PT749444E

PT749444E - Factor viii hibrido humano/animal

Info

Publication number: PT749444E
Application number: PT95903119T
Authority: PT
Inventors: John S Lollar; Marschall S Runge
Original assignee: Univ Emory
Priority date: 1994-03-11
Filing date: 1994-11-15
Publication date: 2001-11-30
Also published as: DE69427997D1; ES2161278T3; CA2185327A1; EP0749444A1; US5663060A; AU1209695A; ATE204298T1; JPH10500282A; WO1995024427A1; DK0749444T3; AU693837B2; DE69427997T2; JP3406607B2; EP0749444B1

Description

r- U, ^

DESCRIÇÃO "FACTOR VIII HÍBRIDO HUMANO/ANIMAL" 0 governo detém alguns direitos sobre a presente invenção resultantes dos subsídios do National Institutes of Health Grant Nos. HL40921, HL46215 e HL36094 que financiaram parcialmente a pesquisa que conduziu à presente invenção.

Antecedentes da invenção A presente invenção refere-se em geral a um factor VIII híbrido, com uma sequência de aminoácidos de factor VIII humana e animal e a métodos para a sua preparação e utilização. A coagulação sanguínea tem início quando as plaquetas aderem à parede cortada de um vaso sanguíneo danificado, no local de uma lesão. Subsequentemente, numa cascata de reacções reguladas enzimaticamente, as moléculas de fibrinogénio solúveis são convertidas, pela enzima trombina, em cadeias de fibrina insolúveis, que mantêm as plaquetas juntas, formando um trombo. A cada passo da cascata um precursor proteico é convertido numa protease, que cliva o próximo precursor proteico da série. São necessários co-factores, na maioria dos passos. Na sua forma activa, o factor proteico VIII é um co-factor necessário para a activação do factor X pela protease, o factor IX activado. 0 factor VIII, ou factor anti-hemofílico, foi detectado no plasma e classificado nos anos 30. Nos anos 40, associou-se uma deficiência no factor VIII com a desordem de coagulação, 1 hemofilia A. Verificou-se que o factor VIII estava ligado a X e pôs-se a hipótese de este ser uma proteína. Trabalhos realizados envolvendo plasma de bovino, humano e de porcino, identificaram o factor VIII como uma proteína, nos anos 80, embora a sua fonte celular definitiva permaneça desconhecida. O modo preciso como o factor VIII funciona na coagulação do sangue é desconhecido. Sabe-se que o factor VIII é activado a factor VlIIa proteoliticamente, pela trombina, ou factor Xa. Em combinação com o cálcio e fosfolípidos, o factor VlIIa torna o factor IXa um activador mais eficiente do factor X, por meio de um mecanismo desconhecido.

As pessoas deficientes em factor VIII, ou que possuem anticorpos contra o factor VIII, que não são tratadas com factor VIII, sofrem de hemorragias internas incontroladas, que poderão levar a vários sintomas graves, desde reacções inflamatórias nas articulações, até à morte prematura. Os hemofílicos graves, que montam a cerca de 10.000 nos Estados Unidos, podem ser tratados com infusões de factor VIII, o qual irá recuperar a capacidade normal do sangue em coagular, se administrado com uma frequência e concentração suficientes. A definição clássica do factor VIII é, de facto, a da substância presente no plasma sanguíneo normal que corrige o defeito de coagulação no plasma derivado de indivíduos com hemofilia A.

Estão disponíveis comercialmente algumas preparações de factor VIII derivado de plasma humano, com vários graus de pureza, para o tratamento de hemofilia A. Estas incluem um factor VIII parcialmente purificado, derivado a partir de sangue reunido de muitos dadores, o qual é tratado pelo calor, ou com detergente, por causa dos vírus, mas que contém um 2

nivel significativo de proteínas antigénicas; um factor VIII purificado-anticorpo monoclonal que tem níveis menores de impurezas antigénicas e de contaminação virai; e factor VIII humano recombinante, para o qual estão em curso estudos clínicos. Adicionalmente, está disponível uma preparação de factor VIII de porcino parcialmente purificado, para tratar pacientes com inibidores do factor VIII humano, i.e. aqueles que têm moléculas de anticorpo circulantes, que se ligam e neutralizam o factor VIII humano.

Os hemofílicos necessitam da substituição diária de factor VIII, para impedir a artropatia hemofílica deformante, que ocorre após muitos anos de hemorragias recorrentes nas articulações. No entanto, os fornecimentos de concentrados de factor VIII nunca foram suficientes para tratar os hemofílicos de forma adequada, devido a problemas na produção comercial e utilização terapêutica. Por exemplo, o factor vulgarmente utilizado, derivado de plasma, é difícil de isolar e purificar, é imunogénico e requer tratamento para remover o risco de infecciosidade pelos vírus da SIDA e de hepatite B. Um factor VIII humano recombinante poderá diminuir estes dois. últimos problemas. 0 factor VIII de porcino pode também representar uma alternativa, uma vez que o factor VIII humano é instável a concentrações e pH fisiológicos, está presente no sangue em concentrações extremamente baixas (0,2 μς/ταί de plasma) e a sua actividade especifica de coagulação é baixa, comparada com a do factor VIII de porcino.

Uma vez que muitos inibidores do factor VIII humano reagem menos fortemente com o factor VIII de porcino, o factor VIII de porcino é normalmente utilizado para corrigir a deficiência de factor VIII em pacientes, sob condições em que estes não 3

respondem a infusões de factor VIII humano. Uma limitação do factor VIII de porcino é o desenvolvimento de anticorpos inibitórios contra este, após uma ou mais infusões.

Os problemas associados com o factor VIII derivado de plasma, comercialmente disponível, vulgarmente utilizado, levaram a um interesse significativo no desenvolvimento de um melhor produto de factor VIII. Há uma necessidade de uma molécula de factor VIII mais potente, de modo a que mais unidades de actividade coagulante possam ser fornecidas, por molécula; uma molécula de factor VIII que é estável a um pH e concentração fisiológica, seleccionados, uma molécula de factor VIII que é menos apta a produzir anticorpos inibitórios e uma molécula de factor VIII que se escapa à detecção imunitária em pacientes que já adquiriram anticorpos contra o factor VIII humano. A WO-A-9320093 descreve a criação de moléculas de factor VIII híbridas, humano/porcino, com actividade coagulante, nas quais os elementos da molécula de factor VIII de uma espécie são substituídos pelos elementos correspondentes da molécula de factor VIII da outra espécie. A WO-A-9411503 descreve moléculas de factor VIII híbridas humano/animal, em que os elementos da molécula de factor VIII de uma espécie, são substituídos pelos elementos correspondentes da molécula de factor VIII da outra espécie.

Constitui assim um objecto da presente invenção proporcionar um factor VIII que corrige a hemofília num paciente deficiente em factor VIII, ou que possui inibidores do factor VIII humano. 4

Constitui ainda outro objecto da presente invenção proporcionar métodos para o tratamento de hemofílicos.

Constitui ainda outro objecto da presente invenção proporcionar um factor VIII que é estável a um pH e concentração fisiológica, seleccionados.

Sumário da invenção

Descreve-se um factor VIII híbrido, com actividade coagulante, incluindo, numa forma de concretização, a sequência de amínoácídos de factor VIII derivada a partir de um humano, e porco, ou outro animal não-humano (aqui referido como "animal"); ou, numa segunda forma de concretização, incluindo a sequência de aminoácidos do factor VIII derivada a partir de um humano ou animal, ou de ambos, e uma sequência de aminoácidos não derivada do factor VIII, de preferência substituída numa região antigénica do factor VIII. Esta molécula de factor VIII híbrida é produzida por isolamento e recombinação de subunidades ou domínios de factor VIII humano e de animal; ou por manipulação genética dos genes de factor VIII humano e de animal.

Na forma de concretização preferida, utilizam-se métodos de ADN recombinante para substituir elementos do factor VIII de animal, por elementos correspondentes do factor VIII humano, resultando em moléculas de factor VIII híbridas humano/animal. Noutra forma de concretização, utilizam-se métodos de ADN recombinante para substituir um ou mais aminoácidos no factor VIII humano, ou animal, ou num híbrido de duas espécies, com aminoácidos que não têm identidade de sequência com o factor VIII, de preferência uma sequência de 5 aminoácidos que não é imunoreactiva cora anticorpos inibidores do factor VIII, que ocorrem naturalmente. Um exemplo de uma sequência de aminoácidos que pode ser utilizada para substituir em particular epitopos imunogénicos, é a sequência de resíduos de alanina.

Noutra forma de concretização, isolam-se e purificam-se subunidades do factor VIII, a partir de plasma humano ou animal e produz-se um factor VIII híbrido humano/animal, quer por mistura de subunidades de cadeia pesada de animal com subunidades de cadeia leve humanas, ou por mistura de subunidades de cadeia pesada humana, com subunidades de cadeia leve animal, produzindo deste modo moléculas híbridas de cadeia leve humana/cadeia pesada animal e cadeia pesada humana/cadeia leve animal. Estas moléculas híbridas são isoladas por cromatografia de permuta iónica.

Alternativamente, isola-se e purifica-se um ou mais domínios, ou domínios parciais de factor VIII, a partir de plasma humano ou animal e produz-se um factor VIII híbrido humano/animal, por mistura de domínios, ou domínios parciais de uma espécie com domínios, ou domínios parciais, da segunda espécie. As moléculas híbridas podem ser isoladas por cromatografia de permuta iónica.

Os métodos para a preparação de factor VIII híbrido altamente purificado são descritos como tendo os passos de: (a) isolamento de subunidades de factor VIII humano, derivado de plasma e subunidades de factor VIII animal, derivado de plasma, seguido de reconstituição da actividade coagulante, por mistura de subunidades humanas e de animal, seguido de isolamento de factor VIII híbrido humano/animal, por 6 f- 11

U cromatografia de permuta iónica; (b) isolamento de domínios, ou domínios parciais de factor VIII humano derivado de plasma e domínios ou domínios parciais de factor VIII animal derivado de plasma, seguido de reconstituição da actividade coagulante, por mistura de domínios humanos e animais, seguido de isolamento de factor VIII híbrido humano/animal por cromatografia de permuta iónica; (c) construção de domínios ou domínios parciais de factor VIII animal por tecnologia de ADN recombinante, seguido de troca de domínios de factor VIII animal ou humano, para produzir factor VIII híbrido humano/animal com actividade coagulante; (d) criação de factor VIII híbrido humano/animal, por substituição de resíduos específicos de aminoácidos do factor VIII humano, com os resíduos de aminoácidos de factor VIII de animal, que possuem identidade de sequência com os aminoácidos humanos substituídos, por mutagénese direccionada para o local; ou (e) criação de uma molécula de factor VIII híbrida, com a sequência de aminoácidos humana ou animal, ou ambas, em que os resíduos de aminoácidos específicos do factor VIII são substituídos por resíduos de aminoácidos que não têm identidade de sequência com o factor VIII, por mutagénese direccionada para o local.

Algumas espécies de factor VIII híbrido têm uma actividade específica maior que o factor VIII humano e igual ou ligeiramente superior à do factor VIII de porcinao. Algumas espécies de factor VIII híbrido têm uma imunoreactividade com anticorpos inibidores do factor VIII igual ou inferior à do factor VIII humano, ou de porcino. 7

Descrição sumária das figuras A Figura IA e 1B é um alinhamento da sequência de aminoácidos dos domínios A2 do factor VIII de humano, ratinho e porcino, em que a numeração dos resíduos começa na posição 373, em relação à sequência de comprimento total do factor VIII humano (SEQ ID NO:2).

Descrição pormenorizada da invenção - Definições

Salvo indicação ou especificação em contrário, os termos "factor VIII híbrido" ou "proteína híbrida", tal como aqui utilizados, designam qualquer molécula de proteína de factor VIII funcional com (1) a sequência de aminoácidos derivada a partir, tanto de factor VIII humano, como de porcino (humano/porcino), ou outro mamífero não humano (humano/mamífero não porcino); (2) sequência de aminoácidos derivada a partir de duas espécies de mamífero não-humano, diferentes (animal 1/animal 2, porcino/mamífero não-humano, não porcino), tal como o porco e o ratinho; e (3) sequência de aminoácidos derivada a partir do factor VIII híbrido, humano, ou animal, na qual é substituída uma sequência de aminoácidos sem identidade conhecida com o factor VIII. Tal como aqui utilizado, o termo "factor VIII de mamífero" inclui factor VIII com uma sequência de aminoácidos derivada a partir de qualquer mamífero não-humano, salvo especificação em contrário. 0 termo "animal", tal como aqui utilizado, refere-se a porco e outros mamíferos não humanos. 0 factor VIII híbrido humano/porcino tem actividade de coagulação num teste de factor VIII humano. Esta actividade, bem como a de outros 8 factores VIII híbridos, pode ser inferior, igual ou superior à do factor VIII humano, quer derivado a partir de plasma, quer recombinante. Nalgumas formas de concretização, este factor VIII híbrido não tem reacção cruzada, ou tem uma reacção cruzada menor, com todos os anticorpos de factor VIII que ocorrem naturalmente, em comparação com o factor VIII humano, ou de porcino.

Este factor VIII híbrido pode ser produzido (1) por substituição de subunidades animais ou subunidades humanas isoladas, derivadas a partir de plasma (cadeias pesadas ou leves) pelas subunidades humanas ou de animal correspondentes; (2) por substituição de domínios humanos ou domínios animais (Al, A2, A3, B, Cl e C2) por domínios animais, ou humanos correspondentes; (3) por substituição de partes de domínios humanos ou domínios animais, por partes de domínios animais ou domínios humanos; (4) por substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos específicos, de humano ou animal, pelo(s) resíduo(s) específico animal ou humano, correspondente; ou (5) por substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos específicos no factor VIII humano, animal ou híbrido, com uma sequência de aminoácidos que não tem identidade de sequência conhecida com o factor VIII. Uma proteína de fusão é o produto de um gene híbrido, no qual a sequência codificante para uma proteína é bastante alterada, por exemplo, fundindo parte desta com a sequência codificante para uma segunda proteína de um gene diferente, para produzir um gene híbrido que codifica para a proteína de fusão. Tal como aqui utilizado, uma proteína de fusão é um subconjunto da proteína híbrida descrita neste pedido. 9 "Aminoácidos correspondentes" são aqueles que estão presentes num local de uma molécula de factor VIII, que tem a mesma estrutura e/ou função que um local noutra molécula de factor VIII, embora o número de resíduos de aminoácido possa não ser idêntico. 0 termo "actividade específica", tal como aqui utilizado, refere-se à actividade que irá corrigir o defeito de coagulação do plasma deficiente em factor VIII humano. A actividade específica é medida em unidades de actividade de coagulação por miligrama de proteína total de factor VIII, num teste convencional, em que o tempo de coagulação do plasma deficiente em factor VIII humano é comparado com o de plasma humano normal. Uma unidade de actividade de factor VIII é a actividade presente em um mililitro de plasma humano normal. No teste, quanto menor é o tempo de formação do coágulo, maior é a actividade de factor VIII testada. A sequência nucleotídica do ADNc de factor VIII humano é apresentada na SEQ ID N0:1. A sequência de aminoácidos prevista para o factor VIII humano é apresentada na SEQ ID NO:2. Numa molécula de factor VIII, o termo "domínio", tal como aqui utilizado, é uma sequência contínua de aminoácidos que são definidos pela identidade da sequência de aminoácidos interna e por locais de clivagem proteolítica pela trombina. Salvo especificado em contrário, os domínios de factor VIII incluem os seguintes resíduos de aminoácidos, quando as sequências estão alinhadas com a sequência de aminoácidos humana (SEQ ID N0:2): Al, resíduos 1-372; A2, resíduos 373-740; B, resíduos 741-1648; A3, resíduos 1690-2032; Cl, resíduos 2033-2172; C2, resíduos 2173-2332. A sequência A3-C1-C2 inclui os resíduos 1690-2332. A sequência remanescente, ΐ Γ"“ \l resíduos 1649-1689, é normalmente referida como péptido de activação de cadeia leve de factor VIII. 0 termo "domínio parcial", tal como aqui utilizado, é uma sequência continua de aminoácidos que contém parte de um domínio.

Tal como aqui utilizado, o termo "equivalente de factor VIII híbrido humano/animal" ou "equivalente de factor VIII híbrido" é uma molécula de factor VIII activa, em que (1) um ou mais resíduos de aminoácidos específicos do factor VIII humano, animal ou híbrido que formam um epítopo imunoreactivo com os anticorpos inibidores de factor VIII, endógenos, é substituído com um ou mais resíduos de aminoácidos, que não têm identidade conhecida com a sequência de factor VIII humano ou animal, e que não formam um epítopo imunoreactivo com anticorpos inibidores de factor VIII, endógenos; e/ou (2) um ou mais resíduos de aminoácidos específicos no factor VIII humano, animal ou híbrido, que são críticos para a actividade coagulante, são substituídos com um ou mais resíduos de aminoácidos específicos, que não têm identidade conhecida com a sequência de factor VIII humano, ou animal, que também tem actividade coagulante. A molécula equivalente de factor VIII híbrido, resultante, tem uma reactividade menor com os anticorpos inibidores de factor VIII, do que o factor VIII humano, não substituído, e tem actividade coagulante. 0 termo "deficiência de factor VIII", tal como aqui utilizado, inclui deficiência na actividade de coagulação, causada pela produção de um factor VIII defeituoso, por uma produção inadequada ou inexistente de factor VIII, ou por inibição parcial ou total do factor VIII por inibidores. A hemofilia A é um tipo de deficiência de factor VIII que 11

resulta de um defeito num gene ligado a X e da ausência, ou deficiência da proteína de factor VIII que codifica. 0 termo "subunidades" do factor VIII humano, ou animal, tal como aqui utilizado, designa as cadeias pesada e leve da proteína. A cadeia pesada do factor VIII contém três "domínios", Al, A2 e B. A cadeia leve de factor VIII também contém três domínios", A3, Cl e C2.

Tal como aqui utilizado, o termo "testes de diagnóstico" inclui testes que de algum modo utilizam a interacção antigénio-anticorpo para detectar e/ou quantificar a quantidade de um anticorpo particular que está presente numa amostra teste, para auxiliar na selecção de terapias médicas. Existem muitos testes deste tipo, conhecidos dos peritos na arte. Tal como aqui utilizado, no entanto, o ADN híbrido humano/animal e a proteína expressa a partir deste, na totalidade ou em parte, podem ser substituídos pelos reagentes correspondentes em testes conhecidos, em que se podem utilizar testes modificados, para detectar e/ou quantificar anticorpos contra o factor VIII. É a utilização destes reagentes, do ADN híbrido humano/animal e a proteína expressa a partir deste ou do ADN de factor VIII híbrido humano/animal equivalente e proteína expressa a partir deste, que permite a modificação de testes conhecidos para a detecção de anticorpos contra o factor VIII humano, ou animal, ou contra o factor VIII híbrido humano/animal. Estes testes incluem, mas não se limitam a, ELISAs, testes de imunodifusão e manchas imuno. Os métodos adequados para a prática de qualquer destes testes são conhecidos dos peritos na arte. Tal como aqui utilizado, o factor VIII híbrido humano/animal ou equivalente, ou porção 12 f sua derivada que inclui pelo menos um epitopo da proteína, podem ser utilizados como reagente de diagnóstico.

Os termos "epitopo", "local antigénico", "local imunogénico" e "determinante antigénico", tal como aqui utilizados, são utilizados como sinónimos e são definidos como a porção de proteína factor VIII híbrida que é especificamente reconhecida por um anticorpo. Pode consistir de qualquer número de resíduos de aminoácidos e pode depender da estrutura primária, secundária ou terciária da proteína. De acordo com esta descrição, a proteína factor VIII ou equivalente que inclui pelo menos um epitopo, pode ser utilizada como um reagente em testes de diagnóstico. - Descrição geral dos métodos

As moléculas de factor VIII híbrido humano/animal e equivalente, algumas das quais têm uma maior actividade coagulante num teste de coagulação convencional, quando comparadas com o factor VIII humano, altamente purificado, e algumas das quais têm uma menor imunoreactividade com anticorpos inibidores contra o factor VIII humano, ou de porcino, podem ser construídas como se segue.

Descrevem-se aqui cinco tipos de moléculas de factor VIII híbrido humano/porcino, ou equivalentes e os métodos para a sua preparação: os obtidos (1) por substituição de uma subunidade de porcino (i.e. cadeia pesada ou cadeia leve) pela subunidade humana correspondente; (2) por substituição de um ou mais domínios de porcino (i.e. Al, A2, A3, B, Cl e C2) pelo(s) domínio humano correspondente; (3) por substituição de parte de um ou mais domínios de porcino pela parte 13

correspondente de um ou mais domínios do domínio humano; (4) por substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos específicos no factor VIII humano, pelos resíduos correspondentes da sequência de porcino; e (5) por substituição de um ou mais aminoácidos específicos no factor VIII humano, de porcino, ou híbrido humano/porcino com um resíduo(s) de aminoácido que não possui identidade de sequência conhecida com o factor VIII. Também se podem preparar pelos mesmos métodos cinco tipos de moléculas de factor VIII híbridas, que têm a sequência de aminoácidos de factor VIII humano e a sequência de aminoácidos do factor VIII de mamífero não porcino, ou como na quinta categoria, factor VIII humano, de mamífero não porcino, ou híbrido.

As proteínas factor VIII híbridas humano/animal e equivalentes, enumeradas acima nos grupos (1)-(3) são produzidas por isolamento de subunidades, domínios ou partes de domínios de factor VIII, derivado a partir de plasma, seguido de reconstituição e purificação. As proteínas de factor VIII híbridas humano/animal e equivalentes, descritas nos grupos (3)-(5) acima, são produzidas por métodos de ADN recombinante. A molécula híbrida pode conter uma percentagem maior ou menor de sequência humana, em relação à animal, dependendo da origem das várias regiões, como descrito em maior pormenor a seguir. A seguir mostra-se que o factor VIII híbrido humano/porcino que consiste de cadeia pesada de porcino/cadeia leve de humano e que corresponde ao primeiro tipo de híbrido enumerado acima, tem uma maior actividade coagulante específica num teste de coagulação convencional, em comparação com o factor VIII humano. 0 factor VIII híbrido humano/anima 14 —-o t ou equivalente, com actividade coagulante, quer a actividade seja maior, igual ou menor, do que a do factor VIII humano, pode ser útil no tratamento de pacientes com inibidores, uma vez que estes inibidores podem reagir menos com o factor VIII híbrido humano/animal, ou equivalente, do com o factor VIII humano ou de porcino.

Preparação de moléculas de factor VIII híbridas humano/animal a partir de subunidades de factor VIII humanas e de animal isoladas, por reconstituição.

Preparam-se e isolam-se moléculas de factor VIII híbridas humano/animal e caracteriza-se a sua actividade pro-coagulante. Um método, modificado a partir dos processos descritos por Fay, P.J., et al., 265 J, Biol. Chem. 6197 (1990); e Lollar, J.S., et al., 263 J. Biol. Chem. 10451 (1988), envolve o isolamento de subunidades (cadeias pesada e leve) de factor VIII humano e de animal, seguido de recombinação de cadeia pesada humana e cadeia leve animal ou da recombinação de cadeia leve humana e cadeia pesada animal. 0 isolamento de ambas as subunidades individuais, humana e animal, envolve a dissociação do dímero cadeia leve/cadeia pesada por quelatação do cálcio com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), seguido de HPLC monoS™ (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) . As moléculas de factor VIII híbridas humano/animal são reconstituídas a partir de subunidades isoladas na presença de cálcio. O factor VIII híbrido cadeia leve humana/cadeia pesada animal, ou cadeia leve animal/cadeia pesada humana é isolado das cadeias pesadas não reagidas por HPLC monoS™ por meio de processos para o 15

L-C t isolamento do factor VIII de porcino, tal como descrito por Lollar, J.S. et al.f 71 Blood 137-143 (1988).

Estes métodos, descritos em pormenor nos exemplos a seguir, resultam em moléculas híbridas de cadeia leve humana/cadeia pesada de porcino, com mais de seis vezes a actividade procoagulante do factor VIII humano. Podem-se preparar, isolar e caracterizar quanto à actividade, outras moléculas híbridas humano/mamífero não porcino, utilizando os mesmos métodos.

Preparação de moléculas de factor VIII híbridas humano/animal a partir de domínios de factor VIII humano e de animal isolados, por reconstituição:

Preparam-se e isolam-se moléculas de factor VIII híbridas humano/animal com substituições de domínios e caracteriza-se a sua actividade pro-coagulante. Um dos métodos envolve o isolamento de um ou mais domínios de factor VIII de humano e um ou mais domínios de factor VIII animal, seguido de recombinação de domínios humano e animal para formar o factor VIII híbrido humano/animal, com actividade coagulante, como descrito por Lollar, P., et ai., 267(33) J. Biol. Chem. 23652-23657 (25 de Nov. 1992).

Os dimeros A1/A3-C1-C2 animal e humano derivados de plasma são isolados por dissociação do domínio A2 do factor VlIIa na presença de NaOH, após o que a mistura é diluída e o dímero é eluido utilizando HPLC monoS™ (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) . 0 domínio A2 é isolado do factor VlIIa como um componente menor, por HPLC monoS™. As moléculas de factor VIII híbridas, humano/animal, são reconstituídas misturando volumes iguais do 16 domínio Δ2 de uma espécie e o dímero A1/A3-C1-C2 da outra espécie. 0 factor VIII híbrido com uma ou mais substituições de domínios é isolado a partir da mistura de dímeros não reagidos e domínios A2, por HPLC monoS™, por processos para o isolamento de factor VIII de porcino, como descrito por Lollar, J.S., et al., 71 Blood 137-143 (1988).

Estes métodos, descritos em pormenor nos exemplos a seguir, resultam em moléculas de factor VIII híbridas, com actividade pró-coagulante.

Preparação de moléculas de factor VIII híbridas por manipulação recombinante das sequências que codificam para subunidades, domínios ou partes de domínios de factor VIII humano, animal e híbrido:

Substituição de subunidades, domínios, partes de domínios: 0 gene de factor VIII humano foi isolado e expresso em células de mamífero, como referido por Toole, J.J. et al.r 312 Nature 342-347 (1984) (Genetics Institute, Gitschier, J. et al., 312 Nature 326-330 (1984) (Genetech); Wood, W.I., et al.r 312 Nature 330-337 (1984) (Genetech); Vehar, G.A. et al., 312

Nature 337-342 (1984) (Genetech) e a sequência de aminoácidos foi deduzida a partir do ADNc. A patente US No. 4,965,199 de Capon et al., descreve um método de ADN recombinante para a produção de factor VIII em células hospedeiras de mamífero e purificação do factor VIII humano. Foi referida a expressão de factor VIII em células CHO (Ovário de Hamster chinês) e BHKC (células de rim de Hamster bebé). 17 t u κ. A sequência de ADNc que codifica para o factor VIII humano e a sequência de aminoácidos prevista são apresentadas na SEQ ID N0:1 e SEQ ID NO:2, respectivamente. 0 factor VIII hibrido recombinante, é preparado começando com ADNc humano (Biogen, Inc.) que codifica para a sequência de factor VIII correspondente aos domínios A1-A2-A3-C1-C2. 0 factor VIII codificado por este ADNc não possui o domínio B completo e corresponde aos resíduos de aminoácidos 1-740 e 1649-2332 do factor VIII humano de cadeia simples (veja-se SEQ IS NO:2), de acordo com o sistema de numeração de Wood et ai., 312 Nature 330-337 (1984) . 0 domínio B é eliminado, uma vez que não parece ser necessário para a função biológica. 0 factor VIII foi isolado e purificado a partir de plasma (Fass, D.N. et ai., 59 Blood 594 (1982)). A sequência de aminoácidos dos domínios B e parte dos domínios A2 do factor VIII de porcino estão descritos por Toole, J.J. et ai., 83 Proc. Natl. Acad. Sci.USA 5939-5942 (1986).

Ambos os factores VIII, de porcino e humano, são isolados a partir do plasma como uma proteína de duas subunidades. As subunidades, conhecidas como a cadeia pesada e a cadeia leve, são mantidas juntas por uma ligação não covalente, que necessita de cálcio ou outros iões metálicos divalentes. A cadeia pesada do factor VIII contém três domínios, Al, A2 e B, que estão ligados de forma covalente. A cadeia leve do factor VIII contém também três domínios, designados por A3, Cl e C2. 0 domínio B não tem nenhuma função conhecida e pode ser removido da molécula proteoliticamente, ou por métodos de tecnologia de ADN recombinante, sem alteração significativa em nenhum dos parâmetros mensuráveis do factor VIII. O factor 18 f ^ ^ VIII recombinante humano tem uma estrutura e função semelhantes ao factor VIII derivado a partir de plasma, embora não seja glicosilado, salvo quando expresso em células de mamífero.

Tanto o factor VIII activado humano, como o de porcino (Factor VlIIa) têm três subunidades devidas à clivagem da cadeia pesada entre os domínios AI e A2. Esta estrutura é designada por A1/A2/A3-C1-C2. 0 factor VlIIa humano não é estável sob as condições que estabilizam o factor VlIIa de porcino. Isto acontece devido à associação mais fraca da subunidade A2 do factor VlIIa humano. A dissociação da subunidade A2 do factor VlIIa humano e de porcino está associada com a perda de actividade na molécula do factor VlIIa. 0 ADNc completo do domínio A2 do factor VIII de porcino (SEQ ID NO: 3) com identidade de sequência com os resíduos 373-740 da SEQ ID NO:l, no factor VIII humano maduro, foi sequenciado. A sequência de aminoácidos prevista é apresentada na SEQ ID NO:4.

Embora apenas os domínios A2 e B do factor VIII de porcino tenham sido sequenciados na totalidade, o remanescente da molécula de factor VIII de porcino pode ser sequenciado por técnicas de clonagem convencionais, como as descritas em Weis, J.H., Construction of recombinant DNA libraries", in Current Protocols in Molecular Bioloqy, F.M. Ausubel et al., eds. (1991), de modo que se podem construir híbridos de comprimento total. 19 p Lc ^

As subunidades, domínios ou partes de domínios individuais do ADNc do factor VIII de porcino, ou humano, podem ser clonados e substituídos pelas subunidades, domínios ou partes de domínios humanos ou de porcino correspondentes, por técnicas de mutagénese estabelecidas. Por exemplo, Lubin, I.M. et ai., 269(12) J. Biol. Chem. 8639-8641 (Março, 1994) descrevem técnicas para substituir o domínio A2 de porcino pelo domínio humano. Estas moléculas de ADNc de factor VIII híbrido podem ser clonadas em vectores de expressão, para a expressão final de moléculas de proteína de factor VIII híbrido humano/porcino, activas, por técnicas estabelecidas, como descrito por Selden, R.F., Introduction of DNA into mammalian cells", in Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds (1991).

Numa forma de concretização preferida, um ADNc híbrido humano/porcino que codifica para o factor VIII, em que a sequência de porcino codifica para um domínio ou parte de um domínio, como o domínio A2 ou parte de um domínio, é inserido num vector de expressão de mamífero, como o ReNeo, para formar uma construção que é utilizada para transfectar de forma estável células em cultura, tais como células de rim de Hamster bebé, utilizando métodos que são de rotina na arte, tais como a transfecção mediada por lipossomas (Lipofection™, Life Technologies, Inc.). A expressão de proteína factor VIII híbrida, recombinante pode ser confirmada, por exemplo, por sequenciação, manchas Northern e Western, ou por reacção em cadeia com polimerase (PCR) . A proteína de factor VIII híbrida no meio de cultura em que as células transfectadas que expressam a proteína são mantidas, pode ser precipitada, sedimentada, lavada, ressuspendida num tampão adequado e a proteína de factor VIII híbrida recombinante, pode ser 20

V

t purificada por técnicas convencionais, incluindo cromatografia de imunoafinidade. Numa forma de concretização, o factor VIII é expresso como uma proteína de fusão a partir de uma molécula recombinante, em que uma molécula que codifica para uma proteína que aumenta a estabilidade, secreção, detecção ou isolamento é inserida num local adjacente à sequência que codifica para o factor VIII. 0 factor VIII híbrido, purificado, pode ser testado quanto à imunoreactividade e actividade de coagulação por testes convencionais, incluindo, por exemplo, o teste de factor VIII isento de plasma, o teste de coagulação de um passo, e o teste imunoadsorvente ligado a enzima, utilizando factor VIII humano, recombinante, purificado, como um padrão.

Outros vectores, incluindo vectores de plasmídeo e vectores virais eucarióticos, podem ser utilizados para expressar uma construção de genes recombinantes em células eucarióticas, dependendo da preferência e critério do perito na arte (veja-se, por exemplo, Sambrook et al., capítulo 16). Podem-se utilizar outros vectores e sistemas de expressão, incluindo sistemas de células bacterianas, de levedura e de insecto, mas estes não são preferidos, devido a diferenças em, ou ausência, de glicosilação. A proteína de factor VIII híbrida, recombinante, pode ser expressa numa variedade de células vulgarmente utilizadas para a cultura e expressão da proteína de mamífero recombinante. Uma linha celular preferida, disponível da American Type Culture Collection, Rockville, MD, é a de células de rim de Hamster chinês, que são cultivadas utilizando processos e meios convencionais. 21 (- Lr ^^

Podem-se utilizar os mesmos métodos para preparar outras proteínas de factor VIII híbridas, recombinantes, tais como humano/rnamífero não porcino. Começando com os iniciadores de síntese da sequência de ADN humana conhecida, clonaram-se o ADNc de factor VIII de murídeo e parte do de porcino. As sequências de factor VIII de outras espécies para utilização na preparação de uma molécula de factor VIII híbrida humano/animal podem ser obtidas utilizando a sequência de ADN humana conhecida, como ponto de partida. Outras técnicas que podem ser utilizadas incluem métodos de amplificação por PCR, com ADN de tecido animal, e utilização de uma biblioteca de ADNc do animal, para clonar a sequência de factor VIII.

Como exemplo, a proteína de factor VIII híbrido, humano/ratinho, pode ser produzida como se segue. Isolaram-se e sequenciaram-se clones de ADN correspondentes ao homólogo de ratinho do gene de factor VIII humano e a sequência de aminoácidos prevista do factor VIII de ratinho, como descrito em Elder, G. et al., 16(2) Genomics 374-379 (Maio 1993), que também inclui uma comparação das sequências de aminoácidos previstas, das moléculas de factor VIII de ratinho, humano e parte da molécula de porcino. A sequência de ADNc de factor VIII de ratinho e a sequência de aminoácidos prevista são apresentadas na SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 8, respectivamente. Numa forma de concretização preferida, pode-se utilizar a amplificação de ARN com métodos de sequenciação do transcrito (RAWTS), descritos em Sarkar, G. e S.S. Sommer, 244 Science 331-334 (1989) . Em resumo, os passos são (1) síntese de ADN com oligo(dT), ou um iniciador de síntese de oligonucleótidos específico para ARNm; (2) reacção em cadeia com polimerase (PCR), em que um ou ambos os oligonucleótidos contêm um promotor de fago ligado a uma sequência complementar com a 22

região a ser amplificada; (3) transcrição com um promotor de fago; e (4) sequenciação didesoxi do transcrito, mediada por transcriptase inversa, cuja síntese é iniciada com um oligonucleótido incluso (interno). Além de revelar a informação da sequência, este método pode produzir um produto de tradução in vitro por incorporação de um sinal de iniciação da tradução num iniciador de síntese de PCR adequado; e pode ser utilizado para obter novas informações da sequência de ARNm de outras espécies.

Substituição de aminoácido(s): 0 domínio A2 é necessário para a actividade pró-coagulante da molécula de factor VIII. De acordo com Lollar, P. et al., 267 J. Biol. Chem. 23652-23657 (1992), a diferença em actividade coagulante entre o factor VIII humano e de porcino parece basear-se numa diferença na sequência de aminoácidos entre um ou mais resíduos no domínio A2. Além disso, pensa-se que os domínios A2 e C2 na molécula de factor VIII humana incluem epítopos com os quais a maioria, se não todos, os anticorpos inibidores reagem, de acordo com Hoyer, L.W. e D. Scandella, 31 Semin. Hematol. 1-5 (1994).

As moléculas de factor VIII híbridas, recombinantes, podem ser produzidas por substituição da sequência de aminoácidos dos domínios A2, C2 e/ou outros, animais, no factor VIII humano, ou da sequência de aminoácidos do domínio A2, C2 e/ou outros, humanos, no factor VIII animal, seleccionado em qualquer dos casos, a sequência de aminoácidos que difere entre as moléculas animal e humana. Também se podem produzir moléculas híbridas em que a sequência de aminoácidos de mais que um animal é substituída na molécula de factor VIII humana, 23

ou em que a sequência de aminoácidos humana e de outro animal é inserida numa molécula de factor VIII animal. Também se podem produzir moléculas equivalentes híbridas, em que o factor VIII humano, animal ou híbrido contém um ou mais aminoácidos que não têm identidade de sequência conhecida com o factor VIII. Estas moléculas híbridas podem ser testadas por processos convencionais, quanto à actividade coagulante e quanto à reactividade com anticorpos inibidores do factor VIII, para identificação de moléculas de factor VIII híbridas, com actividade coagulante aumentada e/ou imunoreactividade de anticorpos diminuída. Também se podem identificar moléculas híbridas que têm uma actividade coagulante reduzida, em comparação com a humana, mas que têm ainda uma reactividade de anticorpos diminuída. Os métodos aqui descritos para preparar factor VIII híbrido humano/porcino, com substituição de aminoácidos, podem ser utilizados para preparar a proteína de factor VIII híbrida recombinante humano/mamífero não porcino e factor VIII híbrido animal-l/animal-2, com substituição da sequência de aminoácidos.

Moléculas de factor VIII híbridas, com actividade de coagulação alterada.

Pode-se preparar factor VIII híbrido humano/porcino, em que a sequência de aminoácidos de factor VIII humano com actividade pró-coagulante no domínio Δ2 é substituída por uma sequência de aminoácidos de porcino, correspondente, que possui também actividade coagulante. A sequência a ser substituída é seleccionada e preparada como se segue. Ambos os domínios A2 humano e de porcino têm 368 resíduos (SEQ ID NOs: 2 e 6, respectivamente) . Como se pode ver pela figura 1A-1B, que compara o alinhamento das sequências de aminoácidos dos 24 L·, ^ domínios A2 de factor VIII humano e de porcino (a numeração dos resíduos começa na posição 373, relativamente à sequência de aminoácidos de comprimento total do factor VIII, humano, SEQ ID NO: 2), 50 destes resíduos são diferentes e 318 são idênticos; i.e., há uma identidade de sequência de 86 porcento quando os domínios A2 de factor VIII humano e de porcino são alinhados. Assim, há um número elevado, mas finito, de combinações que irão resultar em moléculas de factor VIII híbridas humano/porcino, com actividade coagulante aumentada, com base nestas 50 diferenças.

Para a preparação de uma molécula de factor VIII híbrida humano/porcino, os candidatos alvo iniciais para a mutagénese, que são revelados por comparação das sequências de aminoácidos de A2 humana e de porcino (SEQ ID NOs: 2 e 6, respectivamente) , no domínio A2 humano são apresentadas na tabela I. TABELA I CANDIDATOS ALVO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS HUMANA PARA MUTAGÉNESE (SEQ ID NO: 2)

Sequência Resíduos Desemparelhamentos Alterações de carga 398-403 6 4 1 434-444 10 4 3 484-496 13 7 3 598-603 6 4 2 536-541 6 4 0 713-722 10 6 2 727-737 11 6 2 A tabela I e os caracteres a carregado da Figura 1A-1B ilustram sete sequências nas sequências de aminoácidos do 25

domínio A2 humano e de porco (SEQ ID NOs:2 e 6, respectivamente) que constituem apenas 17 porcento do domínio A2, mas incluem 70 porcento das diferenças de sequência entre os domínios A2 humano e de porcino. Os híbridos são produzidos seleccionando a sequência de porcino com base nas diferenças de sequência e substituindo esta no domínio A2 humano.

As técnicas de mutagénese direccionada são utilizadas para identificar as proteínas híbridas com actividade coagulante, que pode ser maior, igual ou menor, em comparação com o factor VIII humano, mas que é de preferência maior. As sequências humanas específicas são substituídas por sequências de porcino, de preferência utilizando o método de corte e rearranjo por extensão da sobreposição (SOE - "splicing by overlap extension method"), como descrito por Ho, S.N. et al., 77 Gene 51-59 (1994) e nos Exemplos 7 e 8. Noutra forma de concretização, pode-se utilizar mutagénese direccionada de oliogonucleótidos, tal como foi o caso para remover ("loop out") a sequência de aminoácidos para parte do domínio A2 (veja-se Exemplo 7) . Uma vez que a análise funcional dos híbridos revela actividade coagulante, a sequência pode ser ainda dissecada e mapeada para sequência pró-coagulante por análise de mutação pontual, utilizando técnicas convencionais de mutagénse direccionada para o local. As substituições de sequências de aminoácidos no domínio A2 estão descritas nos Exemplos 7 e 8.

Moléculas de factor VIII híbridas com imunoreactividade reduzida A aproximação descrita na secção anterior para a substituição de aminoácidos na molécula de factor VIII também 26 u pode ser utilizada para identificar uma ou mais regiões criticas nos domínios A2, C2 e/ou outros domínios, para os quais os anticorpos são direccionados e para preparar uma molécula híbrida pro-coagulante, eficaz, sem imunoreactividade, ou com imunoreactividade reduzida, como demonstrado no Exemplo 8, por substituição de um ou mais epítopos no factor VIII humano, com a sequência de aminoácidos de porcino, correspondente.

Normalmente, o factor VIII de porcino tem uma reacção limitada, ou não tem reacção, com anticorpos inibidores. Mais de 90 porcento dos anticorpos inibidores contra o factor VIII humano são direccionados, ou para o domínio A2 ou C2, ou para ambos. As moléculas de factor VIII híbridas humano/porcino com uma reactividade diminuída, ou sem reactividade, com anticorpos inibidores baseada na substituição de aminoácidos no domínio A2, são preparadas como se segue. O domínio A2 de porcino é clonado por técnicas de clonagem convencionais, como descrito acima e nos Exemplos 6, 7 e 8 e é em seguida cortado e rearranjado ("spliced") no domínio A2, utilizando processos de rotina, como a utilização de locais de restrição para cortar o ADNc ou cortando e rearranjando ("splicing") por extensão da sobreposição (SOE). As construções resultantes da sequência de aminoácidos de porcino, conhecida, são substituídas no domínio A2 humano, para formar uma construção de factor VIII híbrida, que é inserida num vector de expressão de mamífero, de preferência ReNeo, transfectado de forma estável em células de cultura, de preferência, células de rim de hamster chinês e expressas como acima descrito. 0 factor VIII híbrido é testado quanto à imunoreactividade, por exemplo com anticorpos anti-A2, pelo teste de rotina da Bethesda, ou pelo teste cromogénico isento de plasma. A unidade da Bethesda 27 i] (BU) é o método convencional para a medição de titulos de inibidor. Quando o titulo de Bethesda não é mensurável (< 0,7 BU/mg IgG) no híbrido, então elimina-se um epítopo A2 humano na região da sequência de porcino correspondente, substituída. 0 epítopo é progressivamente estreitado e o epítopo de A2 específico pode então ser determinado, para produzir uma molécula híbrida humano/porcino, com o mínimo possível de sequência de porcino.

Podem-se preparar moléculas de factor VIII híbridas humano/porcino com reactividade diminuída, ou sem reactividade, com anticorpos inibidores baseados na substituição da sequência de aminoácidos no domínio C2 ou outro, com ou sem substituição no domínio A2. Os processos podem ser os mesmos, ou semelhantes aos descritos aqui para a substituição de aminoácidos no domínio A2, incluindo a clonagem do domínio C2 de porcino ou outro domínio, por exemplo utilizando RT-PCR ou fazendo a sondagem de uma biblioteca de ADNc de fígado de porcino com ADN de C2 humano, ou outro de domínio; técnicas de locais de restrição e/ou SOE sucessivo para mapear e substituir simultaneamente epítopos no domínio C2, ou outro domínio; expressão em células de cultura, e teste de rotina para imunoreactividade. Para estes testes, estão disponíveis anticorpos específicos para o domínio C2, tais como a IgG auto-anticorpo inibidor descrita por Scandella, D. et al., Thromb. Haemostasis 67:665-671 (1992) e Lubin et al. (1994), por exemplo da Dr. Dorothea Scandella, American Red Cross, Rockville, MD. 0 domínio C2 consiste dos resíduos de aminoácidos 2173-2332 (SEQ ID NO:2). Dentro desta região de 154 aminoácidos, a actividade inibidora parece ser direccionada para uma região 28 V Γ u

de 65 aminoácidos entre os resíduos 2248 e 2312, de acordo com Shima, M. et al.r 69 Thromb. Haemostas. 240-246 (1993). Se a sequência de C2 do factor VIII humano e de porcino é aproximadamente 85 porcento idêntica nesta região, tal como o é noutros locais nas regiões funcionalmente activas de factor VIII, haverá aproximadamente dez diferenças entre a sequência de aminoácidos de C2 do factor VIII humano e de porcino, que podem ser utilizadas como alvos iniciais para construir híbridos com a sequência de C2 substituída. É provável que os epitopos de factor VIII clinicamente relevantes estejam confinados aos domínios A2 e C2. No entanto, se forem identificados anticorpos contra outras regiões (domínios Al, A3, B ou Cl) de factor VIII, estes podem ser mapeados e eliminados utilizando moléculas de factor VIII híbridas, humano/porcino, com a mesma aproximação.

Preparação de moléculas de factor VIII híbridas, utilizando a sequência de aminoácidos de factor VIII humana e de mamífero não porcino.

Os métodos utilizados para preparar o factor VIII híbrido humano/porcino com substituição de aminoácidos específicos, podem ser utilizados para preparar uma proteína factor VIII híbrida, humano/mamífero não porcino, recombinante, que tem, em comparação com o factor VIII humano, uma actividade coagulante alterada ou idêntica e/ou imunoreactividade igual ou inferior, com base na substituição de um ou mais aminoácidos no domínio A2, C2 e/ou outros domínios.

Podem-se fazer comparações semelhantes da identidade de sequência de aminoácidos entre proteínas de factor VIII 29 humanas e de outros mamíferos não porcinos, para determinar as sequências de aminoácidos em que reside a actividade pro-coagulante e a imunoreactividade anti-A2 e anti-C2, ou a imunoreactividade em outros domínios. Podem-se utilizar métodos semelhantes para preparar outras moléculas de factor VIII híbridas humano/animal. Tal como descrito acima, a análise funcional de cada híbrido irá revelar os que têm menor reactividade com os anticorpos inibidores e/ou actividade coagulante maior e a sequência pode ser ainda dissecada por análise de mutação pontual.

Por exemplo, podem-se preparar moléculas de factor VIII híbridas humano/ratinho, como descrito acima. 0 alinhamento de sequência de aminoácidos do domínio A2 de humano (SEQ ID NO: 2) e de ratinho (SEQ ID NO:6) é apresentado na Figura 1A-1B. Como referido por Elder et al., a proteína de factor VIII codificada pelo ADNc de ratinho (SEQ ID NO:5) tem 2319 aminoácidos, com 74% de identidade de sequência global com a sequência de aminoácidos humana (SEQ ID NO:2) (87 porcento de identidade, quando o domínio B é excluído da comparação) e é 32 aminoácidos mais curto que o factor VIII humano. As sequências de aminoácidos nos domínios A e C de ratinho (SEQ ID NO:6) são altamente conservadas, com 84-93 porcento de identidade de sequência com a sequência humana (SEQ ID N0:2), enquanto que o domínio B e os dois domínios acídicos curtos têm 42-70 porcento de identidade de sequência.

Especificamente, as sequências de aminoácidos de Al, A2 e A3 de ratinho (SEQ ID NO: 6) são 85, 85, e 90 porcento idênticas

às sequências de aminoácidos humanas correspondente (SEQ ID NO: 2) As sequências de aminoácidos de Cl e C2 de ratinho são 93 e 84 porcento idênticas às sequências de aminoácidos humanas, correspondentes. Na sequência prevista de aminoácidos 30 Γ ^ ^--<=. de factor VIII de ratinho (SEQ ID NO: 6), os domínios Al, A2 e A3 incluem os aminoácidos 1-330, 380-711 e 1664-1987, respectivamente, utilizando a identidade de sequência de aminoácidos para fins de numeração. O trombina/factor Xa e todos, excepto um dos locais de clivagem da proteína C activada são conservados no factor VIII de ratinho. O resíduo de tirosina para a ligação do factor de von Willebrand também é conservado.

De acordo com Elder et ai., a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:5) do factor VIII de ratinho contém 7519 bases e tem 67 porcento de identidade global com a sequência de nucleótidos humana (SEQ ID NO:l). Os 6957 pares de bases da sequência codificante de murídeo têm 82 porcento de identidade com os 7053 pares de bases da sequência codificante do factor VIII humano. Quando o domínio B não é incluído na comparação, há 88 porcento de identidade da sequência de nucleótidos.

Elder et al. referem que as moléculas de factor VIII humanas e de ratinho são 74 porcento idênticas no global, e que 95 porcento dos resíduos humanos que conduziram à hemofilia quando alterados são idênticos no ratinho. Estes dados suportam a aplicação da mesma técnica utilizada para identificar a sequência de aminoácidos com actividade coagulante e/ou imunoreactividade contra anticorpos na molécula de factor VIII de porcino, contra o factor VIII de ratinho ou de outro animal, para identificar sequências de aminoácidos semelhantes e preparar moléculas híbridas.

Noutra forma de concretização, a reactividade cruzada, em que o plasma humano reage com o factor VIII de porcino, pode 31 s ser reduzida por preparação de factor VIII híbrido porcino/animal. Primeiro, determina-se se os inibidores específicos de A2 humano reagem com o factor VIII de outros animais, utilizando o teste de rotina de Bethesda e o plasma do mamífero particular, como padrão. Os títulos de inibidor são normalmente medidos no plasma, não sendo portanto necessário o factor VIII de animal purificado. Se os inibidores de A2 não reagem com o factor VIII animal, tal como o factor VIII de murídeo, cuja sequência é conhecida, a sequência animal correspondente pode ser substituída na região do epítopo de porcino, tal como identificado utilizando híbridos humano/porcino. Uma vez conhecida a sequência animal, podem-se utilizar técnicas de mutagénese direccionada para o local, tais como mutagénese mediada por oligonucleótidos descrita por Kunkel, T.A. et al., 204 Meth. Enzymol 125-139 (1991), para preparar a molécula de factor VIII híbrida porcino/animal. Se os outros plasmas animais são menos reactivos com os inibidores de A2, do que o factor VIII de

murídeo ou de porcino, a sequência animal correspondente ao epítopo de porcino pode ser determinada por processos de rotina, como RT-PCR, e pode-se construir um factor VIII híbrido humano/animal, ou porcino/animal, por mutagénese direccionada para o local. Além disso, pode-se preparar um factor VIII híbrido humano/animal, ou porcino/mamífero não porcino, que tem uma substituição de sequência de aminoácidos correspondente, de um ou mais outros animais.

Após identificação dos epítopos clinicamente significativos, serão expressas moléculas de factor VIII híbridas, recombinantes, que possuem uma reactividade cruzada menor, ou igual, à do factor VIII humano, quando testados in vitro contra um grande número de plasmas inibidores. De 32 p i-i ^^ preferência, estas moléculas serão híbridos A2/C2 combinados em que a sequência de aminoácidos imunoreactiva nestes domínios é substituída por uma sequência de porcino, ou de outro animal. Pode-se realizar uma mutagénese adicional nestas regiões, para reduzir a reactividade cruzada. Uma reactividade cruzada, reduzida, embora desejável, não é necessária para produzir um produto que possa ter vantagens em relação ao concentrado de factor VIII de porcino, existente, que produz efeitos secundários devido a proteínas de porcino contaminantes e pode produzir efeitos visíveis, devido à imunogenecidade das sequências de factor VIII de porcino. Uma molécula de factor VIII híbrida humano/animal ou porcino/animal não conterá proteínas de porcino estranhas. Adicionalmente, o mapeamento exaustivo de epítopos realizado no domínio A2 de porcino indica que mais de 95% da sequência de factor VIII híbrida humano/porcino terapêutica será humana.

Preparação de equivalentes de factor VIII híbrido humano/animal ou porcino/animal:

Os métodos descritos acima e nos exemplos, podem ser utilizados para preparar moléculas pro-coagulantes, equivalentes ao factor VIII híbridas, humano/animal, animal-1 não porcino/animal-2, ou porcino/mamífero não-porcino. Pode-se identificar, como descrito, um ou mais resíduos de aminoácidos específicos no factor VIII humano, ou animal, ou factor VIII híbrido, que funcionam como um local antigénico que é imunoreactivo com anticorpos inibidores de factor VIII endógenos e em seguida estes podem ser substituídos com um ou mais resíduos de aminoácidos específicos, que não possuem identidade conhecida com a sequência de factor VIII humana, ou animal, e que não formam um local antigénico com anticorpos 33 d ^ inibidores de factor VIII, endógenos. Um ou mais locais antigénicos podem ser substituídos para formar uma molécula equivalente ao factor VIII híbrido, activa. A molécula equivalente ao factor VIII, híbrida, activa, resultante, tem uma reactividade igual ou menor com os anticorpos inibidores de factor VIII do que o factor VIII humano, ou animal, não substituído, ou híbrido humano/animal.

Alternativa ou adicionalmente, podem-se preparar moléculas equivalentes ao factor VIII híbrido activo, utilizando os métodos descritos acima e nos exemplos, em que um ou mais resíduos de aminoácidos específicos no factor VIII humano ou animal, ou no factor VIII híbrido, humano/animal que são críticos para a actividade coagulante podem ser identificados como descrito e podem ser então substituídos, com um ou mais resíduos de aminoácidos sem identidade conhecida com a sequência de factor VIII humana, ou animal, que também proporciona uma actividade coagulante. Podem-se substituir um ou mais aminoácidos específicos com actividade coagulante para formar uma molécula equivalente de factor VIII híbrida, activa. A molécula equivalente ao factor VIII híbrida, procoagulante, resultante, tem uma actividade coagulante que pode ser inferior, igual ou maior que a da molécula de factor VIII não substituída.

De preferência, a molécula equivalente ao factor VIII

híbrido tem actividade coagulante superior à do factor VIII humano.

Os resíduos de aminoácidos específicos que podem ser

substituídos por estas sequências de aminoácidos são críticos para a actividade coagulante e/ou antigénica no factor VIII 34 humano ou animal, ou factor VIII híbrido humano/animal, incluem quaisquer aminoácidos específicos que não possuam identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de factor VIII animal ou humano e/ou que possuem uma reactividade menor ou igual com anticorpos inibidores endógenos, contra o factor VIII.

As moléculas equivalentes ao factor VIII, híbridas, podem ter substituições de uma ou mais sequências de aminoácidos específicos, para a actividade coagulante e/ou uma ou mais sequências de aminoácidos específicas para locais de antigénios. As moléculas equivalentes a factor VIII híbrido aqui descritas, incluem também as moléculas em que os resíduos de aminoácidos não críticos para a actividade coagulante ou antigénica, são substituídos com resíduos de aminoácidos sem identidade conhecida com a sequência de factor VIII animal.

Numa forma de concretização, pode-se preparar uma molécula equivalente ao factor VIII híbrido, de preferência uma molécula híbrida humano/porcino, em que a reactividade cruzada com plasmas inibidores é reduzida como se segue. Um ou mais epítopos são identificados, como descrito acima, e em seguida substituídos por resíduos de alanina, utilizando, por exemplo, o método de mutagénese de varrimento de alanina descrito por Cunningham, B.C., e J.A. Wells, 244 Science 1081-1085 (1989). Uma vez que o epítopo de A2 humano foi estreitado para 26 ou menos aminoácidos, como descrito no Exemplo 8, pode-se realizar mutagénese de varrimento de alanina num número limitado de proteínas híbridas, para determinar quais são os factores VIII híbridos sem reactividade cruzada, activos, baseados em substituições de aminoácidos de A2. 35 - Teste de diagnóstico

Pode-se utilizar o ADNc de factor VIII híbrido humano/animal ou equivalente e/ou a proteína expressa a partir destes, na totalidade ou em parte, em testes, como reagentes de diagnóstico para a detecção de anticorpos inibidores contra o factor VIII humano ou animal, ou contra o factor VIII híbrido humano/animal em substratos, incluindo, por exemplo, amostras de soro e fluidos corporais de pacientes humanos com deficiência de factor VIII. Estes testes de anticorpo incluem testes como testes ELISA, manchas imuno, radioimunoensaios, testes de imunodifusâo, e testes da actividade biológica do factor VIII (e.g. pelo teste de coagulação). As técnicas para preparar estes reagentes e os métodos para a sua utilização são conhecidos dos peritos na arte. Por exemplo, um imunoensaio para a detecção de anticorpos inibidores numa amostra de soro de um paciente, pode incluir a reacçâo da amostra teste com uma quantidade suficiente do factor VIII híbrido humano/animal, que contém pelo menos um local antigénico, em que a quantidade é suficiente para formar um complexo detectável com os anticorpos inibitórios na amostra.

As sondas de ácidos nucleicos e de amninoácidos podem ser preparadas com base na sequência da molécula de factor VIII híbrida humano/animal. Estas podem ser marcadas utilizando corantes ou marcadores enzimáticos, fluorescentes, quimioluminescentes ou radioactivos, disponíveis comercialmente. As sondas de aminoácidos podem ser utilizadas, por exemplo, para pesquisar soros ou outros fluidos corporais em que se suspeita existirem inibidores do factor VIII humano, animal ou híbrido humano/animal. Os níveis de inibidores podem ser quantificados em pacientes e comparados com controlos 36

saudáveis e podem ser utilizados, por exemplo, para determinar se um paciente com uma deficiência no factor VIII pode ser tratado com um factor híbrido humano/anima1. - Composições farmacêuticas

As composições farmacêuticas que contêm factor VIII híbrido humano/animal, porcino/mamífero não-porcino, animal-l/animal-2 ou humano/animal equivalente, sozinho ou em combinação com compostos de estabilização farmacêuticos adequados, veículos de fornecimento e/ou veículos transportadores, são preparados de acordo com métodos conhecidos, como descrito em Remingthon's Pharmaceutical Sciences por E.W. Martin.

Numa forma de concretização preferida, os veículos transportadores ou de fornecimento, preferidos para infusão intravenosa são a solução salina fisiológica, ou solução salina tamponada com fosfato.

Noutra forma de concretização preferida, os compostos de estabilização adequados, veículos de fornecimento e veículos transportadores incluem, mas não se limitam a, outras proteínas humanas ou animais, tais como a albumina.

As vesículas fosfolipídicas ou suspensões lipossomais também são preferidas como veículos transportadores ou de fornecimento, farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos dos peritos na arte e podem conter, por exemplo, fosfatidilserina/-fosfatidilcolina ou outras composições de fosfolípidos, ou detergentes, que em conjunto resultam numa carga negativa na 37

- u, superfície, uma vez que o factor VIII se liga a membranas fosfolipídicas carregadas negativamente. Os lipossomas podem ser preparados dissolvendo o(s) lípido adequado (tal como estearoil fosfatidil etanolamina, estearoil fosfatidil colina, arcadoil fosfatidil colina e colesterol) num solvente orgânico que é então evaporado, deixando um filme fino de lipido seco, na superfície do recipiente. Introduz-se então uma solução aquosa do factor VIII híbrido no recipiente. O recipiente é então rodado à mão, para libertar o material lipídico dos lados do recipiente e para dispersar agregados lipídicos, formando deste modo a suspensão lipossomal. 0 factor VIII híbrido pode ser combinado com outros compostos de estabilização, veículos de fornecimento, e/ou veículos transportadores adequados, incluindo factores de coagulação dependentes de vitamina K, factor tecidular, e factor de von Willebrand (vWf) , ou um fragmento de vWf que contém o local de ligação ao factor VIII e polisacáridos, como a sucrose. 0 factor VIII híbrido pode ser também fornecido por terapia genética, do mesmo modo que o factor VIII humano pode ser fornecido, utilizando meios de fornecimento, tais como vectores retrovirais. Este método consiste na incorporação de ADNc de factor VIII em células humanas que são transplantadas directamente num paciente deficiente para factor VIII ou que são colocadas num dispositivo implantável, permeável às moléculas de factor VIII, mas impermeável às células, que é então transplantável. 0 método preferido será a transferência de genes mediada por retrovírus. Neste método, faz-se a clonagem de um gene exógeno (e.g., um ADNc de factor VIII) no genoma de um retrovírus modificado. 0 gene é inserido no 38

genoma da célula hospedeira por maquinaria virai, onde será expresso pela célula. 0 vector retroviral é modificado de modo a que não produza vírus, prevenindo a infecção virai do hospedeiro. Os princípios gerais para este tipo de terapia são conhecidos dos peritos na arte e foram revistos na literatura (e.g., Kohn, D.B. e P.W. Kantoff, 29 Transfusion 812-820, 1989). O factor VIII híbrido pode ser armazenado ligado a vWf para aumentar a semi-vida e tempo de armazenamento da molécula híbrida. Adicionalmente, a liofilização do factor VIII pode melhorar os rendimentos de moléculas activas na presença de vWf. Os métodos actuais para armazenamento de factor VIII humano e animal, utilizados pelos fornecedores comerciais podem ser utilizados para armazenamento do factor VIII híbrido. Estes métodos incluem: (1) liofilização do factor VIII num estado parcialmente purificado (como um "concentrado" de factor VIII que é utilizado em infusão, sem posterior purificação); (2) purificação por imunoafinidade do factor VIII pelo método de Zimmerman e liofilização na presença de albumina, que estabiliza o factor VIII; (3) liofilização do factor VIII recombinante, na presença de albumina.

Adicionalmente, o factor VIII híbrido tem sido indefinidamente estável a 4 °C em NaCl 0,6 M, MES 20 mM e CaCl2 5 mM a pH 6,0 e pode ser também armazenado congelado nestes tampões e descongelado, com perda mínima de actividade. - Métodos de tratamento

0 factor VIII híbrido é utilizado para tratar hemorragias não controladas devidas a uma deficiência no factor VIII 39 \ Γ t u Κ- (e.g., hemorragia intra-articular, intracranial ou gastrointestinal) em hemofílicos, com ou sem anticorpos inibidores e em pacientes com deficiência de factor VIII adquirida, devido ao desenvolvimento de anticorpos inibidores. Os materiais activos são administrados de preferência intravenosamente.

Adicionalmente, o factor VIII híbrido pode ser administrado por transplante de células, manipuladas geneticamente para produzir o híbrido, ou por implantação de um dispositivo que contém estas células, como acima descrito.

Numa forma de concretização preferida, as composições farmacêuticas de factor VIII sozinho, ou em combinação com estabilizantes, veículos de fornecimento e/ou transportadores, são fornecidas aos pacientes por infusão intravenosa, de acordo com o procedimento utilizado para a infusão de factor VIII humano, ou animal.

As dosagens de tratamento da composição de factor VIII híbrido que deverão ser administradas a um paciente em necessidade de tratamento, variarão dependendo da gravidade da deficiência de factor VIII. Em geral, o nível de dosagem é ajustado em termos de frequência, duração e unidades, tendo em conta a gravidade e duração do episódio de sangramento de cada paciente. Deste modo, o factor VIII híbrido é incluído no transportador, veículo de fornecimento, ou estabilizante farmaceuticamente aceitável, numa quantidade suficiente para fornecer a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do híbrido, para parar o sangramento, tal como medido por testes de coagulação convencionais. 40 u t Γ 0 factor VIII é classicamente definido como a substância presente no plasma sanguíneo normal que corrige o defeito de coagulação, em plasma derivado de indivíduos com hemofilia A. A actividade coagulante in vitro de formas purificadas e parcialmente purificadas de factor VIII é utilizada para calcular a dose de factor VIII para infusões em pacientes humanos e é um indicador de confiança da actividade recuperada a partir do plasma do paciente e da correcção do defeito de sangramento in vivo. Não há registo de discrepâncias entre o teste convencional de novas moléculas de factor VIII in vitro e o seu compostamento no modelo de infusão de cão, ou em pacientes humanos, de acordo com Lusher, J.M. et al., 328 New. Engl. J. Med. 453-459 (1993); Pittman, D.D. et al.., 79 Blood 389-397 (1992) e Brinkhous et al., 82 Proc. Natl. Acad. Sei 8752-8755 (1985).

Normalmente, o nível de factor VIII plasmático que se deseja alcançar no paciente, por administração do factor VIII híbrido está na gama de 30-100% do normal. Num modo de administração preferido do factor VIII híbrido, a composição é fornecida intravenosamente, a uma dosagem preferida na gama de cerca de 20 a 50 unidades/kg de peso corporal; a frequência de intervalo é na gama de cerca de 8 a 24 horas (em hemofílicos gravemente afectados) e a duração do tratamento, em dias, é na gama de 1 a 10 dias, ou até o episódio de sangramento estar resolvido. Veja-se, e.g. Roberts, H.R. e M.R. Jones, "Hemophilia and Related Conditions - Congenital Deficiencies of Prothrombin (Factor II, Factor V e Factors VII to XII)", Ch. 153, 1453-1474, 1460 in Hematology, Williams, W.J. et al., ed. (1990). Os pacientes com inibidores podem necessitar de mais factor VIII híbrido, devido à sua maior actividade especifica em relação ao factor VIII humano, ou menor 41

V

- u reactividade com anticorpos. Tal como no tratamento com factor VIII humano ou de porcino, a quantidade de factor VIII híbrido fornecido por infusão é definida pelo teste de coagulação de factor VIII de uma fase e, em casos particulares, a recuperação in vivo é determinada medindo o factor VIII no plasma do paciente, após a infusão. Deve entender-se que para qualquer indivíduo particular, os regimes de dosagem específicos deverão ser ajustados ao longo do tempo, de acordo com a necessidade do indivíduo e com o critério profissional de quem administra, ou supervisiona a administração das composições e que as gamas de concentração aqui apresentadas não pretendem limitar o âmbito, ou prática da composição reivindicada. 0 tratamento pode tomar a forma de uma única administração intravenosa da composição ou de uma administração periódica ou contínua ao longo de um período alargado de tempo, como necessário. Alternativamente, o factor VIII híbrido pode ser administrado subcutânea ou oralmente, com lipossomas, numa ou várias doses, a intervalos de tempo variados. 0 factor VIII híbrido também pode ser utilizado para tratar o sangramento incontrolado devido a deficiência no factor VIII, em hemofílicos que desenvolveram anticorpos contra o factor VIII humano. Neste caso, a actividade coagulante que é superior à do factor VIII humano, ou animal, sozinho, não é necessária. A actividade coagulante que é inferior à do factor VIII humano (i.e., inferior a 3.000 unidades/mg) será útil se essa actividade não for neutralizada por anticorpos, no plasma do paciente. 42 (Ρ ^ ^-- A molécula de factor VIII híbrida e os métodos para o isolamento, caracterização, produção e utilização, descritos de forma geral acima, serão melhor compreendidos com referência aos exemplos seguintes, não limitantes.

Exemplo 1: Teste do factor VIII de porcino e factor VIII híbrido humano/porcino 0 factor VIII de porcino tem uma actividade coagulante auperior à do factor VIII humano, com base na actividade específica da molécula. Estes resultados são apresentados na tabela III no exemplo 4. Esta conclusão baseia-se na utilização de curvas padrão adequadas, que permitem comparar razoavelmente bem o factor VIII humano e de porcino. Os testes de coagulação baseiam-se na capacidade do factor VIII encurtar o tempo de coagulação do plasma derivado de um paciente com hemofilia A. Utilizaram-se dois tipos de testes: o teste de uma fase e o de duas fases.

No teste de uma fase, incubaram-se 0,1 ml de plasma com hemofilia A (George King Biomedical, Inc.) com 0,1 ml de reagente de tromboplastina parcial activado (APTT)(Organom Teknika) e 0,01 ml de amostra, ou padrão, consistindo de plasma humano normal citrado, diluído, durante 5 min a 37 °C, num banho de água. A incubação foi seguida pela adição de 0,1 ml de CaCl2 20 mM e determinou-se o tempo para o desenvolvimento de um coágulo de fibrina, por inspecção visual.

Uma unidade de factor VIII é definida como a quantidade presente em 1 ml de plasma humano normal, citrado. Utilizando o plasma humano como padrão, fez-se a comparação directa da 43

Lc, ^ actividade do factor VIII de porcino e humano. As diluições do padrão de plasma ou proteínas purificadas foram feitas em NaCl 0,15 M, HEPES 0,02 M, pH 7,4. A curva padrão foi construída com base em 3 ou 4 diluições de plasma, sendo a diluição mais elevada de 1/50 e o logio do tempo de coagulação representado graficamente em função de log10 da concentração no plasma, o que resulta num gráfico linear. As unidades de factor VIII numa amostra desconhecida foram determinadas por interpolação, a partir da curva padrão. 0 teste de uma fase baseia-se na activação endógena de factor VIII por activadores formados no plasma de hemofilia A, enquanto que o teste de duas fases mede a actividade pro-coagulante do factor VIII pré-activado. No teste de duas fases, as amostras que contêm factor VIII que foram reagidos com a trombina, foram adicionadas a uma mistura de tromboplastina parcial activada e plasma de hemofilia A que tinham sido pré-incubados durante 5 min a 37 °C. Os tempos de coagulação resultantes foram então convertidos em unidades/ml, com base na mesma curva padrão humana, acima descrita. A actividade relativa no teste de duas fases era maior do que no teste de uma fase pois o factor VIII tinha sido pré-activado.

Exemplo 2: Caracterização da diferença funcional entre o factor VIII humano e de porcino 0 isolamento de factor VIII derivado de plasma de porcino e humano e do factor VIII recombnante, humano, estão descritos na literatura em Fulcher, C.A. e T.S. Zimmerman, 79 Proc. Natl Acad. Sei. USA 1648-1652 (1982); Toole, J.J. et al.f 312 Nature 342-347(1984) (Genetics Institute) Gitschier, J. et al., 312 Nature 326-330 (1984) (Genentech); Wood, W.I. et al., 44 (j~ ^ ^ 312 Nature 330-337 (1984)(Genentech); Vehar, G.A. et al., 312

Nature 337-342 (1984) (Genentech); Fass, D.N. et al., 59 Blood 594 (1982); Toole; J.J. et al., 83 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 5939-5942 (1986). Este pode ser realizado de várias formas.

Todas estas preparações são semelhantes em termos de composição de subunidades, embora esta seja a primeira descrição da diferença funcional entre o factor VIII humano e de porcino, não observada anteriormente, em parte devido à não utilização de um padrão comum para os comparar.

Para comparação do factor VIII humano recombinante e de porcino, as preparações de factor VIII humano recombinante, altamente purificadas (Cutter Laboratories, Berkeley, CA) e factor VIII de porcino (imunopurifiçado como descrito em Fass, D.N. et al., 59 Blood 594 (1982)) foram submetidas a cromatografia liquida de alta pressão (HPLC) numa coluna de permuta aniónica Mono Q™ (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) (Pharmacia Inc.). Os objectivos do passo de HPLC Mono Q™ foram a eliminação de impurezas menores e troca de factor VIII humano e de porcino num tampão comum, para fins comparativos. Os recipientes contendo 1000-2000 unidades de factor VIII foram reconstituídos com 5 ml de H20. Adicionou-se então Hepes (2 M a pH 7,4) a uma concentração final de 0,02 Μ. O factor VIII foi aplicado a uma coluna Mono Q™HR 5/5, equilibrada em NaCl 0,15 M, Hepes 0,02M, CaCl2 5 mM a pH 7,4 (Tampão A mais NaCl 0,15 M) ; lavado com 10 ml de tampão A + 0,15 M NaCl e eluído com um gradiente linear de 20 ml, de NaCl 0,15 M a 0,90 M em tampão A, a um fluxo de 1 ml/min.

Para comparação do factor VIII humano (derivado a partir de plasma e purificado por HPLC Mono Q™) e factor VIII de porcino, o factor VIII de porcino, derivado de plasma, 45

purificado por imunoafinidade, foi diluído 1:4 com Hepes 0,04M, CaCl2 5 mM, Tween-80 0,01% a pH 7,4 e submetido a HPLC

Mono Q™, nas mesmas condições descritas no parágrafo anterior para o factor VIII humano. Estes processos para o isolamento de factor VIII humano e de porcino são convencionais para os peritos na arte.

As fracções de coluna foram testadas quanto a actividade de factor VIII num teste de coagulação de uma fase. Os resultados médios dos testes, expressos em unidades de actividade por A2go de material, são dados na tabela II e indicam que o factor VIII de porcino tem pelo menos seis vezes mais actividade que o factor VIII humano, quando se utiliza o teste de uma fase.

TABELA II: COMPARAÇÃO DA ACTIVIDADE COAGULANTE DO FACTOR VIII HUMANO E DE PORCINO

Porcino

Actividade (U/A280) 21.300

Humano, derivado de plasma Humano recombinante 3.600 2.400

Exemplo 3: Comparação da estabilidade do factor VIII humano e de porcino

Os resultados do teste de uma fase para o factor VIII reflectem a activação do factor VIII a factor VlIIa na amostra e possivelmente a perda de actividade de factor VlIIa formado. Foi feita uma comparação directa entre a estabilidade do factor VIII humano e de porcino. Diluíram-se amostras de HPLC Mono Q™ (Pharmacia, Inc., Piscataway, N.J.) na mesma 46 1

concentração e composição de tampão e fez-se reagir com trombina. A vários tempos, removeram-se amostras para o teste de coagulação de duas fases. Tipicamente, a actividade máxima (aos 2 min) era 10 vezes maior para o factor VlIIa de porcino, em relação ao humano e as actividades de ambos os factores VlIIa, de porcino e humano, decresceram subsequentemente, sendo que a actividade do factor VlIIa humano decresceu mais rapidamente.

Geralmente, as tentativas para isolar o factor VlIIa humano estável não são bem sucedidas, mesmo quando se empregam condições que produzem factor VlIIa de porcino estável. Para demonstrar este facto, o factor VIII humano, purificado por HPLC Mono Q™ foi activado com trombina e submetido a HPLC de permuta catiónica Mono S™ (Pharmacia, Inc.), sob condições que produzem factor VlIIa de porcino, estável, como descrito por Lollar, J.S. e C.G. Parker, 28 Biochemistry 666 (1989).

Fez-se reagir factor VIII humano, 43 μg/ml (0,2 μΜ) em NaCl 0,2 M, Hepes 0,01 M, CaCl2 2,5 mM, a pH 7,4 num volume total de 10 ml, com trombina (0,036 μΜ) durante 10 min, ao fim dos quais se adicionou FPR-CH2CI D-fenil-prolil-arginil-clorometil cetona, a uma concentração de 0,2 μΜ para a inactivação irreversível da trombina. A mistura foi então diluída 1:1 com ácido 2-(N-morfolino)etano sulfónico (MES) 40 mM, CaCl2 5 mM a pH 6,0 e carregou-se a 2 ml/min numa coluna de HPLC Mono S™ 5/5 (Pharmacia, Inc.), equilibrada em MES 5 mM, CaCl2 5 mM a pH 6,0 (Tampão B) mais NaCl 0,1 Μ. O factor VlIIa foi eluído sem lavagem da coluna com um gradiente de 20 ml de NaCl 0,1 M a NaCl 0,9 M em tampão B, a 1 ml/min. 47

A fracção com actividade coagulante no teste de duas fases eluiu como um pico único, nestas condições. A actividade específica da fracção do pico era de aproximadamente 7.500 U/A280. A electroforese em gel de poliacrilamida com duodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) do pico de factor VlIIa Mono S™, seguida de coloração, com prata, da proteína, revelou duas bandas correspondentes a um derivado heterodimérico (A3-C1-C2/A1) do factor VIII. Embora o fragmento A2 não tenha sido identificado por coloração com prata, nestas condições, devido à sua baixa concentração, ele foi identificado como um constituinte vestigial, por marcação com I.

Em contraste com os resultados com factor VIII humano, o factor VlIIa de porcino, isolado por HPLC Mono S™ nas mesmas condições, tinha uma actividade específica 1,6 x 106 U/A28o- A análise do factor VlIIa de porcino por SDS-PAGE revelou fragmentos correspondentes às subunidades Al, A2 e A3-C1-C2, demonstrando que o factor VlIIa de porcino possui três subunidades.

Os resultados de HPLC Mono S™ de preparações de factor VIII humano, activadas pela trombina, a pH 6,0, indicam que o factor VlIIa humano é lábil nas condições que originam factor VlIIa de porcino, estável. No entanto, embora se tenham identificado quantidades vestigiais de fragmento A2 na fracção do pico, não foi possível determinar, apenas com este método, se a actividade coagulante resulta de pequenas quantidades de factor VlIIa heterotrimérico, ou de factor VlIIa heterodimérico, que possui uma especificidade baixa.

Uma forma de isolar o factor VlIIa humano antes de este perder a sua subunidade A2, é desejável, a fim de resolver 48 f w

u K t esta questão. Para este fim, o isolamento foi realizado num processo que envolve a redução do pH dos tampões Mono S™ para pH 5. 0 factor VIII humano purificado por Mono Q™ (0,5 mg) foi diluído com H20 para se obter uma composição final de factor VIII 0,25 mg/ml (1 μΜ) em NaCl 0,25 M, Hepes 0,01 M, CaCl2 2,5 mM, Tween-80 0,005% a pH 7,4 (volume total 7,0 ml). A trombina foi adicionada a uma concentração final de 0,072 μΜ e deixou-se reagir durante 3 min. A trombina foi então inactivada com FPR-CH2CI (0,2 μΜ). A mistura foi então diluída 1:1 com acetato de sódio 40 mM, CaCl2 5 mM, Tween 80 0,01%, a pH 5,0 e carregada a 2 ml/min numa coluna de HPLC Mono S™ HR 5/5, equilibrada em acetato de sódio 0,01 M, CaCl2 5 mM, Tween-80 0,01% a pH 5,0, mais NaCl 0,1 M. 0 factor VlIIa foi eluído sem lavagem da coluna com um gradiente de 20 ml desde NaCl 0,1 M a NaCl 1,0 M, no mesmo tampão, a 1 ml/min. Isto resultou na recuperação de actividade coagulante, num pico que continha quantidades detectáveis do fragmento A2, como verificado por SDS-PAGE e coloração com prata. A actividade específica da fracçâo do pico era dez vezes maior do que a recuperada a pH 6, 0 (75.000 U/A28o vs 7.500 U/A28o) · No entanto, ao contrário do factor

VlIIa de porcino isolado a pH 6,0, que e indefinidamente estável a 4 °C, a actividade do factor VlIIa humano decresceu de forma estável durante um período de várias horas, após eluição da Mono S™. Adicionalmente, a actividade específica do factor VlIIa purificado a pH 5,0 e testado imediatamente, é apenas 0,5% da do factor VlIIa de porcino, indicando que ocorreu uma dissociação substancial antes do teste.

Estes resultados demonstram que ambos os factores VlIIa, humano e de porcino, são constituídos por três subunidades (Al, A2 e A3-C1-C2). A dissociação da subunidade A2 é responsável pela perda de actividade de ambos os factores 49 (i ' u t

VlIIa, humano e de porcino, sob determinadas condições, como força iónica, pH e concentração fisiológicos. A estabilidade relativa do factor VlIIa de porcino sob certas condições é devida à associação mais forte da subunidade A2.

Exemplo 4: Preparação de factor VIII híbrido humano/porcino, por reconstituição com subunidades

Isolaram-se as cadeias leves de factor VIII e as cadeias pesadas de factor VIII de porcino como se segue. Adicionou-se uma solução de EDTA 0,5 M a pH 7,4 a factor VIII de porcino purificado por Mono Q™, a uma concentração final de 0,05 M e deixou-se em repouso à temperatura ambiente durante 18-24 horas. Adicionou-se um volume igual de histidina-Cl 10 mM, EDTA 10 mM, Tween 80 0,02% v/v a pH 6,0 (tampão B) e a solução foi aplicada a 1 ml/min a uma coluna Mono S™ HR 5/5 previamente equilibrada em tampão A, mais NaCl 0,25 M. As cadeias pesadas de factor VIII não se ligaram à resina, tal como avaliado por SDS-PAGE. A cadeia leve de factor VIII foi eluida com um gradiente linear de 20 ml de NaCl 0,1-0,7 M em tampão A, a lml/min e era homogénea por SDS-PAGE. As cadeias pesadas de factor VIII foram isoladas por HPLC Mono Q™ (Pharmacia, Inc., Piscataway, N.J.) do seguinte modo. As cadeias pesadas de factor VIII não adsorvem à mono S™ durante a purificação das cadeias leves de factor VIII. O material eluido que continha as cadeias pesadas de factor VIII foi ajustado para pH 7,2, por adição de tampão Hepes 0,5 M, pH 7,4 e aplicado a uma coluna de HPLC mono Q™ HR5/5 (Pharmacia, Inc.), equilibrada em NaCl 0,1 M, Hepes 0,02 M, Tween-80 0,01%, pH 7,4. A coluna foi lavada com 10 ml deste tampão e as cadeias pesadas de factor VIII foram eluidas com um gradiente 50

Lc —e*, de 20 ml de NaCl 0,1-1,0 M, neste tampao. As cadeias leves e cadeias pesadas humanas foram isoladas do mesmo modo.

As cadeias leves e pesadas de humano e de porcino foram reconstituídas de acordo com os passos seguintes. Misturaram-se 10 μΐ de cadeia leve de factor VIII humano, ou de porcino, 100 μς/ιτιΐ em NaCl 1 M, Hepes 0,02 M, CaCl2 5 mM, Tween-80 0,01%, pH 7,4 com (1) 25 μΐ de cadeia pesada heteróloga, 60 μg/ml no mesmo tampão; (2) 10 μΐ de Hepes 0,02 M, Tween-80 0,01%, pH 7,4; (3) 5 μΐ de CaCl2 0,6 M, durante 14 horas à temperatura ambiente. A mistura foi diluída 1/4 com MES 0,02 M, Tween-80 0,01%, CaCl2 5 mM, pH 6 e aplicada a Mono S™ HR5/5, equilibrada em NaCl 0,1M. MES 0,02M, Tween-80 0,01%,

CaCl2 5 mM, pH 6,0. Correu-se um gradiente de 20 ml de NaCl 0,1-1,0 M no mesmo tampão a 1 ml/min e recolheram-se fracções de 0,5 ml. Fez-se a leitura de absorvência das fracções a 280 nm e as fracções foram testadas por absorvência, quanto à actividade do factor VIII pelo teste de coagulação de uma fase. As cadeias pesadas estavam presentes em excesso, pois a cadeia leve livre (não associada à cadeia pesada) também se liga a Mono S™; um excesso de cadeias pesadas assegura que as cadeias leves livres não são parte da preparação.

As experiências de reconstituição seguidas de purificação por HPLC Mono S™ foram realizadas com todas as quatro combinações possíveis de cadeias: cadeia leve humana/cadeia pesada humana, cadeia leve humana/cadeia pesada de porcino, cadeia leve de porcino/cadeia pesada de porcino, cadeia leve de porcino/cadeia pesada humana. A tabela III mostra que o factor VIII de cadeia leve humana/cadeia pesada de porcino tem uma actividade comparável com a do factor VIII de porcino, 51 | ^---- « ' nativo, (Tabela II), indicando que os elementos estruturais na cadeia pesada de porcino são responsáveis pela maior actividade coagulante do factor VIII de porcino, em relação ao factor VIII humano.

TABELA III: COMPARAÇÃO DA ACTIVIDADE COAGULANTE DE FACTOR VIII HÍBRIDO HUMANO/PORCINO COM O FACTOR VIII HUMANO E DE PORCINO

Actividade (U/A2so)

Cadeia leve de porcino/cadeia pesada de porcino 30.600 Cadeia leve humana/cadeia pesada de porcino 44.100 Cadeia leve de porcino/cadeia pesada humana 1.100 Cadeia leve humana/cadeia pesada humana 1.000

Exemplo 5: Preparação de factor VIII híbrido humano/porcino, activOf por reconstituição com domínios O dimero A1/A3-C1-C2 de porcino, o domínio A2 de porcino, o dimero A1/A3-C1-C2 humano e o domínio A2 humano foram cada um, isolados a partir de sangue de porcino ou humano, de acordo com o método descrito em Lollar, P. et al.r 267(33) J. Biol. Chem 23652-23657 (Nov. 25, 1992) . Por exemplo, para isolar o dimero A1/A3-C1-C2 de porcino, o factor VlIIa de porcino (140 μg) a pH 6,0 foi ajustado para pH 8,0 por adição de NaOH 5 N, durante 30 minutos, produzindo a dissociação do domínio A2 e 95 porcento de inactivação pelo teste de coagulação. A mistura foi diluída 1:8 com tampão B (HEPES 20 mM, CaCl2 5 mM, Tween 80 0,01%, pH 7,4) e aplicada a uma coluna mono S, equilibrada em tampão B. 0 dimero A1/A3-C1-C2 eluíu como um pico estreito, único, a aproximadamente NaCl 0,4 M, utilizando um gradiente de NaCl 0,1-1,0 M em tampão B. A fim de isolar o domínio A2 de porcino, produziu-se factor VlIIa de 52 porcino, de acordo com o método de Lollar, P. e C.G. Parker, 28 Biochem. 666-674 (1989), começando com 0,64 mg de factor VIII. O domínio A2 de porcino, livre, foi isolado como um componente menor (50 μς) a NaCl 0,3 M no cromatograma monoS .

As moléculas de factor VIII híbrido humano/porcino foram reconstituídas a partir dos dímeros e domínios, como se segue. As condições de concentração e tampão para os componentes purificados eram como se segue: A2 de porcino, 0,63 μΜ em tampão A (MES 5 mM) ; CaCl2 5 mM, Tween 80 0,01%, pH 6,0) mais NaCl 0,3 M; A1/A3-C1-C2 de porcino, 0,27 μΜ em tampão B mais NaCl 0,4 M, pH 7,4, A2 humano, 1 μΜ em NaCl 0,3 M, histidina-HC1 10 mM, CaCl2 5 mM, Tween 20 0,01%, pH 6,0; A1/A3-C1-C2 humano, 0,18 μΜ em NaCl 0,5 M, histidina-Cl 10 mM, CaCl2 2,5 mM, Tween 20 0,1%, pH 6,0. As experiências de reconstituição foram realizadas misturando volumes iguais de domínio A2 e dimero A1/A3-C1-C2. Em experiências de mistura com o dímero A1/A3-C1-C2 de porcino, baixou-se o pH para 6,0, por adição de MES 0,5 M, pH 6,0 a 70 mM.

As actividades de coagulação de todas as quatro moléculas de factor VlIIa possíveis - [pA2/(hAl/A3-Cl-C2)], [hA2/(pAl/A3-Cl-C2)], [pA2/(pAl/pA3-Cl-C2)] e [hA2/(hAl/A3-Cl- C2)] - foram obtidas por meio de um teste de coagulação de duas fases, a vários tempos. A geração de actividade após mistura dos domínios A2 e dímeros A1/A3-C1-C2 estava quase completa ao fim de uma hora e era estável durante pelo menos 24 horas, a 37 °C. A tabela IV mostra a actividade de moléculas de factor VlIIa híbrido reconstituídas, quando testadas após 1 hora. O teste de duas 53

fases, a partir do qual se obtiveram as actividades especificas das moléculas de factor VlIIa, difere do teste de uma fase e os valores não podem ser comparados com os valores de actividade de moléculas de factor VIII, obtidos por meio do teste de uma fase.

TABELA IV: COMPARAÇÃO DAS ACTIVIDADES COAGULANTES DE FACTOR VIIIA HÍBRIDO HUMANO/PORCINO SUBSTITUÍDO NO DOMÍNIO fVIIIa híbrido Actividade _________ específica (U/mq) A2 de porcino + 140.000 A1/A3-C1-C2 humano A2 de porcino + 70.000 A1/A3-C1-C2 de porcino A2 humano + 40.000 A1/A3-C1-C2 de porcino A2 humano + 40.000 A1/A3-C1-C2 humano A tabela IV mostra que a maior actividade foi exibida pelo domínio A2 de porcino/dímero A1/A3-C1-C2 humano, seguido de domínio A2 de porcino/dímero A1/A3-C1-C2 de porcino.

Assim, quando o domínio A2 do factor VlIIa de porcino foi misturado com o dímero A1/A3-C1-C2 do factor VlIIa humano, obteve-se actividade coagulante. Além disso, quando o domínio A2 do factor VlIIa humano foi misturado com o dímero A1/A3-C1-C2 de factor VlIIa de porcino, obteve-se actividade 54

u t coagulante. Por si próprias, as regiões A2, AI e A3-C1-C2 não têm actividade coagulante.

Exemplo 6: Isolamento e sequenciação do domínio A2 do factor VIII de porcino

Apenas a sequência nucleotidica que codifica para o domínio B e parte do domínio A2 do factor VIII de porcino foi anteriormente sequenciada (Toole, J.J. et al., 83 Proc. Nat11 Acad. Sei. U.S.A. 5939-5942 (1986)). 0 ADNc e as sequências de aminoácidos previstas (SEQ ID NOs:5 e 6, respectivamente) para o domínio A2 total do factor VIII de porcino, são aqui descritos. 0 domínio A2 do factor VIII de porcino foi clonado por transcrição inversa de ARN total de baço de porcino e amplificação por PCR; utilizaram-se um iniciador de síntese degenerado baseado na sequência de ADNc do factor VIII humano, conhecida e um iniciador de síntese de porcino, exacto, baseado numa parte da sequência de factor VIII de porcino. Isolou-se um produto de PCR de 1 kb e amplificou-se por inserção num vector fagemídeo Bluescript™ (Stratagene). 0 domínio A2 de porcino foi completamente sequenciado por sequenciação didesoxi. 0 ADNc e as sequências de aminoácidos previstas estão descritos na SEQ ID Nos:5 e 6, respectivamente.

Exemplo 7: Preparação de factor VIII híbrido humano/animal recombinante 55 I— \ 4

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos previstas (SEQ ID NOs:1 e 2, respectivamente) do factor VIII humano foram já descritas na literatura (Toole, J.J. et al., 312 Nature 342-347 (1984) (Genetics Institute); Gitschier, J. et al., 312 Nature 326-330 (1984)(Genetech); Wood, W.I., et al., 312 Nature 330-337 (1984) (Genentech); Vehar, G.A. et al., 312

Nature 337-342 (1984) (Genentech)).

Para a produção de factor VIII híbrido humano/animal, recombinante, é necessário remover uma região do ADNc de factor VIII humano (Biogen Corp.) e inserir uma sequência de ADNc animal que tenha identidade de sequência.

Subsequentemente, o ADNc híbrido é expresso num sistema de expressão adequado. Como exemplo, clonaram-se ADNcs de factor VIII híbrido, em que alguns, ou todos os domínios A2 de porcino foram substituídos pelas sequências A2 humanas, correspondentes. Inicialmente, toda a sequência de ADNc correspondente ao domínio A2 do factor VIII humano e em seguida uma parte menor do domínio A2 foi removida ("looped out") por mutagénese mediada por oligonucleótidos, um método vulgarmente conhecido dos peritos na arte (veja-se, e.g.,

Sambrook, J. E.F. Fritsch e T. Maniatis, Molecular cloning: a Laboratory Manual, capítulo 15, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1989). Os passos foram como se segue.

Materiais O metoxicarbonil-D-ciclohexilglicil-glicil-arginina-p-nitroanilido (Spectrozyme™ Xa) e os anticorpos monoclonais anti-factor VIII, ESH4 e ESH8 foram adquiridos da American Diagnostica (Greenwich, CT). As vesículas unilamelares de fosfatidilcolina/fosfatidilserina (75/25, p/p) foram preparadas de acordo com o método de Barenholtz, Y. et al., 16 56

Biochemistry 2806-2810 (1977). A desulfatohirudina recombinante foi obtida do Dr. R. B. Wallis, Ciba-Geigy Pharmaceuticals (Cerritos, CA). Os factores IXa, X, Xa e trombina de porcino foram isolados de acordo com os métodos de Lollar, P. et al., 63 Blood 1303-1306 (1984) e Duffy, E.J. e P. Lollar, 207 J. Biol. Chem. 7621-7827 (1992) . O factor VIII humano, recombinante, puro, isento de albumina, foi obtido da Baxter-Biotech (Deerfield, IL).

Clonagem do domínio A2 do factor VIII de porcino O ADN que codifica para o domínio A2 de porcino foi obtido por PCR de ARNm de baço de porcino transcrito no sentido inverso, isolado como descrito por Chomeczyneki, P. e Sacohi, N., 162 Anal. Biochem. 156-159 (1987). O ADNc foi preparado utilizando um kit de síntese da primeira cadeia de ADNc, com hexâmeros ao acaso como iniciadores de síntese (Pharmacia, Piscataway, N.J.). A PCR foi realizada utilizando um iniciador de síntese degenerado no terminal 5', 5' AARCAYCCNAARACNTGGG 3' (SEQ ID NO:ll), baseado na sequência de aminoácidos de A2 de porcino limitada, conhecida e um iniciador de síntese exacto de terminal 3', 5' GCTCGCACTAGGGGGTCTTGAATTC 3' (SEQ ID NO:12), baseado na sequência de ADN de porcino conhecida, imediatamente 3' do domínio A2 de porcino. Estes oligonucleótidos correspondem aos nucleótidos 1186-1203 e 2289-2313 na sequência humana (SEQ ID NO:l). A amplificação foi realizada durante 35 ciclos (1 minuto 94 °C, 2 minutos 50 °C, 2 minutos 72 °C) utilizando polimerase de ADN Taq (Promega Corp., Madison, WI). O fragmento amplificado de 1,1 kilobases foi clonado em pBluescript II KS (Stratagene) no local EcoRV, utilizando o procedimento do vector-T, como descrito por Murchuk, D., et al., 19 Nucl. Acids Res. 1154 (1991). As células de Escherichia coli XLl-Blue-competentes foram 57 t U K· transformadas e isolou-se ADN de plasmideo. A sequenciação foi realizada em ambos os sentidos, utilizando Sequenase™ versão 2,0 (U.S. Biochemical Corp., uma divisão da Amersham

LifeScience, Inc., Arlington Hts, IL) . Esta sequência foi confirmada por uma sequência idêntica, que foi obtida por sequenciação directa do produto de PCR de um ARN de baço de transcrição inversa, independente, do mesmo porco (CircumVent , New England Biolabs, Beverly, MA) . A região que contém o epitopo para o auto-anticorpo RC foi identificada como 373-536 no factor VIII humano (SEQ ID NO:2).

Construção e expressão de um ADNc de factor VIII híbrido humano/porcino.

Utilizou-se factor VIII sem domínio B (HB-, da Biogen, Inc. Cambridge, MA), que não possui as sequências que codificam para os resíduos de aminoácidos 741-1648 (SEQ ID NO:2), como material de partida para a construção de um factor VIII híbrido humano/porcino. O HB- foi clonado no vector de expressão ReNeo. A fim de facilitar a manipulação, isolou-se o ADNc para o factor VIII como um fragmento Xhol/Hpal de ReNeo e clonou-se em pBlueScript II KS digerido com Xhol/EcoRv. Utilizou-se um oligonucleótido 5' CCTTCCTTTATCCAAATACGTAGATCAAGAGGAAATTGAC 3' (SEQ ID NO:7), numa reacção de mutagénese direccionada para o local, utilizando ADN de fago contendo uracilo, como descrito por Kunkel, T.A. et al.r 204 Meth. Enzymol. 125-139 (1991), para remover ("loop out") a sequência A2 humana (nucleótidos 1169-2304 na SEQ ID NO:l) e ao mesmo tempo introduzir um local de restrição SnaBI. O plasmideo que contém o factor VIII humano sem domínio A2 foi digerido com SnaBI, seguido de adição de ligantes Ciai. 0 domínio A2 de porcino foi então amplificado 58 f por PCR, utilizando o iniciador de síntese fosforilado em 5', 5' GTAGCGTTGCCAAGAAGCACCCTAAGACG 3' (SEQ ID NO: 8) e o iniciador de síntese 3', 5' GAAGAGTAGTACGAGTTATTTCTCTGGGTTCAATGAC 3' (SEQ ID NO:9), respectivamente. Os ligantes Ciai foram adicionados ao produto de PCR, seguido de ligação no vector contendo factor VIII humano. As junções A1/A2 e A2/A3 foram corrigidas para recuperar a clivagem precisa da trombina e as sequências flanqueadoras, por mutagénese direccionada para o local, utilizando o oligonucleótido apresentado na SEQ ID NO: 8 e os nucleótidos 1-22 (5' GAA . . . TTC na SEQ ID NO: 9), para corrigir as junções de terminal-5' e -3', respectivamente. Na construção resultante, designada por HP1, o domínio A2 humano foi substituído exactamente pelo dominio A2 de porcino. Um produto preliminar continha uma timina não desejada na junção A1-A2, como resultado da amplificação por PCR do domínio A2 de porcino. A única base pode ser removida ("looped out”) utilizando o oligonucleótido mutagénico 5' CCTTTATCCAAATACGTAGCGTTTGCCAAGAAG 3’ (SEQ ID NO:10). A região que contém 63% do domínio A2 do terminal -NH2 de porcino, que inclui o epítopo de A2 putativo, foi substituída pela sequência de ADNc sem domínio B, . humana, homóloga, trocando fragmentos Spel/BamHI entre os plasmídeos pBluescript que contêm factor VIII humano e ADNc de A2 de factor VIII humano/porcino. A sequência foi confirmada sequenciando o domínio A2 e os locais de corte e rearranjo. Por fim, um fragmento Spel/Apal, contendo toda a sequência A2, foi substituído no lugar da sequência correspondente em HB-, produzindo a construção HP2. 59 Γ

A expressão preliminar de HB” e HP2 em células COS-7 foi testada após transfecção de ADN mediada por DEAE-dextrano, como descrito por Seldon, R.F., em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds), pp. 9.21-9.26, Wiley Interscience, N.Y. Após se confirmar a expressão de factor VIII activo e se realizarem estudos preliminares de inibição de anticorpos, fez-se a transfecção de forma estável de ADN de HB- e HP2 em células de rim de Hamster bebé, utilizando transfecção mediada por lipossomas (Lipofectin®, Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). Os clones que contêm plasmídeos foram seleccionados quanto à resistência a G418 em meio F12 de Eagle modificado da Dulbecco, soro fetal de vitela a 10% (DMEM-Fl2/soro fetal de vitela a 10%) contendo 400 μρ/ιηΐ de G418, seguido de manutenção em DMEM-F12/soro fetal de vitela a 10% contendo G418 100 μg/ml. As colónias que apresentam uma expressão máxima de actividade de factor VIII HB- e HP2 foram seleccionadas por clonagem em anel e expandidas para posterior caracterização. A expressão do factor VIII HB- e HP2 foi comparada pelo teste de factor VIII isento de plasma, teste de coagulação de uma fase e teste imunoadsorvente ligado a enzimas, utilizando factor VIII humano, recombinante, purificado, como padrão. Obtiveram-se actividades coagulantes especificas de 2600 e 2580 unidades/mg para HB- e HP2, respectivamente. O HB- e HP2 produziram 1,2 e 1,4 unidades/ml/48 horas/107 células, respectivamente. Estes valores são idênticos aos da construção do tipo selvagem (2.600 + 200 unidades/mg). As actividades especificas de HB- e HP2 eram indistinguíveis no teste de factor VIII isento de plasma. 60 Γ U, ^

Construção e expressão de factor VIII híbrido humano/mamífero não porcino

Pode-se realizar a clonagem de outros domínios Al, A3, Cl e C2 e partes de domínios de outros animais com a mesma estratégia utilizada para clonar o domínio A2 de porcino. Os fragmentos destes domínios podem ser clonados pela técnica de mutagénese de "looping out". Pode-se realizar a excisão dos domínios correspondentes no factor VIII humano e de quaisquer fragmentos seus derivados, incluindo eliminações de aminoácidos únicos, por mutagénese de "looping out", como descrito acima. Todas as substituições de domínio possíveis, substituições de fragmentos de domínios ou substituições de resíduos de aminoácidos únicos, são possíveis de realizar com esta aproximação A actividade biológica do factor VIII híbrido

humano/animal com substituições de domínios Al, A2, A3, Cl e/ou C2 pode ser avaliada inicialmente pela utilização de um sistema de expressão transiente de mamífero de células COS. 0 ADNc híbrido humano/animal pode ser transfectado em células COS e os sobrenadantes podem ser analisados quanto a actividade de factor VIII, utilizando testes de coagulação de uma fase e de duas fases, como acima descrito. Adicionalmente, a actividade de factor VIII pode ser medida por utilização de um teste de substrato cromogénico, que é mais sensível e permite a análise de maiores números de amostras. Testes semelhantes são convencionais no teste da actividade de factor VIII (Wood, W.I. et al., 312 Nature 330-337, 1984; Toole, J.J. et al., Toole, J.J. et al., 312 Nature 342-347, 1984). A expressão de factor VIII recombinante em células COS é também um processo convencional (Toole, J.J. et al., 312 Nature 342- 61 tf í— t 347, 1984; Pittman, D.D. e R.J. Kaufman, 85 Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2429-2433, 1988). 0 ADNc de factor VIII humano utilizado como material de partida para as moléculas recombinantes aqui descritas, foi expresso em células COS, originando um produto com actividade biológica. Este material, tal como descrito acima, pode ser utilizado como padrão para comparar moléculas de factor VIII híbridas humano/animal. A actividade nos testes é convertida numa actividade específica para uma comparação adequada das moléculas híbridas. Para isso, é necessário medir a massa de factor VIII produzido pelas células e isso pode ser feito por imunoensaio com factor VIII humano e/ou animal purificado, como padrão. Os imunoensaios para o factor VIII são rotineiros para os peritos na arte (Veja-se, e.g., Lollar, P. et al., 71 Blood 137-143, 1988).

Exemplo 8. Determinação da actividade inibitória em factor VIII híbrido humano/animal

As sequências de factor VIII humano e animal que provavelmente estão envolvidas como epítopos (i.e. como locais de reconhecimento para anticorpos inibidores que reagem com o factor VIII) podem ser determinadas utilizando processos de rotina, por exemplo utilizando um teste com anticorpos para o factor VIII combinado com técnicas de mutagénese direccionada, como métodos de corte e rearranjo por extensão da sobreposição (SOE), como a seguir se mostra. Podem-se identificar as sequências de factor VIII animal que não são antigénicas, em comparação com as sequências humanas antigénicas correspondentes e podem-se fazer substituições para inserir sequências animais e eliminar sequências humanas, de acordo com métodos de ADN recombinante, convencionais. O factor VIII 62

U t de porcino reage menos do que o factor VIII humano com alguns anticorpos inibidores; isto proporciona uma base para a terapia corrente de pacientes com inibidores. Após se produzirem os híbridos recombinantes, estes podem ser testados in vitro quanto à reactividade, com testes de rotina, incluindo o teste de inibidor da Bethesda. As construções que são menos reactivas que o factor VIII humano, nativo, e que o factor VIII animal, nativo, são candidatas para a terapia de substituição.

Pensa-se que os epítopos para os quais a maioria, se não todos, os anticorpos inibidores reactivos com o factor VIII humano são direccionados, residem em duas regiões na molécula de factor VIII humana, de 2332 aminoácidos, o domínio A2 (resíduos de aminoácido 373-740) e o domínio C2 (resíduos de aminoácidos 2173-2332, ambas as sequências apresentadas na SEQ ID NO:2). O epítopo de A2 foi eliminado, construindo uma molécula de factor VIII híbrida humano/porcino recombinante, em que parte do domínio A2 humano é substituído pela sequência de porcino com identidade de sequência com a sequência de aminoácidos substituída. Isto foi conseguido, como descrito na Exemplo 7, por clonagem do domínio A2 de porcino por técnicas de biologia molecular convencionais, cortando e rearranjando em seguida no domínio A2, utilizando locais de restrição. Na construção resultante, designada por HP2, os resíduos 373-603 (SEQ ID NO:4) do factor VIII de porcino foram substituídos no domínio A2 humano. Ο HP2 foi testado quanto à imunoreactividade com anticorpos de factor VIII anti-humano, utilizando os métodos seguintes.

Teste ímunoadsorvente ligado a enzima, de Factor VIII 63

Revestiram-se os poços de placas de microtítulo com 0,15 ml de ESH4 6 μς/ιηΐ, um anticorpo da cadeia leve de factor VIII humano e incubou-se durante a noite. Após lavagem da placa três vezes com H20, os poços foram bloqueados durante 1 hora com NaCl 0,15 M, fosfato de sódio 10 mM, Tween 20 a 0,05%, leite em pó não gordo a 0,05%, azida de sódio a 0,05%, pH 7,4. Para aumentar a sensibilidade, as amostras que contêm factor VIII foram activadas com trombina 30 nM durante 15 minutos. Adicionou-se então desulfatohirudina recombinante a 100 nM, para inibir a trombina. A placa foi lavada mais uma vez e adicionou-se 0,1 ml de amostra ou de factor VIII humano, recombinante, puro (10-600 ng/ml) , utilizado como padrão. Após 2 horas de incubação, a placa foi lavada e adicionou-se a cada poço 0,1 ml de ESH8 biotinilado, um outro anticorpo da cadeia leve de factor VIII. O ESH8 foi biotinilado utilizando o kit de biotinilação de sulfosuccinimidil-6-(biotinamida)hexanoato da Pierce. Após uma incubação de 1 hora, a placa foi lavada e adicionaram-se 0,1 ml de estreptavidina fosfatase alcalina a cada poço. A placa foi desenvolvida utilizando o kit reagente de substrato de fosfatase alcalina da Bio-Rad, e determinou-se a absorvência resultante a 405 nm, para cada poço, utilizando um leitor de placas de microtítulo Vmax (Molecular Devices, Inc., Sunnyville, CA). Determinaram-se as concentrações de factor VIII desconhecidas a partir da porção linear da curva padrão de factor VIII.

Testes de factor VIII

Mediu-se o factor VIII HB- e HB2 num teste de coagulação de uma fase, que foi realizado como descrito acima (Bowie, E.J.W. e C.A. Owen in Disorders of Hemostasis (Ratnoff e Forbes, eds) pp. 43-72, Grunn & Stratton, Inc., Orlando, FL (1984)), ou por um teste isento de plasma, como se segue. O 64

V

t factor VIII HB- ou HP2 foi activado por trombina 40 nM em NaCl 0,15 M, HEPES 20 nM, CaCl2 5 mM, Tween 80 a 0,01%, pH 7,4 na presença de factor IXa 10 nM, factor X 425 nM e vesículas unilamelares de fosfatidilserina/fosfatidilcolina 50 μΜ (25/75, p/p) . Após 5 minutos, a reacção foi parada com EDTA 0,05 M e desulfatohirudina recombinante 100 nM, e o factor Xa resultante foi medido pelo teste de substrato cromogénico, de acordo com o método de Hill-Eubanks, D.C. e P. Lollar, 265 J. Biol. Chem. 17854-17858 (1990). Nestas condições, a quantidade de factor Xa formada era linearmente proporcional à concentração de partida de factor VIII, tal como avaliado utilizando factor VIII humano recombinante, purificado (Baxter Biotech, Deerfield, IL) como padrão.

Antes do teste de coagulação, o factor HB- ou HP2 foi concentrado a partir de meio condicionado de 48 horas, até 10-15 unidades/ml por cromatografia de heparina-Sepharose™. Adicionou-se factor VIII HB- ou HP2 a plasma de Hemofilia A (George King Biomedical) a uma concentração final de 1 unidade/ml. Os títulos de inibidor em plasma RC ou MR, ou numa solução mãe de mAb 413 IgG (4 μΜ) foram medidos pelo teste da· Bethesda, como descrito por Kasper, C.K. et al., 34 Thromb. Diath. Haemorrh. 869-872 (1975). Preparou-se IgG inibidor como descrito por Leyte, A. et al., 266 J. Biol. Chem. 740-746 (1991). 0 HP2 não reage com anticorpos anti-A2. Assim, os resíduos 373-603 deverão conter um epítopo para anticorpos anti-A2.

Preparação de factor VIII híbrido humano/porcino e teste por corte e rearranjo por extensão da sobreposição (SOE). 65

Prepararam-se mais algumas moléculas de factor VIII híbrido humano/porcino com substituições de aminoácidos de porcino na região A2 humana para estreitar ainda mais o epítopo de A2. Além das técnicas de locais de restrição, utilizou-se o método de "corte e rearranjo por extensão da sobreposição" (SOE), como descrito por Ho, S.N. et al., 77 Gene 51-59 (1989) para substituir qualquer região arbitrária do ADNc de factor VIII de porcino. No SOE, o local de corte e rearranjo é definido por oligonucleótidos sobrepostos, que podem ser amplificados para produzir o ADNc desejado por PCR. Construíram-se oito construções de ADNc, designadas por HP4 a HP11. Estas foram inseridas no vector de expressão ReNeo, transfectado de forma estável em células de rim de Hamster bebé e expressas e níveis elevados, como descrito no exemplo 7.

As construções de factor VIII híbridas humano/porcino foram testadas quanto à reactividade com o inibidor anti-A2 MAb413 utilizando o teste de Bethesda (Kasper, C.K. et al., 34 Thromb. Diath. Haemorrh. 869-872 (1975)). A unidade de

Bethesda (BU) é o método padrão para a medição de títulos de: inibidores. Os resultados são apresentados na Tabela V e são comparados com o factor VIII humano, recombinante

TABELA V: COMPARAÇÃO DA IMUNOREACTIVIDADE DO FACTOR VIII HÍBRIDO HUMANO/PORCINO SUBSTITUÍDO COM AMINOÁCIDOS

Construção Substituição Inibição FVIII humano de porcino Nenhuma MAb413 (BU/mg IgG) HP4 373-540 HP5 373-509 1470 <0,7 <0,7 66 ΗΡβ 373-444 ΗΡ7 445-509 ΗΡ8 373-483 ΗΡ9 484-509 ΗΡ10 373-403 ΗΡ11 404-509

1450 <0,7 1250 <0,7 1170 <0,7

Como se pode ver pela tabela V, se o título de Bethesda não for mensurável (<0,7 BU/mg IgG), então o epítopo de A2 está localizado na região da sequência de porcino substituída. O epítopo foi progressivamente estreitado até aos resíduos 484-509 (SEQ ID NO:2), consistindo de apenas 26 resíduos, como exemplificado pela não reactividade de MAb413 com HP9. A região entre 484-509 pode ser dividida. Se esta divisão produz sequências de porcino de, por exemplo, os resíduos 484-497 e 498-509, nenhum dos quais reage com os anticorpos inibidores anti-A2, isto irá indicar que o epítopo foi dividido e que os aminoácidos de ambos os lados do local de corte 497-498 são necessários para produzir o epítopo.

Os métodos descritos nos Exemplos 7 e 8 podem ser utilizados para preparar outros factores VIII híbridos humano/mamífero não-porcino, com substituição de aminoácidos no domínio A2, factor VIII híbrido humano/animal com substituições de aminoácidos em qualquer domínio, ou outras moléculas de factor VIII híbridas, ou equivalentes, como factor VIII híbrido com imunoreactividade reduzida, ou ausente, com os anticorpos anti-factor VIII. 67 L·. ^

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: Emory University (ii) TÍTULO DO INVENTO: Factor VIII híbrido humano/animal (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 12

(iv) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA (A) DESTINATÁRIO: Kilpatrick & Cody (B) RUA: 1100 Peachtree Street, Suite 2800 (C) CIDADE: Atlanta (D) ESTADO: Georgia

(E) PAÍS: US (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 30309 (v) FORMA DE LEITURA DO COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, versão # 1.25 (vi) DADOS DO PEDIDO ACTUAL:

(A) NÚMERO DO PEDIDO: PCT (B) DATA DE DEPÓSITO: 15-NOV-1994 (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO DO MANDATÁRIO/AGENTE: (A) NOME: Pabst, Patrea L. (B) NÚMERO DE REGISTO: 31,284 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/ENTRADA: EMU106CIP(2) 68

r— l-É il

(ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES (A) TELEFONE: 404-815-6508 (B) TELEFAX: 404-815-6555 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 9009 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SENTIDO INVERSO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo Sapiens (F) TIPO DE TECIDO: Fígado (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica_misc (estrutura do domínio) (B) LOCALIZAÇÃO: 5125 . . . 7053 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Equivalente ao domínio A3-C1-C2" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característíca_misc (estrutura do domínio) (B) LOCALIZAÇÃO: 1 . . . 2277 69 (P ^ ^-- (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Equivalente ao domínio A1-A2" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: domínio (B) LOCALIZAÇÃO: 1 . . . 2277 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "ADNc que codifica para o factor VIII humano" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.l: CAGTGGGTAA GTTCCTTAAA TGCTCTGCAA AGAAATTGGG ACTTTTCATT AAATCAGAAA 60 TTTTACTTTT TTCCCCTCCT GGGAGCTAAA GATATTTTAG AGAAGAATTA ACCTTTTGCT 120 TCTCCAGTTG AACATTTGTA GCAATAAGTC ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT 180 CTGTGCCTTT TGCGATTCTG CTTTAGTGCC ACCAGAAGAT ACTACCTGGG TGCAGTGGAA 240 CTGTCATGGG ACTATATGCA AAGTGATCTC GGTGAGCTGC CTGTGGACGC AAGATTTCCT 300 CCTAGAGTGC CAAAATCTTT TCCATTCAAC ACCTCAGTCG TGTACAAAAA GACTCTGTTT 360 GTAGAATTCA CGGTTCACCT TTTCAACATC GCTAAGCCAA GGCCACCCTG GATGGGTCTG 420 CTAGGTCCTA CCATCCAGGC TGAGGTTTAT GATACAGTGG TCATTACACT TAAGAACATG 4 80 GCTTCCCATC CTGTCAGTCT TCATGCTGTT GGTGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA 540 GCTGAATATG ATGATCAGAC CAGTCAAAGG GAGAAAGAAG ATGATAAAGT CTTCCCTGGT 600 GGAAGCCATA CATATGTCTG GCAGGTCCTG AAAGAGAATG GTCCAATGGC CTCTGACCCA 660 CTGTGCCTTA CCTACTCATA TCTTTCTCAT GTGGACCTGG TAAAAGACTT GAATTCAGGC 720 CTCATTGGAG CCCTACTAGT ATGTAGAGAA GGGAGTCTGG CCAAGGAAAA GACACAGACC 780 TTGCACAAAT TTATACTACT TTTTGCTGTA TTTGATGAAG GGAAAAGTTG GCACTCAGAA 840 ACAAAGAACT CCTTGATGCA GGATAGGGAT GCTGCATCTG CTCGGGCCTG GCCTAAAATG 900 CACACAGTCA ATGGTTATGT AAACAGGTCT CTGCCAGGTC TGATTGGATG CCACAGGAAA 960 TCAGTCTATT GGCATGTGAT TGGAATGGGC ACCACTCCTG AAGTGCACTC AATATTCCTC 1020 GAAGGTCACA CATTTCTTGT GAGGAACCAT CGCCAGGCGT CCTTGGAAAT CTCGCCAATA 1080 ACTTTCCTTA CTGCTCAAAC ACTCTTGATG GACCTTGGAC AGTTTCTACT GTTTTGTCAT 1140 70

ATCTCTTCCC

GAACCCCAAC

GATTCTGAAA

CGCTCAGTTG

GACTGGGACT

TTGAACAATG

ACAGATGAAA

TTACTTTATG

CCATATAACA

CCAAAAGGTG

AAATGGACAG

TATTACTCTA

CTCATCTGCT

AATGTCATCC

CAACGCTTTC

AACATCATGC

CATGAGGTGG

TTCTTCTCTG

CCATTCTCAG

TGCCACAACT

GACAAGAACA

AGTAAAAACA

AGGCAAAAGC

TGGTTTGCAC

ATGCTCTTGC

AAATATGAGA

TCTGAAATGA

GAGTCAGGCC

AAGAAACTTG

ACCAACATGA

TACGAATGAA

TGGATGTGGT

CCAAGAAGCA

ATGCTCCCTT

GCCCTCAGCG

CCTTTAAGAC

GGGAAGTTGG

TCTACCCTCA

TAAAACATTT

TGACTGTAGA

GTTTCGTTAA

ACAAAGAATC

TGTTTTCTGT

TCCCCAATCC

ACAGCATCAA

CATACTGGTA

GATATACCTT

GAGAAACTGT

CAGACTTTCG

CTGGTGATTA

ATGCCATTGA

AATTTAATGC

ACAGAACACC

GACAGAGTCC

CTTTTTCTGA

CACACTTCAG

TCCAATTAAG

ATTTCAAAGT

TGGCATGGAA

AAATAATGAA

CAGGTTTGAT

TCCTAAAACT

AGTCCTCGCC

GATTGGTAGG

TCGTGAAGCT

AGACACACTG

CGGAATCACT

GAAGGATTTT

AGATGGGCCA

TATGGAGAGA

TGTAGATCAA

ATTTGATGAG

AGCTGGAGTG

TGGCTATGTT

CATTCTAAGC

CAAACACAAA

CTTCATGTCG

GAACAGAGGC

TTACGAGGAC

ACCAAGAAGC

CACCACAATT

TATGCCTAAA

TACTCCACAT

TGATCCATCA

GCCACAGCTC

ATTAAATGAG

TTCTAGTACA

GCTTATGTCA

GAAGCGGAAG

GATGACAACT

TGGGTACATT

CCCGATGACA

AAGTACAAAA

ATTCAGCATG

TTGATTATAT

GATGTCCGTC

CCAATTCTGC

ACTAAATCAG

GATCTAGCTT

AGAGGAAACC

AACCGAAGCT

CAGCTTGAGG

TTTGATAGTT

ATTGGAGCAC

ATGGTCTATG

ATGGAAAACC

ATGACCGCCT

AGTTATGAAG

TTCTCCCAGA

CCAGAAAATG

ATACAAAATG

GGGCTATCCT

CCTGGAGCAA

CATCACAGTG

AAACTGGGGA

TCAAATAATC

AAGTAGACAG AC TAT GAT GA CTCCTTCCTT ACATTGCTGC GAAGTTATAA AAGTCCGATT AATCAGGAAT TTAAGAATCA CTTTGTATTC CAGGAGAAAT ATCCTCGGTG CAGGACTCAT AGATAATGTC GGTACCTCAC ATCCAGAGTT TGCAGTTGTC AGACTGACTT AAGACACACT CAGGTCTATG TACTGAAGGT ATATTTCAGC ATTCAAGACA ACATAGAGAA TCTCCTCTAG TATCTGATCT TAGACAGTAA GGGACATGGT CAACTGCAGC TGATTTCAAC

CTGTCCAGAG

TGATCTTACT

TATCCAAATT

TGAAGAGGAG

AAGTCAATAT

TATGGCATAC

CTTGGGACCT

AGCAAGCAGA

AAGGAGATTA

ATTCAAATAT

CCTGACCCGC

TGGCCCTCTC

AGACAAGAGG

AGAGAATATA

CCAAGCCTCC

AGTTTGTTTG

CCTTTCTGTC

CACCCTATTC

GATTCTGGGG

TTCTAGTTGT

ATACTTGCTG

CCCTAGCACT

GACTGACCCT

TGATTTGTTG

CCAAGAAGCC

TAACAGCCTG

ATTTACCCCT

AACAGAGTTG

AATTCCATCA 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 71

GACAATTTGG

CATTATGATA

TCTGGTGGAC

TTAATGAATA

TTATTTAAAG

AAAGTTAGCA

AAGACTCACA

ATATTAGAAA

ATGGACAAAA

AAAAACATGG

CCAGATATGT

ACTCATGGAA

TTAGGACCAG

GTAGGAAAGG

AGAAACCTAT

AAAAAAATTC

CCTCAGATAC

ACTAGGCAAA

AGGTCATTAA

GGGGAGGAAG

GCATGCACCA

AAGAGAGCTT

ATTGTGGATG

CTCACACAGA

GATTGCCTTA

AAGGTATCAT

AACTCTTCTC

AGTCATTTCT

ATGACTGGTG

CAGCAGGTAC

GTCAATTAGA

CTCTGAGCTT

GCCAAGAAAG

GGAAAAGAGC

TCTCTTTGTT

TTGATGGCCC

GTGACACTGA

ATGCTACAGC

AAATGGTCCA

CGTTCTTTAA

AGAACTCTCT

AAAAATCTGT

GTGAATTTAC

TTCTTACTAA

AGGAAGAAAT

ATACAGTGAC

ATGTAGAAGG

ATGATTCAAC

AAAACTTGGA

CAAGGATATC

TGAAACAATT

ACACCTCAAC

TAGACTACAA

CGAGGAGTCA

CATTTCCATC

ATCTTCCAGC

TACAAGGAGC

ATCAAAGAGA

TGATAATACA

TACCACTCTA

GAGTGAAGAA

TTCATGGGGA

TCATGGACCT

AAAGACAAAC

ATCATTATTA

GTTTAAAAAA

TTTGAGGCTA

ACAGAAAAAA

GATGCTATTC

GAACTCTGGG

GGAAGGTCAG

AAAGGACGTA

CTTGGATAAT

AGAAAAGAAG

TGGCACTAAG

TTCATATGAG

AAATAGAACA

AGGCTTGGGA

TCCTAATACA

CAGACTCCCA

CCAGTGGTCC

TGAGAAGGAG

TAGCATCCCT

TATTAGACCT

AGCATCTTAT

CAAAAAAAAT

GGTTGGCTCC

AGTTCCTTAG

TTTGGCAAAA

AATAATGATT

AAAAATGTAT

GCTTTGTTGA

AAAACTTCCA

ATTGAGAATA

GTGACACCTT

AATCATATGT

GAGGGCCCCA

TTGCCAGAAT

CAAGGCCCCA

AATTTCTTGT

GGACTCAAAG

TTACATGAAA

GAAACATTAA

AATTTCATGA

GGGGCATATG

AAGAAACACA

AATCAAACCA

AGCCAGCAGA

CTAGAAGAAA

AAAAACATGA

AAAGGGGCCA

CAAGCAAATA

ATATATCTGA

AGAAAGAAAG

AACCTTTCTT

CTGGGGACAA

GACCCCCAAG

AGTCATCTCC

CAAAGTTGTT

CGTCAACAGA

CTAAAGATAA

ATAATTCAGC

GTCCATCAGT

TGATTCATGA

CAAATAAAAC

TTCCACCAGA

CAGCAAGGTG

GTCCAAAGCA

CTGAGAAAAA

AGATGGTTTT

ATAATACACA

TCCAAGAGAA

AGAACCTTTT

CTCCAGTACT

CAGCTCATTT

AGCAAATTGT

ATTTTGTCAC

CAGAACTTGA

AACATTTGAC

TTACTCAGTC

GATCTCCATT

CCAGGGTCCT

ATTCTGGGGT

TAGCCATTCT

GTGCCACAAA

TATGCCAGTT CCTTACTGAG AGAATCAGGT GAGTGGTAGG TGCCTTATTC AACTAATAGA CTGGCAAAAT CAGAATGCTT TACTTCATCA TGCACAAAAT GATACAAAGG ATTAGTATCC CAAAGTGGTA TCCAAGCAGC CAATCAAGAA TGTAGTTTTG CTTACTGAGC TCAAGATTTT CTCAAAAAAA AGAGAAATAT GCAACGTAGT AAAAAGGATA CCCGAGCACC TCCCTTATCA ACCCATTGCA ATTCCAAGAC CCAAGAAAGC AACCTTGGAG TTCAGTCACA ^ 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 72

TACAAGAAAG

GTTGAATTGC

AATGGGTCTC

GCGATTAAGT

GAAAGCTCTG

GGTACTCAGA

TTTAAGAAAA

GCAATAAATG

ACTGAAAGGC

CGTACTACTC

ATGAAGAAGG

CAAAAGAAAA

AGTAGCTCCC

AAAGTTGTTT

CTAAATGAAC

ATGGTAACTT

TATGAGGAAG

ACCAAAACTT

TGCAAAGCCT

ATTGGACCCC

ACAGTACAGG

ACTGAAAATA

TTTAAAGAGA

TTAGTAATGG

AACATCCATT

AAAATGGCAC

AAAGCTGGAA

ACACTTTTTC

ATTAGAGATT

TTGAGAACAC

TTCCAAAAGT

CTGGCCATCT

GGAATGAAGC

CAAAGACTCC

TACCAAAAGA

AGGATACCAT

AGGGACAAAA

TGTGCTCTCA

TTCAGTCAGA

AAGATTTTGA

CACGACACTA

CACATGTTCT

TCCAGGAATT

ATTTGGGACT

TCAGAAATCA

ATCAGAGGCA

ACTTTTGGAA

GGGCTTATTT

TTCTGGTCTG

AATTTGCTCT

TGGAAAGAAA

ATTATCGCTT

CTCAGGATCA

CTATTCATTT

TGTACAATCT

TTTGGCGGGT

TGGTGTACAG

TTCAGATTAC

TGTTCTCCCG

TCACATTTAT

GGATCTCGTG

AAACAGACCT

CTCCAAGCTA

AGAGTGGAAA

TTTGTCCCTG

TAAGCCCGAA

AAACCCACCA

TCAAGAGGAA

CATTTATGAT

TTTTATTGCT

AAGAAACAGG

TACTGATGGC

CCTGGGGCCA

GGCCTCTCGT

AGGAGCAGAA

AGTGCAACAT

CTCTGATGTT

CCACACTAAC

GTTTTTCACC

CTGCAGGGCT

CCATGCAATC

AAGGATTCGA

CAGTGGACAT

CTATCCAGGT

GGAATGCCTT

CAATAAGTGT

AGCTTCAGGA

AAACCAGACT

CAGAAGGACC

GAAGGGAGCC

GGAAAAGTTC

TTGGATCCTC

TCCCAAGAGA

AACGCTTGTG

ATAGAAGTCA

GTCTTGAAAC

ATTGACTATG

GAGGATGAAA

GCAGTGGAGA

GCTCAGAGTG

TCCTTTACTC

TATATAAGAG

CCCTATTCCT

CCTAGAAAAA

CATATGGCAC

GACCTGGAAA

ACACTGAACC

ATCTTTGATG

CCCTGCAATA

AATGGCTACA

TGGTATCTGC

GTGTTCACTG

GTTTTTGAGA

ATTGGCGAGC

CAGACTCCCC

CAATATGGAC

TGCCCAAAAC TATTCCCTAC TTCTTCAGGG CCTTTCTGAG TTGCTTGGGA AGTCACCAGA AAAGCAATCA CCTGGGCAAA GCCATCAACG ATGATACCAT ATCAGAGCCC GGCTCTGGGA GCAGTGTCCC AGCCCTTATA CAGAAGTTGA TCTATTCTAG ACTTTGTCAA CCACTAAAGA AAGATGTGCA CTGCTCATGG AGACCAAAAG TCCAGATGGA TAATGGATAC TCAGCATGGG TACGAAAAAA CAGTGGAAAT ATCTACATGC TGGGAATGGC AGTGGGCCCC

ATCTGGCAAA

GGAAACTAGC

AACAGAGGGA

AGTAGCAACA

TAACCACTAT

AAAAACAGCT

TGCAATAGCA

GCAAGGTAGG

GGAAATAACT

ATCAGTTGAA

CCGCAGCTTT

TTATGGGATG

TCAGTTCAAG

CCGTGGAGAA

AGATAATATC

CCTTATTTCT

GCCTAATGAA

TGAGTTTGAC

CTCAGGCCTG

GAGACAAGTG

CTGGTACTTC

AGATCCCACT

ACTACCTGGC

CAGCAATGAA

AGAGGAGTAT

GTTACCATCC

TGGGATGAGC

TTCTGGACAC

AAAGCTGGCC ^ 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6360 73

AGACTTCATT ATTCCGGATC AATCAATGCC TGGAGCACCA AGGAGCCCTT TTCTTGGATC 6420 AAGGTGGATC TGTTGGCACC AATGATTATT CACGGCATCA AGACCCAGGG TGCCCGTCAG 6480 AAGTTCTCCA GCCTCTACAT CTCTCAGTTT ATCATCATGT ATAGTCTTGA TGGGAAGAAG 6540 TGGCAGACTT ATCGAGGAAA TTCCACTGGA ACCTTAATGG TCTTCTTTGG CAATGTGGAT 6600 TCATCTGGGA TAAAACACAA TATTTTTAAC CCTCCAATTA TTGCTCGATA CATCCGTTTG 6660 CACCCAACTC ATTATAGCAT TCGCAGCACT CTTCGCATGG AGTTGATGGG CTGTGATTTA 6720 AATAGTTGCA GCATGCCATT GGGAATGGAG AGTAAAGCAA TATCAGATGC ACAGATTACT 6780 GCTTCATCCT ACTTTACCAA TATGTTTGCC ACCTGGTCTC CTTCAAAAGC TCGACTTCAC 6840 CTCCAAGGGA GGAGTAATGC CTGGAGACCT CAGGTGAATA ATCCAAAAGA GTGGCTGCAA 6900 GTGGACTTCC AGAAGACAAT GAAAGTCACA GGAGTAACTA CTCAGGGAGT AAAATCTCTG 6960 CTTACCAGCA TGTATGTGAA GGAGTTCCTC ATCTCCAGCA GTCAAGATGG CCATCAGTGG 7020 ACTCTCTTTT TTCAGAATGG CAAAGTAAAG GTTTTTCAGG GAAATCAAGA CTCCTTCACA 7080 CCTGTGGTGA ACTCTCTAGA CCCACCGTTA CTGACTCGCT ACCTTCGAAT TCACCCCCAG 7140 AGTTGGGTGC ACCAGATTGC CCTGAGGATG GAGGTTCTGG GCTGCGAGGC ACAGGACCTC 7200 TACTGAGGGT GGCCACTGCA GCACCTGCCA CTGCCGTCAC CTCTCCCTCC TCAGCTCCAG 7260 GGCAGTGTCC CTCCCTGGCT TGCCTTCTAC CTTTGTGCTA AATCCTAGCA GACACTGCCT 7320 TGAAGCCTCC TGAATTAACT ATCATCAGTC CTGCATTTCT TTGGTGGGGG GCCAGGAGGG 7380 TGCATCCAAT TTAACTTAAC TCTTACCTAT TTTCTGCAGC TGCTCCCAGA TTACTCCTTC 7440 CTTCCAATAT AACTAGGCAA AAAGAAGTGA GGAGAAACCT GCATGAAAGC ATTCTTCCCT 750.0 GAAAAGTTAG GCCTCTCAGA GTCACCACTT CCTCTGTTGT AGAAAAACTA TGTGATGAAA 7560 CTTTGAAAAA GATATTTATG ATGTTAACAT TTCAGGTTAA GCCTCATACG TTTAAAATAA 7620 AACTCTCAGT TGTTTATTAT CCTGATCAAG CATGGAACAA AGCATGTTTC AGGATCAGAT 7680 CAATACAATC TTGGAGTCAA AAGGCAAATC ATTTGGACAA TCTGCAAAAT GGAGAGAATA 7740 CAATAACTAC TACAGTAAAG TCTGTTTCTG CTTCCTTACA CATAGATATA ATTATGTTAT 7800 TTAGTCATTA TGAGGGGCAC ATTCTTATCT CCAAAACTAG CATTCTTAAA CTGAGAATTA 7860 TAGATGGGGT TCAAGAATCC CTAAGTCCCC TGAAATTATA TAAGGCATTC TGTATAAATG 7920 CAAATGTGCA TTTTTCTGAC GAGTGTCCAT AGATATAAAG CCATTGGTCT TAATTCTGAC 7980 CAATAAAAAA ATAAGTCAGG AGGATGCAAT TGTTGAAAGC TTTGAAATAA AATAACATGT 8040 CTTCTTGAAA TTTGTGATGG CCAAGAAAGA AAATGATGAT GACATTAGGC TTCTAAAGGA 8100 74

CATACATTTA

TACAAACTTT

CTGAAAATAA

GTCCTACTTA

GAAAAAACAC

CCCCATAAGA

CTACACAGAA

TGGAGGAAGC

AAAGAAAAAT

GAGTATTTTC

CTGTCACAGT

AAGTTCTTAA

CGGTAGAGGA

AATCTTATTT

TGGAACTAGC

ACACATACA

ATATTTCTGT

GTAATTCTAA

CACAACAAAA

CATAGTTGAA

TCCAGTCTGC

TTGTGAAGGG

CTCTCCTGAT

ATCCAAAGAC

GGATCCCAAT

TAATAATCCT

ATAGTCACAA

AGTTTAGAGG

GTTAACCCCA

TGGCATTCTT

TCTTTTATTT

GGAAATATGA

TAATGCACTC

ATGTAACAGG

ATATCAAGGA

CATATCACCA

TTTACTGCTC

AGTAAAGGGG

TGCAACCCAG

CTGAGAAAAG

GCTTGACCCT

TCCACAAATG

CTAACTTACA

AAGGTGATAT

TTCCCATTGA

TCCTGCTGGT

GGAAAATCCA

AGTTTACTCT

GGAAATTATA

GGTCAGAAGA

CACAATAGGA

CTTCCATCTG

GCTGGAGGCA

GGCAAATGGA

GCAAAAGAAT

TATCTGACCT

ATGCAGGTGC

GAAATGAATA

GGTTTTATTT

CTATATACAT

TTCTTCAGTA

TGGTTATCTG

CTCCCTCTAC

TACCGTGACT

AAATTGGACT

TCCCCCTTCT

CCTGCACCCC

AGGATAAGTT

AAACAGGAGA

GGCTACTTTT

CTTTGGAAAC

AAATGGTTTA

AGTTGTTTTG

CCTGTTATGT

CTCTATTTCT

ATGAGTTAAA

AGATAGGAGA

TAATTTCCTG

GAAAACTAGA

GGTGAAAACA

TGCCCTCCAC

TTCACTATGA

ATAGAGCAGT

TCCTAATATG

TTCTATGCTG

TATAACATAG

TAGCCCTGTG

TTTTATAGCC

TTAACTTGAT

CAAATGTTCA

TAAAACATTG

8220 8280 8340 8400 8460 8520 8580 8640 8700 8760 8820 8880 8940 9000 9009 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 2332 arainoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: SIM

(iv) SENTIDO INVERSO: NÃO 75 (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo Sapiens (F) TIPO DE TECIDO: Sequência de ADNc de fígado (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Vai Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Met Gin Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Vai Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30 Arg Vai Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Vai Vai Tyr Lys Lys 35 40 45 Thr Leu Phe Vai Glu Phe Thr Vai His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro 50 55 60 Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gin Ala Glu Vai 65 70 75 80 Tyr Asp Thr Vai Vai Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Vai 85 90 95 Ser Leu His Ala Vai Gly Vai Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala 100 105 110 Glu Tyr Asp Asp Gin Thr Ser Gin Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Vai 115 120 125 Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Vai Trp Gin Vai Leu Lys Glu Asn 130 135 140 Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser 145 150 155 160 His Vai Asp Leu Vai Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu 165 170 175 Leu Vai Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gin Thr Leu 180 185 190 His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Vai Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp 195 200 205 His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gin Asp Arg Asp Ala Ala Ser 210 215 220 76 Γ ^ ^^

Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Vai Asn Gly Tyr Vai Asn Arg 225 230 235 240 Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Vai Tyr Trp His 245 250 255 Vai Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Vai His Ser Ile Phe Leu Glu 260 265 270 Gly His Thr Phe Leu Vai Arg Asn His Arg Gin Ala Ser Leu Glu Ile 275 280 285 Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gin Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly 290 295 300 Gin Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gin His Asp Gly Met 305 310 315 320 Glu Ala Tyr Vai Lys Vai Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gin Leu Arg 325 330 335 Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp 340 345 350 Ser Glu Met Asp Vai Vai Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe 355 360 365 Ile Gin Ile Arg Ser Vai Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Vai His 370 375 380 Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Vai Leu 385 390 395 400 Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gin Tyr Leu Asn Asn Gly Pro 405 410 415 Gin Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Vai Arg Phe Met Ala Tyr Thr 420 425 430 Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gin His Glu Ser Gly Ile 435 440 445 Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Vai Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile 450 455 460 Phe Lys Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile 465 470 475 480 Thr Asp Vai Arq Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Vai Lys 485 490 495 77 t Γ

His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys 500 505 510 Trp Thr Vai Thr Vai Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525 Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Vai Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala 530 535 540 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Vai Asp 545 550 555 560 Gin Arg Gly Asn Gin Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Vai Ile Leu Phe 565 570 575 Ser Vai Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gin 580 585 590 Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Vai Gin Leu Glu Asp Pro Glu Phe 595 600 605 Gin Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Vai Phe Asp Ser 610 615 620 Leu Gin Leu Ser Vai Cys Leu His Glu Vai Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu 625 630 635 640 Ser Ile Gly Ala Gin Thr Asp Phe Leu Ser Vai Phe Phe Ser Gly Tyr 645 650 655 Thr Phe Lys His Lys Met Vai Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 660 665 670 Phe Ser Gly Glu Thr Vai Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp 675 680 685 Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700 Leu Leu Lys Vai Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu 705 710 715 720 Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala 725 730 735 Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gin Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg 740 745 750 Gin Lys Gin Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys 755 760 765 78 Γ

t

Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gin Asn 770 775 780 Vai Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gin Ser Pro Thr Pro 785 790 795 800 His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gin Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe 805 810 815 Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser 820 825 830 Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gin Leu His His Ser Gly Asp Met Vai 835 840 845 Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gin Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly 850 855 860 Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Vai Ser Ser 865 870 875 880 Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala 885 890 895 Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Vai His 900 905 910 Tyr Asp Ser Gin Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro 915 920 925 Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp 930 935 940 Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gin Glu Ser Ser Trp 945 950 955 960 Gly Lys Asn Vai Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys 965 970 975 Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys 980 985 990 Vai Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala 995 1000 1005 Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu Ile Glu Asn 1010 1015 1020 Ser Pro Ser Vai Trp Gin Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr Glu Phe Lys 1025 1030 1035 1040 79

Lys Vai Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp Lys Asn Ala 1045 1050 1055 Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr Thr Ser Ser Lys 1060 1065 1070 Asn Met Glu Met Vai Gin Gin Lys Lys Glu Gly Pro Ile Pro Pro Asp 1075 1080 1085 Ala Gin Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu 1090 1095 1100 Ser Ala Arg Trp Ile Gin Arg Thr His Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser 1105 1110 1115 1120 Gly Gin Gly Pro Ser Pro Lys Gin Leu Vai Ser Leu Gly Pro Glu Lys 1125 1130 1135 Ser Vai Glu Gly Gin Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys Vai Vai Vai 1140 1145 1150 Gly Lys Gly Glu Phe Thr Lys Asp Vai Gly Leu Lys Glu Met Vai Phe 1155 1160 1165 Pro Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu 1170 1175 1180 Asn Asn Thr His Asn Gin Glu Lys Lys Ile Gin Glu Glu Ile Glu Lys 1185 1190 1195 1200 Lys Glu Thr Leu Ile Gin Glu Asn Vai Vai Leu Pro Gin Ile His Thr 1205 1210 1215 Vai Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr 1220 1225 1230 Arg Gin Asn Vai Glu Gly Ser Tyr Glu Gly Ala Tyr Ala Pro Vai Leu 1235 1240 1245 Gin Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys His 1250 1255 1260 Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu Gly Leu 1265 1270 1275 1280 Gly Asn Gin Thr Lys Gin Ile Vai Glu Lys Tyr Ala Cys Thr Thr Arg 1285 1290 1295 Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gin Gin Asn Phe Vai Thr Gin Arg Ser Lys 1300 1305 1310 80

Arg Ala Leu Lys Gin Phe Arg Leu Pro Leu Glu Glu Thr Glu Leu Glu 1315 1320 1325 Lys Arg Ile Ile Vai Asp Asp Thr Ser Thr Gin Trp Ser Lys Asn Met 1330 1335 1340 Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr Gin Ile Asp Tyr Asn Glu Lys 1345 1350 1355 1360 Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gin Ser Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg 1365 1370 1375 Ser His Ser Ile Pro Gin Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys 1380 1385 1390 Vai Ser Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Vai Leu 1395 1400 1405 Phe Gin Asp Asn Ser Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys 1410 1415 1420 Asp Ser Gly Vai Gin Glu Ser Ser His Phe Leu Gin Gly Ala Lys Lys 1425 1430 1435 1440 Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gin 1445 1450 1455 Arg Glu Vai Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Vai Thr Tyr 1460 1465 1470 Lys Lys Vai Glu Asn Thr Vai Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr 1475 1480 1485 Ser Gly Lys Vai Glu Leu Leu Pro Lys Vai His Ile Tyr Gin Lys Asp 1490 1495 1500 Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu Asp Leu 1505 1510 1515 1520 Vai Glu Gly Ser Leu Leu Gin Gly Thr Glu Gly Ala Ile Lys Trp Asn 1525 1530 1535 Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Vai Pro Phe Leu Arg Vai Ala Thr Glu 1540 1545 1550 Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp 1555 1560 1565 Asn His Tyr Gly Thr Gin Ile Pro Lys Glu Glu Trp Lys Ser Gin Glu 1570 1575 1580 81 0 ^

Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser 1585 1590 1595 1600 Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly 1605 1610 1615 Gin Asn Lys Pro Glu Ile Glu Vai Thr Trp Ala Lys Gin Gly Arg Thr 1620 1625 1630 Glu Arg Leu Cys Ser Gin Asn Pro Pro Vai Leu Lys Arg His Gin Arg 1635 1640 1645 Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gin Ser Asp Gin Glu Glu Ile Asp Tyr 1650 1655 1660 Asp Asp Thr Ile Ser Vai Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr 1665 1670 1675 1680 Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser Pro Arg Ser Phe Gin Lys Lys Thr Arg 1685 1690 1695 His Tyr Phe Ile Ala Ala Vai Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser 1700 1705 1710 Ser Ser Pro His Vai Leu Arg Asn Arg Ala Gin Ser Gly Ser Vai Pro 1715 1720 1725 Gin Phe Lys Lys Vai Vai Phe Gin Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr 1730 1735 1740 Gin Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly 1745 1750 1755 1760 Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Vai Glu Asp Asn Ile Met Vai Thr Phe Arg 1765 1770 1775 Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr 1780 1785 1790 Glu Glu Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Vai Lys 1795 1800 1805 Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Vai Gin His His Met Ala 1810 1815 1820 Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp 1825 1830 1835 1840 Vai Asp Leu Glu Lys Asp Vai His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu 1845 1850 1855 82

Vai Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gin Vai Thr 1860 1865 1870 Vai Gin Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser 1875 1880 1885 Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn 1890 1895 1900 Ile Gin Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala 1905 1910 1915 1920 Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Vai Met Ala Gin 1925 1930 1935 Asp Gin Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn 1940 1945 1950 Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Vai Phe Thr Vai Arg Lys . Lys 1955 1960 1965 Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Vai Phe Glu 1970 1975 1980 Thr Vai Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Vai Glu Cys 1985 1990 1995 2000 Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Vai 2005 2010 2015 Tyr Ser Asn Lys Cys Gin Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile 2020 2025 2030 Arg Asp Phe Gin Ile Thr Ala Ser Gly Gin Tyr Gly Gin Trp Ala Pro 2035 2040 2045 Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr 2050 2055 2060 Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Vai Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile 2065 2070 2075 2080 Ile His Gly Ile Lys Thr Gin Gly Ala Arg Gin Lys Phe Ser Ser Leu 2085 2090 2095 Tyr Ile Ser Gin Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp 2100 2105 2110 Gin Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Vai Phe Phe Gly 2115 2120 2125 83

Asn Vai Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile 2130 2135 2140 Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser 2145 2150 2155 2160 Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met 2165 2170 2175 Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gin Ile Thr Ala 2180 2185 2190 Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala 2195 2200 2205 Arg Leu His Leu Gin Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gin Vai Asn 2210 2215 2220 Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gin Vai Asp Phe Gin Lys Thr Met Lys Vai 2225 2230 2235 2240 Thr Gly Vai Thr Thr Gin Gly Vai Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr 2245 2250 2255 Vai Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gin Asp Gly His Gin Trp Thr 2260 2265 2270 Leu Phe Phe Gin Asn Gly Lys Vai Lys Vai Phe Gin Gly Asn Gin Asp 2275 2280 2285 Ser Phe Thr Pro Vai Vai Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg 2290 2295 2300 Tyr Leu Arg Ile His Pro Gin Ser Trp Vai His Gin Ile Ala Leu Arg 2305 2310 2315 2320 Met Glu Vai Leu Gly Cys Glu Ala Gin Asp Leu Tyr 2325 2330 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 1130 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 84

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SENTIDO INVERSO: NAO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Porcino (F) TIPO DE TECIDO: Sangue (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 1 . . 1130 (C) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "ADNc que codifica para o domínio A2 do factor VIII de porcino" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:3: TAAGCACCCT AAGACGTGGG TGCACTACAT CTCTGCAGAG GAGGAGGACT GGGACTACGC 60 CCCCGCGGTC CCCAGCCCCA GTGACAGAAG TTATAAAAGT CTCTACTTGA ACAGTGGTCC 120 TCAGCGAATT GGTAGGAAAT ACAAAAAAGC TCGATTCGTC GCTTACACGG ATGTAACATT 180 TAAGACTCGT AAAGCTATTC CGTATGAATC AGGAATCCTG GGACCTTTAC TTTATGGAGA 240 AGTTGGAGAC ACACTTTTGA TTATATTTAA GAATAAAGCG AGCCGACCAT ATAACATCTA 300 CCCTCATGGA ATCACTGATG TCAGCGCTTT GCACCCAGGG AGACTTCTAA AAGGTTGGAA 360 ACATTTGAAA GACATGCCAA TTCTGCCAGG AGAGACTTTC AAGTATAAAT GGACAGTGAC 420 TGTGGAAGAT GGGCCAACCA AGTCCGATCC TCGGTGCCTG ACCCGCTACT ACTCGAGCTC 480 CATTAATCTA GAGAAAGATC TGGCTTCGGG ACTCATTGGC CCTCTCCTCA TCTGCTACAA 540 AGAATCTGTA GACCAAAGAG GAAACCAGAT GATGTCAGAC AAGAGAAACG TCATCCTGTT 600 TTCTGTATTC GATGAGAATC AAAGCTGGTA CCTCGCAGAG AATATTCAGC GCTTCCTCCC 660 CAATCCGGAT GGATTACAGC CCCAGGATCC AGAGTTCCAA GCTTCTAACA TCATGCACAG 720 CATCAATGGC TATGTTTTTG ATAGCTTGCA GCTGTCGGTT TGTTTGCACG AGGTGGCATA 780 85 840 840 900 960 1020 1080 1130

CTGGTACATT CTAAGTGTTG GAGCACAGAC GGACTTCCTC TCCGTCTTCT TCTCTGGCTA CACCTTCAAA CACAAAATGG TCTATGAAGA CACACTCACC CTGTTCCCCT TCTCAGGAGA AACGGTCTTC ATGTCAATGG AAAACCCAGG TCTCTGGGTC CTAGGGTGCC ACAACTCAGA CTTGCGGAAC AGAGGGATGA CAGCCTTACT GAAGGTGTAT AGTTGTGACA GGGACATTGG TGATTATTAT GACAACACTT ATGAAGATAT TCCAGGCTTC TTGCTGAGTG GAAAGAATGT CATTGAACCC AGAAGCTTTG CCCAGAATTC AAGACCCCCT AGTGCGAGCA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 368 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: SIM

(iv) SENTIDO INVERSO: NÃO

(v) TIPO DE FRAGMENTO. Terminal-N (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Porcino (F) TIPO DE TECIDO: Baço (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Proteína (B) LOCALIZAÇÃO: 1 . . 386 (C) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Sequência de aminoácidos prevista do domínio A2 do factor VIII de 86 π

porcino, definida como resíduos homólogos à sequência de aminoácidos 373-740 do factor VIII humano" (os resíduos 1-4 são de uma sequência de aminoácidos de porcino conhecida) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4:

Ser Vai Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Vai His Tyr Ile Ser Ala 1 5 10 15 Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Ala Vai Pro Ser Pro Ser Asp 20 25 30 Arg Ser Tyr Lys Ser Leu Tyr Leu Asn Ser Gly Pro Gin Arg Ile Gly 35 40 45 Arg Lys Tyr Lys Lys Ala Arg Phe Vai Ala Tyr Thr Asp Vai Thr Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Lys Ala Ile Pro Tyr Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu 65 70 75 80 Leu Tyr Gly Glu Vai Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Lys 85 90 95 Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile Thr Asp Vai Ser 100 105 110 Ala Leu His Pro Gly Arg Leu Leu Lys Gly Trp Lys His Leu Lys Asp 115 120 125 Met Pro Ile Leu Pro Gly Glu Thr Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Vai Thr 130 135 140 Vai Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr 145 150 155 160 Tyr Ser Ser Ser Ile Asn Leu Glu Lys Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile 165 170 175 Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Vai Asp Gin Arg Gly Asn 180 185 190 Gin Met Met Ser Asp Lys Arg Asn Vai Ile Leu Phe Ser Vai Phe Asp 195 200 205 Glu Asn Gin Ser Trp Tyr Leu Ala Glu Asn Ile Gin Arg Phe Leu Pro 210 215 220 87

Asn Pro Asp Gly Leu Gin Pro Gin Asp Pro Glu Phe Gin Ala Ser Asn 225 230 235 240 Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Vai Phe Asp Ser Leu Gin Leu Ser 245 250 255 Vai Cys Leu His Glu Vai Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu Ser Vai Gly Ala 260 265 270 Gin Thr Asp Phe Leu Ser Vai Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His 275 280 285 Lys Met Vai Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu 290 295 300 Thr Vai Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp Vai Leu Gly Cys 305 310 315 320 His Asn Ser Asp Leu Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Vai 325 330 335 Tyr Ser Cys Asp Arg Asp Ile Gly Asp Tyr Tyr Asp Asn Thr Tyr Glu 340 345 350 Asp Ile Pro Gly Phe Leu Leu Ser Gly Lys Asn Vai Ile Glu Pro Arg 355 360 365 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 7493 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SENTIDO INVERSO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: 88 f (A) ORGANISMO: Mus musculus (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: unidade_repetição (B) LOCALIZAÇÃO: 1 . . 407 (C) OUTRA INFORMAÇÃO: /tipo_rpt= "terminal" /nota= "5'UTR" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica_misc (B) LOCALIZAÇÃO: 7471 . . 7476 (C) OUTRA INFORMAÇÃO: /função= "sinal_PoliA" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: unidade_repetição (B) LOCALIZAÇÃO: 7368 . . 7493 (C) OUTRA INFORMAÇÃO: /tipo_rpt= "terminal" /nota= "3'UTR" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica_misc (B) LOCALIZAÇÃO: 408 . . 7367 (C) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto= "Factor VIII de coagulação"

(x) INFORMAÇÃO PARA PUBLICAÇÃO (A) AUTORES: Elder, F.

Lakich, D.

Gitschier, J. (B) TÍTULO: Sequência de ADNc do factor VIII de murídeo (C) REVISTA: Genomics 89

(D) VOLUME: 16 (F) PÁGINAS: 374-379 (G) DATA: 1993 (K) RESÍDUOS RELEVANTES NA SEQ ID NO:5: DE 1 A 7476 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5: TCTAGAGTTT CTTTGCTACA GGTACCAAGG AACAGTCTTT TAGAATAGGC TAGGAATTTA 60 AATACACCTG AACGCCCCTC CTCAGTATTC TGTTCCTTTT CTTAAGGATT CAAACTTGTT 120 AGGATGCACC CAGCAGGAAA TGGGTTAAGC CTTAGCTCAG CCACTCTTCC TATTCCAGTT 180 TTCCTGTGCC TGCTTCCTAC TACCCAAAAG GAAGTAATCC TTCAGATCTG TTTTGTGCTA 240 ATGCTACTTT CACTCACAGT AGATAAACTT CCAGAAAATC CTCTGCAAAA TATTTAGGAC 300 TTTTTACTAA ATCATTACAT TTCTTTTTGT TCTTAAAAGC TAAAGTTATT TTAGAGAAGA 360 GTTAAATTTT CATTTCTTTA GTTGAACATT TTCTAGTAAT AAAAGCCATG CAAATAGCAC 420 TCTTCGCTTG CTTCTTTCTG AGCCTTTTCA ATTTCTGCTC TAGTGCCATC AGAAGATACT 480 ACCTTGGTGC AGTGGAATTG TCCTGGAACT ATATTCAGAG TGATCTGCTC AGTGTGCTGC 540 ATACAGACTC AAGATTTCTT CCTAGAATGT CAACATCTTT TCCATTCAAC ACCTCCATCA 600 TGTATAAAAA GACTGTGTTT GTAGAGTACA AGGACCAGCT TTTCAACATT GCCAAGCCCA 660 GGCCACCCTG GATGGGTTTG CTAGGTCCTA CCATTTGGAC TGAGGTTCAT GACACAGTGG 720 TCATTACACT TAAAAACATG GCTTCTCATC CTGTCAGTCT TCATGCTGTT GGTGTGTCCT 780 ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GATGAATATG AAGATCAGAC AAGCCAAATG GAGAAGGAAG 840 ATGATAAAGT TTTCCCTGGT GAAAGTCATA CTTATGTTTG GCAAGTCCTG AAAGAGAATG 900 GTCCAATGGC CTCTGACCCT CCATGTCTCA CTTACTCATA TATGTCTCAT GTGGATCTGG 960 TGAAAGATTT GAATTCAGGC CTCATTGGAG CTCTGCTAGT ATGTAAAGAA GGCAGTCTCT 1020 CCAAAGAAAG AACACAGATG TTGTACCAAT TTGTACTGCT TTTTGCTGTA TTTGATGAAG 1080 GGAAGAGCTG GCACTCAGAA ACAAACGACT CTTATACACA GTCTATGGAT TCTGCATCTG 1140 CTAGAGACTG GCCTAAAATG CACACAGTCA ATGGCTATGT AAACAGGTCT CTTCCAGGTC 1200 TGATTGGATG CCATAGGAAA TCAGTCTACT GGCACGTGAT TGGAATGGGC ACCACTCCTG 1260 AAATACACTC AATATTCCTC GAAGGTCACA CATTTTTTGT GAGGAACCAC CGTCAAGCTT 1320 90 y CATTGGAGAT ATCACCAATA ACTTTCCTTA CTGCTCAAAC ACTCTTGATA GATCTTGGGC 1380 AGTTCCTACT ATTTTGTCAT ATCTCTTCCC ATAAACATGA TGGCATGGAA GCTTATGTCA 1440 AAGTAGATAG CTGCCCTGAG GAATCCCAAT GGCAAAAGAA AAATAATAAT GAGGAAATGG 1500 AAGATTATGA TGATGATCTT TATTCAGAAA TGGATATGTT CACATTGGAT TATGACAGCT 1560 CTCCTTTTAT CCAAATTCGC TCGGTTGCTA AAAAGTACCC TAAAACTTGG ATACATTATA 1620 TTTCTGCTGA GGAGGAAGAC TGGGACTATG CACCTTCAGT TCCTACCTCG GATAATGGAA 1680 GTTATAAAAG CCAGTATCTG AGCAATGGTC CTCATCGGAT TGGTAGGAAA TATAAAAAAG 1740 TCAGATTTAT AGCATACACA GATGAAACCT TTAAGACTCG TGAAACTATT CAGCATGAAT 1800 CAGGACTCTT GGGACCTTTA CTTTATGGAG AAGTTGGAGA CACACTGTTG ATTATTTTTA 1860 AGAATCAAGC AAGCCGACCA TATAACATTT ACCCTCATGG AATCACTGAT GTCAGTCCTC 1920 TACATGCAAG GAGATTGCCA AGAGGTATAA AGCACGTGAA GGATTTGCCA ATTCATCCAG 1980 GAGAGATATT CAAGTACAAG TGGACAGTTA CAGTAGAAGA TGGACCAACT AAATCAGATC 2040 CACGGTGCCT GACCCGCTAT TATTCAAGTT TCATTAACCC TGAGAGAGAT CTAGCTTCAG 2100 GACTGATTGG CCCTCTTCTC ATCTGCTACA AAGAATCTGT AGATCAAAGG GGAAACCAGA 2160 TGATGTCAGA CAAAAGAAAT GTCATCCTGT TTTCTATATT TGATGAGAAC CAAAGCTGGT 2220 ACATCACAGA GAACATGCAA CGCTTCCTCC CCAATGCAGC TAAAACACAG CCCCAGGACC 2280 CTGGGTTCCA GGCCTCCAAC ATCATGCACA GCATCAATGG CTATGTTTTT GATAGCTTGG 2340 AGTTGACAGT TTGTTTGCAT GAGGTGGCAT ACTGGCACAT TCTCAGTGTT GGAGCACAGA 2400 CAGACTTCTT ATCTATCTTC TTCTCTGGAT ATACTTTCAA ACACAAAATG GTCTATGAAG 2460 ATACACTTAC CCTGTTCCCA TTCTCAGGAG AAACTGTCTT TATGTCGATG GAAAACCCAG 2520 GTCTATGGGT CTTGGGGTGT CATAATTCAG ACTTTCGGAA GAGAGGTATG ACAGCATTGC 2580 TGAAAGTTTC TAGTTGTGAC AAGAGCACTA GTGATTATTA TGAAGAAATA TATGAAGATA 2640 TTCCAACACA GTTGGTGAAT GAGAACAATG TCATTGATCC CAGAAGCTTC TTCCAGAATA 2700 CAAATCATCC TAATACTAGG AAAAAGAAAT TCAAAGATTC CACAATTCCA AAAAATGATA 2760 TGGAGAAGAT TGAGCCTCAG TTTGAAGAGA TAGCAGAGAT GCTTAAAGTA CAGAGTGTCT 2820 CAGTTAGTGA CATGTTGATG CTCTTGGGAC AGAGTCATCC TACTCCACAT GGCTTATTTT 2880 TATCAGATGG CCAAGAAGCC ATCTATGAGG CTATTCATGA TGATCATTCA CCAAATGCAA 2940 TAGACAGCAA TGAAGGCCCA TCTAAAGTGA CCCAACTCAG GCCAGAATCC CATCACAGTG 3000 AGAAAATAGT ATTTACTCCT CAGCCCGGCC TCCAGTTAAG ATCCAATAAA AGTTTGGAGA 3060 91

CAACTATAGA

TAATGACTAC

CAGGATTTCC

AGAAAGCATA

ATTCCAACAT

TATTATCAAT

TGACCAAAGA

ATAATCATTC

GTACAACAGA

CTTTGATTCA

TGCTAAATAG

CTATTCCACA

AATCTTCAAA

ATAGTCCAAA

TGTCAGAGAA

AAGACATGGC

AAAATGGTAG

TTGAAGAGAA

AAGACATATT

TACTTCAAAA

ATTTCTTTAA

GAGAAATGGT

CTTTGGGACA

GTATCATTAA

TATCAGATTC

TAAAAACATC

CTCATGTTCA

AAAGCAATAA

GGAATATGTT

AGTAAAGTGG AACAATTCTG AGATATGCCA TTCCCTTGTT ATTGGATTCA AGAGAATGAT TAATACTTTA AACAACTAAT CTTGCAAGAT TGATGGAACA AACTACCTCA AGATGAAGAG TTGGTTTAAA GCAATTAGTA AAATAAAGTC TTTTCCACAT GCACAATCAA AGTAGTTTTG GATACTAGGC CAT CACAT CA AAGAAGGAAG AAAAAACTAT ATTCAGACTG ACAGATAGAC TTCTGTGATT AGCATTTCCA AGCATCATCC TTTCTTAAAA CATAGATCAA

AAGAAACTTG

TCAGACAATT

GTTCACTCTA

GGGTCTCATG

ACTTTAATGT

AGATTACTCA

TTCAAAGACA

GAAAAACTAC

GCCATATTAA

CTTTTAGGCA

ACAAAAAATA

AATACAATCA

AAGACCAATG

TATTTAATGT

ACAGTAGAAC

AATATGAGCA

GAAAAAAATA

CCCCAGGTGC

ACTAGGCAAA

ATAAACAATT

GACAAGGAAA

CCAAGCCAGA

TCAACTCAAT

CACAGCAAGG

AAAAGCACCA

CCAATAGATC

TACATTTATG

GAAACCAAAA

GGAAAATTTA

GTTTGCAAGT TGAAAGCAAC GTAGTAAATT TACCTTTAAA ATAGTCAAGA GAGAGAAGAG ATGTCTCCTT ACACTGAGAG AGGTCAATAG AAAATTCTAC AAGACATATT TGCCATTTTC GAAATAATTC TTAAAAAATA AGGATGGATT TATTTCTTAC TTCAGGAAGA ACGAAGCAAC ATATAAGTTT CAACAAATAC CAAATTCAGA AGAATAT TAC GGCTTAAAAC AAATGAAAAA CTCAGACAAA TCAAAAGGAG ACTTTAAGAC TAAATAACCC CCTCCCCAGG

TTCTAGTTTG

TTTTGAAAAG

AAGTACTACT

CGCGAGTGAA

AAGTTTACCA

GTTTCATGGA

AATGAAAACA

CCCAACATCA

TGAGATTCAA

ATATTTGAGA

TCATAGAAAA

CAAGATGTTG

CTTGAACTCT

TGTAAAAAAT

TACAAAGAAC

CACTTTGTCT

GATAGAGAAG

TGGCTCTAAG

ATATGAAGTA

AGTACAGATT

AGGCTTGGTA

TACTCAACGT

CATAAACTGT

GTTCATTACT

TAGTTCTGAC

TCCATTCCAA

AAAAAGTTCA

TTCTTTAGCC

GAAAAGTAAC

CCAAGTAATC ACAGATTCTT GCATTTGGTA GAAAATAGTG AGAGATAATA ATTGCTTTAT AACAAAACAT ATTGAGAATA GAAGTAACAG CTAAACCATA GATGAAGATC TTCTTGTCAG GAGCAAGAAC CAAAGTTTCT ATAGGACTTA AACGTACATG GAAGCACTAA AATTTCTTGA CATGTACCAG CACATGGAGC AATAAAACCA AGTAAACGGG TCAACACAGT AAATCTTCCT TCACACATTG AACAAATTTT AGAAT T CAAG ATTCTACCAT ACAAACTCAG

3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 92 TCACATATAA GAAACGTGAG AACATTATTT TCTTGAAACC AACTTTGCCT GAAGAATCTG 4860 GCAAAATTGA ATTGCTTCCT CAAGTTTCCA TTCAAGAGGA AGAAATTTTA CCTACAGAAA 4920 CTAGCCATGG ATCTCCTGGA CACTTGAATC TCATGAAAGA GGTCTTTCTT CAGAAAATAC 4980 AGGGGCCTAC TAAATGGAAT AAAGCAAAGA GGCATGGAGA AAGTATAAAA GGTAAAACAG 5040 AGAGCTCTAA AAATACTCGC TCAAAACTGC TAAATCATCA TGCTTGGGAT TATCATTATG 5100 CTGCACAGAT ACCAAAAGAT ATGTGGAAAT CCAAAGAGAA GTCACCAGAA ATTATATCCA 5160 TTAAGCAAGA GGACACCATT TTGTCTCTGA GGCCTCATGG AAACAGTCAT TCAATAGGGG 5220 CAAATGAGAA ACAAAATTGG CCTCAAAGAG AAACCACTTG GGTAAAGCAA GGCCAAACTC 5280 AAAGGACATG CTCTCAAATC CCACCAGTGT TGAAACGACA TCAAAGGGAA CTTAGTGCTT 5340 TTCAATCAGA ACAAGAAGCA ACTGACTATG ATGATGCCAT CACCATTGAA ACAATCGAGG 5400 ATTTTGACAT TTACAGTGAG GACATAAAGC AAGGTCCCCG CAGCTTTCAA CAGAAAACAA 5460 GGCACTATTT TATTGCAGCT GTGGAACGAC TCTGGGACTA TGGGATGAGT ACATCTCATG 5520 TTCTACGAAA TAGGTATCAA AGTGACAATG TACCTCAGTT CAAGAAAGTA GTTTTCCAGG 5580 AATTTACTGA TGGCTCCTTT AGTCAGCCCT TATATCGTGG AGAATTAAAT GAACACCTGG 5640 GGTTGTTGGG CCCATATATA AGAGCAGAAG TTGAAGACAA CATTATGGTA ACTTTCAAAA 5700 ACCAGGCCTC CCGTCCCTAC TCCTTCTATT CTAGCCTCAT TTCTTATAAA GAAGATCAGA 5760 GAGGAGAAGA ACCTAGAAGA AACTTTGTCA AGCCTAATGA AACCAAAATT TATTTTTGGA 5820 AAGTACAACA TCATATGGCA CCCACAGAAG ATGAGTTTGA CTGCAAGGCC TGGGCTTATT 5880 TCTCTGATGT TGATCTTGAA AGAGATATGC ACTCGGGATT AATTGGACCC CTTCTGATTT 5940 GCCACGCGAA CACACTGAAT CCTGCTCATG GGAGACAAGT GTCAGTACAG GAATTTGCTC 6000 TGCTTTTCAC TATCTTTGAT GAGACCAAGA GCTGGTACTT CACTGAAAAC GTGAAAAGGA 6060 ACTGCAAGAC ACCCTGCAAT TTCCAGATGG AAGACCCCAC TTTGAAAGAG AATTATCGCT 6120 TCCATGCAAT CAATGGTTAT GTAATGGATA CCCTACCAGG CTTAGTAATG GCTCAAGATC 6180 AAAGGATTCG ATGGTATCTT CTCAGCATGG GCAACAATGA GAACATCCAA TCTATTCATT 6240 TCAGTGGACA TGTTTTCACT GTACGGAAAA AAGAGGAGTA TAAAATGGCA GTGTACAACC 6300 TCTACCCAGG TGTTTTTGAG ACTCTGGAAA TGATACCATC CAGAGCTGGA ATATGGCGAG 6360 TAGAATGCCT TATTGGCGAG CACTTACAGG CTGGGATGAG CACTCTTTTT CTGGTGTACA 6420 GCAAGCAGTG TCAGATTCCT CTTGGAATGG CTTCTGGAAG CATCCGTGAT TTCCAGATTA 6480 CAGCTTCAGG ACATTATGGA CAGTGGGCCC CAAACCTGGC AAGACTTCAT TATTCCGGAT 6540 93 CAATCAATGC CTGGAGTACC AAGGAGCCCT TTTCTTGGAT CAAGGTAGAT CTGTTGGCAC 6600 CAATGATTGT TCATGGCATC AAGACTCAGG GTGCTCGTCA GAAATTTTCC AGCCTTTATA 6660 TCTCTCAATT TATCATCATG TATAGCCTGG ATGGGAAGAA GTGGCTGAGT TATCAAGGAA 6720 ATTCCACTGG AACCTTAATG GTTTTCTTTG GCAATGTGGA CTCATCTGGG ATTAAGCATA 6780 ATAGTTTTAA TCCTCCAATT ATTGCTCGAT ATATCCGTTT GCACCCCACT CATTCTAGCA 6840 TCCGTAGTAC TCTTCGCATG GAGTTGATGG GCTGTGATTT AAACAGTTGC AGCATACCAT 6900 TGGGAATGGA AAGTAAAGTA ATATCAGATA CACAAATCAC TGCCTCATCC TACTTCACCA 6960 ACATGTTTGC TACTTGGTCT CCTTCACAAG CTCGACTTCA CCTCCAGGGA AGGACTAATG 7020 CCTGGCGACC TCAGGTGAAT GATCCAAAAC AATGGTTGCA AGTGGACTTA CAAAAGACAA 7080 TGAAAGTCAC TGGAATAATA ACCCAGGGAG TGAAATCTCT CTTTACCAGC ATGTTTGTGA 7140 AAGAGTTCCT TATTTCCAGC AGTCAAGATG GCCATCACTG GACTCAAATT TTATACAATG 7200 GCAAGGTAAA GGTTTTTCAG GGGAATCAGG ACTCATCCAC ACCTATGATG AATTCTCTAG 7260 ACCCACCATT ACTCACTCGC TATCTTCGAA TTCACCCCCA GATCTGGGAG CACCAAATTG 7320 CTCTGAGGCT TGAGATTCTA GGATGTGAGG CCCAGCAGCA ATACTGAGGT AGCCTCTGCA 7380 TCACCTGCTT ATTCCCCTTC CTCAGCTCAA AGATTGTCTT AATGTTTTAT TGCTGTGAAG 7440 AGACACTATG ACCATGGCAA CTCTTTATAA AATAAAGCAT TTAATCAGGG CTT 7493 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 2319 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: SIM

(iv) SENTIDO INVERSO: NÃO 94

(v) TIPO DE FRAGMENTO. Terminal-N (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Mus musculus

(x) INFORMAÇÃO PARA PUBLICAÇÃO (A) AUTORES: Elder, F.

Lakich, D.

Gitschier, J. (B) TÍTULO: Sequência de ADNc do factor VIII de murídeo (C) REVISTA: Genomics (D) VOLUME: 16 (F) PÁGINAS: 374-379 (G) DATA: 1993 (K) RESÍDUOS RELEVANTES NA SEQ ID NO:6: DE 1 A 2319 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6:

Met Gin Ile Ala Leu Phe Ala Cys Phe Phe Leu Ser Leu Phe Asn Phe 1 5 10 15 Cys Ser Ser Ala Ile Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Vai Glu Leu Ser 20 25 30 Trp Asn Tyr Ile Gin Ser Asp Leu Leu Ser Vai Leu His Thr Asp Ser 35 40 45 Arg Phe Leu Pro Arg Met Ser Thr Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Ile 50 55 60 Met Tyr Lys Lys Thr Vai Phe Vai Glu Tyr Lys Asp Gin Leu Phe Asn 65 70 75 80 Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile 85 90 95 Trp Thr Glu Vai His Asp Thr Vai Vai Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala 100 105 110 95

Ser His Pro Vai Ser Leu His Ala Vai Gly Vai Ser Tyr Trp Lys Ala 115 120 125 Ser Glu Gly Asp Glu Tyr Glu Asp Gin Thr Ser Gin Met Glu Lys Glu 130 135 140 Asp Asp Lys Vai Phe Pro Gly Glu Ser His Thr Tyr Vai Trp Gin Vai 145 150 155 160 Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Pro Cys Leu Thr Tyr 165 170 175 Ser Tyr Met Ser His Vai Asp Leu Vai Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu 180 185 190 Ile Gly Ala Leu Leu Vai Cys Lys Glu Gly Ser Leu Ser Lys Glu Arg 195 200 205 Thr Gin Met Leu Tyr Gin Phe Vai Leu Leu Phe Ala Vai Phe Asp Glu 210 215 220 Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Asn Asp Ser Tyr Thr Gin Ser Met 225 230 235 240 Asp Ser Ala Ser Ala Arg Asp Trp Pro Lys Met His Thr Vai Asn Gly 245 250 255 Tyr Vai Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser 260 265 270 Vai Tyr Trp His Vai Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Ile His Ser 275 280 285 Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Phe Vai Arg Asn His Arg Gin Ala 290 295 300 Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gin Thr Leu Leu 305 310 315 320 Ile Asp Leu Gly Gin Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Lys 325 330 335 His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Vai Lys Vai Asp Ser Cys Pro Glu Glu 340 345 350 Ser Gin Trp Gin Lys Lys Asn Asn Asn Glu Glu Met Glu Asp Tyr Asp 355 360 365 Asp Asp Leu Tyr Ser Glu Met Asp Met Phe Thr Leu Asp Tyr Asp Ser 370 375 380 96

Ser Pro Phe Ile Gin Ile Arg Ser Vai Ala Lys Lys Tyr Pro Lys Thr 385 390 395 400 Trp Ile His Tyr Ile Ser Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro 405 410 415 Ser Vai Pro Thr Ser Asp Asn Gly Ser Tyr Lys Ser Gin Tyr Leu Ser 420 425 430 Asn Gly Pro His Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Vai Arg Phe Ile 435 440 445 Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Thr Ile Gin His Glu 450 455 460 Ser Gly Leu Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Vai Gly Asp Thr Leu 465 470 475 480 Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro 485 490 495 His Gly Ile Thr Asp Vai Ser Pro Leu His Ala Arg Arg Leu Pro Arg 500 505 510 Gly Ile Lys His Vai Lys Asp Leu Pro Ile His Pro Gly Glu Ile Phe 515 520 525 Lys Tyr Lys Trp Thr Vai Thr Vai Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 530 535 540 Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Ile Asn Pro Glu Arg 545 550 555 560 Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu 565 570 575 Ser Vai Asp Gin Arg Gly Asn Gin Met Met Ser Asp Lys Arg Asn Vai 580 585 590 Ile Leu Phe Ser Ile Phe Asp Glu Asn Gin Ser Trp Tyr Ile Thr Glu 595 600 605 Asn Met Gin Arg Phe Leu Pro Asn Ala Ala Lys Thr Gin Pro Gin Asp 610 615 62 0 Pro Gly Phe Gin Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Vai 625 630 635 640 Phe Asp Ser Leu Glu Leu Thr Vai Cys Leu His Glu Vai Ala Tyr Trp 645 650 655 97

His Ile Leu Ser Vai Gly Ala Gin Thr Asp Phe Leu Ser Ile Phe Phe 660 665 670 Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Vai Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 675 680 685 Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Vai Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 690 695 700 Gly Leu Trp Vai Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Lys Arg Gly 705 710 715 720 Met Thr Ala Leu Leu Lys Vai Ser Ser Cys Asp Lys Ser Thr Ser Asp 725 730 735 Tyr Tyr Glu Glu Ile Tyr Glu Asp Ile Pro Thr Gin Leu Vai Asn Glu 740 745 750 Asn Asn Vai Ile Asp Pro Arg Ser Phe Phe Gin Asn Thr Asn His Pro 755 760 765 Asn Thr Arg Lys Lys Lys Phe Lys Asp Ser Thr Ile Pro Lys Asn Asp 770 775 780 Met Glu Lys Ile Glu Pro Gin Phe Glu Glu Ile Ala Glu Met Leu Lys 785 790 795 800 Vai Gin Ser Vai Ser Vai Ser Asp Met Leu Met Leu Leu Gly Gin Ser 805 810 815 His Pro Thr Pro His Gly Leu Phe Leu Ser Asp Gly Gin Glu Ala Ile 820 825 830 Tyr Glu Ala Ile His Asp Asp His Ser Pro Asn Ala Ile Asp Ser Asn 835 840 845 Glu Gly Pro Ser Lys Vai Thr Gin Leu Arg Pro Glu Ser His His Ser 850 855 860 Glu Lys Ile Vai Phe Thr Pro Gin Pro Gly Leu Gin Leu Arg Ser Asn 865 870 875 880 Lys Ser Leu Glu Thr Thr Ile Glu Vai Lys Trp Lys Lys Leu Gly Leu 885 890 895 Gin Vai Ser Ser Leu Pro Ser Asn Leu Met Thr Thr Thr Ile Leu Ser 900 905 910 Asp Asn Leu Lys Ala Thr Phe Glu Lys Thr Asp Ser Ser Gly Phe Pro 915 920 925 98

Asp Met Pro Vai His Ser Ser Ser Lys Leu Ser Thr Thr Ala Phe Gly 930 935 940 Lys Lys Ala Tyr Ser Leu Vai Gly Ser His Vai Pro Leu Asn Ala Ser 945 950 955 960 Glu Glu Asn Ser Asp Ser Asn Ile Leu Asp Ser Thr Leu Met Tyr Ser 965 970 975 Gin Glu Ser Leu Pro Arg Asp Asn Ile Leu Ser Ile Glu Asn Asp Arg 980 985 990 Leu Leu Arg Glu Lys Arg Phe His Gly Ile Ala Leu Leu Thr Lys Asp 995 1000 1005 Asn Thr Leu Phe Lys Asp Asn Vai Ser Leu Met Lys Thr Asn Lys Thr 1010 1015 1020 Tyr Asn His Ser Thr Thr Asn Glu Lys Leu His Thr Glu Ser Pro Thr 1025 1030 1035 1040 Ser Ile Glu Asn Ser Thr Thr Asp Leu Gin Asp Ala Ile Leu Lys Vai 1045 1050 1055 Asn Ser Glu Ile Gin Glu Vai Thr Ala Leu Ile His Asp Gly Thr Leu 1060 1065 1070 Leu Gly Lys Asn Ser Thr Tyr Leu Arg Leu Asn His Met Leu Asn Arg 1075 1080 1085 Thr Thr Ser Thr Lys Asn Lys Asp Ile Phe His Arg Lys Asp Glu Asp 1090 1095 1100 Pro Ile Pro Gin Asp Glu Glu Asn Thr Ile Met Pro Phe Ser Lys Met , 1105 1110 1115 1120 Leu Phe Leu Ser Glu Ser Ser Asn Trp Phe Lys Lys Thr Asn Gly Asn 1125 1130 1135 Asn Ser Leu Asn. Ser Glu Gin Glu His Ser Pro Lys Gin Leu Vai Tyr 1140 1145 1150 Leu Met Phe Lys Lys Tyr Vai Lys Asn Gin Ser Phe Leu Ser Glu Lys 1155 1160 1165 Asn Lys Vai Thr Vai Glu Gin Asp Gly Phe Thr Lys Asn Ile Gly Leu 1170 1175 1180 Lys Asp Met Ala Phe Pro His Asn Met Ser Ile Phe Leu Thr Thr Leu 1185 1190 1195 1200 99

Ser Asn Vai His Glu Asn Gly Arg His Asn Gin Glu Lys Asn Ile Gin 1205 1210 1215 Glu Glu Ile Glu Lys Glu Ala Leu Ile Glu Glu Lys Vai Val Leu Pro 1220 1225 1230 Gin Vai His Glu Ala Thr Gly Ser Lys Asn Phe Leu Lys Asp Ile Leu 1235 1240 1245 Ile Leu Gly Thr Arg Gin Asn Ile Ser Leu Tyr Glu Vai His Val Pro 1250 1255 1260 Vai Leu Gin Asn Ile Thr Ser Ile Asn Asn Ser Thr Asn Thr Val Gin 1265 1270 1275 1280 Ile His Met Glu His Phe Phe Lys Arg Arg Lys Asp Lys Glu Thr Asn 1285 1290 1295 Ser Glu Gly Leu Vai Asn Lys Thr Arg Glu Met Vai Lys Asn Tyr Pro 1300 1305 1310 Ser Gin Lys Asn Ile Thr Thr Gin Arg Ser Lys Arg Ala Leu Gly Gin 1315 1320 1325 Phe Arg Leu Ser. Thr Gin Trp Leu Lys Thr Ile Asn Cys Ser Thr Gin 1330 1335 1340 Cys Ile Ile Lys Gin Ile Asp His Ser Lys Glu Met Lys Lys Phe Ile 1345 1350 1355 1360 Thr Lys Ser Ser Leu Ser Asp Ser Ser Vai Ile Lys Ser Thr Thr Gin 1365 1370 1375 Thr Asn Ser Ser Asp Ser His Ile Vai Lys Thr Ser Ala Phe Pro Pro 1380 1385 1390 Ile Asp Leu Lys Arg Ser Pro Phe Gin Asn Lys Phe Ser His Val Gin 1395 1400 1405 Ala Ser Ser Tyr Ile Tyr Asp Phe Lys Thr Lys Ser Ser Arg Ile Gin 1410 1415 1420 Glu Ser Asn Asn Phe Leu Lys Glu Thr Lys Ile Asn Asn Pro Ser Leu 1425 1430 1435 1440 Ala Ile Leu Pro Trp Asn Met Phe Ile Asp Gin Gly Lys Phe Thr Ser 1445 1450 1455 Pro Gly Lys Ser Asn Thr Asn Ser Vai Thr Tyr Lys Lys Arg Glu Asn 1460 1465 1470 100

Ile Ile Phe Leu Lys Pro Thr Leu Pro Glu Glu Ser Gly Lys Ile Glu 1475 1480 1485 Leu Leu Pro Gin Vai Ser Ile Gin Glu Glu Glu Ile Leu Pro Thr Glu 1490 1495 1500 Thr Ser His Gly Ser Pro Gly His Leu Asn Leu Met Lys Glu Vai Phe 1505 1510 1515 1520 Leu Gin Lys Ile Gin Gly Pro Thr Lys Trp Asn Lys Ala Lys Arg His 1525 1530 1535 Gly Glu Ser Ile Lys Gly Lys Thr Glu Ser Ser Lys Asn Thr Arg Ser 1540 1545 1550 Lys Leu Leu Asn His His Ala Trp Asp Tyr His Tyr Ala Ala Gin Ile 1555 1560 1565 Pro Lys Asp Met Trp Lys Ser Lys Glu Lys Ser Pro Glu Ile Ile Ser 1570 1575 1580 Ile Lys Gin Glu Asp Thr Ile Leu Ser Leu Arg Pro His Gly Asn Ser 1585 1590 1595 1600 His Ser Ile Gly Ala Asn Glu Lys Gin Asn Trp Pro Gin Arg Glu Thr 1605 1610 1615 Thr Trp Vai Lys Gin Gly Gin Thr Gin Arg Thr Cys Ser Gin Ile Pro 1620 1625 1630 Pro Vai Leu Lys Arg His Gin Arg Glu Leu Ser Ala Phe Gin Ser Glu 1635 1640 1645 Gin Glu Ala Thr Asp Tyr Asp Asp Ala Ile Thr Ile Glu Thr Ile Glu 1650 1655 1660 Asp Phe Asp Ile Tyr Ser Glu Asp Ile Lys Gin Gly Pro Arg Ser Phe 1665 1670 1675 1680 Gin Gin Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Vai Glu Arg Leu Trp 1685 1690 1695 Asp Tyr Gly Met Ser Thr Ser His Vai Leu Arg Asn Arg Tyr Gin Ser 1700 1705 1710 Asp Asn Vai Pro Gin Phe Lys Lys Vai Vai Phe Gin Glu Phe Thr Asp 1715 1720 1725 Gly Ser Phe Ser Gin Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu 1730 1735 1740 101 fp L * κ (Γ ^ ^^

Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Vai Glu Asp Asn Ile Met 1745 1750 1755 1760 Vai Thr Phe Lys Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser 1765 1770 1775 Leu Ile Ser Tyr Lys Glu Asp Gin Arg Gly Glu Glu Pro Arg Arg Asn 1780 1785 1790 Phe Vai Lys Pro Asn Glu Thr Lys Ile Tyr Phe Trp Lys Vai Gin His 1795 1800 1805 His Met Ala Pro Thr Glu Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr 1810 1815 1820 Phe Ser Asp Vai Asp Leu Glu Arg Asp Met His Ser Gly Leu Ile Gly 1825 1830 1835 1840 Pro Leu Leu Ile Cys His Ala Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg 1845 1850 1855 Gin Vai Ser Vai Gin Glu Phe Ala Leu Leu Phe Thr Ile Phe Asp Glu 1860 1865 1870 Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Vai Lys Arg Asn Cys Lys Thr 1875 1880 1885 Pro Cys Asn Phe Gin Met Glu Asp Pro Thr Leu Lys Glu Asn Tyr Arg 1890 1895 1900 Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Vai Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Vai 1905 1910 1915 1920 Met Ala Gin Asp Gin Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Asn 1925 1930 1935 Asn Glu Asn Ile Gin Ser Ile His Phe Ser Gly His Vai Phe Thr Vai 1940 1945 1950 Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Vai Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly 1955 1960 1965 Vai Phe Glu Thr Leu Glu Met Ile Pro Ser Arg Ala Gly Ile Trp Arg 1970 1975 1980 Vai Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu Gin Ala Gly Met Ser Thr Leu 1985 1990 1995 2000 Phe Leu Vai Tyr Ser Lys Gin Cys Gin Ile Pro Leu Gly Met Ala Ser 2005 2010 2015 102

Gin

Gly Ser Ile Arg Asp Phe Gin Ile Thr Ala Ser Gly His Tyr Gly 2020 2025 2030

Trp Ala Pro Asn Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala 2035 2040 2045 Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Vai Asp Leu Leu Ala 2050 2055 2060 Pro Met Ile Vai His Gly Ile Lys Thr Gin Gly Ala Arg Gin Lys Phe 2065 2070 2075 2080 Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gin Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly 2085 2090 2095 Lys Lys Trp Leu Ser Tyr Gin Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Vai 2100 2105 2110 Phe Phe Gly Asn Vai Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ser Phe Asn 2115 2120 2125 Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Ser Ser 2130 2135 2140 Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser 2145 2150 2155 2160 Cys Ser Ile Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Vai Ile Ser Asp Thr Gin 2165 2170 2175 Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro 2180 2185 2190 Ser Gin Ala Arg Leu His Leu Gin Gly Arg Thr Asn Ala Trp Arg Pro 2195 2200 2205 Gin Vai Asn Asp Pro Lys Gin Trp Leu Gin Vai Asp Leu Gin Lys Thr 2210 2215 2220 Met Lys Vai Thr Gly Ile Ile Thr Gin Gly Vai Lys Ser Leu Phe Thr 2225 2230 2235 2240 Ser Met Phe Vai Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gin Asp Gly His 2245 2250 2255 His Trp Thr Gin Ile Leu Tyr Asn Gly Lys Vai Lys Vai Phe Gin Gly 2260 2265 2270 Asn Gin Asp Ser Ser Thr Pro Met Met Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu 2275 2280 2285 Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gin Ile Trp Glu His Gin Ile 2290 2295 2300 103

V

ff !

Ala Leu Arg Leu Glu Ile Leu Gly Cys Glu Ala Gin Gin Gin Tyr 2305 2310 2315 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SENTIDO INVERSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7: CCTTCCTTTA TCCAAATACG TAGATCAAGA GGAAATTGAC 40 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO 104 *

(iv) SENTIDO INVERSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8: GTAGCGTTGC CAAGAAGCAC CCTAAGACG 29 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 37 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SENTIDO INVERSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9: GAAGAGTAGT ACGAGTTATT TCTCTGGGTT CAATGAC 37 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 105

I (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SENTIDO INVERSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10: CCTTATCCA AATACGTAGC GTTTGCCAAG AAG 33 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SENTIDO INVERSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:11: AARCAYCCNA ARACNTGGG 19 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases

106 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SENTIDO INVERSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12: GCTCGCACTA GGGGGTCTTG AATTC 25

Lisboa, 30 de Agosto de 2001 O ALENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

107

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de factor VIII híbrida, purificada, que compreende sequências de aminoácidos de mamífero não humano e de humano, em que a molécula tem actividade pro-coagulante num teste de coagulação in vitro e em que a molécula é seleccionada do grupo constituído por factor VIII humano ou de mamífero não humano, compreendendo pelo menos uma sequência específica mais curta do que um domínio que inclui um ou mais aminoácidos únicos de factor VIII de uma espécie substituída pela sequência correspondente de factor VIII de outra espécie, em que a sequência correspondente inclui pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente às posições 484-509 do factor VIII humano, como apresentado na SEQ ID No: 2 e em que o factor VIII híbrido é menos imunoreactivo do que o factor VIII humano com os anticorpos inibidores contra o domínio A2 de factor VIII.
2. Molécula de factor VIII híbrida de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência correspondente de um ou mais aminoácidos de factor VIII de uma espécie, substituída pela sequência específica, incluindo um ou mais aminoácidos únicos do factor VIII, da outra espécie, corresponde à sequência de aminoácidos humana, como apresentado na SEQ ID NO:2, seleccionada do grupo constituído pelos aminoácidos 373-540, 373-509, 445-509 e 404-509.
3. Molécula de factor VIII híbrida, de acordo com a reivindicação 2, em que a molécula é uma molécula híbrida 1

humano/porcino, a sequência correspondente a ser substituída pela sequência específica é humana e a sequência específica é de porcino.
4. Molécula de factor VIII híbrida, de acordo com a reivindicação 1, em que o factor VIII híbrido é útil no tratamento de pacientes humanos com anticorpos contra o factor VIII que inibem a actividade de coagulação.
5. Composição que contém uma molécula de factor VIII híbrida de acordo com a reivindicação 1, em combinação com factores de coagulação seleccionados do grupo constituído pelo factor de von Willebrand, factores de coagulação dependentes de vitamina K e factor de coagulação tecidular.
6. Molécula de factor VIII híbrida de acordo com a reivindicação 1, em que o domínio de mamífero não humano substituído pelo domínio humano correspondente, é o domínio A2 de porcino, ou de murídeo.
7. Molécula de factor VIII híbrida, de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de mamífero não humano substituída pela sequência humana correspondente é de porcino ou de murídeo e a sequência específica de mamífero não humano, incluindo um ou mais aminoácidos únicos substituídos pelos aminoácidos 484-509 de humano, correspondentes, é de murídeo ou de porcino.
8. Molécula de factor VIII híbrida, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, em que a molécula não tem o domínio B. 2
9. Método para a produção de um medicamento para o tratamento de pacientes humanos com deficiência de factor VIII, que compreende a preparação de uma molécula de factor VIII híbrida, como definido por qualquer das reivindicações 1-7.
10. Método para a preparação de factor VIII híbrido, pro-coagulante, purificado, em que o factor VIII híbrido compreende sequências de aminoácidos de murideo ou humanas, compreendendo a substituição de pelo menos uma sequência específica correspondente às posições 484-509 de factor VIII humano, como apresentado na SEQ ID NO: 2, por uma sequência de aminoácidos de factor VIII da outra espécie, correspondente, por mutagénese direccionada para o local, do ácido nucleico codificante.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, para a preparação de moléculas de factor VIII híbridas, de acordo com as reivindicações 1, 2 e 7.
12. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a sequência correspondente de um ou mais aminoácidos de factor VIII de uma espécie, substituídos pela sequência específica incluindo um ou mais aminoácidos únicos de factor VIII da outra espécie, corresponde à sequência de aminoácidos humana apresentada na SEQ ID NO:2, seleccionada a partir do grupo constituído pelos aminoácidos 373-540, 373-509, 445-509 e 404-509.
13. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a sequência específica que inclui um ou mais aminoácidos únicos de factor VIII de uma espécie, substituída pela sequência correspondente, de um ou mais aminoácidos de 3 f L·. factor VIII da outra espécie, inclui um determinante de actividade coagulante.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o factor VIII híbrido tem uma actividade coagulante maior do que o factor VIII humano, quando se utiliza plasma humano como padrão num teste de coagulação in vitro, de uma fase.
15. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a sequência correspondente de um ou mais aminoácidos de factor VIII de uma espécie a ser substituídos pela sequência específica, incluindo um ou mais aminoácidos únicos de factor VIII da outra espécie inclui um local antigénico que reage com anticorpos contra o factor VIII, que inibem a actividade coagulante e em que o factor VIII híbrido é menos imunoreactivo do que o factor VIII humano, com os anticorpos inibidores contra o factor VIII.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-15 que compreende ainda o passo de eliminar o domínio B, para produzir um factor VIII sem domínio B, híbrido.
17. Método para a preparação de factor VIII híbrido, purificado de acordo com a reivindicação 1, em que o factor VIII híbrido compreende sequências de aminoácidos de porcino e humanas, compreendendo os passos de expressar os domínios codificantes de ADN recombinante, seleccionados do grupo constituído por Al, B, A3, Cl e C2, do factor VIII de porcino e humano. 4 L·. ^ compreender ainda a substituição de um ou mais domínios de factor VIII de porcino e humano.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, compreendendo ainda o passo de eliminar o domínio B, para produzir um factor VIII sem dominio B, híbrido.
19. Molécula equivalente a factor VIII híbrido, purificada, compreendendo um factor VIII humano, de mamífero não-humano ou híbrido humano/mamífero não humano, em que a molécula tem actividade procoagulante num teste de coagulação in vitro, compreendendo pelo menos uma sequência sem identidade de sequência conhecida com o factor VIII, substituído por uma sequência de aminoácidos específica, correspondente às posições 484-509 do factor VIII humano, como apresentado na SEQ ID NO: 2, em factor VIII humano, de mamífero não humano ou híbrido humano/mamífero não humano.
20. Molécula equivalente de acordo com a reivindicação 19, com uma actividade procoagulante superior à do factor VIII humano, num teste de coagulação in vitro de uma fase, utilizando plasma humano como padrão.
21. Molécula equivalente de acordo com a reivindicação 19, em que a sequência de aminoácidos específica no factor VIII humano, de mamífero não-humano ou híbrido humano/mamífero não-humano, compreende um epítopo com uma imunoreactividade com anticorpos que inibem a actividade coagulante de factor VIII e em que o factor VIII equivalente, híbrido, tem uma imunoreactividade com os anticorpos reduzida. 5
22. Molécula equivalente de acordo com a reivindicação 19 ou 21, em que a sequência de aminoácidos sem identidade conhecida com o factor VIII, compreende um ou mais residuos de alanina.
23. Molécula equivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, que não possui o domínio B.
24. Método para a preparação de uma molécula de factor VIII híbrido, equivalente, que compreende factor VIII humano, de mamífero não humano ou híbrido humano/mamífero não humano, em que a molécula equivalente tem actividade procoagulante num teste de coagulação in vitro, compreendendo substituição de pelo menos uma sequência sem identidade de sequência conhecida com o factor VIII, por uma sequência de aminoácidos específica, correspondente às posições 484-509 do factor VIII humano, como apresentado na SEQ ID NO:2 no factor VIII humano, de mamífero não-humano, ou híbrido humano/mamífero não-humano.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a sequência de aminoácidos sem identidade de sequência conhecida com o factor VIII, compreende um ou mais resíduos de alanina.
26. Método de acordo com a reivindicação 24, que compreende ainda a substituição de pelo menos uma sequência específica de um ou mais aminoácidos únicos, incluindo um determinante de actividade coagulante do factor VIII de uma espécie, pela sequência correspondente de um ou mais aminoácidos do factor VIII de outra espécie, ou por uma sequência correspondente de um ou mais aminoácidos do factor VIII 6

híbrido, em que a molécula equivalente ao factor VIII híbrido tem uma actividade coagulante superior à do factor VIII humano num teste de coagulação de uma fase, utilizando plasma humano como padrão.
27. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a sequência de aminoácidos específica no factor VIII humano, de mamífero não-humano ou híbrido humano/não-humano, compreende um epítopo com imunoreactividade com anticorpos que inibem a actividade coagulante de factor VIII e em que o factor VIII equivalente, híbrido, tem uma imunoreactividade reduzida com os anticorpos.
28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-27, que compreende ainda a eliminação do domínio B.
29. Proteína de fusão que compreende a molécula de factor VIII híbrida de acordo com a reivindicação 1 ou 19.
30. Sequência de ácidos nucleicos isolado que codifica para uma molécula de factor VIII híbrida humano/mamífero não humano de acordo com a reivindicação 1, em que o factor VIII híbrido é menos imunoreactivo do que o factor VIII humano com anticorpos inibidores contra o factor VIII.
31. Sequência de ácidos nucleicos isolada, de acordo com a reivindicação 30, em que a molécula tem uma actividade específica superior à do factor VIII humano, quando o plasma humano é utilizado como padrão num teste de coagulação de uma fase. 7 Γ u t
32. Sequência de ácidos nucleicos isolada, de acordo com a reivindicação 30, em que a sequência de aminoácidos correspondente de factor VIII de uma espécie, substituída pela sequência específica, incluindo aminoácidos únicos de factor VIII da outra espécie, corresponde à sequência de aminoácidos humana, apresentada na SEQ ID NO:2, seleccionada do grupo constituído pelos aminoácidos 373-540, 373-509 e 445-509.
33. Sequência de ácidos nucleicos isolada de acordo com a reivindicação 30, em que o factor VIII híbrido é útil no tratamento de pacientes humanos com anticorpos contra o factor VIII, que inibem a actividade de coagulação.
34. Sequência de ácidos nucleicos isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30-33, em que a molécula não tem o domínio B.
35. Sequência de ácidos nucleicos isolada, que codifica para uma molécula equivalente ao factor VIII híbrido, de acordo com a reivindicação 19.
36. Sequência de ácidos nucleicos isolada, de acordo com a reivindicação 35, em que a referida molécula equivalente ao factor VIII híbrido tem uma actividade procoagulante superior à do factor VIII humano, num teste de coagulação in vitro de uma fase, utilizando plasma humano como padrão.
37. Sequência de ácidos nucleicos isolada de acordo com a reivindicação 35, em que a sequência de aminoácidos específica no factor VIII humano, de mamífero não-humano ou híbrido humano/mamífero não-humano, compreende um epítopo 8

com imunoreactividade com anticorpos que inibem a actividade coagulante do factor VIII e em que o factor VIII equivalente, híbrido, tem uma imunoreactividade reduzida com os anticorpos.
38. Sequência de ácidos nucleicos isolada, de acordo com a reivindicação 35, em que a sequência de aminoácidos sem identidade de sequência conhecida com o factor VIII, compreende um ou mais resíduos de alanina.
39. Sequência de ácidos nucleicos isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-38, em que a molécula não possui o domínio B.
40. Molécula de factor VIII híbrida, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, 19-23 ou 29 para utilização em medicina.
41. Utilização de uma molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, 19-23 ou 29, para a produção de um medicamento para utilização no tratamento da deficiência de factor VIII.
42. Utilização de acordo com a reivindicação 41, em que a actividade coagulante da molécula híbrida humano/mamífero não-humano, ou híbrido, equivalente, tem uma imunoreactividade reduzida com os anticorpos que inibem a actividade coagulante de factor VIII. 9
43. Utilização de acordo com a reivindicação 42, em que os pacientes se caracterizam pela presença de anticorpos contra o factor VIII. Lisboa, 30 de Agosto de 2001 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL