ES2261250T3 - Celulas sdupresoras para prevencion y tratamiento de respuestas inmunes en trasplantes. - Google Patents
Celulas sdupresoras para prevencion y tratamiento de respuestas inmunes en trasplantes.Info
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Abstract
Un método para preparar células T supresoras humanas, que comprende: (a) poner en contacto células T efectoras inmunes humanas activadas con células madre mesenquimáticas in vitro, con lo que dichas células madre mesenquimáticas inducen a dichas células T humanas activadas a convertirse en células T supresoras humanas, y (b) aislar las células T supresoras humanas producidas en la etapa (a) a partir de dicho cultivo.
Description
Células supresoras para prevención y tratamiento
de respuestas inmunes en trasplantes.
La presente invención se refiere a la inhibición
de una respuesta inmune a un aloantígeno y además se refiere a la
inhibición y/o prevención de la reactivación de células T
previamente activadas. Más particularmente, la presente invención
se refiere al campo de la prevención, reducción o tratamiento de una
respuesta inmune causada por células efectoras inmunes a un tejido
y/o células y/u órganos extraños. La invención además se refiere a
la prevención, reducción o tratamiento de trasplantes y/o reacción
de injerto contra hospedador.
La tolerancia es la falta adquirida de respuesta
específica a un antígeno hacia el cual se produciría normalmente
respuesta inmune. Típicamente, para inducir tolerancia, debe haber
una exposición a un agente inductor de tolerancia que provoca la
muerte o la inactivación funcional de ciertos linfocitos. La
tolerancia completa se caracteriza por la falta de una respuesta
inmune detectable a la segunda estimulación antigénica. La
tolerancia parcial está tipificada por la reducción cuantitativa de
una respuesta inmune.
Desafortunadamente, el sistema inmune no
distingue los intrusos beneficiosos, tales como el tejido
trasplantado, de los que son perjudiciales, por lo que el sistema
inmune rechaza tejidos u órganos trasplantados. En el rechazo de
órganos trasplantados median significativamente células T
alorreactivas presentes en el hospedador que reconocen aloantígenos
del donante o xenoantígenos.
Actualmente, con el fin de prevenir o reducir
una respuesta inmune contra un trasplante, se trata a los pacientes
con potentes fármacos inmunosupresores. La infusión en individuos de
fármacos que previenen o suprimen una respuesta inmune de las
células T inhibe el rechazo al trasplante, pero también puede
provocar supresión inmune general, toxicidad e incluso muerte
debido a infecciones oportunistas. A causa de la toxicidad y
porcentaje de respuesta incompleta al tratamiento convencional del
rechazo de tejido donante, se necesitan otros enfoques alternativos
para tratar a pacientes que no pueden soportar o no responden a los
métodos actuales de terapia con fármacos.
El documento
WO-A-9947163 describe métodos para
reducir una respuesta inmune a un aloantígeno, que comprende el uso
de células mesenquimáticas.
En consecuencia, se necesita la prevención y/o
reducción de una respuesta inmune no deseada por parte de un
hospedador a un trasplante por células efectoras inmunes como un
método para evitar el rechazo del tejido donante por parte del
hospedador. También sería ventajoso un método para eliminar o
reducir la respuesta inmune no deseada por parte de un tejido
donante contra un tejido receptor, conocida como enfermedad de
injerto contra hospedador.
Se ha descubierto que las células madre
mesenquimáticas (MSC) pueden inducir a células T
alo-activadas a convertirse en supresoras para
respuestas alogénicas, y que las células supresoras humanas
obtenidas de acuerdo con el método de la reivindicación 1 pueden
usarse en trasplantes para mejorar una respuesta del sistema inmune
de tal manera que se reduzca o se elimine una respuesta inmune al
antígeno o antígenos.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se
proporciona un método para preparar células T supresoras humanas
como se define en la reivindicación 1.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se
proporciona un método para reducir o suprimir una respuesta inmune
causada por células T que responden a un aloantígeno, en particular
a un tejido, órgano o células alogénicas, en el que la respuesta
inmune se reduce o se suspende mediante el uso in vitro de
dichas células T supresoras de acuerdo con la reivindicación 4. Las
células T supresoras pueden ser autólogas a las células T (obtenidas
del mismo hospedador) o pueden ser alogénicas a las células T.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporciona el uso de dichas células de acuerdo con
las reivindicaciones 6-13. La patente también
describe un proceso para prevenir la reestimulación de células T
activadas (activadas contra un aloantígeno, en particular un órgano,
un tejido o células alogénicas) mediante el contacto de células T
activadas con células T supresoras en una cantidad eficaz para
prevenir y/o reducir una respuesta de células T subsiguiente a un
antígeno extraño. Las células madre mesenquimáticas que se usan
pueden ser autólogas a las células T o pueden ser alogénicas a las
células T. Preferiblemente, las células madre mesenquimáticas son
autólogas a las células T.
También se describe el uso de dichas células T
supresoras para suprimir o mejorar una respuesta inmune a un
trasplante (de tejido, órgano, células, etc.) administrando al
receptor del trasplante células T supresoras en una cantidad eficaz
para suprimir o mejorar una respuesta inmune contra el trasplante.
Las células T supresoras pueden ser autólogas al receptor del
trasplante o las células T supresoras pueden ser alogénicas al
receptor del trasplante. Preferiblemente, las células T supresoras
son autólogas al receptor del trasplante.
También se describe un método que proporciona
poner en contacto al receptor de tejido donante con células T
supresoras autólogas. En una realización de este aspecto, el método
implica administrar células T supresoras al receptor del tejido
donante. Las células T supresoras pueden administrarse al receptor
antes del trasplante o al mismo tiempo o posteriormente al
trasplante.
Las células T supresoras también pueden
administrarse al receptor como parte del trasplante. Para este
objetivo, la presente descripción proporciona un método para
reducir o mejorar una respuesta inmune proporcionando al receptor
tejido o un órgano del donante que se ha prefundido con células T
supresoras o incluye células T supresoras autólogas a las células
T. Las células T supresoras mejoran una respuesta inmune por parte
de las células T del receptor contra el tejido extraño cuando se
trasplanta en el receptor.
También se describe un método que proporciona un
tratamiento a un paciente que ha recibido un trasplante, con el
objetivo de reducir la gravedad o eliminar un episodio de rechazo
contra el trasplante, administrando al receptor de tejido donante
células T supresoras después de que se haya trasplantado el tejido
donante en el receptor. Las células T supresoras preferiblemente
son autólogas al receptor. La presentación de células T supresoras
a un receptor que sufre una respuesta inmune adversa a un trasplante
induce ausencia de sensibilidad de células T a más estimulación
antigénica, reduciendo por lo tanto o eliminando una respuesta
adversa de células T activadas al tejido u órgano donante.
Además se describe un método para reducir una
respuesta inmune por parte del tejido, el órgano o las células
donantes contra el receptor, es decir, la respuesta de injerto
frente a hospedador, que comprende tratar el tejido, órgano o
células donantes con células T supresoras ex vivo antes del
trasplante del tejido, órgano o células en el receptor. Las células
T supresoras reducen la sensibilidad de las células T en el
trasplante, que posteriormente pueden activarse contra células
presentadoras de antígeno del receptor de tal forma que el
trasplante se puede introducir en el cuerpo del receptor
(hospedador) sin la aparición o con una reducción de una respuesta
adversa del trasplante al hospedador. De esta manera, se puede
evitar lo que se conoce como "enfermedad de injerto contra
hospedador".
El trasplante donante se puede exponer primero a
un tejido o a células del receptor o de una tercera parte ex
vivo, para activar las células T en el trasplante donante. El
trasplante donante después se pone en contacto con células T
supresoras. Las células T supresoras reducirán o inhibirán una
respuesta inmune secundaria adversa por parte de las células T en
el trasplante donante contra la estimulación antigénica por parte
del receptor cuando el trasplante donante se sitúa posteriormente
en el receptor.
Las células T supresoras se pueden obtener del
receptor antes del trasplante. Las células T supresoras pueden
aislarse y almacenarse congeladas hasta que se necesiten. Las
células T supresoras también se pueden reproducir en cultivo hasta
obtener la cantidad adecuada y se pueden almacenar hasta que se
necesiten. Las células T supresoras se administran al receptor en
una cantidad eficaz para reducir o eliminar una respuesta inmune
adversa en curso causada por el trasplante donante contra el
receptor (hospedador). La presentación de las células T supresoras
al receptor con una respuesta inmune adversa en curso causada por un
trasplante inhibe la respuesta en curso y previene la
reestimulación de las células T, reduciendo o eliminando por lo
tanto una respuesta adversa por parte de las células T activadas
hacia el tejido receptor.
De esta manera, de acuerdo con la presente
descripción, se pueden emplear células T supresoras humanas para
tratar rechazos de trasplantes o la enfermedad de injerto contra
hospedador como resultado de un trasplante y/o para prevenir o
reducir el rechazo de trasplantes y/o la enfermedad de injerto
contra hospedador. También se pueden emplear células T supresoras
humanas para facilitar el uso de injertos o trasplantes
xenogénicos.
La Fig. 1 muestra el nivel de reestimulación de
células T supresoras en una reacción linfocítica mixta usando
células estimuladoras del donante original (los mismos estimuladores
del donante que se usan para generar las células T supresoras) en
el día 0. Las células T supresoras (T2) no respondían a la
reestimulación con PBMC originales del donante o fitohemaglutinina
(PHA). La población de células T empobrecidas en células CD8 (T3)
produjo una restauración parcial de la sensibilidad. Las células T
cultivadas sin MSC (T1) respondieron bien en la reacción
linfocítica mixta secundaria y a la PHA.
La Fig. 2 muestra el nivel de supresión de una
reacción linfocítica mixta en curso mediante células T supresoras
en el día 0 (Fig. 2A), día 1 (Fig. 2B) y día 2 (Fig. 2C) después de
la adición de las células T supresoras a los cultivos de reacción.
Las células estimuladoras en la reacción linfocítica mixta son del
mismo donante que las células estimuladoras que se usan para
generar las células T supresoras. Las células T supresoras (T2)
suprimieron una reacción linfocítica mixta en curso prematuramente y
a muy bajo número de células por pocillo. La población de células
empobrecidas en células CD8 (T3) produjo una supresión retrasada y
solamente parcial. Las células T cultivadas sin MSC (T1) no
suprimieron e incluso potenciaron la reacción linfocítica mixta.
La Fig. 3 muestra el nivel de supresión de una
reacción linfocítica mixta en curso por parte de células T
supresoras en el día 0 (Fig. 3A), día 1 (Fig. 3B) y en el día 2
(Fig. 3C) después de la adición de las células T supresoras a los
cultivos de reacción. Las células estimuladoras en la reacción
linfocítica mixta proceden de un tercer donante (donante diferente
del donante original de células estimuladoras y diferente del
donante de células T supresoras). Las células T supresoras (T2)
suprimieron una reacción linfocítica mixta en curso de forma
prematura y a muy bajo número de células por pocillo. La población
de células T empobrecida en células CD8 (T3) dio como resultado una
supresión retrasada y solamente parcial. Las células T cultivadas
sin MSC (T1) no suprimieron e incluso potenciaron la reacción
linfocítica mixta.
La Fig. 4 muestra el nivel de supresión de una
respuesta proliferativa de PHA por parte de células T supresoras en
el día 1 (Fig. 4A), en el día 2 (Fig. 4B) y en el día 3 (Fig. 4C).
Las células T supresoras suprimieron la proliferación inducida por
PHA de PBMC autólogas mientras que células T cultivadas solas
aceleraron la respuesta a PHA. El empobrecimiento en células CD8
produjo una supresión retrasada y solamente parcial.
Como se define en este documento, las células T
supresoras son células T que se han cebado, por ejemplo, en una
reacción linfocítica mixta mediante la exposición a un aloantígeno,
y se han cultivado posteriormente con células madre mesenquimáticas
(autólogas o alogénicas a las células T, es decir, de la misma
procedencia que las estimuladoras o de una tercera parte). Estas
células T supresoras no se reestimulan cuando se sitúan de nuevo en
una reacción linfocítica mixta y se exponen a un aloantígeno bien de
la misma procedencia que las células estimuladoras originales o
bien de una tercera parte.
Antígeno donante se refiere a antígenos
expresados por el tejido donante que será trasplantado en el
receptor. Los aloantígenos son antígenos que difieren de los
antígenos expresados por el receptor. El tejido donante, los
órganos donantes o las células donantes que serán trasplantados son
el trasplante. Los ejemplos de trasplantes incluyen, pero sin
limitación, piel, médula ósea y órganos sólidos tales como corazón,
páncreas, riñón, pulmón e hígado. El páncreas y el hígado se pueden
reducir a suspensiones unicelulares para su trasplante.
Los inventores han descubierto que células T
supresoras pueden suprimir una MLR entre células alogénicas. Las
células T supresoras redujeron activamente la respuesta de las
células T alogénicas en reacciones linfocíticas mixtas de forma
dependiente de la dosis.
En consecuencia, la presente invención
proporciona los métodos y usos de acuerdo con las reivindicaciones
1-13. Se describen métodos para reducir, inhibir o
eliminar una respuesta inmune mediante la administración de células
T supresoras a un receptor de un tejido donante, de órganos donantes
o de células donantes. En una realización, las células T supresoras
se administran al receptor al mismo tiempo que el trasplante. De
forma alternativa, las células T supresoras se pueden administrar
antes de la administración del trasplante. Por ejemplo, las células
T supresoras se pueden administrar al receptor de aproximadamente 3
a 7 días antes del trasplante del tejido donante.
De esta forma, se pueden utilizar células T
supresoras para acondicionar el sistema inmune de un receptor al
tejido del donante o a un tejido extraño administrando al receptor,
antes de, o al mismo tiempo que el trasplante del tejido donante,
células T supresoras en una cantidad eficaz para reducir o eliminar
la respuesta inmune contra el trasplante por parte de las células T
del receptor. Las células T supresoras afectan a las células T del
receptor de tal manera que la respuesta de las células T se reduce o
se elimina cuando se presenta el tejido donante o un tejido
extraño. De esta forma, el rechazo del trasplante por parte del
hospedador se puede evitar o se puede reducir su
gravedad.
gravedad.
En consecuencia, también se describe un método
para tratar a un paciente que está experimentando una respuesta
adversa inmune a un trasplante administrando células T supresoras a
dicho paciente en una cantidad eficaz para reducir o suprimir la
respuesta inmune. Las células T supresoras se pueden obtener del
receptor del trasplante, del donante del trasplante, o de una
tercera parte.
También se describe un método para reducir,
inhibir o eliminar una respuesta inmune por parte de un trasplante
donante contra el receptor del mismo (injerto contra hospedador). En
consecuencia, el método descrito proporciona poner en contacto un
órgano donante o un tejido donante con células T supresoras antes
del trasplante. Las células T supresoras mejoran, inhiben o reducen
una respuesta adversa por parte del trasplante donante contra el
receptor.
Antes del trasplante, el trasplante donante
puede tratarse con tejido o células alogénicas (del receptor) que
activen las células T en el trasplante donante. El trasplante
donante se trata entonces con células T autólogas supresoras antes
del trasplante. Las células T supresoras previenen la
reestimulación, o inducen una hiporrespuesta de las células T a
estimulaciones antigénicas posteriores.
De esta forma, en el contexto del trasplante de
médula ósea (células madre hematopoyéticas), se puede reducir o
eliminar el ataque al receptor por parte del injerto. La médula
donante se puede pretratar con células T supresoras donantes antes
del implante de la médula ósea o de las células madre de sangre
periférica en el receptor. La médula donante se puede exponer
primero a tejido/células del receptor y luego tratarse con células
T supresoras. Aunque sin limitarse a ello, se cree que el contacto
inicial con tejido o células del receptor funciona para activar las
células T en la médula. El tratamiento posterior con células T
supresoras inhibe o elimina la activación posterior de las células
T en la médula, reduciendo o eliminando por lo tanto un efecto
adverso por parte del tejido donante, es decir, la terapia reduce o
elimina la respuesta de injerto contra hospedador.
Un receptor de trasplante que padece la
enfermedad de injerto contra hospedador se puede tratar para
eliminarla o reducir su gravedad administrando a tal receptor
células T supresoras en una cantidad eficaz para reducir o eliminar
un rechazo al injerto por parte del hospedador. Las células T
supresoras inhiben o suprimen las células T activadas en el tejido
del donante para no inducir una respuesta inmune contra el receptor,
reduciendo o eliminando por lo tanto la respuesta de injerto contra
hospedador.
Las células T supresoras del receptor se pueden
obtener a partir del donante del trasplante o del receptor o de una
tercera parte antes del trasplante y se pueden almacenar y/o
reproducir en cultivo para proporcionar una reserva de células T
supresoras en cantidades suficientes para tratar un ataque en curso
del injerto contra el hospedador.
En otro método ya descrito, el tejido donante se
expone a células T supresoras de tal manera que las células T
supresoras se integran en el injerto de órgano antes de su
trasplante. En esta situación, las células T supresoras presentes
en el injerto eliminarían una respuesta inmune contra el injerto
causada por cualquier célula alorreactiva del receptor que haya
escapado al tratamiento convencional para prevenir el rechazo al
trasplante, por ejemplo, inmunosupresión mediada por fármacos. Las
células T supresoras son preferiblemente autólogas al receptor.
De acuerdo con los métodos que se describen en
este documento, se contempla que las células T supresoras de la
presente invención se pueden usar conjuntamente con maneras actuales
para tratar el rechazo a tejido donante o la enfermedad de injerto
contra hospedador. Una ventaja de tal uso es que mejorando la
gravedad de la respuesta inmune en un receptor de un trasplante, se
puede reducir la cantidad de fármacos usados en el tratamiento y/o
la frecuencia de la administración de la terapia de fármacos, lo que
da como resultado la mitigación de la supresión inmune general y
efectos secundarios no deseados.
Se contempla además que puede requerirse sólo un
único tratamiento con las células T supresoras de la presente
invención, eliminando la necesidad de terapia inmunosupresora de
fármacos crónica. De forma alternativa, se pueden emplear múltiples
administraciones de células T supresoras.
En consecuencia, en este documento se describen
métodos para prevenir o tratar el rechazo de trasplantes
administrando células T supresoras en una cantidad profiláctica o
terapéuticamente eficaz para la prevención o el tratamiento o la
mejora del rechazo del trasplante de un órgano, tejido o células de
la misma especie, o un trasplante de xenoinjerto de órgano o tejido
y/o la enfermedad de injerto contra hospedador.
La administración de una única dosis de células
T supresoras puede ser eficaz para reducir o eliminar la respuesta
de células T a un tejido alogénico a las células T o a un tejido
"no propio", particularmente en el caso en el que los
linfocitos T retienen su carácter no sensible (es decir, tolerancia
o anergia) a células alogénicas después de separarse de las células
T supresoras.
La dosificación de las células T supresoras
varía dentro de amplios límites y, por supuesto, se ajustará a los
requisitos individuales en cada caso particular. En general, en caso
de administración parenteral, es habitual administrar de
aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 millones de células por
kilogramo de peso corporal del receptor. El número de células que
se usan dependerá del peso y estado del receptor, el número o la
frecuencia de las administraciones y otras variables conocidas para
los especialistas en la técnica. Las células T supresoras pueden
administrarse mediante una vía que sea adecuada para el tejido,
órgano o células a trasplantar. Se pueden administrar
sistémicamente, es decir, por vía parenteral, por inyección
intravenosa, o también se pueden dirigir a un tejido u órgano
particular, tal como médula ósea. Las células T supresoras se
pueden administrar mediante implante de células por vía subcutánea o
mediante inyección de células madre en tejido conectivo, por
ejemplo músculo.
Las células se pueden suspender en un diluyente
adecuado, a una concentración de aproximadamente 0,01 a
aproximadamente 5 x 10^{6} células/ml. Son excipientes adecuados
para soluciones de inyección los que son biológica y
fisiológicamente compatibles con las células y con el receptor,
tales como soluciones salinas tamponadas u otros excipientes
adecuados. La composición para la administración se debe formular,
producir y almacenar de acuerdo con métodos convencionales que
cumplan con una esterilidad y estabilidad apropiadas.
Aunque la invención no se limita a esto, las
células mesenquimáticas se pueden aislar, preferentemente de médula
ósea, purificar y reproducir en cultivo, es decir, in vitro,
para obtener cantidades suficientes de células para uso en los
métodos descritos en este documento. Las células madre
mesenquimáticas, los blastocitos formativos pluripotenciales que se
encuentran en el hueso, están presentes normalmente a frecuencias
muy bajas en la médula ósea (1:100.000) y otros tejidos
mesenquimáticos. Véase, Caplan y Haynesworth, Patente de Estados
Unidos Nº 5.486.359. En Gerson et al, Patente de Estados
Unidos Nº 5.591.625, se describe la transducción génica de células
madre mesenquimáticas.
Se debe entender que los métodos descritos en
este documento se pueden llevar a cabo de varias formas y con
diversas modificaciones y permutaciones de los mismos que son bien
conocidas en la técnica. También se puede apreciar que cualquier
teoría expuesta en cuanto al modo de acción o interacciones entre
tipos celulares no debe considerarse limitante de esta invención de
ningún modo, sino que se presenta para que los métodos de la
invención se puedan entender mejor.
Los siguientes ejemplos ilustran además aspectos
de la presente invención. Sin embargo, no son en ningún modo una
limitación de los contenidos o la descripción de la presente
invención como se ha expuesto en este documento.
La reacción linfocítica mixta mide la
compatibilidad de los antígenos de superficie del donante y es una
indicación de la probabilidad de rechazo de tejido donante. Los
antígenos de la superficie celular responsables de provocar el
rechazo del trasplante son los antígenos MHC de clases I y II. Las
células T son alorreactivas con aloantígenos MHC extraños. Las
moléculas MHC de clases I y II estimulan la reacción linfocítica
mixta.
Se prepararon células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de densidad
en Ficoll-Paque (Pharmacia). Se congelaron alícuotas
de células en FCS al 90% con DMSO al 10% y se almacenaron en
nitrógeno líquido. Después de la descongelación, las células se
lavaron dos veces con medio MSC (DMEM con bajo nivel de glucosa y
FCS al 10%) y se resuspendieron en medio de ensayo (de ISCOVE con
Hepes 25 mM, piruvato sódico 1 mM, aminoácidos no esenciales 100
\muM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 \mug/ml,
anfotericina B 0,25 \mug/ml, 2-mercaptoetanol 5,5
x 10^{-5} M (todos los reactivos de GibcoBLR) y suero AB humano al
5% (Sigma, ensayado MLR)).
Para preparar la fracción enriquecida en células
T, se empobrecieron las PBMC del donante 155 en monocitos y células
B mediante selección inmunomagnética negativa. Se incubaron las PBMC
con mAb de ratón (sin azida/bajo nivel de endotoxina (NA/LE))
anti-CD 19 y CD 14 humanos seguido por Ab de cabra
conjugados con biotina anti-IgG de ratón (adsorción
múltiple) (todos los reactivos de Pharmingen) y microperlas de
estreptavidina (Miltenyi Biotec). Las células se separaron entonces
usando un clasificador celular magnético (MACS, Miltenyi
Biotec).
Las PBMC del donante 413 se irradiaron con rayos
X a 3600 rad (12 min a 70 kV) utilizando un sistema de rayos X
Cabinet (Faxitron X ray, Buffalo Grove, IL).
Activación de células T: Se cultivaron
células T (15 x 10^{6}/placa) del donante 155 en placas de cultivo
tisular de 10 cm con PBMC (15 x 10^{6} células/placa) del donante
413 durante 7 días. Las células se incubaron a 37ºC en una
atmósfera con el 5% de CO_{2} durante 7 días.
Co-cultivo con MSC: Se
aislaron MSC humanas de la médula ósea del donante 273 como se
describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.486.359 y se
mantuvieron en cultivo con medio MSC y se usaron en pases del 3 al
6. Las células se desplazaron usando una solución de Tripsina/EDTA
al 0,05% y se lavaron una vez con medio MSC. Las MSC (d 273) se
situaron en placas de cultivo tisular de 10 cm a 1,0 x 10^{6}
células/placa, se cultivaron durante 4 días y se lavaron 4 veces
con PBS-D antes de añadir las células T activadas
(d155). Las células T (d155) activadas en la MLR durante 7 días, se
recogieron, se lavaron una vez con medio MSC, se resuspendieron en
medio de ensayo y se transfirieron a las placas previamente
sembradas con MSC (0,5 x 10^{6} células/ml, 1,0 x 10^{7}
células/placa) durante 3 días a 37ºC en una atmósfera con el 5% de
CO_{2}. En los cultivos de control, las células T activadas se
cultivaron sin MSC a la misma densidad (la población "T1"). Las
células cultivadas con MSC son la población "T2"; la población
"T3" se empobreció en células CD8+ como se describe a
continuación.
Empobrecimiento inmunomagnético y tinción
FACS: al final del cultivo con MSC (10 días después del inicio
del cultivo primario), se recuperaron y se lavaron las células T.
Éstas son las "células T supresoras" ("población T2").
Las células CD8 se empobrecieron mediante selección inmunomagnética
negativa con microperlas anti-CD8 (Miltenyi Biotec)
(CD8 empobrecida = población "T3"). Se tiñeron alícuotas de las
células recolectadas antes y después del empobrecimiento con
anticuerpos anti-CD4-PE y
anti-CD8-APC (Caltag) y se
analizaron mediante FACS.
Re-estimulación: Las
células T activadas en MLR durante 7 días y cultivadas sin MSC (T1)
durante 3 días, o cultivadas con MSC (no fraccionadas ("T2") o
empobrecidas en CD8 ("T3")) se recuperaron y se reestimularon
con PBMC irradiadas autólogas al estimulador original (donante 413)
o autólogas al respondedor (donante 155). Las células se cultivaron
a 5 x 10^{4} células/pocillo en placas de cultivo tisular de 96
pocillos. Alternativamente, se estimularon 5 x 10^{4} células T
con PHA (5 \mug/ml).
Los cultivos se sometieron a pulsos con
[H^{3}]TdR (Amersham) (5 Ci/mmol, 1 \muCi/pocillo)
durante 18 horas inmediatamente después de ponerlas en placas, o se
incubaron durante 1, 2, 3 ó 4 días y luego se sometieron a pulsos
con [H^{3}]TdR) durante 18 horas adicionales. Los cultivos
se recogieron utilizando Harvester 96 (Tomtec), los filtros se
analizaron utilizando centelleo líquido Microbeta Trilux y contador
de luminiscencia (E.G. & G Wallac).
Los resultados se muestran en la Figura 1. Las
células T supresoras (T2) no respondieron a la reestimulación con
PBMC originales donantes o PHA. Los cultivos con células
empobrecidas en células CD8+ de la población de células T
supresoras (T3) produjeron una restauración parcial de la
sensibilidad. Las células T cultivadas sin MSC (T1) respondieron
bien en la segunda reacción linfocítica mixta y a la PHA.
Se preparó una MLR en placas de cultivo tisular
de 96 pocillos 4 días antes de añadir células T supresoras. En la
MLR, se mezclaron 1,5 x 10^{5} células T respondedoras con el
mismo número de células estimuladoras irradiadas. Las células T del
donante 155 (autólogas a las células T supresoras) se prepararon a
partir de las PBMC mediante selección inmunomagnética negativa con
microperlas anti-CD14 y anti-CD19.
Las PBMC estimuladoras eran del donante 413 (igual que el
estimulador de la generación de células T supresoras) o del donante
273 (tercera parte para supresores). Como supresores se usaron
células T del donante 155 preactivadas mediante PBMC irradiadas del
donante 413 durante 7 días, y cultivadas solas o con MSC del donante
273 durante 3 días (no fraccionadas o empobrecidas en CD8). Después
de 4 días de cultivo, se añadieron células T supresoras en
diferentes números por pocillo (desde 5 x 10^{4} células/pocillo a
1,56 x 10^{3} células/pocillo). Los cultivos se sometieron a
pulsos de [H^{3}] TdR (5 Ci/mmol, 1 \muCi/pocillo) durante 18
horas inmediatamente después de colocarse en las placas, o se
incubaron durante 1 ó 2 días y luego se sometieron a pulsos de
[H^{3}]TdR durante 18 horas más.
Los resultados se muestran en las Figuras 2 y 3.
Las células T supresoras ("precultivadas con MSC") suprimieron
una reacción linfocítica mixta en curso de forma prematura y a un
número muy bajo de células por pocillo. El empobrecimiento en
células CD8+ tuvo como resultado una supresión retrasada y solamente
parcial, sugiriendo por lo tanto que las células supresoras eran
CD8+. Las células T cultivadas sin MSC ("precultivadas solas")
no suprimieron e incluso potenciaron la reacción linfocítica mixta.
El efecto supresor de las células T supresoras se observó en una
reacción linfocítica mixta inducida por las mismas células
estimuladoras (Fig. 2), así como en estimuladoras de terceras
partes (Fig. 3).
Las PBMC del donante 155 (autólogas a las
células supresoras) a 5 x 10^{4} células/pocillo se estimularon
con PHA-M (5 \mug/ml) en presencia o ausencia de
células T supresoras. Las células T del donante 155 se preactivaron
mediante PBMC irradiadas del donante 413 durante 7 días como se ha
descrito anteriormente. Estas células se cultivaron solas o con MSC
del donante 273 durante 3 días (no fraccionadas o empobrecidas en
CD8). Se añadieron células T supresoras a diferentes número/pocillo
(de 5 x 10^{4} células/pocillo a 1,56 x 10^{3}
células/pocillo). Los cultivos se incubaron durante 1, 2 ó 3 días y
luego se sometieron a pulsos de [H^{3}] TdR (5 Ci/mmol, 1
\muCi/pocillo) durante 18 horas más.
Los resultados se muestran en la Figura 4. Las
células T supresoras suprimieron la proliferación inducida por PHA
de PBMC autólogas, mientras que las células T cultivadas solas
aceleraron la respuesta a PHA. El empobrecimiento en células CD8
dio como resultado una supresión retrasada y solamente parcial.
Claims (13)
1. Un método para preparar células T
supresoras humanas, que comprende:
(a) poner en contacto células T efectoras
inmunes humanas activadas con células madre mesenquimáticas in
vitro, con lo que dichas células madre mesenquimáticas inducen a
dichas células T humanas activadas a convertirse en células T
supresoras humanas, y
(b) aislar las células T supresoras
humanas producidas en la etapa (a) a partir de dicho cultivo.
2. El método de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que las células T efectoras inmunes son
células CD8+.
3. El método de acuerdo con las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que las células mesenquimáticas madre
son células alogénicas.
4. Un método para reducir o suprimir una
respuesta inmune contra un aloantígeno, en el que las células
efectoras inmunes se ponen en contacto in vitro con células T
supresoras humanas aisladas que se han preparado de acuerdo con el
método definido en las reivindicaciones 1 a 3 en una cantidad eficaz
para reducir una respuesta inmune.
5. Un método de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que las células efectoras son células T.
6. El uso de células T supresoras
humanas para la preparación de una composición farmacéutica para
reducir una respuesta inmune a un trasplante donante o para reducir
una respuesta inmune a un aloantígeno o para tratar en un receptor
de trasplante la enfermedad de injerto contra hospedador, en el que
las células T supresoras humanas se han preparado de acuerdo con el
método definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en
el que las células T supresoras humanas se usan en una cantidad
eficaz para reducir una respuesta inmune contra el receptor por
parte del trasplante.
7. El uso de acuerdo con la
reivindicación 6, en el que las células T supresoras humanas son
alogénicas a las células madre mesenquimáticas.
8. El uso de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 6 ó 7, en el que el trasplante es un
trasplante de piel o de médula ósea.
9. El uso de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 6 ó 7, en el que el trasplante es un órgano
sólido.
10. El uso de acuerdo con la reivindicación
9, en el que dicho órgano sólido se selecciona entre el grupo
constituido por corazón, páncreas, riñón, pulmón o hígado.
11. El uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 10, en el que las células T supresoras
humanas se administran antes del trasplante, al mismo tiempo que el
trasplante, como parte del trasplante y/o posteriormente al
trasplante.
12. El uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 11, en el que el receptor del trasplante se
trata además con agentes inmunosupresores.
13. El uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 11, en el que las células supresoras son
autólogas al receptor.
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