RU2173986C2 - Имплантируемые агарозно-коллагеновые шарики, содержащие клетки, которые продуцируют способный к диффузии биологический продукт, и их применение - Google Patents
Имплантируемые агарозно-коллагеновые шарики, содержащие клетки, которые продуцируют способный к диффузии биологический продукт, и их применениеInfo
- Publication number
- RU2173986C2 RU2173986C2 RU98119683A RU98119683A RU2173986C2 RU 2173986 C2 RU2173986 C2 RU 2173986C2 RU 98119683 A RU98119683 A RU 98119683A RU 98119683 A RU98119683 A RU 98119683A RU 2173986 C2 RU2173986 C2 RU 2173986C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- ball
- agarose
- collagen
- factor
- Prior art date
Links
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 title claims abstract description 44
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 23
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 title abstract description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims description 131
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 28
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 27
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 16
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 10
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 3
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 2
- 230000001575 pathological Effects 0.000 claims 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000379 polymerizing Effects 0.000 claims 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 abstract description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000051 modifying Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 32
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 8
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 7
- 206010012601 Diabetes mellitus Diseases 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 210000004153 Islets of Langerhans Anatomy 0.000 description 5
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000001143 conditioned Effects 0.000 description 4
- 239000003636 conditioned culture media Substances 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 206010018987 Haemorrhage Diseases 0.000 description 3
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 3
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 3
- 239000003519 biomedical and dental material Substances 0.000 description 3
- 230000000740 bleeding Effects 0.000 description 3
- 231100000319 bleeding Toxicity 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 210000001015 Abdomen Anatomy 0.000 description 2
- 210000000683 Abdominal Cavity Anatomy 0.000 description 2
- 208000009956 Adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 2
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 2
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 2
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 208000000409 Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 210000001035 Gastrointestinal Tract Anatomy 0.000 description 2
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 229940088597 Hormone Drugs 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 229940049954 Penicillin Drugs 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 2
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 108010045569 atelocollagen Proteins 0.000 description 2
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 2
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 2
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001610 euglycemic Effects 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 2
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000002633 protecting Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 2
- 230000001228 trophic Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethyl 2-methylacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCO WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003497 Asphyxia Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 229920002301 Cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241001315286 Damon Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004408 Hybridomas Anatomy 0.000 description 1
- 229960003444 IMMUNOSUPPRESSANTS Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 1
- 210000000936 Intestines Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102100006003 MT3 Human genes 0.000 description 1
- 102100006037 MUC1 Human genes 0.000 description 1
- 101700052761 MUC1 Proteins 0.000 description 1
- 210000000496 Pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 208000006265 Renal Cell Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002784 Stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 229960001052 Streptozocin Drugs 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N Streptozotocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 1
- 206010047461 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic Effects 0.000 description 1
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 1
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 1
- 229960000070 antineoplastic Monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic Effects 0.000 description 1
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic Effects 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed Effects 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 210000003890 endocrine cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 108010075381 growth inhibitory factor Proteins 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppresant Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000060 monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000069 prophylaxis Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous Effects 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000036435 stunted growth Effects 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к медицине. Имплантируемые шарики, которые сделаны из агарозы и коллагена и/или покрыты агарозой, содержат внутри выборки клеток. Клетки продуцируют способные к диффузии биологические продукты. Такие шарики можно применить как имплантаты, чтобы модулировать иммунный ответ реципиента. Эти шарики также можно применять в условиях in vitro, чтобы способствовать росту специфических типов клеток, продуцировать желаемые продукты в культуре или подавлять рост определенных клеток. Такие имплантаты также могут подавлять рост определенных клеток, будучи введенными какому-либо субъекту, в частности раковых клеток. Изобретение позволяет доставлять клетки в эффективной и безопасной форме. 6 с. и 17 з.п.ф-лы, 5 табл.
Description
Изобретение относится к инкапсуляции клеток в агарозе и коллагене с последующим покрытием агарозой, к терапевтическим методам, которые используют такие материалы и клетки, и к их производству.
Инкапсуляция различных биологических материалов в биологически совместимых материалах является методикой, которая какое-то время уже использовалась, но с ограниченным успехом. Примерами уровня техники в этой области являются патенты США за N 5227298 (Weber, et al.): 5053332 (Cook et al.); 4997443 (Wathall et al.); 4971833 (Larsson et al.): 4902295 ((Wathall et al. ); 4798786 (Tice et al.); 4673566 (Goosen et al.); 4647563 (Mosbach et al.): 4409331 (Lim); 4392909 (Lim); 4352883 (Lim) и 4663286 (Tsang et al.). Интерес также представляет одновременно рассматриваемая заявка с серийным N 08/483738, поданная 7 июня 1995 на Jain et al., которая включена сюда путем ссылки. Jain et al. обсуждает с некоторой степенью детализации инкапсуляцию секреторных клеток в различные биосовместимые материалы. Как рассмотрено здесь, секреторными клетками являются клетки, которые секретируют биологические продукты. Обычно секреторные клетки обладают по крайней мере некоторыми свойствами эндокринных клеток, и обычно их можно рассматривать как эквиваленты клеток, которые являются эндокринными по природе. В одновременно рассматриваемой заявке обсуждаются, например, инкапсуляция клеток, продуцирующих инсулин, предпочтительно в виде островков, в агарозно-коллагеновые ширики, которые также покрыты агарозой. Получающиеся продукты полезны в лечении состояний, например диабета, когда субъекту требуется инсулиновая терапия.
В заявке от Jain et al. рассматриваются с некоторой степенью детализации существовавшие прежде подходы в этой области, которые использовались в трансплантационной терапии. Они суммированы также и здесь.
Известны пять основных подходов к защите трансплантируемой ткани от иммунного ответа хозяина. Все они включают в себя попытки изолировать трансплантированную ткань от иммунной системы хозяина. Те методики иммуноизоляции, которые применялись, включают в себя экстраваскулярные диффузионные камеры, интраваскулярные диффузионные камеры, интраваскулярные ультрафильтрационные камеры, микроинкапсуляцию и макроинкапсуляцию. Однако все эти методы оказались неудачными из-за одной или более проблем из числа следующих: фиброзная реакция хозяина на материал имплантата, нестабильность материала имплантата, ограниченная диффузия питательных веществ через полупроницаемые мембраны, проницаемость стимуляторов секреции и продуктов и задержка при диффузии через полупроницаемые мембранные барьеры.
Например, известна процедура микроинкапсуляции для заключения в полупроницаемую мембрану жизнеспособных клеток, тканей и других лабильных мембранных структур, которую Lim разработал в 1978 г. (Lim, Research report to Damon corporation (1978)). Lim применял микрокапсулы из альгинатов и поли-L-лизина, чтобы инкапсулировать островки Лангерганса. В 1980 было сообщено о первом успешном применении этой новой методики in vivo в исследованиях диабета (Lim et at., Science 210: 908 (1980)). Результатом имплантации этих микроинкапсулированных островков Лангерганса было поддержание эугликемического состояния у животных с диабетом. Однако другие исследователи, повторяя эти эксперименты, обнаружили, что альгинат вызывает тканевую реакцию, и не смогли воспроизвести результаты Lim et al. (Lamberti et al. Applied Biochemistry and Biotechnology 10: 101 (1984); Dupuy et al. J. Biomed. Material Res. 22: 1061 (1988); Weber et al. Transplantation 49: 396 (1990) и Doon-shiong et al. Transplantation Proceedings 22: 754 (1990)). Теперь считается, что причиной ограниченной стабильности и биосовместимости этих микрокапсул in vivo является растворимость этих полимеров в воде (Dupuy et al., см. выше; Weber et al., см. выше; Doon-shiong et al., см. выше: Smidsrod, Faraday Discussion of Chemical Society 57: 263 (1974)).
Недавно Iwata et al. (lwata et al., J. Biomedical Material and Res. 26: 967 (1992)) использовали агарозу для микроинкапсуляции аллогенных панкреатических островков и обнаружили, что она может использоваться как среда для приготовления микрошариков. В их исследовании 1500-2000 островков были микроинкапсулированы индивидуально в 5% агарозе и имплантатированы мышам с стрептозотоцин-индуцированным диабетом. Имплантаты сохраняли жизнеспособность в течение длительного времени, а реципиенты сохраняли нормогликемию неопределенно долго.
Однако их метод страдает множеством недостатков. Он громоздок и неаккуратен. Например, многие шарики остаются покрытыми частично, и образуются многие сотни шариков из пустой агарозы. Таким образом, требуется дополнительное время для того, чтобы отделить инкапсулированные островки от пустых шариков. Боле того, большая часть имплантированных микрошариков собирается в тазовой полости, и для достижения нормогликемии требуется большое число островков в полностью покрытых индивидуальных шариках. И, кроме того, трансплантированные шарики трудно взять обратно, они имеют склонность к ломкости и легко высвобождают островки при малейшем повреждении.
Процедура макроинкапсуляции также прошла проверку. Для иммуноизоляции островков Лангерганса готовили макрокапсулы из множества разных материалов, таких как поли-2-гидроксиэтилметакрилат, поливинилхрорид-C-акриловая кислота и ацетат целлюлозы. (Cм. Altman et al., Diabetes 35: 625 (1986); Altman et al., Transplantation: American Society of Artificial Internal Organs 30: 382 (1984): Ronel et al., J. Biomedical Material Research 17: 855 (1983); Klomp et al. , J. Biomedical Material Research 17:865-871 (1983)). Во всех этих исследованиях была достигнута только временная нормализация гликемии.
Archer et al. (Journal of Surgical Research 28: 77 (1980)) использовали полые волокна из акрилового сополимера для того, чтобы временно предотвратить отторжение ксенографтов островков. Они сообщили о длительном сохранении жизнеспособности имплантатов, представляющих собой диспергированную поджелудочную железу новорожденной мыши, в полых волокнах, которые были трансплантированы хомякам с диабетом. Недавно Lacy et al. (Science 254: 1782- 1784 (1991)) подтвердили их результаты, но обнаружили, что эугликемическое состояние является временной фазой. Они нашли, что, когда островки вводятся в волокно, они агрегируют в полых трубках, результатом чего является некроз в центральной части массы островков. Центральный некроз мешал пролонгации трансплантата. С целью решить эту проблему эти авторы использовали альгинат, чтобы диспергировать островки внутри волокна. Однако этот эксперимент не был повторен в расширенном варианте. Поэтому функционирование такой мембраны в качестве среды для трансплантации островков людям остается под вопросом.
Таким образом, существует необходимость в осуществлении пересадки секреторных клеток и, в особенности, сохранении жизнеспособности аллографтов и ксенографтов панкреатических островков без хронического применения иммуносупрессоров.
В вышеуказанной работе Jain et al. эти изобретатели сообщили, что инкапсулирование секреторных клеток в материале, представляющем собой гидрофильный гель, имеет результатом функциональный неимуногенный материал, который можно трансплантировать животным и хранить длительное время. Инкапсуляция секреторных клеток дает более эффективную и регулируемую методику для трансплантации секреторных клеток. Методика инкапсуляции была описана как полезная для инкапсуляции других биологических агентов, таких как ферменты, микроорганизмы, трофические агенты, включая получаемые рекомбинантными методами трофические агенты, цитотоксические агенты и хемотерапевтические агенты. Была обсуждена полезность инкапсулированных биологических агентов для лечения состояний, о которых известно, что они поддаются действию таких биологических агентов.
В обозначенной выше заявке никак не обсуждается включение клеток, которые продуцируют способные к диффузии биологические материалы, при том что последние полезны в терапевтическом контексте. Здесь же проведено различие между секреторными клетками и клетками, которые производят биологические материалы, способные к диффузии. Первые, как они, например, приведены в заявке Jain, обычно соответствуют продуктам, таким как гормоны, агенты клеточной сигнализации и т. д. , которые в норме считаются биологическими "мессенджерами" (посланниками). В отличие от них биологические материалы, способные к диффузии, соответствуют таким материалам, как пептиды, представляемые главным комплексом гистосовместимости (МНС: Major Histocompatibility Complex), и регуляторы клеточной экспрессии, такие как супрессоры, промоторы, индукторы и т.д. В области онкологии это различие будет видно на примере того, что будет рассмотрено ниже.
Обширные исследования рака включают работы по изучению гетерогенных клеточных экстрактов и различных клеточных компонентов. С помощью моноклональных антител в этой области идентифицированы важные связанные с раком антигены, например GM2, TF, STn, MUC-1 и различные полученные от них эпитопы. Существующая теория постулирует, что эпитопы этих разнообразных опухолевых маркеров образуют нековалентные комплексы с молекулами МНС, образуя таким образом агротипы для специфических цитолитических Т-клеток. Этот механизм не сильно отличается от разных механизмов, вовлеченных в биологическую реакцию на вирусные инфекции. В этой связи надо принять во внимание работы Van der Bruggen et al. (Science 254: 1643-1647 (1991)): Boon et al. (5, 405, 940) и Boon et al. (5, 342, 774), которые все включены путем ссылки.
Дополнительные исследования, которые шли параллельно с работой по идентификации так называемых раковых эпитопов, были сосредоточены на регуляции раковой пролиферации, такой как осуществляемая путем подавления, или, что будет более общим, биомодуляции. См. например Mitchell (J. Clin. Pharmacol 32: 2-9 1992)), MacLean et al. (Can. J. Oncol. 4: 249-254 (1994)). Целью, которая объединяет все эти различные подходы к раку, является такая модификация иммунного ответа организма-хозяина, которая привела бы к некоторому улучшению состояния пациента.
Ключевой для всех этих подходов является активность одного или нескольких способных к диффузии биологических продуктов, которые действуют совместно с другими материалами так, чтобы модулировать иммунный ответ. Boon et al. и van der Bruggen et al. описывают небольшие пептидные молекулы. Mitchell et al. обсуждают молекулы побольше, которые функционируют, например, как супрессоры.
Одна из проблем со всеми терапевтическими подходами, которые используют эти материалы, состоит в том, чтобы доставлять их в безопасной и эффективной форме. Это не просто. К удивлению, сейчас обнаружено, что методики Jain et al. , которые были так полезны в разработке способов лечения тех состояний, для которых требуются продукты секреторных клеток, теперь можно использовать в других областях.
То, как можно это осуществить, является предметом данного изобретения, детальное описание которого следует ниже.
Пример 1.
В этом и последующих примерах использованы клетки RENCA. Эти клетки представляют собой клетки спонтанной почечной аденокарциномы мышей BALB/C, которые широко доступны, будучи поддерживаемыми в культурах как in vitro, так и in vivo. См. Franco et al. Cytokine Induced Tumor Immunogenecity. 181-193 (1994).
Образцы замороженных клеток RENCA оттаивали при 37oC и затем помещали во флаконы для тканевых культур, содержащие модифицированную эссенциальную среду Дульбекко (D-MEM: Dulbecco's Modified Essential Medium), в которую добавляли 10% бычью сыворотку, пенициллин (100 ЕД/мл) и стрептомицин (50 мкг/мл) с получением того, что далее здесь будет называться "полная среда".
Клетки растили до конфлюэнтности и затем трипсинизировали с последующей промывкой сбалансированным солевым раствором Хэнка, а затем полной средой, упомянутой выше.
Чтобы определить, эффективно ли клетки RENCA образуют опухоли, по 106 этих клеток вводили двум мышам BALB/C внутрибрюшинно. Мышей наблюдали в течение 3-4 недель. Клинически они выглядели нормально в первые две недели и проявляли нормальную активность. Затем становились очевидными клинические проявления рака. Одна мышь умерла через 23 дня, а вторая через 25 дней. После смерти мышей обследовали и отметили наличие множества опухолей разных размеров. Некоторые из этих опухолей были еще и кровоточащими.
Пробу одной из опухолей, взятой у одной из мышей, фиксировали в 10% формалине, чтобы позже провести гистологическое исследование.
Пример 2
После демонстрации того, что клетки RENCA действительно росли in vivo, были проведены исследования с целью определить, могут эти клетки расти в шариках по данному изобретению.
После демонстрации того, что клетки RENCA действительно росли in vivo, были проведены исследования с целью определить, могут эти клетки расти в шариках по данному изобретению.
Клетки RENCA растили до конфлюэнтности, как описано, выше и трипсинизировали и промывали, как описано выше. Затем готовили пробы клеток численностью от 60000 до 90000. Затем клетки центрифугировали при 750 об./мин и удаляли жидкость. Затем клетки суспензировали в растворе 1% ателоколлагена в забуференном фосфатом физрастворе, pH 6,5.
1% раствор агарозы с низкой вязкостью готовили в минимальной эссенциальной среде (MEM: Minimal Essential Medium), выдерживали при 60oC, a затем 100 мкл этого раствора добавляли к суспензии клеток RENCA и ателлоколлагена, описанной выше. Затем эти материалы немедленно переносили в виде одной большой капли в стерильное минеральное масло, имеющее комнатную температуру. Эта смесь образовывала один гладкий полутвердый шарик. Всю эту процедуру повторяли для получения множества таких шариков.
Через одну минуту шарики переносили в описанную выше полную среду при 37oC. Затем шарики трижды промывали минимальной эссенциальной средой, содержащей указанные выше антибиотики. Затем шарики инкубировали в течение ночи при 37oC в увлажненной атмосфере, состоящей из воздуха и 5% CO2. После инкубации шарики, теперь твердые, переносили в стерильную ложку, которая содержала 1 мл 5% агарозы в минимальной эссенциальной среде. Шарики перекатывали в этом растворе 2-3 раза, чтобы равномерно покрыть их агарозой. Затем шарики до затвердевания агарозы переносили в минеральное масло, чтобы получить гладкую внешнюю поверхность. Через 60 секунд промывали шарики пять раз полной средой при 37oC, чтобы удалить масло. Затем следовала инкубация в течение ночи (37oC, увлажненная атмосфера, состоящая из воздуха и 5% CO2). Эти шарики, содержащие клетки RENCA, использовали в последующих экспериментах.
Пример 3
Перед проведением исследований in vivo было необходимо определить, станут ли клетки RENCA расти в шариках, приготовленных, как описано выше.
Перед проведением исследований in vivo было необходимо определить, станут ли клетки RENCA расти в шариках, приготовленных, как описано выше.
Для этого инкубировали шарики, приготовленные, как обсуждено в примере 2, в среде, описанной в примере 2, в течение трех недель в указанных условиях. Затем три из этих шариков разрезали на маленькие кусочки и культивировали в стандартном флаконе для культивирования так, чтобы был прямой контакт как с флаконом, так и культуральной средой.
Наблюдение этих культур показало, что клетки росли и образовывали стандартные колонии клеток RENCA. Это указывало на то, что клетки в шариках оставались жизнеспособными.
Пример 4
Затем провели эксперименты in vivo. В этих экспериментах инкубировали шарики в течение семи дней при 37oC. После этого трансплантировали шарики мышам. Для этого у каждой из четырех мышей делали срединный разрез, выполненный внутрибрюшинно, и имплантатировали три шарика, каждый с 60000 клеток RENCA. Затем разрезы закрывали (двухслойное ушивание) с помощью абсорбируемого шва. Эти четыре мыши (BALB/C) были нормальными самцами весом 24-26 г, с виду здоровыми. Ставили две серии контролей. В первой серии две мыши получали по три шарика, не содержащих клеток RENCA, а во второй серии с двумя мышами не делали вообще ничего.
Затем провели эксперименты in vivo. В этих экспериментах инкубировали шарики в течение семи дней при 37oC. После этого трансплантировали шарики мышам. Для этого у каждой из четырех мышей делали срединный разрез, выполненный внутрибрюшинно, и имплантатировали три шарика, каждый с 60000 клеток RENCA. Затем разрезы закрывали (двухслойное ушивание) с помощью абсорбируемого шва. Эти четыре мыши (BALB/C) были нормальными самцами весом 24-26 г, с виду здоровыми. Ставили две серии контролей. В первой серии две мыши получали по три шарика, не содержащих клеток RENCA, а во второй серии с двумя мышами не делали вообще ничего.
Через три недели после имплантатации все мыши получали внутрибрюшинные инъекции по 106 клеток RENCA. Спустя 18 дней одна контрольная мышь умерла. Всех остальных мышей забили и исследовали.
У контрольных мышей были найдены многочисленные опухоли, тогда как у мышей, которые получили имплантаты клеток, инкапсулированных в шариках, были только случайно расположенные в брюшной полости узлы.
Из этих обнадеживающих экспериментов следовала схема эксперимента, описанного в следующем примере.
Пример 5
В этих экспериментах были смоделированы сформированные раковые опухоли путем введения клеток RENCA под капсулу одной почки каждой из шести мышей BALB/C. Спустя 15 дней мышей разбили на две группы. Каждая из трех мышей первой группы получила по три шарика, как описано выше в примере 4. Вторая группа (контрольная) получила шарики, которые не содержали клеток RENCA.
В этих экспериментах были смоделированы сформированные раковые опухоли путем введения клеток RENCA под капсулу одной почки каждой из шести мышей BALB/C. Спустя 15 дней мышей разбили на две группы. Каждая из трех мышей первой группы получила по три шарика, как описано выше в примере 4. Вторая группа (контрольная) получила шарики, которые не содержали клеток RENCA.
Через 4-5 дней мыши, которые получили имплантаты, содержащие клетки RENCA, выглядели сонливыми, а их мех стал взъерошенным, тогда как контрольная группа оставалась энергичной, без всяких изменений в состоянии их меха. Однако через десять дней после имплантатации (25 дней после введения клеток RENCA) контрольные мыши становились вялыми, брюхо у каждой было вздутым.
Одна из трех контрольных мышей умерла на четырнадцатый день после трансплантации шариков. После этого мыши были забиты.
Полости тела контрольных мышей имели обильные кровотечения с многочисленными опухолями по всему пищеварительному тракту, печени, желудку и легким. Вся брюшная полость стала неразличимой из-за безудержного опухолевого роста. У мышей, которые получили шарики с инкапсулированными клетками RENCA, не было кровотечений и было только немного опухолевых узлов в пищеварительном тракте. Сравнение экспериментальных и контрольных групп показало, что в экспериментальной группе узлы не прогрессировали.
Пример 6
Рост свободно инокулированных клеток RENCA подавлен, когда их инкубируют с инкапсулированными клетками RENCA. Эксперименты следующей серии были проведены, чтобы определить, наблюдается ли этот эффект с другими клетками.
Рост свободно инокулированных клеток RENCA подавлен, когда их инкубируют с инкапсулированными клетками RENCA. Эксперименты следующей серии были проведены, чтобы определить, наблюдается ли этот эффект с другими клетками.
Линию клеток аденокарциномы, а именно ММТ (опухоль молочной железы мышей), получили из American Type Culture Collection. Инкапсулированные клетки ММТ готовили, как описано выше, но с клетками ММТ, чтобы получить шарики, содержащие 120000 или 240000 клеток в одном шарике. После приготовления шариков их использовали, чтобы определить, ингибируют ли они пролиферацию клеток RENCA in vitro. Конкретно, готовили две чашки Петри с шестью лунками посредством инокуляции в каждую лунку по 1•104 клеток RENCA в четырех мл среды. В каждой чашке использовали три лунки как контрольные, а три как экспериментальные. Одна из трех контрольных лунок в каждой чашке получила один шарик. Каждая из остальных лунок получила либо два, либо три пустых шарика. Вторую лунку обрабатывали так же, причем лунки получали один, два или три шарика, содержащих 120000 или 240000 клеток ММТ. Инкубировали лунки при 37oC в течение недели, после чего трипсинизировали клетки RENCA, промывали их и подсчитывали с помощью гемоцитометра. Результаты приведены в табл. 1.
Пример 7
После получения результатов примера 6 такие же эксперименты были проведены с использованием 1•104 клеток ММТ, а не клеток RENCA. Эксперименты были выполнены в точности, как в примере 6. Результаты представлены в табл. 2.
После получения результатов примера 6 такие же эксперименты были проведены с использованием 1•104 клеток ММТ, а не клеток RENCA. Эксперименты были выполнены в точности, как в примере 6. Результаты представлены в табл. 2.
Эти результаты побудили провести эксперимент in vivo. Он представлен в примере 8.
Пример 8
Клетки RENCA, которые использовались в предыдущих примерах, представляют собой клетки рака почек. С целью более полно продемонстрировать общую действенность данного изобретения была проведена работа с использованием других типов раковых клеток. Конкретно использовали клетки аденокарциномы.
Клетки RENCA, которые использовались в предыдущих примерах, представляют собой клетки рака почек. С целью более полно продемонстрировать общую действенность данного изобретения была проведена работа с использованием других типов раковых клеток. Конкретно использовали клетки аденокарциномы.
Линию клеток опухоли молочной железы мышей (ММТ) получали из American Type Culture Collection. С использованием протокола, описанного выше, готовили имплантаты, которые содержали 120000 клеток в одном шарике и 240000 клеток в одном шарике.
Использовали экспериментальную модель на мышах, описанную выше. Двадцать две мыши разбили на группы из 4, 9 и 9 животных. Первую группу, то есть контроль, разбили далее на три группы из двух, одной и одной мыши. Первая подгруппа получала имплантаты из одного шарика, не содержавшего клеток. Одна мышь получила два пустых шарика, и одна получила три пустых шарика.
В экспериментальной группе A (9 животных) шарики содержали 120000 клеток, тогда как в группе Б шарики содержали 240000 клеток. В группах А и Б было по три подгруппы, в каждой по три мыши. Подгруппы получали один, два и три шарика, содержащих клетки ММТ.
Через двадцать один день после имплантатации все животные получали инъекции 40000 клеток RENCA. Немедленно после инъекции мыши становились сонливыми, с взъерошенным мехом. Это продолжалось около пяти дней, после чего восстанавливалось нормальное поведение.
Через двадцать дней у контрольных мышей брюхо было вздутым, а мех чрезвычайно взъерошенным. Одна контрольная мышь умерла через 25 дней после инъекции, в то время как состояние остальных контрольных мышей выглядело терминальным. Всех мышей забили и увидели, что у них развились опухоли. Эти наблюдения записаны в табл. 3.
Эти результаты показывают, что из восемнадцати проверенных мышей у тринадцати болезни не было. Из мышей группы (A) у одной было немного узлов, а у другой - немного опухолей. У одной мыши, которая получила два шарика, было немного опухолей.
В группе Б у одной мыши, которая получила один шарик, и у одной мыши, которая получила два шарика, было немного опухолей, заплетенных в кишечнике. У одной из мышей, которая получила три шарика, развилась большая твердая опухоль, и с виду мышь была очень слабой. Тем не менее, в целом результаты показали, что инкапсулированные клетки опухоли молочной железы мыши ингибируют образование опухоли.
Пример 9
Как предполагалось выше, применение данного изобретения имеет результатом получение некоего материала или фактора, который ингибирует и/или предотвращает пролиферацию опухолевых клеток. Это было исследовано далее в нижеследующих экспериментах.
Как предполагалось выше, применение данного изобретения имеет результатом получение некоего материала или фактора, который ингибирует и/или предотвращает пролиферацию опухолевых клеток. Это было исследовано далее в нижеследующих экспериментах.
Дополнительные шарики готовили, как описано выше в примере 2, за исключением того, что не включали ателлоколлаген. Следовательно, эти шарики являются агарозо-агарозными шариками. В них так, как описано выше, заключали вышеописанные клетки RENCA.
Затем в качестве контрольной и экспериментальной группы использовали две серии из трех планшетов с шестью лунками. В контрольной группе в лунки вносили по 4 мл полной среды RPMI (10% фетальной телячьей сыворотки и 11 мл/л пенициллина). Затем в каждую лунку контрольной группы инокулировали по 10000 клеток RENCA.
В экспериментальной группе полную среду RPMI кондиционировали добавлением материала, выделенного путем инкубации десяти иммуноизолированных содержащих клетки RENCA шариков (120000 клеток на шарик) в чашке Петри размером 35х100 мм, содержащей 50 мл полной среды RPMI. Через пять дней инкубации среду собирали из чашек и 4 мл среды помещали в каждую экспериментальную лунку. Затем в эти лунки инокулировали 10000 клеток RENCA.
Все планшеты (как контрольные, так и экспериментальные) инкубировали при 37oC в течение 5 дней. После периода инкубации клетки промывали при трипсинизации и подсчитывали с помощью гемоцитометра. После трипсинизации клетки из каждой лунки планшетов объединяли и подсчитывали. Результаты приведены в табл. 4.
Эти результаты показывают, что клетки при ограничении их, например, в шариках по данному изобретению, продуцируют некий фактор, что приводит к подавлению пролиферации опухолевых клеток. Этот ингибирующий фактор ограничения продуцируется клетками ввиду их заключения в шарик и отличается от других материалов, таких как факторы контактного ингибирования, которые продуцируются, когда клетки контактируют одна с другой.
Пример 10
Эксперименты, описанные выше, показали, что рост клеток RENCA в кондиционированной среде составлял около половины от роста этих клеток в контрольной среде. В экспериментах, описанных здесь ниже, проверяется, останется ли фактор ингибирования роста активным после замораживания кондиционированной среды.
Эксперименты, описанные выше, показали, что рост клеток RENCA в кондиционированной среде составлял около половины от роста этих клеток в контрольной среде. В экспериментах, описанных здесь ниже, проверяется, останется ли фактор ингибирования роста активным после замораживания кондиционированной среды.
Среду, кондиционированную клетками RENCA, готовили инкубацией десяти иммуноизолированных шариков, содержащих клетки RENCA, в течение пяти дней. Инкубацию проводили в чашках Петри размером 35х100 мм с 50 мл полной среды RPMI при 37oC. После инкубации собирали среду и хранили ее при -20oC. Кондиционированную среду готовили инкубацией шариков, содержащих иммуноизолированные клетки ММТ (опухоль молочной железы мыши). Эти шарики содержали 240000 клеток на шарик. В других отношениях все условия были одними и теми же.
Замороженную среду оттаивали при 37oC и затем использовали в нижеследующих тестах. По три планшета с шестью лунками использовали для каждой обработки, а именно: (1) контрольная среда RPMI, (2) замороженная среда, кондиционированная клетками RENCA и (3) замороженная среда, кондиционированная клетками ММТ. В каждую лунку вносили в целом 4 мл среды. Затем во все лунки инокулировали по 10000 клеток RENCA и инкубировали при 37oC в течение 5 дней. После инкубации из каждой лунки брали два планшета образцов, трипсинизировали, объединяли и подсчитывали в гемоцитометре. Через восемь дней таким же образом проверяли три оставшихся планшета каждой лунки.
Результаты приведены в табл. 5.
При сравнении этих результатов с полученными в вышеприведенном примере 6 видно, что, при том что замороженная/оттаянная среда, кондиционированная клетками RENCA, не тормозила рост в той же степени, что и незамороженная среда (сравните примеры 6 и 7), она, тем не менее, тормозила рост. Замороженная среда, кондиционированная клетками ММТ, тормозила рост даже в большей степени, чем незамороженная среда, кондиционированная клетками ММТ. Эти результаты показывают, что из восемнадцати исследованных мышей у тринадцати животных болезни не было. Из мышей группы (А) у одной было немного узлов, а у другой - немного опухолей.
Далее описано изготовление имплантатируемых шариков, которые содержат один или более типов клеток, которые продуцируют какой-либо способный к диффузии биологический продукт в том смысле, в каком это выражение определено здесь. Способный к диффузии биологический продукт представляет собой такой продукт, который оказывает влияние на субъекта, которому имплантатирован этот шарик. Предпочтительно, чтобы этим влиянием была иммуномодуляция, такая как стимуляция иммунного ответа или подавление этого ответа. В случае, например, рака способным к диффузии биологическим продуктом может быть пептид, который образует комплексы с молекулами МНС на раковых клетках у субъекта и таким образом вызывает цитотоксический Т-лимфоцитарный (CTL) ответ на эти клетки, который в свою очередь приводит к снижению опухолевой нагрузки на субъект. Способным к диффузии продуктом может быть также суппрессор опухолевого роста. В связи с такой формой терапии возможно, хотя не обязательно предпочтительно, помещать имплантатируемые шарики в выявленную опухоль или рядом с ней.
Выражение "способный к диффузии биологический продукт" в используемом здесь смысле относится к материалам, таким как белки, гликопротеины, липопротеины, углеводы, липиды, гликолипиды и пептиды. Более конкретно, материалы, такие как антитела, цитокины, гормоны, ферменты и так далее могут быть примерами, но никак не единственными типами включаемых сюда материалов. Исключаются хорошо известные "конечные продукты" клеточных процессов, такие как CO2 и H2O.
Как показывают эксперименты, имплантатируемые шарики можно также применять для профилактики. Хорошо известно, что по меньшей мере часть больных раком предрасположены к рецидивам. Описанные здесь эксперименты показывают, что эти имплантаты могут предотвращать появление или рецидивирование рака посредством биологических эффектов, которое эти способные к диффузии продукты оказывают на какую-либо систему субъекта.
Обсуждение данного изобретения было сосредоточено на подходах in vivo. Надо также понимать, что к данному изобретению существуют подходы in vitro, некоторые из которых обсуждаются здесь. Например, хорошо известно, что многие клетки, которые продуцируют способные к диффузии продукты, при культивировании in vitro требуют присутствия питающих клеток. С такими питающими клетками всегда имеются проблемы. Они могут расти быстрее, чем желаемые клетки, что приводит к фактическому "удушению" материалов, представляющих интерес. Далее, могут быть проблемы с разного рода токсическими продуктами, которые продуцируются питающими слоями. Имплантируемые шарики по данному изобретению действуют почти как клеточные инкубаторы, которые защищают включенные клетки, при этом позволяя способным к диффузии продуктам переходить в культуральную среду, где их можно, например, собирать.
Как указано выше, приготовление имплантируемых шариков требует, во-первых, суспензирования клеток в растворе, предпочтительно водном растворе коллагена. Предпочтительно, чтобы коллаген был ателоколлагеном в растворе с концентрацией от примерно 0,5 до примерно 2%. В зависимости от типа используемых клеток число клеток в растворе в данный момент времени и, следовательно, число клеток в шарике будут варьировать. Предпочтительно, чтобы используемых клеток было от примерно 10000 до примерно 200000 на шарик, более предпочтительно от примерно 30000 до примерно 100000, наиболее предпочтительно от 40000 до 60000.
После суспензирования клеток в коллагеновом растворе к нему добавляют раствор агарозы. Предпочтительно, чтобы этот раствор агарозы имел концентрацию агарозы в пределах от примерно 0,5% до примерно 5%, предпочтительно около 1%. Путем капания смеси на или в инертный материал, такой как TEFLON® или вазелиновое масло, образуется шарик. Этот шарик имеет полутвердую консистенцию. Полутвердый шарик затем переносят в стерильную среду, предпочтительно содержащую антибиотики, промывают и инкубируют, чтобы полимеризовать коллаген. Полимеризация коллагена является хорошо исследованным явлением, и здесь условия, при которых она происходит, не нужно рассматривать подробно.
После затвердевания шарика его покрывают агарозой, предпочтительно перекатывая его в растворе агарозы. Один из предпочтительных способов сделать это состоит в применении простой ложки с покрытием из TEFLON®, которая содержит раствор агарозы с концентрацией предпочтительно от 5 до 10%.
Проведенное выше обсуждение способных к диффузии биологических продуктов не следует истолковывать как ограниченное материалами дикого типа. Например, можно столь же просто использовать трансформированные или трансфецированные клетки хозяина, такие как эукариотические клетки (например клетки линий 293, CHO, COS) или даже прокариотические клетки (например Е. coli), которые были обработаны так, чтобы продуцировать гетерогенный белок, или модифицированы посредством, например, гомологичной рекомбинации, чтобы продуцировать больше желаемых биологических продуктов. Можно также использовать другие материалы, например гибридомы, так что способным к диффузии биологическим продуктом оказывается моноклональное антитело.
Другие признаки и аспекты данного изобретения ясны специалистам, и нет необходимости рассказывать о них здесь.
Употребленные здесь термины и выражения использованы в описательном, а не ограничительном смысле и не предусматривают намерения использовать эти термины и выражения для того, чтобы исключить какие-либо эквиваленты показанных и описанных признаков или их сторон, при полном понимании того, что в объеме данного изобретения возможны разные модификации.
Claims (23)
1. Покрытый агарозой твердый агарозно-коллагеновый шарик, содержащий клетки, которые будучи ограничены продуцируют фактор, который тормозит пролиферацию опухолевых клеток, причем указанный фактор диффундирует через указанный покрытый агарозой твердый агарозоколлагеновый шарик.
2. Шарик по п.1, где указанными клетками являются раковые клетки.
3. Шарик по п.2, где указанными раковыми клетками являются клетки рака почек.
4. Шарик по п.1, где указанный шарик содержит от примерно 10000 до примерно 200000 клеток.
5. Шарик по п.4, где указанный шарик содержит от примерно 30000 до примерно 100000 клеток.
6. Способ введения субъекту фактора, который тормозит пролиферацию опухолевых клеток, при котором указанному субъекту имплантируют шарик по п.1, причем указанный фактор диффундирует через указанный шарик.
7. Способ по п.6, где указанный субъект страдает патологическим состоянием, которое можно лечить указанным фактором.
8. Способ по п.7, где указанное патологическое состояние характеризуется аномальным ростом клеток.
9. Способ по п.8, где указанным патологическим состоянием является рак.
10. Способ изготовления покрытого агарозой агарозно-коллагенового шарика, который содержит клетки, которые будучи ограничены продуцируют фактор, который тормозит пролиферацию опухолевых клеток и который диффундирует через указанный покрытый агарозой твердый агарозно-коллагеновый шарик, при котором суспендируют клетки, которые будучи ограничены продуцируют этот фактор, в содержащем коллаген материале; добавляют агарозу к указанному содержащему коллаген материалу; формируют полутвердый шарик из указанных коллагена, агарозы и клеток; полимеризуют коллаген в указанном полутвердом шарике для формирования твердого агарозно-коллагенового шарика, содержащего указанные клетки, и покрывают агарозной указанный твердый агарозно-коллагеновый шарик, содержащий указанные клетки.
11. Способ по п.10, где указанными клетками являются раковые клетки.
12. Способ по п.10, при котором в указанном содержащем коллаген растворе суспендируют от примерно 10000 до примерно 200000 клеток.
13. Способ по п. 10, где число клеток в указанном содержащем коллаген растворе составляет от примерно 30000 до примерно 100000.
14. Покрытый агарозой, содержащий агарозу шарик, где указанный шарик содержит клетки, которые будучи ограничены продуцируют фактор, который тормозит пролиферацию опухолевых клеток, причем указанный фактор диффундирует через указанный твердый покрытый агарозой содержащий агарозу шарик.
15. Шарик по п.14, где указанными ограниченными клетками являются раковые клетки.
16. Шарик по п.15, где указанными клетками являются клетки рака почек.
17. Шарик по п. 14, где указанный шарик содержит от примерно 10000 до примерно 200000 клеток.
18. Шарик по 17, где указанный шарик содержит от примерно 30000 до примерно 100000 клеток.
19. Способ введения субъекту фактора, который тормозит пролиферацию опухолевых клеток, при котором указанному субъекту имплантируют шарик по п. 14, причем после имплантации указанный фактор диффундирует через указанный шарик.
20. Способ изготовления покрытого агарозой, содержащего агарозу шарика по п.14, причем указанный шарик содержит клетки, которые будучи ограничены в указанном шарике продуцируют фактор, который тормозит пролиферацию опухолевых клеток и который диффундирует через указанный шарик, при котором добавляют раствор, который содержит пробу клеток, которые способны продуцировать фактор, который тормозит пролиферацию опухолевых клеток и который диффундирует через указанный шарик, когда указанные клетки ограничены; формируют полутвердый шарик, включающий в себя указанную агарозу и указанные клетки; полимеризуют эту агарозу в указанном полутвердом шарике для формирования твердого агарозного шарика, содержащего и таким образом ограничивающего указанные клетки, и покрывают агарозой указанный твердый содержащий агарозу шарик, содержащий эти ограниченные клетки.
21. Способ по п.20, где указанными клетками являются раковые клетки.
22. Способ по п.20, при котором в указанном содержащем коллаген растворе суспендируют от примерно 10000 до примерно 200000 клеток.
23. Способ по п. 20, где число клеток в указанном содержащем коллаген растворе составляет от примерно 30000 до примерно 100000 клеток.
Приоритет по пунктам и признакам:
03.04.1996 по пп.1-23;
07.11.1996 - примеры 6-10 описания.
03.04.1996 по пп.1-23;
07.11.1996 - примеры 6-10 описания.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/625,595 | 1996-04-03 | ||
US08/745,063 | 1996-11-07 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU98119683A RU98119683A (ru) | 2000-08-20 |
RU2173986C2 true RU2173986C2 (ru) | 2001-09-27 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
IWATA et al J. Biomedical Material and Res, 1992, 26, 967 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2268735C1 (ru) | Композиции подвергнутых рестрикции клеток, способных к быстрому росту, которые продуцируют вещества, подавляющие пролиферацию клеток, и их применение | |
US5888497A (en) | Agarose coated agarose beads containing cancer cells that produce material which suppresses cancer cell proliferation | |
US20070110773A1 (en) | Composition of restricted cancer cells which produce cancer cell proliferation suppressive materials, and uses thereof | |
EP0914043B1 (en) | Implantable agarose-collagen beads containing cells which produce a diffusible biological product, and uses thereof | |
JP2005104987A5 (ru) | ||
US6303151B1 (en) | Cancer-cell proliferation-suppressing material produced by cancer cells restricted by entrapment | |
RU2173986C2 (ru) | Имплантируемые агарозно-коллагеновые шарики, содержащие клетки, которые продуцируют способный к диффузии биологический продукт, и их применение | |
KR100477296B1 (ko) | 확산성의생물학적산물생산세포를함유하는이식가능한아가로오스-콜라겐비드,및그의용도 | |
AU2003264652B2 (en) | Compositions of restricted cells capable of rapid growth which produce proliferation suppressive materials, and uses thereof | |
MXPA01002927A (en) | Compositions of restricted cells capable of rapid growth which produce proliferation suppressive materials, and uses thereof |