ES2864743T3

ES2864743T3 - Usos de inhibidores del factor inducible por hipoxia

Info

Publication number: ES2864743T3
Application number: ES10834883T
Authority: ES
Inventors: Yang Liu; Yin Wang; Yan Liu; Sami N Malek; Pan Zeng
Original assignee: Oncoc4 Inc
Current assignee: Oncoc4 Inc
Priority date: 2009-12-04
Filing date: 2010-06-25
Publication date: 2021-10-14
Anticipated expiration: 2030-06-25
Also published as: US20170239315A1; CY1125365T1; EP2506840A4; EP2506840A1; US9877998B2; US20200147167A1; US20210161991A1; WO2011068563A1; HUE053793T2; SI2506840T1; HRP20210537T1; EP3892264A3; US20120264697A1; EP2506840B1; CA2782527C; US9427413B2; CN109224064A; CA2782527A1; US20190255140A1; EP3892264A2

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar en el tratamiento de una leucemia mieloide aguda.

Description

DESCRIPCIÓN

Usos de inhibidores del factor inducible por hipoxia

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar en el tratamiento de una leucemia mieloide aguda.

Antecedentes de la invención

Se estima que en 2009 se notificarán 12.800 casos nuevos de leucemia mieloide aguda (AML, por sus siglas en inglés), con 9000 muertes. Aunque en la mayoría de los casos se puede lograr una remisión completa mediante quimioterapia, la cura o remisión prolongada es rara. Por consiguiente, existe una necesidad en la materia de tratar la AML posterior a la remisión. Sin embargo, la leucemia posterior a la remisión tiende a ser más resistente a la quimioterapia en general. Las razones subyacentes de esto incluyen la expresión de la proteína de resistencia a múltiples fármacos Pgp1 y la posible residencia en un área de la médula ósea que está fuera del alcance de los fármacos.

Se ha planteado la hipótesis de que la AML está asociada con células madre cancerosas (CSC, por sus siglas en inglés). Esta idea está respaldada por subconjuntos de CSC identificables de manera fenotípica en células de AML, y la eficacia en la evaluación de CSC en un modelo de AML de tanto unidades formadoras de colonias (UFC) in vitro como en modelos de trasplante xenogénico.

Muchos cánceres humanos, además de la AML, contienen CSC que se consideran responsables de impulsar y mantener el crecimiento tumoral y la resistencia a la terapia. Por lo tanto, comprender el mecanismo de autorrenovación de las CSC no solo es clave para comprender el mecanismo fundamental del desarrollo del cáncer, sino también proporciona nuevos enfoques para la terapia del cáncer de larga duración. Al igual que las células madre normales, la autorrenovación de las CSC implica dos procesos relacionados. En primer lugar, las células madre deben experimentar una proliferación para producir células indiferenciadas. Las rutas conocidas para la autorrenovación de células madre normales y cancerosas, incluyendo Wnt y Hedgehog, regulan la proliferación, al menos en parte mediante el control de la expresión de Bmi-1, un regulador clave para la proliferación de células madre normales y cancerosas. En segundo lugar, las CSC deben sobrevivir en un estado indiferenciado a lo largo de la oncogénesis. La supervivencia de las CSC puede sustentar las dificultades en el tratamiento de cánceres hematológicos, tales como AML. Dichos cánceres son particularmente más intransigentes a la terapia posterior a la remisión. Por consiguiente, existe una necesidad en la materia de terapias adicionales contra el cáncer hematológico que se dirijan a CSC, incluyendo para tratar la AML. Kong et al. (American Association For Cancer Research, 2005) informan que la equinomicina inhibe la actividad de unión al ADN del HIF-1. Foster et al. (Investigational New Drugs, 1986) divulgan que la equinomicina ha mostrado actividad antitumoral en la leucemia P388 murina implantada por vía ip. El documento WO0234291 A2 divulga una molécula de unión al HIF-1 para tratar una neoplasia hemática. El documento WO0234291 A2 no divulga la equinomicina, y mucho menos sus usos. La presente invención aborda esta necesidad mediante la divulgación de un método para tratar un cáncer hematológico utilizando un inhibidor del HIF.

Sumario de la invención

En el presente documento se divulga un método para tratar un cáncer hematológico, que puede comprender administrar un inhibidor del HIF a un mamífero que lo necesite. El inhibidor del HIF puede ser equinomicina, 2-metoxiestradiol o geldanamicina. La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar en el tratamiento de una leucemia mieloide aguda como se define en las reivindicaciones. La equinomicina puede administrarse a una dosis no tóxica, que puede ser de 1-100 pg/m2 La equinomicina puede ser para la administración conjunta con un inhibidor de la ruta Hedgehog, que puede ser ciclopamina. El inhibidor del HIF también puede administrarse conjuntamente con una segunda terapia contra el cáncer.

El cáncer hematológico divulgado en el presente documento puede ser un linfoma o una leucemia, que puede ser leucemia mieloide aguda. El mamífero puede portar una alteración citogenética, que puede ser 47,Xy ,+21;46,XY; 45, XX,-7; 46,XY,t(8;21)(q22;q22); 49,XX,+8,+8,inv(16)(p13.1q22),+21; 46,XX,inv(16)(p13q22)/46,XX; 46, XY,inv(16)(p13q22); 46,XX,t(2;13)(p23;q12)/46,XX; 45,XY,inv(3)(q21q26.2),-7/46,XY; 47, XY,+4,inv(5)(p15q13)/47,s1,-4,+22; 46,XX,t(11;19)(q23;p13.1); 46,XX,t(6;11)(q27;q23)/46,XX; o 46,XX,t(1;17)(p13;q25),t(9;11)(p22;q23). El mamífero puede portar células leucémicas del fenotipo Cd 38'CD34+. El paciente puede portar células madre cancerosas, que pueden ser resistentes a múltiples fármacos, quimiorresistentes o radiorresistentes.

También se proporciona en el presente documento una composición que comprende equinomicina para utilizar en la inducción de la remisión de la leucemia mieloide aguda en un ser humano como se define en las reivindicaciones. La equinomicina puede administrarse a una dosis no tóxica, que puede ser de 1-100 pg/m2 También se proporciona en el presente documento una composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar en la prevención de la futura recaída de la leucemia mieloide aguda en un ser humano durante la remisión de la leucemia mieloide aguda como se define en las reivindicaciones. Se divulga además un método para inhibir una función de mantenimiento o supervivencia de una célula madre cancerosa (CSC), que puede comprender poner en contacto la CSC con un inhibidor del HIF.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Aislamiento de CSC de un linfoma de ratón espontáneo. a. Las células de linfoma, aisladas de un bazo agrandado de ratones transgénicos TGB, se clasificaron mediante BD FACSAria en fracciones c-Kit+Sca-1+ o c-Kit'Sca-1". El panel de la izquierda muestra el fenotipo del tumor, mientras que los paneles de la derecha muestran las purezas posteriores a la clasificación. b. La actividad formadora de colonias de las células tumorales reside dentro del subconjunto c-Kit+Sca-1+. Las fracciones c-Kit+Sca-1+ o c-Kit'Sca-1' (103/pocillo) se sembraron en medio de metilcelulosa al 1 %, el número de colonias se contó al microscopio después de 7 días de cultivo. Los datos mostrados son medias y DE del número de colonias en placas por triplicado y son representativos de tres experimentos independientes. El inserto muestra la morfología de una colonia típica. c. Fotografía de bazos de ratones que recibieron tanto las células tumorales c-Kit+Sca-1+ como c-Kit- Sca-1'. d. Conservación fenotípica y evolución del linfoma surgido de células c-Kit+Sca-1+. Las células de linfoma se tiñeron con anticuerpos contra CD8 y Vp8. El panel de la izquierda muestra células de linfoma cultivadas con células CD8+ transgénicas predominantemente altas en Vp8+; mientras que el panel derecho muestra células de linfoma del bazo de ratones Rag-2'/_ que recibieron células c-Kit+Sca-1+ purificadas a partir de células de linfoma cultivadas. Nótese el aumento de la población Vb8. Las poblaciones doble negativas agrandadas en el panel derecho son células de bazo residentes.

Figura 2. Adicción al HIF de CSC. a. Ablación selectiva de UFC de linfoma por equinomicina. Las células de linfoma cultivadas se trataron con dosis determinadas de fármacos farmacológicamente eficaces en medio durante 24 horas. Después de lavar los fármacos, las células se cultivaron en medio que contenía metilcelulosa al 1 % y se contó el número de colonias después de 6 a 7 días. Los datos mostrados son medias y DE de triplicados y se han confirmado por 3 experimentos independientes. b. Un sistema indicador de la actividad del HIF en el linfoma TGB. El diagrama de la construcción lentivírica para la actividad del HIF se muestra en la parte superior. Pausa, un fragmento de secuencia para eliminar el efecto del promotor lentivírico; HRE, elemento de respuesta a la hipoxia; TATA, secuencia TATA (TATATAAT) (arriba). Abajo a la izquierda, validación del indicador. Las células HEK293 se transfectaron de manera transitoria con ADNc que codifica HIF1a mutante (P402A/P577A) o control con vector junto con el indicador EGFP impulsado por HRE, indicador HRE mutante. Las células se analizaron mediante citometría de flujo para detectar la expresión de EGFP 36 horas después de la transducción. Inferior derecha, actividad del HIF en las CSC de linfoma según lo revelado por la expresión conjunta de células que expresan GFP y c-Kit en HRE TS, pero no en indicadores lentivíricos de HRE mutantes (panel medio inferior). c. CI50 de equinomicina en la inhibición de la actividad del HIF1a en CSC de linfoma. Las células de linfoma transfectadas con el sistema indicador HRE se cultivaron en presencia de diferentes concentraciones de equinomicina durante 12 horas, el % de células c-Kit+GFP+ se normalizó frente al grupo no tratado (1,13 %, que se definió como 100 %). La dosis que dieron como resultado una reducción del 50 % de las células c-Kit+GFP+ se definen como CI50. d. Selectividad del inhibidor del HIF para UFC de CSC de linfoma sobre las UFC de células progenitoras hematopoyéticas. Las células c-Kit+Sca-1+ tanto de TGB o de médula ósea normal se trataron con una concentración determinada de equinomicina durante la noche antes de sembrar en placas en el medio que contenía metilcelulosa al 1 % para el ensayo de UFC. Los datos mostrados eran % de controles no tratados y eran medias /- DE de triplicados. e. Efecto terapéutico de una dosis disminuida de equinomicina. Las células de linfoma cultivadas (1 * 106/ratón) se inyectaron por vía ip en ratones B10.BR inmunocompetentes. Catorce días después, se inyectaron 10 pg/kg/inyección de equinomicina en un intervalo de dos días durante un total de 5 veces. Los ratones de control recibieron solo vehículo. Se observó diariamente la supervivencia de los ratones.

Figura 3. Aumento de la actividad del HIF en las CSC de linfoma bajo normoxia. a y b. Expresión génica. Las células de linfoma cultivadas se clasificaron mediante el sistema de clasificación BD FACSAria en fracciones c-Kit+Sca-1+ o c-Kit'Sca-1'. Las transcripciones de HIF1a, HIF-2a, HIF-3a, VHL y Glut1 se determinaron mediante RT-PCR. a. Fotografía de productos de RT-PCR. b. Expresión relativa medida mediante PCR en tiempo real: comparación con HPC. Expresión relativa de las transcripciones de HIF1a y VHL en células c-Kit+Sca-1 clasificadas por FACS tanto de tumor TGB (tumor Spl) como de médula ósea (MO). Los niveles de expresión se expresaron como fracciones del gen doméstico para la p-actina. c. La equinomicina induce selectivamente la apoptosis de CSC. Las células de linfoma cultivadas se trataron con equinomicina 20 pM o vehículo en medio durante 16 horas. Las células tratadas se tiñeron con c-Kit y Sca-1, seguido de tinción con anexina V. Las células teñidas se analizaron mediante análisis FACS. Los datos mostrados son representativos de 3 experimentos independientes. d. Aislamiento de 4 subconjuntos de células tumorales en muestras de AML. Las células de la médula ósea del paciente con AML MI-AML-36 se tiñeron para CD34 y CD38 y se clasificaron en 4 subconjuntos para el aislamiento de ARN. Las muestras de clasificación previa y las ventanas de adquisición utilizadas para la clasificación se muestran en el panel izquierdo y las poblaciones clasificadas posteriormente se muestran en los paneles centrales y derechos. Los porcentajes de células en cada ventana de adquisición se proporcionan en los paneles. e. Expresión del HIF1a (arriba) y GLUT1 en los subconjuntos. Los datos mostrados son medias /- DE de los niveles de transcripción de los genes, presentados como % de p-actina de las mismas muestras. Se ha observado expresión mejorada en las muestras CD34+CD38' en las 6 muestras de AML evaluadas. f. Las AML-UFC en las 6 muestras de AML son muy sensibles a la equinomicina. Las muestras de AML (2,5 * 105/ml) tanto de sangre periférica (SP) o de médula ósea (MO) se trataron previamente con concentraciones dadas de equinomicina en 2 ml de medio durante 24 horas. Las células tratadas viables se sembraron a continuación en placas a 105/pocillo para el ensayo de UFC por triplicado. El número de colonias se contó 7-10 días después. Los datos mostrados eran % de media /- DE de los controles no tratados.

Figura 4. El silenciamiento de ARNhc reveló un papel clave para HIF1a en el mantenimiento de CSC. a. El silenciamiento de HIF1a anula la CSC c-Kit+Sca-1+. Se infectaron células tumorales TGB con control con vector lentivírico con ARNhc desordenado (secuencia central 5'-tct cgt cat aac aag ttg a-3'), o con vector lentivírico que expresa dos ARNhc independientes (hc-1 o hc-2). Tres días después de la infección, las células tumorales en masa se analizaron mediante citometría de flujo. Las células GFPalta y GFPbaja se seleccionaron y analizaron para determinar la expresión de c-Kit y Sca-1. b. El ARNhc de HIF1a reduce las UFC. Las células de linfoma cultivadas se infectaron con ARNhc de HIF1a lentivírico o con un vector con ARNhc desordenado mediante inoculación por centrifugación, y las células infectadas se seleccionaron con 5 pg/ml de blasticidina durante una semana. Las células infectadas se sembraron en medio de cultivo de metilcelulosa al 1 % a una densidad de 2 * 105/pocillo. El número de colonias se contó al microscopio. Los datos mostrados son medias y DE del número de colonias por triplicado y son representativos de tres experimentos independientes. c. Los ARNhc de HIF1a anulan la actividad iniciadora de tumores. Las células tumorales TGB se infectaron 3 veces con lentivíricos que expresaban ARNhc desordenado o ARNhc del HIF1a y a continuación se inyectaron en ratones B10.BR (9 * 1o5/ratón, ip). La supervivencia de los ratones receptores (n = 5) se comparó mediante análisis de Kaplan-Meier. Todos los ratones que sucumbieron han desarrollado linfoma según lo revelado por la necropsia. Todos los datos de esta figura se han repetido al menos dos veces.

Figura 5. La regulación a la baja del gen Vhl es esencial para el mantenimiento de CSC. a. Regulación a la baja de la transcripción de Vhl en células c-Kit+Sca-1+. Las células de timoma TGB se clasificaron en subconjuntos c-Kit+Sca-1 y c-Kit‘Sca-1’, como se describe en la figura 1, los niveles de transcripciones de Vhl se determinaron mediante PCR en tiempo real. b. Expresión ectópica de CSC ablacionadas con Vhl. Las células tumorales TGB se infectaron con un vector de control lentivírico o con un vector lentivírico que expresaba dos ADNc de Vhl. Tres días después de la infección, las células tumorales en masa se analizaron mediante citometría de flujo. Las células GFpalta y GFPbaja se seleccionaron y analizaron para determinar la expresión de c-Kit y Sca-1. c. La expresión de Vhl reduce las UFC tumorales. Las células de linfoma cultivadas se infectaron con ADNc de Vhl lentivírico o con un vector mediante inoculación por centrifugación, y las células infectadas se seleccionaron con 5 pg/ml de blasticidina durante una semana. Las células transducidas se sembraron en un 1 % de medio de cultivo de metilcelulosa a una densidad de 2 * 105/pocillo. El número de colonias se contó al microscopio. Los datos mostrados son medias y DE del número de colonias por triplicado y son representativos de tres experimentos independientes. d. La expresión ectópica del ADNc de Vhl inhibe la actividad iniciadora de tumores. Las células tumorales TGB se infectaron 3 veces con vector de expresión lentivírico solo o ARNhc de HIF1a y a continuación se inyectaron en ratones B10.BR (9 * 105/ratón, ip). La supervivencia de los ratones receptores (n = 5) se comparó mediante análisis de Kaplan-Meier. El desarrollo de linfomas se confirmó mediante necropsia de los ratones sucumbidos. Este experimento se repitió dos veces.

Figura 6. El HIF trabaja en conjunto con la ruta Notch para mantener la CSC. a. Inhibición de la actividad formadora de colonias de CSC. Las células de linfoma cultivadas se trataron con dosis determinadas de L685.458 durante 24 horas. Después de eso, las células se cultivaron en medio que contenía metilcelulosa al 1 % y se contó el número de colonias después de 6 a 7 días. Los datos mostrados son medias /- DE de muestras por triplicado y son representativos de los de al menos 3 experimentos independientes. b. Actividad de Notch mejorada en CSC, como lo indican los niveles de transcripciones Hes1. Las células de linfoma de bazo con tumor en ratón transgénico TGB se clasificaron en fracciones c-Kit+Sca-1+ o c-kit‘Sca-1’. Las expresiones de ARNm de Hes1and en estas dos fracciones se midieron mediante PCR en tiempo real. c. Inhibición de la actividad de Notch mediante 3 inhibidores del HIF distintos. Se tiñeron células de linfoma TGB cultivadas con anticuerpo anti-c-Kit conjugado con APC y se enriquecieron dos veces utilizando perlas MACS recubiertas con anti-ApC de acuerdo con el protocolo del fabricante (Militenyi Biotec). Las muestras enriquecidas con células positivas para c-kit (60,4 % de células c-Kit+) se trataron con inhibidores del HIF durante 16 horas. El ARNm de las células tratadas se extrajo para su cuantificación mediante PCR en tiempo real. Los datos mostrados son medias /- DE de triplicados y representan los de al menos 3 experimentos independientes. 2ME2, 2-metoxiestradiol; GA, geldanamicina. d-g. Un papel fundamental para Notch en el mantenimiento de CSC, como revela la expresión ectópica de Notch I-C dRdA1-42dOP. d. Un gen Notch truncado con una posible actividad dominante negativa en la inhibición de la expresión del gen diana Hes de Notch. El panel superior izquierdo muestra el diagrama de la porción intracelular de la proteína Notch, con la posición de RAM, 7 repeticiones de anquirina (ANK1-7), dominio de activación transcripcional (TAD, por sus siglas en inglés), las secuencias carboxiterminales OPA (O) y PEST (P) marcadas. El panel inferior izquierdo mostró la composición del mutante dRdA1-4dOP que carece de RAM, ANK1-4 y las secuencias carboxiterminales O y P, pero con inserción de secuencia de localización nuclear (NLS, por sus siglas en inglés). El panel de la derecha muestra la inhibición dominante de la expresión de Hes. Después de tres transducciones consecutivas mediante control con vector o el mutante dRdA1-4dOP, el ARN se aisló y las transcripciones de Hes se midieron mediante PCR cuantitativa. Los datos mostrados son medias por triplicado y se han reproducido mediante dos experimentos independientes. e. Notch I-C deltaRAM anula el subconjunto c-Kit+Sca-1+. Se infectaron células tumorales TGB con control con vector lentivírico o vector lentivírico que expresa dRdA1-4dOP. Tres días después de la infección, las células tumorales en masa se analizaron mediante citometría de flujo. Las células GFPalta y GFPbaja se seleccionaron y analizaron para determinar la expresión de c-Kit y Sca-1. f. Notch IC-dRdA1-42dOP reduce in vitro actividad de autorrenovación de CSC. Las células de linfoma cultivadas se infectaron con un vector lentivírico que codifica dRdA1-4dOP o con un control con vector mediante inoculación por centrifugación. Se sembraron el mismo número de células infectadas en un 1 % de medio de cultivo de metilcelulosa durante 3 días y se contó el número de colonias con GFP al microscopio. Se realizó el mismo procedimiento para el ensayo de formación de colonias de la segunda ronda. Los datos mostrados son la media y la DE del número de colonias en placas por triplicado, y son representativos de los de al menos tres experimentos independientes. g. dRdA1-4dOP anula la actividad iniciadora de tumores. Las células tumorales TGB se infectaron 3 veces con vector de expresión lentivírico solo o ARNhc de HIF1a y a continuación se inyectaron en ratones B10.BR (1 x 106/ratón, ip). La supervivencia de los ratones receptores se comparó mediante análisis de Kaplan-Meier con significación estadística determinada por pruebas del orden logarítmico. Todos los ratones sucumbidos han desarrollado linfoma según lo revelado por la necropsia. Este experimento se repitió dos veces. h-1. HIF1a inhibe la regulación por retroalimentación negativa de Hes1 al evitar que Hes1 se una a las secuencias N en el promotor Hes1. h. Diagrama del promotor Hes1. La secuencia detallada se proporciona en la figura 16. i. HIF1a no colaboró con Notch directamente en la activación del promotor Hes1. La secuencia promotora Hes1 (-225 a 65, TSS como 1) se unieron a GFP y se transfectaron en células 293 junto con controles con vector, o vector que contiene ADNc que codifica HIF1a (P402, 577> A, llamado HIF1a-PA), ADNc de Notch-IC o Notch-IC+ HIF1aPA. La actividad del promotor se mide mediante la intensidad de la fluorescencia verde de las células transfectadas. Los datos mostrados fueron intensidades relativas. La intensidad del indicador Hes1-GFP se define como 1,0. La eficacia de la transfección se normaliza mediante la luciferasa de Renilla transfectada conjuntamente. j. HIF1a inhibió parcialmente la represión del promotor Hes1 mediada por Hes1. Como en i, excepto que se utilizan el ADNc de Hes1 o HIF1a mutante. k. HIF1a disminuye la autorregulación negativa de la expresión de Hes1 en la señalización de Notch. Como en i, excepto que se utilizaron diferentes combinaciones de ADNc. Actividad del indicador Hes1 en ausencia de Hes transfectado, HIF1a-PA y Notch se definen como 1,0. l. Inhibición competitiva entre HIF1a-PA y Hes1 al promotor Hes, según lo revelado por chIP. Los ADNc que codifican Hes1 y HlF-1aPA marcados con Flag o Myc se transfectaron en células 293. Treinta y seis horas después de la transfección, los transfectantes estaban sujetos o ChIP. Se utilizaron fracciones iguales de células en cada grupo para transferencia Western para confirmar los niveles esencialmente idénticos de expresión de proteína cuando Hes1 y HIF1a-PA se transfectaron solos o en combinación (datos no mostrados). Los datos presentes son medias /- d E. (n = 3) de % de ADN de entrada, medido mediante PCR en tiempo real utilizando los cebadores marcados en la figura 16. Los datos que se muestran en i-l son medias /-DE de triplicados. Los experimentos se repitieron al menos 3 veces. Figura 7. La progenie del subconjunto c-Kit+Sca-1 es heterogénea con una pequeña fracción que retiene el fenotipo c-Kit+Sca-1+. Se clasificaron ex vivo células tumorales como se describe en la figura 1a y como se sembraron en placas en la figura 1b. Cinco días después, las células de las colonias se volvieron a analizar para determinar la expresión de c-Kit y Sca-1.

Figura 8. Las células con actividad HIF expresan tanto c-Kit como Sca-1. Se infectaron células tumorales TGB con un vector lentivírico que contenía la secuencia HRE TS como se muestra en la figura 2d. Tres días después de la infección, las células tumorales se tiñeron con AcM anti-c-Kit y anti-Sca-1. Las células GFP+ y GFP' se analizaron para determinar la expresión de c-Kit y Sca-1.

Figura 9. Inhibición de la formación de colonias de células tumorales c-Kit+Sca-1+ mediante inhibidores de HIF-1a. Los datos mostrados eran medias y DE de cultivo por triplicado y se repitieron al menos 3 veces. a. Inhibición continua mediante equinomicina. Se cultivaron las células c-Kit+Sca-1+ clasificadas a partir de células tumorales TGB y se volvieron a clasificar las células c-Kit.+Sca-1+. La primera y segunda rondas de células clasificadas (1000/pocillo) se cultivaron en presencia o ausencia de diferentes dosis de equinomicina durante 24 horas. Los fármacos se lavaron y las células se colocaron en placas. Las colonias se contaron 5 días después del cultivo. b. Inhibición mediante otras clases de inhibidores de HIF1a, 2-metoxiestradiol (2ME2) y geldanamicina (GA), pero no mediante un inhibidor de P38, SB203580. Como se describe en a, excepto que se utilizaron fármacos adicionales como control. c. A bajas concentraciones (5-20 pM), la equinomicina inhibe la autorrenovación de las células iniciadoras de colonias sin afectar la formación de colonias. Se cultivaron alícuotas iguales de células tumorales TGB en medio que contenía metilcelulosa en presencia de concentraciones dadas de equinomicina durante 5 días cuando se contaron las colonias de la primera ronda. Después de lavar los fármacos, se volvieron a sembrar alícuotas iguales de células de la primera ronda. Se contaron las colonias recién formadas. El número de colonias se normalizó frente al grupo no tratado. El número de colonias en cultivos no tratados: primera ronda, 362; segunda ronda 202.

Figura 10. Resistencia continua de la actividad HPC a altas dosis de equinomicina. Para la primera ronda, las células totales de médula ósea (106) se trataron con una concentración dada de equinomicina durante 24 horas. Después de lavar los fármacos, las alícuotas correspondientes a 0,25 x 106 células sembradas/pocillo se sembraron en medio que contenía metilcelulosa para el ensayo de UFC. Las colonias se contaron el día 5. Para el análisis de la segunda ronda, se incubaron 0,5 x 106 células viables aisladas del grupo no tratado en la primera ronda con una concentración dada de equinomicina. Las alícuotas correspondientes a 5 x 104 células/pocillo se volvieron a sembrar y las colonias se contaron el día 5. Los datos mostrados son medias y DE de triplicados. Figura 11. Efecto terapéutico de la equinomicina administrada 4 días después del trasplante de tumor. Se trasplantaron ip células de linfoma cultivadas (1 x 106/ratón) a ratones B10.b R inmunocompetentes. Cuatro días después, se inyectaron 10 pg/kg/inyección de equinomicina con un intervalo de dos días durante un total de 3 veces. Los ratones de control recibieron solo vehículo.

Figura 12. Múltiples inhibidores de HIF-1a reprimen la autorrenovación y la actividad de iniciación tumoral de las células tumorales TGB. a. Inhibición de la formación de colonias dependiente de la dosis mediante 2-metoxiestradiol (2ME2) y geldanamicina. b. Inhibición de la formación de tumores mediante inhibidores de HIF 2ME2 y geldanamicina. Se inyectaron ip células de linfoma cultivadas (9 x 105/ratón) en ratones inmunocompetentes B10.BR. Ocho días después, las dosis administradas de 2ME2 y geldanamicina se inyectaron con un intervalo de dos días por un total de 5 veces. Los ratones de control recibieron solo vehículo. Se observó diariamente la supervivencia de los ratones. Los valores de P dados se obtuvieron mediante pruebas del orden logarítmico en comparación con los grupos tratados y de control.

Figura 13. En los intervalos utilizados en el estudio, la equinomicina inhibe la actividad de HIF1a pero no de cMyc. Las células HEK293 se transfectaron conjuntamente con los indicadores Ebox o HRE (véase la figura 2b) con el vector que codifica c-Myc o HIF1a -Pa . Después de 16 horas, las células se trataron con diferentes concentraciones de equinomicina durante 24 horas adicionales. Las actividades transcripcionales de c-Myc y HIF1a se cuantificaron mediante citometría de flujo. El grupo no tratado se define como 100%. Los datos mostrados son medias /- DE de triplicados. El experimento se repitió tres veces.

Figura 14. Verificación de la eficacia del ARNhc de HIF-1a. Las células 293T se transfectaron con un ADNc que codifica el mutante de HIF-1a (P402A/P577A) que es estable en condiciones de normoxia junto con los vectores de control V (secuencia desordenada del núcleo: 5'-cgcgtagcgaagctca taa-3') o ARNhc-1 y -2 de HIF-1a. Los lisados celulares se sondaron con AcM anti-Flag 24 horas después de la transfección.

Figura 15. Las células tumorales TGB expresan tanto Notch 1 como Notch 2. Las células tumorales TGB se clasificaron en subconjuntos c-Kit+Sca-1 y c-Kit'Sca-1'. La expresión de los miembros de la familia Notch se detectó mediante RT-PCR.

Figura 16. Secuencia de la secuencia promotora Hes1 de ratón y humana. La secuencia N está marcada en rojo, CBF1 está marcado en azul, TSS está marcado en amarillo, mientras que el HRE está marcado en verde. Los cebadores utilizados para la construcción del indicador y la PCR en tiempo real en los ensayos de ChIP están marcados en rosa.

Figura 17. La equinomicina anuló la AML en ratones NOD-SCID. A. Eliminación de células humanas procedentes de AML en la sangre de ratones receptores. Los datos mostrados son medias y DE. (n = 3). B. Falta de células humanas en ratones tratados con equinomicina. Los datos mostrados son el perfil representativo de la expresión de CD45 humana entre células de la médula ósea. Se obtuvieron perfiles esencialmente idénticos con otros dos ratones. B. Células de AML humanas en la médula ósea de ratones no tratados. El panel de la izquierda muestra la tinción de CD45 humano de células de la médula ósea, mientras que los paneles de la derecha muestran fenotipos de las células CD45+ humanas seleccionadas. Los datos mostrados son representativos de tres ratones por grupo.

Figura 18. HIF1a es una diana para la eliminación terapéutica de la AML humana en un modelo de ratón xenogénico. a. Aislamiento de 4 subconjuntos de células tumorales en muestras de AML. Las células de la médula ósea del paciente con AML MI-AML-71 se tiñeron para CD34 y CD38 y se clasificaron en 4 subconjuntos para el aislamiento de ARN. Las muestras de clasificación previa y las ventanas de adquisición utilizadas para la clasificación se muestran en el panel izquierdo y las poblaciones clasificadas posteriormente se muestran en los paneles central y derecho. Los porcentajes de celdas en cada ventana de adquisición se proporcionan en los paneles. b. Expresión de HIF1a (arriba) y GLUT1 en los subconjuntos. Los datos mostrados son medias /- DE de los niveles de transcripción de los genes, presentados como % de p-actina de las mismas muestras. Se observó expresión mejorada en las muestras CD34+CD38' en las 6 muestras de AML analizadas. c. Las UFC-AML en las 6 muestras de AML fueron muy sensibles a la equinomicina. Las muestras de AML (2,5 * 105/ml) tanto de sangre periférica (SP) o de médula ósea (MO) se trataron previamente con concentraciones dadas de equinomicina en 2 ml de medio durante 24 horas. A continuación las células viables tratadas se sembraron en placas a 105/pocillo para el ensayo de UFC por triplicado. El número de colonias se contó 7-10 días después. Los datos mostrados son % de media /- DE de los controles no tratados. d. La equinomicina elimina selectivamente el subconjunto CD34+CD38' de células AML. Las muestras primarias de AML se cultivaron con dosis determinadas de equinomicina o control con vehículo durante 30 horas en RPMI 1640 que contenía suero de ternero fetal al 10 % y un cóctel de citocinas humanas que consistía en CSF, GM-CSF e IL-3 a una densidad de 5 * 105/ml. Las células se tiñeron con anticuerpos contra CD34, CD38 junto con anexina V y DAPI. Los datos mostrados son el % de células anexina V+DAPI_/+. Se restó el % de células anexina V+ en el grupo tratado con vehículo. Los símbolos rellenos muestran los datos del subconjuntos CD34+CD38', mientras que los símbolos abiertos muestran datos para las células leucémicas en masa (CD34+CD38+ para AML9, AMl 32, AML60 y AML71 y CD34'CD38+ para AML15 y AML36). Estos datos se repitieron dos veces. e-h. Efecto terapéutico de la equinomicina. e. Efecto terapéutico de la AML humana en ratones NOD-SCID, los datos mostrados son % de células CD45 (hCD45)+ humanas en la médula ósea de los ratones receptores a los 40 días después del último tratamiento. El efecto terapéutico se ha repetido dos veces. f. La equinomicina no induce la diferenciación de las células de la AML in vivo, como revela la falta de marcadores mieloides maduros en la mayor parte de las células humanas en el grupo tratado y no tratado. Los datos mostrados son perfiles de CD14 y CD15 entre células CD45+ humanas. g. Agotamiento selectivo del subconjunto CD34+CD38' mediante equinomicina. Los datos mostrados en los paneles superiores son la abundancia de subconjuntos CD34+CD38' en la médula ósea del ratón, mientras que el panel inferior muestra la de las células de leucemia humana. h. A pesar de la presencia de células leucémicas, la médula ósea de los ratones tratados con equinomicina no pudo reiniciar la leucemia en los nuevos ratones NOD-SCID. Los perfiles representativos se presentan en el panel superior, mientras que los datos resumidos de 5 ratones por grupo se presentan en el panel inferior.

Descripción detallada

Los inventores han hecho el sorprendente descubrimiento de que el inhibidor del HIF, la equinomicina, es capaz de tratar un cáncer hematológico a una dosis no tóxica. Esto indica una susceptibilidad única de las CSC de linfoma a la equinomicina, y que tan solo 30 |jg/m2 de equinomicina es suficiente para anular el linfoma en el 100% de los receptores. Por ejemplo, in vitro, las UFC-AML de los 6 casos de muestras humanas de AML analizadas fueron altamente susceptibles a la equinomicina.

La equinomicina se introdujo en ensayos clínicos hace aproximadamente 20 años por su actividad antitumoral contra dos tumores murinos implantados ip, el melanoma B16 y la leucemia P388. Sin embargo, las pruebas de la eficacia de los ensayos clínicos de fase II de equinomicina para varios tumores sólidos revelaron que la equinomicina presenta una toxicidad significativa y tiene una eficacia mínima o nula. No se había probado la eficacia de la equinomicina para el tratamiento del cáncer hematológico. Adicionalmente, la dosis ajustada a la superficie corporal utilizada en ensayos clínicos humanos previos fue aproximadamente 100 veces mayor que la dosis que los inventores han descubierto que es eficaz para tratar el cáncer hematológico. La toxicidad observada en ensayos previos en seres humanos probablemente se debió al exceso de dosis utilizada, mientras que la falta de efecto puede deberse a criterios de valoración clínicos que no reflejan el requisito único del HIF en las CSC de linfoma. Por lo tanto, la equinomicina se puede utilizar para tratar el cáncer hematológico asociado con CSC, incluyendo linfoma, y en particular, a una dosis no tóxica.

1. Definiciones.

La terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente y no pretende ser limitante. Como se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno", "una" y "el", "la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

Para la recitación de intervalos numéricos en el presente documento, se contempla de manera explícita cada número intermedio entre ellos con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el intervalo de 6-9, se contemplan los números 7 y 8 además de 6 y 9, y para el intervalo 6,0-7,0, se contemplan de manera explícita los números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0.

Un "péptido" o "polipéptido" es una secuencia enlazada de aminoácidos y puede ser natural, sintética, o una modificación o combinación de natural y sintética.

"Tratamiento" o "tratar", cuando se refiere a la protección de un animal de una enfermedad, significa prevenir, suprimir, reprimir, o eliminar completamente la enfermedad. La prevención de la enfermedad implica administrar una composición de la presente invención a un animal antes de la aparición de la enfermedad. La supresión de la enfermedad implica administrar una composición de la presente invención a un animal después de la inducción de la enfermedad, pero antes de su aparición clínica. La represión de la enfermedad implica administrar una composición de la presente invención a un animal después de la aparición clínica de la enfermedad.

2. Inhibidor del factor inducible por hipoxia

En el presente documento se divulga un inhibidor de la proteína del factor inducible por hipoxia (HIF, por sus siglas en inglés). El inhibidor del HIF puede ser equinomicina, 2-metoxiestradiol o geldanamicina.

a. Equinomicina

La equinomicina puede ser un antibiótico peptídico tal como N,N'-(2,4,12,15,17,25-hexametil-11,24-bis(1-metiletil)-27-(metiltio)-3,6,10,13,16,19,23,26-octaoxo-9,22-dioxa-28-tia-2,5,12,15,18,25-hexaazabiciclo(12.12.3)no-acosano-7,20-diil)bis(2-quinoxalinacarboxamida). La equinomicina puede ser un antibiótico de quinoxalina procedente de microbios, que se puede producir mediante Streptomyces echinatus. La equinomicina puede tener la siguiente estructura.

La equinomicina puede tener una estructura como se divulga en la patente de EE.UU. n.° 5.643.871. La equinomicina también puede ser un derivado de equinomicina, que puede comprender una modificación como se describe en Gauvreau et al., Can J Microbiol, 1984;30(6):730-8; Baily et al., Anticancer Drug Des 1999;14(3):291-303; o Park y Kim, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1998;8(7):731-4. La equinomicina también puede ser un análogo bisquinoxalino de equinomicina

b. HIF

El HIF puede ser un factor funcional inducible por hipoxia, que puede comprender un subconjunto b constitutivo y una subunidad a regulada por oxígeno. El HIF puede estar sobreexpresado en una amplia gama de tipos de cáncer humano, que puede ser un cáncer de mama, próstata, pulmón, vejiga, páncreas u ovario. Aunque sin pretender quedar ligado a una teoría, el aumento de la expresión del h If puede ser una consecuencia directa de la hipoxia dentro de una masa tumoral. Tanto los factores genéticos como los ambientales pueden conducir a un aumento de la expresión del HIF incluso en la condición de normoxia. La mutación de la línea germinal del gen von Hippel-Lindau (VHL), que puede ser el supresor de tumores para el cáncer renal, puede prevenir la degradación del HIF en normoxia. Puede ser posible mantener de manera constitutiva la actividad del HIF en normoxia mediante regulación por aumento del HIF y/o regulación por disminución del VHL. El HIF puede ser HIF1a o HIF2a.

c. Composición farmacéutica

Se divulga una composición farmacéutica que comprende el inhibidor del HIF. La composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar de acuerdo con la invención puede estar en forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional. Por ejemplo, los comprimidos y las cápsulas para administración oral pueden contener excipientes convencionales, pueden ser agentes aglutinantes, rellenos, lubricantes, desintegrantes y agentes humectantes. Los agentes aglutinantes incluyen, pero sin limitación, jarabe, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto, mucílago de almidón y polivinilpirrolidona. Los rellenos pueden ser lactosa, azúcar, celulosa microcristalina, almidón de maíz, fosfato de calcio y sorbitol. Los lubricantes incluyen, pero sin limitación, estearato de magnesio, ácido esteárico, talco, polietilenglicol, y sílice. Los desintegrantes pueden ser almidón de patata y glicolato sódico de almidón. Los agentes humectantes pueden ser laurilsulfato de sodio. Los comprimidos pueden recubrirse de acuerdo con métodos bien conocidos en la materia.

La composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar de acuerdo con la invención también puede ser formulaciones líquidas tales como suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes y elixires. La composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar de acuerdo con la invención también puede formularse como un producto seco para reconstituir con agua u otro vehículo adecuado antes de utilizarlo. Dichas preparaciones líquidas pueden contener aditivos, tales como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos y conservantes. Los agentes de suspensión pueden ser jarabe de sorbitol, metilcelulosa, jarabe de glucosa/azúcar, gelatina, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, gel de estearato de aluminio y grasas comestibles hidrogenadas. Los agentes emulsionantes pueden ser lecitina, monooleato de sorbitán y acacia. Los vehículos no acuosos pueden ser aceites comestibles, aceite de almendra, aceite de coco fraccionado, ésteres oleosos, propilenglicol y alcohol etílico. Los conservantes pueden ser p-hidroxibenzoato de metilo o propilo y ácido sórbico.

La composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar de acuerdo con la invención también se puede formular como supositorios, que pueden contener bases de supositorios tales como cacao o glicéridos. La composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar de acuerdo con la invención también puede formularse para inhalación, que puede estar en una forma tal como una solución, suspensión o emulsión que se puede administrar como un polvo seco o en forma de un aerosol usando un propelente, tal como diclorodifluorometano o triclorofluorometano. Los agentes proporcionados en el presente documento también pueden formularse como formulaciones transdérmicas que comprenden vehículos acuosos o no acuosos tales como cremas, pomadas, lociones, pastas, emplasto medicado, parche o membrana.

La composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar de acuerdo con la invención también se puede formular para administración parenteral tal como mediante inyección, inyección intratumoral o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden estar en forma de suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleaginosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación que incluyen, pero sin limitación, agentes de suspensión, estabilizantes y dispersantes. La composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar de acuerdo con la invención también se puede proporcionar en forma de polvo para reconstituir con un vehículo adecuado que incluye, pero sin limitación, agua estéril y libre de pirógenos.

La composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar de acuerdo con la invención también se puede formular como preparación de depósito, que puede administrarse mediante implante o mediante inyección intramuscular. La composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar de acuerdo con la invención se puede formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (como una emulsión en un aceite aceptable, por ejemplo), resinas de intercambio iónico o como derivados escasamente solubles (como una sal escasamente soluble, por ejemplo).

(1) Adm inistración

La composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar de acuerdo con la invención puede ser para administración oral, administración parenteral, administración sublingual, administración transdérmica, administración rectal, administración transmucosa, administración tópica, administración por inhalación, administración bucal o combinaciones de las mismas. La administración parenteral incluye, pero sin limitación, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intratecal e intraarticular. Para uso veterinario, la composición farmacéutica puede ser para administración como una formulación adecuada aceptable de acuerdo con la práctica veterinaria normal. El veterinario puede determinar fácilmente el régimen de dosificación y la vía de administración que es más apropiada para un animal en particular. La composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar de acuerdo con la invención puede ser para administración a un paciente humano, gato, perro, animal grande, o un ave.

La composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar de acuerdo con la invención puede ser para administración simultánea o metronómica con otros tratamientos. El término "simultáneo" o "simultáneamente", como se utiliza en el presente documento, significa que la composición farmacéutica y otros tratamientos deben administrarse dentro de las 48 horas, preferentemente de 24 horas, más preferentemente de 12 horas, aún más preferentemente de 6 horas, y los más preferentemente de 3 horas o menos, entre sí. El término "metronómicamente", como se utiliza en el presente documento, significa la administración del agente en momentos diferentes del otro tratamiento y a una determinada frecuencia con respecto a la administración repetida.

La composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar de acuerdo con la invención puede ser para administración en cualquier momento antes de otro tratamiento incluyendo aproximadamente 120 h, 118 h, 116 h, 114 h, 112 h, 110 h, 108 h, 106 h, 104 h, 102 h, 100 h, 98 h, 96 h, 94 h, 92 h, 90 h, 88 h, 86 h, 84 h, 82 h, 80 h, 78 h, 76 h, 74 h, 72 h, 70 h, 68 h, 66 h, 64 h, 62 h, 60 h, 58 h, 56 h, 54 h, 52 h, 50 h, 48 h, 46 h, 44 h, 42 h, 40 h, 38 h, 36 h, 34 h, 32 h, 30 h, 28 h, 26 h, 24 h, 22 h, 20 h, 18 h, 16 h, 14 h, 12 h, 10 h, 8 h, 6 h, 4 h, 3 h, 2 h, 1 h, 55 min, 50 min, 45 min, 40 min, 35 min, 30 min, 25 min, 20 min, 15 min, 10 min, 9 min, 8 min, 7 min, 6 min, 5 min, 4 min, 3 min, 2 min y 1 min. La composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar de acuerdo con la invención puede ser para administración en cualquier momento antes de un segundo tratamiento de la composición farmacéutica incluyendo aproximadamente 120 h, 118 h, 116 h, 114 h, 112 h, 110 h, 108 h, 106 h, 104 h, 102 h, 100 h, 98 h, 96 h, 94 h, 92 h, 90 h, 88 h, 86 h, 84 h, 82 h, 80 h, 78 h, 76 h, 74 h, 72 h, 70 h, 68 h, 66 h, 64 h, 62 h, 60 h, 58 h, 56 h, 54 h, 52 h, 50 h, 48 h, 46 h, 44 h, 42 h, 40 h, 38 h, 36 h, 34 h, 32 h, 30 h, 28 h, 26 h, 24 h, 22 h, 20 h, 18 h, 16 h, 14 h, 12 h, 10 h, 8 h, 6 h, 4 h, 3 h, 2 h, 1 h, 55 min, 50 min, 45 min, 40 min, 35 min, 30 min, 25 min, 20 min, 15 min, 10 min, 9 min, 8 min, 7 min, 6 min, 5 min, 4 min, 3 min, 2 min y 1 min.

La composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar de acuerdo con la invención puede ser para administración en cualquier momento después de otro tratamiento incluyendo aproximadamente 1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 6 min, 7 min, 8 min, 9 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 35 min, 40 min, 45 min, 50 min, 55 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h, 22 h, 24 h, 26 h, 28 h, 30 h, 32 h, 34 h, 36 h, 38 h, 40 h, 42 h, 44 h, 46 h, 48 h, 50 h, 52 h, 54 h, 56 h, 58 h, 60 h, 62 h, 64 h, 66 h, 68 h, 70 h, 72 h, 74 h, 76 h, 78 h, 80 h, 82 h, 84 h, 86 h, 88 h, 90 h, 92 h, 94 h, 96 h, 98 h, 100 h, 102 h, 104 h, 106 h, 108 h, 110 h, 112 h, 114 h, 116 h, 118 h y 120 h. La composición farmacéutica puede ser para administración en cualquier momento anterior después de un tratamiento de composición farmacéutica del agente incluyendo aproximadamente 120 h, 118 h, 116 h, 114 h, 112 h, 110 h, 108 h, 106 h, 104 h, 102 h, 100 h, 98 h, 96 h, 94 h, 92 h, 90 h, 88 h, 86 h, 84 h, 82 h, 80 h, 78 h, 76 h, 74 h, 72 h, 70 h, 68 h, 66 h, 64 h, 62 h, 60 h, 58 h, 56 h, 54 h, 52 h, 50 h, 48 h, 46 h, 44 h, 42 h, 40 h, 38 h, 36 h, 34 h, 32 h, 30 h, 28 h, 26 h, 24 h, 22 h, 20 h, 18 h, 16 h, 14 h, 12 h, 10 h, 8 h, 6 h, 4 h, 3 h, 2 h, 1 h, 55 min, 50 min, 45 min, 40 min, 35 min, 30 min, 25 min, 20 min, 15 min, 10 min, 9 min, 8 min, 7 min, 6 min, 5 min, 4 min, 3 min, 2 min y 1 min.

d. Dosificación

La cantidad terapéuticamente eficaz requerida para utilizar varía con la naturaleza de la afección que se está tratando, el período de tiempo deseado para inhibir la actividad del HIF y la edad/condición del paciente.

La dosis de equinomicina puede ser una dosis no tóxica. La dosis también puede ser una en la que se inhiba la actividad del HIF, pero en el que la actividad de c-Myc no se ve afectada. En general, sin embargo, las dosis empleadas para el tratamiento de seres humanos adultos normalmente pueden estar en el intervalo de 1-100 pg/m2 por día, o en una cantidad umbral de 1-100 pg/m2 por día o menos, medida mediante una dosis ajustada a la superficie corporal. La dosis deseada puede administrarse convenientemente en una dosis única o como dosis múltiples administradas a intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más subdosis al día. Pueden ser deseadas dosis múltiples o requeridas.

La dosis de equinomicina puede ser una dosis de aproximadamente 1 pg/m2, 2 pg/m2, 3 pg/m2, 4 pg/m2, 5 pg/m2, 6 pg/m2, 7 pg/m2, 8 pg/m2, 9 pg/m2, 10 pg/m2, 15 pg/m2, 20 pg/m2, 25 pg/m2, 30 pg/m2, 35 pg/m2, 40 pg/m2, 45 pg/m2, 50 pg/m2, 55 pg/m2, 60 pg/m2, 70 pg/m2, 80 pg/m2, 90 pg/m2, 100 pg/m2, 200 pg/m2, 300 pg/m2, 400 pg/m2, 500 pg/m2, 600 pg/m2, 700 pg/m2, 800 pg/m2, 900 pg/m2, 1000 pg/m2, 1100 pg/m2 o 1200 pg/m2, e intervalos de los mismos.

La dosis de equinomicina también puede ser una dosis menor o igual a aproximadamente 1 pg/m2, 2pg/m2, 3 pg/m 2, 4 pg/m2, 5 pg/m2, 6 pg/m2, 7 pg/m2, 8 pg/m2, 9 pg/m2, 10 pg/m2, 15 pg/m2, 20 pg/m2, 25 pg/m2, 30 pg/m2, 35 pg/m2, 40 pg/m2, 45 pg/m2, 50 pg/m2, 55 pg/m2, 60 pg/m2, 70 pg/m2, 80 pg/m2, 90 pg/m2, 100 pg/m2, 200 pg/m2, 300 pg/m2, 400 pg/m2, 500 pg/m2, 600 pg/m2, 700 pg/m2, 800 pg/m2, 900 pg/m2, 1000 pg/m2, 1100 pg/m2 o 1200 pg/m2, e intervalos de los mismos.

e. Adm inistración conjunta

La composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar de acuerdo con la invención puede ser para administración conjunta con otra sustancia farmacológica. La sustancia puede ser un inhibidor de la ruta Hedgehog, que puede ser ciclopamina. La sustancia también puede ser una segunda terapia contra el cáncer. La terapia contra el cáncer puede ser una sustancia citotóxica o una sustancia citostática. La sustancia reductora puede seleccionarse del grupo que consiste en: agentes alquilantes (incluyendo, sin limitación, mostazas nitrogenadas, derivados de etilenimina, alquil sulfonatos, nitrosoureas y triazenos): mostaza de uracilo, clormetina, ciclofosfamida (Cytoxan®), ifosfamida, melfalán, clorambucilo, pipobromano, trietilenmelamina, trietilenotiofosforamina, busulfano, carmustina, lomustina, estreptozocina, dacarbazina y temozolomida; antimetabolitos (incluyendo, sin limitación, antagonistas de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores de adenosina desaminasa): metotrexato, 5-fluorouracilo, floxuridina, citarabina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, fosfato de fludarabina, pentostatina y gemcitabina; productos naturales y sus derivados (por ejemplo, alcaloides de la vinca, antibióticos antitumorales, enzimas, linfocinas y epipodofilotoxinas): vinblastina, vincristina, vindesina, bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, ara-c, paclitaxel (el paclitaxel está disponible comercialmente como Taxol®), mitramicina, desoxicomformicina, mitomicina-c, 1-asparaginasa, interferones (preferentemente IFN-y), etopósido y tenipósido. Otras sustancias citotóxicas antiproliferativas son navelbeno, CPT-11, anastrazol, letrazol, capecitabina, reloxafina, ciclofosfamida, ifosamida y droloxafina.

La sustancia citotóxica puede ser una sustancia que afecta a los microtúbulos, que puede interferir con la mitosis celular. La sustancia que afecta a los microtúbulos puede seleccionarse del grupo que consiste en: alocolchicina (NSC 406042), halicondrina B (NSC 609395), colchicina (NSC 757), derivados de colchicina (por ejemplo, NSC 33410), dolastatina 10 (NSC 376128), maitansina (NSC 153858), rizoxina (NSC 332598), paclitaxel (Taxol®, NSC 125973), derivados de Taxol® (por ejemplo, derivados (por ejemplo, NSC 608832), tiocolchicina (NSC 361792), tritil cisteína (NSC 83265), sulfato de vinblastina (NSC 49842), sulfato de vincristina (NSC 67574), epotilonas naturales y sintéticas, incluyendo, pero sin limitación, epotilona A, epotilona B y discodermolida (véase Service, (1996) Science, 274:2009), estramustina, nocodazol y MAP4. La sustancia que afecta a los microtúbulos también puede ser como se describe en Bulinski (1997) J. Cell Sci. 110:30553064; Panda (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10560-10564; Muhlradt (1997) Cancer Res. 57:3344-3346; Nicolaou (1997) Nature 387:268-272; Vasquez (1997) Mol. Biol. Cell. 8:973-985; y Panda (1996) J. Biol. Chem 271:29807-29812.

La sustancia reductora también puede seleccionarse del grupo que consiste en: epidofilotoxina; una enzima antineoplásica; un inhibidor de topoisomerasa; procarbazina; mitoxantrona; complejos de coordinación de platino tales como cis-platino y carboplatino; modificadores de la respuesta biológica; inhibidores del crecimiento; sustancias terapéuticas antihormonales; leucovorina; tegafur; y factores de crecimiento hematopoyético.

La sustancia citostática puede seleccionarse del grupo que consiste en: hormonas y esteroides (incluyendo análogos sintéticos): 17a-etinilestradiol, dietilestilbestrol, testosterona, prednisona, fluoximasterona, propionato de dromostanolona, testolactona, acetato de megestrol, metilprednisolona, metil-testosterona, prednisolona, triamcinolona, clorotrianiseno, hidroxiprogesterona, aminoglutetimida, estramustina, acetato de medroxiprogesterona, leuprolida, flutamida, toremifeno y zoladex. La sustancia citostática también puede ser un antiangiogénico, tal como un inhibidor de metaloproteinasas de matriz o un inhibidor de VEGF, que puede ser un anticuerpo anti-VEGF o una molécula pequeña tal como ZD6474 o SU6668. El agente también puede ser un anticuerpo anti-hre2 de Genentech, un inhibidor de EGFR tal como EKB-569 (un inhibidor irreversible), o un anticuerpo Imclone C225 inmunoespecífico para EGFR, o un inhibidor de src.

La sustancia citostática también puede seleccionarse del grupo que consiste en: Casodex® (bicalutamida, Astra Zeneca) que hace que los carcinomas dependientes de andrógenos no proliferen; el antiestrógeno Tamoxifen® que inhibe la proliferación o el crecimiento del cáncer de mama dependiente de estrógenos; y un inhibidor de la transducción de señales proliferativas celulares. El inhibidor de la transducción de señales proliferativas celulares puede seleccionarse del grupo que consiste en inhibidores del factor de crecimiento epidérmico, inhibidores de hre-2, inhibidores de la cinasa MEK-1, inhibidores de la cinasa MAPK, inhibidores de PI3, inhibidores de la cinasa Src e inhibidores de PDGF.

3. Usos médicos

a. Tratamiento de un cáncer hematológico

En el presente documento se divulga un método de tratamiento de cáncer hematológico. El método puede comprender administrar un inhibidor del HIF a un mamífero que lo necesite. El mamífero puede ser un paciente humano. El cáncer hematológico puede ser linfoma o leucemia. El cáncer hematológico se puede tratar mediante la inhibición de una función de mantenimiento o supervivencia de una CSC. Sin estar ligado a la teoría, la inhibición del HIF puede dirigirse tanto a las células madre cancerosas como a la resistencia al cáncer.

Además, sin estar ligado a la teoría, las CSC en el cáncer hematológico pueden requerir autorrenovación, que puede ser similar al requerimiento en las células de los tejidos. Las CSC pueden requerir un ambiente hipóxico y la exposición a un elevado nivel de oxígeno puede reducir la función de las CSC. La autorrenovación de la función de las CSC puede verse fuertemente inhibida por fármacos dirigidos a la ruta del HIF. Las CSC pueden ser adictas al HIF, que puede estar asociado con la sobreexpresión del HIF y la regulación a la baja del VHL. La sobreexpresión del HIF y la regulación a la baja del VHL pueden ser claves en el mantenimiento de las CSC. EL HIF puede trabajar en conjunto con la ruta Notch para mediar en la autorrenovación de las CSC de linfoma.

(1) Célula madre cancerosa

La célula madre cancerosa puede ser quimiorresistente o radiorresistente. La CSC también puede ser resistente a múltiples fármacos.

(2) Leucemia mieloide aguda

La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar en el tratamiento de una leucemia mieloide aguda. La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar en la prevención de la futura recaída de la leucemia mieloide aguda en un ser humano durante la remisión de la leucemia mieloide aguda. La AML puede estar asociada con una CSC caracterizada por el genotipo CD38-CD34+. La AML también puede estar asociada con un paciente que porta una alteración citogenética. La alteración citogenética puede seleccionarse del grupo que consiste en: 47,XY,+21;46,XY; 45,XX,-7; 46,XY,t(8;21)(q22;q22); 49,XX,+8,+8,inv(16)(p13.1q22),+21; 46,XX,inv(16)(p13q22)/46,XX; 46,XY,inv(16)(p13q22); 46,XX,t(2;13)(p23;q12)/46,XX; 45,XY,inv(3)(q21q26.2),-7/46,XY; 47,XY,+4,inv(5)(p15q13)/47,s1,-4,+22;46,XX,t(11; 19)(q23; p13.1); 46,XX,t(6; 11)(q27;q23)/46,XX; y 46,XX,t(1; 17)(p13;q25),t(9; 11 )(p22;q23).

La CSC de la AML puede ser extremadamente sensible al inhibidor del HIF. Las UFC de AML pueden ser muy susceptibles al inhibidor del HIF, con una CI50 entre 50-120 pM. El inhibidor del HIF puede utilizarse para eliminar CSC de AML como parte de la terapia de remisión posterior.

b. Inducción de la remisión de la leucemia mieloide aguda

La presente invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar en la inducción de la remisión de la leucemia mieloide aguda en un ser humano. La equinomicina puede administrarse al mamífero durante la remisión de la leucemia mieloide aguda para prevenir una futura recaída. La equinomicina puede administrarse como se divulga en otra parte del presente documento.

c. Inhibición de una función de mantenimiento o supervivencia de una CSC

Se divulga además un método para inhibir una función de mantenimiento o supervivencia de una CSC. El contacto de la CSC con el inhibidor del HIF puede inhibir la función de mantenimiento o supervivencia. El contacto puede comprender administrar el inhibidor del HIF a un mamífero que necesite inhibir la función de mantenimiento o supervivencia de la CSC. El inhibidor del HIF se puede administrar como se divulga en otra parte del presente documento.

La presente invención se ilustra adicionalmente en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

Identificación de células iniciadoras de linfoma autorrenovables en hospedador inmunocompetente singénico

El cien por cien de los ratones transgénicos (TGB) con mutación de inserción del gen Epm2a sucumben al linfoma. En busca de la expresión de posibles marcadores de células madre en las células del linfoma TGB, se encontró que un pequeño subconjunto de células expresaban tanto c-Kit como Sca-1, que en parte constituyen marcadores de HSC (Figura 1a). Para probar si estas células pueden tener actividad de CSC, las células de linfoma del bazo de ratones transgénicos TGB con tumores se clasificaron basándose en la expresión de c-Kit y Sca-1 (paneles de la derecha de la figura 1a). Como se muestra en la figura 1b, no se formó ninguna colonia a partir de 103 células c-KitSca-1- células. Sorprendentemente, 103 células con c-Kit+Sca-1+ produjo aproximadamente 800 colonias, lo que sugiere que todas las células del subconjunto eran UFC. La mayoría de las colonias están compactas (inserto de la figura 1b), en contraste con las diversas colonias obtenidas de HSC de médula ósea. Las progenies de las células c-Kit+Sca-1 consisten en subconjuntos c-Kit+Sca-1+ y c-Kit'Sca-1' (Figura 7). Por lo tanto, las células c-Kit+Sca-1+ son la población autorrenovable entre las células individuales aisladas del linfoma TGB. Para determinar si las células c-Kit+Sca-1+ son también las células que inician el linfoma in vivo, se inyectaron células c-Kit+Sca-1+ o células c-KitSca-1- por vía intraperitoneal (ip) en los ratones singénicos B10BR. Tal como se muestra en la tabla 1, expt 1, tres de cada tres ratones que recibieron 100 células c-Kit+Sca-1+ desarrollaron linfomas generalmente dentro de las 10 semanas posteriores a la inyección, sin embargo, ninguno de los receptores de 104 células c-KitSca-1- lo hizo incluso después de 40 semanas de observación. Se obtuvieron resultados similares cuando se repitieron los experimentos mediante inyección intravenosa (Tabla 1, expt. 2). Los linfomas se caracterizan por agrandamiento del bazo (Figura 1c), ganglios linfáticos y metástasis en el hígado y pulmón, pero no en el timo (datos no mostrados), a diferencia del linfoma desarrollado de manera espontánea que apareció primero como timoma y después hizo metástasis en otro órgano. Además, no se logró la constitución de otros linajes celulares a partir del subconjunto c-Kit+Sca-1+ aislado de tumores, lo que indica que las células c-Kit+Sca-1+ no son las HSC que infiltran el tumor. En tres rondas de trasplante en serie (Tabla 1, expt. 5), las células c-Kit+Sca-1+, pero no las células c-KitSca-1-, dieron lugar a linfoma a una potencia comparable. Los tumores mantuvieron la expresión del marcador de linfocitos T CD8, pero perdió gradualmente la expresión en la superficie celular del TCR transgénico (Figura 1d y tabla S1). Más importante aún, la frecuencia de las células c-Kit+Sca-1+ permaneció alrededor del 1 % (Tabla S1). Por lo tanto, las células iniciadoras de tumores autorrenovables se encuentran entre las células tumorales c-Kit+Sca-1+.

Tabla 1. Identificación de CSC utilizando marcadores c-Kit y Sca-1

Expt donante inyectado Receptor Número de células

100 10.000 1.000 500

1 c-Kit+Sca-1+ 3/3 B10.BR - - 3/3

c-KitSca-1- B10.BR 0/3 - -

2. c-Kit+Sca-1+ 3/3 B10.BR - - 4/4

c-KitSca-1- B10.BR 0/3 - 0/3

3. c-Kit+Sca-1+ 5/5 B10.BR - 5/5

c-KitSca-1- B10.BR 1/5 0/5 -

4. c-Kit+Sca-1+ 5/5 RAG2-/- - - 5/5

c-KitSca-1- RAG2-/- 1/5 0/5 -

Trasplante en serie

5.

Ronda 1

c-Kit+Sca-1+ 3/3 B10.BR 3/3

c-KitSca-1- B10.BR 1/3 0/3 -

Ronda 2

c-Kit+Sca-1+ 5/5 B10.BR

c-KitSca-1- B10.BR 2/5 - -

Ronda 3

c-Kit+Sca-1+ 3/3 B10.BR

c-KitSca-1- B10.BR 0/3 (5000/ratón) -

Las células del donante se aislaron de linfoma ex vivo (expt 1 y 2) o de aquellos que se han cultivado durante más de 30 pases in vitro. Las vías de inyección fueron intraperitoneal (ip) para los experimentos 1, 3 y 4, e intravenosa para el experimento 2. No hubo crecimiento tumoral (0/3) cuando se trasplantaron 10 células c-Kit+Sca-1+ en ratones B10.BR. En el experimento 5, las células del donante se aislaron de linfoma ex vivo y se inyectaron ip. Las células de linfoma obtenidas en la ronda 1 se clasificaron e inyectaron para la segunda ronda, después se repitió para la tercera ronda. Los ratones libres de tumores se observaron durante 22-40 semanas para confirmar la falta de crecimiento tumoral.

Tabla S1

% de células marcadoras+

Marcadores Primario Ronda 3

Ronda 1 Ronda 2

c-Kit+Sca-1- 3,80 3,92 4,81 1,32

c-Kit'Sca-1 1,52 15,38 19,5 5,14

c-Kit+Sca1 0,87 0,81 0,97 0,83

CD8+VP8' 3,48 ND 47,39 54,27

CD8+VD8+ 92,36 ND 19,30 9,20

Tabla S1. Conservación y cambios dinámicos de fenotipos de células tumorales. Se aislaron células c-Kit+Sca-1+ de tumores espontáneos mediante clasificación FACS y se trasplantaron en serie en ratones B10.BR singénicos. Las suspensiones unicelulares de tumores que surgieron en cada ronda se analizaron mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos específicos para CD8, Vb8, c-Kit y Sca-1. Se presenta el % de células entre las células del bazo. ND, no determinado.

Utilizando el medio para analizar las unidades formadoras de colonias (UFC) de células progenitoras hematopoyéticas, fue posible establecer cultivos a largo plazo de las células de linfoma TGB. En más de 30 pases, las células c-Kit+Sca-1+ permanecieron en aproximadamente el 0,5-1,5 % de la población total de células de linfoma y mantuvieron las UFC in vitro (datos no mostrados) e inicio del tumor in vivo (Tabla 1, expts. 3 y 4), con una eficacia no disminuida. El hecho de que las células c-Kit+Sca-1+ permanecieron en un % bajo indica que estos marcadores deben haberse perdido durante la diferenciación que se produjo después del inicio de la formación de la colonia. La población c-Kit+Sca-1- por lo general desapareció durante el cultivo in vitro. La pérdida de las células del Kit+Sca-1- durante el cultivo no acompaña a la pérdida del inicio del tumor y de las UFC (datos no mostrados).

Ejemplo 2

Papel esencial para la regulación al alza de la expresión del HIF1a en el mantenimiento de CSC

Habiendo establecido que las células c-Kit+Sca-1+ son CSC en el modelo de linfoma, se identificó el programa molecular responsable de la autorrenovación de la actividad de CSC, utilizando UFC como ensayo sustituto. Como se muestra en la Figura 2a, el tratamiento con dosis farmacológicamente eficaces de Ly294002 (inhibidor de la ruta de señalización de PI-3 cinasa-AKT), rapamicina (ruta de síntesis de proteínas mTor-S6K), SB216763 (ruta GSK3p-betacatenina), Go6983 (Inhibidor de Pk C), 2-DG (inhibidor de hcx-okinasc), H89 (PKA-Cr Eb ), PDTC (ruta de la señal NF-kB), PD98059, SB203580 y SP600126 (familia MAPK ERK, p38 y JNK respectivamente) no tuvo ningún efecto sobre las UFC. En cambio, las dosis bajas de equinomicina anularon las UFC.

Para controlar la actividad del HIF1a de las CSC, se generó un indicador lentivírico, que consiste en elementos de respuesta al HIF1 (HRE, por sus siglas en inglés) triples en el sentido ascendente de una secuencia TATA mínima y una secuencia de EGFP, como se muestra en la Figura 2b. Se introdujo una secuencia de pausa para eliminar el efecto del promotor LTR en el indicador. Para validar al indicador, las células HEK293 se transfectaron de manera transitoria con un vector de control o un ADNc de HIF1a mutante (P402A/P577A) junto con indicadores de EGFP dirigidos por HRE TS o mutante. La mutación hizo que el HIF1a fuera funcional en condiciones de normoxia al resistir la degradación mediada por hidroxilación de prolilo. Como cabía esperar, el indicador HRE-EGFP fue inducido de manera específica por HIF1a pero no por el vector de control. En cambio, el indicador de EGFP de HRE mutante no respondió a HIF1a (Figura 2b, panel inferior izquierdo). Usando este vector lentivírico, se determinó el efecto de la equinomicina sobre el % de células con actividad del HIF activa. Como se muestra en la Figura 2b, panel inferior derecho, se encontró una población de células GFP+ distinta que expresaba tanto marcadores c-Kit como Sca-1 (Figura 2b y figura 8). La expresión de GFP reflejó la actividad del HIF ya que puede ser anulada mediante mutación del HRE (Figura 2b, panel medio inferior). La sensibilidad de este subconjunto a la equinomicina se evaluó adicionalmente. Como se muestra en la figura 2c, la equinomicina anuló la CSC con una CI50 de 29,4 pM, que es considerablemente más sensible que otros tipos de células, con CI50 en el intervalo nM (Kong et al., 2005).

Para fundamentar el papel de la actividad del HIF1 en la función de las CSC, se evaluó el efecto de los inhibidores del HIF tanto para UFC in vitro y actividad iniciadora de tumores in vivo. Dado que las UFC de las CSC de linfoma y las células progenitoras hematopoyéticas (HPC, por sus siglas en inglés) normales se pueden analizar en condiciones similares, se evaluó la selectividad de la equinomicina para HPC frente a CSC de linfoma. Como se muestra en la figura 2d, las CSC de linfoma fue aproximadamente 100 veces más sensible a la equinomicina que las HPC. En experimentos de siembra en placas en serie, se evaluó el efecto de la equinomicina tanto en la primera como en la segunda ronda de CSC. Como se muestra en la Figura 9a, las CSC en ambas rondas fueron igualmente susceptibles a la equinomicina. La especificidad se confirmó por el efecto de 3 clases diferentes de inhibidores del HIF1a pero no por el inhibidor de P38 (Figura S9b). Cabe resaltar que, con dosis (5-20 pM) que tuvieron poco efecto sobre las UFC en la primera ronda, las UFC en la segunda ronda de formación de colonias se redujeron significativamente (Figura S9c). Estos datos sugieren que la autorrenovación in vitro de CSC es más adicta al HIF1a que la iniciación de colonias. En cambio, ni la primera ni la segunda ronda de HPC-UFC se ven afectadas por dosis considerablemente más elevadas de equinomicina (Figura 10).

Sobre la base de estas observaciones, se exploró el potencial terapéutico de los inhibidores del HIF. Se inyectaron ip 1 x 106 células de linfoma cultivadas en ratones B10BR inmunocompetentes. Cuatro o 14 días después, los ratones que recibieron células de linfoma se trataron solo con vehículo o con 3 (Figura 11) o 5 (Figura 2e) inyecciones de 200 ng/ratón de equinomicina a intervalos de 2 días. Como se muestra en la figura 2e y en la figura 11, los ratones no tratados sobrevivieron solo de 6 a 10 semanas, mientras que todos los ratones tratados vivieron hasta la eutanasia a los 134 (Figura 2e) o 252 días (Figura 11) después de la inyección de células tumorales. Otros dos inhibidores del HIF conocidos, 2-metoxiestradiol (Mabjeesh et al., 2003) y geldanamicina (Minet et al., 1999), también redujeron tanto las UFC como la iniciación tumoral de CSC, aunque con menor eficacia (Figura 12). La diferencia de eficacia puede deberse a diferentes mecanismos de acción y biodisponibilidad. La eficacia terapéutica de estos inhibidores del HIF demostró que el HIF puede servir como una diana terapéutica eficaz.

Para determinar el mecanismo molecular de la elevada actividad del HIF1a en la CSC, las células de linfoma se clasificaron en subconjuntos c-Kit+Sca-1+ o c-KitSca-1- y se analizó la expresión de HIF1a, HIF-2a y HIF-3a mediante RT-PCR. Como se ilustra en la figura 3a y se cuantifica en la figura 3b, las células c-Kit+Sca-1+ expresaron HIF1a a un nivel 4 veces mayor que las células c-Kit'Sca-1'. No se detectó expresión de HIF2a o HIF3a en las células c-Kit+Sca-1+. De acuerdo con niveles más elevados de HIF1a, la expresión del transportador de glucosa Glut1, un gen diana conocido de HIF1a, también es muy elevado en las células c-Kit+Sca-1+. En cambio, no se observó regulación al alza de HIF1a y Glut1 en las células c-Kit+Sca-1+ de la médula ósea. Para evaluar si la actividad del HIF se requiere de manera selectiva para la supervivencia de CSC c-Kit+Sca-1+, se trataron los cultivos de células tumorales con dosis bajas de equinomicina (20 pM) durante 16 horas y se analizó el % de células tumorales c-Kit+Sca-1+ y c-KitSca-1-apoptóticas. En el grupo tratado con vehículo, aproximadamente el 1,8 % de las células tumorales c-Kit+Sca-1+ y c-KitSca-1- se unieron a anexina V. La equinomicina aumentó las células anexina V+ en las células tumorales c-Kit+Sca-1+ en 6 veces, o hasta aproximadamente el 10 %. No se observó ningún efecto en las células tumorales c-KitSca-1-(Figura 3c, panel inferior). En tres experimentos separados con 10 pM de equinomicina, la apoptosis de las células tumorales c-Kit+Sca-1+ fue en promedio 3,8 0,8 veces de la que se observó en el control con vehículo. En el mismo cultivo, la apoptosis de las células tumorales c-KitSca-1- en el grupo tratado con equinomicina es aproximadamente igual (1,2+/-0,3 veces) que la del grupo con vehículo. La diferencia entre los dos grupos es muy significativa (P = 0,01).

Para evaluar la importancia general del HIF1a, se analizó la expresión y función del HIF1a en células iniciadoras de leucemia mieloide aguda (AML) humana. Las células de AML que inician leucemia tienen un fenotipo de CD38-CD34+. Para determinar si el gen HIF1a está sobreexpresado en este subconjunto, se clasificaron los subconjuntos CD38-CD34+, CD38+CD34+, CD38-CD34- y el CD38+CD34- mediante FACS (Figura 3d) y se analizó la expresión de HIF1a y su GLUT1 diana. Como se muestra en la figura 3e, el subconjunto CD38-CD34+ tenía los niveles más elevados de transcripción del HIF1a. De manera correspondiente, la transcripción de GLUT1 también se elevó en las células CD38-CD34+. Los 6 casos de AML evaluados mostraron un aumento de las expresiones de HIF1a y GLUT1 en el subconjunto CD38-CD34+ (datos no mostrados), que indican que el aumento de la expresión de HIF1a es una característica general de los que portan marcadores de células iniciadoras de la AML.

El CD38-CD34+ también se sabe que forma colonias de AML in vitro, lo que proporciona un ensayo simple para evaluar la importancia del HIF1a. Como se muestra en la figura 6f, para todos los casos evaluados, la equinomicina inhibe la formación de colonias con una CI50 entre 50-120 pM. Aunque también se sabe que la equinomicina inhibe la actividad de c-Myc, su CI50 está en el intervalo nM. Como se muestra en la figura 13, en los intervalos utilizados en este estudio, la equinomicina inhibió fuertemente el HIF1a pero no tuvo ningún efecto sobre la función de c-Myc. Dado que los casos de AML utilizados tienen diversas alteraciones genéticas (Tabla S2), la amplia inhibición mediante equinomicina es coherente con una función importante del HIF1a en AML-UFC, que incluye las células CD38-CD34+ iniciadoras de la AML.

Tabla S2

Estado del

Tipo medicamento en Citogenética en el de el momento de Exones 13-15 y 20 del estado de momento del Muestra FAB Edad la inscripción Flt3 diagnóstico MI-AML-9 M4 64 sin tratar TS 46,XY[20]b MI-AML-15 M4 58 ^tratadomutación puntual heterocigota:

_previamenteY572YC en el exón 14 ^46,XY[20]MI-AML-32 M0 55 sin tratar TS 47,XY,+21[4]; 46,XY[16] (continuación)

Estado del

Tipo medicamento en Citogenética en el de el momento de Exones 13-15 y 20 del estado de momento del Muestra FAB Edad la inscripción Flt3 diagnóstico MI-AML-36 M4 55 sin tratar TS ^{46,XY,t(11;19)(q23;}

_p131)[20]MI-AML-60 M1 52 sin tratar Duplicación interna en tándem 46,XY[20] MI-AML-71 ^AML- _NOS73 tratado

_previamenteTS 45,XX,-7[20] a Se llevó a cabo un análisis genético de los siguientes genes y se encontró que eran de tipo silvestre (TS):

Trp53, NPM1, K-RAS y N-RAS.

b Los números entre corchetes son el número de células encontradas de los mismos cariotipos entre un total de 20 células analizadas.

Métodos

Para obtener los datos que se muestran en la Tabla S2, se diseñaron cebadores para amplificar los exones 5-9 de p53, exones 13-15 y exón 20 de Flt3, exón 12 de NPM1 y exones 2-3 de N-ras y K-ras utilizando el programa primer3 (Steve Rozen y Helen J. Skaletsky (2000) Primer3 en la WWW para usuarios generales y para programadores biólogos. En: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, págs. 365-386). Se utilizó PCR para amplificar exones de interés utilizando ADN genómico de blastocitos clasificados por FACS como molde. El ADN se preparó para la secuenciación directa utilizando cebadores de secuenciación anidados y Exo-SAP. Las mutaciones se identificaron mediante el programa Mutation Surveyor y la inspección visual de los trazados de secuencia.

Para establecer la importancia de la regulación al alza del HIF1a en las células c-Kit+Sca-1+, se utilizaron primero lentivirus que expresan ARNhc del HIF1a (véase la figura 14 para la validación del ARNhc) para transducir las células de linfoma. Se utilizó GFP para rastrear células que expresan el vector lentivírico. Como se muestra en la Figura 4a, en el grupo de control con vectores con ARNhc desordenado, se encontraron igual número de células c-Kit+Sca-1+ en subconjuntos GFPalta y GFPbaja. En cambio, en dos tumores transducidos por ARNhc, la población GFPalta estaba esencialmente desprovista de células c-Kit+Sca-1+, lo que indicó que el silenciamiento del HIF1a anula el subconjunto c-Kit+Sca-1+. Dado que se observó una reducción de más de 50 veces de CSC el día 3 después de la transducción, se requiere actividad HIF para el mantenimiento de la CSC c-Kit+Sca-1+.

De acuerdo con esta noción, después de la selección del fármaco para enriquecer las células transducidas, el ensayo de formación de colonias reveló una reducción del 70-80 % en las células transducidas por ARNhc de HIF1a (Figura 4b). Para evaluar el papel del HIF1a en la actividad iniciadora de tumores, el vector de control (con ARNhc desordenado) o células tumorales transducidas con ARNhc de HIF1a se trasplantaron en ratones B10.BR después de tres rondas de transducción. Como se muestra en la figura 4c, la transducción con ARNhc redujo significativamente la actividad de iniciación del tumor según se juzga por el retraso significativo de la muerte relacionada con el tumor.

Ejemplo 3

La regulación a la baja del Vhl en CSC es esencial para el mantenimiento de CSC

Dado que el HIF1a normalmente se degrada en normoxia mediante un mecanismo dependiente de VHL, también se evaluó la expresión de Vhl en la CSC. Los datos demuestran una reducción aproximada de 4 veces en las transcripciones de Vhl de células c-Kit+Sca-1+ (Figura 5a). Para determinar el significado de la regulación a la baja de Vhl, las células tumorales se infectaron con lentivirus que expresaban Vhl que también expresaban GFP. Se compararon los subconjuntos GFPalta y GFPbaja para determinar la abundancia del subconjunto c-Kit+Sca-1+. El subconjunto GFPalta no contiene células c-Kit+Sca-1+ (Figura 5b). Por lo tanto, la elevada expresión de Vhl ablaciona las células c-Kit+Sca-1+. De acuerdo con esto, la expresión ectópica de Vhl redujo significativamente la actividad formadora de colonias de las células tumorales (Figuras 5c). Para evaluar el papel del Vhl reducido en la actividad iniciadora de tumores, se trasplantaron células tumorales transducidas con vector y ADNc de VHL a ratones B10.BR. Como se muestra en la figura 5d, la transducción con lentivirus que expresa ADNc de Vhl redujo significativamente la actividad de iniciación del tumor según se juzga por el inicio de la muerte relacionada con el tumor de los receptores. Tomados en conjunto, los datos presentados en las figuras 4 y 5 demuestran que tanto la sobreexpresión de HIF1a como la reducción de VHL son esenciales para la actividad de CSC.

Ejemplo 4

El HIF actúa en colaboración con la ruta Notch en la autorrenovación de CSC

Para determinar los mecanismos moleculares subyacentes por los cuales la activación del HIF1a promueve la autorrenovación de CSC, se examinó la posible participación de las rutas Wnt y Notch. A pesar de la activación de la señalización Wnt en el tumor TGB, los datos demuestran que el TCF-1 negativo dominante, que se demostró que inhibe el crecimiento tumoral asociado con la regulación a la baja de Epm2a, no afectó a las UFC de las CSC TGB (datos no mostrados). En cambio, el inhibidor de g-secretasa, L-685.458, un inhibidor de Notch, bloqueó potencialmente la actividad de formación de colonias (Figura 6a). Para determinar si la señalización de Notch está sobreactivada en la CSC, las células c-Kit+Sca-1+ se clasificaron y compararon con las células c-KitSca-1- a granel para la expresión del gen diana de Notch Hes1. Como se muestra en la figura 6b, la CSC clasificada tuvo un aumento de aproximadamente 3,5 veces en la expresión de Hes1. Para evaluar si el aumento de la actividad de Notch dependía de la actividad del HIF, se utilizaron tres inhibidores del HIF diferentes para bloquear la regulación al alza de las dianas de Notch en células de linfoma TGB totales y CSC enriquecidas para células c-Kit+. Los datos de la figura 6c demostraron que todos los inhibidores del HIF bloquearon la expresión de Hes1 entre las CSC c-Kit+.

La expresión de Notch1-4 se analizó en células tumorales c-Kit+Sca-1+ y c-Kit'Sca-1'. Como se muestra en la figura 15, Notch 1 y 2, pero no Notch 3 y 4 se expresan en las células tumorales TGB. Dado que se expresan dos genes Notch, se realizó una búsqueda de un mutante negativo dominante eficaz para suprimir la señalización de Notch. Mediante prueba y error, se identificó un posible mutante dominante negativo de Notch (AA1955-2370), que comprende dominios intracelulares de Notchl con truncamiento tanto en el extremo N como en el C. Se insertó una secuencia de localización nuclear (NLS, por sus siglas en inglés) del virus SV40 en el extremo N para facilitar su translocación en los núcleos. Basado en la estructura del complejo Notch I-C/CSL/Mastermind/ADN, la eliminación eliminó tanto el dominio RAM de unión al ADN como las 4 repeticiones de anquirina responsables de la unión al extremo N de mastermind, mientras devuelve la mayor parte de los restos que interactúan con CSL. Así pues, se predice que actúa como un regulador negativo dominante de la señalización de Notch al prevenir la formación del complejo mastermind-CSL-Notch IC-ADN. El mutante se denominó dRdA1-4dOP (Figura 6d, panel izquierdo). Como se muestra en el panel derecho de la figura 6d, la transducción del mutante dominante dio como resultado una reducción de aproximadamente 30 veces de las transcripciones de Hes. Para fundamentar el papel de la señalización Notch, el linfoma TGB se transdujo con un vector lentivírico de control o con el que expresa dRdAl-4dOP. Las células transducidas se marcaron con GFP. Como se muestra en la figura 6e, en el grupo de control con vectores, el % de células c-Kit+Sca-1+ era comparable entre las células GFPalta y GFPbaja. En cambio, en el grupo transducido por dRdA1-4dOP, se observó una reducción de más de 5 veces en el % de células c-Kit+Sca-1+ en el subconjunto GFPalta. Estos datos demuestran que la inactivación de la ruta Notch evita la supervivencia de células c-Kit+Sca-1-. En experimentos de siembra en placas en serie, la transducción de dRdA1-4dOP redujo la actividad de autorrenovación según lo revelado por el ensayo de formación de colonias (Figura 6f). Además, cuando se trasplantaron las células transducidas con el vector de control o dRdA1-4dOP en ratones singénicos, estaba claro que la transducción de dRdA1-4dOP evitó el desarrollo de linfoma, como lo demuestra el análisis de supervivencia (Figura 6 g).

Estudios anteriores demostraron que el HIF1a puede interactuar con Notch directamente para activar su gen diana, Hey2, en condiciones de hipoxia. La utilización del indicador para Hes1 promueve la actividad, sin embargo, no se observó ninguna mejora significativa de la señalización de Notch mediante el mutante HIF1a resistente a oxígeno (Figuras 6 h, i). Por lo tanto, se exploraron explicaciones alternativas para la función del HIF1a en la expresión de Hes1. Está bien establecido que, en respuesta a la señalización de Notch, la expresión de Hes1 es autolimitante y la retroalimentación negativa está mediada por la unión de Hes1 a las secuencias N en la región promotora de Hes1. Curiosamente, inmediatamente después de cada una de las dos secuencias N clave, se identificó un HRE auténtico (Figura 6h y figura 16). Dada su proximidad, se planteó la hipótesis de que el HIF1a puede inhibir directamente la autorregulación de Hes1. De hecho, la transfección de ADNc de Hes1 redujo la actividad del promotor Hes1 en aproximadamente 10 veces. Esta inhibición fue parcialmente revertida por el H lFIa resistente a oxígeno (Figura 6j). Análogamente, en presencia de ADNc de Notch IC, Hes1 también reprimió a su propio promotor. HIF1a invirtió la represión de una manera dependiente de la dosis (Figura 6k). Utilizando inmunoprecipitación de cromatina (Figura 6l), se observó una unión significativa de HIF1a a la región unida mediante Hes1. Curiosamente, la unión de HIF1a y Hes1 parecen competir entre sí en la unión a la región. Los datos sugieren que el HIF1a puede mejorar la expresión de Hes1 inducida por Notch al antagonizar la autorregulación de Hes1.

Ejemplo 5

Un papel para el HIF en el mantenimiento de CSC

El resurgimiento del concepto de CSC se basó en estudios de trasplante para identificar un subconjunto de células iniciadoras de tumores autorrenovables. Dado que la mayoría de los estudios implicaron trasplantes xenogénicos y alogénicos en un hospedador inmunodeficiente, se ha sugerido que el concepto de CSC requiere una reevaluación. Una característica importante del estudio actual es utilizar ratones inmunocompetentes singénicos como receptores. La capacidad de autorrenovación de la CSC identificada en el presente estudio ha sido demostrada por tres rondas de trasplantes en serie, en las que tan solo 100 células c-Kit+Sca-1+ pueden dar lugar a linfoma en casi el 100 % de los receptores. Durante el proceso, el número de células c-Kit+Sca-1+ permanecen alrededor del 1 %. Mientras se mantiene la expresión del correceptor CD8, las células de linfoma en masa parecen perder de manera gradual la expresión del receptor de linfocitos T. Además de dar lugar al linfoma, casi todas las células c-Kit+Sca-1+ presentan actividad UFC. Los datos corroboran una lista cada vez mayor de estudios genéticos que respaldan la noción de CSC, aunque no se puede descartar la posible variación en los modelos tumorales con respecto a la existencia de CSC.

Se utilizaron tanto las propiedades de autorrenovación in vitro como las de iniciación tumoral in vivo para caracterizar el mecanismo molecular de autorrenovación de CSC. En ambos ensayos, el papel del HIF1a se demostró mediante la inhibición de fármacos, silenciamiento de ARNhc y sobreexpresión del inhibidor del HIF dependiente de oxígeno VHL. Dado que la expresión de vectores transducidos conduce a la desaparición casi inmediata de la población de CSC, y dado que el tratamiento a corto plazo (12 horas) de equinomicina dio como resultado una reducción específica de las células c-Kit+Sca-1+ mediante aumento de la apoptosis, es probable que el HIF1a sea necesario para la supervivencia de la CSC.

El aumento de la actividad del HIF en el linfoma murino se debe tanto a la sobreexpresión del HIF1a como a la regulación a la baja del Vhl. Dado que el Vhl es responsable de la degradación del HIFa mediada por oxígeno, el aumento de la actividad del HIFa ya no requiere un entorno hipóxico. Además, cabe señalar que en las 6 muestras de AML evaluadas, no se ha observado un aumento de la expresión de VHL (datos no mostrados). Sin embargo, los HIF son activos en función de la expresión de su diana y la sensibilidad a la equinomicina. Por lo tanto, es probable que existan mecanismos adicionales para permitir la función resistente al oxígeno del HIF en AML-UFC. El efecto de dosis bajas de equinomicina en todas las muestras de AML evaluadas sugiere que el mecanismo descrito en el presente documento puede ser de aplicación general para tumores que crecen en áreas con altos niveles de suministro de sangre, incluyendo leucemia y linfoma. Para áreas de tumores sólidos con escaso suministro de sangre, el mecanismo puede ser operativo incluso sin sobreexpresión del HIF o regulación a la baja de VHL.

Ejemplo 6

Una ruta molecular para el mantenimiento de CSC

Al investigar la ruta molecular responsable del mantenimiento de CSC, se observó una mayor actividad de la ruta Notch, como lo revela el aumento de la expresión de genes diana Notch, en las CSC en comparación con las células tumorales en masa. Los datos demuestran que los tres inhibidores del HIF evaluados bloquean la activación de Notch en el subconjunto c-Kit+. Curiosamente, la inhibición parece específica para el subconjunto c-Kit+ de linfoma TGB, que está enriquecido para CSC, ya que los fármacos no tenían ningún efecto sobre la expresión de la diana Notch si se usaban las células de linfoma t Gb totales. La importancia de Notch en el mantenimiento de CSC y el desarrollo de tumores se demuestra mediante la ablación eficaz de las CSC y la tumorigénesis mediante una expresión ectópica de un inhibidor dominante de la señalización de Notch, dRdA1-4dOP, en las células tumorales TGB. De nuevo, la ablación selectiva demuestra que la señalización de Notch se requiere de manera específica para el mantenimiento de CSC, mientras que la supervivencia de las células tumorales en masa es independiente de la señalización de Notch. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que el HIF mantiene las CSC mediante la regulación de la señalización de Notch.

Hes1 es una importante diana de Notch que se sabe que es clave para las funciones de las células madre/progenitoras. Los datos descritos en el presente documento indican que el H IFla potenció la inducción de Hes1 mediante Notch. En contraste con los estudios anteriores que utilizan el promotor Hey2 como lectura, no se observó actividad conjunta directa entre HIFla y Notch IC en la inducción del gen Hes1. Más bien, se demostró que el H IFla evita la autorregulación por retroalimentación negativa del gen Hes1 mediante la inhibición de su unión a las secuencias N en el promotor Hes1. Dado el papel general, aunque no necesariamente universal, de Notch en el mantenimiento de varias células madre tisulares, los datos indican una importante conservación funcional entre CSC y células madre tisulares.

Ejemplo 7

La ruta del HIF juega un papel en la función de CSC

Una forma importante de validar el papel de la ruta del HIF en la función de CSC fue evaluar si el inhibidor del HIF, la equinomicina, se puede utilizar para tratar la AML en un modelo xenogénico. Se han realizado estudios con dos muestras de AML. Se trasplantaron 6 * 106 células de AML (AML71-SP, que tuvieron mal pronóstico basado en datos citogenéticos, o AML-15-SP que tuvieron pronóstico moderado basado en citogenética; véase la tabla S2 anterior) de la sangre a ratones NOD-SCID irradiados subletalmente. A partir de 2 semanas después de la transferencia, la mitad de los ratones receptores recibieron tres inyecciones de 200 ng/ratón/inyección de equinomicina, una vez cada dos días. Después de dos semanas de pausa, estos ratones recibieron 3 inyecciones más. La otra mitad de los ratones se dejó sin tratar como control. A las 7 semanas después del trasplante, todos los ratones no tratados en ambos grupos (3 ratones por grupo) se volvieron moribundos, mientras que todos los ratones tratados con equinomicina estaban sanos. En la figura 17 se muestra el análisis de la sangre periférica y la médula ósea de los receptores de AML-71SP.

Como se muestra en la figura 17A, el grupo no tratado tenía un promedio de células CD45+ humanas del 12 % en la sangre. El tratamiento con equinomicina eliminó por completo las células CD45+ humanas. Se observó una población de células humanas claramente definible en la médula ósea de la médula ósea no tratada, pero no con el tratamiento con equinomicina (Figura 17B y C). Un análisis adicional de las células CD45+ humanas indicó que eran inmaduras, a juzgar por su falta de marcadores CD14 y CD15 (Figura 17C panel inferior derecho). Además, una elevada proporción de las células CD45+ humanas presentó un marcador de células madre de AML (CD34+CD38-), como se indica en la figura 17C (panel superior derecho). Estos datos demostraron la viabilidad del modelo xenogénico y el apoyo clave para tratar un cáncer hematológico tal como la AML con equinomicina. Estos datos ayudan a demostrar que la actividad del HIF1a es necesaria para el mantenimiento de las células madre para las neoplasias hemáticas y que el HIF sirve como una diana terapéutica valiosa para la terapia contra el cáncer. Más importante aún, los datos establecen que el mismo principio se aplica a la AML en seres humanos.

Ejemplo 8

Eliminación terapéutica de células madre leucémicas para la AML

Este ejemplo demuestra el potencial terapéutico de los inhibidores del HIF para las neoplasias hemáticas humanas. La AML se utilizó como modelo porque el fenotipo de las células madre de leucemia de a Ml (AML-LSC, por sus siglas en inglés) estaba bien caracterizado y porque la función de AML-LSC in vivo puede determinarse utilizando un modelo xenogénico establecido. Las AML-LSc tienen el fenotipo CD34+CD38-. Para determinar si el gen HIF1a está sobreexpresado en este subconjunto de células, se clasificaron los subconjuntos CD34+CD38-, CD34+CD38+, CD34-CD38- y el CD34-CD38+ mediante FACS (Figura 18a) y se analizó la expresión de HIF1a y su GLUT1 diana. Como se muestra en la figura 18b, el subconjunto CD34+CD38- tenía los niveles más altos de transcripción del HIF1a. De manera correspondiente, la transcripción de GLUT1 también se elevó en las células CD38-CD34-. Los 6 casos de AML evaluados mostraron un aumento de las expresiones de HIF1a y GLUT1 en el subconjunto CD38-CD34- (datos no mostrados), que indican que el aumento de la expresión del HIF1a es una característica general de aquellas células que portan marcadores de células AML-LSC.

También se sabe que las células CD34-CD38- forman colonias de AML in vitro, proporcionando así un ensayo sencillo para evaluar la importancia del HIF1a. Como se muestra en la figura 18c, para todos los casos evaluados, la equinomicina inhibió la formación de colonias con una CI50 entre 50-120 pM. Aunque también se sabe que la equinomicina inhibe la actividad de c-Myc, su CI50 para c-Myc está en el intervalo nM. La amplia inhibición mediante equinomicina es coherente con una función importante del HIF1a en AML-UFC, que incluye CD34+CD38- AML-LSC.

La terapia convencional contra el cáncer parece enriquecer las células madre cancerosas. Un inhibidor de NFkB, el análogo dimetilamino de partenolida, mostró cierta selectividad por las AML-LSC. Dado que la actividad del HIF1a parece activarse de manera selectiva en la AML, las AML-LSC podrían dirigirse de manera selectiva mediante equinomicina. Como se muestra en la figura 18d, dosis bajas de equinomicina induce de manera selectiva la apoptosis de la población CD34+CD38- en comparación con las células dominantes de la AML (CD34+CD38+ para la mayoría excepto CD34'CD38+ para dos casos de AML).

Se estableció un modelo de AML xenogénico que utiliza muestras de AML humanas para evaluar si la equinomicina se puede utilizar como una posible sustancia terapéutica para la AML. Las muestras clínicas primarias de pacientes con AML reconstituidas en ratones NOD.SCID irradiados con células mieloides humanas inmaduras se caracterizaron por la expresión de CD45 y Cd11b humanos, pero no de los marcadores mieloides maduros CD14 y CD15. Notablemente, un tratamiento a corto plazo con equinomicina a partir de los 15 días después del trasplante eliminó por completo las células humanas de la muestra de AML 150 y redujo drásticamente la carga de leucemia humana de AML 71 (Figura 18e). Las células residuales en los ratones tratados con equinomicina no se diferenciaron a juzgar por la falta de marcadores mieloides maduros CD14 y CD15 (Figura 18f).

La remisión incompleta de AML71 permitió determinar si la equinomicina reduce selectivamente la AML-LSC, utilizando los marcadores CD34+CD38- La equinomicina redujo el porcentaje de células CD34+CD38' en la médula ósea en más de 10 veces (Figura 18 g, panel superior). Incluso entre el compartimento CD45+ humano, la abundancia relativa de AML-LSC también se redujo (Figura 18 g, panel inferior). Para fundamentar el impacto de la equinomicina en las células iniciadoras de leucemia, se llevaron a cabo estudios de trasplante en serie para determinar si la equinomicina reducía la autorrenovación de AML-LSC. Como se muestra en la figura 18 h, mientras que la médula ósea de ratones no tratados indujo leucemia en todos los nuevos receptores, la médula ósea de los ratones tratados con equinomicina no logró hacerlo en ningún receptor. Por lo tanto, las células residuales en la médula ósea tratada con equinomicina estaban desprovistas de AML-LSc .

Ejemplo 9

Procedimientos Experimentales

Los materiales y métodos para los ejemplos 1-7 se divulgan a continuación.

Muestras de AML

Se inscribirá en el presente estudio a los pacientes con AML diagnosticados en el University of Michigan Comprehensive Cancer Center entre 2005 y 2009. El estudio fue aprobado por la University of Michigan Institutional Review Board. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes antes de la inscripción. Se utilizaron los mismos criterios de diagnóstico de AML (>= 20 % de mieloblastos en la médula ósea o sangre periférica) y se determinó la subclasificación de FAB mediante la revisión de los informes de laboratorio y de patología fechados en el momento del diagnóstico e interpretados por hematopatólogos. La estratificación del riesgo citogenético se determinó de acuerdo con los criterios SWOG/ECOG.

Anticuerpos, citometría de flujo e inmunofluorescencia

Se adquirieron anticuerpos conjugados con fluorocromo específicos para CD117 (c-kit) y Ly-6A/E (Sca-1) de e-Bioscience (Ja Jolla, CA), mientras que los específicos para CD8 y Vp8 se adquirieron de Becton Dickinson-Pharmingen (Ja Jalla, CA). Los marcadores de la superficie celular se analizaron mediante citometría de flujo utilizando LSRII (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Los subconjuntos específicos se clasificaron mediante FACSAria.

RT-PCR y PCR en tiempo real

La expresión de HIF1a, HIF-2a, HIF-3a, VHL y Glutl se determinó mediante RT-PCR y PCR en tiempo real. Los cebadores utilizados fueron HIF1a, directo, 5'-agtctagagatgcagcaagatctc-3'; inverso, 5'-tcatatcgaggctgtgtcgactga-3' (PCR), 5'-ttcctcatggtcacatggatgagt-3' (PCR en tiempo real); hif-2a, directo, 5'-cgacaatgacagctgacaaggag-3'; inverso, 5'-ttggtgaccgtgcacttcatcctc-3'; hif-3a, directo, 5'-atggactgggaccaagacaggtc-3'; inverso, 5'-agcttcttctttgacaggttcggc-3'; vhl, directo, 5'-tctcaggtcatcttctgcaac-3'; inverso, 5'-aggctccgcacaacctgaag-3'; Glutl, directo 5'-tgtgctgtgctcatgaccatc-3' e inverso 5'-acgaggagcaccgtgaagat-3'; mHeslF: gccagtgtc aacacgacaccgg, mHesIR: tcacctcgttcatgcactcg; HIFIaF, 5'-ccatgtgaccatgaggaaatgagag-3'; HIFIaR, 5'-tcatatccaggctgtgtcgactgag-3'; GLUT1F, 5'-tcaatgctgatgatgaacctgct-3'; GLUT1R, 5'-ggtgacacttcacccacataca-3'.

Atenuación de HIF1a mediada por ARNhc y expresión ectópica de VHL y dRdA1-2dOP

Los vectores lentivíricos que llevan ARNip son conocidos en la materia. La secuencia central de HIF1a-ARNhc-1 es 5'-ctagagatgcagcaagatc-3', mientras que la de HIF1a-ARNhc-2 es 5'-gagagaaatgcttacacac-3'. Se utilizó el mismo vector para expresar el ADNc de VHL de longitud completa y el mutante Notch dominante negativo dRdA1-42dOP (AA1995-2370). Los cultivos de células tumorales se infectaron con lentivirus de control o lentivirus que codifican ARNhc de HIF1a, dRdA1-42dOP o ADNc de VHL mediante inoculación por centrifugación. Los cultivos se seleccionaron con 5 pg/ml de blasticidina durante 5 días para eliminar las células no infectadas.

El ensayo de formación de colonias in vitro para células tumorales y células de médula ósea es conocido en la materia.

Ensayo de tumorigenicidad in vivo

Se inyectaron un número determinado de células tumorales totales o subconjuntos clasificados en ratones inmunocompetentes B10.BR o ratones BALB/c RAG-2'/_. Se consideró que los ratones moribundos habían alcanzado el punto final experimental y se sacrificaron. Los efectos terapéuticos se analizaron mediante el análisis de supervivencia de Kaplan Meier.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar en el tratamiento de una leucemia mieloide aguda.

2. Una composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar en la inducción de la remisión de una leucemia mieloide aguda en un ser humano.

3. Una composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar en la prevención de una futura recaída de una leucemia mieloide aguda en un ser humano durante la remisión de la leucemia mieloide aguda.

4. Una composición farmacéutica que comprende equinomicina para utilizar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la equinomicina es el único principio farmacéutico activo utilizado.