PT87138B - Processo de preparacao de moleculas de adn recombinante que codificam segmentos de adn, de polipeptidos e de composicoes de anticorpos relacionados com factor tecidual humano - Google Patents

Description

Referência Cruzada a Pedidos Afins

Este pedido é um pedido continuação dos Pedidos co-pendentes N3s. 033 047, depositado em 31 de Março de 1987, e 067 103, depositado em 25 de Junho de 1987.

Campo Técnico presente invento refere-se a uma molécula de ADN recom binante (ADNr) que transporta um gene estrutural que codifica a proteína de factor tecidual humano, de cadeia pesada (huTFh). Mais especificamente, este invento refere-se a um vector de ex. pressão capaz de expressar huTFh em células hospedeiras conteji do esse vector. 0 presente invento refere-se ainda a um análjj go polipéptido, sintético, de huTFh e a anticorpos monoclonais que ligam huTFh e os análogos polipêptidos.

Antecedentes do Invento

A coagulação do sangue envolve uma série de reacçães, em cascata, enzimáticas de co-factor, proteolíticas e de congelação, mediadas por um grupo de proteínas celulares e de plasma conhecidas por factores de coagulação. 0 início desta cascata pode ocorrer quando o receptor celular, conhecido por factor tecidual (TF) liga o factor de coagulação VII ou o seu derivado, factor Vila, para formar um complexo cataliticamente activo. Na ausência de TF e sem uma ligação continuada num comple xo, o factor Vll/VIIa não inicia a coagulação. Assim, a caraç terização química e biológica de TF é evidentemente importante para perceber o mecanismo de coagulação.

factor tecidual é uma glicoprpteína ligada à membrana que não se encontra, normalmente, solúvel na circulação ou acessível às proteínas do plasma, incluindo o factor Vll/VIIa e os outros factores de coagulação. Embora o factor tecidual não seja normalmente expresso na superfície das células que formam a vasculatura, a sua expressão por monócitos na vasculatura pode ser induzida por constituintes de agentes infeccio sos tais como lipopolissacáridos bacterianos, linfoquinas deri

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-3vadas da algumas células T helper estimuladas por antigénio, directamente por algumas células T helper estimuladas, e por complexos imunitários. Alguns mediadores inflamatórios de origem monócito/macrófago, p.e. interleucina 1 e factor de necrose de tumor bem como lipopolissacáridos bacterianos podem estimular células endoteliais que levam da superfície humoral dos vasos sanguíneos, a expressar TF. A expressão de TF nos compartimentos vasculares tem, tipicamente, como resultado a coagulação intravascular disseminada ou o início localizado da obstrução, i.e. a trombogenese.

factor tecidual é constitutivamente expresso na superfície de algumas células extravasculares em cultura in vitro, incluindo fibroblastos, em alguns tipos de células de cérebro ainda não identificados e em certos epitélios que estão separa dos das proteínas do plasma circulante por barreiras de membra na basais. A presença de TF nestas células tem como resultado a formação de um trombo após contacto com o sangue como resultado da lesão do tecido. Assim, o TF é o alicerce sobre o qual se inicia o sistema hemostático.

relatório de Hou/ell, Am. 3. Physiol, 31:1 (1912) foi o primeiro a sugerir que uma preparação de proteína de tecido isolada contendo TF poderia promover a coagulação apenas quando se encontrasse presente como complexo fosfolípido-proteína (lipoproteína)* A reconstituição da actividade procoagulante funcional do TF, por re-lipidação da proteína isolada, tornasse necessária por o isolamento da proteína de tecido contendo TF ter, tipicamente, como resultado a remoção dos fosfolípidos que estão normalmente associados à proteína TF, tendo esta reconstituição sido estudada por vários investigadores. Por exemplo, foi referido que a recuperação da actividade coagulari te é influenciada pelo tipo de fosfolípido, a razão entre fosfolípido e proteína e a composição detergente e iónica da mistura de reconstituição. Ver Nemerson, 3. Clin. Invest., 47-72 (1968); Nemerson, 3. Clin. Invest., 48-322 (1969); e Carson et al., Science, 208:307 (1980).

As preparações de proteína contendo TF tanto isolado como

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-4re-lipidado têm sido preparadas por extracção de tecidos de vái rias espécies. Historicamente, os métodos usados eram difíceis, eram morosos e tinham baixos rendimentos uma vez que o factor tecidual estâ presente apenas em quantidades extremamente peque nas em tecidos que ocorrem naturalmente. Para uma revisão dos métodos clássicos ver Nemerson et al., Prog. Hem. Thromb., 6:237-261 (1982).

Mais recentemente, Broze et al., 3. Biol. Chem., 260:10917-20 (1985), Bom et al., Thromb. Res., 42:635-643 (1986) e Guha et al., Proc. Natl. Açad, Sei, USA, 83:299-302 (1986) relataram o isolamento de proteína de factor tecidual humano (huTF) usan do um método baseado na descoberta de que a proteína de factor tecidual des-lipidada pode ligar o factor Vll/VIIa quando a proteína está solubilizada numa solução aquosa contendo um detergente não iónico e CaCl₂· Contudo, a utilidade deste método, que emprega um sorvente de afinidade por factor Vll/VIIa, como meio de isolar proteína de factor tecidual é limitada não só pela dificuldade em obter quantidades significativas de factor Vll/VIIa isolado como também pela labilidade do factor Vll/VIIa.

Broze et al., supra, sugeriram que o desenvolvimento de anticorpos monoclonais específicos para huTF e a sua utilização como sorventes de imunoafinidade poderia evitar problemas ocasionados pela disponibilidade limitada de factor Vll/VIIa. Contudo, não foram referidos na literatura anticorpos monoclcnais anti-huTF. Além disso, dois anticorpos monoclonais deserj volvidos contra TF bovino /C^ar,son al·» Blood, 662-156 (1985)_7 não imunorreagiram com huTF (Guha et al., supra).

Breve Sumário do Invento

Numa concretização, o presente invento contempla um segmenta de ADN não compreendendo mais do que cerca de 12000 pares de bases dos nucleótidos, incluindo uma sequência definindo um gene estrutural que codifica proteína de factor tecidual humano, de cadeia pesada, (huTFh). Preferivelmente, o g.e ne estrutural codifica uma proteína possuindo uma sequência de

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aminoácidos representada pela Figura 1 desde cerca do resíduo até cerca do resíduo 263. Mais preferivelmente, o gene estrutural tem uma sequência de bases de nucleóticos representada pela Figura 2 desde cerca da base 130 até cerca da base 918.

Nas concretizações preferidas, o segmento de ADN também inclui uma segunda sequência contígua ao terminal 5’ da primei, ra sequência e codifica uma sequência de resíduos de aminoácidos, de comando, ligada ao terminal amino da proteína huTFh. A primeira e segunda sequências de ADN definem em conjunto um g.e ne estrutural compósito que codifica uma proteína precursora de factor tecidual humano, de cadeia pesada (pre-huTFh). Preferivelmente, o gene estrutural compósito codifica uma proteína possuindo uma sequência de resíduos de aminoácidos represeri tada pela Figura 1 desde cerca do resíduo -32 a cerca do resíduo 263. Mais preferivelmente, o gene estrutural compósito tem uma sequência de bases dos nucleótidos representada pela Figura 2 desde cerca da base 34 a cerca da base 918.

Noutra concretização, o presente invento contempla uma molécula de ADN recombinante compreendendo um vector ligado operativamente a um primeiro segmento de ADN que define um gene estrutural que codifica proteína de cadeia pesada do factor tecidual humano. Preferivelmente, a molécula de ADN recombinante inclui ainda um segundo segmento de ADN contíguo ao terminal 5' do primeiro segmento e que codifica uma sequência de resíduos de aminoácidos, de comando, ligada à referida proteína; definindo os referidos primeiro e segundo segmentos de ADN, em conjunto, um gene estrutural compósito que codifica uma forma precursora da referida proteína.

Noutra concretização, o presente invento contempla um análogo polipéptido do sítio de ligação do factor tecidual humano compreendendo não mais de cerca de 50 resíduos de aminoácidos e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácidos que corresponde a uma sequência representada pela fórmula:

-VNQVYT-.

Preferivelmente, o presente invento contempla um análogo polipéptido do sítio de ligação do factor tecidual humano com67 562

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preendendo não mais do que cerca de 50 resíduos de aminoácidos e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a uma sequência representada por uma fórmula seleç cionada do grupo que consiste em:

-VNQVYTVQIST-, e -LYYWRSSSSGKKT-.

Numa outra concretização do presente invento é uma composição de anticorpo que compreende moléculas de anticorpo ) que:

a) imunorreagem com proteína de cadeia pesada de factor | tecidual humano;

b) imunorreagem com um polipéptido representado por uma fórmula seleccionada do grupo que consiste em:

H-EWEPKPVNQl/YT-OH, H-EPKPVNqVYTVQlSTKSGDWKSKC-OH, H-VFGKDLIYTLYYWRSSSSGKKT-OH, H-RDVFGKDLIYTLYYWK-OH

H-IYTLYYWRSSSSGKKTAK-OH, H-SSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSV-OH, H-SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPV-OH,

I H-TKSGDWKSKCTYTTDTECDLTDEIVKDVKQTY-OH,

H-KSGDWKSKC-OH, ¹ H-ECDLTDEIVKDI/KQTY-OH,

H-LARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLC-OH, H-YENSPEFTPYLETNLGQPTiqSFEQVGTKV-OH, e H-qAVIPSRTVNRKSTDSPVEC-OH; e

c) não imunorreagem essencialmente com um polipéptido representado pela fórmula apresentada na Figura 1, desde a posição 204 à posição 226.

Estão também contemplados pelo presente invento os hibri domas TF8-5G9, TF9-10H10, TF9-5B7 e TF9-6B4, bem como composições de anticorpos monoclonais compreendendo moléculas de anti corpo produzidas por esses hibridomas.

presente invento também contempla um método para deter, minar a presença de proteína de cadeia pesada do factor tecidual

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-7humano, numa amostra de fluido corporal, compreendendo os passos de:

a) misturar uma amostra corporal com anticorpos que imunorreagem com proteína de cadeia pesada do factor tecidual humano para formar uma mistura de imunorreacção;

b) conservar a mistura durante um período de tempo suficiente para que os anticorpos imunorreagem com qualquer factor tecidual humano presente na amostra e formem um produto de imunorreacção; e

c) detectar a presença de qualquer produto de imunorrea£ ção formado no passo b.

E também contemplado um método para detectar um trombo, in vivo, compreendendo os passos de:

a) administrar intravenosamente, a um sujeito humano, uma composição de anticorpo monoclonal compreendendo um dilueri te fisiologicamente tolerável e uma quantidade de moléculas de anticorpo produzidas pelo hibridoma TF9-10H10 ligado a um meio indicador in vivo, eficaz na imunorreacção com factor tecidual humano presente num trombo;

b) conservar o sujeito a quem se administrou a composição durante um período de tempo predeterminado, suficiente para que as moléculas de anticorpo imunorreajam com factor tecidual presente, in vivo, como parte de um trombo e formem um produto de imunorreacção; e

c) avaliar a presença de qualquer produto de imunorrea£ ção formado no passo (b).

E ainda contemplado um método para neutralizar a capacidade do factor tecidual humano ligar factor de coagulação Vil/ /Vila, in vivo, que compreende administrar intravenosamente a um sujeito humano uma composição de anticorpo monoclonal compreendendo um diluente fisiologicamente tolerável contendo uma quantidade de moléculas de anticorpo produzidas por um hibrid£ ma seleccionado do grupo consistindo em TF8-5G9 e TF9-6B4 eficaz na ligação ao factor tecidual humano presente.

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-80 presente invento contempla também um método para inibir a ligação de factor tecidual humano a factor de coagulação Vll/VIIa in vivo, compreendendo administrar intravenosamente a um sujeito humano uma composição de polipéptido compreendendo um diluente fisiologicamente tolerável contendo um polipéptido seleccionado do grupo que consiste em:

H-EWEPKPVNQVYT-OH, H-EPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKC-OH, H-VFGKDLIYTLYYWRSSSSGKKT-OH, H-RDVFGKDLIYTLYYWK-OH H-IYTLYYWRSSSSGKKTAK-OH, e H-SSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSV-OH;

estando o referido polipéptido presente na referida composição numa quantidade eficaz para reagir com factor Vll/VIIa.

Numa outra concretização o presente invento contempla um sistema de diagnóstico, sob a forma de conjunto, para determinar a presença numa amostra de proteína de cadeia pesada do factor tecidual humano, compreendendo uma embalagem contendo uma composição de anticorpo deste invanto. Preferivelmente, a composição de anticorpo compreende moléculas de anticorpos monoclonais produzidas por um hibridoma seleccionado do grupo de hibridomas que consiste em:

a) TF8-5G9,

b) TF9-6B4,

c) TF9-10H10 e

d) TF9-5B7.

E também contemplado um método para isolar factor Vil/ /Vila de coagulação do sangue de uma amostra.

método compreende os passos de:

a) misturar a amostra com um suporte sólido compreende^ do um polipéptido da reivindicação 15 fixado a uma matriz sóli. da, formando a referida mistura uma mistura de reacção de liga ção;

b) conservar a referida mistura de reacção de ligação

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-9durante um período de tempo suficiente para que o referido factor de coagulação se ligue ao referido polipéptido e forme um complexo de fase sólida e um sobrenadanteí

c) separar o referido sobrenadante do referido complexo ; e

d) recuperar o referido factor de coagulação do complexo separado no passo c.

E ainda contemplada uma composição compreendendo uma solução aquosa de proteína de cadeia pesada do factor tecidual humano biologicamente activa, substancialmente isenta de proteína de cadeia leve do factor tecidual humano. Preferivelmen te, a proteína de cadeia pesada do factor tecidual humano, bio logicamente activa, é dispersa num fosfolípido ou num detergeri te não iónico.

E também contemplado um sistema de diagnóstico sob a fo_r ma de conjunto (kit) para determinar a capacidade de coagulação numa amostra de fluido do sistema vascular. Ele inclui uma embalagem contendo uma composição, uma solução aquosa de proteína de cadeia pesada do factor tecidual humano, biologicamen te activa, substancialmente isenta de proteína de cadeias leves do factor tecidual humano, estando a referida proteína de cadeia pesada presente numa quantidade suficiente para se realizar pelo menos um teste. Preferivelmente, a proteína de cadeia pesada estâ dispersa num fosfolípido.

Numa outra concretização é contemplado um método de preparação de proteína de cadeia pesada do factor tecidual humano, madura, bem como o produto de expressão da proteína. 0 método inclui os passos de:

a) iniciar uma cultura, num meio nutriente, de células de mamífero transformadas com uma molécula de ADN recombinante compreendendo um vector de expressão compatível com as referidas células, operativamente ligado a um primeiro segmento de ADN que define um gene estrutural codificando uma proteína de cadeia pesada do factor tecidual humano, e um segundo segmento de ADN contíguo ao referido primeiro segmento de ADN e codifi67 562

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-10cando £ uma sequência de comando de resíduos de aminoácidos li. gada à referida proteína; definindo os referidos primeiro e segundo segmentos de ADN, em conjunto, um gene estrutural compósito que codifica uma forma precursora da referida proteína;

b) manter a referida cultura durante um período de tempo suficiente para que as referidas células expressem a proteí. na a partir da referida molécula de ADN recombinante e formem a referida proteína madura; e

c) recuperar a referida proteína madura da referida cul tura.

Breve Sumário dos Desenhos

Nos desenhos que formam uma parte desta divulgação:

a Figura 1 ilustra a sequência de resíduos de aminoácidos completa das formas madura e precursora das proteínas de cadeia pesada do factor tecidual humano (huTFh e pre-huTFh, respectivamente), apresentada da esquerda para a direita e na direcção do terminal amino para o terminal carboxi, usando o código de resíduo de aminoácido de uma única letra. A sequência de resíduos de aminoácidos da forma predominante da proteí. na madura de ocorrência natural está numerada de 1 a 263. A sequência da forma madura menos encontrada inicia-se no resíduo de aminoácido número 3 e termina no resíduo 263.

A sequência dos resíduos de aminoácidos correspondente à sequência de comando (porção precursora) da proteína pre-huTFh que é removida durante o processo de maturação é designada por números negativos. 0 domínio extracelular e a região de ancoragem transmembrana correspondem às posições dos resíduos 1 a 219 e 220 a 242, respectivamente;

a Figura 2 ilustra a sequência de nucleótidos de um ADNc que codifica as proteínas pre-huTFh e huTFh, apresentada da es. querda para a direita e na direcção do terminal 5’ para o terminal 3’ usando o código de base de nucleótido de uma única le tra. 0 gene estrutural para huTFh inicia-se na base 130 e tej? mina na base 918.

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-11A estrutura de leitura é indicada pela colocação da sequência de resíduos de aminoácidos deduzida por cima da sequência de nucleótidos, de modo que a letra única que representa cada resíduo de aminoácido está localizada por cima da base do meio do códão correspondente;

a Figura 3 ê um gráfico que ilustra o teste de coagulação usado para medir a actividade pro-coagulante da huTF como se descreve no Exemplo 2. E apresentada uma representação de log-log do tempo de coagulação (formação do coágulo) de plasma humano citrado, em segundos, em função da concentração do factor tecidual humano (huTF), em picogramas por mililitro (pg/ /ml);

a Figura 4 ilustra um autofluorograma do huTF isolado por afinidade a partir de factor Ull/VIIa, submetido a electr£ forese num gel de poliacrilamida a 10%. A faixa A mostra huTF 125 marcado com I que foi isolado e reduzido com ditiotreitol (DTT) antes da electroforese, como se descreve no Exemplo 4. A faixa B mostra padrães de peso molecular com pesos moleculares aparentes indicados em quilodaltons (k);

a Figura 5 ilustra um autofluorograma de huTF isolado por afinidade a partir do factor Vll/Vlla submetido a electroforese em geles de poliacrilamida a 15%. 0 isolamento, marcação com I e electroforese de huTF foram feitos como se descreve no Exemplo 4. A faixa A mostra o huTF isolado após redu. ção com DTT. A faixa B mostra a mesma amostra submetida a electroforese sem redução com DTT. As bandas superior e inferior (marcadas com U e L) correspondem às formas de tamanho aproximado de 58 e 47 k do huTF. Após a autofluorografia, as bandas superior e inferior foram excisadas, re-hidratadas em tampão de amostra de SDS contendo DTT, inseridas no depósito da amostra de um segundo gel de poliacrilamida a 15% e submeti, das a electroforese. A faixa C mostra a re-electroforese da banda superior obtida a partir da faixa B. A faixa D mostra a re-electroforese da banda superior obtida a partir da faixa B. As proteínas de pesos moleculares aparentes de 12,5 e 47 quilo, daltons (k) estão indicadas pelas setas;

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-12a Figura 6 ilustra um autofluorograma de huTF isolada por afinidade a partir de factor Vll/VIIa que foi primeiro imu noprecipitada com anticorpo monoclonal específico para huTF, TF8-5G9, e em seguida submetida a electroforese num gradiente de gel de poliacrilamida de 8 a 17%, como se descreve no Exem125 pio 4. A faixa A mostra huTF marcada com I submetida a electroforese com redução por DTT. A faixa B mostra a mesma amostra submetida a electroforese sem redução;

a Figura 7 ilustra um autofluorograma de huTF isolada por afinidade a partir do factor Vll/VIIa, submetida a electro forese em geles do poliacrilamida a 15%. 0 isolamento, marca125 ção com I, redução e desglicosilação foram conduzidas como se descreve no Exemplo 4. A faixa 1 contém os seguintes padrões de proteína submetidos a electroforese como marcadores, com os pesos moleculares aparentes (Mr) indicados em quilodaltons; lisozima, 14,3; anidrase carbónico, 30,0; ovalbumina, 46,0; albumina de soro bovino, 69,0; fosforilase b, 92,5; e miosina 200,0, todos obtidos de Amersham, Arlington Heights, IL. As amostras contendo huTF com I foram submetidas a electroforese quer com DTT (Faixas 2 e 3) quer sem DTT (Faixas 4 e 5). Algumas destas amostras contendo huTF com I foram desglicosiladas (Faixas 3 e 5) enquanto que outras não foram desglicosiladas (Faixas 2 e 4) antes da electroforese.

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As amostras contendo huTF com I processadas nas Faixas 3 e 5 foram desglicosiladas antes da electroforese enquanto que as das Faixas 2 e 4 não o foram;

a Figura 8 ilustra um autofluorograma de huTF isolada por imunoafinidade, submetida a electroforese em geles de poliacrilamida a 10% como se descreve no Exemplo 9. A Faixa 1 contém os seguintes padrões de proteínas submetidas a electroforese como marcadores com pesos moleculares aparentes (Mr) in, dicados em quilodaltons; citocromo c, 12,4; lactoglobulina, 18,4; anidrase carbónica, 29,0; lactato-desidrogenase, 36,0; ovalbumina, 43,0; glutamato-desidrogenase, 55,0; e fosforila se b, 95,5, todos obtidos na Diversified Biotech (Newton Centre, MA).

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-13A Faixa 2 contém cerca de 20 de proteína, determinados usando o método de ensaio de proteína BCA de Smith et al., Anal. Bioch., 150:76-85 (1985) e foi reduzido usando DTT. A cadeia pesada de huTF (huTFh) é claramente visível a Mr de aproximadamente 47 e a cadeia leve de huTF é fracamente visível a Mr de aproximadamente 12,5. A proteína foi visualizada corando com azul Coomassie como é descrito em Laemmli, Nature, 227:680-685 (1970).

A Figura 9 é um gráfico que ilustra a curva de resposta à dose na inibição da coagulação iniciada por huTF por análogos polipéptidos não fosfolipidados (não lipidados de huTFh. Mediu-se a percentagem de inibição da coagulação para várias concentrações de polipéptidos não lipidados, como se descreve no Exemplo 12. Os polipéptidos testados incluiam p26-49 (Λ, TF26-49), pl21-155 (O , TF121.155), pl46-167 (> , TF146.167) e p204-226 ( , TF204.226).

A Figura 10 é um gráfico que ilustra a curva de resposta à dose para a inibição da coagulação iniciada por huTF, por análogos polipéptidos fosfolipidados (lipidados) de huTFh. As percentagens de inibição foram medidas pelos mesmos métodos e para os mesmos análogos que se descreveram na Figura 9.

A Figura 11 ilustra os mapas de restrição das inserções de segmentos de EcoRI nos plasmídeos de ADN recombinante, pCTF64, pCTF314 e pCTF403. As inserções ( I—» ) representam porções sobrepostas de sequências de nucleótidos que em conjun to correspondem à sequência de nucleótidos completa do gene pre-huTFh. Individualmente, as inserções incluem resíduos de nucleótidos que correspondem da esquerda para a direita e na direcção de 5' para 3* à sequência de nucleótidos apresentada na Figura 2 desde os resíduos de bases 1-486 (contidos em pCTF64), resíduos 135-775 (contidos em pCTF314) e resíduos 776-1125 (contidos em pCTF403). E também apresentada a locali zação aproximada dos sítios de clivagem por endonucleases de restrição nas inserções que foram usadas na construção das várias moléculas de ADN recombinante descritas no Exemplo 16. E ainda indicada a localização aproximada da proteína pre-huTFh f

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-14correspondente, apresentando intactos o seu péptido de comando ( pi-'5v| ) e o seu domínio de ancoragem transmembrana ( Y///À ).

A Figura 12 é um gráfico que ilustra a curva de resposta à dose para a inibição de coagulação iniciada por huTF por aná logos polipéptidos não fosfolipidados (não lipidados) de huTFh. A percentagem (%) de inibição da coagulação a várias concentra çães expressa em molaridade (M) de polipéptidos não lipidados foi medida como se descreve no Exemplo 12. Os polipéptidos exa, minados incluiam p24-35 (A) * p26-49 (0), pl52-169 (Q) e os pêptidos p40-71, p72-104, p94-123 e pl61-189 não produzindo, todos eles, inibição substancial e sendo colectivamente indicados pelo círculo a cheio (φ).

A Figura 13 é um gráfico que ilustra as cinéticas de ini bição da coagulação pela composição de anticorpo TF8-5G9. A percentagem (%) de inibição da coagulação é representada em função dos vários tempos de imunorreacção de anticorpo, medidos como se descreve no Exemplo 18.

A Figura 14 é um gráfico que ilustra a resposta à dose para a inibição da coagulação iniciada por huTF por anticorpos anti-huTF, A percentagem (%) de inibição da coagulação a várias concentraçSes do anticorpo monoclonal anti-huTF, TF8-5G9, foi medida como se descreve no Exemplo 19.

A Figura 15 é um gráfico que ilustra a resposta à dose da inibição da coagulação iniciada por huTF, por anticorpos ar» ti-huTF sendo a fonte de huTF um lisado de células humanas da linha celular de fibroblasto GM1381. A percentagem (%) de ini bição da coagulação a várias concentraçBes do anticorpo monoclonal anti-huTF, TF8-5G9, foi medida como se descreve no Exem pio 19, Os círculos a branco (O) designam o anticorpo TF8-5G9 e os círculos a cheio (φ) designam um anticorpo irrelevante.

A Figura 16 ilustra a inibição da actividade procoagulaji te de TF de cérebro humano, purificado, por anticorpo monoclonal anti-TF, TF8-5G9. A actividade coagulante do TF de cérebro humano, purificado, reconstituído em vesículas de fosfolípidos

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foi determinada após pré-incubação durante 30 minutos a 370C com concentrações variáveis de IgG purificada. Os círculos são para o anticorpo anti-TF, TF8-5G9; os triângulos são para o anticorpo irrelevante de controlo, PAblOO. Os valores são expressos em percentagem de inibição em relação à actividade observada na ausência de anticorpo adicionado.

A Figura 17 ilustra a inibição da ligação do factor VII a células de carcinoma da bexiga cultivadas, 082, tratadas com anticorpos monoclonais anti-TF purificados e a formação de fa£ tor Xa pelas mesmas células. Os valores para a inibição da v_e locidade da formação do factor Xa são representados por triângulos; os valores para a inibição da ligação do factor VII são representados por círculos. Os dados são expressos em ρβχ centagem de inibição, relativamente aos valores obtidos para células incubadas sem adição de anticorpo. Painel A, efeito do anticorpo TF9-2C4; painel B, efeito do anticorpo TF9-5B7.

A Figura 18 ilustra uma análise por Western blot de huTF, isolada por imunoafinidade, como se descreve no Exemplo 25. Carregaram-se geles de poliacrilamida a quinze por cento, como se segue: faixa 1 contém padrões de peso molecular com os pesos moleculares aparente em quilodaltons (k), indicados à esquerda do painel A; a faixa 2 contém 1 de hemoglobina hu mana purificada, reduzida antes da electroforese; a faixa 3 contém 0,5 pç de huTF isolada, reduzida antes da electroforese; e a faixa 4 contém 0,5 j^g de huTF isolada e não reduzida. Após a SDS-PAGE as bandas de proteína resultantes foram electrofore^ ticamente transferidas para nitrocelulose. Os Western blots assim formados foram imunorreagidos com 0,2 ^vg/ml de IgG de coelho, anti-huTF, purificada por afinidade (Painel A), 1 j^/ml de IgG de coelho, anti-hemoglobina (Painel B), ou 1 jug/ml de IgG de coelho não imune (Painel C). Os pesos moleculares das bandas imunocoradas estão indicados em kDa à direita.

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-16Descrição Detalhada do Invento

A. Definições

Aminoácido; todos os resíduos de aminoácidos aqui identificados estão na configuração L natural. De acordo com a no menclatura padrão dos polipéptidos, J. Siol. Chem., 243:3557-59 (1969), apresentam-se as abreviaturas dos resíduos de aminoáci dos na Tabela de correspondências que se segue:

TABELA DE CORRESPONDÊNCIAS

SÍMBOLO	AMINOÁCIDO
1 Letra 3	Letras
Y	Tyr	L-tirosina
G	Gly	glicina
F	Phe	L-fenilalanina
M	Met	L-metionina
A	Ala	L-alanina
S	Ser	L-serina
L	Ile	L-isoleucina
L	Leu	L-leucina
T	Thr	L-treonina
V	Vai	L-valina
P	Pro	L-prolina
K	Lys	L-lisina
H	His	L-histidina
Q	Gin	L-glutamina
E	Glu	L-ácido glutâmico
W	T rp	L-triptofano
R	A?g	L-arginina
D	Asp	L-ácido aspártico
N	Asn	L-asparagina
C	Cys	L-cisteína

Deve notar-se que todas as sequências de resíduos de ami noácidos são aqui representadas por fórmulas cuja orientação da esquerda para a direita é a direcção convencional do termi nal amino para o terminal carboxi. Além disso, deve notar-se

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-17que um sombreado no princípio ou final de uma sequência de resíduos de aminoácidos indica uma ligação a um radical como a H ou a OH (hidrogénio e hidroxilo) nos terminais amino e carboxi, respectivamente ou uma outra sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos até um total de cerca de cinquenta resíduos na cadeia do polipéptido.

Polipéptido e Péptido? polipéptido e péptido são termos usados aqui indistintamente para designar uma série linear de não mais do que cerca de 50 resíduos de aminoácidos ligados uns aos outros por ligações peptídicas entre os grupos alfa-ami no e carboxi de resíduos adjacentes.

Proteína? proteína é um termo usado aqui para designar uma série linear de mais de 50 resíduos de aminoácidos ligados uns aos outros como num polipéptido.

Nucleótido; uma unidade manomérica de ADN ou ARN consis tindo numa parte açúcar (pentose), um fosfato e uma base heterocíclica azotada. A base é ligada à parte açúcar, através do carbono glicosídico (carbono 1' da pentose) e a combinação de base e açúcar é um nucleúsido. Quando o nucleósido contém um grupo fosfato ligado à posição 5' ou 3’ da pentose é designado por nucleótido.

Pares de Bases (pb): uma associação de adenina (A) com timina (T) ou de citosina (C) com guanina (G) numa molécula de ADN de cordão duplo.

B. Segmentos de ADN

Nos organismos vivos, a sequência de resíduos de aminoácidos de uma proteína ou polipéptido está directamente relacionada, através do cédigo genético, com a sequência de ácido desoxirribonucleico (ADN) do gene estrutural que codifica a proteína. Assim, um gene estrutural pode ser definido em termos da sequência de resíduos de aminoácidos, i.e., proteína ou polipéptido, que ele codifica.

Uma característica importante e bem conhecida do código genético é a sua redundância. Isto é, para a maioria dos aminoácidos usados para fazer proteínas, mais do que um tripleto

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-18nucleótido de codificação (códão) pode codificar ou designar um resíduo de aminoácido particular. Assim, uma série de dife rentes sequências de nucleótidos pode codificar uma sequência de resíduos de aminoâcidos particular. Essas sequências de nucleótidos são consideradas funcionalmente equivalentes uma vez que podem ter como resultado a produção da mesma sequência de resíduos de aminoâcidos em todos os organismos. Ocasionalmente, uma variante metilada de uma purina ou pirimidina pode estar incorporada numa dada sequência de nucleótidos. Contudo, estas metilações não afectam de modo nenhum a associação codificante.

Os segmentos de ADN do presente invento são caracterizados por incluírem uma sequência de ADN que codifica uma proteí, na de factor tecidual humano, de cadeia pesada (huTFh). Nas concretizações preferidas o segmento de ADN inclui uma sequência de ADN que codifica uma proteína precursora do factor teci, dual humano, de cadeia pesada (pre-huTFh). Isto é, os segmentos de ADN do presente invento são caracterizados pela presença de um gene estrutural da huTFh ou, mais preferivelmente, da pre-huTFh. Preferem-se ainda os segmentos de ADN que incluem uma sequência de ADN que forma um gene estrutural codificando uma proteína huTFh solúvel ou pre-huTFh solúvel. Preferivelmente o gene está presente como uma série linear, ininterrupta, de códões, codificando cada codão, um resíduo de aminoácido eri contrado na proteína huTFh ou pre-huTFh, i.e., um gene livre de intrões.

Assim, um segmento de ADN consistindo essencialmente na sequência apresentada na Figura 2, desde cerca da posição 130 no seu terminal 5' até cerca da posição 918 no seu terminal 3' e capaz de expressar huTFh, constitui uma concretização do pre sente invento. Um segmento de ADN consistindo essencialmente na sequência apresentada na Figura 2, desde cerca da posição 34 até cerca da posição 918 e capaz de expressar pre-huTFh constitui outra concretização do invento.

Uma molécula de huTFh solúvel, preferida, não tem os resíduos de aminoâcidos codificados pelas cerca de cento e cin67 562

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-19quenta últimas bases no terminal 5’ do ADN que codifica huTFh. Assim, um segmento de ADN consistindo essencialmente na sequêri cia apresentada na Figura 2 desde cerca da posição 130 no seu terminal 5' até desde cerca da posição 756 a cerca da posição 801 no seu terminal 3', e capaz de expressar huTFh solúvel constitui mais uma concretização preferida deste invento. Exem pios de segmento de ADN preferidos que formam genes estruturais de huTFh solúvel são os que tém uma sequência de bases de nucleótidos representada pela Figura 2 desde cerca da base 130 até cerca da base 756, de cerca de base 130 até cerca da base 771, de cerca da base 130 até cerca da base 786 e de cerca da base 130 até cerca da base 801.

0s segmentos de ADN preferidos que codificam um pre-huTFh solúvel são semelhantes aos que codificam huTFh solúvel com a excepção de eles codificarem proteínas contendo uma sequência de comando no terminal amino tal como os resíduos de aminoácidos -32 a 0, como se mostra na Figura 1. Assim, um segmento de ADN preferido que forma um gene estrutural que codifica pre-huTFh solúvel consiste essencialmente na sequência apresejn tada na Figura 2, desde cerca da posição 34 no seu terminal 5' até desde cerca da posição 756 a cerca da posição 801 no seu terminal 3'. Exemplos de segmentos de ADN preferidos que codi. ficam pre-huTFh solúvel são os que possuem uma sequência de ba ses de nucleótidos representada pela Figura 2 desde cerca da base 34 até cerca da base 756, desde cerca da base 34 até cerca da base 771, desde cerca da base 34 até cerca da base 786 e desde cerca da base 34 até cerca da base 801.

Sequências de ADN e ARN homólogas que codificam as proteínas huTFh e pre-huTFh anteriores, incluindo as suas formas solúveis, são também contempladas, como se discutiu anteriormente.

Os segmentos de ADN que codificam proteínas huTFh e pre-huTFh podem ser facilmente sintetizadas por técnicas químicas, por exemplo, pelo método de fosfotriéster de Matteucci et al.,

3. Am. Chem. Soc., 103:3185 (1981). (as divulgaçSes da arte citadas aqui são incorporadas para referência). E evidente que,

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-20sintetizando quimicamente a sequência de codificação, se podem fazer quaisquer modificações, substituindo simplesmente as bases que codificam a sequência nativa de resíduos de aminoácidos pelas bases apropriadas. Contudo, preferem-se as moléculas de ADN que incluem sequências exactamente homólogas às apresejn tadas na Figura 2.

Além disso, os segmentos de ADN que consistem essencialmente nos genes estruturais que codificam as proteínas huTFh e pre-huTFh podem ser obtidos a partir de moléculas de ADN recom binante contendo esses genes. Por exemplo as moléculas de ADN recombinante do tipo plasmídeo pCTF64, pCTF314 e pCTF403 contêm cada uma sequências de ADN que codificam diferentes porções das proteínas huTFh e pre-huTFh e em conjunto possuem a sequêjn cia de ADN inteira, necessária para a expressão de cada proteí^ na. Foram depositadas culturas de Escherichia coli (E. coli) transformadas com pCTF64, pCTF314 ou pCTF403, obedecendo aos requisitos do Tratado de Budapeste, no American Type Culture Collection, (ATCC) 12301 Parklau/n Drive, Rockville, MD 20852 em 27 de Março de 1987 e foram-lhes atribuídos os seguintes nú meros de acesso, respectivamente, 67370, 67368 e 67369.

Pode preparar-se um segmento de ADN que inclui uma sequência de ADN que codifica huTFh ou pre-huTFh, ligando operativa mente fragmentos de restrição apropriados de cada um dos anteriores plasmídeos depositados, usando métodos conhecidos. As moléculas de ADN do presente invento produzidas desta forma têm geralmente terminais coesivos, i.e., porções de codão simples projectando-se que se estendem para além da porção de cordão duplo da molécula. Prefere-se a presença de terminais coesivos nas moléculas do presente invento.

Estão também contemplados no presente invento os equivalentes de ácido ribonucleico (ARN) dos segmentos de ADN descri, tos anteriormente.

C. Moléculas de ADN Recombinante

As moléculas de ADN recombinante do presente invento podem ser produzidas ligando operativamente um vector a um segmeri to de ADN do presente invento.

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-21Como se usa aqui o termo vector refere-se a uma molécu la de ADN capaz de replicação autónoma numa célula e à qual pode ser ligado operativamente outro segmento de ADN de modo a efectuar a replicação do segmento unido. Os vectores capazes de dirigir a expressão dos genes huTFh e pre-huTFh são aqui des signados por vectores de expressão. Assim, uma molécula de ADN recombinante (ADNr) é uma molécula de ADN híbrida compreendendo pelo menos duas sequências de nucleótidos que não são normalmente encontradas juntas na natureza.

A escolha do vector ao qual o segmento de ADN do presente invento é ligado operativamente depende directamente, como é já conhecido na arte, das propriedades funcionais desejadas, p.e., da expressão da proteína e da célula hospedeira a ser transformada, sendo estas limitações inerentes à arte de construção de moléculas de ADN recombinante. Contudo, um vector contemplado pelo presente invento é pelo menos capaz de dirigir a replicação e preferivelmente também a expressão, dos genes estruturais de huTFh ou de pre-huTFh incluídos nos segmentos de ADN aos quais está ligado operativamente.

Nas concretizações preferidas, um vector contemplado pelo presente invento inclui um replicão procariótico, i.e. uma sequência de ADN possuindo a capacidade de dirigir a replicão autónoma e a manutenção extracromossómica da molécula de ADN re combinante numa célula hospedeira procariótica, tal como numa célula hospedeira bacteriana, transformada com aquela. Estes replicões são muito conhecidos na arte. Adicionalmente, as concretizações que incluem um replicão procariótico também incluem um gene cuja expressão confere resistência a drogas a um hospedeiro bacteriano transformado com ele. Genes típicos de resistência bacteriana a drogas são os que conferem resistência à ampicilina ou à tetraciclina.

Os vectores que incluem um replicão procariótico podem também incluir um promotor procariórico capaz de dirigir a expressão (transcrição e tradução) dos genes da huTFh ou da pre-huTFh numa célula hospedeira bacteriana, como a E, coli, trans formada com eles. Um promotor é um elemento de controlo de e.x

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-22pressão formado por uma sequência de ADN que permite que ocorra a ligação da ADN polimerase e a transcrição. As sequências promotoras compatíveis com hospedeiros bacterianos são geralmente proporcionadas em vectores plasmídeos contendo sítios de restrição convenientes para inserção de um segmento de ADN do presente invento. Tipicamente, esses vectores plasmídeos são pUC8, pUC9, pBR322 e pBR329 disponíveis em Biorad Laboratories (Richmond, CA) e pPL e pKK223 disponíveis em Pharmacia, Piscatauiay, N.3.

Para formar as moléculas de ADN recombinante do presente invento, podem também usar-se vectores de expressão compatíveis com células eucarióticas, preferivelmente os compatíveis com células de vertebrado. Os vectores de expressão em células eucarióticas são muito conhecidos na arte e estão disponíveis de várias fontes comerciais. Tipicamente, estes vectores são proporcionados contendo vários sítios de restrição conveni entes para inserção do segmento de ADN desejado. São exemplos típicos desses vectores o pSVL e o pKSV-10 (Pharmacia), o pBPU-l/pML2d (International Biotechnologies, Inc.), e o pTDTl (ATCC, #=31255).

Nas concretizações preferidas, os vectores de expressão em células eucarióticas usados para construir as moléculas de ADN recombinante do presente invento incluem um marcador de selecção que é eficaz numa célula eucariótica, de preferência um marcador de selecção de resistência a drogas. Um marcador preferido de resistência a drogas é o gene cuja expressão resulta em resistência a neomicina, i.e., o gene de neomicina-fosfotransferase (neo). Southern et al., 3« Mol, Appl, Genet., 1:327-341 (1982).

*

E também contemplada a utilização de vectores retrovirais de expressão para a formação dos ADNr do presente invento. Como se usa aqui, o termo vector retroviral de expressão refere-se a uma molécula de ADN que inclui uma sequência promotora derivada de uma região de repetição terminal comprida (LTR) de um genoma de retrovírus.

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-2 3Nas concretizações preferidas, □ vector de expressão é tipicamente um vector retroviral de expressão que é de preferência incompetente para replicação em células eucariéticas. A construção e utilização dos vectores retrovirais foi descrita por Sorge et al., Mol. Cell. Biol,, 4:1730-37 (1984).

Foram desenvolvidos vários métodos para ligar operativamente ADN a vectores por intermédio de terminais coesivos complementares. Por exemplo, podem adicionar-se tractos de homopolímeros complementares ao segmento de ADN a ser inserida e ao ADN do vector. 0 vector e o segmento de ADN são então unidos por ligações de hidrogénio entre as caudas homopoliméricas complementares, para formar moléculas de ADN recombinante.

Os ligantes sintéticos contendo um ou mais sítios de res, trição proporcionam um método alternativo de união do segmento de ADN aos vectores. 0 segmento de ADN, gerado por digestão com endonucleases de restrição como se descreveu anteriormente, é tratado com ADN polimerase de bacteriófago T4 ou com ADN polimerase I de E. coli, enzimas que removem os terminais de cordão simples, 3', protuberantes com a sua actividade exonucle olítica em 3'-5’ e preenchem as extremidades 3’ recuadas com a sua actividade polimerizante. A combinação destas actividades gera portanto segmentos de ADN de extremidade romba. Os segmeri tos de extremidade romba são então incubados com um grande excesso molar de moléculas de ligante, na presença de uma enzima que é capaz de catalisar a ligação de moléculas de ADN de extremidade romba, tal como a ADN ligase de bacteriófago T4. Ass sim, os produtos da reacção são segmentos de ADN que transportam sequências de ligantes poliméricas nas suas extremidades. Estes segmentos de ADN são então clivados com a enzima de restrição apropriada e ligados a um vector de expressão que tinha sido clivado com uma enzima que produz terminais compatíveis com os do segmento de ADN.

Os ligantes sintéticos contendo vários sítios da endonuclease de restrição estão disponíveis no comércio com várias origens, incluindo a International Biotechnologies, Inc., Neu Haven, CN.

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-24Estão também contemplados pelo presente invento os equivalentes de ARN das moléculas de ADN recombinante descritas a_n teriormente.

D. Células e Culturas Transformadas presente invento também se refere a uma célula hospedeira transformada com uma molécula de ADN recombinante do pre sente invento, de preferência um ADNr capaz de expressar uma forma solúvel de huTFh ou de pre-huTFh. A célula hospedeira po. de ser quer procariótica quer eucariótica. As células hospedeiras procarióticas preferidas são as células bacterianas e são tipicamente uma estirpe de E, coli como por exemplo a estirpe DH5 de E, coli disponível em Bethesda Research Laboratories, Inc., Bethesda, MD. As células hospedeiras eucarióticas preferidas incluem células de levedura e de mamíferos, de preferência células de vertebrados, como por exemplo as de uma li nha celular fibroblástica de ratinho, ratazana, macaco ou huma no. As células eucarióticas hospedeiras, preferidas, incluem as células de ovário de criceto chinês (CHO) disponíveis na ATCC sob a designação CCL61 e as células de embrião de ratinho Suiço NIH, NIH/3T3 disponíveis na ATCC sob a designação CRL 1658. A transformação dos hospedeiros celulares apropriados com uma molécula de ADN recombinante do presente invento é realizada por métodos muito conhecidos que dependem tipicamente do tipo de vector usado. No que respeita à transformação de células procarióticas hospedeiras, ver, por exemplo, Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69:2110 (1972); e Maniatis et al., Molecular Cloninq, A Laboratory Mammal, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (19Θ2). No que respeita à transformação de células de vertebrados com vectores retrovirais contendo ADNr, ver, por exemplo, Sorge et al., Mói. Cell, Biol,, 4:1730-37 (1984); Graham et al., l/irol., 52:456 (1973); e Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:1373-76 (1979).

As células sucedidamente transformadas, i.e., células que contêm uma molécula de ADN do presente invento, podem ser identificadas por técnicas bastante conhecidas. Por exemplo, as células resultantes da introdução de um ADNr do presente

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-25invento podem ser clonadas para produzir colónias monoclonais. As células dessas colónias podem ser colhidas, lisadas e o seu conteúdo em ADN examinado para detectar a presença do ADNr, usando um método como descrita por Southern, J. Mol. Biol., 98:503 (1975) ou Berent et al., Biotech., 3:208 (1985).

Além de se testar directamente a presença de ADNr, a transformação sucedida pode ser confirmada por métodos imunoló gicos bastante conhecidos quando o ADNr é capaz de dirigir a expressão de huTFh ou pre-huTFh. Por exemplo, as células suce didamente transformadas com um vector de expressão produzem proteínas apresentando a antigenicidade de huTFh ou de pre-huTFh. As amostras de células que se suspeita terem sido transformadas são colhidas e testadas para detecção de huTFh ou pre-huTFh, usando anticorpo específicos para esses antigénios, tais como os produzidos por um hibridoma do presente invento.

Assim, para além das próprias células hospedeiras transformadas, o presente invento também contempla uma cultura dessas células preferivelmente uma cultura monoclonal (homogénea clonalmente), ou uma cultura derivada de uma cultura monoclonal, num meio nutriente. De preferência, a cultura também contém uma proteína apresentando a antigenicidade de huTFh ou de pre-huTFh e mais preferivelmente, de huTFh biologicamente activa.

Os meios nutrientes úteis para cultivar células hospedei, ras transformadas são muito conhecidos na arte e podem ser obtidos de várias origens comerciais. Nas concretizações em que a célula hospedeira é de mamífero, prefere-se um meio isento de soro.

E. Métodos para a Produção de Proteínas huTFh e pre-huTFh

Um dos aspectos do presente invento concerne a um método de produção de proteínas apresentando a antigenicidade de huTFh. As proteínas apresentando a antigenicidade de huTFh são proteínas que imunorreagem com anticorpos induzidos por factor tecidual nativo. As proteínas apresentando a a.ntigeni67 562

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Z& * -26cidade de huTFh são úteis como antigénios e para desenvolverem anticorpos, cada um dos quais pode ser usado nos sistemas de diagnóstico e métodos do presente invento.

presente invento requer a iniciação duma cultura compreendendo um meio nutriente contendo células hospedeiras, de preferência células humanas, transformadas com uma molécula de ADN recombinante do presente invento, que é capaz de expres. sar uma proteína huTFh ou pre-huTFh, preferivelmente uma proteína huTFh solúvel ou pre-huTFh solúvel. A cultura é mantida durante um período de tempo suficiente para que as células transformadas expressem uma proteína huTFh ou pre-huTFh. A proteína expressa é então recuperada da cultura. Nas concreti zaçães preferidas, as proteínas huTFh produzidas pelos métodos do presente invento apresentam adicionalmente a actividade bio lógica de huTFh, i.e., a capacidade de ligar factor Vll/VIIa. Estes métodos incluem cultivar células de mamífero, hospedeiras, transformadas com uma molécula de ADN recombinante capaz de expressar o gene da pre-huTFh nas células. A cultura tem como resultado a expressão da proteína pre-huTFh e subsequente modidicação intracelular pós-tradução da pre-huTFh para formar uma proteína huTFh biologicamente activa.

Os métodos para recuperar uma proteína expressa a partir duma cultura são bastante conhecidos na técnica e incluem o fraccionamento da porção da cultura que contém a proteína por utilização de técnicas bioquímicas muito conhecidas. Por exem pio, para isolar as proteínas expressas encontradas na cultura podem usar-se os métodos de filtração em gel, cromatografia em gel, ultrafiltração, electroforese, permuta iónica, cromatogra fia de afinidade e análogos, tal como se conhece para o fracci onamento de proteínas. Além disso, podem realizar-se os métodos imunoquímicos, como imunoafinidade, imunoadsorção e semelhantes, usando métodos muito conhecidos.

F, Produtos de Expressão e Composiçães das Proteínas huTFh e pre-huTFh

São também contemplados pelo presente invento os produtos de expressão das proteínas huTFh e pre-huTFh dos ADNr do

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-27presente invento. Nas concretizações preferidas os produtos de expressão de huTFh e de pre-huTFh, têm uma sequência de resíduos de aminoácidos correspondentes aos resíduos 1 a 263 e -32 a 263, respectivamente, como mostrado na Figura 1. De pre ferência a proteína expressa tem um comprimento de pelo menos 90 por cento, e mais preferivelmente 95 por cento, do comprimento da sequência de resíduos de aminoácidos de huTFh e de pre-huTFh representada na Figura 1.

Noutra concretização são contempladas as formas solúveis de huTFh e de pre-huTFh e as composições contendo huTFh solúvel e/ou pre-huTFh solúvel. 0 termo solúvel” como usado aqui refere-se a moléculas de huTFh e de pre-huTFh caracterizadas por consistirem essencialmente no domínio extracelular das moléculas huTFh e pre-huTFh nativas, i.e., à porção das moléculas de huTFh e de pre-huTFh que têm o terminal amino no resíduo 220, como mostrado na Figura 1. A huTFh solúvel e a pre-huTFh solú vel não contêm, portanto, nenhuma porção substancial da região de ancoragem transmembrana que se forma nas moléculas nativas (resíduos 220 a 242, como mostrado na Figura 1). Deve-se notar que os termos huTFh” e pre-huTFh como usados aqui, contemplam e incluem, a não ser que especificamente indicado de outro modo, as formas solúveis destas proteínas.

Em consequência de a huTFh solúvel e da pre-huTFh solúvel não conterem a região de ancoragem transmembrana, hidrofóbica, não se agregam, substancialmente, em soluções aquosas toleráveis fisiologicamente. Assim, a huTFh e pre-huTFh solúveis são ainda caracterizadas pela sua capacidade para formar uma solução aquosa, usando um diluente tolerável fisiologicamente, a uma concentração de proteína de cerca de 1 pg/ml a cerca de 100 ng/ml, em que pelo menos cerca de 70, de preferên cia cerca de 80, e com maior preferência cerca de 90 por cento em peso da proteína huTFh ou pre-huTFh estão presentes na forma não agregada (monomêrica). Os métodos para determinar a quantidade de agregação presente numa solução de proteína, são bem conhecidos da técnica e incluem fraccionamento por calibre, por cromatografia de exclusão em coluna.

Uma proteína huTFh preferida é a que tem uma sequência

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-28de resíduos aminoácidos, representada na Figura 1, desde cerca do resíduo 1, no seu terminal amino, até desde cerca do re síduo 209 a cerca do resíduo 224, no seu terminal carboxilo. Assim, são proteínas huTFh solúveis, preferidas, as que têm uma sequência de resíduos aminoácidos, representada na Figura 1, desde cerca do resíduo 1 até cerca do resíduo 209, desde cerca do resíduo 1 até cerca do resíduo 214, desde cerca do re síduo 1 até cerca do resíduo 219 e desde cerca do resíduo 1 até cerca do resíduo 224.

Uma proteína pre-huTFh solúvel, preferida é a que tem uma sequência de resíduos de aminoácidos, representada na Figura 1, desde cerca do resíduo -32, no seu terminal amino, até desde cerca do resíduo 209 a cerca do resíduo 224 no seu terminal carboxilo. Assim são proteínas pre-huTFh preferidas aque las que têm uma sequência de resíduos aminoácidos, representada na Figura 1, desde cerca do resíduo -32 até cerca do resíduo 209, desde cerca do resíduo -32 até cerca do resíduo 214, desde cerca do resíduo -32 até cerca do resíduo 219 e desde cerca do resíduo -32 até cerca do resíduo 224.

Numa concretização, os produtos de expressão huTFh e de pre-huTFh não estão glicosilados, i.e., são produzidos numa célula procariÓtica transformada com um ARNr do presente inveri to. Uma forma não glicosilada huTFh e do pré-huTFh é útil como um imunogénio e como um antigénio, num inoculo e sistema de diagnóstico do presente invento.

A huTFh e a pr-huTFh produzidas eucarioticamente são, tipicamente, glicosiladas e biologicamente activas, além de s.e rem antigénicas e imunogénicas. Quando usada aqui a frase biologicamente activo refere-se a um polipéptido ou proteína huTFh ou pre-huTFh, tendo a capacidade de induzir a coagula ção dependente do factor Vll/VIIa.

Assim o presente invento contempla uma composição compreendendo uma solução aquosa contendo a huTFh biologicamente activa, substancialmente isenta de proteína,de cadeia leve, do factor tecidual humano. De preferência a composição está também substancialmente isenta de outras entidades tais como detex

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-29gentes iónicos, p.e., sulfato de dodecilo e sódio (SDS), poliacrilamida e proteínas derivadas de tecido tendo um peso molecular aparente de menos de cerca de 15 000 daltons, como determinado por electroforese em SDS-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).

As soluções aquosas contendo huTFh, contêm huTFh biologicamente activa numa quantidade suficiente para analisar a capacidade de coagulação de uma amostra de fluido do sistema vascular, tal como sangue ou produtos derivados do sangue tal como plasma citrado. A frase capacidade de coagulação refe re-se à capacidade da amostra de fluído vascular de coagular, na presença de huTFh biologicamente activa. Concentrações típicas de proteína huTFh, suficientes para ensaiar a capacidade de coagulação, são de cerca de 0,1 pg/ml a cerca de 100 ng/ml, preferivelmente de cerca de 1 pg/ml a cerca de 10 ^g/ml e mais preferivelmente de cerca de 10 pg/ml a cerca de 1 ng/ml, utili. zando a amostra a razões de volume de huTFh similares aos do exemplo 2. E claro que também são contempladas soluções contendo huTFh em concentrações superiores às requeridas para ensaiar a capacidade de coagulação mas podem ser diluídas para uma concentração preferida.

Nas concretizações preferidas as soluções aquosas conteri do huTFh, incluem huTFh dispersa num fosfolípido ou detergente não-iónico. Proporções em peso de fosfolípidoíproteína huTFh variam de cerca de 5:1 a cerca de 12000:1, preferivelmente de cerca de 50:1 a cerca de 5000:1 e mais preferivelmente de cerca de 100:1 a cerca de 2500:1.

G. Polipéptidos

Os polipéptidos do presente invento contêm, cada um, não mais de cerca de 50, mais frequentemente menos de cerca de 35 e preferivelmente menos de cerca de 25, resíduos de aminoácidos e contêm pelo menos cerca de 10 resíduos. Em adição os pç» lipéptidos do presente invento são caracterizados pela sua sequência de resíduos de aminoácidos e novas propriedades funcio nais.

Em consequência, uma concretização do polipéptido do pre

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sente invento é um análogo polipéptido do sítio de ligação de huTFh caracterizado, em parte, pela sua capacidade para inibir competitivamente a ligação de huTFh ao factor Vll/VIIa de coagulação do sangue. De preferência, um análogo do sítio de ligação, do presente invento, liga o factor Vll/VIIa sem produzir um complexo activado, i.e., sem iniciar a coagulação.

A palavra complexo como usada aqui refere-se ao produto de uma reacção de ligação específica, tal como uma reacção anticorpo-antigénio ou receptor-ligando. São exemplos de complexos os produtos de imunorreacção e os produtos de reacção de ligação factor tecidual-factor Vll/VIIa, aqui designados por TF:VH/VIIa.

Em concretizações preferidas, um análogo do sítio de ligação de huTFh inclui, pelo menos, a sequência de resíduos de aminoácidos seguinte:

-VNQVYT-, representando os resíduos aminoácidos 30-35 como representados na Figura 1.

Mais preferivelmente, um análogo do sítio de ligação de huTFh inclui pelo menos uma das sequências de aminoácidos seguintes :

-VNQVYTVQIST-, e

-LYYWKSSSSGKKT-.

Aquelas sequências representam os resíduos de aminoácidos

30-40 e 155-167, respectivamente, como representado na Figura 1.

Ainda mais preferivelmente um análogo do sítio de ligação de huTFh inclui uma sequência de resíduos de aminoácidos escolhida do grupo consistindo em:

-EPKPVIWYTVQISTKSGDWKSKC-, e -VFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKT-, representando os resíduos 26-49 e 146-167, respectivamente, como representado na Figura 1.

Análogos polipéptidos do sítio de ligação de huTFh incljj

67 562 EPG:11-SCRF 113.	2
	-31-
em aqueles cujas	sequências de resíduos de aminoácidos	SS t3o
representadas no	Quadro 1.
	Quadro 1
Designação	Sequência de resíduos aminoácidos
p24-35	H-EWEPKPVNQVYT-OH
p26-49	H-EPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKC-OH
P144-159	H-RDVFGKDLIYTLYYWK-OH
P146-167	H-VFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKT-OH
P159-169	H-IYTLYYWKSSSSGKKTAK-OH
P157-169	H-YWKSSSSGKKTAK-OH
plól-189	H-SSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSU-OH

^a A designação laboratorial de cada polipéptido representa a sequência de resíduos aminoácidos como representada na Figura 1.

Os polipêptidos p26-49, pl46-167 e plól-189 são também ca racterizados pela sua capacidade de neutralizar (inibir competitivamente) a ligação de moléculas de anticorpo anti-huTFh a huTFh. Outros polipêptidos do presente invento tendo capacida, de para neutralizar a ligação de anticorpos anti-huTFh a huTFh incluem os do Quadro 2.

Quadro 2

Designação pl-w 30 p40-71 p41-49 p56-71 p72-104C^a

Ρ94-123

Ρ190-209

Sequência de resíduos aminoácidos

H-SGTTNTl/AA YNLTWKSTNFKTILEWEPKPV-OH

H-TKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTY-OH

H-KSGDWKSKC-OH

H-ECDLTDEIl/KDI/KQTY-OH

H-LARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLC-OH

H-YENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKV-OH

H-QAVIPSRTVNRKSTDSPl/EC-OH

Q

C adicionado à designação laboratorial indica que foi adicionado um resíduo cisteína ã sequência indicada como um ligante para conjugação da proteína.

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-32Deve-se entender que um polipéptido do presente invento não precisa de ser idêntico à sequência de resíduos de aminoácidos de huTFh, desde que os polipéptidos em questão sejam capazes de competir com o factor tecidual nativo na ligação ao factor Vll/VIIa e/ou sejam capazes de inibir competitivamente a ligação de moléculas de anticorpo anti-huTFh a huTFh. Assim, o presente polipéptido pode ser submetido a várias alterações como inserções,delecções e substituições, conservativas ou não conservativas, quando essas alterações proporcionarem de certeza vantagens na sua utilização.

Substituições conservativas são aquelas em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo biologicamente semelhante. Exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo hidrofóbico, como a isoleucina, valina, leucina ou metionina, por outro, ou a substituição de um resíduo polar por outro, tal como entre a arginina e a lisina, entre os ácidos glutêmico e aspártico ou entre a glutamina e a asparagina e semelhantes. 0 termo substituição conservativa também inclui o uso de um aminoácido substituído em lugar de um aminoácido progenitor não substituído, desde que tal polipéptido também exiba a exigida actividade de ligação.

Quando um polipéptido do presente invento tem uma sequêjn cia que não é idêntica à sequência da huTFh nativa, em consequência de terem sido feitas uma ou mais substituições conservativas ou não conservativas, normalmente não mais de 20 por cento, em número, e mais habitualmente não mais de 10 por cento, em número, de resíduos de aminoácidos estão substituídos, excepto quando se adicionaram resíduos adicionais a ambos os terminais com a finalidade de proporcionar um ligante por meio do qual os polipéptidos do presente invento podem ser, convenientemente fixados a um marcador ou matriz sólida ou transportador. Marcadores, matrizes sólidas e transportadores que podem ser usados com os polipéptidos deste invento são aqui descritos a seguir.

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-33Os ligantes de resíduos de aminoácidos normalmente são pelo menos um resíduo e podem ser 40 ou mais resíduos, mais frequentemente 1 a 10 resíduos. Resíduos de aminoácidos típicos, usados para ligação são a tirosina, cisteína, lisina, áci dos aspártico e glutâmico ou semelhantes. Adicionalmente, uma sequência polipéptidica deste invento pode diferir da sequência natural, por modificação de sequência por acilaçãc do terminal NH₂, p.e. acetilação, amidação com ácido tioalicólico, | amidação do terminal carboxilo, p.e. amoníaco, metilamina, etc..

I Quando ligado a um transportador por meio de ligante para formar o que é conhecido na técnica por conjugado haoteno-trans. portador, um polipéptido do presente invento é capaz de induzir anticorpos que imunorreagem com huTFh. Em vista do bem conhecido princípio de reactividade cruzada imunológica, o presente invento contempla portanto variantes do polipéptido relacionadas antigenicamente, mostradas nos Quadros 1 e 2. Uma variar^ te relacionada antigenicamente é um polipéptido que inclui pe. lo menos uma porção de sequência com seis resíduos de aminoáci dos de um polipéptido do Quadro 1 ou Quadro 2 e que é capaz de . induzir moléculas de anticorpos que imunorreagem com um poli pêptido do Quadro 1 ou 2 e com huTFh.

I Também contemplada pelo presente invento é urra composição compreendendo uma solução aquosa de um análogo polipéptido do sítio de ligação de huTFh na qual o polipéptido está dis perso num fosfolípido ou num detergente não-iénico. Proporções em peso típicas de fosfolípido:análogo polipéptido variam desde cerca de 5:1 a cerca de 200:1, de preferência desde cerca de 30:1 a cerca de 80:1 e mais preferivelmente desde cerca de 45:1 a cerca de 55:1. Análogos polipéptidos do sítio de li, gação de huTFh, preferidos, adequados para uso dispersos num fosfolipido são os listados no Quadro 4, secção II.

Um polipéptido do presente invento pode ser sintetizado porquaisquer técnicas conhecidas dos peritos na arte dos polipéptidos. Um excelente sumário das muitas técnicas disponíveis pode ser encontrado em 3.M. Steward e 3.D. Young, Solid Phase

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-34Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969, e

3. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, Vol. 2, p. 46, Academic Press (Nem York), 1983 para síntese de péptidos em fase sólida, e E. Schroder e K. Kubke, The Peptides, Vol. 1, Academic Press (New York), 1965 para síntese clássica em solução.

H. Inóculos

Noutra concretização, usa-se um polipéptido deste inuenI to ou uma sua variante relacionada antigenicamente numa composição diluente, aquosa, farmaceuticamente aceitável para formar um inóculo que, quando administrado numa quantidade eficaz, é capaz de induzir anticorpos que imunorreagem com huTFh. A palavra inóculo nas suas variadas formas gramaticais é usada aqui para descrever uma composição contendo como ingrediente activo um polipéptido deste invento, usado para a preparação de anticorpos contra huTFh. Quando o polipéptido é usado para induzir anticorpos entender-se-á que o polipéptido pode ser usado sozinho ou ligado a um transportador como um conjugado, ou como um polímero polipêptidicc, mas para facilidade de expressão várias concretizações dos polipéptidos deste invento k são designadas colectivamente pelo termo polipéptido e pelas ^F suas variadas formas gramaticais.

| Para um polipéptido que contém menos de cerca de 35 res^ duos de aminoácidos é preferível usar o péptido ligado a um transportador com a finalidade de induzir a produção de anticorpos, como já anteriormente referido.

Como já mencionado, podem ser adicionados um ou mais res.1 duos de aminoácidos adicionais aos terminais amino ou carboxilo do polipéptido para permitir a ligação do polipéptido a um transportador. Verificou-se que os resíduos de cisteína adicionados ao terminal amino ou carboxilo do polipéptido são par. ticularmente úteis na formação de conjugado por meio de pontes de bissulfureto. No entanto podem também usar-se outros métodos bem conhecidos na técnica para preparar conjugados. Exemplos de outros procedimentos de ligação incluem os produtos da reacção de adição de Michael, di-aldeídos como o glutaraldeído,

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Klipstein et al., J. Infect. Pis., 147, 318-326 (1983) se semelhantes ou a utilização da tecnologia com carbodiimida como o uso da carbodiimida solúvel em água para formar ligações amida ao transportador. Para uma revisão da conjugação ou acoplamento de proteínas através de grupos funcionais activados veja-se Aurameas, et al., Scand. J. Immunol., Vol, 8, Supp-1. 7, 7-23 (1978).

São bem conhecidos na técnica os transportadores úteis e geralmente são eles próprios proteínas. Exemplos de tais trans portadores são hemocianina de lapa do gênero Fissurella (KLH), edestina, tiroglobolina, albuminas, como a albumina de soro bovino (BSA) ou albumina de soro humano (HSA), glóbulos vermelhos tal como eritrocitos de carneiro (SRBC), tóxoide tetânico, tóxoide da cólera, bem como poliaminoácidos tal como poli (0-lisina: ácido D-glutâmico), e semelhantes.

A escolha do transportador está mais dependente do uso final do inóculo e é baseada em critérios que não estão particularmente envolvidos no presente invento, Por exemplo, deve-se seleccionar um transportador que não gere uma reacção inde. sejada no animal particular a ser inoculado.

presente inóculo contém uma quantidade eficaz, imunogé. nica, de um polipéptido do presente invento, tipicamente como um conjugado ligado a um transportador. A quantidade eficaz de polipéptido por dose unitária depende, entre outras coisas, da espécie do animal inoculado, do peso do corpo do animal e do regime de inoculação escolhido, como bem se sabe na técnica. Os inóculos contêm, tipicamente, concentrações de polipéptido de cerca de 10 microgramas a cerca de 500 miligramas por inoculação (dose), de preferência cerca de 50 microgramas a cerca de 50 miligramas por dose.

termo dose unitária quando referido aos inóculos do presente invento, refere-se a unidades fisicamente discretas, adequadas como dosagens unitárias para animais, contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de material activo, calculada para produzir o efeito imunogénico desejado, em associa ção com o diluente adequado, i.e., transportador ou veículo.

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As especificações para a nova dose unitária de um inóculo deste invento sãa ditadas por, e estão directamente dependentes de, (a) características únicas dc material activo e do efeito imunológico particular a ser conseguido e (b) das limitações inerentes da técnica de formação de compostos tais como materi al activo para uso imunológico em animais, como aqui revelado em detalhe, sendo isto característico do presente invento.

Os inóculos são tipicamente preparados a partir do conju gado-polipéptido sólido anidro, por dispersão do conjugado-poli. pêptido num diluente fisiologicamente tolerável (aceitável), tal como água, solução salina, ou solução salina tamponada com fosfato para formar uma composição aquosa.

Os inóculos podem também incluir um adjuvante como parte do diluente. Adjuvantes como adjuvante de F_reund completo (CFA), adjuvante de Freund incompleto (IFA) e alúmen são mate riais bem conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente com várias proveniências.

I. Anticorpos e Composições de Anticorpo termo anticorpo nas suas várias formas gramaticais é usado aqui para referir moléculas de imunoglobulinas e porções imunologicamente activas de moléculas de imunoglobulinas, i.e., moléculas que contêm um sítio de combinação de anticorpo ou pa ratopo. São exemplos de moléculas de anticorpos, moléculas de imunoglobulinas intactas, moléculas de imunoglobulinas substari cialmente intactas e aquelas porções de uma molécula de imunoglobulina que contêm o paratopo, incluindo aquelas porções conhecidas na técnica por Fab, Fab', F(ab’)2 ^e F(v).

Uma composição de anticorpo do presente invento é um anticorpo anti-péptido caracterizado por conter moléculas de anticorpo, que imunorreagem com huTFh, e com pelo menos um poli, pêptido específico deste invento.

Por exemplo, uma composição de anticorpo do presente invento contendo moléculas de anticorpo que imunorreagem com huTFh e um análogo polipéptido do sítio de ligação do factor tecidual, mas que não imunorreage substancialmente com p204-226

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é capaz de neutralizar a capacidade do Factor tecidual de ligar o factor Vll/VIIa. Assim as composições de anticorpo pre feridas são aquelas que contêm moléculas de anticorpo que imunorreajam com huTFh e com p26-49 ou pl46-167 e são substancial, mente isentas de imunorreacção com p204-226.

Deve-se ter em conta que os anti-soros policlonais desert volvidos para huTFh contêm anticorpos que imunorreagem com p204-226. Assim, a ausência substancial de imunorreactividade | anti-p204-226 é uma característica que distingue as composições de anticorpo do presente invento das descritas na técnica.

¹ Uma composição de anticorpo do presente invento é, tipicamente, produzida imunizando um mamífero com um inóculo do presente invento, induzindo assim no mamífero moléculas de anticorpo tendo a imunoespecificidade para anticorpo adequada. As moléculas de anticorpo são então recolhidas do mamífero e isoladas quanto desejado pelas técnicas bem conhecidas, como por exemplo, por cromatografia de imuno-afinidade. A composição de anticorpo assim produzida pode ser usada inter alia, em métodos de diagnóstico e sistemas de diagnóstico do presente invento para detectar huTFh numa amostra corporal.

As composições de anticorpo monoclonal são também contempladas no presente invento. Uma composição de anticorpo mo ) noclonal contém, dentro dos limites detectáveis, apenas uma es.

pécie de sítio de combinação de anticorpos capaz de ligar efectivamente huTFh. Assim uma composição de anticorpo monoclonal do presente invento exibe, tipicamente, uma única afini dade de ligação para huTFh, ainda que se pense que possa conter anticorpos capazes de ligar proteínas diferentes de huTFh. Numa concretização, uma composição de anticorpo monoclonal con tém moléculas de anticorpos que imunorreagem com huTFh e com um análogo polipéptido do sítio de ligação do factor tecidual, preferivelmente p26-49 ou pl46-167.

Noutra concretização, o presente invento contempla um aja ticoagulante (neutralizante) MoAb contendo moléculas de anticorpo que imunorreagem com huTFh e inibem a coagulação iniciada por huTFh. Um MoAb preferido que inibe a coagulação é ainda

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caracterizado por imunorreagir com um polipéptido do presente invento preferivelmente um análogo polipéptido do sítio de ligação de huTFh, e mais preferivelmente um polipéptido como o mostrado no Quadro 1.

Noutra concretização, um anti-coagulante MoAb contém moléculas de anticorpo que imunorreagem com huTFh e com complexo huTFh:factor Vll/VIIa e inibem (neutralizam) a coagulação iniciada por huTFh. Um anticoagulante MoAb preferido é ainda caracterizado por imunorreagir com os polipéptidos de huTFh pl-30 ou p26-49, e por não imunorreagir com o polipéptido de huTFh p56-71.

presente invento também contempla uma composição de an ticorpo monoclonal não neutralizante contendo moléculas de ajn ticorpo que não neutralizam a capacidade do factor tecidual de iniciar a coagulação. De preferência tsl composição contém mo léculas de anticorpo que imunorreagem com huTFh e com o polipéptido pl-30, e que é produzida segregada pelo hibridoma TF9-10H10.

Uma composição de anticorpo monoclonal do presente inueji to pode ser produzida iniciando uma cultura de hibridoma monoclonal compreendendo um meio nutriente contendo um hibridoma que segrega moléculas de anticorpo com a especificidade para polipéptido, adequada.

A cultura é mantida sob condições, e durante um períodc de tempo suficiente para que o hibridoma segregue as moléculas de anticorpo para o meio. 0 meio contende anticorpos é em seguida recolhido. As moléculas de anticorpo podem ser ainda isoladas por técnicas bem conhecidas.

Os meios úteis na preparação destas composições são bem conhecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis e incluiem meios de cultura sintéticos, ratinhos consanguíneos e semelhantes. Um exemplo de meio sintético é o meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM; Dulbecco e col., Virol. 8:396 (1959)), suplementado com 4,5 g/1 de glucose, 20 g de glutamina e 20% de soro fetal de vitela. Um exemplo de estirpe de ratinhos cons^n

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-39guíneos é a Balb/c. As composições de anticorpo monoclonal produzidas pelo método acima mencionado podem ser usadas, por exemplo, em modalidades de terapêutica e diagnóstico em que se deseje a formação de produto de imunorreacção contendo huTFh.

3. Hibridomas

Os hibridomas do presente invento são caracterizados por produzirem moléculas de anticorpos que imunorreagem com huTFh. Um hibridoma preferido é ainda caracterizado por produzir molé. cuias de anticorpo que inibem a coagulação iniciada por huTFh e que de preferência imunorreagem com um polipéptido do presente invento, de preferência um análcgo polipéptido do sítio de ligação de huTFh, e mais preferivelmente um polipéptido como mostrado no Quadro 1. Noutras concretizações preferidas um anticoagulante MoAb imuncrreage com Tf de primata não-humano.

Noutra concretização preferida, um hibridoma do presente invento produz moléculas de anticorpo que imunorreagem com huTFh e com complexo huTFh:factor Vll/Vlla e que neutralizam a coagulação iniciada por huTFh. De preferência uma hibridoma que produz anticorpos que imunorreagem com o complexo huTFh: :factor Vll/VIIa são ainda caracterizados pela capacidade das referidas moléculas de anticorpo imunorreagirem com os polipéptidos de huTFh pl-30 ou p26-49, de preferência com ambos, e mais preferivelmente em que as referidas moléculas de anticorpo não imunorreagem com o polipéptido poli-huTFh. p56-71.

Métodos para produzir hibridomas produtores (segregadores) de moléculas de anticorpo tendo uma imunoespecificidade desejada, i.e., tendo a capacidade de imunorreagir com uma pro teína e/ou polipéptido particulares, são bem conhecidos na técnica, Particularmente aplicável é a tecnologia de hibridoma descrita em Niman et al., Proc. Natl, Açad. Sei. USA, 80: :4949-4953 (1983). São hibridomas preferidos os mostrados no Quadro 5, no exemplo 13.

As culturas de hibridomas TF8-5G9, TF9-6B4 e TF9-10B10 foram depositadas de acordo com as exigências do Acordo de Budapeste no ATCC em 27 de Março de 1987 e foram-lhes atribuídos

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os seguintes números de acesso HB9382, HB9381 e HB9393.

K. Métodos e composições terapêuticos

Os análogos polipéptidos do sítio de ligação de factor Vll/l/IIa a huTFh, as composições de anticorpos, as composições de anticorpos monoclonais e o MoAb anticoagulante do presente invento podem ser usados, cada um, para modular a ligação do factor Vll/l/IIa in vivo por factor tecidual.

Por exemplo, o análogo polipéptido do sítio de ligação de factor Vll/VIIa a huTFh pode ser usado numa composição farmaceuticamente aceitável que quando administrada a um indivíduo humano numa quantidade eficaz é capaz de inibir competitivamente a ligação do factor Vll/VIIa ao factor tecidual. Crê-se que esta inibição resulta numa taxa de formação de complexo factor tecidual-factor Vll/VIIa diminuída. Assim a adminis tração in vivo de um análogo polipéptido do sítio de ligação do factor Vll/VIIa a huTFh pode ser usado para modular tcdas as respostas fisiológicas iniciadas por ligação do factor tecidual ao factor Vll/VIIa, tais como coagulação e algumas respostas inflamatórias. Em concretizações preferidas o polipépti do é administrado quando disperso num fosfolípido, como anteri ormente descrito.

Outra abordagem para modular a ligação do factor Vll/VIIa por factor tecidual, in vivo, é administrar intravenosamente uma quantidade eficaz de uma composição de anticorpos (anticoj? po anti-péptido) ou um anticoagulante MoAb do presente invento. De preferência as moléculas de anticorpos são aquelas que contêm a região paratópica e estão isentas da região Fc, tais como fragmentos de imunoglobulina F(ab')2> Fab e semelhantes. As quantidades terapeuticamente eficazes de um anticoagulante MoAb variam entre 15 y*g/kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corpjo ral, de preferência de cerca de 100 ytg/kg de peso corporal a cerca de 1 mg/kg de peso corporal e mais preferivelmente de cerca de 150 ^g/kg de peso corporal a cerca de 500 jug/kg de pe. so corporal.

Noutra concretização as moléculas de anticorpo de um MoAb ./

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-41□u MoAb não neutralizante, do presente invento, estão ligadas a um agente anti-tumor para formar uma composição terapêutica anti-tumor. Uma quantidade eficaz de composição terapêutica anti-tumor assim formada pode ser administrada a um indivíduo humano tendo células de tumor que expressam o factor de tecido à sua superfície. Exemplos de tais células de tumor são os carcinomas da mama e do pulmão.

Agentes anti-tumor típicos contemplados aqui são os radionuclideos tais como e semelhantes. Néto dos de produzir composições terapêuticas de anticorpos monoclo, nais conjugados com radionuclideos e o seu uso estão descritos em Kozak et al., Trends In Biotech., 4:259-264 (1986).

As composições contendo moléculas de anticorpo ou conten. do polipéptido, administradas, tomam a forma de soluções ou suspensões, no entanto os polipéptidos podem também tomar a forma de comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de libertação retardada ou pés. Em qualquer caso as composições contêm 0,10/-95% de ingrediente activo, de preferência 25;— 707.

Na preparação de composições terapêuticas que contêm polipéptidos ou moléculas de anticorpos como ingrediente activo é bem conhecida na técnica. Tipicamente tais composições são preparadas como injectáveis, quer comc soluções líquidas ou co mo suspensões, no entanto também se podem preparar formas séli das adequadas para solução num ou suspensão num líquido antes de injecção. A preparação pode também ser emulsionada. 0 ingrediente terapêutico activo é frequentemente misturado como excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente activo. São excipientes adequados por exemplo, a água, solução salina,dextrose, glicerol, etanol ou seme lhantes, ou suas combinações. Adicionalmente a composição pode conter, se desejado, quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tampão do pH, que melhoram a eficácia do ingrediente activo.

Uma composição de moléculas de anticorpo ou de polipépti do pode ser formulada em composição farmacêutica nas formas de sais farmaceuticamente aceitáveis, neutralizados. Os sais far.

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-42maceuticamente aceitáveis incluem sais de adição de ácidos (formados com os grupos amino livres do polipéptido ou da mcljé cuia de anticorpo), que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, os ácidos clorídrico ou fosfórico, ou com ácidos orgânicos tais como o acético, oxálico, tartárico, mandélico e semelhantes. Sais formados com os grupos carboxilo livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais, como por exemplo, hidróxidos de sódio, de potássio, de amónia, de cálcio ou férrico, e com bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaina e semelhantes.

As composições contendo moléculas de anticorpos ou polipéptidos terapêuticos, são, convencionalmente, administradas tópica ou intravenosamente, como por injecção de uma dose unitária, por exemplo. 0 termo dose unitária quando usado em referência à composição terapêutica do presente invento refere -se a unidades fisicamente discretas, adequadas como dosagens unitárias para humanos, contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de material activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o diluente adequado; i.e. transportador ou veículo.

As composições são administradas de um modo compatível com a formulação da dosagem, e numa quantidade eficaz terapeuticamente. A quantidade a ser administrada depende do sujeito a ser tratado, da capacidade do sistema de coagulação sanguínea do sujeito em utilizar o ingrediente activo e grau de inibição ou de neutralização da capacidade de ligação do factor de tecido desejado. As quantidades precisas de ingrediente activo necessário para administração depende da avaliação do médico e são características de cada indivíduo. No entanto uma dosagem de polipéptido adequada varia da ordem de um a vários miligramas de ingrediente activo por indivíduo por dia, e deperi dem da via de administração. Os regimes adequados para administração inicial e reforços são também variáveis, mas são tipificados por uma administração inicial seguida de doses repetidas a intervalos de uma ou mais horas, por uma injecção subsje quente ou outro modo de administração. Alternativamente são

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-43também contempladas as infusões contínuas, intravenosas, suficientes para manter a concentração de dez nanomolar a dez micromolar, no sangue.

L. Sistemas de diagnóstico

Um sistema de diagnóstico do presente invento, sob a foj? ma de conjunto (kit) inclui, numa quantidade suficiente para pelo menos um teste, uma proteína expressa, polipéptido, compo. sição de anticorpo ou composição de anticorpo monoclonal do presente invento, como um reagente embalado separadamente. Ti picamente estão também incluídas as instruções para uso do rea gente embalado.

As instruções para utilização incluem tipicamente uma expressão descrevendo a concentração do reagente ou pelo menos um parâmetro do método de ensaio tal como quantidades relativas de reagente e amostra a ser misturada, períodos de tempo de permanência para misturas reagente/amostra, temperatura, condições tampão e semelhantes.

Nas concretizações preferidas, um sistema de diagnóstico do presente invento inclui ainda um meio de marcação ou indica, dor capaz de sinalizar a formação de um complexo contendo um tipo de reagente.

Como aqui utilizado o termo marcador e meios indicado, res, nas suas diversas formas gramaticais referem-se a átomos e moléculas isolados que estão quer directa quer indirectamente envolvidos na produção de um sinal detectável para indicar a presença de um complexo. Marcadores ou meios indicadores in vivo são aqueles úteis no corpo de um sujeito humano. Qual, quer marcador ou meio indicador pode ser ligado, ou incorporado, a uma proteína, polipéptido ou molécula de anticorpo expressas que seja parte de uma composição de anticorpo ou de a.n ticorpo monoclonal do presente invento, ou usada separadamente, a esses átomos ou moléculas podem ser usados isoladamente ou em conjunção com reagentes adicionais. Tais marcadores são eles próprios bem conhecidos na química do diagnóstico clínico e constituem uma parte deste invento só na medida em que são

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-44utilizados com métodos e/ou sistemas com novas proteínas.

A ligação dos marcadores, i.e., marcação de polipéptidos e proteínas é bem conhecida na técnica. Por exemplo, moléculas de anticorpo produzidas por um hibridoma podem ser marcadas por incorporação metabólica de aminoácidos contendo radio-isótopos, proporcionados como um componente ao meio de cultura. Ver, por exemplo Galfre e col., Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981). As técnicas de conjugação ou ligação de proteína atra vés de grupos funcionais activados são particularmente aplicáveis. Ver por exemplo, Aurameas, et al., Scand. J. Immunol., Vol. 8 Suppl. 7:7-23 (1978), Rodwell et al., Siotech., 3:889-894 (1984), e U.S. Pat. N°. 4 493 795.

Os sistemas de diagnóstico podem também incluir, de preferência, como uma embalagem separada um agente de ligação específica. Um agente de ligação específica é uma entidade mo lecular capaz de ligar selectivamente um tipo de reagente do presente invento, mas não é por si só um produto de expressão de proteína, polipéptido ou molécula de anticorpo do presente invento. São exemplos de agentes de ligação específica, moléculas de anticorpo, proteínas do complemento ou seus fragmentos, proteína A, factor de coagulação do sangue Vll/VIIa, factor te cidual bovino e semelhantes. De preferência o agente de ligação específica pode ligar o tipo de reagente quando o tipo está presente como parte de um complexo.

Nas concretizações preferidas o agente de ligação especf fica está marcado. Contudo, quando o sistema de diagnóstico inclui um agente de ligação específica que não está marcado, o agente é usado, tipicamente, como meio ou reagente de amplificação, estas concretizações o agente de ligação específica marcado é capaz de ligar especificamente os meios de amplificação quando os meios de amplificação estão ligados a um complexo contendo tipos de reagente.

Os conjuntos de diagnóstico do presente invento podem ser usados num formato ELISA para detectar a presença ou quantidade de huTFh numa amostra de fluido corporal tal como soro, plasma ou urina. ELISA refere-se a um ensaio imunosorvente

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-45de ligação enzimática que utiliza um anticorpo ou antigénio li. gados a uma fase sólida e um conjugado enzima-antigénio ou enzima-anticorpo para detectar e quantificar a quantidade de antigénio ou de anticorpo presentes numa amostra. Uma descrição da técnica ELISA pode ser encontrada no capítulo 22 da 4® edição de Basic and Clinicai Immunology por D.P. Sites e col., publicado por Lange Medicai Publications de Los Altos, CA em 1982 e nas Patentes EUA N9. 3 654 090; N9. 3 850 752; e N9.

0χ6 043, que estão aqui incorporadas como referência.

Assim, nas concretizações preferidas a proteína, polipéptido ou molécula de anticorpo expressas, do presente invento, podem ser fixadas a uma matriz sólida para formar um supo£ te sólido que é embalado separadamente nos sistemas de diagnós. tico do presente invento.

reagente é, tipicamente, fixado à matriz sólida por adsorção a partir de um meio aquoso, embora possam ser usados outros modos de fixação, bem conhecidos dos peritos da técnica.

São bem conhecidos na técnica matrizes sólidas úteis.

Tais materiais incluem dextrano reticulado, disponível sob a marca comercial SEPHADEX da Pharmacia Fine Chemicals (Pistacatuay, N3) ; agarose; esferas de poliestireno com cerca de 1 micron a cerca de 5 milímetros de diâmetro disponíveis em Abbott Laboratories de North Chicago, IL; poli(cloreto de vinilo), poliestireno, poliacrilamida reticulada, telas à base de nitrocelulose ou de nilão tais como folhas, tiras ou pás; ou tubos, placas ou os depósitos de placas de microtitulação tais como as feitas de poliestireno ou de poli(cloreto de vini. lo).

A espécie reagente, agente de ligação específica marcado ou reagente amplificador de qualquer sistema de diagnóstico aqui descrito pode ser fornecido em solução, como uma dispersão líquida, ou como um pó substancialmente anidro, p.e., na forma liofilizada. Quando o meio indicador é uma enzima o substrato da enzima pode também ser fornecido numa embalagem separada de um sistema. Um suporte sólido tal como a placa de microtitulação anteriormente descrita e um ou mais tampões pode também ser incluído como elementos embalados separadamente

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-46neste sistema de ensaia de diagnóstica.

As embalagens aqui discutidas em relação aos sistemas de diagnóstico são aquelas habitualments utilizadas em sistemas de diagnóstico. Tais embalagens incluem garrafas de vidro e de plástico (p.e., pclietileno, polipropilenc e policarbonato), recipientes, envólucrcs de plástico e de película plástica laminada e semelhantes.

M. Métodos de ensaio presente invento contempla qualquer método que resulte na detecção da huTFh por produção de um complexo contendo a proteína, polipéptido ou molécula de anticorpo expressas conti das numa composição de anticorpo ou de anticorpo monoclonal do presente invento. Os peritos na arte compreenderão que há mui. tos procedimentos químicos de diagnóstico clínico bem conhecidos, que podem ser utilizados para formar aqueles complexos. Assim, embora os métodos de ensaio exemplares sejam aqui descritos, o inventp não se encontra a eles limitado.

1. Detecção de trombos

Contempla-se um método para detectar a presença de um trombo num ser humano. Uma quantidade eficaz de uma composição de anticorpo monoclonal do presente invento contendo moléculas de anticorpo ligadas a um meio indicador in vivo é administrada intravenosamente ao indivíduo. Nas concretizações preferidas as moléculas de anticorpo marcadas são aquelas que imunorreagem com huTFh e com um polipéptido dos Quadros 1 e 2 mas não com p204-226, mais preferivelmente com aqueles produzi, dos pelo hibridoma TF8-5G9, TF9-6B4 ou TF9-10H10.

indivíduo é então mantido por um período ds tempo predeterminado suficiente para que as moléculas de anticorpo marcado reajam com huTFh presente em parte do trombo e formem um complexo, e preferivelmente por um período de tempo adicional suficiente para que uma quantidade substancial de quaisquer mo léculas de anticorpo não reagido sejam eliminadas do corpo. 0 indivíduo é então testado em relação à presença e, preferivelmente, localização de qualquer complexo que se tenha fcrmado.

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2. Detecção de huTFh numa amostra corporal

Podem-se utilizar diversos protocolos de ensaio hete rogéneos ou homogéneos, competitivos ou não competitivos, para detectar a presença e, preferivelmente, a quantidade de huTFh numa amostra corporal, de preferência numa amostra de fluido corporal. Por exemplo, uma amostra de fluido corporal, líquida, p26-49 marcado são misturados com um suporte sólido comprei endendo moléculas de anticorpo produzidas pelo hibridoma TF9-5G9 ou TF9-10H10, fixados à parede interior de um depósito de uma placa de microtitulação para formar uma mistura de imunorreacção de fase sólida-líquida. A mistura é mantida sob condi ções de ensaio biológico por um período de tempo suficiente pa. ra que qualquer huTFh presente na amostra e p26-49 marcado com pletem a sua ligação às moléculas de anticorpo presentes como um suporte sólido e formem o produto de imunorreacção de fase sólido. 0 p26-49 marcado, não ligado é então separado dos pro dutos de imunorreacção. Determina-se então a quantidade de p26-49 marcado ligado, como produto de imunorreacção e proporciona-se assim, pela diferença, uma medida da presença de huTFh.

Exemplos

Os exemplos que se seguem são destinados a ilustrar, mas não a limitar, o presente invento.

1. Preparação de extracto de cérebro humano contendo factor tecidual

Processaram-se cérebros humanos, normais, durante 12 horas ou armazenaram-se congelados a -803 centígrados (C), obtidos na autópsia. As meninges e os cerebelos foram removidos e as restantes partes do cérebro foram homogeneizadas num volume igual de acetona fria (0 graus C) usando um homogeneizador Polytron (Brinkman Instruments Co., Westbury, l\IY). 0 produto ho mogenado resultante foi misturado com mais 3 volumes de acetona fria, e a fracção de sólidos teciduais foi recuperada por filtração usando um funil de vidro sinterizado. 0 material so. lúvel em acetona foi extraído dos sólidos retidos por mais sete

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-48vezes, de cada vez misturando com dois volumes de acetona fria e subsequentemente filtração. Após a filtração final, deixou-se evaporar a acetona residual dos sólidos retidos à pressão atmosférica, durante a noite, a 20 graus C.

Os sólidos de tecido cerebral retidos foram então submetidos a 5 extracçães, cada uma realizada misturando os sólidos com uma solução 2:1 de heptano:butanol a uma razão de 1 g de sólidos teciduais para 25 mililitros (ml) heptano:butanol, seguida de filtração para recuperar os sólidos. Após a filtração final, os sólidos de tecido cerebral, retidos, foram novamente secos durante a noite, a cerca de 20 graus C, à pressão atmosférica, para formar um pó de tecido cerebral deslipidado, o qual foi armazenado a menos 80 graus C enquanto necessário.

Subsequentemente, misturaram-se vinte e cinco gramas de pó de tecido cerebral com 500 ml de tampão TS/EDTA /JaCl 100 mi limolar (mM), Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) azida de sódio a 0,02% e ácido etilenodiamina tetra-acético 5 mM (EDTA), Triton X-100 a 0,1% (v/v) (éter poliariletileno 9 octilfenilic oJ7e agitou-se durante a noite a 4 graus C. A mistura foi em seguida centrifugada a 15 300 xg durante 1 hora. A pelota resultante foi ressuspensa em 500 ml de tampão A /NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), azida de sódio a 0,02% triton X-100 a 2;’ J para formar uma pasta. Após agitação à temperatura ambiente durante 1 hora, a pasta foi centrifugada como descrito anteriormente. 0 sobrenadante resultante foi recuperado, liofilizado e subsequentemente liofilizado em 100 ml de tampão A para formar uma solução de extracto cerebral contendo huTFh.

2. Ensaio de coagulação para medir a actividade pro- coagulante de huTFh

Mediu-se a actividade procoagulante de huTFh num ensaio de coagulação de um só passo realizado com todos os reagentes e misturas mantidos a 37 graus C. Uma recolha de plasma normal foi citratada misturando 1 volume de plasma com 1 uolume de uma solução contendo citrato de sódio di-hidratado 20 mM e NaCl 140 mM, pH 7,4. Misturaram-se cem microlitros de uma amostra contendo huTF diluída numa solução TBS/OSA (NaCl 150

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-49mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, albumina de soro bovino a 0,1%) com 100 yul de plasma citratado. Misturaram-se, em seguida, cem yul de uma solução de CaCl₂ 25 mM para formar uma mistura reaccional de coagulação que foi suavemente agitada até se dar a coagulação. Mediu-se o tempo entre a adição de CaCl₂ e a formação do coágulo. Construiu-se em seguida uma curva padrão da actividade da huTF por representação da diluição versus o tempo de coagulação em segundos. Um exemplo de curva padrão é apresentado na Fig. 3.

3. Preparação de um suporte sólido contendo factor VII para isolamento por afinidade da huTF

Isolou-se o factor Vll/VIIa humano como descrito por Fair, Blood, 62:784-91 (1983) o qual é aqui incorporado como referência. Este factor Vll/VIIa isolado foi activado para se ligar a uma matriz sólida de agarose dialisando 5 miligramas (mg) contra ácido 2-(N-morfolino)etanossulfónico 0,1 M (MES) (pH 6,5) durante a noite, a 4 graus C. Adicionou-se cloreto de cálcio para uma concentração final de 1 mM. Misturou-se, em seguida, factor Vll/VIIa com 4 ml de pérolas de agarose activa. das com Affigel-15 (Biorad Laboratories, Richmond, CA) e a mis. tura de reacção de ligação resultante foi processada por rotação durante 4 horas, a 4 graus C, de acordo com as recomendadações do fabricante (Biorad).

0s locais de ligação da proteína em excesso no suporte sólido foram bloqueados agitando suavemente o suporte sólido éster de etilglicina 0,1 M durante uma hora, à temperatura ambiente. Seguidamente o suporte foi lavado sequencialmente num funil de vidro sinterizado com cerca de 20 ml, cada, de (1) Tampão A, (2) tampão B contendo NaCl 1 M, (3) Tampão A contendo EDTA 5 mM, e (4) Tampão A contendo CaCl₂ 1 mM. 0 líquido em excesso foi em seguida removido por vácuo para formar uma massa em partículas semi-anidra (bolo).

4. Isolamento por afinidade de factor Vll/VIIa da huTF

Misturaram-se vinte ml de uma solução contendo éster de etilglicina 0,1 M e MES 0,1 M, pH 6,5, com 22,5 ml de pérolas

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-50de agarose Affigel-15 (Biorad) para formar uma mistura de reacção de ligação. A mistura de reacção de ligação foi manti da à temperatura ambiente durante 1 hora. 0 conjugado resultante foi lavado 4 vezes num funil de vidro sinterizado com 10 volumes de Tampão 1, filtrado sob vácuo para formar um bolo de éster de etilglicina-agarose.

Dializaram-se durante a noite, a 4 graus C, trinta ml de solução de extracto cerebral preparado no Exemplo 1, contra 6 litros de Tampão A contendo cloreto de cálcio 1 mM. 0 extracto cerebral dialisado foi misturado com o bolo de ester de etilglicina-agarose para formar uma mistura reaccional de fase sólida-líquida. Após se manterem durante 2 horas, à temperatu ra ambiente, com rotação, as fases sólida e líquida foram sep.a radas por filtração usando um funil de vidro sinterizado. A fase líquida foi recuperada e misturada com Trasylol (aprotini na; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) para uma concentração final de 10 unidades por ml. A fase líquida recuperada foi misturada com o bolo de agarose/factor Vll/VIIa preparado no Exemplo 3 para formar uma segunda mistura de fase líquida-sóli da.

Esta mistura foi mantida durante a noite a 4 graus C, com rotação, para permitir a formação de um produto de fase s.ó lida contendo huTF-factor Vll/UIIa. As fases sólida e líquida foram em seguida separadas por filtração como previamente descrito. A fase sólida retida no funil de vidro sinterizado foi lavada com 25 ml de Tampão A contendo cloreto de cálcio 1 mM. A fase sólida foi então transferida para uma coluna de cromato grafia de vidro sinterizado (0,5x15 cm; Biorad) e lavada com 6 ml do mesmo tampão de lavagem. Qualquer huTF ligado ao suporte sólido após as lavagens anteriores foi então libertado (eluido) lavando o suporte sólido enquanto retido pelo Tampão na coluna de vidro sinterizado contendo EDTA 5 mM. 0 material eluido foi recolhido em fracções de 1 ml e cada fracção foi testada em relação à presença de huTF como descrito no Exemplo

2. As fracçoes contendo huTF foram reunidas e dialisadas durante a noite contra 6 litros de TBS (NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5) contendo Triton X-100 a 1% (TBS/Triton) a 4 graus C.

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-510 dialisado assim formado foi subsequentemente misturado com 4 volumes de acetona fria para precipitar a proteína huTF. 0 precipitado foi em seguida recolhido por centrifugação a 5000 vezes g, durante 30 minutos, a aproximadamente menos 10 graus C. A pelota resultante foi seca sobre azoto. 0s rendimentos típicos foram de 2 yug de huTF por g (peso seco) de pó de tecido cerebral deslipidado.

Suspendeu-se em seguida uma amostra do huTF assim formaà 2 5 do em TBS/Triton e marcou-se em seguida com Na^x (16 micro-Curies por micrograma, Amersham, Arlington Heights, IL) usando Iodogen de acordo com as instruções do fabricante (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Após marcação o excesso de I não reagido foi separado do huTF marcado por cromatografia des salificante em Sephadex G-25 (Pharmacia, Inc., Piscataivay, NO) usando TBS/Triton.

125

As amostras contendo huTF marcado com I foram avaliadas por electroforese em gel de poliacrilamida-sulfato de dode cilo e sódio (SDS-PAGE) de acordo com Laemmli, Nature, 227:680-685 (1970). Incluiu-se ditiotreitol (DTT, Sigma) no tampão da amostra a 100 mM para as amostras avaliadas sob condições de redução. As imuno-precipitações foram efectuadas incubando du rante a noite, 4 graus C, χ-huTF em Triton X-100 a 1%, Tris-HC1 50 mM (ph 7,4), NaCl 120 mM com 1/10 volumes de sobrenadante de uma cultura de hibridoma de TF8-5G9 ou PAb 100 (ATCC TIB 115; um hibridoma produzindo um anticorpo específico do antigênio T, grande, de SV40, utilizado aqui como um controlo negativo). Em seguida, usou-se IgG anti-rato de cabra em péro las de agarose (Sigma Chemical Co, St, Louis, M0) para adsorver os produtos de imunorreacção principais. As pérolas foram 125 lavadas exaustivamente com o mesmo tampão e o Ι-huTF ligado foi eluído por ebulição durante 5 minutos, em tampão de amostra com ou sem DTT. As bandas da proteína foram visualizadas após SDS-PAGE por autofluorografia.

Quando huTF isolado foi radio-iodado, reduzido com DT e analisado por SDS-PAGE em geles de acrilamina a 10% observou-se uma banda principal isolada com uma massa molecular apareni te de 47 kilodaltons (Figura 4). Contudo quando o huTF não re

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-52duzido foi analisado de forma semelhante, observaram-se duas bandas de aproximadamente 58 e 47 kDa em quantidades relatai vamente iguais (Figura 5, faixa B), sugerindo, pelo menos, formas de dois tamanhos diferentes.

As explicações possíveis para as duas bandas observadas na ausência de redução são que a mais larga, i.e. a banda de migração mais lenta, pode estar mais altamente glicosilada e pode possuir proteína não processada adicional, ou pode estar | associada polipéptido ligadas por pontes de bissulfureto adicionais. A presença de uma só banda após redução não era con) sistente com as duas primeiras sujestões. Esta última possibi lidade parece mais provável mas devido à pequena diferença em tamanho as cadeias de polipéptido adicional seriam provavelmente suficientemente pequenas para migrar em ou próximo da frente corada e não seria revelada por geles de acrilamida a 10% após a redução. A electroforese de huTF reduzida ou não reduzida em geles de poliacrilamida a 15% não conseguiu mostrar uma única cadeia leve discreta embora se tenham observado várias bandas menores migrando rapidamente (Fig. 5 faixas A e B). Estes polipéptidos menores, pequenos, poderiam representar contaminantes que foram anteriormente referidos /~Broze et al., 3. Biol. Chem., 260:10917-20 (1985) e Guha et al., Proc. Natl. Açad. Sei. USA 83:299-302 (1986)_7 Para determi¹ nar as possibilidades, excisaram-se as bandas de 47 kDa e de kDa do gel não reduzido e foi cada uma delas reduzida com ditiotreitol e individualmente submetida a SDS-PAGE num gel de acrilamida a 15% (Fig. 5, faixas C e D). A proteína de 58 kDa foi determinada como sendo uma cadeia leve de 12,5 kDa e uma cadeia pesada de 47 kDa. Quando a proteína de 47 kDa foi examinada apenas se observou uma cadeia pesada com o mesmo peso molecular. Assim ambas as formas possuem cadeias pesadas com comportamento semelhante em SDS-PAGE.

Para demonstrar directamente a presença da cadeia leve, 125 imunoprecipitou-se Ι-huTF com o anticorpo monoclonal específico para huTF, TF8-5G9, e submeteu-se a electroforese na presença do agente redutor. A banda principal de 47 kDa foi

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-53observada conjuntamente com uma banda discreta de aproximadamente 12,5 kDa (Fig. 6 faixa A), A eloctroforese da amostra sem redução prévia produziu bandas de aproximadamente 47 kDa e 58 kDa, mas não de polipéptido de baixo peso molecular (Fig. 6 faixa S). A electroforese de huTF não reduzida produziu também quantidades menores de proteína de 90 kDa, sendo isto consistente com um dimero da cadeia pesada de huTF que foi sugeri, do por Broze et al., 3, Biol. Chem., 260:10917-20 (1935).

Para investigar a possibilidade da cadeia leve de huTF pjo der ser derivada proteoliticamente da cadeia pesada, as cadeias pesada e leve isoladas por SDS-PAGE foram submetidas a análise da sequência de aminoácidos do N-terminal.

As cadeias pesada e leve foram resolvidas em SDS-PAGE e electro-blotted em filtros de fibra de vidro, derivados de amino, activados, usando um método de pH elevado de Abersold et al., 3, Biol. Chem., 261:4229-4238 (1986). As bandas de proteína foram visualizadas nos blotts por coloração fluores. cente Abersold et al., supra, excisadas e sequenciadas, quando ainda ligadas à fibra de vidro, num sequenciador de proteínas Applied Biosystems 470A com análise por HPLC simultânea, dos derivados PTH. Alternativamente as bandas de proteína foram visualizadas no gel por coloração com azul de Coomassie e electro-eluídas para sequenciação. Ambos os métodos deram resultados equivalentes.

A microsequênciação da cadeia pesada de huTF resultou, consistentemente, em duas sequências de aminoácidos simultâneas em quantidades aproximadamente equimolares* Em quase todos os casos, cada resíduo de aminoácido apareceu duas vezes, com um afastamento de dois ciclos. Isto é uma prova clara da existência de terminais hl, sobrepostos de duas variantes de cadeia pesada de huTF as quais diferem, em comprimento no terminal N, em dois resíduos. 0 terminal N da variante maior foi deduzido como sendo Ser-Gly-X-X-Asn-Thr-Val-Ala-Ala-Tyr-X-Leu-Thr-Trp-Lys-Ser, na qual X representa um resíduo de ami noácido não especificado.

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As diversas tentativas para sequenciar a cadeia leve não deram qualquer informação sequencial, consistente com um termi nal-N bloqueado. Contudo, as cadeias pesada e leve do huTF são antigenicamente distintas, visto que dois anti-soros anti-huTF de coelho e vinte e oito anticorpos monoclonais murinos produzidos contra huTF isolado mostraram ligar-se à cadeia pesada isolada. Portanto, é pouco provável que a cadeia leve se ja um fragmento proteolítico da cadeia pesada. Além disso, a cadeia leve não reagiu com antisoros contra a microglobina beta₂.

significado da cadeia leve de huTF de 12,5 kDa é presentemente desconhecido. E pouco provável que seja derivado por artefacto durante o isolamento por troca de bissulfureto ocasional, visto que é uma espécie molecular discreta, isolada. Quando huTF isolado por afinidade foi submetido a SDS-PAGE sem redução, a actividade do huTF foi eluída por geles correspondendo a ambas as formas de peso molecular de 58 kDa e 47 kDa. A actividade de huTF correspondendo a estas duas formas de peso molecular foi também detectada quando cerebro em bruto ou extractos placentários parcialmente isolados foram submetidos a electroforese em geles SDS (dados não representados). Em to dos os casos a actividade estava dependente do factor-VII, indicando assim actividade específica de huTF. Estas observações indicam que o huTF isolado pode activar o factor VII e que a cadeia leve não é necessária para esta função.

Há interesse em que a cadeia leve tenha ligações bissulfureto só com,cerca de metade das cadeia pesada de huTF. Ou está ausente in vivo de uma proporção significativa de huTF, ou está presente, mas associado através de interacções não-covalentes que podem ser destruídos por detergentes. A cadeia leve do huTF pode ter passado despercebida em estudos mais antigos, porque o seu pequeno tamanho resultaria em migração na frente de corante em SDS-PAGE, e porque têm sido efectuadas análises publicadas de huTF após redução. As quantidades limi tadas que podem ser isoladas usando métodos de afinidade coraji tes, tornam difícil a detecção de uma pequena cadeia polipépti.

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-55da associada por coloração da proteína.

Embora o huTF monomérico inicie a coagulação in vitro, o início fisiológico da coagulação por huTF ocorre em superfícies celulares. Pode-se especular que a cadeia leve possa ter papeis mais subtis na função ou organização de huTF, do que os que podem ser detectados num ensaio de coagulação simples. Por exemplo, a cadeia leve pode estar envolvida na reunião das duas subunidades receptoras para o factor VII, e que tem sido posto como hipótese para explicar a aparente cooperatividade positiva da ligação do factor Vll/Vlla ao factor tecidual. Al. ternativamente, a organização do huTF em domínios estruturais sobre a superfície celular, e a regulação da actividade de huTF sobre as superfícies celulares, pode ser mediado pela molécula de cadeia leve de huTF.

Examinou-se o papel de oligossacáridos ligados por N,

125 desglicosilando uma amostra do Ι-huTF. Misturaram-se cerca de 12,74 nanogramas (ng) de huTF marcado contendo aproximadamente 3,6x10 contagens por minuto (cpm), com 20 yd de uma solução contendo 0,4 unidades de glicopeptidase F (Boehring-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN), Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), EDTA 10 mM e Triton X-100 a 1% e mantiveram-se subsequentemente durante 16 horas a 37 graus C. Os produtos desglicosilados foram então analisados por SDS-PAGE como previamente descrito.

Os resultados dos estudos da desglicosilação apresentados na Figura 7, faixas 4 e 5, indicam que a forma de 58 kDa do huTF apresenta um peso molecular relativo superior h forma de 47 kDa devido à presença de grupos de proteína de adição,

i.e., a cadeia leve.

huTF assim isolado foi relipidado para reconstituir a sua actividade pro-coagulante. Determinou-se empiricamente a proporção factor tecidual:lípido necessário para proporcionar um produto de factor tecidual relipidado possuindo actividade máxima, dissolvendo o huTF isolado obtido acima a diversas co£ centrações em solução tampão HBS (Hepes 20 mM, pH 6,0, NaCl 140 mM, azida de sódio a 0,01%) contendo BSA a 0,1%. Relipida. ram-se então as diversas diluições de huTF como abaixo descri

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-56to, e a proporção produzindo a actividade maior recuperada como determinado no ensaio de coagulação descrito no Exemplo 2 foi então preparado para uso posterior.

Prepararam-se os lípidos para a relipidação de huTF, extraindo-os do pó de acetona de cérebro de coelho obtido de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. 0 pó foi misturado com heptano:butanol (2:1, v/v) a uma proporção de 25 ml de heptano butanol por grama de pó, e os sólidos nele contidos foram recu perados por filtração usando um funil de vidro sinterizado. 0 processo de extracção foi repetido 6 vezes sobre os sólidos re tidos. Os sólidos retidos foram depois secos por roto-evapora ção, dissolvidos em clorofórmio e armazenados a menos 80 graus *

C. A medida da necessidade, porçães dos sólidos dissolvidos em clorofórmio foram secas sob azoto e dissolvidas para uma concentração de 4 mg/ml numa solução de desoxicolatc de sódio a 0,25% acabada de preparar para formar uma solução de fosfolípidos de cérebro de coelho (RBPL).

Para a relipidação, misturaram-se 100 ul de cada diluição de huTF com 100 pl de solução RBPL 0,76 ml de solução de HBS contendo albumina de soro bovino a 0,1% (HBS/BSA) e 40 yU de uma solução de cloreto de cádmio 100 mM. Esta mistura foi mantida a 37 graus C durante 2 horas e determinou-se a actividade do huTF enle contido, no ensaio de coagulação descrito no Exemplo 2.

5. Produção de Hibridomas e de Anticorpos Monoclonais

Todos os hibridomas foram produzidos usando células de baço de ratos Balb/c fêmeas, obtidos a partir do viveiro Scripps Clinic and Research Institute, variando em idade de 6 a 8 semanas.

a. Imunização de rato TF8

Dissolveram-se cinco microgramas ( isolado por afinidade preparados no Exemplo 4, em solução sa-

sequentemente a uma proporção de 1:1 (U/V) com adjuvante R-700 obtido de Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton, MC. A

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emulsão foi então injectada subcutaneamente (s.c.) no rato TF8.

rato TF8 foi inoculado de forma semelhante cerca de duas semanas depois, usando uma emulsão contendo huTF desnaturado e adjuvante R-700. 0 huTF desnaturado foi preparado fervendo durante 5 minutos TBS /CaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5)_7 contendo Triton X 100 a 0,09%, SDS a 0,93%, 2-mercaptoetanol 0,2 M e huTF a 270 ^tg/ml. Em seguida o huTF desnaturado foi misturado com um volume igual de solução salina normal contendo 0,6 mg/ml de albumina de soro de rato. Subsequentemente, misturaram-se 4 volumes de acetona à solução de huTF desnaturado, e a mistura resultante foi mantida durante a noite a menos 20 graus C. 0 precipitado resultante foi recolhido por centrifugação a cerca de 13 000 vezes g durante 10 minutos, lavada uma vez com uma solução 4:1 (V:V) de acetona:!-^ e depois suspensa em 200 ynJL de solução salina normal a uma concentração de 0,1 mg/ml.

Cerca de quatro semanas depois da injecção inicial, mistu raram-se 33 yq de huTF isolado por afinidade (não-desnaturado) em 0,1 ml de solução salina normal com 0,1 ml de Adjuvante de Freund Completo (CFA) para formar uma emulsão. Esta emulsão foi então injectada intraperitonealmente (i.p.) no rato TF8.

Cerca de oito semanas após a inoculação inicial, injecta ram-se intravenosamente (e.v.) 15 g de huTF isolado por afini dade em solução salina tamponada com fosfato (PBS.) e administrou-se e.v. um inóculo huTF/ΡΒΞ idêntico, vinte e quatro horas depois. Os esplenócitos de ratos TF8 foram recolhidos para fusão três dias depois.

b. Imunização de rato TF9 rato TF9 foi submetido ao mesmo esquema de inoculação que o rato TF8 com a excepção que ambas as injecçães de adjuvante Ribi usaram huTF que tinha sido desnaturado antes da emulsão. Em adição, o primeiro inóculo de PBS foi administrado i.p. e 4 ¹/2 meses após o inóculo contendo CFA.

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c. Formação de Hibridoma

Usou-se o mesmo protocolo de fusão para esplenog eitos derivados de TF8 e TF9. Misturaram-se cerca de 1 x 10 esplenocitos de cada rato com 2 x 10 células de mieloma P3X63 AgB.653.1 em 200 μΧ de um meio de fusão compreendendo 30% p/v de polietileno-glicol (PEG 4000, ATCC 25322-68-3). Após a fusão das células, os hibridomas resultantes foram semeados em placas de 96 depósitos, cultivados em meio HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina), e seleccionados subsequentemente em relação à sua capacidade de produzir uma molécula de anticorpo que reaja com huTF.

Ambas as fusões derivadas de células de baço de TF8 e de TF9 de rato resultaram em clones de células de hibridoma re sistentes em meio HAT. A fusão de TF8 produziu 907 hibridomas resistentes em HAT enquanto que a fusão TF9 produziu 348 hibri. domas resistentes em HAT.

6. Selecção de Hibridomas para a Produção de Moléculas de Anticorpo Anti-huTF

a. RIA de Fase Sólida de IgG anti-rato de cabra Indianapolis, IN) diluídos de placas de microtitulação

Misturaram-se cem yJ. (Boehringer-Mannheim Biochemicals, para 20 ^ug/ml e TBS, nos depósitos de vinilo flexível,de 96 depósitos, Immulon (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA). As placas foram então mantidas durante 1 hora a 37 graus C para que a IgG seja absorvida sobre as paredes dos depósitos. Após lavagem com TBS três vezes, 100 yúL de TBS/Triton contendo 3% de ovalbumina foram misturados para dentro de cada depósito para bloquear o excesso de locais de ligação de proteína.

Os depósitos foram mantidos durante 1 hora a cerca de 20 graus C e a solução bloqueadora foi em seguida removida por as. piração. Misturaram-se para dentro de cada depósito cinquenta al de sobrenadante de cultura de hibridoma. A mistura de imu norreacção de fase sólida-líquida resultante foi mantida a 37 graus C durante 1 hora. Os depósitos foram depois lavados três

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-59vezes com TBS e o líquido em excesso fci removido por aspiração.

Misturaram-se para cada depósito cinquenta U,1 de huTF 125

I-marcado, preparado no Exemplo 4, e contendo aproximadameri te 1 ng de huTF e aproximadamente 5 x 10^ cpm em TBS/Triton, para formar uma segunda mistura de imunorreacção de fase sólida-liquida. Os depósitos foram mantidos durante 2 horas a 37 graus C e depois lavados três vezes com TBS/Triton para isolar k 125 | os produtos de imunorreacção contendo Ι-huTF ligado à fase sólida. 0 liquido em excesso foi removido por aspiração e os ) depósitos foram deixados secar. Os depósitos individuais fo125 ram cortadas e ο I contido em cada um, foi determinado por um contador gama.

A radioactividade de fundo (nenhuma reacção do huTF com o anticorpo) era, em média, cerca de 200-300 cpm por depósito, enquanto que as reacções de huTF com o anticorpo produziram 10 000 cpm por depósito. Os hibridomas ensaiados como positivos para a produção de anticorpos anti-huTF foram seleccionados e constituem os hibridomas do presente invento. Subsequentemejn te, aqueles hibridomas foram seleccionados no ensaio de mancha em ponto abaixo descrito.

b. ELISA de Mancha em Ponto (Dot Blot)

I

Extraiu-se duas vezes com uma solução 4:1 (V/u) acetona:H20, huTF precipitado por acetona preparado no Exemplo

4. 0 precipitado que ficou foi re-suspenso em 20 jug/ml em TBS.

Vinte ng (1yd) desta solução de huTF foram ponteadas sobre papel de nitrocelulose BA83 (Schleicher and Schuell, Keene, NH) junto a um número escrito no papel com tinta indelével. 0 huTF ponteado foi seco ao ar e os pontos individuais foram recortados em círculos de papel usando um furador. 0s circulos de pa pel individuais foram imersos em depósitos individuais de um tabuleiro com vários depósitos contendo BLOTTO /^ohnson e col., Gene. Anal. Tech., 1:3 (1984)_J7, e foram mantidos a 37 graus C durante cerca de 1 hora.

BLOTTO foi removido dos depósitos por aspiração e adi67 562

EPG:11-SCRF 113.2

cionaram-se a cada depósito 200 yj de sobrenadante de cultura de hibridoma. Os depósitos foram então mantidos a 37 graus C durante 2 horas. Os círculos de papel foram lavados duas ve zes com TBS, removidos dos depósitos e combinados num só recipiente maior para uma lavagem adicional em TBS. 0 excesso de líquido foi depois removido do recipiente.

IgG anti-rato conjugada com fosfatase alcalina no equipa mento reagente Protoblot (Promega Biotech, Ann Arbor, Ml) foi diluída 1:5700 em BLOTTO e colocada em contacto com cs círculos de papel. A solução Protoblot foi mantida em contacto a 37 graus C durante 30 minutos. 0s círculos de papel foram depois lavados três vezes em TBS. Detectou-se fosfatase alcalina ligada nos círculos de papel usando os substratos cromogÓni cos fornecidos no equipamento Protoblot, de acordo com as instruções do fabricante.

c. Ensaio de Mancha Western

Para ensaios de Mancha Western, dissolveram-se cerca de 10 yjg de huTF isolado da forma descrita no Exemplo 4 numa amostra tampão (SDS a 2%, ditiotreitol 50 mM, glicerol a 10%, Tris-HCl 125 mM, pH 6,8) e ferveram-se durante 5 minutos. Foi então submetido a electroforese SDS-gel de poliacrilamida numa placa de gel de estilo preparativo como descrito por Laem mli, Nature, 226:680 (1970), cujos processos estão aqui incorporados como referência, numa faixa larga flanqueada em cada lado por pequenas faixas contendo padrões de peso molecular prê -corados (Diversified Biotech, Neuiton Centre, MA). Após electroforese e electroblotting sobre nitrocelulose, como descri to por Touibin e col., Proc. Natl. Acad. Sçj. USA, 76:4350 (1979) cujos processos estão aqui incorporados como referência, a mancha foi bloqueada com uma solução de leite,sem gordura,em pó a 5% em TBS e segura num tubo de ligação (Miniblotterj Immunetics, Cambridge, MA). Lotes de sobrenadantes de oito culturas de células de hibridoma foram colocados em cada fenda do tubo de ligação e incubados durante 1 hora a 3730, após o qual a mancha foi removida e lavada com TBA (TBS contendo azida de sódio a 0,02%). As faixas que tinham ligado o anticorpo

562

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foram visualizadas usando um segundo anticorpo conjugado com fosfatase alcalina revelavo com um substrato cromogénico (Protoblot; Promega, Biotech, Madison, Wl) de acordo com os processos sugeridos pelo fabricante. Os sobrenadantes de culturas de lotes positivos foram re-testados isoladamente a uma diluição de 1/8 em leite sem gordura em pó a 5% em TBA para identificar clones de hibridomas individuais que produzem anticorpos anti-TF.

Os hibridomas que foram considerados positivos para a produção de anticorpos anti-huTF, foram seleccionados para caracterização posterior. Por exemplo, hibridomas derivados da fusão TF8 acima foram caracterizados como culturas de hibridoma produzindo anticorpo anti-huTF. Se os sobrenadantes de cul tura de hibridoma demonstrassem imunorreacção com huTF no ensaio de mancha em ponto descrito no Exemplo 6b e na RIA de fase sólida descrita no Exemplo 6a. Estas caracterizações produ. ziram linhas de células de hibridoma 4 TF8 como se mostra no Quadro 5 no exemplo 13.

Os hibridomas derivados da fusão TF9 foram caracterizados como culturas de hibridoma produzindo anticorpo anti-huTF se os sobrenadantes de cultura de hibridoma demonstrassem imunorreacção com huTF no RIA de fase sólida descrito no Exemplo 6a e no ensaio de mancha Western descrito no Exemplo 6c. Estas caracterizações produziram 24 linhas de células de hibridoma TF9, a maior parte das quais está apresentada no Quadro 5 do Exemplo 13.

As moléculas de anticorpo produzidas por um hibridoma particular seleccionado pelos métodos de selecção atrás meneio nados, estão aqui referidas por caracteres que indicam 1) o ra to imunizado (i.e. TF8 ou TF9) que doou células de baço para uma fusão particular, e 2) a placa de cultura de 96 depósitos, número da fila e do depósito do qual uma célula particular de hibridoma resistente em meio HTA foi isolada (i.e., 5B7, 11D12, etc.). 0 carácter de referência específico pode ser aqui lis. tado como uma palavra, como palavras compostas ou como duas pa lavras. Por exemplo, os caracteres seguintes referem-se a três

562

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-62composições de molécula de anticorpo monoclonal idênticas: TF8-5G9, TF8-5G9, e TF8-5G9.

7. Isolamento de Imunoglobulina IgG

Isolou-se imunoglobulina IgG a partir do fluido ascítico de um rato, contendo a linha de células de hibridoma de rato TF8-5G9 (ATCC número HB9382), usando um sistema MAPS II de Biorad Laboratories de acordo com as instruções do fabricante, Determinou-se a concentração de proteína da IgG isolada usando o Reagente de Ensaio de Proteína BCA (Pierce Chemical Co.) de acordo com as instruções do fabricante.

8. Preparação de um suporte sélido contendo anti-huTF para isolamento por Imunoafinidade de huTF

Anticorpos anti-huTF foram activados para se ligarem a uma matriz sólida de agarose dialisando 10 mg de anticorpo monoclonal TF8-5G9 isolado por MAPS, preparado como descrito no Exemplo 7, contra 500 ml de um tampão de diálise consistindo de ΜΕΞ 0,1 M, pH 6,5, durante 16 horas a 4 graus C com pelo me nos uma mudança do tampão de diálise. Os anticorpos TF8-5G9 activados doram então misturados com 2 ml de pérolas de agarcse AffiGel-10 (Biorad), e a mistura de reacção de ligação resultante foi continuada de acordo com as instruções do fabricante para formar um suporte sólido de agarose/TF8-5G9.

excesso de locais de ligação de proteína no suporte sj5 lido foram então bloqueados, lavados e filtrados sob vácuo, cq mo descrito no Exemplo 3 para formar um bolo de TF8-5G9/agarose.

9. Isolamento de huTF por Imunoafinidade

Uma solução de extracto cerebral equivalente a cerca de metade de um cérebro humano, i.e., cerca de 100 ml, e preparada no Exemplo 1, foi dialisada durante três dias, com duss mudanças, contra um total de 6 litros de tampão A a 4 graus C. 0 extracto cerebral dialisado foi então centrifugado a 10 000 x g durante 4,5 horas. 0 sobrenadante resultante foi misturado com o bolo de éster de etilglicina-agarose, preparado no Exemplo

562 ζ

-63EPG:11-SCRF 113.2

4, para formar uma mistura de reacção de fase sólida-líquida. Após serem mantidas durante 2 horas à temperatura ambiente com rotação, as fases sólida e líquida foram separadas por filtração usando um funil de vidro sinterizado. A fase líquida contendo huTF foi recuperada e misturada com o bolo TF8-5G9/agaro se, preparado no Exemplo 8, para formar uma mistura de imunorreacção de fase sólida/líquida.

A mistura de imunorreacção foi mantida durante a noite a graus C, com rotação, para permitir a formação de um produto de imunorreacção de fase sólida contendo factor tecidual. As fases sólida e líquida foram depois separadas por filtração co mo previamente descrito. A fase sólida foi retida e depois la vada com 10 volumes de tampão A. A fase sólida foi então trans. ferida para uma coluna de cromatografia de vidro e lavada sequencialmente com (1) 2 volumes de NaCl 1 M contendo Triton X-100 a 1%, e (2) 2 volumes de glicina 0,1 M, pH 4,0 contendo Triton X-100 a 1%.

Qualquer huTF ligado imunologicamente ao suporte sólido após as lavagens acima foi então libertado (eluído) lavando o suporte sólido, enquanto retido sobre um funil de vidro sinterizado, com 20 ml de glicina 0,1 M, pH 2,5, e Triton X-100 a 1%. 0 material eluído foi então recolhido, ensaiado em relação a huTF reunido e dialisado, tal como descrito no Exemplo 4.

produto dialisado foi subsequentemente misturado com quatro volumes de acetona fria para precipitar a proteína huTF. 0 precipitado foi então recolhido por centrifugação a 5 000 ve. zes g durante 30 minutos a aproximadamente -10 graus C. A pelota resultante foi seca sob azoto e uma porção da pelota foi analisada por electroforese SDS-gel de poliacrilamida (SDS-P/À GE) sob condições desnaturantes.

Os resultados dessa análise, apresentados na Figura 8, indicam que o huTF pode ser isolado por imunoafinidade com uma produção de 33 mg de huTF por grama de pó de cérebro deslipida. do.

562

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10. Inibição da coagulação por anticorpos Anti-huTF

Dez microlitros de um sobrenadante de cultura de hibrido.

ma foram misturados com 90 yul de HBS/BSA contendo cerca de 2 ng do huTF relipidado preparado no Exemplo 4. As misturas de imunorreacção assim formadas foram mantidas a 37 graus C durari te 30 minutos para permitir que as moléculas de anti-corpo anti -huTF liguem imunologicamente o huTF e formem um produto de imunorreacção. As misturas de imunorreacção foram subsequente mente ensaiadas em relação à actividade pró-coagulante do huTF, como descrito no Exemplo 2. Usou-se uma preparação de IgG irrelevante em vez do anticorpo anti-huTF como um controlo negativo.

Uma concentração de huTF eficaz foi extrapolada da curva padrão produzida, como no Exemplo 2, usando o tempo de coagulai ção medido na presença do inibidor. A inibição fci expressa como uma proporção, em percentagem, da concentração de huTF eficaz sobre a concentração de huTF usada de facto. As preparações de molécula de anticorpo monoclonal produzindo pelo menos uma inibição de 50 por cento, foram seleccionadas como com posições de molécula de anticorpo neutralizante do presente in vento.

Mediram-se numerosos sobrenadantes de cultura de hibrido. mas produzidos contra huTF isolado, como descrito no Exemplo 5, pelo processo acima para avaliar a sua capacidade de inibir a iniciação da coagulação. Aqueles hibridomas que mostraram ini bir significativamente a iniciação da coagulação estão identificados no Quadro 5.

A inibição de coagulação por anticorpos anti-huTF foi também conseguida usando complexos huTF-factor VII pre-formado. Misturaram-se dez yj contendo cerca de 1 ng de huTF relipidado, preparado no Exemplo 4, com 70 ykl de HBS/BSA, 10 yj. de cloreto de cálcio 20 mM e, onde indicado, 10 jul contendo cerca de 25 ng de factor VII preparado da forma descrita no Exemplo 3. E.s ta mistura foi mantida a 37 graus C durante 15 minutos para permitir que o huTF forme um complexo com qualquer factor VII

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-65disponível na mistura. Depois disso, 10 yd da solução foram ainda misturados, contendo cerca de 10 ng de anticorpo monoclo nal isolado com MAPS, preparado da forma descrita no Exemplo 7, e esta segunda mistura foi mantida a 37 graus C durante 30 minutos. A inibição de coagulação foi então medida na mistura resultante adicionando, em primeiro lugar, 100 yd. de cloreto de cálcio 20 mM seguido de 100 yd de plasma citrado humano ou plasma isento de factor VII, preparado da forma descrita no Exemplo 12 e observando o tempo de coagulação em segundos. A percentagem de inibição foi expressa como descrito no Exemplo 10, e os resultados destas inibições com complexo huTF-factor VII pré-formado, estão apresentados no Quadro 6a.

QUADRO 6

Inibição da coagulação iniciada por huTF-Factor VII por anticorpos anti-huTF

I. Coagulação com Plasma Humano Citrado

Anticorpo	Factor	VIIU	Percentagem de	Inibição
r u a Em branco	+		0
TF85G9b	+		58%
Controlo0	+		0
TF85G9	-		83%
Controlo	-		0
II. Coagulação	com Pjasma	Humana	Isento de Factor VII
Anticorpo	Factor	VII	Percentagem de	Inibição
Em branco	+		0
TF85G9	+		58%
Controlo	+		Q

6Ί 562

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-66^a Em branco indica que não se usou qualquer anticorpo monoclonal no ensaio.

^b TF85G9 indica que o anticorpo monoclonal isolado do hibri doma TF8-5G9, era o anticorpo usado no ensaio.

^c Controlo indica que o anticorpo que se usou no ensaio era um anticorpo monoclonal irrelevante.

^b + indica que o factor VII foi adicionado e deixado formar um complexo com huTF purificado, antes do anticorpo ser adi. cionado à mistura.

Têm sido efectuados estudos adicionais de inibição da coa gulação por anticorpos anti-huTF sob condições que comparam a inibição antes e após o TF ter sido associado ao factor Vll/VIIa para formar um complexo TF:factor Vll/VIIa.

Nestes estudos, a inibição da coagulação por anticorpos anti-huTF usando complexos TF:VIl/VIIa pré-formados, foi conse. guida essencialmente da forma descrita acima no Exemplo 10, com a excepção de que a solução contendo 10 jjX de anticorpo mo noclonal utilizada foi sobrenadante de cultura de hibridoma em vez de uma solução contendo anticorpo monoclonal isolado com MAPS. Em comparação, a inibição da coagulação por anticorpos anti-huTF foi assegurada efectuando imunocomplexos entre estes dois anticorpos e huTF relipidado, antes da mistura com plasma citrado contendo factor Vll/VIIa como descrito acima no Exemplo 10.

Embora todos os anticorpos presentemente descritos tenham sido examinados neste ensaio de inibição comparativo, só aqueles que apresentavam uma inibição superior a cerca de sessenta por cento (60%) foram considerados significativos para uma capacidade para inibir a coagulação iniciada por um complexo huTF:Vll/VIIa. Aqueles MoAbs são TF9-1B8, TF9-5B7, TF8-5C4, TF8-11D12, e TF8-21F2.

562

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11. Síntese do polipêptido

Os polipéptidos correspondendo às diversas regiões huTF aqui utilizadas, foram quimicamente sintetizadas num Applied Biosystems Model 430A Peptide Synthesizer, usando o método do anidrido simétrico de Hagenmaier, e col., Hoppe-Seyler*s Z. Physiol. Chem., 353:1973 (1982). Em adição aos polipéptidos listados nos Quadros 1 e 2, os polipéptidos listados no Quadro 3, abaixo, foram também sintetizados e compreendem polipéptidos do presente invento úteis para a produção de anticorpos anti-polipéptido, capazes de reagir com huTFh.

QUADRO 3

Polipéptidos Antigénicos

P121-155 p204-226 p225-244 p245-263

H-TKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTL-OH H-DSPVECMGQEKGRFREIFYIIGA-OH H-GAVl/FVVIILVIILAISLHK-OH H-CRKAGVGQSWKENSPLNVS-OH

12. Inibição da Coagulação por Polipéptidos

A capacidade dos polipéptidos do presente invento inibirem a coagulação iniciada por huTF foi testada incubando primeiro os polipéptidos na presença de factor Vll/VIIa e iões cálcio e depois adicionando esta mistura a plasma deficiente em factor Vll/VIIa e calculando os tempos de formação de coágij los.

factor Vll/VIIa humano foi isolado como se descreveu no Exemplo 3. Adicionaram-se dez microlitros de uma solução de 200 ng deste factor Vll/VIIa isolado por ml de HBS/BSA a uma solução compreendendo 100 yçl de HBS, 20 ybl de CaC^ 25 mM, e com 100 jlaI de TBS/Triton contendo polipêptido sintético. Foram assim preparadas numerosas misturas que continham várias concentrações do polipêptido e mantiveram-se então a 37 graus C durante 15 minutos. 0 factor tecidual relipidado, preparado da forma descrita no Exemplo 4, foi diluído em HBS/BSA de modo que 10 ul dessem um tempo de coagulação de aproximadamente 45

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-68segundos quando testado no ensaio de coagulação descrito no Exemplo 2. A mistura mantida anterior foi ainda misturada com mM e com 100 yX de plasma deficiente em factor Vll/l/IIa (George King Bio-Medical, Inc., Overland Park, KA) diluído a 1 parte de plasma para 1,5 partes de HBS. 0 tempo de formação de coágulos foi então determinado e representado como se descreveu no Exemplo 2. Tomou-se um prolongamento do tempo de formação de coa'gulos como indicativo da inibição da coagulação pelo polipéptido sintético. A percentagem de inibição foi cajL culada como descrito no Exemplo 10. Os polipéptidos que produ. zem pelo menos uma inibição da coagulação de 30% foram conside^ rados análogos polipéptido do sítio de ligação de huTFh, i.e. polipéptidos p26-49, pl46-167 e pl61-189 como se mostra na seç. ção I do Quadro 4.

Alternativamente, foi usado no ensaio de inibição anteri or, plasma deficiente em factor Ull/Ulla preparado a partir de plasma que foi despojado de factor Vll/VIIa por adsorção de imunoafinidade com anticorpos monoclonais. Um anticorpo mono clonal para factor Vll/VIIa humano foi preparado essencialmente da forma descrita no Exemplo 5, com a excepção desse factor l/Il/VIIa isolada como se descreveu no Exemplo 3 ter sido usado com imunogénio em lugar de huTF. Os hibridomas resultantes fo ram avaliados por ELISA para identificar um hibridoma que não reaja com as proteínas de sangue humano, proteínaS, factor IX, factor X e factor II, obtidas de Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN. Um tal hibridoma FVll.F1.2H3-3,2, é obtenível de Dr. T.S. Edgington (Scripps Clinic and Research Foundation, La Qolla, CA). A imunoglobulina IgG foi isolada doíl;i do ascítico de um ratinho contendo hibridoma Fl/11 F1.2H3-3.2 e a IgG isolada foi conjugada com um suporte sólido como se descreveu no Exemplo Θ. 0 suporte sólido resultante, contendo a_n ticorpo monoclonal anti-factor l/Il/l/IIa, foi usado para retirar o factor Vll/VIIa de plasma normal reunido e citrado usando o procedimento de imunoafinidade descrito no Exemplo 9 com a excepção de a fase líquida contendo plasma ser recolhida e retida.

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A capacidade de alguns dos polipéptidos inibirem competi, tiuamente a coagulação quando usados na forma lipidada foi cal. culada no ensaio anterior substituindo por 100 ytil de polipépti do sintético lipidado os 100 jul de solução de polipéptido sintético.

Os péptidos sintéticos lipidados foram preparados da fo_r ma descrita no Exemplo 4 para relipidação de huTF isolado com a excepção de se substituir huTF isolado por polipéptido sinté. tico. Usou-se geralmente a razão de 52 para 1 (p/p) de lípido para polipéptido. Os polipéptidos lipidados que produzem pelo menos 30% de inibição da coagulação foram considerados análogos polipéptidos do sítio de ligação de huTFh, quando presentes na forma lipidada, i.e. os polipéptidos apresentados na Secção II do Quadro 4.

67 562
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QUADRO 4

Inibição da Coagulação iniciada por huTF por Análogos Polipépti dos de huTFh

Pêptido	Inibição	Concentraçã
Péptidos	não fosfolipidados
pl-30	25,0	10
p26-49	88,8	10
P41-71	25,0	10
p40-49	25,0	10
p56-71	25,0	10 jkM
p72-104	25,0	10
p94-123	20,0	10 /ΛΊ
P121-155	10,0	10
P146-167	87,5	10 yUM
plól-189	32,5	10 juM
P190-209	20,0	10
P204-226	20,0	10
nenhum	0	1
Péptidos	F os folipidados
pl-30	81,0	10 γ
p26-40	83,0	10
P40-71	65,0	10
P50-71	73,3	30 jllM
p94-123	93,7	ίο γ
P121-155	55,0	10 p
P146-167	80,0	10 juM
plól-189	94,0	10

Q

Percentagens de Inibição determinadas como se descreveu no Exemplo 12.

Os exemplos de curvas de resposta à dose obtidas quando se realizaram os anteriores estudos de inibição por polipéptido são apresentados nas Figuras 9 e 10.

562

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13. Inibição da Imunorreacção de huTF com Anticorpo por Polipéptidos

Os depósitos de placas de 96 depósitos de fundo em U Immulon feitas de vinilo flexível (Dynatech) foram revestidas com IgG de cabra anti-ratinho (Boehringer-Mannheim) como se descreveu no Exemplo 6 com a excepção do bloqueamento do exces. so de sítios de ligação de proteína ser realizado durante 20 minutos a 37 graus C.

Cinquenta yd de sobrenadante da cultura de hibridomas fo ram colocados em cada depósito e mantidos durante 1 hora a 37 graus C. Os depósitos foram então enxaguados três vezes com TBS e o líquido em excesso foi removido por aspiração.

huTF isolado foi preparado em colunas de imunoafinidade como se descreveu no Exemplo 9. Os precipitados em acetona resultantes contendo huTF isolado foram dissolvidos em TBS/Tri ton e a concentração em proteína foi determinada usando o BCA Protein Assay Reagent (Pierce) de acordo com as especificações do fabricante. Os grupos laterais hidratados de carbono em huTF foram biotinilados usando biotina-hidrazida (ICN Biomedicals Inc., Plainview. NO) de acordo com os métodos descritos por O'Shannessy et al., Immunol, Letters, 8:273-277 (1984) for. mando uma solução de huTF biotinilada.

Cinquenta jLL de solução de huTF biotinilada preparada pja ra 60 ng/ml de TBS/Triton foram então colocados em cada depósi. to em conjunto com 5 yuM de polipéptido sintético e mantidos du. rante 1 hora a 37 graus C. Os depósitos foram então enxaguados três vezes com TBS/Triton.

Cem y<l de fosfatase alcalina conjugada com estreptavidina (Detek I-alk, Enzo Biochem Inc., Nem York, NY) diluídos a 1/100 em TBS contendo EDTA 5 mM, 0,5% de Triton X-100 e 1/ de BSA foram colocados em cada depósito e mantidos durante 30 minutos a 37 graus C. 0s depósitos foram então enxaguados quatro vezes com uma solução contendo fosfato de potássio 10 mM (pH 6,5), 2/o de BSA, 0,5% de Triton X-100, cloreto de sódio 0,5 M e EDTA 1 mM, seguindo-se um único enxaguamento com tam67 562

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-72pão de detecção /Tris-HCl 0,1 M (pH 8,8), NaCl 0,1 M, MgC^ 5 mM_7.

lo em tampão de detecção foi então adicionada a cada depósito e mantida durante 1 hora a 37 graus C. A absorvância óptica a 405 nanómetros (nm) foi então medida para cada depósito usando um leitor de microplaca Bio~Tek (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT). Os resultados do estudo de inibição competitivo são apre sentados no Quadro 5.

562

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-73QUADRO 5

Quadro das Interacções de Péptidos com Anticorpos

Monoclonais

	Ch	rH	Qx	r—l
o	<r	r-		r^
	1	1	1	1
|		o		M3
r—I	(XI			m
CL	CL	CL	CL	CL

	LA	>	οχ	OX
<r	ΙΛ	LTX	MJ	CO	o
o	CXI	i—I	í—1	1—i	CM
r-4	r—I	r	1	1	1
1	1	«—1	M3	i-4	o
CXI	<r	(XI	<t	MD	OX
r~	□x	rd	r-4	—1	.-4
CL	CL	CL	CL	O..	CL

TF85G9 +

TF811D12 +

TF85C4

TF821F2

TF91D5

TF92C4

TF92F6

TF95C7

TF96B4

TF99C3

TF910C2

TF91F1+

TF91E7

TF91B8

TF91B9+

TF94D11+

TF95G4+

TF95B7 ++

TF96G4+

TF97E10+

TF98E8 ++

TF99E1 ++

TF99B4+

TF96C8^b ++

TF910H5^b+

TF99D6^b+

TF910 H10^b ++

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74^a Cada anticorpo monoclonal (Mab) foi produzido por um hibridoma possuindo a mesma designação. Todos os anticorpos monoclonais foram analisados usando sobrenadantes de cultura de hibridoma como se descreveu no Exemplo 13.

Estes anticorpos foram considerados não neutralizantes de acordo com os resultados do Exemplo 10; todos os outros a_n ticorpos foram considerados neutralizantes de acordo com os mesmos resultados.

A inibição foi considerada significativa se o valor medi, do da absorvância, obtido na presença de polipéptido, estava para além de um desvio padrão do valor médio obtido para um da, do anticorpo na ausência de polipéptido.

14. Detecção de huTF numa Amostra Corporal por ELISA de

Dois Sítios

A huTF pode ser detectada numa amostra corporal tal como sangue, plasma, saliva, urina, etc., usando dois anticorpos mo noclonais que ligam concorrentemente a mesma molécula de huTF.

As placas de 96 depósitos de fundo em U, de poliestireno, Immulon, (Dynatech) foram revestidas com IgG de cabra anti-ratinho (Boehringer-Mannheim) misturando primeiro em cada depósi.

a solução de IgG em contacto com o depósito durante a noite a graus C. Os depósitos foram enxaguados três vezes com TBS e adicionaram-se a cada depósito 100 ul de TBS/Tritcn contendo

3% de BSA. Os depósitos são então mantidos durante 1 hora a 37 graus, enxaguados três vezes com TBS e c líquido em excesso é removido por aspiração.

Cem yj de um sobrenadante de cultura de um primeiro hibridoma, contendo moléculas de anticorpo anti-huTF, TF9-6B4, são misturados em cada depósito e mantidos durante 1 hora a 37 graus C, Os depósitos são então enxaguados três vezes com TBS e o líquido em excesso é removido por aspiração.

huTF isolado por imunoafinidade e precipitado com ace67 562

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-75tona, preparado no Exemplo 9, é dissolvido em TBS/Triton. Pre param-se diluições da solução de huTF variando entre 5 j^g/ml e 0,5 ng/ml de TBS/Triton e 100 jaI de uma diluição são colocados num depósito da placa Immulon. As diluições de huTF são manti das em contacto com o primeiro anticorpo durante 1 hora a 37 graus C. As diluições são então removidas e os depósitos são enxaguados três vezes com TBS/Triton. 0 líquido em excesso é removido por aspiração.

Os anticorpos anti-huTF são isolados de MAPS de ascites de um segundo hibridoma, TF9-10H10, pelos métodos descritos no Exemplo 7. A solução de anticorpo que se obtém é medida pa ra determinar a proteína e subsequentemente marcada por biotinilação como se descreveu no Exemplo 13.

anticorpo anti-huTF biotinilado ê diluído para 60 ng/ /ml de TBS/Triton e 100 yxl desta solução são misturados em cada depósito. 0s depósitos são mantidos a 37 graus C durante 1 hora e depois enxaguados três vezes em TBS/Triton.

anticorpo anti-huTF biotinilado ligado é então detecta. do usando o sistema Detek I-alk descrito no Exemplo 13. Os ar» ticorpos monoclonais usados como primeiro e segundo anticorpo | neste ensaio podem variar desde que os dois tenham a capacidade de se ligar concorrentemente a huTF. Por exemplo, quando se

I utiliza como primeiro anticorpo, TF9-6B4 pode utilizar-se TF9-11D12 como segundo anticorpo em vez de TF9-10H10. Assim, esta invenção contempla qualquer combinação de anticorpos que possam ligar concorrentemente neste ensaio.

15. Construção de um Segmento de ADN contendo a sequência da codificação de pre-huTF completa

Um segmento de ADN contendo a sequência de codificação de pre-huTF completa pode ser construído da forma que se segue usando plasmídeos recombinantes pCTF64, pCTF403 e pCTF314, cujos mapas de restrição são apresentados na Figura 11 e proce dimentos que são muito conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold

Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1983)

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Os segmentos inseridos contidos nos plasmídeos de ADN tjb combinante apresentados na Figura 11 têm o ligante EcoTI 5’-GGAATTCC-3' (Collaborative Research, Lexington, MA) em cada terminal para facilitar o processo de clonação. Estas sequências de ligante não estão presentes na sequência de nucleótidos apresentada na Figura 2 visto que não são parte da sequência de codificação de ADN de huTFh que ocorre naturalmente. De modo que as descrições da construção das moléculas de ADN recom binante que se seguem se tornem claras no que respeita às sequências de ADN de huTFh envolvidas, os segmentos gerados por digestões que incluam terminais EcoRI e que possam assim conter estas sequências de ligante adicionais serão referidas pelo número da base do nucleótido apresentado na Figura 2. E evidente que os segmentos podem conter essas sequências adicio nais nos seus terminais.

plasmídeo pCTF64 é digerido com as endonucleases de restrição EcoRI e DrallI para produzir um segmento de ADN incluindo uma sequência de nucleótidos correspondendo à sequência apresentada na Figura 2 desde o resíduo de base 1 até ao resíduo 296. 0 segmento com 302 pares de bases (pb) de nucleji tidos assim produzido é isolado por fraccionamento por tamanho usando um gel de agarose e depois desfosforilado por tratamento com fosfatase alcalina.

plasmídeo pCTF403 é digerido com a endonuclease de res. trição EcoRI para produzir um segmento de ADN incluindo uma sja quência de nucleótidos correspondendo à sequência apresentada na Figura 2 desde o resíduo 776 até ao resíduo 1125. 0 segmen to resultante com 352 pb é isolado por fraccionamento por tama nho usando um gel de agarose.

plasmídeo pCTF314 é digerido com a endonuclease de res. trição EcoRI e o segmento resultante com 647 pb é isolado por fraccionamento por tamanho. Este segmento inclui uma sequência de nucleótidos que corresponda à sequência apresentada na Figura 2 desde o resíduo 135 até ao resíduo 775. 0 segmento de 647 pb é isolado por fraccionamento por tamanho e desfosforilado com fosfatase alcalina.

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EPG:11-SCRF 113.2

-770 segmento com 352 pb e o segmento com 647 pb desfosfori. lado são então ligados opBrativamente por reacção com ADN liga se de T4 formando assim um segmento com 999 pb possuindo uma sequência de nucleâtidos correspondendo à sequência apresentada na Figura 2 desde o resíduo 135 até ao resíduo 1125, 0 segmento com 999 pb é então digerido com a endonuclease de restri. ção DralII clivando o segmento com 999 pb numa posição entre os resíduos de base 296 e 297 apresentados na Figura 2, gerando assim um segmento com 168 pb e um segmento com 831 pb. 0 segmento com 302 pb desfosforilado e o segmento com 831 pb são então ligados operativamente usando ADN ligase de T4 para formar um segmento com 1125 pb incluindo uma sequência de nucleótidos correspondendo à sequência apresentada na Figura 2 desde o resíduo 1 até ao resíduo 1125.

vector plasmídeo de clonação pUC8 é linearizado por di. gestão com EcoRI. 0 segmento com 1133 pb preparado anteriormente e o vector digerido com EcoRI são ligados operativamente usando ADN ligase de T4 para formar a molécula de ADN recombinante circular pUC-pre-huTFh.

A estirpe RR1 de E, coli (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) é transformada com pUC-pre-huTFh e os transformantes sucedidos são seleccionados com base na resistência à ampicilina. Os transformantes seleccionados são então clona dos e analisados relativamente à presença de uma molécula de ADN recombinante possuindo o gene estrutural de pre-huTFh.

A determinação da presença de moléculas de ADN recombinante possuindo o gene estrutural de pre-huTFh é realizada por digestão do ADNr de cada transformante seleccionado com EcoRI. Os fragmentos de EcoRI resultantes são resolvidos num padrão de acordo com o tamanho num gel de agarose. As moléculas de ADN recombinante que produzem um padrão de três bandas correspondendo aos segmentos de ADN de 352 pb, 781 pb e 2682 pb contêm o gene estrutural de pre-huTFh. Os transformantes da E, coli RR1 possuindo ADNr produzindo o padrão de digestão de EcoRI descrito anteriormente contêm uma molécula de ADN recombinante do presente invento e são seleccionados (recuperados).

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EPG:11-SCRF 113.2

-78Um segmento de ADN contendo uma porção substancial da sequência de codificação de pre-huTFh incluindo a região de ajn coragem extracelular mas a quem falta a região de ancoragem transmembrana no terminal carboxi e codificando portanto uma proteína huTFh solúvel é construído da forma se se segue.

plasmídeo pCTF64 é digerido com a endonuclease de restrição EcoRI para produzir um segmento de ADN incluindo uma sei quência de nucleótidos correspondendo à sequência apresentada na Figura 2 desde o resíduo 1 até ao resíduo 486. 0 segmento com 486 pares de bases (pb) de nucleótidos assim produzido é isolado por fraccionamento por tamanho usando um gel de agarose e depois desfosforilado por tratamento com fosfatase alcali, na. 0 segmento com 486 pb desfosforilado é então digerido com a endonuclease de restrição DrallI clivando o segmento com 486 pb numa posição entre o resíduo de base 296 e o 297 apresentados na Figura 2, gerando assim um segmento com 296 pb e um segmento com 190 pb. 0 segmento com 296 pb é isolado por fra£ cionamento por tamanho usando um gel de agarose.

plasmídeo pCTF314 é digerido com a endonuclease EcoRI para produzir um segmento de ADN incluindo uma sequência de nucleótidos correspondendo à sequência apresentada na Figura 2 desde o resíduo 135 até ao resíduo 775. 0 segmento resultante com 641 pb é isolado por fraccionamento por tamanho usando um gel de agarose e depois desfosforilado por tratamento com fosfatase alcalina. 0 segmento com 641 pb desfosforilado é então digerido com DrallI clivando o segmento com 641 pb numa posição entre o resíduo de base 296 e 297 apresentados na Figura 2, gerando assim um segmento com 162 pb e um segmento com 479 pb. 0 segmento com 479 pb é isolado por fraccionamento por tamanho usando um gel de agarose.

Os segmentos com 296 pb e 479 pb preparados anteriormente são então ligados operativamente por reacção com ADN ligase de T4 formando assim um segmento com 775 pb possuindo uma sequência adaptadora de nucleótidos correspondendo à sequência apresentada na Figura 2 desde o resíduo 1 até ao resíduo 775.

vector plasmídeo de clonação pUC18 é linearizada por

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EPG:11-SCRF 113.2

-79digestão com EcoRI. 0 segmento com 775 pb preparado anteriormente e o vector digerido com EcoRI são ligados operativamente usando ADN ligase de T4 para formar a molécula de ADN recombinante circular pUC-pre-huTFh-T.

A E. coli RR1 é transformada com pUC-pre-huTFh-T e os transformantes resistentes à ampicilina, i.e., os clones contendo pUC-pre-tiuTFh-T, são seleccionados.

A molécula de ADN recombinante pUC-pre-huTFh-T é digerida com EcoRI e o segmento resultante com 775 pb é isolado por fraccionamento por tamanho.

I

Os segmentos adaptadores de oligonucleétidos sintéticos: 5«-AATTTAGAGAATAAGAATTCGGG-3’, e 3'-ATCTCTTATTCTTAAGCCC-5· são produzidos de acordo com os métodos de Caruthers et al.,

J. Am. Chem. Soe,, 103:3185 (1981), e Gait et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol», 47:393 (1983) com a excepção dos oligonucleétidos assim produzidos não serem fosforilados com polinucleotido quinase de modo a evitar a ligação operativa destes oligonucleétidos uns aos outros. Os oligonucleótidos | são renaturados para formarem um segmento ligante de ADN de cordão duplo contendo um terminal EcoRI coesivo e um terminal | rombo de acordo com os métodos de Rotherstein et al., Methods in Enzymol., 68:98 (1979). Este segmento ligante é então op£ rativamente ligado ao segmento com 775 pb obtido de pUC-pre-huTFh-T para formar um segmento com 817 pb contendo um segmeri to renaturado em cada extremidade do segmento de 775 pb. 0 segmento resultante com 817 pb é então digerido com EcoRI para converter cada terminal do segmento de 817 pb de rombo para coesivo com EcoRI, formando um segmento com 805 pb. 0 segmento resultante com 805 pb é isolado por fraccionamento por tama nho usando um gel de agarose.

vector plasmídeo de clonação pUC18 é linearizado por digestão com EcoRI. 0 segmento com 805 pb preparado anteriormente e o vector digerido com EcoRI são ligados operativamente usando ADN ligase de T4 para formar a molécula de ADN recombi67 562

EPG:11-SCRF 113.2 ** £ r

-80nante circular pUC-pre-huTFh-TR.

A E. coli RR1 é transformada com pUC-pre-huTFh-TR e os transformantes resistentes à ampicilina, i.e., os clones contendo pUC-pre-huTFh-TR, são seleccionados.

16. Produção de huTFh por Expressão de Sequências de huTFh Recombinante

A expressão de huTFh recombinante a partir de moléculas de ADN recombinante pode ser realizada em vários meios de expressão incluindo células procarióticas bacterianas, células eucarióticas de não vertebrados e células eucariôticas superio res (de vertebrados). Exemplos desses meios de expressão são E. coli, S. cerevisiae e células de ovário de criceto chinês (CHO), respectivamente.

a. Expressão de pre-huTFh em E. coli

Uma molécula de ADN recombinante capaz de expressar o gene estrutural de pre-huTFh em células de E, coli pode ser construída por isolamento de um segmento de ADN contendo o gene de pre-huTFh a partir de uma molécula de ADN recombinante pUC-pre-huTFh produzida no Exemplo 15 e ligação operativa desse segmento a um vector de expressão procariático.

A molécula de ADN recombinante pUC-pre-huTFh é digerida com EcoRI sob condições tais que alguns sítios EcoRI presentes no plasmídeo, mas não todos, sejam clivados. Este procedimento de digestão parcial é descrito com maior detalhe em Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982). Um segmeri to com 1133 pb incluindo uma sequência de nucleótidos correspondendo à sequência apresentada na Figura 2 desde o resíduo 1 até ao resíduo 1125 é isolado dos produtos da digestão parcial com EcoRI por fraccionamento por tamanho.

vector de expressão procariótico pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscatauiay, NY) é linearizado por digestão com EcoRI. 0 vector digerido e o segmento contendo o gene estrutju ral de pre-huTFh com 1133 pb são ligados operativamente usando

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ADN ligase de T4 para formar a molécula circular de ADN recombinante pKK-pre-huTFh.

A E. coli RR1 é transformada com transformantes resisteji tes a pKK-pre-huTFh e à ampicilina, i.e., seleccionam-se clones contendo pKK-pre-huTFh.

b. Expressão de huTFh em E. coli

Constroi-se uma molécula de ADN recombinante capaz de expressar o gene de huTF em E. coli manipulando o segmento preparado no Exemplo 16a. Este segmento é primeiro desfosfori. lado com fosfatase alcalina e depois digerido com a endonuclea, se de restrição BbvI. 0 segmento resultante com 964 pb inclui uma sequência de nucleétidos correspondendo à sequência apresentada na Figura 2 desde o resíduo 164 até ao residuo 1125 e é isolado por fraccionamento por tamanho.

Os segmentos adaptadores oligonucleótidos sintéticos pojs suindo as sequências:

'-AATTGACATGTCAGGCACTACAAATACTGTGGCAGCATATAATT-3’, e

3'-CTGTACAGTCCGTGATGTTTATGACACCGTCGTATATTAAATTG-5’, são produzidos como se descreveu anteriormente e renaturados para formar um segmento ligante de ADN de cordão duplo contendo extremidades EcoRI e BbvI coesivas, seguindo os métodos de Rotherstein et al., Methods in Enzymol., 68:98 (1979). 0 ligante é primeiro ligado operativamente ao segmento com 964 pb para formar um segmento com 1008 pb. 0 segmento com 1008 pb é depois ligado operativamente ao vector pKK223-3 digerido com EcoRI, usando ADN ligase de T4 para formar a molécula circular de ADN recombinante pKK-huTFh.

A molécula de ADN recombinante pKK-huTFh difere de pKK-pre-huTFh apenas pelo facto de (1) estar omitido um segmento do resíduo 1 ao resíduo 129 e de (2) um novo codão metionina estar ligado operativamente antes do resíduo 130 de tal modo que a expressão da proteína (tradução) se inicia no codão metionina inserido.

As moléculas de ADN recombinante pKK-pre-huTFh e pKK-huTFh

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EPG:11-SCRF 113.2

-82são introduzidas num meio hospedeiro procariótico compatível com a expressão da proteína huTFh ou pre-huTFh codificada pelo gene estrutural nele contido. Exemplos de células hospedeiras contendo esse meio são as da estirpe RR1 de E. coli. 0 hospedeiro é transformado com a molécula de ADN recombinante, cultj. vado sob condições compatíveis com o crescimento celular e com a expressão do ADN recombinante e a proteína expressa é colhida por técnicas muito conhecidas.

c. Expressão de pre-huTFh em células de CHO

Uma molécula de ADN recombinante capaz de expressar o gene de pre-huTFh em células de vertebrado é construída usari do o segmento com 1133 pb preparado no Exemplo 16a.

Os segmentos adaptadores oligonucleótidos sintéticos pos. suindo as sequências:

5'-AATTCCCGGG-3’, e

5'-GATCCCCGGG-3 ’, são produzidos usando os métodos de Caruthers et al., supra e Gait et al., supra. Os segmentos adaptadores oligonucleótidos são então ligados a cada um dos terminais do segmento com 1133 pb, usando os métodos descritos por Rotherstein et al., Methods in Enzymol., 68:98 (1979). Os terminais EcoRI coesivos originalmente presentes no segmento com 1133 pb são assim convertidos em terminais BglII coesivos.

vector de expressão eucariótico baseado no vírus de s_í mio (SV4O) pKSV-10 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NO) é linearizado por digestão com a endonuclease de restrição BglII. 0 segmento com 1133 pb adaptado com BglII e o vector digerido com BglII são ligados operativamente usando ADN ligase de T4 para formar a molécula de ADN recombinante circular pSV-pre-huTFh.

A RR1 de E. coli é transformada com pSV-pre-huTFh e os transformantes sucedidos são seleccionados com base na resistência à ampicilina e clonados. Os transformantes seleccionados são então clonados e analisados relativamente à presença

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de pSV-pre-huTFh ensaiando cada clone para determinação da pre sença de proteína pre-huTFh expressa, usando anticorpo monoclo nal TF8-5G9.

d. Expressão de huTFh em células de CHO

Uma molécula de ADN recombinante capaz de expressar o gene de huTFh em células de mamífero é construída por digestão de pSV-pre-huTFh do exemplo 16c com a endonuclease de restrição BglII. 0 segmento resultante com 1153 pb é isolado por fraccionamento por tamanho e subsequentemente digerido com a I endonuclease BbvI. 0 segmento resultante com 974 pb inclui uma sequência de nucleótidos adaptadora correspondendo à sequência apresentada na Figura 2 desde o resíduo 164 até ao resíduo 1125 e é isolado por fraccionamento por tamanho.

Os segmentos adaptadores oligonucleótidos sintéticos pos. suindo as sequências:

5'-GATCGACATGTCAGGCACTACAAATACTGTGGCAGCATATAATT-3·, e 3’-CTGTACAGTCCGTGATGTTTATGACACCGTCGTATATTAAATTG-5’, são produzidos como se descreveu anteriormente e renaturados para formar um segmento ligante de ADN de cordão duplo conten| do terminais BglII coesivos e BbvI coesivos. 0 ligante é então ligado operativamente ao segmento de 974 pb usando ADN li) gase de T4 para formar um segmento com 1018 pb incluindo uma se quência de nucleótidos correspondendo à sequência apresentada na Figura 2 desde o resíduo 130 ao resíduo 1125.

vector de expressão plasmídeo pKSV-10 é linearizado por digestão com BglII e depois ligado operativamente ao segme_n to com 1018 pb usando ADN ligase de T4 para formar a molécula de ADN recombinante circular pSV-huTFh.

As moléculas de ADN recombinante, pSV-pre-huTFh e pSV-huTFh são introduzidas num meio hospedeiro eucariótico compatível com a expressão da proteína huTFh ou pre-huTFh codificadas pelo gene estrutural contido nele. Exemplos de células hos. pedeiras contendo esse meio são as células de CHO, hospedeiro é transfectado com a molécula de ADN recom67 562

EPG:11-SCRF 113.2 ./ £ _Μ^·,ι··ΐΓϊσ:ίϊ^1Ε^* -84binante θ os transformantes estáveis são seleccionados por técnicas muito conhecidas. Ver por exemplo Graham et al., Virol., 52:456 (1973); e Southern et al., 3. Mol. Appl. Genet., 1:327-341 (1982). As células hospedeiras transformadas são cultivadas sob condições compatíveis com o crescimento celular e a expressão do ADN recombinante e a proteína expressa é colhida por técnicas muito conhecidas.

| ^B· Expressão de pre-huTFh em Levedura

Uma molécula de ADN recombinante capaz de expressar o oene de Dre-huTFh em S. cerevisiae é construído preparando segmentos adaptadores oligonucleótidos possuindo a sequência:

5·-AATTCCCGGG-3·, e 5’-CGCCCGGG-3', e ligando-os aos terminais do segmento com 1133 pb do Exemplo 16a como se descreveu anteriormente. 0 segmento adaptado assim formado tem terminais Ciai coesivos.

vector de expressão em levedura, pTDTl (American Type Tissue Collection ATCC 31255) é linearizado por digestão com a endonuclease de restrição Ciai. 0 anterior segmento de 1133 | pb adaptado com Ciai e o vector digerido com Ciai são ligados opsrativamente usando ADN ligase de T4 para formar a molécula I de ADN recombinante circular pY-pre-huTFh.

A RR1 de E, coli é transformada com pre-huTFh e identifi cam-se e seleccionam-se os transformantes que expressam o gene estrutural de pre-huTFh como se descreveu no Exemplo 16c.

f· Expressão de huTFh em Levedura

Uma molécula de ADN recombinante capaz de expressar o gene estrutural de huTFh em 5, cerevisiae é construída por digestão de pY-pre-huTFh com Ciai para produzir um segmento com 1151 pb incluindo uma sequência de nucleótidos correspondendo à sequência apresentada, na Figura 2 desde o resíduo 1 até ao resíduo 1125. Após isolamento por fraccionamento por tamanho, o segmento com 1151 pb é digerido com Bbvl para prod.u zir um segmento com 978 pb incluindo uma sequência de nucleóti

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dos correspondendo à sequência apresentada na Figura 2 desde o resíduo 164 até ao resíduo 1125. 0 segmento de 978 pb, é então isolado por fraccionamento por tamanho.

Os segmentos adaptadores oligonucleétidos sintéticos pos. suindo as sequências:

«-CGGACATGTCAGGCACTACAAATACTGTGGCAGCATATAATT-3’, e 3'-CTGTACAGTCCGTGATGTTTATGACACCGTCGTATATTAAATTG-5’, são produzidos e renaturados como se descreveu anteriormente para formar segmentos de ADN adaptadores possuindo terminais Ciai e Bbvl coesivos. 0 segmento adaptador é primeiro ligado opera tivamente ao segmento com 978 pb para formar um segmento com 1020 pb. 0 segmento com 1020 pb é subsequentemente ligado ao vector pTDTl digerido com Ciai, preparado como se descreveu em 16e, usando ADN ligase de T4 para formar a molécula de ADN recombinante circular pY-huTFh.

As moléculas de ADN recombinante pY-pre-huTFh e pY-huTFh são introduzidas num meio hospedeiro de levedura compatível com a expressão da proteína huTFh ou pre-huTFh codificada pelo gene estrutural nele contido. Exemplos de células hospedeiras contendo um tal meio são as células de S. cerevisiae.

hospedeiro é transformado com a molécula de ADN recombinante e cultivado em meio de selecção para isolar sucedidamente células transformadas por técnicas muito conhecidas. Ver, por exemplo, Hinnen et al., Proc. Natl. Açad. Sei, USA, 75:1929 (1978); e Miyajima et al., Mol. Cell. Biol., 4:407 (1984). As células transformadas são cultivadas sob condições compatíveis com o crescimento celular e a expressão do ADN recombinante e a proteína expressa é colhida por técnicas muito conhecidas.

9· Produção de huTFh Solúvel por Expressão de Sequências de Codificação Recombinantes de huTFh

A expressão de huTFh solúvel a partir de moléculas de ADN recombinante pode ser conseguida em vários meios de expressão de uma forma semelhante à descrita no Exemplo 16 para pre-huTFh e huTFh. Nesse exemplo um segmento de 1133 pb, con67 562

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tendo o gene estrutural de pre-huTFh, possuindo extremidades EcoRI coesivas é produzido no Exemplo 16a e subsequentemente manipulado nos Exemplos 16b-f tendo como resultado vectores capazes de expressarem quer pre-huTFh quer huTFh em três exemplos de meios de expressão. E. coli, S. cerevisiae e células de CHO. De modo semelhante, o segmento com 865 pb contendo um ge, ge estrutural de pre-huTFh possuindo extremidades EcoRI coesivas e preparado no Exemplo 16a é manipulado de acordo com os métodos descritos nos Exemplos 16b-f para produzir vectores de expressão capazes de expressar uma forma solúvel quer de pre-huTFh quer de huTFh (i.e. pre-huTFh-TR ou huTFh-TR) nesses mesmos meios de expressão.

17. Inibição da coagulação por Polipéptidos p24-35 e P159-169

Sintetizaram-se os polipéptidos p24-35 e pl59-169, cujas sequências de resíduos de aminoácidos são apresentadas no Quadro 7, da forma descrita no Exemplo 11.

QUADRO 7

Designação³ p24-35

Ρ159-169

Sequência de Resíduos da Aminoácidos

H-EWEPKPVNQVYT-OH

H-IYTLYYWKSSSSGKKTAK-OH

A designação laboratorial de cada polipéptido representa a sequência de resíduos de aminoácido incluida como se mostra na Figura 1.

Os polipéptidos p24-35 e pl59-169 foram depois ensaiados relativamente à sua capacidade para inibirem competitivamente a coagulação iniciada por huTF como se descreveu no Exemplo 12. Os resultados deste estudo são apresentados na Figura 12 e indicam que p24-35 e p!59-169 são capazes de inibirem 45% e 25%, respectivamente, da coagulação iniciada por huTF quando utilizados a concentrações de 10 y41. Deve notar-se que neste estudo as inibições de fundo como as dos péptidos indicados por um

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EPG:11-SCRF 113.2

-87circulo a negro na Figura 12 foram inferiores à do estudo apre sentado no Quadro 4. Como resultado, os polipéptidos que produziram pelo menos uma inibição da coagulação de 20% a uma corj cantração de 10 jrfl foram considerados neste estudo como análogos polipéptidos do sítio de ligação de huTFh.

Assim os polipéptidos p24-35 e pl59-169 representam análogos do sítio de ligação dos polipéptidos de huTFh do presente invento. Deve também notar-se que os resultados obtidos com p24-35, quando comparados com os resultados semelhantes obtidos com o polipéptido p25-49, indicam que um sítio de liga ção de huTFh-factor Vll/VIIa pode ser formado pela sequência de resíduos de aminoácidos que esses dois polipéptidos têm em comumj i.e. os resíduos 30-35 como apresentados na Figura 1 (-VNQVYT-).

18. Cinéticas de Inibição da Coagulação por Anticorpos Anti-huTFh

Para determinar o tempo durante o qual os anticorpos anti-huTF foram capazes de inibir a coagulação iniciada por huTF, mediu-se o decurso no tempo da inibição usando o ensaio de ini bição descrito no Exemplo 10.

Misturou-se aproximadamente 1 ng de anticorpo monoclonal TF8-5G9 isolado por MAPS, preparado como se descreveu no Exemplo 7 com 100 jul de HBS/BS com aproximadamente 1 ng de huTF re lipidado, preparado como se descreveu no Exemplo 4. As várias misturas assim formadas foram mantidas a 37 graus C durante p.e ríodos variando de 1 a cerca de 60 minutos, para deixar ligar imunologicamente a molécula de anticorpo anti-huTFh à huTFh e formar um produto de imunorreacção. Nos momentos especificados na Figura 13 cada mistura foi subsequentemente ensaiada re lativamente à actividade procoagulante de huTF como se descreveu no Exemplo 2 e a percentagem de inibição foi então expressa como se descreveu no Exemplo 10.

A Figura 13 mostra os resultados dessa medição cinética que indica que inibiçães da coagulação iniciada por huTF superiores a 65 por cento ocorrem em menos do que 10 minutos a cori

562

EPG:11-SCRF 113.2 centração de anticorpo e de huTF purificado utilizada neste ejn saio. Crè-se que inibições mais rápidas e completas serão resultado de maiores concentrações de anticorpo anti-huTF.

19. Resposta à Dose na Inibição da Coagulaçao Iniciada por huTF por Anticorpos Anti-huTF

A capacidade dos anticorpos anti-huTF do presente invento inibirem a coagulaçao iniciada por huTF numa gama de dosagens | de anticorpo foi testada pelos métodos descritos no Exemplo 10 com as seguintes modificações. Um ng de huTF relipidado, prepa I rado no Exemplo 4, foi misturado em 0,1 ml de HBS/BSA com vári.

as quantidades de anticorpo monoclonal TF8-5G9 isolado como se descreveu no Exemplo 7. As misturas assim preparadas foram conservadas para formarem produtos de imunorreacção e foram subsequentemente ensaiadas em relação à actividade procoagulari te de huTF como se descreveu no Exemplo 10.

Os resultados desse ensaio de resposta à dose são apresentados na Figura 14 e indicam que as inibições são metade do máximo a aproximadamente 1 a 5 ng de anti-huTF por ml para a concentração de huTF usada neste estudo.

| Uma resposta à dose semelhante foi obtida usando células humanas lisadas como fonte de huTF.

I A linha celular de fibroblasto humano GM1381 (NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository)foi cultivada em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco Laboratories, Grand Island, NY) suplementado com glutamina 2 mM, 5% de soro de vitela fetal e antibióticos a 37 graus C e sob dióxido de carbono a 1% (v/v) no ar. As células de GM1381 foram feitas crescer e colhidas e preparou-se uma pelota de 30 x 10^ células por ceni trifugação e congelou-se a menos 70 graus C. Esta pelota congelada foi rapidamente descongelada por adição de 9 ml de beta, -octilglupiranosido 15 mM (sigma) em tampão HN (Hepes 25 mM, NaCl 140 mM, pH 7,0) e mantida a 37 graus C durante 10 minutos para lisar as células, tempo após o qual se misturaram 18 ml de HN para formar um lisado celular.

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-890 anticorpo monoclonal TF8-5G9 isolado como se descreveu no Exemplo 7 foi diluído com 0,01% de BSA (Sigma, Tipo RIA) às várias dosagens especificadas na Figura 15. Misturaram-se então vinte cinco ml de cada diluição de anticorpo com 225 yj. do lisado celular preparado anteriormente e mantiveram -se a 37 graus C durante 60 minutos para permitir que o anticorpo imunorreagisse com qualquer huTF presente no lisado celu lar e formasse um produto de imunorreacção. Em seguida misturaram-se 50 yj. de uma solução de CaCl₂ 25 mM com 50yu.1 da solu ção contendo o produto de imunorreacção seguidos de 50 yul de plasma humano citrado para iniciar a coagulação. As misturas assim formadas foram mantidas a 37 graus e mediu-se o tempo eri tre a adição do plasma e a formação de um coágulo. A concentração eficaz de huTF e a percentagem de inibição foram calculados como se descreveu no Exemplo 10.

Os resultados da resposta à dose num ensaio de inibição usando lisados de células GM1381 humanas como fonte de huTF são apresentados na Figura 15. Esses resultados indicam que o anticorpo anti-huTF TF8-5G9 produziu metada da inibição máxima desta fonte de lisado celular de aproximadamente 8-10 ng de anticorpo por ml.

20. Reactividade Cruzada de MoAb com Factor Tecidual ) não Humano factor tecidual foi isolado quer de tecidos do cérebro (ratazana, coelho, bovino, canino, ovino, porcino e de babuíno) ou de células de cultura de tecidos /células de rim de macaco verde africano (C0S)_7. Os tecidos ou células foram descongelados, despojados de membranas, despedaçados, homogeneizados em 1 ml de acetona fria por g de tecido e filtrados sob vácuo através de papel Whatman #1. 0s sólidos foram suspensos em acetona e filtrados mais cinco vezes, depois secos ao ar durari te a noite a armazenados a -302C. Os pós em acetona que compre endiam 16-19% do peso húmido de partida, foram pulverizados com um almofariz s um pilão, ressuspensos a 5% (p/v) em TBS conte_n do 5 mmol/1 de EDTA e misturados durante 1 hora à temperatura ambiente. Os sólidos foram recolhidos por centrifugação a

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fo-90-

lO 000 x g durante 30 minutos a 20SC e as membranas contendo TF foram recolhidas por centrifugação do sobrenadante a 100 000 χ g durante 1 hora. A pelota foi ressuspensa em TBS e armazenada a -809C.

A inibição do TF animal (extractos de tecidos brutos cojn tendo actividade de TF) por anticorpo foi determinada como se segue. Volumes iguais de TF (1 mg/ml) e de sobrenadante hibri doma (diluído a 1/10 com TBS/BSA) foram incubados durante 2 ho ras a 372C. A actividade de TF remanescente foi medida por adição de 100 yil da mistura de incubação a 50 yúL de plasma humano deficiente em factor VII e 50 ykl de CaC^ 50 mM. Após 1 minuto a 379C, adicionaram-se 50 Júl de uma diluição 1/10 de so, ro de espécies homologas como fonte de factor VII, e determinou-se, em duplicado, o tempo para a formação de um coágulo.

Dezoito dos vinte e quatro MoAb inibidos pela actividade procoagulante do TF de cérebro de babuíno ou de extractos celu lares de rim de macaco verde africano (Quadro 8). Contudo, ne nhum dos MoAb exibiu reactividade cruzada com TF da ratazana, coelho, bovino, canino, ovino, ou porcino, i.e. nenhum inibiu a capacidade destas preparações de TF acelerarem o tempo de re calcificação do plasma humano deficiente em factor VII na presença de uma fonte de factor VII homólogo. Nenhum dos anticorpos inibiu a actividade procoagulante do TF de coelho ensaiado com plasma humano normal.

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-91QUADRO 8

MoAb	Isotipo	RIA1 (cpm)	Dot Blot	Western Blot2	% de inibição de:	Inibição de TF animal
R	NR	Coag.	VII4
TF8-5G4	IgC^C	6242	+	+.	+	96	57	—
TF8-5G9	IgGpX	28587	+	-	+	99	80	—
TF8-11D12	IgG-ρΛ	29453	+	-	+	99	82	— —
TF9-1F1	IgG^A	25133	+	+	+	95	83	M,B
TF9-1D5	IgGpA	3872	4·	+	+	95	76	M,B
TF9-1E7	IgGpX,	28586	+	4*	+	97	90	M,B
TF9-1B8	IgGp/C	28552	+	+	+	98	83	M,B
TF9-1B9	IgGpX	28523	+	+	4-	97	84	M,B
TF9-2C4	IgGpÂ	24435	+	+	+	97	78	M,B
TF9-2F6	IgGpÁ	27422	+	+	+	97	79	M,B
TF9-4D11	IgGpÂ	25994	+	+	+	97	81	M,B
TF9-5G4	IgGpX	24073	+	+	+	97	83	M,B
TF9-5B7	IgGpA	26819	+	+	+	97	74	M,B
TF9-5C7	IgGpX	24543	+	+	+	96	72	M,B
TF9-6B4	Ig^.X	17894	+	+	+	96	98*	M,B
TF9-6G4	IgGpX	24065	+	+	+	95	78	M,B
TF9-6C9	IgGpX	8054	+	+	+	95	47	—
TF9-7E10	IgGpX	8025	+	+	+	97	54	•M «
TF9-8E8	IgGpX	29152	+	+	+	97	76	M,B
TF9-9E1	IgGpX	18169	+	4·	+	90	71	M,B
TF9-9C3	IgGpX	30222	+	+	+	97	82	M,B
TF9-9B4	IgGpX	33728	+	+	+	95	82	M,B
TF9-10C2	IgGpX	28692	+	+	+	98	71	M,B
TF9-10H10	I gGpX	24585	+	+	+	0	20*	--
PAblOO	IgGl,	1929	-	-	-	0	0*	—

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¹ A não ser que seja de outro modo estabelecido, todos os resultados foram obtidos usando sobrenadantes de cultura de tecido de hibridoma a uma diluição de 1:10. Os resultados do radio-imunoensaio, expressa em contagens por minuto (CPM), 125 usando I-TF marcado usando lactoperoxidase.

Western blots foram efectuados usando quer TF reduzido (R) quer não reduzido (NR).

Inibição da coagulação de plasma humano induzida por TF de cérebro humano purificado.

Inibição de ¹²⁵I-factor Vll/VIIa específico ligando-se a cé lulas 382. Em alguns casos (asteriscos), os sobrenadantes da cultura à diluição de 1:10 não inibiu apreciavelmente a ligação do factor Vll/VIIa, e os dados são apresentados para IgG purificada a 10 y^g/ml.

Inibição da coagulação de plasma humano induzida por extra£ to bruto de cérebro de babuíno (8) ou células de COS lisadas (M). Introduziu-se uma letra para uma espécie se o MoAb inibiu a actividade procoagulante em 60% ou mais.

A inibição da actividade procoagulante expressa por vári. as células e tecidos humanos foi examinada em maior detalhe usando MoAb TF8-5G9. 0 TF8-5G9 neutralizou a função do TF humano relipidado e purificado em mais de 90% a concentraçães de IgG 1 y*g/ml (Figura 16). A capacidade deste MoAb inibir a actividade procoagulante de lisados celulares humanos e de extractos brutos de tecidos foi também demonstrada (Quadro 9). 0 TF8-5G9 a uma concentração de IgG de 10 yo-g/ml inibiu quantitativamente è 80% da actividade procoagulante de cérebro bruto e de pés de acetona placentária e de fibroblastos humanos lisados, células de carcinoma da bexiga e células mononucleares de sangue periférico estimuladas por endotoxina.

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-93Quadro 9

Inibição da actividade Pró-coagulante de diversas células e tecidos pelo Anticorpo Monoclonal TF8-5G9

Actividade TF (% de inibição)¹

2 Fonte de actividade de TF	Nenhum Anti-	TF8-5G9
corpo	PablOO
TF purificado de cérebro hu-
mano	1569	1520 (3%)	245 (84%)
Extracto de cérebro em bruto	2059	2059 (0%)	411 (80%)
Extracto placentário em bruto	1287	1344 (0%)	159 (88%)
Fibroblastos GM1381 (lisados)	990	966 (2%)	143 (86%)
Monocitos humanos (lisados)	2893	2745 (5%)	176 (94%)
Células de carcinoma da bexi.
ga 382 (lisadas)	882	902 (0/ú)	93 (89%)
Tromboplastina de coelho	2108	2108 (0%)	2157 (0%)
1 0 TF purificado de cérebro	humano foi	reconstituído em vesí.

cuias lipídicas antes de ser testado.

As duas colunas à direita tabelaih a actividade do TF residu al em miliunidades, medido após o tratamento coma IgG purifi.

cada indicada, e são a média de duas determinações. As amos, tras foram incubadas com 10 yiq/ml de IgG durante 30 minutos a 375C antes de medir a actividade TF restante. Os vectores entre parêntesis são percentagem de inibição; em cada caso isto é relativo em relação às unidades de actividade para a mssma amostra não tratada com anticorpo.

21. Estudos de Ligação do Factor VII

Como a ligação do factor Vll/VIIa a TF é necessária para a reunião do complexo procoagulante TF;VIl/VIIa funcional, exa. minou-se a capacidade do MoAbs apresentado no Quadro 8 para neutralizar a actividade TF bloqueando a ligação do factor Vll/VIIa a TF.

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A ligação do factor VII à superfície das células de carcinoma da bexiga 382 mediada por factor tecidual humano, foi já bem caracterizada. Fair e col., 3. Biol. Chem., 262:11692 (1987). Assim, examinaram-se os efeitos dos MoAbs sobre o conjunto do complexo huTF : Vll/VIIa da superfície celular, pre-incubando células 382 com anticorpo e quantificando depois a ligação específica de Vll/VIIa.

As células 382 foram cultivadas até à confluência em pia cas de cultura de 12 depósitos como descrito por Fair e col.,

3. Biol. Chem., 262:11692 (1987), lavadas com tampão A (NaCl 137 mM, KC1 4 mM, L.glucose 11 mmol, azida de sódio 5 mM, HEPES 10 mM, pH 7,45), e incubadas durante 2 horas a 373 com 0,7 ml de tampão A contendo IgG MoAb purificada ou uma diluição 1/10 de sobrenadante de cultura de hibridoma. Adicionaram-se clore to de cálcio e I-factor UlI/VIIa para concentrações finais de 5 mM e 1 nM, respectivamente, e foram incubadas com células durante mais 2 horas a 372C. As monocamadas de células foram então lavadas 5x com tampão B frio (NaCl 140 mM, BSA a 0,5%, Tris-HCl 5 mM, pH 7,45), lisadas em 1 ml de NaOH 0,2 M, SDS a 1%, EDTA 10 mM, e o lisado foi contado num contador de partícu las gama. A ligação específica foi determinada subtraindo a radio-actividade inespecificamente ligada (^x I-factor Vll/VIIa associado a células na presença de um excesso molar de 100 vezes de factor Vll/VIIa não marcado). Determinou-se a percenta

I gem de inibição de ligação específica para células 382 tratadas com MoAbs em relação a células de controlo tratadas com 9 partes de tampão A e 1 parte de meio de cultura.

Quando o factor Vll/VIIa está ligado a TF, não está, nor, malmente internalizado mas, para eliminar a possibilidade de intornalização de TF induzido pela ligação com anticorpo, as células 382 foram envenenadas metabolicamente com azida de sódio 5 mM. Obtiveram-se resultados semelhantes quer as células fossem ou não tratadas com azida.

0s resultados deste estudo estão apresentados no Quadro

8, acima. Todos os vinte e três MoAbs que inibiram a activida^ de TF, bloquearam também a ligação do factor Vll/VIIa. Como se esperava, o MoAb - não inibiu a actividade TF, TF9-10H10,

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-95não bloqueou a ligação do factor VII.

22. Inibição da Formação de Factor Xa pelas células J82

As velocidades de formação do factor Xa pelo complexo huTF:Vll/VIIa em células J82 foram quantificadas em duplicado usando o ensaio em placa de cultura de depósitos múltiplos des. crito por Fair e col., 3, Biol. Chem., 262:11692 (1987) com as seguintes modificações. As células foram cultivadas em placas de 12 depósitos e foram pré-incubadas durante 2 horas a 373C com concentrações variáveis de fracção IgG purificada de MoAbs antes do início do ensaio, como acima descrito para a ligação de factor Vll/VIIa a células J82. Utilizou-se no ensaio uma só concentração de factor Vll/VIIa (1 mM). Em intervalos de 5, 10 e 15 minutos, após a adição de factor X para uma concentração final de 50 y^g/ml, retiraram-se 50ytl de sobrenadante e adicionaram-se a 550 yd de Tris-HCl 50 mM, NaCl 225 mM, EDTA 50 mM (pH 8,2). Após a adição de substrato de factor Xa cromo génico (50 yd de S-2222 3,4 mM Helena Labs, Beaumont, TX), a actividade do factor Xa foi quantificada medindo a velocidade de aumento na absorvância a 405 nm num espectrofotómetro de Beckman DU-30 com módulo de análise cinética. A hidrólise de fundo do S-2222 pelo sobrenadante de células J82 incubadas na auàência de factor Vll/VIIa, foi subtraída de cada determinação. A percentagem de inibição pelo tratamento com anticorpo foi calculada em relação a células que não tinham sido pré-incubadas com anticorpo.

As curvas de inibição para o tratamento de células J82 com MoAbs TF9-2C4 e TF9-5B7 indicaram que a velocidade de formação de factor Xa foi inibida por concentrações de anticorpo semelhantes àquelas que inibiram a ligação do factor VII (Figjj ra 17). 0 MoAb TF9-10H10 não-inibidor (não-neutralizante) tinha pouco ou nenhum efeito sobre a actividade pro-coagulante, ligação do factor Vll/VIIa, ou sobre a velocidade de produção de factor Xa a concentrações de IgG até 10 yug/ml, bem como o controlo MoAb PAblOO (não apresentado).

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23. Inibição da Activação do Factor X sobre células 382 por ligação competitiva de polipéptidos huTF ao Factor VII/ /Vila

Como é bem conhecido na arte, a activação celular dascas, catas de proteases de coagulação está associada a um grupo hete rogénio de doenças geralmente referidas por doenças trombohemorrágicas consumptivas. A cascata de proteases de coagulação é geralmente iniciada nas superfícies celulares por se encontrar factor Vll/VIIa com elevada afinidade para os seus receptores de membrana, e co-factor essencial, factor tecidual (TF). 0 complexo pro-coagulante biomolecular de TF e o factor VII/ /Vila /TF:VIl/VIIa__7, activam os factores X e IX por proteólise limitada que leva, em último lugar, à formação de trombina e deposição de fibrina. Em adição, o papel de TF na hemostase, iniciação da cascata de proteases de coagulação por TF, tem sido implicado na coagulação intravascular disseminada e na trombogénese. Niemetz e col., Blood, 42:47 (1973) e Bevi lacqua e col., 3, Exp. Med., 160:618 (1984). TF é uma molécula efectora importante expressa na superfície de monocitos e de células endoteliais, em resposta a mediadores inflamatórios e nas respostas imunológicas celulares.

Estudou-se a capacidade dos polipéptidos huTFh do presen te invento se ligarem ao factor Vll/VIIa e inibir assim a formação de um complexo TF:VIl/VIIa capaz de activar o factor X.

Adicionaram-se cinquenta microlitros Çxl) de uma solução contendo um análogo polipêptido huTF, 100 mM, em TBS, a cada depósito de uma placa de ensaio de polistireno de fundo liso, de 96 depósitos. Depois, misturou-se em cada depósito 25 /1 de uma solução contendo factor Vll/VIIa isolado da forma descrita no Exemplo 3, a uma concentração de 1 nm em TBS, misturou-se ainda com 25 jul de cloreto de cálcio 20 mM em TBS e a mistura resultante foi mantida à temperatura ambiente durante 30 minutos.

Obtiveram-se células 382 de células de carcinoma da bexi. ga humana a partir do American Type Culture Collection (ATCC

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-97HTB 1; Rockville, MD) e foram cultivadas como descrito por Fair e col., 3. Biol. Chem», 262:11692-11698 (1983) cujos mêt£ dos são aqui incorporados como referência.

Suspenderam-se 5 x 10^ células 382 em 50de TBS e foram misturadas a cada depósito da placa de ensaio de polistire no, após o período de manutenção acima. Imediatamente depois misturaram-se 25 jkl de factor X, isolado como descrito por Fair e col., 3« Biol. Chem., 262:11692-11698 (1987), a uma cori I centração de 100 mM em TBS e 50 JU- do substrato cromogénico Xa

S-2222 (1 mg/ml em TBS), e a mistura resultante foi mantida du.

I rante dois minutos à temperatura ambiente para formar uma solu ção contendo um produto de reacção cromogénico.

A quantidade de produto cromogénico formado foi quantifi cada medindo a quantidade de densidade óptica (O.D.) a 405 nanómetros (nm) usando um espectrofotómetro V-max de 96 depósitos (Molecular Devices, Mountain Vieuj, Califórnia). 0s contro los com PBS em vez de polipéptido, ou sem adição de factor VII, foram também efectuados para estabelecer os valores máximos e mínimos possíveis de O.D.. Os resultados destas inibições medidas estão apresentados no Quadro 10.

)

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-98Quadro 10

Inibição da activação de X sobre células 382 usando polipépti dos de huTF

Polipéptido	huTFh	Densidade Opt
PBS		0,960 χ 0,083
Sem Factor	Vll/VIIa	0,005 χ 0,001
pl-18		1,007 χ 0,087
pl-30		1,098 χ 0,028
pll-28		0,687 x 0,071
p24-35		0,477 χ 0,017
p26-49		0,437 x 0,020
p40-71		0,814 x 0,053
Ρ72-104		0,781 x 0,047
p94-123		0,818 x 0,055
P121-155		0,889 x 0,067
P144-159		0,507 x 0,053
P146-167		0,004 x 0,001
P157-169		0,389 x 0,035
plól-190		0,600 x 0,023
P190-209		0,625 x 0,031
p204-226		0,715 x 0,042
p244-263		0,619 x 0,047

•í

A inibição da activação do factor X (formação de Xa) foi considerada significativa se a densidade óptica (O.D.) fosse de cerca de 0,500 ou menos.

Os resultados deste estudo indicam que os polipéptidos de huTFh p24-35, p26-49, p!44-159, pl46-167 e pl57-169 se ligam ao factor Vll/VIIa, e podem inibir a sua capacidade para formar um complexo TF:VIl/VIIa que possa activar o factor X. Estes resultados indicam que um local de ligação de um análogo polipéptido de huTFh do presente invento pode ser usado para inibir a coagulação.

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24. Inibição in vivo da coagulação por MoAbs anti-huTFh

A sepsis provocada por bactérias gram-negativas envolve frequentemente um estado de choque que pode, em último caso, levar à morte. As alterações do sistema hemostático estão intimamente ligadas ao desenvolvimento do estado de choque. Taylor e col., 3. Clin. Invest., 79:918-825 (1987) mostraram que a adição exógena de proteína C activada, uma enzima anticoagulante que ocorre naturalmente, impede a resposta coagulopática e os efeitos mortais de concentrações LD^qq de E, coli em babuínos.

A capacidade de um MoAb anticoagulante do presente inveri to em inibir a coagulação in vivo foi examinada usando o modelo babuíno de choque séptico, descrito por Taylor e col., supra. Babuínos, pesando 7-8Kg foram mantidos em jejum de um dia para outro antes do estudo, e imobilizados na manhã da ex periância com cetamina (14 mg/kg intramuscularmente). Adminijs trou-se então pentobarbital de sódio na veia cefálica através de um catéter percutâneo para manter um baixo nível de anestesia cirúrgica (2 mg/kg em cada 45 min.). Uma veia femural foi exposta assepticamente e canalizada num membro posterior para colheita de sangue. 0 catéter percutâneo foi usado para infundir a E, coli e outros agentes, incluindo MoAb TF9-5B7,

TF de que mostrou no Exemplo 20 reagir de forma cruzada com/babuíno. Após um período de equilíbrio de 30 min., os animais foram infundidos durante um período de cerca de 10 min. com 500 yvg/kg ou com 150 yxg/kg de MoAb TF9-5B7 (isolado por MAPS como no Exemplo 7, e depois dializado contra para uma concentração de 0,58yug/ml) ou MoAb irrelevante.

solução salina estéril com 500 juq/kg de um

Após a administração de MoAb e um período de equilíbrio de 30 min., cada animal recebeu uma dose de E, coli (cejç ca de 10¹⁰ organismos, uma quantidade para produzir a morte de, vido a choque séptico cerca de 8-16 horas após a infusão). As E. coli foram administradas por infusão durante um período de 2 horas. Os resultados deste estudo estão apresentados no Quadro 11.

67 562 EPG:11-SCRF 113.2	-100-
	Quadro 11

Interrupção in	vivo da letalidade	do choque	séptico	no babuíno
			Dose	Hemos.	Infusão	de
	Grupo	MoAb	g/kg	tase^	E. coli	Morte
I.	Controlo	TF9-5B7	500	Normal	Não	Não
II.	Controlo	HB2	500	Normal	Sim	Sim
III.	Estudo	TF9-5B7	500	Normal	Sim	Não
		TF9-5B7	150	Normal	Sim	Não

¹ Diversos parâmetros hemostáticos, incluindo pressão sanguínea, activação da coagulação e produtos de degradação da fi brina, foram determinados após a administração de MoAb, mas antes da infusão de E, coli.

HB é um MoAb da mesma classe e sub-classe que TF9-5B7 mas imunorreage com um antigénio irrelevante.

do Quadro 11, os babuínos que receberam MoAb TF9-5B7 sobreviveram o teste com uma dose LD de E. coli. protegeram, cascata da coagulação e a degradação da fibrina associada à coagulopatia foram marcadamente atenuados nos animais recebendo MoAb TF9-5B7.

Como se pode ver a partir

100 Ambas as doses de 150y>ug/kg e 500ycg/kg de MoAb Em adição, a hipotensão acentuada, a activação em

25. Caracterização da cadeia leve do Heterodímero do huTF de 58 kDa como cadeia de Hemoglobina Alfa huTF isolado por imunoafinidade foi melhor caracteriza, do por análise em mancha Western, para identificar as espécies componentes do heterodímero do huTF de 58 kDa, nomeadamente as proteínas de 47 kDa e 12,5 kDa descritas no Exemplo 4.

A análise em mancha Western, conduzida como descrito no Exemplo 6c, foi efectuada usando huTF isolado por imunoafinidade, preparado como descrito no Exemplo 9, hemoglobina huma na purificada, ou usando padrões de peso molecular à medida que

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-101as amostras eram submetidas a electroforese. Quando indicado, ditiotreitol 50 mM foi incluído na amostra tampão para redução das pontes de bissulfureto. As manchas Western foram imunorreagidas, como indicado, usando IgG de coelho não-imunizado, IgG anti-huTF de coelho preparada usando métodos bem conhecidos ou IgG de hemoglobina anti-humana de coelho obtida de Dako (Santa Barbara, Califórnia). As duas primeiras preparações de IgG foram isoladas por MAPS-II como descrito no Exemplo 7.

) Os resultados da análise em mancha Western acima, estão apresentados na Figura 18. A IgG anti-huTF imunorreagiu somejn

I te com a banda 47 kDa do huTF reduzido, e não com a banda 12,5 kDa (Painel A, tira 3), enquanto que a mesma IgG imunorreagiu com ambas as formas 58 kDa e 47 kDa de huTF não-reduzido (Painel A, tira 4). Estes resultados são consistentes com uma ideri tificação de huTF como o componente de 47 kDa do heterodímero de 58 kDa. A IgG anti-hemoglobina imunorreagiu nas manchas Western só com a banda de 58 kDa na amostra de huTF não reduzi, da e não com o monómero de 47 kDa (Painel B, tira 4). Contudo, a IgG anti-hemoglobina imunorreagiu com a banda de 12,5 kDa na amostra de huTF reduzida (Painel B, tira 3), e imunorreagiu . com a proteína de hemoglobina humana purificada de 12,5 kDa ’ (Painel B, tira 2), Não houve qualquer reactividade com uma

IgG de coelho não imunizado.

Os resultados acima apoiam a conclusão de que a forma de 58 kDa do huTF não reduzido consiste na proteína de huTF de 47 kDa ligada por bissulfureto à hemoglobina.

Assim, pensa-se agora que o componente de cadeia leve de

12,5 kDa do heterodímero de 58 kDa descrito no Exemplo 4 é a cadeia alfa da hemoglobina e que a sua associação com a proteX na do huTF de 47 kDa é um artefacto do processo de isolamento do huTFh.

Sumário e Discussão dos Resultados do Exemplos 1-25

Foi já descrita uma biblioteca de vinte e quatro MoAbs para TF de cérebro humano, obtida a partir de 2 fusões celulares diferentes. Caracterizou-se a imunoespecificidade de cada

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102MoAb por mancha em ponto, mancha Western e radio-imunoensaio. A maior parte dos MoAbs reagiram com TF humano sob todas estas condições, e com TF nativo e desnaturado. Um dos MoAbs, TF8-5G9 tem sido usado, com sucesso, para a purificação de rotina da proteína TF. Ele absorve quantitativamente a actividade de TF dos extractos de tecido e, por consequência, produz TF huma no purificado em quantidades da ordem dos miligramas.

Todos, excepto um dos MoAbs, neutralizaram fortemente a actividade funcional de TF de cérebro humano, purificado. Embo ra diversos MoAbs reajam de forma cruzada com TF de babuíno e de macaco, nenhum dos anticorpos inibiu a coagulação do plasma humano deficiente em factor VII iniciada por tromboplastina de ratazana, coelho, bovina, canina, ovina, ou porcina, na presen ça de factor VII homólogo. Além disso, a iniciação da coagula ção de plasma humano normal por tromboplastina de cérebro de coelho, não foi iniciada por nenhum destes MoAbs, o que suporta a conclusão de que a inibição da actividade pro-coagulante de TF humano não foi devida à interferência pelos anticorpos com proteínas de coagulação do plasma solúveis, incluindo factor Vll/VIIa.

A base mais directa para a inibição da actividade pro-coagulante de TF por anticorpos anti-TF, consiste em bloquear a ligação do factor Vll/VIIa. Como esperado, todos os vinte e três MoAbs anti-coagulantes (neutralizantes), aboliram a ligação específica do factor Vll/VIIa a células 382, o que é consistente com a função receptora primária de TF. Isto foi melhor substanciado na titulação da dose de MoAbs purificado seleccionado, na qual ocorreu metade da inibição máxima de ligação de factor VII e metade da inibição máxima da cadência de formação de factor Xa, a concentrações semelhantes de IgG.

Foi descrito recentemente um MoAb para TF humano por Ca.r son e col., Blood, 70:490 (1987), como inibindo a actividade de TF, aparentemente interferindo com a ligação de factor Vll/VIIa, embora isto não tenha sido examinado directamente. A descoberta de que vinte e três de vinte e quatro dos MoAbs pre sentemente descritos neutralizaram fortemente a actividade de TF é notável. A experiência em laboratório com MoAbs para uma

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-103variedade de proteínas da coagulação humana tem sido, que, só z uma pequena proporção, neutraliza a actividade funcional. E pouco provável que os hibridomas sejam todos clones parentes, devido às diferenças nas suas reactividades, incluindo reactividades cruzadas com TF de primata. Em adição, estudos em evci lução sobre gráficos de epítopos, indicam que pelo menos três locais de ligação de anticorpo não-competitivos distintos são reconhecidos por este painel de MoAbs. Portanto, a grande proporção de MoAbs neutralizantes para TF é, pouco provavelmente, a consequência de alguns epítopos imunodominantes que parti cipam também na função; de facto, a sequência aminoácida TF es. tá prevista pelo método de Hopp e col., Mol, Immunol», 20:483 (1983), como contendo múltiplos determinantes antigénicos.

pequeno tamanho de TF pode explicar, em parte, porque é que tantos MoAbs anti-TF bloquearam a ligação de factor Vil/ /Vila. Prevê-se a partir de clonação de cADN, que TF tenha um domínio extracelular de 25 kDa, excluindo a glicosilação. Portanto, as moléculas de anticorpo de factor Vll/VIIa podem apre sentar um impedimento estereo na ligação com o domínio extracelular muito mais pequeno de TF. A hipótese do impedimento estereo está consistente com a observação de que a concanavalina A apresenta actividade TF, /~Pitlick, 3. Clin. Invest., 55:175 (1975)./ visto que os grupos carbo-hidrato em TF não são provavelmente necessários para a função /~Nakamura, Throm. Hemost., 58:135 (1987)./.

Houve alguma preocupação pelo facto de a actividade pro-coagulante dependente do factor VII, expressa por diferentes células e tecidos, poder ser atribuível a mais de uma espécie molecular de proteínas tipo TF com função semelhante. Contudo, o MoAb TF8-5G9 inibiu quantitativamente a actividade pro-coagu lante de cérebro em bruto e de extractos placentáxios, e de fibroblastos lisados, de células de carcinoma de bexiga e de células mononucleares do sangue periférico. Embora não exaustivos, estes resultados suportam a conclusão que as actividades celulares pró-coagulantes, correntemente atribuídas a TF, estão antigenicamente relacionadas, se não idênticas. Isto está con. sistente com a descoberta de que há, provavelmente, um só gene

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-104para TF.

Recentemente, tem sido demonstrado que os efeitos letais do choque séptico podem ser impedidos, em babuínos, pela infusão de proteína C activada, uma proteína anticoagulante que actua em passos intermédios na cascata de proteases de coagula, ção. Os estudos presentes indicam que os MoAbs que inibiram a actividade TF são agentes anticoagulantes altamente específicos in vivo visto que, bloqueando a iniciação da cascata de pro teases de coagulação, impedem o consumo de factores de coagula ção de plasma, normalmente associado com a activação patológica da coagulação intravascular.

A forma de 58 kDa de huTF descrita no Exemplo 4, foi aqui mostrada como sendo um heterodímero, ligado por bissulfureto, da proteína de TF de 47 kDa e um polipéptido de aproximadamente 12,5 kDa, agora identificado imunoquimicamente e por sequên cia aminoácida parcial, como a cadeia alfa da hemoglobina. A especulação prévia de que a banda de 58 kDa possa constituir uma forma heterodimérica, natural, de TF celular, está provável, mente incorrecta, e é provável que o heterodímero de 58 kDa s.e ja formado durante o isolamento.

A cadeia alfa da hemoglobina tem uma só cisteína, e prevê-se que TF, a partir do cADN, tenha uma só cisteína no seu domínio citoplasmíco. TF tem também quatro cisteínas no seu domínio extracelular, mas pelo menos dois têm de estar envolvi, dos nas ligações de bissulfureto entre cadeias, visto que a fun ção TF é perdida após redução. A cisteína isolada no domínio citoplasmátioo de TF está, provavelmente, como as cisteínas na maior parte das proteínas citoeólidas, mantida no estado reduzido. Esta (ou menos provavelmente outra cisteína de TF) podem estar prontamente acessíveis para a formação de bissulfure to misto após a lise celular, e propõe-se que a oxidação durante o processo de isolamento resulte na formação de uma liga, ção bissulfureto entre o resíduo cisteína do domínio citoplasma tico de TF e a hemoglobina. A apoiar esta conclusão está a observação de que a formação de heterodímero está aparentemente dependente do tempo, pelo que minimizando o tempo entre a

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-105 extracção com detergente de TF do pó de acetona de cérebro e ligando à matriz de imunoafinidade, diminui a quantidade de TF heterodimérica obtida. Pode-se também formar o dímero de TF presumido de 96 kDa por um mecanismo semelhante durante o isolamento.

Uma coluna de anticorpo anti-hemoglobina ligou especificamente o heterodímero de 58 kDa, mas não removeu quantitativa mente todas as espécies de pesos moleculares mais elevados observadas nas preparações de TF purificado por imunoafinidade. Observaram-se quantidades vestigiais de outras bandas menores com pesos moleculares superiores a 47 kDa, que reagem com anti corpos anti-TF. Estas espécies menores, incluindo uma porção da banda de 58 kDa, podem representar bissulfuretos mistos fo.r mados entre TF e outras proteínas não-identificadas.

A especificação acima, incluindo as concretizações e exemplos específicos, destina-se a ser ilustrativa do presente invento e não deve ser tomada como limitante. Podem-se efectuar numerosas outras variações e modificações sem se afastar do verdadeiro espírito e alcance do presente invento.

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Processo de preparação de uma molécula de ADN recombinante que codifica um segmento de ADN compreendendo não mais do que cerca de 12000 pares de bases nucleótidas incluindo o referido segmento um gene estrutural que codifica a proteína do factor de tecido humano, de cadeia pesada, caracterizado por compreender:

   ) a) ligar operativamente um vector ao referido segmento de ADN, codificando o referido vector uma sequência de contro. lo de expressão;

   b) transformar uma célula hospedeira apropriada com a referida molécula de ADN recombinante;

   c) cultivar o referido hospedeiro? e

   d) recolher a referida proteína de factor de tecido humano, de cadeia pesada, expressa.

   2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido gene estrutural codificar uma proteína pos, suindo a seguinte sequência de resíduos de aminoácidos:

   -30 -20 -10 ME TPAWPRVPRP ETAVARTLLL GWVFAQVAGA 10 20 30 40 SGTTNTVAAY NLTWKSTNFK TILEWEPKPV NQVYTVQIST 50 60 70 80 KSGDWKSKCF YTTDTECDLT DEIVKDVKQT YLARVFSYPA 90 100 110 120 GNVESTGSAG EPLYENSPEF TPYLETNLGQ PTIQSFEQVG 130 140 150 160 TKVNVTVEDE RTLVRRNNTF LSLRDVFGKD LIYTLYYWKS

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   EPG:11-SCRF 113.2 _;χ,-107-

   170 180 190 200 SSSGKKTAKT NTNEFLIDVD KGENYCFSVQ AVIPSRTVNR 210 220 230 240 KSTDSPVECM GQEKGEFREI FYIIGAVVFV VIILVIILAI 250 260 SLHKCRKAGV GQSWKENSPL. NVS

   I desde cerca do resíduo 1 a cerca do resíduo 263.

   3 - Processo de preparação de um análogo polipêptido do local de ligação do factor de tecido humano, compreendendo não mais de cerca de 50 resíduos de aminoácidos e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácidos que corresponde a uma sequência representada pela fórmula seleccionada do grupo que consiste em:

   -VNQVYTVQIST-, e

   -LYYWKSSSSGKKT-, caracterizado por compreender

   a) reagir uma resina de estireno-divinilbenzeno, ligada cruzadamente, clorometilada, com o grupo carboxi de um aminoácido bloqueado em amino para formar um aminoácido, bloqueado em amino, ligado à resina;

   b) separar a resina reagida de qualquer aminoácido, blo queado em amino, não reagido;

   c) remover o grupo bloqueador de amino para formar um grupo amino livre de um aminoácido ligado à resina;

   d) separar do meio reaccional a resina reagida, contendo o grupo amino livre?

   e) acoplar o grupo carboxi de outro aminoácido, bloqueja do em amino, com a resina, contendo o grupo amino livre, para formar uma ligação amida entre o grupo amino livre na resina e o grupo carboxi do aminoácido mencionado em último lugar, e um pêptido ligado à resina;

   tf

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   -10p-

   f) separar □ pêptido ligado à resina, acoplado por amida, de qualquer aminoácido bloqueado em amino, não reagido;

   repetir os passos de c) a f) até se preparar o pêpti do ligado à resina, desejado;

   g) clivar da resina o pêptido; e

   h) recuperar o pêptido.

   4 - Processo de preparação de um análogo polipéptido do factor de tecido humano possuindo uma fórmula seleccionada do grupo que consiste em

   H-EPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKC-OH,

   H-EWEPKPVNQVYT-OH,

   H-RDVFGKDLIYTLYYWK-OH

   H-YWKSSSSGKKTAK-OH,

   H-VNQVYTVQIST-OH,

   H-LYYWKSSSSGKKT-OH,

   H-VFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKT-OH, e

   H-SSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSV-OH, caracterizado por compreender:

   a) reagir uma resina de estireno-divinilbenzeno, ligada cruzadamente, clorometilada, com o grupo carboxi de um aminoácido bloqueado em amino para formar um aminoácido, bloqueado em amino, ligado à resina;

   b) separar a resina reagida, de qualquer aminoácido, bloqueado em amino, não reagido;

   c) remover o grupo bloqueador de amino para formar um grupo amino livre de um aminoácido ligado à resina;

   d) separar do meio reaccional a resina reagida, contendo o grupo amino livre;

   e) acoplar o grupo carboxi de outro aminoácido, bloquea do em amino, com a resina, contendo o grupo amino livre, para formar uma ligação amida entre o grupo amino livre na resina e o grupo carboxi do aminoácido mencionado em último lugar, e um pêptido ligado à resina;

   _r/f

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   -109-

   f) separar o péptido ligado à resina, acoplado por amida, de qualquer aminoácido bloqueado em amino, não reagido;

   repetir os passos de c) a f) até se preparar o pépti do ligado à resina, desejado;

   g) clivar da resina o péptido; e

   h) recuperar o péptido.

   5 - Processo de preparação de um análogo polipéptido do factor de tecido humano possuindo uma fórmula seleccionada do grupo que consiste em:

   H-SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPV-OH,

   H-TKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDUKQTY-OH,

   H-KSGDWKSKC-OH,

   H-ECDLTDEIVKDVKQTY-OH H-LARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLC-OH, H-YENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQUGTKV-OH, e H-QAVIPSRTVNRKSTDSPVEC-OH, caraeterizado por compreender:

   a) reagir uma resina de estireno-divinilbenzeno, ligada cruzadamente, clorometilada, com o grupo carboxi de um aminoácido bloqueado em amino para formar um aminoácido, bloqueado em amino, ligado à resina;

   b) separar a resina reagida, de qualquer aminoácido, bloqueado em amino, não reagido;

   c) remover o grupo bloqueador de amino para formar um grupo amino livre de um aminoácido ligado à resina;

   d) separar do meio reaccional a resina reagida, contendo o grupo amino livre;

   e) acoplar o grupo carboxi de outro aminoácido, bloquea do em amino, com a resina, contendo o grupo amino livre, para formar uma ligação amida entre o grupo amino livre na resina e o grupo carboxi do aminoácido mencionado em último lugar, e um péptido ligado à resina;

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   -Λ·®»* _s>-1 ιοί) separar o péptido ligado à resina, acoplado por amida, de qualquer aminoácido bloqueado em amino, não reagido; repetir os passos de c) a f) até se preparar o péptj. do ligado à resina, desejado;

   g) clivar da resina o péptido; e

   h) recuperar o péptido.

   6 - Processo de preparação de uma composição de anticorpos compreendendo moléculas de anticorpos que:

   a) imunorreagem com proteína do factor de tecido humano, de cadeia pesada;

   b) imunorreagem com um polipéptido representado por uma fórmula seleccionada do grupo que consiste em:

   H-EPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKC-OH, H-VFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKT-OH, H-SSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSV-OH, H-SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPV-OH H-TKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTY-OH, H-KSGDWKSKC-OH, H-ECDLTDEIVKDVKQTY-OH H-LARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLC-OH, H-YENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQl/GTKV-OH, e H-QAVIPSRTVNRKSTDSPVEC-OH; e

   c) não imunorreagem substancialmente com um polipéptido representado pela fórmula apresentada na reivindicação 2, desde cerca da posição 204 até cerca da posição 226, processo caracterizado por compreender:

   1) misturar antigénio, correspondente à referida proteí.

   na do factor de tecido humano, de cadeia pesada, ou qualquer dos referidos polipéptidos com uma composição diluente aquosa, farmaceuticamente aceitável para formar um inóculo antigénico,
2. 2) administrar o referido inóculo numa quantidade eficaz para que um hospedeiro mamífero seja capaz de formar anticorpos para os referidos antigénios;

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3. 3) recolher o sangue do referido hospedeiro mamífero;
4. 4) isolar a referida composição de anticorpos, do referido sangue.

   7 - Hibridoma que produz moléculas de anticorpo capazes de imunorreagirem com proteína de cadeia pesada de factor de tecido humano, caracterizado por ser seleccionado do grupo que consiste em

   I TF8-5G9,

   TF9-10H10,

   TF9-5B7.

   8 - Processo de preparação de composição de polipéptidos para inibição da ligação de factor tecidual humano a factor de coagulação Vll/VIIa in vivo, caracterizado por compreender associar um polipéptido seleccionado do grupo que consiste em:

   H-EPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKC-OH,

   H-VFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKT-OH, e

   H-SSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSV-OH;

   com um diluente fisiologicamente tolerável, estando o referido polipéptido presente, na referida composição numa quantidade eficaz para reagir com o factor Vll/VIIa.

   9 - Sistema de diagnóstico, sob a forma de conjunto, para determinar a presença de proteína do factor de tecido humano, de cadeia pesada, numa amostra, caracterizado por compreerj der:

   a) uma embalagem contendo uma composição de anticorpos monoclonais contendo moléculas de anticorpo produzidas por um dos hibridomas seleccionados do grupo que consiste em:

   a) TF8-5G9,

   b) TF9-6B4, e

   c) TF9-10H10.

   10 - Processo de preparação de uma composição, caracteri zado por compreender a formação de uma solução aquosa de pro

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   -112- teína do factor tecidual humano, de cadeia pesada, biologicamente activa, substancialmente isenta de proteína do factor tedial humano, de cadeia leve·

   11 - Sistema de diagnóstico sob a forma de conjunto, para testar a capacidade de coagulação numa amostra de fluido de sistema vascular, caracterizado por compreender:

   a) uma embalagem contendo uma composição, em solução aquosa, de proteína do factor de tecido humano, de cadeia pesa da, essencialmente isenta de proteína do factor de tecido huma no, de cadeia leve, estando a referida proteína de cadeia pesa da presente numa quantidade suficiente para realizar pelo menos um teste.

   12 - Método de preparação de proteína madura, do factor de tecido humano, de cadeia pesada, caracterizado por compreender os seguintes passos:

   a) iniciar, num meio nutriente, uma cultura de células de mamífero transformadas com uma molécula de ADN recombinante, compreendendo um vector de expressão compatível com as referidas células, ligado operativamente a um primeiro segmento de ADN que define um gene estrutural que codifica uma proteína do factor de tecido humano, de cadeia pesada, e a um segundo segmento de ADN contíguo ao referido primeiro segmento e que codi^ fica uma sequência de comando de resíduos de aminoácido ligada à referida proteína; definindo os referidos primeiro e segundo segmentos de ADN, em conjunto, um gene estrutural compósito que codifica uma forma precursora da referida proteína;

   b) manter a referida cultura durante um período de^empo suficiente para que as referidas células expressem proteína a partir da referida molécula de ADN recombinante e formem a referida proteína madura; e

   c) recuperar da referida cultura, a referida proteína madura