KR102029946B1 - 항-cd40 항체, 용도 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CD40에 대한 다가 결합 특이성을 갖는 항체(및 그의 단편, 변이체, 융합체, 및 유도체)로서, B 세포 활성에 대한 효능과 동일하거나 또는 그보다 더 높은 수지상 세포 활성에 대한 효능을 가지며, 상기 항체, 항원-결합 단편, 또는 이의 융합체, 변이체 또는 유도체는 1x10-10 M 미만의 CD40에 대한 친화도 (KD)를 갖고, 암과 같은 질병의 치료에 유용성을 갖는 것인 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그와 같은 항체를 포함하는 약학적 조성물, 용도, 방법 및 키트에 관한 것이다.

Description

항-CD40 항체, 용도 및 방법{Anti-CD40 antibodies, uses and methods}
본 발명은 개선된 친화도 및/또는 효능제(agonist) 효능을 보이는, CD40에 대한 결합 특이성을 갖는 항체-기반 폴리펩티드에 관한 것으로, 암과 같은 질병의 치료에 유용성을 갖는다. 본 발명은 또한 그와 같은 항체를 포함하는 약학적 조성물, 용도, 방법 및 키트에 관한 것이다.
암은 선진국에서 사망의 30% 이상을 차지한다. 큰 진전이 일부 종양(호지킨병, 일부 림프종/백혈병, 국부적 피부암(localized cutaneous cancer))의 치료에서 달성되었으나, 수술, 화학요법, 및 방사선요법과 같은 전통적 치료는 파종성 고형 종양을 치료하는 데는 종종 효과적이지 못하다.
암의 면역요법 (생물학적 요법과 동의어임)은 파종성 전이 종양 (disseminated metastatic tumours)을 포함한, 여러 상이한 종류의 암의 치료에 대해 유망한 전망을 갖는다 (Stagg et al., 2007, Immunol Rev. 220:82-101; Melief, 2008, Immunity , 29:372-383, Melero et al., 2007, Nat Rev Cancer , 7:95-106; Waldmann, 2006, Annu. Rev Med. 57:65-81; Khawli et al., 2008, Handb. Exp. Pharmacol. 181:291-328; Berinstein, 2007, Vaccine , 25 Suppl 2: B72-B88; Mellor & Munn, 2008, Nat Rev Immunol. 8:74-80). 면역요법은 암과 싸우고 종양 세포의 장기간 근절을 달성하기 위해 환자 자신의 면역 시스템을 채용하는 것을 목표로 한다.
암 면역요법에 대해 하기를 포함한, 여러 다른 접근이 개발되었다:
(1) 단일클론 항체 (Monoclonal antibody, Mab) 요법은 ⅰ) 네이키드(naked) 항체 또는 독소와 접합된 항체를 사용하여 (예를 들면 리툭시맵), 파괴를 위해 암 세포를 표적화하고; 및/또는 ⅱ) 성장 인자 수용체를 차단하고 (예를 들면 허셉틴); 및/또는 ⅲ) 면역계를 자극하기 위해 사용될 수 있다
(2) 종양 세포 백신 (자가(autologous) 또는 동종이계(allogeneic)), 항원성 백신 및 수지상 세포(dendritic cell, DC) 백신, DNA 백신, 및 벡터-기반 백신 (예를 들면 아데노바이러스-기반 유전자 전달)을 포함하는 암 백신.
(3) 면역계를 더 일반적으로 자극하는 것에 의해 작용하고, 그로 인해 종양 환경에 의해 억제된 종양-특이적 면역 세포를 활성화시키는 비-특이적 면역요법 및 보조제. 이것은 면역 효과기 세포(immune effector cells) (예를 들면　효과기 T 세포, 또는 Treg 세포)를 자극 또는 활성화하여 종양에 대한 면역 반응을 생성하거나 또는 억제 표현형을 갖는 세포를 억제 또는 비활성화시키는 것에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 접근은 면역-조절 수용체 (예를 들면 CTLA-4 및 CD40)을 표적으로 하는 사이토카인, 세균성 보조제(bacterial adjuvant)와 같은 활성분자 및 약물 (mAbs 포함)을 포함할 것이다. 추가적 접근은 입양 T 세포(adoptive T cell) 전달 및 Treg 고갈(Treg depletion)) 요법을 포함하는데, 이는 후자의 두 그룹 사이에 해당된다.
CD40은 종양 괴사 인자 수용체(tumour necrosis factor receptor, TNFR) 수퍼패밀리에 속하며, 면역계에서 중심 역할을 하는 세포-표면 발현 당단백질이다. B 세포, 수지상 세포, 단핵구, 및 대식세포와 같은, 다양한 면역 세포에서 발현된다. CD40을 통한 신호전달(signalling)이 일어나는 경우 전문적 항원 제시 세포 (antigen-presenting cells, APCs)가 활성화된다 (Schonbeck and Libby, 2001, Cell Mol Life Sci, 58(1): 4-43에서 검토됨).
CD154 또는 CD40L로 표기되는, CD40의 천연 리간드는 주로 성숙 T 림프구 상에서 발현된다 (Armitage et al., 1992, Nature, 357: 80-82; Schonbeck et al., 2001, Cell Mol Life Sci., 58,40-43; van Kooten et al., 2000, J. Leuk . Biol., 67: 2-17; Quezada et al., 2004, Annu. Rev. Immunol., 22:3077-328). CD40L-매개 신호전달은 면역 세포 활성화, 증식, 및 사이토카인 및 케모카인의 생산을 포함한, 여러 생물학적 사건을 일으킨다 (Schonbeck et al., 2001, Cell Mol Life Sci., 58:40-43; van Kooten et al., 2000, J. Leuk ., Biol., 67: 2-17).
CD40 신호전달은 T 세포-의존 및 B 세포-의존 면역 반응에 중요하고, 비-기능적 CD40 또는 CD40L을 갖는 환자들은 현저하게 면역 억제된다 (Foy et al., 1993, J Exp Med 5:1567-1575; Siepmann et al., 2001, Immunology 3:263-272; Allen et al ., 1993, Science, 259:990-993).　재조합 CD40L 또는 항-CD40 항체에 의한, 인간 B 세포 및 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포(antigen presenting cells)의 자극은 CD23, CD80, CD86, Fas 및 MHC II와 같은 표면 마커의 상향조절(up-regulation) 및 가용성 사이토카인, 예를 들면 IL-12, TNF-γ 및 TNF-α의 분비를 유도한다 (van Kooten et al ., 2000, J Leucoc Biol,67:2-17; Schonbeck et al., 2001, 앞에). 종양 환경(setting)에서, CD40-자극 수지상 세포는 종양 특이적 효과기 T 세포를 활성화시킬 수 있고, 이는 종양 세포를 근절시킬 잠재력을 갖는다 ((van Kooten et al ., 2000, J Leucoc Biol,67:2-17; Sotomayor et al., 1999, Nature Medicine, 5:780-787).
CD40 발현은 다수의 정상 세포 및 종양 세포에서 일어난다. 예를 들면, 모든 B-림프종 및 30% 내지 70%의 고형 종양은 CD40 발현을 갖는다. 흑색종 및 암종 (carcinoma)은 CD40 발현을 갖는 종양에 속한다. CD40의 활성화가 항-종양 반응을 일으키는데 효과적임이 확립되었다 (Tong et al., 2003, Cancer Gene Therapy, 10(1):1-13; Ottalano et al., 2002, Tumori, 88 (5):361-6). 종양 성장 장애에 기여하는 CD40 활성화의 효과는 적어도 종양-특이적 T 세포 반응을 생성하는 면역 활성화, CD40-양성 종양에 대한 직접적 세포사멸 효과, 및 ADCC를 가져오는 체액성 반응 자극의 메카니즘을 포함한다. CD40-활성화에 의한 항-종양 효과는 또한 CD40-음성 종양에서도 보고되었다 (Tutt et al., 2002, J Immunol., 168 (6):2720-8; van Mierlo et al., 2002, Proc Natl Acad Sci, USA, 99(8):5561-6). 여기서, 관찰된 종양 근절은 CTL, 종양-특이적 세포독성 T 림프구의 출현과 강력하게 연결되었다.
CD40 자극을 포함하는, 암 백신 보조제가 제안되었다. 전-임상 개념증명 (proof-of-concept)이 여러 암 형태에 대한 효능성(agonistic) CD40 항체에 대해 입증되었다. (Kalbashi et al., 2010, J Immunotherapy, 33:810-816; Loskog et al., 2009, Semin Immunology, 21:301-307; French et al., 1999, Nature Medicine, 548-553; Sotomayor et al., 1999, Nature Medicine, 5:780-787; Staveley et al., 2003, Nature Medicine, 171:697-707). 임상 시험은 또한 SGN-40 (부분적 및 약한 효능성 특성을 갖는 인간화 항체) 및 CP-870,893 (완전한 인간 및 선택적 CD40 효능성 단일클론 항체)을 포함한, 효능성 CD40 항체에 대해 수행되었다 (Khalil and Vonderheide, 2007, Update on Cancer Therapeutics, 2:61-65; Hussein et al., 2010, Haematologica, 95:845-848).
그러나, CD40-항체의 전신 투여(systemic administration)는 쇼크 증후군, 및 사이토카인 유리 증후군(cytokine release syndrome)과 같은 부작용과 연관되었다 (van Mierlo et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:5561-5566; van Mierlo et al., 2004, J Immunol 173:6753-6759).
전술한 내용을 고려해 볼때 , 개선된 항-종양 요법, 특히 임상 용도에 적합한 항- CD40 효능제 항체에 대한 요구가 존재한다.
제1 양태에서, 본 발명은 CD40에 대한 다가 결합 특이성을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 CD40에 대한 다가 결합 특이성을 유지하는, 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 변이체, 융합체 또는 유도체, 또는 상기 변이체 또는 그의 유도체의 융합체를 제공하고, 상기 항체, 항원-결합 단편, 또는 그의 융합체, 변이체 또는 유도체의 수지상 세포 활성화에 대한 효능(potency)은 B 세포 활성화에 대한 효능보다 더 크거나 또는 동일하고, 상기 항체, 항원-결합 단편, 또는 그의 융합체, 변이체 또는 유도체는 1x10-10 M (즉 0.1 nM) 미만의 CD40에 대한 친화도 (KD)를 갖는다.
대안적으로, 또는 추가로, 본 발명의 제1 양태는 CD40에 대한 다가 결합 특이성을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 CD40에 대한 다가 결합 특이성을 유지하는, 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 변이체, 융합체 또는 유도체, 또는 상기 변이체 또는 그의 유도체의 융합체로서, 상기 항체, 항원-결합 단편, 또는 그의 융합체, 변이체 또는 유도체는 (바람직하게는 인 비보에서) CD40+ 종양 세포에 이중 세포독성 효과를 가할 수 있다. "이중 세포독성 효과(dual cytotoxic effects)"에 의해 본 발명자들은 종양 세포에 대한 직접적 세포사멸(apoptotic) 효과 및 간접적 면역 세포-매개 세포 독성(예를 들면 ADCC) 효과를 포함시킨다.
"효능(potency)"에 의해, 수지상 세포 활성화 및 B 세포 활성화와 관련하여, 본 발명자들은 항체, 항원-결합 단편, 또는 그의 융합체, 변이체 또는 유도체에 의한 이와 같은 세포 활성화에 대한 EC50을 의미한다. 수지상 세포 활성화 및 B 세포 활성화에 대한 효능이 하기 실시예에서 기재된 방법을 포함하나 이에 의해 한정되지 않는, 상이한 방법에 의해 측정될 수 있다는 것이 당해 분야의 당업자들에 의해 이해될 것이다.
일 구체예에서, 수지상 세포 활성화는 FACS 분석에 의해 측정된 CD80의 발현의 자극에 대한 EC50의 참조에 의해 정의되며(실시예 4에서와 같이), B 세포 활성화는 B 세포 증식에 대한 EC50의 참조에 의해 정의된다(실시예 6에서와 같이).
화이자(Pfizer)에 의해 개발된 항-CD40 항체, CP-870,893은 수지상 세포의 활성화보다 B 세포 활성화에 대해 약 20 배 더 높은 효능을 갖는 것으로 알려져 있다 (Gladue et al., 2011, Cancer Immunol Immunotherapy (7), 1009-1017). 또한 CP-870,893에 의한 치료의 주요 약역학적 효과 중 하나는 말초 혈액 림프구 중에서 B 세포의 퍼센트의 빠른 감소라는 것이 입증되었다 (Vonderheide et al., 2007, Journal of Clinical Oncology 25, 7, 876-883). B 세포에 대한 효과는 수지상 세포를 활성화시키기에 불충분한 치료 용량에서 용량-제한 독성(dose-limiting toxicity)을 초래할 수 있다. 본 발명자들은 수지상 세포의 활성화가 B-세포의 활성화보다 더 큰 임상적 관련성이 있다고 믿는다. 암의 CD40 효능제 요법은 확고하게 T-세포 활성화와 연관되고 (French et al., 1999, Nature Medicine, 548-553; van Kooten et al ., 2000, J Leucoc Biol,67:2-17; Sotomayor et al., 1999, Nature Medicine, 5:780-787), 이러한 T-세포 활성화는 전문적 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포에 의존한다 (Melief et al., 2000, 75: 235-282).
본 발명자들은 수지상 세포를 활성화시키는 개선된 능력을 갖는 효능성 항-CD40 항체 클론을 개발하였다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 변이체, 융합체 및 이의 유도체는 B 세포 활성화에 대한 효능보다 높거나 또는 그와 동일한, 수지상 세포 활성화에 대한 효능을 갖는다. 또는, 다르게 말하면, 본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 변이체, 융합체 및 이의 유도체는 수지상 세포 활성화에 대한 효능보다 높거나 그와 동일한, 수지상 세포 활성화에 대한 효능보다 낮거나 그와 동일한 B 세포 활성화에 대한 효능을 가진다.
"결합 특이성(binding specificity)"에 의해 본 발명자들은 다른 폴리펩티드보다 CD40에 10배 이상 더 강하게, 바람직하게는 50 배 이상 더 강하게, 및 더욱 바람직하게는 100배 이상 더 강하게 결합하는 본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 변이체, 융합체 또는 이의 유도체의 능력을 포함시킨다. 바람직하게는, 본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 변이체, 융합체 또는 이의 유도체는 생리학적 조건 하에서 (예를 들면, 인 비보; 및 예를 들면, CD40이 세포 표면에 존재하는 경우) 선택적으로 CD40에 결합한다 .
"다가(multivalent)"에 의해 본 발명자들은 CD40에 대한 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함한 본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 변이체, 융합체 또는 이의 유도체를 포함시킨다. 예를 들면, 상기 항체는 두 개 세 개 또는 네 개 또는 다섯 개 또는 여섯 개 또는 그 이상의 그와 같은 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 항체는 온전한(intact), 이가(bivalent) IgG 항체이다.
CD40은 종양 괴사 인자 수용체 (tumour necrosis factor receptor, TNFR) 수퍼패밀리에 속하고, 면역 시스템에서 중요한 역할을 하는, 세포-표면에서 발현되는 당단백질이다. CD40은 CD40을 통한 신호전달이 일어날 경우 활성화되는, 다양한 B 세포, 수지상 세포, 단핵구, 및 대식세포와 같은 면역세포, 및 전문적 APC상에 발현된다 (Tasci et al., 2001, Cell. Mol. Life Sci., (58), 4-43 에 의해 검토됨). CD40 발현은 많은 정상 세포, 및 B-림프종, 고형 종양, 흑색종, 암종(carcinoma)과 같은 종양 세포에서 발생한다. CD40의 활성화가 항-종양 반응을 유발시키는데 효과적이며, CD40 활성화가 적어도 면역 활성화, CD40-양성 종양에 대한 직접 세포사멸 효과, 및 ADCC 및 CDC를 초래하는 체액성 반응의 자극의 기전에 의해 종양 성장 장애에 기여한다는 것이 확립되었다.
ADCC 및 CDC의 발생은 중쇄 불변 도메인에 의해 결정되는, 항체의 Fc-부분과 상호작용하는 숙주 면역계에 의존한다. 천연적으로 발생하는 불면 도메인 중에, 감마1(gamma1)이 가장 효과적으로 ADCC 및 CDC를 일으키는 이소형(isotype)이다.(Janeway's Immunobiology, 2008, 7th edition, Garland Science). 따라서, 본 발명의 항체에 대해 바람직한 Fc는 항-CD40 항체를 IgG1 이소형으로 만드는, 감마 1 Fc이다. 또한 Fc-조작(engineering) (점 돌연변이) 및 글리칸 변형과 같은 다수의 공지된 방법을 이용하여 이러한 효과를 추가로 강화시키는 것도 가능하다 (Carter, Nature Reviews Immunology, 2006 (6), 343-357에서 검토됨).
항체가 수지상 세포 및 B 세포에서 CD40을 활성화시키는 기전은 그것이 결합하는 CD40의 에피토프 및 수용체 다중체화(multimerization)에 의존한다. 본 발명의 예시적인 이가 항체(IgG1)에 의한 CD40 수용체의 이량체화(dimerization)는 그것의 효능성(agonistic) 효과에 유리하다.
"CD40"에 의해 본 발명자들은 본 명세서에서 정의된 인간 CD40 단백질 및/또는 그의 천연 변이체에 대한 구조적 및/또는 기능적 동일성을 갖는 자연적 또는 합성적 단백질을 포함시킨다.
바람직하게는 상기 CD40은 인간 CD40, 예를 들면 UniProt Accession No. P25942 및 GenBank Accession No. AAH12419이다.
그러나, CD40이 가축화(domesticated) 포유동물과 같은 포유동물 (바람직하게는 말, 돼지, 소, 양, 개 및 고양이를 포함한 농업적 또는 상업적으로 중요한 포유동물)로부터 유래한 것이라는 것은 당업자들에 의해 이해될 것이다. "포유동물 단백질(mammalian protein)" 에 의해 본 발명자들은 포유 동물의 하나 이상의 세포에서 발견되고, 그로부터 유래되고 및/또는 그로부터 단리된 단백질을 포함시킨다; 예를 들면, 용어 "인간 단백질(human portein)"은 인간의 하나 이상의 세포에서 발견되고, 그로부터 유래되고 및/또는 그로부터 단리된 단백질을 포함한다.
앞서 검토된 바와 같이, 본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 및 유도체는 B 세포 및 수지상 세포를 활성화시킬 수 있다.
전문적 APC(professional APC), 예를 들면 수지상 세포는 CD40을 통한 신호전달이 일어나는 경우 활성화되어, 면역 세포 활성화, 증식, 및 사이토카인 및 케모카인(chemokine)의 생산을 포함하는 여러 생물학적 사건을 일으킨다. CD40과 연관된 수지상 세포 활성화를 결정하는 방법이 당해 기술분야에 공지되어 있으며 (예를 들면, Schonbeck et al., 2001, Cell Mol Life Sci., 58:40-43; van Kooten et al., 2000, J. Leuk ., Biol., 67: 2-17 에서 기술됨), 동반한 실시예에 기재된다.
재조합 CD40L 또는 항-CD40 항체에 의한 인간 B 세포의 자극은 표면 마커, 예를 들면 CD23, CD30, CD80, CD86, Fas 및 MHC II의 상향-조절, 가용성 사이토카인의 분비, 예를 들면 IL-6, TNF-α 및 TNF-β의 분비 및 동형 응집(homeotypic aggregation)을 유발한다. CD40-관련 B 세포 활성화를 결정하는 방법이 당해 분야에 공지되어 있으며 (예를 들면, Schonbeck et al., 2001, supra 에서 기술됨) 동반한 실시예에 기재된다.
본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 및 유도체는 수지상 세포의 활성화에 대한 개선된 효능을 제공하기 위해 최적화되었다. 일 구체예에서, 수지상 세포의 활성화에 대한 효능은 B 세포의 활성화에 대한 효능 대비 선택적으로 증가된다.
수지상 세포 및 B 세포의 활성화에 대한 항체의 효능을 결정하는 방법 및 분석법은 당해 분야에 잘 알려져 있다.
예를 들면, 수지상 세포의 활성화는 CD86 및 CD80과 같은 세포 표면 마커의 상향조절을 측정하는 것에 의해 (실시예 3 참조) 및/또는 T 세포로부터 IFNγ의 항-CD40 항체-유도 분비를 측정하는 것(하기 실시예 4 참조)에 의해 평가될 수 있다.
유사하게, B 세포의 활성화는 세포 표면 마커들(예를 들면 CD86; Gladue et al., 2011, supra. 참조)의 상향조절을 측정하는 것에 의해 및/또는 항-CD40 항체-유도 B 세포 증식을 측정하는 것(하기 실시예 6 참조)에 의해 평가될 수 있다.
본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 변이체, 융합체 및 이의 유도체는 최소 B 세포를 활성화시키는 강도로 수지상 세포를 활성화시킨다 (예를 들면, 그 위의 CD80 및/또는 CD86의 상향조절의 측정에 의해 결정됨). 따라서, 본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 및 유도체는 B 세포 대비 수지상 세포의 활성화에 대해 두 배 더 높은 효능, 예를 들면 수지상 세포의 활성화에 대해 최소 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 그 이상의 효능을 가질 수 있다.
"항체(antibody)"에 의해 우리는 실질적으로 온전한 항체 분자, 및 키메라 항체, 인간화(humanized) 항체, 인간(human) 항체 (천연적으로 발생한 인간 항체 대비 하나 이상의 아미노산이 돌연변이된다), 단일 사슬 항체, 이중-특이성 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 호모다이머(homodimer) 및, 헤테로다이머(heterodimer), 및 항원 결합 단편 및 그의 유도체를 포함한다. 상기 용어는 또는 파지-디스플레이(phage-display) 기법 또는 분자들에 대한 기타 무작위 선별 기법을 사용하여 생산될 수 있는 항체-유사 분자를 포함한다. 상기 용어는 또한 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE를 포함한 또한 항체의 모든 종류(class)를 포함한다.
하기에서 추가로 기술된 바와 같이, 또한 본 발명에서는 항원-결합 부위를 유지하는, Fab, F(ab')2, Fv 및 기타 단편과 같은 항체 단편이다. 유사하게 용어 "항체(antibody)"는 단일 사슬 Fv 분자 (scFv) 및 단일 도메인 항체 (dAb) 와 같은 항체의 유전적으로 조작된(genetically-engineered) 유도체를 포함한다. 그와 같은 단편 및 유도체는 다중체화에 의해, CD40에 대한 다가로 만들어질 수 있고, 예를 들면 scFv-ScFv 또는 dAb-dAb 다이머(dimer)이다.
항체의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 도메인은 항원 인식에 포함되며, 이는 초기 프로테아제 분해 실험에 의해 최초로 인식된 사실이다. 추가 확인은 설치류(rodent) 항체의 "인간화(humanisatioin)"에 의해 발견되었다. 결과로 생긴 항체가 설치류 부모 항체의 항원 특이성(antigenic specificity)을 유지하도록 설치류 기원의 가변 도메인이 인간 기원의 불변 도메인과 융합될 수 있다 (Morrison et al (1984) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81, 6851-6855) .
본 발명은 그와 같은 변이체, 융합체 및 유도체가 CD40에 대한 결합 특이성 및 B 세포 활성화에 대한 효능보다 높거나 또는 그와 동일한, 수지상 세포 활성화에 대한 효능을 갖는 경우, 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편의 변이체, 융합체 및 유도체, 및 상기 변이체 또는 유도체의 융합체를 포함한다.
본 명세서에서 정의된 항체 및 항원-결합 단편은 하나 이상의 폴리펩티드 성분을 포함하므로, 항체 및 그의 항원-결합 단편의 적합한 변이체, 융합체 및 유도체는 재조합 폴리뉴클레오티드를 사용하는 기술분야에서 잘 알려진 단백질 유전공학(protein engineering) 및 위치 지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)의 방법을 이용하여 만들어질 수 있다 (실시예 참조, 참조에 의해 본 명세서에 포함된 Molecular Cloning : a Laboratory Manual, 3rd edition, Sambrook & Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press 참조).
따라서 본 명세서에 정의된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 변이체, 융합체, 및 유도체는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 폴리펩티드 성분에 기반하여 만들어질 수 있다.
"융합체(fusion)"에 의해 본 발명자들은 다른 폴리펩티드에 융합된 상기 폴리펩티드를 포함시킨다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하기 위해 글루타치온-S-트랜스퍼라제 (GST) 또는 단백질 A와 같은 폴리펩티드와 융합될 수 있다. 이와 같은 융합체의 예는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 유사하게, 상기 폴리펩티드는 His6와 같은 올리고-히스티딘 태그 또는 잘 알려진 Myc-태그 에피토프와 같은 항체에 의해 인식되는 에피토프와 융합될 수 있다. 상기 폴리펩티드의 변이체 또는 유도체의 융합체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
융합체는 상기 폴리펩티드에 원하는 특징을 부여하는 추가 부분을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다; 예를 들면, 상기 부분은 상기 폴리펩티드를 검출 또는 단리하거나 또는 상기 폴리펩티드의 세포 흡수를 증진시키는데 유용할 수 있다. 상기 부분은 예를 들면 바이오틴 모이어티, 방사성활성 모이어티, 형광 모이어티, 예를 들면, 당해 기술분야의 당업자들에게 잘 알려진, 작은 형광단 또는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)일 수 있다. 상기 모이어티는 당해 기술분야의 당업자들에게 공지된, 면역원성 태그, 예를 들면 Myc-태그일 수 있으며, 또는 당해 기술분야의 당업자들에게 공지된, 친유성(lipophilic) 분자 또는 폴리펩티드의 세포 흡수를 증진시킬 수 있는 폴리펩티드 도메인일 수 있다.
상기 폴리펩티드의 "변이체(variants)"에 의해 본 발명자들은 보존 또는 비보존적인, 삽입, 결실 및 치환을 포함시킨다. 특히 본 발명자들은 그와 같은 변화가 실질적으로 상기 폴리펩티드의 활성을 변경시키지 않는 폴리펩티드의 변이체를 포함시킨다. 변이체는 예를 들면, 주어진 서열로부터 단지 1개 또는 2개 또는 3개의 아미노산 잔기, 및 통상적으로 10개 또는 20개 이하의 아미노산 잔기에 의해 변하는 대립유전자 변이체를 포함할 수 있다. 통상적으로, 상기 변이체는 보존적 치환을 갖는다.
상기 폴리펩티드 변이체는 주어진 하나 이상의 아미노산 서열과 75% 이상의 동일성, 예를 들면 본 명세서에 명시된 하나 이상의 아미노산 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
예를 들면, 본 명세서에서 정의된 폴리펩티드의 변이체는 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 21; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 24; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 27; 및 서열번호 28; 서열번호 32; 서열번호 33; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 36; 서열번호 37; 서열번호 38; 및 서열번호 39를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 60% 이상의 동일성(identity)을 갖는 서열을 포함하는, 바람직하게는 상기 서열과 70% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 이상의 동일성, 및 더 바람직하게는 상기 서열과 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
퍼센트 동일성(percent identity)은 예를 들면 Expasy facility 사이트 (http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html)에서 LALIGN 프로그램 (Huang and Miller, Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357)에 의해 변수로 글로벌 얼라인먼트 옵션(global alignment option), 스코링 매트릭스(scoring matrix) BmOSUM62, 개시 갭 패널티(opening gap penalty) -14, 확장 갭 패널티(extending gap penalty) -4를 사용하여 결정될 수 있다. 대안적으로, 두 개의 폴리펩티드 사이의 퍼센트 서열 동일성은 적합한 컴퓨터 프로그램, 예를 들면 위스콘신 대학의 유전 컴퓨팅 그룹(Genetic Computing Group)의 GAP 프로그램을 이용하여 결정될 수 있으며, 퍼센트 동일성은 서열이 최적으로 정렬된 폴리펩티드와 비교하여 계산되는 것으로 이해될 것이다.
정렬은 대안적으로 Clustal W program을 사용하여 수행될 수 있다 (본 명세서에서 참고문헌으로 인용된, Thompson et al ., 1994, Nucl . Acid Res. 22:4673-4680 에 기재됨). 사용된 변수는 다음과 하기와 같을 수 있다:
-신속한 쌍 정렬(pair-wise alignment) 변수: K-tuple(word) 크기; 1, 윈도우 크기; 5, 갭 패널티(gap penalty); 3, 탑 다이애거널(top diagonal)의 수; 5. 스코링 방법: x 퍼센트
-다중 정렬 변수: 갭 오픈 페널티(gap open penalty); 10, 갭 연장 패널티(gap extension penalty); 0.05.
-스코링 매트릭스: BLOSUM.
대안적으로, BESTFIT 프로그램이 국소 서열 정렬을 결정하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체는 변형되거나 또는 유도체화된 하나 이상의 아미노산을 포함하거나 그로 구성될 수 있다.
하나 이상의 아미노산의 화학적 유도체는 작용성 측기(functional side group)와의 반응에 의해 달성될 수 있다. 그와 같은 유도체화된 분자는, 예를 들면, 유리 아미노기가 유도체화되어 아민 하이드로클로리드, p-톨루엔 술포닐기, 카르복시벤즈옥시기, t-부틸옥시카르보닐기, 클로로아세틸기 또는 포르밀기를 형성한 것인 분자를 포함한다. 유리 카르복실기는 유도체화되어 염, 메틸 및 에틸 에스테르 또는 기타 유형의 에스테르 및 하이드라지드를 형성할 수 있다. 유리 하이드록실기는 유도체화되어 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성할 수 있다. 또한 화학적 유도체로 포함되는 것은 20개의 표준 아미노산의 자연 발생적인 아미노산 유도체를 포함하는 펩티드이다. 예를 들면: 4-하이드록시프롤린이 프롤린을 치환할 수 있다; 5-하이드록시라이신이 라이신을 치환할 수 있으며; 3-메틸히스티딘이 히스티딘을 치환할 수 있고; 호모세린이 세린을 치환할 수 있고 오르니틴이 라이신을 치환할 수 있다. 또한, 유도체는 필요한 활성(requisite activity)이 유지되는 한 하나 이상의 첨가 또는 결실을 포함하는 펩티드를 포함한다. 기타의 포함되는 변형은 아미드화, 아미노 말단 아실화(amino terminal acylation) (예를 들면, 아세틸화 또는 티오글리콜산 아미드화), 말단 카르복실아미드화 (예를 들면, 암모니아 또는 메틸 아민에 의해), 및 기타 말단 변형이다.
추가로 펩티도미메틱 화합물도 유용할 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 용어 '펩티도미메틱(peptidomimetic)'은 치료제로서 특정 펩티드의 구조 및 바람직한 특징을 모방하는 화합물을 지칭한다.
예를 들면, 상기 폴리펩티드는 아미노산 잔기가 펩티드 (-CO-NH-) 결합에 의해 연결되어 있는 분자뿐 아니라 펩티드 결합이 역전되어 있는 분자를 포함한다. 그와 같은 레트로-인버스 펩티도미메틱(retro-inverso peptidomimetic)은 기술 분야에 알려져 있는 방법, 예를 들면, 본 명세서에 참조에 의해 포함되는 Meziere et al. (1997) J. Immunol . 159, 3230-3237에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 이 접근법은 백본(backbone)을 포함하나, 곁가지의 배향(orientation)은 포함하지 않는 변화를 포함하는 슈도펩티드(pseudo-peptide)를 제조하는 것을 포함한다. CO-NH 펩티드 결합 대신 NH-CO 결합을 포함하는 레트로-인버스 펩티드는 단백질분해에 대해 훨씬 더 저항성을 갖는다. 대안적으로, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 잔기가 통상적인 아미드 결합 대신 -y(CH2NH)- 결합에 의해 연결된 펩티도미메틱 화합물일 수 있다.
추가의 대안에서, 아미노산 잔기의 탄소 원자 간 간격을 유지하는 적절한 결합 모이어티가 이용된다면, 펩티드 결합은 완전히 생략될 수 있다; 결합 모이어티가 펩티드 결합과 실질적으로 동일한 전하 분포 및 실질적으로 동일한 평면성을 갖게 하는 것이 유리할 수 있다.
상기 폴리펩티드가 외부-단백질 분해(exo-proteolytic digestion)에 대한 민감성을 감소시키는 것을 돕기 위하여 그의 N- 또는 C-말단에서 알맞게 봉쇄될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
또한, D-아미노산 및 N-메틸 아미노산과 같은 여러 언-코딩(un-coded) 또는 변형 아미노산이 포유동물의 펩티드를 변형시키는데 이용되었다. 또한, 추정되는 생물학적 활성 구조(presumed bioactive conformation)는 고리화 반응과 같은 공유결합에 의한 변형(covalent modification)에 의해 또는 락탐 또는 기타 유형의 브릿지(bridge)의 통합(incorporation)에 의해 안정화될 수 있고, 예를 들면, 본 명세서에 참조에 의해 포함되는 Veber et al., 1978, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 75:2636 and Thursell et al., 1983, Biochem . Biophys . Res . Comm. 111:166을 참조한다.
다수의 합성 전략 중 공통된 주제는 일부 사이클릭 모이어티의 펩티드-기반 프레임워크로의 도입이었다. 사이클릭 모이어티는 펩티드 구조 중 입체 공간(conformational space)을 제한하고 이는 종종 특정 생물학적 수용체에 대한 펩티드의 증가된 특이성을 초래한다. 이 전략의 추가 이점은 사이클릭 모이어티의 펩티드로의 도입이 또한, 세포의 펩티다제에 대한 감소된 민감도를 갖는 펩티드를 생성할 수 있다는 것이다.
그러므로, 본 발명의 예시적인 폴리펩티드는 말단 시스테인 아미노산을 포함하거나 상기 아미노산으로 구성된다. 그와 같은 폴리펩티드는 말단 시스테인 아미노산에서 머캅티드기(mercaptide group)의 이황화 결합 형성에 의한 이종 고리 형태(heterodetic cyclic form), 또는 말단 아미노산 간의 아미드 펩티드 결합 형성에 의한 동조 형태(homodetic form)로 존재할 수 있다. 전술한 바와 같이, N-말단과 C-말단 시스테인 간의 이황화 결합 또는 아미드 결합을 통한 소형 펩티드의 고리화는, 단백질 분해를 감소시키고 또한, 구조의 경직성(rigidity)을 증가시킴으로써, 때때로 선형 펩티드에서 관찰되는 특이성과 반감기 문제를 피할 수 있고, 이는 보다 높은 특이성을 갖는 화합물을 생성할 수 있다. 이황화 결합에 의해 고리화된 폴리펩티드는, 여전히 단백질 분해에 민감할 수 있는 유리 아미노 말단과 카르복시 말단을 갖는 반면, N-말단 아민과 C-말단 카르복실 간 아미드 결합 형성에 의해 고리화된 펩티드는 따라서 더 이상 유리 아미노 말단 또는 카르복시 말단을 포함하지 않는다. 그러므로, 펩티드는 C-N 결합 또는 이황화 결합에 의해 연결될 수 있다.
본 발명은 펩티드의 고리화 방법에 의해 어떠한 방식으로도 한정되지 않으나, 적합한 합성 방법에 의해 달성될 수 있는 고리 구조를 갖는 펩티드를 포함한다. 그러므로, 이종 결합(heterodetic linkage)은 이황화, 알킬렌 또는 황화(sulphide) 브릿지를 통한 형성을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이황화, 황화 및 알킬렌 브릿지를 포함하는, 고리형 동종 펩티드 및 고리형 이종 펩티드의 합성 방법들이, US　5,643,872에 기술되어 있고, 이는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 고리화 방법에 대한 기타 예가 US　6,008,058에 논의되고 기술되며, 이는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
안정화된 고리형 펩티도미메틱 화합물의 합성에 대한 추가의 접근법은 폐환 상호교환 반응(ring-closing metathesis, RCM)이다. 이 방법은, 펩티드 전구체를 합성하는 단계 및 이를 RCM 촉매와 접촉시켜 입체형태적으로 제한된 펩티드(conformationally restricted peptide)를 생성하는 단계를 포함한다. 적합한 펩티드 전구체는 둘 이상의 불포화 C-C 결합을 포함할 수 있다. 상기 방법은 고상 펩티드 합성 기법(solid-phase-peptide-synthesis technique)을 이용하여 수행할 수 있다. 이 구체예에서, 고형 지지체에 고정된 전구체를 RCM 촉매와 접촉시킨 후 그 산물을 고형 지지체로부터 절단시켜 입체형태적으로 제한된 펩티드를 생성한다.
참조에 의해 본 명세서에 포함되는, Protease Inhibitors, Barrett and Selveson, eds., Elsevier (1986)에 D. H. Rich에 의해 개시된 다른 접근법은, 효소 억제제 설계에서 전이 상태 유사체 개념(transition state analogue concept)을 적용하여 펩티드 모방체를 설계하는 것이었다. 예를 들면, 스탈린(staline)의 2차 알코올은 펩신 기질의 절단되기 쉬운 아미드 결합의 사면체 전이 상태(tetrahedral transition state)를 모방하는 것으로 알려져 있다.
요약하면, 말단 변형은, 잘 알려진 바와 같이, 프로테나제 분해에 대한 감수성을 감소시키고, 따라서 용액, 특히 프로테아제가 존재할 수 있는 생물학적 유체에서 펩티드의 반감기를 연장시키는데 유용하다. 또한, 폴리펩티드의 고리화는 고리화에 의해 형성된 안정한 구조로 인해 및, 고리형 펩티드에 대해 관찰되는 생물학적 활성의 관점에서 유용한 변형이다.
따라서, 일 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 고리형이다. 그러나, 대안적인 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 선형이다.
바람직하게는, 항체, 항원-결합 단편, 변이체, 융합체 또는 이의 유도체는 공지된 항-CD40 항체 "B44" (그의 아미노산 서열이 하기 실시예 10에 표시됨)보다 수지상 세포 활성화에 대해 더 높은 효능을 갖는다.
B44 효능성(agonistic) 항체는 인간 항체 단편 디스플레이 라이브러리이고, BioInvent International AB (Soderlind et al., 2000, Nature Biotechnol., 18:852-6; WO 98/32845)의 소유물인 n-CoDeR®라이브러리로부터 기원한다. B44 항체는 1.7 nM의 중간 내지 낮은 친화도 상수 (KD), 및 인 비트로에서 결정된 중간(moderate) 효능을 갖는다 (Ellmark et al., 2002, Immunology, 106:456-463; Ellmark et al., 2008, AIDS Research and Human Retroviruses, 243, 367-372). B44 효능성 항체의 친화도 및 효능은 그것을 임상적으로 및 치료학적으로 적절한 항-CD40 효능제 항체로 부적합하게 만든다.
더 바람직하게는, 항체, 항원-결합 단편, 변이체, 융합체 또는 이의 유도체는 0.5 ㎍/ml 이상 (즉, EC50이 0.5 ㎍/ml 이하)의 수지상 세포 활성화에 대한 효능을 갖는다 (실시예 4에 기재된 바와 같이, EC50으로 측정됨). 예를 들면, 0.5 ㎍/ml 미만, 예를 들면, 0.4 ㎍/ml, 0.3 ㎍/ml, 0.2 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml 미만 또는 0.05 ㎍/ml 미만의 (실시예 4에서 측정된) CD80의 자극에 대한 EC50을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 항체, 항원-결합 단편,그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 B44 항체의 결합 친화도에 비해 CD40에 대한 개선된 결합 친화도를 갖는다.
항체 결합 특이성에 대해, 가장 보편적으로 지칭되는 동역학적 변수(kinetic parameter)는, 통상적으로 해리 상수 (KD)로 표현되는, 전체 친화도(overall affinity)이다. 이 정적 변수(static parameter)는 평형 상태에서 세포 수용체의 상대적 점유율(occupancy)을 반영하고 전신 투여와 관련된다. 그러나, 국소 투여 동안 항체는 국소 종양 부위로부터 누출될 수 있으며, 따라서 반응 시간이 제한된다. 그러므로, 높은 결합 속도(or-rate) (높은 ka)가 항체가 평형(equilibrium)에 도달하는데 걸리는 시간을 결정하므로, 국소 투여 동안 임상 효과에 있어서 매우 중요할 수 있다 (Katakura et al., Journal of Molecular Catalysis, (28), 191-200, 2004). 또한, 느린 해리 속도(off-rate) (낮은 kd)는 치료의 지속시간에 영향을 끼칠 수 있고, 항체가 종양 부위에 제한되도록 함으로써, 전신 노출 및 독성을 최소화시킬 수 있다.
전체 친화도 (KD) 및 상호작용 (예를 들면 항체 및 리간드 사이의 상호작용) 결합 속도 (ka) 및 해리 속도 (kd)를 측정하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 대표적인 인비트로 방법은 동반한 실시예에 기재된다. 또한 유세포 분석기(flow cytometry) 기반 방법들을 사용하는 것도 가능하다 (Sklar et al., Annu Rev Biophys Biomol Struct, (31), 97-119, 2002).
본 발명의 항체, 또는 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 1.0 x10-10 M 미만의 CD40에 대한 친화도, 예를 들면 9.0 x10-11 M, 8.0 x10-11 M, 7.0 x10-11 M, 6.0 x10-11 M, 5.0 x10-11 M, 4.0 x10-11 M, 3.0 x10-11 M, 2.0 x10-11 M 미만 또는 1.0 x10-11 M 미만의 KD를 갖는다.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 B44 항체의 결합 속도보다 더 높은 CD40에 대한 결합속도, 예를 들면 2.7 x106 Ms 초과의 결합속도 (ka), 및 바람직하게는 3.0 x 106 Ms; 또는 4.0 x 106 Ms; 또는 5.0 x 106 Ms; 또는 6.0 x 106 Ms; 또는 7.0 x 106 Ms; 또는 8.0 x 106 Ms; 또는 9.0 x 106 Ms; 또는 1.0 x 107 Ms 초과의 결합 속도 (ka)를 갖는다.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 B44 항체의 해리 속도보다 낮은 CD 40에 대한 낮은 해리 속도, 예를 들면 4.5 x10-3 s 미만의 해리 속도(kd), 및 바람직하게는 3.0 x 10-3 s; 또는 2.0 x 10-3 s; 또는 1.0 x 10-3 s; 또는 9.0 x 10-4 s; 또는 8.0 x 10-4 s; 또는 7.0 x 10-4 s; 또는 6.0 x 10-4 s; 또는 5.0 x 10-4 s; 또는 3.0 x 10-4 s; 또는 2.0 x 10-4 s; 또는 1.0 x 10-4 s; 또는 9.0 x 10-5 s; 또는 8.0 x 10-5 s; 또는 7.0 x 10-5 s; 또는 6.0 x 10-5 s; 또는 5.0 x 10-5 s; 또는 4.0 x 10-5 s; 또는 3.0 x 10-5 s; 또는 2.0 x 10-5 s; 또는 1.0 x 10-6 s 미만의 해리 속도를 갖는다.
일 바람직한 구체예에서, 상기 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 1.0 x10-10 M 내지 1x10-11 M 범위의 CD40에 대한 친화도 (KD) 및 2.7 x 106 내지 1 x 107 Ms 범위의 CD40에 대한 결합 속도 (ka)를 갖는다.
일반적으로, 본 발명은 세포 표면에 위치한 CD40에 대한 친화도를 갖는, 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 이의 변이체, 융합체 또는 유도체를 제공한다.
"세포 표면에 위치한 (localised on the surface of a cell)"에 의해 본 발명자들은 하나 이상의 CD40의 영역이 세포 표면의 외부면에 존재하도록 CD40이 세포와 결합된다는(associated) 의미를 포함시킨다. 예를 들면, CD40은 세포 원형질 막(plasma membrane)으로 삽입되고 (즉, 막관통단백질(transmembrane protein)로 배향됨), 하나 이상의 영역이 세포외 표면에 제시된다. 대안적으로, CD40은 공유적 및/또는 이온적 상호작용에 의해 세포 바깥쪽에 위치하여 세포 표면의 특정 영역 또는 영역들로 그것을 국소화시킬 수 있다.
따라서, "암 세포의 표면(surface of a cancer cell)"에 의해 본 발명자들은 CD40이 암 세포 또는 종양으로부터 유래하거나, 또는 암세포 또는 종양의 특징을 갖는 하나 이상의 세포에 대해 그와 같은 방식에 의해 위치된다는 의미를 포함시킨다.
일 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 온전한 항체를 포함하거나 또는 온전한 항체로 구성된다.
대안적으로, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 Fv　단편 (예를 들면 단일 사슬 Fv 단편, 또는 이황화 결합된 Fv 단편), 및 Fab-유사 단편 (예를 들면 Fab 단편; Fab' 단편 또는 F(ab)2 단편)으로 구성된 군으로부터 선택되는 항원-결합 단편을 포함하거나 그로 구성된다.
예를 들면, 상기 항원-결합 단편, 또는 이의 변이체, 융합체 또는 유도체는 scFv를 포함할 수 있다.
"ScFv 분자(ScFv molecules)"에 의해 본 발명자들은 VH 및 VL 파트너 도메인이 유연한(flexible) 올리고펩티드를 통해 연결되는 분자를 포함시킨다.
전체 항체가 아닌, 항체 단편을 사용하는 것의 잠재적 이점은 여러가지이다. 단편의 더 작은 크기는 표적 부위로의 더 우수한 투과와 같은, 개선된 약리학적 특성을 가져올 수 있다. 보체 결합과 같은, 전체 항체의 효과기 기능(effector functions)은 제거된다. Fab, Fv, ScFv 및 dAb 항체 단편은 모두 E. coli에서 발현되고 분비되어, 따라서 상기 단편의 많은 양의 용이한 생산을 가능하게 한다.
바람직하게는, 본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 재조합 분자이다.
상기 항체가 다중클론(polyclonal) 항체일 수 있으나, 그것이 단일클론 항체이거나, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체가 단일클론 항체로부터 유래하는 것이 바람직하다.
적합한 단일클론 항체는 공지된 기법, 예를 들면 "Monoclonal Antibodies ; A manual of techniques ", H Zola (CRC Press, 1988) 및 in "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application " SGR Hurrell (CRC Press, 1982)에 개시된 기법에 의해 제조될 수 있다. 다중-특이성 또는 단일-특이성인 다중클론 항체가 생산될 수 있다. 그들은 단일-특이성인 것이 바람직하다.
바람직하게는 상기 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 인간 유래(human)이거나 또는 인간화된 것이다.
항체는 본 명세서에서 정의된 CD40 단백질에 대한 특이성을 갖는 인간 항체의 아미노산 서열을 가진다는 의미에서 인간 항체일 수 있으나, 인간의 면역화를 필요로 하지 않는 분야에서 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, 항체 폴리펩티드는 인간 또는 비-인간(non-human) 세포주에서 생산될 수 있다. 대안적으로, 본질적으로 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 형질전환(transgenic) 마우스가 이용가능하다 (Vaughan et al (1998) Nature Biotechnol. 16, 535-539 참조.
적절하게 제조된 비-인간 항체는 공지된 방법으로, 예를 들면 인간 항체의 프레임워크 안으로 마우스 항체의 CDR 영역을 삽입하는 것에 의해 "인간화(humanised)" 될 수 있다.
키메라 항체(Chimeric antibodies)는 Neuberger et al (1998, 8 th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799)에 의해 논의되었다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합 특이성은 구성 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 내의 상보성 결정 영역(complementarity determining regions, CDRs)에 의해 부여된다는 것이 당해 기술분야의 당업자들에 의해 이해될 것이다. 하기에서 기술된 바와 같이, 본 명세서에서 정의된 항체 및 항원-결합 단편, 변이체, 융합체, 및 이의 유도체의 특히 바람직한 구체예에서, CD40에 대한 결합 특이성은 본 명세서에서 정의된 하나 이상의 CDR 아미노산 서열의 존재에 의해 부여된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "아미노산(amino acid)"은 표준 20개의 유전적으로 코딩되는 아미노산 및 (천연적인 'L' 형태 대비) 'D' 형태의 그들의 상응하는 입체이성질체, 오메가-아미노산, 기타 천연적으로-발생하는 아미노산, 비전형적인 아미노산 (예를 들면,α,α-이치환 아미노산, N-알킬 아미노산, 등) 및 화학적으로 유도체화된(derivatised) 아미노산(하기 참조)을 포함한다.
아미노산이 '알라닌' 또는 'Ala' 또는 'A'와 같이 특이적으로 나열되는 경우, 그 용어는 다른 언급이 없는 한, L-알라닌 및 D-알라닌 모두를 의미한다. 또한, 소정의 기능적 특성이 그 폴리펩타이드에 의해 유지되는 한, 기타 비전형적인 아미노산이 본 발명의 폴리펩타이드를 위한 적절한 구성성분이 될 수 있다. 표시된 펩타이드에 대해, 적절한 경우, 각 암호화된 아미노산 잔기는 통상적인 아미노산의 통속명칭에 해당하는 단일 문자 명칭으로 표기된다.
일 구체예에서, 본 명세서에서 정의된 폴리펩티드는 L-아미노산을 포함하거나 또는 L-아미노산으로 구성된다.
바람직한 구체예에서, 상기 항체, 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 CDR1이 하기의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 하기의 아미노산 서열로 구성되는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다:
CTGSX1SNIGAGYX2VY [서열번호 1]
여기서:
X1는 S 또는 T이고; 및
X2는 K 또는 H 또는 D 또는 G 또는 N이다.
바람직한 구체예에서, 상기 항체, 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 CDR2가 하기의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 하기의 아미노산 서열로 구성되는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다:
X3NINRPS [서열번호 2]
여기서:
X3는 G 또는 R이다.
바람직한 구체예에서, 상기 항체, 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 CDR3가 하기의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 하기의 아미노산 서열로 구성되는, 가변 경쇄 (VL)를 포함한다:
CAAWDX4X5X6X7GLX8 [서열번호 3]
여기서:
X4는 D 또는 S 또는 E 또는 G 또는 K이고; 및
X5는 S 또는 T 또는 G이고; 및
X6는 L 또는 S 또는 T 또는 L 또는 I이고; 및
X7는 S 또는 T 또는 L이고; 및
X8는 V 또는 L이다.
더 바람직하게는, 상기 항체, 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 CDR1이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 아미노산 서열로 구성되는, 가변 경쇄 (VL)를 포함한다:
CTGSTSNIGAGYKVY [서열번호 4]; 및
CTGSSSNIGAGYHVY [서열번호 5]; 및
CTGSSSNIGAGYKVY [서열번호 6]; 및
CTGSSSNIGAGYDVY [서열번호 7]; 및
CTGSSSNIGAGYGVY [서열번호 8]; 및
CTGSSSNIGAGYNVY [서열번호 9].
더 바람직하게는, 상기 항체, 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 CDR2가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 아미노산 서열로 구성되는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다:
GNINRPS [서열번호 10]; 및
RNINRPS [서열번호 11].
더 바람직하게는, 상기 항체, 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 CDR3가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 아미노산 서열로 구성되는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다:
CAAWDDSLSGLV [서열번호 12]; 및
CAAWDSSSSGLV [서열번호 13]; 및
CAAWDESITGLV [서열번호 14]; 및
CAAWDGSLLGLV [서열번호 15]; 및
CAAWDGTLTGLL [서열번호 16]; 및
CAAWDKSISGLV [서열번호 17]; 및
CAAWDGGLLGLV [서열번호 18].
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 하기의 CDR을 포함하는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다:
(ⅰ) 서열번호 1 및 서열번호 2 및 서열번호 3; 또는
(ⅱ) 서열번호 4 및 서열번호 10 및 서열번호 12; 또는
(ⅲ) 서열번호 5 및 서열번호 10 및 서열번호 13; 또는
(ⅳ) 서열번호 4 및 서열번호 10 및 서열번호 12; 또는
(ⅴ) 서열번호 6 및 서열번호 10 및 서열번호 14; 또는
(ⅵ) 서열번호 7 및 서열번호 11 및 서열번호 15; 또는
(ⅶ) 서열번호 8 및 서열번호 10 및 서열번호 16; 또는
(ⅷ) 서열번호 9 및 서열번호 10 및 서열번호 17; 또는
(ⅸ) 서열번호 9 및 서열번호 10 및 서열번호 12; 또는
(ⅹ) 서열번호 9 및 서열번호 10 및 서열번호 18.
훨씬 더 바람직한 구체예에서, 상기 항체, 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다:
서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 21; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 24; 서열번호 25; 서열번호 26; 및 서열번호 27.
일 구체예에서, 상기 항체, 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 불변 경쇄 (CL)를 포함한다.
또한 상기 항체, 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 CDR1이 하기의 아미노산 서열을 포함하거나 하기의 아미노산 서열로 구성된 가변 중쇄 (VH)를 포함하는 것이 바람직하다:
GFTFSTYGMH [서열번호 28]
또한 상기 항체, 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 CDR2가 하기의 아미노산 서열을 포함하거나 하기의 아미노산 서열로 구성된 가변 중쇄 (VH)를 포함하는 것이 바람직하다:
GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR [서열번호 29]
또한 상기 항체, 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 CDR3가 하기의 아미노산 서열을 포함하거나 하기의 아미노산 서열로 구성된 가변 중쇄 (VH)를 포함하는 것이 바람직하다:
CARILRGGSGMDL [서열번호 30].
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 상기 항체, 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 서열번호 28 및 서열번호 29 및 서열번호 30의 CDR을 포함하는 가변 중쇄 (VH)를 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체, 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH)를 포함한다:
서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 33; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 36; 서열번호 37; 서열번호 38; 및 서열번호 39.
일 구체예에서, 상기 항체, 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 불변 중쇄 (VH)를 포함한다.
상기 항체, 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 하기의 CDR을 포함하는 것이 특히 바람직하다:
(ⅰ) 서열번호 1 및 서열번호 2 및 서열번호 3 및 서열번호 28 및 서열번호 29 및 서열번호 30; 또는
(ⅱ) 서열번호 4 및 서열번호 10 및 서열번호 12 및 서열번호 28 및 서열번호 29 및 서열번호 30; 또는
(ⅲ) 서열번호 5 및 서열번호 10 및 서열번호 13 및 서열번호 28 및 서열번호 29 및 서열번호 30; 또는
(ⅳ) 서열번호 4 및 서열번호 10 및 서열번호 12 및 서열번호 28 및 서열번호 29 및 서열번호 30; 또는
(ⅴ) 서열번호 6 및 서열번호 10 및 서열번호 14 및 서열번호 28 및 서열번호 29 및 서열번호 30; 또는
(ⅵ) 서열번호 7 및 서열번호 11 및 서열번호 15 및 서열번호 28 및 서열번호 29 및 서열번호 30; 또는
(ⅶ) 서열번호 8 및 서열번호 10 및 서열번호 16 및 서열번호 28 및 서열번호 29 및 서열번호 30; 또는
(ⅷ) 서열번호 9 및 서열번호 10 및 서열번호 17 및 서열번호 28 및 서열번호 29 및 서열번호 30; 또는
(ⅸ) 서열번호 9 및 서열번호 10 및 서열번호 12 및 서열번호 28 및 서열번호 29 및 서열번호 30; 또는
(ⅹ) 서열번호 9 및 서열번호 10 및 서열번호 18 및 서열번호 28 및 서열번호 29 및 서열번호 30.
일 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 CD40 (바람직하게는, 인간 CD40)의 제1 도메인 (D1) 내의 에피토프에 결합한다 .
예를 들면, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 본 발명의 하나 이상의 예시적인 항체 (표 A 참조; 하기의 실시예에 기재됨)와 CD40으로의 결합에 대하여 경쟁할 수 있다:
표 A
본 발명의 예시적인 항체들 (가변 영역)
Figure 112014031458112-pct00001

따라서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 하나 이상의 본 발명의 예시적인 항체와 동일한 CD40 에피토프에 결합할 수 있다.
일 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 하나의 본 발명의 예시적인 항체 중 하나의 VL 과 VH 쌍을 포함한다 (표 A에 나타냄)
따라서, 특히 바람직한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 하기 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH)를 포함한다:
(ⅰ) 서열번호 19 및 서열번호 31; 또는
(ⅱ) 서열번호 20 및 서열번호 32; 또는
(ⅲ) 서열번호 21 및 서열번호 33; 또는
(ⅳ) 서열번호 22 및 서열번호 34; 또는
(ⅴ) 서열번호 23 및 서열번호 35; 또는
(ⅵ) 서열번호 24 및 서열번호 36; 또는
(ⅶ) 서열번호 25 및 서열번호 37; 또는
(ⅷ) 서열번호 26 및 서열번호 38; 또는
(ⅸ) 서열번호 27 및 서열번호 39.
바람직하게는, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 항체 Fc 영역을 포함한다. Fc 부분이 IgG 항체로부터, 또는 다른 항체의 클래스 (예를 들면 IgM, IgA, IgD 또는 IgE)로부터 유래할 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들면, 상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체로부터 유래할 수 있다. 그러나, 유리하게는, 상기 Fc 영역은 IgG1 항체로부터 유래한다.
FC 영역은 천연 발생일(naturally-occurring) 수 있거나 (예를 들면 내생적으로 (endogenously) 생산된 항체의 일부) 또는 인공적일 수 있다 (예를 들면 천연 발생 Fc 영역 대비 하나 이상의 점 돌연변이를 포함). 예를 들면 혈청 반감기를 변경 또는 ADCC 및 CDC에 관여하는 Fcγ수용체 (FcγR)로의 결합을 개선하는 것에 의해, FcR에 결합하는 능력을 개선하는 점 돌연변이를 갖는 Fc-영역은 유리할 수 있다. 특히, FcγRIIB로의 결합을 강화하는 돌연변이, 예를 들면 S267E (Strohl et al., 2009, Curr Opin Biotechnol, 20:685-691)는 FcγRIIB 결합과 CD40 항체의 기능적 활성 사이의 연결을 제공하여 본 발명에 이로울 수 있다 (Li et al., 2011, Science, 333: 1030-1034).
일 구체예에서, 상기 Fc-영역은 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 62의 아미노산 서열로 구성된다.
본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 이의 유도체는 IgG 분자이거나, 또는 IgG 분자의 항원-결합 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체인 것이 바람직하다. 특히 바람직한 IgG 서열의 아미노산 서열이 동반한 실시예에 기재된다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 직접적 및/또는 간접적 세포독성일 수 있는, 세포독성 모이어티를 더 포함한다.
"직접적 세포독성(directly cytotoxic)"에 의해 본 발명자들은 모이어티가 그 자체로 세포독성적이라는 의미를 포함시킨다. "간접적 세포독성(indirectly cytotoxic)"에 의해 본 발명자들은 모이어티가 비록 그 자체는 세포독성적이지 않으나, 예를 들면 추가 분자에 대한 그의 작용 또는 그에 대한 추가 작용에 의해, 세포독성을 유도할 수 있다는 의미를 포함시킨다.
알맞게는, 세포독성 모이어티는 세포 내인 경우 세포독성이며, 바람직하게는 세포 밖인 경우 세포독성이 아니다.
바람직하게는 본 발명은 세포독성 모이어티가 직접적 세포독성적 화학치료제인, 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체를 제공한다. 선택적으로, 세포독성 모이어티는 직접적 세포독성 폴리펩티드이다. 세포독성 치료제는 당해 기술분야에 잘 알져져 있다.
항암제와 같은 직접적 세포독성 화학치료제는 하기를 포함한다: 메클로레타민 (HN2), 시클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란 (L-사르콜리신(sarcolysin)) 및 클로람부실과 같은 질소 머스터드를 포함한 알킬화제; 헥사메틸멜라민, 티오테파(thiotepa)와 같은 엔틸렌이민 및 메틸멜라민; 부설판과 같은 알킬 설포네이트; 카르무스틴 (BCNU), 로무스틴 (CCNU), 세무스틴 (메틸-CCNU) 및 스트렙토조신 (스트렙토조토신)과 같은 니트로소우레아; 및 데카르바진 (DTIC: 디메틸트리아제노이미다졸-카복사마이드) 과 같은 트리아젠; 메토트렉세이트 (아메톱테린)와 같은 엽산 유사체를 포함한 항대사산물; 플루오로우라실 (5-플루오로우라실; 5-FU), 플록스우리딘 (플루오로데옥시우리딘: FUdR) 및 시타라빈 (사이토신 아라비노시드)와 같은 피리미딘 유사체; 및 메르캅토퓨린 (6-메르캅토퓨린: 6-MP), 티오구아닌 (6-티오구아닌; TG) 및 펜토스타틴 (2'-데옥시코포르마이신)과 같은 퓨린 유사체 및 관련 억제제; 빈블라스틴 (VLB) 및 빈크리스틴과 같은 빈카 알카로이드(vinca alkaloids)를 포함한 천연 산물; 에토포시드 및 테니포시드와 같은 에피포도필로톡신; 닥티노마이신 (악티노마이신 D), 다우노루비신 (다우노마이신; 루비도마이신), 독소루비신, 블레오마이신, 플리카마이신 (미트라마이신) 및 미토마이신 (미토마이신 C)과 같은 항생제; L-아스파라기나제와 같은 효소; 및 인터페론 알페놈(interferon alphenomes)과 같은 생체 반응 조절물질(biological response modifier); 시스플라틴 (cis-DDP) 및 카보플라틴과 같은 백금 배위 화합물(platinum coordination complexe)을 포함한 기타 제제; 미톡산트론(mitoxantrone) 및 안트라사이클린과 같은 안트라세네디온(anthracenedione); 히드록시우레아와 같은 치환 우레아; 프로카르바진 (N-메틸하이드라진, MIH)과 같은 메틸 하이드라진 유도체; 및 미토탄(mitotane) (o, p' -DDD) 및 아미노글루테티미드(aminoglutethimide)와 같은 부신피질 억제제; 탁솔 및 유사체/유도체; 및 플루타미드 및 타목시펜과 같은 호르몬 효능제/길항제.
다양한 이러한 작용제는 이전에 항체 및 다른 표적 부위-전달제에 부착되어 왔으며, 따라서 이러한 작용제를 포함하는 본 발명의 항체는 당해 분야의 당업자들에 의해 쉽게 만들어질 수 있다. 예를 들면, 카르보디이미드 접합 (Bauminger & Wilchek (1980) Methods Enzymol . 70, 151-159; 참조에 의해 본 명세서에 포함됨)은 독소루비신을 포함한 다양한 작용제를 항체 또는 펩티드로 접합시키는데 사용될 수 있다.
카르보디이미드는 R1 및 R2는 지방족 또는 방향족일 수 있는 것인, 일반식 R1-N=C=N-R2을 갖는 화합물의 그룹을 포함하고, 펩티드 결합의 합성을 위해 사용된다. 제조 방법은 단순하고, 비교적 빠르며, 온화한 조건 하에서 수행된다. 카르보디이미드 화합물은 카르복실기를 공격하여 유리 아미노기를 위한 반응 부위로 변경시킨다.
수용성 카르보디이미드, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC)는 특히 기능적 모이어티를 결합 모이어티에 접합하는데 유용하며, 종양 추적 펩티드(tumour homing peptide)로 독소루비신을 접합하는데 이용될 수 있다. 독소루비신 및 결합 모이어티의 접합은 독소루비신에 의해 제공되는 아미노기 및 항체에 의해 제공되는 카르복실기의 존재를 필요로 한다.
펩티드 결합의 직접 형성을 위해 카르보디이미드를 사용하는 것 이외에, EDC는 또한 N-히드록시석신이미드 (NHS) 에스테르와 같은 활성 에스테르(active esters)를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 아미노기에만 결합하는 NHS 에스테르는, 그 후 독소루비신의 단일 아미노기와의 아미드 결합의 형성을 유도하기 위해 이용될 수 있다. 조합된 EDC와 NHS의 사용은 접합체(conjugate)의 형성 수율을 증가시키기 위해 일반적으로 접합(conjugation)을 위해 이용된다 (Bauminger & Wilchek, supra, 1980).
항체에 세포독성 모이어티를 접합하는 다른 방법이 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, 글루타르알데히드 가교 형성(cross-linking)이 사용될 수 있는 것처럼, 소듐 페리오데이트 산화 및 뒤이은 적절한 반응물의 환원 알킬화가 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명의 접합체를 생산하는 방법의 선택과 관계없이, 항체가 그것의 표적화 능력을 유지하고 기능적 모이어티가 그것의 연관 기능을 유지한다는 결정이 있어야 하는 것으로 인정된다.
본 발명의 일 구체예에서, 세포독성 모이어티는 세포독성 펩티드 또는 폴리펩티드 모이어티이고, 본 발명자들은 이에 세포 사망을 초래하는 모이어티를 포함시시킨다. 세포독성 펩티드 또는 폴리펩티드 모이어티는 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 리신(ricin), 아브린, 슈도모나스 엑소톡신(Pseudomonas exotoxin), 조직 인자 등을 포함한다. 항체와 같은 표적화 모이어티와 그들을 연결하는 방법도 당해 분야에 공지되어 있다. 세포독성제로서 리신의 용도는 본 명세서에 의해 포함된, Burrows & Thorpe (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90, 8996-9000 에 기재되며, 국부적 혈액 응고 및 종양의 경색(infarction of a tumour)을 초래하는 조직 인자의 용도는 Ran et al (1998) Cancer Res . 58, 4646-4653및 Huang et al (1997) Science 275, 547-550에 기재되었다. Tsai et al (1995) Dis . Colon Rectum 38, 1067-1074 은 단일 클론 항체에 접합된 아브린 A 사슬을 기재하며, 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 기타 리보솜 불활성화 단백질이 WO 96/06641에서 세포독성제로 기재된다. 슈도모나스 엑소톡신은 또한 세포독성 폴리펩티드 모이어티로 이용될 수 있다 (예를 들면, Aiello et al (1995) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 92, 10457-10461 참조; 본 명세서에 참조에 의해 포함됨).
TNFα 및 IL-2와 같은 일부 사이토카인이 또한 세포독성제로 이용될 수 있다.
일부 방사성 원자는 충분한 용량으로 전달될 경우 또한 세포독성일 수 있다. 따라서 세포독성 모이어티는 사용에 있어서, 세포독성이 되도록 충분한 양의 방사능을 표적 부위로 전달하는 방사성 원자를 포함할 수 있다. 적합한 방사성 원자는 인-32, 요오드-125, 요오드-131, 인듐-111, 레늄-186, 레늄-188 또는 이트륨-90, 또는 인접 세포, 기관 또는 핵산을 파괴하도록 충분한 에너지를 방출하는 기타 동위원소를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 작용제(agent) 중 동위원소 및 방사성 원자의 농도는 4000 cGy 이상 (바람직하게는 6000, 8000 또는 10000 cGy 이상)의 용량이 표적 부위, 바람직하게는 표적 부위의 세포 및 그의 세포 기관, 특히 핵으로 전달되는 것이다.
방사성 원자는 공지된 방식으로 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체에 부착될 수 있다. 예를 들면, EDTA 또는 다른 킬레이트제가 결합 모이어티에 부착될 수 있으며 111In 또는 90Y를 부착하는데 사용될 수 있다. 티로신 잔기가 직접 125I 또는 131I로 표지될 수 있다..
세포독성 모이어티는 적합한 간접-세포독성 폴리펩티드일 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 간접 세포독성 폴리펩티드는 효소 활성을 가지며, 비-독성 및/또는 상대적 비-독성 전구약물을 세포독성 약물로 전환시킬 수 있는 폴리펩티드이다. 항체의 경우, 이러한 유형의 시스템은 종종 ADEPT ((항체-지시 효소 전구약물 요법(Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy))로 지칭된다. 상기 시스템은 항체가 효소 부분(enzymatic portion)을 환자의 몸 안의 원하는 부위로 위치시키고 효소가 그 부위에 국재화되는 시간을 허용한 후, 효소에 대한 기질인 전구약물을 투여하며, 촉매 작용의 최종 산물이 세포독성 화합물이 되는 것을 요구한다. 상기 시도의 목적은 원하는 부위에서 약물의 농도를 최대화하고 정상 조직에서는 약물의 농도를 최소화하는 것이다 (Senter, P.D. et al (1988) "Anti-tumour effects of antibody-alkaline phosphatase conjugates in combination with etoposide phosphate" Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85, 4842-4846; Bagshawe (1987) Br . J. Cancer 56, 531-2; 및 Bagshawe, K.D. et al (1988) "A cytotoxic agent can be generated selectively at cancer sites" Br . J. Cancer . 58, 700-703. 참조)
바람직한 구체예에서, 세포독성 모이어티는 비-독성 전구약물을 세포독성 약물로 전환시킬 수 있다.
본 명세서에 기재된 표적화 효소를 이용한 시스템의 효소 및 전구약물은 이전에 제안된 것들일 수 있다. 세포독성 물질은 알킬화제와 같은 기존의 항암 약물; DNA에 인터칼레이션(intercalate)되는 작용제; 디히드로폴레이트 리덕타제, 티미딘 합성효소(synthetase), 리보뉴클레오티드 리덕타제, 뉴클레오시드 키나제 또는 토포이소머라제와 같은 일부 주요 효소(key enzyme)를 억제하는 작용제; 또는 다른 세포 구성물과 상호작용하는 것에 의해 세포 사망을 가져오는 작용제일 수 있다. 에토포시드는 토포이소머라제 억제제의 예이다.
보고된 전구약물 시스템은 다음을 포함한다: E. coli β-글루쿠로니다제에 의해 활성화되는 페놀 머스타드(phenol mustard) 전구약물 (Wang et al, 1992 and Roffler et al, 1991); 인간 β- 글루쿠로니다제에 의해 활성화되는 독소루비신 전구약물 (Bosslet et al, 1994); 커피 콩 α-갈락토시다제에 의해 활성화되는 다른 독소루비신 전구약물 (Azoulay et al, 1995); 커피 콩 α-D-갈락토시다제에 의해 활성화되는, 다우노루비신 전구약물 (Gesson et al, 1994); E. coli β-D-갈락토시다제에 의해 활성화되는 5-플루오로우리딘 전구약물 (Abraham et al, 1994); 및 카르복시펩티다제 A에 의해 활성화되는 메토트렉세이트 전구약물 (예를 들면 메토트렉세이트-알라닌) (Kuefner et al, 1990, Vitols et al, 1992 및 Vitols et al, 1995). 이들 및 기타 다른 것들이 하기 표 B에 포함된다.
표 B
Figure 112014031458112-pct00002

표 A는 이러한 다양한 시스템에 대한 완전한 참조(full references)가 얻어질 수 있는, Bagshawe (1995) Drug Dev. Res. 34, 220-230 로부터 개작된다; 탁솔 유도체는 Rodrigues, M.L. et al (1995) Chemistry & Biology 2, 223 에 기재된다.
효소 부위의 일부를 형성하는 적합한 효소는 다음을 포함한다: 카르복시펩티다제 G, G1 및 G2 (글루타밀화 머스터드 전구약물의 경우), 카르복시펩티다제 A 및 B (MTX-기반 전구약물의 경우) 및 아미노펩티다제 (2-α 아미노아실 MTC 전구약물의 경우)와 같은 엑소펩티다제; 엔도펩티다제, 예를 들면 트롬볼리신(thrombolysin) (트롬빈 전구약물의 경우); 가수분해효소(hydrolases), 예를 들면, 포스파타제 (예를 들면 알칼라인 포스파타제) 또는 설파타제 (예를 들면 아릴 설파타제) (인산화된(phosphylated) 또는 황산화된(sulphated) 전구약물의 경우); 아미다제, 예를 들면 페니실린 아미다제 및 아릴아실 아미다제; β-락타마제와 같은, 락타마제; 글리코시다제, 예를 들면 β-글루쿠로니다제 (β-글루쿠로노미드 안트라사이클린(glucuronomide anthracyclines)의 경우), α-갈락토시다제 (아미그달린의 경우) 및 β-갈락토시다제 (β-갈락토스 안트라사이클린의 경우); 디아미나제, 예를 들면, 사이토신 디아미나제 (5FC의 경우); 키나제, 예를 들면 우로키나제 및 티미딘 키나제 (간시클로비르의 경우); 리덕타제, 예를 들면, 니트로리덕타제 (CB1954 및 유사체의 경우), 아조리덕타제(azoreductase) (아조벤젠 머스터드의 경우) 및 DT-디아포라제 (CB1954의 경우); 옥시다제, 예를 들면, 글루코스 옥시다제 (글루코스의 경우), 잔틴 옥시다제 (잔틴의 경우) 및 락토퍼옥시다제; DL-라세마제, 촉매 항체(catalytic antibodies) 및 시클로덱스트린.
바람직하게는 전구약물은 세포독성 약물과 비교하여 상대적으로 비-독성이다. 일반적으로 전구약물은 인 비트로 세포독성 시험에서 적합한 것으로 측정된 독성의 10% 미만, 바람직하게는 1% 미만의 독성을 갖는다.
전구약물을 세포독성 약물로 전환시킬 수 있는 모이어티는 본 발명의 작용제의 나머지로부터의 단리(isolation)시 활성일 것으로 보이나, (a) 본 발명의 나머지 작용제와 조합된 경우 및 (b) 본 발명의 작용제가 표적 세포에 부착되거나, 그에 인접하거나, 또는 표적 세포 내로 내화된(internalised) 경우에만, 그것이 활성화되는 것이 필요하다.
각 모이어티가 폴리펩티드인 경우, 두 개의 부분이 O'Sullivan et al (1979) Anal. Biochem. 100, 100-108에 일반적으로 기재된 바와 같은, 폴리펩티드를 가교시키는 종래 방법에 의해 함께 연결될 수 있다. 예를 들면, 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 티올기로 강화(enrich)될 수 있으며, 추가 모이어티는 티올기와 반응할 수 있는 이작용성(bifunctional) 작용제, 예를 들면 요오드 아세트산의 N-히드록시석신이미드 에스테르 (N-hydroxysuccinimide ester of iodoacetic acid, NHIA) 또는 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP)와 반응한다. 아미드 및 티오에테르 결합, 예를 들면 m-말레이미도벤조일-N-히드록시석신이미드 에스테르에 의해 수득된, 아미드 및 티오에테르 결합은 이황화 결합보다 인 비보에서 일반적으로 더 안정하다.
대안적으로, 상기 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 DNA의 길이가 서로 인접하거나 또는 작용제의 원하는 특징을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리된, 본 발명의 제제의 두개의 모이어티를 코딩하는 대표적인 영역을 포함하게 되는 것인 재조합 DNA 기법에 의해 융합 화합물로 생산될 수 있다. 이로써 생각할 수 있는 바로는, 상기 제제의 두 부분이 전체적으로 또는 부분적으로 겹쳐질 수 있다.
세포독성 모이어티는 방사성민감제(radiosensitizer)일 수 있다. 방사성민감제는 플루오로피리미딘, 티미딘 유사체, 히드록시우레아, 젬시타빈, 플루다라빈, 니코틴아미드, 할로겐화 피리미딘, 3-아미노벤즈아미드, 3-아미노벤조디아미드, 에타닉사돌(etanixadole), 피모니다졸 및 미소니다졸을 포함한다 (예를 들면, McGinn et al (1996) J. Natl. Cancer Inst. 88, 1193-11203; Shewach & Lawrence (1996) Invest. New Drugs 14, 257-263; Horsman (1995) Acta Oncol. 34, 571-587; Shenoy & Singh (1992) Clin . Invest . 10, 533-551; Mitchell et al (1989) Int . J. Radiat . Biol. 56, 827-836; Iliakis & Kurtzman (1989) Int . J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16, 1235-1241; Brown (1989) Int . J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16, 987-993; Brown (1985) Cancer 55, 2222-2228 참조).
또한, 세포 내로의 유전자의 전달, 예를 들면 p53 유전자 또는 사이클린 D의 전달은 세포를 방사선에 민감화시킬 수 있다 (Lang et al (1998) J. Neurosurg . 89, 125-132; Coco Martin et al (1999) Cancer Res. 59, 1134-1140).
추가 모이어티는 방사선 조사시, 세포독성이 되거나 또는 세포독성 모이어티를 방출하는 것일 수 있다. 예를 들면, 붕소-10 동위원소는, 적당하게 조사될 경우, 세포독성인 α 입자를 방출한다 (예를 들면, Goldenberg의 US 4,348,376; Primus et al (1996) Bioconjug. Chem. 7, 532-535 참조).
유사하게, 세포독성 모이어티는 포토프린(photofrin)과 같은 광역동 요법에 유용한 것일 수 있다 (예를 들면, Dougherty et al (1998) J. Natl . Cancer Inst. 90, 889-905 참조).
추가 모이어티는 직접적 또는 간접적 세포독성인 핵산 분자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 핵산 분자는 표적 부위에서의 국소화 후, 세포로 들어가서, 그들의 사망을 초래할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 그러므로, 상기 올리고뉴클레오티드는 필수 유전자의 발현을 방지하는 것 또는 세포사멸을 야기하는 유전자 발현에서의 변화를 초래하는 것일 수 있다. 대안적으로, 세포독성 모이어티는 직접적 및/또는 간접적 세포독성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자이다.
적합한 올리고뉴클레오티드의 예는 bcl-2 (Ziegler et al (1997) J. Natl . Cancer Inst. 89, 1027-1036), 및 DNA 폴리머라제 α 및 토포이소머라제 IIα (Lee et al (1996) Anticancer Res. 16, 1805-1811)에 대한 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
펩티드 핵산이 종래 핵산을 대신해서 유용할 수 있다 (Knudsen & Nielsen (1997) Anticancer Drugs 8, 113-118 참조).
추가 구체예에서, 상기 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 표적으로 핵산을 전달하기 위한 전달 비히클 내에 포함될 수 있다. 상기 전달 비히클은 적합한 전달 비히클일 수 있다. 그것은 예를 들면, 핵산을 포함하는 리포좀일 수 있거나, 또는 핵산을 전달할 수 있는 바이러스 또는 바이러스 유사 입자일 수 있다. 이러한 경우, 전달되는 분자는 통상적으로 전달 비히클의 표면에 존재한다. 예를 들면, 적합한 항체 단편이 리포좀 외부 표면에 존재할 수 있고 전달되는 핵산은 리포좀 내부에 존재할 수 있다. 다른 예로, 레트로바이러스(retroviral) 또는 아데노바이러스(adenoviral) 벡터와 같은 바이러스 벡터(viral vector)는 결합 모이어티가 바이러스 입자의 표면에 부착되거나 또는 상기 표면에 위치하도록 조작되고, 따라서 바이러스 입자가 원하는 부위로 표적화되는 것을 가능하게 한다. WO 94/10323에 기재된 변형된 아데노바이러스 시스템과 같은 표적화 전달 시스템이 또한 공지되었으며, WO 94/10323에서, 일반적으로, DNA는 아데노바이러스 입자, 또는 아데노바이러스-유사 입자 내에 운반된다. Michael et al (1995) Gene Therapy 2, 660-668은 파이버 단백질(fibre protein)에 세포-선택적 모이어티를 추가하기 위한 아데노바이러스 변형을 기재한다. 표적화 레트로바이러스는 또한 본 발명에서의 용도를 위해 이용가능하다; 예를 들면, 특이적 결합 친화도를 부여하는 서열이 이미 존재하는 바이러스 env 유전자 내로 조작될 수 있다 (유전자 요법을 위한 이들 및 기타 표적화 벡터의 검토를 위하여 Miller & Vile (1995) Faseb J. 9, 190-199 참조).
면역리포좀(Immunoliposomes) (항체-지시(antibody-directed) 리포좀)이 이용될 수 있다. 면역-리포좀의 제조를 위해, MPB-PE (N-[4-(p-말레이미도페닐)-부티릴]-포스파티딜에탄올-아민)이 Martin & Papahadjopoulos (1982) J. Biol . Chem . 257, 286-288 의 방법에 따라 합성된다. MPB-PE가 리포좀 표면과 항체 또는 그의 단편의 공유 결합에 의한 커플링(covalent coupling)을 허용하기 위해 리포좀의 이중층(liposomal bilayer)으로 혼입된다. 예를 들면 DNA 또는 다른 유전적 구조물의 용액 안에서 상기 리포좀을 형성하고 뒤이어 0.8 MPa까지의 질소 압력에서 0.6㎛ 및 0.2㎛ 세공(pore) 크기를 갖는 폴리카보네이트 막 필터를 통한 순차적 압출에 의해, 알맞게 표적 세포로 전달을 위한 DNA 또는 기타 유전적 구조물을 리포좀에 적재(load)한다. 압출 후, 포획된 DNA 구조물을 80 000 x g에서 45분 동안 초원심분리(ultracentrifugation)에 의해 유리 DNA 구조물로부터 분리한다. 산소 제거된 버퍼 중 신선하게 제조된 MPB-PE-리포좀을 신선하게 제조된 항체 (또는 그의 단편)와 혼합하고, 커플링 반응을 밤새 일정한 엔드오버 엔드 로테이션(end over end rotation)하에 4℃ 질소 분위기에서 수행한다. 면역리포좀을 80 000 x g에서 45분 동안 초원심분리에 의해 접합되지 않은 항체로부터 분리한다. 면역리포좀은 복강내로 또는 직접 종양으로 주입될 수 있다.
표적 부위로 전달된 핵산은 직접적 또는 간접적으로 세포독성을 유발하는 적합한 DNA일 수 있다. 예를 들면, 핵산은 세포에 세포독성인 리보자임(ribozyme)을 코딩할 수 있거나, 또는 실질적으로 비-독성 전구약물을 세포독성 약물로 전환시킬 수 있는 효소를 코딩할 수 있다 (이러한 후자 시스템은 때때로 GDEPT (Gene Directed Enzyme Prodrug Therapy)로 지칭된다).
표적으로 전달되는 핵산에 코딩될 수 있는 리보자임은 본 명세서에 참조에 의해 모두 포함된 Cech and Herschlag "Site-specific cleavage of single stranded DNA" US 5,180,818; Altman et al "Cleavage of targeted RNA by RNAse P" US 5,168,053, Cantin et al "Ribozyme cleavage of HIV-1 RNA" US 5,149,796; Cech et al "RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods", US 5,116,742; Been et al "RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endonucleases and methods", US 5,093,246; 및 Been et al "RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods; cleaves single-stranded RNA at specific site by transesterification", US 4,987,071에 기재된다. 리보자임을 위한 적합한 표적은 c-fos 및 c-myc, 및 bcl-2와 같은 전사 인자(transcription factor)를 포함한다. Durai et al (1997) Anticancer Res. 17, 3307-3312는 bcl-2에 대한 해머헤드 리보자임(hammerhead ribozyme)을 기재한다.
EP 0 415 731는 GDEPT 시스템을 기재한다. 효소 및 전구약물의 선택에 관한 유사한 고려가 전술된 ADEPT 시스템에서와 같이 GDEPT 시스템에 적용된다.
표적 부위로 전달되는 핵산은 직접적 세포독성 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
대안적으로, 추가 모이어티는 직접적 또는 간접적 세포독성이 아니나, 치료적 이익이 있는 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 그와 같은 폴리펩티드의 예는 의약에서, 예를 들면 암의 치료에 유용할 수 있는, 항-증식성 또는 항-염증성 사이토카인, 및 항-증식성, 면역조절성 또는 혈액 응고에 영향을 미치는 인자를 포함한다.
추가 모이어티는 유용하게 펩티드 안지오스타틴 또는 엔도스타틴과 같은 혈관신생(angiogenesis)의 억제제일 수 있다. 추가 모이어티는 또한 유용하게 전구 폴리펩티드(precursor polypeptide)를 안지오스타틴 또는 엔도스타틴으로 전환하는 효소일 수 있다. 대식 세포 엘라스타제, 젤라티나제 및 스트로몰리신(stromolysin)과 같은 인간 매트릭스 메탈로-프로테아제(Human matrix metallo-proteases)는 플라스미노겐을 안지오스타틴으로 전환한다 (Cornelius et al (1998) J. Immunol. 161, 6845-6852). 플라스미노겐은 안지오스타틴의 전구체이다.
일 구체예에서, 상기 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 방사성 원자, 예를 들면 하기로 구성된 군으로부터 선택된 방사성 원자를 포함하는 세포독성 모이어티를 포함한다: 인-32; 요오드-125; 요오드-131; 인듐-111; 레늄-186; 레늄-188; 이트륨-90.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 쉽게 검출가능한 모이어티를 더 포함하는, 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체를 제공한다.
"쉽게 검출가능한 모이어티(readily detectable moiety)"에 의해 본 발명자들은 환자에게 본 발명의 작용제의 투여 후 표적 부위에 위치된 경우, 일반적으로 신체 외부에서 및 위치된 표적 부위로부터 비-침습적으로 검출될 수 있는 모이어티라는 의미를 포함시킨다. 따라서 본 발명의 이 구체예의 작용제는 이미징 및 진단에 유용하다.
통상적으로, 쉽게 검출가능한 모이어티는 이미징에 유용한 방사성 원자이거나 방사성 원자를 포함한다. 적합한 방사성 원자는 신티그래프(scintigraphic) 연구를 위한 99 mTc 및 123I를 포함한다. 기타 쉽게 검출가능한 모이어티는 예를 들면, 123I, 131I, 111In, 19F, 13C, 15N, 17O, 가돌리늄, 망간 또는 철과 같은 자기 공명 영상(magnetic resonance imaging, MRI)을 위한 스핀 표지(spin label)를 포함한다. 명백하게, 본 발명의 상기 작용제는 분자가 쉽게 검출가능하게 하기 위해 적절한 동위원소(atomic isotope)를 충분히 가져야 한다.
방사성의(radio-) 표지 또는 기타 표지는 공지된 방법으로 내포(incorporate)될 수 있다. 예를 들면, 상기 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 예를 들면, 수소 대신에 불소-19를 포함하는, 적합한 아미노산 전구체를 사용하여 생합성될 수 있거나 또는 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. 99 mTc, 123I, 186Rh, 188Rh 및 111In 과 같은 표지는 예를 들면, 폴리펩티드 중 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 라이신 잔기를 통해 부착될 수 있다. IODOGEN 방법 (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 49-57)이 123I를 내포시키기 위해 이용될 수 있다. 참고문헌 ("Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" J-F Chatal, CRC Press, 1989)은 다른 방법들을 자세하게 설명한다.
바람직하게는, 상기 쉽게 검출가능한 모이어티는 예를 들면 테크네튬-99m 또는 요오드-123과 같은 방사성 원자를 포함한다.
대안적으로, 상기 쉽게 검출가능한 모이어티는 요오드-123; 요오드-131; 인듐-111; 불소-19; 탄소-13; 질소-15; 산소-17; 가돌리늄; 망간; 철을 포함한 군으로부터 선택될 수 있다: .
본 발명의 추가 바람직한 구체예에서 추가 모이어티가 직접적 또는 간접적 세포독성 모이어티 또는 쉽게 검출가능한 모이어티에 선택적으로 결합될 수 있다. 따라서 이 구체예에서, 추가 모이어티는 세포독성이거나 또는 쉽게 검출가능한 추가 화합물 또는 구성요소에 결합하는 모이어티일 수 있다.
그러므로 추가 모이어티는 추가 화합물 또는 구성성분에 선택적으로 결합하는 항체일 수 있거나, 또는 스트렙타비딘 또는 바이오틴 등과 같은 다른 결합 모이어티일 수 있다. 하기 실시예는 본 발명에 포함되는 분자의 유형을 나타내고; 기타 그와 같은 분자는 쉽게 본 명세서의 교시로부터 명백하다.
이중-특이성 항체에서, 하나의 결합 부위는 본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체를 포함하고, 제2 결합 부위는 예를 들면 실질적으로 비독성 전구약물을 세포독성 약물로 전환시킬 수 있는 효소에 결합하는 모이어티를 포함한다.
본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체가 유용한 연구 시약 및 치료제라는 것이 이해될 것이다. 적절하게, 본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 검출가능하도록 표지되고, 예를 들면 그들은 그들이 직접적 또는 간접적으로 검출될 수 있는 방식으로 표지화될 수 있다.
편리하게, 항체는 방사성 모이어티 또는 유색 모이어티(coloured moiety) 또는 형광 모이어티로 표지되거나, 또는 효소에 결합될 수 있다. 일반적으로, 상기 효소는 무색(non-coloured) (또는 비-형광) 물질을 유색 (또는 형광) 산물로 전환시킬 수 있는 효소이다. 항체는 바이오틴(또는 스트렙타비딘)에 의해 표지화되고, 그 후 방사성 모이어티 또는 유색 모이어티 또는 형광 모이어티 등으로 표지된 스트렙타비딘 (또는 바이오틴)을 이용하여 간접적으로 검출될 수 있거나, 또는 전술된 유형의 효소에 결합될 수 있다.
바람직하게는, 상기 쉽게 검출가능한 모이어티는 방사성 원자, 예를 들면 테크네튬-99m 또는 요오드-123, 또는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 방사성 원자를 포함한다: 요오드-123; 요오드-131; 인듐-111; 불소-19; 탄소-13; 질소-15; 산소-17; 가돌리늄; 망간; 철.
제2 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른, 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체, 또는 이의 구성 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. "핵산 분자(nucleic acid molecule)"에 의해, 본 발명자들은 단일- 또는 이중-가닥일 수 있는, DNA, cDNA 및 mRNA 분자를 포함시킨다.
바람직하게는, 상기 핵산 분자는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다: 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 42; 또는 서열번호 43; 또는 서열번호 44; 또는 서열번호 45; 또는 서열번호 46; 또는 서열번호 47; 또는 서열번호 48; 또는 서열번호 49; 또는 서열번호 50; 또는 서열번호 51; 또는 서열번호 52; 또는 서열번호 53; 또는 서열번호 54; 또는 서열번호 55; 또는 서열번호 56; 또는 서열번호 57;.
훨씬 더 바람직하게는, 본 발명은 하기의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다:
(ⅰ) 서열번호 40 및 서열번호 49; 또는
(ⅱ) 서열번호 41 및 서열번호 50; 또는
(ⅲ) 서열번호 42 및 서열번호 52; 또는
(ⅳ) 서열번호 43 및 서열번호 53; 또는
(ⅴ) 서열번호 44 및 서열번호 54; 또는
(ⅵ) 서열번호 45 및 서열번호 55; 또는
(ⅶ) 서열번호 46 및 서열번호 56; 또는
(ⅷ) 서열번호 47 및 서열번호 57; 또는
(ⅸ) 서열번호 48 및 서열번호 51.
제3 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제2 양태에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
바람직하게는, 상기 벡터는 발현 벡터이다. "발현 벡터(expression vector)"에 의해 본 발명자들은 적절한 숙주 내에서 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 벡터를 의미한다.
그와 같은 벡터는 숙주 세포 내에서 유용한 양을 생산하기 위해 본 발명의 코딩되는 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체를 발현하는데 유용할 수 있다.
다양한 방법, 예를 들면, 상보적 결합(cohesive) 말단을 통해 핵산 분자, 특히 DNA를 벡터와 작동가능하게 연결시키는 방법이 개발되어 왔다. 예를 들면, 상보적 호모폴리머(homopolymer) 부분(tract)이 벡터 DNA로 삽입되는 DNA 절편에 첨가될 수 있다. 그 후, 상기 벡터와 DNA 절편이 상보적 호모폴리머 꼬리(homopolymeric tail) 사이의 수소 결합에 의해 연결되어 재조합 DNA 분자를 형성한다.
하나 이상의 제한 부위(restriction site)를 포함하는 합성 링커가 DNA 절편(segment)을 벡터와 연결하는 대안적 방법을 제공한다. 예를 들면 엔도뉴클레아제 제한효소 분해에 의해 생성된 DNA 절편을 3'-5'-엑소뉴클레아제(exonucleolytic) 활성으로 돌출된, 3'-단일 가닥 말단을 제거하고, 그들의 폴리머라제((polymerising) 활성으로 짧아진(recessed) 3' 말단을 채우는 효소, 박테리오파지 T4 DNA 폴리머라제 또는 E. coli DNA 폴리머라제 I으로 처리한다.
그러므로 이러한 활성의 조합은 평활-말단(blunt-ended) DNA 절편을 생성한다. 평활-말단 절편을 그다음에 박테리오파지 T4 DNA 리가제와 같은 평활-말단 DNA 분자의 라이게이션(ligation)을 촉매할 수 있는 효소의 존재하에 더 높은 과몰량(larger molar excess)의 링커 분자와 함께 인큐베이션시킨다. 그러므로, 이 반응의 산물은 그의 말단에 중합체 링커 서열을 포함하는 DNA 절편이다. 그 후 이들 DNA 절편을 적절한 제한효소에 의해 절단하고 DNA 절편의 말단과 조화가능한(compatible with) 말단을 생성하는 효소에 의해 절단된 발현 벡터에 라이게이션시킨다.
다양한 제한효소(restriction endonuclease) 부위를 포함하는 합성 링커가 International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, USA를 포함한 여러 공급원으로부터 상업적으로 이용가능하다.
폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 변형시키는 바람직한 방법은 PCR을 이용하는 것이다. 이 방법은, 예를 들면, 적합한 제한효소 부위에서의 엔지니어링에 의해 적합한 벡터 내로 DNA를 도입하는데 이용될 수 있거나, 또는 당해 기술분야에 알려져 있는 기타 유용한 방식으로 DNA를 변형시키는데 이용될 수 있다.
이 방법에서, 효소에 의해 증폭될 DNA는 그 자신이 증폭된 DNA에 내포되는 두 개의 특이적 프라이머에 의해 플랭킹된다(flanked). 특이적 프라이머는 당해 기술분야에 알려져 있는 방법을 이용하여 발현 벡터 내로 클로닝하는데 이용될 수 있는 제한효소 인식부위를 포함할 수 있다.
그 후, DNA (또는 레트로바이러스 벡터의 경우, RNA)가 적합한 숙주에서 발현되어 본 발명의 작용제(agent)를 포함하는 폴리펩티드를 생성한다. 그러므로, 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 그 후 폴리펩티드의 발현 및 생산을 위해 적절한 숙주 세포를 형질전환시키는데 이용되는 발현 벡터를 구축하기 위해 공지된 기법에 따라, 본 명세서에 포함된 교시의 관점에서 적절하게 변형되어, 이용될 수 있다. 그와 같은 기법은, 모두 참조에 의해 본 명세서에 포함되는, Rutter et al에게 1984년 4월 3일에 발행된 미국 특허 제4,440,859호, Weissman에게 1985년 7월 23일에 발행된 미국 특허 제4,530,901호, Crowl에게 1986년 4월 15일에 발행된 미국 특허 제4,582,800호, Mark et al에게 1987년 6월 30일에 발행된 미국 특허 제4,677,063호, Goeddel에게 1987년 7월 7일에 발행된 미국 특허 제4,678,751호, Itakura et al에게 1987년 11월 3일에 발행된 미국 특허 제4,704,362호, Murray에게 1987년 12월 1일에 발행된 미국 특허 제4,710,463호, Toole, Jr. et al에게 1988년 7월 12일에 발행된 미국 특허 제4,757,006호, Goeddel et al에게 1988년 8월 23일에 발행된 미국 특허 제4,766,075호, Stalker에게 1989년 3월 7일에 발행된 미국 특허 제4,810,648호에 개시된 것을 포함한다.
폴리펩티드를 코딩하는 DNA (또는 레트로바이러스 벡터의 경우, RNA)는 적절한 숙주 내로 도입되기 위하여 다양한 범위의 기타 DNA 서열에 결합될 수 있다. 동반 DNA(companion DNA)는 숙주의 성질, 숙주로의 DNA 도입 방식, 및 에피솜 유지 또는 통합(episomal maintenance or integration)이 요구되는지 여부에 의존할 것이다.
일반적으로, DNA는 발현을 위한 적절한 배향 및 올바른 해독 프레임으로, 플라스미드와 같은 발현 벡터로 삽입된다. 필요한 경우, 일반적으로 적절한 전사 및 번역 조절(regulatory control)이 발현 벡터에서 이용가능함에도 불구하고, DNA는 원하는 숙주에 의해 인식되는 적절한 전사 및 번역 조절 핵산 서열에 결합될 수 있다. 그 후 벡터는 표준 기법을 통하여 숙주로 도입된다. 일반적으로 모든 숙주가 벡터에 의해 형질전환되지는 않을 것이다. 그러므로, 형질전환 숙주 세포를 선발하는 것이 필요할 것이다. 한 가지 선발 기법은 항생제 저항성과 같은, 형질전환 세포에서 선발가능한 형질을 코딩하는, 필요한 조절 서열과 함께, 발현 벡터로 DNA 서열을 통합시키는 것을 포함한다. 대안적으로, 그와 같은 선발가능한 형질에 대한 유전자는, 원하는 숙주 세포를 공동-형질전환시키는데 이용되는, 또 다른 벡터 상에 존재할 수 있다.
그 후 본 발명의 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 충분한 시간 동안, 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 본 명세서에 개시된 교시의 관점에서 통상의 기술자에게 알려져 있는 적절한 조건하에서 배양되고, 그 후 회수될 수 있다.
박테리아 (예를 들면, 대장균(Escherichia coli) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 효모 (예를 들면, 사카로마이시스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 곰팡이 (예를 들면, 아스퍼길러스(Aspergillus)), 식물 세포, 동물 세포 및 곤충 세포를 포함한, 여러 발현 시스템이 알려져 있다.
벡터는, 기타의, 비-원핵생물, 세포 유형에서의 발현을 위해 이용될 수 있음에도 불구하고, 일반적으로 원핵생물에서의 증식을 위해 ColE1 ori와 같은 원핵생물 복제단위(replicon)를 포함한다. 또한, 벡터는 그에 의해 형질전환되는 E. coli와 같은 박테리아 숙주 세포에서 유전자의 발현 (전사 및 번역)을 지시할 수 있는 원핵생물 프로모터와 같은 적절한 프로모터를 포함할 수 있다.
프로모터는 RNA 폴리머라제의 결합 및 전사가 일어나게 하는 DNA 서열에 의해 형성된 발현 조절 요소이다. 예시적인 박테리아 숙주와 조화가능한 프로모터 서열은 본 발명의 DNA 절편의 삽입을 위한 편리한 제한효소 부위를 포함하는 플라스미드 벡터에서 일반적으로 제공된다.
일반적인 원핵생물의 벡터 플라스미드는 Biorad Laboratories, (Richmond, CA, USA)로부터 입수가능한 pUC18, pUC19, pBR322 및 pBR329, 및 Pharmacia, Piscataway, NJ, USA로부터 입수가능한 pTrc99A 및 pKK223-3이다.
일반적인 포유동물 세포의 벡터 플라스미드는 Pharmacia, Piscataway, NJ, USA로부터 입수가능한 pSVL이다. 이 벡터는 클로닝된 유전자의 발현을 구동하기 위해, SV40 후기 프로모터를 이용하고, 가장 높은 수준의 발현은 COS-1 세포와 같은 T 항원-생성 세포에서 발견된다.
유도성 포유동물의 발현 벡터의 예는 Pharmacia로부터 또한 입수가능한 pMSG이다. 이 벡터는 클로닝된 유전자의 발현을 구동하기 위해 생쥐 유방 종양 바이러스의 긴 말단 반복서열(tumour virus long terminal repeat)의 글루코코르티코이드-유도성 프로모터를 이용한다.
유용한 효모 플라스미드 벡터는 pRS403-406 및 pRS413-416이고 일반적으로 Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA로부터 입수가능하다. 플라스미드 pRS403, pRS404, pRS405 및 pRS406은 효모 통합 플라스미드 (Yeast Integrating plasmid: YIp)이고 효모 선발 마커인 HIS3 , TRP1 , LEU2 및 URA3을 내포한다. 플라스미드 pRS413-416는 효모 동원체 플라스미드(Yeast Centromere plasmid: Ycp)이다.
기타 벡터 및 발현 시스템이 여러 숙주 세포에 의한 이용을 위해 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
제4 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제2 양태에 따른 핵산 분자 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다.
바람직하게는, 숙주 세포는 박테리아 세포 또는 인간 세포와 같은 포유동물 세포이다.
숙주 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 박테리아 세포가 바람직한 원핵 숙주 세포이고 일반적으로, 대장균 스트레인(strain), 예를 들면, Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, USA로부터 입수가능한 DH5, 및 American Type Culture Collection (ATCC) of Rockville, MD, USA로부터 입수가능한 RR1 (No. ATCC 31343)이다. 바람직한 진핵 숙주 세포는 효모, 곤충 및 포유동물 세포, 바람직하게는 마우스, 랫트, 원숭이 또는 인간 섬유아세포 및 신장 세포주로부터 유래된 것과 같은 척추동물 세포를 포함한다. 효모 숙주 세포는, 일반적으로 Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA로부터 입수가능한 YPH499, YPH500 및 YPH501을 포함한다. 바람직한 포유동물 숙주 세포는, CRL 1658로 ATCC로부터 입수가능한 중국 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary: CHO) 세포 및 인간 배아 신장 세포인 293 세포를 포함한다. 바람직한 곤충 세포는 바큘로바이러스 발현 벡터에 의해 형질감염(transfect)될 수 있는 Sf9 세포이다.
본 발명의 DNA 구조물에 의한 적절한 세포 숙주의 형질전환은, 일반적으로 이용되는 벡터 유형에 의존적인 잘 알려져 있는 방법에 의해 달성된다. 원핵 숙주 세포의 형질전환에 관하여, 예를 들면, Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 및 Sambrook et al (1989) Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY를 참조한다. 효모 세포의 형질전환은 Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY에 기재되어 있다. 또한, Beggs (1978) Nature 275, 104-109의 방법이 유용하다. 척추동물 세포에 관하여, 예를 들면, 칼슘 포스페이트 및 DEAE-덱스트란 또는 리포좀 제제와 같은, 이러한 세포를 형질감염시키는데 유용한 시약은 Stratagene Cloning Systems, 또는 Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA로부터 입수가능하다.
또한, 전기천공법(electroporation)이 세포를 형질전환 및/또는 형질감염시키는데 유용하고 효모 세포, 박테리아 세포, 곤충 세포 및 척추동물 세포를 형질전환시키기 위하여 당해 분야에 잘 알려져 있다.
예를 들면, 여러 박테리아 종이 참조에 의해 본 명세서에 포함되는 Luchansky et al (1988) Mol . Microbiol. 2, 637-646에 기재된 방법에 의해 형질전환될 수 있다. 형질전환체의 최대 수(greatest number)는 25 μFD에서 cm 당 6250V를 이용한, 2.5 PEB에 현탁된 DNA-세포 혼합물의 전기천공법 후에 일관되게 회수된다.
전기천공법에 의한 효모의 형질전환 방법은 Becker & Guarente (1990) Methods Enzymol . 194, 182에 개시되어 있다.
성공적으로 형질전환된 세포, 즉, 본 발명의 DNA 구조물을 포함하는 세포는 잘-알려져 있는 기법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 발현 구조물의 도입으로 얻어진 세포는 증식되어 본 발명의 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 세포를 수확하고 용해시키며 그의 DNA 함량을 Southern (1975) J. Mol . Biol . 98, 503 or Berent et al (1985) Biotech . 3, 208에 의해 기재된 것과 같은 방법을 이용하여 DNA의 존재에 대하여 검사할 수 있다. 대안적으로, 상층액 중 단백질의 존재를 하기 기재된 항체를 이용하여 검출할 수 있다.
재조합 DNA의 존재를 직접적으로 분석하는 것 이외에, 성공적인 형질전환은 재조합 DNA가 단백질 발현을 지시할 수 있는 경우, 잘 알려져 있는 면역학적 방법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 발현 백터에 의해 성공적으로 형질전환된 세포는 적절한 항원성을 나타내는 단백질을 생산한다.
형질전환된 것으로 의심되는 세포 시료를 수확하고 적합한 항체를 이용하여 단백질을 분석한다.
숙주 세포는 인간이 아닌 동물 신체 내의 숙주 세포일 수 있다. 그러므로, 형질전환 유전자(transgene)의 존재로 인해 본 발명에 따른 작용제 (또는 그의 결합 모이어티)를 발현하는 인간이 아닌 형질전환 동물이 포함된다. 바람직하게는, 인간이 아닌 형질전환 동물은 마우스와 같은 설치류이다. 인간이 아닌 형질전환 동물은 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
제5 양태에서, 본 발명은, 유효량의 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체, 및 약학적으로 허용가능한 완충액, 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는, '치료적 유효량(therapeutically effective amount)' 또는 '유효량(effective amount)', 또는 '치료적으로 유효한(therapeutically effective)'은 주어진 상태(condition) 및 투여 계획(regimen)에 대한 치료적 효과를 제공하는 양을 지칭한다. 이는 요구되는 부가제 및 희석제, 즉, 담체 또는 투여 비히클과 함께, 원하는 치료적 효과를 생성하도록 계산된 활성 항체의 정해진 양이다. 또한, 숙주의 활성, 기능 및 반응에서 임상적으로 유의한 결핍을 감소시키거나 예방하는데 충분한 양을 의미하는 것으로 의도된다. 대안적으로, 치료적 유효량은 숙주에서 임상적으로 유의한 상태에서 개선을 유발하기에 충분하다. 당해 분야의 당업자에게 인식되는 바와 같이, 화합물의 양은 그의 비활성(specific activity)에 따라 변할 수 있다. 적합한 투여량은 요구되는 희석제와 함께, 요구되는 치료적 효과를 생성하도록 계산된 활성 조성물의 정해진 양을 포함할 수 있다.
치료적 유효량은 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 바와 같이, 연령, 체중, 성별, 상태, 합병증, 기타 질병 등, 환자의 특성에 기초하여 통상의 의사 또는 수의사에 의해 결정될 수 있다.
따라서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는, 이용될 폴리펩티드의 효능/독성에 따라, 여러 농도로 제제화될 수 있다. 바람직하게는, 제제는 0.1　μM 내지 1　mM, 예를 들면, 1 μM 내지 500　μM, 500　μM 내지 1　mM, 또는 300　μM 내지 700　μM의 농도로 활성 폴리펩티드를 포함한다.
"약학적으로-허용가능한(pharmaceutically-acceptable)"은 제제가 무균 및 무발열원(pyrogen free)인 것을 포함한다. 적합한 약학적 담체가 약학 분야에서 잘 알려져 있다. 담체(들)는 본 발명의 항체와 조화가능하고 그의 수용자(recipients)에 유해하지 않다는 의미에서 "허용가능"해야 한다. 일반적으로, 담체는 무균 및 무발열원이 될 물 또는 염수(saline)일 것이다; 그러나, 기타 허용가능한 담체가 이용될 수 있다.
적합한 약학적으로 허용가능한 완충액, 희석제, 담체, 및 부형제가 당해 기술분야에 잘 알려져 있다 (그 개시가 본 명세서에 참조에 의해 포함되는, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) 및 handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed ., Pharmaceutical Press (2000)을 참조한다).
용어 "완충액(buffer)"은 pH를 안정화시킬 목적으로 산-염기 혼합액을 함유하는 수성 용액을 포함하는 것으로 의도된다. 완충액의 예는 Trizma, Bicine, Tricine, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, 포스페이트, 카르보네이트, 아세테이트, 시트레이트, 글리콜레이트, 락테이트, 보레이트, ACES, ADA, 타르트레이트, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, 카코딜레이트(cacodylate), CHES, DIPSO, EPPS, 에탄올아민, 글리신, HEPPSO, 이미다졸, 이미다졸락트산, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO 및 TES이다.
용어 "희석제(diluent)"는 약학적 제조에서 작용제를 희석시킬 목적을 갖는 수성 또는 비-수성 용액을 포함하는 것으로 의도된다. 희석제는 염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 (홍화씨 오일, 옥수수 오일, 땅콩 오일, 면실유 또는 참기름과 같은) 오일 중 하나 이상일 수 있다.
용어 "보조제"는 본 발명의 작용제의 생물학적 효과를 증가시키기 위하여 제제에 첨가되는 화합물을 포함하는 것으로 의도된다. 보조제는, 상이한 음이온, 예를 들면, 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 요오디드, 티오시아네이트(tiocyanate), 설피트(sulfite), 하이드록사이드, 포스페이트, 카르보네이트, 락테이트, 글리콜레이트, 시트레이트, 보레이트, 타르트레이트 및 상이한 아실 조성물의 아세테이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는 음이온을 갖는, 하나 이상의 아연, 구리 또는 은 염일 수 있다. 또한, 보조제는 양이온 셀룰로스 에테르, 양이온 셀룰로스 에스테르, 탈아세틸화 히알루론산(deacetylated hyaluronic acid), 키토산, 양이온 덴드리머와 같은 양이온 중합체, 폴리(비닐 아미다졸)과 같은 양이온 합성 중합체, 및 폴리히스티딘, 폴리라이신, 폴리아르기닌, 및 이들 아미노산을 포함하는 펩티드와 같은 양이온 폴리펩티드일 수 있다.
부형제는 탄수화물, 중합체, 지질 및 미네랄 중 하나 이상일 수 있다. 탄수화물의 예는 락토오스, 글루코스, 수크로스, 만니톨, 및 사이클로덱스트린을 포함하고, 이들은 조성물에 예를 들면, 동결건조를 촉진시키기 위하여 조성물에 첨가된다. 폴리머의 예는 전분, 셀룰로스 에테르, 셀룰로스 카르복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 에틸하이드록시에틸 셀룰로스, 알기네이트, 카라기난, 히알루론산 및 이의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리설폰산염, 폴리에틸렌글리콜/폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌옥사이드/폴리프로필렌 옥사이드 공중합체, 상이한 가수분해도의 폴리비닐알코올/폴리비닐아세테이트, 및 상이한 분자량을 갖는 모든 폴리비닐피롤리돈이고, 이들은 예를 들면, 점성 조절을 위하여, 생체부착(bioadhesion)을 달성하기 위하여, 또는 화학적 분해 및 단백질 효소에 의한 분해로부터 지질을 보호하기 위하여 조성물에 첨가된다. 지질의 예는 지방산, 인지질, 모노-, 디-, 및 트리글리세라이드, 세라마이드, 상이한 아실 사슬 길이 및 포화도를 갖는 모든 스핑고리피드 및 글리코리피드, 달걀 레시틴, 대두 레시틴, 경화된 달걀 및 대두 레시틴이고, 이들은 폴리머에 대한 것과 유사한 이유에 의해 조성물에 첨가된다. 미네랄의 예는, 탈크, 마그네슘 옥사이드, 징크 옥사이드 및 티타늄 옥사이드이고, 이들은 액체 축적의 감소 또는 유리한 색소 특성과 같은 이익을 얻기 위해 조성물에 첨가된다.
본 발명의 활성 항체-기반 작용제는 그의 전달에 적합하도록 당해 분야에 알려진 약학적 조성물의 유형으로 제제화될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 작용제가 다른 약학적으로 허용가능한 담체 이외에, 미셀, 불용성 단분자막(insoluble monolayer), 및 액정(liquid crystal)과 같이 응집된 형태로 존재하는, 지질과 같은 양친매성 제제와 조합된, 리포좀의 형태일 수 있다. 리포좀 제형을 위한 적합한 지질은 제한 없이, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 설파티드, 리소레시틴, 포스포리피드, 사포닌, 담즙산(bile acid) 등을 포함한다. 적합한 지질은 또한 혈류 순환 시간을 증가시키기 위해 극성 헤드기(polar headgroup)에서 폴리(에틸렌 글리콜)에 의해 변형된 지질을 포함할 수 있다. 그와 같은 리포좀 제형의 제조는 예를 들면 참조에 의해 그의 개시가 본 명세서에 포함된, US 4,235,871에서 발견될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 생분해성 미소구체(iodegradable microsphere)의 형태일 수 있다. 지방족 폴리에스테르(aliphatic polyester), 예를 들면, 폴리(락트산) (PLA), 폴리(글리콜산) (PGA), PLA와 PGA의 공중합체 (PLGA) 또는 폴리(카르프로락톤) (PCL), 및 폴리안하이드라이드(polyanhydride)가 미소구체의 제조에서 생분해성 폴리머로 널리 이용되고 있다. 그와 같은 미소구체의 제조는 참조에 의해 그의 개시가 본 명세서에 포함된, US　5,851,451 및 EP 0 213 303에서 찾을 수 있다.
추가 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 폴리머 겔의 형태로 제공되는데, 여기서 전분, 셀룰로스 에테르, 셀룰로스 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 에틸히드록시에틸 셀룰로스, 알기네이트, 카라기난, 히알루론 산 및 그의 유도체, 폴리아크릴 산, 폴리비닐 이미다졸, 폴리설포네이트, 폴리에틸렌글리콜/폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌글리콜/폴리프로필렌 옥사이드 공중합체, 상이한 가수분해도의 폴리비닐알콜/폴리비닐아세테이트, 및 폴리비닐피롤리돈과 같은 폴리머가 상기 작용제를 포함하는 용액의 농후화(thickening)을 위해 이용된다. 폴리머는 또한 젤라틴 또는 콜라겐을 포함할 수 있다.
대안적으로, 상기 작용제는 단순하게 식염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 오일 (예를 들면 홍화 오일, 옥수수 오일, 땅콩 오일, 목화씨 오일 또는 참깨 오일), 트라가칸스검(tragacanth gum), 및/또는 다양한 버퍼에 용해될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물이 활성제의 작용을 강화하기 위해 이온 및 정의된 pH를 포함할 수 있는 것은 이해될 것이다. 추가적으로, 상기 조성물은 살균과 같은 통상적인 약학적 작업(operation)이 적용될 수 있으며 및/또는 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 버퍼, 충진제 등과 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 당해 분야의 당업자들에게 알려진 적절한 경로를 통해 투여될 수 있다. 따라서 투여의 가능한 경로는 비경구 (정맥내, 피하, 및 근육내), 국소 경로, 안구(ocular), 비강, 폐, 구강(buccal), 경구(oral), 비경구, 질 및 직장 경로를 포함한다. 또한, 이식물로부터의 투여가 가능하다.
유리하게는, 상기 약학적 조성물은 종양 부위에 또는 종양 부위 근처, 예를 들면 종양-내 또는 종양-주위에 투여하는데 적합하다.
상기 약학적 조성물은 비경구 투여에 적합한 것이 바람직하다. 항체를 약학적 조성물로 제제화하는 방법은 의학 및 약학 분야의 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다. 바람직한 조성물은 동반된 실시예에 기재된다.
본 발명의 작용제 (즉, 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체), 약제 및 약학적 조성물은 주사가능한 지효성 약물 전달 시스템(sustained-release drug delivery system)을 사용하여 전달될 수 있다. 이들은 주사 빈도를 줄이도록 특별히 디자인된다. 이러한 시스템의 예는 생분해성 미소구체(microsphere) 내에 재조합 인간 성장 호르몬(rhGH)을 캡슐화한 Nutropin Depot이며, 이는 주입되면 지속된 기간에 걸쳐 서서히 rhGH를 방출한다. 바람직하게, 전달은 근육 내(i.m.) 및/또는 피하(s.c.) 및/또는 정맥 내(i.v.) 로 수행된다.
본 발명의 작용제, 약제 및 약학적 조성물은 필요한 부위에 직접 약물을 방출하는 외과적으로 이식된 장치에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 비트라서트(Vitrasert)는 CMV 망막염을 치료하기 위해 눈으로 직접 간시클로비르(ganciclovir)를 방출한다. 질병 부위에 이러한 독성제의 직접적인 적용은 약물의 현저한 전신성 부작용 없이 효과적인 치료를 달성한다.
또한, 전기천공요법(EPT) 시스템이 본 발명의 작용제, 약제 및 약학적 조성물의 투여를 위해 이용될 수 있다. 세포에 펄스 전기장을 전달하는 장치는 세포막의 약물 투과성을 증가시켜 세포 내 약물 전달의 유의한 증가를 가져온다.
또한, 본 발명의 작용제, 약제 및 약학적 조성물은 EI(Electro-incorporation)에 의해 전달될 수 있다. EI는 피부의 표면에서 직경이 최대 30미크론인 소 입자가 전기 천공법에 사용된 것과 동일하거나 유사한 전기 펄스를 받을 경우에 일어난다. EI에서, 이러한 입자는 각질층을 통해 통과하며, 피부의 보다 깊은 층으로 들어간다. 상기 입자에 약물 또는 유전자가 적재되거나 코팅될 수 있거나, 또는 상기 입자는 단순히 피부에 약물이 들어갈 수 있는 세공(pore)을 생성하는 "발사체(bullets)"로 작용할 수 있다.
본 발명의 작용제, 약제 및 약학적 조성물을 전달하는 대안적 방법은 온도 감응성인 ReGel 주사 시스템이다. 체온 미만의 온도에서, ReGel은 주사가능한 액체이지만, 체온에서는 즉시, 알려진, 안전한 생분해성 폴리머로 서서히 침식 및 용해되는 겔 저장소(gel reservoir)를 형성한다. 활성 물질은 생중합체가 용해됨에 따라 경시적으로 전달된다.
본 발명의 작용제, 약제, 및 약학적 조성물은 또한 경구로 전달될 수 있다. 이 과정은 단백질 및 펩타이드를 동시-전달(co-deliver)하기 위해 체내 비타민 B12 및/또는 비타민 D의 경구 흡수를 위한 자연적인 처리를 이용한다. 비타민 B12 및/또는 비타민 D 섭취 시스템을 통해, 본 발명의 작용제, 약제, 및 약학적 조성물은 장 벽을 통해 이동할 수 있다. 비타민 B12 유사체들 및/또는 비타민 D 유사체들과, 복합체의 비타민 B12 부분/비타민 D 부분 중 고유 인자(IF)에 대한 유의한 친화도 및 상기 복합체의 활성 물질의 유의한 생활성 모두를 보유하는 약물 간의 복합체가 합성된다.
본 발명의 작용제, 약제, 및 약학적 조성물은 "트로이 펩티드(Trojan peptides)"에 의해 세포로 도입될 수 있다. 이는 전위 특성을 가지며, 원형질막을 통해 친수성 화합물을 운반할 수 있는 페너트라틴(penetratin)이라 불리는 폴리펩x티드의 종류이다. 이 시스템은 세포질 및 핵에 올리고펩타이드를 직접 표적할 수 있도록 하며, 세포 타입 특이적이 아니며(non-cell type specific) 고 효율성일 수 있다. Derossi et al. (1998), Trends Cell Biol 8, 84-87 참조한다.
바람직하게는, 본 발명의 약제 및/또는 약학적 조성물은 활성 성분의 일일 투여량 또는 단위, 일일 부-투여량(sub-dose) 또는 그의 적절한 분획을 함유하는 단위 용량(unit dosage)이다.
본 발명의 작용제, 약제, 및 약학적 조성물은 일반적으로 활성 성분을 포함하는 약학 조성물의 형태로, 선택적으로, 비독성 유기, 또는 무기 산 또는 염기, 부가염의 형태로, 약학적으로 허용되는 투여 형태로, 일반적으로 경구 투여되거나 임의의 비경구 경로에 의해 투여될 것이다. 치료할 질병과 환자, 및 투여 경로에 따라, 상기 조성물은 다양한 투여량으로 투여될 수 있다.
인간 치료에 있어서, 본 발명의 작용제, 약제, 및 약학적 조성물은 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로 의도된 투여 경로 및 표준 약학 관행과 관련되어 선택된 적절한 약학적 부형제, 희석제 또는 담체와 혼합하여 투여될 것이다.
예를 들면, 본 발명의 작용제, 약제, 및 약학적 조성물은 즉시 방출, 지속 방출 또는 제어 방출용으로, 향료 또는 착색제를 함유할 수 있는, 정제, 캡슐, 질좌약, 엘릭시르, 용액 또는 서스펜션의 형태로 경구, 구강 또는 설하 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 작용제, 약제, 및 약학적 조성물은 음경 해면체 주입을 통해 투여될 수 있다.
이와 같은 정제는 미정질 셀룰로스(microcrystalline cellulose), 락토오스, 소듐 시트레이트, 칼슘 카보네이트, 이염기성 칼슘 포스페이트 및 글리신과 같은 부형제, 전분 (바람직하게 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 소듐 전분 글리콜레이트, 크로스카멜로즈 소듐 및 특정 복합 실리케이트(complex silicate)와 같은 붕해제, 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸셀룰로즈(HPMC), 히드록시-프로필셀룰로즈(HPC), 수크로즈, 젤라틴 및 아카시아와 같은 과립 결합제(granulation binder)를 함유할 수 있다. 또한, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트(glyceryl behenate) 및 탈크와 같은 윤활제가 포함될 수 있다.
또한, 유사한 타입의 고형 조성물이 젤라틴 캡슐에 필러로서 이용될 수 있다. 이와 관련된 바람직한 부형제는 락토오스, 전분, 셀룰로즈, 유당 또는 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수성 서스펜션 및/또는 엘릭시르(elixir)의 경우 본 발명의 작용제, 약제 및 약학 조성물은 다양한 감미료 또는 향료, 착색물 또는 염료와 함께, 유화제 및/또는 현탁제(suspending agent)와 함께, 및 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 글리세린과 같은 희석제와 함께, 및 이들의 조합과 함께 혼합될 수 있다.
본 발명의 작용제, 약제, 및 약학적 조성물은 비경구적으로, 예를 들면 정맥내, 동맥내, 복강내, 척추 강내(intra-thecally), 심실내(intraventricularly), 흉골내, 두개골내, 근육내로 또는 피하로 투여될 수 있거나, 또는 주입 기법(infusion technique)에 의해 투여될 수 있다. 이들은 예를 들어, 혈액과 등장성인 용액을 형성하기에 충분한 염 또는 글루코즈와 같은 다른 물질들을 함유할 수 있는 멸균 수용액의 형태로 가장 잘 사용된다. 상기 수용액은 필요에 따라 적절히 완충(바람직하게는 pH 3 내지 9) 되어야 한다. 멸균 조건하에서 적절한 비경구 제제의 제조는 당해 분야의 당업자에게 잘 알려진 표준 약학 기법에 의해 용이하게 수행된다.
비경구 투여용으로 적절한 약제 및 약학적 조성물은 항산화제, 버퍼, 세균 발육 저지제(bacteriostat) 및 제제를 의도된 수용자의 혈액과 제형 등장성이 되게하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사액; 및 현탁제 및 증점제(thickening agent)를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 서스펜션을 포함한다. 상기 약제 및 약학적 조성물은 예를 들어, 밀봉된 앰플 및 바이얼과 같은 단위 투여량 또는 멀티-투여량 용기에 제공될 수 있으며, 예를 들면, 사용 직전에 주사용수와 같은 멸균 액체 담체의 첨가만을 요구하는 동결-건조 조건으로 보관될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 서스펜션이 멸균 분말, 과립 및 전술된 다양한 종류의 정제들로부터 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 작용제, 약제, 및 약학적 조성물은 비강내로 또는 흡입에 의해 투여될 수 있으며, 적절한 추진제(propellant), 예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로-에탄, 1,1,1,2-테트라플루오로에탄(HFA 134A3) 또는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판(HFA 227EA3)과 같은 하이드로플루오로알칸, 이산화탄소 또는 기타 적절한 기체를 사용한 가압 용기, 펌프, 스프레이 또는 네뷸라이저(nebuliser)로부터 건조 분말 흡입기 또는 에어로졸 스프레이 방식의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우에, 투여량 단위는 칭량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 측정될 수 있다. 가압 용기, 펌프, 스프레이 또는 연무기는 예를 들면, 용매로서 에탄올과 추진제의 혼합물을 사용한 활성 성분의 용액 또는 서스펜션을 함유할 수 있으며, 이는 예를 들어, 소르비탄 트리올레이트와 같은 윤활제를 부가적으로 함유할 수 있다. 흡입기 또는 취입기(insufflator)에 사용되는 (예를 들면, 젤라틴으로 제조된) 캡슐 및 카트리지가 본 발명의 작용제와 락토오스 또는 전분과 같은 적절한 분말 베이스의 분말 혼합물을 함유하도록 제제화될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 작용제, 약제, 및 약학적 조성물은 좌약 또는 페서리(pessary)의 형태로 투여될 수 있거나, 또는 로션, 용액, 크림, 겔, 연고 또는 살포제(dusting powder)의 형태로 국소적으로 적용될 수 있다. 본 발명의 작용제, 약제, 및 약학적 조성물은 또한 예를 들면, 피부 패치의 사용에 의해 경피 투여될 수 있다. 이들은 또한 특히 눈 질환을 치료하기 위해 안구 경로에 의해 투여될 수 있다.
안과용으로, 본 발명의 작용제, 약제, 및 약학적 조성물은 등장성의 pH 조정된 멸균 염수 중 미분화된 서스펜션으로서, 또는 바람직하게 등장성의 pH 조정된 멸균 염수 중 용액으로서, 선택적으로 벤질알코늄 클로라이드와 같은 보존제와 함께 제제화될 수 있다. 대안적으로, 이들은 바셀린(petrolatum)과 같은 연고에 제제화될 수 있다.
피부로의 국소 도포를 위해, 본 발명의 작용제, 약제, 및 약학적 조성물은 예를 들어, 미네랄 오일, 액체 바셀린, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 작용제, 유화 왁스(emulsifying wax) 및 물 중 하나 이상과의 혼합물에 현탁되거나 용해된 활성제를 함유하는 적절한 연고로서 제제화될 수 있다. 대안적으로, 이들은 예를 들면, 하기 중 하나 이상의 혼합물에 현탁되거나 용해된 적절한 로션 또는 크림으로 제형화될 수 있다: 미네랄 오일, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 액체 파라핀, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알코올 및 물.
구강 내의 국소(topical) 투여에 적절한 제형은 풍미 기제(flavoured bases), 보통 수크로즈 및 아카시아 또는 트라가칸트에 활성 성분을 포함하는 로젠지(lozenge); 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로즈 및 아카시아와 같은 비활성 기제에 활성 성분을 포함하는 패스틸(pastille); 및 적절한 액체 담체에 활성 성분을 포함하는 구강 청결제를 포함한다.
일반적으로, 인간에서, 종양 부위 또는 그 가까이로의, 본 발명의 작용제, 약제, 및 약학적 조성물의 국소 투여, 특히 종양 내 또는 종양 주위 투여가 바람직한 경로이다.
수의학용으로, 본 발명의 작용제, 약제, 및 약학적 조성물은 일반적인 수의학 관례에 따라 적절히 허용되는 제제로 투여되며, 수의학 외과 의사는 특정 동물에 대해 가장 적절한 투여 방법 및 경로를 결정할 것이다.
제6 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제5 양태에 따른 약학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
제7 양태에서, 본 발명은 의약에서 이용하기 위한, 본 발명의 제1 양태에 따른 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 핵산 분자, 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 벡터, 또는 본 발명의 제4 양태에 따른 숙주 세포, 또는 본 발명의 제5 양태에 따른 약학적 조성물을 제공한다.
제8 양태에서, 본 발명은 암의 치료에 이용하기 위한, 본 발명의 제1 양태에 따른 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 핵산 분자, 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 벡터, 또는 본 발명의 제4 양태에 따른 숙주 세포, 또는 본 발명의 제5 양태에 따른 약학적 조성물을 제공한다.
제9 양태에서, 본 발명은 암 치료용 약제의 제조에 이용하기 위한, 본 발명의 제1 양태에 따른 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 핵산 분자, 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 벡터, 또는 본 발명의 제4 양태에 따른 숙주 세포, 또는 본 발명의 제5 양태에 따른 약학적 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 제7 양태 및/또는 제8 및/또는 제9 양태에서, 상기 암의 치료는 이를 필요로 하는 개체에게 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체, 또는 유도체, 또는 핵산 분자 또는 벡터 또는 숙주 세포 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
제10 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 개체에게 제1 양태에 따른 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 핵산 분자, 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 벡터, 또는 본 발명의 제4 양태에 따른 숙주 세포, 또는 본 발명의 제5 양태에 따른 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 가진 개체의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 제7 양태 및/또는 제8 및/또는 제9 양태 및/또는 제10 양태에서, 상기 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계는 국소 투여, 예를 들면 환자의 종양으로의 국소 (예를 들면, 종양-내 또는 종양-주변) 투여를 포함하는 것이 바람직하다.
이러한 항-CD40 항체의 종양으로의 국소 주입이 훨씬 낮은 투여량에서 전신성 항-종양 효과를 생성할 수 있다는 것이 알려져 있다 (van Mierlo et al., 2002, Proc Natl Acad Sci USA, 99:5561-5566; Kalbasi et al., 2010, J Immunotherapy, 33:810-816). 또한, 마우스의 한 측면에서(in one flank) 종양-내 처리는 반대 측면에 있는 종양을 깨끗하게 할 수 있으며, 항-종양 효과가 수지상 세포의 활성화 및, 순차적인 세포독성 T 림프구에 의한 반응의 후속 활성화에 의존한다는 것이 보고되었다. 또한, 상기 치료는 종양-재발(tumour re-challenge)에 대한 보호성 면역을 생성했다.
전술된 바와 같이, 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체의 투여량의 환자 맞춤형(patient-specific) 최적화 후, 환자는 치료의 지속기간(duration) 동안 최대 치료 용량을 투여받는다. 그러나, 상기 용량은 치료가 요구되는 치료 효과를 갖기 시작하면, 시간이 흐르면서 낮아질 수 있는 것으로 이해될 것이다.
일반적으로, 인간 환자에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체의 치료적 용량은 투여 당 100 ㎍　내지 700　mg 범위가 될 것이다 (70kg의 체중 기준).
예를 들면, 최대 치료 용량은 투여 당 0.1 내지 10 mg/kg 범위, 예를 들면 0.1 내지 5 mg/kg 또는 1 내지 5 mg/kg 또는 0.1 내지 2 mg/kg 일 수 있다. 이러한 용량이 종양학자/의사에 의해 결정되는 바와 같이, 상이한 간격으로 투여될 수 있다는 것이 이해될 것이다; 예를 들면, 용량은 매일, 일주일에 2회, 매주, 2주마다 또는 매월 투여될 수 있다.
일 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체의 최대 치료 용량은 낮은 투여량이다. 예를 들면, 본 발명에서 국소적으로 투여되는 용량은 치료적 효과를 생성하는데 필요한 동일한 작용제의 통상적인 전신 투여량(systemic dose)의 25% 미만일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 투여량은 투여당 1mg 이하, 예를 들면 투여당 500 ㎍, 400 ㎍, 300 ㎍, 200 ㎍, 100 ㎍, 50 ㎍, 30 ㎍, 20 ㎍, 10 ㎍, 5　㎍ 또는 1 ㎍ 이하이다. 이러한 투여량은 환자에게 시간이 흐르면서 반복적으로, 예를 들면 매일 2회, 매일 1회, 2일당 1회, 매주 2회, 매주 1회, 매달 2회, 매달 1회, 등으로 반복적으로 투여될 수 있음이 이해될 것이다.
일 구체예에서, 항체-기반 작용제(들)는 사용을 위해 투여 당 10 ㎍ 내지 100 ㎍ 의 용량으로 존재한다.
예를 들면, 상기 항체-기반 작용제(들)는 투여당 20 ㎍ 내지 40 ㎍, 예를 들면 투여당 30 ㎍의 용량으로 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항체-기반 제제(들)는 전신 항-종양 효과를 제공할 수 있다. 그와 같은 전신 항-종양 효과는 치료가 국소적/종양내로 이루어지더라도 얻어질 수 있다. 면역치료용 항체를 국소적으로, 예를 들면 종양내 주입에 의해 투여하는 경우, 종양 영역의 세포만이 CD40 치료에 대해 표적화된다. 그러므로, 그것의 효과를 발휘하도록 의도된 조직-영역에서의 CD40 효능제의 농도만이 CD40 활성화의 수준에 영향을 미친다. 국소 투여할 경우, 최적 투여량은 환자의 체중이 아닌 치료와 관련된 조직 영역의 부피에 의해 결정된다. 종양내 치료의 경우 이 부피는 대신에 종양 부피에 의해 정의될 수 있다. 따라서 적절한 총 용량은 전신 치료에 대한 것보다 낮을 수 있으며, 그리고 환자의 체중에 의해서가 아니라, PET 스캔 또는 다른 이미징 방법에 의한 종양 진단에 기반하여 정의될 수 있다.
본 발명의 항체-기반 작용제가 CD40 활성화가 치료적 이점을 제공할 수 있는 종류의 암의 치료 용도에 적합한 것으로 이해될 것이다.
예를 들면, 상기 암은 전립선암; 유방암; 대장암; 췌장암; 난소암; 폐암; 자궁경부암; 횡문근육종; 신경아세포종; 다발성 골수종; 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 흑색종, 방광암(bladder) 및 교모세포종로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 암은 CD40+ 종양 세포와 연관된다. 그러나, 본 발명의 항체-기반 작용제는 또한 CD40- 종양 세포와 연관된 암의 치료에 이용될 수 있다.
본 발명의 항체-기반 작용제가 환자의 암에 대한 단독 치료로서 또는 조합 치료의 부분으로서 (추가 치료는 약학적 작용제, 방사선요법 및/또는 수술일 수 있다) 이용될 수 있다는 것이 또한 이해될 것이다.
따라서 환자는 또한 암에 대하여 하나 이상의 추가 치료, 예를 들면 약학적 작용제(예를 들면, 화학치료제), 방사선요법 및/또는 수술을 받을 수 있다.
일 구체예에서, 상기 하나 이상의 추가 치료는 통상적 화학치료제 (예를 들면 알킬화제, 대사 길항 물질(anti-metabolites), 식물 알칼로이드 및 테르페노이드, 토포이소머라제 억제제 및 항종양제(antineoplastics)), 방사선치료제, 항체-기반 치료제 (예를 들면 젬투주맙, 알렘투주맙, 리툭시맙, 트라스투주맙, 니모투주맙, 세툭시맙, 베바시주맙), 및 스테로이드로 구성된 군으로부터 선택된다.
제11 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른, 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체, 융합체 또는 유도체를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 코딩된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 발현을 허용하는 조건 하에서 본 발명의 제4 양태에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
숙주 세포를 배양하고 재조합 단백질을 단리하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 숙주 세포에 따라, 생산된 단백질이 다를 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들면, 효모 또는 박테리아 세포와 같은 일부 숙주 세포는 다른 방식으로 번역-후 변형될 수 있는 본 발명의 작용제(또는 그의 결합 모이어티)의 형태를 생산을 초래할 수 있는, 상이한 번역-후 변형 시스템을 갖거나 또는 갖지 않는다.
본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체 (또는 그의 결합 모이어티)는 포유동물 세포와 같은, 진핵 세포 시스템에서 생산되는 것이 바람직하다.
덜 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 토끼 망상적혈구 용해물(rabbit reticulocyte lysate) 또는 맥아 용해물(wheatgerm lysate) (Promega로부터 입수가능)과 같은, 상업적으로 입수가능한 인 비트로 번역(translation) 시스템을 이용하여 인 비트로에서 생산될 수 있다. 바람직하게는, 상기 번역시스템은 토끼 망상적혈구 용해물이다. 알맞게, 상기 번역 시스템은 TNT 전사-번역 시스템(Promega)과 같은 전사 시스템과 연결될 수 있다. 이 시스템은 번역과 동일한 반응에서 코딩 DNA 폴리뉴클레오티드로부터 적합한 mRNA 전사물을 생산하는 이점을 갖는다.
작용제가 구별되는 모이어티, 예를 들면 결합 및/또는 세포독성 도메인을 포함하는 경우, 그러한 모이어티는 하나 이상의 분리된 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 이 양태의 생산 방법은 숙주 세포로부터 또는 인 비트로 번역 혼합물(translation mix)로부터 본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체를 단리하는(isoloting) 추가 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 단리는 본 발명의 발현된 폴리펩티드에 선택적으로 결합하는 항체를 이용한다.
항체를 생산하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 항체는 동물에서 적절한 펩티드로 면역화하는 것 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 오늘날의 기술로, 동물을 사용할 필요 없이 항체를 만드는 것이 가능하다; 이러한 기법은 예를 들면, 당해 분야에서 잘 알려진 항체 파지 디스플레이 기술을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 그의 변이체, 융합체 또는 유도체는 직접적 또는 간접적으로, 인 비트로 단백질 최적화의 산물이다 (예를 들면 WO　02/48351 및 WO 03/097834에 기재된, Alligator Bioscience AB의 FIND® 기술을 사용).
본 명세서에서 종래의 공개 문헌의 열거 또는 검토는 반드시 그 문헌이 당해 기술 분야의 종래 기술의 일부이거나 일반적인 관용 지식임을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안된다.
본 발명의 일부 양태를 구체화하는, 바람직한, 비-제한적 실시예가 하기 도면들을 참조하여, 이제 서술될 것이다:
도 1 - (a) 라이브러리 및 선별부터-1회(primary) 초고속 대량 스크리닝(HTS) 까지의 "히트 맵(Heat map)". 각 상자는 아미노산 위치를 나타낸다. 히트 맵은 돌연변이가 도입되고 및/또는 서열 분석에 의해 발견된 위치로 제한된다. VH와 VL 사이의 링커는 도시되지 않는다. 각 위치에서 돌연변이 빈도가 보다 진한 음영으로 표시된다. (b) 선별 과정으로부터 유래한 서열에 기반하여 계산된 5개 보다 많은 돌연변이를 갖는 위치의 수.
도 2 - HTS 결과의 시각화. 두 개의 ELISA 측정 값 (일반 세척 및 강한(harsh) 세척)의 비가 y-축에 표시된다; x-축 상에는, 최초 ELISA(일반 세척)의 결합 신호가 표시된다. 그래프에서 각 구는 하나의 클론으로부터의 데이터를 나타낸다. B44 (회색) 및 선별 라운수 넘버 5의 클론 (검정)을 보여준다.
도 3 - CD40의 도메인의 모식도(Schematic diagram).
도 4 - 37℃ 및 생리학적 pH에서 표적에 결합하는 CD40 항체 클론의 표면 플라즈몬 공명 분석.
도 5 - B44 항체와 대비, CD40 항체 클론에 의한 표면 마커인 CD86의 상향-조절.
도 6 - 종료일 (28일차)에 측정된 종양의 중량을 보여준다. 30 ㎍의 G12 또는 이소형 대조군에 의한 처리를 보여준다 (Mann-Whitney 검정을 이용하여 대조군과 비교한 두 개의 처리군에 대한 **p<0.01, 양측 검정(two tailed)).
도 7 - 상이한 처리군의 평균 (n=9) 종양 부피를 보여준다 (+/- SEM). 30 ㎍ 약물로 처리된 마우스는 이소형 대조군 (30 ㎍)과 비교된다. G12에 의한 처리는 이소형 대조군과 비교하여 유의성있는 항-종양 효과를 제공한다.
도 8 - 종료일 (28일차)에 측정된 종양의 중량을 보여준다. 인간 수지상 세포 및 T 세포의 존재하에 G12를 PBS-처리와 비교하며, 처리군(n=10)은 두 상이한 공여체로부터(전체 10 마리의 마우스 중, 각 공여체마다 5 마리 마우스) 유래한 자가(autologous) T 세포 및 수지상 세포로 이식되었다. G12에 의한 처리는 이소형 대조군과 비교하여 유의성있다 (t-검정(students t-test)을 이용하여 대조군과 비교한 처리군에 대한 p<0.05, 양측 검정).
도 9 - 처리군의 평균 (n=10) 종양 부피를 보여준다 (+/- SEM). 마우스를 인간 수지상 세포 및 T 세포의 존재 하에서 30 ㎍의 G12로 처리하고 PBS-처리군과 비교하였으며, 처리군(n=10)은 두 다른 공여체로부터(전체 10 마리의 마우스에서, 각 공여체마다 5 마리 마우스) 유래한 자가 T 세포 및 수지상 세포로 이식되었다. G12에 의한 처리는 동종형 대조군과 비교하여 유의성있다.
도 10 - 약물로 처리된 종양 접종된 마우스의 생존 곡선을 나타낸다. G12의 처리는 이소형 대조군과 비교하여 유의성있게 동물의 생존을 증가시킨다 (p < 0.013). G12로 처리된 마우스의 생존 곡선을 S2C6와 비교하였다 (p<0.13). S2C6로 처리한 마우스의 생존을 이소형 대조군과 비교하였다 (p<0.088). 각 처리군은 5 마리의 마우스로 구성된다, N=5.
도 11 - 약물로 처리된 종양-생성 마우스의 생존 곡선을 나타낸다. 표시된 생존 곡선은 풀 데이터(pooled data)에 기반한다. G12 및 이소형 대조군으로 처리된 마우스의 군은 각 군마다 20 마리의 동물로 구성된다. S2C6로 처리된 마우스의 군은 12 마리의 동물로 구성된다. G12 처리군 및 S2C6 처리군의 생존 곡선을 다중 비교(multiple comparison)에 대해 조정하기 위해 본페로니(Bonferroni) 방법을 이용한 로그 순위 검정(log rank test)에 의해 동종형 대조군 처리 그룹과 비교된다. G12의 생존 곡선은 이소형 대조군과 비교하여 유의성있게 다르다 (조정되지 않은 p 0.004).
도 12 - 처리된 마우스에서의 사이토카인 수준을 나타낸다. 혈청 시료를 처리된 마우스에서 10일차에 제2 처리 후 4시간 차에 채취하고 사이토카인 수준에 대해 분석하였다. G12, S2C6 및 이소형 대조군으로 처리된 마우스로부터의 사이토카인 수준을 조정된(adjusted) p 값을 계산하기 위해 본페로니 다중 비교 검정(Bonferroni's multiple comparisons test)에 의한 일원분산분석(one-way Anova)을 이용하여 비교하였다. G12에 의한 처리는 S2C6 처리된 마우스와 비교하여 유의성있다. ***로 표시된 사이토카인 수준은 p<0.001를 나타내며, **로 표시된 데이터는 0.001< p <0.01의 p 값을 나타내며, *로 표시된 사이토카인 수준은 0.01< p <0.05의 p 값을 나타낸다. G12 처리군 및 S2C5 처리군은 23 마리의 마우스로 구성된다, N=23. 이소형 대조군의 처리군은 18 마리의 마우스로 구성된다, N=18.
도 13 - 처리된 마우스의 혈청 중 항체 수준. G12 또는 대조군으로 제1 처리 (7일차) 및 제2 처리 (10일차) 후 4시간차 채취된 혈청 시료를 항체 수준에 대해 분석하였다. 7일차 및 10일차에, 클론 S2C6과 비교하여 항-CD40 항체 클론 G12에 대해, 항체 역가는 약 두 배 유의성 있게 더 낮았다.
단측 언페어드 t-검정(one tailed unpaired t-test)을 이용하여 G12 및 S2C6의 평균의 비교를 위한 p 값을 계산하였다. 혈청 G12 역가는 표적 연관 효과 때문에 이소형 대조군과 비교하여 약 100배 낮았다, (G12 역가는 인간 CD40 음성 마우스에서의 이소형의 역가와 유사하다).
동일한 투여량(30 ㎍)의 G12 및 S2C6의 처리 후에 처리 후 4시간 차의 G12 및 S2C6의 혈청 역가에 유의성 있는 차이가 있다. 이것은 G12가 S2C6와 비교하여 종양 및 주변 조직에서 더 오래 유지된다는 것을 나타낸다. 이러한 차이는 다른 CD40 항체, 예를 들면 S2C6와 비교하여 G12의 표적 (CD40)에 대한 높은 결합 속도 및 친화도의 결과일 수 있다.
***로 표시된 항체 수준은 p<0.001를 나타내며, **로 표시된 데이터는 0.001< p <0.01의 p 값을 나타낸다. G12 처리군 및 S2C5 처리군은 23 마리의 마우스로 구성된다, N=23. 이소형 대조군의 처리군은 18 마리의 마우스로 구성된다, N=18.
실시예
실시예 1 - 개선된 효능을 갖는 효능성 ( agonistic ) CD40 항체의 지시된 진화
도입( Introduction )
B44 항체는 인간 항체 단편 디스플레이 라이브러리인 단편 n-CoDeR® 라이브러리로부터 유래한다 (Soderlind et al., 2000). 한 라이브러리를 제외하고, 무작위 돌연변이가 전체 서열에 걸쳐 삽입된, 라이브러리를 설계하는데 항-CD40 효능성 항체 B44의 아미노산 서열 및 구조 모델을 사용하였다.
본 발명의 항체들을 하기와 같이 제조하고 선택하엿다.
라이브러리 설계
B44 항체의 서열 분석 및 구조 모델링에 기반하여, 세 개의 설계된 라이브러리 및 하나의 무작위 라이브러리를 구축하였다. B44의 구조 모델은 단백질 데이터 뱅크 (protein data bank, PDB)내의 적합한 주형 구조, VH에 대해서는 1NL0 및 VL에 대해서는 2J6E에 기반을 두었다.
AL-10013-04에서, B44 내의 생식-계열 핫 스팟 잔기 (germ-line hot spot residues) (LeFranc et al, IMGT/VQEST, http://www.imgt.org/IMGTeducation/Tutorials/IGandBcells/_UK/SomaticHypermutations/ 참조)를 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 확인하였다 (Ho and Pastan "Therapeutic antibodies: Methods and protocols" 2009, (525) Humana Press). 생식계열 핫 스팟 돌연변이는 체세포 과돌연변이(somatic hypermutation) 과정 동안 돌연변이가 일어나기 쉬운 재배열된 가변 면역글로불린 도메인 내의 아미노산 위치이다. CDRL3에서 생식계열 핫 스팟 잔기는 구조적으로 가까운 CDRL1 내에서 선택된 생식-계열 핫 스팟 잔기와 함께 무작위화(randomize)된다. 각각의 생식계열 핫 스팟 돌연변이의 가변성은 복잡성을 감소시키고, 매우 기능적인 라이브러리를 생성하기 위해 8-9개의 선택된 잔기로 제한되었다. 이러한 잔기는 편리한 수준에서 복잡성 및 이론적 가변성을 유지하면서, 모든 (20) 자연적으로 발생하는 아미노산의 이화학적(physiochemical) 특성을 대표하도록 선택된다 (Tanping, Protein Engineering, 2003, 16, 323-330) (Koide et al, 2009, ACS Chemical biology). 이러한 라이브러리의 이론적 가변성은 1.9 x 107개의 개별 변이체이다.
AL-10013-05에서, 모든 표면 노출된 CDR-잔기는 B44의 구조 모델에 기반하여 확인되었다. 이러한 잔기는 추가적 가변성이 도입된 H3를 제외하고, 가변성을 1 또는 2개의 상동 잔기로 제한하면서, 변하였다 (도 1 참조). 그 목적은 편리한 수준에서 복잡성 및 이론적 다양성을 유지하면서, 고도로 기능적인 라이브러리를 생성하는 것이었다. 이러한 라이브러리의 이론적 다양성은 1.9 x 107개의 개별 변이체이다.
설계된 라이브러리 AL-10013-06에서, CDRL3의 중심 부분의 잔기 및 구조적으로-가까운 CDRH2의 잔기는 무작위화되었다 (n = 11). 상기 잔기는 B44의 구조적 모델로부터 확인하였다. 각 위치에서의 가변성은 편리한 수준에서 복잡성 및 이론적 가변성을 유지하면서, 고 친화도, "미니멀리스트(minimalist)" 단백질 결합 에피토프를 생성하는데 적합한 이화학적 특성을 대표하도록 선택된 4-5개의 잔기로 제한되었다 (Koide et al 2009, ACS Chemical biology, Fellouse et al., 2007, J Mol Biol)1, 2. AL-10013-06 라이브러리는 1.6 x 107개의 고유한(unique) 변이체를 포함한다.
무작위화된 라이브러리 AL-10013-07에서, 전체 B44 서열은 돌연변이 성향(mutational bias)을 최소화시키도록 설계된 에러-유발(error-prone) PCR 방법 (Genemorph)을 사용하여 무작위화되었다. 생성된 라이브러리의 크기는 6.3 x 108개의 고유한(unique) 변이체이다.
선별 전략 ( Selection strategy )
출발 라이브러리는 바이오틴화된(biotinylated) CD40-Fcγ에 대한 결합자(binder)에 대해 강화(enrich)시켰으며, 그로 인해 기능적 결합자를 코딩하는, 각 라이브러리로부터 유래된 서열의 풀(pool)을 생성했다 (표 1의 "라운드(Round) 1"). 결합자에 대한 초기 강화(enrichment)는 시퀀싱에 의해 확인하였다.
기능적 변이체를 코딩하는 서열의 풀을 뒤이어 FIND®를 사용하여 재조합시켰다. Alligator Bioscience AB의 FIND® 기술은 WO 02/48351 및 WO 03/097834에 기술된다.
FIND®-재조합 라이브러리는 2 x 108개의 고유한 변이체를 포함했다.
생산된 FIND®-재조합 라이브러리를 네 개 라운드의 추가 선별을 거쳤다 (표 1의 "라운드 2 내지 5").
각각의 선별 라운드로부터, 초고속 대량 분석법(high through-put assay)에서 약 2,000개의 클론을 선별하고 스크린하였다. 친화도 성숙에 대한 선별 프로토콜은 하기의 특성에 영향을 주는 단계를 포함하였다: 친화도; 결합 속도(on-rate); 해리 속도(off-rate); 다중체화(multimerization); 및 에피토프 유지.
- 친화도를 증가시키기 위해, 3개의 라운드에서 항원 농도를 10배 낮추고, 및 뒤이어 2개의 라운드에서 항원 농도를 5배 낮추었다.
- 결합 속도는 유지되도록 설계하고, 인큐베이션(incubation) 시간을 단축하는 것에 의해 해결했다.
- 해리 속도는 세척 엄격성(stringency)을 증가시키는 것에 의해 개선되도록 설계하였다. 다중체화를 방지하고 결합활성(avidity)에 대한 선택을 억제하기 위해 바이오틴화되지 않은 CD40을 라운드 4 및 5에 포함시켰다.
1차(primary) 초고속 대량 스크리닝에서의 선별 결과가 각 라이브러리에서 생성된 돌연변이의 위치 및 빈도를 나타내는, 라이브러리의 "히트 맵(heat maps)"에 요약된다 (도 1a).
도 1b는 어떻게 FIND® 재조합 기술이 친화도를 여전히 개선시키면서, 돌연변이된 잔기의 개수를 감소시키는지를 보여준다.
라운드 Ag conc ( nM ) 인큐베이션 (분) a 세척 (분) b
1 10 60/30 표준
2 1 20/30 표준
3 0.1 10/20 표준 + 10
4 0.02 5/10/20 표준 + 30
5 0.004 5/10/15 표준 + 120
표 1: 선별 전략
a 상기 인큐베이션 시간은 비오틴화된 CD4와의 인큐베이션 시간/라운드 4 및 5에서 비-비오틴화된(non-biotinylated) CD40와의 추가 인큐베이션 시간/자성 비드 상에서 파지/항원 복합체를 복구하도록 허용되는 인큐베이션 시간을 나타낸다.
b 표준 세척은 선별 버퍼 (PBS-T/BSA)를 사용한 세척 7회 및 뒤이은 PBS에 의한 세척 4회를 포함한다. 프로토콜은 라운드 3-5에서 확장되며, 연장된 인큐베이션을 추가했다 (시간은 분으로 표시됨).
초고속 대량 스크리닝 ( High throughput screening , HTS )
각 선별 라운드로부터, 약 2,000개의 클론을 선별하였고, 초고속 대량 분석법에서 스크리닝하였다.
초고속 대량 스크리닝 분석법은 하기와 같이 설계되었다: 직접 결합 ELISA에서 두가지 상이한 세척 조건에서의 해리 속도를 측정하는 방법을 수행하였다. 개선된 해리 속도는 두 측정값의 증가된 비와 상관되었다. 초고속 대량 스크리닝 분석법의 결과를 측정 비 대 ELISA에서의 결합 신호로 도시하였다 (도 2).
HTS 분석법은 마이크로적정 플레이트에서 코팅된 CD40으로의 조(crude) E.coli 상등액 중 ScFv-his 단편의 결합을 측정하는 샌드위치 ELISA에 기반했다.
백색의 394-plate flat bottom high binding (Greiner #781074)을 실온에서 2시간 또는 4℃에서 밤새 인큐베이션에 의해 CD40mFc (Apollo #9025H)로 코팅시켰다 (Apollo #9025H). 상기 플레이트를 세척하고 (세척 버퍼: PBS + 0,05% Tween 20 (PBST), Medicago#09-9410-100, ELx405 micro-plate washer (BioTek)) 이후 PBST + 3% 밀크 파우더(Milk powder) (Semper)로 블록킹(block)시켰다. 플레이트를 다시 세척하고, 시료 또는 대조군을 웰에 첨가하였다. 시료를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 이후 일반 세척 (3회의 세척 사이클) 또는 강한(harsh) 세척 (3회의 세척 사이클 및 뒤이은 PBST와의 30분 인큐베이션 및 3회의 세척 사이클)을 이용하여 세척하였다.
검출 Ab, 펜타-His-HRP (Qiagen #1014992)를 첨가하고, 상기 플레이트를 뒤이어 SuperSignal Pico Chemiluminescent 기질 (Thermo #37069)을 사용하여 현상(develop)하고, Envision 판독기 (Perkin Elmer)로 검출하였다.
실시예 2 - 예시적인 항- CD40 항체의 개선된 친화도
CD40 수용체에 대해 개선된 친화도 (KD)를 갖도록 FIND® 재조합 항-CD40 항체를 선별하였다. 표적에 대한 항-CD40 항체의 친화도는 표면 플라스몬 공명에 의해 결정했고 계산된 동역학적 상수(kinetic constant)가 표 1 및 표 2에 표시된다. 친화도는 생리학적 pH 및 37℃에서, 오리지널 B44 항체와 비교하여 항-CD40 항체 클론에 대해 대략 100 배 개선되었다, 표 2 및 도 3.
항-CD40 항체에 의한 개선된 친화도를 또한 낮은 pH에서 관찰하였다, 표 2. 표면 플라스몬 공명을 이용하여 pH 5.4 및 37℃에서 동역학적 상수를 결정하고, B44 항체와 비교하였다.
결과는 전체 친화도가 pH를 5.4로 낮추는 것에 의해 단지 적당하게 영향받으며 (비록 해리 속도 및 결합 속도가 개별적으로 변화되더라도), B44와 비교하여 친화도의 증가가 남아있는 것을 보여준다. 이는 본 발명을 사용하는 국소 면역요법에 대해 임상적 이점이 될 수 있다.
재료 및 방법
표면 플라즈마 공명에 의해 확인된 동역학적 변수 및 친화도 상수의 결정
Biacore 3000 기구를 사용한, 표면 플라즈몬 공명에 의한 정제된 항체의 친화도 측정을 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.
CD40hfc (R&Dsystems, USA)을 통상적인 아민 커플링을 사용하여, BIAcore 센서칩(sensorchip), CM5에 고정화시켰다. 본 발명의 항-CD40 항체 (1-0,012 nM로부터 연속으로 희석된 1/3)를 37℃ 및 pH 7.3에서 30 ㎕/분의 유량(flow rate)으로 HBS-P (GE, BR-1003-68)에서 결합에 대하여 분석하였다. 결합(association)을 3분 동안 추적(follow)하고 해리는 10분 동안 추적하였다. 재생(Regeneration)이 30초 동안 50 mM NaOH를 사용하여 두 번 수행되었다. 동역학적 변수 및 친화도 상수는 IAevaluation 4.1 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
대안적으로, 시료를 37℃에서 10mM 아세테이트, 150 mM NaCl, 0,005% T20, 아세테이트 버퍼, pH 5.4에서 인큐베이션하였다.
결과가 표 2 및 표 3에 표시된다.
결과
항체 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
B44
 2.7 x 106 4.5 x 10-3 1.7 x 10-9
A4
 7.3 x 106 7.6 x 10-5 1.0 x 10-11
A5
 8.5 x 106 9.6 x 10-5 1.1 x 10-11
F6
 11 x 106 3.2 x 10-5 3.0 x 10-11
F9
 2.8 x 106 1.2 x 10-5 4.3 x 10-11
G12
 9.6 x 106 2.0 x 10-4 2.0 x 10-11
H12
 11 x 106 4.9 x 10-5 4.5 x 10-11
B9
 8.5 x 106 1.2 x 10-4 1.4 x 10-11
C4
 7.5 x 106 5.4 x 10-5 7.2 x 10-11
H11
 8.5 x 106 1.3 x 10-4 1.6 x 10-11
표 2. 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된, 생리학적 pH에서 B44 대비 고정화된 CD40 수용체와 항-CD40 항체 클론 사이의 상호작용에 대한 동역학적 상수.
항체 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
B44
 6.0 x 106 5.5 x 10-3 9.3 x 10-10
A4
 1.1 x 107 2.2 x 10-4 2.0 x 10-11
A5
 1.1 x 107 2.5 x 10-4 2.2 x 10-11
G12
 9.6 x 106 2.0 x 10-4 2.0 x 10-11
H12
 11 x 106 4.9 x 10-5 4.5 x 10-11
B9
 9.7 x 106 3.2 x 10-4 3.3 x 10-11
ka, 결합 속도 상수; kd, 해리 속도 상수, KD, 친화도 상수
표 3. 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된, pH=5.4에서 B44와 비교한 고정화된 CD40 수용체와 항-CD40 항체 사이의 상호작용에 대한 동역학적 상수,
실시예 3 - 본 발명의 예시적인 항체의 에피도프 맵핑 ( mapping ) 및 교차-반응성
CD40 수용체는 네 개의 세포외 도메인으로 구성되고, 각 도메인은 각 두가지 유형의 모듈 유닛(modular unit)으로 구성된, 네 개의 세포 밖의 도메인으로 구성되고 (Naismith and Sprang, 1998, Trends Biochem, (23) 74-79), 각 모듈은 하나 또는 두개의 이황화 결합에 의해 안정화된다. 선택된 scFv의 미세한 특이성을 분석하기 위해, 각 scFv 에피토프의 위치를 도메인 맵핑에 의해 결정하였다. 형질감염된 COS-7 또는 L-세포의 표면에 발현된 절단된(truncated) CD40-구조물에 결합하는 scFv 단편의 능력을 (Ellmark et al 2002, Immunology에서 기술된 바와 같은) FACScan 분석을 이용하여 측정하였다. 구조물에 결합될 수 있는 본 발명의 예시적인 항체는 제1 모듈이 제거된 것이나, 구조물에 결합할 수 없는 것은 CD40의 전체 제1 도메인이 제거된 것이었다 (도 4 및 표 4 참조).
G12 A4 A5 C4 B44 H11
D1 + + + + + +
D1 /B2 + + + + + +
D2 - - - - - -
D2 /B1 - - - - - -
D3 - - - - - -
교차-반응성 ( Cross - specificity )
본 발명의 항체 클론은 사이노몰구스 원숭이(cynomolgous monkey), 레서스 원숭이(rhesus macaque) 및 기타 관련된 마카크(macaque)-종으로부터 유래한 CD40과 교차-반응한다. 본 발명의 항체 클론은 마우스(murine) 또는 개(canine) CD40과는 교차 반응하지 않는다.
실시예 4 - 예시적인 항- CD40 항체에 의한 수지상 세포 표면 분자의 상향-조절
CD40 수용체의 라이게이션은 수지상 세포의 활성화를 유도하고, 잠재적으로 특이적 항-종양 T-세포 반응의 활성화를 초래한다. 항-CD40 항체로 처리된 단핵구-유래 수지상 세포는 표면 분자 CD80, CD83, CD86, 및 HLA-DR의 상향-조절된 발현을 보인다. 표면 분자, CD80 및 CD86의 상향-조절은 T-세포 활성화의 동시-자극(co-stimulation)을 필요로 한다.
다른 효능성 CD40 항체, 예를 들면 CP-870,893은 수지상 세포의 활성화보다 B 세포 활성화에 대해 약 20 배 더 높은 효능을 갖는다 (Gladue et al., 2011, Cancer Immunol Immunother 60[7]; 1009-1017).
수지상 세포의 활성화는 B-세포 활성화보다 더 임상적 타당성이 있으며, B 세포에 대한 효과는 수지상 세포를 활성화시키지 않는 치료 용량에서 용량 제한 독성을 초래할 수 있다. 따라서 동일 범위에서 B 세포 활성화에 대한 효능을 유지하면서, 수지상 세포의 활성화에 대한 효능을 개선시키는 것이 유리하다. 본 발명에서 기재된 클론들은 수지상 세포의 활성화의 동일 범위에 있는 B 세포 활성화에 대한 효능을 가져, 임상적 이익을 제공할 수 있다.
오리지널 항-CD40 항체, B44와 비교하여, 수지상 세포의 활성화를 증진시키는 항-CD40 항체 클론의 개선된 효능을 인 비트로 분석법에 의해 결정하였다. 표면 분자 CD86의 상향-조절에 의해 결정된 수지상 세포 활성화에서, 항-CD40 항체 클론에 대해 개선된 효능을 관찰하였다.
표 5는 이러한 표면 마커의 발현 연구로부터의 결과를 요약한다.
도 5a 및 b에, CD86의 발현 및 그의 농도 의존성이 도시된다.
재료 및 방법
수지상 세포 활성화 분석
수지상 세포는 말초 혈액 단핵구에서 유리되었다. 간략하게, 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 피콜 농도 구배(Ficoll gradient)에 의해 전혈의 전혈 연막(whole blood buffy coats)으로부터 분리하고, CD14+ 단핵구를 제조사의 설명서에 따라 CD14+ MACS 마이크로비드 (Miltenyi)로 단리하였다. ~95%의 순도에 도달한, CD14+ 세포를 RPMI 배지 + 10% FCS, 150ng/ml GM-CSF 및 50ng/ml IL-4에서 37℃, 6일 동안 1x106 세포/ml 농도로 배양하였다. 3일 배양 후에 배지의 80%를 신선한 배지 및 사이토카인으로 교체하였다.
배양 6일 후 세포는 하향 조절된 CD14 및 상향 조절된 CD1a를 갖는다. 이들을 세척하고, 신선한 사이토카인 및 자극 항체의 연속 희석물(dilution series)을 포함하는 배지에 재현탁시켰다. 세포를 667000개의 세포/ml 농도 및 3.3-0.013 ㎍/ml의 항체로 배양하였다. 자극 항체는 B44 및 A4, A5, B9, C4, F6, G12, H11 및 H12의 8개 클론이엇다. 수지상 세포를 37℃에서 48시간 추가 배양하였다. 그 다음, 활성화 마커 CD86, CD80 및 HLA-DR의 상향 조절을 FACS로 분석하였다.
G12 항- CD40 항체
EC50 (㎍/ml)
(평균(mean) +/- st.d.)
 G12 항- CD40 항체
최대 배수 증가
(Maximum Fold Increase)
(평균 +/- st.d.)
CD86 0.09 +/- 0.056 136 +/- 72.6
CD80 0.09 +/- 0.056 292 +/- 205
MHC II 0.14 +/-0.078 864 +/- 450
A4 항- CD40 항체
EC50 (㎍/ml)
(평균 +/- st.d.)
 A4 항- CD40 항체
최대 배수 증가
(평균 +/- st.d.)
CD86 0.13 +/- 0.08 149 +/- 79,5
CD80 0,17 +/- 0,047 599 +/- 87,8
MHC II 0,14 +/- 0,08 851 +/- 485
C4 항- CD40 항체
EC50 (㎍/ml)
(평균 +/- st.d.)
 C4 항- CD40 항체
최대 배수 증가
(평균 +/- st.d.)
CD86 0,11 +/- 0,050 164 +/- 101
CD80 0,031 +/- 0,0007 609 +/- 136
MHC II 0,04 +/- 0,014 395 +/-252
H11 항- CD40 항체
EC50 (㎍/ml)
(평균 +/- st.d.)
 H11 항- CD40 항체
최대 배수 증가
(평균 +/- st.d.)
CD86 0,14 +/- 0,056 195 +/- 88
CD80 0,14 +/- 0,056 641 +/- 37
MHC II 0,22 +/- 0,15 481 +/- 122
B44 항- CD40 항체
EC50 (㎍/ml)
(평균 +/- st.d.)
 B44 항- CD40 항체
최대 배수 증가
(평균 +/- st.d.)
CD86 0.37 +/- 0,21 132 +/- 81
CD80 0.25 +/- 0,14 132 +/- 81
MHC II 0.51 +/- 0,20 811 +/- 684
표 5: 본 발명의 클론 및 B44의 CD86, CD80,및 MHC II 발현의 평균 EC50 및 최대 배수 증가.
실시예 5 - 예시적인 항- CD40 항체에 의해 유도된 활성화된 T 세포에 의한 강화된 IFN -γ 분비
항-CD40 항체 클론에 의해 자극된 수지상 세포에 의한 인 비트로 T 세포 활성화를 연구하고 IFNγ 생산을 분석하였다.
결과가 표 6에 요약된다.
동종(allogenic) T 세포 및 수지상 세포 분석법에서 항-CD40 항체 클론의 효능은 B44 항체와 비교하여 개선되었다.
재료 및 방법
수지상 세포에 의한 동종 T 세포 활성화에 대한 분석
수지상 세포는 수지상 세포 활성화 분석에서 기재된 바와 같이 말초 혈액 단핵구로부터 유래되었다.
6일 후, 수지상 세포를 세척하고, 신선한 사이토카인을 갖는 배지에 재현탁시키고 다른 공여체로부터 유래한 T 세포 존재하에서 배양하였다. T 세포를 제조사의 설명서에 따라, CD3+ MACS 마이크로비드(Miltenyi)로 PBMC로부터 단리하였다.
T 세포 활성화 분석에서 수지상 세포 및 T 세포의 농도는 각 세포-종류마다 667,000개의 세포/ml이었다. 또한, 공-배양물(co-culture)은 150ng/ml GM-CSF 및 50ng/ml IL-4 및 3,3-0.013 ㎍/ml의 자극 항체의 연속 희석물을 함유하였다. 자극 항체는 B44 및 8개의 클론 A4, A5, B9, C4, F6, G12, H11 및 H12 이었다. 상기 공-배양물을 37℃에서 추가 72시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 상등액을 제조사의 설명서에 따라 ELISA (Biolegends)에 의해 IFN-γ 함량에 대해 분석하였다.

항체 		Allo DC/ T IFN-γ
EC50 ㎍/ml
 Max (pg/ml)
B44
0.2 8.7
A4
0.04 8.9
A5
0.08 9.5
B9
0.03 8.5
C4
0.12 9
F6
0.15 9
G12
0.05 9.1
H11
0.03 9.5
표 6: B44 항체 대비 본 발명의 항-CD40 항체에 의한 IFN-γ 분비의 강화.
실시예 6 - 예시적인 항- CD40 항체에 의한 B 세포 활성화의 비교
효능성 항-CD40 항체의 B 세포 상의 CD40로의 결합은 B 세포 활성화 및 증식, 동형 응집 (homeotypic aggregation) 및 CD23, CD30, CD80, CD86, Fas, 주조직적합성 복합체 (major histocompatibility complex, MHC) II 및 가용성 사이토카인, 예를 들면 IL-6, TNF-α 및 TNF-β와 같은 표면 마커의 상향 조절을 초래한다 (Schonbeck and Libby, 2001, Cell Mol Life 58(1), 4-43).
CD40 유도 B 세포 증식의 측정이 일반적으로 CD40 효능성 항체를 평가하는데 이용된다 (Pound et al, 1999, Int Immunol, (11), 11-20).
재료 및 방법
말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 피콜 농도구배에 의해 전혈의 전혈 연막으로부터 분리하고 CD19+ B 세포를 제조사의 설명서에 따라 CD19+ MACS 마이크로비드 (Miltenyi)에 의해 단리시켰다. ~95%의 순도에 도달한, CD19+ 세포 (5-7.5 x 104/웰)를 RPMI 배지 + 10% FCS + 10ng/ml IL4 및 항체의 연속 희석물에서 배양하였다. 48-72 시간 후, 대사활성을 Cell titer-Glo (Promega)로 측정하였다. EC50 값은 Graph Pad prism를 사용하여 계산하였다.
결과
항체 EC50 (㎍/ ml ) +/- SEM
B44 0.204 +/- 0,025561
A5 0.29 +/- 0,0155
B9 0.48 +/- 0,0528
C4 0.288 +/- 0,06225
F6 0.40 +/- 0,04415
F9 0.21 +/- 0,0815
H11 0.46 +/- 0,0953
H12 0.18 +/- 0,003
G12 0.098 +/- 0,019657
A4 0.16 +/- 0,02395
표 7 - B 세포의 활성화
본 발명의 항-CD40 항체는 B 세포 활성화에서 B44와 유사한 (즉, 동일한 정도의 차수(order of magnitude)의) 효능을 갖는다 (표 7 참조).
실시예 7 - RAMOS 세포에 결합하는 본 발명의 예시적인 항- CD40 항체의 능력
본 발명의 항-CD40 항체가 RAMOS 세포에 결합하는 능력을 인비트로에서 결정하였다. 본 발명자들은 항-CD40 항체의 인간 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma) 세포주 RAMOS로의 결합의 FACS 분석을 수행하였다. 본 발명의 항-CD40 항체들 및 오리지널 B44 항-CD40 항체에 대해 EC50 값을 계산하였다.
재료 및 방법
인간 버킷 림프종 세포주 RAMOS를 결합 분석을 위해 사용하였다 (ECACC, Sigma Aldrich, USA). 본 발명의 비접합된 항-CD40 항체들을 RAMOS 세포로의 결합에 대해 분석하였다.
RAMOS 세포, 약 125,000개의 세포를 4℃에서 30분 동안, 30-0.0015 ㎍/ml로부터 연속적으로 희석된 1/3인, 항-CD40 항체와 인큐베이션시켰다. 상기 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척하고, 이어서 4℃에서 30분 동안 이차 항체, 항-인간 Ig 토끼 F(ab')2 /FITC (DAKO, Glostrup, Denmark)를 세포에 첨가하였다. 세포를 세척하고 FACScalibur 기구(Becton Dickinson, USA)에서 제조사의 설명서에 따라 분석한 다음 평균 형광 강도(mean fluorescent intensity, "MFI")를 결정하였다.
결과
결과가 표 8에 표시된다.
예시적인 항-CD40 항체 클론들은 B44 항체와 비교하여 약 100-배 증가된 효능을 갖는다.
항- CD40 항체 EC50 (㎍/ ml )
A4 7.0x10-3
A5 6.2x10-3
B9 4.9x10-3
C4 6.1x10-3
F6 5.8x10-3
G12 6.7x10-3
H11 4.4x10-3
H12 8.9x10-3
B44 0.38
표 8: 항체 클론의 RAMOS 세포로의 결합.
실시예 8 - 마우스 종양 모델에서의 예시적인 항체의 인 비보 효과
본 발명의 예시적인 항-CD40 항체들의 항-종양 활성을 NSG 마우스 모델에서 T 세포 및 수지상 세포의 부재 및 존재 하에 연구하였다.
(A) T 세포 및 수지상 세포의 부재하에서 CD40 양성 종양을 사용한 연구
재료 & 방법
본 발명자들은 Jackson으로부터 암컷 NSG 마우스 (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm/Wjl/SzJ (NSG))를 얻었고, 이들을 처리 전에 적응되도록 하였다. 방광암 세포 (EJ-세포, 3 x 106 개의 세포/마우스)를 피하로 주입하였다. G12, 또는 동위원소 대조군을 1.2 mg/kg (30 ㎍)의 용량으로 종양 내로 0, 7 및 14일차에 주입하였다. 종양 부피는 0, 7, 10, 14, 17, 21, 23 및 27일차에 측정하였다. 종양을 28일차에 절제하고 중량을 측정하였다.
결과
결과가 도 6 및 7에 표시된다.
(B) T 세포 및 수지상 세포의 존재하에서 CD40 양성 종양을 사용한 연구
재료 & 방법
본 발명자들은 Jackson으로부터 암컷 NSG 마우스 (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm/Wjl/SzJ (NSG))를 얻고, 이들을 처리 전에 적응되도록 하였다. 방광암 세포 (EJ-세포, 3 x 106 개의 세포/마우스)를 동일 공여체로부터 얻은 T 세포 (5x105) 및 DC (1x105)와 함께 피하 내로 주입하였다. 수지상 세포를 (전술된 바와 같이) 단핵구로부터 준비하였다. 각 처리군(n=10)은 10마리의 마우스로 구성되고, 두 공여체로부터 유래한 T 세포 및 DC를 5 마리의 마우스/공여체에 사용하였다 (표 9 참조).
테스트 물질 인간
moDC/T 세포
(공여체)		 마우스의 수
PBS
 공여체 1 5
공여체 2 5
G12
 공여체 1 5
공여체 2 5
G12, 또는 PBS 대조군을 1.2 mg/kg (30 ㎍)의 용량으로 종양 내로 0, 7 및 14일차에 주입하였다. 종양 부피는 0, 7, 10, 14, 17, 21, 23 및 27일차에 측정하였다. 종양은 28일차에 절제하고 무게를 측정하였다.
결과
결과가 도 8 및 9에 표시된다.
실시예 9 - 세포사멸로부터 세포를 구조하는 능력
세포사멸 및 성장 정지(growth arrest)로부터 인간 CD40을 발현하는 세포를 구조(rescue)하는 항-CD40 항체의 능력을 인비트로에서 측정하였다. 세포사멸 및 성장 정지를 형질감염된 WEHI-231 세포에서 항-IgM 항체의 첨가에 의해 유도시켰다. 세포를 항-CD40 항체의 첨가에 의해 구조했다. 이에 뒤이어, 증식에 대한 세포의 능력을 결정하였다.
B44 항체와 비교하여 항-CD40 항체 클론들에 대해 40 배까지, 개선된 효능을 관찰하였다 - 표 9 참조.
재료 및 방법
세포사멸로부터의 구조:
안정한 세포주를 인간 CD40, huCD40/WEHI-231로 형질감염시키고, 세포사멸 및 성장 정지로부터 구조를 조사하는데 사용하였다 (Ellmark et al., 2003, Immunology, 108, 452-7). 세포, huCD40/WEHI-231을 항-마우스 IgM (Jackson Immunoresearch, USA) 및 25-0.0001 ㎍/ml로부터 연속적으로 희석된 1/3의 본 발명의 항-CD40 항체 존재 또는 부재하에 96-웰 플레이트에서 72 시간 동안 배양하였다 (2x104 cells/well). Cell titer-Glo를 첨가하고 수득된 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다 (Promega, USA). ATP 방출을 측정하는 것을 통해 세포를 증식에 대하여 분석하였다. 발광 신호를 FluoSTAR OPTIMA에서 측정하고, 상기 신호를 정규화시켰다 (BMG, Germany)
항 - CD40 항체 클론 B44 항체 대비 효능의 배수 변화( Fold change )
G12 19
A4 46
A5 19
B9 38
C4 52
표 10: 세포사멸 및 성장 정지로부터 세포를 구조하는 항체 클론들의 능력
실시예 10: 서열 정보의 요약
하기 기재된 각 항체에 대해서, VL 아미노산 위치 1-112 및 VH 아미노산 위치 1-119를 해당하는 뉴클레오티드 서열과 함께 나타낸다. CDR은 아미노산 서열 내에 밑줄로 표시한다 - VL 아미노산 서열 내에서, CDR은 아미노산 위치 23-40 (CDR1), 위치 52-58 (CDR2), 및 90-101 (CDR3)에서 발견된다; VH 아미노산 서열 내에서, CDR은 아미노산 위치 26-35 (CDR1), 위치 42-67 (CDR2), 및 97-108 (CDR3)에서 발견된다.
항체 B44
가변 경쇄 ( V L ) 아미노산 서열 - 서열번호 58
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가변 경쇄 ( V L ) 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 59
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATAATGTATACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT
가변 중쇄 ( V H ) 아미노산 서열 - 서열번호 60
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가변 중쇄 ( V H ) 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 61
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
항체 클론 A4
가변 경쇄 ( V L ) 아미노산 서열 - 서열번호 19
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSTSNIGAGYKVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGLVFGGGTKLTVLG
가변 경쇄 ( V L ) 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 40
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATAATGTATACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT
가변 중쇄 ( V H ) 아미노산 서열 -서열번호 31
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가변 중쇄 ( V H ) 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 49
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDR 아미노산 서열
VL CDR: CDR1: CTGSTSNIGAGYKVY [서열번호 4]
CDR2: GNINRPS [서열번호 10]
CDR3: CAAWDDSLSGLV [서열번호 12]
VH CDR: CDR1: GFTFSTYGMH [서열번호 28]
CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR [서열번호 29]
CDR3: CARILRGGSGMDL [서열번호 30]
항체 클론 A5
가변 경쇄 ( V L ) 아미노산 서열 - 서열번호 20
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYHVYWYQQLPGTAPKLLIYGSINRPSGVPDRFSGSKSGTSGSLAISGLRSEDEADYYCAAWDSSSSGLVFGGGTKLTVLG
가변 경쇄 ( V L ) 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 41
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATAATGTATACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT
가변 중쇄 ( V H ) 아미노산 서열 - 서열번호 32
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
가변 중쇄 ( V H ) 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 50
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDR 아미노산 서열
VL CDR: CDR1: CTGSSSNIGAGYHVY [서열번호 5]
CDR2: GNINRPS [서열번호 10]
CDR3: CAAWDSSSSGLV [서열번호 13]
VH CDR: CDR1: GFTFSTYGMH [서열번호 28]
CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR [서열번호 29]
CDR3: CARILRGGSGMDL [서열번호 30]
항체 클론 C4
가변 경쇄 ( V L ) 아미노산 서열 - 서열번호 21
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSTSNIGAGYKVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGLVFGGGTKLTVLG
가변 경쇄 ( V L ) 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 48
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCACCTCCAACATCGGGGCAGGTTACAAAGTATATTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT
가변 중쇄 ( V H ) 아미노산 서열 - 서열번호 33
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADTVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
가변 중쇄 ( V H ) 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 51
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACACAGTGAGGGGCCGATTCACTATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGGGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDR 아미노산 서열
VL CDR: CDR1: CTGSTSNIGAGYKVY [서열번호 4]
CDR2: GNINRPS [서열번호 10]
CDR3: CAAWDDSLSGLV [서열번호 12]
VH CDR: CDR1: GFTFSTYGMH [서열번호 28]
CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR [서열번호 29]
CDR3: CARILRGGSGMDL [서열번호 30]
항체 클론 G4
가변 경쇄 ( V L ) 아미노산 서열 - 서열번호 22
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYKVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDESITGLVFGGGTKLTVLG
가변 경쇄 ( V L ) 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 42
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATAATGTATACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT
가변 중쇄 ( V H ) 아미노산 서열 - 서열번호 34
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
가변 중쇄 ( V H ) 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 52
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDR 아미노산 서열
VL CDR: CDR1: CTGSSSNIGAGYKVY [서열번호 6]
CDR2: GNINRPS [서열번호 10]
CDR3: CAAWDESITGLV [서열번호 14]
VH CDR: CDR1: GFTFSTYGMH [서열번호 28]
CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR [서열번호 29]
CDR3: CARILRGGSGMDL [서열번호 30]
항체 클론 F6
가변 경쇄 ( V L ) 아미노산 서열 - 서열번호 23
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVYWYQQLPGTAPKLLIYRNINRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDGSLLGLVFGGGTKLTVLG
가변 경쇄 ( V L ) 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 43
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTATACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATCGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGGCAGCCTGCTGGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTGGGT
가변 중쇄 ( V H ) 아미노산 서열 - 서열번호 35
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
가변 중쇄 ( V H ) 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 53
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDR 아미노산 서열
VL CDR: CDR1: CTGSSSNIGAGYDVY [서열번호 7]
CDR2: RNINRPS [서열번호 11]
CDR3: CAAWDGSLLGLV [서열번호 15]
VH CDR: CDR1: GFTFSTYGMH [서열번호 28]
CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR [서열번호 29]
CDR3: CARILRGGSGMDL [서열번호 30]
항체 클론 F9
가변 경쇄 ( V L ) 아미노산 서열 - 서열번호 24
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYGVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDGTLTGLLFGGGTKLTVLG
가변 경쇄 (VL) 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 44
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGGTGTATACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCTTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGGCACCCTGACCGGTCTGCTGTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT
가변 중쇄 ( V H ) 아미노산 서열 - 서열번호 36
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
가변 중쇄 ( V H ) 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 54
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDR 아미노산 서열
VL CDR: CDR1: CTGSSSNIGAGYGVY [서열번호 8]
CDR2: GNINRPS [서열번호 10]
CDR3: CAAWDGTLTGLL [서열번호 16]
VH CDR: CDR1: GFTFSTYGMH [서열번호 28]
CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR [서열번호 29]
CDR3: CARILRGGSGMDL [서열번호 30]
항체 클론 G12
가변 경쇄 ( V L ) 아미노산 서열 - 서열번호 25
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYNVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDKSISGLVFGGGTKLTVLG
가변 경쇄 ( V L ) 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 45
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCGGGTTACAATGTATACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATAAGAGCATTTCTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT
가변 중쇄 ( V H ) 아미노산 서열 -서열번호 37
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
가변 중쇄 ( V H ) 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 55
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDR 아미노산 서열
VL CDR: CDR1: CTGSSSNIGAGYNVY [서열번호 9]
CDR2: GNINRPS [서열번호 10]
CDR3: CAAWDKSISGLV [서열번호 17]
VH CDR: CDR1: GFTFSTYGMH [서열번호 28]
CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR [서열번호 29]
CDR3: CARILRGGSGMDL [서열번호 30]
항체 클론 H12
가변 경쇄 ( V L ) 아미노산 서열 - 서열번호 26
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYNVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGLVFGGGTKLTVLG
가변 경쇄 ( V L ) 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 46
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATAATGTATACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGTGAGTAGAACGTACGCTAGCAAGCTTGGATCCACGATCCTGAGCAAGGACCTCTGCCCTCCCTGTTCAGACCCTTGCTTGCCTCAGCAGGTCATTACAACCACTTCACCTCTGACCGCAGGGGCAGGGGACTAGATAGAATGACCTACTGAGCCTCGTCTGTCTGTCTGTCTGTCTCTCTGTTTGTCTGTCTGTCTCTCTGTTTGTCTCTCTGTCTGTCTGACAGGCGCAGGCTGGGTCTCTAAGCCTTGTTCTGTTCTGGCCTCCTCAGTCTGGGTTCTTGTCGGAACAGCTTTGCCCTTGGGTTACCTGGGTTCCATCTCCTGGGGAATTGGGAACAAGGGGTCTGAGGGAGGCACCTCCTGGGAGACTTTAGAAGGACCCAGTGCCCTCGGGGCTGATGCTCGGGA
가변 중쇄 ( V H ) 아미노산 서열 - 서열번호 38
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
가변 중쇄 ( V H ) 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 56
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGAGTCGTACGCTAGCAAGCTTTCTGGGGCAGGCCAGGCCTGACCTTGGCTTTGGGGCAGGGAGGGGGCTAAGGTGAGGCAGGTGGCGCCAGCCAGGTGCACACCCAATGCCCATGAGCCCAGACACTGGACGCTGAACCTCGCGGACAGTTAAGAACCCAGGGGCCTCTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCACGACTCTA
CDR 아미노산 서열
VL CDR: CDR1: CTGSSSNIGAGYNVY [서열번호 9]
CDR2: GNINRPS [서열번호 10]
CDR3: CAAWDDSLSGLV [서열번호 12]
VH CDR: CDR1: GFTFSTYGMH [서열번호 28]
CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR [서열번호 29]
CDR3: CARILRGGSGMDL [서열번호 30]
항체 클론 B9 및 H11
가변 경쇄 ( V L ) 아미노산 서열 - 서열번호 27
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYNVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDGGLLGLVFGGGTKLTVLG
가변 경쇄 ( V L ) 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 47
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATAATGTATACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGGCGGCCTGCTGGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT
가변 중쇄 ( V H ) 아미노산 서열 - 서열번호 39
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
가변 중쇄 ( V H ) 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 57
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGAGTCGTACGCTAGCAAGCTTTCTGGGGCAGGCCAGGCCTGACCTTGGCTTTGGGGCAGG
CDR 아미노산 서열
VL CDR: CDR1: CTGSSSNIGAGYNVY [서열번호 9]
CDR2: GNINRPS [서열번호 10]
CDR3: CAAWDGGLLGLV [서열번호 18]
VH CDR: CDR1: GFTFSTYGMH [서열번호 28]
CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR [서열번호 29]
CDR3: CARILRGGSGMDL [서열번호 30]
본 발명의 예시적인 항체의 불변 영역
>sp|P01857|IGHG1_HUMAN Ig gamma-1 heavy chain C region OS=Homo sapiens GN=IGHG1 PE=1 SV=1
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[서열번호 62]
>gi|186127|gb|AAA59107.1| immunoglobulin lambda light chain C2 region [Homo sapiens]
QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
[서열번호 63]
중쇄 가변 영역 ( V H ) 내의 예시적인 프레임워크 ( framework ) 돌연변이
돌연변이가 볼드체 밑줄로 표시된다.
가변 중쇄 ( VH ) 아미노산 서열 [서열번호 64]
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNSEN T LYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
가변 중쇄 ( VH ) 뉴클레오티드 서열 [서열번호 65]
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGG AGC GGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
가변 중쇄 ( VH ) 아미노산 서열 [서열번호 66]
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNS K N T LYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
가변 중쇄 ( VH ) 뉴클레오티드 서열 [서열번호 67]
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATT AAG AGGCGGG AGC GGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
항체 B44와 비교한 V L 내의 항체 클론 아미노산 변화 및 위치
항체 클론 아미노산 변화 아미노산 변화 아미노산 변화 아미노산 변화 아미노산 변화
A4 S26T D34K
A5 D34H N53S A73G D95S L97S
G4 D34K D95E L97I S98T
F6 G52R D95G S98L
F9 D34G D95G S96T S98T V101L
G12 D34N D95K L97I
H12 D34N
B9 D34N D95G S96G S98L
C4 S26T D34K
H11 D34N D95G S96G S98L
항체 B44와 비교한 V H 내의 항체 클론 아미노산 변화 및 위치
항체 클론 아미노산 변화
A4
A5
G4
F6
F9
G12
H12
B9
C4 S63T
H11
실시예 11: 예시적인 약학적 제제
본 발명의 항체가 단독으로 투여되는 것이 가능하나, 하나 이상의 허용가능한 담체와 함께, 약제 또는 약학적 제제로 제공하는 것이 바람직하다. 본 발명의 담체(들)는 본 발명의 작용제와 조화가능하고 그의 수용자에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용가능(acceptable)" 해야 한다. 통상적으로, 담체는 무균 및 무발열원(pyrogen-free)인 물 또는 염수일 것이다.
하기 실시예는 활성 성분이 본 발명의 항체인, 본 발명에 따른 약제 및 약학적 조성물을 나타낸다.
실시예 A: 정제
활성 성분 1 mg
락토오스 200 mg
전분 50 mg
폴리비닐피롤리돈 5 mg
마그네슘 스테아레이트 4 mg
정제를 습식 과립법 및 뒤이은 압착에 의해 전술한 성분으로부터 제조한다.
실시예 B: 점안액( Ophthalmic Solution )
활성 성분 1 mg
소듐 클로라이드, 분석용 그레이드 0.9 g
티오머살(Thiomersal) 0.001 g
정제수 100 ml 까지 채움
pH 7.5로 조절
실시예 C: 정제 제제( Tablet Formulations )
하기 제제 A 및 B는 포비돈 용액을 이용한 성분의 습식 과립법 및 뒤이은 마그네슘 스테아레이트의 첨가 및 압착에 의해 제조한다.
제제 A
mg /정( tablet ) mg /정
(a) 활성 성분 1 1
(b) 락토오스 B.P. 210 26
(c) 포비돈 B.P. 15 9
(d) 소듐 전분 글리콜레이트 20 12
(e) 마그네슘 스테아레이트 5 3
＿
251 51
제제 B
mg /정 mg /정
(a) 활성 성분 1 1
(b) 락토오스 150 -
(c) 아비셀 PH 101® 60 26
(d) 포비돈 B.P. 15 9
(e) 소듐 전분 글리콜레이트 20 12
(f) 마그네슘 스테아레이트 5 3
251 51
제제 C
mg /정
활성 성분 1
락토오스 200
전분 50
포비돈 5
마그네슘 스테아레이트 4
260
하기의 제제, D 및 E는 혼합된 성분의 직접 압착에 의해 제조한다. 제제 E에 사용된 락토오스는 직접 압착 타입이다.
제제 D
mg /정
활성 성분 1
전호화분(pregelatinised) 전분 NF15 150
151
제제 E
mg /정
활성 성분 1
락토오스 150
아비셀(Avicel)® 100
251
제제 F (방출 조절 제제)
상기 제제는 포비돈 용액을 이용한, (하기)성분들의 습식 과립법 및 뒤이은 마그네슘 스테아레이트의 첨가 및 압착에 의해 제조한다.
mg /정
(a) 활성 성분 1
(b) 히드록시프로필메틸셀룰로스 112
(메토셀 K4M 프리미엄)®
(c) 락토오스 B.P. 53
(d) 포비돈 B.P.C. 28
(e) 마그네슘 스테아레이트 7
201
약물 방출은 약 6-8시간 기간에 걸쳐 일어나고 12시간 후에 완료되었다.
실시예 D: 캡슐 제제
제제 A
캡슐 제제는 상기 실시예 C의 제제 D의 활성성분을 혼합하고 2 부분으로 나누어진 경질 젤라틴 캡슐(two-part hard gelatin capsule)에 충진하는 것에 의해 제조한다. 제제 B (아래)는 유사한 방법으로 제조한다.
제제 B
mg /캡슐
(a) 활성 성분 1
(b) 락토오스 B.P. 143
(c) 소듐 전분 글리콜레이트 25
(d) 마그네슘 스테아레이트 2
171
제제 C
mg /캡슐
(a) 활성 성분 1
(b) 마크로골(Macrogol) 4000 BP 350
351
캡슐은 마크로골 4000 BP를 용융시키고, 활성 성분을 용융물(melt)에 분산시키고, 상기 용융물을 2 부분으로 나누어진 경질 젤라틴 캡슐에 충진하는 것에 의해 제조한다.
제제 D mg /캡슐
활성 성분 1
레시틴 100
땅콩 오일(Arachis Oil) 100
201
캡슐은 레시틴 및 땅콩 오일에 활성 성분을 분산시키고 연질 엘라스틱 젤라틴 캡슐에 분산물을 충진하는 것에 의해 제조한다.
제제 E (방출 조절 캡슐)
하기 방출 조절 캡슐 제제는 압출기를 이용하여 성분 a, b, 및 c를 압출하고, 뒤이어 압출물의 구형화(spheronisation) 및 건조에 의해 제조한다. 건조된 펠렛을 이후 방출-조절 막 (d)으로 코팅하고 두 조각의, 경질 젤라틴 캡슐에 충진한다.
mg /캡슐
(a) 활성 성분 1
(b) 미정질 셀룰로스 125
(c) 락토오스 BP 125
(d) 에틸 셀룰로스 13
264
실시예 E: 주사 제제
활성 성분 1mg
무균, 무발열원 포스페이트 버퍼(pH7.0) 10 ml까지 채움
활성 성분을 대부분의 포스페이트 버퍼 (35-40℃)에 용해시키고, 이 후 최종 부피까지 채우고 멸균된 10 ml 앰버 유리 바이얼 (1 형) 안으로 멸균된 마이크로포어 필터를 통해 여과한 다음, 멸균된 마개 및 오버실(overseal)로 밀봉한다.
실시예 F: 근육내 주사
활성 성분 1mg
벤질 알콜 0.10 g
글루코푸롤(Glucofurol) 75® 1.45 g
주사용수 3.00 ml까지 채움 (q.s.)
활성 성분을 글리코푸롤(glycofurol)에 용해시킨다. 이 후 벤질 알콜을 첨가하고 용해시킨 다음 물을 3ml까지 첨가한다. 그 후 수득된 혼합물을 멸균 마이크로포어 필터로 여과한 다음 멸균된 3ml 유리 바이얼(1 형)에 밀봉한다.
실시예 G: 시럽 서스펜션( Syrup Suspension )
활성 성분 1mg
솔비톨 용액 1.5000 g
글리세롤 2.0000 g
분산성 셀룰로스 0.0750 g
소듐 벤조에이트 0.0050 g
향료, 복숭아 17.42.3169 0.0125 ml
정제수 5.0000 ml까지 채움 (q.s.)
소듐 벤조에이트fmf 정제수의 일부에 용해시키고 및 솔비톨 용액을 첨가한다. 활성 성분을 첨가하고 분산시킨다. 글리세롤 내에 증점제 (분산성 셀룰로스)를 분산시킨다. 두 개의 분산물을 혼합하고 정제수로 요구되는 부피까지 채운다. 추가 농후화(thickening)는 서스펜션의 추가 전단 가공에 의해 필요에 따라 달성한다.
실시예 H: 좌약
mg /좌약
활성 성분 (63 ㎛)* 1
경화 지방(Hard Fat), BP (Witepsol H15 - Dynamit Nobel) 1770
1771
*활성 성분은 입자의 90% 이상이 63 ㎛ 이하의 직경인 파우더로 사용된다.
Witepsol H15의 5분의 1을 최대 45℃에서 스팀-자켓 팬(team-jacketed pan)에서 용융시킨다. 활성 성분을 200 ㎛ 체(sieve)로 치고, 고루 잘 섞인 분산액(smooth dispersion)이 얻어질 때까지, 커팅 헤드(cutting head)가 달린 실베르손(silverson)을 사용하여, 혼합하면서 용융 염기에 첨가한다. 수득된 혼합물을 45℃에서 유지시키면서, 남아 있는 Witepsol H15을 현탁액에 첨가하고 균질한 혼합물이 되도록 교반한다. 전체 현탁액을 250 ㎛ 스텐레스 스틸 스크린(screen)을 통해 통과시키고, 지속적인 교반과 함께 40℃까지 냉각되게 한다. 38℃ 내지 40℃ 온도에서 혼합물의 2.02 g을 적절한 플라스틱 몰드(mould)안으로 충진한다. 좌약을 실온까지 냉각되게 한다.
실시예 I: 페서리( Pessaries)
mg / 페서리
활성 성분 1
무수 덱스트로스 380
감자 전분 363
마그네슘 스테아레이트 7
751
전술된 성분을 직접 혼합하였고 결과적으로 수득된 혼합물의 직접 압착에 의해 페서리(pessaries)를 제조한다.
실시예 12: 마우스 종양 모델에서의 예시적인 항체의 인비보 효과
본 발명의 항-CD40 항체의 항-종양 활성을 방광암 세포가 접종된 인간 CD40 형질전환(transgenic) 마우스에서 연구하였다. MB49 방광암 세포를 인간 CD40 형질전환 마우스 내로 피하 접종하였다. 마우스를 종양 주변에 G12 또는 대조군으로 7일차 및 10일차에 처리하였다. G12에 의한 처리는 이소형 대조군과 비교하여 유의성 있는 항-종양 효과를 가져온다.
기준 항체 S2C6은 인간 감마1 및 카파 불변 영역과 각각 융합된, 마우스(murine) 가변 도메인, VH 및 VL로 구성된 키메라 항-CD40 항체이다 (유럽 특허 번호 EP1885399, Francisco et al., 2000 Cancer Research). 따라서 상기 항체는 인간화된 항-CD40 항체 SGN-40의 유사체이다 (Law et al., 2005 Cancer Research). SGN-40은 임상 시험에서 연구되었다 (Advani et al., 2009 J Clinical Oncology; Hussein et al., 2010 Haematologica).
재료 및 방법
MB49 세포주는 C57BL/6 수컷 마우스로부터 유래하는 이행상피암(transitional cell carcinoma)을 유발하는 발암물질이다 (Summerhayes & Franks, 1979, Journal of the National Cancer Institute). MB49는 마우스 CD40을 발현하나 인간 CD40을 발현하지 않는다. G12는 마우스 CD40과 교차 반응하지 않으며, MB49 종양세포에 결합할 수 없다.
2.5 x 105개의 방광암 MB49 세포를 0일차에 암컷 인간 CD40 형질전환 C57BL/6 마우스의 측면에 피하 접종한다. 인간 CD40 형질전환 마우스는 마우스 CD40 결핍 (mCD40-/-) 배경에서 인간 야생형 CD40을 발현한다. 처리를 7일차에 시작하고 7일차 및 10일차 (2회 투여량)에 피하 종양의 종양 주변에 항체를 주입했다. 종양 부피는 캘리퍼(caliper)로 주 2회 측정하고 타원체 부피 공식에 의해 계산하였다. 마우스는 종양이 1cm3를 넘거나 또는 궤양이 발달할 경우 희생시켰다. 각 처리 후 4h에 혈청 시료를 채취했다. 혈청 시료 중 사이토카인 수준은 Mesoscale discovery platform (MSD, Gaithersburg, MD, USA)을 사용하여 Mouse ProInflammatory 7-Plex Ultra-Sensitive Kit로 분석하였다. 항체 역가는 샌드위치 ELISA를 사용하여 혈청에서 측정하였다. MB49 세포주는 C57BL/6 수컷 마우스로부터 유래하는 이행상피암(transitional cell carcinoma)을 유발하는 발암물질이다 (Summerhayes & Franks, 1979, Journal of the National Cancer Institute). MB49는 마우스 CD40을 발현하나 인간 CD40을 발현하지 않는다. G12는 마우스 CD40과 교차 반응하지 않으며 MB49 종양 세포에 결합할 수 없다.
결과
결과는 도 10에 표시된다.
G12에 의한 처리는 이소형 대조군과 비교하여 동물의 생존을 유의성있게 증가시킨다 (p < 0.013). G12로 처리된 마우스의 생존 곡선은 S2C6와 비교하였다 (p<0.13). S2C6으로 처리된 마우스의 생존률은 이소형 대조군과 비교하였다 (p<0.088).
실시예 13: 마우스 종양 모델에서의 예시적인 항체의 인비보 효과
처리된 동물의 보다 큰 군으로부터 풀링된 데이터를 이용하여 항-CD40 항체 인터루킨-6 (IL-6), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α) 및 케라티노사이트-유래 사이토카인 (KC) (케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 / CXCL1로도 알려짐)의 항-종양 활성을 연구하였다. G12 처리군은 20마리의 동물군을 포함하고, S2C6 처리군은 12마리의 동물을 포함하고, 이소형 대조군은 20마리의 동물을 포함하였다.
MB49 방광암 세포를 인간 CD40 형질전환 마우스에게 피하 접종하였다. 이 마우스를 7일차 및 10일차에 종양 주변에(peritumourally) G12, 또는 대조군으로 처리하였다. G12에 의한 처리는 이소형 대조군에 의해 처리된 군에 비하여 종양이 있는(tumour-bearing) 마우스의 생존률의 유의성 있는 증가를 제공한다 (도 11).
처리된 쥐로부터 혈청 시료를 채취하고 사이토카인 수준을 분석하였다. 처리 후 사이토카인 수준은 기준 항체 S2C6에 비하여 G12에 대한 면역 반응에서 보다 강력한 유도를 입증한다 (도 12).
재료 및 방법
0일차에 2.5 x 105개의 방광암 MB49 세포를 인간 CD40 형질전환 C57BL/6 암컷 쥐의 측면(flank)에 피하로 접종하였다. 인간 CD40 형질전환 마우스는 CD40이 결핍된 (mCD40-/-) 배경을 갖는 마우스에서 인간 야생형 CD40을 발현한다. 7일차에 처리를 시작하고 7일차 및 10일차 (2회 투여량)에 피하 종양에 의해 종양 주변에 항체를 주입하였다. 종양 부피를 캘리퍼에 의해 주당 2회 측정하고 타원체 부피 공식에 의해 계산하였다. 종양이 1㎤를 초과할 경우 또는 궤양이 발달될 경우 마우스를 희생시켰다. 혈청 시료를 각 처리 후 4 h에 채취하였다. 혈청 시료 중 사이토카인 수준을 Mesoscale discovery platform을 이용한 Mouse ProInflammatory 7-Plex Ultra-Sensitive Kit (MSD, Gaithersburg, MD, USA) 상에서 분석하였다. Graph Pad Prism 6.0 (GraphPad Software, Inc. La Jolla , CA)을 이용하여 통계 분석을 수행하였다.
결과
결과는 도 11 및 12에 나타낸다.
실시예 14: 항체 수준의 인비보 분석
처리된 마우스를 혈청 내의 항체 수준에 대하여 분석하였다. 혈청 시료를 제1 처리 (7일차) 및 제2 처리 (10일차) 후에 채취하였다. 항-CD40 항체에 대한 항체 역가는 기준 항체와 비교하여 유의성있게 낮았다. 데이터를 도 13에 나타낸다.
재료 & 방법
실시예 I 에서 기술된 실험으로부터 제1 처리 (7일차) 및 제2 처리 (10일차) 후 4h에 채취된 혈청 시료를 항체 수준에 대하여 분석하였다. 혈청 중 항체 역가를 샌드위치 ELISA를 사용하여 측정하였다.
G12 처리 군은 23마리의 마우스(N=23)로 구성되고, S2C6 기준 항체 처리군은 23마리의 마우스(N=23)로 구성되며, 이소형 대조군의 처리군은 18마리의 마우스(N=18)로 구성되었다.
결과
결과는 도 13에 나타낸다.
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ggagcagctc caacatcggg gcgggttaca atgtatactg gtatcagcag 120 ctcccaggaa cggcccccaa actcctcatc tatggtaaca tcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cagtgggctc 240 cggtccgagg atgaggctga ttattactgt gcagcatggg ataagagcat ttctggtctg 300 gttttcggcg gaggaaccaa gctgacggtc ctaggt 336 <210> 46 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody clone H12 <400> 46 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttata atgtatactg gtatcagcag 120 ctcccaggaa cggcccccaa actcctcatc tatggtaaca tcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cagtgggctc 240 cggtccgagg atgaggctga ttattactgt gcagcatggg atgacagcct gagtggtctg 300 gttttcggcg gaggaaccaa gctgacggtc ctaggtgagt agaacgtacg ctagcaagct 360 tggatccacg atcctgagca aggacctctg ccctccctgt tcagaccctt gcttgcctca 420 gcaggtcatt acaaccactt cacctctgac cgcaggggca ggggactaga tagaatgacc 480 tactgagcct cgtctgtctg tctgtctgtc tctctgtttg tctgtctgtc tctctgtttg 540 tctctctgtc tgtctgacag gcgcaggctg ggtctctaag ccttgttctg ttctggcctc 600 ctcagtctgg gttcttgtcg gaacagcttt gcccttgggt tacctgggtt ccatctcctg 660 gggaattggg aacaaggggt ctgagggagg cacctcctgg gagactttag aaggacccag 720 tgccctcggg gctgatgctc ggga 744 <210> 47 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody clones B9 and H11 <400> 47 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttata atgtatactg gtatcagcag 120 ctcccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca tcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cagtgggctc 240 cggtccgagg atgaggctga ttattactgt gcagcatggg atggcggcct gctgggtctg 300 gttttcggcg gaggaaccaa gctgacggtc ctaggt 336 <210> 48 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody clone C4 <400> 48 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgcactg ggagcacctc caacatcggg gcaggttaca aagtatattg gtatcagcag 120 ctcccaggaa cggcccccaa actcctcatc tatggtaaca tcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cagtgggctc 240 cggtccgagg atgaggctga ttattactgt gcagcatggg atgacagcct gagtggtctg 300 gttttcggcg gaggaaccaa gctgacggtc ctaggt 336 <210> 49 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody clone A4 <400> 49 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gctttcatat attagtggtg gtagtagtta cattttctac 180 gcagactcag tgaggggccg attcaccatc tccagagaca actccgagaa cgcgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaatatta 300 agaggcggga gcggtatgga cctctggggc caaggtacac tggtcaccgt gagctca 357 <210> 50 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody clone A5 <400> 50 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gctttcatat attagtggtg gtagtagtta cattttctac 180 gcagactcag tgaggggccg attcaccatc tccagagaca actccgagaa cgcgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaatatta 300 agaggcggga gcggtatgga cctctggggc caaggtacac tggtcaccgt gagctca 357 <210> 51 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody clone C4 <400> 51 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gctttcatat attagtggtg gtagtagtta cattttctac 180 gcagacacag tgaggggccg attcactatc tccagagaca actccgagaa cgcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaatatta 300 agagggggga gcggtatgga cctctggggc caaggtacac tggtcaccgt gagctca 357 <210> 52 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody clone G4 <400> 52 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gctttcatat attagtggtg gtagtagtta cattttctac 180 gcagactcag tgaggggccg attcaccatc tccagagaca actccgagaa cgcgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaatatta 300 agaggcggga gcggtatgga cctctggggc caaggtacac tggtcaccgt gagctca 357 <210> 53 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody clone F6 <400> 53 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acttatggca tgcactgggt tcgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gctttcatat attagtggtg gtagtagtta cattttctac 180 gcagactcag tgaggggccg attcaccatc tccagagaca actccgagaa cgcgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaatatta 300 agaggcggga gcggtatgga cctctggggc caaggtacac tggtcaccgt gagctca 357 <210> 54 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody clone F9 <400> 54 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gctttcatat attagtggtg gtagtagtta cattttctac 180 gcagactcag tgaggggccg attcaccatc tccagagaca actccgagaa cgcgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaatatta 300 agaggcggga gcggtatgga cctctggggc caaggtacac tggtcaccgt gagctca 357 <210> 55 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody clone G12 <400> 55 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gctttcatat attagtggtg gtagtagtta cattttctac 180 gcagactcag tgaggggccg attcaccatc tccagagaca actccgagaa cgcgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaatatta 300 agaggcggga gcggtatgga cctctggggc caaggtacac tggtcaccgt gagctca 357 <210> 56 <211> 774 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody clone H12 <400> 56 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gctttcatat attagtggtg gtagtagtta cattttctac 180 gcagactcag tgaggggccg attcaccatc tccagagaca actccgagaa cgcgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaatatta 300 agaggcggga gcggtatgga cctctggggc caaggtacac tggtcaccgt gagctcaggt 360 gagtcgtacg ctagcaagct ttctggggca ggccaggcct gaccttggct ttggggcagg 420 gagggggcta aggtgaggca ggtggcgcca gccaggtgca cacccaatgc ccatgagccc 480 agacactgga cgctgaacct cgcggacagt taagaaccca ggggcctctg cgccctgggc 540 ccagctctgt cccacaccgc ggtcacatgg caccacctct cttgcagcct ccaccaaggg 600 cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct 660 gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc 720 cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcacgac tcta 774 <210> 57 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody clones B9 and H11 <400> 57 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gctttcatat attagtggtg gtagtagtta cattttctac 180 gcagactcag tgaggggccg attcaccatc tccagagaca actccgagaa cgcgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaatatta 300 agaggcggga gcggtatgga cctctggggc caaggtacac tggtcaccgt gagctcaggt 360 gagtcgtacg ctagcaagct ttctggggca ggccaggcct gaccttggct ttggggcagg 420 420 <210> 58 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody B44 <400> 58 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asn Ile Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 59 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody B44 <400> 59 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttata atgtatactg gtatcagcag 120 ctcccaggaa cggcccccaa actcctcatc tatggtaaca tcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cagtgggctc 240 cggtccgagg atgaggctga ttattactgt gcagcatggg atgacagcct gagtggtctg 300 gttttcggcg gaggaaccaa gctgacggtc ctaggt 336 <210> 60 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody B44 <400> 60 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Ala Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Leu Arg Gly Gly Ser Gly Met Asp Leu Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 61 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody B44 <400> 61 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gctttcatat attagtggtg gtagtagtta cattttctac 180 gcagactcag tgaggggccg attcaccatc tccagagaca actccgagaa cgcgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaatatta 300 agaggcggga gcggtatgga cctctggggc caaggtacac tggtcaccgt gagctca 357 <210> 62 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 63 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 64 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary framework mutations <400> 64 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Leu Arg Gly Gly Ser Gly Met Asp Leu Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 65 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary framework mutations <400> 65 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gctttcatat attagtggtg gtagtagtta cattttctac 180 gcagactcag tgaggggccg attcaccatc tccagagaca actccgagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaatatta 300 agaggcggga gcggtatgga cctctggggc caaggtacac tggtcaccgt gagctca 357 <210> 66 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary framework mutations <400> 66 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Leu Arg Gly Gly Ser Gly Met Asp Leu Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 67 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary framework mutations <400> 67 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gctttcatat attagtggtg gtagtagtta cattttctac 180 gcagactcag tgaggggccg attcaccatc tccagagaca actccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaatatta 300 agaggcggga gcggtatgga cctctggggc caaggtacac tggtcaccgt gagctca 357

Claims (75)

  1. CD40에 대한 다가 결합 특이성을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서,
    상기 항체 또는 항원-결합 단편은 하기의 CDR을 포함하는 가변 경쇄 (VL)를 포함하고:
    (i) 서열번호 4 및 서열번호 10 및 서열번호 12; 또는
    (ii) 서열번호 5 및 서열번호 10 및 서열번호 13; 또는
    (iii) 서열번호 6 및 서열번호 10 및 서열번호 14; 또는
    (iv) 서열번호 7 및 서열번호 11 및 서열번호 15; 또는
    (v) 서열번호 8 및 서열번호 10 및 서열번호 16; 또는
    (vi) 서열번호 9 및 서열번호 10 및 서열번호 17; 또는
    (vii) 서열번호 9 및 서열번호 10 및 서열번호 12; 또는
    (viii) 서열번호 9 및 서열번호 10 및 서열번호 18;
    상기 항체 또는 항원-결합 단편은 CDR1이 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 가변 중쇄 (VH)를 포함하고:
    GFTFSTYGMH [서열번호 28]
    상기 항체 또는 항원-결합 단편은 CDR2가 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 가변 중쇄 (VH)를 포함하고:
    GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR [서열번호 29]
    상기 항체 또는 항원-결합 단편은 CDR3이 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 가변 중쇄 (VH)를 포함하는 것인 항체 또는 항원-결합 단편:
    CARILRGGSGMDL [서열번호 30].
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 수지상 세포 활성화에 대해, 서열번호 58의 가변 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호 60의 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 B44 항체보다, 더 높은 효능을 갖는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL)를 포함하는 것인 항체 또는 항원-결합 단편:
    서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 21; 서열번호 22;
    서열번호 23; 서열번호 24; 서열번호 25; 서열번호 26;
    및 서열번호 27.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH)를 포함하는 것인 항체 또는 항원-결합 단편:
    서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 33; 서열번호 34;
    서열번호 35; 서열번호 36; 서열번호 37; 서열번호 38;
    및 서열번호 39.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 하기의 CDR을 포함하는 것인 항체 또는 항원-결합 단편:
    (i) 서열번호 4 및 서열번호 10 및 서열번호 12 및 서열번호 28 및 서열번호 29 및 서열번호 30; 또는
    (ii) 서열번호 5 및 서열번호 10 및 서열번호 13 및 서열번호 28 및 서열번호 29 및 서열번호 30; 또는
    (iii) 서열번호 6 및 서열번호 10 및 서열번호 14 및 서열번호 28 및 서열번호 29 및 서열번호 30; 또는
    (iv) 서열번호 7 및 서열번호 11 및 서열번호 15 및 서열번호 28 및 서열번호 29 및 서열번호 30; 또는
    (v) 서열번호 8 및 서열번호 10 및 서열번호 16 및 서열번호 28 및 서열번호 29 및 서열번호 30; 또는
    (vi) 서열번호 9 및 서열번호 10 및 서열번호 17 및 서열번호 28 및 서열번호 29 및 서열번호 30; 또는
    (vii) 서열번호 9 및 서열번호 10 및 서열번호 12 및 서열번호 28 및 서열번호 29 및 서열번호 30; 또는
    (viii) 서열번호 9 및 서열번호 10 및 서열번호 18 및 서열번호 28 및 서열번호 29 및 서열번호 30.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 하기의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH)를 포함하는 것인 항체 또는 항원-결합 단편:
    (i) 서열번호 19 및 서열번호 31; 또는
    (ii) 서열번호 20 및 서열번호 32; 또는
    (iii) 서열번호 21 및 서열번호 33; 또는
    (iv) 서열번호 22 및 서열번호 34; 또는
    (v) 서열번호 23 및 서열번호 35; 또는
    (vi) 서열번호 24 및 서열번호 36; 또는
    (vii) 서열번호 25 및 서열번호 37; 또는
    (viii) 서열번호 26 및 서열번호 38; 또는
    (ix) 서열번호 27 및 서열번호 39.
  9. 청구항 1에 있어서, IgG1 항체로부터 항체 Fc-영역을 포함하는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 Fc-영역은 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.
  11. 청구항 1에 있어서, 세포독성 모이어티(moiety)를 더 포함하는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 세포독성 모이어티는 비-세포독성 전구약물(prodrug)을 세포독성 약물로 전환할 수 있거나, 또는 상기 세포독성 모이어티는 방사선-민감제 (radio-sensitiser)인 것인 항체 또는 항원-결합 단편.
  13. 청구항 1, 2, 및 5 내지 12 중 어느 한 항에서 정의된 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 구성 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 핵산 분자.
  14. 청구항 13에서 정의된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  15. 청구항 13에서 정의된 핵산 분자를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  16. 청구항 1, 2, 및 5 내지 12 중 어느 한 항에서 정의된 항체 또는 항원-결합 단편의 유효량, 및 약학적으로 허용가능한 버퍼, 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, 종양 부위에 또는 종양 부위 가까이에 국소 투여(local administration)를 위한 것인 약학적 조성물.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 국소 투여는 종양 세포 내(intra-tumourally) 또는 종양 세포 주위(peri-tumourally)에 투여하는 것인 약학적 조성물.
  19. 청구항 16에 있어서, 상기 암은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물: 전립선암; 유방암; 대장암; 췌장암; 난소암; 폐암; 자궁경부암; 횡문근육종; 신경아세포종; 다발성 골수종; 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 흑색종, 방광암 및 교모세포종.
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