CN1233844C - HIF－1α在治疗白血病药物的筛选中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明关于HIF-1α在诱导分化治疗白血病药物的筛选中的应用，其通过将HIF-1α作为药物靶标，在低氧环境下来筛选可对白血病细胞产生分化作用的药物。利用HIF-1α作为药物靶标，可筛选出氯化钴用于实现对白血病细胞的分化作用。所述白血病细胞是指NB4细胞、U937细胞及Kasumi细胞和各型AML细胞等。
Description
技术领域
本发明关于HIF-1α在治疗白血病药物的筛选中的应用，其通过将HIF-1α作为药物靶标，在低氧环境下来筛选可对白血病细胞产生分化作用的药物。
背景技术
白血病是严重危害人类生命健康的造血系统恶性肿瘤。其中，急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)由于起病急，病死率高等特点而受到更为广泛的重视。另一方面，由于白血病取材方便，并且易于观察疗效，有关AML发病学和治疗学的研究在过去十多年中所取得的进展令人瞩目。人们相信，未来肿瘤治疗学上的突破很有可能首先源自于对白血病的研究。已知大多数白血病细胞存在特异的细胞遗传学改变，尤其是染色体易位。这些易位常常形成异常融合基因和产生相应的融合蛋白，干扰造血干细胞的正常分化过程并使该过程受阻于某一分化阶段。例如，约占成人AML10-15％的急性早幼粒细胞性白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)以骨髓粒系细胞发育停滞在早幼粒细胞阶段为特征。它的发生与位于人类17号染色体长臂上的维甲酸受体α(retinoic acid receptorα，RARα)基因的异常重排密切相关。现已发现，95％以上的APL患者的白血病细胞存在非随机染色体易位t(15；17)(q22；q21)，该染色体易位使17号染色体上的RARα基因与15号染色体上的PML(promyelocyticleukemia)基因融合，形成PML-RARα融合基因。一些变异型染色体易位也存在少数APL病人中，并且几乎毫无例外地累及RARα。这些易位包括t(11；17)(q23；q21)、t(11；17)(q13；q21)、t(5；17)(q35；q21)和dup(17)(q21.3；q23)，它们分别产生PLZF-RARα、NuMA-RARα、NPM-RARα和STAT5b-RARα融合基因。这些融合基因蛋白产物均对野生型RARα具有显性负调节作用，被认为是APL发病的直接原因。
上世纪八十年代中期，我国学者率先运用全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)治疗APL，并在临床实践中取得良好疗效。缓解率达到了90％以上，为肿瘤的治疗提供了全新的模式——“诱导分化治疗”(differentiation therapy)，即运用诱导分化剂诱导白血病细胞向成熟阶段分化，恢复其正常的表型及功能，同时抑制恶性肿瘤细胞的增殖。诱导分化疗法正日益受到众多学者的关注，但迄今为止，诱导分化治疗的成功模式仍限于ATRA治疗APL。因此，该治疗模式在其它类型的白血病以及实体瘤中取得突破是各国学者共同追求的目标，也是当今医学研究的重要热点之一。
上世纪末，我国学者成功地应用三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)治疗ATRA治疗后复发以及对ATRA和化疗药物不敏感的难治性APL病人，并在短期内得到世界大多数国家和地区的广泛证实。于是，许多医学实验室致力于对ATO治疗APL的药理机制的研究。体外实验证实，ATO具有双重性的药理效应，即高浓度(1-2μM)的ATO能有效地诱导APL细胞凋亡，而低浓度(0.1-0.5μM)ATO经过长时间的处理，则可诱导APL细胞发生部分分化。但是，APL动物模型以及临床实验观察提示，ATO的治疗效果在很大程度上取决于其对细胞的诱导分化效应。另一方面，越来越多的体外研究显示，ATO的凋亡诱导效应并不局限于APL，它也可以诱导许多其它白血病和实体瘤细胞凋亡。但是，迄今为止尚未见到ATO对APL以外的恶性肿瘤治疗效果的报道。
基于ATO的体外诱导分化效应远不如其在白血病病人体内的作用效应明显，我们推测存在体内骨髓微环境中的某些因素可能影响ATO的诱导分化作用，而氧浓度可能属于这些影响因素之一，因为体外细胞培养通常在氧浓度为21％左右的大气环境中；而人体内环境的氧分压却要低得多，如肺泡的氧浓度仅为16％，而人体其它脏器的氧浓度均低于6％。虽然在骨髓中恶性增殖的白血病细胞，并未形成如同于实体瘤的局部病灶所形成的低氧环境，然而AML病人中普遍存在贫血等症状，并且随着白血病细胞的迅速增生，可能进一步加重骨髓中的低氧状况。事实上，Jensen等科学家最近的发现也证实了这种推测。他们发现移植到Brown Norwegan小鼠的白血病细胞在骨髓中呈现明显的低氧状态。
低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是受控于氧浓度变化一个至关重要的转录因子。HIF-1由α和β亚基组成。这些亚基都属于具有螺旋一环一螺旋(BHLH)/Per-Arnt-Sim(PAS)结构域的蛋白家族成员。该家族由两大类蛋白质组成。第一类包括HIF-1α、HIF-2α(EPAS-1/HLF/HRF/MOP2)和HIF-3α。第二类则有Arnt1(HIF-1β)、Arnt2和Arnt 3。其中HIF-1α是依赖于低氧情况而存在的转录因子，它在维持氧浓度平衡中起着举足轻重的作用。HIF-2α和HIF-3α的表达同样也受到氧浓度的调节，但与HIF-1α相比，它们更具有组织特异性功能。HIF-1的活性实际上依赖HIF-1α的稳定表达。在正常氧浓度时，HIF-1α受细胞内泛素的蛋白酶体系统的作用发生降解。而在低氧时，HIF-1α稳定表达并转移至细胞核与HIF-1β形成异二聚体。此异二聚体作用于靶基因的低氧反应元件(HRE)，启动一系列基因的转录，产生特定的蛋白质调节对低氧的适应性反应而维持机体内氧稳态。HIF-1在心脏缺血、大脑缺氧、慢性阻塞性肺病、肿瘤中都有过度表达。
虽然目前关于低氧和HIF-1α的研究涉及很多领域，但迄今为止，还没有关于其在白血病分化中的作用以及如何利用低氧和HIF-1α相关的信号传导途径诱导分化治疗白血病的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供HIF-1α在治疗白血病药物的筛选中的应用，其通过将HIF-1α作为药物靶标，在低氧环境下来筛选可对白血病细胞产生分化作用的药物。
本发明的技术要点是：提供HIF-1α在治疗白血病药物的筛选中的应用，其特征在于：通过将HIF-1α作为药物靶标，来筛选能使HIF-1α的降解被抑制、从而对白血病细胞产生分化作用的药物。
利用低氧环境抑制HIF-1α-4-脯氨酰羟化酶的活性，使得HIF-1α的降解被抑制的特性，可将HIF-1α用于筛选适当的低氧模拟物用于使白血病细胞进行分化
本发明利用HIF-1α作为药物靶标，筛选出氯化钴用于实现对白血病细胞的分化作用。所述白血病细胞是指NB4细胞、U937细胞及Kasumi细胞和各型AML细胞等。
本发明利用低氧环境抑制HIF-1α-4-脯氨酰羟化酶的活性，使得HIF-1α的降解被抑制的特性，来筛选适当的药物，尤其是可能的低氧模拟物，用于使白血病细胞进行分化，从而达到治疗白血病的目的。
附图说明
图1是CoCl2对NB4细胞的生长、活力和细胞周期的影响的示意图。
图1A是不同浓度的CoCl2对NB4细胞生长影响的示意图。
图1B是不同浓度的CoCl2对NB4细胞活力影响的示意图。
图1C是用25μM和50μM CoCl2处理3天后，对NB4细胞细胞周期影响的示意图。
图1D是NB4细胞经过50μM CoCl2、0.5μMATO以及联合用药后第3天时AnnexinV检测的示意图。
图2是25μM和50μM CoCl2诱导NB4细胞分化的示意图。
图2A是用25μM和50μM CoCl2处理NB4细胞6天时的形态学观察示意图。
图2B是经25μM和50μM CoCl2处理2、4、6天时的NB4细胞CD11b的表达增加的示意图。
图3是50μM CoCl2和/或0.5μM ATO与0.1μM ATRA处理NB4细胞3天对PML/PML-RARα细胞内定位的影响示意图。
图4是经50μM CoCl2和/或0.5μM ATO与0.1μM ATRA处理3天后，NB4细胞的PML-RARα蛋白表达情况的示意图。
图5是CoCl2对于ATRA和ATO诱导NB4细胞分化的影响示意图。
图5A是NB4经过50μM CoCl2和/或0.1μM ATRA处理4后，对CD11b以及CD14影响的示意图。
图5B是NB4经过50μM CoCl2和/或0.5μM ATO处理4天后，对CD11b表达影响的示意图。
图6是CoCl2诱导U937和Kasumi-1细胞分化，但不诱导HL60细胞发生分化。
图6A是U937细胞经过25μM和50μM CoCl2处理后第6天的形态学改变及其细胞表面抗原CD11b的表达情况示意图。
图6B是Kasumi-1细胞经过50μM CoCl2处理至第6天的形态学变化示意图。
图6C是Kasumi-1细胞经过50μM CoCl2诱导后对细胞表面抗原CD11b影响的示意图。
图6D是HL60细胞经50μM CoCl2处理后对其表面抗原CD11b影响的示意图。
图7是2％O2诱导U937细胞发生成熟相关的形态学改变示意图。
图8是CoCl2对来源于AML病人的新鲜白血病细胞的诱导分化情况的示意图。
图8A是用50μM的CoCl2处理6天后，对新鲜白血病细胞表面抗原CD11b表达的影响的示意图。
图8B是来自AML-M2型白血病病人的新鲜细胞，经过50μM的CoCl2处理6天后出现了明显的形态学改变示意图。
图9是NB4细胞经过50μM CoCl2处理48小时以后，对C-myc和P53蛋白水水平的影响的示意图。
图10是50μM CoCl2处理后，对白血病细胞中HIF-1α蛋白水平的影响的示意图。
图11是用HIF-1α的特异性抑制剂SIN-1处理后，对白血病细胞NB4分化的影响的示意图。
图11A是SIN-1能够明显地抑制HIF-1α蛋白的稳定性表达示意图。
图11B是HIF-1α蛋白的特异性抑制剂SIN-1对NB4细胞生长的影响示意图。
图11C是HIF-1α蛋白的特异性抑制剂SIN-1降低CoCl2诱导的NB4细胞分化指标CD11b的表达示意图。
具体实施方式
现结合具体实验及其结果分析和相应的说明书附图，对本发明CoCl2在制备治疗白血病的药物中的应用作进一步详细说明。
本发明涉及人转录调控因子的分离和功能研究，调控该转录因子表达的药物、抗体等化合物和方法。转录调控因子可以广泛定义为组成性和组织特异性的，其中之一是低氧诱导因子1(HIF-1)，该基因及其产物在表1所述的30多个基因的转录中具有重要作用。而且，低氧诱导因子1可能还在尚未发现的诸多基因的转录中发挥重要调控作用。
表1是将U937细胞放置于2％的O2中培养时，相应的细胞表面抗原的检测。表1中所示的这些基因主要涉及血管形成、血管重建、葡萄糖和能量代谢、细胞的增殖及存活，红细胞生成等。
表1 低氧诱导因子(HIF-1)的靶基因
HIF-1参与的生理功能 HIF-1靶基因
氧气的运输：红细胞生成 促红细胞生成素
运铁蛋白
运铁蛋白受体
氧气的运输：新生血管的形成 血管内皮生长因子(VEGF)
VEGF受体1(Flt-1)
纤溶酶原激活物抑制剂
内皮素-1
一氧化碳合成酶
血红素氧化酶1
α1B-肾上腺素能受体
无氧酵解相关酶类 磷酸果糖激酶L
醛缩酶A
3磷酸甘油醛脱氢酶
磷酸甘油酸激酶1
烯醇化酶1
乳糖脱氢酶A
果糖转移子-1
HIF-1功能的负反馈调节 P35SRJ(CBP/p300拮抗剂)
其它 胰岛素样生长因子结合蛋白-1
反转录转座子VL30
大量研究认为，在人类生长发育的生理过程中，细胞及组织中的氧浓度的维持主要通过体内短期或长期的适应性反应信号来调节，以维持机体处于适宜的氧环境下。其中，转录因子HIF-1发挥了重要作用。HIF-1是由低氧敏感性的α-亚单位(HIF-1α)与基础表达的β-亚单位(HIF-1β，也称为ARNT)形成的异二聚体。
人体所有组织中均表达HIF-1α和HIF-1βmRNA。ARNT2主要是在大脑和肾脏中表达，而HIF-2α则主要在胚胎发生过程中的血管内皮细胞表达，同时在产生儿茶酚胺类细胞、肾脏以及肺脏也有表达。在正常鼠的生长发育过程中均有ARNT、HIF-1α和HIF-1β的参与。HIF-1α在机体的发育生长中发挥了重要作用。迄今为止，已经发现30多个基因受到HIF-1调节。
已知HIF-1α存在一个结合抑癌蛋白Von Hippel Lindar(VHL)的结构域。VHL是一个多蛋白复合体，具有E3泛素连接酶活性。它与HIF-1α的结合导致HIF-1α泛素化，并被细胞内的蛋白酶体系统降解。HIF-1α的564位和402位脯氨酸的羟化状态调节α亚单位与VHL的结合能力，而涉及这个羟化反应的酶已被命名为HIF-1α-4-脯氨酰羟化酶，其活性需要氧气、二价铁离子等的参与。
所以，在正常氧浓度时，HIF-1α-4-脯氨酰羟化酶因O2的存在而激活，使HIF-1α中的564位脯氨酸残基羟化。于是，VHL上的E3泛素连接酶结合脯氨酸羟化的HIF-1α，引发HIF-1α的降解。相反，低氧时，HIF-1α-4-脯氨酰羟化酶的活性因为氧的缺少而受到抑制，因此HIF-1α则不能被羟化，亦不能被VHL识别。于是，HIF-1α聚集，并通过其核定位信号转移至细胞核与胞核内持续表达的HIF-1β亚单位结合形成异二聚体。形成的异二聚体与靶基因的低氧反应元件(HRE)结合，启动某些基因如VEGF、EPO等的转录活性(参阅表1)，通过增加新生血管形成，调节葡萄糖代谢及转移，降低氧耗量等，使细胞内、组织内的缺氧状态得到改善，可知HIF-1α也是低氧反应信号途径中-个关键的转录因子。
因此，可以利用低氧环境抑制HIF-1α-4-脯氨酰羟化酶的活性，使得HIF-1α的降解被抑制的特性，来筛选适当的药物，尤其是可能的低氧模拟物，用于使白血病细胞进行分化，从而可达到治疗白血病的目的。
以下为本发明的基本思路：
1.低氧模拟物的筛选、该低氧模拟物有效剂量的确定、及其是否诱导肿瘤细胞分化的确证。
通过细胞计数、细胞周期及annexin V检测分析不同浓度的待测化合物对APL细胞系NB4细胞的生长及活力的影响。选择能够有效地抑制NB4细胞生长，并呈时间和剂量依赖性的低氧模拟物化合物CoCl2。根据早期细胞凋亡的重要分子标志annexinV阳性细胞有无明显增加，确定待测化合物CoCl2最佳的作用浓度(见实施例1和实施例2)。在上述研究的基础上，进一步观察有效剂量范围内的化合物是否诱导NB4细胞分化。
根据经待测化合物CoCl2处理一段时间后，肿瘤细胞呈现明显的成熟、及相关的细胞形态学改变情况，如核染色质浓缩、核/浆比例减少、核变小并伴随部分细胞核形的改变、能否见到核仁、受诱导的细胞是否表达与粒细胞分化相关的细胞表面抗原CD11b等，确定待测化合物是否促进肿瘤细胞分化。
2.检测待测化合物CoCl2能否调控HIF-1α蛋白的稳定性。
为了检测待测化合物诱导肿瘤细胞分化是否与HIF-1α存在着联系，我们运用半定量RT-PCR技术和Western blot技术检测待测化合物对细胞内HIF-1α的mRNA和蛋白的表达水平的可能影响(实施例3)。
3.确证待测化合物(CoCl2)的作用靶标是HIF-1α蛋白，以明确HIF-1α蛋白在待测化合物(CoCl2)诱导白血病细胞分化中的作用，即HIF-1α蛋白是否可用于筛选该待测化合物CoCl2。
为了明确HIF-1α蛋白是否参与了待测化合物(CoCl2)诱导的肿瘤(白血病)细胞分化过程，应用该蛋白的抑制剂来观察其对细胞诱导效应的影响是目前生物学研究的常用方法。某些一氧化氮供体，如3-morpholinosychnonimine(SIN-1)能够降低HIF-1α表达的稳定性，因此本发明检测了在HIF-1α蛋白表达降低的前提下，其对待测化合物诱导分化效应的影响(实施例4)。
因此，本发明即欲通过相应的实验及其结果来推证这样的结论：可将HIF-1α作为药物靶标，来筛选能使HIF-1α的降解被抑制、从而对白血病细胞产生分化作用的药物。
本发明采用下列具体实验来进行证实，但是本发明的范围并不仅限于下列实验所公开的范围。
实验方法
步骤一、预备待测化合物CoCl2制剂。
取购自上海化学试剂公司(上海，中国)的纯度为99％的CoCl2，用灭菌后的双蒸水配制成50mmol/L的储存液，4℃保存，需每月新鲜配制以保持药物的药效。取0.1％的三氧化二砷(ATO)以少量1.0mol/L的NaOH溶解后，用PBS配制成5.0mmol/L的储存液，4℃保存。取0.1％的一氧化氮供体3-morpholinosydnonimine(SIN-1)和全反式维甲酸(ATRA)分别用PBS和无水乙醇配制成10mmol/L和1mmol/L的储存液，-20℃保存。
以上0.1％的三氧化二砷、全反式维甲酸和一氧化氮供体试剂均购自Sigma公司(St Louis，MO，USA)。
步骤二、白血病细胞培养。
本研究采用的白血病细胞系包括存在t(15；17)和对ATRA敏感的APL细胞系NB4、无t(15；17)但对ATRA敏感的AML细胞系HL60、人类单核细胞性白血病细胞系U937以及携带t(8；21)融合基因的M2b型白血病细胞系Kasumi-1。原代细胞来源于通过形态学、免疫表型分析和细胞遗传学检测诊断后的各型AML病人骨髓，用淋巴细胞分离液从患者的骨髓中分离出单个核细胞后，再裂解红细胞，洗涤后，以4-5×105/ml的起始浓度培养。
将上述白血病细胞系和处理以后的原代细胞分别接种于含10％胎牛血清(FBS)(Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland)、100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素和2mmol/ml谷氨酰胺的RPMI1640培养液(Sigma公司，St Louis，Missouri)中进行常规培养(37℃，5％CO2，/95％O2)。同时，每天换液以保持细胞浓度维持在2-5×105/ml的最佳生长状态，并根据需要分别加入适量的待测化合物CoCl2制剂，准备单独加入上述预备好的CoCl2、或同时加入CoCl2、三氧化二砷和/或全反式维甲酸的加药组和不加入任何药剂的对照组。
为了观察低氧条件对白血病细胞的作用，将细胞放置于由90-93％的N2、5％CO2和2-5％O2组成的混合气体产生的特殊低氧培养箱(Thermo Electron Corporation，Forma，Massachusetts)中，37℃培养。细胞的活力通过苔盼兰拒染法检测。
步骤三、流式细胞仪检测细胞分化抗原表达。
自步骤二准备的各加药组和对照组中分别取1×106细胞，PBS清洗两次，加入荧光标记的抗人CD11b/FITC抗体和相应的同型对照抗体(均购自Coulter-Immunotech，Paris，France)10ul，于室温避光反应30分钟；PBS清洗一次。置于流式细胞仪检测(Beckmon-Coulter，Miami，Florida)。
步骤四、细胞周期分析与凋亡指标的检测。
自步骤二准备的各加药组和对照组中分别收集约106细胞，PBS清洗两次，经70％冷乙醇固定24小时以上后，再用PBS清洗两次，加1％RNA酶37℃消化30分钟。随后，加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)50ug/ml染色，经流式细胞仪检测后，所得资料再经LYSIS II软件(Beckon Dickson产品)收集处理分析。
根据Clontech公司提供的ApoAlert Annexin-V kit(Palo Alto，CA)检测细胞凋亡，在步骤二准备的各加药组和对照组中分别收集2×105细胞，用PBS洗一遍，加入200μl结合溶液并悬浮细胞，再加5μl Annexin V和10μl PI(Propidium Iodine)置于室温避光10分钟，流式细胞仪(Beckmon-Coulter，Miami，Florida)检测荧光强度。
步骤五、免疫荧光分析。
在步骤二准备的各加药组和对照组中分别收集约106细胞，PBS清洗两次，细胞涂片仪离心涂片，过夜自然凉干后，先用预冷丙酮4℃固定10分钟，自然凉干20分钟；用PBS预先孵育15分钟，再用1∶400稀释的抗人PML N端抗体(Santa Cruz，CA，USA)，37℃孵育1小时；PBS清洗3次，加1∶50稀释的FITC标记的二抗(Santa Cruz，CA，USA)，37℃孵育1小时，PBS清洗3次，加抗淬灭剂，荧光显微镜(MRC-600Confocal Imaging System；Bio-Rad MicroscienceLtd，Hertfordshire，UK)下进行观察。
步骤六、Western蛋白印迹。
自步骤二准备的各加药组和对照组中分别取2×106细胞，经PBS清洗、离心(2000rpm/min，5分钟)沉淀后加入100ul 2×SDS上样缓冲液(100mMTris碱，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油和5％β巯基乙醇)并超声裂解细胞。细胞裂解产物经煮沸(5分钟)后离心13000r/min 15分钟，弃沉淀物，剩余的溶液即为抽取的蛋白质。蛋白质经Bradford法定量后上样于8％SDS聚丙稀酰胺凝胶，电泳，常规转膜，0.2％丽春红染色估计转移效率，膜经5％脱脂奶粉(0.1％Tween-20)室温封闭1小时后，与相应一抗(包括HIF-1α、P53、RARα、C-myc)按一定的稀释度室温孵育2小时或4℃过夜，经PBS(含0.1％Tween-20)充分洗涤后与相应稀释度的二抗室温反应60分钟，洗涤后经ECL试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，England)显色。所用抗体均购自Santa Cruz公司。
步骤七、半定量RT-PCR。
在步骤二准备的各加药组和对照组中分别收集1×107细胞，根据TRIzol kit(Invitrogen，Scotland，UK)抽提总RNA。以管家基因G3PDH为内参，取药物处理的不同细胞的cDNA作为模板，采用G3PDH引物和基因特异性引物同时进行单管扩增的策略。扩增条件：25ul反应体系95℃，5分钟；94℃，30秒；55℃，40秒；72℃，60秒；72℃，10分钟；30个循环。
HIF-1α的引物5’-CGTTGTGAGTGGTATTATTCAGC-3’
5’-CAGTTTCTGTGTCGTTGCTGC-3’
扩增1019bp-1265bp HIF-1αcDNA片段。
运用SmartView version 5.0软件(Furi Corporation，上海，中国)对扩增的单个HIF-1α片段强度进行检测，并与内参G3PDH比较分析得到样本的表达强度。
步骤八、HIF-1αcDNA测序。
运用如下两对引物扩增全长的HIF-1αcDNA(GenBank accessionno.NM-001530)：①正向引物5’-ATTCACCATGGAGGGCGC-3’和反向引物5’-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3’；②正向引物5’-GATGCTTTAACTTTGCTGGC-3’和反向引物5’-TCAGTTAACTTGATCCAAAGCTC-3’。这两对引物分别扩增HIF-1α的1-1265和1173-2481cDNA片段。
PCR扩增条件：95℃，30秒；55℃，40秒；72℃，1分钟，35个循环，用GeneAmp PCR System9600(Perkin-Elmer Norwalk，USA)。扩增后的产物构件至pGEM-T载体中(Promega，Madison)，最后在ABI377 DNA测序仪上检测(Perkin-Elmer，Boston，Massachusetts)
步骤九、cDNA-微阵列分析。
采用cDNA-微阵列方法，收集步骤二准备的各加药组和对照组的NB4细胞，用Trizol抽提总RNA并经过RT-PCR获取cDNA。步骤二准备的对照组以及加入CoCl2的加药组分别用Cy3-dUTP和Cy5-dUTP标记，标记后的cDNA与带有8464基因的基因芯片(BioStar H-80s，United Gene Co，Shanghai，China)进行杂交，并经过ScanArray4000激光扫描仪(Perkin-Elmer，Boston，Massachusetts)扫描。得到的图象再经过GenePix Pro 3.0(Axon，Union City，California)分析处理。首先对芯片上40个管家基因进行标准化参数分析后，通过计算机软件分析得到相应每一个点的Cy5/Cy3比值，比值大于2者为上调基因，比值小于2者为下调基因。
实验结果
1.CoCl2对NB4细胞生长和活力的影响：剂量-效应关系---实施例1。
CoCl2是一种模拟低氧环境的常用试剂，广泛应用于低氧的研究。本发明首先通过细胞计数、细胞周期及annexinV检测分析不同浓度(12.5-200μM)的CoCl2对APL细胞系NB4细胞的生长及活力的影响。如图1A所示是不同浓度的CoCl2对NB4细胞生长影响的示意图，从图中可看出，CoCl2能够有效地抑制NB4细胞生长，并呈时间和剂量依赖性。其中，如图1B所示，100-200μM CoCl2明显降低细胞活力，而12.5-50μM CoCl2对细胞活力无明显影响。从图1C和图1D可进一步看出，12.5-50μM CoCl2并不明显改变NB4细胞的细胞周期分布和诱导细胞凋亡，因为早期细胞凋亡的重要分子标志annexinV阳性细胞无明显增加。
2.非毒性剂量的CoCl2诱导NB4细胞分化-实施例2。
在上述实验研究的基础上，本发明进一步观察25-50μM CoCl2是否诱导NB4细胞分化。如图2A所示，经25-50μM CoCl2处理6天后NB4细胞呈现明显的成熟，且相关的细胞发生形态学改变，如核染色质浓缩、核/浆比例减少、核变小并伴随部分细胞核形的改变，但是仍可见到核仁。更为重要的是，这些受诱导的细胞也表达与粒细胞分化相关的细胞表面抗原CD11b(图2B)，提示非毒性作用浓度的CoCl2能够在一定程度上促进NB4细胞分化。
3.CoCl2并不降解APL细胞特异的融合蛋白PML-RARα。
如前所述，95％以上的APL病人存在染色体易位t(15，17)，并表达PML-RARα融合蛋白。该融合蛋白与APL的发病具有重要关系。另一方面，PML-RARα融合蛋白的降解或剪切在ATRA或ATO诱导APL细胞分化和(或)凋亡中发挥了重要作用。
为此，本发明观察了CoCl2是否也同样调变PML-RARα蛋白的表达。以抗PML抗体进行的间接免疫荧光实验显示(图3)，在未经任何药物处理的NB4细胞中，由于存在特异融合蛋白PML-RARα形成的同二聚体或PML-RARα/PML异二聚体，呈现大量细小的颗粒弥散地分布于整个细胞核中。经过0.1μM ATRA和0.5μM ATO作用后，PML在细胞内的分布呈现明显的改变。经0.1μM ATRA处理3天后的NB4细胞逐渐恢复PML在细胞内的正常分布，表现为荧光颗粒减少，颗粒直径增大等；而经0.5μM ATO处理后可见细胞核内的荧光颗粒数量明显地减少。然而，50μM CoCl2处理3天后的加药组与对照组比较无明显的改变，同时也不影响ATRA和ATO对融合蛋白的作用在白血病细胞内的定位。
如图4所示，由Western blot证实，50μM CoCl2并不调变PML-RARα蛋白表达水平。但值得注意的是，经过ATRA和CoCl2共同处理的NB4细胞在72小时可见到PML-RARα蛋白的剪切片段，提示50μM CoCl2可加速ATRA引起的PML-RARα蛋白的剪切。
4.CoCl2加强ATRA和ATO对NB4细胞的诱导分化效应。
为了了解CoCl2对于ATRA和ATO诱导APL细胞分化效应的影响(图5)，本发明进一步观察了0.1μM ATRA和0.5μM ATO单独以及联合50μMCoCl2作用于NB4细胞的效应。结果显示，50μM CoCl2联合0.1μM ATRA处理NB4细胞4天后，CD11b和CD14的阳性细胞数比0.1μM ATRA单独处理有明显的增加，分别达到了97.23±0.58％和87.93±7.98％，而单独用ATRA处理的只达到了81.4±2.17％和45.87±1.62％。因此，提示CoCl2和ATRA诱导NB4细胞分化的作用具有明显的叠加效应。0.5μM ATO和50μM CoCl2的联合运用也产生同样的效果。
5.CoCl2和低氧诱导AML细胞分化的效应谱分析
CoCl2诱导的细胞分化并不伴随PML-RARα蛋白水平的调变，提示CoCl2模拟的低氧环境可能对其它类型的AML细胞系具有同样的诱导分化效应。为此，我们选用了其它三种白血病细胞系即U937(M5型AML)、Kasumi-1(M2b型AML)和HL60(M3型AML)作为研究对象。结果显示，25μM和50μM的CoCl2在抑制这三种细胞生长的同时，的确能有效地诱导U937细胞和Kasumi-1细胞分化。如图6所示，经50μM的CoCl2处理6天的U937和Kasumi-1细胞，呈现明显的形态学分化，同时伴随有功能性分化指标CD11b的表达上升。但是CoCl2虽然也能抑制HL60细胞的生长但并不诱导HL60细胞分化。
6.2-3％的低氧环境对AML细胞分化的影响。
为了证实真正的低氧环境是否同样也具有诱导这些白血病细胞系的分化作用，我们将NB4、U937和HL60分别置于2-5％O2和21％O2环境下培养。结果显示，在2-3％的低氧环境下，NB4和U937细胞经过2至9天的培养，出现了明显的形态学分化，同时伴随有功能性分化指标CD11b的表达增加，而在5％和21％的低氧环境下则无类似的改变。如图7所示，U937细胞在2％O2的环境下处理第4至第9天时，细胞体积明显缩小，染色质浓缩，核/浆比例减小，核变小，核仁消失，尤其是某些细胞核的形状还出现了明显的马蹄样改变以及伴随有粒系分化指标CD11b的表达上升(参表2)。然而这些分化相关的改变并不存在于在2-3％的低氧环境下培养的HL60细胞。
表2.U937细胞放置于2％O2培养时，相应的细胞表面抗原的检测
6天 9天
21％O2 2％O2 21％O2 2％O2
CD11b 24.6±4.10 38.9±3.39 18.6±1.22 50.27±5.90
CD11c 25.0±2.05 60.5±6.79 26.13±1.55 61.2±3.98
7.CoCl2诱导部分新鲜AML细胞分化。
由于细胞系经过体外的长时间培养，可能已经不能真正反映急性白血病细胞的特性。于是，本发明也研究了50μM CoCl2对来自3例存在t(15，17)的APL病人，4例存在t(8，21)的M2型病人，2例M4型病人和2例M5型病人的新鲜白血病细胞的体外效应。结果显示，50μM的CoCl2单独处理上述3例APL细胞并不能有效诱导其细胞分化，但在其中一例(case3)，CoCl2能加强0.1μM ATRA诱导的分化效应。另外，ATRA和ATO不能诱导其它8例AML病人原代细胞发生分化，但是50μM的CoCl2却能诱导其中4例病人细胞发生分化，包括2例M2b型以及2例M4型病人。如图8所示，是具有代表性的存在t(8，21)以及AML1-ETO转录本的AML-M2b型白血病病人原代细胞，经50μM CoCl2处理6天后出现了明显的形态学分化。
8.CoCl2对NB4细胞基因表达谱的影响源于cDNA阵列的结果。
为了进一步探索低氧模拟环境下CoCl2诱导白血病细胞分化的分子机制，本发明运用cDNA micro array技术观察了NB4细胞经过50μM的CoCl2处理及未处理3天时的基因表达量的变化。在功能已知的8000多个基因中，大多数基因的RNA水平无改变，包括P53以及C-myc等。后两者经Western blot所证实(图9)。但是，有68个基因下调2倍以上，这些基因主要涉及细胞代谢、细胞骨架、DNA合成和修复，调节细胞周期的进行以及诱导细胞凋亡等。受50μM CoCl2诱导后上调的基因只有二个，即白介素8(IL-8)和细胞因子C-X-C基元受体4(CXCR4)。基于以上初步发现，可以推测可能在低氧条件下，白血病细胞通过分泌某些因子促使其发生分化。但是，预先用CoCl2处理白血病细胞后的条件培养液并不能诱导这些细胞发生分化，提示低氧诱导的细胞分化可能是通过白血病细胞内的信号途径而引发。
9.CoClC2能有效抑制NB4和U937细胞内HIF-1α蛋白的降解---
实施例3。
为了了解HiF-1α与CoCl2诱导的白血病细胞的分化是否存在着联系，本发明运用半定量RT-PCR技术和Western blot技术检测了CoCl2对细胞内HIF-1α的mRNA和蛋白的表达水平的可能影响(图10)。结果显示，50μM的CoCl2处理并不改变所有检测的三种AML细胞系的HIF-1α的mRNA水平，但它能快速增加NB4和U937细胞中HIF-1α蛋白水平。因此，与大多数组织一样，CoCl2有利于这两种细胞稳定HIF-1α蛋白水平，值得一提的是，HL60细胞在mRNA水平也有HIF-1α的表达以及正常的HIF-1αcDNA序列，但CoCl2却不诱导HL60细胞中HIF-1α蛋白的稳定表达。
10.抑制HIF-1α蛋白水平会明显拮抗CoCl2的诱导分化效应-
实施例4。
为了进一步明确HIF-1α是否参与了CoCl2诱导的白血病细胞分化过程，应用该蛋白的抑制剂来观察其对细胞诱导效应的影响是目前生物学研究的常用方法。根据文献报道，某些一氧化氮供体，如3-morpholinosychnonimine(SIN-1)能够降低HIF-1α表达的稳定性。因此，我们观察了在HIF-1α蛋白表达降低的前提下，其对CoCl2诱导分化效应的影响(图11)。结果显示，500μM的SIN-1几乎完全抑制HIF-1α在NB4和U937细胞中的聚集。与此同时，SIN-1在抑制NB4和U937细胞生长的同时，能有效地拮抗CoCl2诱导的细胞分化，因而可知HIF-1α介导或参与了低氧诱导的白血病细胞分化过程。
通过前述实验及其结果分析可知，氯化钴的使用量范围为非毒性剂量，最优范围为12.5-50μM，并可配合三氧化二砷或全反式维甲酸一起使用。三氧化二砷的使用剂量为10mg/日，静脉活性；全反式维甲酸的使用剂量为25-45mg/日，一日一次。
本发明利用低氧环境抑制HIF-1α-4-脯氨酰羟化酶的活性，使得HIF-1α的降解被抑制的特性，将HIF-1α用于筛选适当的低氧模拟物，用于使白血病细胞进行分化，从而达到治疗白血病的目的。
本发明利用低氧模拟物CoCl2可通过其自身造成一个低氧模拟环境的特性，或者可以直接将白血病细胞在低氧环境下经氯化钴处理，通过抑制HIF-1α-4-脯氨酰羟化酶的活性，使得可以有效抑制白血病细胞中的HIF-1α降解，从而诱导白血病细胞分化，达到治疗肿瘤、尤其是白血病的目的。
采用HIF-1基因的靶向治疗可使缺氧组织中诱导新生血管生成，诱导HIF-1活性的小分子物质可保护因缺氧引起的细胞死亡，抑制HIF-1活性的小分子物质则可能有利于肿瘤和肺部高血压的治疗，因此，利用模拟低氧环境的小分子化合物可能对于AML具有治疗潜力，而HIF-1a及其相关分子可能成为治疗白血病的候选药物靶标，可以根据不同的治疗目的来选用不同的治疗策略。
Claims (3)
1、HIF-1α作为药物靶标，在制备治疗急性髓系白血病药物的筛选中的应用。
2、如权利要求1所述的应用，其特征在于：急性髓系白血病是急性早幼粒细胞性白血病。
3、如权利要求1所述的应用，其特征在于：急性髓系白血病是急性单核细胞性白血病。
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