WO2012003814A1 - Composiciones vacunales a base de sticholisina encapsulada en liposomas - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to the field of Biotechnology applied to human health.
- the present invention relates to a vaccine vehicle for both subcutaneous and intramuscular use based on liposomes that contain sticholysin and that enhance a specific cellular immune response to antigens, useful in the immunotherapy of cancer and in the treatment of diseases caused by intracellular pathogens. .
- the immunoadjuvant capacity of liposomal vesicles has long been known.
- the rationality that exists in the use of liposomes in immunizations and in the design of vaccines is based on their ability to release the antigenic molecule in antigen presenting cells (APC) and stimulate an immune response.
- APC antigen presenting cells
- liposomes as immunoadjuvants are summarized in: (i) the ability to mimic pathogens by transporting large amounts of antigens to APCs, (ii) the possibility of co-encapsulating antigens together with immunostimulatory molecules, (iii) flexibility regarding the modification of its physicochemical properties with the purpose of greater effectiveness, and (iv) the fact of being biodegradable and non-toxic (Leserman in the Journal of Liposome Research, 2004, 14 (3 & 4), 175- 189).
- a challenge in the field of vaccinology is the potentiation of a cellular immune response mediated by cytotoxic CD8 + T lymphocytes (CTL) specific to antigens, with relevance for the prevention and treatment of diseases induced by intracellular pathogens and tumor cells.
- CTL cytotoxic CD8 + T lymphocytes
- Liposomal vesicles can potentiate a CTL response but not always effectively.
- Different strategies based on liposomal vesicles have been designed with the intention of making this function more efficient; Examples of this are liposomes sensitive to endosomal acidic pH, cationic liposomes, the inclusion of immunomodulators such as CpG and pore-forming toxins of bacterial origin.
- immunomodulators such as CpG and pore-forming toxins of bacterial origin.
- virosomes have not only been used as parental virus vaccines, but have also been exploited as vehicles for vaccine antigens, linked or encapsulated to the virosome (Zurbriggen in Vaccine, 2003 14; 21 (9-10): 921 - 4).
- Virosomal particles known by the acronym IRIV immunopotentiating reconstituted influenza virosomes
- IRIV immunopotentiating reconstituted influenza virosomes
- Immobilization of inactivated and highly pure hepatitis A viruses in the virosome membrane favored the processing and presentation of peptides derived by the classical MHCII pathway, as a result of the process of fusion of the virosomal and endosomal membranes in APCs (Glück and Wálti in Dev Biol (Basel), 2000, 103, 189-97).
- the evidence described indicates that the physical association of antigens-virosomes is important in immunoadjuvantity (Zurbriggen et al., Progr., In Lipid Res., 2000, 39 (1), 3-18; Amacker et al., In Int Immunol., 2005 , 17 (6), 695-704).
- Schumacher et al. In Vaccine 22: 714-723, 2004, reported that IRIVs are also capable of enhancing the cell-mediated immune response.
- Schumacher et al. Demonstrated their adjuvant activity in the induction of CTL in vitro. This ability depended mainly on the stimulation of the reactivity of specific CD4 + T cells to viral proteins.
- virosomes as an adjuvant has numerous advantages such as low toxicity and high immunogenicity
- one of the problems in current virosomal technology is the non-existence of procedures for efficient encapsulation of solutes, such as proteins, necessary for the induction of a CTL response to the lipid concentration at which virosomes are produced (approximately 1 mM of lipids), and given their diameter of approximately 200 nm, less than 1% of the aqueous phase is encapsulated within the virosomes (Schoen et al., in J. Liposome Res., 3: 767-792, 1993). These characteristics significantly reduce the efficiency of virosomes from releasing antigens or genes to cells.
- Sts are basic proteins with a high isoelectric point (> 9.5), with a molecular mass of approximately 20 kDa, lacking cysteine residues in their amino acid sequence and a preference for membranes containing sphingomyelin (SM). Sts are produced in soluble form but easily associated with different cell membrane systems and models forming pores with a diameter of 2 nm, probably due to the interaction of the ⁇ -helices of the N-terminal of four monomers. Both events, the association and the formation of the pore, depend on the physicochemical properties of the membranes.
- SM sphingomyelin
- the object of the present invention is a vaccine vehicle based on DPPC and Cho liposomal preparations in which the toxins known as Sts are co-encapsulated together with a protein antigen.
- They are also subject of the present invention are those of DPPC liposomal preparations and Cho in which co-encapsulated mutants of the toxins known as Sts (eg StlW111C and StlW111C ⁇ rev r) with the protein antigen.
- the vaccine compositions based on this vaccine vehicle and containing the toxins together with an antigen are also object of the present invention and are administered by the se or im route, for the induction of a potent CTL response specific to the antigen in question.
- a method for the treatment of a patient that requires a strengthening of his immune response the administration by the se or im route of vaccine compositions based on this vaccine vehicle and containing the Sts toxins is also the subject of the present invention. or its mutants together with an antigen relevant to the pathology.
- the present invention also relates to the protection provided by said vaccine compositions against challenge with tumor cells expressing the antigen, the percentage of tumor appearance is reduced and the survival of the carrier subjects is increased. Therefore, a prophylactic method for the onset of antigen-related disease is also the subject of the present invention.
- the vaccine vehicle object of the invention is based on aqueous dispersions of the DRPC liposomes of DPPC.Cho in a 1: 1 molar ratio that encapsulate St together with the antigen, and which may eventually contain other water-miscible co-solvents, not toxic, non-irritating and not causing destabilization of the vesicles, such as those commonly used in injectable pharmaceutical compositions, for example sugars, polyethylene glycol, etc.
- the liposomal preparations of the present invention are obtained by the dehydration-rehydration process and constituted by DPPC and Cho in a 1: 1 molar ratio and that co-encapsulate some of the variants of Sts or its reversibly inactive mutants together with an antigen ; wherein said vaccine compositions are capable of potentiating a CTL immune response specific to the antigen and protective against challenges with tumor cells.
- the vaccine composition comprises as an antigen the OVA protein, but where said antigen can be any protein or polypeptide associated with a pathology for which, from the therapeutic point of view, it is relevant to induce a specific CTL immune response against said protein antigen.
- the antigen could be a protein or polypeptide associated with cancer, a protein or polypeptide associated with AIDS or a protein or polypeptide associated with tuberculosis.
- the liposomes described in the present invention are obtained by dehydration-rehydration technology, described by Kirby and Gregoriadis in Biotechnology, 1984, 2, 979-984, these are vesicles with an internal aqueous phase surrounded by several lipid bilayers characterized by high efficiency of encapsulation and retention of labile molecules as antigens and immunomodulators of a protein nature.
- the chloroform solutions of DPPC and Cho in a 1: 1 molar ratio are broken and evaporated under vacuum for 30 minutes.
- the lipids are hydrated with deionized water at a temperature higher than the phase transition temperature (Te) of the DPPC (T> 45 ° C).
- MLVs multilamellar vesicle suspensions
- LUV Large Unilamellar Vesicles
- the vesicles obtained are mixed with the protein solutions, following a lipid ratio: protein of 16-64 ⁇ of lipids: 1.8 -7 nmol of antigen and 0.5-2 nmol of St and freeze-dried for 20-24 hours. Rehydration is performed with deionized water and stirring for 30 minutes at a temperature equal to or greater than 45 ° C.
- the non-encapsulated material in the liposomes is removed by washing with phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (NaCl 136 mmol / l, KH2P04 1.47 mmol / l, Na2HP04 9.55 mmol / l, KCI 2.68 mmol / l) followed by centrifugation at 10,000 g for 15 minutes.
- PBS phosphate buffered saline
- Said preparations reach an encapsulation efficiency for the different variants of Sts that oscillates around 50% with a retention of 70% after a month of storage at 4 ° C in suspension in PBS.
- Stl and Stll toxins are isolated and purified from the sea anemone Stichodactyla helianthus, using the procedure described by Lanio et al., In Toxicon. 2001, 39, 187-94.
- the recombinant Sticholisin I (Stlr) and the Stlr mutant, Stl W111C, are obtained according to the procedures described by Pazos et al., In Toxicon, 2006, 48,1083-1094. and Pentón et al., (Press article), respectively.
- the concentration of Sts employed is in the range of 0.25-1 ⁇ and is co-encapsulated with the antigen in a concentration range of 1 - 3.5 ⁇ in a liposomal suspension with a range of Total lipid concentration of 16-64 mM.
- the vaccine vehicle of the present invention contains an amount of Sts of 0.3-4.4 nmol co-encapsulated with 1-2 nmol of the antigen in a liposomal suspension of 20 ymol of total lipids in a volume of
- the dose range used for the vaccines referred to in the present invention, by the se or im route, is between 1 nmol-2 nmol (50-100 g) of the antigen.
- An essential feature of the vaccine compositions object of the invention is that they lack other immunological adjuvants except those described.
- bacterial pore-forming toxins encapsulated in liposomal vesicles are capable of potentiating a CTL response, but the adverse effects of human use of vaccine compositions are known. based on toxins of bacterial origin; however, the authors of the present invention have unexpectedly found that non-bacterial toxins are capable of having the same immunostimulatory effect.
- the authors of this invention have succeeded in separating the pore-forming activity of toxins from their stimulatory effects of the CTL response, which offers great advantages for the clinical use in humans of this vaccine vehicle.
- the results obtained using the vaccine carrier of the present invention the molecular entities Stl W1 January 1 rre Cj vo Stll heat inactivated, co-encapsulated with the antigen in liposomes, to establish that there is no absolute dependence between the enhancing an CTL immune response specific to the antigen by the liposome-St formulations and the ability of these proteins to form pores in the membranes.
- the dendritic cell maturation (CDs) assay isolated from the bone marrow of C57BL / 6 mice and exposed to Stll in vitro, demonstrates the ability of this protein, not only in its active variant, but also in heat inactivated, of inducing the activation of the CDs, equivalent to that observed with the LPS (positive control) under similar conditions.
- Sts The ability of Sts to form pores in membranes was assessed by hemolytic activity and permeabilization assays of carboxifluorescein (CF) -LVVs as described by Mart ⁇ nez et al., In Toxicon, 2001, 39,1547-1560. It was shown that Sts do not exhibit permeabilizing activity by means of a permeabilization test of DPPC liposomal vesicles. Ch (1: 1) encapsulating CF, compared to that observed in vesicles constituted by egg yolk phosphatidyl choline and SM (1: 1 ) (Positive control).
- StlW111C mutant forms an inactive dimer stabilized by a disulfide bond by testing hemolytic activity and electrophoresis in PAGE-SDS in the presence and absence of 2-mercaptoethanol (2-ME) as a reducing agent, as described by Pentón and others, in Protein Eng Des Sel. 20 1, 24, 485-493.
- 2-ME 2-mercaptoethanol
- StlW111 C rr e V an irreversible dimeric species of StlW111C based on the reduction of StlW111C by incubation with 2-ME (0.1 mol / I), the elimination of this reducing agent by filtration on a PD-10 column and immediate incubation StlW111 Cmonómero with the homobifunctional reagent bis (maleimido) hexane (BMH) in a molar ratio StlW111C omero mon: BMH 1: 1 or 2: 1 for 2 hours at 4 ° C .
- StlW 11 Crev was purified by gel filtration chromatography on a Superdex 75 HR 10/30 column in the presence of a reducing agent.
- the immunomodulatory properties of the different Sts molecular species in the Liposome-St particulate system can be measured in the experimental mouse model of strain C57BL / 6 using the antigen and tumor line E.G7, a subclone of the murine thymoma EL-4 (Kusmartsev and Gabrilovich, in J Leukoc Biol., 2003, 74: 186-96), transfected with the complementary DNA of OVA pAc-neo-OVA (Moore, et al., In Cell, 1988, 54: 777-85) and obtained from the "American Type Cultures Collection" (ATCC, VA).
- ATCC American Type Cultures Collection
- Example 1 Cytotoxicity evaluation and CTL response of the vaccine vehicle using native Stl or STII and as an antigen the OVA protein.
- the liposome-based vaccine vehicle was prepared as previously described.
- DRVs vesicles composed of DPPC and Cho (1: 1 molar ratio) the OVA was co-encapsulated as a model antigen and Sts (Stl or Stll) in a ratio of 10 pmol of total lipids: 1.1 nmol OVA and 0.3 nmol of St in buffer saline phosphate (PBS) pH 7.4.
- PBS buffer saline phosphate
- Vaccine composition A DPPC DRVs liposomes: Cho (60 ⁇ of total lipids) encapsulating 6.6 nmol (50 ⁇ g) of OVA.
- Vaccine composition B DPPC.Cho DRVs liposomes (60 pmol of total lipids) that co-encapsulate 6.6 nmol (50 ⁇ g) OVA and 1.88 nmol of Stl or Stll.
- mice 15 female C57BL / 6 mice with a body weight of between 18-20 g were selected, and separated into 5 test groups of 3 animals each.
- Group 1 (negative control) was inoculated via, on days 0, 12, 13 and 14, with 0.2 ml of phosphate buffered saline (PBS).
- PBS phosphate buffered saline
- Group 2 (positive control) was inoculated via, on day 12, with 22.2 nmoles (1 mg) of OVA and mixed with 100 pg of polyinosinoic-polycytidyl acid (PIC), a synthetic TLR3 ligand and a classical inducer of CTL response (Hamilton-Williams et al., in J. Immunol., 2005, 174: 1 159-63), on days 13 and 14 the animals again received 100 pg of PIC.
- PIC polyinosinoic-polycytidyl acid
- Group 3 was inoculated via the se, on days 0 and 12, with 0.2 ml of the vaccine composition A (equivalent to 1.1 nmol or 50 pg of OVA).
- Group 4 was inoculated subcutaneously, on days 0 and 12, with 0.2 ml of the vaccine composition B (equivalent to 1.1 nmol or 50 pg of OVA and 0.3 nmol or 6.25 pg of Stl).
- Group 5 was inoculated subcutaneously, on days 0 and 12, with 0.2 ml of the vaccine composition B (equivalent to 1.1 nmol or 50 pg of OVA and 0.3 nmol or 6.25 pg of Stll).
- spleen cells of unimmunized C57BIJ6 mice were incubated with two concentrations of carboxyfluorescein succinimidyl ester diacetate (CFSE) (0.33 and 5 ⁇ / ⁇ , respectively); Cells labeled with higher fluorescence intensity were also incubated with 1 ⁇ / ⁇ of the immunodominant OVA peptide (257-SIINFEKL-264) in the context of the MHC I haplotype of the C57BL / 6 mouse strain. Then, the labeled cells were mixed 1: 1 and the experimental groups 1-5 were inoculated by the tail vein with 30x10 6 cells of the mixture in a volume of 0.2 ml. Mice were sacrificed at 16 hours and the percentage of white cell lysis in the inguinal ganglion closest to the immunization site was determined by flow cytometry (FACS).
- FACS flow cytometry
- Figure 1 shows the cytotoxicity produced in vivo by immunization of mice with liposomes that co-encapsulated OVA and Sts.
- Animals immunized with liposomes encapsulating Sts (Stl or Stll) showed a response of specific cytotoxic CD8 + T lymphocytes (CTL) to OVA statistically superior to the positive control group.
- CTL cytotoxic CD8 + T lymphocytes
- liposomes containing only OVA also induced a CTL response statistically similar to the classic positive control of this assay (ICP).
- Example 2 Induction of antitumor protection of the vaccine vehicle in the OVA protein model.
- Liposome-based vaccines were studied for their ability to induce antitumor protection. For this, 60 female C57BL / 6 mice with a body weight between 18-20 g were selected, and separated into 3 test groups of 20 animals each.
- Group 1 (negative control) was inoculated intramuscularly, on days 0 and 12, with 0.2 ml of phosphate buffered saline (PBS).
- Group 2 was inoculated intramuscularly, on days 0 and 12, with 0.2 ml of the vaccine composition A described in example 1 (equivalent to 1.1 nmol or 50 pg of OVA).
- Group 3 was inoculated intramuscularly, on days 0 and 12, with 0.2 ml of the vaccine composition B described in example 1 (equivalent to 1.1 nmol or 50 g of OVA and 0.3 nmol or 6.25 pg of Stll).
- the animals were individualized from day 0 and the following parameters were determined three times per week: tumor volume, time to progression and survival.
- the time to progression is a parameter that assesses the time it takes for the tumor to appear in each individual animal, measured from the moment of inoculum. For mice that had not developed a tumor at the close of the experiment, the time to progression was considered to be 60 days. The impact on prolonging time to progression is a very desirable parameter for a cancer vaccine. As can be seen in Figure 2A, the animals of group 3, vaccinated with the vaccine composition formulation B described in Example 1 and object of the invention, showed the most relevant results.
- This parameter evaluates the ability of vaccination to increase the time that immunized animals live after the challenge with tumor cells expressing OVA (E.G7).
- the parameter is measured in days and has a relative character, since it is compared with the survival of untreated animals.
- the test of choice to see the statistical significance of survival comparisons is the Log-Rank.
- Figure 2B clearly shows that the animals of group 3, vaccinated with the vaccine composition B described in example 1 and object of the present invention, are the ones that survive the longest after inoculation of the tumor.
- Example 3 Hemolytic activity of the mimics of Sts.
- the formation of pores in the erythrocyte membrane generates a colloid-osmotic shock that results in cell lysis.
- the AH of the irreversibly inactive dimer of StlW1 1 1 C was compared with that of the reversible dimeric variant StlW1 1 1 C, under reducing conditions (2-ME 0.1 mol / l ) and non-reducing, for a relatively high concentration of proteins in the assay (0.15 pmol / l), when compared with the Stl / Stll AH reported by ⁇ lvarez et al., in Toxicon, 2009, 54 (8): 1135-47.
- the hemolysis kinetics shown in Figure 3 indicate that StlW11 C ir rev was inactive under non-reducing conditions. Under reducing conditions showed lower StlW111C ⁇ rr ev lytic activity StlW111C completely reduced and unreduced.
- Example 4 Evaluation of inactive Stll pore forming capacity.
- Example 5 Effect of the vaccine vehicle on the maturation of CDs.
- Stll-induced CD maturation was evaluated in cells obtained from the bone marrow of C57BL / 6 mice exposed to active Stll (0.1 nmole or 2 pg) or inactivated by heat treatment (4 pg) in the presence or absence of 20 pg of Polymyxin B (pmxB, neutralizing the biological activity of endotoxins by binding to the lipid portion A of the LPS), for 24 hours at 37 ° C in a chamber with 5% CO2.
- LPS (2 pg) was used as a positive control and RPMI plus pmxB as a negative negative control.
- the cells extracted from the bone marrow of the mouse were seeded in a number of 600,000 CD precursors in RPMI medium per well in 6-well plates.
- Figure 5 shows the percentage increase in molecular markers (CD80, CD86 and CD40) indicative of the activation of CDs as a result of the exposure of these cells in vitro to Stll, both in its active variant and inactivated by treatment. thermal and comparable to the results of the positive control.
- Example 6 Evaluation of cytotoxicity and CTL response of the vaccine vehicle using the St mutants and as an antigen the OVA protein.
- Vaccine composition A DPPC DRVs liposomes: Cho (60 pmol total lipids) encapsulating 6.6 nmol of OVA.
- Vaccine composition B DPPC DRVs liposomes: Cho (60 pmol of total lipids) that co-encapsulate 6.6 nmol of OVA and 1,875 nmol of St (StlW1 11 C, StlW1 Cirrev, native St II or Stll inactivated by heat treatment)
- Group 1 (negative control) was inoculated via, on days 0 and 12, with 0.2 ml of PBS.
- Group 2 (positive control) was inoculated via, on days 0 and 12, with 0.2 ml of the vaccine composition B (equivalent to 1.1 nmol or 50 pg of OVA and 0.3 nmol or 6.25 pg of Stll native)
- Group 3 was inoculated via, on days 0 and 12, with 0.2 ml of the vaccine composition B (equivalent to 1.1 nmol or 50 pg of OVA and 0.3 nmol or 6.25 pg of StlW1 1 1 C) .
- Group 4 was inoculated via, on days 0 and 12, with 0.2 ml of the vaccine composition B (equivalent to 1.1 nmol or 50 pg of OVA and 0.3 nmol or 6.25 pg of StlW11 1 C irrev ) .
- mice 9 female C57BLJ6 mice with a body weight between 8-20 g were selected, and separated into 3 test groups of 3 animals each.
- Group 1 (negative control) was inoculated via, on days 0 and 12, with 0.2 ml of phosphate buffered saline (PBS).
- PBS phosphate buffered saline
- Group 2 was inoculated subcutaneously, on days 0 and 12, with 0.2 ml of the vaccine composition A (equivalent to 1.1 nmol or 50 pg of OVA).
- Group 3 was inoculated subcutaneously, on days 0 and 12, with 0.2 ml of the vaccine composition B (equivalent to 1.1 nmol or 50 pg of OVA and 0.3 nmol or 6.25 pg of inactive Stll).
- Figure 6B shows that immunization with liposomes that co-encapsulate OVA and the Stll variant completely inactivated by heat treatment generated an OVA-specific cytotoxic activity significantly higher than that induced by liposomes that only contained the antigen and similar to that observed with the Liposomal formulation containing native Stl / Stll.
- Figure 1 represents a graph with the percentage of lysis of the white cells loaded with the immunodominant peptide of OVA (SIINFEKL) and labeled with CFSE in experimental animals subjected to different vaccine treatments in an in vivo cytotoxicity test. Each point corresponds to the data of an animal and the line to the average value of at least two independent experiments. The different letters indicate statistical significance among the groups immunized according to the Dunnett T3 test (p ⁇ 0.05).
- Figure 2A represents the percentage of animals without tumor in three groups of experimental animals subjected to different vaccine treatments and challenged with tumor cells expressing OVA.
- Figure 2B represents a graph that allows the survival parameter after inoculation of tumor cells expressing OVA to be appreciated in the 3 groups mentioned. Different letters indicate statistical significance according to the Log-Rank test (p ⁇ 0.05).
- Figure 3 shows the variation in turbidity of an erythrocyte suspension product of the action of the dimeric variants of Stl (StlW111C or StlW111 Crerv) under reducing conditions (presence of 2-ME) and non-reducing.
- Figure 4 represents the loss of turbidity of an erythrocyte suspension due to the action of native Stll (active protein) or inactivated by heat treatment.
- FIG. 5 shows the variation in the expression of molecular markers in dendritic cells (CDs) by in vitro exposure to St II in its active and inactivated variants by heat treatment in the presence or absence of an endotoxin neutralizer (pmxB).
- Figure 6 represents two graphs with the percentage of lysis of white cells loaded with the immunodominant OVA peptide (SIINFEKL) and labeled with CFSE in experimental animals subjected to different vaccine treatments in an in vivo cytotoxicity test. Each point corresponds to the data of an animal and the line to the average value. The different letters indicate statistical significance among the groups immunized according to the Tukey test (p ⁇ 0.05).
- Graph A Response obtained by immunization with liposomes that co-encapsulate OVA, native Stll or dimeric variants of reversible Stl (StlW111C) or irreversibly (StlW111 C irr and V ) inactive.
- Graph B Response obtained by immunization with liposomes that co-encapsulate OVA and Stll inactivated by heat treatment.
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Abstract
La presente invención se relaciona con el campo de Biotecnología aplicada a la salud humana. En la misma se describe un vehículo vacunal donde se encapsula toxinas provenientes de organismos eucariontes en liposomas de múltiples capas lipídicas obtenidos por el procedimiento de deshidratación-rehidratación cuya composición lipídica es dipalmitoilfosfatidilcolina: colesterol en una relación molar 1:1, destinadas a la administración subcutánea o intramuscular. Estas composiciones no requieren del empleo de otros adyuvantes.Las composiciones descritas posibilitan la modulación de la respuesta inmune CTL específica contra uno o varios antígenos co-encapasulados en liposomas que contienen la toxina. El vehículo vacunal de la presente invención presenta ventajas frente a otros descritos por el arte previo debido a la robustez y funcionalidad de la respuesta inmune que induce así como a sus propiedades inmumoduladoras
Description
COMPOSICIONES VACUNALES A BASE DE STICHOLISINA ENCAPSULADA EN LIPOSOMAS.
SECTOR TÉCNICO:
La presente invención se relaciona con el campo de la Biotecnología aplicada a la salud humana. Particularmente, la presente invención se refiere a un vehículo vacunal para uso tanto subcutáneo como intramuscular basado en liposomas que contienen sticholisina y que potencian una respuesta inmune celular específica a antígenos, útil en la inmunoterapia del cáncer y en el tratamiento de enfermedades causadas por patógenos intracelulares.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR:
Se conoce desde hace tiempo la capacidad inmunoadyuvante de las vesículas liposomales. La racionalidad que existe en el empleo de los liposomas en inmunizaciones y en el diseño de vacunas se basa en su capacidad para liberar la molécula antigénica en las células presentadoras de antígenos (APC) y estimular una respuesta inmune. Las ventajas fundamentales de los liposomas como inmunoadyuvantes se resumen en: (i) la capacidad de mimetizar patógenos al transportar grandes cantidades de antígenos a las APC, (ii) la posibilidad de co-encapsular antígenos junto con moléculas inmunoestimuladoras, (iii) la flexibilidad en cuanto a la modificación de sus propiedades físico-químicas con el propósito de una mayor efectividad, y (iv) el hecho de ser biodegradables y no tóxicas (Leserman en Journal of Liposome Research, 2004, 14 (3 & 4), 175-189).
Un reto en el campo de la vacunología es la potenciación de una respuesta inmune celular mediada por linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) específica a antígenos, con relevancia para la prevención y tratamiento de enfermedades inducidas por patógenos intracelulares y células tumorales. Las vesículas liposomales pueden potenciar una respuesta CTL pero no siempre de manera efectiva. Se han diseñado diferentes estrategias basadas en vesículas liposomales con la intención de hacer más eficiente esta función; ejemplo de ello son los liposomas sensibles al pH acídico endosomal, liposomas catiónicos, la inclusión de inmunomoduladores tales como CpG y toxinas formadoras de poro de origen bacteriano. A pesar de la diversidad de
publicaciones, alguna de estas estrategias han tenido un limitado éxito en la inducción de una respuesta inmune celular efectiva o presentan desventajas por lo que requieren un mejor diseño antes de su aplicación.
La integración de proteínas de membranas virales en la membrana liposomal con el propósito de favorecer la fusión de membranas bajo condiciones de pH ácido o de procesamiento proteolítico, ha sido otra alternativa para el desarrollo de vehículos vacunales. Estas vesículas conocidas como virosomas no sólo han sido empleadas como vacunas del virus parental, sino que también han sido explotadas como vehículos para antígenos vacunales, enlazados o encapsulados al virosoma (Zurbriggen en Vaccine, 2003 14; 21 (9-10):921 -4). Las partículas virosomales conocidas con las siglas IRIV (immunopotentiating reconstituted influenza virosomes), que contienen las proteínas y lípidos de la envoltura del virus influenza, son el mejor representante de esta estrategia y constituyen la base de la patente de la vacuna contra la hepatitis A (patente núm. US 5, 565,203). Sin embargo, este preparado vacunal se diseñó para potenciar una respuesta de anticuerpos neutralizantes contra el virus de la hepatitis A. La inmovilización de virus de hepatitis A inactivados y altamente puros en la membrana del virosoma favoreció el procesamiento y la presentación de los péptidos derivados por la vía clásica MHCII, como resultado del proceso de fusión de las membranas virosomal y endosomal en las APCs (Glück y Wálti en Dev Biol (Basel), 2000, 103, 189-97). Las evidencias descritas indican que la asociación física antígenos-virosomas es importante en la inmunoadyuvanticidad (Zurbriggen y otros, Progr., en Lipid Res., 2000, 39(1), 3-18; Amacker y otros, en Int Immunol., 2005, 17(6), 695-704).
Schumacher y otros, en Vaccine 22:714-723, 2004, informaron que los IRIVs son también capaces de potenciar la respuesta inmune mediada por células. En particular, Schumacher y otros demostraron su actividad adyuvante en la inducción de CTL in vitro. Esta capacidad dependió principalmente de la estimulación de la reactividad de las células T CD4+ específica a las proteínas virales. Sin embargo, aunque el uso de los virosomas como adyuvante tiene numerosas ventajas como es la baja toxicidad y la elevada inmunogenicidad, uno de los problemas en la actual tecnología virosomal es la no existencia de procedimientos para el encapsulamiento eficiente de solutos, tales como proteínas, necesaria para la inducción de una respuesta CTL A la
concentración de lípidos a la cual los virosomas se producen (1 mM de lípidos aproximadamente), y dado su diámetro de aproximadamente 200 nm, menos del 1 % de la fase acuosa resulta encapsulada dentro de los virosomas (Schoen y otros, en J. Liposome Res., 3: 767-792, 1993). Estas características reducen notablemente la eficiencia de los virosomas de liberar antígenos o genes a las células. Una estrategia para superar esta limitación y generar una preparación inmunogénica para células T CD8+, recientemente publicada en la solicitud de patente núm. US 20100015214, se basa en la combinación de virosomas vacíos con vehículos, preferiblemente liposomas, que encapsulan el o los antígenos. US 20100015214, describe un efecto trans-adyuvante para los virosomas, aunque estas partículas y los liposomas no exhiban ninguna interacción física entre ellos.
En el artículo de Lanio y otros, publicado en J Liposome Res. ,2008, 18(1 ), 1 -19 se describe, para el EGFhr, la mayor eficiencia de encapsulación-retención de liposomas obtenidos por el procedimiento de deshidratación-rehidratación (DRVs) y constituidos por fosfatidil colina (PC) saturada (dipalmitoil fosfatidil colina, DPPC) y colesterol (Cho) en una relación molar 1 : 1 en comparación con aquellos que contienen PC ¡nsaturada y Cho. De hecho, el procedimiento de obtención de DRVs rinde vesículas de múltiples bicapas con elevada eficiencia de encapsulación/retención para una gran diversidad de solutos solubles. Lanio y otros, demostraron las propiedades inmunoadyuvantes de estas vesículas para potenciar una respuesta de anticuerpos cuantitativa y cualitativamente superior contra el EGFhr.
En la revisión realizada por Álvarez y otros, y publicada en Toxicon, 2009, 54(8): 1 135-47, se resumen las características estructurales y funcionales de dos proteínas producidas por un invertebrado marino, la anémona del Mar Caribe Stichodactyla helianthus, y nombradas por los autores sticholisinas (Sts) I y II (Stl/ll). Estas son toxinas formadoras de poros (PFTs) pertenecientes a la familia de proteínas Actinoporinas, única clase de PFTs de origen eucarionte encontradas exclusivamente en anémonas marinas. Al igual que el resto de los miembros de esta familia, las Sts son proteínas básicas con elevado punto isoeléctrico (>9.5), con masa molecular de aproximadamente 20 kDa, carentes de residuos de cisteína en su secuencia aminoacídica y una preferencia por membranas que contienen esfingomielina (SM). Las Sts son
producidas en forma soluble pero fácilmente se asocian a diferentes sistemas de membranas celulares y modelos formando poros de un diámetro de 2 nm, probablemente por la interacción de las α hélices del N-terminal de cuatro monómeros. Ambos eventos, la asociación y la formación del poro, dependen de las propiedades físico-químicas de las membranas.
En el artículo de Martínez y otros, publicado en Toxicon, 2007, 49: 68-81 se describe la relevancia de la presencia de la SM y del Cho para el enlace- formación de poros en las membranas por Stll. El estado de fase de la membrana influye sobre la asociación de Stll con estas estructuras. Según lo publicado por Martínez y otros, en la Revista Biología, 2002, 16, 2: 85-93, esta toxina se asocia reversiblemente a membranas de DPPC y SM y con una muy baja capacidad de permeabilización.
Si bien se ha informado ampliamente las propiedades inmunomoduladoras de las toxinas formadoras de poros de origen bacteriano para la inducción de una respuesta CTL específica a antígenos, empleando diferentes estrategias que incluye su vehiculización en liposomas, tal y como se resumen en las revisiones realizadas por Dietrich y otros, y Morón y otros, en TRENDS in Microbiology, 2001 , Vol.9 No.1 , 23-28 y TRENDS in Immunology, 2004, Vol.25 No.2, 92-97, respectivamente; nada se ha referido a las toxinas funcionalmente homólogas y provenientes de organismos eucariontes marinos.
Desde el punto de vista de sus aplicaciones en el tratamiento inmunológico de enfermedades tumorales, resulta deseable disponer de nuevas composiciones vacunales que sean capaces de inducir una respuesta inmune celular específica al antígeno y que sean menos agresivas que aquellas composiciones que contienen toxinas bactarianas.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION:
De manera sorprendente, los autores de la presente invención han encontrado que cuando un antígeno se administra por vía subcutánea (se) o intramuscular (im) encapsulado en la formulación vacunal Liposoma-St, con cualquiera de las variantes de toxinas descritas e incluyen las que no exhiben actividad formadora de poros o lítica, se inducen porcentajes de lisis de las células diana muy superiores a las que se observan en el grupo control positivo que usa ácido polinosinoico-policitidílico (PIC) que se considera en el estado del arte
como el potenciador por excelencia de la respuesta CTL, sin modificar los niveles de anticuerpos y la respuesta mixta Th1/Th2 que induce el antígeno liposomal. Esto indica la potencialidad del sistema liposoma-St para generar una respuesta tanto celular como humoral contra un antígeno proteico, lo cual es relevante para el empleo de esta formulación con fines vacunales.
Es objeto de la presente invención un vehículo vacunal basado en preparaciones liposomales de DPPC y Cho en las que se co-encapsulan las toxinas conocidas como Sts junto con un antígeno proteico. También son objeto de la presente invención aquellas preparaciones liposomales de DPPC y Cho en las que se co-encapsulan mutantes de las toxinas conocidas como Sts (ej: StlW111C y StlW111C¡rrev) junto con el antígeno proteico.
En otro aspecto, también son objeto de la presente invención las composiciones vacunales basadas en este vehículo vacunal y que contienen las toxinas conjuntamente con un antígeno y se administran por la vía se o im, para la inducción de una potente respuesta CTL específica al antígeno en cuestión.
Es también objeto de la presente invención el uso de las composiciones vacunales descritas, basadas en este vehículo vacunal y que contienen las toxinas conjuntamente con un antígeno y se administran por la vía se o im para el reforzamiento de la respuesta inmune de un paciente que sufra una patología seleccionada del grupo que consiste en cáncer y enfermedades infecciosas causadas por patógenos intracelulares.
En otro aspecto también es objeto de la presente invención un método para el tratamiento de un paciente que requiera un reforzamiento de su respuesta inmunológica, la administración por la vía se o im, de composiciones vacunales basadas en este vehículo vacunal y que contienen las toxinas Sts o sus mutantes conjuntamente con un antígeno relevante para la patología.
Adicionalmente, la presente invención también se relaciona con la protección que proporcionan dichas composiciones vacunales ante el reto con células tumorales que expresan el antígeno, se reduce el porcentaje de aparición de tumores y se incrementa la sobrevida de los sujetos portadores. Por tanto es también objeto de la presente invención un método profiláctico de aparición de la enfermedad relacionada con el antígeno.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
El vehículo vacunal objeto de la invención se basa en dispersiones acuosas de los liposomas DRVs de DPPC.Cho en una relación molar 1 :1 que encapsulan St conjuntamente con el antígeno, y que eventualmente pueden contener otros co-disolventes miscibles con el agua, no tóxicos, no irritantes y que no provoquen desestabilización de las vesículas, tales como aquellos habitualmente empleados en composiciones farmacéuticas inyectables, por ejemplo azúcares, polietilenglicol, etc.
Las preparaciones liposomales de la presente invención son obtenidas por el procedimiento de deshidratación-rehidratación y constituidas por DPPC y Cho en una relación molar 1 :1 y que co-encapsulan algunas de las variantes de Sts o de sus mutantes reversiblemente inactivas junto con un antígeno; en donde dichas composiciones vacunales son capaces de potenciar una respuesta inmune CTL específica al antígeno y protectiva frente a retos con células tumorales.
En una modalidad de la invención la composición vacunal comprende como antígeno la proteína OVA, pero donde dicho antígeno puede ser cualquier proteína o polipéptido asociado a una patología para la cual, desde el punto de vista terapéutico, sea relevante inducir una respuesta inmune CTL específica contra dicho antígeno proteico. Por ejemplo, el antígeno podría ser una proteína o un polipéptido asociado al cáncer, una proteína o un polipéptido asociado al SIDA o una proteína o un polipéptido asociado a la tuberculosis. Los liposomas descritos en la presente invención, son obtenidos por la tecnología deshidratación-rehidratación, descrita por Kirby y Gregoriadis en Biotechnology, 1984, 2, 979-984, estos son vesículas con una fase acuosa interna rodeada por varias bicapas lipídicas que se caracterizan por una elevada eficiencia de encapsulación y retención de moléculas lábiles como antígenos e inmunomoduladores de naturaleza proteica. Las soluciones clorofórmicas de DPPC y Cho en una relación molar de 1 :1 se rotoevaporan y se mantienen al vacío durante 30 minutos. Los lípidos se hidratan con agua desionizada a una temperatura superior a la temperatura de transición de fase (Te) del DPPC (T>45°C). Las suspensiones de vesículas multilaminares (MLVs) resultantes se transforman en SUV o LUV (del inglés: Small Unilamellar Vesicles and Large Unilamellar Vesicles, respectivamente) mediante ciclos de
ultrasonido y reposo o extrusión a través de membranas de policarbonato de tamaño de poros 100 nm. Las vesículas obtenidas se mezclan con las soluciones proteicas, siguiendo una relación lípido: proteína de 16 - 64 μητιοΙ de lípidos: 1.8 -7 nmol de antígeno y 0.5 - 2 nmol de St y se liofilizan durante 20- 24 horas. La rehidratación se realiza con agua desionizada y agitación durante 30 minutos a una temperatura igual o superior a 45°C. El material no encapsulado en los liposomas se elimina mediante lavados con tampón fosfato salino (PBS) pH 7,4 (NaCI 136 mmol/l, KH2P04 1 ,47 mmol/l, Na2HP04 9,55 mmol/l, KCI 2,68 mmol/l) seguido de centrifugación a 10 000 g durante 15 minutos. Dichas preparaciones alcanzan una eficiencia de encapsulación para las diferentes variantes de Sts que oscila alrededor de un 50 % con una retención de un 70 % después de un mes de almacenamiento a 4°C en suspensión en PBS.
Las toxinas Stl y Stll se aislan y purifican a partir de la anémona de mar Stichodactyla helianthus, mediante el uso del procedimiento descrito por Lanio y otros, en Toxicon. 2001 , 39, 187-94. Las Sticholisina I recombinante (Stlr) y el muíante de Stlr, Stl W111C, se obtienen según los procedimientos descritos por Pazos y otros, en Toxicon, 2006, 48,1083-1094. y Pentón y otros, (Articulo en prensa), respectivamente.
En el vehículo vacunal de la presente invención, la concentración de Sts empleada es está en el rango de 0.25 - 1 μΜ y es co-encapulada con el antígeno en un rango de concentración de 1 - 3.5 μΜ en una suspensión liposomal con un rango de concentración de lípidos totales de 16 - 64 mM. Preferiblemente el vehículo vacunal de la presente invención contiene una cantidad de Sts de 0.3 - 0.4 nmol co-encapulada con 1 - 2 nmol del antígeno en una suspensión liposomal de 20 ymol de lípidos totales en un volumen de
El rango de dosis empleado para las vacunas referidas en la presente invención, por la vía se o im, es entre 1 nmol - 2 nmol (50-100 g) del antígeno. Una característica esencial de las composiciones vacunales objeto de la invención es que carecen de otros adyuvantes inmunológicos excepto los descritos.
Como ya se había explicado anteriormente, es conocido del estado del arte que las toxinas formadoras de poros de origen bacteriano encapsuladas en vesículas liposomales son capaces de potenciar una respuesta CTL, pero se sabe de los efectos adversos que tiene el uso en humanos de composiciones vacunales basadas en toxinas de origen bacteriano; sin embargo, los autores de la presente invención han encontrado de manera inesperada que toxinas no bacterianas son capaces de tener el mismo efecto inmunoestimulante. Más aun, los autores de esta invención han logrado desvincular la actividad formadora de poro de las toxinas de sus efectos estimuladores de la respuesta CTL, lo cual ofrece grandes ventajas para el uso clínico en humanos de este vehículo vacunal. Los resultados obtenidos usando en el vehículo vacunal de la presente invención las entidades moleculares Stl W1 1 1 C¡rrev o Stll inactivada por calor, co-encapsulada con el antígeno en liposomas, permiten demostrar que no existe una dependencia absoluta entre la potenciación de una respuesta inmune CTL específica al antígeno por las formulaciones liposomas- St y la capacidad de estas proteínas de formar poros en las membranas. El ensayo de maduración de células dendríticas (CDs), aisladas de la médula ósea de ratones C57BL/6 y expuestas a Stll in vitro, demuestra la capacidad de esta proteína, no sólo en su variante activa, sino también en la inactivada por calor, de inducir la activación de las CDs, equivalente a la observada con el LPS (control positivo) en similares condiciones.
La capacidad de Sts de formar poros en membranas se evaluó mediante ensayos de actividad hemolítica y de permeabilización de LUVs cargados de carboxifluoresceína (CF) tal y como se describe por Martínez y otros, en Toxicon, 2001 , 39,1547-1560. Se demostró que Sts no exhiben actividad permeabilizante mediante un ensayo de permeabilización de vesículas liposomales de DPPC.Cho (1 : 1 ) que encapsulan CF, en comparación con la observada en vesículas constituidas por fosfatidil colina de yema de huevo y SM (1 :1 ) (Control positivo).
Se verificó que el mutante StlW111C forma un dímero inactivo estabilizado por un enlace disulfuro mediante el ensayo de actividad hemolítica y electroforesis en PAGE-SDS en presencia y ausencia de 2-mercaptoetanol (2-ME) como agente reductor, tal y como se describe por Pentón y otros, en Protein Eng Des Sel. 20 1 , 24, 485-493. La incapacidad de la estructura dimérica de formar
poros en el eritrocito, como célula modelo, fue el resultado de su no asociación con la membrana.
Se estableció un procedimiento para la obtención de una especie dimérica irreversible de StlW111C (StlW111 C¡rreV) basado en la reducción de StlW111C por incubación con 2-ME (0,1 mol/I), la eliminación de este agente reductor mediante filtración en una columna PD-10 y la incubación inmediata de StlW111 Cmonómero con el reactivo homobifuncional bis (maleimido) hexano (BMH) en una relación molar StlW111Cmonómero: BMH 1 :1 ó 2:1 , durante 2 horas a 4 °C. StlW 11 C¡rrev se purificó mediante cromatografía de filtración en gel en una columna Superdex 75 HR 10/30 en presencia de un agente reductor. La obtención del dímero irreversible y su grado de pureza se verificó mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras. El dímero irreversible se obtuvo con un 94% de pureza y solo un 6% de dímero reversible contaminante. La ausencia de actividad funcional se verificó mediante el ensayo de actividad hemolítica.
La inactivación irreversible de Stll se realizó mediante tratamiento térmico, según el procedimiento descrito por Martínez y otros, en Toxicon, 2001 , 39,1547-1560 y la pérdida total de la capacidad de formar poros en membrana se comprobó mediante el ensayo de actividad hemolítica.
Las propiedades inmunomoduladoras de las diferentes especies moleculares Sts en el sistema particulado liposoma-St, relacionadas con su capacidad de potenciar una respuesta inmune citotóxica antígeno-específica in vivo e inmunidad antitumoral en un escenario preventivo, se puede medir en el modelo experimental de ratones de la cepa C57BL/6 empleando el antígeno y la línea tumoral E.G7, un subclon del timoma murino EL-4 (Kusmartsev y Gabrilovich, en J Leukoc Biol., 2003, 74: 186-96), transfectado con el DNA complementario de OVA pAc-neo-OVA (Moore, y otros, en Cell, 1988, 54: 777- 85) y obtenida de la "American Type Cultures Collection" (ATCC, VA).
Los autores de la presente invención también han encontrado que la inoculación preventiva con el vehículo vacunal liposomas-St que contienen el antígeno, induce protección antitumoral y superior a la generada por liposomas que no contienen Stll. Estos resultados demuestran que el sistema liposomas- St es efectivo para inducir una respuesta antitumoral funcionalmente robusta y protectora, cuando se emplea un antígeno proteico, sin la necesidad de otros
adyuvantes. A su vez, el uso de esta preparación en terapias combinadas pudiera potenciar aún más su efecto antitumoral.
En los siguientes ejemplos se incluyen los detalles experimentales comparativos que permiten contrastar la eficacia inmunológica de inducir una respuesta inmune citotóxica antígeno-específica in vivo e inmunidad antitumoral en un escenario preventivo con las composiciones vacunales objeto de la invención respecto a las otras formulaciones que no son liposomales y no contienen Sts. EJEMPLOS:
Ejemplo 1 :_Evaluación de citotoxicidad y respuesta CTL del vehículo vacunal usando Stl o STII nativas y como antígeno la proteína OVA.
El vehículo vacunal basado en liposomas se preparó según lo descrito previamente. En vesículas DRVs compuestas de DPPC y Cho (relación molar 1 : 1 ) se co-encapsuló la OVA como antígeno modelo y Sts (Stl o Stll) en una relación 10 pmol de lípidos totales: 1.1 nmol OVA y 0.3 nmol de St en tampón fosfato salino (PBS) pH 7,4. De esta manera se obtuvieron dos composiciones vacunales:
Composición vacunal A: Liposomas DRVs de DPPC:Cho (60 μηηοΙ de lípidos totales) que encapsulan 6.6 nmol (50 μg) de OVA.
Composición vacunal B: Liposomas DRVs de DPPC.Cho (60 pmol de lípidos totales) que co-encapsulan 6.6 nmol (50 μg) OVA y 1.88 nmol de Stl o Stll.
Se seleccionaron 15 ratones hembra C57BL/6 con un peso corporal comprendido entre 18-20 g, y se separaron en 5 grupos de ensayo de 3 animales cada uno.
El Grupo 1 (control negativo) se inoculó por vía se, a los días 0, 12, 13 y 14, con 0.2 mi de tampón fosfato salino (PBS).
El Grupo 2 (control positivo) se inoculó por vía se, el día 12, con 22.2 nmoles (1 mg) de OVA y mezcló con 100 pg de ácido polinosinoico-policitidílico (PIC), un ligando sintético de TLR3 y un inductor clásico de respuesta CTL (Hamilton- Williams y otros, en J. Immunol., 2005, 174: 1 159-63), los días 13 y 14 los animales recibieron nuevamente 100 pg de PIC.
El Grupo 3 se inoculó por vía se, a los días 0 y 12, con 0.2 mi de la composición vacunal A (equivalente a 1.1 nmol ó 50 pg de OVA).
El Grupo 4 se inoculó por vía subcutánea, a los días 0 y 12, con 0,2 mi de la composición vacunal B (equivalente a 1.1 nmol ó 50 pg de OVA y 0.3 nmol ó 6,25 pg de Stl).
El Grupo 5 se inoculó por vía subcutánea, a los días 0 y 12, con 0,2 mi de la composición vacunal B (equivalente a 1.1 nmol ó 50 pg de OVA y 0.3 nmol ó 6.25 pg de Stll).
El día 20 del experimento, células de bazo de ratones C57BIJ6 sin inmunizar se incubaron con dos concentraciones de diacetato succinimidil ester de carboxifluoresceína (CFSE) (0,33 y 5 μηιοΙ/Ι, respectivamente); las células marcadas con mayor intensidad de fluorescencia también se incubaron con 1 μηηοΙ/Ι del péptido de OVA (257-SIINFEKL-264) inmunodominante en el contexto del haplotipo de MHC I de la cepa de ratón C57BL/6. Luego, las células marcadas se mezclaron 1 :1 y los grupos experimentales 1-5 se inocularon por la vena de la cola con 30x106 células de la mezcla en un volumen de 0,2 mi. Los ratones se sacrificaron a las 16 horas y se determinó el porcentaje de lisis de células blanco en el ganglio inguinal más cercano al sitio de inmunización mediante citometría de flujo (FACS).
En la Figura 1 se presenta la citotoxicidad producida in vivo por la inmunización de ratones con liposomas que co-encapsulaban OVA y Sts. Los animales inmunizados con liposomas que encapsulaban Sts (Stl o Stll) mostraron una respuesta de linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) específicos a OVA estadísticamente superior al grupo control positivo. Adicionalmente, los liposomas que sólo contenían OVA también indujeron una respuesta CTL estadísticamente similar al control positivo clásico de este ensayo (PIC).
Ejemplo 2: Inducción de protección antitumoral del vehículo vacunal en el modelo de la proteína OVA.
A las vacunas basadas en liposomas se les estudió su capacidad de inducir protección antitumoral. Para ello se seleccionaron 60 ratones hembra C57BL/6 con un peso corporal comprendido entre 18-20 g, y se separaron en 3 grupos de ensayo de 20 animales cada uno.
El Grupo 1 (control negativo) se inoculó por vía intramuscular, a los días 0 y 12, con 0,2 mi de tampón fosfato salino (PBS).
El Grupo 2 se inoculó por vía intramuscular, a los días 0 y 12, con 0,2 mi de la composición vacunal A descrita en el ejemplo 1 (equivalente a 1.1 nmol ó 50 pg de OVA).
El Grupo 3 se inoculó por vía intramuscular, a los días 0 y 12, con 0,2 mi de la composición vacunal B descrita en el ejemplo 1 (equivalente a 1.1 nmol ó 50 g de OVA y 0.3 nmol ó 6,25 pg de Stll).
Todos los Grupos 1 a 3 se retaron el día 19 con 3x105 células de la línea tumoral E.G7 por vía subcutánea (0.2 mi).
Los animales se individualizaron a partir del día 0 y se determinaron tres veces por semana los siguientes parámetros: volumen tumoral, tiempo a la progresión y sobrevida.
Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
Tiempo a la progresión
El tiempo a la progresión es un parámetro que valora el tiempo que tarda en aparecer el tumor en cada animal individual, medido a partir del momento del inóculo. Para los ratones que no habían desarrollado tumor al cierre del experimento se consideró que el tiempo a la progresión era de 60 días. El impacto en la prolongación del tiempo a la progresión es un parámetro muy deseable para una vacuna contra el cáncer. Según se observa en la Figura 2A los animales del grupo 3, vacunados con la formulación composición vacunal B descrita en el Ejemplo 1 y objeto de la invención, mostraron los resultados más relevantes.
Sobrevida
Este parámetro evalúa la capacidad de la vacunación para aumentar el tiempo que viven los animales inmunizados después del reto con las células tumorales que expresan OVA (E.G7). El parámetro se mide en días y tiene carácter relativo, ya que se compara con la sobrevida de los animales no tratados. La prueba de elección para ver la significación estadística de las comparaciones de sobrevida es el Log-Rank.
En la figura 2B se muestra con claridad que los animales del grupo 3, vacunados con la composición vacunal B descrita en el ejemplo 1 y objeto de la presente invención, son los que más tiempo sobreviven después de la inoculación del tumor.
Ejemplo 3: Actividad hemolítica de las imitantes de Sts.
La formación de poros en la membrana del eritrocito genera un choque coloido- osmótíco que trae como consecuencia la lisis de la célula. La actividad formadora de poros de una porina puede ser por lo tanto evaluada por su actividad hemolítica (AH), la cual se determina experimentalmente por la disminución de la absorbancia aparente (λ = 600 nm) de una suspensión de eritrocitos producto de la lisis celular.
En el ensayo se comparó la AH del dímero irreversiblemente inactivo de StlW1 1 1 C (Stl W1 1 1 C¡rrev) con la de la variante dimérica reversible StlW1 1 1 C, en condiciones reductoras (2-ME 0,1 mol/l) y no reductores, para una concentración relativamente elevada de proteínas en el ensayo (0, 15 pmol/l), si se compara con la AH de Stl/Stll informada por Álvarez y otros, en Toxicon, 2009, 54(8): 1135-47. Las cinéticas de hemolisis que se muestran en la figura 3 indican que StlW11 Cirrev resultó inactiva bajo condiciones no reductoras. En condiciones reductoras StlW111C¡rrev mostró menor actividad lítica que StlW111C completamente reducido y no reducido.
Ejemplo 4: Evaluación de la capacidad formadora de poros de Stll inactivada.
La pérdida de la capacidad de formar poros en membrana de Stll, inactivada de manera irreversible por el calentamiento a 80°C durante 2 horas, se evaluó mediante el ensayo de actividad hemolítica. En la figura 4 se aprecia la ausencia total de la actividad hemolítica de la Stll inactivada, al compararla con la proteína activa.
Ejemplo 5: Efecto del vehículo vacunal sobre la maduración de CDs.
La maduración de las CDs inducida por Stll se evaluó en células obtenidas de la médula ósea de ratones C57BL/6 expuestas a Stll activa (0.1 nmole ó 2 pg) o inactivada por tratamiento térmico (4 pg) en presencia o no de 20 pg de polimixina B (pmxB, neutralizante de la actividad biológica de las endotoxinas por unirse a la porción de lípido A del LPS), durante 24 horas a 37°C en cámara con CO2 al 5%. Como control positivo se empleó LPS (2 pg) y como control negativo medio RPMI más pmxB. Las células extraídas de la médula ósea del ratón, se sembraron en un número de 600 000 precursores de CDs en
medio RPMI por pozo en placas de 6 pozos. A cada pozo se le adicionó suero fetal bovino (SFB) al 10%, 400 ul de GMCSF y RPMI hasta completar un volumen por pozo de 3ml. En la figura 5 se muestra el incremento en porcentaje de los marcadores moleculares (CD80, CD86 y CD40) indicativos de la activación de las CDs como resultado de la exposición de estas células in vitro a Stll, tanto en su variante activa como inactivada por tratamiento térmico y comparables a los resultados del control positivo.
Ejemplo 6: Evaluación de citotoxicidad y respuesta CTL del vehículo vacunal usando las mutantes de St y como antígeno la proteína OVA.
Las variantes diméricas de Stl de baja actividad formadora de poros reversible (StlW11 1C) o irreversible (Stl W1 1 1 C¡rrev) y la variante de Stll inactivada por tratamiento térmico, se co-encapsularon con el antígeno OVA en los liposomas de DPPC:Cho (1 : 1), en una relación 10 pmol de lípidos totales: 1.1 nmol de OVA: 0.3 nmol de StlW1 1 1 C, StlW1 1 1 Cirrev o Stll inactivada por tratamiento térmico, en PBS pH 7,4 y se evaluó la capacidad de estas preparaciones vacunales de inducir actividad citotóxica OVA-específica in vivo. En estos ensayos se emplearon esencialmente las composiciones vacunales descritas en el ejemplo 1 , en el caso de la composición B se emplearon las diferentes variantes de St
Composición vacunal A: Liposomas DRVs de DPPC:Cho (60 pmol de lípidos totales) que encapsulan 6.6 nmol de OVA.
Composición vacunal B: Liposomas DRVs de DPPC:Cho (60 pmol de lípidos totales) que co-encapsulan 6.6 nmol de OVA y 1.875 nmol de St (StlW1 11 C, StlW1 Cirrev, St II nativa o Stll inactivada por tratamiento térmico)
En un primer ensayo se seleccionaron 12 ratones hembra C57BL/6 con un peso corporal comprendido entre 18-20 g, y se separaron en 4 grupos de ensayo de 3 animales cada uno.
El Grupo 1 (control negativo) se inoculó por vía se, a los días 0 y 12, con 0.2 mi de PBS.
El Grupo 2 (control positivo) se inoculó por vía se, a los días 0 y 12, con 0,2 mi de la composición vacunal B (equivalente a 1.1 nmol ó 50 pg de OVA y 0.3 nmol ó 6,25 pg de Stll nativa).
El Grupo 3 se inoculó por vía se, a los días 0 y 12, con 0,2 mi de la composición vacunal B (equivalente a 1.1 nmol ó 50 pg de OVA y 0.3 nmol ó 6,25 pg de StlW1 1 1 C).
El Grupo 4 se inoculó por vía se, a los días 0 y 12, con 0,2 mi de la composición vacunal B (equivalente a 1.1 nmol ó 50 pg de OVA y 0.3 nmol ó 6,25 pg de StlW11 1 Cirrev).
En la figura 6A se muestra que en los animales inmunizados con liposomas que contienen las variantes de St de baja actividad formadora de poros (LP/OVA+StlW1 11 C o LP/OVA+StlW1 1 C¡rrev) se induce una respuesta citotóxica estadísticamente similar a la obtenida por Stll cuando se co- encapsula con OVA en liposomas (LP/OVA+Stll).
Para otro ensayo se seleccionaron 9 ratones hembra C57BLJ6 con un peso corporal comprendido entre 8-20 g, y se separaron en 3 grupos de ensayo de 3 animales cada uno.
El Grupo 1 (control negativo) se inoculó por vía se, a los días 0 y 12, con 0,2 mi de tampón fosfato salino (PBS).
El Grupo 2 se inoculó por vía subcutánea, a los días 0 y 12, con 0,2 mi de la composición vacunal A (equivalente a 1.1 nmol ó 50 pg de OVA).
El Grupo 3 se inoculó por vía subcutánea, a los días 0 y 12, con 0,2 mi de la composición vacunal B (equivalente a 1.1 nmol ó 50 pg de OVA y 0.3 nmol ó 6,25 pg de Stll inactiva).
La figura 6B evidencia que la inmunización con liposomas que co-encapsulan OVA y la variante de Stll inactivada completamente por tratamiento térmico generó una actividad citotóxica OVA-específica significativamente superior a la inducida por liposomas que sólo contenían el antígeno y similar a aquella observada con la formulación liposomal que contiene Stl/Stll nativa.
Los resultados experimentales demostraron que la vacuna liposomal objeto de esta invención y que co-encapsulan un antígeno con cualquiera de las variantes de sticholisinas, aún con aquellas que no exhiben actividad formadora de poros, indujo una potente respuesta CTL específica al antígeno, robusta y funcional y muy superior que el clásico control positivo (PIC) en un ensayo de CTL in vivo. La formulación liposoma-St en un escenario preventivo, incrementó el curso temporal del prendimiento del tumor e incrementó significativamente la sobrevida en los grupos evaluados en relación con
aquellos que sólo se trataron con PBS. En resumen, la vacunación con liposomas-St mostró mejores resultados que aquellos observados con vesículas liposomales que sólo contenían el antígeno. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS FIGURAS
Figura 1 : representa una gráfica con el porcentaje de lisis de las células blanco cargadas con el péptido inmunodominante de OVA (SIINFEKL) y marcadas con CFSE en animales de experimentación sometidos a diferentes tratamientos vacunales en un ensayo de citotoxícidad in vivo. Cada punto corresponde a los datos de un animal y la línea al valor promedio de al menos dos experimentos independientes. Las letras diferentes indican significación estadística entre los grupos inmunizados según la prueba Dunnett T3 (p< 0,05).
Figura 2A: representa el porcentaje de animales sin tumor en tres grupos de animales de experimentación sometidos a diferentes tratamientos vacunales y retados con células tumorales que expresan OVA.
Figura 2B: representa una gráfica que permite apreciar en los 3 grupos mencionados el parámetro de sobrevida después de la inoculación de células tumorales que expresan OVA. Letras diferentes indican significación estadística según la prueba Log-Rank (p< 0,05).
Figura 3: muestra la variación en la turbidez de una suspensión eritrocitaria producto de la acción de las variantes diméricas de Stl (StlW111C o StlW111 C¡rrev) en condiciones reductoras (presencia de 2-ME) y no reductoras. Figura 4: representa la pérdida de la turbidez de una suspensión de eritrocitos por la acción de Stll nativa (proteína activa) o inactivada por tratamiento térmico.
Figura 5: muestra la variación de la expresión de marcadores moleculares en células dendríticas (CDs) por la exposición in vitro a St II en sus variantes activa e inactivada por tratamiento térmico en presencia o no de un neutralizante de las endotoxinas (pmxB).
Gráfica A: Porcentaje de CD80
Gráfica B: Porcentaje de CD86
Gráfica C: Porcentaje de CD40
Figura 6: representa dos gráficas con el porcentaje de lisis de las células blanco cargadas con el péptido inmunodominante de OVA (SIINFEKL) y
marcadas con CFSE en animales de experimentación sometidos a diferentes tratamientos vacunales en un ensayo de citotoxicidad in vivo. Cada punto corresponde a los datos de un animal y la línea al valor promedio. Las letras diferentes indican significación estadística entre los grupos inmunizados según la prueba Tukey (p< 0,05).
Gráfica A: Respuesta obtenida por la inmunización con liposomas que co- encapsulan OVA, Stll nativa o variantes diméricas de Stl reversible (StlW111C) o irreversiblemente (StlW111 CirreV) inactivas.
Gráfica B: Respuesta obtenida por la inmunización con liposomas que co- encapsulan OVA y Stll inactivada por tratamiento térmico.
Claims
1. - Un vehículo vacunal para inducir respuesta inmune celular caracterizado porque comprende la encapsulación en vesículas lipídicas de proteínas obtenidas de la anémona Stichodactyla helianthus junto con un antígeno.
2. - El vehículo vacunal de la reivindicación 1 caracterizado porque la vesícula lipídica contiene DPPC y Cho en una relación equimolar.
3. - El vehículo vacunal de la reivindicación 1 caracterizado porque las proteínas de la anémona Stichodactyla helianthus son seleccionadas del grupo que comprende Stll, Stl y variantes de ellas.
4. - El vehículo vacunal de la reivindicación 3 caracterizado porque las variantes de las toxinas St, son seleccionadas del grupo que comprende StlW111C, StlW111C¡rrev o St II inactivada por tratamiento térmico.
5.- El vehículo vacunal de la reivindicación 1 caracterizado porque el antígeno es una proteína o un polipéptido asociado a una patología seleccionada del grupo que comprende cáncer y enfermedades infecciosas causadas por patógenos intracelulares.
6. El vehículo vacunal de la reivindicación 5 caracterizado porque el antígeno es una proteína o un polipéptido asociado al cáncer.
7. - El vehículo vacunal de la reivindicación 5 caracterizado porque el antígeno es una proteína o un polipéptido asociado al SIDA.
8- El vehículo vacunal de la reivindicación 5 caracterizado porque el antígeno es una proteína o un polipéptido asociado a la tuberculosis.
9- Una composición vacunal caracterizada porque comprende el vehículo vacunal de cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9 y porque carece de adyuvantes inmunológicos.
10.- El uso de la composición vacunal de la reivindicación 10 para el reforzamiento de la respuesta inmune de un paciente que sufra una patología seleccionada del grupo que comprende cáncer y enfermedades infecciosas causadas por patógenos intracelulares.
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