CN101768570A

CN101768570A - 一种富集和提取成体干细胞的方法

Info

Publication number: CN101768570A
Application number: CN200910013604A
Authority: CN
Inventors: 王世立; 韩金祥; 丁宁; 李俊玲
Original assignee: Shandong Provincial Pharmaceutical Biological Tech Research Center
Current assignee: Shandong Provincial Pharmaceutical Biological Tech Research Center
Priority date: 2009-01-04
Filing date: 2009-01-04
Publication date: 2010-07-07

Abstract

本发明提供一种从人或动物体内提取和富集成体干细胞的方法，即将一种生理上可接受的、多孔的三维组织工程材料埋植到人或动物体内，使成体干细胞在材料中富集，然后从材料中分离得到干细胞。纯化并增殖捕获的干细胞后，可实现自体移植。

Description

一种富集和提取成体干细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种成体干细胞的获得方法，尤其涉及一种肌肉干细胞、脂肪干细胞等的捕获、提取和富集方法，属生物和医学技术领域。

背景技术

干细胞是一种未分化细胞，其基本特性为：具有自我复制能力，产生出与自己完全相同的子细胞；分化为一种以上的功能细胞。根据分化阶段不同干细胞可分为来源于受精卵等早期胚胎的胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)和来源于成年动物或未成年动物组织的成体干细胞(adult stem cells，ASC)。干细胞研究不仅对人类发育生物学研究有重要的科学价值，更重要的是它可以作为临床细胞治疗和人工组织或器官构建的种子细胞，在肿瘤、各种退行性疾病治疗及创伤修复、组织或器官功能重建等方面发挥作用；另外，干细胞能够作为基因治疗的载体工具而被应用于基因治疗。总之，干细胞给诸如帕金森病、糖尿病、慢性心脏病、白血病、骨缺损等严重危害人类生命、降低人群生活质量疾病的彻底治疗带来了无限的希望和曙光。因干细胞研究在理论和临床实践上的重要意义，近年来成为生物医学领域研究的热点。目前ESC的研究由于受伦理学争议、免疫排斥、实验技术限制等影响，阻碍了其在临床治疗中的应用，同时ASC的研究异军突起，成为近年来研究的热点，虽然ASC可能不具有ESC那样的全能性，但它有很强的“可塑性”，可以横向分化(transdifferentiation)为不同类型的特化细胞，由于ASC可以克服ESC应用所面临的问题，可以实现自体细胞移植，因此临床意义更加重要，ASC将是未来干细胞应用和研究的大趋势。

组织工程和细胞治疗的目的是利用干细胞的可塑性和迁移能力的优势，去重建缺损组织或者是患病组织。许多研究者在成体干细胞上的研究证明：组织特异性细胞可以分化成为多种细胞系。大量实验证实，肌源干细胞(muscle-derived stem cell，MDSC)可以分化成为多种细胞系，包括造血细胞、神经细胞、平滑肌细胞，并在分化成为其他细胞系后还保留成肌细胞的潜能，2005年台湾的学者发现肌肉来源的干细胞在体外也可以发育分化成为骨。现在，MDSC不但被用于肌营养失调(muscular dystrophies)的治疗，而且被用于其他肌肉损伤的修复，并被普遍用于心脏和平滑肌损伤的修复，有实验证明，MDSC甚至可以改善切除神经的尿道括约肌功能，因此，MDSC具有广泛的应用前景。

2004年Bauermeister等证明肌肉中的干细胞可以迁移到骨髓，骨髓中的干细胞也可以在肌肉中出现，即肌肉和骨髓之间有很强的干细胞交流。他们用Y染色体特异基因探针原位杂交技术和定量PCR技术，证明在骨髓干细胞移植后，大量骨髓干细胞位于受体动物肌肉组织的血管内和血管外空间。Kucia等认为：在骨髓中本来就居住着组织特异性干细胞，如肌肉干细胞、神经干细胞、肝干细胞/祖细胞等，骨髓不仅是骨髓干细胞而且也是组织特异性干细胞的“家”(home)或者称“躲藏地”(hide-out place)，在应激和组织损伤时，居住在骨髓中的组织特异性干细胞，可以动员进入血液。他们用实时RT-PCR检测，在人和鼠上均发现，当G-SCF动员时，其组织特异性细胞标志物在血液中的单个核细胞上的表达水平增加。日本学者Tsuboi等检测了年轻人和成年人的肌源造血细胞，发现虽然肌肉造血干细胞数量(CD45⁺)较少，但是它出现的频率却是外周血的大约4倍多^[32]。他们提出：人骨骼肌具有造血细胞储存库(reservoir)的功能。这些观点和实验结果说明干细胞的可塑性或者横向分化在理论上也许需要继续进行严格实验的证明和探讨，但是同时也暗示：从骨骼肌(也许是任何组织)中可以提取得到多种组织特异性干细胞。

有研究证明，MDSC保持多能性和自我更新能力，自体MDSC移植与骨髓细胞移植效果没有明显区别(P＝0.9)。

目前提取MDSC的方法是取出肌肉剪碎，再进行体外分离培养，这是一项具有严重组织破坏性的方法，同时操作复杂、费时、技术要求高。

发明内容

本发明的目的在于公开利用一种多孔三维组织工程材料，从人或其他动物的体内提取、富集成体干细胞，所述的方法简易且对组织的损失性小，获得细胞密度大，是可实现自体移植的、能在临床上实用的方法。

本发明的组织工程材料具有以下特点：1、具有良好的生物相容性，在体内不会引起毒性反应、炎症反应和排异反应；2、具有良好的材料-细胞界面，有利于细胞的黏附、扩展和增殖；3、具有一定的力学强度；4、具有三维立体的多孔结构，孔隙率应达到85％以上，具有高的面积体积比，有利于细胞迁移和生长。

本发明分离获得的部分，表达CD34⁺，CD45⁺，Sca-1⁺，成体干细胞部分细胞表达CD105，有体外分化的能力，经过纯化可以大。

本发明设计了一种新的、简易的提取、富集成体干细胞方法，这种发明可以应用于临床自体移植。

为了实现上述的目的，本发明采用的技术方案为：将多孔组组织材料埋植于体内，如：肌肉肌间隙、皮下、腹腔等，干细胞即会迁移进入多孔组织工程三维材料中从而被富集。技术路线如下：

本发明的优点：只要将多孔三维组织工程材料埋植于体内，干细胞即会进入多孔组织工程材料中从而被富集而获得。此方法与目前取出组织、剪碎再培养分离的方法相比，不但方法简单，损伤小，而且细胞密度大，因此富集成体干细胞效率高，进行干细胞计数，发现干细胞数量比率在1.02％-4.29％之间，与对照组骨髓中干细胞数量比率1.87％-4.15％相比，相差不大。

本发明干细胞的提取方法包括如下步骤：

1)在人或动物的体内埋植多孔组织工程三维材料，经过一段时间(3天至15天)后，取出材料；

2)获得埋植材料中捕获的细胞，纯化并增殖细胞；

3)取部分细胞，可经过免疫荧光、流式细胞术等方法进行细胞比率测定；

4)进行自体移植。

附图是本发明方法获得的迁移细胞和显示干细胞表面标志特征及具有造血干细胞特征的细胞，说明本发明的方法具有可行性和实用性。

附图说明：

图1，14天捕获细胞进行体外培养5天的结果图，显示捕获细胞具有旺盛的增殖能力。箭头所指为多孔三维组织工程材料。

图2，Sca-1和CD34双重荧光标记后的结果图，A图为Sca-1，CD34标记下细胞的明场图；B与C图分别为CD34(红)，Sca-1(绿)干细胞标记后的阳性图，D图为图A，B，C叠加之后的效果图。

图3，捕获细胞在造血分化培养基的克隆集落结果图，说明所获得的细胞具有造血干细胞特征。

实施例：

下面通过实施例具体详细地说明本发明，但本发明并不受实施例的任何限定。

实施例1

将明胶海绵制成适宜的规格，经环氧乙烷或者其他方法灭菌后，埋植于人或动物前肢或后肢肌肉肌间隙；一定时间(3天至15天)后，无菌条件下取出材料，分离、培养细胞。

纯化分离得到的捕获细胞，采用流式细胞术、免疫荧光、免疫酶化学等方法鉴定细胞组成后，进行自体细胞移植或者作为组织工程的种子细胞加以应用。

实施例2

将聚乳酸多孔三维组织工程材料制成适宜的规格，经环氧乙烷或者其他方法灭菌后，埋植于人或动物前肢或后肢肌肉肌间隙；一定时间(3天至15天)后，无菌条件下取出材料，分离细胞。

实施例3

将符合要求的天然海绵多孔三维组织工程制成实验所适宜的规格，经环氧乙烷或者其他方法灭菌后，埋植于人或动物的人或动物前肢或后肢肌肉肌间隙；一定时间(3天至15天)后，无菌条件下取出材料，分离细胞。

实施例4

将各种符合要求的多孔三维组织工程制成实验所适宜的规格，经环氧乙烷或者其他方法灭菌后，埋植于人或动物的皮下组织中；一定时间(3天至15天)后，无菌条件下取出材料，分离细胞。

纯化分离得到的捕获细胞，采用流式细胞术、免疫荧光、免疫酶化学等方法鉴定细胞组成后，进行自体移植。

实施例5

将符合要求的多孔三维组织工程制成实验所适宜的规格，经环氧乙烷或者其他方法灭菌后，埋植于人或动物的腹腔或脂肪组织中；一定时间(3天至15天)后，无菌条件下取出材料，分离细胞。

实施例6

将符合要求的多孔三维组织工程制成实验所适宜的规格，经环氧乙烷或者其他方法灭菌后，埋植于人或动物的组织中；按各细胞因子时间的要求，皮下注射细胞因子Op-1或G-CSF或M-CSF或GM-CSF进行干细胞动员，一定时间(3天至15天)后，无菌条件下取出材料，分离细胞。

实施例7

将符合要求的多孔三维组织工程制成实验所适宜的规格，将细胞因子Op-1或G-CSF或M-CSF或GM-CSF复合于材料上，经环氧乙烷或者其他方法灭菌后，埋植于人或动物的组织中；一定时间(3天至15天)后，无菌条件下取出材料，分离细胞。

纯化分离得到的捕获细胞，采用流式细胞术、免疫荧光等方法鉴定细胞组成后，进行自体移植。

Claims

1.一种提取和富集成体干细胞的方法，其特征是通过在人或其他动物的体内埋植一种多孔的三维组织工程材料，使成体干细胞在三维多孔材料中富集，然后从材料中分离得到干细胞，干细胞经过纯化增殖可实现自体移植。本发明方法获得的干细胞具有避免伦理争议、免疫排斥、并可实现自体移植的优势。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征包括如下关键步骤：

1)在人或其他动物的体内埋植多孔的三维组织工程材料，经过一段时间后，取出富集有干细胞的材料；

2)获得埋植材料中捕获的细胞，纯化并增殖干细胞；

3)可通过免疫荧光、免疫酶化学、流式细胞术等方法对获得的干细胞进行分析鉴定；

4)进行自体移植。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是最终获得的是成体干细胞。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所获得的成体干细胞可实现自体移植。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是所获得的成体干细胞，可直接或者经过体外纯化、增殖实现自体移植。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征是体内埋植的部位为前肢或后肢的肌肉肌间隙。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征是体内埋植的部位为皮下组织。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征是体内埋植的部位为腹腔或脂肪组织中。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征是在体内埋植多孔三维组织工程材料，可加入细胞因子，动员细胞富集于材料中。细胞因子可富集于材料上，也可采用皮下注射的方法注入体内。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征是体内埋植的材料为生理上可接受的、具有一定强度的、具有良好生物相容性的多孔三维组织工程材料，包括：明胶海绵、海绵或利用多聚乳酸等材料制备的组织工程材料，以及一系列符合上述条件的多孔三维组织工程材料。