DE102011008153B4 - Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen oligomeres Alpha-Synuclein - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen oligomeres Alpha-Synuclein Download PDF

Info

Publication number
DE102011008153B4
DE102011008153B4 DE102011008153.4A DE102011008153A DE102011008153B4 DE 102011008153 B4 DE102011008153 B4 DE 102011008153B4 DE 102011008153 A DE102011008153 A DE 102011008153A DE 102011008153 B4 DE102011008153 B4 DE 102011008153B4
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
synuclein
alpha
pathological
hybridomas
oligomeric
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
DE102011008153.4A
Other languages
English (en)
Other versions
DE102011008153A1 (de
Inventor
Dr. Lachmann Ingolf
Gabor G. Dr. Kovacs
Dr. Wagner Uta
Dr. Osman Awad A.
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ROBOSCREEN GMBH, DE
Original Assignee
AJ Roboscreen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by AJ Roboscreen GmbH filed Critical AJ Roboscreen GmbH
Priority to DE102011008153.4A priority Critical patent/DE102011008153B4/de
Publication of DE102011008153A1 publication Critical patent/DE102011008153A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE102011008153B4 publication Critical patent/DE102011008153B4/de
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen pathologisches oligomeres Alpha-Synuclein durchImmunisierung von Mäusen oder In-vitro-Zellkulturen mit dem Peptid TKEGWHGVATVAE des Alpha-Synucleins, gekoppelt an einen Träger, zur Induktion einer adäquaten Immunantwort in Adjuvant,Entnahme der B-Lymphozyten, Fusion dieser mit der für eine nachfolgende Selektion von Fusionszellen geeigneten murinen Myelomzelllinie P3X63 Ag8.653 unter Verwendung von Polyethylenglycol 1500,nachfolgender HAT-Selektion der Fusionsprodukte in Zellkulturgefäßen, Auswahl Immunglobulin produzierender und unter Selektionsbedingungen wachsender Hybridome und aufgrund ihrer Reaktivität gegenüber dem Immunogen oder pathologischem, oligomerem Alpha-Synuclein,Vereinzeln der Hybridome auf Einzelzellebene zur Sicherstellung der Monoklonalität der Hybridomkultur,Kultivierung der Hybridome, wobei das Kultivieren der Hybridome in vitro oder in vivo monoklonale Antikörper 5G4/F7 ergibt, die das Epitop HGVA auf pathologischem, oligomerem Alpha-Synuclein erkennen.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers (MAk) 5G4/F7, die murine monoklonale Hybridomzelllinie H-5G4/F7. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Diagnostik und die Therapie von Synucleopathien, einer Gruppe neurodegenerativer Erkrankungen beim Menschen, deren häufigste Form Morbus Parkinson darstellt. Die Diagnostik kann in verschiedenen Körperflüssigkeiten oder Gewebsproben mittels immunochemischer Testverfahren erfolgen. Weiterhin kann der Antikörper für histologische Untersuchungen post mortem in der neuropathologischen Diagnostik eingesetzt werden.
  • Verfahren zur Herstellung von MAk gehen auf Arbeiten von Köhler und Milstein (1975) zurück und sind in den vergangenen Jahren und Jahrzehnten breit erforscht und ausgebaut worden. Monoklonale Antikörper sind als Detektoren für Epitope auf Zelloberflächen unverzichtbar. In der Diagnostik von Krankheiten an Tier und Mensch werden sie vielfältig eingesetzt, als Bestandteile von Therapeutika ebenso.
  • Parkinson
  • Die Parkinson-Erkrankung (Morbus Parkinson) ist eine Krankheit, bei der es zu einem fortschreitenden Verlust bestimmter Zellen (dopaminproduzierender Zellen) des Gehirns kommt. Dadurch kann der Neurotransmitter Dopamin nicht mehr in ausreichender Menge produziert werden. Ohne die richtige Menge an Dopamin kann sich der Mensch nicht richtig bewegen. Es kommt zu den klassischen Symptomen mit Bewegungsarmut bzw. Bewegungsverlangsamung (Akinese), Muskelsteifheit (Rigor) und Zittern (Tremor). Daher nannte James Parkinson diese Erkrankung in seiner Erstbeschreibung aus dem Jahr 1817 auch Schüttellähmung (Paralysis agitans).
  • Die Parkinson Krankheit ist eine Erkrankung vorwiegend des höheren Lebensalters. Nur etwa zehn Prozent der Patienten sind bei Diagnosestellung jünger als 40 Jahre. In der Regel fällt die Erkrankung zwischen dem 50. und 60. Lebensjahr auf. Die Häufigkeit nimmt mit dem Alter zu. In der Gesamtbevölkerung sind zwischen 100 und 200 pro 100 000 Personen betroffen. Bei Personen älter als 60 ist etwa einer von 100 erkrankt. Das männliche Geschlecht ist etwas häufiger betroffen.
  • Diagnose
  • Die Diagnose „Parkinson“ ergibt sich aus den Symptomen, der Krankengeschichte und den Untersuchungsbefunden. Ein anfangs gutes Ansprechen auf die Gabe von L-Dopa, einer Vorstufe von Dopamin, ist richtungsweisend. Um andere Hirnerkrankungen auszuschließen, werden das CCT (Schädel-Computertomogramm) und MRT (Magnet-Resonanz-Tomogramm) eingesetzt. Spezielle Verfahren der Nuklearmedizin (PET und SPECT) erlauben zwar eine aussagekräftige Diagnose, sind jedoch sehr kostenintensiv. Labordiagnostische Verfahren zur Diagnose von Morbus Parkinson extistieren zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht, die Verwendung des Nachweises von Alpha-Synuclein wird aber diskutiert.
  • Nannenga et al. (Nannenga, Brent L.; Zameer, Andleeb; Sierks, Michael R.; Anti-oligomeric single chain variable domain antibody differentially affects huntingtin and α-synuclein aggregates.; In FEBS Letters, Vol. 582, 2008,No. 4, S. 517-522, ISSN 0014-5793) beschreiben einen Antikörper, der die Formierung von htt-Fibrillen blockiert, aber die Formation zytotoxischer oligomerer htt-Aggregate stabilisiert. Gleichzeitig wird von Nannenga et al. darauf verwiesen, dass vorherige Arbeiten eine Blockierung der Toxizität von Oligomeren von Alpha-Synuclein zeigten. Außerdem ist beschrieben, dass der Antikörper nicht nur spezifisch mit oligomeren Formen des Alpha-Synucleins reagiert, sondern mit htt51Q. Eine Bindungstelle dieses Antikörpers ist darüber hinaus nicht definiert. Weiterhin sind die Eigenschaften dieses Antikörpers nur an synthetischen Materialien bzw. an Zellkulturen beschrieben. Die Aggregation von Synuclein als Ursache für die Parkinson-Krankheit ist mehrfach beschrieben.
  • Kolaskar et al. (Kolaskar, AS Tongaonkar, OC. FEBS Lett. 1990 Dec 10; 276 (1-2) 172-4) beschreiben ein grundsätzliches Verfahren, das für das Heraussuchen von geeigneten Peptidsequenzen zur Erzeugung von Immunantworten in Mäusen in der vorliegenden Erfindung verwendet wurde. Darüber hinaus beschreiben Kolaskar et al. aber nicht, wie herausgefunden werden kann, welche Eigenschaften ein an diese geeigneten Peptidsequenzen bindender Antikörper haben muss und ob diese Sequenzen und ein bindender Antikörper an diese Sequenzen geeignet sind, bei einem Protein zwischen normalem, d.h. monomerem Synuclein, und pathologischem oligomerem Synuclein zu unterscheiden.
  • Lippa et al. (Lippa, Carol F. [et al]: α-alpha-synuclein in familial Alzheimer disease: epitope mapping parellels dementia with Lewy bodies and Parkinson disease.; In: Archives of neurology, Vol. 58, 2001, S. 1817-1820; ISSN 0003-9942) beschreiben fünf Antikörper (SNL-4, SYN204, LB509, 211, 202) gegen alpha-Synuclein mit ihren Bindungsstellen (Epitopen), die an die Aminosäresequenzen 2-12, 87-110, 115-122, 121-125 und 130-140 binden. Zwar werden dort Antikörper gegen alpha-Synuclein mit ihren Bindungsstellen beschrieben, das für die vorliegende Erfindung wichtige Epitop HGVA auf Alpha-Synuclein aber nicht genannt.
  • In WO 2007/021255 A1 werden verschiedene Antikörper gegen verschiedene Bindungsstellen (Epitope) des alpha-Synuclein beschrieben. Keiner der beschriebenen Antikörper ist gegen das Epitop HGVA, Aminosäuresequenz 50-53 des humanen alpha-Synuclein, das die Bindungsstelle des erfindungsgemäßen Antikörpers 5G4/F7 darstellt, gerichtet. In WO 2007/021255 A1 ist weiterhin beschrieben, dass diese verschiedenen Antikörper gegen die verschiedenen Bindungsstellen (Epitope) des alpha-Synuclein alle zur Bindung an alpha-Synuclein speziell in löslicher Form und Lewybodies geeignet sind.
  • Bei Conway et al. (Conway, Kelly A.; Harper, James D.; Lansbury, PeterT.Jr.; Fibrils formed in vitro from α-synudein and two mutant forms linked to parkinson's disease are typical amyloid.: In Biochemistry, Vol. 39, 2000, No. 10, S. 2552-2563) wird auf Seite 21058 in die gesamte Sequenz des humanen Alpha-Synucleins dargestellt, ohne dass die für die vorliegende Erfindung wichtige Sequenz HGVA dabei besonders hervorgehoben ist oder in ihrer Eigenschaft als hervortretende Bindungsstelle für einen möglichen Binder, wie einen monoklonalen Antikörper, durch die Oligomerisierung des Alpha-Syncucleins beschrieben wird. Der Fachmann könnte daraus jedoch lediglich entnehmen, dass gezeigt wird, wie durch Beta-Helix-Bildung die Aggregation des Alpha-Synucleins befördert wird, ohne dass die für die vorliegende Erfindung wichtige Sequenz HGVA dabei jedoch betrachtet wird.
  • Lamberto et al. (Lamberto, G. R. et al.; PNAS, December 15, 2009, Vol. 106, No. 50, Seiten 21057-21062) beschreiben mutierte Formen des Alpha-Synucleins A30T und A53T, wobei die T53-Form als stärker oligomerisierend beschrieben wird. Die Epitopdarstellung von verschiedenen Antikörpern zeigt aber weder einen Bezug zur für die vorliegende Erfindung wichtigen Sequenz HGVA, noch zur Eigenschaft, in der patholgisch oligomeren Form besonders hervorzutreten, als immunogene Region oder als Antikörperbindungsstelle.
  • Nachteilig ist, dass bisherige immundiagnostische Techniken sich auf den Nachweis von Alpha-Synuclein konzentrieren, wobei keine Unterscheidung zwischen der ubiquitär vorkommenden, monomeren Form des Proteins und den bei pathologischen Prozessen auftretenden Aggregaten bzw. Oligomeren (pathologisches, oligomeres Alpha-Synuclein) getroffen werden kann. In der Histopathologie werden unter Verwendung monoklonaer Antikörper gegen Alpha-Synuclein beide Formen dargestellt und über die Dichte der aggregierten Strukturen eine Differenzierung ermöglicht. In immunochemischen Testungen wird meist der Gesamtgehalt an Alpha-Synuclein bestimmt.
  • Die Ursache liegt vor allem darin, dass zwischen der monomeren normalen Alpha-Synuclein Struktur und den pathologischen Formen (pathologisches oligomeres Alpha-Synuclein) zumindest in der Primärsequenz des Moleküls keine Unterschiede zu finden und diese für die tertiäre/quartäre Strukturen bisher auch noch nicht im Detail beschrieben sind. Entwickelte monoklonale Antikörper sind deshalb bisher nicht in der Lage, aufgrund des Vorhandenseins der Bindungsstelle auf dem Monomer wie auch Oligomer von Alpha-Synuclein diese zu unterscheiden.
  • Die Erfindung hat das Ziel, einen monoklonalen Antikörper zu entwickeln, der spezifisch pathologisches, oligomeres Alpha-Synuclein erkennt.
  • Die Erfindung hat die Aufgabe, einen monoklonalen Antikörper zur Verfügung zu stellen, der ein bisher nicht zur Bindung verwendetes Epitop besitzt und aufgrund dieser Struktur sich an ein pathologisches, oligomeres Alpha-Synuclein bindet und seine Identifizierung ermöglicht.
  • Bei der Auswahl des Immunogens wurde die Methode nach Kolaskar et al. verwendet. Mit dieser Methode können antigene Determinanten mit etwa 75 % Genauigkeit ausgewählt werden. Aus der Alpha-Synuclein-Sequenz konnten demnach 4 Peptide als mögliche Kandidaten gefunden werden:
    • 1- EGWAAAEKTKQGVAEA
    • 2- AGKTKEGVLYVGSK
    • 3- TKEGWHGVATVAE
    • 4- TGVTAVAQKTVEGA
  • Die gestellte Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren nach Anspruch 1 und den monoklonalen Antikörper 5G4/F7 nach Anspruch 4. Konkret wird die Aufgabe derart gelöst, dass in einem ersten Schritt Mäuse mit den 4 ausgewählten Peptiden aus dem Alpha-Synuclein in Gerbu-Adjuvant immunisiert, den Mäusen die B-Lymphozyten entnommen und mit der Myelomzelllinie P3X63 Ag8.653 unter Verwendung von 50-%-igem Polyethylenglycol fusioniert werden.
  • Die Fusionsprodukte werden mittels HAT-Selektion nach Littlefield (1964) in Zellkulturplatten selektioniert. Die Charakterisierung der Primärzelllinie erfolgt durch folgende Testungen:
    • - Testung auf Immunglobulin G (IgG) produzierende und wachstumfähige Hybridome,
    • - Prüfung der Reaktivität des produzierten IgG mit dem Immunogen im Western Blot,
    • - und Prüfung der Reaktivität des produzierten IgG mit dem monomeren und dem pathologischen, oligomeren Alpha-Synuclein im Western Blot.
  • Nach der Immunisierung und Charakterisierung war nur das Peptid Nr. 3 mit der Aminosäuresequenz TKEGWHGVATVAE, Position 44-57 des humanen Alpha-Synuclein, für die Entwicklung von monoklonalen Antikörpern geeignet.
  • Die entwickelten Hybridome, nach Immunisierung mit Peptid Nr. 3, Fusion mit der Myelomzelllinie P3X63 Ag8.653 und HAT-Selektion, werden per Verdünnung in der Kultur bis zur einzelnen Ausgangszelle (engl.: limiting dilution) kloniert und subkloniert und zu monoklonalen Hybridomzellen kultiviert. Expandierte monoklonale Hybridome werden wiederum auf ihre Fähigkeit, IgG zu produzieren, und ihre Reaktivität gegenüber dem monomeren und oligomeren Alpha-Synuclein mittels ELISA und Western Blot getestet. Nach erfolgreicher Testung werden die Hybridome durch Einfrieren von 5×106 Zellen in fetalem Kälberserum + 10 % Dimethylsulfoxide gesichert.
  • Aus der Vielzahl der entstandenen Hybridome wird die Zelllinie H-5G4/F7 als produktiver Klon ausgewählt und kultiviert.
  • Produktion und Sicherung des MAk und der Hybridomzelllinie H-5G4/F7
  • Zunächst wird eine Sicherheits-Zellbank (oder Hauptzellbank bzw. oder Originalzellbank; engl.: master cell bank) und eine Arbeitszellbank (engl.: working cell bank) der monoklonalen Hybridomzelllinie H-5G4/F7 angelegt. Dann werden Chargen des MAk 5G4/F7 in MiniPerm-Kleinreaktoren produziert und nach Prüfung zur Verwendung freigegeben.
  • Charakterisierung des MAk 5G4/F7
    • - Der Antikörper der monoklonalen Hybridomzelllinie H-5G4/F7 wird charakterisiert unter Verwendung eines Maus-Hybridoma-Subtyping Kit der Firma Roche. Das Ergebnis dieser Analyse zeigt, dass der Antikörper den Isotyp IgG1 [kappa] besitzt.
    • - Westernblot-Analysen werden durchgeführt und zeigen, dass der Antikörper mit dem pathologischen, oligomeren Alpha-Synuclein reagiert.
    • - Epitop-mapping erfolgt mittels Pepscan nach Osman et al. (2001). Der Antikörper erkennt das Epitop HGVA am humanen Alpha-Synuclein.
    • - Reaktivitätsnachweis in Immuno-Assays von pathologischem, oligomerem Alpha-Synuclein ist im Ausführungsbeispiel erbracht.
  • Ausführungsbeispiele
  • Herstellung des pathologischen, oligomeren Alpha-Synuclein
  • Zur Herstellung pathologischen, oligomeren Alpha-Synucleins (70 µM; 1 mg/ml) wird monomeres Alpha-Synuclein in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,7 inkubiert unter Zusatz von 0,5 mM Natriumlaurylsulfat (SDS; Sodium Dodecyl Sulfate), 100 mM NaCl für 20 Stunden bei 37 °C unter Rühren. Portionen pathologischen, oligomeren Alpha-Synucleins werden stabil gelagert bei -80 °C.
  • Alpha-Synuclein-Oligomer-ELISA
  • Der ELISA (engl.: Enzyme-linked Immunosorbent Assay) ist ein enzymimmunologischer Assay, der aus einem Fang-Antikörper (monoklonal), einer Präparation an pathologischem oligomerem Alpha-Synuclein und einem mit Peroxidase (POD) markierten Nachweis-Antikörper (monoklonal) besteht. Beide Antikörper binden an unterschiedlichen Bindungsdomänen des Alpha-Synuclein, so dass das pathologische, oligomere Alpha-Synuclein eine spezifische Brücke zwischen beiden Antikörpern (sandwich) bildet.
  • Beschreibung der Durchführung des ELISA
  • 100 µl des Antikörpers 5G4/F7 werden in 0,05 M Karbonatpuffer pH 9,6 in die Vertiefung einer Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert und für 18 Stunden beladen. Der Inhalt wird abgesaugt und die freien Bindungsstellen werden mittels 3 %-iger Rinderserumalbumin-lösung (Assaypuffer) abgesättigt. 100 µl Alpha-Synuclein-Oligomer-Präparation in einer Verdünnungsreihe bzw. einer unbekannten Konzentration werden in der Vertiefung der MTP gegeben und für 90 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 3-maligem Waschen werden 100 µl Nachweis-Antikörper-POD (Klon 10D2, spezifisch für Alpha-Synuclein, Eigentümer AJ Roboscreen GmbH) pipettiert und 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Über eine nachgeschaltete Substrat-POD (Horseradishperoxidase)-Reaktion kann die gebundene Menge des oligomeren Alpha-Synuclein bestimmt werden. Als Substrat wird Tetramethylbenzidin (TMB) verwendet. Die Höhe des Signals ist proportional der Menge des vorhandenen pathologischen, oligomeren Alpha-Synculeins. Unbekannte Proben werden anhand ihrer Signalhöhe aus einer Eichkurve bestimmt.
  • Ergebnis des ELISA
  • Es wird im ELISA die Bindung von pathologischem, oligomerem Alpha-Synuclein an eine mit 5G4/F7 beschichtete Mikrotiterplatte im Vergleich zu nicht bindendem monomerem Alpha-Synuclein gezeigt.
  • Pathologisches, oligomeres und monomeres Alpha-Synuclein werden in Form einer Verdünnungsreihe inkubiert. Gebundenes Alpha-Synuclein wird nachgewiesen mit dem Antikörper 10D2, der beide Formen an Alpha-Synuclein erkennt und im ELISA mit Meerettich-peroxidase konjugiert verwendet wird. In einem weiteren Ansatz wird die Inhibierung der Bindung von pathologischem, oligomerem Alpha-Synuclein an 5G4/F7 durch Zusatz des Alpha-Synuclein Peptides 44-57 gezeigt, dass die spezifische Bindungsstelle von 5G4/F7 (Epitop) enthält. Dazu wird der Reaktionsansatz mit 1 µg Peptid ko-inkubiert. Das Ergebnis des ELISA ist in dargestellt.
  • Alpha-Synuclein-Fang-Assay
  • Der Fangassay ist ein Bead-basierender Test, der spezifisch pathologisches, oligomeres Alpha-Synuclein aus Präparationen isoliert und dieses dann nach Auftrennung mittels SDS-PAGE und Übertragung auf Nitrozellulose mittels Wetsern Blot durch ein spezifisches Alpha-Synclein Antiserum nachweisen lässt.
  • Beschreibung der Durchführung des Fang-Assay
  • Biotinylierter Antikörper 5G4/F7 wird mit vorgewaschenen Streptavidin-beschichteten Dynabeads M-280 nach Herstellervorschrift inkubiert (Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway). Die mit biotinyliertem Antikörper beladenen Beads werden mittels Magnet separiert und nach Waschen in Pufferlösung mit 200 ng Alpha-Synuclein (rPeptide) bzw. 200 ng pathologischem, oligomerem Alpha-Synuclein über Nacht bei 4 °C bis 8 °C mit leichtem Schwenken der Röhrchen inkubiert. Die Beads werden mittels Magnet und Pufferlösung 6 Mal gewaschen und dann in 50 µl SDS-Probenpuffer aufgenommen (10 mM Tris pH 6,8 mit 1,6 % Glycerol, 4 % SDS und 10 % Mercaptoethanol) und für 10 min bei 99 °C gekocht. Die magnetischen Beads ohne die abgetrennten Antikörper-Antigen-Komplexe werden mittels Magnet abgetrennt und die Überstande werden auf ein Gradientengel von 4 % bis 20 % Acrylamidgel geladen und getrennt mittels SDS-PAGE. Die aufgetrennten Proteine werden auf eine 0,45 µm Nitrozellulose-Membran mittels Trans-BlotR SD semi-dry electrophoretic transfer cell (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany) übertragen. Die Nitrozellulose wird anschließend blockiert in 50 mM Tris/150 mM NaCl Puffer pH 10 mit 0,05 % Tween 20 (Waschpuffer) und 5 % Milchpulver bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Die Nitrozellulose wird dann mit 0,2 µg/ml Anti-human-Alpha-Synuclein Kaninchenserum FL140 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA) über Nacht inkubiert und der Nachweis der gebundenen Kaninchenantikörper an Alpha-Synuclein erfolgt nach Waschen mittels Anti-Kaninchen IgG Serum Peroxidase konjugiert und anschließender TMB/Peroxid-Färbung.
  • Ergebnis des Fang-Assay
  • Nachweis von gebundenem pathologischem, oligomerem Alpha-Synuclein im Vergleich zu nicht gebundenem monomerem Alpha-Synuclein an biotinylierten 5G4/F7, der an magnetische Streptavidinbeads gebunden ist. Der Nachweis erfolgte nach Separation mittels SDS-PAGE und Übertragung auf Nitrozellulose mittels Western Blot. Als Kontrolle wurde eine Isotypkontrolle eines nicht relevanten monoklonalen Antikörpers eingesetzt.
  • erbringt den Nachweis des Fangens an Antigen durch biotinylierten Antikörper 5G4/F7 (1) beladen auf magnetische Streptavidin-Beads von monomeren (a) bzw. pathologischen, oligomeren (b) Alpha-Synuclein-Präparationen nachgewiesen im Western Blot auf Nitrozellulose. Zum Nachweis von Alpha-Synuclein wurde ein spezifisches Kaninchenantiserum (FL140) verwendet. Als Isotypkontrolle wurde ein monoklonaler IgG1-Antikörper, der nicht an Alpha-Synuclein bindet, verwendet.
  • Immunhistochemische Untersuchung von Patientenproben
  • Immunhistochemischer Nachweis von pathologischem, oligomerem Alpha-Synuclein Ablagerungen in Paraffin-eingebetteten Gewebsschnitten des Mesencephalon mit Substantia nigra, Amygdala, Hippocampus und von temporalen Cortex von Individuen mit neuropathologisch bestätigten Parkinson Erkrankung und Lewy-Body-Demenz und von Striatum von Patienten mit multipler Systematrophy.
  • Beschreibung der Durchführung der immunhistochemischen Untersuchungen
  • Die Gewebsschnitte wurden evaluiert durch Austestung unterschiedlicher Behandlungen zur Epitopfreisetzung und verschiedenen Verdünnungen an 5G4/F7 Antikörper. Für vergleichende Untersuchungen wurde eine 1:1000 Verdünnung von 5G4/F7 verwendet. Als Vorbehandlung wurde eine 10 min Mikrowellen-Inkubation in Citratpuffer pH 6 gefolgt von einer Behandlung mit 80 % Ameisensäure (engl: Formic acid) Behandlung für 5 min gewählt. Die Immunfärbung wurde verglichen zwischen 5G4/F7 und verfügbaren kommerziellen Antikörpern gegen Alpha-Synuclein (gegen komplettes Alpha-Synuclein).
  • Ergebnis der immunhistochemischen Untersuchungen
  • Der Antikörper 5G4/F7 zeigt keine Hintergrundfärbung mit normalen synaptischen Strukturen (sogenannte Synapsenfärbung mit anderen Antikörpern). 5G4/F7 weist nur pathologische Strukturen nach. Die Anfärbung intrazellulärer und Neuritenstrukturen ist signifikant höher als mit anderen kommerziell erhältlichen Antikörpern. Außerdem ist 5G4/F7 in der Lage, pathologische Strukturen auch nach sehr langer Formalinfixierung des Gewebes nachzuweisen. Der Antikörper 5G4/F7 weist auch kleine Granula in synaptischen Strukturen nach (klar zu unterscheiden von feinem präsynaptischen Markierungen der physiologischen Form mit anderen Antikörpern) und auch in Astrogliazellen. Mit dem Antikörper 5G4/F7 kann granuläre Immunreaktivität nachgewiesen werden, die zu den meisten klinischen Symptomen korrespondiert (zum Beispiel im Striatum und der Substantia nigra in Patienten mit Parkinson Syndrom und im Cortex bei Patienten mit Demenz).
  • Durchgeführte immunhistochemische Untersuchungen in Hirngewebsproben von Patienten mit der Lewy-Körperchen-Krankheit zeigen den Unterschied im Ausmaß der Pathologie und den Mangel an normaler synaptischer Färbung mit 5G4/F7.
  • Literatur
    • Kohler, G.; Milstein, C. (1975). „Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature 256 (5517): 495-497
    • LITTLEFIELD JW. SELECTION OF HYBRIDS FROM MATINGS OF FIBROBLASTS IN VITRO AND THEIR PRESUMED RECOMBINANTS.Science. 1964 Aug 14;145:709-10.
    • Osman A. A., Uhlig H. H., Valdes I., Amin M., Mendez E., Mothes T. Monoclonal antibody recognizing a potential coeliac toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 2001; 13:1189-1193.
    • Kolaskar AS, Tongaonkar PC. A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens. FEBS Lett. 1990 Dec 10;276(1-2):172-4

Claims (8)

  1. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen pathologisches oligomeres Alpha-Synuclein durch Immunisierung von Mäusen oder In-vitro-Zellkulturen mit dem Peptid TKEGWHGVATVAE des Alpha-Synucleins, gekoppelt an einen Träger, zur Induktion einer adäquaten Immunantwort in Adjuvant, Entnahme der B-Lymphozyten, Fusion dieser mit der für eine nachfolgende Selektion von Fusionszellen geeigneten murinen Myelomzelllinie P3X63 Ag8.653 unter Verwendung von Polyethylenglycol 1500, nachfolgender HAT-Selektion der Fusionsprodukte in Zellkulturgefäßen, Auswahl Immunglobulin produzierender und unter Selektionsbedingungen wachsender Hybridome und aufgrund ihrer Reaktivität gegenüber dem Immunogen oder pathologischem, oligomerem Alpha-Synuclein, Vereinzeln der Hybridome auf Einzelzellebene zur Sicherstellung der Monoklonalität der Hybridomkultur, Kultivierung der Hybridome, wobei das Kultivieren der Hybridome in vitro oder in vivo monoklonale Antikörper 5G4/F7 ergibt, die das Epitop HGVA auf pathologischem, oligomerem Alpha-Synuclein erkennen.
  2. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper 5G4/F7 durch Kultivieren der Hybridomzellinie DSM ACC3099.
  3. Hybridomzellinie DSM ACC3099.
  4. Monoklonale Antikörper 5G4/F7.
  5. Verwendung monoklonaler Antikörper 5G4/F7 zum Erkennen von pathologischem, oligomerem Alpha-Synuclein.
  6. Verwendung monoklonaler Antikörper 5G4/F7 zum histologischen Nachweis von pathologischem, oligomerem Alpha-Synculein in biologischen Proben von Menschen.
  7. Testkit zum immunologischen Nachweis von pathologischem, oligomerem Alpha-Synuclein, bestehend aus I. 5G4/F7 als Fang-Antikörper, beschichtet auf einer Mikrotiterplatte, II. 10D2 als Nachweis-Antikörper (monoklonaler Antikörper, IgG1[kappa], spezifisch gegen Alpha-Synuclein, konjugiert an Meerettich-Peroxidase), III. Negative Kontrollen (Probenpuffer), IV. Positive Kontrollen (rekombinantes Alpha-Synuclein, oligomerisiert, in Probenpuffer portioniert und lyophilisiert), V. Färbe-Lösung (Kaliumcitratpuffer pH 4,0 mit 41 mM TMB-Lösung und 185 mM Peroxid-Lösung), VI. Stoplösung (0,5 M Schwefelsäure), VII. Proben-Puffer (20 mM Phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,5 mit 3 % BSA und 0,05 %Polyoxyethylen(20)-sorbitan-monolaurat), VIII. Waschpuffer (0,5 M Tris pH 7,5, 1,5 M NaCl, 0,5%Polyoxyethylen(20)-sorbitan-monolaurat), IX. Probenvorbereitungskit.
  8. Verwendung eines Testkit nach Anspruch 7 in der Humandiagnostik zur Untersuchung von Blutplasma, Blutserum, Liquor oder anderen Körperflüssigkeiten.
DE102011008153.4A 2011-01-08 2011-01-08 Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen oligomeres Alpha-Synuclein Active DE102011008153B4 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102011008153.4A DE102011008153B4 (de) 2011-01-08 2011-01-08 Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen oligomeres Alpha-Synuclein

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102011008153.4A DE102011008153B4 (de) 2011-01-08 2011-01-08 Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen oligomeres Alpha-Synuclein

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE102011008153A1 DE102011008153A1 (de) 2012-07-12
DE102011008153B4 true DE102011008153B4 (de) 2018-08-09

Family

ID=46509647

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE102011008153.4A Active DE102011008153B4 (de) 2011-01-08 2011-01-08 Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen oligomeres Alpha-Synuclein

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE102011008153B4 (de)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9534044B2 (en) 2013-02-28 2017-01-03 United Arab Emirates University Alpha-synuclein antibodies and uses thereof
GB201720970D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201720975D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Anti-alpha synuclein antibodies

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007021255A1 (en) 2005-08-09 2007-02-22 Elan Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to alpha-synuclein

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007021255A1 (en) 2005-08-09 2007-02-22 Elan Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to alpha-synuclein

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Conway et al. (Conway, Kelly A.; Harper, James D.; Lansbury, PeterT.Jr.; Fibrils formed in vitro from α-synudein and two mutant forms linked to parkinson's disease are typical amyloid.: In Biochemistry, Vol. 39, 2000, No. 10, S. 2552-2563)
Kohler, G.; Milstein, C. (1975). „Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature 256 (5517): 495-497
Kolaskar AS, Tongaonkar PC. A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens. FEBS Lett. 1990 Dec 10;276(1-2):172-4
Kolaskar et al. (Kolaskar, AS Tongaonkar, OC. FEBS Lett. 1990 Dec 10; 276 (1-2) 172-4)
Kolaskar, AS, Tongaonkar, PC. FEBS Lett. 1990 Dec 10; 276 (1-2) 172-4.
Lamberto et al. (Lamberto, G. R. et al.; PNAS, December 15, 2009, Vol. 106, No. 50, Seiten 21057-21062)
Lippa et al. (Lippa, Carol F. [et al]: α-alpha-synuclein in familial Alzheimer disease: epitope mapping parellels dementia with Lewy bodies and Parkinson disease.; In: Archives of neurology, Vol. 58, 2001, S. 1817-1820; ISSN 0003-9942)
Lippa, Carol F. [et al.]: α-synuclein in familial Alzheimer disease : epitope mapping parallels dementia with Lewy bodies and Parkinson disease. In: Archives of neurology, Vol. 58, 2001, S. 1817-1820. - ISSN 0003-9942
Nannenga et al. (Nannenga, Brent L.; Zameer, Andleeb; Sierks, Michael R.; Anti-oligomeric single chain variable domain antibody differentially affects huntingtin and α-synuclein aggregates.; In FEBS Letters, Vol. 582, 2008,No. 4, S. 517-522, ISSN 0014-5793)
NANNENGA, Brent L. ; ZAMEER, Andleeb ; SIERKS, Michael R.: Anti-oligomeric single chain variable domain antibody differentially affects huntingtin and α-synuclein aggregates. In: FEBS Letters, Vol. 582, 2008, No. 4, S. 517-522, ISSN 0014-5793
Osman A. A., Uhlig H. H., Valdes I., Amin M., Mendez E., Mothes T. Monoclonal antibody recognizing a potential coeliac toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 2001; 13:1189-1193

Also Published As

Publication number Publication date
DE102011008153A1 (de) 2012-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110249226A (zh) 评估患者样品中gfap状态的改进方法
CN106574258A (zh) 抗‑运甲状腺素蛋白人源化抗体
EP0499176B1 (de) Monoklonale Antikörper gegen humane Pankreas-Inselzellen
DE102011008153B4 (de) Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen oligomeres Alpha-Synuclein
DE3218312A1 (de) Monoklonale antikoerper, hybridoma-zellklone, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur erkennung von brustkrebs und maligner lymphogranulomatose
EP0443599B1 (de) Nachweisverfahren von tumorassoziierten Antigenen
DE69733957T2 (de) Verfahren zur bestimmung der gegenwart des gehirnspezifischen proteins s-100 beta
DE69212461T2 (de) Methode zur produktion von autoantikörpern
EP3194436A2 (de) Monoklonaler antikörper gegen humanes tau-protein
DE3851050T2 (de) Diagnostische methode für chronischen gelenkrheumatismus.
CN113603773B (zh) 靶向淀粉样蛋白的单克隆抗体7b8、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及应用
EP0133551A2 (de) Monoklonaler Antikörper, der eine Struktur erkennt die dem Human-Interleukin-2 (TCGF) und der leichten Kette "lambda" von Humanimmunglobulin gemeinsam ist, und Hybridoma-Zell-Linien, die diese monoklonalen Antikörper produzieren
US20030186335A1 (en) Monoclonal antibodies, hybridomas, cell isolation method, isolated cells and immunological diagnostic method
DE69020315T2 (de) Monoklonaler antikörper gegen c-reaktives protein.
DE3850962T2 (de) Diagnoseverfahren für leberkrebs.
EP0115062A2 (de) Monoklonale Antikörper, im direkten Agglutinationstest reagierend, spezifisch für das humane Blutgruppenantigen D (Rho) und Hybridoma-Zell-Linien, die diese monoklonalen Antikörper produzieren
DE102014000857A1 (de) Hybridom-Zelllinie (My-C-cC0C2-235-3H8) und deren Verwendung zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen das humane, herzspezifische Myosin Binding Protein C (C-protein, MYBPC3, cMyBP-C oder My-C)
JP7181523B2 (ja) 糖鎖をエピトープとして特異的に認識する新規抗体及びその用途
CN104726412A (zh) 特异结合人心型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体及其用途
JPS63258493A (ja) 抗ガングリオシドｇｍ↓１単クロ−ン性抗体、これを産生する細胞及びこれから成る試薬
EP1107993B1 (de) Humane monoklonale antikörper gegen inselzellantigen ia-2
JP2635946B2 (ja) 抗ガングリオシドＧＤ１ａ単クローン性抗体ＭＺを産生する細胞
EP2762494A2 (de) Monoklonale Antikörper gegen Scrapie-Prion-Protein (PrPSc) und Verwendung davon
DE3850325T2 (de) Monoklonalantikörper MZ gegen Ganglioside GD, MZ produzierende Zellen und MZ enthaltendes Agens.
Feldmann Development of a Novel Adult Mouse Model and in Vitro Testing of Signaling Pathway Inhibitors in Pemphigus Vulgaris

Legal Events

Date Code Title Description
R012 Request for examination validly filed

Effective date: 20121009

R016 Response to examination communication
R016 Response to examination communication
R018 Grant decision by examination section/examining division
R020 Patent grant now final
R081 Change of applicant/patentee

Owner name: ROBOSCREEN GMBH, DE

Free format text: FORMER OWNER: AJ ROBOSCREEN GMBH, 04129 LEIPZIG, DE

R082 Change of representative

Representative=s name: RECHTSANWALTSGESELLSCHAFT MBH DR. JUR. PETER N, DE

R082 Change of representative

Representative=s name: SPIRIT LEGAL RECHTSANWALTSGESELLSCHAFT MBH, DE