MXPA00008532A

MXPA00008532A - Metodo y dispositivo para modular la respuesta inmune

Info

Publication number: MXPA00008532A
Application number: MXPA/A/2000/008532A
Authority: MX
Inventors: Cerami Anthony; Cerami Carla; Gelber Cohava; David Dove
Original assignee: Applied Vaccine Technologies Corp*
Priority date: 1998-03-02
Filing date: 2000-08-31
Publication date: 2002-03-05

Abstract

La presente invención ofrece los métodos y dispositivos para inducir, estimular, bloquear y reducir la respuesta inmune de un mamífero ante un antígeno, utilizando un dispositivo que puede ser implantado, el cual expone el antígeno en un modo controlado a las células del sistema inmune. El dispositivo consiste en una matriz contenida dentro de un recipiente impermeable, perforado. Al manipular la biosdisponibilidad del antígeno dentro del dispositivo, y el tiempo de introducción del antígeno en el dispositivo con respecto al tiempo de implantación del dispositivo dentro del mamífero se puede inducir una respuesta robusta y de largo plazo contra un antígeno, o se puede inhibir o bloquear una respuesta inmune existente o potencial. Los métodos y dispositivos pueden ser utilizados para vacunación terapéutica, y en mamíferos no expuestos, para vacunación profiláctica. La inmunidad puede ser celular, humoral o mucosa. La supresión de la respuesta inmune esútil para el tratamiento o profilaxis de estados tales como:alergias, enfermedad autoinmune y en mamíferos tolerantes para suprimir una respuesta inmune a antígenos de transplantes. El dispositivo también puede ser utilizado para cosechar células inmunes para una reintroducción posterior en el mamífero, y para preparar suero e hibridonas inmunes.

Description

MÉTODOS Y DISPOSITIVOS PARA MODULAR LA RESPUESTA INMUNE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere, en general, a un método para modular, en un mamífero, una respuesta inmune a un antígeno, utilizando un dispositivo que puede ser implantado, el cual expone el antígeno en un modo controlado a las células del sistema inmune. Al crear un medio artificial que imite la composición y la función de un ganglio linfático, y manipulando la biodisponibilidad del antígeno dentro del dispositivo, es posible inducir una respuesta robusta contra con un antígeno, o es posible inhibir una respuesta inmune existente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La inducción de una respuesta inmune a un antígeno, y la magnitud de esta respuesta inmune, dependen de una interacción compleja entre el antígeno, diversos tipos de células inmunitarias y las moléculas co-estimuladoras que incluyen citocinas y quimiocinas. El tiempo y grado de exposición de las células inmunitarias al antígeno y el medio co-estimulador además modulan la respuesta inmune. Dentro del cuerpo, estos diferentes tipos de células y factores adicionales se llevan convenientemente en proximidad al tejido linfoide como pueden ser los ganglios *. ^ linfáticos. De los numerosos tipos de células involucradas en el proceso, las células presentadoras de antígeno, como pueden ser los macrofagos y las células dendríticas, transportan antígenos -desde la periferia hacia el tejido linfoide local, organizado, procesan el antígeno y presentan peptídicos antigénicos a las células T así como secretan moléculas co-estimuladoras. Así pues, si el antígeno llega a los órganos linfáticos en un modo gradual, localizado, bajo el gradiente de concentración óptima y bajo el ambiente adecuado que contiene moléculas co-estimuladoras, se induce una respuesta inmune en el ganglio linfático drenador. De este modo, un antígeno extraño inducido en el cuerpo, como puede ser por medio de una vacuna, puede o no da origen al desarrollo de una respuesta inmune convenientemente robusta. Los antígenos que se utilizan para las vacunas incluyen bacterias y virus atenuados e inactivados y sus componentes. El éxito de la vacunación depende en parte del tipo y cantidad del antígeno, la ubicación del sitio de inmunización y el estado del sistema inmunitario en el momento de la vacuna. No todos los antígenos son igualmente inmunogénicos, y para antígenos inmunogénicos deficientes, hay pocas alternativas disponibles para incrementar la eficacia de la inmunización. Mientras que numerosas técnicas en animales, experimentales están disponibles para potenciar el desarrollo de la respuesta inmune, como puede ser conjugando el antígeno a una proteína o biomolécula portadora más inmunogénica (por ejemplo, hemocianina de molusco) , o el uso de coadyuvantes como el coadyuvante de Freund o alumbre, para- las vacunas humanas tales técnicas y coadyuvantes no están a la disposición. Así pues, numerosas enfermedades que de otro modo serían prevenibles por vacunación antes de la exposición al agente infeccioso, o en el caso de una vacuna terapéutica, que puede inducir el desarrollo de una respuesta inmune eficaz a un agente o célula causante de enfermedad existente, como puede ser el cáncer, no están disponibles para el paciente. Se han realizado estudios de implantes de esponja en mamíferos para valorar la población de células inmunes atraídas al cuerpo extraño, lo cual produce lo que se denomina un absceso estéril, y las esponjas antes o después de la implantación han sido cargadas con un antígeno para además estudiar la población de células atraídas. Vallera y col., (1982, Cáncer Research 42: 397-404) implantaron esponjas que contenían células tumorales en ratones para examinar la composición de las células atraídas durante un periodo de 16 días, y encontraron que, al principio, estaban presentes precursores de células citotóxicas, y la citotoxicidad tuvo un máximo el día 16. Las esponjas que contenían células tumorales implantadas en ratones implantadas en ratones que habían sido anteriormente inmunizados con células tumorales mostraron una aparición más rápida de las células citotóxicas en la esponja. En ningún caso las células del bazo, ganglios linfáticos o peritoneo mostraron eitotoxicidad, lo cual sugiere una respuesta altamente localizada a un antígeno en la esponja. Jenski y col., (1985, J. Immunol. Methods 85: 153-161) utilizaron condiciones similares para seguir la recuperación de la inmunidad celular en ratones que recibieron trasplantes singénicos de médula ósea después de irradiación supletal implantando esponjas cargadas con antígeno. La recuperación de la inmunidad fue determinada por medición de la actividad citotóxica de los linfocitos T de las células recuperadas en las esponjas con el tiempo. Zangemeister-Wittke y col., (1989; J. Immunol. 143: 379-385) inyectaron una vacuna de tumor en esponjas implantadas en ratones inmunes al tumor, y verificaron la generación de una respuesta inmune secundaria en el sitio de la esponja. Ningún efecto acompañante fue evidente en los ganglios linfáticos adyacentes a la esponja implantada. Chen y col., (1994, Cáncer Research 54: 1065-1070) cosecharon células T de los implantes o injertos de esponjas cargadas con células tumorales irradiadas para mostrar que estas células podían ser utilizadas para transferir de manera adoptiva [sic] actividad antitumoral. La frecuencia de las células T citotóxicas, reactivas al tumor recuperadas de la esponja, junto con los ganglios 'linfáticos regiones y el bazo, fueron medidas en animales que recibieron los implantes de esponja cargados con células tumorales. Las esponjas contenían una frecuencia cuatro veces mayor de células T citotóxicas reactivas a las células tumorales en comparación con los ganglios linfáticos, y 50 veces mayor que el bazo. Aunque esta en camino investigación importante para solucionar estas deficiencias en las vacunas eficaces y disponibles, sigue habiendo inconvenientes asociados con las técnicas terapéuticas y materiales. Por tanto, sería deseable desarrollar una técnica o modalidad que superará los problemas actualmente asociados con la inmunoterapia contemporánea y al mismo tiempo protocolos de tratamiento, como pueden ser la vacuna profiláctica y terapéutica, para facilitar por este medio el desarrollo de nuevas estratégicas eficaces y eficientes para efectividad mejorada de la inmunización de animales saludables y aquellos que pueden beneficiarse de la inmunoterapia. Además, la capacidad para suprimir la respuesta inmune a un antígeno específico o series de antígenos ofrece ventajas en el tratamiento de alergias y prevención de rechazo de transplantes, por ejemplo. Por consiguiente, la presente invención se dirige al logro de estos objetivos y similares.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para modular la respuesta inmune en un mamífero a un antígeno implantando -dentro del cuerpo del mamífero un dispositivo que contenga una matriz porosa contenida dentro de un recipiente perforado pero de otro modo impermeable. El antígeno para el cual se desea una respuesta inmune esta presente en la matriz porosa de! dispositivo. El antígeno puede estar presente en el dispositivo antes de la implantación o introducido después de la implantación; el antígeno presente en la matriz del dispositivo en el momento de la implantación puede estar provisto en una forma no biodisponible que se vuelva biodisponible después de la implantación. El dispositivo atraerá células del sistema inmunitario para encontrar al antígeno dentro del dispositivo, y el encuentro modulará la respuesta inmune al antígeno. El recipiente perforado actúa como una barrera de difusión, manteniendo dentro del dispositivo altas concentraciones de citocinas y otros factores co-estimuladores producidos por las células inmunes dentro del dispositivo el cual, con la exposición a otras células inmunes en el dispositivo favorece el desarrollo de la respuesta inmune deseada. Las perforaciones permiten el ingreso y egreso de las células inmunes. La respuesta inmune deseada puede incluir inmunidad celular, mucosa y humoral, y *. .. puede ser aplicada a mamíferos sanos y aquellos que pueden beneficiarse de la inmunoterapia. Por ejemplo, en la practica de la invención, pequeñas cantidades de antígeno se proporcionan dentro de un dispositivo de la presente invención antes de la implantación dentro del mamífero. De preferencia, el antígeno se introduce en, o se vuelve biodisponible dentro, de la matriz porosa del dispositivo aproximadamente tres días después de la implantación del mamífero. Una respuesta inmune robusta al antígeno será inducida en el mamífero. En otra modalidad, el dispositivo esta compuesto de materiales biodegradables que finalmente se degradan dentro del cuerpo. De otro modo, el dispositivo puede ser separado del cuerpo después de que ha alcanzado su efecto deseado. En su más amplio aspecto, la presente invención se extiende a un dispositivo que puede ser implantado para inmunizar un mamífero, que tiene las siguientes características: una matriz porosa contenida dentro de un recipiente perforado pero de otro modo impermeable, el dispositivo además contiene un antígeno que esta presente dentro de la matriz en una forma biodisponible antes de la implantación, o se vuelve biodisponible dentro de la matriz después de la implantación, o el antígeno se introduce en el mismo después de la implantación. La biodisponibilidad del antígeno dentro del dispositivo puede ser controlada proporcionando el antígeno en una forma no biodisponible como puede ser en una formulación para liberación retardada, como la que se puede proporcionar mediante las microesferas, microcápsulas o liposomas, la cual con la degradación libera el antígeno en la matriz del dispositivo. En otra modalidad, el método y dispositivo de la presente invención puede ser utilizado para disminuir la respuesta inmune a un antígeno dentro de un mamífero, utilizando una alta concentración de un antígeno particular dentro del dispositivo, lo cual da origen a la supresión de la respuesta inmune al antígeno particular, y la inhibición del desarrollo de una respuesta inmune al antígeno. Las citocinas u otras moléculas co-estimuladoras también pueden ser proporcionadas dentro del dispositivo. Otras utilidades de los métodos y dispositivos de la presente invención incluyen la cosecha de las células inmunes desde el dispositivo para reintroducción subsiguiente en el cuerpo para propósitos de proporcionar inmunoterapia adoptiva, inmunización activa y reconstitución del sistema inmune. Usos adicionales incluyen me oramientos en la preparación de anticuerpos policlonales (suero inmune) y anticuerpos monoclonales, que incluye la preparación de anticuerpos monoclonales humanos en animales que sirven de puerto para las células inmunes. Como será evidente más adelante, al utilizar la invención que se describe en la presente, creando un ambiente artificial que imite la composición y función de un ganglio linfático, y manipulando la biodisponibilidad del antígeno dentro del dispositivo, se logra el desarrollo de una respuesta robusta contra un antígeno. Bajo diferentes condiciones para los antígenos particulares, es posible disminuir una respuesta inmune existente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La FIGURA 1 muestra el transcurso del tiempo de la población de células dentro del dispositivo de la presente invención durante un periodo de 9 días después de la implantación bajo la piel de un mamífero. La FIGURA 2 representa un análisis de los números y tipos de células presentes en el dispositivo 4 días después de la implantación sin ningún antígeno presente dentro del dispositivo. La FIGURA 3 muestra un cambio en la población de diferentes tipos de células dentro del dispositivo en los días 4, 7 y 10 después de la implantación, en ausencia de cualquier antígeno inducido. La FIGURA 4 muestra el efecto de la inducción del antígeno en el dispositivo sobre los números de células CD3 positivas (células T) , células CD80 positivas (células B) , y células CD14 positivas (macrofagos como subconjunto representativo de células presentadoras de antígeno) dentro del dispositivo los días 3, 7 y 10 posteriores a la implantación. El antígeno fue introducido en el dispositivo el día 4 posterior a la implantación. La FIGURA 5 muestra un análisis del cambio en una expresión de las células CD4 (células T cooperadoras) y CD8 (células T citotóxicas) positivas en los bazos de ratones 10 días después de la implantación de un dispositivo que contenía ninguna o diferentes cantidades de antígeno de influenza, o la inmunización en la almohadilla de la pata con antígeno más coadyuvante. La FIGURA 6 representa de la respuesta proliferativa de células esplénicas a antígeno de influenza de ratones que habían sido implantados con un dispositivo que contenia antígeno, con o sin coadyuvante, o inmunizados en la almohadilla de la pata con antígeno más coadyuvante. La proliferación de las células T esplénicas se mide por producción de interferón gamma. La figura 7 muestra el nivel de secreción del intérferón gamma por las células T aisladas de los ganglios linfáticos poplíteos de ratón inmunizado en la 'almohadilla de la pata con antígeno de influenza más coadyuvante. La FIGURA 8 muestra la respuesta proliferativa de las células T esplénicas medidas por el nivel de secreción de interferón gamma en ratones inmunizados con antígeno de influenza, con o sin coadyuvante, utilizando el dispositivo de la presente invención. La FIGURA 9 muestra el nivel de activación de las células T esplénicas medido por el nivel de secreción de interferón gamma en ratones inmunizados con un intervalo de dosis del antígeno ovalbúmina, sin coadyuvante, utilizando el dispositivo de la presente invención, en comparación con la respuesta proliferativa de células esplénicas de animales inmunizados por inyección en la almohadilla de la pata del mismo intervalo de dosis de antígeno con coadyuvante. La FIGURA 10 también represente la respuesta proliferativa de las células T esplénicas medido por el nivel de secreción de interferón gamma en ratones inmunizados con ninguno, 50 µg, 50 ng ó 50 pg de ovalbúmina, sin o con coadyuvante BCG, utilizando el dispositivo de la presente invención, en comparación con la respuesta proliferativa de las células esplénicas de animales inmunizados por inyección en la almohadilla de la pata a la misma dosis de antígeno con coadyuvante Ribi. La FIGURA 11 muestra la respuesta específica del anticuerpo anti-antígeno IgG2a en animales implantados con dispositivos que contenían diferentes dosis de antígeno péptido gpl20 de VIH, en comparación con animales inmunizados por inyección en la almohadilla de pata con las mismas dosis de antígeno más coadyuvante.

*. „ La FIGURA 12 muestra el mismo experimento como se representa en la FIGURA 11, pero después de un refuerzo, tres semanas después de la primera inmunización, con 10?: de la cantidad de la inmunización inicial dada por la misma vía. Los dispositivos implantados en animales fueron nuevamente cargados con antígeno. La FIGURA 13 compara el desarrollo de los anticuerpos IgG2a específicos contra el péptido VIH gpl20 en animales inmunizados con el dispositivo de la presente invención, con o sin coadyuvante Ribi o BCG, y la inmunización tradicional en la almohadilla de la pata con los mismos coadyuvantes. La FIGURA 14 representa el nivel del anticuerpo específico IgG2a en animales inmunizados con diferentes dosis del antígeno citrocromo C utilizando el dispositivo de la presente invención sin coadyuvante o por la inmunización tradicional en la almohadilla de la pata con el coadyuvante Ribi. Los niveles de IgG2a circulantes fueron detectados utilizando diluciones en serie de los sueros de ratones. La FIGURA 15 muestra el nivel de IgG específico del virus de influenza total desarrollado después de la inmunización de ratones con 0.1 µg ó 10 µg de fragmento de la proteína hemaglutinina de influenza (BHA) en el dispositivo de la presente invención, sin coadyuvante, en comparación con la misma dosis de antígeno dada en la almohadilla de la pata, con coadyuvante Ribi.

La FIGURA 16 representa los resultados de un ensayo de activación de células T utilizando interferón gamma como la lectura de salida. Los ratones fueron inmunizados con antígeno de influenza utilizando el dispositivo de la presente invención, sin coadyuvante, en comparación con la inmunización de la almohadilla de la pata utilizando antígeno con coadyuvante, y también en comparación con la inmunización con antígeno en una matriz polimérica porosa implantada (pero no presente dentro del recipiente perforado, como es el dispositivo de la presente invención) .

La FIGURA 17 muestra los resultados del experimento anterior con el desafío in vitro de las células esplénicas, de ratones inmunizados para influenza, con antígeno no relacionado (EBV) , indicando al especificidad de la respuesta desarrollada después de la inmunización al utilizar el dispositivo de la presente invención. La FIGURA 18 representa los resultados de una prueba de difusión de proteína (albúmina de suero bovino) a partir de la esponja sola en comparación con el dispositivo de la presente invención. La FIGURA 19 represente el fenotipo de células extraídas de un dispositivo de la presente invención, con o sin antígeno de influenza, cuatro días de la inserción en ratones. Se muestran los valores de los mismos tipos de células en linfocitos de sangre periférica de ratones no manipulados. La FIGURA 20 muestra los niveles de las citocinas estimuladoras en un dispositivo de la presente invención en ausencia de antígeno - en comparación con los niveles en suero. La FIGURA 21 representa el grado de producción de células T citotóxicas, medido por lisis de células objetivo infectadas por influenza, mediante el dispositivo implantado de la presente invención conteniendo vacuna del virus de influenza, en comparación con animales inmunizados por vía subcutánea con vacuna de virus de influenza junto con coadyuvante. La FIGURA 22 compara la respuesta humoral medida por el nivel de IgGl específico del virus de influenza en ratones inmunizados por el dispositivo de la presente invención conteniendo vacuna del virus de influenza, con ratones inmunizados por vía subcutánea con la vacuna más coadyuvante. La FIGURA 23 muestra la afinidad de IgGl específica de influenza aumentada en animales inmunizados con el dispositivo de la presente invención conteniendo la vacuna del virus de influenza en comparación con animales inmunizados por vía subcutánea con la vacuna más coadyuvante . La FIGURA 24 representa la supervivencia de ratones desafiados con virus de influenza después de la inmunización con el dispositivo de la presente invención conteniendo vacuna del virus de influenza en comparación con ratones inmunizados por vía- subcutánea con la vacuna más coadyuvante . La FIGURA 25 representa el título de los anticuerpos IgG humanos específicos de influenza aumentados en ratones SCID utilizando un dispositivo de la presente invención, en comparación con la inmunización intramuscular. La FIGURA 26 muestra la afinidad de los anticuerpos en suero para el antígeno de influenza (como se describe en la FIGURA 25) en comparación con anticuerpos aumentados por administración intramuscular del antígeno. La FIGURA 27 muestra la supresión de la respuesta inmune mediante cantidades altas de antígeno presente en un dispositivo de la presente invención. La FIGUR 28 demuestra la utilidad del dispositivo de la presente invención para la inmunización con DNA plásmido. La FIGURA 29-31 demuestra la utilidad del dispositivo de la presente invención para generar una respuesta inmune a un antígeno polisacárido. La FIGURA 32 representa la utilidad del dispositivo de la presente invención para producir una respuesta inmune a un antígeno altamente conservado y así deficientemente inmunogénico, ciclofilina.

La FIGURA 33 muestra la utilidad del dispositivo de la presente invención para producir una respuesta inmune a un antígeno parásito utilizando animales completos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención ofrece un método para modular, en un mamífero, una respuesta inmune a un antígeno, utilizando un dispositivo que puede ser implantado, el cual expone el antígeno en un modo controlado a las células del sistema inmune. Al crear un ambiente artificial que imite la composición y función del ganglio linfático, y manipulando la biodisponibilidad del antígeno dentro del dispositivo, es posible inducir una respuesta robusta contra un antígeno, o es posible disminuir una respuesta inmune existente. El dispositivo consiste en una matriz porosa, es decir, un material tipo esponja, rodeado por o contenido dentro de un revestimiento o barrera perforada, pero de otro modo impermeable, en la presente denominado un recipiente. El recipiente perforado actúa como una barrera de difusión para mantener altas concentraciones de los productos de secreción de las células inmunes dentro del dispositivo. El antígeno para el cual se va a aumentar o disminuir una respuesta inmune está presente dentro de la matriz porosa del dispositivo, antes o después de que el dispositivo sea insertado bajo la piel. Para inducir una respuesta inmune robusta, el antígeno de preferencia es biodisponible dentro de la matriz del dispositivo aproximadamente tres días después de que el dispositivo es insertado. Esto se puede lograr inyectando el antígeno en el dispositivo aproximadamente en este tiempo, o utilizando un dispositivo en donde la matriz contenga una forma de liberación retardada del antígeno, la cual después de aproximadamente tres días se vuelve biodisponible. Para disminuir o suprimir la respuesta inmune a un antígeno particular, y dependiendo del antígeno particular, el antígeno completamente biodisponible de preferencia se proporciona dentro del dispositivo antes de que éste sea implantado dentro del mamífero. En el caso donde el antígeno se coloca dentro del dispositivo después de que el dispositivo ha sido implantado, el antígeno puede ser introducido en el dispositivo por vía transdérmica utilizando una jeringa y aguja hipodérmica, identificando el lugar del dispositivo, e insertando la aguja en el dispositivo. El dispositivo puede quedarse en el lugar o ser separado del cuerpo. Este puede ser fabricado de materiales biodegradables que finalmente se desintegrarán dentro del cuerpo, o puede ser separado después de que ha logrado su efecto deseado. El antígeno puede ser reintroducido a un dispositivo en un tiempo posterior. El antígeno puede ser utilizando dentro del dispositivo sólo o con un coadyuvante, o una combinación de coadyuvantes. De preferencia, no se utiliza coadyuvante. La presente invención ofrece mejoramientos a muchas formas de inmunoterapia, en donde se desarrolla o incrementa una respuesta inmune deseable contra un antígeno, y, por el contrario, en donde una respuesta inmune existente o el potencial para desarrollar una respuesta inmune contra un antígeno particular pueden ser suprimidos o bloqueados, respectivamente. Estos incluyen vacunación, como puede ser vacunar a los mamíferos sanos contra antígenos específicos, y procedimientos de vacunación terapéutica. El bloqueo o supresión de la respuesta inmune puede ser aplicado a un mamífero antes de encontrar el antígeno específico, como puede ser un recipiente de trasplante futuro, un mamífero anticipado para estar expuesto a un alérgeno o alguien predispuesto a desarrollar una respuesta inmune a un antígeno exógeno o endógeno, como pueden ser las enfermedades auto inmunes. La supresión de una respuesta inmune puede ser útil después de la exposición al antígeno, como puede ser un mamífero, con una respuesta alérgica o anafiláctica a un antígeno, o alguien que presenta rechazo de un. trasplante. Los métodos y dispositivos de la presente invención se dirigen hacia todas las formas de inmunidad, incluida la inmunidad celular, humoral y mucosa. La configuración del dispositivo y su método de uso estimulan la estructura y función del tejido linfático de mamífero y, particularmente, un ganglio linfático. En cl cuerpo, los antígenos extraños introducidos son tomados y procesados por las células que presentan antigeno, macrofagos y células dendríticas,- las cuales entran a los ganglios linfáticos y presentan péptidos inmunogénicos derivados del antígeno en una conformación particular con antígenos MHC a los linfocitos T. Una subserie especial de células T (CD4-Th2) proporciona ayuda para células B y soporta el desarrollo de respuesta humoral con alta afinidad. Las células B pueden interactuar con el antígeno directamente (en especial con antígenos de múltiples unidades o antígenos recordadores) y diferenciarse en células plasmáticas que secretan anticuerpos específicos para el antígeno inmunizante. Las células presentadoras de antígeno también liberan citocinas, linfocinas y quimiocinas que co-precipitan durante el desarrollo de la respuesta inmune. El componente recipiente perforado del dispositivo mantiene una barrera de difusión que conserva las concentraciones del antígeno y los productos dc secreción de las células inmunes, como las citocinas, dentro del dispositivo y en proximidad de las células inmunes dentro del dispositivo. Las perforaciones limitan la difusión de estas moléculas del dispositivo pero permiten el libre ingreso y egreso de células inmunes y otras hacia y fuera del dispositivo. Cantidades muy pequeñas de antígeno han sido encontradas adecuadas para inducir una respuesta inmune robusta. La interacción entre el antígeno presente dentro del dispositivo y las células inmunes y moléculas co-cstimuladoras dentro del dispositivo de este modo se optimiza para mejorar el desarrollo de la respuesta inmune al antígeno, así como impartiendo inmunidad de largo plazo mediante la producción dc una población de células de memoria. La implantación del dispositivo de la presente invención en el cuerpo de mamífero inicia lo que se denomina un absceso estéril, en el cual ciertas células del sistema inmune son atraídas hacia el cuerpo extraño y entran a través del número limitado de perforaciones. Durante los primeros días, una población celular creciente se acumula dentro del dispositivo, aún en ausencia de cualquier antígeno. Con la biodisponibilidad del antígeno en el dispositivo en aproximadamente el día 3, y el encuentro del antígeno por las células del sistema inmune presentes dentro de la matriz, cl antígeno es captado y procesado por las células presentadoras de antígeno y presentado a los linfocitos T. En vista dc que el dispositivo tiene exposición limitada al exterior por medio del recipiente perforado, las células inmunes pueden entrar, pero el antígeno es retenido dentro del dispositivo y su concentración sigue siendo alta, como las concentraciones de los actores co-estimulantes secretados por la población de células dentro del dispositivo, muy parecido al modo dentro de un ganglio linfático. Después de que los linfocitos T quedan cebados e inactivados, estos pueden salir del dispositivo a través del número limitado de perforaciones y volver a entrar a la circulación. Así pues, el dispositivo ofrece un medio para controlar la exposición del antígeno a las células del sistema inmune y mantener las concentraciones de las citocmas y otros factores necesarios para el desarrollo de la respuesta inmune robusta. Como se observará en los ejemplos siguientes, el dispositivo proporciona un mejoramiento de varios ordenes de magnitud en el desarrollo de una respuesta inmune a un antígeno particular. En otra consideración teórica, la implantación de un dispositivo de la presente invención que contiene una gran cantidad de un antígeno particular, puede funcionar en un modo opuesto como el descrito antes, en cuanto a que puede disminuir o suprimir una respuesta inmune existente o potencial al antígeno. La exposición de las células T al antígeno en exceso aparentemente inicia la apoptosis de las células T específicas del antígeno, eliminando así las células T específicas del antígeno y las progenitoras, suprimiendo eficazmente la respuesta celular y también la respuesta humoral dirigidas hacia el antígeno. La hiperactivación de las células B mediada por la adición de las citocinas (como pueden ser IL-2, IL-4, ?-IFN, IL-12) al antígeno estimula o expone las células T al estímulo antigénico adicional cuando se encuentra en un estado refractario (es decir, antes de que descienda el estado de activación) activará la apoptosis de las células y la deleción de los clones reactivos (células B ó T) del repertorio específico- del antígeno. La selección dc la concentración adecuada de un antígeno específico para lograr la estimulación o la supresión de la respuesta inmune utilizando un dispositivo de la presente invención será conocida o fácilmente determinada por el experto. La inmunogenicidad de un antígeno particular y, por tanto, los intervalos de sus dosis inmunosupresivas e inmunoestimuladoras de un antígeno específico pueden determinarse mediante los métodos in vitro o in vivo conocidos en la técnica. Además, la respuesta inmune mejorada que se logra mediante el uso del dispositivo de la presente invención excede la que puede obtenerse con los métodos dc inmunización tradicionales que por lo común, en el caso de los animales, incluye el uso de coadyuvantes. En teoría, la exposición controlada del antígeno solo a las células inmunes y sus factores co-estimuladores dentro del dispositivo parece proporcionar un- ambiente óptimo para obtener una respuesta inmune robusta, que sea superior a la que se puede obtener mediante el uso de coadyuvantes. La inmunización ofrece un método eficaz para la profilaxis contra diversos agentes de enfermedades infecciosas, "como virus: influenza, VIH, papiloma, hepatitis, citomegalovirus, polio y rabias; bacterias, por ejemplo E. coli , Pseudomonas , Shigella , sífilis, micobacteria, Clamydia, ricketsias y Serra tia marcescens; hongos, por ejemplo Aspergill us y Candida; y protozoarios y parásitos multicelulares, por ejemplo Schi s tosoma , Plasmodi um, Onchocerca , y amibas. La inmunización también ofrece el uso potencial de una vacuna terapéutica para tratar a un individuo que ya sufre de una enfermedad infecciosa. Además, las enfermedades no infecciosas pueden ser prevenidas o tratadas por inmunización, como el cáncer. No obstante, muchos antígenos son débilmente inmunogénicos, y la inmunización no ha demostrado ser una estrategia adecuada para la prevención o tratamiento de estas enfermedades. Los coadyuvantes, como son los utilizados dc manera habitual con inmunizaciones animales, no están a la disposición para incrementar la respuesta inmune. Además, el sistema inmune de un individuo o paciente puede no estar funcionando de manera óptima para producir una respuesta inmune a un antígeno que de otro modo produciría una respuesta inmune robusta en un individuo de otro modo sano. Estas situaciones ofrecen la oportunidad al dispositivo de la presente invención para estimular una respuesta inmune robusta donde tal respuesta no sería posible por los procedimientos de inmunización tradicionales.

La supresión de la respuesta inmune también puede ser deseable para tratar ciertos padecimientos, como son alergias, o para preparar a los pacientes para la exposición a antigenos extraños, como puede ser para trasplantes. Se considera que las respuestas inmunes inadecuadas tienen origen en diferentes enfermedades autoinmunes y otras, como diabetes tipo I, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, uveitis, lupus eritematoso sistémico, miastenia gravis y enfermedad de Grave. Al implantar en un individuo un dispositivo de la presente invención que contenga el antígeno sospechado, la entrada de las células cebadas para reconocer el antígeno puede ser intudica para sufrir apoptosis, y eliminadas del sistema inmune. La eliminación de las células específicas del antígeno, progenitoras, puede permitir el trasplante posterior de antígenos extraños sin rechazo. Otras utilidades de la presente invención incluyen los mejoramientos en la producción de anticuerpos policlonales (suero inmune) y anticuerpos monoclonales en animales de laboratorio y obtener el isotipo deseado del anticuerpo así generado. En una modalidad, un procedimiento para preparar anticuerpos policlonales (suero inmune) y monoclonales contra un antígeno disponible solo en cantidades muy pequeñas puede realizarse mediante el dispositivo de la presente invención. El dispositivo puede ser proporcionado con una pequeña cantidad del antígeno extraño, para inmunizar al animal, después de lo -cual es posible cosechar las células esplénicas. Este procedimiento ofrece un mejoramiento sobre el método tedioso e impredecible actual de introducir el antígeno extraño directamente al bazo. Además, la necesidad de una inmunización de refuerzo puede obviarse mediante el uso del dispositivo de la presente invención y, además, se generará una respuesta inmune con mayor rapidez. Un tiempo más corto necesario para inmunizar animales permitirá la producción de anticuerpos monoclonales con mayor rapidez. En otra modalidad, las células inmunes para la producción de hibridomas pueden ser cosechadas del dispositivo después de la inmunización de un animal con un antígeno que se haya introducido dentro del dispositivo. Este procedimiento también puede utilizarse para generar anticuerpos, monoclonales humanos, implantando un dispositivo de la presente invención en un individuo, cargando el dispositivo con el antígeno y luego cosechando las células inmunes del dispositivo para la producción de hibridomas. Los anticuerpos policlonales antes mencionados (suero inmune y anticuerpos monoclonales pueden ser utilizados para diagnóstico, investigación básica, formación de imágenes y/o terapia. En otra modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos pueden ser generados utilizando el dispositivo de la presente invención implantado en un ratón con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) , mediante el siguiente procedimiento. Primero, se inyecta en un ratón SCID linfocitos de sangre periférica humana, en donde los linfocitos humanos pueblan el sistema inmune de murino. Después de la implantación de un dispositivo de la presente invención que contiene el antígeno deseado, que está disponible en aproximadamente 3 días después de la implantación, la cosecha subsiguiente de las células del dispositivo proporcionará las células linfocitos B humanos que pueden luego ser utilizados para preparar hibridomas que secreten anticuerpos humanos contra el antígeno deseado. Otra utilidad del dispositivo de la presente invención es en la recolección de células inmunes a partir de un mamífero para posterior reintroducción en el mamífero. Las células pueden ser separadas del dispositivo, por ejemplo, por aspiración del dispositivo implantado o recolección del dispositivo después de separarlo del cuerpo disolviendo la matriz polimérica, el almacenamiento subsiguiente de las células, por ejemplo por criopreservación y reintroducción en el mamífero en un tiempo posterior. Esto puede ser particularmente útil para mamíferos que son sometidos a terapia de radiación en todo el cuerpo. Un dispositivo de la presente invención, sin contener antígeno, puede ser implantado y mantenerse durante 7 a 10 días, y posteriormente el dispositivo o su contenido puede ser separado y las células contenidas en el criopreservadas.

Después de terapia de radiación, el mamífero puede tener las células reintroducidas en el cuerpo, con lo cual las células reconstituirán el sistema inmune. En otra modalidad de esta utilidad, factores oo-estimuladores como citocinas que inducen la proliferación de células inmunes pueden ser introducidos en el dispositivo para aumentar la producción de células dentro del dispositivo, antes de la cosecha. En otra modalidad, las células inmunes recolectadas de un dispositivo proporcionado con antígeno pueden ser utilizadas para inmunización activa, en donde las células pueden ser almacenadas y luego reintroducidas en el mamífero después de, por ejemplo, un curso de quimioterapia u otra manipulación terapéutica. En todavía otra modalidad, las células recolectadas de un dispositivo pueden ser criopreservadas, y en un tiempo posterior pueden ser expuestas al antígeno (por ejemplo, un antígeno de cáncer) para propagación ex vivo de las células T antes de la introducción al cuerpo, para inmunoterapia adoptiva. En otra utilidad de la presente invención, el dispositivo puede ser utilizado para transfectar células inmunes dentro del dispositivo con genes. Las células inmunes transfectadas pueden luego cebar las células inmunes dentro del dispositivo, y/o después de la migración hacia afuera del dispositivo, pueden cebar células inmunes en órganos distantes. Por ejemplo, el DNA, RNA ó cDNA que codifica para un antígeno específico de tumor o antigeno viral, bacteriano o parásito pueden ser colocados dentro del dispositivo, con o sin el antígeno proteína respectivo. Las células presentadoras de antígeno que ingresan al dispositivo pueden ser transfectadas con el gen, posteriormente expresando la proteína del antígeno y migrando a los sitios periféricos dentro del cuerpo, donde estimularán a las células inmunes. El dispositivo de la presente invención puede ser fabricado por los métodos conocidos por los expertos en la técnica, y el tamaño y forma puede variar, siempre y cuando su configuración le permita funcionar en la forma descrita en la presente. Como ya se describió, el dispositivo ofrece una barrera de difusión para moléculas pequeñas, como puede ser el antígeno introducido en el dispositivo, y citocinas y otros factores secretados por las células inmunes dentro del dispositivo, pero permite el ingreso y la salida de las células inmunes hacia adentro y hacia afuera del dispositivo. Así pues, la difusión pasiva de las proteínas y otras moléculas pequeñas es limitada, pero las células inmunes sufren movimiento activo hacia adentro y hacia afuera del dispositivo. En una modalidad, un dispositivo para inserción conveniente en una incisión pequeña en la piel y posterior separación, si se requiere, puede ser diseñado a partir de un segmento corto de tubo de plástico hueco, biológicamente inerte, como puede ser tubo dc silicona. La matriz polimérica porosa, es decir, un material tipo esponja, se ajusfa en el orificio del tubo. Los extremos abiertos pueden o no estar sellados. En las paredes del. tubo se hace un número pequeño de perforaciones. Las variaciones en la cantidad, forma y tamaño dc las perforaciones están dentro del alcance de la invención. El antígeno puede ser introducido en la forma de una solución o suspensión del antígeno o una forma no biodisponible del antígeno, mediante la incorporación en la matriz durante la fabricación, o inyección en la matriz, a través de un extremo del tubo o a través de la pared del propio tubo. El antígeno puede proporcionarse en la matriz del dispositivo directamente, mencionado en la presente como la forma biodisponible o completamente biodisponible, o puede ser proporcionado en una forma no biodisponible, que posteriormente se haga biodisponible. Es conveniente la incorporación del antígeno en una formulación que proporcione características de liberación controlada, liberación prolongada o liberación retardada; estos procesos y formulaciones pueden incluir microencapsulación, liposomas y microesferas. De preferencia, para el propósito de estimular o incrementar la respuesta inmune al antígeno, el antígeno formulado se hace biodisponible dentro de la matriz del dispositivo aproximadamente tres días después de la implantación. Las formulaciones de' liberación convenientes son conocidas en la técnica. En otra modalidad, es posible preparar un dispositivo a partir de un material -matriz polimérica en la forma deseada del dispositivo final, y aplicar un revestimiento impermeable a la superficie. La perforación puede hacerse posteriormente. De otro modo, una matriz polimerica dc una cierta porosidad y grado de reticulación puede ser extruída en la forma deseada del dispositivo, y luego el exterior tratado con un agente para además reticular el polímero en la superficie del dispositivo para formar eficazmente un revestimiento o recipiente impermeable. El revestimiento después puede ser perforado e introducido el antígeno. El incremento en la polimerización de la superficie del dispositivo. también puede efectuarse por tratamiento ultravioleta superficial si se utiliza polímero curable por luz ultravioleta. Los ejemplos que se proporcionan en la presente no se proponen como limitantes, en vista de que cl experto estará capacitado para diseñar un dispositivo conveniente con las propiedades antes mencionadas. Los materiales que comprenden • el dispositivo pueden seleccionarse de una amplia gama de composiciones naturales o sintéticas convenientes. En una modalidad, la matriz polimérica puede ser un material biológicamente compatible como acetato de polivinil hidroxilado. Otra matriz es poliuretano que se utiliza ampliamente. Otros materiales convenientes incluyen copolímero de etileno/acetato de vinilo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímero de polilacturo-glicol ro, colágena, colágena reticulada y gelatina. Como ya se describió, la obtención de una barrera o revestimiento perforado pero de otro modo impermeable alrededor de la matriz polimérica puede lograrse por diferentes medios. En una modalidad, se colocan segmentos de la matriz polimérica dentro del lumen de un segmento corto de un tubo de plástico biológicamente compatible, como puede ser tubo de silicona. En un ejemplo, un segmento de 2.5 cm de tubo con diámetro interno de 0.15 cm y un diámetro externo de 0.2 cm fue ajustado con un segmento de 2.5 cm correspondientes de matriz de acetato de polivinilo hidroxilado prehumedecida. En otros ejemplos, la barrera o revestimiento puede hacerse de un material natural o sintético conveniente, como puede ser un plástico u otro polímero, como polietileno, colágena reticulada, polietilenoo [sic], silicona, resina de látex, poliestireno, resina acrílica, polivinilpirrolidona y combinaciones dc estos materiales. Un material que esta a la disposición en el comercio es tubo de silicona SILASTIC® de Dow Corning. Estos ejemplos no limitantes son simplemente ejemplares del intervalo de composiciones convenientes útiles para la *• .. presente invención. Como un ejemplo no limitante de la preparación de un dispositivo de la presente invención, y de acuerdo con las características deseadas antes mencionadas del dispositivo que limita la difusión de moléculas pequeñas del dispositivo pero permite el ingreso y salida de células inmunes, cs posible preparar manualmente un dispositivo como sigue. Un tubo de silicona, de 1.125 pulgadas de largo, de diámetro externo 0.047 pulgadas y un radio de 0.0235 pulgadas puede utilizarse como el recipiente impermeable del dispositivo de la presente invención. Los agujeros pueden perforarse manualmente con una aguja hipodérmica calibre 20 a través de la pared del dispositivo, lo cual produce agujeros dc aproximadamente 1/16 y 1/32 de pulgada de diámetro. Se perforan 20 agujeros en el tubo. Estos parámetros solo sirven como una guía para las características del dispositivo, y un experto estará consciente de otros parámetros que lograrán los mismos objetivos como los antes establecidos, es decir, proporcionar ingreso y salida celular no limitada pero limitar y confinar la difusión de moléculas pequeñas, como las citocinas, dentro del dispositivo. Un dispositivo biodegradable de la presente invención puede consistir en una matriz y recipiente de materiales conocidos para degradarse lentamente dentro del cuerpo.

Estos materiales incluyen gelatina, colágena, colágena reticulada, ácido poliláctico, copolímero de polilacturo-glicoluro y otros materiales conocidos por los expertos. Así pues, un dispositivo completamente biodegradable, preferido, para estimular la respuesta inmune puede consistir en un recipiente biodegradable, una matriz biodegradablc y una formulación biodegradable, de liberación retardada del antígeno contenido dentro de la matriz. Esta última formulación libera el antígeno en aproximadamente tres días después de la implantación. La matriz y el recipiente comienzan a biodegradarse significativamente después de la vida útil del dispositivo, aproximadamente 10 días después de la implantación. Es posible realizar las perforaciones en el recipiente del dispositivo por diversos métodos, incluidos los procedimientos manuales y automatizados. Es óptima una cantidad pequeña de perforaciones, de preferencia cerca de 10 por centímetro de tubo, aunque esto dependerá algo del tamaño y forma del dispositivo. De acuerdo con las consideraciones teóricas antes mencionadas, la función de las perforaciones es permitir la entrada de células del sistema inmune al dispositivo las cuales luego entran en contacto con el antígeno y las moléculas co-estimuladoras quedan cebadas, y luego permitir la salida de las células cebadas. Estos objetivos deben lograrse al mismo tiempo que el dispositivo perforado debe contener y mantener las concentraciones deseadas del antígeno y los factores co-estimuladores como citocinas producidas por las células del sistema inmune dentro del dispositivo. Una cantidad y tamaño conveniente de perforaciones logrará estas características, como se ilustra en los ejemplos siguientes. En casos donde se prepara el dispositivo a partir de un segmento de tubo, los extremos del tubo pueden dejarse abiertos para actuar como perforaciones, así como un receptáculo para la introducción de una aguja u otro medio para cargar el antígeno, antes de la implantación o después de la implantación. El dispositivo puede ser implantado en un sitio conveniente en el cuerpo donde se facilite la inserción, la carga del antígeno y la separación puede lograrse con incomodidad mínima para el paciente. Un sitio conveniente cs la superficie media del brazo superior. En otra modalidad, el dispositivo se fabrica de materiales biodegradablcs, en vista de que el dispositivo se degradará después de su vida útil y no necesita ser retirado. Para estimular una respuesta- inmune, el antígeno biodisponible puede estar presente dentro del dispositivo en el momento de la implantación o de preferencia después; si es después, el tiempo de preferencia es aproximadamente tres días después de la implantación. Una formulación no biodegradable del antígeno con características de liberación retardada puede estar presente en el dispositivo en el momento de la implantación la cual libera el antígeno en la matriz del dispositivo- aproximadamente tres días después de la implantación. Después de aproximadamente tres días, un número suficiente y tipos de células capaces de responder a la presencia del antígeno están presentes dentro del dispositivo, junto con concentraciones de citocinas y otras moléculas co-estimuladoras secretadas de estas células y mantenidas dentro del dispositivo como resultado de la barrera de difusión producida por el recipiente perforado, y la subsiguiente introducción de antígeno al dispositivo inicia del desarrollo de una respuesta inmune óptima. El dispositivo, si no se construye de materiales biodegradables como ya se describió, puede ser retirado por un procedimiento quirúrgico sencillo después de que ha alcanzado su función deseada. En general, aproximadamente después de 10 días, la población de células inmunes ha salido del dispositivo y éste ya no es funcional. Por otra parte, el dispositivo puede ser rellenado con antígeno en una fecha posterior para reforzar la respuesta inmune. Como ya se describió, para obtener la estimulación o supresión deseadas de la respuesta inmune, el tiempo de la biodisponibilidad del antígeno dentro de la matriz del dispositivo es importante, y depende de las características del antígeno específico. En general, una concentración grande de antígeno completamente biodisponible presente en el momento de la implantación tendrá el efecto dc suprimir la respuesta inmune al antígeno. Asimismo, on general, una cantidad pequeña de antígeno completamente biodisponiblc aproximadamente tres días después de la implantación del dispositivo tendrá el efecto de estimular la respuesta inmune. Estas condiciones pueden variar sin perjuicio de la utilidad de la invención, dependiendo de las características del antígeno específico que ha de utilizarse en el dispositivo. Los expertos podrán evaluar la inmunogenicidad del antígeno específico, mediante métodos normales in vitro o in vivo, y determinar la concentración adecuada del antígeno para obtener el efecto deseado. El método de uso del dispositivo de la presente invención para mejorar o estimular la respuesta inmune a un antígeno se propone para producir una población de células inmunes, linfocitos T y B, que montarán una respuesta inmune eficaz contra el antígeno utilizado en el dispositivo. Otro objetivo de la presente invención es disminuir la respuesta inmune contra un antígeno específico utilizando el método y dispositivo antes mencionados. Al incorporar dosis altas de un antígeno en el dispositivo, las células inmunes que entran al dispositivo y encuentran al antígeno pueden ser inducidas para sufrir apoptosis. Las condiciones como ». rechazo de injerto y de trasplante pueden evitarse o ser tratadas si el recipiente, antes o después del trasplante, esta provisto con un dispositivo de la presente invención conteniendo antígeno donador. Las condiciones generales que se pueden manejar para una disminución de la respuesta inmune incluyen: trasplante, en el cual se desea hacer tolerante al recipiente con células sanguíneas del donador para disminuir la respuesta inmune del recipiente al injerto del donador; enfermedades auto inmunes, en las cuales es deseable la tolerancia a los auto antígenos para disminuir las células T patógenas y aminorar la formación dc complejos inmunes con antígenos endógenos, como puede ser colágena en artritis reumatoide; diabetes, en la cual se desea hacer tolerantes a los pacientes diabéticos a la insulina o GAD; y miastenia gravis, en la cual los pacientes pueden hacerse tolerantes para evitar una respuesta inmune contra el receptor de acetilcolina. Además, la respuesta inmune que caracteriza las alergias y las reacciones alérgicas pueden ser tratadas haciendo tolerante o desenbilizando al paciente al alérgeno induciendo apoptosis en las células inmunes responsables de la respuesta inmune. Los ejemplos de las alergias y antígenos que pueden ser utilizados en el dispositivo de la presente invención para suprimir la respuesta inmune incluyen: el alérgeno DERP-1 de alergia a los gatos, y alergias a hiedra venenosa/roble causadas por los péptidos modificados con urushiol. Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar más completamente las modalidades preferidas dc la invención. Estos no deben ser- considerados, no obstante, como limitantes del amplio alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Un ejemplo del dispositivo de la presente invención fue preparado utilizando un tubo de silicona de 2.5 cm de largo con un diámetro interno de 0.15 cm y un diámetro externo de 0.2 cm, ajustado con un segmento de 2.5 cm de largo de esponja de acetato de polivinilo hidroxilada. El dispositivo fue sumergido en un recipiente que contenía salina amortiguada con fosfatos y sometido a autoclave para esterilización. Ratones hembra BALB/c (6-8 semanas de nacidas) fueron anestesiadas con Avertin. El dispositivo fue insertado a través de una incisión en la línea media dorsal de 0.5 cm en el día 1. En algunos animales, 50 µl de antígeno de influenza 1 mg/ml (FLUSHIELD® vacuna de virus de influenza) trivalente, tipos A & B; obtenido de Henry Schein®, Melville NY) fue introducido en el dispositivo en el día 2 posterior a la implantación, insertando una aguja hipodérmica a través de la piel cerca del dispositivo implantado y luego guiando mediante el tacto la aguja hasta un extremo del dispositivo.

Mediante el uso de una aguja hipodérmica, el fluido fue aspirado de los dispositivos implantados de cada uno de los cinco animales los días 2, 4, 7 y 9 después del implante, y luego las células en los fluidos fueron combinadas, lavadas y contadas. Como se muestra en la Figura 1, en animales implantados con dispositivos no provistos con antígeno, la población de células comenzó a elevarse el día 4 y tuvo un máximo el día 7. Por el día 9, el número decreciente de células en el dispositivo indica que las células que habían migrado al dispositivo estaban migrando fuera del dispositivo y hacia la periferia. Cuando se adicionó antígeno de influenza al dispositivo durante el día 2 posterior a la implantación, el número de células presentes en el dispositivo en el día 4 posterior a la implantación fue varias veces mayor, 225,000, en comparación con 60,000 células en los dispositivos sin antígeno. Así pues, la presencia del antígeno dentro del dispositivo aumentó el reclutamiento de células dentro del dispositivo y/o activó la proliferación de las células dentro del dispositivo.

EJEMPLO 2 Los números y fenotipos de células presentes en el dispositivo sin antígeno adicionado fueron determinados en este experimento, utilizando ratones BALB/c. En los días 4 posteriores a la implantación de un dispositivo como se describió en el Ejemplo 1, las células de cada uno de los cinco animales fueron aspiradas de los dispositivos, combinadas, lavadas y divididas en varios tubos. Fueron adicionados anticuerpos monoclonales marcados con isotiocianato- ó ficoeritrin-fluoresceína específicos para los siguientes marcadores (CD14, CD54/220, CDllb, CD40, CDllc, CD80, CD86, CD62P, CD62E, CD3 y I-Ad) , y después de la incubación durante '30-45 minutos a 4°C, las células fueron lavadas y se determinó el promedio geométrico de la fluorescencia por citometría de flujo. Para comparación, los linfocitos de sangre periférica de ratones singénicos, no manipulados, utilizando el mismo arreglo de anticuerpos específicos, fue determinada, y los resultados para cada anticuerpo fue expresado como el porcentaje de incremento en la fluorescencia de las células del dispositivo sobre las dc linfocitos de sangre periférica. La Figura 2 representa el fenotipo de las células extraídas del dispositivo cuatro días posteriores a la inserción. La migración y acumulación de las células T (CD3, CD40), macrofagos (CD14, CDllb, MHC clase II, CD80) células dendríticas (CD40, CDllc, MHC clase -II, CD80) y células B (MHC clase II, CD45/B220, CDllb) en alta densidad fueron evidentes en el dispositivo.

EJEMPLO 3 Los cambios en la población celular dentro del dispositivo descritos en el Ejemplo 1 con el tiempo fueron evaluados cosechando células del dispositivo los días 3, 7 y 10 después de la implantación. En el primer experimento, no fue proporcionado antígeno dentro del dispositivo. Las células aspiradas de los dispositivos implantados en cinco ratones en cada punto de tiempo fueron combinadas, y la densidad de las células que portaban marcadores CD3, CD8, CD80, CD44, CDllc, CD45R/B220 y CD14 fueron determinadas siguiendo el mismo procedimiento que se describió en el Ejemplo 2, expresando los valores como por ciento de incremento sobre linfocitos de sangre periférica de ratones sin manipulación. La Figura 3 muestra la densidad de los fenotipos de células enumeradas en los días 3, 7 y 10 posteriores a la implantación. Para todos los marcadores, el enriquecimiento del tipo de células en el dispositivo fue evidente en los días 3 y 7, y por el día 10, la población había migrado fuera del dispositivo.

EJEMPLO 4 En un segundo experimento establecido exactamente igual que el anterior, se proporcionó antígeno de influenza dentro del dispositivo el día 2 posterior a la implantación. Como se muestra en la Figura 4, la densidad de las células T y las células presentadoras de antígeno (CD3, CD80 ó CD14) fue además aumentada por la presencia de antígeno on el dispositivo y, además, -dio origen a la persistencia de estos tres tipos de células en el día 10. La adición de antígeno pudo haber retardado la salida de las células inmunes del dispositivo.

EJEMPLO 5 El efecto distante de la implantación del dispositivo proporcionado con antígeno de influenza fue evaluado midiendo el cambio en la expresión de las células T CD4 y CD8 en los bazos de animales implantados. Se siguieron los métodos como los ya descritos, y los fenotipos dc células T fueron determinados por el método del Ejemplo 2. Los dispositivos fueron provistos con 0, 5, 10 ó 50 µg de vacuna de influenza dos días después de la implantación, y los bazos fueron cosechados de los animales 10 días después de la inmunización (12 días después de la implantación) . Las células esplénicas fueron aisladas desmenuzando ligeramente los bazos entre los lados ásperos de -portaobjetos de vidrio. Las células fueron lavadas con PBS y los eritrocitos fueron depletados mediante cinco minutos de incubación en Red Cell Lysis Buffer (Sigma) . La fluorescencia de CD4 y CD8 fue determinada por citometría de flujo como ya se describió.

Como control, se siguió un protocolo de inmunización normal, tradicional, en el cual los ratones fueron inyectados con la misma cantidad de antígeno de influenza en la almohadilla de la pata, junto con coadyuvante Ribi R-700, una emulsión que contenía monofosforil lípido A y dicrinomicolato de trealosa sintético (MPLA + TDM) , fabricados por Ribi ImmunoChem Research, Inc. Los ratones control también fueron sangrados 10 días después dé la inmunización. Como se muestra en la Figura 5, las células T obtenidas de células esplénicas de ratones implantados con el dispositivo presentaron incremento en la densidad de las moléculas CD4 y CD8 después de cargar el dispositivo con antígeno de influenza. Los niveles de células T citotóxicas (CD8) en los bazos de animales inmunizados por los métodos tradicionales, con 50 µg de antígeno más coadyuvante fueron equivalentes a los inducidos por 10 µg de antígeno en un dispositivo de la presente invención. Además, el dispositivo sin antigeno también mostró una expansión de células CD8 en el bazo, como resultado de la inflamación estéril inducida por el dispositivo. Vale la pena señalar que en animales implantados con dispositivos de la presente invención provistos con 50 µg de antígeno (la misma cantidad que la inoculada a través de la almohadilla de la pata con coadyuvante en los animales control) mostró una pérdida de expresión de las células CD8 en el bazo. Una explicación es que la administración de una dosis alta de antígeno en el dispositivo dio origen a apoptosis de las células específicas del antígeno. El ejercicio del estímulo extremadamente fuerte pudo haber procedido para activar un efecto de fruncimiento y su resultado final fue la eliminación de todas las células T CD4+ , CD8+ del bazo de los ratones tratados. Esto tiene aplicación en la disminución deseada de la respuesta inmune en casos en los que es perjudicial una respuesta inmune, por ejemplo en el rechazo de trasplante. La explicación de la eficiencia incrementada de la inmunización utilizando el dispositivo de la presente invención se presume que es la cantidad de antígeno que realmente llega a los ganglios linfáticos de un animal después de la inyección del antígeno en un sitio periférico es muchos logs menor que la que se da en la inmunización. Así pues, la dosis óptima para la inmunización utilizando el dispositivo de la presente invención para producir una respuesta inmune positiva se espera que sea substancialmente menor (es decir varios logs menor) que la dosis utilizada en la inmunización tradicional.

EJEMPLO 6 La intensidad de la respuesta inmune al antígeno de influenza proporcionada en el dispositivo de la presente invención fue evaluada utilizando ' secreción de interferón gamma de las células T esplénicas como marcador. La secreción del interferón gamma es uno de los atributos principales de la respuesta de las células T citotóxicas tipo Thl y CD8, conocidas por ser el brazo protector contra patógenos intracelulares y cáncer. Los ratones fueron implantados con dispositivos antes descritos y se proporcionó 5 µg de vacuna de influenza en los días 3 después de la implantación. El grupo control fue inmunizado en la almohadilla de la pata con 50 µg de antígeno más coadyuvante Ribi. 10 días después de la inmunización, las células esplénicas fueron aisladas como en el ejemplo anterior, plaqueadas y se midió la producción de interferón gamma utilizando el kit ELISA (Endogen) después de la estimulación con una serie de concentraciones de antígeno (1.4 a 180 µg/ml) La Figura 6 muestra que la inmunización de los animales con 5 µg de antígeno en un dispositivo de la presente invención produce el mismo nivel de activación de células T producido por una inmunización de 50 µg, con coadyuvante, en la almohadilla de la pata. Así, se puede lograr una fuerte respuesta inmune sin el uso de coadyuvante utilizando el dispositivo de la presente invención, y con una cantidad mucho menor de antígeno. La secreción de interferón gamma de las células T obtenidas de los ganglios linfáticos poplíteos de los mismos animales fue evaluada, después de la exposición de las células T aisladas a un intervalo similar de concentraciones del antígeno. Como se muestra en la Figura 7, la secreción de interferón gamma - por las células T de animales inmunizados con antígeno más coadyuvante en la almohadilla de la pata no fue tan robusta como la producida a partir de las células T esplénicas de animales inmunizados utilizando el dispositivo de la presente invención (comparar con la Figura 6) . En vista de que los ganglios linfáticos poplíteos son aquellos que drenan el área de la almohadilla de la pata y de este modo se espera que sean cebados por la presencia de antígeno, este resultado además muestra la eficacia con la cual el dispositivo de la presente invención puede utilizarse para producir una respuesta inmune robusta sin la necesidad de coadyuvante. En otra evaluación, la población de células remanente en un dispositivo (habiendo sido proporcionado con antígeno el día 3) , 10 días después de la implantación fue evaluada para secreción de interferón gamma en respuesta a la exposición al antígeno. La Figura 8 muestra que se secreta una muy baja concentración de interferón gamma en respuesta a un- desafío in vitro con antígeno de influenza en comparación con la concentración de respuesta registrada con células esplénicas. Este resultado implica que las células efectoras cebadas por inmunización intra dispositivo migraron hacia afuera del sitio en el día *. (cuando se tomó el aspirado del dispositivo) la mayor parte de la población efectora fue depletada. Las Figuras 1 y 3 representan la pérdida de células con el fenotipo de células B y T del dispositivo por el día 9 y 10, confirmando la posibilidad de su egreso a los órganos periféricos.

EJEMPLO 7 En otro experimento dirigido a examinar específicamente la intensidad de la respuesta inmune al antígeno inducida por el dispositivo de la presente invención, después de la implantación y carga del dispositivo con antígeno, se realizó un ensayo de proliferación de células esplénicas. Se siguió el mismo protocolo como el descrito en los ejemplos anteriores. El antígeno en este experimento fue ovalbumina; los dispositivos fueron proporcionados con diferentes cantidades de ovalbumina en el intervalo desde 10 pg a 50 µg; los animales control fueron inmunizados por inyección en la almohadilla de la pata con la misma cantidad de antígeno, más coadyuvante Ribi . 10 días después de la implantación, los ratones fueron sacrificados y retirados los bazos. En placas de 96 pozos se estableció un ensayo de proliferación. 200 mil células esplénicas por pozo fueron expuestas a 180 µg/ml de antígeno durante 72 horas a 37°C; como controles se utilizó la misma dosis de antígeno del virus Epstein-Barr . Después de la exposición al antígeno o control, las células fueron pulsadas durante 6 horas con "H-timidina, y se midió la incorporación de la marca y se expresó como índice dc estimulación. La Figura 9 muestra la inmunización do los ratones utilizando el dispositivo proporcionado con ovalbumina dio origen a una respuesta robusta proliferativa de células esplénicas específicas del antígeno. Se detectó una respuesta en animales inmunizados con picogramos de antígeno. Las células esplénicas de los animales inmunizados por los métodos tradicionales con coadyuvante produjeron una respuesta proliferativa solo a 5 a 7 logs mayor de la concentración del antígeno. Niveles insignificantes de estimulación al antígeno control (virus de Epstein-Barr) (no se muestran los datos) indican que la producción de la respuesta inmune a ovalbumina fue altamente específica. En otro experimento utilizando ovalbumina como antígeno, los ratones fueron inmunizados utilizando el dispositivo dc la invención o por la almohadilla de la pata, con 50 µg, 50 ng, ó 50 pg de ovalbumina, sola en el dispositivo, con coadyuvante BCG en el dispositivo o por la almohadilla de la pata con coadyuvante Ribi. El coadyuvante BCG (bacilo de Calmette Guerin) utilizado en estos experimentos, Theracys (R) , es una suspensión liofilizada de una cepa atenuada de Mycobacteri um bovis, preparada por Connaught Laboratories Limited para tratamiento de carcinoma in situ de la vejiga urinaria. 10 días después de la inmunización, las células esplénicas fueron cosechadas y expuestas a diferentes concentraciones de antígeno (1.4 a 180 µg/ml) o al mismo intervalo de un antígeno control, virus Epstcin-Barr, in vitro. Después de una incubación de 72 horas, las células fueron pulsadas con H-timidína durante 6 horas, y la incorporación de la marca fue expresada como un índice de estimulación y utilizada como medida de la estimulación y proliferación de las células T. La Figura 10 muestra que se puede obtener una respuesta robusta de las células T específicas del antígeno a partir de dosis bajas del antígeno utilizando el dispositivo dc la presente invención. Niveles de estimulación insignificantes fueron detectados después de que las células esplénicas fueron expuestas al antígeno control, indicando además que la respuesta fue específica para el inmunógeno.

EJEMPLO 8 La respuesta del anticuerpo específico del antígeno contra el antígeno péptido gpl20 de - VIH (residuos 315-322, RIQRGPGRAFVTIGK) fue evaluada después de cargar dosis muy bajas en los dispositivos de la presente invención. Ratones BALB/c fueron inmunizados con el dispositivo o por la almohadilla de la pata, con coadyuvante Ribi, con diferentes dosis de péptido VIH. La sangre ' fue recolectada 10 días después de la inmunización, y el título de anticuerpos contra el péptido fue determinado. Cuatro días después, los animales fueron reforzados con 10% de la cantidad del inmunógeno inicial, y se realizó un segundo sangrado 10 días después para la determinación del título de anticuerpos. Se utilizó ELISA para medir el anticuerpo IgG2a dc la subclase específica del antígeno, y se realizó de acuerdo con un procedimiento de rutina. En resumen, las placas dc microtitulación fueron revestidas con el antígeno (1 g/ml) de salina amortiguada con fosfatos, durante 16 horas a 4°C. Las placas fueron lavadas (Tris 50 mM + 0.2° Tween-20 en PBS, pH 7-7.5) y bloqueadas con buffer de bloqueo (solución al 5% de BSA + 0.1% Tween 20 en PBS, pH 7.2-7.4) a 4°C durante 16 horas. Las placas se lavan y 100 1 [sic] de muestras de suero se adicionan a los pozos comenzando desde la dilución 1:50 y además diluidas con pasos triples. Las muestras se prueban en duplicado. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavan como en lo anterior y se adiciona a los pozos solución de anticuerpo IgG2a anti-ratón biotinilado (1 µg/ml). Después de una hora de incubación y lavados extensos como en lo anterior, se adiciona a los pozos peroxidasa de rábano conjugada con estreptavidina, diluida 1:4000 en buffer do bloqueo. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, se adiciona el sustrato (100 1/pozo [sic] de tetrametilbencidina) . Las placas se incuban durante 30 minutos. La adición de 100 1/pozo [sic] de H2SO4 2N interrumpe la reacción. Las placas se leen utilizando el lector dc placas para ELISA a una longitud de onda de 450 nm. La Figura 11 muestra el nivel de la IgG2a del peptido GP120 anti-VIH específico e indica que después de la única inmunización utilizando el dispositivo de la presente invención, se produce un anticuerpo específico de antígeno (IgG2a) fuerte, mientras que no se produce respuesta mediante una sola inmunización en la almohadilla de la pata siguiendo un protocolo tradicional. Después de una segunda inmunización (refuerzo) en la almohadilla de la pata, sc genera una respuesta de anticuerpos en animales inmunizados de manera tradicional, pero los animales inicialmentc inmunizados utilizando el dispositivo de la presente invención y luego reforzados (con 10% de la dosis original administrada dentro del dispositivo) mostraron aumento en los niveles de IgG2a y todavía una respuesta mucho más robusta a los niveles menores del antígeno (Figura 12) .

EJEMPLO 9 El efecto de los diferentes coadyuvantes fue evaluado en las respuestas inmunes resultantes generadas a partir de la inmunización con el dispositivo de la presente invención en *. .. comparación con la inmunización en la almohadilla de la pata, tradicional. Los ratones BALB/c fueron inmunizados con el dispositivo o por medio de la almohadilla de la pata, con el péptido gpl20 de VIH (del ejemplo anterior) a diferentes dosis solo o con coadyuvantes Ribi ó BCG, como ya sc describió. El dispositivo fue provisto con inmunógeno tres días después de la implantación, y se determinaron los títulos de anticuerpos 10 días después de la inmunización. Un ensayo ELISA para el anticuerpo IgG2a específico para el antígeno péptido gpl20 fue realizado como se describe en el Ejemplo anterior. La inmunización tradicional con los coadyuvantes Ribi ó BCG produjo un nivel menor de IgG2a específico del peptido (Figura 13) . Por el contrario. La inmunización utilizando cl dispositivo de la presente invención sin coadyuvante (50 ng de péptido) produjo un nivel notablemente mayor de IgG2a específico del péptido. El péptido, en combinación con cl coadyuvante (Ribi ó BCG) produce una respuesta baja. Estos datos implican que la adición de un coadyuvante a un estímulo antigénico ya fuerte da origen a depresión de la respuesta inmune. Es posible que para demostrar el efecto aditivo o sinergismo del coadyuvante y el antígeno, los protocolos de inmunización deben ser probados a intervalos menores (menores que las dosis femtogramos) del antígeno así como concentraciones menores de los coadyuvantes.

Se observaron resultados similares cuando sc probó cl péptido 15-mero de la glucoproteína B del virus del herpes si plex (residuos 497-507: TSSIEFARLQF) .

EJEMPLO 10 En otra prueba de la intensidad de la respuesta inmune humoral inducida por un antígeno presente en el dispositivo de la presente invención, ratones BALB/c fueron implantados con dispositivos a los cuales tres días después se les introdujo diferentes dosis de citocromo C. Como controles, diferentes dosis del mismo antígeno fueron administradas a través de la almohadilla de la pata en combinación con coadyuvante Ribi. 10 días después posteriores a la implantación ó 10 días después posteriores a la inoculación en la almohadilla de la pata, los animales fueron sangrados y se realizó una prueba ELISA en suero para IgG2a que específicamente reconoce el antígeno. Los procedimientos fueron similares a los que se siguieron en el ejemplo anterior, salvo que se realizó la prueba ELISA en diluciones en serie del suero, a partir de 1:50 a 1:6400. La Figura 14 muestra que se obtuvo una respuesta inmune humoral específica, muy intensa al antígeno con dosis muy bajas del antígeno utilizado en el dispositivo de la presente invención. Dosis tan bajas como 40 femtogramos de antígeno en el dispositivo produjeron una respuesta de anticuerpos similar a la que se obtuvo por inmunización en la pata más coadyuvante, tradicional, utilizando 5 ng de antígeno, un incremento de cuatro órdenes de magnitud.

EJEMPLO 11 Además se evaluó el desarrollo de una respuesta humoral utilizando como antígeno la proteína hemaglutinina, disociada y purificada del virus de influenza A (antígeno hemaglutinina fraccionado, o BHA) . Ratones BALB/c . fueron inmunizados utilizando el dispositivo de la presente invención con dosis de 0.1 µg y 10 µg, proporcionadas en el dispositivo tres días después posteriores a la implantación, los ratones control fueron inmunizados con la misma cantidad de antígeno por vía subcutánea en la base de la cola, con coadyuvante Ribi. Los ratones fueron sangrados en el día 7, 14, 21 y 28 posteriores a la inmunización, y se realizó una prueba ELISA en el suero para anticuerpo IgG total específico del antígeno. Como se muestra en la Figura 15, se obtuvo una intensa respuesta humoral con el antígeno a 0.1 µg, alcanzando una concentración alta de los anticuerpos específicos de HA tan pronto como a las dos semanas posteriores a la inmunización. Los ratones inmunizados utilizando el protocolo tradicional con coadyuvante presentaron un nivel bajo de respuesta humoral específica del antígeno a la segunda semana, aumentando su nivel 3 y 4 semanas después de la inmunización. El nivel del anticuerpo específico de BHA en suero de ratones inmunizados con el dispositivo fue 75-80;-mayor que el nivel • alcanzado después de inmunización tradicional con mayor dosis del antígeno y en presencia de coadyuvante. En este experimento, el inmunógeno con dosis baja en el dispositivo produjo una respuesta humoral superior que fue alcanzada con una dosis mayor [sic]. Como se observa en los experimentos anteriores, dosis mayores que 5 µg pueden dar origen a supresión de la respuesta inmune posiblemente debido a la provocación de apoptosis como una reacción a la sobre estimulación.

EJEMPLO 12 La importancia del revestimiento o recipiente perforado pero de otra manera impermeable y biológicamente inerte proporcionado alrededor de la matriz de esponja del dispositivo de la presente invención fue evaluado inmunizando ratones con antígeno de influenza dentro del dispositivo intacto como ya se describió, o dentro de la matriz de esponja sola, implantada a • un lado de un segmento de tubo perforado. Se evaluó un intervalo de dosis de antígeno (0.50 pg, 500 pg, 5 µg y 50 µg) y fueron provistas en los dispositivos, o en las esponjas solas, tres días después de la implantación. Como control, los mismos intervalos de antígeno fueron inmunizados en la pata del ratón, junto con coadyuvante Ribi. 10 días después de la implantación o la inmunización en la pata, los bazos fueron cosechados de los animales y se realizó un ensayo de proliferación de células T como ya se describió, utilizando un intervalo de concentraciones de antígeno desde 0.1 hasta 180 µg/ml. Como control para especificidad se utilizó virus 3 de Epstein-Barr in vitro. La incorporación de H-timidina fue expresada como un índice de estimulación, para representar la estimulación y proliferación de las células T. Como se observa en la Figura 16, la activación de las células T presentadas por los animales inmunizados con el dispositivo intacto mostró una respuesta significativamente más fuerte que cuando el antígeno estuvo presente en las esponjas no presentes • dentro del recipiente perforado pero de otro modo impermeable. La respuesta al antígeno no relacionado, Figura 18, fue mínima.

EJEMPLO 13 Realizando una prueba de difusión se evaluó la importancia del recipiente o revestimiento perforado pero de otro modo impermeable y biológicamente inerte proporcionado alrededor de la matriz de esponja del dispositivo de la presente invención. 200 µg de albúmina de suero bovino (BSA) fueron inyectados en el dispositivo o en una esponja. El dispositivo y la esponja fueron colocados en tubos conteniendo 1.5 ml de PBS. Se tomaron las muestras a diferentes puntos del tiempo y se midió la concentración de BSA. Como se muestra en la Figura 18, la esponja liberó todo su contenido dentro de 5 minutos de incubación. El dispositivo de la presente invención controló la liberación del antígeno y más de 65% del antígeno fue retenido durante más de 960 minutos. El mantenimiento de una barrera de difusión para altos niveles sostenidos de antígeno, citocinas, quimiocinas y otras moléculas co-estimuladoras dentro del dispositivo en contacto con las células inmunes se postula para ser uno de los mecanismos importantes que proporciona el mejoramiento significativo del dispositivo sobre los procedimientos de inmunización tradicionales en provocar una respuesta inmune robusta. Así pues, los ejemplos antes presentados demuestran la capacidad del dispositivo de la presente invención para estimular una respuesta de células T y humoral superior a una variedad de antígenos, en comparación con la inmunización en la pata tradicional y en comparación con simplemente cargar antígeno en una matriz de esponja implantada.

EJEMPLO 14 Los fenotipos de las células presentes en el dispositivo de la presente invención sin antígeno adicionado fueron determinados después de la implantación. Las células extraídas del dispositivo de la presente invención cuatro días después de la implantación fueron recolectadas, lavadas y teñidas con isotiocianato de fluoresceína o anticuerpos monoclonales marcados con ficoeritrina específicos de los siguientes marcadores: CD14, CD45/B220, CDllb, CD40, CDllc, CD80, CD86, CD3 y I-Ad (PharMingen, CA) . Los promedios geométricos de la fluorescencia fueron determinados por citometría de flujo. Por comparación, la fluorescencia de los linfocitos de sangre periférica (PBL) de ratones singénicos, no manipulados utilizando el mismo arreglo de anticuerpos específicos fue determinada, y los resultados de cada anticuerpo expresados como promedio de la intensidad de la fluorescencia (MFI). La Figura 19 representa el fenotipo de las células extraídas del dispositivo 4 días después de la inserción. La migración y acumulación de las células T (CD3, CD40), macrofagos (CD14, CDllb, MHC clase II, CD80), células dendríticas (CD40, CDllc, MHC clase II, CD80), y células B (MHC clase II, CD45/B220, CDllb) en alta densidad fueron evidentes en el dispositivo. Así pues, las células inmunes importantes para el desarrollo de la respuesta inmune están presentes en el dispositivo. La expresión de moléculas co-estimuladoras (CD80 y CD86) y de adhesión (CD44) se elevó significativamente en las células inmunes extraídas del dispositivo de la presente invención en comparación con PBL (no se muestran los datos) . Es importante señalar que el análisis en el microscopio electrónico de las secciones del dispositivo de la presente invención revelaron la presencia de macrofagos con grandes cantidades de lisosomas, implicando su estado de activación celular aumentado.

EJEMPLO 15 Después de la implantación, la concentración de citocinas contenidas dentro del dispositivo de la presente invención en ausencia de antígeno fue comparada con la concentración de citocinas en suero murino nativo. Como se observa en la Figura 20, el dispositivo contenía mayores niveles de citocinas estimuladoras IL-2, IL-4 y TNF-a y aproximadamente una séptima parte de la concentración de la citocina inhibidora TGF-ß (no se muestran los datos) . Así, el dispositivo de la presente invención es un ambiente altamente cargado equilibrado por la erupción de la respuesta inmune una vez "encendido" con el antígeno. EJEMPLO 16 - Se cree que las respuestas del linfocito T citotóxico (CTL) son cruciales para el desarrollo de la inmunidad al virus de influenza. Para evaluar la capacidad del dispositivo de la presente invención para producir CTL específico del antígeno, los ratones fueron inmunizados con 500 pg de vacuna de virus de influenza en el dispositivo de la presente invención. Como control, los ratones fueron inmunizados por vía subcutánea con 500 pg de vacuna más coadyuvante Ribi. Se obtuvieron linfocitos de los animales inmunizados y su especificidad para el virus de influenza fue determinada por lisis de las células objetivo infectadas con el virus de influenza. Los CTL fueron preparados como sigue. Los ratones fueron sacrificados y se les separaron los bazos. Las suspensiones de células individuales fueron preparadas y las células fueron lavadas con PBS. Los eritrocitos fueron depletados utilizando Red Cell Lysis Buffer (Sigma, MO) . Las células esplénicas (5 x 10 ) fueron co-cultivadas in vitro con 5 x 10 células esplénicas singénicas . infectadas con virus (100 HAU/10 células/ml durante 60 minutos a 37°C) e irradiadas (3000 rad) e incubadas durante 5 días a 37°C, 5% de C02. Células PR8 infectadas (500 HAU/106 células) Pl.HTR y células no infectadas Pl.HTR fueron utilizadas como objetivos para la citotoxicidad. Las células fueron marcadas con 100 mCi de Na 1Cr?4 durante 90 minutos y luego lavadas tres veces. Las células objetivo (10 /ml) en 100 ml de RPMI 1640 y 5% de medio FCS fueron adicionadas a células efectoras en diferentes concentraciones comenzando en una relación 100:1 (E: T) y titulando el doble en placas de microtitulación de fondo redondo de 96 pozos. Después de incubación durante 5 horas, el sobrenadante fue cosechado. Los resultados se expresan como un porcentaje de la liberación de Cr específico de acuerdo con la fórmula: [(liberación experimental) - (liberación espontánea)] x 100/ [ (liberación máxima) - (liberación espontánea)]. Como se observa en la Figura 21, la inmunización utilizando el dispositivo de la presente invención con 500 pg de vacuna de virus de influenza activó los CTL específicos de influenza poderosos que fueron significativamente mejores usando las células objetivo infectadas con influenza, en comparación con los CTL producidos en respuesta a la inmunización subcutánea tradicional con coadyuvante Ribi. Los CTL generados no mataron células objetivo no infectadas in vitro, indicando la especificidad de la respuesta provocada. Con mayores dosis del antígeno en el dispositivo de la presente invención, no se observó estimulación.

EJEMPLO 17 Para determinar que la inmunización con el dispositivo de la presente invención también podría modular la respuesta inmune humoral, los ratones fueron inmunizados con diferentes dosis distintas de vacuna de virus de influenza administrados en el dispositivo de la presente invención o inyectados por vía subcutánea con coadyuvante Ribi . Concentraciones altas de anticuerpos IgM, IgGl e IgG2a específicos de influenza fueron demostradas en sueros de ratones después de inmunización con el dispositivo de a presente invención con dosis menores de vacuna en comparación con la inmunización subcutánea en combinación con Ribi (no se muestran los datos) . El examen de los anticuerpos IgGl específicos del virus reveló mayor unión cuando se midió por la absorbancia registrada en diluciones de suero en escala (Figura 22) . Resultados similares fueron observados para anticuerpos IgG2a.

EJEMPLO 18 /Anticuerpos de suero generados por inmunización utilizando el dispositivo de la presente invención relacionada con el protocolo tradicional con coadyuvante fueron sometidos a un gradiente de molaridad en escala de KSCN (tiocianato de potasio) utilizando para eluir anticuerpos específicos del antígeno a partir de complejos unidos a las placas de microtitulación revestidas con antígeno para determinar la afinidad relativa de los anticuerpos al virus de influenza. Se utilizó un formato ELISA basado en placas de microtitulación normales, como se describe antes. Antes de la adición de IgG anti-ratón biotinilada, las placas fueron lavadas y se adicionaron diferentes concentraciones de KSCN a los pozos. Las placas fueron incubadas a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después del lavado, la solución de anticuerpo IgGl antiratón biotinilado (0.5 µg/ml) fue adicionada a los pozos. Mayores concentraciones de KSCN son necesarias para romper los complejos creados por la unión de los anticuerpos con alta afinidad al antígeno. Como se representa en la Figura 23, se demostró que los anticuerpos desarrollados poseen mayor afinidad a los antígenos virales. Así, una dosis muy pequeña de vacuna es suficiente para estimular una respuesta humoral poderosa cuando se utiliza cl dispositivo de la presente invención.

EJEMPLO 19 La capacidad de inmunización utilizando un dispositivo de la presente invención para proteger a los mamíferos contra enfermedades infecciosas fue probada en cl modelo dc influenza de murino. Dos dosis de vacuna del virus de influenza (5 pg y 500 pg) fueron utilizadas para inmunizar ratones con el dispositivo de la presente invención o por administración subcutánea en combinación con coadyuvante Ribi. Aproximadamente 12 semanas después de la vacunación, los animales fueron desafiados con una dosis letal de virus de influenza. Como se observa en la Figura 24, la vacunación utilizando un dispositivo de la presente invención con ambas dosis la de 5 pg y 500 pg de vacuna de influenza dio origen a una protección completa, mientras que solo 60z de los ratones inmunizados por vía subcutánea con 500 pg dc la vacuna de influenza -más coadyuvante Ribi sobrevivieron. Todos los animales inmunizados con la dosis de 5 pg más coadyuvante sucumbieron a la enfermedad el día 14. Es importante señalar que, no solo la inmunización utilizando un dispositivo de la presente invención proporcionó protección total, sino fue también lograda utilizando una centésima de la cantidad de antígenc y sin coadyuvante. Los ratones inmunizados con el dispositivo de la presente invención también presentaron peso estable después del desafío viral, indicando el desarrollo de una enfermedad moderada correlacionada con su resistencia relativa a la infección aguda.

EJEMPLO 20 La utilidad del dispositivo de la presente invención para generar IgG humana específica en ratones con inmunodeficiencia combinada (SCID) poblados con células inmunes humanas fue evaluada implantando el dispositivo que contenía vacuna del virus de influenza. Ratones SCID Beige CD17 (6-8 semanas de nacidos, hembras) fueron administrados por vía intraperitoneal con 20 x 106 PBMC a partir de un donador humano normal. Tres días después los ratones fueron inmunizados por vía intramuscular o implantados con un dispositivo de la presente invención prepulsado con 50 ng de vacuna de virus de influenza. Tres semanas después de la inmunización, los ratones fueron sangrados y los sueros fueron probados para respuesta humoral específica de influenza, utilizando el ELISA convencional. Como se observa en la Figura 25, la inmunización con la vacuna generó IgG human específica de influenza. Además, como se observa utilizando KSCN en una molaridad en escala para medir la afinidad relativa de los anticuerpos del suero al antígeno de influenza (como ya se describió en el Ejemplo 18), el dispositivo de la presente invención produjo un título mayor que el anticuerpo específico de influenza humana que la obtenida por la inmunización intramuscular, tradicional (Figura 26) . Este método también puede ser utilizado para generar hibridomas humanos capaces de producir anticuerpos monoclonales humanos .

EJEMPLO 21 Cantidades mayores de antígeno proporcionadas en un dispositivo de la presente invención pueden causar una supresión de la respuesta inmune. Ratones Balb/c fueron implantados con el dispositivo cargado con los 5 a 50 µg de vacuna de influenza o inmunizados en la almohadilla de la pata con el antígeno mezclado con coadyuvante Ribi. Los ratones fueron sacrificados 10 días desp ^u^és dc la inmunización y las células esplcnicas fueron aisladas y plaqueadas en placas de 96 pozos (2 x 10 células/pozo) . Las células fueron expuestas al antígeno de influenza durante 72 ? / * - o C ;rX> — "3i "" i7 ° - v L i. c: ?? u .um, c uc un c µ u i. t?v-x *_> v_x* .x. ^ ?_ v y •_> <^- nl L x vj x. Cl producción de interferón gamma utilizando un kit ELISA (Endogen) . Como se observa en la Figura 27, los ratones inmunizados con una combinación del antígeno y el coadyuvante Ribi produjeron una respuesta inmune que aumentó directamente con la dosis del antígeno. Por el contrario, los ratones inmunizados con el antígeno dentro del dispositivo mostraron una estimulación de la respuesta ejemplos anteriores de la presente) pero una disminución en la respuesta inmune a dosis mayores del antígeno. Así pues, la presencia de cantidades grandes de antígeno en un dispositivo implantado de la presente invención conduce a una disminución de la respuesta inmune. Este método puede ser utilizado en el tratamiento de estrategias donde es útil la inmunosupresión específica, por ejemplo, el trasplante, alergias, etcétera.

EJEMPLO 22 El dispositivo de la presente invención también puede ser utilizado para generar una respuesta inmune a un antígeno polisacárido. Una sola inmunización utilizando un dispositivo cargado con vacuna neumocócica (Pncumovax-23) produce una respuesta inmune específica. El Pncu ovax cs una vacuna neumocócica polivalente que consiste en polisacáridos capsulares altamente purificados provenientes dc los 23 tipos neumocócicos más prevalentes o invasivos. Los ratones fueron inmunizados con 5 µg ó 40 pg de vacuna Pneumovax en un dispositivo implantado en forma subcutánea co o ya se describió, o mezclado con coadyuvante Ribi e inyectado en la almohadilla de la pata. Todos los ratones fueron sangrados el día 10 y ensayados por ELISA para respuesta de IgG (Figura 29), IgGl (Figura 30) e IgG2a (Figura 31) total. Estos resultados muestran que es posible obtener una respuesta inmune a los antígenos polisacáridos utilizando cl dispositivo de la presente invención.

EJEMPLO 23 El dispositivo de la presente invención puede ser utilizado para generar una respuesta inmune a un antígeno altamente conservado. Se seleccionó- ciclofilina como una proteína modelo para estos experimentos, dado que cl desarrollo de una respuesta inmune a ciclofilina ha sido difícil de obtener, en vista de que esta proteína cs altamente conservada entre especies de mamíferos. Los ratones fueron inmunizados con 5 µg, 50 ng ó 0.5 ng dc ciclofilina humana cargada en un dispositivo dc la presente invención e implantado por vía subcutánea, o mezclado con coadyuvante Ribi e inyectado por vía subcutánea. Los ratones fueron sangrados y los sueros fueron probados para una respuesta de IgG2a a ciclofilina humana por ELISA. Como se observa en la Figura 32, los ratones inmunizados con las dos dosis menores de antígeno utilizando el dispositivo de la presente invención mostraron una respuesta superior al antígeno en comparación con los ratones inmunizados por vía subcutánea con ciclofilina más coadyuvante Ribi. Este resultado demuestra que el dispositivo puede inducir una respuesta inmune a antígenos altamente conservados que dc otro modo son no inmunogénicos. La inmunización con la dosis alta de antígeno en el dispositivo de la presente invención fracasa en inducir una respuesta inmune.

EJEMPLO 24 El dispositivo de la presente invención puede ser utilizado para generar una respuesta inmune en organismos vivos,, completos. En este experimento, los ratones fueron inmunizados con larvas de anquilostomiasis vivas, utilizando larvas introducidas a un dispositivo implantado por vía subcutánea de la presente invención, o utilizando 1000 larvas vivas inyectadas por vía subcutánea dos semanas después. Como se observa en la Figura 23, ambos protocolos indujeron IgG total específica de L3 medida por ELISA. Ha sido posible inmunizar contra diferentes organismos parásitos incluida la -anquilostomiasis y malaria utilizando larvas irradiadas y esporozitos, respectivamente; los estudios en la presente indican que la inmunización utilizando el dispositivo de la presente invención puede lograrse utilizando un número disminuido de organismos. Esta invención puede ser incorporada en otras formas o realizada de otra manera sin apartarse del espíritu o características esenciales de la misma. La presente descripción, por tanto, se debe considerar en todos sentidos ilustrativa y no restrictiva, el alcance de la invención siendo indicada por las reivindicaciones anexas y todos los cambios que surjan dentro del significado c intervalo de equivalencias se proponen para estar comprendidas en la misma . Diferentes publicaciones se citan en la presente, las descripciones de las cuales se incorporan como referencia en sus enterezas.

Claims

REI I DICACIONES Un método para modular la repuesta inmune en un mamífero a un antígeno mediante la implantación dentro del cuerpo del mamífero de un dispositivo que contiene una matriz porosa contenida dentro de un recipiente perforado pero de otro modo impermeable, la matriz conteniendo una cantidad de antígeno, en donde el dispositivo atrae células del sistema inmune para encontrar cl antígeno y modular la respuesta inmune. El método de la reivindicación 1, en donde el antígeno esta biodisponible dentro de la matriz porosa en el tiempo de implantación del dispositivo en cl mamífero. El método de la reivindicación 1, en donde cl antígeno se hace biodisponible dentro de la matriz porosa después que el dispositivo ha sido implantado en cl mamífero. El método de la reivindicación 3, en donde cl antígeno se hace biodisponible aproximadamente tres días después de la implantación dentro del mamífero. El método de la reivindicación 1, en donde cl antígeno se introduce en el dispositivo aproximadamente tres días después de la implantación. El método de la reivindicación 1, en donde el antígeno esta provisto en una formulación de liberación retardada. 7. El método de la reivindicación 1, en donde la matriz porosa contiene un material polimérico. Q El método de la reivindicación 7, en donde cl material polimérico se selecciona de fuentes naturales y ón 8, en donde la matriz polimérica se selecciona del grupo que consiste en acetato de polivinilo hidroxilado, poliuretano, copolímero de etileno/acetato de vinilo, _ ácido poliláctico, copolímero de polilacturo-glicoluro, gelatina, colágena, colágena reticulada y combinaciones de las mismas. 10. El método de la reivindicación 1, en donde cl recipiente consiste en un material polimérico seleccionado de fuentes naturales y sintéticas. 11. El método de la reivindicación 1, en donde la matriz polimérica porosa consiste en acetato de polivinilo hidroxilado y el recipiente consiste en un segmento de tubo perforado. 12. El método de la reivindicación 1, en donde la cantidad de antígeno y el tiempo de la biodisponibilidad del antígeno dentro del dispositivo con relación al tiempo de implantación del dispositivo en el mamífero da origen a la inducción o mejoramiento de la respuesta inmune al antígeno. 13. El método de la reivindicación 12, en donde cl antígeno esta biodisponible dentro del dispositivo después dc la implantación del dispositivo en cl mamífero. 14. El método de la reivindicación 13, en donde cl antígeno es introducido en el dispositivo aproximadamente 2-4 días después de la implantación del dispositivo en cl mamífero . 15. El método de la reivindicación 1, en donde la cantidad de antígeno y el tiempo de biodisponibilidad del antígeno dentro del dispositivo con respecto al tiempo de implantación del dispositivo en el mamífero da origen a la supresión o disminución de una respuesta inmune existente o potencial al antígeno. 16. El método de la reivindicación 15, en donde cl antígeno esta biodisponible dentro del dispositivo en cl tiempo de implantación dentro del mamífero. 17. El método de la reivindicación 1, en donde cl dispositivo se separa del cuerpo del mamífero después do un periodo de aproximadamente 10 días. 18. El método de la reivindicación 1, en donde una segunda Cantidad de antígeno es reintroducida en el dispositivo. 19. El método de la reivindicación 18, en donde la segunda cantidad de antígeno es reintroducida en el dispositivo por liberación retardada de la segunda cantidad de antígeno presente dentro del dispositivo en el momento de la implantación. Un dispositivo implantable para modular una respuesta inmune a un antígeno consiste en una matriz porosa contenida dentro -de un recipiente perforado, pero de otro modo impermeable. El dispositivo de la reivindicación 20, en donde cl antígeno está presente dentro de la matriz porosa. El dispositivo de la reivindicación 20, además comprende el medio para introducir el antígeno en contacto con la matriz porosa, antes o después de la implantación. El dispositivo de la reivindicación 20, en donde la matriz consiste en un material polimérico. El dispositivo de la reivindicación 23, en donde cl material polimérico se selecciona de fuentes naturales y sintéticas. El dispositivo de la reivindicación 24, en donde cl material polimérico se selecciona del grupo que consiste en acetato de polivinilo hidroxilado, copolímero de etileno/acetato de vinilo, ácido poliláctico, copolímero polilacturo-glicoluro, poliuretano, gelatina, colágena, colágena reticulada y combinaciones de estos. El dispositivo de la reivindicación 20, en donde el recipiente consiste en un segmento de tubo perforado. El dispositivo de la reivindicación 20, en donde el recipiente consiste en un revestimiento perforado, pero de otro modo impermeable ubicado alrededor dc la matriz porosa . 28. El dispositivo de la reivindicación 27, en donde cl revestimiento consiste en un material polimerico. 29. El dispositivo de la reivindicación 28, en donde cl material polimérico se selecciona dc fuentes naturales y sintéticas . 30. El dispositivo de la reivindicación 29, en donde cl material polimérico se selecciona del grupo que consiste en colágena reticulada, ácido poliláctico, copolímero polilacturo-glicoluro, polietilcno, silicona, resina dc látex, poliestireno, resina acrílica, polivinilpirrolidona y combinaciones dc estos. 31. El dispositivo de la reivindicación 20, en donde la matriz porosa consiste on acetato de polivinilo hidroxilado y el recipiente consiste en un segmento dc tubo perforado. 32. Un método para obtener células inmunes de un mamífero, en donde las células inmunes son cosechadas de un dispositivo implantado en el mamífero, consistiendo en una matriz porosa contenida dentro de un recipiente perforado, pero de otro modo impermeable. 33. El método de la reivindicación 32, en donde las células cosechadas de reintroducen en el mamífero. El método de la reivindicación' 33, en donde las células cosechadas son criopreservadas antes dc su reintroducción en el mamífero. El método de la reivindicación 32, en donde está presente un antígeno dentro de la matriz porosa del dispositivo. El método de la reivindicación 35, en donde las células inmunes se reintroducen en el mamífero. El método de la reivindicación 35, en donde las células inmunes se reintroducen en el mamífero después de la exposición al antígeno in vitro. El dispositivo de la reivindicación 32, en donde la matriz consiste en un material polimérico. El dispositivo de la reivindicación 38, en donde cl material polimérico se selecciona de fuentes naturales y sintéticas . El dispositivo de la reivindicación 39, en donde el material polimérico se selecciona del grupo que consisto en acetato de polivinilo hidroxilado, ccpolíméro de etileno/acetato de vinilo, ácido poliláctico, copolímero polilacturo-glicoluro, poliuretano, gelatina, colágena, colágena reticulada y combinaciones de estos. El dispositivo de la reivindicación 32, en donde el recipiente consiste en un segmento de tubo perforado. 42. El dispositivo de la reivindicación 32, en donde cl recipiente consiste en un revestimiento perforado, pero de otro modo impermeable ubicado alrededor dc la matriz porosa. 43. El dispositivo de la reivindicación 42, en donde cl revestimiento consiste en un material polimerico. 44. El dispositivo de la reivindicación 43, en donde cl material polimérico se selecciona de fuentes naturales y sintéticas. 45. El dispositivo de la reivindicación \ \ , en donde el material polimérico se selecciona del grupo que consiste en colágena reticulada, polietileno, silicona, resina de látex, poliestireno, resina acrílica, ácido poliláctico, copolímero polilacturo-glicoluro, polivinilpirrolidona y combinaciones de estos. 46. El dispositivo de la reivindicación 32, en donde la matriz porosa consiste en acetato de polivinilo hidroxilado y el recipiente consiste en un segmento do tubo perforado. 47. El método de la reivindicación 35, en donde las células inmunes se utilizan para la preparación de un hibridoma para la producción de anticuerpo monoclonal contra antígeno. 48. Un método de inmunización a un mamífero con un antígeno para la preparación de un hibridoma para la producción *. .. (H .1J_ ~? -tt~u> +-- ? se inmuniza al mamífero utilizando cl método dc la reivindicación 12. Un método de inmunización a un mamífero con un antígeno para la preparación de un hibridoma para la producción de un anticuerpo monoclonal contra el antígeno, en donde se inmuniza al mamífero utilizando el método de la reivindicación 21. El método de la reivindicación 12, en donde la respuesta inmune al antígeno se selecciona del grupo que consiste en vacunación profiláctica, vacunación terapéutica, inmunidad celular, inmunidad humoral, inmunidad mucosa, inmunidad de largo plazo y combinaciones de estas. Un método para la producción de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos centra un antígeno preseleccionado consiste en los pasos secuenciales de: (a) introducir linfocitos de sangre periférica humana en la circulación de un ratón inmunodeficiento combinado grave (SCID) y permitir a los linfocitos poblar el sistema inmune del ratón; b) implantar en el ratón un dispositivo de la reivindicación 21, el antígeno del dispositivo conteniendo el antígeno preseleccionado; (c) cosechar células inmunes del dispositivo; (d) preparar hibridomas de linfocitos B presentes en las células inmunes cosechadas; y (c) identificar por método dc detección aquellos hibridomas que produzcan anticuerpos monoclonalcs que reconozcan cl antígeno prcsclcccionado . 52. Un método para transfectar células inmunes dc un mamífero con material genético consiste en introducir cl material genético dentro dc la matriz do un dispositivo que consiste en una matriz porosa contenida dentro de un recipiente perforado, pero de otro modo impermeable, cl dispositivo implantado dentro del cuerpo del mamífero. 53. El método de la reivindicación 52, en donde cl material genético se selecciona del grupo que consiste en DNA, RNA y cDNA. 54. El método do la reivindicación 52, on donde cl material genético codifica para un antígeno. 55. Un método para el tratamiento o profilaxis dc una enfermedad o padecimiento causado por una respuesta inmune consiste en suprimir la respuesta inmune dc acuerdo con la reivindicación 15. 56. El método de la reivindicación 55, en donde la enfermedad o anomalía se selecciona del grupo que consiste en alergias, rechazo dc trasplante y enfermedades auto inmunes. 57. Un método para modular la respuesta inmune en un mamífero a un antígeno implantando dentro del cuerpo del mamífero un dispositivo que contiene cl antígeno y además comprende el medio para limitar la difusión pasiva de las moléculas hacia afuera del dispositivo sin limitar el movimiento activo de las células inmunes hacia adentro o hacia afuera del dispositivo.