗体がF7(ウロクプルマブ)、F9、D1もしくはE2(WO2008/060367により特定される)のCDRまたは可変領域を含み、または、CXCR4の同じエピトープ領域への結合について、これらの抗体のいずれかと交差競合することである。望ましい機能的特徴は、インビボにおいて、細胞表面上に発現されるヒトCXCR4に高い親和性で結合すること、CXCR4+腫瘍細胞の増殖を阻害する、ことおよび/またはCXCR4+腫瘍細胞アポトーシスを阻害することを含む。本開示の治療方法の特定の好ましい実施形態では、抗CXCR4抗体またはその部分は、配列が配列番号25に記載される連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域中のCDR1、CDR2およびCDR3ドメイン、ならびに配列が配列番号29に記載される連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域中のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む。
抗CXCR4抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはそれらの組成物ならびに使用のための指示書、たとえば、WM患者に対して抗体またはその組成物を投与することを医療従事者または患者に可能にする投与スケジュールを含む指示書、を含むキットもまた、本開示の範囲内である。したがって、本開示は、対象におけるC1013G/CXCR4関連WMを治療するためのキットであって、(a)本開示の抗CXCR4抗体またはその結合部分のいずれかの1回以上の用量、および(b)本明細書に記載される治療方法のいずれかにおいて抗CXCR4抗体またはそのフラグメントを使用するための指示書を含む、キットを提供する。たとえば、特定の実施形態では、キット中の抗CXCR4抗体またはその抗原結合部分は、配列番号25に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域におけるCDR1、CDR2およびCDR3ドメイン、ならびに配列番号29に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域におけるCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む。好ましい実施形態では、抗CXCR4抗体は、ウロクプルマブである。任意に、本明細書中に記載の方法に従って、単回投与のための有効量の抗CXCR4抗体をそれぞれ含む、単回用量の医薬組成物の複数のパッケージを含む。このキットはさらに、化学療法薬剤もしくは放射性毒性薬物、または異なる抗原を標的とする1つ以上のさらなる抗体などの本明細書に記載される1つ以上の追加的治療用試薬を含み得る。特定の実施形態では、抗CXCR4抗体は、単位用量剤形中に1つ以上の他の治療薬とともにパッケージされる。
様々なB細胞リンパ増殖性障害を有する患者が、C1013G/CXCR4変異体の存在についてスクリーニングされた。
腫瘍試料は、様々なB細胞リンパ増殖性障害(B−LPD)を有する418名の患者から採取され、以下のとおり割り振られた:WM(n=131);IgM MGUS(n=40);びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(n=75);脾辺縁帯リンパ腫(n=14);B細胞慢性リンパ球性リンパ腫(n=37、M成分を有する16を含む);有毛細胞白血病(n=35);MM(n=36、IgMアイソタイプのうち3);IgA/IgG MGUS(n=22);WM基準なしのリンパ形質細胞性リンパ腫(n=13);アミロイドーシス(n=6);および他に特定されないB−LPD(n=9)。診断は、造血およびリンパ組織の腫瘍の最新のWHOの分類にしたがって行った(Campo et al.,2011)。32名の健常者もまた、コントロールとして本研究に含まれた。
免疫表現型評価は、既に記載された従来のモノクローナル抗体のパネルを使用して(Paiva et al.,2013)、かつ血液悪性腫瘍の免疫表現評価のためEuroFlowグループの一般的な推奨事項にしたがって、従来どおりに行われた(van Dongen et al.,2012)。これらの症例は、表面IgM(sIgM)ならびに細胞質Igラムダおよびカッパ(cyIgλおよびcyIgκ)に加えて、最大20の異なる抗原を含む、4色の組み合わせを用いて、免疫表現型解析された。クローン細胞の割合は、sIgM/CD25/CD19/CD38 MoAbを含むチューブにより数えた。データ取得は、FACSCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson Biosciences [BDB] San Jose,CA)において、FACSDivaソフトウェア、ならびにトータルおよびCD19+のみのイベントのための2段階の取得手順を用いて行われた。データ解析は、Infinicytソフトウェアを用いて行われた(Cytognos;Salamanca,Spain)。診断組織における免疫表現型分析およびクローン細胞の定量後、C1013G/CXCR4バリアントの検出が、リアルタイムアレル特異的PCR(AS−PCR)を用いて行われた。骨髄外WMの10例もまた、これらの研究に含まれた。これらの研究のためにダナ・ファーバー癌研究所および大学病院のサラマンカ施設内治験審査委員会から承認が得られた。インフォームドコンセントは、ヘルシンキ宣言にしたがって提供された。
リアルタイムAS−PCRアッセイは、記載されるように(Paiva et al.,2013)、それぞれのプライマーが野生型または変異アレルのいずれかに特異的であるように、最後の2つのヌクレオチド(3’位)において異なる2つのリバースプライマーの使用に基づいて開発された。マッチングしないプライマーの増幅を阻害するために(それによる特異性を増加させる)、さらなるヌクレオチドミスマッチ(C>G)が変異ヌクレオチドの隣に導入された。プライマーの特異的な長さおよび位置は、オリゴ6.0ソフトウェア(Molecular Biology Insights,Cascade,CO)を用いて計算された。リバースプライマーは:5’−GACTCAGACTCAGTGGAAACAGATG−3’(リバース野生型プライマー)および5’−GACTCAGACTCAGTGGAAACAGAAC−3’(リバース変異型プライマー)であった。165bpのPCR産物を生成するための共通のフォワードプライマーは5’−TTTCTTCCACTGTTGTCTGAACC−3’であった。さらに、特異的TaqMan(登録商標)プローブが、Primer Express(登録商標)ソフトウェアv3.0.1(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)を使用して設計され、以下のレポーター、配列およびクエンチャー:6FAM:5’−TATGCTTTCCTTGGAGCCA−3’:NFQ−MGBを生成した。
C1013G/CXCR4バリアントは、WMを有する患者において生じる
C1013G/CXCR4変異は、WM患者の28.2%(37/131)、およびTgM−MGUS患者の20%(8/40)において検出された。表1を参照のこと。さらに、当該バリアントは、脾辺縁帯リンパ腫を有する患者の7%(1/14)、およびびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫を有する1.3%(1/75)において検出された一方、B細胞慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、MMおよびIgG/IgA MGUSでは存在せず(表1)、WMの分子病態およびIgM−MGUS前駆段階の分子病態を裏付ける際の、このバリアントの潜在的な役割を示唆している。C1013G/CXCR4バリアントは、CXCR4における単一ヌクレオチド変化C→Gをもたらし、アミノ酸位置338のセリンのかわりに推定終始コドン(S338X)をもたらす。これは、CXCR4のC末端ドメインのトランケーションに既に関連づけられていて(Alapi K et al.,2007)、障害された細胞内トランスロケーションを引き起こす。
表1:C1013G/CXCR4体細胞バリアントを有するワルデンシュトレームマクログロブリン血症患者
C1013G/CXCR4バリアントは、WMを有する患者の28%において生じ、B細胞リンパ増殖異常症を有する患者では、存在しないまたは少数において存在する、のいずれかである。B−CLL、B細胞慢性リンパ球性白血病;MGUS、意義不明のモノクローナル免疫グロブリン血症;NOS、他に特定されない。
表2:C1013G/CXCR4バリアントは、骨髄外WM疾患を有する患者の肺および腎臓組織中に存在する
WM生態を裏付ける際にC1013G/CXCR4バリアントのインビボでの機能的関連性を分析するために、CXCR4(GFP+)過剰発現WM細胞(CXCR4+)は、インビボでのWMにおけるCXCR4の役割への見識を最初に提供するものであった。
マウス組織(BM、肝臓、腎臓、肺およびリンパ節)を、ヒトCD20およびヒトCXCR4の発現について解析および定量した。マウスの組織は、ホルマリン10%で固定し、エタノール70%は保存液として使用し、パラフィンで包埋した。パラフィン切片を、ライカボンドIII自動染色プラットフォーム(Leica Biosystems,Buffalo Grove,IL)を用いて、抗ヒトCXCR4(Abcam,Cambridge,MA)および抗ヒト−CD20(Dako,Carpinteria,CA)モノクローナル抗体とインキュベートした。二次抗体は、ボンドIIIリファイン検出キット(Leica Biosystems)の一部として提供され、切片を、ボンドIIIリファイン検出キットで提供されるジアミノベンジジン(DAB)−ペルオキシダーゼ基質とインキュベートし、ヘマトキシリン−エオシンで対比染色し、脱水し、マウントし、およびデジタル写真を撮影した(Nikon Eclipse 80i,Nikon,Melville,NY)。CD20およびCXCR4染色の定量は、NISエレメントソフトウェア(Nikon,Melville,NY)を用いて行われた。
組織免疫蛍光イメージングが、記載されているように(Hsieh et al.,2012)、マウスから採取された大腿骨、肝臓および腎臓の、GFP+/CXCR4過剰発現WM細胞またはRFP+/スクランブルWM細胞の評価のために行われた。目的の細胞は、BCWM.1−GFP+またはBCWM.1−RFP+のいずれかである。核染色DAPIを各スライドに追加した。スライドを、蛍光顕微鏡(Nikon Eclipse 80i;objective 40X plan fluor 0.75NA)を用いて分析した。MM.1S−GFP+細胞を、スライドあたり4つの個別のフィールドからカウントした。画像は、浜松オルカERのカメラとNISエレメントソフトウェアを用いて撮影した。ImageJを、2つの異なるチャネルを併合するために使用した。
ヒト血清IgMレベルは、製造元のプロトコルにしたがって、ヒト血清IgM ELISAアッセイ(ZeptoMetrix,Buffalo,NY)を用いて決定した。
初代WM BM−MSCsに対するWM細胞の接着性は、カルセインAMで標識されたMM細胞を用いて、インビトロ接着性アッセイにより評価された。蛍光の程度は、既に記載されたように(Roccaro et al.,2010)、分光光度計(485〜520)を用いて測定された。フィブロネクチンへのWM細胞の接着は、製造元の推奨事項(EMD Biosciences,San Diego,CA)に従い、フィブロネクチンに対するインビトロ接着性アッセイを用いて、記載されたように評価した(Roccaro et al.,2013)。WM細胞株の遊走は、トランスウェル遊走プレート(Corning Life Sciences,Tewksbury,MA)を用いて、既に記載されたように(Roccaro et al.,2010;Sacco et al.,2011;Azab et al.,2012)、SDF−1αまたは初代WM BM−MSCsのいずれかに対して評価された。WM細胞増殖は、既に記載されたように(Roccaro et al.,2010;Sacco et al.,2011;Azab et al.,2012)、初代BM−MSCsとの共培養の48時間後に、[3H]−チミジン([3H]−TdR;Perkin Elmer,Boston,MA)取り込みによって測定されるDNA合成を評価することにより評価された。細胞毒性は、既に記載されているように(Roccaro et al.,2010;Sacco et al.,2011;Azab et al.,2012)、3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(Chemicon International,Temecula,CA)を測定することにより評価された。
CXCR4の機能の獲得または喪失研究は、既に記載されたように(Roccarro et al.,2010;Sacco et al.,2011)、単独または初代WM BM−MSCsとの関連でのいずれかでWM細胞株(BCWM.1;MWCL1)を用いて行われてきた。簡潔には、CXCR4を、短ヘアピンRNA(shRNA);クローン171、649)およびレンチウイルス媒介感染を用いてWM細胞においてノックダウンし、製品仕様に従って(Thermo Scientific,Waltham,MA)、スクランブルプローブを、標的配列(クローン171、649)を含むコントロールまたはスクランブルコントロールとして使用した。導入効率を、定量的逆転写PCR(QRT−PCR)によって、および蛍光顕微鏡(Nikon Eclipse 80i,Nikon,Melville,NY)を用いるGFP発現細胞の検出を評価することによって、検証した。
記載された特定の統計的手法はまた、他の実施例において使用される。インビトロアッセイのために与えられたP値はT検定(両側;α 0.05)またはANOVAに基づく。P値は各図のために与えられる。薬物相乗作用は、25〜27に記載されているように、CalcuSynソフトウェアプログラム(Biosoft,Ferguson,MO)を用いたアイソボログラム分析により解析された。カプラン−マイヤー曲線はグラフパッドプリズムを用いて得られ、P値をログランク検定(Roccaro et al.,2010;Sacco et al.,2011;Roccaro et al.,2008)に基づいて計算した。
インビボでのCXCR4の機能的関連性
CXCR4+/GFP+細胞および空ベクター/RFP+細胞の両方を、SCID/Bgマウスに注入した。感染効率をqRT−PCR(図3)および免疫蛍光イメージング(データ未掲載;Roccaro et al.,2014)により確認した。CXCR4+/GFP+細胞および空ベクター/RFP+細胞の両方をSCID/Bgマウスに注入した。疾患の進行により、マウスを3週間後に安楽死させ、WM細胞中のCXCR4過剰発現が、空ベクター細胞を注入したマウスと比較してCXCR4+細胞を注入したマウスにおいて著しく高い臓器の侵襲によって証明された、より攻撃的な表現型をもたらすことを実証した(P<0.01;図4A−C)。
C1013G/CXCR4バリアントは、疾患の進行をもたらすWM病理を積極的に裏付けるかどうかという疑問が解明された。
C1013G/CXCR4バリアントは、製造元の指示書に従い、QuickChange XL部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene,Agilent Technologies,Santa Clara,CA)を用いた部位特異的突然変異誘発により、WM細胞株(BCWM.1;MWCL1)において生成された。コントロールベクターで感染させた細胞はコントロールとして考えられ、本明細書中で「コントロール細胞」として記載されている。WM感染細胞におけるC1013G/CXCR4バリアントの検出は、感染細胞から単離したゲノムDNAまたはcDNAのいずれかでアレル特異的PCRを行うことによって評価した。(フォワードプライマー:5’−TTTCTTCCACTGTTGTCTGAACC−3’;リバース野生型プライマー:5’−GACTCAGACTCAGTGGAAACAGATG−3’;リバース変異型プライマー:5’−GACTCAGACTCAGTGGAAACAGAAC−3’)。データはDNAシーケンシングによりさらに確認された。
遺伝子発現プロファイリングは、HG−U133プラス2アレイ(GSE50683)を用いて、C1013G/CXCR4変異BCWM.1細胞で行われた。RNAはRNeasyキット(Qiagen)を用いて単離した。データは、d−Chipソフトウェアを用いて正規化した。差次的に発現した遺伝子の痕跡は、既に報告されているように(Subramanian et al.,2005)、ジーンセットエンリッチメント解析(GSEA)を用いて解析した。遺伝子セットは公衆に利用可能なソース(Broad Institute,Cambridge,MA)からダウンロードした。
安定C1013G−変異WM細胞(C1013G/CXCR4−WM)が生成され、コントロールベクター−感染WM細胞がコントロールとして用いられた。突然変異誘発効率は、ゲノムDNAおよび相補的DNA(cDNA)レベルで、それぞれ定量的PCR(qPCR)およびqRT−PCRによって確認され、さらにサンガーDNAシークエンシングによって検証された(図8A−C)。
表3:C1013G/CXCR4−WM患者における遺伝子のアップレギュレーション
C1013G/CXCR4変異を有するWM患者(n=10)における遺伝子のアップレギュレーションをCXCR4/野生型WM患者(n=30)と比較した。
従来使用の抗WM小分子に対する、1013G/CXCR4バリアントを有するWM細胞の感受性を調べた。
試薬
エベロリムス、イデラリシブ、イブルチニブ、ボルテゾミブ、およびカーフィルゾミブを、セレックケミカルズ(Houston,TX)より購入した。薬剤は、ジメチルスルホキシドに溶解し、その後、使用の直前に細胞培養培地中(10%ウシ胎仔血清)に希釈した。ジメチルスルホキシドの最大最終濃度(0.1%)は、細胞増殖に影響せず、かつ、試験された細胞株で細胞毒性を誘導しなかった。
GSEAは実施例3に記載されているように行った。
WMの進行を裏付ける際にCXCR4の生物学的関連性に基づいて、抗CXCR4ヒトモノクローナル抗体BMS−935564(WO2008/060367においてF7で称され;ウロクプルマブまたはMDK−1338としても知られる)を、WM細胞の標的化における活性について試験した。WM細胞の接着性、遊走および増殖を測定するためのアッセイは、実施例2で記載されているように行い、遺伝子発現研究は、実施例3で記載されているように行った。
タンパク質溶解物は、5mM NaF、2mM Na3VO4、1mM PMSF(ポリメチルスルホニルフルオライド)、5μg/ml ロイペプチン、および5μg/mL アプロチニンを補った溶解緩衝液(Cell Signaling Technology,Beverly,MA)中で、非変性条件下でホモジナイズすることによりWM細胞から得られた。全細胞溶解物を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)に供し、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレン(Bio−Rad Laboratories,Hercules,CA)に転写した。イムノブロッティングのために使用した抗体は:抗ホスホ(p)−ERK、抗ERK、抗p−Akt、抗Akt、抗p−Src、抗Src、抗カスパーゼ−9、抗PARP、抗p−β−カテニン、抗β−カテニン、抗p−GSK3、抗GAPDHおよび抗α−チューブリン抗体(Cell Signaling,Danvers,MA)を含んだ。
BMS−936564は、初代WM BM−MSCsまたはSDF−1のいずれかに対してWM細胞株の遊走を阻害することが示された(図14A、B)。
インビボ研究
SCID/Bgマウス(n=5/グループ)に、precision LentiORF/CXCR4/GFP(CXCR4+)−または空ベクタープローブ/RFP(コントロール)−感染BCWM.1細胞のいずれかに感染したBCWM.1細胞を注入した。3週間後、マウスを安楽死させ、臓器を採取した。ヒト−CD20および−CXCR4のためのヘマトキシリン−エオシン染色、免疫組織化学は、外植臓器で行った。生存の違いを評価するために、独立した実験を行った(SCID/Bgマウス、n=7/グループ)。同様の研究が、C1013G/CXCR4変異細胞およびコントロールベクター−感染細胞(コントロール細胞)を用いて行われた。インビボにおけるホーミングの研究は、BCWM.1−mCherry+細胞を用いて行った:当該細胞を、SID/Bgマウスに静脈内注射し、かつBMS−936564またはコントロール抗体のいずれかで処置(10mg/kg、腹腔内;1週間あたり3〜4回を3週間)した。BM、脾臓およびリンパ節にホーミングするWMを調節するBMS−936564の能力を、外植組織上で、3週間目にエキソビボで蛍光顕微鏡(Nikon Eclipse 80i,Melville,NY)を用いて評価した(Roccaro et al.,2013)。
CXCR4変異WM細胞に対するBMS−936564の効果を、インビボで調べた。BMS−936564は、コントロール抗体で処置したマウスと比較して、処置したマウスにおける大腿骨、肝臓、腎臓および肺におけるCXCR4+/CD20+細胞の浸潤の著しい減少によって示されるように、C1013G/CXCR4WM細胞を注入したマウスでWM転移を阻害した(図19A−E;図20A−D)。重要なことに、リンパ節の侵襲はBMS−936564で処置したマウスにおいては存在しなかった(図20E)。
また、BMS−936564の抗WM活性を、野生型WM細胞を用いてインビボで調べた。BCWM.1−mCherry+細胞はSCID/BgマウスならびにBMS−936564もしくはコントロール抗体のいずれかで処置したマウスに静脈内注射された。採取したBM、脾臓およびリンパ節の免疫蛍光イメージングは、エキソビボでのWM細胞の転移を阻害するBMS−936564の能力を実証した(データ未掲載;Roccaro et al.,2014)。
Claims (14)
- ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞の表面上に発現されるC−X−Cケモカイン受容体タイプ4(CXCR4)受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、C1013G/CXCR4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に罹患している対象を治療するための方法。
- 抗体またはその抗原結合部分が、単剤療法として投与される、請求項1に記載の方法。
- 抗体またはその抗原結合部分と組み合わせて、少なくとも1つの抗癌剤を投与することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの抗癌剤が、リツキシマブ、ボルテゾミブ、カーフィルゾミブ、イブルチニブ、イデラリシブ、パノビノスタット、サリドマイド、レナリドマイド、クロラムブシル、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、フルダラビン、ベンダムスチン、デキサメタゾン、および/またはクラドリビンである、請求項3に記載の方法。
- 抗体またはその抗原結合部分が、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症のための前治療の失敗後に対象に投与される、請求項1に記載の方法。
- 治療有効量の抗体またはその抗原結合部分が、1週間毎に1回、2週間毎に1回、3週間毎に1回、または月に1回の投与スケジュールで投与される0.1、0.3、0.5、1、3、5、10または20mg/kg体重の用量を含む、請求項1に記載の方法。
- C1013G/CXCR4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に罹患している対象を治療するための方法であって、:
(a)治療のための適切な候補である対象を選択すること、ここで、前記選択が
(i)対象におけるワルデンシュトレームマクログロブリン血症組織から得られた試験組織試料を任意に提供すること;
(ii)ワルデンシュトレームマクログロブリン血症試験組織試料中の細胞が、C−X−Cケモカイン受容体タイプ4(CXCR4)遺伝子中にC1013G変異を有するかどうかを評価すること;および
(iii)ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有するという決定に基づいて適切な候補として対象を選択することを含み;ならびに
(b)C1013G/CXCR4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞の表面上に発現されるCXCR4受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を、選択された対象に投与することを含む、方法。 - C1013G/CXCR4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に罹患している対象を治療するための方法であって、C1013G/CXCR4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞の表面上に発現されるCXCR4受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を、対象に投与することを含み、ここで、対象のワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞が、C−X−Cケモカイン受容体タイプ4(CXCR4)遺伝子中にC1013G変異を有すると決定されていることに基づいて、対象が選択されている、方法。
- ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞の表面上に発現されるC−X−Cケモカイン受容体タイプ4(CXCR4)受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分による治療のための、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症患者を選択するための方法であって、:
(a)前記患者におけるワルデンシュトレームマクログロブリン血症組織から得られた試験組織試料を任意に提供すること;
(b)ワルデンシュトレームマクログロブリン血症試験組織試料中の細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有するかどうかを評価すること;および
(c)ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞が、CXCR4遺伝子中にC1013G変異を有するという決定に基づいて治療のために患者を選択することを含む、方法。 - 抗CXCR4抗体またはその部分が、配列番号25に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域中のCDR1、CDR2およびCDR3ドメイン、ならびに配列番号29に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域中のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 抗CXCR4抗体またはその部分が、配列番号25に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号29に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 抗CXCR4抗体またはその部分が、配列番号1に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR1、配列番号5に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR2、配列番号9に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域CDR3、配列番号13に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域CDR1、配列番号17に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域CDR2、および配列番号21に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域CDR3を含む、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 対象におけるC1013G/CXCR4関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症を治療するためのキットであって:
(a)抗C−X−Cケモカイン受容体タイプ4(CXCR4)抗体もしくはその抗原結合部分の1以上の用量;および
(b)請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法において抗CXCR4抗体を使用するための指示書を含む、キット。 - 抗CXCR4抗体またはその抗原結合部分が、配列番号25に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域中のCDR1、CDR2およびCDR3ドメイン、ならびに配列番号29に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域中のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む、請求項13に記載のキット。
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