KR20070089930A

KR20070089930A - 내인성 화합물을 향상시키는 리간드

Info

Publication number: KR20070089930A
Application number: KR1020077012946A
Authority: KR
Inventors: 이안 엠. 톰린손
Original assignee: 도만티스 리미티드
Priority date: 2004-11-10
Filing date: 2005-11-10
Publication date: 2007-09-04
Also published as: CN101098712A; EP2420251A3; EP1814584A2; BRPI0517569A; AU2005303584A1; JP2008519813A; RU2007117196A; KR20070084069A; WO2006051288A3; WO2006051288A2; NO20072475L; CN101724071A; MA29221B1; CA2587206A1; MA29427B1; RU2401842C2; RU2007112509A; NO20071788L; EP2420251A2

Abstract

본 발명은 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니지만, 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 부분 (예를들어, dAb)을 포함하는 리간드에 관한 것이다. 바람직하게는, 리간드는 내인성 표적 화합물의 활성 부위에 결합하지 않는다. 본 발명은 상기 란드에 결합하는 내인성 표적 화합물의 반감기, 생체이용률, 활성 또는 양을 증가시키기 위한 약제의 제조에 있어서 상기 리간드의 용도에 관한 것이다.

Description

내인성 화합물을 향상시키는 리간드{LIGANDS THAT ENHANCE ENDOGENOUS COMPOUNDS}

발명의 배경

포유동물을 포함하는 동물 및 인간은 동물의 정상적 건강 및 생리 기능을 유지시키는 것을 돕는 활성을 지니는 다양한 내인성 화합물을 생성한다. 이러한 화합물은 다양한 생리학적 과정, 예를들어 지혈, 면역 기능, 물질대사, 세포 증식의 조절 및 분화 등과 관련된다. 다수의 내인성 화합물이 분리되었고, 합성 또는 재조합 형태가 제조되어 질병을 치료하기 위해 환자에게 투여될 수 있다. 현재의 치료 방법은 종종 외인성 또는 외인적으로 생성된 형태의 내인성 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 이러한 치료 방법은 일반적으로 투여되는 높은 용량으로 인해 바람직하지 않은 효과를 생성할 수 있고, 특정 치료제, 예를들어 인간 단백질의 재조합 형태는 일반적으로 고비용인 포유동물 세포에서의 발현에 의해 생성되어야 하며, 이는 박테리아 또는 효모 시스템에서의 발현보다 낮은 수율로 생성된다.

이러한 문제점은 치료 효과를 생성하기 위한 내인성 화합물의 이로운 활성을 이용하고 활용할 수 있는 치료제 및 방법의 개발에 의해 극복될 수 있다. 이러한 치료제 및 방법이 요구된다.

발명의 개요

본 발명은 약제의 제조를 위한 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 용도에 관한 것으로서, 상기 리간드는 상기 내인성 표적 화합물에 결합하지만, 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는다. 바람직하게는, 리간드는 내인성 표적 화합물의 활성 부위에 결합하지 않는다.

약제는 피검체의 내인성 표적 화합물의 양을 증가시키고, 피검체의 내인성 표적 화합물의 생체이용률을 증가시키고, 내인성 표적 화합물의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다. 약제는 또한 내인성 표적 화합물의 활성 (예를들어, 결합 활성)을 증가시킬 수 있다. 약제는 국소 또는 전신 전달될 수 있다.

몇몇 구체예에서, 약제의 투여후 약 4시간 후의 피검체의 내인성 표적 화합물의 양은 약제의 투여 전의 양에 비해 1.5배 이상으로 증가된다. 몇몇 구체예에서, 내인성 표적 화합물의 생체내 반감기는 약제의 투여후 1.5배 이상으로 증가된다.

일반적으로, 리간드는 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 약 10% 이하로 억제하거나, 1 마이크로몰 이상의 억제 농도 50(IC50)을 지닌다.

리간드는 내인성 표적에 대한 결합 부위를 지니는 상기 부분의 2개 이상의 카피를 포함할 수 있다. 예를들어, 리간드는 내인성 표적에 대한 결합 부위를 지니는 부분의 이합체, 예를들어 dAb 이합체일 수 있다.

내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분은 어피바디(affibody), SpA 도메인, LDL 수용체 부류 A 도메인, EGF 도메인, 아비머(avimer), 항체 또는 항체 단편 (예를들어, Fv 단편, 단일 사슬 Fv 단편, 이황화 결합된 Fv 단편, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, 디아바디(diabody) 및 면역글로불린 단일 가변 도메인 (예를들어, 인간 V_H, 및 인간 V_L, V_HH)일 수 있다.

요망시, 리간드는 본원에 기술된 반감기 연장 부분을 추가로 포함할 수 있다. 예를들어, 리간드는 폴리알킬렌 글리콜 부분, 혈청 알부민 또는 이의 단편, 트랜스페린 수용체 또는 이의 트랜스페린 결합 부분, 또는 생체내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함하는 부분으로 구성된 군으로부터 선택된 반감기 연장 부분을 포함할 수 있다. 생체내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함하는 적절한 부분은 어피바디, SpA 도메인, LDL 수용체 부류 A 도메인, EGF 도메인, 아비머, 항체 또는 항체 단편, 예를들어 Fv 단편, 단일 사슬 Fv 단편, 이황화 결합된 Fv 단편, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, 디아바디, 및 면역글로불린 단일 가변 도메인 (예를들어, 인간 V_H, 인간 V_L, V_HH)을 포함한다.

본 발명의 약제 및 리간드는 실질적으로 비-면역원성이다. 몇몇 구체예에서, 약제는 데포(depot) 제형이다. 몇몇 구체예에서, 내인성 표적 화합물은 가용성 효능제 (예를들어, 사이토카인, 성장 인자, 호르몬), 가용성 수용체 (예를들어, 가용성 사이토카인 수용체, 예를들어 가용성 TNFR1, 가용성 TNFR2, 가용성 IL-1 수용체, 가용성 IL-4 수용체, 가용성 IL-13 수용체), 내인성 수용체 길항제 (예를들어, IL-1 수용체 길항제 (IL-1ra)) 또는 효소이다. 특정 구체예에서, 내인성 표적 화합물은 가용성 사이토카인 수용체, 예를들어 가용성 TNFR1이다. 바람직하게는, 리간드는 높은 친화성, 예를들어 1 x 10^-7M 이하의 Kd로 내인성 표적 화합물에 결합한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 약제 또는 리간드는 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0144484에 기술된 항체, 이의 단편 또는 영역을 포함하지 않는다.

특정 구체예에서, 본 발명의 약제 또는 리간드는 인간 TNF-알파에 대한 항체 A2 또는 키메라 항체 A2 (cA2)의 결합을 억제하지 않는다. 특정 구체예에서, 본 발명의 약제 또는 리간드는 인간 TNF (종양 괴사 인자)의 아미노산 87-108에 포함되는 에피토프 또는 아미노산 59-80 및 87-108 둘 모두에 포함되는 에피토프에 결합하지 않는다. 이들 아미노산은 하기와 같다:

59-80: Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-Thr-His-Thr-Ile (SEQ ID NO:26); 및

87-108: Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-Ile-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg- Glu-Thr-Pro-Glu-Gly (SEQ ID NO:27).

본 발명은 또한 내인성 표적의 활성을 증가시키기 위한 약제의 제조에 있어서 상기 내인성 표적 화합물의 용도에 관한 것으로, 상기 리간드는 상기 내인성 표적에 결합하지만, 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는다. 바람직하게는, 리간드는 상기 내인성 표적 화합물의 활성 부위에 결합하지 않는다. 몇몇 구체예에서, 내인성 표적 리간드의 결합 활성이 증가되고, 예를들어 결합 활성 (예를들어, 친화성, 결합성)은 10배 이상으로 증가될 수 있다.

본 발명은 또한 내인성 표적 화합물을 이용하여 치료가능한 질병의 요법에 사용하기 위한, 피검체의 질병을 치료하기에 적합한 활성을 지니는 상기 내인성 표적 화합물에 결합하는 리간드에 관한 것으로, 상기 리간드는 상기 내인성 표적 화합물의 활성 부위에 결합하지 않거나, 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는다.

본 발명은 또한 피검체의 질병을 치료하기에 적합한 활성을 지니는 내인성 표적 화합물에 결합하는 리간드 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물에 관한 것으로, 상기 리간드는 상기 내인성 표적 화합물의 결합 부위에 결합하지 않거나, 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는다.

본 발명은 또한 본 발명의 약제 조성물을 포함하는 약물 전달 장치에 관한 것이다. 몇몇 구체예에서, 약물 전달 장치는 비경구 전달 장치, 정맥내 전달 장치, 근내 전달 장치, 복막내 전달 장치, 경피 전달 장치, 폐 전달 장치, 동맥내 전달 장치, 수막강내 전달 장치, 관절내 전달 장치, 피하 전달 장치, 비내 전달 장치, 질내 전달 장치, 및 직장 전달 장치이다. 예를들어, 약물 전달 장치는 주사기, 경피 전달 장치, 캡슐, 정제, 분무기, 흡입기, 아토마이저(atomizer), 연무기, 미스터(mister), 건조 분말 흡입기, 정량식 흡입기, 정량식 스프레이어, 정량식 미스터, 정량식 아토마이저 및 카테터일 수 있다.

본 발명은 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 유효량을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 피검체의 상기 내인성 표적 화합물의 반감기를 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 유효량을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 피검체의 상기 내인성 표적 화합물의 양을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 유효량을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 피검체의 상기 내인성 표적 화합물의 생체이용률을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 유효량을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 피검체의 상기 내인성 표적 화합물의 활성 (예를들어, 결합 활성)을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 유효량을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 피검체의 상기 내인성 표적 화합물을 이용하여 치료가능한 질병을 지닌 피검체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에 기술된 신규한 리간드 (예를들어, dAb)에 관한 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 TNFR1 (TAR2m-21-23/40K 분지된 PEG; PEG 항-TNFR1 dAb로도 언급됨)에 결합하는 페길화된 dAb 단량체의 단일 정맥내 투여 후의 시간의 경과에 따른 혈청 내에서 ELISA에 의해 검출된 가용성 TNFR1의 상대 농도 (농도 시간 곡선)의 그래프이다. 작도된 데이터 포인트는 혈청의 1:5 희석액을 이용하여 ELISA에 의해 수득되었다. 그래프는 전신 순환의 TNFR1의 생체이용률이 TNFR1에 결합하는 페길화된 dAb 단량체의 투여에 의해 증가되었음을 명백히 나타낸다. 농도 시간 곡선에 의해 나타나는 바와 같이, 혈청 내의 가용성 TNFR1의 수준은 페길화된 dAb 단량체가 투여된 후 증가하였고, 최고 농도에 도달한 후, 시간이 경과하면서 페길화된 dAb가 제거됨에 따라 기저 수준으로 감소하였다. 상기 결과는 가용성 수용체에 결합하는 dAb의 투여가 수용체의 생체이용률을 증가시키고, 전신 순환의 가용성 수용체의 수준 또는 양을 증가시킬 수 있으며, 전신 순환의 가용성 수용체의 증가된 수준 또는 양이 제거되어 기저 수준으로 회귀한다는 것을 입증한다. 상기 결과는 전신 순환의 가용성 수용체의 수준이 가용성 수용체에 결합하는 페길화된 dAb 단량체를 투여함으로써 조절될 수 있다는 것을 나타낸다.

발명의 상세한 설명

본 명세서 내에서, 구체예는 명세서가 명백하고 간결하게 작성가능하게 하는 방식으로 기술되었으나, 상기 구체예는 본 발명에 벗어남이 없이 다양하게 조합되거나 분리될 수 있고, 이러한 사실이 인식될 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "리간드"는 요망되는 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 하나 이상의 단백질, 폴리펩티드 또는 단백질 부분을 포함하는 화합물에 관한 것이다. 예를들어, 요망되는 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분은 요망되는 내인성 표적 화합물 (예를들어, 가용성 수용체 단백질, 내인성 수용체 길항제, 사이토카인 또는 성장 인자)에 대한 결합 특이성을 면역글로불린 단일 가변 도메인 (예를들어, V_H, V_L, V_HH)일 수 있다. 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분은 또한 상기 부분이 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니도록 하는, 적절한 포맷의 요망되는 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 면역글로불린 단일 가변 도메인중 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함할 수 있다. 예를들어, CDR은 적절한 단백질 스캐폴드 또는 골격, 예를들어 어피바디, SpA 스캐폴드, LDL 수용체 부류 A 도메인, 또는 EGF 도메인으로 이식될 수 있다. 추가로, 리간드는 본원에 기술된 바와 같이 1가 (예를들어, dAb 단량체), 2가 (동종2가, 이종2가) 또는 다가 (동종다가, 이종다가)일 수 있다. 따라서, "리간드"는 본원에 기술된 바와 같이 dAb로 구성되는 폴리펩티드를 포함하고, dAb를 필수 성분으로 포함하는 폴리펩티드, 적절한 포맷, 예를들어 항체 포맷 (예를들어, IgG-유사 포맷, scFv, Fab, Fab', F(ab')₂)의 dAb (또는 dAb의 CDR), 또는 적절한 단백질 스캐폴드 또는 골격, 예를들어 어피바디, SpA 스캐폴드, LDL 수용체 부류 A 도메인 또는 EGF 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 제 1 내인성 표적 화합물에 결합하는 dAb 및 또 다른 내인성 표적 화합물 (예를들어, 혈청 알부민)에 결합하는 제 2 dAb를 포함하는 이중특이적 리간드, 및 다중특이적 리간드를 포함한다. 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분은 또한 요망되는 표적에 대한 결합 부위를 포함하는 단백질 도메인, 예를들어 어피바디, SpA 도메인, LDL 수용체 부류 A 도메인, EGF 도메인 및 아비머 (참조: U.S. Patent Application Publication Nos. 2005/0053973, 2005/0089932, 2005/0164301)로부터 선택된 단백질 도메인일 수 있다. 요망시, "리간드"는 서로 독립적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 부분 또는 비-펩티드 부분 (예를들어, 폴리알킬렌 글리콜, 지질, 탄수화물)일 수 있는 하나 이상의 추가 부분을 추가로 포함할 수 있다. 예를들어, 리간드는 본원에 기술된 반감기 연장 부분 (예를들어, 폴리알킬렌 글리콜 부분, 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변형체를 포함하는 부분, 트랜스페린, 트랜스페린 단편 또는 트랜스페린 변형체를 포함하는 부분, 알부민에 결합하는 부분, 신생아 Fc 수용체에 결합하는 부분)을 추가로 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "내인성 표적 화합물"은 관심 피검체 (예를들어, 포유동물, 인간)에 의해 생성되는 가용성 화합물을 의미한다. 내인성 표적 화합물은, 예를들어 가용성 효능제 (예를들어, 사이토카인, 성장인자, 호르몬), 가용성 수용체 (예를들어, 가용성 사이토카인 수용체, 예를들어 가용성 TNFR1, 가용성 TNFR2, 가용성 IL-1 수용체, 가용성 IL-4 수용체, 가용성 IL-13 수용체), 내인성 수용체 길항제 (예를들어, IL-1 수용체 길항제 (IL-1ra)), 효소 등을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "활성 부위"는 내인성 표적 화합물의 내인성 결합 파트너 (예를들어, 수용체의 리간드와 접촉하는 수용체 단백질의 부위 또는 도메인, 효능제의 수용체와 접촉하는 효능제 단백질(예를들어, 사이토카인)의 부위 또는 도메인, 효소의 촉매 도메인)와 상호작용 (예를들어, 결합)하는 내인성 표적 화합물 (예를들어, 단백질)의 부위 또는 도메인을 의미한다. 본원에서 사용되는 가용성의 내인성 화합물, 예를들어 사이토카인, 성장인자 또는 호르몬의 "활성 부위"는 상기 사이토카인, 성장인자 또는 호르몬에 결합하는 내인성 수용체와 접촉하는 사이토카인, 성장인자 또는 호르몬 상의 부위이다.

본원에서 사용되는 "생체이용률"은 내인성 표적 화합물 또는 리간드-내인성 표적 화합물 복합체가 요망되는 작용 부위(예를들어, 전신 순환, 중추신경계, 작용의 국소부위(예를들어, 특정 기관, 특정 조직 영역(예를들어, 근육, 피부)))에 존재하거나 이에 접근하는 정도를 의미한다. 내인성 표적 화합물의 생체이용률은 피검체의 내인성 표적 화합물의 생체내 반감기의 임의의 변화 또는 내인성 표적 화합물의 양의 임의의 변화에 의해 독립적으로 증가될 수 있다. 예를들어, 리간드는 전신 순환에서 이로운 활성을 지니는 내인성 표적 화합물에 결합할 수 있으나, 조직으로 신속하게 분포되고, 조직으로의 분포 속도를 늦춘다. 이러한 리간드는 전신 순환의 내인성 표적 화합물의 생체이용률을 증가시킬 것이고, 내인성 표적 화합물의 이로운 활성은 치료 효과를 지닐 수 있다.

본원에서 사용되는 "결합 활성"은 서로 결합하는 결합 파트너의 능력을 의미한다. 예를들어, 동족 리간드에 결합하는 수용체 또는 가용성 수용체의 능력을 의미한다. 결합 활성은, 예를들어 친화성(K_d;K_d=K_off/K_on) 또는 결합성으로 측정될 수 있다. 결합 활성은, 예를들어 친화성을 증가 (예를들어, 결합(K_on)의 속도를 증가시키거나 해리(K_off)의 속도를 감소시킴)시키거나 결합성을 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 결합성은, 예를들어 제 1 결합 파트너와 제 2 결합 파트너가 접촉하는 부위의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다.

본원에서 사용되는 관용구 "실질적으로 비-면역원성"은 리간드, 리간드-내인성 표적 화합물 또는 내인성 표적 화합물에 결합하는 고친화성 항체가 피검체에 투여되는 리간드에 의해 생성되지 않는 것을 의미한다. 고친화성 항체는 리간드, 리간드-내인성 표적 화합물 복합체 또는 내인성 표적 화합물에 500 nM 이하, 300 nM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 또는 1 nM 이하로 결합한다. 리간드, 리간드-내인성 표적 화합물 복합체 또는 내인성 표적 화합물에 결합하는 항체 및 이러한 항체의 친화성은 임의의 적절한 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 이러한 여러 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를들어, 리간드가 투여 (예를들어, 투여후 약 1주, 2주, 3주, 4주후)된 인간으로부터 수득될 수 있고, 혈청은 예를들어 ELISA 또는 기타 적합한 검정을 이용하여 리간드, 리간드-내인성 표적 화합물 또는 내인성 표적 화합물에 결합하는 항체의 존재에 대해 시험될 수 있다. 항체의 친화성은 임의의 적합한 방법, 예를들어 평형 투석 또는 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 결정될 수 있다.

관용구 "면역글로불린 단일 가변 도메인"은 기타 V 영역 또는 도메인과는 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 가변 영역 (V_H, V_HH, V_L)을 의미하나; 상기 용어가 본원에 사용되는 바에 따르면, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다른 영역 또는 도메인이 단일 면역글로불린 가변 도메인에 의한 항원 결합에 필요하지 않는 경우(즉, 면역글로불린 가변 도메인이 추가의 가변 도메인과는 독립적으로 항원에 결합하는 경우)에 다른 가변 영역 또는 가변 도메인을 지닌 포맷 (예를들어, 동종이합체 또는 이종이합체)으로 존재할 수 있다. "면역글로불린 가변 도메인"은 분리된 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 뿐만 아니라, 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 단량체를 포함하는 보다 큰 폴리펩티드도 포함한다. "도메인 항체" 또는 "dAb"는 본원에서 사용되는 용어에 따르면 "면역글로불린 단일 가변 도메인" 폴리펩티드와 동일하다. 본원에서 사용되는 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드는 포유동물, 바람직하게는 인간 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드를 의미하지만, 설치류의 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드 (참조: 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 WO 00/29004) 및 카멜리드(camelid) V_HH dAb도 포함한다. 카멜리드 dAb는 낙타, 라마, 알파카, 단봉낙타 및 과나코를 포함하는 종으로부터 유래되는 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이고, 천연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 항체를 포함한다: V_HH·V_HH 분자는 IgG 분자보다 약 10배 작고, 단일 폴리펩티드와 같이 이들은 극도의 pH 및 온도 조건에 내성으로 매우 안정하다.

"상보적" : 두개의 면역글로불린 도메인은 이들이 동족쌍 또는 그룹을 형성하는 구조의 과에 속하고, 이러한 과로부터 유래되고, 이러한 특징을 보유하는 경우에 "상보적"이다. 예를들어, 항체의 V_H 도메인 및 V_L 도메인은 상보적이고; 두개의 V_H 도메인은 상보적이지 않고, 두개의 V_L 도메인은 상보적이지 않다. 상보적 도메인은 다른 일원의 면역글로불린 상과, 예를들어 T 세포 수용체의 V_α 및 V_β (또는 γ 및 δ) 도메인에서 발견될 수 있다. 인공적인 도메인, 예를들어 에피토프에 결합하도록 고안되지 않는 한 에피토프에 결합하지 않는 단백질 스캐폴드에 기초한 도메인은 비-상보적이다. 마찬가지로, (예를들어) 면역글로불린 도메인 및 피브로넥틴 도메인에 기초한 두개의 도메인은 상보적이 아니다.

"면역글로불린과" : 이는 두개의 β 시트 및 보통 보존된 이황화 결합을 보유하는, 항체 분자의 면역글로불린 폴드 특성을 포유하는 폴리펩티드 과를 의미한다. 면역글로불린 상과의 일원은 면역계에서의 광범위한 역할(예를들어, 항체, T 세포 수용체 분자 등)을 포함하는 세포 및 비세포 상호작용의 다양한 양태, 및 세포 부착 (예를들어, ICAM 분자) 및 세포내 신호전달 (예를들어, 수용체 분자, 예를들어 PDGF 수용체)에 수반된다. 본 발명은 결합 도메인을 지니는 모든 면역글로불린 상과 분자에 적용가능하다. 바람직하게는, 본 발명은 항체를 의미한다.

"도메인" : 도메인은 단백질의 나머지와는 독립적인 삼차 구조를 보유하는 폴딩된 단백질 구조이다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 분비 기능 특성을 담당하고, 많은 경우에서 단백질 및/또는 도메인의 나머지의 기능의 손실 없이 기타 단백질로 첨가되거나, 제거되거나 이동될 수 있다. 단일 항체 가변 도메인은 항체 가변 도메인의 서열 특성을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인을 의미한다. 따라서, 이는 완전한 항체 가변 도메인 및, 예를들어 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특성이 아닌 서열로 대체된 변형된 가변 도메인, 또는 N-말단 또는 C-말단이 트렁케이션되거나 N-말단 또는 C-말단 신장을 포함하는 항체 가변 도메인, 뿐만 아니라 전장 도메인의 적어도 일부의 결합 활성 및 특이성을 보유하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다.

"레퍼토리" : 다양한 변이체, 예를들어 1차 서열이 다른 폴리펩티드 변이체의 집합. 본 발명에 사용된 라이브러리는 1000개 이상의 일원을 포함하는 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함한다.

"라이브러리" : 용어 라이브러리는 이종 폴리펩티드 또는 핵산의 혼합물을 의미한다. 라이브러리는 각각이 단일 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 지니는 일원으로 구성된다. 이러한 맥락에서, 라이브러리는 레퍼토리와 유의하다. 라이브러리 일원 사이의 서열 차이는 라이브러리에 존재하는 다양성을 책임진다. 라이브러리는 폴리펩티드 또는 핵산의 단순한 혼합물의 형태를 취하거나, 유기체 또는 세포, 예를들어 박테리아, 바이러스, 동물 또는 식물 세포 등의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 각각의 개별적 유기체 또는 세포는 단지 하나 또는 제한된 수의 라이브러리 일원을 함유한다. 유리하게는, 핵산이 발현 벡터로 통합되어, 핵산에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 발현을 가능케 한다. 따라서, 한 바람직한 양태에서, 라이브러리는 각각의 유기체가 상응하는 폴리펩티드 일원을 생성시키기 위해 발현될 수 있는 핵산의 라이브러리의 단일 일원을 함유하는 하나 이상의 카피의 발현 벡터를 함유하는, 숙주 유기체의 집단의 형태를 취할 수 있다. 따라서, 숙주 유기체의 집단은 유전적으로 다양한 폴리펩티드 변이체의 광범위한 레퍼토리를 엔코딩하는 잠재성을 지닌다.

"항체" : 천연적으로 항체를 생성하는 임의의 종으로부터 유래되거나, 재조합 DNA 기술에 의해 생성되고; 혈청, B 세포, 하이브리도마, 트랜스펙토마(transfectoma), 효모 또는 박테리아로부터 분리된, 항체 (예를들어, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE) 또는 단편 (예를들어, Fab, F(ab')₂, Fv, 이황화 결합된 Fv, scFv, 폐쇄 형태의 다중특이적 항체, 이황화 결합된 scFv, 디아바디(diabody).

"이중특이적 리간드" : 본원에 정의된 제 1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제 2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드로서, 상기 가변 영역은 단일특이적 면역글로불린에 의해 일반적으로 결합되지 않는 두개의 상이한 항원 또는 동일한 항원의 두개의 에피토프에 결합될 수 있다. 예를들어, 두개의 에피토프는 동일한 합텐일 수 있으나, 동일한 에피토프가 아니거나 단일특이적 리간드에 의해 결합되기에 충분히 인접하지 않는다. 본 발명에 따른 이중특이적 리간드는 상이한 특이성을 지니는 가변 도메인으로 구성되고, 동일한 특이성을 지니는 서로 상보성인 가변 도메인쌍을 함유하지 않는다. 이중특이적 리간드 및 이중특이적 리간드를 제조하기 위한 방법은 WO 2004/058821, WO 2004/003019 및 WO 03/002609에 기술되어 있고, 이러한 공개된 국제 공개의 전체 교시는 참조로서 본원에 포함되어 있다.

"항원" : 본 발명에 따른 리간드에 의해 결합되는 분자. 통상적으로, 항원은 항체 리간드에 의해 결합되고, 생체내에서 항체 반응을 일으킬 수 있다. 이는 폴리펩티드, 단백질, 핵산 또는 기타 분자일 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 이중특이적 리간드는 특정 항원에 대한 특이성을 표적으로 하기 위해 선택된다. 통상적인 항체 및 이의 단편의 경우, 가변 루프 (L1, L2, L3 및 H1, H2, H3)로 규정된 항체 결합 부위가 항원에 결합될 수 있다.

"에피토프" : 면역글로불린 V_H/V_L 쌍에 의해 통상적으로 결합된 구조의 단위. 에피토프는 항체에 대한 최소 결합 부위를 규정하고, 따라서 항체의 특이성 표적을 의미한다. 단일 도메인 항체의 경우, 에피토프는 분리시 가변 도메인에 의해 결합된 구조의 단위를 의미한다.

"유니버셜 프레임워크(universal framework)" : 케이뱃(Kabat)의 문헌["Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services]에 의해 정의된 서열에 보존된 항체의 영역 또는 문헌[Chothia and Lesk, (1987) J. MoI. Biol. 196:910- 917]에 정의된 인간 점라인 면역글로불린 레퍼토리 또는 구조에 상응하는 단일 항체 프레임워크 서열. 본 발명은 고변이 영역 단독에서의 변이를 통한 실질적으로 임의의 결합 특이성의 유도를 허용하는 것으로 밝혀진, 단일 프레임워크, 또는 상기 프레임워크의 세트의 용도를 제공한다.

"반감기" : 예를들어 천연 메커니즘에 의해 리간드의 분해 및/또는 리간드의 제거 또는 분리로 인해 생체내에서 리간드의 혈청 농도가 50%로 감소되는데 걸리는 시간. 본 발명의 리간드는 생체내에서 안정적이고, 이들의 반감기는 분해 및/또는 제거 또는 분리에 내성인 분자로의 결합에 의해 증가된다. 통상적으로, 이러한 분자는 스스로 생체내에서 긴 반감기를 지니는 천연 발생 단백질이다. 리간드의 반감기는 기능 활성이 반감기 증가 분자에 대해 특이적이지 않은 유사한 분자보다 긴 기간 동안 생체내에서 지속되는 경우에 증가된다. 따라서, HSA에 특이적인 리간드 및 표적 분자는 HSA에는 결합하지 않지만 다른 분자에는 결합하는 HSA에 대한 특이성이 존재하지 않는 동일한 리간드와 비교된다. 예를들어, 이는 표적 분자의 제 2의 에피토프에 결합할 수 있다. 통상적으로, 반감기는 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 이 이상 증가된다. 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 2Ox, 30x, 4Ox, 50x 또는 이 이상의 범위의 반감기의 증가가 가능하다. 또한 대안적으로 30x, 40x, 50x, 6Ox, 7Ox, 80x, 9Ox, 10Ox, 150x 이하의 범위의 반감기의 증가가 가능하다.

"실질적으로 동일 (또는 "실질적으로 상동")" : 제 1 아미노산 또는 누클레오티드 서열이 제 2 아미노산 또는 누클레오티드 서열에 대해 충분한 수의 동일하거나 동등한 (예를들어, 유사한 측쇄, 예를들어 보존된 아미노산 치환을 지님) 아미노산 잔기 또는 누클레오티드를 함유하여, 제 1 및 제 2 아미노산 또는 누클레오티드 서열이 동일한 활성을 지니는 것을 의미한다. 이러한 항체의 경우, 제 2 항체는 동일한 결합 특이성을 지니고, 50% 이상의 동일한 친화성을 지닌다.

본원에 언급된 용어 "약"은 바람직하게는 ±20%, 더욱 바람직하게는 ±10%, 더욱 더 바람직하게는 ±5%, 더욱 더 바람직하게는 ±2%, 가장 바람직하게는 ±1%를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "낮은 엄격한 조건", "중간의 엄격한 조건", "높은 엄격한 조건" 또는 "매우 높은 엄격한 조건"은 핵산 하이브리드화 및 세척을 위한 조건을 기술한다. 하이브리드화 반응을 수행하기 위한 지침은 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]의 최신 프로토콜에서 발견될 수 있다. 수성 및 비수성 방법이 상기 참조에 기술되어 있고, 둘 모두 사용될 수 있다. 본원에 언급된 특정 하이브리드화 조건은 하기와 같다: (1) 약 45℃의 6X 염화나트륨/시트르산 나트륨(SSC)중의 낮은 엄격한 하이브리드화 조건 후, 50℃ 이상 (세척 온도는 낮은 엄격한 조건에 대해 55℃로 증가될 수있음)에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 2회 세척; (2) 약 45℃의 6X SSC 중의 중간의 엄격한 하이브리드화 조건 후, 60℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS로 1회 이상 세척; (3) 약 45℃에서 6X SSC 중의 높은 엄격한 하이브리드화 조건 후, 65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS로 1회 이상 세척; 바람직하게는 (4) 65℃에서 0.5M 염화나트륨, 7% SDS 중의 매우 높은 엄격한 하이브리드화 조건 후, 65℃에서 0.2X SSC, 1% SDS로 1회 이상 세척. 매우 높은 엄격한 조건 (4)가 바람직한 조건이고, 나머지 조건들은 달리 상술되지 않는 경우에 사용됨.

본원에 언급된 용어 "경쟁하다"는 제 2 에피토프가 제 2 에피토프의 동족 에피토프 결합 도메인에 대해 결합되는 경우에 제 1 에피토프의 동족 에피토프 결합 도메인에 대한 제 1 에피토프의 결합이 방해되는 것을 의미한다. 예를들어, 결합은, 예를들어 결합 도메인의 물리적 장벽에 의하거나, 결합 도메인의 구조 또는 환경의 변화에 의해 입체적으로 억제되어, 이의 활성 또는 에피토프에 대한 결합성이 감소될 수 있다.

본원에 기술된 서열과 유사하거나 상동성인 서열 (예를들어, 약 70% 이상의 서열 동일성)이 또한 본 발명의 일부를 이룬다. 몇몇 구체예에서, 아미노산 수준에서의 서열 동일성은 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이 이상일 수 있다. 핵산 수준에서, 서열 동일성은 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이 이상일 수 있다. 대안적으로, 핵산 분절이 선택적 하이브리드화 조건 (예를들어, 매우 높은 엄격한 하이브리드화 조건)하에서 상보적인 가닥에 하이브리드화되는 경우에 충분한 동일성이 존재한다. 핵산은 전체 세포 또는 세포 용해질에 존재하거나 부분적으로 정제되거나 충분히 순수한 형태로 존재할 수 있다.

두개의 서열 사이의 "상동성" 또는 "서열 동일성" 또는 "유사성" (이러한 용어들은 본원에서 상호 교환하여 사용됨)의 계산은 하기와 같이 수행된다. 서열은 최적 비교 목적을 위해 정렬된다 (예를들어, 최적 정렬을 위해 제 1 및 제 2 아미노산 서열중 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있거나, 비상동성 서열이 비교 목적을 위해 무시될 수 있음). 한 바람직한 구체예에서, 비교 목적을 위해 정렬된 참조 서열의 길이는 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 더욱 더 바람직하게는 60% 이상, 더욱 더 바람직하게는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 및 100% 길이의 참조 서열이다. 이후, 상응하는 아미노산 위치 또는 누클레오티드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 누클레오티드가 비교된다. 제 1 서열의 위치가 제 2 서열 내의 상응하는 위치와 같은 아미노산 잔기 또는 누클레오티드에 의해 차지되는 경우, 분자들은 상기 위치에서 동일하다 (본원에서 사용되는 아미노산 또는 핵산 "상동성"은 아미노산 또는 핵산 "동일성"과 동일하다). 두개의 서열 사이의 동일성 %는 두개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입되는 것이 필요한, 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하는, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.

본원에 정의된 아미노산 및 누클레오티드 서열 정렬 및 상동성, 유사성, 동일성은 바람직하게는 디폴트 파라미터(Tatusova, T. A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174:187-188 (1999))를 이용하는 알고리듬 BLAST 2 서열을 이용하여 제조되고 결정된다. 대안적으로, 유리하게는 디폴트 값에 대해 설정된 파라미터를 지닌 BLAST 알고리듬 (버전 2.0)이 서열 정렬을 위해 사용된다. BLAST 알고리듬은 미연방정부(".gov")의 국립보건원("nih")의 국립 생물학 기술정보센터(".ncbi")의 월드 와이드 웹 사이트("www")에 "/Blast/" 디렉토리에 "blast_help.html" 파일로 상세하게 기술되어 있다. 검색 파라미터는 하기와 같이 정의되고, 규정된 디폴트 파라미터에 대해 유리하게 설정된다.

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)는 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx로 사용되는 학습 검색 알고리듬이다; 이들 프로그램은 몇가지 기능 강화와 함께 문헌[Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-8] (상기 기술된 "blast_help.html" 파일 참조)의 통계 방법을 이용한 이들의 발견에 의의를 둔다. BLAST 프로그램은 서열 유사성 검색을 위해, 예를들어 질의 서열에 대한 상동성을 확인하기 위해 맞추어진다. 상기 프로그램은 일반적으로 모티프-양식 검색에는 유용하지 않다. 서열 데이터베이스의 유사성 검색에서의 기본적인 문제를 검토하려면, 문헌[Altschul et al. (1994)]를 참조하라. 국립 생물학 기술정보센터 웹 사이트에서 이용가능한 5개의 BLAST 프로그램은 하기의 작업을 수행한다:

"blastp"은 단백질 서열 데이터베이스에 대해 아미노산 질의 서열을 비교한다;

"blastn"은 누클레오티드 서열 데이터베이스에 대해 누클레오티드 질의 서열을 비교한다;

"blastx"는 단백질 서열 데이터베이스에 대해 누클레오티드 질의 서열(둘 모두의 가닥)의 6개 프레임의 개념적 번역 생성물을 비교한다;

"tblastn"은 모든 6개의 판독 프레임에서 동적으로 번역된 누클레오티드 서열 데이터베이스에 대해 단백질 질의 서열을 비교한다 (둘 모두의 가닥);

"tblastx"는 누크레오티드 서열 데이터베이스의 6개 프레임 번역에 대해 누클레오티드 질의 서열의 6개 프레임 번역을 비교한다.

BLAST는 하기의 검색 파라미터를 사용한다:

HISTOGRAM은 각각의 검색에 대한 스코어의 막대그래프를 나타낸다; 디폴트는 '예'이다 (참조: BLAST 매뉴얼 내의 파라미터 H).

DESCRIPTIONS은 특정된 수로 보고되는 매칭 (matching) 서열의 짧은 디스크립션 (description)의 수를 제한한다; 디폴트 한계는 100개의 디스크립션이다 (매뉴얼 페이지의 파라미터 V 참조). 또한, EXPECT 및 CUTOFF를 참조하라.

ALIGNMENTS는 높은 스코어 분절쌍 (HSP)이 보고되는 특정된 수로 데이터베이스 서열을 제한한다; 디폴트 한계는 50이다. 이보다 더 많은 데이터베이스 서열이 보고를 위한 통계적 유의 분계점을 만족시키는 경우 (하기 EXPECT 및 CUTOFF 참조), 가장 높은 통계 유의성에 기인된 매치만이 보고된다 (BLAST 매뉴얼의 파라미터 B 참조).

EXPECT는 데이터베이스 서열에 대한 매치를 보고하기 위한 통계적 유의 분계점이다; 디폴트 값은 10이고, 이로써 10 매치는 문헌[Karlin and Altschul (1990)]의 추계학 모델에 따라 단지 우연에 의해 발견되는 것으로 예상된다. 매치에 기인한 통계적 유의성이 EXPECT 분계점보다 높은 경우, 매치는 보고되지 않을 것이다. 보다 낮은 EXPECT 분계점은 더욱 엄격해지고, 이는 보고되는 우연적인 매치수를 보다 적게 만든다. 분수값도 허용된다 (BLAST 매뉴얼의 파라미터 E 참조).

CUTOFF는 높은 스코어의 분절쌍을 보고하기 위한 컷오프 스코어이다. 디폴트 값은 EXPECT 값(상기 참조)로부터 계산된다. HSP는 이들에 기인된 통계 유의성이 최소한 CUTOFF 값과 동일한 스코어를 지니는 단독 HSP에 기인되는 것과 같이 높은 경우에만 데이터베이스 서열에 대해 보고된다. 보다 높은 CUTOFF 값은 더욱 엄격해지고, 이는 보고되는 우연적인 매치수를 보다 적게 만든다 (BLAST 매뉴얼의 파라미터 S 참조). 통상적으로, 유의 분계점은 EXPECT를 이용하여 더욱 직관적으로 다루어질 수 있다.

MATRIX는 BLASTP, BLASTX, TBLASTN 및 TBLASTX에 대한 교대 스코어 매트릭스를 특정한다. 디폴트 매트릭스는 BLOSUM62이다 (Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Natl. Aacad. Sci. USA 89(22): 10915-9). 유효한 교대 선택은 PAM40, PAM120, PAM250 및 IDENTITY를 포함한다. BLASTN에 대해서는 교대 스코어 매트릭스를 이용할수 없다; BLASTN 요청에서의 MATRIX 지시어를 특정하는 것은 오류 반응을 일으킨다.

STRAND는 TBLASTN 검색을 바로 데이터베이스 서열의 상단 또는 하단 가닥으로 제한하거나; BLASTN, BLASTX 또는 TBLASTX 검색을 바로 질의 서열의 상단 또는 하단 가닥상의 리딩 프레임으로 제한한다.

FILTER는 문헌[Wootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17:149-163]의 SEG 프로그램에 의해 결정되는 낮은 구성적 복잡성, 또는 문헌[Claverie & States, 1993, Computers and Chemistry 17:191-201]의 XNU 프로그램에 의해 결정되거나, BLASTN에 대해서는 타투소프(Tatusov) 및 리프만(Lipman)의 DUST 프로그램 (NCBI의 월드 와이드 웹 사이트 참조)에 의해 결정되는 짧은 주기의 내부 반복으로 구성된 분절을 지니는 질의 서열의 분절을 마스킹(masking)한다. 필터링은 blast 산출로부터 통계적으로는 유의하나 생물학적으로는 괌심을 끌지 않는 보고를 배제하여 (예를들어, 통상적인 산성, 염기성 또는 프롤린 풍부 영역에 대한 적중), 데이터베이스 서열에 대한 특이적 매칭에 이용가능한 질의 서열의 생물학적으로 보다 관심을 끄는 영역을 남길 수 있다.

필터 프로그램에 의해 발견된 낮은 복잡성 서열은 누클레오티드 서열 내에서 문자 "N" (예를들어, "N"이 13회 반복됨)을 이용하여 대체되고, 단백질 서열에서 문자 "X" (예를들어, "X"가 9회 반복됨)를 이용하여 대체된다.

필터링은 질의 서열 (또는 이의 번역 생성물)에만 적용되고, 데이터베이스 서열에는 적용되지 않는다. 디폴트 필터링은 BLASTN에 대해서는 DUST이고, 기타 프로그램에 대해서는 SEG이다.

SWISS-PROT 내의 서열에 적용되는 경우 SEG, XNU 또는 둘 모두에 의해 마스킹되어 아무것도 나타나지 않는 것은 특별한 것이 아니므로, 필터링은 항상 결과를 산출하는 것으로 예상되어선 안된다. 더욱이, 몇몇 경우에, 서열은 이의 전체에서 마스킹되는데, 이는 필터링되지 않은 질의 서열에 대해 보고된 임의의 매치의 통계적 유의성이 의심되는 것을 나타낸다. NCBI-gi는 NCBI gi 인식자 뿐만 아니라 수탁정보 및/또는 유전자좌 명칭이 산출물에 나타나게 한다. 가장 바람직하게는, 서열 비교는 상기 기술된 NCBI 월드 와이드 웹 사이트에서 "/BLAST" 디렉토리 내에 제공된 간단한 BLAST 검색 알고리듬을 이용하여 수행된다.

달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학용어 (예를들어, 세포 배양, 분자유전학, 핵산 화학, 하이브리드화 기술 및 생화학)는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 지닌다. 표준 기술이 분자, 유전학 및 생화학 방법 (참조: 전체 내용이 본원에 참조로서 포함된 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.) 및 화학적 방법에 대해 사용된다.

본 발명은 요망되는 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부분을 포함하는 리간드, 치료에 사용하기 위한 이러한 리간드, 약제를 제조하기 위한 위한 이러한 리간드의 용도 및 이러한 리간드를 투여하는 것을 포함하는 치료 방법에 관한 것이다.

가용성의 내인성 표적 화합물에 결합하지만, 이러한 화합물의 활성을 실질적으로 변화시키지 않는 작용제, 예를들어 항체 및 항체 단편 (예를들어, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, Fv 단편 (예를들어, scFv, 이황화 결합된 Fv), dAb, 디아바디)이 내인성 표적 화합물의 특정한 특성을 변화시킴으로써 이러한 내인성 표적 화합물이 질병을 치료하거나, 억제하거나, 완화시키기에 더욱 효과적이거나, 진단용으로 더욱 효과적으로 만드는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 가용성의 내인성 표적 화합물에 결합하고, 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않지만(예를들어, 내인성 표적 화합물의 활성 부위에 결합하지 않음), 내인성 표적 화합물의 특정 특성을 변화시키는데 유용한, 본원에 기술된 리간드에 관한 것이다. 예를들어, 요망되는 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부분을 포함하는 리간드는 내인성 표적 화합물에 결합함으로써 상기 내인성 표적 화합물의 유체역학적 크기를 증가시키고 상기 내인성 표적 화합물의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 이롭게는, 내인성 표적 화합물은 리간드 (예를들어, 리간드 및 내인성 표적 화합물로 구성되는 복합체 내에서 활성인 리간드)에 의해 결합되는 경우 이의 생물학적 활성을 보유하고, 치료 및/또는 진단 목적에 대한 이로운 효과를 생성할 수 있다.

본원에 기술된 리간드는, 예를들어 내인성 표적 화합물의 제거 속도를 감소시킴으로써 내인성 표적 화합물의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 이러한 상황에서, 피검체 (예를들어, 전신 순환에서)의 내인성 표적 화합물의 양은 피검체에 정상적으로 존재하는 양 보다 많은 양으로 증가할 수 있고, 내인성 표적 화합물의 증가된 양은 보다 낮거나 정상적인 양의 내인성 표적 화합물에 의해 생성되지 않는 이로운 치료 효과를 생성할 수 있다.

요망되는 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부분을 포함하는 리간드는 내인성 표적 화합물에 결합할 수 있고, 피검체의 내인성 표적 화합물의 생체내 반감기의 임의의 변화, 또는 내인성 표적 화합물의 양의 임의의 변화에 의해 독립적으로 내인성 표적 화합물의 생체이용률을 증가시킬 수 있다. 예를들어, 리간드는 전신 순환에서 이로운 활성을 지니지만, 조직으로 신속하게 분포되거나 제거 (예를들어, 스테로이드 또는 펩티드 호르몬)되고, 분포 또는 제거의 속도를 감소시키는 내인성 표적 화합물에 결합할 수 있다. 이러한 리간드는 전신 순환의 내인성 표적 화합물의 생체이용률을 증가시킬 수 있고, 이러한 내인성 표적 화합물의 활성은 이로운 (예를들어, 치료) 효과를 지닐 수 있다.

요망되는 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부분을 포함하는 리간드는 내인성 표적 화합물에 결합할 수 있고, 내인성 표적 화합물의 활성 (예를들어, 결합 활성)을 증가시킬 수 있다. 예를들어, 리간드는 내인성 표적 화합물, 예를들어 내인성 효능제 (예를들어, 사이토카인) 또는 가용성 사이토카인 수용체에 결합할 수 있고, 내인성 결합 파트너에 대한 내인성 표적 화합물의 친화성 및/또는 결합성을 증가시킴으로써 내인성 표적 화합물의 결합 활성을 개선시킬 수 있다. 예를들어, 요망되는 사이토카인에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 2개 이상의 부분을 포함하는 리간드는 2개 이상의 개별적 사이토카인 분자에 결합함으로써 사이토카인 이합체, 삼합체, 소중합체 또는 중합체를 생성할 수 있다. 이러한 이합체, 삼합체, 소중합체 또는 중합체는, 예를들어 보다 높은 결합성으로 인해 사이토카인에 대한 수용체를 발현하는 세포로의 결합 활성을 개선시킬 것이다. 유사하게, 가용성 수용체 (예를들어, 가용성 TNFR1)의 결합 활성은 가용성 TNFR1에 대한 2개 이상의 결합 부위를 포함하는 리간드에 의해 증가될 수 있다. 이러한 리간드는, 예를들어 단일 TNFR1 사슬에 보다 높은 결합성으로 삼합체 TNF와 결합하는 가용성 TNFR1 이합체를 형성하는 2개의 가용성 TNFR1 사슬에 결합할 수 있다.

본원에 기술된 리간드는, 예를들어 전신 순환의 내인성 표적 리간드에 결합하여, 전신 순환의 이로운 효과를 생성하도록 전신적으로 투여될 수 있다. 또한, 리간드는 국소적(예를들어, 피하 주사, 근내 주사, 관절내 주사, 피내 주사, 흡입 등)으로 투여됨으로써, 내인성 표적 화합물의 국소적 생체이용률을 개선시키거나, 리간드가 국소적으로 투여되는 부위에서 내인성 표적 화합물의 양을 증가시킬 수 있다. 예를들어, 리간드의 데포 제형이 피하 주사에 의해 국소적으로 투여될 수 있고, 투여된 리간드는 데포 부위로 내인성 표적 리간드를 보충하고, 내인성 표적 리간드에 결합하여 국소 생체이용률을 개선시키거나, 국소적으로 높은 양의 내인성 표적 리간드를 생성시킬 수 있다. 이러한 방법은, 예를들어 상처 치유를 촉진하거나, 국소적 염증 반응 (예를들어, 피부, 폐, 관절)을 억제시키는데 이롭다.

본 발명은 통상적인 치료제 및 방법에 비해 여러 이점을 제공한다. 예를들어, 본원에 기술된 리간드는 보다 적은 수율로 생성되는 보다 고가의 포유동물 발현 시스템이 아닌 박테리아 또는 효모 발현 시스템을 이용하여 경제적으로 보다 많은 양으로 생성될 수 있는 일반적으로 작은 폴리펩티드이다. 또한, 본원에 기술된 리간드는 환자에게 내인성인 화합물 (예를들어, 단백질)의 이로운 활성을 이용하고 활용하도록 투여되고, 일반적으로 이러한 리간드는 동일한 환자 기원 (예를들어, 인간 기원)이므로 실질적으로 비-면역원성이다. 유리하게는, 이는 환자가 리간드, 리간드-내인성 표적 화합물 복합체 또는 내인성 표적 화합물에 대한 높은 친화성의 중화 항체를 생성하는 위험을 현저하게 감소시키거나 제거한다. 이는 치료제의 효능을 제한하거나 제거할 수 있는 환자의 높은 친화성 항체의 생성을 종종 야기하는 외인성 화합물, 또는 재조합적으로 생성된 내인성 단백질을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법에 비해 명백한 이점이다.

내인성 표적 화합물에 결합하는 리간드

본 발명은 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니지만 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 부분 (예를들어, dAb)을 포함하는 리간드에 관한 것이다. 바람직하게는, 리간드는 내인성 표적 화합물의 활성 부위에 결합하지 않는다.

본원에 기술된 리간드는 이들이 결합하는 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않고, 상기 리간드에 의해 결합되는 경우 상기 내인성 표적 화합물은 활성을 유지한다. 예를들어, 가용성 수용체가 본 발명의 리간드에 의해 결합되고, 생성되는 수용체-리간드 복합체 내의 가용성 수용체는 가용성 수용체의 내인성 리간드에 결합할 수 있다. 또 다른 예에서, 효소가 본 발명의 리간드에 의해 결합되고, 생성되는 효소-리간드 복합체 내의 효소는 기질에 결합하여 효소 반응을 촉매할 수 있다.

일반적으로, 리간드는 결합하는 이의 내인성 표적 화합물의 활성을 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하로 억제하거나, 내인성 표적 화합물의 활성에 대해 실질적으로 억제 효과를 지니지 않는다. 몇몇 예에서, 결합하는 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 리간드는 높은 억제 농도 50(IC50), 예를들어 1 나노몰 이상, 10 나노몰 이상, 100 나노몰 이상, 1 마이크로몰 이상, 또는 10 마이크로몰 이상의 IC50으로 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 억제한다.

내인성 표적 화합물의 활성을 억제하는 리간드의 능력은 임의의 적절한 시험관내 또는 생체내 검정을 이용하여 측정될 수 있다. 다수의 적절한 검정법이 당 분야에 널리 공지되어 있고, 화합물의 억제 활성을 측정하기 위해 사용된다. 예를들어, 활성 또는 TNFR1을 억제하기 위한 TNFR1에 대한 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 능력이 내독소 쇼크 또는 TNF에 의해 유발된 피부 괴사의 시험관내 모델 (참조: Sheehan et al., J. Exp. Med., 181:607-611 (1995)), 및/또는 본원에 기술된 시험관내 수용체 결합 검정, L929 세포독성 검정, HeLa IL-8 검정, 또는 MRC-5 IL-8 방출 검정을 이용하여 측정될 수 있다. 본원에 기술된 것과 같은, 리간드가 요망되는 내인성 표적 화합물의 활성을 억제하는지의 여부를 측정하기 위한 기타 적절한 검정법은 당 분야에 널리 공지되어 있다.

리간드 그 자체는 실질적 치료 활성을 지니지 않지만, 치료 또는 진단 목적으로 내인성 표적 화합물의 활성을 이용하고 활용하기 위해 사용된다. 몇몇 구체예에서, 리간드는 내인성 표적 화합물의 활성에 대해 적절한 시험관내 검정에서 실질적 활성을 지니지 않는다. 예를들어, 내인성 표적 화합물에 결합하여 내인성 표적 화합물의 반감기를 증가시키는 리간드는 일반적으로 동일하지만 리간드가 없는 검정에서의 내인성 표적 화합물의 활성과 비교하여 보면 상기 검정에서 내인성 표적 화합물의 활성을 변화시키지 않을 것이다.

요망되는 내인성 화합물, 예를들어 수용체 단백질, 가용성 효능제 (예를들어, 사이토카인), 또는 효소에 결합하지만 상기 내인성 표적 화합물의 활성 부위에 결합하지 않는 리간드 (예를들어, dAb)는 임의의 적절한 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 예를들어, 개별적 리간드, 또는 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분 또는 이러한 부분의 집합물 (예를들어, 라이브러리 또는 레퍼토리)은내인성 표적 화합물에 대한 내인성 결합 파트너 (예를들어, 중성 리간드, 기질, 보조인자)의 결합이 스크리닝되는 리간드 또는 부분(또는 리간드 또는 부분의 집합물)의 존재하에서 측정되는 적합한 경쟁 검정에서 스크리닝될 수 있다. 적절한 대조군에 비한 내인성 표적 화합물로의 내인성 결합 파트너의 결합에서의 실질적인 감소(예를들어, 억제)가 없는 것은 스크리닝되는 리간드 또는 부분이 내인성 표적 화합물의 활성 부위에 결합하지 않는 것을 나타낸다.

내인성 표적 화합물, 예를들어 효소, 수용체 (예를들어, 사이토카인 수용체, 성장 인자 수용체), 및 가용성 효능제 (예를들어, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 호르몬)에 대한 결합 부위를 포함하는 리간드 및 부분을 스크리닝하기 위한 다수의 적절한 검정은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 또한, 경쟁 검정이 10⁶ 내지 10⁹개 또는 이 이상의 일원을 함유하는 화합물의 집합물을 스크리닝하기 위해 통상적으로 사용된다. 따라서, 이러한 스크리닝 활성은 당 분야의 숙련된 기술에 해당하고, 당업자에게 번거롭거나 과도하지 않다. 예를들어, WO 03002609, WO 2004101790, WO 2005035572, WO 2004061026, WO 2004003019, WO 2004058821, WO 9404678, WO 9749805, WO 9923221, WO 9937681, WO 0024884, WO 0043507, WO 0065067, WO 0140310, WO 03035694, WO 03053531, WO 03054015, WO 0305527, WO 2004015425, WO 2004041862, WO 2004041863, WO 2004041865, WO 2004062551, WO 2005044858 및 EP1134231에 기술된 가변 도메인이 적절한 경쟁 검정에서의 활성 부위로의 결합 없이 요망되는 내인성 표적 화합물에 결합하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 전술한 문헌의 가변 도메인, 이의 서열 및 생성 및 선택 방법의 기술은 본 발명에 사용하기 위한 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분의 예를 당업자에게 제공하기 위해 본원에 참조로서 명백하게 포함되어 있다.

리간드는 피검체에서 이들이 결합하는 내인성 표적의 반감기를 증가시킬 수 있고/거나, 이들이 결합하는 내인성 표적의 양(예를들어, 전신적 양, 요망되는 부위 또는 위치에서의 양)을 증가시킬 수 있고/거나 이들이 결합하는 내인성 표적의 생체이용률을 증가시킬 수 있다.

리간드는 내인성 표적 화합물에 결합함으로써 내인성 표적 화합물의 유체역학적 크기를 증가시키거나, 내인성 표적 화합물에 결합하여 이를 안정화시키거나, 내인성 표적 화합물에 결합하여 이의 제거 또는 물질대사 속도를 감소시킴으로써 결합하는 내인성 표적 화합물의 반감기를 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 리간드는 결합하는 내인성 표적 화합물의 반감기를 리간드의 부재하에서의 내인성 표적 화합물의 반감기에 비해 약 1.5배 이상, 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 또는 약 10배 이상으로 증가시킬 것이다. 예를들어, 내인성 표적 화합물은 약 1시간의 반감기를 지닐 수 있고, 상기 내인성 표적 화합물에 결합하는 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 투여 후, 내인성 표적 화합물의 반감기는 약 1.5 시간, 약 10시간 또는 이 이상으로 증가될 수 있다.

내인성 표적 화합물의 수준 또는 양은 리간드의 반감기를 증가시키는 효과로 인해 본원에 기술된 바와 같이 리간드의 투여 후 증가할 수 있다. 예를들어, 본 발명의 리간드의 투여후 1시간, 또는 2시간, 또는 3시간, 또는 4시간, 또는 5시간, 또는 6시간, 또는 7시간, 또는 8시간, 또는 9시간, 또는 10시간, 또는 11시간, 또는 12시간, 또는 1일 후의 내인성 표적 리간드의 수준 또는 양 (예를들어, 혈청내의 수준 또는 양)은 약 1.5배 이상, 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 10배 이상, 약 50배 이상, 약 100배 이상, 약 500배 이상, 약 1,000배 이상, 약 5,000배 이상, 약 10,000배 이상, 약 50,000배 이상, 또는 약 100,000배 이상으로 증가될 수 있다. 내인성 표적 화합물의 증가된 수준 또는 양은 임의의 적절한 방법을 이용하여 용이하게 검출될 수 있다. 예를들어, 적절한 샘플(예를들어, 혈청)이 리간드의 투여 전에 수득될 수 있고, 투여후 하나 이상의 시점에서 샘플 내의 내인성 표적 화합물의 수준 또는 양이 임의의 적절한 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 샘플은, 예를들어 혈액, 혈청, 뇌척수액, 윤활액, 기관지 폐포 세척액, 관장제 또는 생검의 샘플일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 샘플 내의 리간드의 양 또는 수준은 리간드의 투여 전의 양 또는 수준에 비해 증가된다.

리간드는 내인성 표적 화합물의 생체이용률을 증가시킬 수 있다. 생체이용률은 전신적으로 증가할 수 있거나, 요망되는 작용 부위(예를들어, 리간드가 국소적으로 투여되는 부위)에서 증가할 수 있다. 예를들어, 리간드는 전신 순환에서 이로운 활성을 지니나, 조직으로 신속하게 분포되거나 제거되고(예를들어, 스테로이드 또는 펩티드 호르몬), 분포 또는 제거 속도를 감소시키는 내인성 표적 화합물에 결합할 수 있다. 이러한 리간드는 전신 순환의 내인성 표적 화합물의 생체이용률을 증가시킬 수 있고, 이러한 내인성 표적 화합물의 활성은 이로운 (예를들어, 치료) 효과를 지닐 수 있다. 리간드는 내인성 표적 화합물을 요망되는 부위로 보충함으로써 요망되는 부위에서 내인성 표적 화합물의 생체이용률을 증가시킬 수 있다. 예를들어, 요망되는 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 포함하는 리간드는 환자에게 국소적으로 투여(예를들어, 데포 제형으로서)될 수 있다. 국소적으로 투여되는 리간드는 요망되는 내인성 표적 화합물에 결합할 수 있고, 상기 부위에 추가의 내인성 표적 화합물을 보충할 수 있다. 따라서, 내인성 표적 화합물의 증가된 수준 또는 양이 이로운 효과를 생성시키기 위해 상기 부위에 존재할 수 있다. 예를들어, 한 구체예에서, 리간드는 TGF 베타 이소형 3에 대한 결합 부위를 지니는 부분을 포함한다. 이러한 리간드는 국소적으로 투여되어 TGF 베타 이소형(isoform) 3에 결합할 수 있고, 국소 투여의 부위에 TGF 베타 이소형 3를 보충함으로써, 상처 치유를 촉진할 수 있다.

요망되는 세포 표면 표적에 대한 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 유사한 리간드가 본원에 기술된 방법을 이용하여 제조될 수 있고, 예를들어 요망되는 부위(예를들어, 상처 부위, 염증 부위)로 요망되는 세포 유형을 보충하기 위해 사용될 수 있다.

일반적으로, 리간드는 결합하는 내인성 표적 화합물의 생체이용률(예를들어, 전신 순환에서, 요망되는 작용 부위에서)을 리간드의 부재하에서의 내인성 표적 화합물의 생체이용률에 비해 약 1.5배 이상, 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 또는 약 10배 이상으로 증가시킬 것이다. 예를들어, 리간드가 전신 순환에서 생체이용률을 증가시키는 경우, 리간드의 투여 시점에서 출발하는 내인성 리간드의 농도 시간 곡선이 제작될 수 있고, 전신 생체이용률의 증가 정도를 결정하기 위해 내인성 표적 리간드의 일반적인 전신 수준과 비교될 수 있다.

리간드는 이들이 결합하는 내인성 표적의 활성 (예를들어, 결합 활성)을 증가시킬 수 있다. 예를들어, 리간드는 내인성 표적 화합물, 예를들어 내인성 효능제 (예를들어, 사이토카인) 또는 가용성 사이토카인 수용체에 결합할 수 있고, 내인성 결합 파트너에 대한 내인성 표적 화합물의 친화성 및/또는 결합성을 증가시킴으로써 내인성 표적 화합물의 결합 활성을 개선시킬 수 있다. 요망되는 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 2개 이상의 부분을 포함하는 리간드는 2개 이상의 개별적 내인성 표적 화합물 분자에 결합하여 내인성 표적 화합물 이합체, 삼합체, 소중합체 또는 중합체를 생성시킬 수 있다. 이러한 이합체, 삼합체, 소중합체 또는 중합체는, 예를들어 보다 높은 결합성으로 인해 내인성 표적 화합물에 대한 천연 결합 파트너를 발현하는 세포에 대한 개선된 결합 활성을 지닐 것이다. 일반적으로, 이러한 리간드는 내인성 표적 화합물의 결합 활성을 개선시킬 수 있다. 예를들어, 결합 파트너에 대한 내인성 표적 화합물 이합체, 삼합체, 소중합체 또는 중합체의 결합 강도 (예를들어, 친화성 또는 결합성)는 단량체 (즉, 본 발명의 리간드와의 복합체가 아닌 상태)로서의 내인성 표적 화합물의 결합 강도에 비해 약 10배 이상, 약 100배 이상, 약 1000배 이상, 또는 약 10,000배 이상 강할 수 있다.

한 예에서, 리간드는 요망되는 내인성 효능제 (예를들어, 사이토카인, 성장인자)에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 2개 이상의 부분을 포함하고, 2개 이상의 내인성 효능제 분자에 결합하여 내인성 효능제 이합체, 삼합체, 소중합체 또는 중합체를 생성한다. 이러한 이합체, 삼합체, 소중합체 또는 중합체는, 예를들어 보다 높은 결합성으로 인해 내인성 효능제에 대한 수용체를 발현하는 세포에 대해 개선된 결합 활성을 지닐 것이고, 개선된 치료 효능을 지닐 수 있다. 유사하게, 가용성 수용체 (예를들어, 가용성 TNFR1)의 결합 활성은 가용성 수용체에 대한 2개 이상의 결합 부위를 포함하는 리간드에 의해 증가될 수 있다. 이러한 리간드는, 예를들어 단일 수용체 사슬에 대해 보다 높은 결합성을 지니는 수용체의 내인성 리간드에 결합하는 가용성 수용체 이합체를 형성하는 2개의 가용성 수용체 사슬에 결합할 수 있다.

한 특정 구체예에서, 리간드는 가용성 TNFR1에 대한 결합 특이성을 지니지만, 활성 부위(가용성 TNFR1의 활성 부위는 도메인 2 및 3 내에 함유됨)에 결합하지 않는 2개 이상의 부분(dAb)을 포함한다. 이러한 리간드는 2개 이상의 가용성 TNFR1 사슬에 결합하여, 증가된 결합성으로 인해 삼합체 리간드인 TNF에 대한 개선된 결합 활성을 지니는 가용성 TNFR1 이합체, 삼합체, 소중합체 또는 중합체를 형성할 수 있다. 단일한 가용성 TNFR1 사슬 보다 큰 유체역학적 크기를 지니는 이러한 가용성 TNFR1 이합체, 삼합체, 소중합체 또는 중합체의 반감기가 또한 단일 TNFR1에 비해 연장될 수 있음이 인지되어야 한다. 결과적으로, 이러한 리간드는 가용성 TNFR1의 TNF 억제 활성을 개선시킬 수 있고, 이의 치료 효능을 개선시킬 수 있다. 예를들어, 이러한 리간드는 약 10배 이상, 약 100배 이상, 약 1,000배 이상 또는 약 10,000배 이상으로 가용성 TNFR1의 효능을 개선시킬 수 있다.

이러한 구체예의 한 예에서, 마우스 TNFR1의 도메인 1에 결합하는 dAb의 이합체인 리간드가 가용성 TNFR1의 이합체화를 유도하는 리간드가 가용성 TNFR1의 효능을 개선시키는 것을 입증하기 위해 사용된다. 예를들어, 이러한 리간드는 인간 MRC5 세포, 인간 TNF 및 가용성 마우스 TNFR1를 함유하는 분석에 첨가될 수 있다. 가용성 마우스 TNFR1는 인간 TNF로의 결합에 대해 MRC5 세포 상의 인간 TNFR1와 경쟁할 것이다. 마우스 TNFR1의 도메인 1에 결합하는 dAb의 이합체인 리간드는 2개의 가용성 마우스 TNFR1에 결합하여 검정에서 TNF의 효과를 억제하는데 있어서 훨씬 더 효과적인 마우스 TNFR1 이합체를 형성한다. 예를들어, 마우스 TNFR1에 대한 IC50은 가용성 TNFR1의 이합체화를 유도하는 리간드의 첨가에 의해 나노몰 범위에서 피코몰 범위로 감소(약 10 또는 약 100 또는 약 1000배의 감소)될 수 있다.

환자에 대한 가용성 수용체 사슬의 이합체화 (또는 삼합체화 또는 소중합체화)를 유도하는 리간드의 투여는 세표 표면에서 발현되는 특정 수용체의 막횡단 형태의 클러스터링(clustering) 및 활성화를 야기할 것이다. 일반적으로, 이러한 활성화 (예를들어, 면역 세포의 활성화)의 요망되지 않는 효과는 이합체화된 가용성 수용체의 개선된 결합 기능 및 효능에 비해 최소화될 것이다. 그럼에도 불구하고, 요망시 이합체화, 삼합체화 또는 소중합체화 리간드와 수용체의 막횡단 형태의 상호작용이 리간드를 본원에 기술된 바와 같이 유체역학적 크기로 증가시키기 위해 포맷화시킴으로써 추가로 감소될 수 있다. 예를들어, 리간드는 PEG 부분 또는 기타 반감기 연장 부분, 예를들어 생체내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 지니는 부분 (예를들어, 혈청 알부민에 결합하는 dAb)을 포함하도록 포맷화될 수 있다. 본원에 나타낸 바와 같이, TNFR1에 결합하는 dAb를 이용하여, dAb의 페길화는 세포 기재 검정에서 TNFR1 활성을 억제하는 dAb의 능력을 극적으로 감소시키나, 이는 생체내에서 가용성 TNFR1에 대한 결합을 위한 조건에 근접하는 수용체 결합 검정에서 TNFR1에 결합하는 dAb의 능력에 거의 영향을 주지 않는다. 이러한 결과는 2개 이상의 dAb를 포함하는 페길화 dAb 및 리간드가 수용체의 막횡단 형태에 비해 가용성 수용체에 대한 dAb의 선택성을 개선시키는 것을 나타낸다.

몇몇 내인성 표적 화합물은 천연적으로 함께 결합하여 활성 이합체, 삼합체 또는 다합체를 형성한다. 따라서, 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분은 내인성 표적 화합물의 단편 또는 일부의 내인성 표적 화합물 그 자체일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분이 내인성 표적 화합물인 경우, 리간드는 내인성 표적 화합물의 활성을 지닐 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 바와 같이 이러한 리간드를 투여하는 것은 내인성 표적 화합물의 반감기를 증가시키고, 생체이용률을 증가시키고, 양을 증가시키고/거나 활성을 증가시킬 수 있고, 리간드 내의 내인성 표적 화합물의 생물학적 활성 형태의 존재로 인해 추가의 내인성 표적 화합물 활성을 제공할 것이다.

기타 구체예에서, 리간드는 내인성 표적 화합물의 일부인 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분을 포함할 수 있다. 예를들어, 내인성 표적 화합물의 일부는 생체내에서 내인성 표적 화합물에 결합하지만 내인성 표적 화합물의 활성(예를들어, 리간드 결합 활성, 수용체 결합 활성, 촉매 활성)을 지니지 않는 일부일 수 있다.

이합체, 삼합체 또는 중합체를 천연적으로 형성하는 내인성 표적 화합물의 예는, 예를들어 성장 인자 (예를들어, A 및 B 사슬의 동종이합체 및 이종이합체를 형성하는 PDGF), 사이토카인 (예를들어, 삼함체를 형성하는 TNF 상과 (예를들어, RANK-L)의 사이토카인), 및 수용체 (예를들어, 삼합체를 형성하는 TNF 수용체 상과의 수용체)를 포함한다. 상기 내인성 표적 화합물의 적절한 일부는 내인성 표적 화합물의 도메인을 형성하는 이합체, 삼합체 또는 중합체의 구조의 지식에 기초하거나, 내인성 표적 화합물의 펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 제조하고, 내인성 표적 화합물에 결합하는 능력에 대해 펩티드 또는 폴리펩티드를 분석 (예를들어, 표면 플라즈몬 공명 또는 임의의 기타 적절한 방법을 이용함)함으로써 용이하게 제작될 수 있다.

생체내의 상응하는 내인성 표적 화합물에 결합하는 내인성 표적 화합물의 일부의 예는 TNF 수용체 상과의 일원의 소위 프레-리간드(pre-ligand) 어셈블리 도메인(PLAD)이다 (참조: WO 01/58953; U.S. Patent Application Publication No. 2003/0108992 Al; Deng et al., Nature Medicine, doi: 10.1038/nml304 (2005)). 특정 수용체로부터의 PLAD 도메인은 생체내에서 서로 결합한다. 예를들어, TNFR1의 PLAD 도메인은 생체내의 TNFR1의 또 다른 PLAD 도메인에 결합할 것이다.

TNF 수용체 상과는 TNFR1 (p55, CD120a, p60, TNF 수용체 상과 일원 1A, TNFRSF1A), TNFR2 (p75, p80, CD120b, TNF 수용체 상과 일원 1B, TNFRSF1B), CD (TNFRSF3, LTβR, TNFR2-RP, TNFR-RP, TNFCR, TNF-R-III), OX40 (TNFRSF4, ACT35, TXGP1L), CD40 (TNFRSF5, p50, Bp50), Fas (CD95, TNFRSF6, APO-1, APTI), DcR3 (TNFRSF6B), CD27 (TNFRSF7, Tp55, S152), CD30 (TNFRSF8, Ki-1, D1S166E), CD137 (TNFRSF9, 4-1BB, ILA), TRAILR-1 (TNFRSF1OA, DR4, Apo2), TRAIL-R2 (TNFRSF1OB, DR5, KILLER, TRICK2A, TRICKB), TRAILR3 (TNFRSF1OC, DcR1, LIT, TRID), TRAILR4 (TNFRSF1OD, DcR2, TRUNDD), RANK (TNFRSF11A), OPG (TNFRSF11B, OCIF, TR1), DR3 (TNFRSF12, TRAMP, WSL-1, LARD, WSL-LR, DDR3, TR3, APO-3), DR3L (TNFRSF12L), TAC1 (TNFRSF13B), BAFFR (TNFRSF13C), HVEM (TNFRSF14, ATAR, TR2, LIGHTR, HVEA), NGFR (TNFRSF16), BCMA (TNFRSF17, BCM), AITR (TNFRSF18, GITR), TNFRSF19, FLJ14993 (TNFRSF19L, RELT), DR6 (TNFRSF21), SOBa (TNFRSF22, Tnfrh2, 2810028K06Rik), mSOB (THFRSF23, Tnfrh1)을 포함하는 단백질의 당 분야에 인지되는 그룹이다.

여러 PLAD 도메인이 당 분야에 공지되어 있고, 기타 PLAD 도메인 및 PLAD 도메인의 변형체가 임의의 적절한 방법, 예를들어 문헌[WO 01/58953; U.S. Patent Application Publication No. 2003/0108992 Al; Deng et al., Nature Medicine, doi: 10.1038/nm1304 (2005)]에 기술된 방법을 이용하여 용이하게 분리되고 제조될 수 있다. 폴리펩티드, 단백질 단편, 및 펩티드 변형체를 제조하기 위한 다수의 적절한 방법 뿐만 아니라 적절한 결합 검정법, 예를들어 본원에 기술된 TNFR1 수용체 결합 검정법이 당 분야에 널리 공지되어 있고, 당 분야에서 통상적이다. 예시적 PLAD 도메인이 표 1에 제시되어 있다.

표 1

몇몇 구체예에서, 리간드는 PLAD, 예를들어 TNFR1, TNFR2, FAS, LTβR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40, DR4 또는 기타 TNF 수용체 상과 일원의 PLAD, 또는 PLAD 도메인의 변형체인 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 부분을 포함한다. PLAD 도메인의 변형체는 TNFR1, TNFR2, FAS, LTβR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40 또는 DR4의 PLAD 도메인일 수 있고, 여기서 하나 이상의 아미노산은 결실되거나, 삽입되거나 치환되지만, TNFR1, TNFR2, FAS, LTβR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40 또는 DR4의 상응하는 PLAD에 결합하는 능력은 보유한다. 변형체 PLAD 도메인의 아미노산 서열은 상응하는 PLAD (예를들어, TNFR1, TNFR2, FAS, LTβR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40, DR4의 PLAD)의 아미노산 서열 내의 아미노산과 동일한 약 10개 이상의 연속적 아미노산, 약 15개 이상의 연속적 아미노산, 약 20개 이상의 연속적 아미노산, 약 25개 이상의 연속적 아미노산, 약 30개 이상의 연속적 아미노산, 약 35개 이상의 연속적 아미노산, 또는 약 40개 이상의 연속적 아미노산의 영역을 포함할 수 있다. 또한, 또는 대안적으로, 변형체 PLAD 도메인의 아미노산 서열은 상응하는 PLAD (예를들어, TNFR1, TNFR2, FAS, LTβR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40 또는 DR4의 PLAD)의 아미노산 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 동일할 수 있다.

PLAD 또는 PLAD 변형체인 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 결합 부분을 포함하는 리간드가 본원에 기술된 바와 같이 포맷화될 수 있다. 예를들어, 리간드는 PLAD 또는 PLAD 변형체의 이합체, 삼합체 또는 중합체, 또는 PLAD 또는 PLAD 변형체 및 반감기 연장 부분 (예를들어, 혈청 알부민 또는 신생아 Fc 수용체에 대한 결합 부위를 지니는 부분)을 포함하는 융합 단백질일 수 있다.

2개 이상의 PLAD 또는 PLAD 변형체 (예를들어, PLAD 이합체, 삼합체, 중합체)를 포함하는 리간드는 2개 이상의 가용성 수용체 사슬에 결합하여 본원에 기술된 바와 같이 가용성 수용체 단량체에 비하여 개선된 결합 기능을 지닐 수 있는 가용성 수용체 이합체, 삼합체 또는 중합체를 형성할 수 있다. 몇몇 상황에서, 이러한 리간드는 가용성 수용체에 결합할 수 있고, 또한 세포 표면에서 발현되는 막횡단 형태의 수용체에 결합할 수 있다. 요망시, 가용성 수용체에 결합하기 위한 선택성은, 예를들어 PEG 부분, 또는 본원에 기술된 기타 반감기 연장 부분을 이용하여 보다 큰 유체역학적 크기를 지니도록 리간드를 포맷화시킴으로써 개선될 수 있다.

특정 구체예에서, 리간드는 PLAD (예를들어, TNFR1, TNFR2, FAS, LTβR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40 또는 DR4의 PLAD) 또는 PLAD 변형체 및 반감기 연장 부분, 예를들어 또는 혈청 알부민 또는 신생아 Fc 수용체에 결합하는 PEG 부분 또는 dAb를 포함한다.

바람직하게는, 가용성 수용체 사슬의 이합체화 (또는 삼합체화 또는 소중합체화)를 유도하는 리간드는 표준 세포 검정에서 세포 표면 또는 막횡단 형태의 수용체를 실질적으로 효능화시키지 않는다 (즉, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1000 μM 또는 5,000 μM의 농도로 존재하는 경우, 상기 검정에서 수용체의 천연 리간드에 의해 약 5% 이하의 수용체 매개 활성이 유도됨).

내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 부분이 높은 친화성, 예를들어 표면 플라즈몬 공명으로 측정시 300 nM 내지 5 pM (즉, 3 x 10^-7 내지 5 x 10^-12M), 바람직하게는 50 nM 내지 20 pM, 더욱 바람직하게는 5 nM 내지 200 pM, 가장 바람직하게는 1 nM 내지 100 pM, 예를들어 1 x 10^-7 M 이하, 바람직하게는 1 x 10^-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 1 x 10^-9 M 이하, 유리하게는 1 x 10^-10 M 이하, 가장 바람직하게는 1 x 10^-11 M 이하의 Kd; 및/또는 5 x 10^-1 s^-1 내지 1 x 10^-7 s^-1, 바람직하게는 1 x 10^-2 s^-1 내지 1 x 10^-6 s^-1, 더욱 바람직하게는 5 x 10^-3 s^-1 내지 1 x 10^-5 s^-1, 예를들어 5 x 10^-1 s^-1 이하, 바람직하게는 1 x 10^-2 s^-1 이하, 유리하게는 1 x 10^-3 s^-1 이하, 더욱 바람직하게는 1 x 10^-4 s^-1 이하, 더욱 더 바람직하게는 1 x 10^-5 s^-1 이하, 가장 바람직하게는 1 x 10^-6 s^-1 이하의 해리(K_off) 속도 상수로 내인성 표적 화합물에 결합하는 것이 바람직하다. 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니고 높은 친화성으로 내인성 표적 화합물에 결합하는 부분은 본원에 기술된 바와 같이 임의의 적절한 리간드 포맷으로 포맷화될 수 있다.

본원에 기술된 리간드의 특징 외에, 리간드는 높은 친화성, 예를들어 표면 플라즈몬 공명으로 측정시 300 nM 내지 5 pM (즉, 3 x 10^-7 내지 5 x 10^-12M), 바람직하게는 50 nM 내지 20 pM, 더욱 바람직하게는 5 nM 내지 200 pM, 가장 바람직하게는 1 nM 내지 100 pM, 예를들어 1 x 10^-7 M 이하, 바람직하게는 1 x 10^-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 1 x 10^-9 M 이하, 유리하게는 1 x 10^-10 M 이하, 가장 바람직하게는 1 x 10^-11 M 이하의 Kd; 및/또는 5 x 10^-1 s^-1 내지 1 x 10^-7 s^-1, 바람직하게는 1 x 10^-2 s^-1 내지 1 x lO^-6 s^-1, 더욱 바람직하게는 5 x 10^-3 s^-1 내지 1 x lO^-5 s^-1, 예를들어 5 X lO^-1 s^-1 이하, 바람직하게는 1 x 10^-2 s^-1 이하, 유리하게는 1 x 10^-3 s^-1 이하, 더욱 바람직하게는 1 x 10^-4 s^-1 이하, 더욱 더 바람직하게는 1 x 10^-5 s^-1 이하, 가장 바람직하게는 1 x 10^-6 s^-1 이하의 해리(K_off) 속도 상수로 내인성 표적 화합물에 결합하는 것이 바람직하다.

특정 구체예에서, 리간드는 내인성 표적 화합물에 결합하는 dAb를 포함한다. 내인성 표적 화합물은, 예를들어 가용성 수용체(예를들어, 가용성 사이토카인 수용체, 가용성 성장 인자 수용체, 가용성 호르몬 수용체), 내인성 수용체 길항제(예를들어, IL-1ra), 효소 및 내인성 효능제(예를들어, 사이토카인, 성장 인자, 호르몬)일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 리간드는 dAb 이합체, 삼합체, 소중합체 또는 중합체일 수 있다.

리간드는 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분을 포함할 수 있고, 여기서 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 상기 부분은 어피바디, SpA 도메인, LDL 수용체 부류 A 도메인, EGF 도메인 및 아비머로 구성된 군으로부터 선택된다. 리간드는 또한 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분을 포함할 수 있고, 여기서 상기 부분은 항체 또는 항체 단편, 예를들어 Fv 단편, 단일 사슬 Fv 단편, 이황화 결합된 Fv 단편, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, 디아바디, 면역글로불린 단일 가변 도메인(예를들어, 인간 V_H, 인간 V_L, V_HH)이다.

요망시, 리간드는 본원에 기술된 반감기 연장 부분을 추가로 포함할 수 있다. 예를들어, 리간드는 폴리알킬렌 글리콜 부분, 혈청 알부민 또는 이의 단편, 트랜스페린 수용체 또는 이의 트랜스페린 결합 부분, 또는 생체내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함하는 부분으로 구성된 군으로부터 선택된 반감기 연장 부분을 포함할 수 있다. 생체내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부분을 포함하는 적절한 부분은 어피바디, SpA 도메인, LDL 수용체 부류 A 도메인, EGF 도메인, 아비머, 항체 또는 항체 단편, 예를들어 Fv 단편, 단일 사슬 Fv 단편, 이황화 결합된 Fv 단편, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, 디아바디, 및 면역글로불린 단일 가변 도메인(예를들어, 인간 V_H, 인간 V_L, V_HH)을 포함한다.

본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 리간드는 이들이 결합하는 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는다. 그러나, 표적이 하나를 초과하는 활성(예를들어, 결합 활성 및 신호전달 활성)을 지니는 경우, 리간드는 소기의 치료 활성 또는 이점과 관련되지 않는 활성을 억제할 수 있다. 예를들어, 리간드 또는 dAb 단량체는 가용성 수용체에 결합할 수 있고, 막횡단 형태의 수용체에 결합할 수도 있다. 이러한 상황에서, 막횡단 형태의 수용체는 리간드-결합 활성을 지닐 수 있고, 신호전달 활성을 지닐 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 리간드는 리간드에 의해 유도되는 과정을 억제하는 리간드 결합 활성(가용성 및 막횡단 형태의 수용체의 리간드 결합 활성)을 억제하지 않지만, 막횡단 형태의 수용체의 신호전달 활성을 억제할 것이다.

본 발명의 추가 예시를 위해, 가용성 TNFR1에 결합하는 리간드의 예시적 구체예가 하기 기술된다. 가용성 TNFR1에 결합하는 리간드의 구체예는 기타 수용체에 결합하는 본 발명의 리간드의 예시가 된다.

TNFR1은 리간드, 및 내재성 신호전달 활성이 결핍되어 있으나 신호전달 물질과 회합될 수 있는 세포내 도메인과 결합하는 세포외 영역을 함유하는 막횡단 수용체이다. TNF와 결합된 TNFR1의 복합체는 3개의 TNFR1 사슬 및 3개의 TNF 사슬을 함유한다 (Banner et al., Cell, 73(3) 431-445 (1993). TNF 리간드는 3개의 TNFR1 사슬에 의해 결합된 삼합체로 존재한다. 3개의 TNFR1 사슬은 수용체-리간드 복합체에서 함께 밀접하게 클러스터링되어 있고, 이러한 클러스터링은 TNFR1에 의해 매개된 신호전달에 대해 필수적이다. 사실, TNFR1에 결합하는 다가 작용제, 예를들어 항-TNFR1 항체는 TNF의 부재하에서 TNFR1 클러스터링 및 신호전달을 유도할 수 있고, 통상적으로 TNFR1 효능제로 사용된다 (참조: Belka et al., EMBO, 14(6):1 156-1165 (1995); Mandik-Nayak et al., J. Immunol, 167:1920-1928 (2001). 따라서, TNFR1에 결합하는 다가 작용제는 일반적으로 이들이 TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 차단하더라도 TNFR1의 효과적인 길항제는 아니다.

TNFR1의 세포외 영역은 막-근위 영역 (SEQ ID NO:2의 아미노산 168-182 (인간); SEQ ID NO:4의 아미노산 168-183 (마우스))에 후속하는 13개 아미노산의 아미노 말단 분절 (SEQ ID NO:2의 아미노산 1-13 (인간); SEQ ID NO:4의 아미노산 1-13 (마우스)), 도메인 1 (SEQ ID NO:2의 아미노산 14-53 (인간); SEQ ID NO:4의 아미노산 14-53 (마우스)), 도메인 2 (SEQ ID NO:2의 아미노산 54-97 (인간); SEQ ID NO:4의 아미노산 54-97 (마우스)), 도메인 3 (SEQ ID NO:2의 아미노산 98-138 (인간); SEQ ID NO:4의 아미노산 98-138 (마우스)), 및 도메인 4 (SEQ ID NO:2의 아미노산 139-167 (인간); SEQ ID NO:4의 아미노산 139-167 (마우스))을 포함한다 (참조: Banner et al., Cell 73(3) 431-445 (1993) and Loetscher et al., Cell 61(2) 351-359 (1990)). 도메인 2 및 3은 결합 리간드 (TNFβ, TNFα)와 접촉한다 (Banner et al., Cell, 73(3) 431-445 (1993)). TNFR1의 세포외 영역은 또한 프레-리간드 결합 어셈블리 도메인 또는 PLAD 도메인으로 언급되는 영역 (SEQ ID NO:2의 아미노산 1-53 (인간); SEQ ID NO:4의 아미노산 1-53 (마우스))을 함유한다 (The Government of the USA, WO 01/58953; Deng et al., Nature Medicine, doi: 10.1038/nm1304 (2005)).

TNFR1은 도메인 4 및 막-근위 영역 (SEQ ID NO:2의 아미노산 168-182; SEQ ID NO:4의 아미노산 168-183)에서 TNFR1이 단백질 분해되어 TNFR1의 가용성 형태를 생성하는 단계를 통해 생체내에서 세포의 표면으로부터 쉐딩(shedding)된다. 가용성 TNFR1은 TNFα에 결합하는 능력을 지니고, 이에의해 TNFα의 활성의 내인성 억제제로서 작용한다.

몇몇 구체예에서, 가용성 TNFR1에 결합하는 리간드 또는 dAb 단량체는 또한 막횡단 TNFR1에 결합할 수 있고, 세포 표면 상에서 TNFα에 의해 유도된 TNFR1의 클러스터링을 억제할 수 있고, 이는 수용체를 통한 신호 전달에 선행하지만, 막횡단 TNFR1 및 가용성 TNFR1에 대한 TNFa의 결합을 억제하지 않는다.

특정 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 가용성 및 막횡단 형태의 TNFR1의 TNF 결합 활성을 억제하지 않지만, TNFR1의 신호전달 활성을 억제할 수 있다. 이러한 유형의 리간드 또는 dAb 단량체는 TNFR1의 도메인 1 또는 도메인 4에 결합할 수 있다. 이러한 리간드 또는 dAb 단량체는 가용성 TNFR1 및 막횡단 TNFR1에 결합할 수 있으나, 상기 두 형태의 TNFR1의 TNF 결합 활성을 억제하지 않는다. 따라서, 이러한 리간드 또는 dAb가, 예를들어 가용성 TNFR1의 반감기를 연장시키거나 가용성 TNFR1의 결합 활성을 향상시키기 위해 투여될 수 있다. 따라서, 이러한 리간드 또는 dAb를 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 것은 치료 목적을 위해 세포 표면 TNFR1의 활성을 억제하는 내인성 조절 경로를 이용하고 활용할 수 있다.

기타 구체예에서, 본 발명은 기타 가용성 수용체에 결합하지만, 가용성 수용체에 대한 내인성 리간드의 결합을 억제하지 않는 유사한 리간드 및 dAb 단량체를 제공한다.

더욱 특정한 구체예에서, 리간드는 TNFR1의 도메인 1에 결합하고, 마우스 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2m-21-23과 경쟁하거나 인간 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2h-205와 경쟁하는 dAb를 포함한다. 더욱 특정한 구체예에서, 리간드는 상기 dAb의 이합체이고, 요망시 PEG 부분을 추가로 포함한다.

특정 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 실질적으로 응집에 대해 내성이다. 예를들어, 몇몇 구체예에서, 약물 제조에 통상적으로 사용되는 용매, 예를들어 염수, 완충 염수, 시트레이트 완충 염수, 물, 에멀젼 및 FDA에 의해 승인된 허용되는 부형제를 지닌 임의의 상기 용매중에 1-5 mg/ml, 5-10 mg/ml, 10-20 mg/ml, 20-50 mg/ml, 50-100 mg/ml, 100-200 mg/ml 또는 200-500 mg/ml의 리간드 또는 dAb의 용액이, 예를들어 10분, 1시간, 8시간, 24 시간, 2일, 3일, 4일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 6개월, 1년 또는 2년의 기간 동안 22℃, 22-25℃, 25-30℃ 30-37℃, 37-40℃, 40-50℃, 50-60℃, 60-70℃, 70-80℃, 15-2O℃, 10-15℃, 5-1O℃, 2-5℃, 0-2℃, -1O℃ 내지 O℃, -2O℃ 내지 -1O℃, -4O℃ 내지 -2O℃, -6O℃ 내지 -4O℃ 또는 -8O℃ 내지 -6O℃에서 유지되는 경우에, 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하 또는 약 1% 이하의 리간드 또는 dAb 단량체가 응집된다.

응집은 임의의 적절한 방법, 예를들어 현미경, 시각적 관찰 또는 분광학에 의한 용액의 혼탁도 측정, 또는 임의의 적절한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 바람직하게는, 응집은 동적광산란법으로 측정된다. 응집에 대해 내성인 리간드 또는 dAb 단량체는 여러 이점을 제공한다. 예를들어, 이러한 리간드 또는 dAb 단량체는 적절한 생물학적 생성 시스템, 예를들어 대장균(E. coli)을 이용한 발현에 의해 가용성 단백질로서 높은 수율로 용이하게 생성될 수 있고, 보다 적은 응집성 및 적은 활성 손실로 통상적인 폴리펩티드 보다 높은 농도로 포뮬레이팅되고/되거나 저장될 수 있다.

또한, 응집에 내성인 리간드 또는 dAb 단량체는 기타 항원 결합 폴리펩티드 또는 에피토프 결합 폴리펩티드 (예를들어, 통상적인 항체) 보다 경제적으로 생성될 수 있다. 예를들어, 일반적으로, 생체내 적용을 위한 항원 결합 폴리펩티드 또는 에피토프 결합 폴리펩티드의 제조는 응집된 폴리펩티드를 제거하는 과정 (예를들어, 젤 여과)을 포함한다. 이러한 응집물 제거의 불이행은 생체내 적용에 적합하지 않은 제조물을 생성시킬 수 있는데, 이는 예를들어 길항제로 작용시키기 위한 항원 결합 폴리펩티드의 응집물이 표적 항원의 가교 또는 클러스터링을 유도시킴으로써 효능제로 작용할 수 있기 때문이다. 단백질 응집물은 또한 이들이 투여되는 피검체에서 면역 반응을 유도함으로써 치료 폴리펩티드의 효능을 감소시킬 수 있다.

대조적으로, 본 발명의 응집 내성 리간드 또는 dAb 단량체는 응집물을 제거하는 공정 단계를 포함하지 않고 생체내 적용을 위해 제조될 수 있고, 폴리펩티드 응집에 의해 야기되는 상술한 불이익 없이 생체내에 적용될 수 있다.

몇몇 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 온도 (Ts)로 가열되고 온도 (Tc)로 냉각되는 경우 가역적으로 언폴딩되고, 여기서 Ts는 dAb의 용융 온도 (Tm)를 초과하는 온도이고, Tc는 dAb의 용융 온도 미만의 온도이다. 예를들어, dAb 단량체는 80℃로 가열되고, 대략 실온으로 냉각되는 경우 가역적으로 언폴딩된다. 가역적으로 언폴딩된 폴리펩티드는 기능을 상실하나, 재폴딩되는 경우 기능을 회복한다. 이러한 폴리펩티드는 언폴딩되거나 부적절하게 재폴딩 (잘못 폴딩된 폴리펩티드)되는 경우 응집되는 폴리펩티드 (즉, 기능을 회복하지 않음)와는 구별된다.

폴리펩티드 언폴딩 및 재폴딩은, 예를들어 임의의 적절한 방법을 이용하여 폴리펩티드 구조를 직접적 또는 간접적으로 검출함으로써 측정될 수 있다. 예를들어, 폴리펩티드 구조는 원형 광이색성 (CD) (예를들어, 파(far)-UV CD, 니어(near)-UV CD), 형광 (예를들어, 트립토판 측쇄의 형광), 단백질 분해에 대한 민감성, 핵자기공명(NMR)에 의하거나, 적당한 폴딩 (예를들어, 표적 리간드에 대한 결합, 일반 리간드에 대한 결합)에 따른 폴리펩티드 기능을 검출하거나 측정함으로써 검출될 수 있다. 한 구체예에서, 폴리펩티드 언폴딩은 결합 기능 (예를들어, 일반 및/또는 표적 리간드 결합, 기질 결합)의 손실이 폴리펩티드가 언폴딩됨을 나타내는 기능 분석을 이용함으로써 측정된다.

리간드 또는 dAb 단량체의 언폴딩 및 재폴딩 범위는 언폴딩 또는 변성 곡선을 이용하여 결정될 수 있다. 언폴딩 곡선은 세로좌표로서 온도 및 가로좌표로서 폴딩된 폴리펩티드의 상대 농도를 작도함으로써 생성될 수 있다. 폴딩된 리간드 또는 dAb 단량체의 상대 농도는 임의의 적합한 방법 (예를들어, CD, 형광, 결합 분석)을 이용하여 직접 또는 간접적으로 결정될 수 있다. 예를들어, 리간드 또는 dAb 단량체 용액이 제조될 수 있고, 상기 용액의 타원율은 CD에 의해 결정된다. 수득된 타원율 값은 100%의 폴딩된 리간드 또는 dAb 단량체의 상대 농도를 나타낸다. 이후, 용액 내의 리간드 또는 dAb 단량체는 용액의 증진적인 온도 상승에 의해 언폴딩되고, 타원율은 적합한 증가량 (예를들어, 각각 1℃의 온도증가 후)에서 결정된다. 이후, 용액 내의 리간드 또는 dAb 단량체는 용액의 증진적인 온도 감소에 의해 재폴딩되고, 타원율은 적합한 증가량에서 결정된다. 데이터는 작도되어 언폴딩 곡선 및 재폴딩 곡선이 생성될 수 있다. 언폴딩 및 재폴딩 곡선은 리간드 또는 dAb 단량체 분자가 폴딩되는 부분, 리간드 또는 dAb 단량체 분자가 다양한 정도로 언폴딩되는 언폴딩/재폴딩 변이, 및 리간드 또는 dAb 단량체 분자가 언폴딩 되는 부분을 포함하는 특징적인 S자 형태를 지닌다. 재폴딩 곡선의 y-축 절편은 회복된 재폴딩된 리간드 또는 dAb 단량체의 상대량이다. 약 50% 이상, 또는 약 60% 이상, 또는 약 70% 이상, 또는 약 75% 이상, 또는 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상의 회복은 리간드 또는 dAb 단량체가 가역적으로 언폴딩됨을 나타낸다.

한 바람직한 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체의 언폴딩의 가역성은 리간드 또는 dAb 단량체 용액을 제조하고, 가열 언폴딩 및 재폴딩 곡선을 작도함으로써 결정된다. 리간드 또는 dAb 단량체 용액은 임의의 적합한 용매, 예를들어 리간드 또는 dAb 단량체가 용해되기에 적합한 pH (예를들어, 약 3 유닛 초과 또는 등전점 (pi) 미만인 pH)를 지니는 수성 수성 완충용액에서 제조될 수 있다. 리간드 또는 dAb 단량체 용액은 언폴딩/재폴딩이 검출되기에 충분하도록 농축된다. 예를들어, 리간드 또는 dAb 리간드 용액은 약 0.1 μM 내지 약 100 μM, 또는 바람직하게는 약 1 μM 내지 약 10 μM일 수 있다.

리간드 또는 dAb 단량체의 용융 온도 (Tm)가 공지되어 있는 경우, 용액은 Tm 에서 약 10℃ 이하 (Tm-10)로 가열될 수 있고, 폴딩이 타원율 또는 형광 (예를들어, 235 nm 내지 225 nm에서의 파장 CD로 고정된 200 nm 내지 250 nm의 파-UV CD 스캔; 298 nm에서의 여기와 함께 300 내지 450 nm에서의 트립토판 형광 방출 스펙트럼)에 의해 측정되어 100%의 상대적으로 폴딩된 리간드 또는 dAb 단량체를 제공할 수 있다. 이후, 용액은 소정의 증진 (예를들어, 약 0.1 내지 약 1℃의 증가)으로 Tm 에서 약 10℃ 이상 (Tm+10)으로 가열되고, 타원율 또는 형광이 각각의 증진에서 결정된다. 이후, 리간드 또는 dAb 단량체는 소정의 증진으로 TM-10 이상으로 냉각됨으로써 재폴딩되고, 타원율 또는 형광이 각각의 증진에서 결정된다. 리간드 또는 dAb 단량체의 용융 온도가 공지되어 있지 않은 경우, 용액은 약 25℃ 내지 약 100℃로 점진적으로 가열되어 언폴딩된 후, 약 25℃ 이상으로 점진적으로 냉각됨으로써 재폴딩될 수 있고, 각각의 가열 및 냉각 증가에서의 타원율 또는 형광이 결정된다. 수득된 데이터는 작도되어 언폴딩 곡선 및 재폴딩 곡선의 y-축이 회수된 재폴딩 단백질의 상대량인 재폴딩 곡선이 생성될 수 있다.

리간드 또는 dAb 단량체는 임의의 적합한 면역글로불린 가변 도메인을 포함할 수 있고, 바람직하게는 인간 가변 도메인 또는 인간 프레임워크 영역을 포함하는 가변 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, dAb 단량체는 본원에 기술된 유니버셜 프레임워크를 포함한다.

유니버셜 프레임워크는 V_L 프레임워크 (V_λ 또는 V_κ), 예를들어 인간 점라인 DPK1, DPK2, DPK3, DPK4, DPK5, DPK6, DPK7, DPK8, DPK9, DPK1O, DPK12, DPK13, DPK15, DPK16, DPK18, DPK19, DPK20, DPK21, DPK22, DPK23, DPK24, DPK25, DPK26 또는 DPK 28 면역글로불린 유전자 분절에 의해 엔코딩된 프레임워크 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크일 수 있다. 요망되는 경우, V_L 프레임워크는 인간 점라인 J_κ1, J_κ2, J_κ3, J_κ4 또는 J_κ5 면역글로불린 유전자 분절에 의해 엔코딩된 프레임워크 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.

기타 구체예에서, 유니버셜 프레임워크는 V_H 프레임워크, 예를들어 인간 점라인 DP4, DP7, DP8, DP9, DP1O, DP31, DP33, DP38, DP45, DP46, DP47, DP49, DP50, DP51, DP53, DP54, DP65, DP66, DP67, DP68 또는 DP69 면역글로불린 유전자 분절에 의해 엔코딩된 프레임워크 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크일 수 있다. 요망되는 경우, V_H 프레임워크는 인간 점라인 J_H1, J_H2, J_H3, J_H4, J_H4b, J_H5 및 J_H6 면역글로불린 유전자 분절에 의해 엔코딩된 프레임워크 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.

특정 구체예에서, dAb 단량체 리간드는 DPK9 V_L 프레임워크, 또는 DP47, DP45 및 DP38로 구성된 군으로부터 선택된 V_H 프레임워크를 포함한다.

dAb 단량체는 일반 리간드, 예를들어 단백질 A, 단백질 L 및 단백질 G에 대한 결합 부위를 포함할 수 있다.

특정 구체예에서, dAb 단량체는 인간 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열, 또는 인간 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열에 비해 5개 이하의 아미노산 서열 차이를 집합적으로 포함하는 하나 이상의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 프레임워크 영역을 포함한다.

기타 구체예에서, dAb 단량체의 FW1, FW2, FW3 및 FW4의 아미노산 서열은 인간 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열, 또는 인간 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열에 비해 10개 이하의 아미노산 차이를 집합적으로 함유하는 FW1, FW2, FW3 및 FW4의 아미노산 서열과 동일하다.

기타 구체예에서, dAb 단량체는 FW1, FW2 및 FW3 영역을 포함하고, 상기 FW1, FW2 및 FW3 영역의 아미노산 서열은 인간 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일하다.

몇몇 구체예에서, dAb 단량체는 카멜리드 면역글로불린 가변 도메인, 또는 카멜리드 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 면역글로불린 가변 도메인에 대해 유일무이한 하나 이상의 프레임워크 아미노산을 포함하지 않는다.

특정 구체예에서, 본 발명의 리간드(예를들어, dAb 단량체)는 유효량이 투여되는 경우 질병 모델에 효과적이다. 일반적으로, 유효량은 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg (예를들어, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg 또는 약 10 mg/kg)이다. 다수의 적절한 질병 모델이 존재한다. 본원에 기술된 만성 염증 질병 모델은 인간에게 있어서 예보적인 치료 효능과 같이 당업자에 의해 인지된다. 종래 분야는 이러한 모델에서 내인성 표적 화합물, 예를들어 가용성 사이토카인 수용체(예를들어, 가용성 TNFR1)에 결합하는 부분을 포함하는 리간드를 이용하거나, 이들이 유효할 것이라는 것을 암시하지 않았다.

특정 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 표준 마우스의 콜라겐에 의해 유발된 관절염 모델에 유효하다. 예를들어, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 표준 마우스의 콜라겐에 의해 유발된 관절염 모델에서 4개의 사지의 합산의 평균 관절염 스코어를 적절한 대조군에 비해, 예를들어 약 1 내지 약 16, 약 3 내지 약 16, 약 6 내지 약 16, 약 9 내지 약 16 또는 약 12 내지 약 16으로 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 표준 마우스의 콜라겐에 의해 유발된 관절염 모델에서 관절염의 증상의 발병을 적절한 대조군에 비해, 예를들어 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 21일 또는 약 28일 지연시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 표준 마우스의 콜라겐에 의해 유발된 관절염 모델에서 0 내지 약 3, 약 3 내지 약 5, 약 5 내지 약 7, 약 7 내지 약 15, 약 9 내지 약 15, 약 10 내지 약 15, 약 12 내지 약 15 또는 약 14 내지 약 15의 4개의 사지의 합산의 평균 관절염 스코어를 생성시킬 수 있다.

기타 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 마우스의 ΔARE 모델의 관절염에 효과적이다(Kontoyiannis et al., J Exp Med 196: 1563-74 (2002)). 예를들어, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 마우스의 ΔARE 모델의 관절염에서 평균 관절염 스코어를 적절한 대조군에 비해, 예를들어 약 0.1 내지 약 2.5, 약 0.5 내지 약 2.5, 약 1 내지 약 2.5, 약 1.5 내지 약 2.5, 또는 약 2 내지 약 2.5로 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 마우스 ΔARE 모델의 관절염에서 관절염 증상의 발병을 적절한 대조군에 비해, 예를들어 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 21일 또는 약 28일 지연시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 마우스의 ΔARE 모델의 관절염에서 0 내지 약 0.5, 약 0.5 내지 약 1, 약 1 내지 약 1.5, 약 1.5 내지 약 2, 또는 약 2 내지 약 2.5의 평균 관절염 스코어를 생성시킬 수 있다.

기타 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 마우스의 ΔARE 모델의 염증성 장질병 (IBD)에 효과적이다(Kontoyiannis et al., J Exp Med 196: 1563-74 (2002)). 예를들어, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 마우스의 ΔARE 모델의 IBD에서 평균 급성 및/또는 만성 염증 스코어를 적절한 대조군에 비해, 예를들어 약 0.1 내지 약 2.5, 약 0.5 내지 약 2.5, 약 1 내지 약 2.5, 약 1.5 내지 약 2.5, 또는 약 2 내지 약 2.5 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 마우스의 ΔARE 모델의 IBD에서 IBD 증상의 발병을 적절한 대조군에 비해, 예를들어 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 21일 또는 약 28일 지연시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 마우스의 ΔARE 모델의 IBD에서 0 내지 약 0.5, 약 0.5 내지 약 1, 약 1 내지 약 1.5, 약 1.5 내지 약 2, 또는 약 2 내지 약 2.5의 평균 급성 및/또는 만성 염증 스코어를 생성시킬 수 있다.

기타 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 마우스의 덱스트란 설페이트 나트륨 (DSS)에 의해 유발된 모델의 IBD에 효과적이다(참조: Okayasu I. et al., Gastroenterology 95:694-702 (1990); Fodolsky K., J Gasteroenterol 38 suppl XV:63-66 (2003)). 예를들어, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 마우스의 DSS 모델의 IBD에서 평균 중증도 스코어를 적절한 대조군에 비해, 예를들어 약 0.1 내지 약 2.5, 약 0.5 내지 약 2.5, 약 1 내지 약 2.5, 약 1.5 내지 약 2.5, 또는 약 2 내지 약 2.5로 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 마우스의 DSS 모델의 IBD에서 IBD 증상의 발병을 적절한 대조군에 비해, 예를들어 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 21 일, 또는 약 28일 지연시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 마우스의 DSS 모델의 IBD에서 0 내지 약 0.5, 약 0.5 내지 약 1, 약 1 내지 약 1.5, 약 1.5 내지 약 2, 또는 약 2 내지 약 2.5의 평균 중증도 스코어를 생성시킬 수 있다.

특정 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 마우스의 담배 연기 모델의 만성 폐쇄폐병 (COPD)에 효과적이다 (참조: Wright and Churg, Chest, 122:301-306 (2002), Groneberg, DA et al., Respiratory Research 5:18 (2004), Coffman RL et al., J. Exp. Med. 201(12):1875-1879 (2001), Van Scott, MR et al., J. App. Physiol. 96:1433-1444 (2004)).

추가 구체예에서, dAb 단량체의 리간드는 동물 모델의 천식(참조: Coffman RL et al., J. Exp. Med. 201(12):1875-1879 (2001); Van Scott, MR et al., J. App. Physiol. 96:1433-1444 (2004)), 폐 섬유증 (예를들어, Venkatesan, N et al., Lung 287:1342-1347 (2004)), 전신홍반루푸스 (SLE) (Knight et al. (1978) J. Exp. Med., 147: 1653; Reinersten et al. (1978) New Eng. J. Med., 299: 515), 중증근무력증 (Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol., 42: 233), 관절염 (Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233; Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171), 갑상선염 (Maron et al. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115), 인슐린의존당뇨병 (IDDM) (Kanasawa et al. (1984) Diabetologia, 27: 113), 및 EAE 모델의 다발성경화증 (참조: Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al., eds., Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; McFarlin et al., (1973) Science, 179: 478: and Satoh et al. (1987) J. Immunol., 138: 179)에 효과적이다.

바람직하게는, 리간드 또는 dAb 단량체는 대장균(E. coli) 또는 피키아 종 (예를들어, P. 파스토리스)에서 발현되는 경우 약 0.5 mg/L 이상의 양으로 분비된다. 기타 바람직한 구체예에서, dAb 단량체는 대장균(E. coli) 또는 피키아 종 (예를들어, P. 파스토리스)에서 발현되는 경우 약 0.75 mg/L 이상, 약 1 mg/L 이상, 약 4 mg/L 이상, 약 5 mg/L 이상, 약 10 mg/L 이상, 약 15 mg/L 이상, 약 20 mg/L 이상, 약 25 mg/L 이상, 약 30 mg/L 이상, 약 35 mg/L 이상, 약 40 mg/L 이상, 약 45 mg/L 이상, 또는 약 50 mg/L 이상, 또는 약 100 mg/L 이상, 또는 약 200 mg/L 이상, 또는 약 300 mg/L 이상, 또는 약 400 mg/L 이상, 또는 약 500 mg/L 이상, 또는 약 600 mg/L 이상, 또는 약 700 mg/L 이상, 또는 약 800 mg/L 이상, 약 900 mg/L 이상, 또는 약 lg/L 이상의 양으로 분비된다. 기타 바람직한 구체예에서, dAb 단량체는 대장균(E. coli) 또는 피키아 종 (예를들어, P. 파스토리스)에서 발현되는 경우 약 1 mg/L 이상 내지 약 lg/L 이상, 약 1 mg/L 이상 내지 약 750 mg/L 이상, 약 100 mg/L 이상 내지 약 1 g/L 이상, 약 200 mg/L 이상 내지 약 1 g/L 이상, 약 300 mg/L 이상 내지 약 1 g/L 이상, 약 400 mg/L 이상 내지 약 1 g/L 이상, 약 500 mg/L 이상 내지 약 lg/L 이상, 약 600 mg/L 이상 내지 약 1 g/L 이상, 약 700 mg/L 이상 내지 약 1 g/L 이상, 약 800 mg/L 이상 내지 약 lg/L 이상, 또는 약 900 mg/L 이상 내지 약 lg/L 이상의 양으로 분비된다. 비록, 대장균(E. coli) 또는 피키아 종 (예를들어, P. 파스토리스)에서 발현되는 경우 본원에 기술된 리간드 및 dAb 단량체는 분비될 수 있으나, 이들은 대장균(E. coli) 또는 피키아 종을 사용하지 않는 임의의 적절한 방법, 예를들어 합성 화학 방법 또는 생물학적 생성 방법을 이용하여 생성될 수 있다.

기타 구체예에서, 리간드는 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를들어 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편 또는 Fv 단편 (예를들어, scFV)이다. 기타 구체예에서, 길항제 또는 리간드는 1가, 예를들어 dAb 또는 항체의 1가 항원 결합 단편, 예를들어 Fab 단편, Fab' 단편 또는 Fv 단편이다.

본원을 통해 기술된 본원의 기타 구체예에서, 본 발명의 리간드에서 "dAb"를 사용하는 것 대신, 당업자는 내인성 표적 화합물에 결합하는 dAb의 CDR을 포함하는 도메인 (예를들어, CDR이 적합한 단백질 스캐폴드 또는 골격, 예를들어 어피바디, SpA 스캐폴드, LDL 수용체 부류 A 도메인 또는 EGF 도메인에 이식된 것)을 사용할 수 있거나, TNFR1에 대한 결합 부위를 포함하는 단백질 도메인을 사용할 수 있다는 것이 고려되고, 여기서 도메인은 어피바디, SpA 도메인, LDL 수용체 부류 A 도메인 또는 EGF 도메인으로부터 선택된다. 따라서, 전체적인 기술은 길항제, 리간드 및 dAb 대신 상기 도메인을 사용하는 방법의 기술을 제공하는 것으로 해석되어진다. 또한, 본 발명의 리간드는 본원에 기술된 바와 같이 포맷화(예를들어, 연장된 반감기 포맷)될 수 있다.

내인성 표적 화합물에 결합하는 리간드의 용도 및 치료 방법

본 발명은 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니지만 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 부분(예를들어, dAb)을 포함하는 리간드에 관한 것이다. 바람직하게는, 리간드는 내인성 표적 화합물의 활성 부위에 결합하지 않는다. 본 발명의 리간드의 추가 특징이 본원에 기술되어 있다. 간결하게 하고 중복을 피하기 위해, 리간드의 모든 기술된 특징을 본 발명의 용도 및 방법과 관련하여 특이적으로 기술하지 않는다. 본 발명의 용도 및 방법은 본원에 기술된 임의의 리간드를 투여하는 것을 포함하는 용도 및 방법을 포함한다.

본 발명은 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부분을 지니지만, 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 부분(예를들어, dAb), 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 리간드 또는 조성물을 사용하는 치료 및 진단 방법에 관한 것이다. 본원에 기술된 리간드는 생체내 치료 및 예방 적용, 생체내 진단 적용 등에 사용될 수 있다.

예를들어, 본 발명의 리간드(예를들어, dAb 단량체)는 통상적으로 질병(예를들어, 급성 및/또는 만성 염증 질병)을 예방하거나, 억제하거나, 치료하는데 사용될 것이다. 예를들어, 길항제 및/또는 리간드는 염증 질병 (예를들어, 급성 및/또는 만성 염증), 암 및 신생물 (예를들어, 림프종 (예를들어, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 급성 골수 림프종), 다발성 골수종, 폐암, 암종), 대사병 (예를들어, 당뇨병, 비만), 알레르기 과민성, 박테리아 또는 바이러스 감염, 자가면역 장애 (타입 Ⅰ 당뇨병, 천식, 다발성 경화증, 관절염(예를들어, 류마티스 관절염, 유년기 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 척추관절병증(예를들어, 강직성 척추염)을 포함하나, 이에 제한되지 않음), 전신홍반루푸스, 염증성 장질병(예를들어, 크론병, 궤양성 대장염), 중증근무력증 및 베체트 증후군, 건선, 자궁내막증, 복부 유착(예를들어, 복부 수술후 유착), 골관절염, 만성 폐쇄폐병, 또는 내인성 표적 화합물을 이용하여 치료가능한 기타 질병을 치료하거나, 억제하거나 예방하기 위해 투여될 수 있다.

즉각적인 적용에서, 용어 "예방"은 질병의 도입 전에 보호적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. "억제"는 유도 결과 후이지만, 질병의 임상 외간 전에 조성물의 투여를 의미한다. "치료"는 질병 증상이 명백해진 후의 보호적 조성물의 투여를 포함한다.

본 발명은 이로운 효과(예를들어, 치료적으로 이로운 효과, 진단적으로 이로운 효과)를 생성하기 위해 내인성 화합물의 이로운 활성을 이용하고 활용하기 위해 환자에게 투여될 수 있는 약제의 제조에 있어서, 본원에 기술된 리간드의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은, 예를들어 피검체에서 상기 내인성 표적 화합물의 양(예를들어, 전신 순환의 내인성 표적 화합물의 양, 특정 부위, 예를들어 특정 기관, 조직 또는 영역(예를들어, 관절, 폐, 근육, 피부 부위, CNS)에서의 양)을 증가시키기 위한 약제, 피검체의 상기 내인성 표적 화합물의 (예를들어, 전신적으로 또는 요망되는 작용 부위(예를들어, 관절, 폐, 근육, 피부 부위, CNS)에서의) 생체이용률을 증가시키기 위한 약제, 상기 내인성 표적 화합물의 생체내 반감기를 증가시키기 위한 약제, 또는 내인성 표적 화합물을 이용하여 치료가능한 질병(예를들어, 본원에 기술된 질병)을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 리간드의 용도에 관한 것이다. 약제는 전신 또는 국소 투여될 수 있다.

본 발명은 피검체의 내인성 표적 화합물의 반감기를 증가시키기 위한 약제의 제조에 있어서 상기 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 용도에 관한 것이다.

약제는, 예를들어 내인성 표적 화합물에 결합하여 내인성 표적 화합물의 유체역학적 크기를 증가시킴으로써, 또는 내인성 표적 화합물을 안정화시킴으로써, 또는 내인성 표적 화합물에 결합하여 이의 제거 또는 물질 대사 속도를 감소시킴으로써 리간드가 결합하는 내인성 표적 화합물의 반감기를 증가시키기 위해 환자에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 리간드는 리간드의 부재하에서의 내인성 표적 화합물의 반감기에 비해 약 1.5배 이상, 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 또는 약 10배 이상으로 리간드가 결합하는 내인성 표적 화합물의 반감기를 증가시킬 것이다. 예를들어, 내인성 표적 화합물은 약 1시간의 반감기를 지닐 수 있고, 상기 내인성 표적 화합물에 결합하는 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 투여후, 내인성 표적 화합물의 반감기는 약 1.5 시간, 약 10시간 또는 이 이상으로 증가될 수 있다.

본 발명은 피검체의 내인성 표적 화합물의 양을 증가시키기 위한 약제의 제조에 있어서, 상기 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 용도에 관한 것이다.

내인성 표적 화합물의 수준 또는 양은, 예를들어 리간드의 반감기 증가 효과로 인해, 본원에 기술된 바와 같은 리간드의 투여 후에 증가할 수 있다. 예를들어, 본 발명의 리간드의 투여후 1시간, 또는 2시간, 또는 3시간, 또는 4시간, 또는 5시간, 또는 6시간, 또는 7시간, 또는 8시간, 또는 9시간, 또는 10시간, 또는 11시간, 또는 12시간, 또는 1일 후의 내인성 표적 리간드(예를들어, 혈청 내의 리간드)의 수준 또는 양은 약 1.5배 이상, 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 10배 이상, 약 50배 이상, 약 100배 이상, 약 500배 이상, 약 1,000배 이상, 약 5,000배 이상, 약 10,000배 이상, 약 50,000배 이상, 또는 약 100,000배 이상으로 증가될 수 있다. 내인성 표적 화합물의 증가 수준 또는 양은 임의의 적절한 방법을 이용하여 용이하게 검출될 수 있다. 예를들어, 적절한 샘플(예를들어, 혈청)이 리간드의 투여 전 또는 투여 후 하나 이상의 시점에서 수득될 수 있고, 샘플 내의 내인성 표적 화합물의 수준 또는 양이 임의의 적절한 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 샘플은, 예를들어 혈액, 혈청, 뇌척수액, 윤활액, 기관지 폐포 세척액, 관장제 또는 생검의 샘플일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 샘플 내의 리간드의 양 또는 수준은 리간드 투여 전의 양 또는 수준에 비해 증가된다.

본 발명은 피검체의 내인성 표적 화합물의 생체이용률을 증가시키기 위한 약제의 제조에 있어서 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 용도에 관한 것이다.

약제는 내인성 표적 화합물의 생체이용률을 증가시키기 위해 피검체에 전신적으로 또는 요망되는 작용 부위(예를들어, 리간드가 국소적으로 투여되는 부위)에 투여될 수 있다. 예를들어, 리간드는 전신 순환에서 이로운 활성을 지니지만 조직으로 신속하게 분포되고 제거(예를들어, 스테로이드 또는 펩티드 호르몬)되고, 분포 또는 제거 속도를 감소시키는 내인성 표적 화합물에 결합한다. 이러한 리간드는 전신 순환의 내인성 표적 화합물의 생체이용률을 증가시킬 수 있고, 여기서 내인성 표적 화합물의 이로운 활성은 이로운(예를들어, 치료) 효과를 지닐 수 있다. 리간드는 내인성 표적 화합물을 요망되는 부위로 보충함으로써 상기 요망되는 부위의 내인성 표적 화합물의 생체이용률을 증가시킬 수 있다. 예를들어, 요망되는 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 포함하는 리간드는 환자에 국소적으로 투여(예를들어, 데포 제형으로서)될 수 있다. 국소적으로 투여되는 리간드는 요망되는 내인성 표적 화합물에 결합할 수 있고, 상기 부위로 추가의 내인성 표적 화합물을 보충할 수 있다. 따라서, 내인성 표적 화합물의 증가된 수준 또는 양은 이로운 효과를 생성하기 위해 상기 부위에 존재할 수 있다. 예를들어, 한 구체예에서, 리간드는 TGF 베타 이소형 3에 대한 결합 부위를 지니는 부분을 포함한다. 이러한 리간드는 국소적으로 투여되어 TGF 베타 이소형 3에 결합할 수 있고, 국소 투여 부위로 TGF 베타 이소형 3를 보충하여, 상치 치유를 촉진할 수 있다.

일반적으로, 리간드는 결합하는 내인성 표적 화합물의 생체이용률(예를들어, 전신 순환에서, 요망되는 작용 부위에서)을 리간드의 부재하의 내인성 표적 화합물의 생체이용률에 비해 약 1.5배 이상, 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 또는 약 10배 이상으로 증가시킬 것이다. 예를들어, 리간드가 전신 순황에서 생체이용률을 증가시키는 경우, 리간드의 투여 시점에서 출발하는 내인성 리간드의 농도 시간 곡선이 제조될 수 있고, 전신 생체이용률의 증가 정도를 결정하기 위해 상기 곡선 및 곡선하 영역(AUC)이 내인성 표적 화합물의 정상 전신 수준과 비교될 수 있다.

본 발명은 내인성 표적의 활성을 증가시키기 위한 약제의 제조에 있어서, 상기 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 용도에 관한 것이다.

리간드는 이들이 결합하는 내인성 표적의 활성(예를들어, 결합 활성)을 증가시킬 것이다. 예를들어, 리간드는 내인성 표적 화합물, 예를들어 내인성 효능제(예를들어, 사이토카인) 또는 가용성 사이토카인 수용체에 결합할 수 있고, 내인성 결합 파트너에 대한 내인성 표적 화합물의 친화성 및/또는 결합성을 증가시킴으로써 내인성 표적 화합물의 결합 활성을 개선시킬 수 있다. 요망되는 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 2개 이상의 부분을 포함하는 리간드는 2개 이상의 개별적 내인성 표적 화합물 분자에 결합하여 내인성 표적 화합물 이합체, 삼합체, 소중합체 또는 중합체를 생성할 수 있다. 이러한 이합체, 삼합체, 소중합체 또는 중합체는 보다 높은 결합성으로 인해, 예를들어 내인성 표적 화합물에 대한 천연 결합 파트너를 발현하는 세포에 대해 개선된 결합 활성을 지닐 것이다. 일반적으로, 이러한 리간드는 내인성 표적 화합물의 결합 활성을 개선시킬 수 있다. 예를들어, 결합 파트너에 대한 내인성 표적 화합물의 결합 강도(예를들어, 친화성 또는 결합성)는 단량체(즉, 본 발명의 리간드와의 복합체가 아닌 것)로서의 내인성 표적 화합물의 결합 강도 보다 약 10배 이상, 약 100 배 이상, 약 1,000배 이상 또는 약 10,000배 이상 강할 수 있다.

한 특정 구체예에서, 리간드는 가용성 TNFR1에 대한 결합 특이성을 지니지만 활성 부위 (가용성 TNFR1의 활성 부위는 도메인 2 및 3 내에 함유됨)에 결합하지 않는 2개 이상의 부분(dAb)을 포함한다. 이러한 리간드는 2개 이상의 가용성 TNFR1에 결합하여 증가된 결합성으로 인해 삼합체 리간드인 TNF에 대한 개선된 결합 활성을 지니는 가용성 TNFR1 이합체, 삼합체, 소중합체 또는 중합체를 형성할 수 있다. 단일 가용성 TNFR1 사슬 보다 큰 유체역학적 크기를 지니는 가용성 TNFR1 이합체, 삼합체, 소중합체 또는 중합체의 반감기가 또한 단일 TNFR1에 비해 연장될 수 있다. 결과적으로, 이러한 리간드는 가용성 TNFR1의 TNF 억제 활성을 개선시킬 수 있고, 이의 치료 효능을 개선시킬 수 있다. 예를들어, 이러한 리간드는 가용성 TNFR1의 효능을 약 10배 이상, 약 100배 이상, 약 1,000배 이상 또는 약 10,000배 이상 개선시킬 수 있다.

본 발명의 한 예에서, 마우스 TNFR1의 도메인 1에 결합하는 dAb의 이합체인 리간드가, 가용성 TNFR1의 이합체화를 유도하는 리간드가 가용성 TNFR1의 효능을 개선시키는 것을 입증하기 위해 사용된다. 예를들어, 이러한 리간드는 인간 MRC5 세포, 인간 TNF 및 가용성 마우스 TNFR1을 함유하는 검정에 첨가될 수 있다. 가용성 마우스 TNFR1은 MRC5 세포 상에서 인간 TNF에 대한 결합에 대해 인간 TNFR1와 경쟁할 것이다. 마우스 TNFR1의 도메인 1에 결합하는 dAb의 이합체인 리간드는 2개의 가용성 마우스 TNFR1 사슬과 결합하여 상기 검정에서 TNF의 효과의 억제에서 훨씬 더 효과적인 마우스 TNFR1 이합체를 형성한다. 예를들어, 마우스 TNFR1에 대한 IC50은 가용성 TNFR1의 이합체화를 유도하는 리간드의 첨가에 의해 나노몰 범위에서 피코몰 범위로 감소(약 10 또는 약 100 또는 약 100 배 감소)될 수 있다.

한 특정 구체예에서, 본 발명은 내인성 표적 화합물의 결합 활성을 증가시키기 위한 약제의 제조에 있어서 상기 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 2개 이상의 부분을 포함하는 리간드의 용도에 관한 것으로, 상기 리간드는 상기 내인성 표적에 결합하지만, 상기 내인성 표적의 활성 부위에 결합하지 않고, 상기 내인성 표적 화합물의 결합 활성을 실질적으로 억제하지 않는다.

본 발명은 또한 내인성 표적 화합물을 이용하여 치료가능한 질병의 치료에 사용하기 위한, 피검체의 질병을 치료하기에 적합한 활성을 지니는 내인성 표적 화합물에 결합하는 리간드에 관한 것으로, 상기 리간드는 상기 내인성 표적 화합물의 활성 부위에 결합하지 않거나, 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는다. 예를들어, 리간드는 상기 내인성 표적 화합물의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있고/거나, 피검체의 상기 내인성 표적 화합물의 양을 증가시킬 수 있고/거나, 상기 내인성 표적 화합물의 생체이용률을 증가시킬 수 있고/거나, 상기 내인성 화합물의 결합 활성을 증가시킬 수 있다.

본 발명은 내인성 화합물의 반감기, 생체이용률 또는 활성을 증가시키기 위한 상기 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 결합 부분을 포함하는 리간드의 용도에 관한 것으로, 내인성 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 상기 결합 부분은 상기 내인성 화합물 또는 이의 일부 또는 변형체이고, 상기 리간드는 상기 내인성 표적 화합물에 결합하지만, 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는다.

본 발명은 TNF 수용체 상과의 일원의 반감기, 생체이용률 또는 활성을 증가시키기 위한 상기 TNF 수용체 상과의 상기 일원에 대한 결합 부위를 지니는 결합 부분을 포함하는 리간드의 용도에 관한 것으로, 상기 리간드는 TNF 수용체 상과의 상기 일원에 결합하지만, TNF 상과의 상기 일원의 활성을 실질적으로 억제하지 않고, TNF 수용체 상과의 일원에 대한 결합 부위를 지니는 상기 결합 부분은 프레-리간드 어셈블리 도메인(PLAD) 또는 이의 변형체이다.

본 발명은 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 유효량을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 피검체의 상기 내인성 표적 화합물의 활성(예를들어, 결합 활성)을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 유효량을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 피검체의 상기 내인성 표적 화합물을 이용하여 치료가능한 질병을 지니는 피검체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 유효량을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 상기 내인성 표적 화합물의 반감기, 생체이용률 또는 활성을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 내인성 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 상기 결합 부분은 상기 내인성 화합물 또는 이의 일부 또는 변형체이고, 상기 리간드는 상기 내인성 표적 화합물에 결합하지만, 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는다.

본 발명은 TNF 수용체 상과의 일원에 대한 결합 부위를 지니는 결합 부분을 포함하는 리간드의 유효량을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여, TNF 수용체 상과의 상기 일원의 반감기, 생체이용률 또는 활성을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 상기 리간드는 TNF 수용체 상과의 상기 일원에 결합하지만, TNF 수용체 상과의 상기 일원의 활성을 실질적으로 억제하지 않고, TNF 수용체 상과의 일원에 대한 결합 부위를 지니는 상기 결합 부분은 프레-리간드 어셈블리 도메인(PLAD) 또는 이의 변형체이다.

본 발명의 리간드의 치료 및 예방 용도는 수용체 포유동물, 예를들어 인간으로의 본 발명에 따른 리간드의 투여를 포함한다. 이중특이적 및 다중특이적 리간드(예를들어, 이중특이적 항체 포맷)은 높은 결합성으로 중합 항원에 결합한다. 이중특이적 리간드 또는 다중특이적 리간드는, 예를들어 가용성 수용체의 높은 결합성의 이합체, 삼합체 또는 중합체를 생성하기 위해 2개의 항원의 가교를 허용할 수 있다.

90 내지 95% 이상의 동질성의 실질적으로 순수한 리간드가 포유동물에 대한 투여에 바람직하고, 98 내지 99% 또는 이 이상의 동질성이 약제 용도, 특히 포유동물이 인간인 경우에 가장 바람직하다. 부분적으로 또는 요망되는 동질성으로 정제된 후, 리간드는 진단적으로 또는 치료적(체외적으로를 포함함)으로 사용될 수 있거나, 검정 과정, 면역형광 염색 등을 개발하고 수행하는데 사용될 수 있다 (Lefkovite and Pernis, (1979 and 1981) Immunological Methods, Volumes I and II, Academic Press, NY).

일반적으로, 리간드는 약리학적으로 적절한 담체와 함께 정제된 형태로 이용될 것이다. 통상적으로, 이러한 담체는 수용액 또는 알코올/수용액, 에멀젼 또는 현탁액, 염수 및/또는 완충 배지를 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거의 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨 및 락테이트화된 링거를 포함한다. 현탁액 내에 폴리펩티드 복합체를 지속시키는 것이 필요한 경우, 적절한 생리학적으로 허용되는 애쥬번트가 증점제, 예를들어 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알기네이트로부터 선택될 수 있다.

정맥내 비히클은 유체 및 영양소 보충물 및 전해질 보충물, 예를들어 링커 덱스트로오스에 기초한 것을 포함한다. 보존제 및 기타 첨가제, 예를들어 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 비활성 가스가 또한 존재할 수 있다 (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition). 연장된 방출 포뮬레이션을 포함하는 다양한 적절한 포뮬레이션이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약제 조성물의 투여 경로는 당업자에게 통상적으로 공지된 것중 임의의 것일 수 있다. 면역 요법을 제한하지 않는 것을 포함하는 치료를 위해, 본 발명의 선택된 리간드는 표준 기술에 따라 임의의 환자에 투여될 수 있다. 투여는 비경구, 정맥내, 근내, 복막내, 경피, 폐경로를 통해, 또는 적절하게는 카테터를 이용한 직접 주입을 포함하는 임의의 적절한 방식일 수 있다. 비경구 투여는 또한 동맥내, 수막강내, 관절내, 피하, 또는 기타 적절한 주사 또는 주입에 의해 이루어질 수 있다. 추가의 적절한 투여 방법은 폐 투여, 비내 투여, 질내 투여, 직장내 투여(예를들어, 좌약 또는 관장제에 의함)를 포함한다. 투여량 및 빈도는 임상의에 의해 고려되는 환자의 연령, 성별 및 상태, 기타 약물의 동반 투여, 카운터인디케이션(counterindication) 및 기타 파라미터에 의존될 것이다. 투여는 나타낸 바와 같이 국소적 (예를들어, 폐 투여에 의한 폐로의 국소 전달, 예를들어 비내 투여)이거나 전신적일 수 있다.

본 발명의 리간드가 별도로 투여되는 조성물 또는 기타 작용제와 함께 투여되는 조성물로 사용될 수 있다. 이들은 다양한 면역치료 약물, 예를들어 시클로스포린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신 또는 시스플라티늄, 및 면역독소를 포함할 수 있다. 약제 조성물은 본 발명의 길항제 (예를들어, 리간드)와 함께 다양한 세포독소 또는 기타 작용제의 "칵테일(cocktail)", 또는 다양한 특이성을 지니는 본 발명에 따른 리간드, 예를들어 투여전에 풀링되건 안되건 간에 다양한 표적 항원 또는 에피토프를 이용하여 선택된 리간드의 조합물을 포함할 수 있다. 일반적으로, 리간드 및 임의의 추가 작용제가 치료 효과가 중첩되는 방식으로 투여된다.

특정 구체예에서, 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드가 저용량의 내인성 표적 화합물(예를들어, 내인성 표적 화합물의 재조합 형태)과 함께 투여된다. 본원에 기술된 바와 같이, 리간드는, 예를들어 저용량이 치료적으로 유효하게 되도록 하기 위해, 내인성 표적 화합물의 반감기 또는 생체이용률을 증가시킬 수 있거나, 내인성 표적 화합물의 활성을 증가시킬 수 있다. 이러한 치료 방법은 질병을 치료하기 위한 보다 높은 용량의 작용제(예를들어, 내인성 표적 단백질의 재조합 형태)와 관련된 부작용이 회피될 수 있으므로 유리하다.

기타 구체예에서, 내인성 표적 화합물을 이용하여 예비적하된 리간드(예를들어, 내인성 표적 화합물의 재조합 형태와 함께 인큐베이션되고 결합되도록 함)가 투여된다. 예비적하된 리간드는 보통 하위 치료 수준으로 존재하거나, 내인성 표적 리간드의 활성이 요망되는 부위로 보충하기에 어려운 내인성 표적 리간드의 높은 생체이용률을 제공하기 위한 국소 투여에 매우 적합화되어 있다.

세포내 이입과 관련된 세포외 표적 (예를들어, 클라트린)에 결합할 수 있는 본 발명에 따른 리간드가 세포내 이입되어, 세포내 표적에 접근될 수 있다. 또한, 이중특이적 또는 다중특이적 리간드는 세포내 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 도메인 (예를들어, dAb 단량체)가 세포내 환경으로 전달될 수 있는 수단을 제공한다. 이러한 방법은, 예를들어 세포 내에서 기능적으로 지속될 수 있도록 하는 물리적 특성을 지닌 이중특이적 리간드를 필요로 한다. 대안적으로, 최종 목적의 세포내 구획이 산화되는 경우, 잘 폴딩된 리간드는 디설피드 결핍을 필요로 하지 않을 수 있다.

유리하게는, 이중특이적 또는 다중특이적 리간드는 유기체의 신체에서 치료 상황에서 상승작용적으로 협동하는 표적 사이토카인 및 기타 분자에 대해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 두개 이상의 분자 (예를들어, 사이토카인)에 결합할 수 있는 이중특이적 또는 다중특이적 리간드를 투여하는 것을 포함하여, 사이토카인 또는 기타 분자에 결합하는 두개 이상의 결합 도메인 (예를들어, dAb)의 활성을 상승작용시키기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 양태에서, 이중특이적 또는 다중특이적 리간드는 상보적 및/또는 비-상보적 도메인으로 구성된 리간드, 개방 형태 및 폐쇄 형태의 리간드를 포함하는 임의의 이중특이적 또는 다중특이적 리간드일 수 있다. 예를들어, 본 발명의 이러한 양태는 V_H 도메인 및 V_L 도메인, V_H 도메인 단독 및 V_L 도메인 단독의 조합물에 관한 것이다.

치료 맥락에서의 상승작용은 다수의 방법으로 달성될 수 있다. 예를들어, 표적 조합물은 둘 모두의 표적이 리간드에 의해 표적화되는 경우에만 치료적으로 활성일 수 있는 반면, 하나의 단독 표적을 표적화하는 것은 치료적으로 효과적이지 않다. 또 다른 구체예에서, 하나의 단독 표적은 다소 낮거나 최소 치료 효과를 제공할 수 있으나, 제 2 표적과 함께에서는 상기 조합물은 치료 효과의 상승적 증가를 제공한다.

질병에 대한 보호 또는 치료에서 상기 리간드의 유효성을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있는 동물 모델 시스템이 이용가능하다. 적절한 동물 모델이 본원에 기술된 모델과 같이 사용될 수 있다.

본 발명의 리간드는 보관을 위해 동결건조될 수 있고, 사용전에 적절한 담체에 재구성될 수 있다. 이러한 기술은 통상적인 면역글로불린을 이용하여 효과적인 것으로 밝혀졌고, 당 분야에 공지된 동결건조법 및 재구성 기술이 사용될 수 있다. 당업자는 동결건조법 및 재구성이 항체 활성 손실의 다양한 정도를 야기할 수 있으며 (예를들어, 통상적인 면역글로불린인 IgM 항체는 IgG 항체보다 더 큰 활성 손실을 지니는 경향이 있음), 이를 보충하기 위해 사용 수준이 상향 조절될 수 있음을 인지할 것이다.

본 발명의 리간드 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 예방적 및/또는 치료적 처리를 위해 투여될 수 있다. 특정 치료 적용에서, 선택된 세포의 집단의 적어도 부분적인 억제, 서프레션, 조절, 사멸, 또는 기타 측정가능한 파라미터를 달성하기에 적절한 양은 "치료적 유효량"으로 정의된다. 이러한 용량을 달성하기에 요구되는 양은 질병의 중중도 및 환자의 면역계의 일반 상태에 좌우될 것이나, 일반적으로 체중 ㎏ 당 0.005 내지 5.0 mg의 리간드의 범위이고, 0.05 내지 2.0 mg/kg/용량의 용량이 더욱 일반적으로 사용된다. 예방 적용을 위해, 본 발명의 리간드 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 또한 질병의 발명을 예방하거나, 억제하거나, 지연시키기 위해 (예를들어, 완화 또는 정지를 지속시키거나 급성 단계를 방지하기 위해) 유사하거나 약간 낮은 용량으로 투여될 수 있다. 숙력된 임상의는 질병을 치료하거나, 억제하거나, 예방하기 위한 적절한 투여 간격을 결정할 수 있을 것이다. TNFR1의 길항제 (예를들어, 리간드)가 만성 염증 질병을 치료하거나, 억제하거나, 예방하기 위해 투여되는 경우, 이는 , 예를들어 약 10 μg/kg 내지 약 80 mg/kg, 약 100 μg/kg 내지 약 80 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 80 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 70 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 60 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 10 μg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 10 μg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 10 μg/kg 내지 약 2.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg 또는 약 10 mg/kg의 용량으로 하루당 4회 이하, 1주일에 2회, 1주일에 1회, 2주 간격으로 1회, 1개월에 1회 또는 2개월 간격으로 1회로 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, TNFR1의 길항제 (예를들어, 리간드)는 약 10 μg/kg 내지 약 10 mg/kg (예를들어, 약 10 μg/kg, 약 100 μg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg 또는 약 10 mg/kg)의 용량으로 2주에 1회 또는 1개월에 1회로, 만성 염증 질병을 치료하거나, 억제하거나, 예방하기 위해 투여될 수 있다. 리간드는 또한, 예를들어 약 1 mg/일 내지 약 10 mg/일 (예를들어, 10 mg/일, 9 mg/일, 8 mg/일, 7 mg/일, 6 mg/일, 5 mg/일, 4 mg/일, 3 mg/일, 2 mg/일 또는 1 mg/일)의 용량으로 투여(예를들어, 전신 또는 국소 투여)될 수 있다. 따라서, 작용제는 약 1 μg/kg/일 내지 약 200 μg/kg/일 (예를들어, 약 10 μg/kg/일, 약 20 μg/kg/일, 약 30 μg/kg/일, 약 40 μg/kg/일, 약 50 μg/kg/일, 약 60 μg/kg/일, 약 70 μg/kg/일, 약 80 μg/kg/일, 약 90 μg/kg/일, 약 100 μg/kg/일, 약 110 μg/kg/일, 약 120 μg/kg/일, 약 130 μg/kg/일, 약 140 μg/kg/일, 약 150 μg/kg/일, 약 160 μg/kg/일, 약 170 μg/kg/일, 약 180 μg/kg/일, 또는 약 190 μg/kg/일)의 용량으로 폐 조직에 국소 투여될 수 있다.

본원에 기술된 조성물을 이용하여 수행되는 치료 또는 요법은 치료 전에 존재하는 증상, 또는 상기 조성물로 치료되지 않은 개체 (인간 또는 모델 동물) 또는 기타 적절한 대조군에서의 증상에 비해, 하나 이상의 증상이 감소 (예를들어, 10% 이상 또는 임상 평가 스케일에서 하나 이상의 포인트에 의함)된 경우 "효과적인" 것으로 간주된다. 증상은 치료되는 질병 또는 장애에 따라 다양할 것이나, 숙련된 임상의 또는 기술자에 의해 측정될 수 있다. 이러한 증상은, 예를들어 질병 또는 장애의 하나 이상의 생화학적 지시자 (예를들어, 질병과 관련된 효소 또는 대사물질의 수준, 감염된 세포수 등)의 수준을 모니터링하거나, 물리적 표현 (예를들어, 염증, 종양 크기 등)을 모니터링하거나, 인정된 임상적 평가 척도, 예를들어 확장 장애 상태 척도 (다발성 경화증에 대해서임), 어빈(Irvine) 염증성 장질병 질문표 (장 기능, 전신 증상, 사회적 기능 및 감정 상태의 질을 평가하는 32 포인트의 평가 - 스코어는 32 내지 224의 범위이며, 보다 높은 스코어는 보다 나은 삶의 질을 나타냄), 류마티스 관절염 척도의 삶의 질, 세인트 조지 호흡기 설문지(St. George's Respiratory Questionnaire), 또는 당 분야에 공지된 기타 인정된 임상적 평가 척도에 의해 측정될 수 있다. 주어진 임상 척도에 대해 10% 이상 또는 하나 이상의 포인트에 의한 질병 또는 장애 증상에서의 지속적 (예를들어, 하루 이상, 바람직하게는 더 이상) 감소는 "효과적인 치료를 나타낸다. 유사하게, 본원에 기술된 조성물을 이용하여 수행된 예방은 하나 이상의 증상의 발병 또는 중증도가 상기 조성물로 치료되지 않은 유사한 개체 (인간 또는 동물 모델)에서의 증상에 비해 지연되거나, 감소되거나, 제거된 경우 "효과적"이다.

본 발명에 따른 리간드 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 포유동물의 선택 표적 세포 집단의 변화, 비활성화, 사멸 또는 제거를 돕기 위한 예방적 및 치료 환경에 이용될 수 있다. 또한, 본원에 기술된 선택된 레퍼토리의 폴리펩티드는 세포의 이종 집합물로부터 표적 세포 집단을 사멸시키거나, 고갈시키거나, 달리 효과적으로 제거하기 위해 체외에서 또는 시험관내에서 선택적으로 사용될 수 있다. 포유동물의 혈액이 리간드, 예를들어 항체, 세포 표면 수용체 또는 이의 결합 단백질과 체외에서 조합될 수 있고, 이에의해 표준 기술에 따라 포유동물로 복귀시키기 위해 요망되지 않는 세포가 혈액으로부터 사멸되거나 달리 제거된다.

본 발명에 따른 리간드를 함유하는 조성물은 포유동물 내의 선택 표적 세포 집단의 변화, 비활성화, 사멸 또는 제거를 돕기 위해 예방적 및 치료 환경에서 사용될 수 있다.

또한, 본원에 기술된 폴리펩티드의 선택된 레퍼토리가 세포의 이종성 집합물로부터 표적 세포 집단을 사멸시키거나, 고갈시키거나 달리 효과적으로 제거하기 위해 체외적으로 또는 시험관 내에서 선택적으로 사용될 수 있다. 포유동물로부터의 혈액이 리간드, 예를들어 항체, 세포 표면 수용체 또는 이의 결합 단백질과 체외적으로 조합되어, 표준 기술에 따라 포유동물로 복귀시키기 위해 요망되지 않는 세포가 혈액으로부터 사멸되거나 달리 제거된다.

내인성 표적 화합물

적절한 내인성 표적 화합물은, 예를들어 가용성 사이토카인 수용체 (예를들어, 가용성 TNFR1, 가용성 TNFR2, 가용성 IL-1 수용체, 가용성 IL-4 수용체, 가용성 IL-13 수용체), 내인성 수용체 길항제 (IL-1ra, IL-6ra), 효소 (예를들어, 베타-글루코세레브로시다아제 (E.C. 3.2.1.45)), 혈액 인자 (예를들어, 인자 II, 인자 VIII), 에리트로포이어틴, 인간 성장 호르몬, TPO, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, GLP-1, OXM, 성 호르몬 (예를들어, 테스토스테론, 에스트로겐), 골 형태형성 단백질 (예를들어, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-베타) 이소형 1, TGF-베타 이소형 2, TGF-베타 이소형 3, IL-1O, IL-2, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, 과립구 콜로니 자극 인자, 인슐린, 글루카곤, GIP를 포함한다.

적절한 내인성 표적 화합물은 사이토카인, 예를들어 인터루킨, 인터페론, 콜로니 자극 인자 및 케모카인을 포함한다. 이러한 사이토카인의 예는 인터루킨, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL1O, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15 (IL-T), IL16, IL17, IL17B, IL17C, IL17E, IL17F, IL18, IL19, IL20, IL21, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, IL-31 및 IL-32, 및 인터페론 IFN-알파, IFN-베타, IFN-델타, IFN-감마, IFN-카파, IFN-람다-1, IFN-람다-2, IFN-람다-3, IFN-오메가, 및 IFN-tau를 포함한다.

적절한 내인성 표적 화합물은 케모카인, 예를들어 CCF18, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL1O, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL1O, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, ECIP-1, EDNAP, ENA-78, ENAP, ENAP-알파, ENAP-베타, 내피세포 성장 억제제, 내피 IL8, FIC, FDNCF, FINAP, GDCF-2, GCF, GCP-2, GRO-알파, GRO-베타, GRO-감마, 헤파린 중화 단백질, Humig, I-309, ILC, ILINCK, IMAC, I-TAC, IL8, IP-9, IP-10, 림포탁틴, LAG-1, LARC, LCC-1, LD78-알파, LD78-베타, LD78-감마, LDCF, LEC, Lkn-1, LMC, LAI, LCF, LA-PF4, LDGF, LDNAP, LIF, LIX, MARC, MCAF, MCIF, 멕시킨(Mexikine), MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, MDC, MEC, MIP-1-알파, MIP-1-베타, MIP-1-델타, MIP-1-감마, MIP-3, MIP-3-알파, MIP-3-베타, MIP-4, MIP-4-알파, MIP-5, 모노탁틴-1, MPIF-1, MPIF-2, MRP-1, MRP-2, MDGF, MDNAP, MDNCF, 거대핵세포-자극-인자, MGSA, MGSA-알파, MGSA-베타, Mig, MIP-2, MIP-2-알파, MIP-2-베타, MIP-2-감마, NAF, NAP-1, NAP-2, NAP-3, NAP-4, NCP, 온코스타틴 A, PARC, PBP, PBP-유사, PBSF, PF4, PLF, PPBP, RANTES, 레가카인(Regakine)-1, SCM-1-알파, SCYC1, SCYC2, SCI, SCYA1, SCYA2, SCYA3, SCYA4, SCYA5, SCYA6, SCYA7, SCYA8, SCYA9, SCYA1O, SCYA11, SCYA12, SCYA13, SCYA14, SCYA15, SCYA16, SCYA17, SCYA19, SCYA20, SCYA21, SCYA22, SCYA23, SCYA24, SCYA25, SCYA26, SCYA27, SCYA28, SLC, SMC-CF, STCP-I, SCYB1, SCYB2, SCYB3, SCYB4, SCYB5, SCYB6, SCYB7, SCYB8, SCYB9, SCYB9B, SCYB1O, SCYB11, SCYB12, SCYB13, SCYB14, SCYB15, SCYB16, SDF-1-알파, SDF-1-베타, SR-PSOX, SCYD1, SR-PSOX, TARC, TCA-3, TCA-4, TDCF, TECK, TSC-1, TSG-8, TCF, TCK-1, TLSF-알파, TLSF-베타, TPAR-1, TSG-1, WECHE를 포함한다.

적절한 내인성 표적 화합물은 콜로니 자극 인자 (CSF)를 포함한다. CSF는 성인의 골수의 특이적 다능성 줄기 세포의 증식을 자극하는 사이토카인다. 과립구-CSF (G-CSF)는 과립구 계통의 세포에서의 증식 효과에 대해 특이적이다. 대식세포-CSF (M-CSF)는 대식세포 계통의 세포에 대해 특이적이다. 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF)는 둘 모두의 부류의 림프구 세포에 대해 증식 효과를 지닌다. Epo는 또한 CSF 뿐만 아닐 성장 인자로 간주되는데, 이는 Epo가 적혈구 콜로니 형성 유닛의 증식을 자극하기 때문이다. IL-3 (T-세포로부터 주로 분비됨)는 또한 다중-CSF로 공지되어 있는데, 이는 IL-3가 조혈 세포의 모든 형태를 생성하기 위해 줄기 세포를 자극하기 때문이다.

적절한 내인성 표적 화합물은 에리트로포이어틴 (Epo)을 포함한다. Epo는 신장에 의해 합성되고, 적혈구생성의 주요 조절자이다. Epo는 미성숙 적혈구의 증식 및 분화를 자극하고; 또한 적혈구 전구세포 (예를들어, 적혈구 대집락 형성 단위 및 콜로니 형성 단위)의 성장을 자극하고, 적혈구 콜로니 형성 단위의 전적혈구모세포로의 분화를 유도한다. 부전으로 인해 빈혈에 걸린 환자에게 Epo가 주어지는 경우, 이는 적혈구 세포수의 신속하고 현저한 증가를 야기시킨다.

적절한 내인성 표적 화합물은 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-I)을 포함한다. IGF-I (본래 소마토메딘 C으로 언급됨)은 인슐린과 구조적으로 관련된 성장 인자이다. IGF-I는 성장 호르몬(GH)에 대한 세포의 반응과 관련된 주요 단백질로, 즉 IGF-I는 GH에 대한 반응으로 생성된 후, 이후의 세포 활성, 특히 골 성장을 유도한다. 이는 용어 소마토메딘을 발생시키는 GH에 대한 IGF-I의 활성이다. 그러나, 이후의 연구는 IGF-I가 자가분비 및 주변분비 활성 이외에 뼈에서 최초로 관찰된 내분비 활성을 지니는 것을 입증하였다. 인슐린 수용체와 같은 IGF-I 수용체는 내재성 티로신 키나아제 활성을 지닌다. 구조적 유사성으로 인해, IGF-I는 인슐린 수용체에 결합할 수 있으나, 인슐린 자체보다는 훨씬 낮은 친화성을 지닌다.

적절한 내인성 표적 화합물은 인슐린 유사 성장 인자-I (IGF-II)를 포함한다. IGF-II는 거의 배아 조직 및 신생아 조직에서만 발현된다. 출생후, 검출가능한 IGF-II 단백질의 수준은 현저하게 감소한다. 이러한 이유에 대해, IGF-II는 태아 성장 인자인 것으로 생각된다. IGF-II 수용체는 리소좀에 대한 리소좀 효소(만노오스-6-포스페이트 잔기를 함유함)의 통합을 책임지는 만노오스-6-포스페이트 수용체와 동일하다.

적절한 내인성 표적 화합물은 종양 괴사 인자 베타를 포함한다. TNF-베타(림프독소로도 언급됨)는 다수의 상이한 세포 유형을 사멸시키는 능력 뿐만 아니라 다른 세포에서의 말기 분화를 유도하는 능력을 특징으로 한다. TNF-베타에 대한 하나의 현저한 비-증식성 반응은 관 내피세포의 표면에 존재하는 지질단백질 리파아제의 억제이다. TNF-베타 합성이 우세한 부위는 T-림프구, 특히 세포독성 T-림프구(CTL 세포)로 언급되는 T-세포의 특정 부류이다. TNF-베타 발현의 유도는 IL-2 뿐만 아니라 항원과 T-세포 수용체의 상호작용의 상승으로부터 발생한다.

적절한 내인성 표적 화합물은 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)를 포함한다. TNF-알파(림프독소 B, 또는 카켁틴(cachectin)으로도 언급됨)는 다면발현 염증 사이토카인이고, 이는 몇몇 종류의 종양의 괴사를 야기할 수 있다. TNF-알파는 TNF-베타와 36%의 아미노산 서열 상동성을 공유한다. 그러나, 상기 두 단백질의 3차 구조는 매우 유사하고, 둘 모두 TNF 수용체인 TNFR-1 및 TNFR-2에 결합한다. TNF-알파는 주조직적합복합체 내에서 엔코딩되는 삼합체 단백질이다. 이는 17 kD의 분비 형태로 처음 확인되었으나, 이후의 추가의 연구는 분열되지 않은 2 kD 전구물질 형태가 또한 막횡단 형태로 존재하는 것을 밝혀내었다. 자극된 대식세포는 세포-대-세포 접촉을 통해 TNFR-1 및 TNFR-2에 직접적으로 결합하거나 분열되어 이의 가용성 형태로 결합한다. 사이토카인은 여러 유형의 세포에 의해 생성되지만, 특히 대식세포에 의해 생성된다. 저수준의 TNF-알파는 섬유모세포 성장을 자극시킴으로써 손상되고 노쇠한 조직의 재형성 또는 대체를 촉진한다. TNF-알파의 추가의 이로운 기능은 박테리아, 및 특정 진균, 바이러스, 및 기생충 침입에 대한 면역 반응에서의 역할 뿐만 아니라 특정 종양의 괴사에서의 역할을 포함한다. 마지막으로, 이는 국소 염증 면역 반응에서 중요 매개체로서 작용한다. TNF-알파는 사이토카인의 캐스케이드를 개시하고, 관 투과성을 증가시킴으로써, 감염 부위에 대식세포 및 호중구를 보충하는 급성기 단백질이다. 대식세포에 의해 분비된 TNF-알파는 감염 억제에 도움이 되는 혈액 응고를 야기시킨다. TNF-알파는 또한 만성 효과(예를들어, 염증)를 나타내고, TNF-알파의 연장된 과생성은 또한 식욕부진, 넷(net) 이화작용, 체중 손실 및 빈혈로 특징되고 암 및 AIDS와 같은 병을 발생시키는 악액질로 공지된 질환을 일으킨다.

적절한 내인성 표적 화합물은 조혈의 사이토카인 및 성장 인자, 예를들어 CD34, CIL (콜로니 억제 림포카인), 다니플레스팀(Daniplestim), GADS (shc의 GRB2 관련 어댑터 다운스트림), 조혈세포 성장 인자, 조혈세포 키나아제, 조혈세포 포스파타아제, 조혈 공통 티로신 결핍 키나아제, 조혈 콜로니 자극 인자-309, 헤마토포이어틴-1, 헤마토포이어틴-2, 혈액조절 펩티드(Hemoregulatory peptide), HIM, Hiwi, HnudC, 프로제니포이어틴(progenipoietin), 프로제니포이어틴-1, 프로제니포이어틴-2, 프로제니포이어틴-4, 프로메가포이어틴(Promegapoietin), 프로메가포이어틴-1, 프로메가포이어틴-1a, 및 신토카인(Synthokine)을 포함한다.

광의의 기타 조혈 성장 인자는 다양한 콜로니 자극 인자 (참조: G-CSF, GM-CSF, M-CSF를 포함하는 CSF), Epo, SCF(줄기세포 인자), SCPF(줄기세포 증식 인자), 다양한 인터루킨(IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL11, IL12), LIF, TGF-베타, MIP-1-알파, TNF-알파, 및 다수의 기타 저분자량 인자, 및 여러 기타 사이토카인을 포함한다. 이러한 단백질의 다수는 다기능적이다. 이들은 매우 조기의 분화 단계 또는 더 이후의 단계에서 작용하고; 이들은 또한 계통-특이적 방식으로 작용할 수 있거나, 하나의 계통 보다 더욱 영향을 미칠 수 있다. 관련된 전구세포의 증식 및 성숙은 후기 작용의 계통 특이적 인자, 예를들어 Epo, M-CSF, G-CSF 및 IL5에 의해 조절된다. 활성 세포 증식을 시작하는 다능성 전구세포는 IL3, GM-CSF 및 IL4를 포함하는 여러 중첩 사이토카인에 의해 조절된다. 휴지의 원시 전구세포에 의한 사이클링의 트리거링(Triggering) 및 원시 전구세포의 B 세포 잠재력의 유지는 IL6, G-CSF, IL11, IL12, LIF 및 SCF를 포함하는 조기 작용 사이토카인의 상호작용에 필요한 것으로 보인다. 생물학적 활성에 의해, 헤마토포이어틴은 여러 소집단으로 분류되었다.

용어 타입-1 헤마토포이어틴은 가끔 몇몇 세포 유형에 직접적으로 작용하는 조혈의 조절과 관련된 인자들을 기술하는데 사용된다. 이들 그룹은 IL3 (다중-CSF) 및 GM-CSF를 포함한다. 콜로니 자극 인자와 상승작용하지만, 내재성 콜로니 자극 활성을 지니지 않는 인자는 가끔 타입-2 헤마토포이어틴으로 언급되었다. 이들은 IL1, IL4, IL5 및 IL6을 포함한다. 타입-3 헤마토포이어틴은 각각의 생산자 세포에 의해 콜로니 자극 인자의 방출을 자극함으로써 조혈 성장을 조절하는 것이다. 이들은 IL1, IL2, TNF-베타 및 IFN-감마를 포함한다.

몇몇 인자는 조혈 과정을 부정적으로 조절한다. 이들은 몇몇 유형의 조혈 세포의 증식을 선택적으로 억제할 수 있고, 세포 사멸을 유도할 수 있다. 예를들어, 형질전환 성장 인자인 TGF-베타는 주로 원시 조혈 세포 및 림프구 세포에서 작용한다. MIP-1-알파 (대식세포 염증 단백질-1-알파)로 언급되는 인자는 원시 조혈 세포에 대해 유사한 활성을 나타낸다.

적절한 내인성 표적 화합물은 혈관신생과 관련된 내인성 화합물을 포함한다. 혈관신생과 관련된 내인성 화합물의 예는 16K 프로락틴, ADAMTS-1, ADAMTS-8, 아드레노메둘린(Adrenomedullin), 혈관-관련 이동 세포 단백질, 안지오제닌(Angiogenin), 안지오제닌 관련 단백질, 안지오모둘린(Agiomodulin), 안지오모틴(Angiomotin), 안지오포이어틴(안지오포이어틴)-1, 안지오포이어틴-2, 안지오포이어틴-3, 안지오포이어틴-4, 안지오포이어틴-5, 안지오포이어틴-유사 1, 안지오포이어틴-유사 2, 안지오포이어틴-유사 3, 안지오포이어틴-유사 4, 안지오포이어틴-관련 단백질-2, 안지오스타틴(Angiostatin), 안지오텐신(Angiotensin)-2, 안지오트로핀(Angiotropin), ARP-2, B16-F1 흑색종 자가분비 운동 인자, 뇌-특이적 혈관신생 억제제-1, 뇌-특이적 혈관신생 억제제-2, 뇌-특이적 혈관신생 억제제-3, C49a, CAM 검정, 연골에 의해 유래된 항-종양 인자, 연골에 의해 유래된 억제제, CATF, cCAF, CD55, CDI, CDT6, 연골세포에 의해 유래된 억제제, 혈관신생 및 금속단백분해효소 활성의 연골세포에 의해 유래된 억제제, 콘드로모둘린(Chondromodulin)-1, 연골육종에 의해 유래된 성장 인자, 융모요막 검정 CLAF, 콜라겐 유형 18, 결합조직 성장 인자, 황체 혈관신생 인자, 탈과립 억제 단백질, EGF, EG-VEGF, 태아 신장에 의해 유래된 혈관신생 인자-1, 태아 신장에 의해 유래된 혈관신생 인자-2, 내분비샘에 의해 유래된 관 내피세포 성장 인자, 엔도레펠린(Endorepellin), 엔도스타틴(endostatin), 내피세포 자극 혈관신생 인자, 내피세포에 의해 유래된 성장 인자, 내피 단핵구 활성화 폴리펩티드-2, ESAP, f-ECGF, FGF, FGF-4, 섬유소 단편 E, 섬유모세포에 의해 유래된 세포 성장 인자, 섬유모세포 유도가능 분비 단백질-12, FrzB2, GFB-111, 신경교종에 의해 유래된 혈관신생 억제 인자, 성장 호르몬, GSM, HAP, 합토글로빈(Haptoglobin), 헤파린-결합 신경돌기-촉진 인자, 간세포 성장 인자, HGF, HUAF, 인간 혈관신생 인자, 인간 억제제 혈관신생 인자-1, 인간 자궁 혈관신생 인자, IFN-알파, IFN-감마, IGF, IGF-1, IGF-BP-7, jagged, KAF, 칼리스타틴(kallistatin), K-FGF, 신장 혈관신생 인자, 키니노스타틴(kininostatin), 이동 자극 인자, 미토겐에 의해 조절되는 단백질/프로리페린(proliferin), 미토겐에 의해 조절되는 단백질-4, 단핵구-안지오트로핀, MRP/PLF, MRP-4, 뉴로루킨(Neuroleukin), 뉴로필린(Neuropilin)-1, NKG5, NLK, Notch-1, Notch-4, ORF-74, 난소 성장 인자, PAF, 부갑상샘 호르몬-유사 관련 단백질, PD-ECGF, PDGF, PDGF-BB, PEDF, PF4, PGI, 색소 내피세포에 의해 유래된 인자 태반 성장 인자, 태반 혈관신생 인자, 혈소판 인자-4, 혈소판에 의해 유래된 내피세포 성장 인자, PlGF, PrGF, 프로키네티신(Prokineticin)-1, 프로리페린-관련 단백질, 프로스타사이클린(Prostacyclin) 자극 인자, 전립샘 성장 인자, 프로트롬빈 크링글(kringle)-2 도메인 PRP, PTHrP, RNASE5, 산란 인자(Scatter factor), 세마포린(semaphorin)-3, Sprouty, TAF, TAMF, TGF-알파, TGF-베타, 트롬빈, 트롬보스폰딘, TIE-1, TIE-2, 조직 인자, TNF-알파, TNF-베타, 아폽토시스의 TNF-유사 약 유도인자, 트랜스페린, TSP, 종양 혈관신생 인자, 종양 자가분비 운동 인자, 투마스타틴(Tumstatin), TWEAK, 자궁 혈관신생 인자, 관 투과 인자, 바스큘로트로핀(Vasculotropin), VEGF, VEGF-162, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGI 및 VPF를 포함한다.

다수의 상이한 성장 인자 및 사이토카인이 내피세포, 평활근 세포 및 섬유모세포에서 화학주성, 분열촉진, 조절 또는 억제 활성을 나타내는 것을 밝혀졌고, 따라서 하나의 방식 또는 또 다른 방식으로 혈관신생 과정에 관여하는 것으로 예상될 수 있다. 이러한 과정은 단백질분해 효소, 세포외 기질 성분, 세포 부착 분자, 및 혈관활성 인자의 협력 작용을 포함한다. 성장, 화학주성 행동 및/또는 평활근 세포의 기능성 활성을 조절하는 인자는 액티빈(Activin) A, 아드레노메둘린(Adrenomedulin), aFGF, ANF, 안지오텐신, 안지오텐신-2, 베타셀룰린(Betacellulin), bFGF, CLAF, ECDGF (내피세포에 의해 유래된 성장 인자), ET(엔도텔린), 인자 X, 인자 Xa, HB-EGF, 관세포 증식의 심장에 의해 유래된 억제제, IFN-감마, IL1, LDGF(평활근종에 의해 유래된 성장 인자), MCP-1, MDGF(대식세포에 의해 유래된 성장 인자, 단핵구에 의해 유래된 성장 인자), NPY, 온코스타틴 M, PD-ECGF, PDGF, 프로락틴, 단백질 S, SDGF(평활근 세포에 의해 유래된 성장 인자), SDMF(평활근 세포에 의해 유래된 이동 인자), 타키키닌(Tachykinins), TGF-베타, 트롬보스폰딘(Thrombospondin)을 포함한다.

성장, 화학주성 행동 및/또는 관 내피세포의 기능성 활성을 조절하는 인자는 AcSDKP, aFGF, ANF, 안지오제닌, 안지오모둘린, 안지오트로핀, AtT20-ECGF, B61, bFGF, bFGF 유도 활성, CAM-RF, ChDI, CLAF, ECGF, ECI, EDMF, EGF, EMAP-2, 뉴로텔린(Neurothelin)(참조: EMMPRIN), 엔도스타틴, 내피세포 성장 억제제, 내피세포 생존유지 인자, Epo, FGF-5, IGF-2(참조: 관 내피세포에 대한 성장 촉진 활성), HBNF, HGF, HUAF, IFN-감마, IL1, K-FGF, LIF, MD-ECI, MECIF, NPY, 온코스타틴 M, PD-ECGF, PDGF, PF4, PlGF, 프로락틴, TNF-알파, TNF-베타, 트랜스페린, VEGF를 포함한다. 이들 인자중 일부는 몇몇 기타 생물학적 활성으로 인해 초기에 검출되고, 이후 혈관신생을 촉진하는 것을 나타내는 단백질 인자이다. 생체내에서 혈관신생 활성을 지니는 단백질 인자의 목록은 섬유모세포 성장 인자(참조: FGF), 안지오제닌, 안지오포이어틴-1, EGF, HGF, NPY, VEGF, TNF-알파, TGF-베타, PD-ECGF, PDGF, IGF, IL8 및 성장 호르몬을 포함한다. 섬유소 단편 E가 또한 혈관신행 활성을 지니는 것으로 밝혀졌다. 또한, 내피세포에 대해 통상적인 성장 인자로서 작용하지 않지만 혈관성 및 혈관신생 과정에서 두드러진 역할을 하는 안지오포이어틴-1과 같은 인자가 존재한다. PF4 및 프로락틴의 16 kDa 단편이 생체내에서 억제제로 존재한다.

적절한 내인성 표적 화합물은 중추신경계 및/또는 말초신경계의 형성 및 유지와 관련된 내인성 화합물, 예를들어 신경 분화를 향상시키고, 증식을 유도하고, 시냅스 기능에 영향을 미치고, 중추신경계 및 말초신경계 발달의 여러 단계 동안 일반적으로 사멸되는 것으로 예정되는 뉴런의 생존을 촉신시키는 신경영양 인자를 포함한다. 이러한 단백질의 예는 뉴로트로핀(neurotrophin), 예를들어 BDNF(뇌에 의해 유도되는 신경영양 인자), NGF, NT-3 (뉴로트로핀-3), NT-4, NT-5, NT-6, NT-7, CNTF (섬모 신경영양 인자), GDNF (아교세포주에 의해 유도된 신경영양 인자), 및 푸르푸린(Purpurin)을 포함한다. bFGF 또는 LIF와 같은 성장 인자는 종종 다수의 뉴런에서의 이들의 영양 활성으로 인해 뉴로트로핀 중에서 계수되기도 한다.

BDNF, NGF 및 NT-3는 때때로 이러한 과의 단백질의 창립 일원인 NGFis와 같이 NGF 단백질과로 집합적으로 언급된다. NGF, BDNF 및 NT-3로부터의 구조적 요소의 조합에 의해, 모든 trk 수용체를 효과적으로 활성화시키고, 다중 신경영양 특이성을 나타내는 다기능성 판-뉴로트로핀(Pan-Neurotrophin)-1 (PNT-1)를 고안하는 것이 가능해졌다. 또 다른 신경 생존 인자는 NSE (뉴런 특이적 에놀라이제)이다. 신경영양 활성을 지니는 기타 인자는 일반적으로 뉴로트로핀으로 분류되지 않고, 흔히 광범위한 기능을 지니는 것은 EGF, HBNF(헤파린-결합성 신경돌기-촉진 인자), IGF-2, aFGF 및 bFGF, PDGF, NSE (뉴런-특이적 에놀라아제), 및 액티빈 A이다. 신경세포에 영향을 주는 항증식 성장 인자는 또한 중성 항증식성 단백질, 아스트로스타틴(Astrostatine) 및 GGIF (아교세포 성장 억제 인자)를 참조하라.

생체활성에 따라서, 때때로 신경돌기 촉진 인자 (NPF)와 신경 분화 인자 사이에 구별이 이루어진다. 신경돌기 촉진 인자는 그 자체에 의해서는 신경 생존 또는 일반적인 성장을 촉진하지 않지만, 하나 이상의 신경영양 인자가 첨가되면 액손 또는 수지상돌기 과정의 성장을 유도한다. NPF 활성을 지니는 인자는 NGF, S100, GMF-베타 (아교세포 성숙 인자), 프로테오글리칸, 메로신, 콜라겐, 세포 부착 분자, 및 라미닌을 포함한다.

적절한 내인성 표적 화합물은 상처 치유와 관련된 내인성 화합물을 포함한다. 혈소판은 활성 성장 인자 및 사이토카인의 국소적으로 풍부한 공급원이다. 특히, 혈소판에 의해 유래된 인자는 아데노신 디누클레오티드 (혈소판 응집을 유도하고, 세포 증식 및 이동을 자극함), 베타-트롬보글로불린, bFGF, CTAP-3 (결합조직 활성화 단백질-3), EGF, 호산구 화학주성 폴리펩티드-1 (즉, RANTES), f-ECGF (섬유모세포에 의해 유래된 내피세포 성장 인자), 피브로넥틴 (혈소판 응집에 대한 조기 기질 리간드로서 작용함), HCI (인간 콜라게나아제 억제제), HGF (간세포 성장 인자), HRF (히스타민-방출 인자), IGF-BP-3, NAP-2 (호중구 활성화 단백질-2), NAP-4 (호중구 활성화 단백질-4), PBP (혈소판 염기성 단백질), PD-ECGF (혈소판에 의해 유래된 내피세포 성장 인자), PDGF, PF4, 혈소판 활성화 인자 (PAF, 혈소판 응집과도 관련됨), 세로토닌 (관 투과성을 유도하고, 호중구에 대한 화학주성물질임), 소마토스타틴, TGF-알파, TGF-베타, 트롬복산 A2 (혈관수축, 혈소판 응집, 및 화학주성과 관련됨), 비트로넥틴을 포함한다.

순환하는 말초 혈액 백혈구는 상처 공간으로 이동한다. 상처 영역에 첫번째로 나타나는 세포는 호중구이다. 호중구 일원은 상처후 약 24시간 후에 최고 수준에 도달한다. 이들의 이동은 보체 인자, IL1, TNF-알파, TGF-베타, 및 케모카인, 예를들어 IL8, GRO-알파, PF4, MCP-1, IP-1O 및 mig를 포함하는 다양한 화학주성 인자 및 사이토카인, 또는 박테리아 다당류에 의해 자극된다. 호중구는 내피 표면에서 호중구 수용체로 작용하는 셀렉틴에 의해 내피에 부착한다. 호중구 세포 표면 상의 인테그린 수용체는 세포외기질에 대한 호중구의 결합을 촉진한다. 호중구가 고갈된 동물에서 상처가 치유될 수 있는 것으로 보아 호중구는 감염이 없는 경우의 상처 이유에서 중요한 역할을 하는 것으로 보이지 않는다. 호중구는 이들이 더 이상 필요하지 않는 경우에 조직 대식세포에 의해 제거된다.

단핵구는 상처후 약 24시간 후에 출현하고, 상처후 48시간 후에 최대에 도달한다. 단핵구가 대식세포로 성숙한 이래로, 이들은 수복 과정을 일으키는 필수적인 사이토카인 공급원으로 간주될 수 있다. 대식세포 및 단핵구가 또한 다양한 케모카인에 의해 유인된다. 이들 케모카인은 백혈구 서브셋의 공간적이고 일시적인 다양한 침윤에 기여하고, 따라서 상처 수복 동안의 염증 및 회복 과정을 조정한다.

조직 대식세포는 상처 치유 과정을 본질적으로 통제하고 조절하는 세포이고, 상처 대식세포의 고갈을 포함하는 실험에 의해 나타나는 바와 같이 상기 세포의 참여 없이 상처는 치유될 수 없다. 대식세포의 분화는 여러 특이적 사이토카인에 의해 개시된다. 다수의 사이토카인은 상처 영역으로의 염증 세포의 이동을 추가로 촉진하는 활성화된 대식세포에 의해 생성되고 분비된다. 대식세포는 또한 세포외 기질의 붕괴를 조절하고, 상처 기질의 재형성을 조절한다. 대식세포는 TGF-베타, FGF 및 VEGF를 포함하는 사이토카인 및 성장인자, 및 JE와 같은 케모카인을 분비한다.

TGF-베타는 육아 조직의 형성 및 세포외 기질의 단백질의 합성을 책임지는 주요 인자인 것으로 보이고, 따라서 "상처 호르몬"으로 언급된다. TGF-베타는 다양한 TGF-베타 이소형 및 기타 과의 일원, 예를들어 액티빈 A 및 BMP로 구성된 사이토카인 상과의 가장 복잡한 그룹중 하나의 일원이다. 상처 치유 과정의 복잡성은 TGF-베타 상과 일원의 비, 특히 TGF-베타-1 대 TGF-베타-3의 비의 조작이 흉터형성 및 섬유증을 감소시키는 관찰에 의해 예시된다.

재-상피화는 성장 인자의 EGF과의 화학주성 및 분열촉진 성장 인자에 의해 매개된다. 렙틴이 상처 치유 동안의 각질세포에 대한 효능있는 성장 인자인 것으로 밝혀졌다.

상처 치유의 최종 단계는 결합 조직에 의한 육아 조직의 점진적 대체로 특징된다. 이러한 과정은 또한 국소적으로 작용하는 사이토카인을 필요로 한다. 그러나, 수복 과정이 완료된 후 최후에는 조직 성장을 억제하는 인자 및 메커니즘에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 콜라겐 및 단백질분해효소 억제제의 합성은 특히 TGF-베타 및 관련 인자에 의해 자극된다. 상처의 폐쇄 및 흉터 발달은 통상적인 근육섬유모세포의 소실을 포함하는 세포충실성의 급격한 감소와 관련된다. 아폽토시스에 의한 세포 사멸은 육아조직을 흉터로 발달시키는 것을 책임지는 메카니즘으로 제안되어졌다.

태아 상처 치유는 흉터형성의 부재를 특징으로 한다. 태아 및 성인 섬유모세포가 이동 활성, 사이토카인에 대한 분열촉진 반응, 및 분열촉진 사이토카인, 성장 인자 및 기질 거대세포의 합성과 관련하여 표현형적으로 차이를 나타내는 몇몇 증거가 존재한다.

성장 인자 및 사이토카인의 작용을 조절함으로써, 상처 치유를 가속화시키거나 변형시키는 것이 가능하다. 동물 실험 및 임상 실험은 bFGF, EGF, KGF, PDGF 및 TGF-베타를 포함하는 다양한 사이토카인의 단독 또는 조합의 국소 투여가 육아조직 형성을 자극하고 상피화를 향상시킴으로써 상처 치유를 현저하게 가속화시킴을 입증하였다.

적절한 내인성 표적 화합물은 염증의 급성기 단백질을 포함한다. 이러한 단백질 및 이들의 기능의 적절한 예가 하기 표 2에 제공된다.

표 2

단백질	기능
알파-1 산 당단백질	콜라겐과 상호작용 섬유모세포 성장 촉진 특정 스테로이드에 결합
알파-1 항키모트립시노겐	프로테아제 억제제
알파-1 항트립신	프로테아제 억제제 폐기종의 분해
알파-2 항플라스민	응고 캐스케이드의 조절
알파-2-마크로글로불린	여러 혈청 프로테아제의 억제 및 기타 기능
항트롬빈-3	응고 캐스케이드의 조절
C1 억제제	보체 캐스케이드의 부정적 조절
C2	보체 성분
C4	보체 성분
C4	보체 성분
C4 결합 단백질	보체 성분
C5	보체 성분
C9	보체 성분
C-반응성 단백질	막 포스포릴콜린에 대한 결합 보체 활성화 및 옵소닌화 T-세포 및 B-세포와의 상호작용
세룰로플라스민	구리 운반 단백질 반응 산소 제거제
인자 Ⅷ	수복을 위한 섬유소 기질의 응고 형성
인자-B	보체 성분
페리틴	철 운반 단백질
피브리노겐	수복을 위한 섬유소 기질의 응고 형성
피브로넥틴	섬유소 응고 형성
합토글로빈	헤모글로빈 제거제
헴 옥시게나아제	헴 분해
헤모펙신	헴 결합 및 운반 단백질
헤파린 보조인자-2	단백질분해효소 억제제
칼리크레인	관 투과성 및 확장
LPS 결합 단백질	대식세포 활성화
망간 수퍼옥시드 디스뮤타아제	구리 아연 결합 단백질 반응산소종의 형성
만노오스-결합 단백질	혈청 렉틴
플라스미노겐	보체, 응고, 섬유소용해의 단백질분해 활성화
플라스미노겐 활성인자 억제제-1	프로테아제 억제제
프로트롬빈	수복을 위한 섬유소 기질의 응고 형성
혈청 아밀로이드 A	콜레스테롤 및 HDL 제거제
혈청 아밀로이드-P	IgG 면역 복합체의 형성
폰 빌레브란트(von Willebrand) 인자	응고 단백질
IL1ra (IL1 수용체 길항제)	IL1ra

급성기 단백질의 주요 유도인자는 IL1, IL6 및 TNF이다. 두개의 매개체 IL1 및 IL6가 급성기 단백질을 두개의 서브그룹으로 분류하기 위해 사용되어왔다. 타입-1 급성기 단백질은 최대 합성을 위해 IL6 및 IL1의 상승작용적 활성을 필요로 하는 단백질이다. 타입-1 단백질의 예는 C-반응성 단백질, 혈청 아밀로이드 A 및 알파-1 산 당단백질이다. 타입-2 급성기 단백질은 최대 유도를 위해 IL6만을 필요로 하는 단백질이다. 타입-2 단백질의 예는 피브리노겐 사슬, 합토글로빈 및 알파-2-마크로글로불린이다. 타입-2 급성기 단백질을 엔코딩하는 유전자의 발현은 IL1에 의해 종종 향상되기보다는 억제된다 (Ramadori et al; Fey et al). 사이토카인과 급성기 단백질의 발현에 영향을 주는 기타 매개체 물질 사이에 추가적이고 상승작용적이고, 협동적이고, 길항적인 효과가 거의 모든 조합물에서 발생하고, 관찰되었다. 다수의 사이토카인은 또한 하나 또는 두개의 급성기 단백질의 합성을 유도하지만 나머지는 유도하지 않는 특이한 효과를 나타낸다. 예를들어, 액티빈 A는 HepG2 세포에서 급성기 단백질의 서브셋을 유도한다. 박테리아 지질다당류 및 여러 사이토카인(주로 IL1, IL6 및 TNF 뿐만 아니라 LIF, CNTF, 온코스타틴 M, IL11, 및 카디오트로핀-1)이 SAA 합성의 유도에 관여되고, 이들 사이토카인중 몇몇은 상승작용적으로 작용한다 (Benigni et al).

IL1 및 IFN-감마는 IL6의 효과중 일부를 감소시킨다. IL2 및 IL6의 효과중 일부가 TGF-베타에 의해 길항된다. 두개 이상의 사이토카인의 조합된 작용은 자신의 인자가 이루지 못하는 효과를 생성한다. 배양된 HepG2 간암 세포에서, IL1, IL6, TNF-알파 및 TGF-베타는 항키모트립신의 합성을 유도하고, 동시에 알부민 및 AFP (알파-태아단백질)의 합성을 억제한다. 피브리노겐의 합성은 IL6에 의해 유도되고, 이러한 효과는 차례로 IL1-알파, TNF-알파 또는 TGF-베타-1에 의해 억제된다.

적절한 내인성 표적 화합물은 지혈 및 응고 캐스케이드와 관련된 내인성 화합물을 포함한다. 모세관 투과성 및 혈관 투과성과의 관련과는 별개로, 혈관의 내피는 응고 및 섬유소용해의 활성인자 및 억제제를 제공함으로써 비-혈전형성 표면을 유지시키는 결정적인 역할을 한다. 내피는 또한 다양한 면역학적 과정의 조절에 관여한다.

내피세포에서, IL1은 특히 다양한 콜로니 자극 인자, IL6, TNF-알파, 프로스타글란딘, 혈소판 활성화 인자 (PAF), 플라스미노겐 활성인자 억제제 (PAI)의 합성을 유도한다. IL1의 중요한 내인성 조절인자는 IL1 및 TNF-알파의 분비를 억제하는 PGE2이다. 특히, TNF-알파는 트롬빈의 생성을 촉매하는 인자 X 활성인자 복합체의 형성에 관여하는 조직 트롬보플라스틴 (TPL)의 합성을 유도한다. 이러한 복합체는 또한 인자 IX를 활성화시킨다. TNF-알파는 또한 내피세포에 의해 IL1의 합성을 유도하고, 이러한 IL1은 또한 내피세포에 의해 TPL의 생성을 촉진할 수 있다. TNF-알파의 합성은 또한 IL1에 의해 유도될 수 있다. TNF-알파 및 IL1은 또한 세포 표면 항원의 합성을 유도한다. 부착 분자의 발현은 혈관벽에서의 림프구 및 백혈구의 부착을 증가시키고, 이에 따라 이들 세포의 내피통과 이동을 촉진한다. TNF-알파 및 IL1은 트롬보모둘린의 합성을 억제함으로써 단백질 C 불활성화 시스템을 하향 조절한다. 트롬빈과 함께 복합체화된 트롬보모둘린은 이후 막 결합된 단백질 S와 복합체화될 수 있는 단백질 C를 활성화시킨다. 이러한 복합체는 인자 Va를 억제한다. 활성화된 단백질 C는 또한 복합체 형성에 의해 플라스미노겐 활성인자 억제제 (PAI)를 중화시킨다. 따라서, TNF-알파 및 IL1은 인자 Va의 불활성화를 감소시킨다.

응고와 관련된 기타 적절한 내인성 표적 화합물은 칼리크레인, 인자 XII, 인자 XIb, 인자 XI, 인자 XIa, 인자 IX, 인자 IXa, 인자 VIII, 인자 VIIIa, 인자 X, 인자 Xa, 인자 Va, 인자 XIIIa, 프로트롬빈, 트롬빈, 피브리노겐, 피브린, 플라스미니겐, 플라스민을 포함한다.

적절한 내인성 표적 화합물은 또한 호르몬, 예를들어 스트레스 호르몬(예를들어, 아드레날린, 부신피질자극 호르몬, 코르티코스테론, 에피네프린, 성장 호르몬, 히드로코르티손), 유체/전해질 및 관 호르몬 (예를들어, 알도스테론, 안드로스텐디온, 바소프레신, 브라디키닌, 칼시토닌, 뉴로텐신), 간 및 소화 호르몬 (예를들어, 콜레시스토키닌, 콜레스테롤, VIP), 생식 호르몬 (예를들어, 융모성 성선자극 호르몬, 에포겐, 에스트라디올, 에스트리올, 에스트론, 에티오콜라놀론, FSH, 최유 호르몬, 황체형성 호르몬, 테스토스테론, 옥시토신, 프로게스테론, 프로락틴, 성선자극호르몬), 당 조절 호르몬 (예를들어, 글루카곤, 인슐린), 갑상샘 호르몬 (예를들어, T2, T3, T4, 갑상샘자극 호르몬, 갑상샘자극 방출 인자, TSH, 부갑상샘 호르몬), 골 호르몬 (예를들어, CSF-1, RANKL, 골 형태형성 단백질과 일원), 및 기타 호르몬, 예를들어 갑상샘자극 호르몬 (TSH), 난포자극 호르몬 (FSH), 황체형성 호르몬 (LH), 프로락틴 (PRL), 성장 호르몬 (GH), 부신피질자극 호르몬 (ACTH), 항이뇨 호르몬 (ADH)(바소프레신), 옥시토신, 갑상선자극 호르몬 방출 호르몬 (TRH), 성선자극 호르몬 방출 호르몬 (GnRH), 성장호르몬 방출 호르몬 (GHRH), 코르티코트로핀 방출 호르몬 (CRH), 소마토스타틴, 도파민, 멜라토닌, 티록신 (T4), 칼시토닌, 부갑상샘 호르몬 (PTH), 글루티코코르티코이드 (예를들어, 코르티솔), 광질코르티코이드 (예를들어, 알도스테론), 안드로겐 (예를들어, 테스토스테론), 아드레날린 (에피네프린), 노르아드레날린 (노르에피네프린), 에스트로겐 (예를들어, 에스트라디올), 프로게스테론, 인간 융모성 성선자극 호르몬 (HCG), 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 아밀린, 에리트로포이어틴 (EPO), 칼시트리올, 칼시페롤 (비타민 D3), 심방나트륨이뇨 펩티드 (ANP), 가스트린, 세크레틴, 콜레시스토키닌 (CCK), 소마토스타틴, 뉴로펩티드 Y, 그렐린, PYY3-36, 인슐린-유사 성장인자-1 (IGF-1), 안지오텐시노겐, 트롬보포이어틴, 렙틴, 레티놀 결합 단백질 4, 및 아디포넥틴을 포함한다. 추가의 적절한 호르몬은 표 3에 나열되어 있다.

표 3

내분비샘	호르몬	약어	주요 기능(들)
송과체	멜라토닌		생물학적 시계
시상하부	항이뇨 호르몬	ADH	유체 및 전해질 균형을 유지하기 위해 신장에서 작용함
	프로오피오멜라노코르틴	POMC	ACTH 및 MSH에 대한 전구체 호르몬
뇌하수체	황체형성 호르몬	LH	여성에서, 이 LH는 에스트로겐의 생성을 자극하고 배란을 유도하기 위해 난소에서 작용함. 남성에서, 이 LH는 테스토스테론의 생성을 자극하기 위해 고환에서 작용함
	난포자극 호르몬	FSH	여성에서, FSH는 난포의 성숙을 자극함. 남성에서, FSH는 세르톨리 세포에서 작용하고 정자 생성의 조절에 관여함
	부신피질자극 호르몬	ACTH	ACTH는 코르티솔의 생성을 자극하기 위해 부신에서 작용함
	성장 호르몬	GH	GH는 성장을 자극하기 위해 여러 조직에서 작용함
	프로락틴	Prl	수유 동안 밀크를 분비시킴
	멜라닌세포 자극 호르몬	MSH	피부 색을 자극함
	갑상샘 자극 호르몬	TSH	TSH는 티록신의 생성을 신호전달하기 위해 갑상샘에서 작용함
췌장	인슐린		혈당 수준을 조절함
갑상샘	삼요오드티로닌 및 티록신	T3 및 T4	뇌 및 생식관을 발달시키고 대사를 조절함
부신	코르티솔		면역 억제 및 스트레스 반응
	데히드로에피안드로스텐디온	DHEA
난소	에스트로겐(에스트라디올, 에스트론, 에스트리올)	E2, E1, E3	성장 촉진, 결합조직의 탄력성 유지, 골밀도 보존, 및 관 탄성 유지
	프로게스테론	P4	임신 준비에서 내막 유지
	테스토스테론	T	에스트로겐에 대한 전구체이고, 성욕에 작용함
	인히빈		뇌하수체 FSH 분비에 대한 피드백 조 절
고환	테스토스테론	T	남성 이차성징의 성장, 정자 생성 및 성욕
	디히드로테스토스테론	DHT	약간의 남성 이차성징
	인히빈		뇌하수체 FSH 분비에 대한 피드백 조절
태반	프로게스테론	P4	임신 유지
	에스트리올	E3

표 4는 적절한 내인성 표적 화합물 및 본원에 기술된 리간드를 지니는 내인성 화합물을 표적으로 하는 바람직한 치료제의 비제한적 목록을 제공한다. "예시적 적응증" 컬럼은 내인성 표적 화합물 또는 상기 내인성 표적 화합물의 단편 또는 변형체의 아미노산 서열을 함유하는 CAS 등록소 또는 유전자은행 데이터베이스에서의 기재사항에 상응하는 화학 초록 서비스(CAS) 등록 번호(미국 화학협회에 의해 공개됨) 및/또는 유전자은행 등록 번호((예를들어, www.ncbi.nlm.nih.gov의 미국생명공학정보센터(NCBI)를 통해 이용가능한 로커스 ID, NP_XXXXX (참조 서열 단백질), 및 XP_XXXXX (모델 단백질) 인식자)를 제공한다. 이러한 CAS 및 유전자은행의 각각과 관련된 요약 페이지 및 GenSeq 등록 번호 뿐만 아니라 인용된 간행물 (예를들어, PubMed ID 번호 (PMID))이, 특히 거기에 기술된 아미노산 서열과 관련하여 전체 내용이 참조로서 포함되어 있다. "생물학적 활성" 컬럼은 내인성 표적 화합물과 관련된 생물학적 활성을 기술한다. "바람직한 적응증" 컬럼은 지정된 내인성 표적 화합물에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드에 의해 치료되거나, 예방되거나, 진단되거나, 개선될 수 있는 질병, 장애, 및/또는 질환을 기술한다.

본 발명은 또한 표 4에 기술된 임의의 상응하는 바람직한 적응증을 치료하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 표 4에 기술된 임의의 내인성 표적 화합물에 대해 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 표 4에 나열된 상응하는 내인성 표적 화합물에 대해 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 유효량을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 표 4에 나열된 임의의 바람직한 적응증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

표 4

내인성 표적 화합물	식별자	생물학적 활성	바람직한 적응증
산성 FGF	로커스ID:2246	산성 섬유모세포 성장 인자 1 수용체를 발현하는 세포에 결합함	관 질병
액티빈(액티빈A); EDF, 인히빈, 베타A)	CAS-114949-22-3 로커스ID:3624 NP_002183 XP_004832	인히빈 베타 A 서브유닛의 동종이합체로 구성된 인히빈 A 복합체는 성선 간질 세포 증식을 부정적으로 조절하고 종양 억제 활성을 지니는 것으로 밝혀진 뇌하수체 FSH 분비 억제제이다. 또한, 이러한 복합체의 혈청 수준은 과립층 세포 종양의 크기를 반영하는 것으로 보이며, 따라서 원발성 질병 뿐만 아니라 회귀성 질병에 대한 마커로서 사용될 수 있음.	골절; 폐경후 골다공증; 암; 남성 불임증; 여성 불임증; 낫적혈구 빈혈
액티빈 베타 c(인히빈, 베타 c)	로커스ID:3626 NP_005529 XP_006661	인히빈 베타 C 서브유닛은 인히빈/액티빈 베타 A 및 베타 B 서브유닛과 유사하고, 형질전환 성장 인자-베타 상과의 일부일 수 있음	신경변성 장애; 상처 치유; 간 재생

아데노신 데아미나아제	로커스ID:100 NP_000013 XP_009517	아데노신 데아미나아제는 아데노신의 이노신으로의 가수분해를 촉매함.	중증복합면역결핍증(SCID)을 지닌 환자에서의 아데노신 데아미나아제 결핍
아디포신	CAS-9035-55-6 유전자은행:223277 유전자은행:223281	아디포신은 전구체 단백질인 프레-프로-오피오멜라노코르틴(POMC)의 연속적 분해에 의해 생성됨. 아디포신은 뇌 멜라노코르틴-4-수용체의 활성화를 통해 음식 흡수 조절에서 중요한 역할을 함.	비만; 암
아구티(Agouti) 신호전달 단백질	로커스ID:434 NP_001663 XP_009476	아구티 신호전달 단백질(ASP)은 132개의 아미노산의 단백질로, 이를 엔코딩하는 mRNA는 고환, 난소 및 심장에서 발현되고, 간, 신장 및 포피에서 낮은 수준으로 발현됨. ASP는 연장 유전자(호르몬[알파-MSH]을 자극하는 알파-멜라닌세포에 대한 멜라닌세포 수용체를 엔코딩함)와 상호작용하고, 세포 배양에서의 ASP의 발현은 마우스 흑색종 세포에서 알파-MSH에 의해 자극되는 cAMP의 축적을 차단함.	색소침착 장애; 비만
알파 글루코시다아제(산 알파-글루코시다아제; 폼파아제)	로커스ID:2548 NP_000143 XP_012708	글리코겐에서의 알파1-6결합의 가수분해; 가지제거 효소; 근육, 간 및 기타 조직에서의 당의 분해	폼페병
알파-갈락토시다아제 (아르기노숙시네이트 리아제; 베타-글루코시다아제; x-갈락토시다아제 A; 아갈시다아제 알파; CC-갈락토시다아제	로커스ID:2717 NP_000160 XP_010108	글리코스핑고지질 갈락토실갈락토실글루코실세라미드로부터 갈락토오스 잔기의 가수분해	파브리병

알파-L 이두로니다아제(알로니다아제; 라로니다아제; 이두로나토-2-술파타아제)	로커스ID:3425 NP_000194	이두로니다아제는 더마탄 설페이트 및 헤파란 설페이트의 분해에 관여하는 리소좀 효소임.	점액다당류증I; 점액다당류증Ii; 후를러 증후군; 후를러-샤이에 증후군; 샤이에 증후군; 헌터 증후군
안지오포이어틴1	NP_001137	안지오포이어틴 1은 Tie 수용체를 통해 혈관신생의 조절에 관여하는 성장 인자임.	염증 장애; 심혈관 장애
안지오포이어틴2	유전자은행: BAA95590	안지오포이어틴 2는 Tie 수용체를 통해 혈관신생의 조절에 관여하는 성장 인자임.	암
안지오스타틴 (안지오스타틴)	CAS-86090-08-6 로커스ID:5340 NP_000292 XP_004371	안지오스타틴은 플라스미노겐(처음 4개의 크린글 구조를 함유함)의 내부 단편으로 존재함. 안지오스타틴의 개별적 또는 조합된 크린글 구조는 모세관 내피세포 증식의 효과를 억제하는 것으로 나타남.	고형 종양
항-도살라이징(dorsalizing) 형태형성 단백질-1 (ADMP)	유전자은행: AAC59736 유전자은행: AAD52011	ADMP는 인간 골 형태형성 단백질-3과 관련됨. 이의 발현은 창자배형성 동안 최고에 달하고, 등 및 전방 구조의 용량 의존성 억제를 야기함.	암
AP02 리간드 (TRAIL)	로커스ID:8743 NP_003801 XP_003200	세포 사멸을 매개하는 종양 괴사인자 리간드 상과의 타입 Ⅱ 당단백질; TRAIL은 다양한 계통의 광범위한 형질전환된 세포주에서 아폽토시스를 유도할 수 있으나, 정상 세포는 사멸시키지 않는듯 함.	암

어레스틴	유전자은행: AF72630	어레스틴은 내피세포 증식, 이동, 관형성, 및 마트리겔(Matrigel) 혈관신생을 억제함으로써 항-혈관신생 분자로 작용함.	암; 고형종양
아릴술파타아제 B (BM102; 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-4-술파타아제; rhASB)	로커스ID:411 NP_000037 유전자은행: AAB19988 유전자은행: CAA51272 유전자은행: AAA51784 유전자은행: AAA51779	아릴술파타아제 B 동종이합체는 N-아세틸-D-갈락토사민, 콘드리오틴 설페이트, 및 더마탄 설페이트의 설페이트기를 가수분해함. 이러한 단백질은 리소자임에 대해 표적화됨. 이러한 유전자의 결함은 마로토라미 증후군을 야기함.	점액다당류증VI
아스파르기나아제	CAS-130167-69-0 유전자은행: CAA01168	아스파라기나아제는 L-아스파라긴의 가수분해를 책임지는 효소임.	급성 림프모구 백혈병
살균 투과성 증가 단백질 21	로커스ID:671 NP_001716 AAA51841	살균 활성을 지니는 LBP, CETP 및 PLTP와 유사한 막결합 단백질.	안구 염증; 낭성 섬유증; 출혈성 외상; 복강내 감염; 수막구균 감염; 수막구균혈증; 중이염; 부분 간절제술; 톡소포자충증
BDNF (뇌에 의해 유래되는 신경영양 인자)	로커스ID:627 NP_001700 XP_006027	뇌에 의해 유래된 신경영양 인자는 중추신경계에 위치되거나 이에 직접적으로 연결된 신경 집단의 생존을 촉진함.	근위축성 측삭 경화증; 신경변성

B-글루코세레브로시다아제	CAS-143003-46-7 CAS-154248-97 -2 로커스ID:2629 NP_000148 XP_002191	글루코세레브로시다아제(베타-글루코시다아제)는 글루코실세라미드로부터 글루코오스를 제거하여 세라미드를 생성시키는 것을 촉매함.	고셔병
BMP-2 (골 형태형성 단백질 2; 골 관련 단백질)	CAS-192509-82-3 로커스ID:650 NP_001191 XP_009629	BMP2는 형질전환 성장인자-베타(TGFB) 상과에 속함. 골 형태형성 단백질은 골 형성을 유도함. BMP2는 진행성 화골성 섬유형성이상(근육염)의 보통 우세 질병에 대한 후보자임.	골 재생; 골 및 조직 수복; 암
BRCA1 (BRCA1 종양 억제 단백질)	로커스 ID:672 NP_006759 XP_007013	인간 유방암 세포의 종약 억제인자인 BRCA1은 RNA 중합효소 II 완전효소와 관련된 핵 인단백질임. RCA1은 전사 조절인자로서 기능하고, 또한 분비 성장 억제 단백질로서 기능하는 그라닌 유사 단백질임.	암; 유방암; 전립선암; 난소암
BRCA2	로커스 ID:675 NP_000050 XP_007138	인간 유방암 세포의 종약 억제인자인 BRCA1은 RNA 중합효소 II 완전효소와 관련된 핵 인단백질임. BRCA2는 전사 조절인자로서 기능하는 BRCA1을 지닌 이합체 복합물로 존재하고, 또한 분비 성장 억제 단백질로서 기능하는 그라닌 유사 단백질임.	암; 유방암; 난소암

칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP)	CAS-83652-28-2 CAS-83652-28-2 로커스 ID:796 로커스 ID:797 로커스 ID: 27297 NP_001732 NP_000719 NP_055293 XP_006209 XP_006016 XP 004758	CGRP는 효능있는 혈관확장제, 및 내피세포 및 골모세포 증식의 조절인자임. CGRP의 추가 효과는 위액 분비 감소, 체온 증가, 식욕부진 효과, 및 심장에 대한 긍정적인 수축 및 심박증가 효과를 포함함.	협심증; 부정맥; 심장부전; 고혈압; 폐경후기 골다공증; 레이노병; 거미막밑 출혈
칼레티쿨린	로커스 ID:811 NP_004334 XP_009055 유전자은행: AH02500	칼레티쿨린은 소포체의 루멘에서 주요 Ca(2+)-결합(저장) 단백질로 작용하는 다기능성 단백질임. 칼레티쿨린은 핵 호르몬 수용체에 의해 유전자 전사의 조절의 중요한 조절인자로서 작용할 수 있음.	암; 상처 치유
CD4	로커스 ID:920 NP_000607 XP_006966	CD4는 신호전달에서 세포-세포 상호작용에서 역할을 하는 T-세포 표면 당단백질임. CD4는 HIV의 gp120에 결합하고, HIV 진입을 위한 세포 표면 수용체임	Hiv 감염
CD40 리간드	로커스ID:959 NP_000065 XP_010367	CD40-L은 T 세포의 표면에서 발현됨. 이는 B 세포 표면 상에서 CD40을 속박함으로써 B 세포 기능을 조절함. 이러한 유전자의 결함은 면역글로불린 클래스 전환을 할 수 없게 만들고, 과 IgM 증후군과 관련됨.	내피 고형암; 두경부암; 면역결핍 장애; 비호지킨 림프종; 신장암; 신장세포 암종; 고형암; 바이러스 감염

케모카인 결합 단백질 (CBP 1; CPB 2)	로커스ID:1238 NP_001287 XP_003126 로커스ID:1241 NP_000743 XP_007314	케모카인 결합 단백질은 케모카인 매개 신호전달에 관여됨.	이식 거부; 심혈관 질병; 류마티스 관절염; 염증 장애; 면역계 장애
섬모 신경영양 인자(CNTF)	로커스ID:1270 NP_000605 XP_006012	CNTF는 신경계에서 광범위한 세포 유형의 분화 및 생존을 촉진함.	근위축성 측삭 경화증; 당뇨성 신경병증; 헌팅턴병; 비만; 신장 장애; 타입2 당뇨병
콘토르트로스타틴	CAS-153858-68-5	콘토르트로스타틴은 인테그린을 길항시키는 독특한 이합체 디스인테그린임.	암 전이; 혈전증; 뇌졸중
코르티코트로핀 방출 인자 결합 단백질	로커스ID:1393 NP_001873 XP_003672 유전자은행: P24387 유전자은행: CAA41086	코르티코트로핀 방출 인자(CRF)는 염증 및 스트레스 관련 반응의 말초 및 중추 매개체임. CRF-결합 단백질은 CRF를 불활성화시킴.	류마티스 관절염; 염증
CTLA4	로커스ID:1493 NP_005205 XP_002490	CTLA4는 활성화된 T 세포에서 일반적으로 발현되는 B7 리간드 수용체임. CTLA4 Ig는 항염증 활성을 지닌 가용성 키메라 수용체임.	기관 이식 거부; 알레르기; 류마티스 관절염; 이식편-대-숙주병; 건선; 타입1 당뇨병; 외래이식 거부

데코린	로커스ID: 1634 XP_012239 NP_001911	특화된 콜라겐 및 SLRP과의 이러한 일원은 콜라겐 및 성장인자와 상호작용하는 소규모의 프로테오글리칸이고, 기관 발달 및 형성 동안 내피/중간엽 상호작용에 관여됨.	암; 당뇨성 신장병증; 염증 장애; 수술후 유착; 폐 섬유증
Del-1 (발달적으로 조절되는 내피 로커스-1; EDIL3; EGF-유사 반복 및 디스코이딘 I-유사 도메인 3)	로커스ID: 10085 유전자은행: U70312 NP_005702 XP_003954	알파v베타3 인테그린 수용체에 대한 신규한 리간드이고, 태아 발달에서 관 형태형성 또는 재형성을 조절하는 기능을 할 수 있음.	허혈; 암; 재협착
DNASE	CAS- 143831-71- 4 CAS-9003- 98-9 CAS- 132053-08- 0 로커스ID: 1773 NP_005214 XP_008097	Dnase는 선택적으로 DNA를 분해하고, 높은 세포 전환의 부위에서 핵 항원으로부터 DNA를 제거함.	만성 폐쇄폐병; 낭성섬유증; 루푸스 신장염

엑토아피라아제 (CD39과; 인간 엑토아피라아제(엑토-ADPases); CD39-L2; CD39-L4)	로커스ID:953 로커스ID:954 로커스ID:955 로커스ID:956 로커스ID:957 NP_001767 NP_001237 NP_001238 NP_001239 NP_001240 XP_005712 XP_011771 XP_009435 XP_003296 XP_007435	세포외 누클레오티드의 이화작용을 매개함	심근경색증; 뇌졸중
EGF (내피 성장 인자;	CAS-62229-	EGF는 이기능성 조절 특정을 지님: 이는 여러 내피 종양세포의 성장을 억제하고, 섬유모세포 및 기타 세포 유형의 성장을 자극함.	위궤양; 상처 치유; 관상 재협착; 관 재협착; 비소세포 폐암; 건선
EMAP II (내피 단핵구 활성화 폴리펩티드 II)	로커스ID:9255 로커스ID:13722 NP_004748 XP_003390	EMAP-II는 혈관신생을 억제하고, 염증전 매개인자의 특성을 나타내고, 시험관내 및 생체내의 내피세포에서 유효한 효능을 발휘하는 종양에 의해 유래되는 사이토카인임.	암
FGF-1	로커스ID:2246 NP_000791	FGF-1은 증식 및 혈관신생을 자극함.	말초혈관병; 말초 동맥폐쇄성 질병; 중요 사지 허혈

FGF-2 (섬유모세포 성장 인자-2; 섬유모세포)	CAS-131094-16- 1 로커스ID:2247 NP_001997 XP_003306	섬유모세포 성장 인자. 혈관신생 성장 인자	관상 장애; 골절; 치주병; 말초혈관병; 폐경후 골다공증; 피부궤양; 뇌졸중; 말초 동맥병; 관상 동맥병
FLT3 리간드	로커스ID:2323 NP_001450 XP_008921	조혈 전구세포의 성장 및 생존을 자극함. 수지상 세포 발달을 자극함.	화학보호; 혈액작용 장애; 악성흑색종; 골수억제; 비호지킨 림프종; 전립선암; 줄기세포 가동화
폴리트로핀	CAS-146479-72- 3 CAS-56832-30-5 CAS-110909-60-9 CAS-150490-84-9 CAS-97048-13-0 로커스ID:1081 로커스ID:2488 NP_000726 NP_000501 XP_011444 XP 006316	폴리트로핀은 cAMP 경로를 통한 스테로이드 생성을 자극하는 뇌하수체 당단백질 호르몬임.	여성 불임증; 남성 불임증

GDNF (아교세포에 의해 유래되는 신경영양 인자; 뉴르투린)	CAS-185857-51-6 로커스ID:2668 NP_000505 XP_003703	아교세포에 의해 유래되는 신경영양 인자(GDNF)는 수용체 티로신 키나아제 Ret를 통해 세포내적으로 작용하는 형질전환 성장인자-베타(TGF-베타) 상과의 먼 일원임. GDNF는 중뇌 도파민 뉴런, 운동뉴런, 노르아드레날린 뉴런, 뿐만 아니라 교감, 부교감 및 감각 뉴런에 대한 효능있는 생존 인자임. 그러나, 운동뉴런을 제외한 대부분의 뉴런 집단에 대해, TGF-베타가 GDNF에 대한 보조인자로서 필요함. GDNF는 또한 신장 발달에서 요관가지를 촉진하고 정자발생을 조절하는, 신경계 외부에서의 별개의 기능을 지님.	근위축성 측삭 경화증; 파킨슨병; 헌팅턴병
젤솔린	로커스ID:2934 NP_000168 유전자은행: CAA28000	젤솔린은 액틴 미세섬유를 절단하고 캡핑시키고, 낭성섬유증 가래의 점도를 감소시키는 것으로 밝혀진 칼슘 의존성 단백질임.	기관지염; 낭성섬유증
아교세포 성장 인자-2 (GGF-2; 뉴레귤린1)	로커스ID:3084 NP_039256 유전자은행: AAB59622	GGF2는 크린글 유사 서열과 Ig 및 EGF 유사 도메인을 함유하는 뉴레귤린1의 이소형임. GGF2 수용체는 티로신 키나아제 막횡단 수용체의 ERBB과의 일원임. ERBB 수용체와의 상호작용을 통해, GGF2는 중추신경계에서의 뉴런 및 미세섬유 발달에서 중추적인 역할을 함.	다발성 경화증; 화학요법에 의해 유도되는 신경병증; AIDS 신경병증; 당뇨병 신경병증; 말초 신경병증

글루카곤	CAS-16941-32-5 CAS-118549 37-4 로커스ID:2641 NP_042045 XP_002210	글루카곤은 랑게르한스의 테이슬렛(theislet)의 A 세포에서 유리된 29개의 아미노산 펩티드 호르몬임. 글루카곤은 혈당 농도의 저하에 대한 반응으로 생성됨. 이의 효과는 혈청 글루코오스를 상승시킴. 인슐린 의존 당뇨병에서 중증 저혈당증의 치료에서, 글루카곤은 글리코겐의 글루코오스로의 전환을 자극시킴으로써 간이 글루코오스를 방출하게 함. 글루카곤은 또한 위장 평활근을 느슨하게 하여, 방사선 검사를 개선시킴.	저혈당증; 위장관 진단; 당뇨병; 비만; 타입2 당뇨병
HBNF (헤파린-결합 신경영양 인자; PTN; 플레이오트로핀; 헤파린 결합 성자 인자 8; 신경돌기 성장 촉진 인자 1; NEGF1)	로커스ID:5764 NP_002816 유전자은행: AAA41311 유전자은행: M68916	HBNF는 뉴런에서 신경돌기 성장을 자극하고, 래트 뇌에서 발달적으로 조절되는 방식으로 발현됨.	신경병증; 신경계장애
HCG (인간 융모막 성선자극 호르몬; 임신 뇨 호르몬; 오비드렐; 오비드렐레; APL)	로커스ID:1081 로커스ID:1082 NP_000726 NP_000728 XP_011444 XP_012903	인간 융모막 성선자극 호르몬은 통상적인 알파 사슬, 및 티로트로핀, 루트로핀, 폴리트로핀 및 고나도트로핀을 포함하는 다수의 당단백질 호르몬에 생물학적 특이성을 수여하는 독특한 베타 사슬(융모막 성선자극 호르몬 베타)의 이종이합체임. 이종이합체만이 기능적임. 이의 일반적인 기능은 임신의 유지에 필수적인 스테로이드를 합성하도록 난소를 자극하는 것임.	유방암; 카포시 육종; 여성 불임증; 성선기능저하; 남성 불임증

열충격 단백질(HSP; HSP96; gp96)	로커스ID:3316 유전자은행: M11717 유전자은행: M15432 유전자은행: X15183 유전자은행: M33716	열충격 단백질은 전시 경로에서 항원성 펩티드와 동반함. Gp96은 항원성 종양 항원과 복합체화되는 경우 종양 특이적 사멸 반응을 유발한다.	고형 종양; 직장결장암; 위암; 악성 흑색종;비호지킨 림프종; 췌장암; 신장암; 육종; 간질; 신경보호; 뇌졸중
IL-1 (인터루킨-1; 인터루킨-1 알파; 인터루킨-1 베타)	로커스ID:3552 로커스ID:3553 NP_000566 NP_000567 XP_010760	사이토카인인 인터루킨-1(IL-1)은 열, 수면, 식욕부진, 급성기 단백질 합성, 케모카인 생성, 부착 분자 상향조절, 혈관확장, 혈액응고전 상태, 조혈 증가, 및 기질 금속단백분해효소 및 성장 인자의 생성 및 방출을 포함하는, 손상 또는 감염에 대한 숙주 반응을 개시하고 촉진하는 광범위한 생물학적 활성을 유발함.	세균 감염; 소화궤양; 이식거부; 암; 악성 흑색종; 비소세포 폐암; 전백혈병; 화학보호; 방사선보호
IL-1 수용체 길항제	CAS-143090-92-0 로커스ID:3557 NP_000568 XP_010756	IL1 수용체 길항제는 표적 세포를 활성화시키지 않고 IL1 수용체에 강하게 결합하고, IL1-알파 및 IL1-베타의 결합을 억제하는 단백질임. 결과로서, 이러한 두 사이토카인의 생물학적 활성은 생리학적 및 병태생리학적 면역 및 염증 반응에서 중화됨.	류마티스 관절염; 천식; 당뇨병; GVHD; 염증성 장질병; 안구 염증; 건선; 패혈 쇼크; 이식 거부; 염증 장애; 류마티스 장애; 폐경후 골다공증; 뇌졸중

IL-10	로커스ID:3586 NP_000563 XP_001409	IL-10은 활성화된 대식세포 및 보조 t 세포에 의해 생성된 ifn-감마, il-2, il-3, tnf 및 gm-csf를 포함하는 다수의 사이토카인의 합성을 억제함.	염증성 장질병; 급성 폐 손상; 자가면역 장애; 암; 크론병; 이식편-대-숙주병; 성장 장애; 간 섬유증; C형 간염; 단순헤르페스바이러스 감염; HIV 감염 치료; 허혈/재관류; 다발성 경화증; 심근염; 건선; 류마티스 관절염; 패혈; 이식거부; 타입 1 당뇨병; 궤양성 대장염; 류마티스 관절염; 염증성 장질병
IL-11	CAS-145941-26-0 로커스ID:3589 NP_000632 XP_008906	우선 혈전형성 활성을 지니는 조혈 사이토카인으로 특징되는, 간질세포에 의해 유래되는 사이토카인으로서, IL-11은 조혈세포, 및 뇌, 척수 뉴런, 장 및 고환을 포함하는 여러 다른 조직에서 발현되고, 다면발현 작용을 나타내는 것으로 밝혀짐.	저혈소판증; 골수 이식 거부; 크론병; 이식편-대-숙주병; 염증 장애; 점막염; 류마티스 관절염; 패혈에 의해 유도된 전신 염증 반응 증후군
IL-12	로커스ID:3592	IL-12는 항종양 및 항바이러스를 나타냄.	암; C형 간염;
IL18 결합 단백질	로커스ID:10068 NP_005690 XP_006006	IL18 결합 단백질은 조기 Th1 사이토카인 반응을 나타내고, 이는 면역글로불린 상과의 일원임.	자가면역병; 염증; 류마티스 관절염

IL2	로커스ID:3558	IL2 수용체를 발현하는 세포에 결합하여 활성화시킴.	암 감염; 류마티스 관절염; 암
IL-4	로커스ID:3565	IL4 수용체를 발현하는 세포에 결합하여 활성화시킴.	암; 급성 면역결핍
IL-4 수용체	로커스ID:3566 NP_000409 XP_407989	IL4에 결합하여, B-세포의 증식 및 사이토카인의 생성 유도; 흉선 세포의 성숙 유도; 성숙 T-세포 및 NK 세포의 활성화, 골수성 조혈 조절, 호산구 및 비만세포 생성의 향상; 내피세포의 증식을 포함하는 광범위한 효과를 지니는 IL4의 활성을 차단할 수 있음.	천식; 이식편-대-숙주병; 과민
IL-8 (인터루킨-8)	로커스ID:3576 NP_000575 XP_003501	IL-8 인터루킨 8은 화학주성 및 호중구의 활성화에서 역할을 하는 사이토카인임. 이는 여러 혈소판에 의해 유래되는 인자와 유사성을 지님.	분만 유도

인터페론 감마	CAS-98059-61-1 로커스ID:3458 NP_000610 XP_006883	항-바이러스, 항-바이러스 및 면역조절 활성.	만성 육아종병과 관련된 심각한 감염; 중증; 악성 골화석증; 결핵; 아토피성 피부염; 만성 육아종병; 효모균증; 낭성섬유증; 켈로이드; 악성 흑색종; 미코박테리아 감염; 진균증; 난소암; 폐 섬유증; 신장암; 소세포폐암; 전신성 경피증; 균상식육종; 피부암
인터페론 오메가	로커스ID:3467 NP_002168 XP_005411	항바이러스 방어, 세포 성장, 및 면역 활성화를 조절함; 타입 I 인터페론 과의 단백질의 일원임.	암; C형 간염
인터페론 유도가능 단백질 10	로커스ID:3627 NP_001556 CAA26370	IFN-감마-유도가능 단백질은 C-X-C 케모카인과의 일원이고, 화학주성 및 분열촉진 활성을 지님.	백혈병
인터루킨-3	CAS-148641-02-5 CAS-161753-30-6 로커스ID:3562 NP_000579 XP_003752	인터루킨-3(콜로니-자극 인자)는 조혈에서 역할을 하는 성장 인자의 한 과의 일원임. 이는 광범위한 조혈 세포 유형을 원조할 수 있음.	암; 혈액작용 장애; 혈액작용 악성종양; 전백혈병; 호지킨병; 골수성 백혈병; 비호지킨 림프종; 저혈소판증; 화학보호; 방사선보호

KGF-1 (각질세포 성장 인자-1)	로커스ID:2252 NP_002000	각질세포 성장 인자 1(KGF-1)은 내피세포에 대해 특이적인 인간 미토겐임. 이는 내피세포 증식의 간질 매개인자의 특성을 지님.	화학보호; 이식편-대-숙주병; 점막염
쿤니츠 프로테아제 억제제 1 (KPI 1)	로커스ID:6692 NP_003701 XP_007555	쿤니츠 프로테아제 억제제 1은 HGF 활성인자에 대해 특이적인 효능있는 억제제이고, 손상된 조직에서 HGF의 단백질분해 활성의 조절에 관여하는 것으로 생각됨.	혈전증; 항응고제
락토페린 (아포락토페린)	로커스ID:4057 NP_002334 XP_010963	트랜스페린과의 일원인 락토페린은 세포외액 내에서 철을 운반하고, 항박테리아 및 항바이러스 특성을 지님.	알레르기 접촉 피부염; 박테리아 감염; 심혈관 장애; 응고 장애; 건성안; 위염; C형 감염; 건선
렙틴	로커스ID:3952 NP_000221 XP_004625	지방 세포에 의해 분비됨. 비만 조절. 음식 흡수, 체중 감소, 및 인슐린 및 글루코오스 수준의 감소를 조절.	비만; 타입 2 당뇨병; 관 장애; 면역 장애; 면역억제
백혈병 억제 인자	로커스ID:3976 NP_002300 XP_009915	백혈병 억제 인자는 대식세포 분화를 유도하는 사이토카인임. LIF는 성상세포를 유도하기 위해 1차 태아 신경 전구세포에서의 BMP2와 함께 작용함.	여성 불임증; 신경근육 장애
Lys 플라스미노겐 (재조합의 트렁케이션된 플라스미노겐)	로커스ID:5340 NP_000292 XP_004371	플라스미노겐의 보다 반응적인 트렁케이션된 형태. 플라스미노겐은 혈병 내의 섬유소를 분해하는 염성 프로테아제인 플라스민의 전구체임.	혈전증; 동맥 폐쇄성 장애

마스핀	CAS-157857-21-1 로커스ID: 5268 NP_002630 XP_008742	혈관신생을 억제함으로써 종양 전이를 억제하는 세린 프로테아제 억제제.	암; 유방암; 전립선암
메티오니나아제	CAS-42616-25-1 유전자은행: AAB03240	메티오니나아제는 호모시스테인 및 이의 S-치환된 유도체의 알파, 감마-제거 반응 뿐만 아니라 시스테인 및 이의 유도체의 알파, 베타-제거 반응을 촉매함. 이는 또한 호모시스테인 기질의 감마-탄소에서의 치환과 상응하는 S-알킬호모시스테인을 형성하는 외인성으로 첨가된 알칸티올 사이의 교환 반응을 촉매함. 이는 또한 시스테인과 알칸티올 사이의 유사한 베타-교환 반응을 촉매함.	암; 위장암; 비소세포폐암; 췌장암
미크로솜 운반 단백질	로커스ID: 4547 NP_000244 XP_003363	MTP는 이종이합체의 미크로솜 트리글리세라이드 운반 단백질의 큰 서브유닛을 엔코딩함. 단백질 디술피드 이소머라아제(PM)은 지질단백질 어셈블리에서 중추적인 역할을 하는 것으로 밝혀진 이종이합체의 미크로솜 트리글리세라이드 운반 단백질을 완성시킴.	지질 장애
MSH-디프테리아 독소 키메라	로커스ID: 5443 NP_000930 XP_002485 K01722 AAA32182	MSH 수용체를 발현하는 세포에 결합하여 사멸시킴.	암

신경성장 인자 (NGF)	로커스ID:4803 NP_002497 XP_002122	신경 분화 및 생존에서 역할을 지닌 성장 인자.	HIV-관련 감각 신경병증; 당뇨 신경병증; 신경변성 장애
중화 엔도펩티다아제 (NEP)	CAS82707- 54-8 로커스ID: 4311 NP_000893 NP_009218 NP_009219 NP 009220 XP_003136 XP_003137 XP_003138 XP_003139	중화 엔도펩티다아제는 근위세관의 솔변연 및 사구체상피에 존재하는, 특히 신장에 풍부한 100-kD의 타입 II 막횡단 당단백질임. NEP는 소수성 잔기의 아미노측에서 펩티드를 분해하고, 글루카곤, 엔케팔린, 물질 P, 뉴로텐신, 옥시토신, 및 브래디키닌을 포함하는 여러 펩티드 호르몬을 불활성화시킴.	암; 편두통; 염증성 장질병; 염증; 천식; 호흡기병; 폐암; 소세포암
NIF (호중구 억제 인자)	유전자은행:AAA27789	NIF는 내피세포로의 부착 및 과산화수소의 부착 의존성 방출과 같은 다수의 호중구 기능의 당단백질 억제제임. 이들의 기능적 효과는 알파M베타2에 대해 특이적으로 결합하나 기타 베타2 인테그린에는 결합하지 않는 이의 특이적 결합으로부터 유래됨. NIF는 동물 모델에서 조직 손상 및 허혈-재관류 손상과 같은 과도한 호중구 활성화의 유독한 효과를 감약화시키는데 유효한 것으로 밝혀짐.	뇌졸중
노긴(Noggin)	로커스ID: 9241 NP_005441 XP_008151	노긴은 골 형태형성 단백질-4(BMP4)와 같은 형질전환 성장 인자-베타(TGF-베타) 상과 신호전달 단백질의 일원에 결합하여 불활성화시킴.	진행성 골화성 섬유형성이상; 비정상 골성장; 병리적 골 성장

NT-3 (뉴로트로핀3)	로커스ID:4908 NP_002518	NT-3은 포유동물 뉴런의 생존 및 분화를 조절하는 신경영양 인자, 뉴로트로핀 과의 일원임. 이러한 유전자는 신경성장 인자 및 뇌에 의해 유래되는 신경영양 인자 둘 모두와 밀접하게 관련됨. 이러한 유전자에 의해 엔코딩된 단백질은 성인 신경계의 유지와 관련될 수 있고, 인간 태반에서 발현되는 경우 배아의 뉴런 발달에 영향을 줌.	장 신경병증; 변비; 당뇨 신경병증; 말초신경 장애
골원성 단백질-1 (OP-1)	로커스ID:655 NP_001710 XP_012943	OP-1은 세포 반응을 자극하는 수용체 세린/트레오닌 키나아제를 통해 신호전달하는 조절 분자의 형질전환 성장 인자-베타 상과의 일원임. 이의 효과는 태아 두개관 세포에 의한 증가된 VEGF 발현 및 대뇌 피질 뉴런에서 증가된 수상돌기 성장을 포함함.	급성 골절; 연골 수복; 신경 장애; 정형외과 재건술; 파킨슨병; 치주조직 수복; 신부전; 척주골융합술; 뇌졸중; 치아 상아질 재생; 긴뼈 불유합

오스테오프로테그린(파골세포형성 억제 인자)	로커스ID: 4982 NP_002537 로커스ID: 7941 NP_005075 XP_004492	오스테오프로테그린은 파골세포형성 및 골흡수를 억제하고, 섬유모세포 증식을 유도함. 혈소판 활성화 인자 아세틸히드롤라아제는 혈소환 활성화 인자 및 관련 인지질을 불활성화시킴.	골 장애; 암 동통; 폐경후 골다공증; 류마티스 관절염 천식; 괴사성 위장염; 급성 위장염; 성인성 호흡곤란증후군; 알레르기 천식; 염증성 장질환; 허혈/재관류; 췌장염; 패혈에 의해 유도된 전신 염증 반응 증후군; 고형 장기 보존; 타입 I 당뇨병;
Patched (헷지혹 수용체)	로커스ID: 5727 NP_000255 XP_005574	소닉 헷지혹에 대한 수용체인 Patched는 발생 패턴 및 성장을 조절하는 종양 억제제임.	기저세포암; 뇌암
PDGF (PGDF-B)	CAS-165101-51-9 로커스ID:5154 로커스ID:5155 NP_002598 NP_002599 XP_009997	PDGF-B는 효능있는 미토겐 및 형질전환제임. 이는 PDGF 수용체 티로신 키나아제를 통해 이의 분열촉진 및 형질전환 효과를 발휘하도록 작용함.	하지 당뇨병 신경변성 궤양; 욕창; 당뇨병 족부궤양; 정맥 울혈 궤양; 치주병; 피부 궤양
PEDF (색소 내피에 의해 유래된 인자)	로커스ID: 5176 NP_002606	색소 내피에 의해 유래된 인자는 세린 프로테아제 억제제의 세르핀과의 비억제 일원임. 이는 세린 프로테아제 억제가 아닌 메커니즘에 의해 신경돌기 촉진인자로서 작용함.	근위축성 측삭 경화증; 염증성 안구 질병; 관 안구 질병; 퇴행성 안구 질병; 이영양성 안구 질병; 신경변성

플라스미노겐 활성인자 억제제(플라스미노겐 활성인자 억제제-1)	로커스ID:5054 NP_000593 XP_004828	플라스미노겐 활성인자 억제제 I은 비활성 플라스미노겐의 플라스민으로의 전환을 억제함으로써 섬유소용해를 조절함. 플라스미노겐 활성인자 억제제 I은 세린 프로테아제 억제제의 세르핀과의 일원임.	출혈
프로삽티드(Prosaptide)	유전자은행: AAG31635 펩메드(Pubmed): PMID:9114068	프로삽티드는 프로사포신으로부터 유래된 신경영양 펩티드임(TXLIDNNATEEILY; 여기서 X는 D-알라닌임).	당뇨 신경변성; 동통; 중추신경계 장애
릴렉신(인간 릴렉신)	로커스ID:6013 로커스ID:6019 NP_008842 NP_005050 XP_011804 XP_005512	릴렉신은 임신 동안 난소의 위축황체에서 합성된 펩티드 호르몬으로, 분만 전에 혈류로 방출됨. 이의 주요 생물학적 효과는 출산 과정을 촉진하기 위해 포유동물 생식관을 재형성시킴.	공피증; 불임증; 울혈심부전증; 출산 장애; 말초 동맥 장애; 폐 섬유증; 폐 고혈압
망막 S-항원(망막 어레스틴)	유전자은행: AAA30378	망막 S-항원은 인산화된 로돕신에 결합하고, 광전달 캐스케이드를 비활성화시키는 역할을 하는 광수용체 단백질임.	포도막염
인간 황체형성 호르몬	로커스ID:1081 로커스ID:3972 NP_000726 NP_000885 XP_011444 XP_009418	hLH는 비공유적으로 회합되는 알파 및 베타 서브유닛으로 구성되는 뇌하수체 호르몬 이합체임. 이의 주요 효과는 난모세포의 성숙, 및 난포에 의한 에스트로겐 및 프로게스테론의 분비임.	불임증
사루플라아제	CAS-99149- 95-8 유전자은행: CAA01515	사루플라아제는 글루코실화되지 않은 단일 사슬의 재조합 우로키나아제 유형의 플라스미노겐 활성인자임.	심근경색증

가용성 보체 수용체 유형 1	로커스ID:1378 NP_000564 NP_000642	보체 수용체 유형 1(C3b/C4b 수용체)는 C3b- 및 C4b-코팅된 리간드에 대한 수용체임. 이는 막횡단 및 세포질 도메인이 결핍되고, 우선적으로 C4b 및 C3b에 결합함으로써 C3 및 C5 전환효소 활성을 억제함.	심근경색; 급성 호흡곤란 증후군; 성인 호흡곤란 증후군; 타가이식 거부; 파종성 혈관내 응고; 폐 이식거부; 다발성 경화증; 재관류 손상; 류마티스 관절염; 전신홍반루푸스; 이종이식 거부
소닉 헷지혹(헷지혹)	로커스ID:6469 NP_000184 XP_004942	소닉 헷지혹은 배아의 패턴형성에서 중추적인 역할을 함. 이는 단백질분해적으로 분해되고 변형되어 신호전달 분자로서 활성화되는 비활성 전구체로 발생함. 소닉 헷지혹에 대한 수용체는 다중-패스 막횡단 단백질인 Patched이고, 소닉 헷지혹 신호전달의 다운스트림 표적은 전사인자 유사 Gli3임.	파킨슨병; 신경계 장애; 탈모
스태필로키나아제	유전자은행: CAA29822 유전자은행: CAA01335	스태필로키나아제는 단백질분해적으로 플라스미노겐을 활성화시키는 단일 도메인 단백질임.	심근경색; 동맥 폐쇄 장애; 뇌졸중

줄기세포 인자(Kit 리간드)	CAS-163545-26-4 NP_003985	SCF는 비만세포 생존에 실질적으로 필요하고, 시험관내 변연 비만세포 증식을 유도함. SCE의 존재하에서, 비만세포는 종양 괴사 인자 (TNF)-알파, IL-1베타, IL-6, IL-8, IL-16 및 IL-18을 포함하는 전염증 사이토카인을 주로 생성함.	유방암에서 PBPCT 전의 전구세포의 가동화; 뉴포겐과 결합; 줄기세포 가동화; 빈혈; 이종이식 거부
스트렙토키나아제	CAS-9002-01-1 유전자은행: E03308	스트렙토키나아제는 비-단백질분해적으로 인간(h)-플라스미노겐을 활성화하고 알파2-항플라스민에 의한 비활성화로부터 플라스민을 보호하는 3 도메인(알파, 베타, 감마)임.	심근경색; 혈병; 폐 색전증
수퍼옥시드 디스뮤타아제	CAS-9016-01-7 로커스ID:6647 로커스ID:6648 로커스ID:6649 NP_000445 NP_000627 NP_003093 XP_009723 XP_004242 XP_003578	구리 아연 수퍼옥시드 디스뮤타아제는 수퍼옥시드의 산소 및 과산화수소로의 부동변화를 촉매하는 세포내 단백질임.	천식; 미성숙의 기관지폐이형증; 화상; 안구 장애; 두부 손상; 유아 호흡곤란 증후군; 염증 장애; 신장 장애; 심근경색; 허혈성 심질환; 재관류 손상; 호흡기 장애; 뇌졸중; 자가면역 장애; 급성 폐손상; HIV 감염 치료; 근위축성 측삭경화증; 호흡기 융합체 바이러스; 방광염; 방사선보호; 류마티스 장애

T1/ST2 수용체(T1/ST2 수용체)	유전자은행: P14719	T1/ST2는 Th2 세포의 표면에서 우선적으로 발현하는 IL-1R과의 일원으로, Th2 세포의 활성화에서 중요한 역할을 함.	천식; 알레르기
TGF 베타 1 (형질전환 성장인자-베타)	로커스ID: 7040 NP_000651 XP_008921	다수의 세포 유형에서 세포 증식, 분화 및 아폽토시스를 조절함.	알츠하이머병; 죽상동맥경화증; 암; 피부 장애; 전신홍반루푸스; 이식거부
TGF 베타 2(형질전환 성장인자 베타 2)	로커스ID: 7042 NP_003229 XP_001754	형질전환 성장 인자-베타 2(TGF-베타 2)는 특히 인터루킨-1-베타(IL1-베타) 자극된 래트 평활근 세포에서 유도가능한 산화질소 합성효소(iNOS) 유전자 전사를 억제하고, 낮은 용량에서 구성적 NOS를 억제하지 않는 것으로 밝혀짐.	만성 상처; 점막염; 연령 관련 황반 변성; 자가면역 장애; 암; 당뇨성 족부 궤양; 안구 장애; 다발성 경화증; 폐경후 골다공증; 류마티스 관절염; 피부 장애; 이식거부
TGF 베타 3 (형질전환 성장인자 베타 3)	로커스ID: 7043 NP_003230 XP_007417	형질전환 성장인자-베타 3은 막횡단 세린/트레오닌 키나아제를 통한 분열촉진 신호를 전달하는 사이토카인임. TGF 베타 3은 폐와 구개의 정상적인 발달에 필요함.	만성 상처; 경구 점막염, 방사선보호
트롬보포이어틴	로커스ID: 7066 NP_000451 XP_002815	트롬보포이어틴은 c-Mpl 수용체에 결합하고, 거대핵세포 발달을 조절함.	저혈소판증; 화학보호

Tie-2(Tek; 내막 내피세포 키나아제)	로커스ID:7010 NP_000450 XP_005480	안지오포이어틴 수용체 티로신 키나아제인 Tie-2/Tek은 안지오포이어틴에 의한 자극 후에 세포내 신호전달 및 혈관신생 반응을 매개함.	암
조직 인자 경로 억제제	로커스ID:7035 NP_006278 XP_002672	조직 인자 경로 억제제는 지질단백질 관련 응고 억제제임. 이는 섬유소응고 형성을 억제하는 쿤니츠 타입 프로테아제임.	패혈증; 응고 장애; 재관류 손상; 죽상경화증
TNF알파	로커스ID:7124 NP_000585 XP_011402	TNF는 패혈의 병태생리학에서 중추적인 역할을 함. 고수준의 TNF 알파는 중증 박테리아 감염에서 증가된 질병 중증도와 관련되고, 말라리아 TNF 알파 신호전달은 NF 카파 B의 활성화 및 아폽토시스의 유도를 일으킬 수 있음.	암; CNS 암; 림프종; 피부암; 비뇨생식암;
TNF 결합 단백질	NP_001056	TNF 결합 단백질은 TNF 결합과 경쟁함으로써 TNF-수용체의 활성화를 억제함.	류마티스 관절염; 심장 재관류 손상; 자가면역 장애; 크론병; 말라리아; 재관류 손상; 패혈 쇼크
가용성 TNF 수용체	CAS-185243-69-0 로커스ID:7132 로커스ID:7133 NP_001056 NP_001057 XP_006950 XP_001743	종양 괴사 인자 수용체는 TNF 자극에 대한 반응으로 전염증성 세포 반응을 매개함.	류마티스 관절염; 카켁시아; 심부전; HIV 1 감염; 유년기 류마티스 관절염; 건선; 건선성 관절염; 패혈 쇼크; 이식 거부; 알레르기 천식

t-PA	CAS-105857-23-6 CAS-171870-23-8 CAS-156616-23-8 CAS-151912-42-4 CAS-133652-38-7 CAS-191588-94-0 로커스ID:5327 NP_000921 NP_000922 XP_005024	조직 유형 플라스미노겐 활성인자; 비활성 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키는 세린 프로테아제	색전증; 심근경색; 뇌졸중; 혈전증; 울혈성 심부전; 허혈성 심장 장애; 관상 재협착
영양막 인터페론 (인터페론 tau; IFN-tau, 트로포블라스틴)	유전자은행:A53746	태반 세포 성장 및 분화 뿐만 아니라 바이러스 환경에서의 태아 보호에 관여함.	HIV 감염 치료; 다발성 경화증
트로포닌 1	로커스ID:7135 NP_003272 XP_001918 로커스ID:7136	트로포닌 I은 휴식근 조직에서 액틴 및 미오신 상호작용을 억제하는 조절성 단백질임. 트로포닌 I은 트로포닌의 억제 서브유닛임.	암 전이; 당뇨 망막병증; 안구 장애; 황반 변성; 고형 종양
뇨산염 옥시다아제	로커스ID:7377 유전자은행: S94095	뇨산염 옥시다아제는 요산의 산화를 촉매하는 효소임.	화학보호; 화학요법 관련 유리세미아(uricemia)의 예방 및 치료; 통풍

우로키나아제 (프로-우로키나아제)	CAS-9039-53-6 로커스ID:5328 NP_002649 XP_011861	우로키나아제는 혈액 응고 조절과 관련된 플라스미노겐 활성인자로 작용함. 이는 플라스미노겐을 분해하여 플라스민을 형성시키는 세린 프로테아제임.	카테터 제거; 관상 재협착; 당뇨성 망막병증; 심근경색; 혈전증; 유리체 출혈; 말초 관 장애; 뇌졸중
VEGF-1 (VEGF-121)	로커스ID:7422 로커스ID:7423 로커스ID:7424 NP_003367 NP_003368 NP_005420 XP_004512 XP_006539 XP_003456	VEGF-1은 내피 세포 증식 및 관 투과성을 유도하는 성장인자임.	심혈관질병; 관 장애; 골절 치료

내인성 표적 화합물의 제시된 목록은 총망라된 것은 아니다. 리간드가 두개의 에피토프(동일하거나 상이한 항원 상의 에피토프)에 결합하는 경우, 항원(들)은 상기 리스트로부터 선택될 수 있다. 특정 구체예에서, 리간드는 TNFR1에 결합하는 dAb 및 상기 항원중 임의의 하나와 결합하는 제 2 dAb 또는 에피토프 결합 도메인을 포함한다. 이러한 구체예에서, 다중특이적 리간드는 면역글로불린 가변 도메인(예를들어, V_HV_H, V_HV_L, V_LV_L)의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.

혈청 알부민에 결합하는 리간드 및 dAb 단량체

본 발명은 1 nM 내지 500 μM (즉, x 10^-9 내지 5 x 10^-4), 바람직하게는 100 nM 내지 10 μM의 K_d로 혈청 알부민 (SA)에 결합하는 리간드 또는 dAb 단량체 (예를들어, 이러한 dAb를 포함하는 이중특이적 리간드)를 제공한다. 바람직하게는, 제 1 항-SA dAb 및 또 다른 표적에 대한 제 2 dAb를 포함하는 이중특이적 리간드에 대해서, 제 2 dAb의 표적에 대한 이의 친화성 (예를들어, 비아코어(BiaCore)를 이용한, 예를들어 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 K_d 및/또는 K_off)은 SA에 대한 제 1 dAb의 친화성에 비해 1 내지 100000배 (바람직하게는, 100 내지 100000배, 더욱 바람직하게는 1000 내지 100000배, 또는 10000 내지 100000배)이다. 예를들어, 제 1 dAb는 약 10 μM의 친화성으로 SA에 결합하는 반면, 제 2 dAb는 100 pM의 친화성으로 이의 표적에 결합한다. 바람직하게는, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민 (HSA)이다. 한 구체예에서, 제 1 dAb (또는 dAb 단량체)는 약 50, 바람직하게는 70, 더욱 바람직하게는 100, 150 또는 200 nM의 K_d로 SA (예를들어, HSA)에 결합한다.

특정 구체예에서, SA에 결합하는 dAb 단량체는 응집을 억제하고, 가역적으로 언폴딩되고/되거나 TNFR1에 결합하는 dAb 단량체에 대해 상기 기술된 바와 같은 프레임워크 영역을 포함한다.

리간드 포맷

리간드 및 dAb 단량체는 단일특이적 또는 다중특이적 항체 또는 항체 단편으로 포맷화되거나, 단일특이적 또는 다중특이적 비-항체 구조로 포맷화될 수 있다. 적합한 포맷은, 항체 가변 도메인 또는 이의 CDR중 하나 이상이 포함되어 구조상에 항원에 대한 결합 특이성을 수여할 수 있는 임의의 적합한 폴리펩티드 구조를 포함한다. 다양한 적합한 항체 포맷, 예를들어 IgG-유사 포맷, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 단일 사슬 항체, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 동종이합체 및 이종이합체, 상술한 임의의 항체의 항원 결합 단편 (예를들어, Fv 단편 (예를들어, 단일 사슬 Fv (scFv), 이황화결합된 Fv), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편), 단일 가변 도메인 (예를들어, V_H, V_L, V_HH), dAb, 및 상술한 임의의 항체의 변형된 버전 (예를들어, 폴리알킬렌 글리콜 (예를들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜) 또는 기타 적절한 다합체의 공유적 부착)이 당 분야에 공지되어 있다. 페길화된 단일 가변 도메인 및 dAb, 이를 제조하기에 적합한 방법, 증가된 생체내 반감기의 페길화된 단일 가변 도메인 및 dAb 단량체 및 다합체, 적합한 PEG, 바람직한 유체역학적 크기의 PEG, 및 바람직한 유체역학적 크기의 페길화된 단일 가변 도메인 및 dAb 단량체 및 다합체에 관한 미국에서 지정된, 2003년 6월 30일자로 출원된 PCT/GB03/002804 (WO 2004/081026)를 참조하라. 상기에 언급된 부분을 포함하는 PCT/GB03/002804 (WO 2004/081026)의 전체 교시는 본원에 참조로서 포함되어 있다.

리간드는, 예를들어 적절한 링커, 예를들어 (Gly₄Ser)_n(여기서, n은 1 내지 8, 예를들어 2, 3, 4, 5, 6 또는 7임)을 이용하여 요망되는 dAb 단량체의 이합체, 삼합체 또는 중합체로 포맷화될 수 있다. 요망시, dAb 단량체, 이합체 및 삼합체를 포함하는 리간드는 C_H2 및 C_H3 도메인중 하나 또는 둘 모두와 임의로 힌지 영역을 포함하는 항체 Fc 영역에 연결될 수 있다. 예를들어, Fc 영역에 대해 단일 누클레오티드 서열로서 연결된 리간드를 포함하는 벡터가 상기 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용될 수 있다.

리간드 및 dAb 단량체는 또한 비-항체 다중-리간드 구조로 조합되고/되거나 포맷화되어 다가 복합체를 형성할 수 있고, 이는 동일한 항원을 지닌 표적 분자에 결합함으로써 우수한 결합성을 제공한다. 예를들어, 천연 박테리아 수용체, 예를들어 SpA는 CDR의 이식을 위한 스캐폴드로서 사용되어 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 리간드를 생성시킨다. 이러한 과정의 상세한 설명은 US 5,831,012에 기술되어 있다. 기타 적절한 스캐폴드는 피브로넥틴 및 어피바디에 기초한 것을 포함한다. 적절한 과정의 상세한 설명은 WO 98/58965에 기술되어 있다. 기타 적절한 스캐폴드는 문헌[van den Beuken et al., J. Mol. Biol. 310, 591-601 (2001)]에 기술된 바와 같은 리포칼린 및 CTLA4, 예를들어 박테리아 GroEL 또는 기타 샤페론 폴리펩티드의 고리 구조에 기초한 문헌[WO 00/69907 (Medical Research Council)]에 기술된 것과 같은 스캐폴드를 포함한다. 단백질 스캐폴드는 조합될 수 있고; 예를들어, CDR은 CTLA4 스캐폴드에 이식될 수 있고, 면역글로불린 V_H 또는 V_L 도메인과 함께 사용하여 리간드를 형성할 수있다. 유사하게, 피브로넥틴, 리포칼린 및 기타 스캐폴드가 조합될 수 있다.

임의의 요망되는 포맷을 제조하기 위한 다양한 적절한 방법이 당 분야에 공지되어 있다. 예를들어, 항체 사슬 및 포맷 (예를들어, IgG-유사 포맷, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 단일 사슬 항체, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 동종이합체 및 이종이합체)이 적절한 발현 작제물의 발현 및/또는 적절한 세포 (예를들어, 하이브리도마, 헤테로하이브리도마, 상기 포맷을 엔코딩하는 재조합 작제물을 함유하는 재조합 숙주 세포)의 배양에 의해 제조될 수 있다. 추가로, 포맷, 예를들어 항체 또는 항체 사슬의 항원 결합 단편(예를들어, Fv 단편 (예를들어, 단일 사슬 Fv (scFv), 이황화 결합된 Fv), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편)이 적절한 발현 작제물의 발현 또는 예를들어 파파인 또는 펩신을 이용한 항체의 효소적 분해에 의해 제조될 수 있다.

리간드는 예를들어 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 WO 03/002609에 기술된 바와 같은 이중특이적 리간드 또는 다중특이적 리간드로서 포맷화될 수 있다. 이중특이적 리간드는 상이한 결합 특이성을 지니는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다. 이러한 이중특이적 리간드는 중쇄 및 경쇄 도메인을 포함할 수 있다. 예를들어, 이중특이적 리간드는 scFv (예를들어, Gly₄Ser와 같은 적절한 링커를 이용함)의 형태로 함께 연결될 수 있는 V_H 도메인 및 V_L 도메인을 포함할 수 있거나, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를들어, F(ab')₂ 단편)으로 포맷화될 수 있다. 이중특이적 리간드는 항원 또는 에피토프에 협동적으로 결합하는 통상적인 두개의 사슬의 항체 항원 결합 부위를 형성하는 상보적 V_H/V_L쌍을 포함하지 않는다. 대신, 이중 포맷 리간드는 V 도메인이 상이한 결합 특이성을 지니는 V_H/V_L 상보적 쌍을 포함한다.

또한, 이중특이적 리간드는 요망시 하나 이상의 C_H 또는 C_L 도메인을 포함할 수 있다. 힌지 영역 도메인이 또한 요망시 포함될 수 있다. 이러한 도메인의 조합은 예를들어 미믹(mimic) 천연 항체, 예를들어 IgG 또는 IgM, 또는 이의 단편, 예를들어 Fv, scFv, Fab 또는 F(ab')₂ 분자일 수 있다. 기타 구조, 예를들어 V_H, V_L, C_H1 및 C_L 도메인을 포함하는 IgG 분자의 단일 암이 예상된다. 바람직하게는, 본 발명의 이중특이적 리간드는 비록 상기 여러 리간드가 동일한 단백질로 포함될 수 있으나 단지 두개의 가변 도메인을 포함하고, 예를들어 두개의 상기 리간드는 IgG 또는 중합체 면역글로불린, 예를들어 IgM으로 포함될 수 있다. 대안적으로, 또 다른 구체예에서, 다수의 이중특이적 리간드가 조합되어 중합체를 형성한다. 예를들어, 두개의 상이한 이중특이적 리간드가 조합되어 사(tetra)-특이적 분자를 생성한다. 본 발명의 방법에 따라 생성된 이중특이적 리간드의 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 동일한 폴리펩티드 사슬에 존재하거나, 대안적으로 상이한 폴리펩티드 사슬에 존재하는 것이 당업자에 의해 인지될 것이다. 가변 영역이 상이한 폴리펩티드 사슬에 존재하는 경우, 이들은 링커, 일반적으로 가요성 링커(예를들어, 폴리펩티드 사슬), 화학적 결합기, 또는 당 분야에 공지된 임의의 기타 방법을 통해 연결될 수 있다.

다중특이적 리간드는 하나 이상의 에피토프 결합 특이성을 지닌다. 일반적으로, 다중특이적 리간드는 두개 이상의 에피토프 결합 도메인, 예를들어 에피토프에 대한 결합 부위를 포함하는 dAb 또는 비-항체 단백질, 예를들어 어피바디, SpA 도메인, LDL 수용체 부류 A 도메인, EGF 도메인 및 아비머를 포함한다. 다중특이적 리간드는 본원에 기술된 바와 같이 추가로 포맷화될 수 있다.

몇몇 구체예에서, 리간드는 IgG-유사 포맷이다. 이러한 포맷은 하나 이상의 가변 영역 (V_H 및/또는 V_L)이 요망되는 특이성의 dAb 또는 단일 가변 도메인으로 대체된, 통상적으로 4개 사슬 구조의 IgG 분자 (2개의 중쇄 및 2개의 경쇄)를 지닌다. 바람직하게는, 각각의 가변 영역 (2개의 V_H 영역 및 2개의 V_L 영역)은 dAb 또는 단일 가변 도메인으로 대체된다. IgG-유사 포맷에 포함된 dAb(들) 또는 단일 가변 도메인(들)은 동일한 특이성 또는 상이한 특이성을 지닐 수 있다. 몇몇 구체예에서, IgG-유사 포맷은 4가이고, 1, 2, 3 또는 4개의 특이성을 지닐 수 있다. 예를들어, IgG-유사 포맷은 단일특이적이며, 동일한 특이성을 지니는 4개의 dAb를 포함하거나; 이중특이적이며, 동일한 특이성을 지니는 3개의 dAb 및 상이한 특이성을 지니는 또 다른 dAb를 포함하거나; 이중특이적이며, 동일한 특이성을 지니는 두개의 dAb 및 동일하지만 상이한 특이성을 지니는 두개의 dAb를 포함하거나; 삼중특이적이며, 동일한 특이성을 지니는 제 1 및 제 2 dAb, 상이한 특이성을 지니는 제 3 dAb, 및 제 1, 제 2 및 제 3 dAb와 다른 특이성을 지니는 제 4 dAb를 포함하거나; 사중특이적이며, 각각 상이한 특이성을 지니는 4개의 dAb를 포함할 수 있다. IgG-유사 포맷의 항원 결합 단편 (예를들어, Fab, F(ab')₂, Fab', Fv, scFy)이 제조될 수 있다. 바람직하게는, IgG-유사 포맷 또는 이의 항원 결합 단편은 TNFR1를 가교시키지 않는다.

반감기 연장된 포맷

리간드는 생체내 혈청 반감기를 연장시키기 위해 포맷화될 수 있다. 증가된 생체내 반감기는 면역글로불린, 특히 항체, 가장 특히 소규모의 항체 단편, 예를들어 dAb의 생체내 적용에 유용하다. 이러한 단편 (Fvs, 이황화 결합된 Fv, Fab, scFv, dAb)은 신체로부터 신속하게 제거되고, 이는 임상 적용을 심각하게 제한할 수 있다.

리간드(예를들어 dAb 단량체)는 폴리알킬렌글리콜기(예를들어, 폴리에틸렌글리콜(PEG)기, 폴리프로필렌글리콜기), 혈청 알부민, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체 또는 최소한 이의 트랜스페린 결합 부분, 항체 Fc 영역의 부착, 또는 항체 도메인으로의 컨쥬게이션에 의해 보다 큰 유체역학적 크기를 지니도록 포맷화될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 리간드는 페길화된다. 바람직하게는, 페길화된 리간드는 페길화되지 않는 리간드와 실질적으로 동일한 친화성으로 내인성 표적 화합물에 결합한다. 예를들어, 리간드는 내인성 표적 화합물에 결합하는 페길화된 dAb 단량체일 수 있고, 여기서 페길화된 dAb 단량체는 약 1000배 이하, 바람직하게는 약 100배 이하, 더욱 바람직하게는 약 10배 이하로 페길화되지 않은 형태의 dAb의 친화성과는 상이한 친화성으로 상기 내인성 표적 화합물에 결합하거나, 페길화되지 않은 형태에 비해 실질적으로 변화되지 않은 친화성으로 상기 내인성 표적 화합물에 결합한다.

소규모의 리간드, 예를들어 dAb 단량체는 항체의 보다 큰 항원 결합 단편 또는 항체(예를들어, Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂, IgG, scFv로 포맷화된 항체)로 포맷화될 수 있다. 길항제(예를들어, 리간드, dAb 단량체)의 유체역학적 크기 및 이의 혈청 반감기는 또한 길항제를 본원에 기술된 바와 같이 생체내 반감기를 증가시키는 항원 또는 에피토프에 결합하는 결합 도메인(예를들어, 항체 또는 항체 단편)에 컨쥬게이션시키거나 연결시킴으로써 증가될 수 있다. 예를들어, 리간드(예를들어, dAb 단량체)는 항-혈청 알부민 또는 항-신생아 Fc 수용체 항체 또는 항체 단편, 예를들어 항-SA 또는 항-신생아 Fc 수용체 dAb, Fab, Fab' 또는 scFv, 또는 항-SA 어피바디 또는 항-신생아 Fc 수용체 어피바디에 컨쥬게이션되거나 연결될 수 있다.

본 발명의 리간드(예를들어, dAb 단량체 및 중합체)의 유체역학적 크기는 당 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 예를들어, 젤 여과 크로마토그래피가 리간드의 유체역학적 크기를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 리간드의 유체역학적 크기를 결정하기 위한 적절한 젤 여과 매트릭스, 예를들어 가교된 아가로오스 매트릭스가 널리 공지되어 있고, 용이하게 구입가능하다.

리간드 포맷의 크기 (예를들어, 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 결합 부분에 부착된 PEG 부분의 크기)는 요망되는 적용에 따라 다양할 수 있다. 예를들어, 리간드가 순환에 존재하고 말초 조직으로 진입하도록 하는 경우, 혈류로부터의 혈관외유출을 촉진하기 위해 리간드의 유체역학적 크기를 낮게 유지시키는 것이 바람직하다. 대안적으로, 리간드를 보다 장기간 동안 전신 순환에 유지시키는 것이 요망되는 경우, 리간드의 크기는, 예를들어 Ig 유사 단백질로 포맷화시키거나 30 내지 60 kD의 PEG 부분의 첨가에 의해 증가될 수 있다.

본 발명에 따른 리간드에 사용하기에 적합한 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체의 예는 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 WO 2005/077042A2에 기술되어 있다. 특히, 하기의 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체가 본 발명에 사용될 수 있다:

· SEQ ID NO:1 (WO 2005/077042A2에 기술됨, 이 서열은 참조로서 본원에 명백히 포함되어 있음);

· WO 2005/077042A2 내의 SEQ ID NO:1의 아미노산 1-387을 포함하거나 이로 구성된 알부민 단편 또는 변이체;

· 하기의 (a) 내지 (l)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체: (a) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 54 내지 61; (b) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 76 내지 89; (c) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 92 내지 100; (d) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 170 내지 176; (e) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 247 내지 252; (f) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 266 내지 277; (g) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 280 내지 288; (h) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 362 내지 368; (i) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 439 내지 447; (j) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 462 내지 475; (k) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 478 내지 486; 및 (l) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 560 내지 566.

본 발명에 따른 리간드에 사용하기에 적합한 알부민, 및 이의 단편 및 유사체의 추가의 예는 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 WO 03/076567 A2에 기술되어 있다. 특히, 하기의 알부민, 또는 이의 단편 또는 변이체가 본 발명에 사용될 수 있다:

· WO 03/076567A2, 예를들어 도 3에 기술된 인간 혈청 알부민 (이 서열 정보는 참조로서 본원에 명백히 포함되어 있음);

· 66,500의 화학식 분자량을 지니는 585개의 아미노산의 단일한 글리코실화되지 않은 폴리펩티드 사슬로 구성된 인간 혈청 알부민 (HA) (참조: Meloun, et al., FEBS Letters 58:136 (1975); Behrens, et al., Fed. Proc. 34:591 (1975); Lawn, et al., Nucleic Acids Research 9:6102-6114 (1981); Minghetti, et al., J. Biol Chem. 261:6747 (1986));

· 문헌[Weitkamp, et al., Ann. Hum. Genet. 37:219 (1973)]에 기술된 알부민의 다형 변이체 또는 유사체 또는 단편;

· EP 322094에 기술된 알부민 단편 또는 변이체, 예를들어 HA(1-373), HA(1-388), HA(1-389), HA(1-369) 및 HA(1-419) 및 1-369와 1-419 사이의 단편;

· EP 399666에 기술된 알부민 단편 또는 변이체, 예를들어 HA(1-177) 및 HA(1-200) 및 HA(1-X) 사이의 단편, 여기서 X는 178 내지 199중 임의의 수임.

(하나 이상의) 반감기 연장 부분 (예를들어, 알부민, 트랜스페린 및 이들의 단편 및 유사체)이 본 발명의 리간드에 사용되는 경우, 이는 임의의 적절한 방법, 예를들어 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 결합 부분으로의 직접 융합, 예를들어 융합 단백질을 엔코딩하는 단일 누클레오티드 작제물을 이용함으로써 컨쥬게이션될 수 있고, 여기서 융합 단백질은 TNFR1 결합 부분에 N-말단 또는 C-말단으로 위치된 반감기 연장 부분을 지닌 단일 폴리펩티드 사슬로서 엔코딩된다. 대안적으로, 컨쥬게이션은 부분들 사이의 펩티드 링커, 예를들어 WO 03/076567 A2 또는 WO 2004/003019에 기술된 펩티드 링커를 이용함으로써 달성될 수 있다 (상기 링커는 본 발명에 사용하기 위한 예를 제공하기 위해 본원에 참조로서 포함되어 있다).

통상적으로 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드는 생체내에서 자연적으로 발생하고, 유기체(예를들어, 인간)로부터 원치 않는 물질을 제거하는 내인성 메커니즘에 의해 의한 분해 또는 제거에 내성을 지닌 폴리펩티드이다. 예를들어, 생체내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드는 세포외 기질로부터의 단백질, 혈액에서 발견되는 단백질, 혈액뇌장벽 또는 신경 조직에서 발견되는 단백질, 신장, 간, 폐, 심장, 피부 또는 뼈에 집중된 단백질, 스트레스 단백질, 질병 특이적 단백질, 또는 Fc 운반체와 관련된 단백질로부터 선택될 수 있다.

생체내 혈청 반감기를 향상시키는 적절한 폴리펩티드는, 예를들어 트랜스페린 수용체 특이적 리간드-신경약제 융합 단백질(참조: 내용이 본원에 참조로서 포함된 미국 특허 제 5,977,307호), 뇌 모세관 내피 세포 수용체, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체(예를들어, 가용성 트랜스페린 수용체), 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF 1) 수용체, 인슐린 유사 성장 인자 2 (IGF 2) 수용체, 인슐린 수용체, 혈액 응고 인자 X, α1-항트립신 및 HNF 1α를 포함한다. 혈청 반감기를 향상시키는 적절한 폴리펩티드는 또한 알파-1 당단백질(오로소뮤코이드; AAG), 알파-1 항키모트립신(ACT), 알파-1 소글로불린(단백질 HC; AIM), 항트롬빈 III (AT III), 아포지질단백질 A-1 (Apo A-1), 아포지질단백질 B (Apo B), 세룰로플라스민 (Cp), 보체 성분 C3 (C3), 보체 성분 C4 (C4), C1 에스테라아제 억제제 (C1 INH), C-반응 단백질 (CRP), 페리틴 (FER), 헤모펙신 (HPX), 지질단백질(a) (Lp(a)), 만노오스 결합 단백질 (MBP), 미오글로빈 (Myo), 전알부민 (트랜스티레틴; PAL), 레티놀 결합 단백질 (RBP) 및 류마티스 인자 (RF)을 포함한다.

세포외 기질로부터의 적절한 단백질은, 예를들어 콜라겐, 라미닌, 인테그린 및 피브로넥틴을 포함한다. 콜라겐은 세포외 기질의 주요 단백질이다. 신체의 상이한 부분에서 발견된 약 15개 유형의 콜라겐 분자가 공지되어 있고, 예를들어 뼈, 피부, 힘줄, 인대, 각막, 내부 기관에서 발견된 타입 I 콜라겐(신체 콜라겐의 90%에 해당) 또는 연골, 척추 디스크, 척삭 및 안구의 유리체액에서 발견된 타입 II 콜라겐이 있다.

혈액으로부터의 적절한 단백질은, 예를들어 혈장 단백질 (예를들어, 피브린, α-2 마크로글로불린, 혈청 알부민, 피브리노겐 (예를들어, 피브리노겐 A, 피브리노겐 B), 혈청 아밀로이드 단백질 A, 합토글로빈, 프로필린, 유비퀴틴, 우테로글로불린 및 β-2-소글로불린), 효소 및 효소 억제제 (예를들어, 플라스미노겐, 리소자임, 시스타틴 C, 알파-1-항트립신 및 췌장 트립신 억제제), 면역계의 단백질, 예를들어 면역글로불린 단백질 (예를들어, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, 면역글로불린 경쇄 (카파/람다)), 운반체 단백질 (예를들어, 레티놀 결합 단백질, α-1 소글로불린), 디펜신 (예를들어, 베타-디펜신 1, 호중구 디펜신 1, 호중구 디펜신 2 및 호중구 디펜신 3) 등을 포함한다.

혈액뇌장벽 또는 신경 조직에서 발견되는 적절한 단백질은, 예를들어 멜라노코르틴 수용체, 미엘린, 아스코르베이트 운반체 등을 포함한다.

생체내 혈청 반감기를 향상시키는 적절한 폴리펩티드는 또한 신장에 집중된 단백질 (예를들어, 폴리시스틴, 타입 IV 콜라겐, 유기 음이온 운반체 K1, 하이만 항원(Heymann's antigen)), 간에 집중된 항원 (예를들어, 알코올 데히드로게나아제, G250), 폐에 집중된 단백질 (예를들어, IgA에 결합하는 분비 성분), 심장에 집중된 단백질 (예를들어, 확장심근병증과 관련된 HSP 27), 피부에 집중된 단백질 (예를들어, 케라틴), 골특이적 단백질, 예를들어 골원성 활성을 나타내는 단백질(예를들어, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8)의 형질전환 성장 인자 β 상과의 서브셋인 형태형성 단백질 (BMP), 종양 특이적 단백질 (예를들어, 영양막 항원, 헤르셉틴 수용체, 에스트로겐 수용체, 카텝신 (예를들어, 간 및 비장에서 발견될 수 있는 카텝신 B))을 포함한다.

적절한 질병 특이적 단백질은, 예를들어 활성화된 T 세포에서만 발현되는 항원, 예를들어 LAG-3 (림프구 활성화 유전자), 오스테오프로테게린 리간드 (OPGL; 참조: Nature 402, 304-309 (1999)), OX40 (활성화된 T 세포에서 발현되고, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입-I (HTLV-I)-생성 세포에서 특이적으로 상향 조절되는 TNF 수용체과의 일원; 참조 Immunol. 165 (1):263-70 (2000))을 포함한다. 적절한 질병 특이적 단백질은 또한, 예를들어 메탈로프로테아제 (관절염/암과 관련), 예를들어 CG6512 드로소필라, 인간 파라플레긴, 인간 FtsH, 인간 AFG3L2, 뮤린 ftsH; 및 혈관신생 성장 인자, 예를들어 산성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-1), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-2), 관 내피세포 성장 인자/관 투과성 인자 (VEGF/VPF), 형질전환 성장 인자-α (TGFα), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 안지오제닌, 인터루킨-3 (IL-3), 인터루킨-8 (IL-8), 혈소판에 의해 유래된 내피 성장 인자 (PD-ECGF), 태반 성장 인자 (P1GF), 미드카인 혈소판에 의해 유래된 성장 인자-BB (PDGF) 및 프랙탈카인을 포함한다.

생체내 혈청 반감기를 향상시키는 적절한 폴리펩티드는 또한 스트레스 단백질, 예를들어 열충격 단백질(HSP)을 포함한다. HSP는 일반적으로 세포내에서 발견된다. 이들이 세포외에서 발견되는 경우, 이는 세포가 사멸되었고, 이의 내용물이 유출된 것을 나타낸다. 이러한 프로그램화되지 않은 세포 사멸(괴사)은 외상, 질병 또는 손상의 결과로서 세포외 HSP가 면역계로부터의 반응을 트리거링(triggering)하는 경우 발생한다. 세포외 HSP에 대한 결합은 질병 부위로의 본 발명의 조성물을 국소화시킨다.

Fc 운반체와 관련된 적절한 단백질은, 예를들어 브람벨(Brambell) 수용체(FcRB로도 공지됨)를 포함한다. 이러한 Fc 수용체는 두가지 기능을 지니는데, 이러한 기능 둘 모두는 전달에 잠재적으로 유용하다. 기능은 (1) 태반을 통한 엄마로부터 아이로의 IgG의 운반 및 (2) IgG를 분해로부터 보호하여 이의 혈청 반감기를 연장시키는 것이다. 상기 수용체는 엔도솜으로부터 IgG를 재순환시키는 것으로 생각된다 (참조: Holliger et al., Nat Biotechnol 15(7):632-6 (1997)).

약동학적 분석 및 리간드 반감기의 결정 방법은 당업자에게 친숙할 것이다. 이에 대한 상세한 설명은 t 알파 및 t 베타 반감기 및 곡선하영역(AUC)와 같은 약동학 파라미터를 기재하는 문헌[Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al., Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996). Reference is also made to "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2^nd Rev. ex edition (1982)]에서 발견될 수 있다.

내인성 표적 화합물 기능을 측정하기 위한 분석.

하기의 분석, 이의 적절한 변형 및 기타 적절한 분석이 내인성 표적 화합물의 활성을 측정하고, 리간드가 결합하는 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하는지의 여부를 측정하기 위해 사용될 수 있다.

ABC-1 기능은 배양된 세포로부터 아포지질단백질 매개 지질 유출을 측정함으로써 분석될 수 있다 (J Clin Invest 1999 Oct; 104(8): R25-31). aFGF1-슈도모나스 외독소 키메라 기능이 세포독성 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (Proc Natl Acad Sci USA 1989 Jun; 86(11): 4215-4219). 인히빈 A 활성은 마우스 프렌드 적백혈병 (MEL) 세포 및 인간 K-562 세포에 대한 인히빈 A의 분화에 의해 유도되는 활성(Proc Natl Acad Sci USA 1988 Apr; 85(8): 2434-2438); 또는 뇌하수체 소포에 의해 자극되는 호르몬의 분비의 억제(Biol Reprod 2000 Sep; 63(3): 865-871)를 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다. 인히빈 베타 C 활성은 마우스 프렌드 적백혈병 (MEL) 세포 및 인간 K-562 세포에 대한 인히빈 C의 분화에 의해 유도되는 활성(Proc Natl Acad Sci USA 1988 Apr; 85(8): 2434-2438); 또는 뇌하수체 소포에 의해 자극되는 호르몬의 분비의 억제(Biol Reprod 2000 Sep; 63(3): 865-871)를 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다. 아데노신 데아미나아제 활성은 퓨린 이화작용을 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (Mol Cell Biol 1985 Apr; 5(4): 762-767). 아디포신 기능은 아디포신에 의해 자극된 마우스 흑색종 세포에서의 cAMP의 축적을 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (Hum Mol Genet 1995 Feb; 4(2): 223-230).

ASP 기능은 마우스 흑색종 세포에서의 알파-MSH에 의해 자극된 cAMP 축적의 억제를 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (Hum Mol Genet 1995 Feb; 4(2): 223-230). 미엘린은 MAP 키나아제에 의한 이의 인산화(J Neurochem 1999 Sep; 73(3): 1090-1097); 또는 뉴런 사이의 시냅스 전달에서의 미엘린의 효과(Eur Neurol. 1988; 28(2): 57-63)의 측정에 의해 시험관내에서 분석될 수 있다. 미엘린 염기성 단백질은 MAP 키나아제에 의한 이의 인산화(J Neurochem 1999 Sep; 73(3): 1090-1097); 또는 뉴런 사이의 시냅스 전달에서의 미엘린의 효과(Eur Neurol. 1988; 28(2): 57-63)의 측정에 의해 시험관내에서 분석될 수 있다. 콜라겐 기능은 시험관내 콜라겐 피브릴 안정성 분석(Cell Mol Life Sci 2000 May; 57(5): 859-863); 또는 시험관내 세포 부착 검정(J Cell Biochem Oct. 1, 1997; 67(1): 75-83)을 이용하여 분석될 수 있다. 알파 글루코시다아제는 유색의 인공 기질인 p-니트로페닐 a-D-글루코시드의 가수분해에 의해 분석될 수 있다 (Bergmeyer, H. U. (ed) Methods of Enzymatic Analysis, Second English Edition, 1, 459 (1974)). 알파-갈락토시다아제는 p-니트로페놀 및 D-갈락토오스에 대한 유색 인공 기질 p-니트로페닐 a-D-갈락토시다아제의 가수분해에 의해 분석될 수 있다 (Rietra et al., (1975) "Properties of the residual alpha-galactosidase activity in the tissues of a Fabry hemizygote". Clin Chim Acta; 62(3): 401-13). 알파-L 이두로니다아제는 형광 분석에서 후속되는 기질 A-메틸럼벨리페릴 알파-L-이두로니드의 가수분에 의해 분석될 수 있고(Hopwood et al. (1979), Clin Chim Acta.; 92: 257-65); 기타 분석은 문헌[Thompson (1978) "Substrates for the assay of alpha-L-iduronidase". Clin Chim Acta; 89(3): 435-46]에서 발견된다.

안지오포이어틴 1 활성은 모세관 스프라우팅(sprouting) 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (Curr Biol Apr. 23, 1998; 8(9): 529-532). 안지오포이어틴 2 활성은 모세관 스프라우팅 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (Curr Biol Apr. 23, 1998; 8(9): 529-532). 안지오스타틴은 내피 증식 분석에서 분석될 수 있다 (Kringle domains of Human Angiostatin. Cao et al (1996) J. Biol. Chem. 271 29461-29467). ADMP 활성은 등형성(dorsalizing) 인자인 noggin, 구세코이드(goosecoid) 또는 폴리스타틴을 하향조절하는 이의 능력을 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (Development 1995 Dec;121(12): 4293-4301). TRAIL은 아폽토시스 분석에서 분석될 수 있다 (TRAIL-R2: a novel apoptosis-mediating receptor for TRAIL, Walczak et al. (1996) EMBOJ 16: 5386-5397). 어레스틴 기능은 내피 세포 증식, 이동, 관 형성 및 마트리겔 혈관신생을 억제하는 이의 능력을 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (Cancer Res May 1, 2000;60(9): 2520-6). 아릴술파타아제 B 활성은 N-아세틸-D-갈락토사민의 설페이트의 가수분해의 시험관내 측정에 의해 분석될 수 있다 (J Biol Chem Feb. 25, 1990;265(6): 3374-3381). 아스파라기나아제 활성은 아스파라기나아제 효소 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (Anal Biochem Apr. 10, 2000;280(1): 42-45). rBPI 활성은 항박테리아 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (J Biol Chem Nov. 5, 1987;262(31): 14891-14894).

BDNF는 신경 성장 및 시냅스 활성 분석에서 분석될 수 있다 (BDNF는 해마 세포 배양에서 신경 성장 및 시냅스 활성을 향상시킴, 참조: Bartrupet al (1997) Neuroreport 1; 8(17): 3791-4 Daniels L B, Glew R H, Radin N S, Vunnam R R). B-글루코세레브로시다아제는 베타 글루코시다아제의 공급원으로서 간과 함께 콘두리톨-베타-에폭시드를 이용하여 고셔병에 대한 형광 분석을 이용하여 분석될 수 있다 (Clin Chim Acta. Sep. 25, 1980; 106(2): 155-63; Johnson W G, Gal A E, Miranda A F, Pentchev P G. Diagnosis of adult Gaucher disease: use of a new chromogenic substrate, 2-hexadecanoylamino-4-nitrophenyl-beta-D- glucopyranoside, in cultured skin fibroblasts. Clin Chim Acta. Mar. 14, 1980;102(1): 91-7). BMP-2는 문헌[Wang, E. A et al]에 기술된 바와 같이 분석될 수 있다. 재조합 인간뼈 형태형성 단백질은 골형성을 유도한다 (Proc. NatAcad. Sci. 87: 2220-2224,1990). BT-SD 기능은 수퍼옥시드 디스뮤타아제 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (Nucleic Acids Res Mar. 25, 1985; 13(6): 2017-34). BRCA1 활성은 p21WAF1/CIP1의 발현에서의 변화를 측정함으로써 분석될 수 있다 (Oncogene Jun. 11, 1998;16(23): 3069-82). BRCA2 활성은 p21WAF1/CIP1의 발현에서의 변화를 측정함으로써 분석될 수 있다 (Oncogene Jun. 11, 1998;16(23): 3069-82). CGRP의 혈관확장 활성은 문헌[Pharmacol Res. 1999 Mar; 39(3): 217-20]에 기술된 환상 대동맥 혈관확장 분석을 이용하여 분석될 수 있고; 내피세포 및 골모세포 증식 활성은 시험관내에서 측정될 수 있다 (Eur J Pharmacol. Dec. 15, 2000; 409(3): 273-8; Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1990 May; 87(9): 3299-303).

칼레티쿨린 활성은 칼슘 화상 분석을 이용하여 시험관내에서 측정될 수 있다 (Cell. Sep. 8, 1995; 82(5): 765-71). CD4 기능은 gp120 결합 (Viral Immunol 2000; 13(4): 547-554); 또는 gp120 결합 후의 변화된 단핵구 반응 톰사이토카인(tomcytokine) (J Immunol Oct. 15, 1998; 161(8): 4309-4317)을 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다. CD40 리간드는 문헌[Hollenbaugh D, et al., The human T cell antigen gp39, a member of the TNF gene family, is a ligand for the CD40 receptor: expression of a soluble form of gp39 with B cell co-stimulatory activity. EMBO J. 1992 Dec; 11(12): 4313-21]에 기술된 바와 같이 분석될 수 있다. 케모카인 결합 단백질은 수용체 결합 분석을 이용하여 분석될 수 있다 (J Biol Chem May 9, 1997; 272(19): 12495-12504). CNTF는 신경 증식 및 생존 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (EMBO J. Apr. 2, 2001 ; 20(7) 1692-1703). 콘토르트로스타틴 활성은 알파v베타3 및 알파v베타5에 대한 결합, 혈소판 응집의 억제, 및 피브로넥틴 및 비트로넥틴에 대한 암세포 부착의 억제를 측정함으로써 시험관내에서 측정될 수 있다 (Arch Biochem Biophys Mar. 15, 2000;375(2): 278-288). CRF 결합 단백질의 활성은 CRF 결합 분석을 이용하여 측정될 수 있다 (Peptides Jan. 22, 2001; 22(1): 47-56).

CTLA4 활성은 T 세포 활성화 분석을 이용하여 측정될 수 있다 (J Immunol Mar. 1, 2001; 166(5): 3143-3150). 데코린 기능은 시험관내 콜라겐 피브릴 안정성 분석 (Cell Mol Life Sci 2000 May;57(5): 859-863); 또는 시험관내 세포 부착 분석 (J Cell Biochem Oct. 1, 1997;67(1): 75-83)을 이용하여 측정될 수 있다. Del-1 기능은 알파v베타3 인테그린 부착 분석을 이용하여 시험관내 분석될 수 있다 (Genes Dev Jan. 1, 1998; 12(1): 21-33). 데스모테플라아제는 문헌[Wallen, P., Biochemistry of plasminogen. In:Kline D.L., Reddy, K.N. N., eds. Fibrinolysis. Boca Raton, FL: CRC Press,1980: 1-25; Saksela, O., Rifkin, D. B., Cell-associated plasminogen activation: Regulation and physiological functions.Annu Rev Cell Biol 1988; 4: 93-126; Womack C J, Ivey F M, Gardner A W, Macko R F, Fibrinolytic response to acute exercise in patients with peripheral arterial disease. Med Sci Sports Exerc 2001 Feb; 33(2): 214-9]에 기술된 바와 같이 분석될 수 있다. Dnase 활성은 문헌[J Biochem (Tokyo). 1982 Oct; 92(4): 1297-303]에 기술된 DNA 분해 분석을 이용하여 측정될 수 있다. 엑토아피라아제 활성은 엑토아피라아제 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (J Biol Chem Sep. 18, 1998; 273(38): 24814-24821). EGF는 세포 성장 분석을 이용하여 분석될 수 있다 (J Biol Chem Mar. 31, 1995; 270(13): 7495-500). EMAP II 활성은 모세관 스프라우팅 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (Curr Biol Apr. 23, 1998; 8(9): 529-532). FGF-1은 세포 증식 분석을 이용하여 분석될 수 있다 (Cell, vol.50, no.5, pp.729-737 (Aug. 1987). Proc Natl Acad Sci U.S.A, vol.86, no.3, pp.802-806 (1989)). FGF-2는 NR6R-3T3 세포를 이용하는 증식 분석을 이용하여 분석될 수 있다 (Rizzino 1988 Cancer Res. 48: 4266). 피브롤라아제 활성은 섬유소 용해 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (Thromb Res May 15, 1994; 74(4): 355-367). FLT3는 Flt-3 형질전환된 프로 B 세포주를 이용하는 증식 분석에서 분석될 수 있다 (Hannum 1994 Nature 368: 643).

폴리트로핀 활성은 FSH 수용체를 발현하는 세포에서 cAMP 생성을 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (J Reprod Immunol 2001 Jan; 49(1): 1-19). GDNF 활성은 GDNF 치료에 응한 Ret 티로신 인산화의 증가를 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (Mol Cell Biol Mar. 15, 1995; (3): 1613-1619). 젤솔린 활성은 액틴의 단백질 분해를 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (Nature 1987 Jan 22-28; 325(6102): 362-364). GGF2 활성은 인간 횡문근육종 세포에서의 ERBB 수용체 티로신 키나아제의 활성화를 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (Int J Cancer Jul. 1, 2000;87(1): 29-36).

글루카곤의 당생성 활성은 높은 친화성의 글루카곤 수용체에 의해 매개된다. 재조합 글루카곤의 생물학적 활성은 직접적인 결합 분석에 의해 측정될 수 있다 (Science Mar. 12, 1993; 259(5101): 1614-6). HBNF 활성은 신경돌기 생성 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (J Biol Chem Oct. 27, 1995; 270(43): 25992-25999). hCG 수용체 결합 및 활성화는 재조합 hCG의 생물학적 활성을 평가하기 위해 측정될 수 있다 (J Biol Chem Oct. 5, 1993; 268(28): 20851-4). 열충격 단백질은 마우스의 두개의 UV에 의해 유도된 암종 모델에서 HSP-펩티드 복합체의 투여에 의해 분석될 수 있다 (US 5,837,251). 인터루킨 1은, 1) YT-NCI 또는 C3H/HeJ 세포에서의 IL-1 수용체에 대한 결합 (Carter et al., Nature 344: 633-638, 1990); 2) 내피세포-백혈구 부착의 유도 (Carter et al., Nature 344: 633-638, 1990); 3) A375-C6 세포에 대한 증식 분석 (Murai T et al., J. Biol. Chem. 276: 6797-6806, 2001); D1OS 증식 (Orencole & Dinarello (1989) Cytokine 1, 14-20)에 의해 분석될 수 있다. IL-1ra는, 1) YT-NCI 또는 C3H/HeJ 세포의 IL-1 수용체에 대한 IL-1 결합과의 경쟁 (Carter et al., Nature 344: 633-638, 1990); 2) IL-1에 의해 유도된 내피세포-백혁구 부착의 억제 (Carter et al., Nature 344: 633-638, 1990); 3) IL-1의 항증식 작용에 매우 민감한 인간 흑색종 세포주인 A375-C6 세포에서의 증식 분석(Murai T et al., J. Biol. Chem. 276: 6797-6806, 2001)에 의해 분석될 수 있다. IL-10은, 1) NK 세포에 대한 IL-10의 결합 (carson WE et al., Blood 85: 3577-3585, 1995); 2) 대식세포에 의한 TNF-알파 생성의 억제 (Riley J K et al., J. Biol. Chem. 274: 16513-16521, 1999); 3) 대식세포 증식의 억제 (O'Farrell A-M et al., EMBO 17: 1006-1018, 1998); MC-9 증식 (Thompson-Snipes et al (1991) J. Exp. Med. 173, 507-510)에 의해 분석될 수 있다. IL-11은 조혈세포 증식 분석에서 분석될 수 있다 ("Interleukin-11 enhances human megakaryocytopoiesis in vitro." Blood. Jan. 15, 1992; 79(2): 327-31. "Synergistic effects of stem cell factor and interleukin 6 or interleukin 11 on the expansion of murine hematopoietic progenitors in liquid suspension culture." Stem Cells. 1995 JuI; 13(4): 404-13; B9-11 proliferation: Lu et al (1994) J immunol. Methods 173, 19). IL-12는 자연살(NK) 세포 세포독성 분석 및 인터페론-감마(IFN-감마) 방출 분석에서 분석될 수 있다 ("Requirement for type 2 NO synthase for IL-12 signaling in innate immunity". Science 284: 951-955, 1999; KIT-225 proliferation: Hori et al (1987), Blood 70, 1069-1078).

IL18 결합 단백질 활성은 조기 Th1 반응을 억제하는 이의 능력을 측정함으로써 분석될 수 있다 (Immunity 1999 Jan; 10(1): 127-136). IL2-디프테리아 독소 키메라 기능은 세포독성 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (Exp Hematol 2000 Dec; 28(12): 1390-1400). IL-4는 정상 T 림프구에서의 세포독성 분석으로 분석될 수 있다 ((PMID: 8144944); RAMOS Augmentation of CD23 expression: Siegel & Mostowski (1990) J Immunol Methods 132, 287-295). IL-4 수용체 활성은 TF-1 세포의 IL-4 의존 증식을 억제하는 능력에 의해 측정될 수 있다 (Kitamura, T et al., 1989, J. Cell. PPhysiol. 140:323). IL-8은 IL8R 함유 세포에서 칼슘 환류를 모니터하는 분석으로 분석될 수 있다 (Holmes et al (1991)Science 253, 1278-80). 인터페론 감마는 hEMC 바이러스로 감염된 Hela 세포를 이용하는 항바이러스 분석으로 활성을 측정할 수 있고 (Meager, A. 1987, Lymphokines and Interferons, A Practical Approach, Clemens, MJ et al., eds., IRL Press, p. 129); 인간 직장결장 암종 세포주 COLO 205에서의 MHC 클래스 II 발현의 조절을 측정할 수 있다 (Gibson and Kramer, 1989, J. Immunol. Methods, 125: 105-113).

인터페론-오메가 활성은 시험관내 항바이러스 분석을 이용하여 측정될 수 있다 (JMed Microbiol 1998 Nov; 47(11): 1015-8). IP-10 활성은 래트 동맥 평활근 세포 화학주성 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (J Biol Chem Sep. 27, 1996; 271(39): 24286-24293). IL-3 활성은 조혈세포 분화 분석을 이용하여 시험관내에서 측정될 수 있다 (Science 1985; 228(4701): 810-815). KGF-1 활성은 내피 세포 증식 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1989 Feb; 86(3): 802-806). 키스트린 활성은 관상 동맥 혈전증의 개 모델에서 재조합 조직 타입 플라스미노겐 활성인자 (rt-PA)의 투여와 관련된 혈전용해, 재폐쇄, 및 출혈을 분석함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (Circulation 1991 Mar; 83(3): 1038-1047). 쿤니츠 프로테아제 억제제 1 활성은 HGF 활성인자에 대한 억제 활성을 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (J Biol Chem Mar. 7, 1997; 272(10): 6370-6376). 락토트랜스페린 활성은 시험관내 바이러스 억제 분석 (J Med Microbiol 1998 Nov; 47(11): 1015-8), 및 항균 분석 (J Clin Invest Sep. 1, 1998; 102(5): 874-80)을 이용하여 측정될 수 있다. 렙틴은 음식 흡수의 생체내 조절, 체중의 감소, 및 ob/ob 마우스의 인슐린 및 글루코오스 수준의 저하, 방사선면역분석 (RIA) 및 세포 기재 분석에서의 렙틴 수용체의 활성화에 의해 분석될 수 있다 (Protein Expr Purif 1998 Dec; 14(3): 335-42). LIF 활성은 조혈 세포 분화 분석을 이용하여 시험관내에서 측정될 수 있다 (Science 1985; 228(4701): 810-815). LFA-3 활성은 T 세포 기능을 억제하는 이의 능력을 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (JExp Med JuI. 1, 1993;178(1): 211-222). Lys 플라스미노겐 활성은 시험관내 섬유소용해 분석을 이용하여 측정될 수 있다 (J Biol Chem Dec. 25, 1992; 267(36): 26150-6).

마스핀 활성은 시험관내 혈관신생 분석을 이용하여 측정될 수 있다 (Nat Med 2000 Feb; 6(2): 196-9). 메티오나아제 활성은 문헌[Ito et al. (J Biochem (Tokyo), 1975 Nov; 78(5): 1105-1107)]에 기술된 바와 같이 시험관내에서 분석될 수 있다. MTP 활성은 apo-B 함유 지질단백질 분비 분석을 이용함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (J Biol Chem Sep. 2, 1994; 269(35): 21951-21954). NGF 활성은 배양물 내의 교감 뉴련의 CREB 전사 인자 활성화의 측정에 의해 분석될 수 있다 (Science Dec. 17, 1999;286(5448): 2358-2361). 중화 엔도펩티다아제 활성은 봄베신 유사 펩티드의 단백질 분해를 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (Proc NatlmAcad Sci U.S.A. Dec. 1, 1991; 88(23): 10662-10666). NIF 활성은 다형핵 백혈구 부착 검정을 이용하여 시험관 내에서 분석될 수 있다 (Mol Pharm 1999 Nov; 56(5): 926-932). Noggin 활성은 HeLa 세포의 TNF 자극에 대한 TNF 수용체 반응을 측정함으로써 분석될 수 있다 (J Biol Chem Feb. 28, 1997; 272(9): 5861-5870). NT-3 활성은 무혈청 한정 배지에서 배양된 NC 전구세포를 증식시키는 이의 능력을 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (Proc Natl Acad Sci U.S.A Mar. 1, 1992; 89(5): 1661-1665). OP-1 활성은 태아 래트 두개관 세포에서의 VEGF 발현을 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (Mol Cell Endocrinol Jul. 20, 1999;153(l-2): 113-124). 오스테오프로테게린 활성은 파골세포형성에 대한 공동배양 분석, 태아 긴뼈 기관 배양 시스템을 이용하는 골흡수 분석, 상아질 흡수 분석, 또는 섬유모세포 증식 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (FASEB J. 1998; 12: 845-854). 혈장 PAF 아세틸히드롤라아제 활성은 문헌[Stafforini et al. (Stroke 1997 Dec; 28(12): 2417-20)]의 방법에 의해 결정될 수 있다.

Patched 기능은 이의 리간드인 소닉 헷지혹 (Sonic hedgehog)의 결합을 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (Nature Nov. 14, 1996; 384(6605): 129-134). PDGF 활성은 PDGF 수용체에서 티로신 인산화를 유도하는 이의 능력을 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (J Biol Chem May 25, 1989;264(15): 8905-8912). PEDF 기능은 신경돌기 생성 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (J Biol Chem Oct. 27, 1995; 270(43): 25992-25999). 플라스미노겐 활성인자 억제제는 문헌[Wallen, P., Biochemistry of plasminogen, In: Kline D. L., Reddy, K. N. N., eds. Fibrinolysis. Boca Raton, FL: CRC Press, 1980: 1-25; Saksela, O., Rifkin, D. B., Cell-associated plasminogen activation: Regulation and physiological functions. Annu Rev Cell Biol 1988; 4: 93-126; Womack C J, Ivey F M, Gardner A W, Macko R F, Fibrinolytic response to acute exercisein patients with peripheral arterial disease. Med Sci Sports Exerc 2001 Feb; 33(2): 214-9]에 기술된 바와 같이 분석될 수 있다. PGP 활성은 태아 간 티로신 키나아제-3 및 과립구 콜로니-자극 인자의 효능화를 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (Exp Hematol 2001 Jan; 29(1): 41-50). PMP 활성은 골수, 수동 말초혈액 전구 세포, 또는 탯줄로부터 정제된 CD43+ 세포에서 거대핵세포형성을 유도하는 능력을 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (J Hematother 1999 Apr; 8(2): 199-208). 프로삽티드 효능은 당뇨병 래트를 이용하는 다회 투여 요법을 통해 측정될 수 있다 (Anesthesiology 2000 Nov; 93(5): 1271-8).

시험관내 란피르나아제 활성은 리보누클레아제 및 세포독성 활성 분석을 이용함으로써 분석될 수 있다 (J Mol Biol Apr. 19, 1996; 257(5): 992-1007). 릴렉신 활성은 시험관내 분석에서의 KCl에 의해 유도된 래트 자궁수축의 억제를 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (Can J Physiol Pharmacol 1981 May; 59(5): 507-12). 망막 S-항원 활성은 막대 광수용 세포에서의 고리 GMP 관문 통로의 활성을 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (J Biol Chem Nov. 25, 1994; 269(47): 29765-29770). RhLH 활성은 RhLH 자극에 대한 반응으로 분리된 돼지 난포막 세포에서의 Fura-2 형광을 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (Endocrinology 2000 Jun; 141(6): 2220-2228). 사루플라아제 활성은 플라스미노겐 분열 분석을 이용하여 시험관내에서 측정될 수 있다 (J Biol Chem Jan. 18, 2001; epub ahead of print). 보체 수용체 타입 1은 C3b 및 C4b 결합을 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (J Exp Med Nov. 1, 1988; 168(5): 1699-1717).

소닉 헷지혹 기능은 patched에 대한 이의 결합을 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (Nature 1996 Nov. 14; 384(6605): 129-134). 스태필로키나아제 활성은 플라스미노겐 분해 분석을 이용하여 시험관내에서 측정될 수 있다 (J Biol Chem Jan. 18, 2001; epub ahead of print). SCF 활성은 비만 세포 생존, 증식, 또는 전염증 사이토카인의 생성을 측정함으로써 분석될 수 있다 (Immunol Rev 2001 Feb; 179: 57-60). 스트렙토키나아제 활성은 플라스미노겐 활성화 분석을 이용하여 시험관내에서 측정될 수 있다 (J Biol Chem Jan. 18, 2001; epub ahead of print). 수퍼옥시드 디스뮤타아제 활성은 수퍼옥시드 디스뮤타아제 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (Nucleic Acids Res Mar. 25, 1985; 13(6): 2017-34). T1/ST2 기능은 Th2 세포 활성화 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (J Immunol Mar. 1, 2001 ; 166(5): 3143-3150). TGF 베타 1 활성은 FGF-2의 유도를 통한 신장 섬유모세포 증식의 유도를 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (Kidney Int 2001 Feb; 59(2): 579-592). TGF 베타 2 기능은 iNOS 전사의 억제를 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (Inflamm Res 1997 Sep; 46(9): 327-331). TGF-베타 3은 기관 배양의 신생아 마우스 두개관에서의 프로스타글란딘 E2 (PGE2)의 생성 및 골 흡수의 자극 (PNAS USA 1985 Jul; 82(13): 4535-4538), 또는 콜라겐, 오스테오폰틴, 오스테오넥틴, 및 알칼라인 포스파타아제의 합성의 자극, 및 골모세포 유사 세포에서의 복제를 자극하는 능력에 대해 분석될 수 있다 (J Biol Chem 1987;262: 2869, J Biol Chem 1988; 263: 13916, J Cell Biol 1988; 106: 915, J Cell Physiol 1987; 133: 426, Endocrinology 1987; 121: 212, Endocrinology 1986;19: 2306, and J Cell Biol 1987; 105: 457).

트롬보포이어틴 (TPO)는 거대핵세포의 성장 및 분화의 조절을 결정하기 위해 분석될 수 있다 (Mol Cell Biol 2001 Apr; 21(8): 2659-2670; Exp Hematol 2001 Jan; 29(1): 51-58; Leukemia 2000 Oct; 14(10): 1751-1756). Tie-2/Tek 기능은 혈관신생에 의한 자극에 대한 반응인 이의 인산화를 측정함으로써 분석될 수 있다 (Int Immunol 1998 Aug; 10(8): 1217-1227). 조직 인자 경로 억제제는 외인성 응고 경로의 인자 Xa의 비활성화 및 ⅤⅡa 조직 인자 복합체의 억제에 대해 분석될 수 있다 (J Biol Chem May 5, 1998; 263(13): 6001-6004; Thromb Haemost 1998; 79(2): 306-309). TNF 결합 단백질 활성은 HeLa 세포의 TNF 자극에 대한 반응인 PIP5K 활성화의 억제를 측정함으로써 분석될 수 있다 (J Biol Chem Feb. 28, 1997; 272(9): 5861-5870). TNF 결합 단백질 활성은 HeLa 세포의 TNF 자극에 대한 반응인 PIP5K 활성화의 억제를 측정함으로써 분석될 수 있다 (J Biol Chem Feb. 28, 1997;272(9): 5861-5870). TNF 수용체 활성은 HeLa 세포의 TNF 자극에 대한 반응인 PIP5K 활성화의 증가를 측정함으로써 분석될 수 있다 (J Biol Chem Feb. 28, 1997; 272(9): 5861-5870). t-PA는 문헌[Wallen, P., Biochemistry of plasminogen. In: Kline D. L., Reddy, K. N. N., eds. Fibrinolysis. Boca Raton, FL: CRC Press, 1980: 1-25; Saksela, O., Rifkin, D. B., Cell-associated plasminogen activation: Regulation and physiological functions. Annu Rev Cell Biol 1988; 4: 93-126; Womack C J, IveyFM, Gardner A W, Macko R F, Fibrinolytic response to acute exercise in patients with peripheral arterial disease. Med Sci Sports Exerc 2001 Feb; 33(2): 214-9]에 기술된 바와 같이 분석될 수 있다. IFN-tau 활성은 발정 주기의 13일 째의 암양으로부터 제조된 배양된 자궁내막의 체외이식 조직에서의 산성의 70kD 단백질의 IFN-tau에 의해 유도된 생성을 측정함으로써 시험관내에서 분석될 수 있다 (Mol Endocrinol 1990 Oct; 4(10): 1506-1514).

트로포닌 I 활성은 근육원섬유 결합 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (J Muscle Res Cell Motil 1999 Nov; 20(8): 755-760). 뇨산염 옥시다아제 활성은 요산의 요산분해효소에 의해 촉매되는 산화에 대한 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있거나(Anal Chem May 15, 1999; 71(10): 1928-1934); 재조합 요산염 옥시다아제의 면역분석에 의해 분석될 수 있다 (J Pharm Sci 1996 Sep; 85(9): 955-959). 우로키나아제 활성은 플라스미노겐 분해 분석을 이용하여 시험관내에서 측정될 수 있다 (Sazonova et al. (J Biol Chem Jan. 18, 2001, electronic publication prior to print)). VEGF-1 활성은 내피 세포 증식 분석을 이용하여 시험관내에서 분석될 수 있다 (Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1989 Feb; 86(3): 802-806). 비스쿠민의 활성은 과립구 및 호중구 활성화 분석을 이용하여 분석될 수 있다 (Anticancer Res 1999 Jul-Aug; 19(4B): 2925-2928; and J Leukoc Biol 2000 Dec; 68(6): 845-853).

면역글로불린 기재 리간드의 제조

본 발명의 따라 본원에 기재된 결합 리간드 (예를들어, dAb)는 scFv, "파지" 항체 및 기타 고안된 항체 분자를 제조하기 위해 항체 공학 분야에서 사용되는 기존에 확립된 기술에 따라 제조될 수 있다. 항체를 제조하기 위한 기술은, 예를들어 하기의 리뷰 및 본원에 인용된 참고문헌에 기술되어 있다: [Winter & Milstein, (1991) Nature 349:293-299; Pluckthun (1992) Immunological Reviews 130:151-188; Wright et al., (1992) Crti. Rev. Immunol.l2:125-168; Holliger, P. & Winter, G. (1993) Curr. Op. Biotechn. 4, 446-449; Carter, et al. (1995) J. Hernatother. 4, 463-470; Chester, K.A. & Hawkins, R.E. (1995) Trends Biotechn. 13, 294-300; Hoogenboom, H.R. (1997) Nature Biotechnol. 15, 125-126; Fearon, D . (1997) Nature Biotechnol. 15, 618-619; Pluckthun, A. & Pack, P. (1997) Inumunotechnology 3, 83-105; Carter, P. & Merchant, A.M. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 449-454; Holliger, P. & Winter, G. (1997) Cancer Immunol. Immuaother. 45,128-130].

요망되는 특이성을 지니는 항체 가변 도메인의 선택에 사용되는 기술은 당 분야에 공지된 라이브러리 및 선택 과정을 이용한다. 인간 B 세포로부터 수거된 재배열된 V 유전자를 사용하는 천연 라이브러리 (Marks et al (1991) J. MoI. Biol, 222: 581; Vaughan et al (1996) Mature Biotech., 14: 309)가 당 분야에 널리 공지되어 있다. 합성 라이브러리 (Hoogenbooxn & Winter (1992) J. MoI. Biol, 227: 381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl Acad. ScL USA, 89: 4457; Nissim et al (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J, 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. MoI Biol, 248: 97)가 보통 PCR을 이용하는 면역글로불린 V 유전자의 클로닝에 의해 제조된다. PCR 과정에서의 오류는 높은 정도의 무작위화를 발생시킬 수 있다. V_H 및/또는 V_L 라이브러리는 표적 항원 또는 에피토프에 대해 별도로 선택될 수 있고, 이러한 경우 단일 도메인 결합이 직접적으로 선택되거나, 함께 선택된다.

라이브러리 벡터 시스템

본 발명에 사용하기에 적합한 다양한 선택 시스템이 당 분야에 공지되어 있다. 이러한 시스템의 예는 하기에 기술되어 있다.

박테리오파지 람다 발현 시스템이 기존에 기술된 바와 같이 박테리오파지 플라크 또는 용해소원의 콜로니, 또는 둘 모두로서 직접적으로 스크리닝될 수 있고 (Huse et al. (1989J Science, 246: 1275; Caton and Koprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A., 87; Mullinax et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A., 87: 8095; Persson et al. (1991) Proc. Natl Acad. Sd. U.S.A., 88: 2432), 본 발명에 사용된다. 이러한 발현 시스템이 10⁶개 이하의 상이한 일원의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있으나, 이들은 보다 많은 수(10⁶개 일원 초과)의 스크리닝에는 적합하지 않다. 라이브러리의 작제하는데 특히 사용되는 것은 핵산이 이의 발현물인 폴리펩티드로 연결될 수 있는 선택 전시 시스템이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 선택 전시 시스템은 적절한 전시 수단에 의해 일반 및/또는 표적 리간드에 의해 라이브러리의 개별적 일원의 선택을 가능케 하는 시스템이다.

요망되는 수의 다수의 라이브러리를 분리시키기 위한 선택 프로토콜은 당 분야에 공지되어 있고, 이는 파지 전시 기술로 대표된다. 다양한 펩티드 서열이 섬유상 박테리오파지의 표면에 전시되는 이러한 시스템 (Scott and Smith (1990) Science, 249: 386)은 시험관내 선택을 위한 항체 단편 (및 이를 엔코딩하는 누클레오티드 서열)의 라이브러리 및 표적 항원에 결합하는 특이적 항체 단편의 증폭 (McCafferty et al., WO 92/01047)을 생성시키기에 유용한 것으로 증명되었다. 가변 영역을 엔코딩하는 누클레오티드 서열은, 이들을 대장균(E. coli)의 원형질막 주위공간으로 향하게 하여, 결과로서 생성된 항체 단편이 통상적으로 박테리오파지 코트 단백질 (예를들어, pⅢ 또는 pVIII)로의 융합으로 박테리오파지의 표면에 전시되도록 하는 선도 신호를 엔코딩하는 유전자 단편에 연결된다. 대안적으로, 항체 단편은 람다 파지 캡시드 (파지바디(phagebodi))에서 외부적으로 전시된다. 파지 기재 전시 시스템의 이점은 이들이 생물학적 시스템이므로, 선택된 라이브러리 일원이 박테리아 세포에서 선택된 라이브러리 일원을 함유하는 파지를 성장시킴으로써 간단하게 증폭될 수 있다는 점이다. 더욱이, 폴리펩티드 라이브러리 일원을 엔코딩하는 누클레오티드 서열이 파지 또는 파지미드 벡터에 함유되므로, 서열분석, 발현 및 이후의 유전적 조작이 비교적 간단하다.

박테리오파지 항체 전시 라이브러리 및 람다 파지 발현 라이브러리의 작제를 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다 (McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552; Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624; Lowman et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Burton et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 88: 10134; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133; Chang et al. (1991) J Immunol., 147: 3610; Breitling et al. (1991) Gene, 104: 147; Marks et al. (1991) supra; Baxbas et al. (1992) supra; Hawkins and Winter (1992) J. Immunol, 22: 867; Marks et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 16007; Lerner et al. (1992) Science, 258: 1313, 본원에 참조로서 포함되어 있음).

특히 유리한 한 방법은 scFv 파지-라이브러리를 사용하는 것이다 (Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883; Chaudlxary et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070; McCafferty et al (1990) supra; Clackson et al (1991) Nature, 352: 624; Marks et al (1991) J MoI. Biol, 222: 581; Chiswell et al (1992) Trends Biotech., 10: 80; Marks et al (1992) J Biol. Chem., 267). 박테리오파지 코트 단백질에 전시되는 scFv 라이브러리의 다양한 구체예가 기술되어 있다. 파지 전시 방법의 정련이 본원에 참조로서 포함된 WO96/06213 및 WO92/01047 (Medical Research Council et al.) 및 WO97/08320 (Morphosys)에 기술된 바와 같이 공지되어 있다.

폴리펩티드의 라이브러리를 생성하기 위한 기타 시스템은 라이브러리 일원의 시험관내 합성을 위한 세포 결핍 효소 기구의 사용을 포함한다. 한 방법에서, RNA 분자는 표적 리간드에 대한 대안적 범위의 선택 및 PCR 증폭에 의해 선택된다 (Tuerk and Gold (1990) Science, 249: 505; Ellington and Szostak (1990) Nature, 346: 818). 유사한 기술이 소정의 인간 전사 인자에 결합하는 DNA 서열을 확인하기 위해 사용될 수 있다 (Thiesen and Bach (1990) Nucleic Acids Res., 18: 3203; Beaudry and Joyce (1992) Science, 257: 635; WO92/05258 and WO92/14843). 유사한 방식에서, 다수의 라이브러리를 생성시키기 위한 방법으로서 폴리펩티드를 합성하기 위해 시험관내 번역이 사용될 수 있다. 일반적으로 안정화된 폴리솜(polysome) 복합체를 포함하는 이러한 방법이 WO88/08453, WO90/05785, WO90/07003, WO91/02076, WO91/05058 및 WO92/02536에 추가로 기술되어 있다. 파지 기재가 아닌 대안적 전시 시스템, 예를들어 WO95/22625 및 WO95/11922 (Affymax)에 기술된 것은 선택을 위한 폴리펩티드를 전시하기 위해 폴리솜을 이용한다.

또 다른 추가 범주의 기술은 유전자와 이의 유전 생성물의 결합을 가능케 하는 인공 구획내에서의 레퍼토리의 선택을 포함한다. 예를들어, 요망되는 유전자 생성물을 엔코딩하는 핵산 서열이 유중수 에멀젼에 의해 형성된 마이크로캡슐에서 선택될 수 있는 선택 시스템이 WO99/02671, WO00/40712 및 문헌[Tawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6]에 기술되어 있다. 요망되는 활성을 지니는 유전자 생성물을 엔코딩하는 유전 성분이 마이크로캡슐 내로 구획으로 나누어진 후, 마이크로캡슐 내에서 이들의 각각의 유전자 생성물 (RNA 또는 단백질)을 생성시키기 위해 전사되고/되거나 번역된다. 요망되는 활성을 지니는 유전자 생성물을 생성하는 유전 성분은 이후 분류된다. 이러한 방법은 다양한 방법에 의해 요망되는 활성을 검출함으로써 관심 유전자 생성물을 선택한다.

라이브러리 작제

선택을 위한 라이브러리는 당 분야에 널리 공지된 기술, 예를들어 상기 나열된 기술을 이용하여 작제될 수 있거나, 상업적 공급원으로부터 구입될 수 있다. 본 발명에 유용한 라이브러리는, 예를들어 WO99/20749에 기술되어 있다. 일단 벡터 시스템이 선택되고, 관심 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 서열이 라이브러리 벡터 내로 클로닝되면, 이는 발현 전에 돌연변이 유발을 수행함으로서 클로닝된 분자 내에서 다양성을 생성시킬 수 있고; 대안적으로, 엔코딩된 단백질은 돌연변이 유발 및 추가 범위의 선택이 수행되기 전에 상기 기술된 바와 같이 발현되고 선택될 수 있다. 구조적으로 최적화된 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열의 돌연변이 유발은 표준 분자 방법에 의해 수행된다. 물론, 중합효소 연쇄반응, 또는 PCR(Mullis and Faloona (1987) Methods Enzymol, 155: 335, 본원에 참조로서 포함됨)이 사용된다. 관심 표적 서열을 증폭시키기 위한 열안정적인 DNA 의존성 DNA 중합효소에 의해 다중 사이클의 DNA 복제를 이용하는 PCR은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 다양한 항체 라이브러리의 작제는 본원에 참조로서 인용된 문헌[Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55]에 논의되어 있다.

PCR은 주형 DNA (1 fg 이상; 보다 유용하게는 1-1000 ng) 및 25 pmol 이상의 올리고누클레오티드 프라이머를 이용하여 수행되고; 프라이머 풀이 각각의 서열이 상기 풀의 분자의 소량의 분획만에 의해 나타내어지는 바와 같이 매우 이종이고, 양이 이후의 증폭 사이클에서 제한이 되는 경우에 보다 많은 양의 프라이머를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 통상적인 반응 혼합물은 2μl의 DNA, 25 pmol의 올리고누클레오티드 프라이머, 2.5 μl의 1OX PCR 완충용액 1 (Perkin-Elmer, Foster City, CA), 0.4 μl의 1.25 μM dNTP, 0.15 μl (또는 2.5 유닛)의 Taq DNA 중합효소 (Perkin Elmer, Foster City, CA) 및 전체 부피가 25μl가 되게 하는 탈이온화된 물을 포함한다. 미네랄 오일이 입혀지고, 프로그램화된 열 사이클러를 이용하여 PCR이 수행된다. PCR 사이클의 각각의 단계의 길이 및 온도, 뿐만 아니라 사이클의 수는 효과에 대한 엄격한 요구조건에 따라 조정된다. 어닐링 온도 및 시간은 주형에 대해 어닐링되는 것으로 예상되는 프라이머의 효능 및 용인되는 미스매치의 정도 둘 모두에 의해 결정되고; 명백하게는, 핵산 분자가 동시에 증폭되고 돌연변이 유발되는 경우 최소한 첫번째 순환의 합성에서 미스매치가 요구된다. 프라이머 어닐링 조건의 엄격함을 최적화시키기 위한 능력은 당업자의 지식 범위 내에 해당된다. 30℃ 내지 72℃ 사이의 어닐링 온도가 사용된다. 주형 분자의 최초 변성은 일반적으로 4분 동안 92℃ 내지 99℃에서 발생한 후, 변성 (15초 내지 1분 동안 94-99℃), 어닐링 (상기 논의된 바와 같은 온도; 1-2분) 및 신장 (증폭되는 생성물의 길이에 따라 1-5분 동안 72℃)으로 구성된 20-40회의 사이클로 발생한다. 최종 신장은 일반적으로 72℃에서 4분이고, 4℃에서 한계가 없는 (0 내지 24시간) 단계가 후속될 수 있다.

단일 가변 도메인의 조합

일단 선택되면, 본 발명에 유용한 도메인은 공유 및 비공유 방법을 포함하는 당 업계에 공지된 다양한 방법에 의해 조합될 수 있다. 바람직한 방법은, 예를들어 scFv 분자와 관련하여 기술된 바와 같은 폴리펩티드 링커의 사용을 포함한다 (Bird et al., (1988) Science 242:423-426). 적절한 링커의 논의는 문헌[Bird et al. Science 242, 423-426; Hudson et al., Journal Immunol Methods 231 (1999) 177-189; Hudson et al., Proc Nat Acad Sci USA 85, 5879-5883]에 제공되어 있다. 링커는 바람직하게는 가요성으로, 이는 두개의 단일 도메인이 상호작용할 수 있도록 한다. 하나의 예시적 링커는 (Gly4 Ser)n 링커로, 여기서 n=1 내지 8, 예를들어 2, 3, 4, 5 또는 7이다. 덜 가요성인 디아바디에 사용되는 링커가 또한 사용될 수 있다 (Holliger et al , (1993) PNAS (USA) 90:6444-6448). 한 구체예에서, 사용되는 링커는 면역글로불린 힌지 영역이 아니다.

가변 도메인은 링커가 아닌 방법을 이용하여 조합될 수 있다. 예를들어, 천연 발생되거나 고안된 시스테인 잔기를 통해 제공되는 이황화결합(Reiter et al., (1994) Protein Eng. 7:697-704)을 사용하거나 "피트(fit)"하여 이에 따라 상호작용의 안정성을 개선시키기 위해 가변 도메인 사이의 인터페이스를 개조 (Ridgeway et al., (1996) Protein Eng. 7:617-621; Zhu et al., (1997) Protein Science 6:781-788)시킴으로써 V_H-V_H, V_L-V_L 또는 V_H-V_L 이합체를 안정화시킬 수 있다. 면역글로불린의 가변 도메인, 특히 항체 V_H 도메인을 결합시키거나 안정화시키기 위한 기타 기술이 적절하게 사용될 수 있다.

리간드의 특성분석

리간드 (예를들어, dAb 단량체, 이중특이적 리간드)의 이의 특정 항원(들) 또는 에피토프(들)에 대한 결합은 당업자에게 친숙한 방법에 의해 시험될 수 있고, 이는 ELISA를 포함한다. 본 발명의 한 바람직한 구체예에서, 결합은 모노클로날 파지 ELISA를 이용하여 시험된다. 파지 ELISA는 임의의 적절한 과정에 따라 수행될 수 있고; 한 예시적 프로토콜이 하기 기술된다.

각각의 라운드의 선택에서 생성된 파지의 집단은 "폴리클로날" 파지 항체를 확인하기 위해, 선택된 항원 또는 에피토프에 대한 결합이 ELISA에 의해 스크리닝될 수 있다. 이후, 상기 집단으로부터의 단일한 감염된 박테리아 콜로니로부터의 파지가 "모노클로날" 파지 항체임을 확인하기 위해 ELISA에 의해 스크리닝될 수 있다. 항원 또는 에피토프에 대한 결합에서 가용성 항체 단편을 스크리닝하는 것이 또한 요망되고, 이는 또한 예를들어 C- 또는 N-말단 태그에 대한 시약을 이용하는 ELISA에 의해 수행될 수 있다 (참조: Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55, 참조로서 본원에 인용되어 있음).

선택된 모노클로날 항체의 다양성은 또한 PCR 생성물의 젤 전기영동 (Marks et al. 1991, supra; Nissim et al. 1994 supra), 프로빙 (Tomlinson et al., 1992) J. MoI. Biol. 227, 776) 또는 벡터 DNA의 서열분석에 의해 측정될 수 있다.

리간드의 구조

가변 도메인이 예를들어 본원에 기술된 파지 전시 기술을 이용하여 선택된 V 유전자 레퍼토리로부터 선택되는 경우, 이들 가변 도메인은 유니버셜 프레임워크 영역을 포함하여, 본원에 정의된 특정 일반 리간드에 의해 인식될 수 있다. 유니버셜 프레임워크 및 일반 리간드 등의 사용은 WO99/20749에 기술되어 있다.

V 유전자 레퍼토리가 사용되는 경우, 폴리펩티드 서열 내의 변이는 바람직하게는 가변 도메인의 구조적 루프 내에 위치된다. 가변 도메인의 폴리펩티드 서열은 각각의 가변 도메인과 이의 상보적 쌍의 상호작용을 향상시키기 위해 DNA 셔플링 또는 돌연변이에 의해 변경될 수 있다. DNA 셔플링은 당 분야에 공지되어 있고, 예를들어 문헌[Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391] 및 미국 특허 제 6,297,053호에 교시되어 있고, 상기 두 문헌은 참조로서 본원에 포함되어 있다. 돌연변이 유발의 기타 방법이 당 분야에 널리 공지되어 있다.

일반적으로, 리간드 선택, 제조 및 포맷화에 요구되는 핵산 분자 및 벡터 작제물은 표준 실험실 매뉴얼, 예를들어 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA]에 기술된 바와 같이 작제되고 조작될 수 있다.

본 발명에 유용한 핵산의 조작은 통상적으로 재조합 벡터로 수행된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 벡터는 이종유래의 DNA를 이의 발현 및/또는 복제를 위해 세포로 도입시키기 위해 사용되는 별개의 성분을 의미한다. 상기 벡터를 선택하고, 작제하고, 이후에 사용하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 인공 염색체 및 에피솜 벡터를 포함하는 다양한 벡터가 공적으로 이용가능하다. 이러한 벡터는 간단한 클로닝 및 돌연변이 유발에 사용될 수 있고; 대안적으로, 유전자 발현 벡터가 사용된다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 벡터는 요망되는 크기, 통상적으로 0.25 킬로베이스 (kb) 내지 40 kb 또는 이 이상의 길이의 폴리펩티드 코딩 서열을 수용하도록 선택될 수 있다. 적절한 숙주 세포가 시험관내 클로닝 조작 이후에 벡터로 형질전환된다. 각각의 벡터는 일반적으로 클로닝 (또는 "폴리링커") 부위, 복제 기점 및 하나 이상의 선택 마커 유전자를 포함하는 다양한 기능 성분을 함유한다. 주어진 벡터가 발현 벡터인 경우, 이는 추가로 클로닝 부위에 근접하여 위치되는 인핸서 성분, 프로모터, 전사 종결 및 신호 서열중 하나 이상을 포함하고, 이들은 본 발명에 따른 리간드를 엔코딩하는 유전자에 작동적으로 연결된다.

클로닝 및 발현 벡터 둘 모두는 일반적으로 하나 이상의 선택된 숙주세포에서 벡터가 복제할 수 있는 핵산 서열을 함유한다. 통상적으로, 클로닝 벡터에서, 상기 서열은 벡터가 숙주 유전체 DNA와 독립적으로 복제가능한 서열이고, 복제 기점 또는 독립적 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322의 복제 기점이 대부분의 그람-네거티브 박테리아에 적합하고, 2 미크론의 플라스미드 기점이 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (예를들어, SV 40, 아데노바이러스)이 표유동물 세포에서의 벡터의 클로닝에 적합하다. 일반적으로, 복제 기점은 이들이 높은 수준의 DNA를 복제할 수 있는 포유동물 세포, 예를들어 COS 세포에 사용되지 않는 경우 포유동물 발현 세포에 필요하지 않다.

유리하게는, 클로닝 또는 발현 벡터는 선택 마커로도 언급되는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 이들 유전자는 선택 배양 배지에서 성장하는 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 엔코딩한다. 따라서, 선택 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주세포는 상기 배지에서 생존하지 않는다. 통상적인 선택 유전자는 항생제 및 기타 독소, 예를들어 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성 또는 상보적 영양요구 결핍에 대한 내성을 수여하거나, 성장 배지에서 이용가능하지 않은 필수 영양소를 공급하는 단백질을 엔코딩한다.

본 발명에 따른 리간드를 엔코딩하는 벡터의 복제는 대장균에서 가장 편리하게 수행되므로, 대장균 선택 마커, 예를들어 항생제인 앰피실렌에 대한 내성을 수여하는 β-락타마아제 유전자가 사용된다. 이들은 대장균 플라스미드, 예를들어 pBR322 또는 pUC 플라스미드, 예를들어 pUC18 또는 pUC19로부터 수득될 수 있다.

발현 벡터는 보통 숙주 유지체에 의해 인지되고, 관심 코딩 서열에 작동적으로 연결되는 는 프로모터를 함유한다. 이러한 프로모터는 유도되거나 구성될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결"은 기술된 성분이 이들이 이들의 의도되는 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 근접부위를 의미한다. 코딩 서열에 "작동적으로 연결된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 양립가능한 조건하에서 달성되는 방식으로 라이게이션된다.

원핵생물 숙주에 이용하기에 적합한 프로모터는, 예를들어 β-락타마아제 및 락토오스 프로모터 시스템, 알칼라인 포스파타아제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터, 예를들어 tac 프로모터를 포함한다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한 일반적으로 코딩 서열에 작동적으로 연결된 샤인-델가르노 (Shine-Delgarno) 서열을 함유할 것이다.

바람직한 벡터는 폴리펩티드 라이브러리 일원에 상응하는 누클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 발현 벡터이다. 따라서, 제 1 및/또는 제 2 항원 또는 에피토프를 이용한 선택은 폴리펩티드 라이브러리 일원을 발현하는 단일한 클론의 별도의 증식 및 발현에 의하거나, 임의의 선택 전시 시스템의 사용에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 바람직한 선택 전시 시스템은 박테리오파지 전시이다. 따라서, 파지 또는 파지미드 벡터, 옐를들어 pIT1 또는 pIT2가 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 선도 서열은 pelB, stll, ompA, phoA, bla 및 pelA를 포함한다. 한 예는 대장균 복제 기점 (이중 가닥 복제를 위한 것임) 및 파지 복제 기점 (단일 가닥의 DNA의 생성을 위한 것임)을 지니는 파지미드 벡터이다. 상기 벡터의 조작 및 발현은 당 분야에 널리 공지되어 있다 (Hoogenboom and Winter (1992) supra; Nissim et al. (1994) supra). 요컨대, 벡터는 파지미드의 선택성을 수여하기 위한 β-락타마아제 유전자 및 pelB 선도 서열 (발현된 폴리펩티드를 원형질막 주위공간으로 향하게 함), 다중 클로닝 부위 (라이브러리 일원의 누클레오티드 버젼을 클로닝시키기 위한 것임), 임의로 하나 이상의 펩티드 태그 (검출을 위한 것임), 임의로 하나 이상의 TAG 정지 코돈 및 파지 단백질 pⅢ로 구성 (N에서 C 말단)되는 발현 카세트의 lac 프로모터 업스트림을 함유한다. 따라서, 대장균의 다양한 억제인자 및 비억제인자 균주 및 글루코오스, 이소-프로필 티오-β-D-갈락토시드 (IPTG) 또는 조력 파지, 예를들어 VCS M13을 이용함으로써, 상기 벡터는 발현이 없는 플라스미드로서 복제되거나, 다량의 폴리펩티드 라이브러리 일원만을 생성하거나, 일부가 이들의 표면에서 하나 이상의 카피의 폴리펩티드-pIII 융합을 함유하는 파지를 생성시킬 수 있다.

본 발명에 따른 리간드를 엔코딩하는 벡터의 작제물은 통상적인 라이게이션 기술을 사용한다. 분리된 벡터 또는 DNA 단편이 분해되고, 손질되고, 필요한 벡터를 생성하기에 요망되는 형태로 다시 라이게이션된다. 요망되는 경우, 정확한 서열이 작제된 벡터에 존재하는지를 확인하기 위한 분석이 공지된 방식으로 수행될 수 있다. 발현 벡터를 작제하고, 시험관내 전사체를 제조하고, DNA를 숙주 세포로 도입시키고, 발현 및 기능을 측정하기 위한 분석을 수행하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 서던 또는 노던 분석, 웨스턴 블로팅, DNA, RNA 또는 단백질의 도트 블로팅, 인시츄 하이브리드화, 면역세포화학 또는 핵산 또는 단백질 분자의 서열 분석에 의해 샘플 내의 유전자 서열의 존재가 검출되거나, 이의 증폭 및/또는 발현이 정량화된다. 당업자는 요망시 이들 방법이 변형될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다.

골격

골격은 면역글로불린 분자에 기초될 수 있거나, 상기 기술된 기원의 비-면역글로불린일 수 있다. 본원에 정의된 바람직한 면역글로불린 골격은 하기로부터 선택된 것중 하나 이상을 포함한다: 최소한 (i) 항체의 CL (카파 또는 람다 서브클래스) 도메인; 또는 (ii) 항체 중쇄의 CH1 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자; 항체 중쇄의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자; 항체 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자; 또는 항체의 CL (카파 또는 람다 서브클래스) 도메인과 연결된 상기 서브셋 (ii)중 임의의 것. 힌지 영역 도메인이 또한 포함될 수 있다. 도메인의 이러한 조합물은, 예를들어 미믹 천연 항체, 예를들어 IgG 또는 IgM, 또는 이들의 단편, 예를들어 Fv, scFv, Fab 또는 F(ab')2 분자일 수 있다. 당업자는 상기 목록이 총망라된 것이 아님을 인식할 것이다.

단백질 스캐폴드

각각의 에피토프 결합 도메인은 단백질 스캐폴드 및 하나 이상의 에피토프를 지닌 도메인의 특정 상호작용에 수반되는 하나 이상의 CDR을 포함한다. 유리하게는, 본 발명에 따른 에피토프 결합 도메인은 세개의 CDR을 포함한다. 적절한 단백질 스캐폴드는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 것을 포함한다: 면역글로불린 도메인에 기초한 것, 피브로넥틴에 기초한 것, 어피바디에 기초한 것, CTLA4에 기초한 것, 샤페론, 예를들어 GroEL에 기초한 것, 리포칼린에 기초한 것, 및 박테리아 수용체 SpA 및 SpD에 기초한 것. 당업자는 상기 목록이 총망라된 것이 아님을 인식할 것이다.

리간드 작제에 사용하기 위한 스캐폴드

주쇄 형태의 선택

면역글로불린 상과의 일원은 모두 이들의 폴리펩티드 사슬에 대한 유사한 폴드를 공유한다. 예를들어, 항체가 이들의 주요 서열과 관련하여 매우 다양하지만, 서열 및 결정학적 구조의 비교는 예상과는 반대로 제한된 수의 주쇄 형태, 또는 정준 구조를 채택한 항체의 6개의 항원 결합 루프중 5개 (H1, H2, L1, L2, L3)를 나타낸다 (Chothia and Lesk (1987) J. MoI. 3iol, 196: 901; Chothia et al (1989) Nature, 342: 877). 따라서, 루프 길이 및 중요 잔기의 분석은 인간 항체의 대부분에서 발견되는 H1, H2, L1, L2 및 L3의 주쇄 형태의 예상을 가능케 한다 (Chothia et al. (1992) J MoI. Biol, 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBOJ., 14: 4628; Williams et al. (1996) J. MoI. Biol, 264: 220). H3 영역이 서열, 길이 및 구조와 관련하여 보다 다양하지만 (D 분절의 사용에 기인함), 이는 또한 루프 및 항체 프레임워크 내의 중요 위치에서 특정 잔기 또는 잔기의 유형의 길이 및 존재에 따른 짧은 루프 길이에 대해 제한된 수의 주쇄 형태를 형성한다 (Martin et al (1996) J. Mol Biol, 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1).

리간드 및/또는 도메인의 라이브러리는 특정 루프 길이 및 중요 잔기가 일원의 주쇄 형태가 공지되는 것이 보장되게 선택되도록 고안된다. 유리하게는, 이들은 상기 논의된 바와 같이 비기능적인 우연을 최소화하기 위한 천연에서 발견되는 면역글로불린 상과 분자의 실제 형태이다. 점라인 V 유전자 분절은 항체 또는 T 세포 수용체 라이브러리에 적절한 기본 프레임워크로 작용하며; 기타 서열이 또한 사용될 수 있다. 기능에 영향을 미치지 않는 적은 수의 기능적 일원이 변경된 주쇄 형태를 지닐 수 있도록 매우 낮은 빈도로 변이가 발생할 수 있다.

리간드에 의해 엔코딩된 상이한 주쇄 형태의 수를 측정하고, 리간드 서열에 기초한 주쇄 형태를 예측하고, 정준 구조에 영향을 미치지 않는 다양성을 위한 잔기를 선택하기 위해 정준 구조 이론이 또한 사용된다. 인간 V_κ 도메인에서, L1 루크가 4개의 정준 구조중 하나를 채택할 수 있고, L2 루프가 단일 정준 구조를 지닐 수 있고, 인간 V_κ 도메인의 90%가 L3 루프에 대해 4개 또는 5개의 정준 구조중 하나를 채택한다는 것이 공지되어 있으므로 (Tomlinson et al. (1995) supra); V_κ 도메인 단독에서, 상이한 정준 구조가 매우 다양한 주쇄 형태를 생성시키기 위해 조합될 수 있다. Vλ 도메인이 L1, L2 및 L3 루프에 대해 다양한 범위의 정준 구조를 엔코딩하고, V_κ 및 Vλ 도메인이 H1 및 H2 루프에 대해 여러 정준 구조를 엔코딩할 수 있는 임의의 V_H 도메인과 함께 쌍을 이룰 수 있고, 이들 5개의 루프에 대해 관찰된 정준 구조 조합의 수가 매우 크다는 것이 제공되어 있다. 이는 주쇄 형태에서의 다양성의 생성이 광범위한 결합 특이성의 생성에 필수적일 수 있음을 의미한다. 그러나, 단일한 공지된 주쇄 형태에 기초하여 항체 라이브러리를 작제하는 경우, 예상과는 반대로 주쇄 형태의 다양성이 모든 항원을 실질적으로 표적으로 하는 충분한 다양성을 생성시키는데 필요하지 않음이 발견되었다. 더욱 놀랍게는, 단일 주쇄 형태는 공통 구조를 필요로 하지 않으며, 단일한 천연 발생 형태가 전체 라이브러리에 대한 기초로 사용될 수 있다. 따라서, 한 바람직한 양태에서, 본 발명의 이중특이적 리간드는 단일한 공지된 주쇄 형태를 지닌다.

선택되는 단일한 주쇄 형태는 바람직하게는 당해 면역글로불린 상과 유형의 분자중 평범한 것이다. 형태는 현저한 수의 천연 발생 분자가 이를 채택하는 것으로 관찰되는 경우에 평범한 것이다. 따라서, 본 발명의 한 바람직한 양태에서, 면역글로불린 도메인의 각각의 결합 루프에 대한 다양한 주쇄 형태의 천연 발생은 별개인 것을 간주되고, 천연 발생 가변 도메인은 상이한 루프에 대한 주쇄 형태의 요망되는 조합을 지니도록 선택된다. 어떠한 것도 가능하지 않은 경우, 가장 근접한 동등물이 선택될 수 있다. 상이한 루프에 대한 주쇄 형태의 요망되는 조합은 요망되는 주쇄 형태를 엔코딩하는 점라인 유전자 분절을 선택함으로써 생성되는 것이 바람직하다. 선택된 점라인 유전자 분절이 종종 천연으로 발현되는 것이 더욱 바람직하고, 매우 빈번히 모든 천연 점라인 유전자 분절이 발현되는 것이 가장 바람직하다.

리간드 (예를들어, dAb) 또는 이의 라이브러리의 고안에서, 6개의 항원 결합 루프의 각각에 대한 상이한 주쇄 형태의 발생은 별개적인 것으로 간주될 수 있다. H1, H2, L1, L2 및 L3에 대해, 천연 발생 분자의 항원 결합 루프중 20% 내지 100%에 의해 채택되는 소정의 형태가 선택된다. 통상적으로, 이의 관찰된 발생률은 35% 초과 (즉, 35% 내지 100%)이고, 이상적으로는 50% 초과 또는 65% 초과이다. 방대한 대부분의 H3 루프는 정준 구조를 지니지 않으므로, 정준 구조를 나타내지 않는 루프들중에서 평범한 것의 주쇄 형태를 선택하는 것이 바람직하다. 따라서, 각각의 루프에 대해, 천연 레퍼토리에서 가장 빈번히 관찰되는 형태가 선택된다. 인간 항체에서, 각각의 루프에 대해 가장 인기있는 정준 구조 (CS)는 하기와 같다: H1-CS1 (발현된 레퍼토리의 79%), H2-CS3 (46%), V_K의 L1-CS 2 (39%), L2-CS1 (100%), V_κ의 L3-CS1 (36%) (계산은 70:30의 κ:λ 비로 추정, Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 48: 133). 정준 구조를 지니는 H3 루프에 대해, 잔기 94에서 잔기 101의 염교(salt bridge)를 지니는 7개의 잔기의 CDR3 길이 (Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services)가 가장 통상적인 듯 하다. 상기 배열을 형성하기 위해 필요한 H3 길이 및 중요 잔기를 지니는 EMBL 데이터 라이브러리 내에 16개 이상의 인간 항체 서열 및 항체 모델링에 대한 기초로 사용될 수 있는 단백질 데이터 뱅크에서의 두개 이상의 결정학적 구조(2cgr 및 ltet)가 존재한다. 상기 형태의 정준 구조에서 가장 빈번하게 발현되는 점라인 유전자 분절은 V_H 분절 3-23 (DP-47), J_H 분절 J_H4b, V_κ 분절 02/012 (DPK9) 및 J_κ 분절 J_κ1이다. V_H 분절 DP45 및 DP38이 또한 적합하다. 따라서, 이들 분절은 작제물에 기초하여 요망되는 단일 주쇄 형태를 지닌 라이브러리와 조합하여 사용될 수 있다.

대안적으로, 분리시 결합 루프의 각각에 대해 상이한 주쇄 형태의 천연 발생에 기초한 단일 주쇄 형태를 선택하는 것 대신에, 주쇄 형태의 조합물의 천연 발생이 단일 주쇄 형태를 선택하기 위한 기초로 사용될 수 있다. 항체의 경우, 예를들어, 임의의 2개, 3개, 4개, 5개 또는 모든 6개의 항원 결합 루프에 대한 정준 구조 조합물의 천연 발생이 결정될 수 있다. 여기서, 선택된 형태는 천연 발생 항체에서 평범한 것이 바람직하고, 천연 레퍼토르에서 가장 빈번하게 관찰되는 것이 가장 바람직하다. 따라서, 인간 항체에서, 예를들어, 5개 항원 결합 루프인 H1, H2, L1, L2 및 L3의 천연 조합이 고려되는 경우, 정준 구조의 가장 빈번한 조합이 결정되고, 단일 주쇄 형태를 선택하기 위한 기초로서 H3 루프에 대한 가장 인기있는 형태와 조합된다.

정준 서열의 다양성

선택된 여러 공지된 주쇄 형태 또는 바람직하게는 바람직하게는 단일의 공지된 주쇄 형태를 지니는, 본 발명에 사용하기 위한 리간드 (예를들어, dAb)는 구조 및/또는 기능적 다양성일 지니는 레퍼토리를 생성시키기 위해 분자의 결합 부위를 다양화시킴으로써 작제될 수 있다. 이는 변이체가 광범위한 활성을 제공할 수 있도록 이들의 구조 및/또는 기능에서 충분한 다양성을 지니도록 생성된다는 것을 의미한다.

요망되는 다양성은 통상적으로 하나 이상의 위치에서 선택된 분자를 다양화시킴으로써 생성된다. 변형되는 위치는 무작위적으로 선택될 수 있고, 바람직하게는 선택된다. 이후, 변이는 존재하는 아미노산이 천연 또는 합성의 임의의 아미노산 또는 이의 유사체에 의해 대체되는 동안 무작위화에 의해 매우 다양한 수의 변이체를 생성시키거나, 존재하는 아미노산을 하나 이상의 정의된 서브셋의 아미노산으로 대체하여 보다 제한된 수의 변이체를 생성시킴으로써 달성될 수 있다.

상기 다양성을 도입시키기 위해 다양한 방법이 보고되어 있다. 오류 빈발(Error-prone) PCR (Hawkins et al. (1992) J. MoI. Biol, 226: 889), 화학적 돌연벼이 유발 (Deng et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 9533) 또는 박테리아 돌연변이 균주 (Low et al (1996) J. MoI. Biol, 260: 359)가 상기 분자를 엔코딩하는 유전자로 무작위적 돌연변이를 도입시키기 위해 사용될 수 있다. 선택된 위치를 돌연변이화시키기 위한 방법은 또한 당 분야에 널리 공지되어 있고, PCR을 사용하거나 사용하지 않고 미스매칭된 올리고누클레오티드 또는 축퇴된 올리고누클레오티드를 사용하는 것을 포함한다. 예를들어, 여러 합성 항체 라이브러리가 항원 결합 루프에 대해 돌연변이를 표적화시킴으로써 생성되었다. 인간 톡소이드 결합 Fab의 H3 영역이 다양한 신규한 결합 특이성을 생성시키기 위해 무작위화되었다 (Barbas et al (1992) Proc. Natl. Acad. ScL USA, 89: 4457). 무작위 또는 반-무작위 H3 및 L3 영역이 돌연변이화되지 않은 프레임워크 영역을 지니는 다수의 라이브러리를 생성시키기 위해 점라인 V 유전자 분절에 첨부되었다 (Hoogenboom & Winter (1992) J. MoI Biol, 227: 381; Barbas et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissim et al (1994) EMBO J, 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBOJ., 13: 3245; De Kruif et al (1995) J MoI Biol, 248: 97). 이러한 다양성이 기타 항원 결합 루프중 일부 또는 전부를 포함하도록 확장되었다 (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, WO97/08320, supra).

루프 무작위화는 H3 단독에 대해 잠재적으로 약 10¹⁵개 이상의 구조 및 기타 5개 루프에 대해 유사하게 많은 변이를 생성시킬 수 있으므로, 이는 현재의 형질전환 기술을 이용하거나 모든 가능한 조합을 나타내는 라이브러리를 생성시키는 세포 결핍 시스템을 이용하여 실행 불가능하다. 예를들어, 지금까지 작제된 가장 큰 라이브러리중 하나로, 상기 고안의 라이브러리에 대한 잠재적 다양성중 단지 소량인 6 x 10¹⁰개의 상이한 항체가 생성되었다 (Griffiths et al. (1994) supra).

바람직하게는, 분자의 요망되는 기능을 생성시키거나 변형시키는데 직접적으로 관련된 잔기들만이 다양화된다. 많은 분자에 대해, 상기 기능은 표적으로의 결합이 될 것이며, 따라서 다양성은 표적 결합 부위에 집중되어야 하는 반면, 분자의 전체 패킹에 중요한 분자를 변화시키거나 선택된 주쇄 형태를 유지시키는 것은 피해야 한다.

항체 도메인에 적용됨에 따른 정준 서열의 다양화

항체 기재 리간드 (예를들어, dAb)의 경우, 표적에 대한 결합 부위는 가장 빈번하게는 항원 결합 부위이다. 따라서, 바람직하게는 항원 결합 부위 내의 잔기만이 변형된다. 이들 잔기는 인간 항체 레퍼토리에서 극도록 다양하고, 고-분해 항체/항원 복합체 내에서 접촉을 이루는 것으로 공지되어 있다. 예를들어, L2는 천연 발생 항체에서 위치 50 및 53이 다양한 것으로 공지되어 있고, 항원과 접촉을 이루는 것으로 관찰된다. 대조적으로, 통상적인 방법은 문헌[Kabat et al. (1991, supra)]에 정의된 바와 같이 상응하는 상보성 결정 영역 (CDR1) 내의 모든 잔기를 다양화시켰고, 약 7개의 잔기를 본 발명에 따라 사용하기 위한 라이브러리에서 다양화된 2개와 비교하였다. 이는 다양한 항원 결합 특이성을 생성시키기 위해 필요한 기능적 다양성에 대한 현저한 개선을 나타낸다.

사실상, 항체 다양성은 나이브(naive) 1차 레퍼토리를 생성하기 위한 점라인 V, D 및 J 유전자의 체세포성 재조합 (점라인 및 접합부 다양성으로도 언급됨) 및 생성된 재배열된 V 유전자의 체세포성 과변이의 두개의 과정의 결과이다. 인간 항체 서열의 분석은 1차 레퍼토리에서의 다양성이 항원 결합 부위의 중심에 초점이 되는 반면, 체세포성 과변이는 1차 레퍼토리에서 고도로 보존된 항원 결합 부위의 주위의 영역에 대해 다양하게 분포된 것으로 나타난다 (참조: Tomlinson et al. (1996) J. MoI. Biol, 256: 813). 이러한 상보성은 비록 항체에서만 명백하게 독특히지만 서열 공간을 검색하기 위한 효과적인 방법으로 발달될 수 있고, 이는 기타 폴리펩티드 레퍼토리에도 용이하게 적용될 수 있다. 다양화된 잔기들은 표적에 대한 결합 부위를 형성하는 것의 서브셋이다. 표적 결합 부위 내의 다양한 (오버래핑되는 것을 포함함) 잔기의 서브셋은 요망시 선택 동안 여러 단계에서 다양화된다.

항체 레퍼토리의 경우, 최초 '나이브' 레퍼토리는 항원 결합 부위 내의 전체가 아닌 몇몇 잔기가 다양화되는 경우 생성될 수 있다. 본원에서 사용되는 맥락과 같이, 용어 "나이브"는 미리 결정된 표적을 지니지 않는 항체 분자를 의미한다. 이러한 분자는 면역계가 아직 광범위한 항원 자극에 의해 공격되지 않은 태아 및 신생아 개체의 경우와 같이 면역 다양성을 경험하지 않은 개체의 면역글로불린 유전자에 의해 엔코딩된 것과 유사하다. 이후, 이러한 레퍼토리는 광범위한 항원 또는 에피토프에 대해 선택된다. 요망되는 경우, 추가의 다양성이 최초 레퍼토리에서 다양화된 영역 외부에 도입될 수 있다. 이러한 성숙한 레퍼토리는 변형된 기능, 특이성 또는친화성에 대해 선택될 수 있다.

항원 결합 부위 내의 몇몇 또는 모든 잔기가 변형된 리간드의 작제물을 위한 결합 도메인의 나이브 레퍼토리가 당 분야에 공지되어 있다 (참조, WO 2004/058821, WO 2004/03019, 및 WO 03/002609). "1차" 라이브러리는 점라인 V 유전자 분절 내에서 다양하거나 (점라인 다양성) 재조합 과정 동안 다양화 (접합 다양성)된 항원 결합 부위의 중심의 잔기에 제한된 다양성을 지니는 천연 1차 레퍼토리를 모방한다. 다양화된 잔기들은 H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 및 L96을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "체세포성" 라이브러리에서, 다양성은 재조합 과정 동안 다양화(접합 다양성)되거나 매우 체세포적으로 돌연변이화된 잔기에 제한된다. 다양화된 잔기는 H31, H33, H35, H95, H96, H97, H98, L30, L31, L32, L34 및 L96을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 라이브러리에서의 다양화에 적합한 상기 기술된 모든 잔기는 하나 이상의 항체-항원 복합체에서 접촉을 이루는 것으로 공지되어 있다. 둘 모두의 라이브러리에서, 항원 결합 부위 내의 모든 잔기가 변화되는 것은 아니므로, 요망되는 경우 잔여 잔기를 변화시킴으로서 선택 동안 추가의 다양성이 통합된다. 임의의 상기 잔기 (또는 항원 결합 부위를 포함하는 추가 잔기)의 임의의 서브셋이 항원 결합 부위의 최초 및/또는 이후의 다양화에 사용될 수 있음이 당업자에게 명백해야 한다.

본 발명에 사용하기 위한 라이브러리의 작제에서, 선택된 위치의 다양화는 통상적으로 다수의 가능한 아미노산 (모든 20 또는 이의 서브셋)이 상기 위치에 포함될 수 있도록 폴리펩티드의 서열을 특성화하는 코딩 서열을 변환시킴으로써 핵산 수준에서 달성된다. IUPAC 명명법을 이용하여, 가장 다능한 코돈은 모든 아미노산 뿐만 아니라 TAG 정지 코돈을 엔코딩하는 NNK이다. NNK 코돈은 바람직하게는 필요한 다양성을 도입시키기 위해 사용된다. 추가의 정지 코돈 TGA 및 TAA의 생성을 야기시키는 NNN 코돈을 포함하는 동일한 목적을 달성하는 기타 코돈이 또한 사용된다.

인간 항체의 항원 결합 부위에서의 측쇄 다양성의 특징은 특정 아미노산 잔기를 선호하는 현저한 경향이다. 각각의 V_H, V_K 및 Vχ 영역에서의 10개의 가장 다양한 위치의 아미노산 조성이 합계되는 경우, 측쇄 다양성의 76% 이상이 세린 (24%), 티로신 (14%), 아스파라긴 (11%), 글리신 (9%), 알라닌 (7%), 아스파테이트 (6%) 및 트레오닌 (6%)의 7개의 상이한 잔기만으로부터 발생한다. 이러한 주쇄 가요성을 제공할 수 있는 친수성 잔기 및 작은 잔기로의 경향은 광범위한 항원 또는 에피토프에 결합하는 경향이 있는 표면의 진화를 반영하는 듯 하며, 1차 레퍼토리 내의 항체에서 요구되는 복잡성을 설명하는데 도움이 될 수 있다.

아미노산의 상기 분포를 모방하는 것이 바람직하므로, 다양화되는 위치에서의 아미노산의 분포는 바람직하게는 항체의 항원 결합 부위에서 관찰되는 것을 모방한다. 다양한 표적 항원에 대한 특정 폴리펩티드 (반드시 항체 폴리펩티드는 아님)의 선택을 허용하는 아미노산의 분포에서의 상기 경향은 임의의 폴리펩티드 레퍼토리에 대해 용이하게 적용된다. 다양화되는 위치에서의 아미노산 분포를 경향화시키는 다양한 방법 (트리-누클레오티드 돌연변이 유발의 사용을 포함함, 참조 WO97/08320)이 존재하고, 이중 바람직한 방법은 합성의 용이함으로 인해 통상적인 축퇴성 코돈의 사용이다. 천연 아미노산 용도를 이용한 축퇴성 코돈 (각각의 위치에서 동일한 비의 단일, 이중, 삼중 및 사중 축퇴를 지님)의 모든 조합에 의해 엔코딩된 아미노산 프로파일을 비교함으로써, 대부분의 표시 코돈을 계산하는 것이 가능하다. IUPAC 명명법을 이용한 코돈 (AGT)(AGC)T, (AGT)(AGC)C 및 (AGT)(AGC)(CT) - 즉, DVT, DVC 및 DVY 각각이 요망되는 아미노산 프로파일에 가장 근접한 것들이다: 이들은 22% 세린 및 11% 티로신, 아라파라긴, 글리신, 알라닌, 아스파테이트, 트레오닌 및 시스테인을 엔코딩한다. 따라서, 바람직하게는 라이브러리는 각각의 다양화된 위치에서 DVT, DVC 또는 DVY 코돈을 이용하여 작제된다.

L929 세포독성 분석

TNFR1의 길항제 (예를들어, 리간드, dAb 단량체)는 마우스 L929 섬유모세포에서 TNF에 의해 유도된 세포독성을 억제하는 능력에 의해 확인될 수 있다 (Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15, 243-248). 간단히, 미세역가 플레이트에 플레이팅된 L929 세포를 TNFR1의 길항제, 100pg/ml의 TNF 및 1mg/ml의 액티노마이신 D (Sigma, Poole, UK)과 함께 밤새 인큐베이션시켰다. 이후, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸리움 (Promega, Madison, USA)과의 인큐베이션 후, 세포 생존률을 490nm에서 흡광도를 판독하여 측정하였다. TNFR1의 길항제는 세포독성을 억제할 것이고, 따라서 TNF 단독 대조군에 비해 흡광도를 증가시킬 것이다.

HeLa IL-8 분석

TNFR1의 길항제는 인간 HeLa 세포에 의한 IL-8의 TNF에 의해 유도된 분비를 억제하는 능력에 의해 확인될 수 있다 (HUVEC에서 IL-1에 의한 IL-8의 유도를 기술하는 문헌[Akeson, L. et al (1996) Journal of Biological Chemistry 271, 30517-30523]의 방법으로부터 적합화된 방법; 본 발명자들은 인간 TNF 알파에 의한 유도를 주목하였고, HUVEC 세포주 대신 HeLa 세포를 사용하였다). 간단히, 미세역가 플레이트에 플레이팅될 수 있는 HeLa 세포를 TNFR1의 길항제 및 300pg/ml의 TNF와 함께 밤새 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 상층액을 세포로부터 흡출시켜 제거하고, 샌드위치 ELISA (R&D Systems) 또는 기타 적절한 방법을 이용하여 IL-8 농도를 측정하였다. TNFR1의 길항제는 IL-8 분비를 억제하고, 상층액에서 TNF 단독 대조군에 비해 보다 적은 IL-8가 검출된다.

실시예

실시예 1. 종양 괴사 인자 (TNF)의 혈청 반감기의 연장.

인간 TNF (Tg 197)에 대한 마우스 트랜스제닉에 40k의 분지된 PEG (PEG TAR1-5-19로 언급)를 지닌 이합체 또는 항혈청 알부민 dAb (TAR1-5-19/MSA 삼합체로 언급)를 지니는 방식으로 재포맷화된 항-TNF dAb의 복막내 투여로 10 마리의 동물의 그룹에 투여하였다. 염수 투여를 대조군으로 사용하였다. 약물 투여 7주 후, 동물의 혈청을 항-TNF 샌드위치 ELISA 키트를 이용하여 순환 TNF 수준에 대해 분석하였다. 염수 투여된 동물은 25.6pg/ml의 순환 TNF 수준을 지닌 반면, TAR1-5-19/MSA 삼합체를 투여받은 동물은 28.8pg/ml로 상승된 TNF 수준을 지니고, PEG TAR1-5-19는 2315pg/ml로 상승된 수준을 지녔다. 이는 연장된 혈청 반감기를 지니는 dAb가 사이토카인과 같은 짧은 혈청 반감기를 지니는 분자의 순환 수준을 증가시킬 수 있고, 이에 따라 혈청 수준을 증가시킬 수 있음을 명백히 입증한다.

실시예 2. 가용성 종양 괴사 인자 수용체 1 (sTNFR1)의 혈청 반감기의 연장.

CD1 마우스에 40k의 분지된 PEG (PEG 항-TNFR1 dAb로 언급) 또는 항혈청 알부민 dAb(항-TNFR1 /항-SA 이합체로 언급)를 지니는 방식으로 재포맷화된 항-마우스 TNFR1 dAb를 단일 정맥내 1mg/kg 용량으로 투여하였다. 하기 상세하기 기술되는 항-TNFR1 샌드위치 ELISA를 이용하여 가용성 TNFR1의 수준에 대해 여러 시점에서 혈청을 시험하였다.

TNFR1의 측정

F96 맥시소프(Maxisorp) 96 웰 편평 바닥 이뮤노플레이트(flat bottom immunoplates) (Nunc, Cat No: 439454)를 sTNF R1/TNFRSF1A 항체 (1ug/ml의 PBS 중의 웰당 50ul)를 코팅시켰다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 200ul의 PBS로 3회 세척하였다. 실온에서 1시간 동안 3% BSA/PBS로 비특이적 결합을 차단시켰다. 플레이트를 200ul의 PBS/0.05% Tween-20으로 3회 세척하였다.

PBS/1% BSA중에서 재조합 마우스 sTNF R1 (R & D Systems, cat# 4254-R1)의 희석액을 5000ng ml^-1, 500ng ml^-1, 50ng ml^-1 및 5ng ml^-1로 제조하고, 웰에 50ul를 첨가하였다. 대안적으로, TAR2m-21-23/40K 분지된 PEG로 면역화된 마우스로부터의 혈청을 PBS/1%BSA 중에서 1/5, 1/50, 1/500 및 1/5000 희석으로 제조하고, 웰에 50ul를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 200ul의 PBS/0.05% Tween-20으로 3회 세척하였다.

비오티닐화된 항-마우스 sTNF R1 항체 (R & D Systems, cat # AHFO1)를 1ug/ml로 제조하고, 웰에 50ul를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 비오티닐화된 항-마우스 sTNF R1 항체 (R & D Systems, cat # AHFO1)를 1ug/ml로 제조하고, 웰에 50ul를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 200ul의 PBS/0.05% Tween-20으로 3회 세척하였다.

퍼옥시다아제 컨쥬게이션된 IgG 분획 모노클로날 마우스 항-비오틴 (Stratech, Cat No: 200-032-096)을 160ng ml^-1로 제조하고, 웰에 50ul를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 200ul의 PBS/0.05% Tween-20으로 3회 세척하고, PBS로 3회 세척하였다.

SureBlue TMB 1-성분 마이크로웰 퍼옥시다아제 기질 (KPL, Cat No: 52-00-00)을 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트를 15분 동안 실온에서 인큐베이션시키고, 1M HCl로 반응을 중지시켰다. 흡광도를 45OnM에서 판독하였다.

모든 샘플을 이중으로 분석하였다. 샘플이 없는 웰을 포함시켰다.

PEG 항-TNFR1 dAb으로 투여된 마우스로부터의 혈청의 1/5 희석액에 대한 OD 결과를 시간에 대해 작도하였다 (도 1). 결과는 dAb의 제거에 따른 기저 수준으로의 감소 전에 혈청에서의 TNFR1의 수준의 증가를 명백히 나타낸다.

실시예 3. 수용체 분자에 결합하지만 활성 부위에 결합하지 않는 dAb.

본 실시예는 요망되는 수용체 분자에 결합하지만 상기 수용체의 활성 부위에 결합하지 않는 dAb를 확인하는 방법을 예시한다. 상기 방법은 종양 괴사 인자 1 수용체 (TNFR1)을 이용하여 예시되고, 일반적으로 수용체 분자에 적용가능하다.

키메라 수용체 분자는 여러 뮤린 TNFR1 도메인 및 인간 TNFR1 도메인으로 구성되고 (Banner DW, et al. Cell, 75(3):431-45 (1993)), TNFR1의 네개의 소정의 세포외 도메인을 함유하지만, 마우스 TNFR1 및 인간 TNFR1 단백질 사이에서 기원적으로 다양한 분자가 생성된다. 생성된 키메라 수용체는 다양한 도메인 역할 및 기능에 따라 인간 TNFR1 및 마우스 TNFR1 둘 모두의 특성을 공유한다. 이러한 분자는 인간 또는 마우스 TNFR1에 결합하는 dAb, 항체 및 이의 항원 결합 단편 및 기타 분자 (예를들어, 단백질 도메인, 예를들어 어피바디, LDL 수용체 도메인 도는 EGF 도메인)의 도메인 특이성을 측정하기 위한 수단을 제공한다.

방법

인간 및 마우스 TNFR1 서열을 EcoRⅠ 및 NotⅠ 제한 엔도누클레아제 부위를 통해 피키아 (Pichia) 발현 벡터 pPicZalpha Invitrogen)로 미리 클로닝시켰다. 주형 마우스 TNFR1 DNA (및 이에따른 뮤린 도메인 4를 엔코딩하는 키메라 수용체 작제물)은 3' 6x 히스티딘 태그를 함유하였다. 인간 TNFR1 (및 이에따른 인간 도메인 4를 엔코딩하는 키메라 수용체 작제물)은 3 말단의 서열 내에 Myc 및 6x 히스티딘 태그 둘 모두를 함유하였다.

RubyTaq DNA 중합효소 (USB Corporation, Cleveland, Ohio), 100 ng의 주형 DNA (전장의 mTNFR1 또는 hTNFR1 DNA의 관련 DNA 미니프렙 주형을 포함함)를 이용하여 표준 PCR 조건에 따라 최초 PCR을 수행하였다.

통상적인 PCR 반응을 하기와 같이 설정하였다: 중합효소를 함유하는 25μl의 1OX RubyTaq PCR 완충용액; 2μl의 제 1 프라이머 (10μM 스톡으로부터); 2μl의 제 2 프라이머 (10μM 스톡으로부터); 1μl (100 ng) 전장의 TNFR1 주형 DNA; 20μl의 dH₂O (50μl의 최종 부피로). 반응물을 얇은 벽의 튜브에 두고, 하기의 파라미터에 따라 반응이 수행되는 열순환기에 두었다.

최초 변성	3분	94℃

변성 어닐링 (25 주기) 신장	30초	94℃
	30초	55℃
	1분	72℃

최종 신장	10분	72℃

키메라 작제물의 생성에 사용되는 최초 PCR 반응의 개요

작제물*	PCR 수 - 사용된 프라이머	주형
MHHH	PCR 1- 1 및 12	마우스
MHHH	PCR 2 - 2 및 3	인간
HMHH	PCR 1 - 1 및 9	인간
	PCR 2 - 6 및 13	마우스
	PCR 3 - 2 및 4	인간
HHMH	PCR 1 - 1 및 10	인간
	PCR 2 - 7 및 14	마우스
	PCR 3 - 2 및 5	인간
HHHM	PCR 1 - 1 및 11	인간
HHHM	PCR 2 - 2 및 8	마우스
HMMM	PCR 1 -1 및 9	인간
HMMM	PCR 2 - 2 및 6	마우스

* 기호: H = 인간 도메인; M = 마우스 도메인; 예를들어, MHHH = 마우스 도메인 1, 인간 도메인 2-4.

이러한 최초 PCR에서 생성된 PCR 생성물을 1% 아가로오스 젤로부터 절단하여, 젤 정제 키트 (Qiagen)를 이용하여 정제하고, 50μl의 dH₂0로 용리시켰다.

키메라 TNFR1 작제물 생성에 사용된 프라이머

SOE PCR

어셈블리 PCR ('풀-스루(pull-through)' 또는 중첩 신장에 의한 스플라이싱 (SOE)로도 공지되어 있음, 참조: Gene, 15:77(1):61-8 (1989))은 제 1 PCR 생성물의 상보성 말단을 사용하여, 분해 또는 라이게이션 없이 제 1 PCR 생성물이 함께 생성되는 것을 가능케 한다. 이러한 과정 동안, 제 1 생성물이 함께 생성되고, 이들의 상보성 말단이 Taq DNA 중합효소 및 dNTP의 존재하에서 함께 어닐링되기 전에 변성된다. 여러 주기의 재어닐링 및 신장은 상보성 가닥의 필-인(fill-in) 및 전장 주형의 생성을 야기시킨다. 전장의 작제물 카세트를 플랭킹시키는 프라이머를 첨가하고, 통상적인 PCR을 수행하여 어셈블리된 생성물을 증폭시켰다. 상기 기술된 최초 PCR 생성물로부터 유래된 다양한 TNFR1 도메인을 함께 어닐링시키고 증폭시키기 위해 SOE PCR을 수행하였다. 어셈블리 SOE PCR을 하기와 같이 설정하였다: MgCl₂를 함유하는 40μl의 10 x PCR 완충용액; ~2μl (100 ng)의 최초 PCR 1의 정제된 생성물; ~2μl (1OO ng)의 최초 PCR 2의 정제된 생성물; 36μl의 dH₂O (80μl의 최종 부피). SOE 프라이머 혼합물을 어셈블리 단계 후 하기와 같이 첨가하였다: 2 μl의 5' 플랭킹 프라이머 (프라이머 1); 2μl의 3' 플랭킹 프라이머 (프라이머 2); 10μl의 1Ox PCR 완충용액; 6μl의 dH₂O (20μl의 최종 부피).

하기 기술된 프로그램을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 최초 어셈블리 주기는 열순환기가 94℃에서 정지되도록 설정된 후 약 45분의 시간을 필요로 한다. 20μl의 프라이머 혼합물을 각각의 반응물에 첨가하고, 혼합하였다.

어셈블리 조건

최초 변성	5분	94℃
변성 어닐링 (15 주기) 신장	1분	94℃
	1분	55℃
	1분	72℃

증폭 조건 (94℃에서 정지, 프라이머 혼합물 첨가)

변성 어닐링 (25 주기) 신장	1분	94℃
	1분	55℃
	1분	72℃

PCR 생성물을 각각의 반응물의 3-5μl를 1% 아가로오스 젤에 영동시켜 확인하였다.

피키아 발현 벡터로의 어셈블리된 TNFR1의 클로닝

pPicZalpha 벡터 (Invitrogen)를 EcoRI 및 NotI 효소로 순차적으로 분해하고, 크로마스핀 (Chromaspin) TE-1000 젤 여과 컬럼 (Clontech, Mountain View, CA)으로 정제시켰다.

대장균으로의 TNFR1 키메라 작제물의 형질전환

라이게이션된 키메라 작제물을 HB2151 전기적격 대장균 세포로 형질전환시키고, 저염 LB 배지에서 1시간 동안 회수하고, 37℃에서 24시간 동안 0.25μg/ml의 ZEOCIN, 플레오마이신 D (Cayla, Toulouse, France)를 함유하는 항생물질 포뮬레이션을 지니는 저염 LB 아가 상에 플레이팅시켰다. 이후, 개별적 콜로니를 발현 벡터 내의 키메라 작제물의 정확한 서열을 확인하고, 각각의 키메라 작제물 벡터의 대규모 맥시프렙 (Maxiprep) 플라스미드 제조물을 제조하였다.

제조된 키메라 작제물의 누클레오티드 서열을 하기에 나타내었다. 키메라 작제물을 이들의 도메인의 기원에 따라 작명하였다 (좌측의 도메인 1로부터 우측의 도메인 4으로). 예를들어, HMMM은 인간 도메인 1 및 마우스 도메인 2-4를 함유한다. 마우스 도메인 4를 함유하는 키메라 단백질은 His 태그만을 지니며, 막횡단 영역과 도메인 4 사이의 스페이서 (spacer) 영역이 결핍되어 있다.

TNFR1 키메라 작제물의 제조 및 피키아 파스토리스로의 형질전환.

각각의 맥시프렘에 의해 생성된 플라스미드 DNA를 희귀한 절단 제한 엔도누클레아제 PmeⅠ으로 분해시켜, 피키아 형질전환 전에 선형화시켰다. 선형화된 DNA를 이후 페놀/클로로포름 추출에 의해 정제시키고, 에탄올 침전시키고, 30μl의 dH₂O에 재현탁시켰다. 10μl의 선형화된 DNA 용액을 80μl의 전기적격 KM71H 피키아 세포와 5분 동안 혼합시키고, 1.5kV, 200Ω, 25μF에서 전기 천공시켰다. 세포를 YPDS를 이용하여 즉시 회수하고, 30℃에서 2시간 동안 인큐베이션시키고, 2일 동안 1OOμg/ml의 ZEOCIN, 플레오마이신 D (Cayla, Toulouse, France)를 함유하는 YPDS 아가 플레이트에 플레이팅시켰다.

피키아에서의 작제물의 발현

각각의 작제물에 대한 개별적 형질전환체 콜로니를 시작 배양으로 5ml의 BMGY로 채집하여 넣고, 30℃에서 24시간 동안 성장시켰다. 이러한 배양물을 500 ml의 BMGY 배지에 접종시키고, 이를 30℃에서 24시간 동안 성장시키고, 실온에서 5분 동안 1500-3000g에서의 원심분리로 세포를 수거하였다. 이후, 세포를 100ml의 BMMY에 재현탁시키고, 메탄올 농도차를 증가시켜 4일 동안 성장시켰다 (1일에 0.5%, 2일에 1%, 3일에 1.5% 및 4일에 2%). 발현후, 15분 동안 330Og에서 배양물을 원심분리하여 상층액을 수거하였다.

니켈 수지를 이용한 TNFR1 키메라 작제물의 정제

배양 상층액을 처음 10 mM의 최종 농도의 이미다졸 및 2x PBS를 첨가하여 완충처리하였다. His-태깅된 단백질을 니켈-NTA 수지를 첨가하여 실온에서 4시간 (진탕) 동안 배치 흡수시켰다. 이후, 상층액/수지 혼합물을 폴리-프렙 컬럼 (Biorad)으로 유동시켰다. 이후, 수지를 10 컬럼 부피의 2 x PBS로 세척하고, 250mM의 이미다졸 1x PBS를 이용하여 용리시켰다. 완충용액 교환 후, 키메라 작제물 발현을 EndoH 데글리코실라아제를 이용하여 데글리코실화시키고, SDS-PAGE로 확인하였다.

PCR 동안 사용된 주형 DNA 서열

인간 (호모 사피엔스) TNFR1 (세포외 영역 유전자은행 (Genbank) 등록번호 33991418)

인간 TNFR1의 엔코딩된 세포외 영역은 하기의 아미노산 서열을 지닌다.

뮤린 (무스 무스쿨루스) TNFR1 (세포외 영역 유전자은행 등록번호 31560798)

뮤린 (무스 무스쿨루스) TNFR1의 엔코딩된 세포외 영역은 하기의 아미노산 서열을 지닌다.

항-TNFR1 dAb의 도메인 특이성

항-TNFR1 dAb의 도메인 특이성을, 상기 기술된 과량의 키메라 수용체와 함께 인큐베이션되고 평형화된 후, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 칩 표면 상에 고정된 완전한 인간 또는 마우스의 비오티닐화된 TNFR1에 결합하는 항체의 능력을 결정하는 SPR ('Detection of immuno-complex formation via surface plasmon resonance on gold-coated diffraction gratings.' Biosensors. 1987-88;3(4):211-25)을 이용하여 결정하였다. 이러한 분석에서, TNFR1 표면 상의 항-TNFR1 dAb의 유동은 SPR 신호를 발생시키고, 이는 SPR 칩 상에 고정된 TNFR1에 결합하는 dAb의 양을 나타낸다. dAb가 특정 dAb와 결합하는 TNFR1의 도메인(들)을 포함하는 키메라 분자로 미리 인큐베이션되고 평형화되는 경우, TNFR1 표면 상의 상기 혼합물의 유동은 dAb 단독에 비해 작은 SPR 신호를 발생시킬 것이다. 그러나, dAb가 특정 dAb와 결합하는 TNFR1의 도메인(들)을 포함하지 않는 키메라 분자로 미리 인큐베이션되고 평형화되는 경우, TNFR1 표면 상의 상기 혼합물은 dAb 단독을 이용하여 수득된 신호와 대략 비슷하다.

방법

SPR 칩 TNFR1 표면의 생성.

TNFR1 표면의 선택은 시험되는 항-TNFR1 dAb의 종 특이성에 의해 결정된다. 따라서, 항-인간 TNFR1 dAb를 인간 TNFR1로 코팅된 표면을 이용하여 평가하고, 항-마우스 TNFR1 dAb를 마우스 TNFR1로 코팅된 칩을 이용하여 평가하였다.

비오티닐화된 TNFR1를 적절한 SPR 완충용액에 희석시키고, 비아코어 3000 SPR 기계 (Biacore International AB, Uppsala, Sweden) 내의 스트렙타비딘 (SA) 센서 칩을 가로질러 작동시켰다. 비오티닐화된 TNFR1과 스트렙타비딘 표면 사이의 접촉 시간을 최대화하기 위해 낮은 유속 (5-10μl/분)을 이용하였다. 스트렙타비딘 표면이 비오티닐화된 물질로 포화될때까지 유동을 지속시켜, 최대 TNFR1 표면을 지닌 칩을 생성시켰다. 칩은 통상적으로 비오티닐화된 물질의 수백 내지 수천의 SPR 반응 유닛에 결합하였다.

SPR 칩에서의 항-TNFR1 반응의 적정

성공적인 경쟁 실험은 dAb의 최소량이 현저한 SPR 신호를 발생시키는 표면 위로 유동되도록 하는 항-TNFR1 dAb 농도의 최초 최적화를 필요로 한다. 특정 농도 범위 내에서, dAb는 dAb 결합의 RU의 수가 칩 표면을 가로질러 유동된 dAb의 농도를 반영하는 용량 의존 반식으로 표면에 결합할 것이다.

이러한 용량 의존물의 농도를 확인하기 위해, 항-TNFR1 dAb를 1/10 희석 내지 1/1,000,000 희석의 범위의 비아코어 완충용액의 일련의 10배의 연속적 희석으로 적정하였다. 이후, 희석액을 대부분의 희석 샘플로 시작하여, TNFR1 칩 표면을 가로질러 개별적으로 및 연속적으로 주입시켰다. 각각의 희석액에서 수득된 RU의 최대수를 측정하였다. 각각의 주입후, 필요시 적절한 SPR 재생 완충용액을 이용하여 결합된 항-TNFR1 dAb를 제거하기 위해 TNFR1 표면을 재생시켰다. 이러한 방법을 이용하여, 약 100RU를 나타내는 신호를 생성하는데 필요한 항-TNFR1 dAb의 최소 농도를 결정하였다.

항-TNFR1 dAb/키메라의 예비 평형화

일단 최적 항-TNFR1 dAb 농도가 결정된 후, 항-TNFR1 dAb/키메라 TNFR1 혼합물을 제조하였다. 항-TNFR1 dAb의 최종 농도가 이전에 결정된 최적 농도와 동일하도록 혼합물을 구성시켰다. 통상적으로, 반응물을 50 마이크로리터의 2x 농도의 항-TNFR1 dAb, 40 마이크로리터의 비아코어 완충용액 및 10 마이크로리터의 순수한 정제된 키메라 단백질을 함유하는 100μl 부피로 제조하였다. 최종 혼합물에 대한 통상적 농도는 약 10-100μM의 키메라 단백질 및 약 10-100nM의 항-TNFR1 dAb이었다. 혼합물을 실온에 30분 동안 평형화되도록 두었다.

경쟁 비아코어 실험

평형화 후, 각각의 항-TNFR1 dAb/키메라 TNFR1 혼합물을 TNFR1 SPR 표면상에서 연속적으로 작동시키고, 반응 유닛의 반응수를 측정하였다. 각각의 혼합물을 주입시키고, 다음 혼합물이 주입되기 전에 결합된 항-TNFR1 dAb를 제거하기 위해 표면을 재생시켰다. 상이한 키메라를 이용하여 생성된 상이한 반응은 특정 dAb에 의해 결합된 TNFR1 도메인의 결정을 가능하게 하였다.

이들 연구는 TAR2m-21-23이 마우스의 도메인 1에 결합하고, TAR2h-205가 인간 TNFR1의 도메인 1에 결합하는 것을 나타낸다.

TAR2M-21-23 및 TAR2h-205의 아미노산 서열에서, CDR1은 ~에 의해 플랭킹되고, CDR2는 ~~에 의해 플랭킹되고, CDR3는 ~~~에 의해 플랭킹된다. 제시된 아미노산 서열은 갭이 없이 연속적이다.

스크리닝 방법

본원에 기술된 키메라 TNFR1 단백질과 같은 키메라 수용체 단백질은 요망되는 수용체 내의 특정 도메인에 결합하는 작용제 (예를들어, 항체, dAb)를 분리시키기 위한 분석 또는 스크리닝에 사용될 수 있다. 요망되는 수용체 단백질에 대한 모델로서 TNFR1을 사용하는, 이들 방법은 ELISA 또는 표면 플라즈몬 공명에 의해 수용체 결합을 스크리닝하기 전에 미정제 항체 제조물에 키메라 항체를 첨가하는 것을 기술한다. 추가로, 이들은 표면 (예를들어, ELISA 플레이트 또는 SPR 칩) 상에 코팅된 키메라 단백질의 사용 및 상기 표면 상의 키메라 단백질로의 결합의 시험을 통한 항체의 스크리닝을 기술한다. 기타 수용체의 요망되는 도메인 (예를들어, 활성 부위의 외부)에 결합하는 작용제 (예를들어, 항체, dAb)를 확인하기 위해 유사한 방법이 사용될 수 있다.

가용성 ELISA 스크리닝

본 방법은 공지되지 않은 특이성의 항체 또는 항체 단편의 방대한 레퍼토리로부터 TNFR1의 특정 도메인에 결합하는 항체 또는 항체 단편 (예를들어, dAb)을 신속하게 분리시키기 위해 사용될 수 있다.

96 웰 분석 플레이트는 웰당 lOOμl의 키메라 TNFR1로 4℃에서 밤새 코팅될 것이다. 웰은 0.1% TPBS (0.1%의 농도로 Tween-20을 함유하는 인산염 완충 식염수)로 3회 세척될 것이다. 웰당 200μl의 1% TPBS가 플레이트를 블로킹하기 위해 첨가될 것이고, 플레이트는 실온에서 1-2시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이후, 웰은 PBS로 3회 세척되고, 50μl의 0.2% TPBS 중에 가용성 항체 또는 항체 단편 (c-Myc 에피토프 태그 함유)를 함유하는 50μl의 박테리아 상층액 또는 페리프렙이 첨가될 것이다. 이후, 플레이트는 실온에서 1시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이후, 플레이트는 0.1% TPBS (PBS중 0.1% Tween-20)로 5회 세척될 것이다. 이후, lOOμl의 제 1 항-c-Myc 마우스 모노클로날이 각각의 웰에 0.1% TPBS로 첨가될 것이고, 상기 플레이트는 실온에서 1시간 동안 인큐베이션될 것이다. 상기 제 1 항체 용액은 폐기될 것이고, 이후 플레이트는 0.1% TPBS로 5회 세척될 것이다. 이후, 염소로부터의 lOOμl의 미리희석된 항-마우스 IgG (Fc 특이적) HRP 컨쥬게이트 (Sigma Cat No: AOl 68)가 첨가되고, 플레이트가 실온에서 1시간 동인 인큐베이션될 것이다. 이후, 제 2 항체가 폐기되고, 플레이트가 0.1% TPBS로 6회 세척된 후, PBS로 2회 세척될 것이다. 이후, 50μl의 TMB 과산화효소 용액이 각각의 웰에 첨가되고, 플레이트가 2-60분 동안 실온에 방치될 것이다. 50μl의 1M 염산이 첨가되어 반응이 정지될 것이다. 플레이트의 450nm에서의 OD가 산 첨가후 30분 이내에 96-웰 플레이트 판독기에서 판독될 것이다. 키메라 단백질 내에 존재하는 TNFR1의 도메인에 결합하는, 미정제 박테리아 상층액 또는 페리프렙으로 존재하는 상기 항체들은 그렇지 않은 항체 보다 강한 ELISA 신호를 발생시킬 것이다.

경쟁적 ELISA 스크리닝

본 방법은 도메인 결합 특이성을 결정하기 위해 다양한 세트의 TNFR1에 결합하는 미정제 항체 또는 항체 단편 제조물을 신속하게 스크리닝하는데 사용될 수 있다.

96웰 분석 플레이트는 웰당 lOOμl의 뮤린 또는 인간 TNFR1 (인간 또는 마우스)로 4℃에서 밤새 코팅될 것이다. 웰은 0.1% TPBS (0.1%의 농도로 Tween-20을 함유하는 인산염 완충 식염수)로 3회 세척될 것이다. 웰당 200μl의 1% TPBS (PBS중 1% Tween-20)가 플레이트를 블로킹하기 위해 첨가될 것이고, 플레이트는 실온에서 1-2시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이후, 웰은 PBS로 3회 세척될 것이다. 동시에, 박테리아 상층액 또는 페리프렙이 미리 최적화된 농도의 용액 중의 키메라 TNFR1 단백질로 미리 평형화될 것이다. 이후, 가용성 항체 또는 항체 단편을 함유하는 50μl의 이러한 미정제 박테리아/키메라 단백질 혼합물이 ELISA 플레이트에 첨가될 것이다. 플레이트는 실온에서 1시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이후, 플레이트는 0.1% TPBS (PBS중 0.1% Tween-20)로 5회 세척되고, lOOμl의 제 1 검출 항체 (또는 단백질 A-HRP 또는 단백질 L HRP)이 각각의 웰에 0.1% TPBS로 첨가되고, 플레이트는 실온에서 1시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이러한 제 1 항체 용액은 폐기되고, 플레이트는 0.1% TPBS로 5회 세척될 것이다. 요망되는 경우, 염소로부터의 1OOμl의 미리 희석된 제 2 항체/HRP 컨쥬게이트가 첨가될 것이고, 플레이트는 실온에서 1시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이후, 제 2 항체는 폐기되고, 플레이트는 0.1% TPBS로 6회 세척된 후, PBS로 2회 세척될 것이다. 50μl의 TMB 과산화효소 용액이 각각의 웰에 첨가될 것이고, 플레이트가 2-60분 동안 실온에 방치될 것이다. 50μl의 1M 염산이 첨가되어 반응이 중지될 것이다. 플레이트의 450 nm에서의 OD가 산 첨가후 30분 이내에 96-웰 플레이트 판독기에서 판독될 것이다. ELISA 신호의 감소는 플레이트 상에 코팅된 완전한 TNFR1이 아닌 키메라 TNFR1 도메인에 대한 항체 결합을 나타내는 것으로, 키메라 항체 내의 도메인중 하나에 결합하는 것을 나타낸다.

TNFR1에 대한 결합에서 참조 항체 또는 항체 단편과의 경쟁하는 항체 및 항체 단편에 대한 경쟁적 ELISA 스크리닝

본 방법은 TNFR1에 대한 결합에서 참조 항체 또는 항체 단편 (예를들어, TAR2m-21-23)과 경쟁하는 항체 또는 항체 단편에 대해 TNFR1에 결합하거나 TNFR1의 요망되는 도메인 (예를들어, 도메인 1)에 결합하는 다양한 세트의 미정제 항체 또는 항체 단편 제조물을 신속하게 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 상이한 검출가능한 태그 (에피토프 태그)를 함유하는 참조 항체 또는 항체 단편 및 시험 항체 또는 항체 단편 (예를들어, 스크리닝되는 항체의 집단)을 사용한다.

96웰 분석 플레이트는 웰당 lOOμl의 뮤린 또는 인간 TNFR1로 4℃에서 밤새 코팅될 것이다. 웰은 0.1% TPBS (0.1%의 농도로 Tween-20을 함유하는 인산염 완충 식염수)로 3회 세척될 것이다. 웰당 200μl의 1% TPBS (PBS중 1% Tween-20)가 플레이트를 블로킹하기 위해 첨가될 것이고, 플레이트는 실온에서 1-2시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이후, 웰은 PBS로 3회 세척될 것이다. 동시에, 시험되는 미정제 항체 제조물이 용액 중의 미리 최적화된 농도의 참조 항체 또는 항체 단편 (예를들어, 도메인 1-결합 항체; TAR2m-21-23)과 함께 혼합될 것이다. 이미 언급한 바와 같이, 이러한 항체는 도메인 결합 특이성에 대해 스크리닝되는 항체 내에 존재하는 바와 같은 동일한 검출 태그를 포함하지 않는 것이 중요하다. 50μl의 이러한 미정제 항체/참조 항체 혼합물이 ELISA 플레이트에 첨가될 것이다. 이후, 플레이트는 실온에서 1시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이후, 플레이트는 0.1% TPBS로 5회 세척될 것이고, lOOμl의 제 1 검출 항체 (스크리닝되는 항체 집단 내에서만 존재하는 태그에 결합함)가 각각의 웰에 0.1% TPBS로 첨가될 것이고, 플레이트는 실온에서 1시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이러한 제 1 항체 용액은 폐기될 것이고, 플레이트는 0.1% TPBS로 5회 세척될 것이다. 제 1 검출 항체를 인식하는 10Oμl의 미리 희석된 제 2 항체-HRP 컨쥬게이트가 첨가될 것이고, 플레이트는 실온에서 1시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이후, 제 2 항체 용액은 폐기될 것이고, 플레이트는 0.1% TPBS로 6회 세척된 후 PBS로 2회 세척될 것이다. 이후, 50μl의 TMB 과산화효소 용액이 각각의 웰에 첨가될 것이고, 플레이트는 2-60분 동안 실온에 방치될 것이다. 50μl의 1M 염산을 첨가하여 반응이 중지될 것이다. 플레이트의 450 nm에서의 OD가 산 첨가후 30분 이내에 96-웰 플레이트 판독기에서 판독될 것이다. 상기 방법을 이용하나 참조 항체 또는 항체 단편을 첨가하지 않는 별도의 병행 ELISA가 동시에 수행되어야 한다. 참조 항체 또는 항체 단편과 경쟁하지 않는 동일한 항체 제조물에 대한 ELISA 신호와 비교한 참조 항체 또는 항체 단편의 존재하에서의 ELISA 신호의 감소는 특정 항체 또는 항체 단편이 TNFR1에 대한 결합에서 참조 항체 또는 항체 단편과 경쟁하고, 참조 항체 또는 항체 단편과 동일한 TNFR1의 도메인에 결합함을 나타낸다.

SPR 스크리닝

상기 기술된 ELISA 방법은, 예를들어 비아코어 3000 SPR 기계 (Biacore International AB, Uppsala, Sweden)를 이용하여 표면 플라즈몬 공명을 이용하는 포맷에 용이하게 적합화될 수 있다. 일반적으로, 키메라 항체는 SPR 칩에 고정되거나, 키메라 항체는 항-TNFR1 항체 또는 항체 단편을 함유하는 미정제 박테리아 상층액을 이용하여 평형화될 것이고, 생성된 혼합물은 전장의 인간 TNFR1 또는 뮤린 TNFR1로 코팅된 SPR 칩 상에 유동될 것이다.

실시예 5. dAb의 페길화

무세포 수용체 결합 분석에서 TNFR1에 결합하고, 세포 기재 분석에서 세포의 표면에서 TNFR1의 기능을 억제하는 dAb의 능력에 대한 dAb의 페길화의 효과를 연구하였다.

세포 분석

MRC-5 IL-8 방출 분석

인간 TNFR1에 결합하는 특정 dAb의 활성을 하기의 MRC-5 세포 분석에서 평가하였다. 이 분석은 MRC-5 세포에서의 TNF에 의한 IL-8 분비의 유도를 기초로 하고, HUVEC에서의 IL-1에 의한 IL-8의 유도를 기술하는 문헌[Alceson, L. et al. Journal of Biological Chemistry 271:30517-30523 (1996)]에 기술된 방법으로부터 적합화된 것이다. HUVEC 세포주 대신에 MRC-5 세포를 이용하여 인간 TNFα에 의한 IL-8 유도를 측정함으로써 dAb의 활성을 분석하였다. 간단히, MRC-5 세포를 미세역가 플레이트에 플레이팅시키고, 플레이트를 dAb 및 인간 TNFα (300 pg/ml)와 함께 밤새 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 배양 상층액을 흡출시키고, 상층액 내의 IL-8의 농도를 샌드위치 ELISA (R&D Systems)를 통해 측정하였다. 항-TNFR1 dAb 활성은 TNFα로만 인큐베이션된 대조군 웰에 비해 상층액으로의 IL-8 분비를 감소시켰다.

수용체 결합 분석

항-TNF dAb를 재조합 TNF 수용체 1 (p55)에 대한 TNF의 결합을 억제하는 능력에 대해 시험하였다. 간단히, 맥시소프(Maxisorp) 플레이트를 30mg/ml의 항-인간 Fc 마우스 모노클로날 항체 (Zymed, San Francisco, USA)로 밤새 인큐베이션시켰다. 웰을 0.05% Tween-20을 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고, 1%의 PBS중 BSA로 블로킹시키고, 100ng/ml의 TNF 수용체 1 Fc 융합 단백질 (R&D Systems, Minneapolis, USA)로 인큐베이션시켰다. 항-TNF dAb를 10ng/ml의 최종 농도로 세척된 웰에 첨가되는 TNF와 혼합시켰다. TNF 결합을 0.2mg/ml의 비오티닐화된 항-TNF 항체 (HyCult biotechnology, Uben, Netherlands), 이후 스트렙타비딘으로 라벨링된 1/500 희석의 호스라디쉬 과산화효소 (Amersham Biosciences, UK)으로 검출한 후, TMB 기질 (KPL, Gaithersburg, USA)과 함께 인큐베이션시켰다. 상기 반응을 HCl을 첨가하여 정지시키고, 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 항-TNF dAb 활성은 TNF 결합을 감소시켰고, 따라서 TNF 단독 대조군에 비해 흡광도가 감소하였다.

재조합 및 세포 표면 TNFR1에 대한 dAb의 페길화의 비교 효과를 표 5에 제시된 데이터에 나타내었다.

표 5

비세포 기재 분석 포맷에서 수용체의 세포외 부분만을 함유하는, 수용체의 재조합 형태를 사용하는 수용체 결합 분석 (RBA)이 좌측에 제시되어 있으며, 여기서 페길화에 대한 효과는 최소이고, 5K PEG의 경우 결합에는 차이가 없었다.

대조적으로, 세포 분석에서 수득된 데이터에 나타나는 바와 같이, dAb의 페길화는 상기 분석에서 dAb의 효과를 실질적으로 감소시켰다. 몇몇 경우, 효과는 33배 이하로 감소하였다. 데이터는 세포 표면에서 수용체 활성을 차단시키는 dAb의 능력을 기초로 하는 세포 기재 분석에서 수득되었다.

상기 연구의 결과는 dAb의 페길화가 무세포 분석에서 TNFR1에 결합하는 능력 보다 세포 표면에서 TNFR1의 기능을 억제하는 dAb의 능력에 대해 훨씬 큰 효과를 지닌다는 것을 나타낸다.

실시예 6. 내인성 효능제 분자에 결합하지만 활성 부위에는 결합하지 않는 dAb.

본 실시예는 요망되는 내인성 효능제 분자에는 결합하지만 내인성 효능제의 활성 부위에는 결합하지 않는 dAb를 확인하기 위한 방법을 예시한다. 이러한 방법은 에리트로포이어틴(epo)를 이용하여 예시되고, 일반적으로 내인성 효능제에 적용가능하다.

EPO에 결합하는 도메인 항체는 임의의 적절한 스크리닝 방법을 이용하여 확인되고 분리될 수 있다. 재조합 EPO 수용체를 발현하고, 성장에 대해 조혈 인자에 의존하는 세포주가 EPO에 결합하지만 활성 부위에는 결합하지 않으므로, EPO 수용체에 대한 EPO의 결합을 방해하지 않는 dAb를 확인하기 위한 분석에 사용될 수 있다. 예를들어, 인간 EPO 수용체로 트랜스펙션되고 epo 의존 성장하는 뮤린 IL-3 의존성 세포주인 Ba/F3 세포가 사용될 수 있다 (D'Andrea et al., Blood 82:46-52 (1993). Ba/F3 세포는 적절한 배양 접시에서 배양될 수 있고, 배지는 제거될 수 있고, 세포는 PBS와 같은 적절한 완충용액을 이용하여 세척될 수 있다. 이후, 세포는 EPO를 함유하는 배지에서 약 48시간 동안 배양될 수 있다. 분석되는 도메인 항체는 개별적 배지 (예를들어, 적절한 세포 배양 분석 플레이트의 개별적 웰)에 첨가될 수 있다. 약 48시간 후, 세포 증식이 임의의 적절한 방법, 예를들어 디메틸티아졸 디페닐-테트라졸리움 브리마이드 (MTT) 감소 분석을 이용하여 측정될 수 있다. 배지를 함유하지만 dAb를 함유하지 않는 대조 웰에 비한 dAb를 함유하는 웰에서의 세포 증식의 억제의 결핍은 dAb가 epo의 활성 부위에 결합하지 않음을 나타낼 것이다.

본 명세서에 언급된 모든 간행물, 및 상기 간행물에 인용된 참조는 본원에 참조로서 포함되어 있다. 본 발명의 상기 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 사상을 벗어남이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정한 바람직한 구체예로 기술되어 있으나, 청구되는 발명은 이러한 특정 구체예에 의해 과도학 제한되는 것이 아님을 이해해야 한다. 또한, 분자생물학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위해 기술된 방법의 다양한변형은 하기의 청구항의 범위 내에 속한다.

SEQUENCE LISTING <110> Domantis Limited Tomlinson, Ian M. <120> LIGANDS THAT ENHANCE ENDOGENOUS COMPOUNDS <130> 3440.1014001 <140> PCT/GB2005/004319 <141> 2005-11-10 <150> 10/985,847 <151> 2004-11-10 <160> 38 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 546 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encodes Human TNFR1 Extracellular Region <400> 1 ctggtccctc acctagggga cagggagaag agagatagtg tgtgtcccca aggaaaatat 60 atccaccctc aaaataattc gatttgctgt accaagtgcc acaaaggaac ctacttgtac 120 aatgactgtc caggcccggg gcaggatacg gactgcaggg agtgtgagag cggctccttc 180 accgcttcag aaaaccacct cagacactgc ctcagctgct ccaaatgccg aaaggaaatg 240 ggtcaggtgg agatctcttc ttgcacagtg gaccgggaca ccgtgtgtgg ctgcaggaag 300 aaccagtacc ggcattattg gagtgaaaac cttttccagt gcttcaattg cagcctctgc 360 ctcaatggga ccgtgcacct ctcctgccag gagaaacaga acaccgtgtg cacctgccat 420 gcaggtttct ttctaagaga aaacgagtgt gtctcctgta gtaactgtaa gaaaagcctg 480 gagtgcacga agttgtgcct accccagatt gagaatgtta agggcactga ggactcaggc 540 accaca 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acctgagtga gacacacttc 300 cagtgcgtgg actgcagccc ctgcttcaac ggcaccgtga caatcccctg taaggagact 360 cagaacaccg tgtgtaactg ccatgcaggt ttctttctaa gagaaaacga gtgtgtctcc 420 tgtagtaact gtaagaaaag cctggagtgc acgaagttgt gcctacccca gattgagaat 480 gttaagggca ctgaggactc aggcaccaca gcggccgcca gctttctaga acaaaaactc 540 atctcagaag aggatctgaa tagcgccgtc gaccatcatc atcatcatca ttga 594 <210> 22 <211> 594 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encodes Chimeric TNFR1 <400> 22 agtgtgtgtc cccaaggaaa atatatccac cctcaaaata attcgatttg ctgtaccaag 60 tgccacaaag gaacctactt gtacaatgac tgtccaggcc cggggcagga tacggactgc 120 agggagtgtg aaaagggcac ctttacggct tcccagaatt acctcaggca gtgtctcagt 180 tgcaagacat gtcggaaaga aatgtcccag gtggagatct ctccttgcca agctgacaag 240 gacacggtgt gtggctgcag gaagaaccag taccggcatt attggagtga aaaccttttc 300 cagtgcttca attgcagcct ctgcctcaat gggaccgtgc acctctcctg ccaggagaaa 360 cagaacaccg tgtgcacctg ccatgcaggt ttctttctaa gagaaaacga gtgtgtctcc 420 tgtagtaact gtaagaaaag cctggagtgc acgaagttgt gcctacccca gattgagaat 480 gttaagggca ctgaggactc aggcaccaca gcggccgcca gctttctaga acaaaaactc 540 atctcagaag aggatctgaa tagcgccgtc gaccatcatc atcatcatca ttga 594 <210> 23 <211> 594 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encodes Chimeric TNFR1 <400> 23 agcttgtgtc cccaaggaaa gtatgtccat tctaagaaca attccatctg ctgcaccaag 60 tgccacaaag gaacctactt ggtgagtgac tgtccgagcc cagggcggga tacagtctgc 120 agggagtgtg agagcggctc cttcaccgct tcagaaaacc acctcagaca ctgcctcagc 180 tgctccaaat gccgaaagga aatgggtcag gtggagatct cttcttgcac agtggaccgg 240 gacaccgtgt gtggctgcag gaagaaccag taccggcatt attggagtga aaaccttttc 300 cagtgcttca attgcagcct ctgcctcaat gggaccgtgc acctctcctg ccaggagaaa 360 cagaacaccg tgtgcacctg ccatgcaggt ttctttctaa gagaaaacga gtgtgtctcc 420 tgtagtaact gtaagaaaag cctggagtgc acgaagttgt gcctacccca gattgagaat 480 gttaagggca ctgaggactc aggcaccaca gcggccgcca gctttctaga acaaaaactc 540 atctcagaag aggatctgaa tagcgccgtc gaccatcatc atcatcatca ttga 594 <210> 24 <211> 120 <212> PRT <213> Mouse <220> <223> Anti-Mouse TNFR1 dab <400> 24 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Ser Tyr Gly Arg Gly Thr Tyr Tyr Glu Asp Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ile Ser Gln Phe Gly Ser Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 25 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Human TNFR1 dAb <400> 25 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Lys Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gln Ile Ser Asn Thr Gly Gly His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Thr Gly Arg Trp Glu Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acids 59-80 of Human TNF <400> 26 Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val 1 5 10 15 Leu Leu Thr His Thr Ile 20 <210> 27 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acids 87-108 of Human TNF <400> 27 Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln 1 5 10 15 Arg Glu Thr Pro Glu Gly 20 <210> 28 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD Domain of TNFR1 <400> 28 Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys 1 5 10 15 Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro 20 25 30 Gly Gln Asp Thr Asp Cys 35 <210> 29 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD Domain of TNFR2 <400> 29 Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser 1 5 10 15 Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser 20 25 30 Asp Thr Val Cys 35 <210> 30 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD Domain of FAS <400> 30 Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser 1 5 10 15 Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn 20 25 30 Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys 35 40 <210> 31 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD Domain of FAS <400> 31 Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser 1 5 10 15 Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn 20 25 30 Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro 35 40 45 Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp 50 55 60 <210> 32 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD Domain of LTbetaR <400> 32 Cys Arg Asp Gln Glu Lys Glu Tyr Tyr Glu Pro Gln His Arg Ile Cys 1 5 10 15 Cys Ser Arg Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Val Ser Ala Lys Cys Ser Arg 20 25 30 Ile Arg Asp Thr Val Cys 35 <210> 33 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD Domain of CD40 <400> 33 Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys 1 5 10 15 Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr 20 25 30 Glu Cys <210> 34 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD Domain of CD30 <400> 34 Cys His Gly Asn Pro Ser His Tyr Tyr Asp Lys Ala Val Arg Arg Cys 1 5 10 15 Cys Tyr Arg Cys Pro Met Gly Leu Phe Pro Thr Gln Gln Cys Pro Gln 20 25 30 Arg Pro Thr Asp Cys Arg Lys Gln Cys 35 40 <210> 35 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD Domain of CD27 <400> 35 Trp Trp Leu Cys Val Leu Gly Thr Leu Val Gly Leu Ser Ala Thr Pro 1 5 10 15 Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr Trp Ala Gln Gly Lys Leu 20 25 30 Cys Cys Gln Met 35 <210> 36 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD Domain of HVEM <400> 36 Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys 1 5 10 15 Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr 20 25 30 Val Cys <210> 37 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD Domain of OX40 <400> 37 Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val Gly Asp 20 25 30 Thr Tyr <210> 38 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD Domain of DR4 <400> 38 Ala Thr Ile Lys Leu His Asp Gln Ser Ile Gly Thr Gln Gln Trp Glu 1 5 10 15 His Ser Pro Leu Gly Glu Leu Cys Pro Pro Gly Ser His Arg 20 25 30

Claims

피검체의 내인성 표적 화합물의 양을 증가시키기 위한 약제의 제조에 있어서 상기 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 용도로서, 상기 내인성 표적 화합물에 결합하고 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 상기 리간드의 용도.
피검체의 내인성 표적 화합물의 생체이용률을 증가시키기 위한 약제의 제조에 있어서 상기 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 용도로서, 상기 내인성 표적 화합물에 결합하고 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 상기 리간드의 용도.
내인성 표적 화합물의 생체내 반감기를 증가시키기 위한 약제의 제조에 있어서 상기 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 용도로서, 상기 내인성 표적 화합물에 결합하고 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 상기 리간드의 용도.
투여 부위에서 내인성 표적 화합물의 양을 증가시키는 국소 투여용 약제의 제조에 있어서 상기 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 용도로서, 상기 내인성 표적 화합물에 결합하고 상기 내인성 표적 화 합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 상기 리간드의 용도.
제 1항 내지 제 4항중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제의 투여후 약 4시간 후의 피검체의 내인성 표적 리간드의 양이 상기 약제의 투여 전의 양에 비해 1.5배 이상 증가함을 특징으로 하는 용도.
제 5항에 있어서, 상기 약제의 투여후 약 4시간 후의 피검체의 내인성 표적 리간드의 양이 상기 약제의 투여 전의 양에 비해 10배 이상 증가함을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 상기 내인성 표적 화합물에 결합하고, 상기 내인성 표적 화합물의 생체내 반감기를 1.5배 이상 증가시킴을 특징으로 하는 용도.
제 7항에 있어서, 상기 리간드가 상기 내인성 표적 화합물에 결합하고, 상기 내인성 표적 화합물의 생체내 반감기를 10배 이상 증가시킴을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 약 10% 이하만큼 억제함을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드의 억제 농도 50(IC50)이 1 마이크로몰 이상임을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 상기 내인성 표적 화합물에 결합하지만, 상기 내인성 표적 화합물의 활성 부위에 결합하지 않음을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 11항중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 내인성 표적에 대한 결합 부위를 지니는 상기 부분의 2개 이상의 카피(copy)를 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 12항에 있어서, 상기 리간드가 내인성 표적에 대한 결합 부위를 지니는 상기 부분의 이합체임을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 13항중 어느 한 항에 있어서, 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 상기 부분이 어피바디(affibody), SpA 도메인, LDL 수용체 부류 A 도메인, EGF 도메인 및 아비머(avimer)로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 14항중 어느 한 항에 있어서, 내인성 표적 화합물에 대한 결 합 부위를 지니는 상기 부분이 항체 또는 항체 단편임을 특징으로 하는 용도.
제 15항에 있어서, 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 상기 부분이 Fv 단편, 단일 사슬 Fv 단편, 이황화 결합된 Fv 단편, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, 디아바디(diabody) 및 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편임을 특징으로 하는 용도.
제 16항에 있어서, 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 상기 부분이 면역글로불린 단일 가변 도메인임을 특징으로 하는 용도.
제 17항에 있어서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인이 인간 V_H 및 인간 V_L로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 18항중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 반감기 연장 부분을 추가로 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 19항에 있어서, 상기 반감기 연장 부분이 폴리알킬렌 글리콜 부분, 혈청 알부민 또는 이의 단편, 트랜스페린 수용체 또는 이의 트랜스페린 결합 부분, 또는 생체내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함하는 부분임을 특 징으로 하는 용도.
제 20항에 있어서, 상기 반감기 연장 부분이 생체내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 지니는 항체 또는 항체 단편임을 특징으로 하는 용도.
제 21항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 dAb임을 특징으로 하는 용도.
제 20항에 있어서, 상기 반감기 연장 부분이 어피바디, SpA 도메인, LDL 수용체 부류 A 도메인, EGF 도메인, 및 아비머로 구성된 군으로부터 선택된 생체내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함하는 부분임을 특징으로 하는 용도.
제 21항 내지 제 23항중 어느 한 항에 있어서, 생체내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드가 혈청 알부민 또는 신생아 Fc 수용체임을 특징으로 하는 용도.
제 20항에 있어서, 상기 반감기 연장 부분이 폴리에틸렌 글리콜 부분임을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 25항중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제가 실질적으로 비-면 역원성임을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 26항중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제가 데포(depot) 제형임을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 27항중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 표적 화합물이 가용성 사이토카인 수용체, 내인성 수용체 길항제, 효소, 사이토카인, 성장 인자, 및 호르몬으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용도.
제 28항에 있어서, 상기 내인성 표적 화합물이 가용성 사이토카인 수용체임을 특징으로 하는 용도.
제 28항에 있어서, 상기 가용성 사이토카인 수용체가 가용성 TNFR1임을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 30항중 어느 한 항에 있어서, 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분이 1 x 10^-7M 이하의 Kd로 상기 내인성 표적 화합물에 결합함을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 30항중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 1 x 10^-7M 이하의 Kd로 상기 내인성 표적 화합물에 결합함을 특징으로 하는 용도.
내인성 표적의 활성을 증가시키는 약제의 제조에 있어서 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분을 포함하는 리간드의 용도로서, 상기 내인성 표적에 결합하고 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 상기 리간드의 용도.
제 33항에 있어서, 상기 리간드가 상기 내인성 표적 화합물의 활성 부위에 결합하지 않음을 특징으로 하는 용도.
제 33항 또는 제 34항에 있어서, 상기 리간드가 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 약 10% 이하만큼 억제함을 특징으로 하는 용도.
제 33항 또는 제 34항에 있어서, 상기 리간드의 억제 농도 50(IC50)이 1 마이크로몰 이상임을 특징으로 하는 용도.
제 33항 내지 제 36항중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 상기 내인성 표적에 대한 결합 부위를 지니는 2개 이상의 부분을 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 33항 내지 제 36항중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 내인성 표적에 대한 결합 부위를 지니는 상기 부분의 2개 이상의 카피를 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 38항에 있어서, 상기 리간드가 내인성 표적에 대한 결합 부위를 지니는 상기 부분의 이합체임을 특징으로 하는 용도.
제 33항 내지 제 39항중 어느 한 항에 있어서, 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 상기 부분이 어피바디, SpA 도메인, LDL 수용체 부류 A 도메인, EGF 도메인, 및 아비머로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용도.
제 33항 내지 제 40항중 어느 한 항에 있어서, 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 상기 부분이 항체 또는 항체 단편임을 특징으로 하는 용도.
제 41항에 있어서, 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 상기 부분이 Fv 단편, 단일 사슬 Fv 단편, 이황화 결합된 Fv 단편, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, 디아바디, 및 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편임을 특징으로 하는 용도.
제 42항에 있어서, 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 상기 부분이 면역글로불린 단일 가변 도메인임을 특징으로 하는 용도.
제 43항에 있어서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인이 인간 V_H 및 인간 V_L로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용도.
제 33항 내지 제 44항중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 반감기 연장 부분을 추가로 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 45항에 있어서, 상기 반감기 연장 부분이 폴리알킬렌 글리콜 부분, 혈청 알부민 또는 이의 단편, 트랜스페린 수용체 또는 이의 트랜스페린 결합 부분, 또는 생체내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함하는 부분임을 특징으로 하는 용도.
제 46항에 있어서, 상기 반감기 연장 부분이 생체내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 지니는 항체 또는 항체 단편임을 특징으로 하는 용도.
제 47항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 dAb임을 특징으로 하는 용도.
제 46항에 있어서, 상기 반감기 연장 부분이 어피바디, SpA 도메인, LDL 수용체 부류 A 도메인, EGF 도메인, 및 아비머로 구성된 군으로부터 선택된 생체내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함하는 부분임을 특징으로 하는 용도.
제 47항 내지 제 49항중 어느 한 항에 있어서, 생체내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드가 혈청 알부민 또는 신생아 Fc 수용체임을 특징으로 하는 용도.
제 46항에 있어서, 상기 반감기 연장 부분이 폴리에틸렌 글리콜 부분임을 특징으로 하는 용도.
제 33항 내지 제 51항중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제가 실질적으로 비-면역원성임을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 27항중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제가 데포 제형임을 특징으로 하는 용도.
제 33항 내지 제 53항중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 표적 화합물이 가용성 사이토카인 수용체, 내인성 수용체 길항제, 효소, 사이토카인, 성장인자, 및 호르몬으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용도.
제 54항에 있어서, 상기 내인성 표적 화합물이 가용성 사이토카인 수용체임을 특징으로 하는 용도.
제 55항에 있어서, 상기 가용성 사이토카인 수용체가 가용성 TNFR1임을 특징으로 하는 용도.
제 33항 내지 제 56항중 어느 한 항에 있어서, 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분이 1 x 10^-7M 이하의 Kd로 상기 내인성 표적 화합물에 결합함을 특징으로 하는 용도.
제 33항 내지 제 56항중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 1 x 10^-7M 이하의 Kd로 상기 내인성 표적 화합물에 결합함을 특징으로 하는 용도.
내인성 표적 화합물의 결합 활성을 증가시키는 약제의 제조에 있어서 상기 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 2개 이상의 부분을 포함하는 리간 드의 용도로서, 상기 내인성 표적에 결합하고, 상기 내인성 표적의 활성 부위에 결합하지 않고, 상기 내인성 표적 화합물의 결합 활성을 실질적으로 억제하지 않는 상기 리간드의 용도.
제 59항에 있어서, 상기 리간드가 내인성 표적에 대한 결합 부위를 지니는 부분의 2개의 카피를 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 61항에 있어서, 상기 리간드가 내인성 표적에 대한 결합 부위를 지니는 상기 부분의 이합체임을 특징으로 하는 용도.
제 59항 내지 제 61항중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 활성이 10배 이상 증가됨을 특징으로 하는 용도.
제 59항 내지 제 63항중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 표적 화합물이 가용성 사이토카인 수용체임을 특징으로 하는 용도.
제 64항에 있어서, 상기 가용성 사이토카인 수용체가 가용성 TNFR1이고, 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 상기 부분이 도메인 1 및 도메인 4로 구성된 군으로부터 선택된 TNFR1의 도메인에 독립적으로 결합함을 특징으로 하는 용도.
제 59항 내지 제 64항중 어느 한 항에 있어서, 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 상기 부분이 어피바디, SpA 도메인, LDL 수용체 부류 A 도메인, EGF 도메인, 및 아비머로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용도.
제 59항 내지 제 64항중 어느 한 항에 있어서, 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 상기 부분이 항체 또는 항체 단편임을 특징으로 하는 용도.
제 66항에 있어서, 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 상기 부분이 Fv 단편, 단일 사슬 Fv 단편, 이황화 결합된 Fv 단편, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, 디아바디, 및 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편임을 특징으로 하는 용도.
제 67항에 있어서, 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 상기 부분이 면역글로불린 단일 가변 도메인임을 특징으로 하는 용도.
제 68항에 있어서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인이 인간 V_H 및 인간 V_L로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용도.
제 59항 내지 제 69항중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 반감기 연장 부분을 추가로 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 70항에 있어서, 상기 반감기 연장 부분이 폴리알킬렌 글리콜 부분, 혈청 알부민 또는 이의 단편, 트랜스페린 수용체 또는 이의 트랜스페린 결합 부분, 또는 생체내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함하는 부분임을 특징으로 하는 용도.
제 71항에 있어서, 상기 반감기 연장 부분이 생체내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 지니는 항체 또는 항체 단편임을 특징으로 하는 용도.
제 72항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 dAb임을 특징으로 하는 용도.
제 71항에 있어서, 상기 반감기 연장 부분이 어피바디, SpA 도메인, LDL 수용체 부류 A 도메인, EGF 도메인, 및 아비머로 구성된 군으로부터 선택된 생체내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함하는 부분임을 특징으로 하는 용도.
제 72항 내지 제 74항중 어느 한 항에 있어서, 생체내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드가 혈청 알부민 또는 신생아 Fc 수용체임을 특징으로 하는 용도.
제 71항에 있어서, 상기 반감기 연장 부분이 폴리에틸렌 글리콜 부분임을 특징으로 하는 용도.
제 59항 내지 제 76항중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제가 실질적으로 비-면역원성임을 특징으로 하는 용도.
제 59항 내지 제 77항중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제가 데포 제형임을 특징으로 하는 용도.
제 59항 내지 제 78항중 어느 한 항에 있어서, 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 부분이 1 x 10^-7M 이하의 Kd로 상기 내인성 표적 화합물에 결합함을 특징으로 하는 용도.
제 59항 내지 제 78항중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 1 x 10^-7M 이하의 Kd로 상기 내인성 표적 화합물에 결합함을 특징으로 하는 용도.
내인성 표적 화합물을 이용하여 치료가능한 질병의 치료에 사용하기 위한, 피검체의 질병 치료에 적합한 활성을 지니는 상기 내인성 표적 화합물에 결합하는 리간드로서, 상기 내인성 표적 화합물의 활성 부위에 결합하지 않거나 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 리간드.
제 81항에 있어서, 상기 내인성 표적 화합물의 생체내 반감기를 증가시킴을 특징으로 하는 리간드.
제 81항 또는 제 82항에 있어서, 피검체의 상기 내인성 표적 화합물의 양을 증가시킴을 특징으로 하는 리간드.
제 81항 내지 제 83항중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 표적 화합물의 생체이용률을 증가시킴을 특징으로 하는 리간드.
제 81항 내지 제 84항중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 화합물의 결합 활성을 증가시킴을 특징으로 하는 리간드.
제 81항 내지 제 85항중 어느 한 항에 있어서, 제 1항 내지 제 80항중 어느 한 항에 기술된 것임을 특징으로 하는 리간드.
피검체의 질병을 치료하기에 적합한 활성을 지니는 내인성 표적 화합물에 결합하는 리간드 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물로서, 상기 리간드가 상기 내인성 표적 화합물의 활성 부위에 결합하지 않고 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 약제 조성물.
제 87항에 있어서, 상기 리간드가 상기 내인성 표적 화합물의 생체내 반감기를 증가시킴을 특징으로 하는 약제 조성물.
제 87항 또는 제 88항에 있어서, 상기 리간드가 피검체의 상기 내인성 표적 화합물의 양을 증가시킴을 특징으로 하는 약제 조성물.
제 87항 내지 제 89항중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 상기 내인성 표적 화합물의 생체이용률을 증가시킴을 특징으로 하는 약제 조성물.
제 87항 내지 제 90항중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 상기 내인성 화합물의 결합 활성을 증가시킴을 특징으로 하는 약제 조성물.
제 87항 내지 제 91항중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 제 1항 내지 제 80항중 어느 한 항에 기술된 것임을 특징으로 하는 약제 조성물.
제 87항 내지 제 92항중 어느 한 항의 약제 조성물을 포함하는 약물 전달 장치.
제 93항에 있어서, 비경구 전달 장치, 정맥내 전달 장치, 근내 전달 장치, 복막내 전달 장치, 경피 전달 장치, 폐 전달 장치, 동맥내 전달 장치, 수막강내 전달 장치, 관절내 전달 장치, 피하 전달 장치, 비내 전달 장치, 질내 전달 장치, 및 직장 전달 장치로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 약물 전달 장치.
제 94항에 있어서, 주사기, 경피 전달 장치, 캡슐, 정제, 분무기, 흡입기, 아토마이저(atomizer), 연무기, 미스터(mister), 건조 분말 흡입기, 정량식 흡입기, 정량식 스프레이어, 정량식 미스터, 정량식 아토마이저 및 카테터로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 약물 전달 장치.
내인성 화합물의 반감기, 생체이용률 또는 활성을 증가시키기 위한 상기 내인성 표적 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 결합 부분을 포함하는 리간드의 용도로서, 내인성 화합물에 대한 결합 부위를 지니는 상기 결합 부분이 상기 내인성 화합물 또는 이의 일부 또는 변형체이고, 상기 리간드가 상기 내인성 표적 화합물에 결합하지만, 상기 내인성 표적 화합물의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 상기 리간드의 용도.
제 96항에 있어서, 상기 내인성 화합물이 TNF 수용체 상과(superfamily)의 일원인 가용성 수용체임을 특징으로 하는 용도.
TNF 수용체 상과의 일원의 반감기, 생체이용률 또는 활성을 증가시키기 위한 TNF 수용체 상과의 일원에 대한 결합 부위를 지니는 결합 부분을 포함하는 리간드의 용도로서, 상기 리간드가 TNF 수용체 상과의 상기 일원에 결합하지만, TNF 수용체 상과의 상기 일원의 활성을 실질적으로 억제하지 않고, TNF 수용체 상과의 일원에 대한 결합 부위를 지니는 상기 결합 부분이 프레-리간드(pre-ligand) 어셈블리 도메인(PLAD) 또는 이의 변형체인 상기 리간드의 용도.