JP2001507344A - 抗体を産生するカプセル封入細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、抗体産生細胞を封入するカプセル、並びに前記カプセルおよびカプセル封入細胞それぞれの、治療上有益な抗体の長期間のデリバリーまたは継続したデリバリーを目的とする生体移植のための使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 抗体を産生するカプセル封入細胞 本発明は、抗体、とりわけ種々のクラスの免疫グロブリン；IgM、IgD、IgGs、 IgEおよびIgAに属する抗体を産生するカプセル封入細胞、並びに前記カプセル封 入細胞の、治療上有益な抗体の長期間のデリバリーまたは継続したデリバリーを 目的とする生体移植のための使用に関する。 背景 患者に移植した操作された（engineered）細胞により、細胞増殖抑制性腫瘍ま たは細胞毒性腫瘍に特異的な抗体を全身デリバリーすることは、外科手術、化学 療法または放射線治療のような主治療後の再発を防止するための長期に亘る抗が んサーベイランス治療にとって非常に有益であり得る。このようなアプローチは 、ウイルス中和抗体またはウイルス産生細胞に対する毒性を有する抗体をデリバ リーするものであれば、ＡＩＤＳのような重症のウイルス性疾患を治療するため に使用することもできる。さらに、抗体の長期的な全身デリバリーは、より基本 的な目的、例えば体液性応答が病気の進展に寄与する自己免疫疾患の新規動物モ デルを開発するためにも有効であり得る（Rose,N.R．and Bona,C.，Immunol．T oday,Vo1.14,426-430(1993)）。別の適用可能性として、細胞タイプに特異的な 膜マーカーを認識する細胞毒性抗体を血流に放出することにより、特異的な細胞 セットの種々の分化経路および／または生物学的重要性をin vivoで研究するの に有効な新たな細胞破壊技術の開発が挙げられる。この状況において、抗体は、 例えば特定の分化ステップの後、分化中の標的細胞表面にコグネイト抗原が出現 した直後に、この標的細胞を殺すだろう。 レトロウイルスの遺伝子転移を用いることにより、遺伝的改変および患者への 移植が可能な幾つかの細胞タイプ（皮膚繊維芽細胞、筋細胞、肝細胞およびケラ チノサイト）が、親抗体の特異性および親和性を保持した抗体を産生できること が最近示された（Noel,Dら，Hum.Gene Ther.,Vol.8，1219-1229(1997)）。更に 、操作された筋細胞の移植は、少なくとも数ヶ月間、マウスにおいてクローン抗 体 の全身デリバリーを可能にする。これらの観察は、患者細胞の操作が長期に亘る 抗体ベースの遺伝子治療にとって有効であり得るという考えを支持するが、幾つ かの問題により、このような技術の臨床上の適用は潜在的に制限される。第一に 、このような治療上のアプローチは、労働集約的であり時間浪費的であるだろう 。第二に、患者細胞の安定した遺伝的改変には、現在のところ、免疫システムに よる非ＭＨＣ（ＭＨＣ＝主要組織適合遺伝子複合体）適合細胞の拒絶を避けるた め、ex vivoレトロウイルス感染、その後の自己移植を利用している。これは、 ある個人由来の操作された細胞を別人に使用することができないため、該アプロ ーチの多用途性を低下させる。第三に、遺伝子治療プロトコールで使用可能な細 胞における効率的な遺伝子転移および転移遺伝子の長期的な発現が、未だ完全に は解決されない問題である（Crystal,R.G.，Science，Vol.270，404-410(1995); Harris,J.D．and Lemoine,N.R.，Trends Genet.，Vol.12，400-405(1996);Vile, R.G.ら，Mol.Biotechnol.,Vol.5，139-158(1996)）。 この観点から、免疫保護デバイスの中にカプセル封入した操作された細胞の患 者への移植は、より多用途で、費用的に有効なアプローチであり得る。一方では 、この移植は（最適な抗体発現のためにin vitroで可能性として選択された）非 ＭＨＣ適合細胞の同じバッチを数人の患者に使用することを可能にするはずであ り、他方では、カプセルの移植は非常に単純な外科手術である。その上、このよ うな技術は、治療を終了することが必要なときに、抗体産生細胞の簡単な外科的 除去という実現性をも提供してくれるだろう。 最適な機能のために、カプセル孔は、二つの基準を満たさなければならない。 一つは、カプセル孔は、抗体のような問題の分子が出ていくことを許容し、且つ 細胞の生存に必要な栄養分が侵入して効率よく拡散することを許容するのに十分 大きくなければならない。二つめに、カプセル孔は、封入された細胞がカプセル から外に出ることを妨害し、且つ宿主の免疫システム細胞の侵入を妨害するため に十分小さくなければならない。 ある生物学的に活性な分子の放出を可能にするが、これら分子を産生する細胞 を宿主の免疫システムから保護する、透過性の構造に細胞を封入することは、幾 つかの成功により達成された。(Chang,P.L．In Somatic Gene Therapy．P.L,Cha ng， ed．(CRC Press，Boca Raton)，p203-223(1995)を概説として参照）。ヒト成長 ホルモン（ｈＧＨ）（Tai,I.T．and Sun,A.M.，FASEB J．7，1061-1069(1993)） または分泌型のヒト・アデノシンデアミナーゼ（Hughesら，Hum.Gene Ther．5， 1445-1455(1994)）を産生するように遺伝的に改変した細胞を、カプセルで封入 した。これら研究の双方において、細胞を、ポリ-L-リジン-アルギン酸塩のマイ クロカプセルに封入して、その細胞を長期間培養すると生存し続けることが示さ れた。これに伴って、酵素またはホルモンの長期間の産生が起こった。更に、マ ウスにそのマイクロカプセルを移植すると、細胞は１年間生存しつづけ、ｈＧＨ を産生しつづけることが実証され、これにより、カプセルが宿主の免疫システム による破壊からトランスフェクトされた細胞を保護していることが証明された。 しかし、ポリリジン-アルギン酸塩カプセルが、炎症応答を引き起こすことも報 告された（Pueyo,M.E.ら，J.Biomater.Sci.Polym.Ed.，Vol.5，197-203(1993)； Vandenbossche,G.M.ら，J.Pharm.Pharmacol.,Vol.45，115-120(1993)）。 細胞のカプセル封入については、他の材料を用いた報告もされている。神経成 長因子を産生するように遺伝的に改変された新生仔ハムスターの腎細胞を、ポリ アクリロニトリル／塩化ビニルで封入し、ラットの脳に移植した。そのカプセル 封入細胞は、少なくとも６ヶ月間生存し、ＮＧＦを産生し続けた（Winnら，Proc .Natl.Acad.Sci．USA 91，2324-2328(1994)およびDeglonら，Gene Ther.，2，56 3(1995)）。 マウスのＩＬ-４に対して特異的なmAbを分泌するラットのハイブリドーマ細胞 を、アルギン酸塩で封入し、マウスの腹腔内および皮下に移植した（Savelkoul, H.F.ら，J.Immunol.Methods,Vol.170,185-196(1994)）。しかし、血流中にデリ バリーされた抗体レベルは、カプセルの劣化の結果、14日後に低下した。その上 、このシステムにおいて、カプセルから腹腔内に放出された細胞の結果、腹水の 発達が移植30日後に100％観察された。 肝細胞を、硫酸セルロースおよびポリジメチルジアリルアンモニウムのポリ電 解質複合体で封入することに成功した（Stangeら，Biomat.Art.Cells & Immob.B iotech．21，3443-352(1993)）。90％以上のカプセル封入された肝細胞が、その 生存能力を保持し、単層として増殖した肝細胞に比べて、このカプセル 封入細胞は高い代謝活性を示した。 同じ封入材料が、抗体を産生するハイリドーマ細胞をカプセル封入するために 使用されている（MertenらCytotechnology 7:121-130，1991）。そのカプセルは 、硫酸セルロースナトリウム（1.5％）およびポリ-ジメチル-ジアリル-アンモニ ウムクロリド（２％溶液）の溶液から調製された。カプセル特性、細胞増殖、お よびモノクローナル抗体産生に対する、カプセル封入工程の種々のパラメーター の影響をテストし、ポリアニオンとして硫酸セルロースナトリウム、およびポリ カチオンとしてポリ-ジメチル-ジアリル-アンモニウム-クロリドを使用したカプ セル封入が、高密度で哺乳類細胞を培養するのに有効なカプセル調製にとって適 切なツールであることが実証された。 当該分野の状況から公知であることを要約すると、抗体を産生するカプセル封 入細胞の、治療を目的とする抗体の長期間のデリバリーおよび／または継続した 放出のための生体移植は、記載または示唆もされていないか、あるいはカプセル の移植は、例えば、炎症応答のような重度の副作用という結果に至るかのどちら かである。 本発明の目的 従って、本発明の目的は、カプセルからの抗体の放出が可能であり、かつ宿主 において移植後の炎症応答を引き起こさない、抗体産生細胞を含有するカプセル を提供することである。 本発明の概要 本発明は、単独または組み合わせにおいて、とりわけ以下のものを包含する。 抗体産生細胞を封入するカプセルであって、前記細胞を含有するコアと、前記 コアを取り囲み、且つ前記細胞により産生された抗体を通過可能である多孔性カ プセル壁とを備えたカプセル； 前記多孔性カプセル壁が、反対電荷のポリ電解質から形成されたポリ電解質複 合体から成る上記カプセル； 前記多孔性カプセル壁が、硫酸セルロースおよびポリジメチルジアリルアンモ ニウムから形成された複合体から成る上記カプセル； 前記細胞が、クローン抗体を産生するように遺伝的に改変された上記の任意の カプセル； 前記抗体が、免疫グロブリンのIgA、IgM、IgG、IgDまたはIgEクラスに属する 上記の任意のカプセル。 上記の任意のカプセルであって、前記抗体が、 ウイルス感染細胞の表面上にあるウイルス表面マーカー がん細胞 自己免疫疾患の病理学的効果に関与するＴまたはＢリンパ球 寄生生物の表面マーカーまたは 有害効果（例えば自己抗体）を伴って循環する抗原 に結合し、前記細胞に対して細胞増殖抑制性または細胞毒性効果を示す抗体から 選択されるか、または、 前記抗体が、ウイルスの細胞感染に必要なウイルスレセプターに結合し阻害す る抗体、ウイルスへの結合を介した直接的な中和効果を有する抗体もしくは循環 する有害抗原に対する直接的な中和効果を有する抗体から選択されるカプセル； 上記の任意のカプセルの、前記カプセルから放出された抗体に応答する病気ま たは疾患を治療するための、ヒトを含めた動物生体への移植のための使用； 皮下移植のための上記の使用； 上記の任意のカプセルの、前記カプセルから放出された抗体に応答する病気ま たは疾患を治療する薬学的組成物を産生するための使用； 上記の任意のカプセルを含有し、前記カプセルから治療上有効な量で放出され た抗体に応答する病気または疾患を治療するための薬学的組成物； 上記の任意のカプセル封入細胞により産生された抗体に応答する疾患または病 気の治療方法であって、前記カプセルおよび／または上記の薬学的組成物の、ヒ トを含めた動物生体への移植を含む方法； 皮下移植を含む上記の方法；並びに、 がんもしくは自己免疫疾患を治療するか、または寄生生物もしくは病原性ウイ ルスによる感染を治療もしくは防御する上記の方法。 本発明 本発明により、カプセルからの抗体の放出を可能にし、且つ宿主において移植 後の炎症応答を引き起こさない、抗体を産生する細胞を含有するカプセルを提供 する。 本発明のカプセル封入された細胞は、（例えば、硫酸基含有ポリサッカライド もしくはポリサッカライド誘導体、またはスルホン酸基含有合成ポリマーから選 択された）ポリ電解質の水溶液中に、抗体を産生する細胞を懸濁することにより 調製することができ、その後、予め形成された粒子形態のその溶液を、（例えば 、第四級アンモニウム基を有するポリマーのような）反対電荷のポリ電解質の水 溶液を含有する沈殿浴に導入する。 硫酸基含有ポリサッカライドまたはポリサッカライド誘導体とは、硫酸セルロ ース、酢酸硫酸セルロース、硫酸カルボキシメチルセルロース、硫酸デキストラ ンまたは硫酸デンプンの塩、特にナトリウム塩の形態を含む。スルホン酸基含有 合成ポリマーとは、スルホン酸ポリスチレンの塩、好ましくはナトリウム塩であ り得る。 第四級アンモニウム基を有するポリマーとは、ポリジメチルジアリルアンモニ ウムまたはポリビニルベンジル-トリメチルアンモニウムの塩、好ましくは塩化 物の塩の形態を含む。 本発明の好ましい態様において、抗体を産生する細胞は、硫酸セルロースおよ びポリジメチルジアリル-アンモニウムから形成された複合体から成る複合体中 でカプセル封入される。 本発明のカプセル調製のために使用する硫酸セルロースカプセルの調製方法は 、DE A1 40 21 050に全て記載されている。また、硫酸セルロースの合成は、こ の特許出願に記載されている。硫酸セルロースカプセルの包括的な特徴付けのた めの方法は、H.Dautzenbergら,Biomat.，Art．Cells & Immob．Biotech.，Vol.2 1，399-405(1993)に、広く取りあげられている。硫酸セルロースカプセルおよび その調製は、GB 2 135 954にも記載されている。セルロースカプセルの特徴、即 ちそのサイズ、孔サイズ、壁の厚さ、および機械的特性は、例えばカプセルを調 製 した物理的状況、沈殿浴の粘性、そのイオン強度、温度、細胞／硫酸セルロース 懸濁液の添加速度、硫酸セルロースの組成、並びにDautzenbergグループにより 記載されたその他のパラメーターのような幾つかのファクターに依存する。 本発明のカプセルは、抗体を産生する細胞を、水溶液中、好ましくは緩衝液中 に0.5−50％、好ましくは0.5−５％の硫酸セルロースナトリウムおよび５％のウ シ胎仔血清を含有する溶液中で懸濁することにより調製することができる。次い で、この懸濁液を、分注システム（例えば、エアージェットシステムまたはピエ ゾ電気システム）により、水溶液中、好ましくは緩衝液中に0.5−50％、好まし くは0.5−10％のポリジメチル-ジアリルアンモニウムクロリドの撹拌溶液を含有 する沈殿浴に滴下する。カプセル形成はミリ秒以内に起こり、細胞を含有するカ プセルは、30秒ないし５分間沈殿浴に保持してから洗った。この方法の迅速性に より、全工程にわたって細胞は過度に圧迫されないことが保証される（Strange ら，Biomat．Art．Cells & Immob．Biotech．21．343-352(1993)）。 本発明のカプセルは、0.01から５ｍｍまでの可変的な直径を有するが、好まし くは、0.1から３ｍｍまでである。その結果、カプセルは、可変的な細胞数を含 有するようにつくることができる。本発明のカプセル封入工程を用いて、10¹⁰以 下、好ましくは、10³−10⁷の抗体産生細胞を、ポリ電解質複合体中でカプセルに 封入することができる。 硫酸セルロースおよびポリジメチルジアリルアンモニウムから成るカプセルは 、優れた機械的特性を有し、一定した直径および孔サイズに製造することができ る。 カプセル封入細胞は、通常の細胞培養培地（その培地特性は、カプセル封入さ れた細胞に依存する）中で、標準の湿度、温度およびＣＯ₂濃度の条件で培養す ることができる。この培養期間にわたって、カプセルから細胞培養培地への抗体 の産生は、特異的抗体を用いたウェスタンブロットまたはElisa技術のどちらか により実証することができ、更に蛍光色素を結合した二次抗体を用いて定量する こともできる。 適切な期間の培養後（通常、１時間以上30日以下）、細胞含有カプセルを、直 接またはシリンジを用いた注射により、身体の種々の場所に外科的に移植するこ とができる。 本発明のカプセル封入細胞により産生される抗体は、治療に有効な任意の免疫 グロブリンクラスに基づくことができ、遺伝的に改変された抗体も含むがこれに 限定されない。 本発明のカプセル封入細胞は、患者から採取した細胞、またはクローン抗体の 産生のために遺伝的に改変した、ヒトおよび動物細胞を含む任意の他の供給源か ら採取した細胞であり得る。 カプセル封入細胞およびカプセルの各々は、前記カプセルから放出された抗体 に応答する病気または疾患の治療を目的とする、ヒトを含めた動物生体への移植 のために特に使用される。カプセルを動物体の腹腔内および皮下に移植した後、 カプセル、特に硫酸セルロースカプセルは、皮下または腹腔内移植にかかわらず 、移植後10ヶ月もの間、元の形のまま観察されるため、例えば、アルギン酸塩カ プセルより、機械的耐性に関して明らかな利点を提供することが見出された。 その上、細胞を含有した硫酸セルロースカプセルの皮下および腹腔内移植は、 少なくとも二つの点に関して違いを呈していることが観察された。第一に、血流 中に放出された抗体の量は、前者の状況において著しく高かった。この違いに対 する非常に適切な説明は、皮下に移植されるとカプセルは急速に血管新生され、 腹腔内に移植されると全く血管新生されないという事実にある。血管新生の有利 な効果は二重にあり、一つには血液による抗体摂取が容易になることであり、二 つめには、腹腔内に移植されたカプセル内の細胞生存能力の低いことが再現的に 観察されることから、細胞の生存に好ましい栄養分の供給が確保されていること である。10ヶ月間の追跡にわたって何の重大な変化も示さなかった広範囲の血管 新生に加えて、皮下移植後に結合嚢（connective pouch）内に細胞が群生するこ とは、カプセルの除去が必要と分かった場合、カプセルの除去を、簡単な一工程 での新器官全体の外科的切除により可能にする。結局、移植された硫酸セルロー スカプセルの周囲での孤立した繊維症（isolating fibrosis）の発生は系統的で ないと強調することは重要である。この観察は、繊維症を伴う宿主の反応が、カ プセル化ポリマーによる有効なマクロファージの活性化の結果として、カプセル の周囲でおそらく生じた、アルギン酸塩-ポリ（Ｌ）-アルギン酸塩のマイクロカ プセルのケースで報告されたものと対照的である（Pueyo，M.E.ら，J.Biomater Sci．Polym．ED.，Vol.5，197-203(1993)）。 抗イディオタイプ応答は、多量の投与量の精製モノクローナル抗体により繰り 返し治療された患者にしばしば観察され、時々、その治療の効果を中和すること ができる（Isaacs,J.D.，Semin.Immunol.，Vol.2，449-456(1990)）。更に、抗 体の投与方法は、抗イディオタイプ応答の誘導に関して重要なパラメーターであ ることも示されている。例えば、皮下および皮内注射は、静脈内注射よりずっと 免疫抗原性が高いことが報告されている（Durrant,L.G.ら.，Cancer Immunol．I mmunother.,Vol.28,37-42(1989)）。従って、前記抗体を放出する硫酸セルロー スカプセルに封入された細胞を移植した動物体で産生されるモノクローナル抗体 に対して検出可能な抗イディオタイプ応答が観察されないと強調することは重要 である。 要約すると、上記のデータは、抗体を放出するカプセル封入細胞の移植が、特 にがんおよびウイルス性疾患に対する、長期に亘る抗体ベースの遺伝子／細胞治 療アプローチに適していることを明らかに実証している。 従って、本発明の好ましい態様において、カプセル封入された抗体産生細胞は 、長期的な治療のために継続した抗体の放出が必要である療法で使用される。 このような状況は、例えば、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、単純ヘルペス、および陰部ヘ ルペスのような慢性ウイルス感染により引き起こされる病気である。 或る種のウイルス感染は、細胞表面で特異的なマーカーまたは抗原の露出とい う結果に至る。このような表面マーカーは、ウイルス感染細胞に対して毒性を有 するように変化させることができる特異的な抗体により選択的に認識され得る。 このような抗体を産生するカプセル封入細胞は、ウイルス感染の長期的な治療に 適用することができる。 本発明の他の態様において、ウイルス感染に対する直接的または間接的な中和 効果である場合、ウイルス感染の最初の段階でウイルスと相互作用する細胞表面 上にあるマーカーまたはウイルス受容体を認識して結合する中和抗体を産生する カプセル封入細胞を提供する。 中和効果は、この場合、ウイルスの結合および／または細胞侵入を直接妨害す ることにより、任意の標的細胞の更なる感染を防止するか、あるいは間接的に患 者自身の補体系により溶解するか、もしくは単球もしくはマクロファージのよう な免疫システムの細胞に抗体を介してウイルスを呈示することに依存し得る。 特別な態様において、本発明は、腫瘍の治療における本発明のカプセル封入細 胞の使用に関する。 特異的な細胞タイプ、または自己再生が可能な特異的な細胞セットが、ヒトに 対して毒性があるか、または生命をおびやかすものであると判明した任意の状況 において、細胞の選択的破壊のためにカプセル封入細胞により産生され、正常も しくはその毒性を改良して改変された、細胞特異的な毒性抗体を、腫瘍細胞を除 去するために使用することができる。 本発明のカプセルの別の適用は、多発性硬化症およびリウマチ性動脈炎のよう な重度の自己免疫疾患の治療にあり、その治療において、病理学的効果を担う特 異的なＴ細胞およびＢ細胞は、長期の治療において、カプセル封入細胞により産 生される細胞特異的な毒性抗体によって絶えず排出され得る。 本発明の別の態様において、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum） 、三日熱マラリア原虫（P.vivax）または四日熱マラリア原虫（P.malariae）の ような寄生生物の表面マーカーに対する抗体を産生するカプセル封入細胞を提供 する。 マラリアは、ＴＢＣおよびＨｅｐＢに加えて、一年に最も多くの死者を出す三 大病の一つである。寄生生物にマークを付け、それにより寄生生物を破壊する免 疫システムの細胞を引きつけた結果、マラリア原虫（Plasmodium）に対する抗体 を適用することは、マラリア感染の危険性が高い国への旅行者のための、無毒で 無害な予防法として使用することができる。 カプセル封入された、抗体を放出する細胞は、少なくとも一つの薬学的キャリ アまたは賦形薬と共に治療上有効な量の細胞を含有する薬学的組成物を製造する ために使用することもできる。 以下の実施例は、本発明をさらに説明するものであるが、限定するものと解釈 してはならない。 実施例 細胞および細胞培養条件 マウスの骨髄腫細胞（P3-X63-Ag8.653）とhTgで免疫処置したマウス由来の脾 臓細胞との融合により調製されたハイブリドーマ細胞株、Tg10（Piechaczyk,M.C hardes,T.，Cot,M.C.，Pau,B.，and Bastide,J.M.，Hybridoma，Vol4，No.4，36 1-367(1985)）を、カプセルに封入するために使用した。Tg10細胞は、ヒトサイ ログロブリンに対する、Tg10とも呼ばれるモノクローナル抗体（mAb）を産生す る。細胞は、10％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ 1640（Gibco/BRL）中、100ｕ.(＝ Units)/mLストレプトマイシン、100ｕ./mLペニシリンおよび２mM L-グルタミン の存在下で増殖させた。硫酸セルロースマトリクス（ＣＳＭ）中にカプセル封入 されたTg10細胞を、フリーな細胞と同じ条件下で培養した。 抗体およびＦ(ab)'2断片の精製 Tg10mAbを、Tg10細胞の培養上清について、アフィニティークロマトグラフィ ーにより精製した（Durrant,LGら，Cancer Immunol．Immunother.，Vol,28，37- 41(1989)）。Tg10mAbに対するウサギ抗イディオタイプ抗体を、記載どおりに作 製した（Del Rio,M.ら，Immunol．Invest.，Vol.24，655-667(1995)）。Tg10Ｆ( ab)'2断片を、ペプシンによるTg10mAbの切断後、電気泳動で調製し、調製断片の 純度は、SDS-PAGE解析により制御した（Del Rio,M.ら，Immunol．Invest.，Vol. 24，655-667(1995)）。 細胞のカプセル封入 10⁷個の細胞を、3.8％硫酸セルロースナトリウムおよび５％ウシ胎仔血清を含 む食塩緩衝液１mLに懸濁した。その懸濁液を、食塩緩衝液中に2,5％ポリ-ジメチ ル-ジアリル-アンモニウム（PDDMDAAC）を含む沈殿浴に、分注システム（エアー ジェットシステム）を用いて滴下した。カプセル形成はミリ秒以内に起こり、続 いて、内側の多孔性の硫酸セルロースから本質的に成る機械的支持層がさらに構 築された。細胞を含むそのカプセルを、沈殿浴中に30秒ないし５分間保持し、次 いでＤＭＥＭで洗った（Stangeら，Biomat.Art.Cells & Immob.Biotech．21， 3443-352(1993)）。 上述の種々のパラメーター、即ち硫酸セルロースナトリウムの濃度、エアージ ェットシステムの流速および沈殿浴中の時間に対して得られたバッチを、生物学 的研究のために使用した。条件の代表的な例は、例えば、2.5％硫酸セルロース ナトリウム、２％ポリジメチル-ジアリルアンモニウム、および沈殿浴中に１分 、または1.5％硫酸セルロースナトリウム、２％ポリジメチル-ジアリルアンモニ ウム、および沈殿浴中に0.5分、または３％硫酸セルロースナトリウム、３％ポ リジメチル-ジアリルアンモニウム、および沈殿浴中に２分である。正確なパラ メーターは、所望のカプセルの正確なサイズ、カプセル壁の厚み、並びにその他 の特徴を更に考慮して選択することができる。 カプセルの移植 ４〜６週齢のC3Hマウス（IFFA-CREDO）に、0.1％キシラジン（Rompun，Bayer ）および10mg/mLケタミン（Imalgene，Rhone Merieux）を含む溶液を体重１グラ ムあたり0.01mL使用して、麻酔をかけた。カプセルは、移植前にリン酸緩衝化食 塩水（0.15Ｍ NaCl、0.01Ｍリン酸Ｎａ、ｐＨ７）で洗った。６または20個のCSM -Tg10カプセルを、マウスの腹腔内または皮下（腹の部位）の何れかに移植した 。後者のケースでは、１または３箇所に、１箇所あたり６または７カプセルのク ラスターで移植した。 マウスの免疫処置 Tg10抗イディオタイプ抗体を産生するため、６週齢のB6D2F1メスマウス（IFFA CREDO）に、１：１の体積比のフロイント完全アジュバント（Sigma）で乳化さ れた精製Tg10mAbをマウスあたり20μg使用して、複数の部位に皮内注射した。フ ロイント不完全アジュバント（Sigma）中の精製Tg10mAbを20μｇ（腹腔内に10μ ｇおよび筋内に10μｇ）、初回免疫処置から３週および４週後に各々、２回のブ ースター注射を行った。マウスから、各免疫処置の前および最後の免疫処置から １週間後に採血した。凝固後、血液サンプルを6000rpmで15分間遠心し、血清の 一部を使用まで−20℃で保存した。各血清サンプルを、以下に記載したように、 Tg10に対する抗イディオタイプ抗体の存在について分析した。 Tg10抗体の免疫アッセイ。抗イディオタイプ免疫応答の解析 細胞培養の上清中およびマウス血清中のTg10抗体を、記載どおりにマイクロタ イタープレート（Maxisorb,Nunc）のコーティングについて、ヒトサイログロブ リン（hTg）（UCB-Bioproducts）を用いて、ELISAにより分析し（Piechaczyk,M. ら，Hybridoma，Vol.4，361-367(1985)；Noel,D.ら，J.Immunol.Meth.，Vol.193 ，177-187(1996)）、450ｎｍにおける吸光度をDynatech社の自動ＭＲ5000プレー トリーダーを用いて測定した。プロテインＡセファロース−精製Tg10mAbを、濃 度決定のための基準として使用した。Tg10mAbに対する抗イディオタイプ抗体を 、マイクロタイタープレートのコーティングについて、Tg10F(ab)'2を用いて、E LISAにより分析した（Del Rio,M.ら，Immunol.Invest.，Vol.24，655-667(1995) ）。Tg10mAbに対するウサギ抗イディオタイプ抗血清（Del Rio,M.ら，Immunol.I nvest.,Vol.24,655-667(1995)）を陽性コントロールとして実験に含めた。 硫酸セルロース（ＣＳ）中にカプセル封入されたTg10細胞による in vitroでの抗体産生 まず、カプセル封入工程およびＣＳマトリクスがTg10ハイブリドーマ細胞に対 して毒性があり得るか、または抗体産生に影響を及ぼし得るかどうかを測定した 。細胞培養条件に置かれたカプセル封入細胞を、カプセルの破砕後、カプセル封 入後の種々の時点で数えた。細胞の生存能力をトリパンブルー排除法を用いて制 御した。平行して、Tg10mAbの産生を、ELISAにより分析した。培養培地は、24時 間ごとに交換した。 主な観察結果は、以下のとおりである。 （ｉ）各カプセルは、その直径が0.5ｍｍから２ｍｍまで変化し、平均１ｍｍで 、カプセル封入の時点で平均２×10⁴個のTg10細胞を含んでいた。 （ii）カプセル封入から４日後のカプセル封入細胞の生存能力は、少なくとも80 ％であると算定された。 （iii）Tg10mAbの産生は、50日の期間にわたって検出できた。 （iv）10日間にわたって、抗体産生の初期増加が観察され、これは、（空間の限 界のため分割は１または２ラウンドを越えることができない）カプセル内のTg10 細胞の増殖の限界と関連していた。 （ｖ）抗体産生の著しい低下は、細胞死の始まりと関連しており、10日ないし20 日目に始まった。 総合すると、これらのデータは、カプセル封入工程それ自体は、Tg10細胞に対 して毒性がないことを示唆している。むしろ、ＣＳマトリクス内の細胞の生存は 、好ましいようである。というのも、標準の培養条件下において継代しないで同 時に培養したTg10細胞は、１ないし２週間以内に死ぬからである。 Tg10細胞含有のＣＳカプセルをマウスに移植した後の in vivoにおけるTg10mAbのデリバリー 次に、Tg10mAbの全身デリバリーが、マウスにカプセルを移植した後に達成さ れ得るかどうかを検討した。皮下（腹の部位）および腹腔内の移植の両方を、ど ちらの局在が抗体の血流へのより良いデリバリーを可能にするかを決定するため 、調査した。３匹のC3Hマウスの腹腔内に６カプセルを移植し、１匹のマウスに2 0カプセルを移植した。同様に、３匹のマウスの皮下に６カプセルおよび３匹の マウスに20カプセルを移植した。血流中のTg10抗体の濃度は、以後ELISAにより モニターした。 抗体産生は、 （ｉ）移植したカプセルの数に直接関連している （ii）移植後２〜３週の間にピークに達する （iii）カプセルを皮下に移植した際は、腹腔内移植の場合の2.5μg/mLと比べて 、12.5μg/mLもの高い値に達することができるため、再現的に高い （iv）血流中のTg10抗体の濃度は、わずか数十ｎｇ／ｍＬまでしだいに減少した が、４ヶ月もの間検出され得る ことが観察できた。 結局、抗体産生の低下は、カプセル封入細胞の連続的な死に関連しているよう である。皮下移植後２ヶ月のマウスから取り出したカプセル中の封入細胞の生存 能力は20-30％と算定され、この値は抗体濃度の低下と関連している。 カプセルの血管新生の追跡 腹腔内および皮下に移植されたカプセルは、血管新生に関して異なった行動を 示した。従って、移植後２ヶ月の皮下移植されたカプセルは、緩い結合組織から 作られた血管新生された嚢に包まれているように見えた。このような新器官は、 ハイブリドーマ細胞を含有したカプセルであるかないかに関わらず形成された。 対照的に、カプセルを腹腔内に移植すると、カプセルはクラスターを形成せず、 流動的なままであり、血管新生は観察されなかった。 次に、血管新生の始まりを調査し、血管由来因子によるカプセルの処理が、皮 下移植されたカプセルの血管新生を促進および／または改良できるかどうかを調 べた。ｂＦＧＦ、血管形成活性を有することが公知の増殖因子（Montesano,R.ら ，Proc.Natl.Acad.Sci．USA，Vol.83，7297-7301(1986)；Thompson,J.A,ら，Pro c.Natl.Acad.Sci．USA，Vol.86，7928-7932(1989)）および／または上記のタイ プＩラットコラーゲン（Sigma）で処理されたカプセルを、移植し、血管新生に 関して追跡した。テストした種々の実験条件の間で明白な違いは観察されなかっ た。カプセルのまわりに発達する血管は、移植３日後に容易に目に見ることがで き、完全な血管新生は２ないし３週間後に完成し、血管の網目構造は、少なくと も10ヶ月間、安定に残る新器官のまわりやその内部に存在した。 検出可能な炎症応答は、 移植された標準的なTg10細胞含有のＣＳカプセルで発生しなかった マウスを、移植されたカプセルにより触発される可能性がある炎症応答の発生 について調査した。肉眼検査で検出可能な即時型または遅延型炎症応答は、腹腔 内または皮下どちらの移植後もカプセル付近で観察されなかった。また、皮下移 植から10ヶ月後でさえ、カプセルの血管新生に変化がないことは注目すべきこと であった。 カプセル封入細胞により放出されたTg10抗体に対する 抗イディオタイプ体液性応答は検出できなかった Tg10抗体に対する体液性応答が、カプセル封入されたハイブリドーマ細胞を移 植されたマウスにおいて発生するという可能性を、更に調査した。抗Tg10抗体を 含有する予め特性決定されたウサギ血清（Del Rio,Mら，Immunol.Invest.，Vol. 24，655-667(1995)）を、これらの実験にポジティブコントロールとして使用し た。その上、一連のマウスに、上記したとおり、フロイントアジュバントの存在 下で精製モノクローナル抗体により免疫処置をした。注射した13匹のマウスのう ち、６匹が明らかな抗イディオタイプ応答を発生し、これはマウスがこのような 応答の誘導に本質的に無反応でないことを示している。対照的に、抗イディオタ イプ応答は、抗体の血液濃度および移植部位に関わらず、カプセルを移植された 何れのマウスにおいても検出されなかった。これらのデータは、硫酸セルロース マトリクスが、Tg10抗体に対する中和体液性応答の誘導に都合がよい明らかなア ジュバント効果を発揮しないことを示している。 要約すると、ハイブリドーマ細胞を含有する硫酸セルロースのカプセルは、皮 下または腹腔内腔に移植されると、少なくとも数ヶ月間、免疫応答性マウスの血 流にモノクローナル抗体を運搬するために使用され得ることが示された。上記デ ータは、抗体産生細胞を含有するカプセルの患者への移植は、抗体の全身への長 期間にわたる運搬を潜在的に可能にし、がんおよび重度のウイルス性疾患のサー ベイランス治療の発展に有効であり得ることを示している。その上、抗体産生細 胞の硫酸セルロースによるカプセル封入は、抗体ベースの遺伝子／細胞治療アプ ローチにおいて有効である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年１月１５日（１９９９．１．１５） 【補正内容】 請求の範囲 １．抗体産生細胞をカプセル封入する硫酸セルロースのカプセルであって、前 記細胞から産生された抗体に応答する病気または疾患の治療に使用するためのカ プセル。 ２．前記カプセルが、前記細胞により産生された抗体を通過可能な多孔性カプ セル壁を具備する請求項１記載のカプセル。 ３．前記多孔性カプセル壁が、反対電荷のポリ電解質から形成されたポリ電解 質複合体を含む請求項１または２記載のカプセル。 ４．前記多孔性カプセル壁が、硫酸セルロースおよびポリジメチルジアリルア ンモニウムから形成された複合体を含む請求項１ないし３のいずれか１項記載の カプセル。 ５．前記カプセル封入細胞が、クローン抗体を産生するように遺伝的に改変さ れた請求項１ないし４のいずれか１項記載のカプセル。 ６．前記抗体が、免疫グロブリンのIgA、IgM、IgG、IgDまたはIgEクラスに属 する請求項１ないし５のいずれか１項記載のカプセル。 ７．請求項１ないし６のいずれか１項記載のカプセルであって、前記抗体が、 ウイルス感染細胞の表面上にあるウイルス表面マーカー がん細胞 自己免疫疾患の病理学的効果に関与するＴまたはＢリンパ球 寄生生物の表面マーカーまたは 有害効果を伴って循環する抗原 に結合し、細胞増殖抑制性または細胞毒性効果を示す抗体から選択されるか、ま たは、 前記抗体が、ウイルスの細胞感染に必要なウイルスレセプターに結合し阻害す る抗体、ウイルスへの結合を介した直接的な中和効果を有する抗体もしくは循環 する有害抗原に対する直接的な中和効果を有する抗体から選択されるカプセル。 ８．ヒトを含めた動物体に移植するための、請求項１ないし７のいずれか1項 記載のカプセル。 ９．皮下移植のための請求項８記載のカプセル。 １０．請求項１ないし９のいずれか１項記載のカプセルの、前記カプセルから 放出された抗体に応答する病気または疾患を治療する際に使用する薬学的組成物 を産生するための使用。 １１．請求項１ないし９のいずれか１項記載のカプセルを含み、前記カプセル から治療上有効な量で放出された抗体に応答する病気または疾患を治療する際に 使用するための薬学的組成物。 １２．請求項１ないし９のいずれか１項記載のカプセル封入細胞により産生さ れた抗体に応答する疾患または病気の治療方法であって、前記カプセルおよび／ または請求項１１記載の薬学的組成物の、ヒトを含めた動物生体への適用を含む 方法。 １３．前記カプセルおよび／または薬学的組成物の移植を含む請求項１２記載 の方法。 １４．皮下移植を含む請求項１３記載の方法。 １５．がんおよび／もしくは自己免疫疾患を治療し、および/または寄生生物 および／もしくは病原性ウイルスによる感染を治療および／もしくは防御する請 求項１２ないし１４のいずれか１項記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ， ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＷ (72)発明者 ペルグラン、ミレイア フランス国、34000 モンペリエ、リュ・ ピエール・コシュロー 38、アパルトマン 21、レ・ジャルダン・デュ・シャトー (72)発明者 マラン、マリアンナ フランス国、34090 モンペリエ、リュ・ ドゥ・レギュロンギュ 459、アパルトマ ン 48、バティマン ６、レジダーンス・ ラ・シャルムレ (72)発明者 ザラー、ロベルト ドイツ連邦共和国、 デー―80636 ミュ ンヘン ユタシュトラーセ 22 (72)発明者 サルモンス、ブライアン ドイツ連邦共和国、 デー―85229 マル クト・インデルスドルフ、ミッテルフェル トシュトラーセ 11

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．抗体産生細胞をカプセル封入するカプセルであって、前記細胞を含有する コアと、前記コアを取り囲み、且つ前記細胞により産生された抗体を通過可能で ある多孔性カプセル壁とを備えたカプセル。 ２．前記多孔性カプセル壁が、反対電荷のポリ電解質から形成されたポリ電解 質複合体から成る請求項１記載のカプセル。 ３．前記多孔性カプセル壁が、硫酸セルロースおよびポリジメチルジアリルア ンモニウムから形成された複合体から成る請求項２記載のカプセル。 ４．前記細胞が、クローン抗体を産生するように遺伝的に改変された請求項１ ないし３記載のカプセル。 ５．前記抗体が、免疫グロブリンのIgA、IgM、IgG、IgDまたはIgEクラスに属 する請求項１ないし４記載のカプセル。 ６．請求項１ないし５記載のカプセルであって、前記抗体が、 ウイルス感染細胞の表面上にあるウイルス表面マーカー がん細胞 自己免疫疾患の病理学的効果に関与するＴまたはＢリンパ球 寄生生物の表面マーカーまたは 有害効果を伴って循環する抗原 に結合し、前記細胞に対して細胞増殖抑制性または細胞毒性効果を示す抗体から 選択されるか、または、 前記抗体が、ウイルスの細胞感染に必要なウイルスレセプターに結合し阻害す る抗体、ウイルスへの結合を介した直接的な中和効果を有する抗体もしくは循環 する有害抗原に対する直接的な中和効果を有する抗体から選択されるカプセル。 ７．請求項１ないし６記載のカプセルの、前記カプセルから放出された抗体に 応答する病気または疾患を治療するための、ヒトを含めた動物生体への移植のた めの使用。 ８．皮下移植のための請求項７記載の使用。 ９．請求項１ないし６記載のカプセルの、前記カプセルから放出された抗体に 応答する病気または疾患を治療する薬学的組成物を産生するための使用。 １０．請求項１ないし６記載のカプセルを含有し、前記カプセルから治療上有 効な量で放出された抗体に応答する病気または疾患を治療するための薬学的組成 物。 １１．請求項１ないし６記載のカプセル封入細胞により産生された抗体に応答 する疾患または病気の治療方法であって、前記カプセルおよび／または請求項１ ０記載の薬学的組成物の、ヒトを含めた動物生体への移植を含む方法。。 １２．皮下移植を含む請求項１１記載の方法。 １３．がんもしくは自己免疫疾患を治療するか、または寄生生物もしくは病原 性ウイルスによる感染を治療もしくは防御する請求項１１または１２記載の方法 。