KR20010041528A

KR20010041528A - 면역 반응을 조절하는 방법 및 그 장치

Info

Publication number: KR20010041528A
Application number: KR1020007009699A
Authority: KR
Inventors: 앤토니 세라미; 칼라 세라미; 코하바 겔르벌; 데이비드 도브
Original assignee: 어플라이드 백신 테크놀로지스 코포레이션
Priority date: 1998-03-02
Filing date: 1999-03-02
Publication date: 2001-05-25
Also published as: JP2003523308A; NO20004349L; NO20004349D0; AU3066799A; PL343432A1; TR200003225T2; HUP0101076A2; US20040166141A1; ID26963A; AU756951B2; CN1299272A; RU2225197C2; EP1066028A2

Abstract

본 발명은 면역계 세포에 제어된 방식으로 항원을 노출시킬 수 있는 이식가능한 장치를 이용하여 포유류의 면역 반응을 유도, 자극, 차단 및 감소시킬 수 있는 방법 및 장치를 제공하는 것이다. 장치내에 항원의 생체 이용성을 조절하고, 포유류에 장치를 이식하는 시기와 관련하여 장치내에 항원을 도입하는 시기를 조절함으로써, 항원에 대한 강력하고 오랜 반응을 유도하거나 또는 기존의 또는 발생 가능성이 있는 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 치료요법적 백신화에 이 방법 및 장치를 이용할 수 있고, 예방 목적으로 이용할 수도 있다. 면역성은 세포, 체액성 및 점막성이 된다. 면역 반응의 억제는 알레르기, 자가면역 질환과 같은 상황을 예방 또는 치료하는데 유용한다. 포유류를 이식 항원에 대핸 면역 반응을 억제할 수 있도록 내성을 가지도록 한다. 장치를 이용하여 포유류에 다시 도입시킬 면역 세포를 수득하고, 면역 혈청 및 하이브리도마를 준비할 수 있다.

Description

면역 반응을 조절하는 방법 및 그 장치{METHODS AND DEVICES FOR MODULATING THE IMMUNE RESPONSE}

항원에 면역 반응의 유도 및 반응의 크기는 항원, 다양한 형태의 면역 세포. 사이토킨 및 케모킨을 포함하는 공동-자극 분자간의 복잡한 상호작용에 따라 달라진다. 항원 및 공동 자극 환경에 대한 면역 세포의 노출 시기 및 그 정도에 따라 면역 반응이 추가로 조절된다. 신체내에서, 이와 같은 다양한 세포 형태 및 추가 인자를 임파구와 같은 임파 조직에 용이하게 가져올 수 있다. 이 과정에 관련된 다양한 세포형에서도, 대식세포, 항원 제공 세포, 수상돌기 세포등이 말초에서 국소로 항원을 운반하고, 임파 조직을 구성하고, 항원을 처리하여, T 세포로 항원성 펩티드를 제공하고 뿐만 아니라 공동 자극 분자를 분비한다. 따라서, 항원이 국소적으로 교차된 방식으로 임파기관에 도달하는 경우에, 공동-자극 분자로 구성된 적절한 환경 및 적절한 농도하에서는 임파구에서 반응을 유도할 수 있다.

이와 같은 방식으로 백신화 수단등에 의해 외부 항원을 신체로 도입시켜, 원하는 강력한 면역 반응을 만들 수 있다. 백신화 반응에 이용된 항원에는 감쇠된 또는 비활성화된 박테리아 및 이들의 성분이 포함된다. 백신화 반응의 성공 여부는 부분적으로 항원의 종류 및 그 양, 면역화 부위, 백신반응시에 면역계의 상태에 따라 달라진다. 모든 항원이 균등한 면역원성을 가지지는 않으며, 면역원성이 약한 항원도 있고, 면역화반응의 효과를 증가시키는데 이용될 수 있는 것도 소수 있다. 실험 동물에서 여러 가지 기술을 이용하여, 면역 반응 발생을 강화시킬 수 있는데, 항원에 몇 가지 면역원성 담체 단백질 또는 생분자(가령, 키홀 림페트 헤모시아닌)를 결합시키거나 또는 Freund's Adjuvant 또는 알룸과 같은 어쥬번트를 이용할 수 있지만, 사람을 백신화시키는 경우에는 이와 같은 기술 및 어쥬번트를 이용할 수 없다. 따라서, 감염성 물질에 노출되기 전에 백신화반응으로 예방할 수 있는 여러 질환 또는 기존의 질병의 원인이 되는 물질 또는 암세포와 같은 세포에 대해 효과적인 면역 반응을 일으킬 수 있도록 유도하는 치료 백신의 경우에 환자에 이용할 수 없다.

포유류에서 스펀지 이식 연구를 실행하여, 외부 몸체에 유인되는 면역 세포 집단을 평가하였는데, 이는 소위 무균성 농양을 만드는데, 이식 전후에 스펀지에 항원을 얹어서, 유인된 세포 집단을 연구한다. Vallera et al.(1982, Cancer Research 42:397-404)은 생쥐에 종양 세포를 포함하는 스펀지를 이식하여, 16일 기간동안에 유인된 세포 조성물을 검사하여, 초기에 세포독성 세포 전구물질이 존재하고, 16일경에 세포 독성이 절정에 다다른다는 것을 발견하였다. 종양 세포로 미리 면역화시킨 생쥐에 이식된 종양 세포를 포함하는 스펀지에서 세포 독성 세포가 좀더 빨리 나타난다는 것을 확인하였다. 어느 경우에서도, 비장, 임파구 또는 복막에서 취한 세포에 세포독성이 나타나지 않았는데, 이는 스펀지에서 항원에 대한 반응이 상당히 국소적이라는 것을 말하는 것이다.

Jenski et al.(1985, J. Immunol. Methods 85:153-161)은 유사한 조건을 이용하여 항원이 적하된 스펀지를 이식하여, 거의 치사수준의 방사능을 조사한 후에 유성생식에 의한 골수 이식물을 제공받은 생쥐에서 세포 면역성을 회수하였다. 면역성의 회수는 시간에 따라 스펀지에서 회수된 세포의 세포독성 T 임파세포 활성을 측정하여 실시한다. Zangemeister-Wittke et al.(1989, J. Immunol.. 143:379-385)은 종양 백신을 종양으로 면역한 생쥐에 이식된 스펀지에 종양 백신을 주사하여, 스펀지 부위에서 2차 면역 반응이 발생하는지를 모니터하였다. 이식된 스펀지에 인접하여, 임파구에서 수반되는 효과는 나타나지 않았다.

Chen et al.(1994, Cancer Research 54:1065-1070)은 방사능 조사된 종양 세포를 적하시킨 스펀지 이식물에서 T 세포를 수득하여, 이들 세포가 선택적으로 항-종양 활성을 전달하는데 이용된다는 것을 보여주었다. 지역적인 임파구 및 비장과 함께 스펀지에서 회수된 종양-반응성 세포독성 T 세포의 빈도는 종양 세포 적하된 스펀지 이식물을 제공받은 동물에서 측정한다. 스펀지에는 임파구보다는 4배 이상 높은 빈도의 종양 세포-반응성 세포독성 T 세포를 포함하고, 비장과 비교하였을 때에는 50배 이상 높다.

이와 같은 결함에 효과적으로 이용할 수 있는 백신을 제공하기 위해 상당한 연구가 진행중이지만, 치료 기술 및 재료와 관련된 문제점이 여전히 남아있다. 따라서, 현재의 면역요법 및 치료 과정과 관련된 문제점을 극복할 수 있는 기술 또는 예방 및 치료목적의 백신화와 같은 방법을 개발하여, 건강한 포유류 및 이와 같은 면역요법으로 이익을 얻을 수 있는 집단 모두에 개선된 새로운 효과적인 면역화반응을 실행하는 것이 바람직하다. 또한, 특정 항원 또는 일련의 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 능력으로 또는 예를 들자면, 이식거부의 방지 및 알레르기 치료에 유익한 점을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명이 지향하는 바는 이와 같은 또는 이와 유사한 것을 얻는데 있다.

발명의 요약

본 발명에 따르면, 항원에 대해 포유류에서 면역 반응을 조절하는 방법을 제공하는데, 이는 천공된 단, 불투성 용기에 포함된 다공성 매트릭스로 구성된 장치를 포유류에 이식하는 것이다. 면역 반응을 원하는 항원은 장치의 다공성 매트릭스내에 있다. 항원은 이식 전에 또는 이식후에 장치에 도입시킬 수 있다; 이식하는 시기에 장치의 매트릭스에 존재하는 항원은 이식후에 생체 이용될 수 있는 비-생체이용성 형으로 제공된다. 장치는 면역계의 세포를 유인하여, 장치에 있는 항원에 대항하고, 이와 같은 대항이 항원에 대한 면역 반응을 조절하게 된다. 천공된 용기는 장치내에서 면역 세포에 의해 만들어진 사이토킨 및 다른 공동-자극 인자들을 높은 수분으로 유지시키는 확산 장벽으로 작용하고, 장치내에 다른 면역 세포에 노출되었을 때 원하는 면역 반응 발생을 강화시킨다. 천공으로 인하여, 면역세포의 유입 및 유출이 가능하다. 원하는 면역 반응은 세포, 점막 및 체액 면역성이 포함되고, 건강한 포유류 및 면역치료법으로부터 이익을 얻을 수 있는 집단에 모두 적용할 수 있다.

예를 들면, 본 발명을 실행하는데 있어서, 소량의 항원이 포유류에 이식하기 전 본 발명의 장치에 제공될 수 있다. 적절하게는, 항원은 포유류에 장치를 이식한 후에 약 3일경에 장치의 다공성 매트릭스내에 도입되거나 또는 생체 이용가능하게 된다. 항원에 대한 강력한 면역 반응이 포유류에 도입될 수 있다.

추가 구체예에서, 장치는 신체에서 결국에는 분해되는 생체분해가능한 재질로 구성된다. 또는, 장치는 원하는 효과를 얻은 후에 신체에서 제거해야 한다.

광범위한 측면에서, 본 발명은 다음의 특징을 가지는 포유류를 면역화시키는 이식가능한 장치에 해당하는데; 천공된 단 불투성인 용기에 포함된 다공성 매트릭스, 장치에는 또한 이식하기 전에 생체 이용가능한 형으로 매트릭스에 존재하거나 이식된 후에 매트릭스내에서 생체이용가능해지거나 또는 이식한 후에 항원을 제공한다. 장치에서의 항원의 생체이용 가능성은 항원을 미소구, 미소캡슐 또는 리포좀과 같은 지연 방출 제형등으로 제공하고, 분해되면, 항원이 매트릭스에 방출되도록 하여, 항원을 생체 이용 불가능하게 하여 조절할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법 및 장치를 이용하여 포유류에서 항원에 대한 면역 반응을 감소 또는 하향 조절할 수 있는데, 이때 장치내에 특정 항원의 농도를 높게 하여, 특정 항원에 대한 면역 반응을 억제시키고, 항원에 대한 면역 반응 발생을 저해하는 것이다. 사이토킨 또는 다른 공동-자극 분자로 장치에 제공한다.

본 발명의 방법 및 장치의 유용성에는 선택적인 면역요법, 활성 면역화를 제공하기 위한 목적으로 신체내로 연속적인 재도입 및 면역계의 재구성을 위해 장치로부터 면역 세포를 수득하는 것이 포함된다. 추가 용도에는 사람의 면역 세포를 가지는 동물에 사람의 단클론성 항체를 준비하는 것을 포함하여, 다클론성 항체(면역 혈청) 및 단클론성 항체를 준비하는데 개선점이 포함된다.

하기에서 볼 수 있는 것과 같이, 여기에서 설명하는 본 발명을 이용하여, 임파구의 조성물 및 역할을 닮은 인공적인 환경을 만들고, 장치내에 항원의 생체 이용성을 조절하여, 항체에 대한 강력한 면역 반응을 발생시킬 수 있다. 특정 항원에 대한 다른 조건들 하에, 기존의 면역 반응을 하향 조절할 수 있다.

본 발명은 항원에 대한 포유류에서 면역 반응을 조절하는 방법에 관계하는데, 이때 면역계의 세포에 제어된 방식으로 항원을 노출시키는 이식가능한 장치를 이용한다. 임파구의 조성과 역할을 닮은 인공적인 환경을 만들고, 장치내 항원의 생체 이용성을 조절함으로써 항원에 대해 강한 반응을 유도하거나 또는 기존의 면역 반응을 하향 조절할 수 있다.

도 1은 포유류의 피부에 이식한 후에 9일 경과후 본 발명의 장치내에 세포 집단의 시간별 과정을 나타낸 것이다.

도 2는 장치내에 존재하는 항원 없이 이식후 4일 경에 장치에 있는 세포의 수와 형태를 분석한 것이다.

도 3은 임의 도입된 항원없이 이식후 4, 7, 10일에 장치내에 다양한 세포 형태군의 변화를 나타낸 것이다.

도 4는 이식후 3일, 7일, 10일 경에 장치내에 CD3-양성 세포(T 세포), CD80-양성 세포(B 세포), CD14-양성 세포(항원을 제공하는 세포의 대표적인 서브셋으로 대식세포)의 수에 있어서, 장치내로 도입된 항원의 효과를 나타낸 것이다. 항원은 이식후 4일경에 장치내로 도입된다.

도 5는 장치의 이식후에 10일 경에 생쥐의 비장에서 CD4(헬퍼 T 세포) 및 CD8(세포독성 T 세포)의 발현에서 변화를 분석한 것으로, 장치에는 항원이 없거나 다양한 양의 인플루엔자 항원을 포함하거나 항원 및 어쥬번트와 함께 푸트패드로 면역화시킨 것이다.

도 6에서는 어쥬번트 유무하에 항원을 포함하는 장치가 이식된 또는 항원과 어쥬번트가 있는 푸트패드로 면역화된 생쥐에서 인플루엔자 항원에 대한 비장 세포의 증식성 반응을 검사한 것이다. 비장 T 세포 증식은 감마-인터페론 생산을 측정하여 평가한다.

도 7은 인플루엔자 항원 및 어쥬번트를 가진 푸트패드로 면역화된 생쥐의 슬와 임파구에서 분리한 T 세포에 의한 감마-인터페론 분비 수준을 나타낸 것이다.

도 8은 본 발명의 장치를 이용하여 어쥬번트 유무하에 인플루엔자 항원으로 면역화된 생쥐의 감마-인터페론 분비 수준으로 평가되는 비장 T 세포의 증식성 반응을 나타낸 것이다.

도 9는 본 발명의 장치를 이용하여 어쥬번트 없이 항원 오브알부민의 약량 범위로 면역화된 생쥐에서 감마-인터페론 분비 수준을 측정하고, 동일한 약량의 항원과 어쥬번트를 푸트패드 주사에 의해 면역화시킨 동물의 비장 세포의 증식 반응과 비교하여 비장 T 세포의 활성화 수준을 보여주는 것이다.

도 10은 BCG 어쥬번트 유무하에, 본 발명의 장치를 이용하여, 0, 50㎍, 50ng, 50pg 오브알부민으로 면역화된 생쥐에서 감마-인터페론 분비 수준을 측정하여, 비장 T 세포의 증식성 반응을 나타내는데, 이는 동일한 약량의 항원과 Ribi 어쥬번트를 푸트패드 주사하여 면역화된 동물의 비장 세포의 증식성 반응과 비교한다.

도 11은 다양한 약량의 HIV gp120 펩티드 항원을 포함하는 장치를 이식받은 동물에서 특이적인 항-항원 IgG2a 항체 반응을 나타낸 것으로 이는 동일한 약량의 항원과 어쥬번트를 푸트패드 주사하여 면역화시킨 동물의 것과 비교하였다.

도 12는 도 11에서 설명한 것과 동일한 실험이나, 부스트후에, 제1회 면역화후 3주에, 동일한 경로일 이용하여 초기 면역화반응에 제공된 양의 10%를 사용한다. 동물에 이식된 장치에 항원을 적하시킨다.

도 13은 Ribi 또는 BCG 어쥬번트 유무하에 본 발명의 장치를 이용하여 또는 동일한 어쥬번트와 함께 푸트패드를 이용한 면역화반응에 의해 면역화된 동물에서 HIV gp 120 펩티드에 대한 특이적인 IgG2a 항체 발생을 비교하였다.

도 14는 어쥬번트 없이 본 발명의 장치를 이용하거나 Ribi 어쥬번트를 이용한 푸트패드 면역화반응에 의해 다양한 양의 사이토크롬 C 항원으로 면역화된 동물에서 특이적인 IgG2a 항체 수준을 나타낸 것이다. 생쥐 혈청을 연속적으로 희석하여 순환계 IgG2a 수준을 나타내었다.

도 15는 어쥬번트 없이 본 발명의 장치에서 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질 단편(BHA) 0.1㎍ 또는 10㎍으로 생쥐를 면역화시킨 후에 발생된 전체 인플루엔자 바이러스-특이적인 IgG 수준과 Ribi 어쥬번트와 함께 푸트패드에 제공된 동일한 양의 항원으로 면역화시킨 경우를 비교하였다.

도 16은 판독하기 위해 감마-인터페론을 이용하여 T 세포 활성화 검사 결과를 나타낸 것이다. 어쥬번트없이 본 발명의 장치를 이용하여 인플루엔자 항원으로 생쥐를 면역화시킨 것을 어쥬번트를 이용한 항원으로 푸트패드 면역화시킨 것과 비교하였고, 또한, 이식된 다공성 고분자 매트릭스(본 발명의 장치와 같이, 천공된 용기내에 존재하지 않음)에 있는 항원으로 면역화시킨 것과도 비교하였다.

도 17은 무관한 항원(EBV)으로 인플루엔자 면역화된 생쥐에서 비장 세포를 in vitro 도전시에 상기 실험 결과를 나타낸 것으로 본 발명의 장치를 이용하여 면역반응후에 발생된 반응의 특이성을 나타낸다.

도 18은 본 발명의 장치와 비교하기 위해 스펀지에서 단백질(소 혈청 알부민) 확산 테스트 결과를 나타낸 것이다.

도 19는 생쥐내로 삽입한 후 4일경에 인플루엔자 항원 유무하에 본 발명의 장치에서 추출한 세포의 표현형을 나타낸 것이다. 고유 생쥐의 말초 혈액 임파세포에 있는 동일한 세포형의 값을 나타낸 것이다.

도 20은 혈청에서 수준을 비교함으로써 항원 없이 본 발명의 장치에 있는 자극 사이토킨의 수준을 나타낸 것이다.

도 21은 인플루엔자 바이러스 백신을 포함하는 본 발명의 이식된 장치에 의해, 인플루엔자-감염된 표적 세포 용혈에 의해 측정된 세포독성 T 세포 유도 정도를 나타낸 것으로 어쥬번트와 함께 인플루엔자 바이러스 백신으로 피하 면역화된 동물과 비교하였다.

도 22는 인플루엔자 바이러스 백신을 포함하는 본 발명의 장치로 면역화된 생쥐에서 인플루엔자 바이러스-특이적인 IgG1의 수준을 측정하여, 어쥬번트와 백신으로 피하 면역화된 생쥐의 경우에 체액 반응을 비교하였다.

도 23은 인플루엔자 바이러스 백신을 포함하는 본 발명의 장치로 면역화된 동물에서 발생된 인플루엔자 특이적인 IgG1의 친화력과 백신 및 어쥬번트로 피하 면역화된 동물과 비교하였다.

도 24는 인플루엔자 바이러스 백신을 포함하는 본 발명의 장치로 면역화된 후에 인플루엔자에 도전을 받은 생쥐의 생존을 나타낸 것으로 백신 및 어쥬번트로 피하 면역화된 생쥐의 경우와 비교하였다.

도 25는 근육내 면역화반응과 비교하여 본 발명의 장치를 이용하여, SCID 생쥐에서 상승된 인플루엔자-특이적인 사람 IgG 항체의 역가를 나타낸 것이다.

도 26은 항원의 근육내 투여에 의해 상승된 항체와 비교하였을 경우에 인플루엔자 항원(도 25에서 설명함)에 대한 혈청 항체의 친화력을 나타낸 것이다.

도 27은 본 발명의 장치에 존재하는 다량의 항원에 의한 면역 반응 억제를 나타낸 것이다.

도 28은 플라스미드 DNA로 면역화시키기 위한 본 발명의 장치의 유용성을 설명하는 것이다.

도 29~31은 폴리사카라이드 항원에 대한 면역 반응을 발생시키기 위한 본 발명 장치의 유용성을 설명하는 것이다.

도 32는 상당히 보존된 따라서 면역원성이 약한 항원, 사이클로필린에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 본 발명의 장치의 유용성을 설명하는 것이다.

도 33은 전체 동물을 이용하여 기생충 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 본 발명의 장치의 유용성을 설명하는 것이다.

본 발명은 포유류에서 면역계의 세포에 제어된 방식으로 항원을 노출시키는 이식가능한 장치를 이용하여 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 방법을 제공한다. 임파구의 조성물과 기능을 닮은 인공적인 환경을 제공하고, 장치내에서 항원의 생체이용성을 조절함으로써 항원에 대한 강력한 반응을 유도하거나 또는 기존 면역 반응을 하향 조절할 수 있다. 장치는 천공된 그러나 불투성인 코딩 또는 장벽내에 포함된 또는 둘러싸인 스펀지형 재질로 된 다공성 매트릭스로 구성되는데 이하에서는 "용기"로 칭한다. 천공된 용기는 확산 장벽으로 작용하여, 장치내에서 면역 세포 분비 생성물을 고농도로 유지할 수 있게 한다. 면역 반응이 상승하는 또는 하향 조절되는 항원은 장치가 피부에 이식되기 전후에 장치내에 다공성 매트릭스내에 존재한다. 강력한 면역 반응을 유도하기 위해서는 항원은 장치를 삽입한 후 약 3일경에 장치내에 매트릭스내에서 생체 이용할 수 있는 것이 바람직하다. 이는 이 시기에 장치로 항원을 주사하거나 지연 방출형 항원으로 매트릭스를 만들어진 장치를 이용하면 된다. 특정 항원에 대한 면역 반응을 하향 조절하거나 또는 억제하기 위해서, 그리고 특정 항원에 따라 반응을 달리하기 위해서, 완전한 생체 이용가능한 항원을 포유류내에 장치를 이식하기 전에 장치에 제공하는 것이 바람직하다. 항원이 장치가 이식된 후에 장치내에 있을 경우에 항원은 주사기 또는 피하 바늘을 이용하여, 장치가 위치한 부위를 확인하여, 바늘을 장치에 꽂음으로써 장치내로 항원을 투여할 수 있다. 장치는 신체에 그대로 두거나 제거할 수 있다. 신체내에서 결국에는 분해될 수 있는 생분해가능한 재질로 만들거나 원하는 효과를 거둔 후에 장치를 제거할 수 있다. 항원은 나중에 장치에 도입시킬 수 있다. 장치내에서 항원만 또는 어쥬번트와 함께 또는 이와 복합하여 이용될 수 있다. 어쥬번트를 이용하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명은 다양한 형태의 면역요법에 개선점을 제공하는데, 이때 항원에 대한 원하는 면역 반응이 발생되거나 또는 증가되는데, 기존의 면역 반응 또는 특정 항원에 대한 면역 반응이 일어날 가능성은 억제되거나 차단된다. 이와 같은 경우는 특정 항원에 대한 건강한 포유류의 백신화, 치료요법적 백신화 과정등을 포함하는 백신화 과정이 포함된다. 면역 반응의 차단 또는 억제는 장래에 이식 수용체, 알레르기원인 물질에 노출될 것으로 보이는 포유류 또는 자가 면역 질환과 같은 내생 또는 외생 항원에 대한 면역 반응이 발생될 가능성이 있는 포유류에 적용할 수 있다. 면역 반응 억제는 항원에 대한 알레르기 또는 과민성 반응을 가진 포유류 또는 이식 거부를 하고 있는 포유류에서 항원에 노출된 후에 이용할 수 있다. 본 발명의 방법 및 장치는 세포성, 체액성, 점막성 면역성을 포함하는 모든 형태의 면역성에 이용할 수 있다.

장치의 형태 및 사용 방법은 포유류 임파 조직 특히 임파구의 구조 및 기능을 닮았다. 신체에서, 유입된 외부 항원을 수용하고, 항원 제공 세포, 대식세포, 수상돌기 세포에 의해 처리되는데, 이들은 임파구로 들어가 항원으로부터 유도된 면역원성 펩티드를 MHC 항원과 함께 특정 모양으로 T 임파세포로 제공한다. 특정 서브셋 T 세포(CD4-Th2)는 B-세포를 돕고, 고친화성 체액성 반응 발생을 지원한다. B 세포는 항원과 직접적으로 상호작용할 수 있어( 특히 다중 단위 항원 또는 리콜 항원), 면역원성 항원에 특이적인 혈장 세포 분비 항체로 분화된다. 항원 제공 세포는 또는 사이토킨, 림포킨, 케모킨을 분비하여, 면역 반응 발생에서 공동 침전된다. 장치의 천공된 용기 부분이 항원 및 사이토킨과 같은 면역 세포 분비 생성물의 수준을 장치내에서 그리고 장치내 면역 세포 근접한 위치에서 높게 유지시키는 확산 장벽 역할을 한다. 천공은 이와 같은 분자들이 장치로부터 확산되는 것을 방지하나, 면역 및 다른 세포가 장치 안팎으로 들어가고 나가는 것은 자유롭게 허용한다. 아주 소량의 항원으로도 강력한 면역 반응을 유도할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 장치내에 존재하는 항원과 장치내에 있는 면역 세포 및 공동-자극 분자간의 상호작용을 최적화시켜, 항원에 대한 면역 반응 발생을 강화시키고, 기억 세포 집단을 만들어 장시간 면역원을 부여할 수 있다.

포유류 신체내에 본 발명의 장치를 이식하면, 무균성 농양이 개시되는데, 이때 면역계의 특정 세포는 외부 몸체를 유인하여, 한정된 수의 천공으로 들어간다. 처음 수일이 경과한 후에, 증가된 세포 집단은 임의 항원이 없다하더라도 장치내에 축적된다. 약 3일 경에는 장치에 항원의 생체 이용성으로 그리고 매트릭스에 존재하는 면역계 세포에 의해 항원과 만나면 항원이 수용되어 항원 제공 세포에 의해 처리되어 T 임파세포로 제공된다. 장치는 천공된 용기에 의해 외부와 한정된 노출을 하기 때문에, 면역 세포는 들어갈 수 있으나, 항원은 장치에 유지되어, 항원의 농도가 높게 유지되고, 장치에 있는 세포 집단에 의해 분비되는 공동 자극 인자의 농도도 임파구내에서와 같은 방식으로 높게 유지된다. T 임파세포가 프라임되고, 활성화된 후에 이들은 한정된 수의 천공을 통하여 장치를 떠나고, 다시 순환계로 들어간다. 따라서, 장치는 면역계 세포에 항원 노출을 조절하는 강력한 면역 반응을 발생하는데 필수적인 사이토킨 및 다른 인자 수준을 유지하는 수단을 제공한다. 하기 실시예에서 볼 수 있는 것과 같이, 장치는 특정 항원에 대한 면역 반응 발생에서 몇 배의 개선점을 제공한다.

이론적으로, 다량의 특정 항원을 포함하는 본 발명의 장치를 이식하면 상기에서 설명하는 반대 방식으로 기능을 할 수도 있는데, 즉, 항원에 대해 기존의 또는 가능성이 있는 면역 반응을 하향 조절하거나 억제할 수 있다. 과량의 항원에 대한 T 세포의 노출은 실제 항원-특이적인 아팝토시스를 개시하여, 항원 특이적인 세포 및 이의 후손을 제거함으로써 세포 반응을 효과적으로 억제하고 또한, 항원에 대한 체액성 반응도 억제한다. 저항할 수 상태이전에 항원성 자극물에 대해 사이토킨(IL-2, IL-4,-IFN, IL-12)을 추가하거나 추가 항원성 자극에 대해 T 세포를 노출시켜 중개되는 T 세포의 과다 활성화반응으로 세포의 아팝토시스를 자극하고, 항원-특이적인 과정으로부터 반응성 클론(B 또는 T 세포) 결손을 자극하게 된다. 본 발명의 장치를 이용한 면역 반응의 자극 또는 억제를 얻기 위해 적절한 농도의 특정 항원을 선택하는 것은 당업자가 할 수 있을 정도의 것이다. 특정 항원의 면역원성 및 특정 항원에 대한 면역억제 및 면역자극 약량 범위도 당분야에 공지된 in vitro 및 in vivo 방법으로 결정할 수 있다.

또한, 본 발명의 장치를 이용하여 얻을 수 있는 개선된 면역 반응은 통상 동물에서 어쥬번트를 이용하는 것을 포함한 전통적인 면역화 방법에서 얻을 수 있는 것보다 크다. 이론적으로, 장치내에서 면역 세포 및 이들의 공동-자극 인자에 항원만을 제어된 방식으로 노출시키는 경우에 강력한 면역 반응을 얻을 수 있는 최적의 환경을 얻는 것으로 보이는데, 이와 같은 반응은 어쥬번트를 이용하여 얻을 수 있는 것보다 우위의 것이다.

인플루엔자, HIV, 유두염, 간염, 사이토메갈로바이러스, 폴리오, 공수병등의 바이러스 및 대장균(E. coli) 슈도모나스(Pseudomonas), 쉬겔라(Shigella), 시필러스(syphilis), 미코박테리아(mycobacteria), 클라미디아(Chlamydia), 리켓챠(rickettsiae), 세라티아 마르세신(Serratia marcescens)과 같은 박테리아, 아스퍼질러스(Aspergillus), 칸디다(Candida)와 같은 곰팡이, 프로토조아 및 쉬스토조마(Schistosoma), 플라스모디움(Plasmodium), 옹코세라(Onchocerca), 아메바(ameobae)와 같은 다세포 기생충등의 감염성 질환 매체에 대한 효과적인 예방을 위해, 면역화를 시킨다. 면역화 반응은 또한, 치료요법적 백신을 이용하여 감염성 질환으로 이미 고통을 받는 개체를 치료하는 가능성을 제공한다. 또한, 비감염성 질환도 예방할 수 있고 또는 암과 같은 것을 면역화 방법을 이용하여 치료할 수도 있다. 그러나, 많은 항원은 면역원성이 약하고, 면역화 방법이 이와 같은 질환의 예방 및 치료에 적절한 방법이라는 것이 증명되지도 않았다. 동물의 면역화 방법에 일상적으로 이용되는 어쥬번트도 면역 반응을 증가시키는데 에는 이용할 수 없다. 또한, 건강한 개체에서는 강력한 면역 반응을 만들 수도 있지만, 환자의 면역계는 항원에 대해 면역 반응을 만들 수 있을 정도의 능력이 없을 수도 있다. 이와 같은 상황에서 본 발명의 장치는 통상의 면역화 과정에서는 얻기 어려운 강력한 면역 반응을 자극시킬 수 있다.

면역 반응 억제도 특정 질환을 치료하는데 이용할 수 있는데, 가령 알레르기등이 있고, 또는 이식을 위해 외부 항원에 노출시켜야 할 환자의 경우에 이용할 수 있다. 부적절한 면역 반응은 자가면역 및 타입 I 당뇨병, 류머티스 관절염, 다발성 경색, 포도막염, 전신 홍반성 낭창, 중증성근무력증, Graves 질환과 같은 다른 질환에 내제된 병인학으로 보인다. 의심이 가는 항원을 포함하는 본 발명의 장치를 개체에 이식하여, 항원을 인지하도록 프라임된 세포가 들어가면 아팝토시스를 실행하도록 유도되어 면역계로부터 제거된다. 후손 항원-특이적인 세포를 제거하면 거부반응없이 외부 항원을 이식할 수 있다.

본 발명의 다른 용도로는 실험실 동물에서 다클론성(면역 혈청) 및 단클론성 항체를 만드는데 개선점 및 발생된 항체의 원하는 이소타입을 얻는데에도 장점이 있다. 한 구체예에서, 아주 소량만을 이용할 수 있는 항원에 대한 다클론성(면역 혈청) 및 단클론성 항체를 준비하는 과정도 본 발명의 장치를 이용하여 실행할 수 있다. 장치에는 희귀한 소량의 항원을 제공하여, 동물을 면역화시키고, 그 다음 비장에서 수득할 수도 있다. 이와 같은 과정은 현재 비장으로부터 직접 희귀한 항원을 도입하여 지루하고 예측하기 힘든 과정보다 개선된 것이다. 또한, 본 발명의 장치를 이용할 경우에 부스트 면역화 과정을 피할 수 있고, 면역 반응을 좀더 신속하게 일으킬 수 있다. 동물을 면역화시키는데 소요되는 시간을 짧아지면 좀더 신속하게 단클론 항체를 만들 수 있다. 또 다른 구체예에서, 하이브리도마를 생산하기 위한 면역 세포는 장치에서 제공하는 항원으로 동물을 면역화시킨 후에 장치로부터 수득할 수 있다. 이와 같은 과정을 이용하여 본 발명의 장치를 개체에 이식하고, 장치에 항원을 적하시키고, 그 다음 하이브리도마를 생산하기 위해 장치로부터 면역 세포를 수득하여 사람의 단클론 항체를 만들 수 있다. 상기에서 설명하는 다클론성 항체(면역 혈청) 및 단클론성 항체는 진단, 기초 연구 및 이미징 및 치료에 이용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 사람의 단클론성 항체는 다음의 과정에 의해 심각한 복합 면역결핍증(SCID) 생쥐에 이식된 본 발명의 장치를 이용하여 얻을 수 있다. 우선, 사람의 말초 혈액 임파세포를 SCID 생쥐에 주사하고, 이때 사람의 임파세포는 생쥐 면역계에 정착한다. 이식후에 약 3일 뒤에 생체이용할 수 있는 원하는 항원을 포함하는 본 발명의 장치를 이식한 후에, 장치로부터 세포를 수득하여 사람의 B임파세포를 제공하고, 이는 원하는 항원에 대한 사람의 항체를 분비하는 하이브리도마를 만드는데 이용한다.

본 발명 장치의 또 다른 용도는 포유류에 다시 재도입시키기 위해 포유류로부터 면역 세포를 수집하는데 있다. 예를 들면 이식된 장치에서 흡입에 의해 장치로부터 세포를 제거하거나 또는 신체로부터 장치를 제거한 후에 세포를 수집하는데, 고분자 매트릭스를 용해시키고, 세포를 저장하는데 예를 들면 냉동보전하여, 나중에 포유류로 다시 도입시킨다. 전체 신체 방사능 치료법을 시행하는 포유류에 특이 이용할 수 있다. 항원을 포함하지 않는 본 발명의 장치를 이식하거나 7일 내지 10일간 유지하고 결과적으로 이에 포함된 장치 및 이의 내용물은 제거내고 세포는 냉동보존된다. 방사능 요법후에, 포유류는 신체로 다시 도입되는 세포를 가지는데, 이때 세포는 면역계를 재구성할 수 있다. 이와 같은 용도의 또 다른 구체예에서, 면역 세포 증식을 유도할 수 있는 사이토킨과 같은 공동-자극 인자를 장치로 도입시켜 수득하기 전에 장치에 있는 세포의 수득율을 증가시킨다. 또 다른 구체예에서, 항원을 제공하는 장치로부터 수득된 면역 세포는 활성 면역화방법에 이용할 수 있는데, 이때 세포는 저장하고, 일련의 화학요법 및 다른 치료과정후에 포유류에 다시 도입된다. 다른 구체예에서, 장치에서 수집된 세포는 냉동 보존하고, 나중에 채택된 면역요법을 위해 신체로 다시 도입되기 전에 T 세포의 ex-vivo 증식을 위해 항원(암 항원)에 노출된다.

본 발명의 또 다른 용도에 있어서, 장치를 이용하여 유전자를 가진 장치내에 면역 세포를 감염시킬 수 있다. 그 다음 감염된 면역 세포는 장치내에 면역 세포를 프라임시킬 수 있고, 장치를 제거한 후에, 말단 기관에서 면역 세포를 프라임시킬 수 있다. 예를 들면 종양-특이적인 항원 또는 바이러스성, 박테리아성 또는 기생충 항원을 인코드하는 DNA, RNA, cDNA를 장치내에 두는데, 이 경우에 이에 상응하는 단백질 항원이 포함될 수도 안될 수도 있다. 장치에 들어가는 항원-제공 세포에 유전자를 감염시킬 수 있고, 연속하여 항원 단백질이 발현되어 신체의 말초 부위로 이동되고, 이동된 위치에서 이들은 면역 세포를 자극한다.

본 발명의 장치는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 제작할 수 있는데, 그 크기와 모양은 다양하게 할 수 있지만, 단 이와 같은 모양으로 여기에서 설명하는 기능을 수행할 수 있어야 한다. 상기에서 설명하는 것과 같이, 장치에는 장치로 도입된 항원 및 장치내에 있는 면역 세포에 의해 분비되는 사이토킨 및 다른 인자들과 같은 작은 분자의 확산 장벽이 있지만, 이 장벽은 장치 안팎으로 면역 세포의 이동은 허용한다. 따라서, 단백질 및 다른 소분자의 수동적인 확산은 제한을 받지만, 면역 세포는 장치 안팎으로 자유로이 이동할 수 있다. 한 구체예에서, 피부에 작게 절개한 부분으로 편리하게 장치를 삽입하고, 필요할 경우에 나중에 제거할 수 있는 장치는 속이 비어 있는 생물학적으로 삽입할 수 있는 실리콘 뷰트와 같은 튜브 모양의 짧은 단편이 된다. 스펀지와 유사한 재질로 된 다공성 고분자 매트릭스를 튜브의 구멍에 고정시킨다. 개방 말단은 봉할 수도 있고, 봉하지 않을 수도 있다. 적은 수의 천공을 튜브의 벽에 만든다. 본 발명의 범위내에서 천공의 수, 크기 및 모양을 다양하게 할 수 있다. 항원은 용액형태 또는 항원 현탁액 또는 생체 이용할 수 없는 형태의 항원으로 제조하는 과정에서 매트릭스 에 결합시키거나 또는 매트릭스로 튜브의 말단 또는 튜브 자체의 벽에 주사할 수 있다.

항원은 장치의 매트릭스에 직접 제공될 수 있거나(여기에서는 생체이용할 수 있는 또는 충분히 생체이용할 수 있는 형태로 말한다) 생체 이용할 수 없는 형으로 제공되어 차후에 생체이용가능하게 하는 경우도 있다. 조절된 방출, 지연 방출 또는 유지 방출 특징을 제공하는 조성물에 항원을 결합시키는 것이 바람직한데, 이와 같은 공정 및 조성물에는 마이크로포집, 리포좀, 미소구등이 포함된다. 항원에 대한 면역 반응을 자극시키거나 증가시킬 목적으로 조제된 항원은 이식후 약 3일 경에 장치의 매트릭스 내에서 생체 이용될 수 있는 것이 바람직하다. 적절한 방출 조제물은 당분야에 공지되어 있다.

또 다른 구체예에서, 장치는 최종 장치의 원하는 모양으로 고분자 매트릭스 재질로 만드는데, 표면에 불투성 코팅을 할 수 있다. 천공을 만든다. 또는, 특정 다공성 및 교차결합도를 가지는 고분자 매트릭스를 원하는 장치 모양으로 압출시키고, 그 다음 외부를 물질로 처리하여, 장치의 표면에서 고분자를 교차 결합시켜, 불투성 코팅 또는 용기를 효과적으로 만들 수 있다. 연속하여 코팅에 천공을 만들어 항원을 도입시킨다. UV-광 경화성 고분자를 이용할 경우에 표면 UV 처리하여, 장치 표면의 중합도를 증가시킬 수 있다. 여기에서 제공되는 실시예는 이에 한정되지 않고, 당업자는 전술한 성질을 가지는 적절한 장치를 고안할 수 있을 것이다.

장치를 이루는 재질은 적절한 자연 발생 또는 합성 조성물에서 선택할 수 있다. 한 구체예에서, 고분자 매트릭스 는 하이드록실화된 폴리비닐 아세테이트와 같은 생체 적합성 물질이 될 수 있다. 또 다른 매트릭스로는 폴리우레탄이 광범위하게 이용된다. 다른 적절한 재질에는 에틸렌/비닐 아세테이트 고분자, 폴리라틱산, 폴리글리콜산, 폴리락티드-글리코리드 혼성중합체, 콜라겐, 교차 결합된 콜라겐, 젤라틴등이 포함된다.

상기에서 설명하는 것과 같이, 고분자 주변의 천공된 그러나 불투성 장벽 또는 코팅을 얻기 위해서는 여러 가지 수단을 이용할 수 있다. 한 구체예에서, 고분자 매트릭스 단편을 실리콘 튜브와 같은 생체 적합성 플라스틱 튜브 단편의 관강에 둔다. 한 예에서, 내부 직경이 0.15㎝이고, 외경이 0.2㎝인 2.5-㎝ 단편의 튜브를 비리-적신 폴리하이드레이트 폴리비닐 아세테이트 매트릭스 2.5㎝ 단편에 고정시킨다. 또 다른 실시예에서, 장벽 또는 코팅은 적절한 자연-발생 또는 합성 물질로 만들 수 있는데, 예를 들자면, 플라스틱 또는 다른 고분자, 즉 폴리에틸렌, 교차-결합된 콜라겐, 폴리에틸렌, 실리콘, 라텍스 수지, 폴리스테렌, 아크릴성 수지, 폴리비닐리롤리돈 및 이들 물질의 복합물이 된다. 현재 이용되는 물질로는 SILASTIC^?실리콘 튜브(Dow Corning)가 있다. 이와 같은 물질은 본 발명에 이용할 수 있는 적절한 조성물로 예를 든 것으로 이에 한정시키지는 않는다.

면역 세포의 출입을 허용하고 작은 분자의 확산은 제한하는 장치의 원하는 성질을 유지하는 본 발명의 장치를 준비하는 예로써, 장치는 다음과 같이 수작업으로 준비할 수 있지만, 이에 국한시키지는 않는다. 외격이 0.047인치이고 반경이 0.023인치인 1.125 인치 길이의 실리콘 튜브를 이용하여 본 발명의 장치의 불투성 용기를 만든다. 구멍은 장치의 벽에 20 가우지 피하 바늘을 이용하여 수작업으로 뚫어, 직경이 1/16 및 1/32 인치의 구멍을 만든다. 튜브당 20개 구멍을 만든다. 이와 같은 변수는 장치의 특징을 간단히 나타내기 위한 지침이고, 당업자는 상기에서 제시한 것과 같은 장치내에서 사이토킨과 같은 소분자의 확산은 제한하면서 세포의 출입을 자유롭게 하는 동일한 목적을 이루기 위해 다른 변수를 이용할 수 있을 것이다.

본 발명의 생분해가능한 장치는 신체내에서 서서히 분해될 수 있는 것으로 알려진 매트릭스 및 용기로 구성된다. 이와 같은 재질에는 젤라틴, 콜라겐, 교차-결합된 콜라겐, 폴리라틱산, 폴리락티드-글리코리드 혼성중합체 및 당분야에 공지된 물질이 포함된다. 따라서, 면역 반응을 자극시키기 위한 적절한 생분해 가능한 장치는 생분해가능한 용기, 생분해가능한 매트릭스, 생분해가능하고, 장치에 포함된 항원을 지연 방출할 수 있는 조제물로 구성될 수 있다. 후자의 경우에 이식후 약 3일경에 항원이 방출되고, 매트릭스 및 용기는 장치의 사용 수명(이식후 약 10일경)후에 생분해되기 시작한다.

장치의 용기에 있는 천공은 수작업으로 또는 자동화 작업을 포함하는 여러 가지 방법으로 만들 수 있다. 천공은 적은 수로 하는데 적절하게는 튜브 ㎝당 10개 정도가 되지만, 장치의 크기 및 모양에 따라 달라질 수 있다. 이론적으로 천공의 기능은 장치내로 면역 세포를 유입시키고, 그 다음 항원과 접촉시켜, 공동-자극 분자를 프라임시키고, 프라임된 세포를 방출시키는 것이다. 이와 같은 목적은 천공된 장치에 항원 및 공동 자극 분자 즉, 장치내에 면역계 세포에 의해 만들어지는 사이토킨과 같은 인자를 원하는 수준으로 포함하고 있어야 한다. 적절한 수와 크기의 천공으로 이와 같은 요구사항을 이룰 수 있다. 장치를 튜브 단편에서 만드는 경우에, 튜브의 단부는 천공으로 작용할 수 있도록 개방시키고, 이식 전에 또는 이식 후에 항원을 적하시키기 위한 바늘 또는 다른 수단을 끼우기 위한 소켓으로 이용할 수도 있다.

장치는 신체의 적절한 부위에 이식하는데, 즉, 삽입, 항원 적하, 제거를 환자가 불편을 최소로 하면서 용이하게 실시할 수 있는 부위가 된다. 적절한 위치는 상측 팔 중간 부분이 된다. 또 다른 구체예에서, 장치의 수명이 다한 후에 제거할 필요없는 생분해 가능한 재질로 장치를 만드는 것이다.

면역 반응을 자극하기 위해, 생체 이용가능한 항원은 이식시에 또는 이식후에 장치에 제공하는데, 시기는 이식후 약 3일 경이 바람직하다. 이식시에 장치에 제공하여 이식후 3일경에 장치의 매트릭스로 항원을 방출할 수 있는 지연 방출 특징을 가지는 생체-불용성 항원을 제공할 수 있다. 3일 경에, 천공된 용기가 확산 장벽 역할을 함으로써 항원의 존재에 반응할 수 있는 적절한 수의 적절한 형태의 세포가 이들 세포에서 분비하는 사이토킨 및 다른 공동 자극 분자 수준과 같이 존재하여, 장치내로 연속하여 항원을 도입시키면 적절한 면역 반응 발생이 시작된다.

상기에서 설명하는 생분해가능한 장치로 만들어진 장치가 아닌 경우에 원하는 기능을 얻은 후에 간단한 외과술을 통하여 장치를 제거할 수 있다. 일반적으로 약 10일 후에, 면역 세포 집단이 장치로부터 빠져나가면 더 이상 기능을 할 수 없다. 한편, 장치에 나중에 항원을 다시 충전시켜 면역 반응을 부스터시킬 수 있다.

상기에서 설명한 바와 같이, 면역 반응의 자극 또는 억제시키기 위해, 장치내에 매트릭스에 있는 항원의 생체 이용가능 시기가 중요하고, 특정 항원의 성질에 따라서도 달라진다. 일반적으로 이식 시기에 존재하는 완전하게 생체이용할 수 있는 항원의 농도가 큰 경우에 항원에 대한 면역 반응을 억제하는데 효과가 있을 것이다. 또한, 일반적으로 장치를 이식한 후에 3일간 충분히 생체 이용할 수 있는 소량의 항원은 면역 반응을 자극시키는데 효과가 있을 것이다. 이와 같은 조건은 장치에 이용되는 특정 항원의 성질에 따라 다양하게 할 수 있다. 당업자는 in vivo 또는 in vitro 표준 방법을 이용하여, 특정 항원의 면역원성을 추정하고, 원하는 효과를 얻기 위해 적절한 항원 농도를 결정할 수 있다.

항원에 대한 면역 반응을 강화 또는 자극시키기 위한 본 발명의 장치를 이용하는 방법은 면역 세포, T 및 B 임파세포 집단을 생산하는 것으로 장치에 이용된 항원에 대해 효과적인 면역 반응을 준비하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전술한 장치 및 방법을 이용하여 특정 항원에 대한 면역 반응을 하향 조절하는 것이다. 다량의 항원을 장치에 결합시켜 면역 세포가 장치로 들어가서 항원과 접하여 아팝토시스를 유도한다. 접합 및 이식 거부와 같은 상태를 예방하거나 또는 이식후 또는 직전에 수용체를 치료하기 위해 제공자 항원을 포함하는 본 발명의 장치를 이용할 수 있다. 면역 반응을 하향 조절하는 일반적인 상황에는 이식(이는 제공자의 혈액 세포에 수용자가 내성을 갖고, 제공자의 접합체에 대한 수용자의 면역 반응을 하향 조절한다); 자가면역 질환(이는 자가 항원에 대해 내성을 가지는 것으로, 병인성 T 세포를 하향 조절하고, 류머티스 관절염에서 콜라겐과 같은 내생 항원으로 면역 복합체를 형성하는 것을 개선한다); 당뇨병(이는 인슐린 또는 GAD에 당뇨병 환자가 내성을 가지도록 한다); 중증성근무력증(이는 환자가 아세틸콜린 수용체에 대한 면역 반응을 피할 수 있도록 내성화시키는 것이다) 등이 포함된다. 또한, 알레르기 및 알레르기성 반응을 특징으로 하는 면역 반응은 면역 반응에 책임이 있는 면역 세포에서 아팝토시스를 유도하여 알레르기 원인물질에 대해 환자가 내성을 가지거나 또는 감성이 약해지도록 하여 치료할 수 있다. 면역 반응을 억제하기 위해 본 발명의 장치에서 이용될 수 있는 알레르기 및 항원의 예를 들자면, 고양이 알레르기 원인 물질인 DERP-1, 우루시올-변형된 펩티드로 인한 덩굴옻나무/ 오크 알레르기등이 포함된다.

다음의 실시예는 본 발명의 적절한 구체예를 완벽하게 설명하기 위하여 제공한다. 하지만, 이들은 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

실시예 1

본 발명의 장치는 2.5㎝-길이의 실리콘 고무관을 이용하여 만드는데, 상기 고무관은 내부직경이 0.15㎝이고, 외부 직경이 0.2㎝이며, 2.5㎝-길이의 하이드록실화된 아세테이트 스펀지가 달려있다. 이 장치는 인산염-완충 식염수를 함유한 용기에 담그고, 가압멸균하였다. 암컷 BALB/c 생쥐(6-8주)는 Avertin으로 마취시켰다. 이 장치는 1일째, 척추 중간선을 0.5㎝ 절개하여 도입하였다. 몇몇 동물에, 50㎕의 1㎎/㎖ 독감항원(FLUSHIELD?인플루엔자바이러스 백신, 3가, A ＆ B형)(Henry Schein?, Melville NY)은 이식한 후 2일째, 이식된 장치근처의 피부를 통해 피하주사장치를 삽입하고, 이후 바늘을 상기 장치의 한쪽 끝에 넣어 도입하였다.

피하주사 바늘을 이용하여, 이식 2, 4, 7, 9일째, 5마리 각 동물의 이식된 장치로부터 유체를 뽑아내고, 이후 세포는 모으고, 세척하고, 계수하였다. 도1에서 보인 바와 같이, 항원이 장치에 제공되지 않은 동물에서, 세포 개체군은 4일째, 상승하기 시작하고, 7일째 최고치에 도달하였다. 9일이 되면, 장치에서 세포수가 감소하는데, 이것은 장치로 이동한 세포가 장치를 빠져나와 주위로 이동한다는 것을 의미한다. 이식 2일째, 인플루엔자바이러스를 장치에 첨가하는 경우, 이식 4일째 장치에 존재하는 세포의 수는 7배이상 증가하여 225,000개에 이른다(항원없는 장치에서는 60,000개). 따라서, 장치내에 항원이 존재하면, 더 많은 세포가 장치로 모이거나 또는 장치내에 세포 증식이 이루어진다.

실시예 2

이번 실험에서, BALB/c 생쥐를 이용하여 항원이 첨가되지 않은 장치에 존재하는 세포의 수와 표현형을 조사하였다. 실시예 1에서 밝힌 바와 같은 장치를 이식한 후 4일째 되는 시점에, 5마리 동물 각각의 장치에서 세포를 뽑아내고, 모으고, 세척하고, 여러 개의 튜브로 나누어 넣었다. 다음의 마크(CD14, CD45/B220, CD11b, CD40, CD11c, CD80, CD86, CD62P, CD62E, CD3, I-Ad)에 특이적인 형광 이소티오시아네이트- 또는 피코에리트린-라벨된 단클론 항체를 첨가하고, 4℃에서 30-45분동안 배양한 후, 세포는 세척하고, 형광의 기하평균은 혈구 유량 계산으로 측정하였다. 비교를 위해, 동일 계열의 특정 항원을 이용하여 고유 동계생쥐에서 말초혈 림프구의 형광을 측정하고, 각 항체에 대한 결과는 말초혈 림프구의 형광에 대하여 장치에서 얻은 세포의 형광 퍼센트 증가로 표시하였다.

도2는 이식 4일째 장치로부터 추출된 세포의 표현형을 보여준다. T 세포(CD3, CD40), 대식세포(CD14, CD11b, 클래스 Ⅱ MHC, CD80), 수상돌기 세포(CD40, CD11c, 클래스 Ⅱ MHC, CD80), B 세포(클래스 Ⅱ MHC, CD45/B220, CD11b)의 이동과 고밀도 축척이 장치에 확실하게 나타났다.

실시예 3

실시예 1에서 밝힌 장치에서, 시간경과에 따른 세포 개체군 변화는 이식 3, 7, 10일째 장치에서 세포를 수거하여 평가하였다. 제 1 실험에서, 항원은 장치에 첨가되지 않았다. 각 시점에서, 5마리 생쥐에 이식된 장치로부터 뽑아낸 세포는 모으고, CD3, CD8, CD80, CD44, CD11c, CD45R/B220, CD14 마크를 보유한 세포의 밀도는 실시예 2에서 밝힌 과정을 따라 측정하고, 수치는 고유 생쥐의 말초혈 림프구에 대한 퍼센트 증가로 표시하였다.

도3은 이식 3, 7, 10째, 계산한 세포 표현형의 밀도를 보여준다. 모든 마크의 경우, 3일과 7일째 장치내 세포형이 풍부했고, 10일째가 되면, 개체군은 장치밖으로 이동하였다.

실시예 4

상기와 동일하게 시행된 제 2 실험에서, 이식 2일째, 장치에 인플루엔자항원을 첨가했다. 도4에 보이는 바와 같이, T 세포와 항원 제시 세포(CD3, CD80 또는 CD14)의 밀도는 장치에 항원이 존재하면, 더욱 증폭되고, 따라서, 10일째에도 이들 3개의 세포형은 계속 존재하였다. 항원을 첨가하면, 장치로부터 면역세포의 이동이 지연된다.

실시예 5

인플루엔자항원이 제공된 장치 이식의 말초효과는 이식된 동물의 비장에서 CD4와 CD8 T의 발현변화를 측정하여 평가하였다. 전술한 방법을 따랐는고, T-세포 표현형은 실시예 2의 방법으로 측정하였다. 이식 2일째, 0, 5, 10 또는 50㎍ 인플루엔자백신을 장치에 공급하고, 면역후 10일되는 시점에, 동물로부터 비장을 수거하였다. 비장 세포는 유리 슬라이드의 거친면사이에서, 비장을 가볍게 눌러 분리하였다. 세포는 PBS로 세척하고, 적혈구는 적혈구 용해 버퍼(Sigma, MO)에서 5분간 배양하여 고갈시켰다. CD4와 CD8 형광은 전술한 혈구 유량 계산으로 측정하였다. 컨트롤로, 통상적인 표준 면역프로토콜을 따랐는데, 여기서, Ribi 애쥬번트 R-700과 함께, 생쥐 푸트패드에 동일한 양의 인플루엔자항원을 주사하였는데, 상기 R-700은 모노포르포릴 지질 A와 합성 트레할로스 디크리노미콜레이트(MPLA+TDM)(Ribi ImmunoChem Research, Inc.)를 함유한다. 컨트롤 생쥐 또한, 면역 10일후 방혈하였다.

도5에서 보인 바와 같이, 장치 이식된 생쥐의 비장세포에서 유래한 T 세포는 인플루엔자항원을 장치에 적하한 후, CD4와 CD8분자의 밀도를 증가시키는 것으로 보였다. 통상적인 방법으로 50㎍ 항원 + 애쥬번트를 면역주사한 동물의 비장에서 세포독성 T 세포(CD8)의 수준은 본 발명의 장치에서 10㎍ 항원으로 유도한 수준과 동일하였다. 게다가, 항원없는 장치 또한, 상기 장치에 의해 유도된 살균염증의 결과로 비장에서 CD8 세포를 팽창시키는 것으로 보였다. 50㎍ 항원(컨트롤 동물에서 애쥬번트와 함께, 푸트패드를 통해 접종된 것과 동일한 양)이 첨가된 본 발명의 장치를 이식한 동물에서, 비장내 CD8 세포 발현이 사라진다는 것은 주목할만한 가치가 있다. 이것은 고 투여량의 항원을 장치에 투여하면 항원-특이적 세포의 아팝토시스가 발생한다는 것으로 설명할 수 있다. 극도로 강한 자극은 동요 효과를 촉발하고, 이로 인해, 처리된 생쥐의 비장에서 전체 CD4＋CD8＋T 세포가 소멸된다.

이것은 면역반응의 하향조절이 필요한 경우, 예를 들면, 이식편 거부반응에서 면역반응을 제거하는데 응용할 수 있다.

본 발명의 장치를 이용한 면역의 효율증가는 말초혈에 항원을 주사한 동물의 림프절에 실제로 도달하는 항원의 양이 면역으로 제공된 항원의 양보다 적다는 것으로 설명할 수 있다. 따라서, 본 발명의 장치를 이용한 면역에서, 면역 양성 반응을 촉발하기 위한 최적 투여량은 통상적인 면역에 사용되는 투여량보다 훨씬 적을 것으로 예상된다(즉, 몇 로그(log)적음)

실시예 6

본 발명의 장치에 제공된 인플루엔자항원에 대한 면역반응의 강도는 감마-인터페론 분비를 이용하여, 비장 T 세포(마크)로 측정하였다. 감마-인터페론 분비는 Th1-형과 CD8 세포독성 T 세포 반응의 주원인중의 하나이며, 세포내 병원균과 암에 대한 보호무기인 것으로 알려져 있다. 생쥐는 전술한 장치를 이식하고, 이식 3일째, 5㎍ 인플루엔자백신을 첨가하였다. 컨트롤 그룹은 50㎍ 항원 + Ribi를 푸트패드에 면역주사하였다. 면역 10일후, 비장 세포는 전술한 실시예와 같이 분리하고, 도말하고, 감마-인터페론 생산은 일정 수준의 항원(1.4 내지 180㎍/㎖)으로 자극한 후, ELISA 키트(Endogen)를 이용하여 측정하였다.

도6은 본 발명의 장치에 담긴 5㎍ 항원으로 동물을 자극하면, 푸트패드로 50㎍ 애쥬번트를 면역한 후에 생성되는 것과 동일한 수준의 T-세포 활성화 수준이 발생한다는 것을 보여준다. 따라서, 애쥬번트를 사용하지 않고, 소량의 항원과 본 발명의 장치를 이용하여 강한 면역반응을 성취할 수 있다.

동일한 동물의 슬와(popliteal) 림프절에서 유래된 T-세포로부터 감마-인터페론 분비는 분리된 T 세포를 유사한 범위의 항원농도에 노출시킨 후, 평가하였다. 도7에서 보인 바와 같이, 항원 + 애쥬번트를 푸트패드에 면역한 동물로부터 T-세포에 의한 감마-인터페론 분비는 본 발명의 장치를 이용하여 면역한 동물의 비장 T-세포에서 이루어지는 것만큼 강하지 않다(도 6). 슬와 림프절은 푸트패드가 유출되고, 따라서 항원의 상당히 존재할 것으로 예상되는데, 이들 결과는 애쥬번트의 사용없이 본 발명의 장치로 강한 면역반응을 효율적으로 유도할 수 있다는 것을 더욱 확실하게 보여준다. 추가 평가에서, 면역 10일후 장치(3일째 항원 제공)에 남아있는 세포 개체군은 항원에 대한 노출반응에서 감마-인터페론 분비를 평가하였다. 도8은 비장세포에서 기록된 반응수준에 비하여, 인플루엔자항원의 in vitro 자극에 반응하여 분비된 감마-인터페론의 수준이 매우 낮다는 것을 보여준다. 이 결과에서, 내부-장치 면역에 의해 기폭된 주효체 세포가 위치를 이탈하고, 10일째(장치에서 뽑아냄) 주효체 개체군의 대부분이 고갈된다는 것을 알 수 있다. 도1과 3은 9일과 10일째, B와 T 세포 표현형으로 세포의 손실을 설명하는데, 여기에서 이들이 말초기관으로 빠져나갈 가능성이 확인되었다.

실시예 7

본 발명 장치에 의해 유도된 항원에 대한 면역반응의 강도를 특이적으로 검사하기 위한 실험에서, 이식하고 항원을 장치에 적하한 후, 비장 세포 증식분석을 실시하였다. 전술한 실시예에서 밝힌 것과 동일한 프로토콜을 따랐다. 이 실험에서 항원은 난알부민이었다; 장치에 다양한 양(10pg 내지 50㎍)의 난알부민을 제공하였다; 컨트롤 동물은 동일양의 항원 + Ribi 애쥬번트를 퓨트패드 주사하여 면역하였다.

면역 10일후, 생쥐는 안락사시키고, 비장을 떼어냈다. 증식분석은 96-웰 평판에서 실시하였다. 웰당 200,000만개의 비장세포를 37℃로 72시간동안 180㎍/㎖항원에 노출시켰다; 컨트롤로, 동일 투여량의 Epstein-Barr 바이러스 항원을 사용하였다. 항원 또는 컨트롤에 노출시킨 후, 세포는 6시간동안³H-티미딘으로 펄스하고, 라벨통합을 측정하여 자극 지수로 표시하였다.

도9는 난알부민을 제공한 장치를 이용한 생쥐의 면역에서, 강한 항원-특이적 비장 세포 증식반응이 야기되는 것을 보여준다. 반응은 피코그램(pg)정도의 항원으로 면역한 동물에서 검출되었다. 통상적인 방법으로 애쥬번트 면역한 동물의 비장 세포에서는, 5 내지 7로그 높은 항원농도에서 증식반응이 일어났다. 컨트롤(Epstein-Barr 바이러스) 항원에 대한 무시할 수 있는 수준의 자극에서, 난알부민에 대한 자극반응이 매우 특이적이라는 것을 알 수 있다.

난알부민을 항원으로 이용한 실험에서, 생쥐는 50㎍, 50ng 또는 50pg 난알부민을 본 발명의 장치로 또는 푸트패드로, 장치단독으로, BCG 애쥬번트를 장치로, Ribi 애쥬번트를 푸트패드로 면역하였다. 이들 실험에 사용한 BCG(Bacille Calmette Guerin)애쥬번트 TheraCys(R)는 Mycobacterium bovis의 약독화된 균주의 동결-건조된 현탁액으로, 방광의 in situ 치료를 위해 Cognaught laboratories Limited에서 만들었다. 면역 10일후, 비장 세포는 수거하고, in vitro에서 다양한 농도(1.4 내지 180㎍/㎖)의 항원 또는 동일범위의 컨트롤 항원(Epstein-Barr 바이러스)에 노출시켰다. 72시간 배양한 후, 세포는³H-티미딘으로 6시간동안 펄스하고, 라벨통합은 자극 지수로 표시하고, T 세포 자극 및 증식의 수치로 사용하였다.

도10은 저 투여량의 항원으로부터 강한 항원-특이적 T-세포 반응은 본 발명의 장치를 이용하여 성취할 수 있다는 것을 보여준다. 비장 세포를 컨트롤 항원에 노출시킨 후, 무시할 수 있는 수준의 자극이 검출되는데, 이것은 난알부민에 대한 자극반응이 매우 특이적이라는 것을 알 수 있다.

실시예 8

HIV gp120 펩티드(잔기 315-322, RIQRGPGRAFVTIGK)항원에 대한 항원-특이적 항체반응은 저 투여량을 본 발명의 장치에 적하한 후, 평가하였다. BALB/c 생쥐는 장치 또는 푸트패드로, Ribi 애쥬번트로, 다양한 투여량의 HIV 펩티드로 면역하였다. 혈액은 면역 10일후에 수거하고, 펩티드에 대한 항체 역가를 측정하였다. 4일후, 동물은 초기 면역원 양의 10%로 돋구고, 10일후 항체 역가를 결정하기 위해 두 번째 혈액을 수거하였다. ELISA를 이용하여 항원-특이적 IgG2a 항체를 측정하고, 일상적인 절차에 따랐다. 간단히 말하면, 미소역가 평판은 인산염-완충 식염수에 4℃로 16시간동안 항원(1g/㎖)으로 피복하였다. 평판은 세척하고(50mM Tris＋0.2% Tween-20(PBS 용매), pH 7-7.5), 차단버퍼(5% BSA 용액＋0.1% Tween-20(PBS 용매), pH 7.2-7.4)로 4℃로 16시간동안 차단하였다. 평판은 세척하고, 100 l혈청 샘플은 먼저 1:50 희석하여 웰에 첨가하고, 이후 3배 희석하였다. 샘플은 2번 검사하였다. 실온에서 1시간 배양한 후, 평판은 상기와 같이 희석하고, 비오틴화된 항-생쥐 IgG2a 항체 용액(1㎍/㎖)을 웰에 첨가한다. 1시간배양하고, 상기와 같이 세척한 후, 차단버퍼에서 1:4000으로 희석한 스트렙타비딘-접합 양고추냉이 페록시다제를 웰에 첨가한다. 실온에서 30분배양한 후, 기질을 첨가한다(100 l 테트라메틸벤지딘/웰). 평판은 30분동안 배양한다. 100 l 2 N H₂SO₄/웰을 첨가하여 반응을 중단시킨다. 평판은 450㎚ 파장에서, ELISA 평판 판독기를 이용하여 판독한다

도11은 특이적 항-HIV gp120 펩티드 IgG2a 수준을 보여주는데, 여기에서 본 발명의 장치를 이용하여 단일 면역한 후에 강한-특이적 항체(IgG2a)가 유도되는 반면, 통상적인 프로토콜을 따라 단일 푸트패드 면역한 후에는 어떤 반응도 유도되지 않는다는 것을 알 수 있다. 푸트패드에 제 2 면역(부양)한 후, 항체 반응은 통상적으로 면역한 동물에서 발생하지만, 본 발명의 장치를 이용하여 초기에 면역하고, 이후 부양한(장치에 투여된 원 투여량의 10%) 동물은 증가된 IgG2a 수준을 보였고, 적은 항원수준에서 훨씬 강한 반응을 보였다(도12).

실시예 9

통상적인 푸트패드 면역과 비교하여, 본 발명의 장치로 면역하여 발생한 면역반응에 대한 상이한 애쥬번트의 효과를 평가하였다. BALB/c 생쥐는 전술한 바와 같이 장치 또는 푸트패드를 통해, 다양한 투여량의 HIV gp120 펩티드로, 또는 Ribi 또는 BCG 애쥬번트로 면역하였다. 이식 3일후 장치에 면역원을 제공하고, 항체 역가는 면역 10일후에 측정하였다. gp120 펩티드 항원에 특이적인 IgG2a 항체에 대한 ELISA은 앞선 실시예에서 설명한 바와 같이 실시하였다. Ribi 또는 BCG 애쥬번트로 면역하면, 낮은 수준의 펩티드-특이적 IgG2a가 만들어진다(도13). 대조적으로, 애쥬번트(50ng 펩티드)없이, 본 발명의 장치를 이용하여 면역하면, 눈에 띄게 높은 수준의 펩티드-특이적 IgG2a가 만들어진다. 애쥬번트(Ribi 또는 BCG)와 펩티드의 혼합물에 발생한 반응은 저조했다. 이들 데이터에서, 기존의 강한 항원 자극에 애쥬번트를 첨가하면, 면역반응이 억제된다는 것을 알 수 있다. 애쥬번트와 항원의 첨가 효과 또는 상승작용을 입증하기 위하여, 면역프로토콜은 낮은 범위(펨토그램 투여량미만)의 항원과 낮은 농도의 애쥬번트로 검사하여야 한다.

단순 포진 바이러스 당단백질 B의 15개 펩티드(잔기 497-507: TSSIEFARLQF)를 검사하는 경우, 유사한 결과를 얻었다.

실시예 10

본 발명의 장치에 존재하는 항원에 의해 유도된 체액 면역 반응 강도의 추가 실험에서, BALB/c 생쥐는 장치를 이식하고, 3일후 다양한 투여량의 시토크롬 C를 제공하였다. 컨트롤로, 다양한 투여량의 동일한 항원을 Ribi 애쥬번트와 함께 혼합하여 푸트패드를 통해 투여하였다. 이식 10일후 또는 푸트패드 접종 10일후, 동물은 방혈하고, 항원을 특이적으로 인식하는 IgG2a에 대한 혈청에서 ELISA를 실시하였다. 과정은 이전 실시예에서 유사한데, 1:50 내지 1:6400으로 연속희석된 혈청에서 ELISA를 실시한 점은 예외로 한다.

도14는 본 발명의 장치를 이용하면, 항원에 대한 매우 강한 특이적 체액 면역 반응이 매우 적은 투여량의 항원으로 성취되는 것을 보여준다. 장치내 50 펨토그램정도의 항원이 통상적인 푸트패드 + 4배정도 많은 5ng 항원을 이용한 애쥬번트 면역으로 성취할 수 있는 것과 유사한 항체 면역반응을 유도했다.

실시예 11

체액반응의 발생은 적혈구 응집소 단백질을 항원으로 이용하여 평가하였는데, 상기 단백질은 절단하고, 인플루엔자 A 바이러스(깨어진 적혈구 응집소 또는 BHA)로부터 정제하였다. BALB/c 생쥐는 본 발명의 장치를 이용하여 0.1㎍과 10㎍ 투여량으로 면역하였는데, 상기 투여량은 이식 3일후에 장치에 제공하였다. 컨트롤 생쥐는 Ribi 애쥬번트와 함께, 동일한 양의 항원을 꼬리말단의 피하에 면역주사하였다. 생쥐는 면역 7, 14, 21, 28일후에 방혈하고, 혈청에서 항원-특이적 전체 IgG 항체에 대한 ELISA를 실시하였다.

도15에서 보는 바와 같이, 강한 체액 반응은 0.1㎍ 항원으로 수득하였는데, 면역 2주후 HA-특이적 항체의 농도가 최고치를 기록했다. 통상적인 프로토콜을 이용하여 애쥬번트로 면역한 생쥐는 2주째 매우 낮은 항원-특이적 체액 반응을 보이고, 면역 3주와 4주가 되면서 점차 증가한다. 장치로 면역된 생쥐의 혈청에서 BHA-특이적 항체의 수준은 애쥬번트의 존재하에 많은 투여량의 항원으로 면역한후 얻은 수준보다 75-80% 더 높았다. 이 실험에서, 본 장치의 적은 투여량 면역원은 많은 투여량으로 성취한 것보다 훨씬 높은 체액 반응을 유도했다. 이전의 실험에서 보는 바와 같이, 5㎍이상의 투여량은 면역반응을 억제하는데, 이것은 과도한 자극에 대한 반응으로 아팝토시스가 촉발되기 때문인 것으로 보인다.

실시예 12

본 발명 장치의 스펀지 메트릭스주변의 천공된 불투성 생물불활성 피복 또는 용기의 중요성은 전술한 장치내 또는 스펀지 메트릭스내 인플루엔자 항원으로 생쥐를 면역하여 평가하였는데, 상기 장치 또는 스펀지는 천공된 고무관의 분절주위에 이식하였다. 일정 범위의 항원 투여량(0, 50pg, 500pg, 5㎍, 50㎍)은 평가하고, 이식 3일후 장치는 또는 스펀지에 제공하였다. Ribi 애쥬번트와 함께, 컨트롤로 동일범위의 항원을 생쥐의 푸트패드에 면역하였다. 이식 또는 푸트패드 면역 10일후, 비장은 동물에서 떼어내고, 전술한 바와 같이, 일정 범위(0.1 내지 180㎍/㎖)항원 수준을 이용하여 항원T-세포 증식 분석을 실시하였다. 특이성에 대한 컨트롤로, Epstein-Barr 바이러스를 시험관내에서 사용하였다.³H-티미딘 통합을 자극 지수로 표시하여, T-세포 자극 및 증식을 설명하였다. 도16에서 보는 바와 같이, 장치로 면역한 동물에서 나타난 T-세포 활성은 항원이 스펀지에 존재하지만, 천공된 불투성 용기에는 존재하지 않는 경우보다 훨씬 강한 면역반응을 보였다. 무관한 항원에 대한 반응(도18)은 최소였다.

실시예 13

본 발명 장치의 스펀지 메트릭스주변의 천공된 불투성 생물불활성 피복 또는 용기의 중요성은 확산 실험을 실시하여 평가하였다. 200㎍의 소 혈청 알부민(BSA)은 장치 또는 스펀지로 주사하였다. 장치와 스펀지는 1.5㎖ PBS를 함유한 튜브에 두었다. 샘플은 다양한 시점에서 취하고, BSA 농도를 측정하였다.

도18에서 보는 바와 같이, 스펀지는 5분간의 배양동안, 전체 함량을 방출하였다. 본 발명의 장치는 항원의 방출을 조절하여, 항원의 65%이상이 960분이상동안 계속 잔존하였다. 면역세포와 접촉하는 장치에 고수준의 항원, 사이토킨, 케모킨, 다른 보조 분자를 계속 지속시키기 위한 확산장벽의 유지는 강한 면역반응을 유도하는데 있어 통상적인 면역과정에 비하여 상당히 개선된 장치를 제공하는 중요한 기작중의 하나인 것으로 추정된다.

따라서, 상기 실시예는 통상적인 푸트패드 면역에 비하여 그리고 이식된 스펀지 메트릭스로 항원을 단순히 적하하는 것에 비하여, 본 발명 장치가 다양한 항원에 대한 T 세포와 체액반응을 훨씬 우월하게 자극할 수 있다는 것을 입증한다.

실시예 14

이식 후, 항원첨가 없는 본 발명의 장치에 존재하는 세포의 표현형을 측정하였다. 이식 4일째 본 발명의 장치로부터 추출된 세포는 수거하고, 세척하고, 다음의 마크:CD14, CD45/B220, CD11b, CD40, CD11c, CD80, CD86, CD3, I-Ad(PharMingen, CA)에 특이적인 형광 이소티오시아네이트-또는 피코에리트린-라벨된 단클론 항체로 염색하였다. 형광의 기하평균은 혈구 유량 계산으로 측정하였다. 비교를 위해, 동일 계열의 특정 항원을 이용하여 고유 동계생쥐에서 말초혈 림프구(PBL)의 형광을 측정하고, 각 항체에 대한 결과는 평균 형광 강도(MFI)로 표시하였다.

도19는 이식 4일째 장치로부터 추출된 세포의 표현형을 보여준다. T 세포(CD3, CD40), 대식세포(CD14, CD11b, 클래스 Ⅱ MHC, CD80), 수상돌기 세포(CD40, CD11c, 클래스 Ⅱ MHC, CD80), B 세포(클래스 Ⅱ MHC, CD45/B220, CD11b)의 이동과 고밀도 축척이 장치에 확실하게 나타났다. 따라서, 면역반응의 발생에 중요한 면역세포는 장치에 존재하게 된다. 보조-자극(CD80 ＆ CD86)분자와 접착(CD44)분자의 발현은 본 발명의 장치에서 추출한 면역세포에서, PBL(제시하지 않음)과 비교하여 평가하였다. 흥미롭게도, 본 발명의 장치부분의 전자 현미경 분석에서, 다수의 리소좀과 대식세포의 존재가 밝혀졌는데, 이것은 세포 활성화의 고조된 상태를 암시한다.

실시예 15

이식후, 항원의 부재하에 본 발명의 장치에 존재하는 사이토킨의 농도와 고유 뮤린 혈청에 존재하는 사이토킨의 농도를 비교하였다. 도20에서 보는 바와 같이, 장치는 훨씬 높은 수준의 자극 사이토킨 IL-2, IL-4, TNF-α를 보유하는데, 저해 사이토킨 TGF-β의 농도는 약 1/7이었다(자료 제시하지 않음). 따라서, 본 발명의 장치는 항원으로 "점화된" 면역반응을 촉발시키는 환경이 된다.

실시예 16

세포독성 T 림프구(CTL) 반응은 인플루엔자 바이러스에 대한 면역개발에 중요한 것으로 여겨진다. 본 발명 장치의 항원-특이적 CTL의 유도 능력을 평가하기 위하여, 생쥐는 본 발명의 장치의 500pg 인플루엔자 바이러스로 면역하였다. 컨트롤로 생쥐는 500pg 백신 + Ribi 애쥬번트를 피하에 면역주사하였다. 림프구는 면역된 동물로부터 수득하고, 인플루엔자 바이러스에 대한 이들의 특이성은 인플루엔자 바이러스-감염된 표적세포를 용해하여 측정하였다. CTL은 다음과 같이 준비하였다. 생쥐는 마취시키고, 비장은 떼어냈다. 단일 세포 현탁액을 만들고, 세포는 PBS로 세척하였다. 적혈구 세포는 적혈구 용해 버퍼(Sigma, MO)를 이용하여 고갈시켰다. 비장세포(5 ×10⁶)는 5 ×10⁶바이러스 감염되고(100 HAU/10⁷세포/㎖, 37℃, 60분) 조사된(3000Rad) 동계 비장세포와 시험관내에서 동시 배양하고, 37℃, 5% CO₂에서 5일동안 배양하였다.

PR8 감염된(500HAU/10⁶세포) P1. HTR 세포와 비-감염된 P1.HTR 세포는 세포독성에 대한 표적으로 사용하였다. 세포는 100mCi의 Na₂ ⁵¹CrO₄로 90분동안 라벨하고, 이후 세 번 세척하였다. 100㎖의 RPMI 1640와 5% FCS 배지상의 표적세포(10⁴/㎖)는 100:1 비율(E:T)에서부터 시작하여 다양한 농도로 주효체 세포로 첨가하고, 96-웰 원형바닥 미소역가 평판에서 2배로 적정하였다. 5시간 배양후, 상층액은 수거하였다. 결과는 다음의 공식을 따라, 특이적⁵¹Cr 방출 퍼센트로 표시하였다:

[(실험 방출)-(자발적 방출)] ×100/[(최대 방출)-(자발적 방출)].

도21에서 보는 바와 같이, 본 발명의 장치를 이용하여 500pg 인플루엔자 바이러스를 면역하면, Ribi 애쥬번트를 이용한 통상적인 피하면역에 대한 반응으로 생성된 CTL에 비하여, 강한 인플루엔자-특이적 CTL이 만들어지고, 인플루엔자-감염된 표적 세포는 더 효율적으로 용해된다. 만들어진 CTL은 시험관내에서 비-감염된 표적세포를 죽이지 않았는데, 이것은 촉발된 반응의 특이성을 암시한다. 본 발명의 장치에서 더 높은 투여량의 경우, 자극은 관찰되지 않았다.

실시예 17

본 발명의 장치를 이용한 면역이 체액면역 반응을 조절하는지 확인하기 위하여, 생쥐에 인플루엔자 백신의 여러 가지 투여량을 본 발명의 장치로 투여하거나 또는 Ribi 애쥬번트와 함께 피하주사하였다. 본 발명의 장치로 면역하는 경우, 고 수준의 인플루엔자-특이적 IgM, IgG1, IgG2a 항체는 Ribi와 혼합하여 피하면역한 경우에 비하여 훨씬 적은 백신 투여량에서 혈청에 나타났다. 바이러스-특이적 IgG1 항체 검사에서, 혈청 희석수를 증가시킬수록 결합이 더 많이 일어나는 것으로 밝혀졌다(흡수도로 측정)(도22). IgG2a 항체에서 유사한 결과가 관찰되었다.

실시예 18

통상적인 애쥬번트 프로토콜에 상대적으로, 본 발명의 장치를 이용한 면역에 의해 만들어진 혈청항체는 몰농도 구배된 KSCN(티오시안산 칼륨)에 처리하였는데, 이는 항원-피복된 미소역가 평판에 결합된 복합체로부터 항원-특이적 항체를 용출하여, 인플루엔자 항원에 대한 항체의 상대적 친화도를 결정하기 위한 것이다. 표준 미소역가 평판-기초의 ELISA형은 전술한 바와 같이 사용하였다. 비오틴화된 항-생쥐 IgG를 첨가하기 전, 평판은 세척하고, 다양한 농도의 KSCN을 웰에 첨가하였다. 평판은 30분동안 실온에서 배양하였다. 세척후, 비오틴화된 항-생쥐 IgG1 항체 용액(0.5㎍/㎖)을 웰에 첨가하였다. 증가된 KSCN 농도는 항체의 항원에 대한 고 친화성 결합에 의해 생성된 복합체를 깨뜨리기 위해 필요하다. 도23에서 설명한 바와 같이, 생성된 항체는 바이러스 항원에 대해 높은 친화성을 보유한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 장치를 이용하는 경우, 강력한 체액 반응의 자극에 극소량의 백신이 필요하다.

실시예 19

본 발명의 장치를 이용하는 경우, 감염질병으로부터 포유동물을 보호하는 면역능력은 뮤린 인플루엔자 모델에서 검사하였다. 2가지 투여량의 인플루엔자 바이러스 백신(5pg와 500pg)을 사용하여, 본 발명의 장치 또는 Ribi 애쥬번트를 병용한 피하투여로 생쥐를 면역하였다. 백신접종 12주후, 동물에 치사량의 인플루엔자 바이러스를 투여하였다. 도24에서 보는 바와 같이, 본 발명의 장치를 이용하여 인플루엔자 바이러스 5pg와 500pg를 백신접종하면, 완전한 보호가 이루어지는 반면, 500pg 인플루엔자 백신 + Ribi 애쥬번트를 피하에 면역주사하는 경우, 단지 60%의 생쥐만이 생존하였다. 5pg 투여량 + 애쥬번트로 면역한 동물 모두가 14일째 죽었다. 본 발명의 장치를 이용한 면역의 경우 완전한 보호가 이루어질 뿐만 아니라, 애쥬번트없이 1/000의 항원을 사용하여 목적하는 바를 성취할 수 있었다. 본 발명의 장치로 면역한 생쥐는 바이러스 감염후 지속적인 체중을 보였는데, 이것은 급성 감염에 대한 이들의 상대적인 저항력으로 인해 질병이 훨씬 약하게 발병한다는 것을 의미한다.

실시예 20

복합 면역 결핍된(SCID) 생쥐에서 사람 면역세포로 특정 사람 IgG를 생산하는데 있어 본 발명 장치의 유용성은 인플루엔자 바이러스 백신을 보유한 장치를 이식하여 평가하였다. 생쥐 정상 사람 공여체에서 얻은 20 ×10⁶PBMC를 SCID Beige CD17(6-8주된 암컷) 생쥐에 융합시켰다. 3일후, 생쥐에 50ng 인플루엔자 바이러스 백신을 근육내 면역주사하거나 또는 이를 함유한 선-펄스된 본 발명의 장치를 이식하였다. 면역 3주후 생쥐는 방혈하고, 혈청은 통상적인 ELISA를 이용하여 인플루엔자-특이적 체액반응을 검사하였다. 도25에서 보는 바와 같이, 백신을 이용한 면역에서 인플루엔자-특이적인 사람 IgG가 만들어졌다. 또한, 몰농도를 증가시킨 KSCN을 이용하여 인플루엔자 항원에 대한 혈청 항체의 상대적인 친화도를 측정하면, 통상적인, 근육내 면역하여 성취한 것보다 더 높은 역가의 사람 인플루엔자-특이적 항체를 만들 수 있었다(도26). 이런 방법을 이용하여, 사람 단클론 항체를 생산할 수 있는 사람 하이브리도마를 만들 수 있다.

실시예 21

본 발명의 장치에서 제공된 항원의 양이 더 높으면 면역반응의 억제를 유발할 수 있다. Balb/c 생쥐에 5내지 50㎍ 인플루엔자 백신을 적하한 장치를 이식하거나 또는 내부-푸트패드에 Ribi 애쥬번트와 혼합한 항원으로 면역하였다. 면역 10일후, 생쥐는 안락사시키고, 비장세포는 분리하고, 96 웰 평판(2 ×10⁵세포/웰)에 도말하였다. 세포는 37℃에서 72시간동안 인플루엔자 항원에 노출시켰다. 항원으로 자극한 후, 상층액은 배양물로부터 옮기고, 감마-인터페론 생산은 ELISA 키트(Endogen)를 이용하여 측정하였다. 도27에서 보는 바와 같이, 항원과 Ribi 애쥬번트 혼합물로 면역한 생쥐에서 면역반응이 생성되었는데, 상기 면역반응은 항원의 투여량에 따라 증가하였다. 대조적으로, 장치내 항원으로 면역한 생쥐는 적은 항원 투여량(전술한 실시예에서 설명)에서 면역반응의 촉진을 보인 반면, 더 높은 항원 투여량에서 면역반응의 감소를 보였다. 따라서, 이식된 본 발명의 장치에 대량의 항원이 존재하면, 면역반응의 하향조절이 일어나게 된다. 이 방법은 특정 면역억제가 필요한 경우, 예를 들면, 이식, 알레르기와 같은 경우에, 치료방법으로 사용할 수 있다.

실시예 22

본 발명의 장치를 사용하여, 또한 다당체 항원에 대한 면역반응을 유도할 수 있다. 폐렴 구균 백신(Pneumovax-23)을 적하한 장치를 이용한 단일 면역은 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있다. Pneumovax는 다가 폐렴 구균 백신으로, 23개의 가장 일반적인 또는 침입성 폐렴 구균에서 나온 고도로 정제된 캡슐 다당체로 이루어진다. 생쥐는 전술한 것과 같이 피하에 이식된 장치내 또는 Ribi 애쥬번트와 혼합하여 푸트패드로 주사된 5㎍ 내지 40pg Pneumovax 백신으로 면역하였다. 모든 생쥐는 10일째 방혈하고, ELISA로 전체 IgG(도 29), IgG1(도 30), IgG2a(도 31) 반응을 분석하였다. 이들 결과는 본 발명의 장치를 이용하여 다당체 항원에 대한 면역반응을 성취할 수 있음을 보여준다.

실시예 23

본 발명의 장치를 이용하여, 고도로 보존된 항원에 대한 면역반응을 유도할 수 있다. 이들 실험에 대한 모델 단백질로 사이클로필린을 선택하였는데, 그 이유는 사이클로필린에 대한 면역반응을 발생시키고 어렵고, 이 단백질이 포유동물종에 잘 보존되어있기 때문이다. 생쥐는 피하에 이식된 본 발명의 장치에 적하하거나 또는 Ribi 애쥬번트와 혼합하여 피하주사한 5㎍, 50㎍ 또는 50ng의 사람 사이클로필린으로 면역하였다. 생쥐는 방혈하고, 혈청은 ELISA로 사람 사이클로필린에 대한 IgG2a 반응을 검사하였다. 도32에서 보는 바와 같이, 본 발명의 장치를 이용하여 2가지 적은 항원 투여량으로 면역한 생쥐는 항원에 대하여 사이클로필린 + Ribi 애쥬번트를 피하에 면역주사한 생쥐에 비하여 훨씬 우수한 반응을 보였다. 이 결과에서, 본 장치는 비-면역원성인 고도로 보존된 항원에 대하여 면역반응을 유도할 수 있다는 것을 알 수 있다. 본 발명의 장치에서 높은 항원 투여량으로 면역하면, 면역반응을 유도하지 못한다. 본 발명의 장치를 이용하여 생존한 전체 미생물에 대한 면역반응을 유도할 수 있다. 이 실험에서, 생쥐는 본 발명의 피아-이식된 장치내 5마리의 유충을 이용하여 또는 2주간격으로 피하에 주사된 1000마리의 살아있는 유충을 이용하여, 살아있는 구충으로 면역하였다. 도33에서 보는 바와 같이, 양 프로토콜은 L3-특이적인 전체 IgG를 유도하는데, 이것은 ELISA로 측정하였다. 구충 말라리아를 비롯한 다수의 기생미생물에 대하여, 조사된 유충과 포자소체를 이용하여 각각 면역할 수 있다; 이런 연구를 통해, 본 발명의 장치를 이용한 면역은 감소된 수의 미생물을 이용하여 성취할 수 있다.

본 발명은 구체예를 이용하여 설명하였지만, 이들 구체예는 본 발명의 개념과 범주에 포함된다. 본 출원문은 모든 측면을 고려하여 설명하였고, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항으로 한정하고, 본 발명의 범주내 모든 변화는 여기에 포함된다.

이 글에서 언급한 모든 간행물은 여기에 참고문헌으로 한다.

Claims

포유류에서 항원에 대해 면역 반응을 조절하는 방법에 있어서, 포유류의 몸에 천공된 용기에 포함된 다공성 매트릭스로 구성된 장치를 이식하는 것으로, 이때 매트릭스에는 항원을 포함하고, 장치는 면역계 세포를 유인하여, 항원에 대항하여, 면역 반응을 조절하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 항원은 포유류에 장치를 이식하는 시기에 다공성 매트릭스내에서 생체 이용될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 항원은 장치가 포유류에 이식된 후에 다공성 매트릭스내에서 생체 이용될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 항원은 포유류에 장치가 이식된 후 약 3일간 생체 이용될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 항원은 이식후 3일후에 장치에 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 항원은 지연 방출 제형으로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 다공성 매트릭스는 고분자 재질로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 고분자 물질은 천연 및 합성 재료에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 고분자 매트릭스는 하이드록실화된 폴리비닐 아세테이티, 폴이우레탄, 에틸렌/비닐 아세테이트 혼성중합체, 폴리라틱산, 폴리락티드-글리코리드 혼성중합체, 젤라틴, 콜라겐, 교차결합된 콜라겐, 이들의 복합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 용기는 천연 및 합성 재료에서 선택된 고분자 재질로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 다공성 고분자 매트릭스는 하이드록실화된 아세테이트로 구성되고, 용기는 천공된 튜브 단편으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 항원의 양과 장치내에서 항원을 생체이용할 수 있는 시기는 포유류에 장치를 이식하는 시기와 관련되고, 이식하여, 항원에 대해 면역 반응을 유도 또는 강화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 항원은 장치가 포유류에 이식된 후에 장치내에서 생체 이용될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 항원은 포유류에 장치가 이식된 후 약 2-4일간 장치로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 항원의 양과 장치내에서 항원을 생체이용할 수 있는 시기는 포유류에 장치를 이식하는 시기와 관련되고, 항원에 대한 기존 또는 잠재된 면역 반응을 억제 또는 하향 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 항원은 포유류에 장치를 이식한 시점에서 생체 이용할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 장치는 포유류 신체에서 이식후 약 10일 이후에 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 장치로 일정양의 항원을 다시 도입시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 두 번째로 도입되는 항원은 장치의 이식 시점에 존재하는 항원의 두 번째 양을 지연 방출시킴으로써 장치로 재도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
항원에 대한 면역 반응을 조절하는 이식가능한 장치에 있어서, 천공된 불투성 용기내에 포함된 다공성 매트릭스로 구성된 것을 특징으로 하는 장치.
제 20 항에 있어서, 항원은 다공성 매트릭스내에 존재하는 것을 특징으로 하는 장치.
제 20 항에 있어서, 이식전후에 다공성 매트릭스와 항원을 접촉시키기 위한 장치가 포함된 것을 특징으로 하는 장치.
제 20 항에 있어서, 매트릭스는 고분자 재질로 구성된 것을 특징으로 하는 장치.
제 23 항에 있어서, 고분자 물질은 천연 및 합성 재료에서 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
제 24 항에 있어서, 고분자 매트릭스는 하이드록실화된 폴리비닐 아세테이티, 폴이우레탄, 에틸렌/비닐 아세테이트 혼성중합체, 폴리라틱산, 폴리락티드-글리코리드 혼성중합체, 젤라틴, 콜라겐, 교차결합된 콜라겐, 이들의 복합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
제 20 항에 있어서, 용기는 천공된 튜브 단편으로 구성된 것을 특징으로 하는 장치.
제 20 항에 있어서, 용기는 다공성 매트릭스 주변에 천공된 그러나 불투성 코팅으로 구성된 것을 특징으로 하는 장치.
제 27 항에 있어서, 코팅은 고분자 재질로 구성된 것을 특징으로 하는 장치.
제 28 항에 있어서, 고분자 물질은 천연 및 합성 재료에서 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
제 29 항에 있어서, 고분자 재질은 교차결합된 콜라겐, 폴리라틱산, 폴리락티드-글리코리드 혼성중합체, 폴리에틸렌, 실리콘, 라텍스 수지, 폴리스테렌, 아크릴 수지, 폴리비닐피롤리돈, 이들의 복합체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
제 20 항에 있어서, 다공성 매트릭스는 하이드록실화된 폴리비닐 아세테이트로 구성되고, 용기는 천공된 튜브로 구성된 것을 특징으로 하는 장치.
포유류에서 면역 세포를 얻는 방법에 있어서, 면역 세포는 천공된 그러나 불투성 용기에 포함된 다공성 매트릭스로 구성된 장치가 이식된 포유류에서 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 32 항에 있어서, 수득된 세포를 포유류에 다시 주입시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 33 항에 있어서, 수득된 세포는 포유류에 다시 주입시키기 전에 냉동보관하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 32 항에 있어서, 항원은 장치의 다공성 매트릭스에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 35 항에 있어서, 면역 세포는 포유류에 다시 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 35 항에 있어서, 면역 세포는 in vitro에서 항원에 노출된 후에 포유류에 다시 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 32 항에 있어서, 매트릭스는 고분자 재질로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 38 항에 있어서, 고분자 물질은 천연 및 합성 재료에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 39 항에 있어서, 고분자 매트릭스는 하이드록실화된 폴리비닐 아세테이티, 폴이우레탄, 에틸렌/비닐 아세테이트 혼성중합체, 폴리라틱산, 폴리락티드-글리코리드 혼성중합체, 젤라틴, 콜라겐, 교차결합된 콜라겐, 이들의 복합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 32 항에 있어서, 용기는 천공된 튜브 단편으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 32 항에 있어서, 용기는 다공성 매트릭스 주변에 천공된 그러나 불투성 코팅으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 42 항에 있어서, 코팅은 고분자 재질로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 43 항에 있어서, 고분자 물질은 천연 및 합성 재료에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 44 항에 있어서, 고분자 재질은 교차결합된 콜라겐, 폴리라틱산, 폴리락티드-글리코리드 혼성중합체, 폴리에틸렌, 실리콘, 라텍스 수지, 폴리스테렌, 아크릴 수지, 폴리비닐피롤리돈, 이들의 복합체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 32 항에 있어서, 다공성 매트릭스는 하이드록실화된 폴리비닐 아세테이트로 구성되고, 용기는 천공된 튜브로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 35 항에 있어서, 면역 세포는 항원에 대해 단클론 항체를 만들기 위한 하이브리도마를 만드는데 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
항원에 대한 단클론 항체를 만들기 위한 하이브리도마를 준비하기 위한 항원으로 포유류를 면역화시키는 방법에 있어서, 포유류는 제12항에 따른 방법을 이용하여 면역화되는 것을 특징으로 하는 방법.
항원에 대한 단클론 항체를 만들기 위한 하이브리도마를 준비하기 위한 항원으로 포유류를 면역화시키는 방법에 있어서, 포유류는 제12항에 따른 장치를 이용하여 면역화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 항원에 대한 면역 반응은 예방을 위한 백신화, 치료를 위한 백신화, 세포 면역성, 체액 면역성, 점막 면역성, 장기간 면역성 및 이의 복합 면역성에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
선택된 항원에 대해 단클론 항체를 만들 수 있는 하이브리도마를 생산하는 방법에 있어서,

(a) 심각하게 복합 면역 결핍된(SCID) 생쥐의 순환계로 사람의 말초 혈액 임파세포를 도입시키고, 임파세포가 생쥐의 면역계에 정착하도록 하고;

(b) 제21항에 따른 장치를 생쥐에 이식하고, 장치의 항원은 선택된 항원으로 구성되고;

(c) 장치로부터 면역 세포를 수득하고;

(d) 수득된 면역 세포에 존재하는 B 임파세포로부터 하이브리도마를 준비하고; 그리고

(e) 선택된 항원을 인지하는 단클론 항체를 만들 수 있는 하이브리도마를 선별하는 방법으로 확인하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
유전 물질로 포유류의 면역 세포를 감염시키는 방법에 있어서, 유전 물질을 천공된 그러나 불투성 용기에 포함된 다공성 매트릭스로 구성된 장치의 매트릭스에 도입시키고, 이때 장치는 포유류의 신체에 이식된 것을 특징으로 하는 방법.
제 52 항에 있어서, 유전 물질은 DNA, RNA, cDNA에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 52 항에 있어서, 유전 물질은 항원을 코드하는 것을 특징으로 하는 방법.
면역 반응에 의한 질병 또는 질환의 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, 제 15 항에 따른 방법을 이용하여 면역 반응을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 55 항에 있어서, 질환 또는 질병은 알레르기, 이식 거부, 자가면역 질환에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
포유류에서 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 방법에 있어서, 포유류의 신체에 장치를 이식하는데, 이때 장치는 항원 및 장치의 안팎으로 면역 세포의 활동적인 움직임을 제한하지 않고 장치밖으로 분자의 수동적인 확산을 제한하는 수단이 포함된 것을 특징으로 하는 방법.