CN104237505A - 一种检测阿司匹林和氯吡咯雷药物双重抵抗的试剂盒 - Google Patents
一种检测阿司匹林和氯吡咯雷药物双重抵抗的试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104237505A CN104237505A CN201410473417.XA CN201410473417A CN104237505A CN 104237505 A CN104237505 A CN 104237505A CN 201410473417 A CN201410473417 A CN 201410473417A CN 104237505 A CN104237505 A CN 104237505A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- liquid
- solution
- kit
- elisa plate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 24
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 24
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 239000005552 B01AC04 - Clopidogrel Substances 0.000 title abstract description 10
- GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N clopidogrel Chemical compound C1([C@H](N2CC=3C=CSC=3CC2)C(=O)OC)=CC=CC=C1Cl GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N 0.000 title abstract description 10
- 229960003009 clopidogrel Drugs 0.000 title abstract description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title abstract description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims abstract description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 11
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 10
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 37
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims description 19
- QSMTUAJDOTXEDZ-UHFFFAOYSA-N N1C=CC=C1.[Cl] Chemical class N1C=CC=C1.[Cl] QSMTUAJDOTXEDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 14
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 12
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 10
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 10
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 8
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 8
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 8
- 229940005654 nitrite ion Drugs 0.000 claims description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 8
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 8
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 claims description 8
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000004411 aluminium Substances 0.000 claims description 6
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 6
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 5
- 238000005204 segregation Methods 0.000 claims description 5
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- -1 hatch Substances 0.000 claims description 3
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 claims 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 10
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract 1
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 abstract 1
- 239000006046 creatine Substances 0.000 abstract 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 abstract 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 abstract 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 5
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 3
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229940127218 antiplatelet drug Drugs 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 1
- 208000025870 aspirin resistance Diseases 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000002318 cardia Anatomy 0.000 description 1
- 238000013194 cardioversion Methods 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000011977 dual antiplatelet therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测阿司匹林和氯吡咯雷药物双重抵抗的试剂盒，该试剂盒包括：(1)CK-MB抗体包被的酶联板；(2)酶标记CK-MB特异性抗体：采用辣根过氧化物酶标记；(3)CK-MB标准溶液：(4)底物显色液：四甲基联苯胺；(5)终止液：盐酸缓冲液；(6)浓缩洗涤液：去离子水；(7)浓缩复溶液：0.1％-5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；该试剂盒检测样本为血清，可以长期保存，检测过程简单、快速，其准确度达到95％以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种检测阿司匹林和氯吡咯雷药物双重抵抗的试剂盒。
背景技术
阿司匹林和氯吡咯雷的联合应用，对冠心病患者，尤其是接受了皮冠脉介入术(PCI)的冠脉综合症患者，能显著防止心血管不良事件的发生，降低死亡率，因此无论是在欧美，还是国内的冠心病治疗指南中，阿司匹林和氯吡咯雷都具有举足轻重的地位。但是，随着阿司匹林和氯吡咯雷等药物使用的推广和深入，阿司匹林抵抗者常伴有氯吡咯雷抵抗，因此这类患者在经PCI术后发生血栓栓赛事件的危险增加。部分接受高危PCI患者在给予阿司匹林和氯吡咯雷双重抗血小板治疗时却具有双重抵抗，这类患者是发生血栓栓赛事件的高危人群，因而这类患者急需预先检测是否具有阿司匹林和氯吡咯雷抵抗，从而为临床规划用药作为参考，预防不良事件发生。但是目前关于阿司匹林和氯吡咯雷双重抵抗的研究还非常有限，缺乏PCI术后冠心病患者的阿司匹林和氯吡咯雷双重抵抗检测手段，也缺乏大规模随机临床研究评估抗血小板药物抵抗冠心病患者对其抗血小板药物抵抗检测方法和试剂的准确性和特异性，结果导致检测方法效果误差大，特异性低从而使得血小板抵抗功能检测很难进入临床广泛应用。
发明内容
为解决以上现有技术问题，本发明的目的是提供一种适用于检测PCI术后患者阿司匹林和氯吡咯雷药物双重抵抗的试剂盒。检测样本为血清，可以长期保存，检测过程简单、快速；通过大规模样本收集和多种手段验证试剂检测结果，其检测准确度和特异性都有很大幅度提高。
为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种检测阿司匹林和氯吡咯雷药物双重抵抗的试剂盒，包括：
(1)CK-MB抗体包被的酶联板；
(2)酶标记CK-MB特异性抗体：采用辣根过氧化物酶标记；
(3)CK-MB标准溶液：
(4)底物显色液：四甲基联苯胺；
(5)终止液：盐酸缓冲液；
(6)浓缩洗涤液：去离子水；
(7)浓缩复溶液：0.1％-5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
所述的终止液优选为3％的盐酸缓冲液；
所述的浓缩复溶液优选为1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；
所述的CK-MB抗体为单克隆抗体，该单克隆抗体的制备方法包括：
(1)采用6～8周龄Balb/c小鼠作为免疫动物，CK-MB纯化蛋白免疫原免疫剂量为50～80μg/只，首次免疫时将免疫原于等量的弗氏佐剂混合乳化，颈背部皮下多点注射，间隔2～3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次。免疫完成7天后取脾细胞；
(2)细胞融合与克隆：将脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按照5：1混合，采用HAT培养基筛选杂交瘤细胞，然后将阳性细胞扩大培养，产生分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片；
(3)抗体在37℃下做冻干处理，放入-20℃冷藏；
所述的CK-MB抗体包被的酶联板的制作方法包括：
(1)用包被缓冲液将CK-MB抗体稀释为0.01～0.05μg/ml浓度的抗体稀释液；
(2)向酶联板中加入抗体稀释液，孵育，倾去包被液，用洗涤液洗涤，拍干；
(3)向酶联板的每孔中加入封闭液，孵育，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存；
所述包被缓冲液为pH8.5-10的碳酸盐缓冲液，优选为pH9碳酸盐缓冲液；所述洗涤液为含有2-6％的吐温-20的去离子水，优选为5％的吐温-20的去离子水；所述封闭液为含有5％-15％的脱脂奶和0.1％-2.5％的人血清白蛋白溶液，优选为10％的脱脂奶和1％的人血清白蛋白溶液。
本发明与现有技术相比，其详细说明如下：
本发明针对的检测对象为PCI术后合用阿司匹林和氯吡格雷的患者血清样品，一般PCI术后病人在服药1个礼拜后检测。
目前指南规定使用抗血小板方案是：对于目前广泛使用的药物支架(70％的为药物洗脱支架)的患者，放支架后，联合服用阿司匹林和氯吡格雷至少一年。美国休斯敦MethodistDeBakey心脏中心研究结果显示阿司匹林和氯吡格雷双重抵抗为26.9％，双重抵抗的机制是血小板反应性全面增加，提示这类接受高危PCI的患者在联合服用阿司匹林和氯吡格雷治疗是，可能提高发生血栓栓赛事件概率。因此对于这一类人群检测是否具有双重抵抗可以指导药物使用剂量和用药方案，预防血栓事件发生。然而目前国内并没有针对阿司匹林和氯吡格雷双重抵抗的一次性检测方法，而本发明填补了这一空白，提供一种检测PCI术后患者阿司匹林和氯吡咯雷药物双重抵抗的试剂盒，血清样本可长时间保存，检测过程简单、快速，通过大规模样本收集和多种手段验证试剂检测结果，其检测准确度和特异性都有很大幅度提高。
本发明人通过研究发现利用离子交换柱层析法当CK-MB超过CK总活性的3，或者通过免疫抑制法当CK-MB超过CK总活性的10时，可以判断出该患者会出现急性心肌梗塞的几率会加大，故可将其作为急性心肌梗塞的诊断依据。且各种类型的心脏手术后可引起血清CK-MB活性增强，在并发术间或术后心肌梗塞时升高更为显著，发明人也通过多次研究发现具有阿司匹林和氯吡格雷双重抵抗的患者血清中发现CK-MB较高水平表达，也提示了CK-MB的升高与双重抵抗之间有必然的联系。
通过上面的研究发现，本发明的试剂盒利用抗原抗体反应测定样品中CK-MB水平，用纯化的人CK-MB抗体包被酶联板，制成固相抗体，再往包被单抗的微孔中依次加入含有CK-MB的血清，HRP标记的CK-MB抗体，形成抗体-抗原-酶标记抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物四甲基联苯胺显色，四甲基联苯胺在HRP酶的催化作用下转化为蓝色，在酸的作用下呈黄色。颜色的深浅与样品中CK-MB含量成正比。在酶标仪450nm波长下测定吸光值，通过标准曲线计算样品CK-MB含量，若血清CK-MB水平在40～45ng/ml之间，表示阿司匹林和氯吡格雷双重抵抗；≦30ng/ml表示无抵抗；在30～40ng/ml表示可能出现双重抵抗。
本说明书和权利要求书所使用的缩写及英文的含义如下所示：
CK-MB：肌酸激酶
HRP：辣根过氧化物酶
本发明试剂盒的具体使用方式如下：
1.获取待检样本及样本处理：
A.常规方法配制抗凝剂，3.8％枸橼酸钠，全血(v)：抗凝剂(v)＝9：1；
B.全血混匀，4℃，2000×g离心5min，吸取上层2/3体积血清，放置于-20℃保存。
2.用本发明的试剂盒进行检测的步骤：
A.将试剂盒从冷藏箱中取出，室温平衡15min，每种液体使用前摇匀。标准液做2个平行试验。
B.将酶标记CK-MB特异性抗体与浓缩复溶液混合：体积比为10：1混合均匀；
C.加50μl CK-MB标准溶液或待检样品于对应微孔中，再加50μl上述混合液，盖上酶标板盖，室温避光反应1h；
D.打开酶标板盖，将孔内液体甩干，并在吸水纸上拍干酶标板孔底水分；加洗涤液200μl/孔，每次浸泡30s，充分洗涤5次，用吸水纸拍干；
E.每孔各加入底物显色液50μl，再各加入酶标记CK‐MB特异性抗体50μl，摇床振荡30s混匀，室温避光显色15min；
F.每孔加入50μl终止液，在酶标仪450nm处检测OD值，5min内读取吸光度值数据；
G.检测结果分析：
所测得标准溶液或样本吸光度值的平均值(M)减去空白试验吸光度值(M0)为实际吸光度值。
吸光度值(OD)＝M-M0
M＝标准溶液或样本吸光度值的平均值(M)
M0＝0μg/L空白试验吸光度值
以标准品百分吸光率为纵坐标，以标准品浓度(μg/L)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的吸光度值(OD)代入标准曲线中，即读出样本对应浓度，再乘以稀释倍数即为样本中CK-MB实际浓度。
现对现有技术存在的阿司匹林或氯吡格雷抵抗是检测方法进行比较
附图说明
图1为标准品百分吸光率为纵坐标，以标准品浓度(μg/L)的半对数为横坐标的标准曲线图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1试剂盒的制备，组分：
(1)CK-MB抗体包被的酶联板；
(2)酶标记CK-MB特异性抗体：采用辣根过氧化物酶标记；
(3)CK-MB标准溶液：0.75μg/L，10ml/瓶；
(4)底物显色液：四甲基联苯胺；8ml/瓶；
(5)终止液：3％盐酸缓冲液；10ml/瓶，1瓶；
(6)浓缩洗涤液：去离子水；100ml/瓶；
(7)浓缩复溶液：含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，10ml/瓶，1瓶。
其中：抗CK-MB抗体包被的酶联板的制备：
(1)用0.5mol/L pH8.5的碳酸盐缓冲液将抗CK-MB抗体以0.01μg/ml浓度稀释成抗体稀释液；
(2)向酶联板中加入100μl抗体稀释液，37℃孵育2h，倾去包被液，用2％吐温-20的去离子水洗涤5次，每次15s，拍干；
(4)向酶联板的每孔中加入200μl含有5％的脱脂奶和0.1％的人血清白蛋白溶液的封闭液，37℃孵育1h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
单克隆抗体的制备：
(1)采用6～8周龄Balb/c小鼠作为免疫动物，CK-MB纯化蛋白免疫原免疫剂量为50～80μg/只，首次免疫时将免疫原于等量的弗氏佐剂混合乳化，颈背部皮下多点注射，间隔2～3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次。免疫完成7天后取脾细胞；(2)细胞融合与克隆：将脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按照5：1混合，采用HAT培养基筛选杂交瘤细胞，然后将阳性细胞扩大培养，产生分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片；
(3)抗体在37℃下做冻干处理，放入-20℃冷藏；
实施例2
实施例1试剂盒的制备，组分：
(1)CK-MB抗体包被的酶联板；
(2)酶标记CK-MB特异性抗体：采用辣根过氧化物酶标记；
(3)CK-MB标准溶液：4.5μg/L，10ml/瓶；
(4)底物显色液：四甲基联苯胺；8ml/瓶；
(5)终止液：3％盐酸缓冲液；10ml/瓶，1瓶；
(6)浓缩洗涤液：去离子水；100ml/瓶；
(7)浓缩复溶液：含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，10ml/瓶，1瓶。
其中：抗CK-MB抗体包被的酶联板的制备：
(1)用0.5mol/L pH9.0的碳酸盐缓冲液将抗CK-MB抗体以0.03μg/ml浓度稀释成抗体稀释液；
(2)向酶联板中加入100μl抗体稀释液，37℃孵育2h，倾去包被液，用4％吐温-20的去离子水洗涤5次，每次15s，拍干；
(4)向酶联板的每孔中加入200μl含有12％的脱脂奶和1.5％的人血清白蛋白溶液的封闭液，37℃孵育1h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
单克隆抗体的制备：
(1)采用6～8周龄Balb/c小鼠作为免疫动物，CK-MB纯化蛋白免疫原免疫剂量为50～80μg/只，首次免疫时将免疫原于等量的弗氏佐剂混合乳化，颈背部皮下多点注射，间隔2～3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次。免疫完成7天后取脾细胞；(2)细胞融合与克隆：将脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按照5：1混合，采用HAT培养基筛选杂交瘤细胞，然后将阳性细胞扩大培养，产生分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片；
(3)抗体在37℃下做冻干处理，放入-20℃冷藏；
实施例3试剂盒的制备，组分：
(1)CK-MB抗体包被的酶联板；
(2)酶标记CK-MB特异性抗体：采用辣根过氧化物酶标记；
(3)CK-MB标准溶液：7.0μg/L，10ml/瓶；
(4)底物显色液：四甲基联苯胺；8ml/瓶；
(5)终止液：3％盐酸缓冲液；10ml/瓶，1瓶；
(6)浓缩洗涤液：去离子水；100ml/瓶；
(7)浓缩复溶液：含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，10ml/瓶，1瓶。
其中：抗CK-MB抗体包被的酶联板的制备：
(1)用0.5mol/L的pH10的碳酸盐缓冲液将抗CK-MB抗体以0.05μg/ml浓度稀释成抗体稀释液；
(2)向酶联板中加入100μl抗体稀释液，37℃孵育2h，倾去包被液，用6％吐温-20的去离子水洗涤5次，每次15s，拍干；
(4)向酶联板的每孔中加入200μl含有15％的脱脂奶和2.5％的人血清白蛋白溶液的封闭液，37℃孵育1h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
单克隆抗体的制备同实施例1所述的方法。
实施例4
通过收集杭州各大医院术后冠心病患者为实验对象，根据检测样品对象将实验对象分为双重抵抗血样组、未抵抗血样组和健康样品组。
双重抵抗血样组：83例
未抵抗血样组：96例
健康样品：100例
1.获取待检样本及样本处理：
A.常规方法配制抗凝剂，3.8％枸橼酸钠，全血(v)：抗凝剂(v)＝9：1；
B.全血混匀，4℃，2000×g离心5min，吸取上层2/3体积血清，放置于-20℃保存。
2.用本发明的试剂盒进行检测的步骤：
A.将试剂盒从冷藏箱中取出，室温平衡15min，每种液体使用前摇匀。标准液做2个平行试验。
B.将酶标记CK-MB特异性抗体与浓缩复溶液混合：体积比为10：1混合均匀；
C.加50μl标准品或样品于对应微孔中，再加50μl上述混合液，盖上酶标板盖，室温避光反应1h；
D.打开酶标板盖，将孔内液体甩干，并在吸水纸上拍干酶标板孔底水分；加洗涤液200μl/孔，每次浸泡30s，充分洗涤5次，用吸水纸拍干；
E.每孔各加入底物显色液50μl，再各加入酶标记CK-MB特异性抗体50μl，摇床振荡30s混匀，室温避光显色15min，
F.每孔加入50μl终止液，在酶标仪450nm处检测OD值，5min内读取数据；
G.检测结果分析：
所测得标准溶液或样本吸光度值的平均值(M)减去空白试验吸光度值(M0)为实际吸光度值。
吸光度值(OD)＝M-M0
M＝标准溶液或样本吸光度值的平均值(M)
M0＝0μg/L空白试验吸光度值
以标准品百分吸光率为纵坐标，以标准品浓度(μg/L)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的吸光度值(OD)代入标准曲线中，即读出样本对应浓度，再乘以稀释倍数即为样本中CK-MB实际浓度。
所得结果下表所示。
表CK-MB检测有效率
Claims (6)
1.一种检测阿司匹林和氯吡咯雷药物双重抵抗的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括：
（1）CK-MB抗体包被的酶联板；
（2）酶标记CK-MB特异性抗体：采用辣根过氧化物酶标记；
（3）CK-MB标准溶液：
（4）底物显色液：四甲基联苯胺；
（5）终止液：盐酸缓冲液；
（6）浓缩洗涤液：去离子水；
（7）浓缩复溶液：0.1%-5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述CK-MB抗体为单克隆抗体。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的单克隆抗体的制备方法包括：
（1）采用6~8周龄Balb/c小鼠作为免疫动物，CK-MB纯化蛋白免疫原免疫剂量为50~80μg/只，首次免疫时将免疫原于等量的弗氏佐剂混合乳化，颈背部皮下多点注射，间隔2~3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，免疫完成7天后取脾细胞；
（2）细胞融合与克隆：将脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按照5：1混合，采用HAT培养基筛选杂交瘤细胞，然后将阳性细胞扩大培养，产生分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片；
（3）抗体在37oC下做冻干处理，放入-20oC冷藏；
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的CK-MB抗体包被的酶联板的制作方法包括：
（1）用包被缓冲液将CK-MB抗体稀释为0.01~0.05μg/ml浓度的抗体稀释液；
（2）向酶联板中加入抗体稀释液，孵育，倾去包被液，用洗涤液洗涤，拍干；
（3）向酶联板的每孔中加入封闭液，孵育，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存；
所述包被缓冲液为pH8.5-10的碳酸盐缓冲液；所述洗涤液为含有2-6%的吐温-20的去离子水；所述封闭液为含有5%-15%的脱脂奶和0.1%-2.5%的人血清白蛋白溶液。
4. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的终止液为3%盐酸缓冲液；
6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的浓缩复溶液为1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗CK-MB抗体包被的酶联板的制作方法中所述的包被缓冲液为pH9的碳酸盐缓冲液；所述的洗涤液为含有5%的吐温-20的去离子水；所述的封闭液为含有10%的脱脂奶和1%的人血清白蛋白溶液。
6. 一种检测阿司匹林和氯吡咯雷药物抵抗的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括：
（1）CK-MB抗体包被的酶联板；
（2）酶标记CK-MB特异性抗体：采用辣根过氧化物酶标记；
（3）CK-MB标准溶液：
（4）底物显色液：四甲基联苯胺；
（5）终止液：3%盐酸缓冲液；
（6）浓缩洗涤液：去离子水；
（7）浓缩复溶液：1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；
所述CK-MB抗体为单克隆抗体；所述的单克隆抗体的制备方法包括：
（1）采用6~8周龄Balb/c小鼠作为免疫动物， CK-MB纯化蛋白免疫原免疫剂量为50~80μg/只，首次免疫时将免疫原于等量的弗氏佐剂混合乳化，颈背部皮下多点注射，间隔2~3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，免疫完成7天后取脾细胞；
（2）细胞融合与克隆：将脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按照5：1混合，采用HAT培养基筛选杂交瘤细胞，然后将阳性细胞扩大培养，产生分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片；
（3）抗体在37oC下做冻干处理，放入-20oC冷藏；
所述的CK-MB抗体包被的酶联板的制作方法包括：
（1）用包被缓冲液将抗CK-MB抗体稀释为0.01~0.05μg/ml浓度的抗体稀释液；
（2）向酶联板中加入抗体稀释液，孵育，倾去包被液，用洗涤液洗涤，拍干；
（3）向酶联板的每孔中加入封闭液，孵育，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存；
所述包被缓冲液为pH9的碳酸盐缓冲液；所述洗涤液为含有5%的吐温-20的去离子水；所述封闭液为含有10%的脱脂奶和1%的人血清白蛋白溶液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410473417.XA CN104237505B (zh) | 2014-09-17 | 2014-09-17 | 一种检测阿司匹林和氯吡咯雷药物双重抵抗的试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410473417.XA CN104237505B (zh) | 2014-09-17 | 2014-09-17 | 一种检测阿司匹林和氯吡咯雷药物双重抵抗的试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104237505A true CN104237505A (zh) | 2014-12-24 |
| CN104237505B CN104237505B (zh) | 2016-05-04 |
Family
ID=52225995
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410473417.XA Active CN104237505B (zh) | 2014-09-17 | 2014-09-17 | 一种检测阿司匹林和氯吡咯雷药物双重抵抗的试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104237505B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018001259A1 (zh) * | 2016-06-29 | 2018-01-04 | 南京市第一医院 | ABCC3-013 mRNA在制备检测氯吡格雷抵抗的试剂盒中的应用及其试剂盒 |
| CN109374897A (zh) * | 2018-11-22 | 2019-02-22 | 大连大学 | 一种用于肝癌检测的试剂盒 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1368888A (zh) * | 2000-02-08 | 2002-09-11 | 金晓骏 | 用于心脏病的抗人线粒体腺苷酸激酶同工酶抗体,诊断制剂和诊断试剂盒 |
| CN101762704A (zh) * | 2008-12-26 | 2010-06-30 | 上海裕隆生物科技有限公司 | 一种单克隆抗体制备方法及其应用 |
| CN102154216A (zh) * | 2010-12-31 | 2011-08-17 | 北京利德曼生化股份有限公司研发中心 | 抗ckm单克隆抗体与产生其的杂交瘤细胞株以及其的应用 |
| CN102746382A (zh) * | 2012-07-27 | 2012-10-24 | 重庆业为基生物科技有限公司 | 心脏型脂肪酸结合蛋白b细胞表位肽及其抗体和应用 |
| CN102809651A (zh) * | 2012-07-26 | 2012-12-05 | 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 | 肌酸磷酸激酶同工酶化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 |
-
2014
- 2014-09-17 CN CN201410473417.XA patent/CN104237505B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1368888A (zh) * | 2000-02-08 | 2002-09-11 | 金晓骏 | 用于心脏病的抗人线粒体腺苷酸激酶同工酶抗体,诊断制剂和诊断试剂盒 |
| CN101762704A (zh) * | 2008-12-26 | 2010-06-30 | 上海裕隆生物科技有限公司 | 一种单克隆抗体制备方法及其应用 |
| CN102154216A (zh) * | 2010-12-31 | 2011-08-17 | 北京利德曼生化股份有限公司研发中心 | 抗ckm单克隆抗体与产生其的杂交瘤细胞株以及其的应用 |
| CN102809651A (zh) * | 2012-07-26 | 2012-12-05 | 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 | 肌酸磷酸激酶同工酶化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 |
| CN102746382A (zh) * | 2012-07-27 | 2012-10-24 | 重庆业为基生物科技有限公司 | 心脏型脂肪酸结合蛋白b细胞表位肽及其抗体和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 皓尘生物网: "人肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）ELISA试剂盒", 《HTTP://WWW.HAOCHENGBIO.COM/HAOCHEN20132013-DOWN-1224371/》, 19 December 2013 (2013-12-19) * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018001259A1 (zh) * | 2016-06-29 | 2018-01-04 | 南京市第一医院 | ABCC3-013 mRNA在制备检测氯吡格雷抵抗的试剂盒中的应用及其试剂盒 |
| CN109374897A (zh) * | 2018-11-22 | 2019-02-22 | 大连大学 | 一种用于肝癌检测的试剂盒 |
| CN109374897B (zh) * | 2018-11-22 | 2021-11-02 | 大连大学 | 一种用于肝癌检测的试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104237505B (zh) | 2016-05-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103901201B (zh) | 头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条及其制备 | |
| CN104849464B (zh) | 一种检测阿司匹林疗效的试剂盒及其检测方法 | |
| CN1811436B (zh) | 一种检测恩诺沙星的方法及其专用酶联免疫试剂盒 | |
| EP3216460B1 (en) | Antigen polypeptide for detecting plasma immunological marker-vegfr1 autoantibody and use thereof | |
| CN101403752A (zh) | 一种加替沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒 | |
| Katayama et al. | Hepatitis B virus infection in hemodialysis patients in Japan: Prevalence, incidence and occult hepatitis B virus infection | |
| CN105277708A (zh) | 检测辣椒中黄曲霉毒素b1的酶联免疫试剂盒 | |
| CN101013131B (zh) | 呋喃妥因代谢物酶联免疫分析试剂盒及其应用 | |
| CN103288872A (zh) | 甲基对硫磷半抗原及其制备方法和应用 | |
| CN104237505A (zh) | 一种检测阿司匹林和氯吡咯雷药物双重抵抗的试剂盒 | |
| CN101538266A (zh) | 罗格列酮半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用 | |
| CN101981452B (zh) | 肺炎球菌检测方法 | |
| EP3092497A1 (en) | Lateral flow immunoassays for the detection of antibodies against biological drugs | |
| Builder et al. | Equilibrium ligand binding assays using labeled substrates: nature of the errors introduced by radiochemical impurities | |
| CN102766212A (zh) | 用于检测氟喹诺酮类药物残留的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒 | |
| Lam et al. | KRAS mutation‐independent downregulation of MAPK/PI3K signaling in colorectal cancer | |
| CN107677807A (zh) | 一种吉他霉素磁免疫化学发光检测试剂盒 | |
| CN105399639A (zh) | 一种酪胺人工抗原和抗体及其制备方法与应用 | |
| CN104109112A (zh) | 赛庚啶半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用 | |
| CN106771273B (zh) | 一种检测福莫特罗胶体金免疫层析试纸条及制备方法与应用 | |
| CN106153954A (zh) | 一种苯妥英钠的快速检测方法 | |
| CN105353095A (zh) | 一种西地那非及其结构类似物的免疫检测方法 | |
| CN105628923B (zh) | 一种半定量免疫胶体金试纸条及其应用 | |
| CN109459565B (zh) | 人血清C4BP-a蛋白作为预测氯吡格雷抵抗的生物标志物及其临床应用 | |
| CN104130978B (zh) | 一种杂交瘤细胞株11a2及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210422 Address after: Room 402, building 3, 1500 Wenyi West Road, Cangqian street, Yuhang District, Hangzhou City, Zhejiang Province Patentee after: HANGZHOU S-EVANS BIOSCIENCES, Ltd. Address before: 310058 Yuhang, Zhejiang, Tong Road, No. 866, No. Patentee before: HANGZHOU THOMAS BIOTECHNOLOGY Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A reagent kit for detecting dual resistance to aspirin and clopidogrel drugs Granted publication date: 20160504 Pledgee: Zhejiang Hangzhou Yuhang Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Science and Technology City Branch Pledgor: HANGZHOU S-EVANS BIOSCIENCES, Ltd. Registration number: Y2024980003656 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |