CN108997495B - 一种改进的人源模拟Bt Cry杀虫蛋白功能效应物及其设计方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人源分子改造杀虫蛋白及其制备方法与应用，属于基因工程和生物防治领域。本发明提供了一种人源分子改造杀虫蛋白，所述杀虫蛋白CCL‑CCL_scFv的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述杀虫蛋白CCL‑CCl_scFv与小菜蛾(Plutella xylostella)中肠BBMV的亲和力显著高于Cry1Ab毒素，且与Cry1Ab和Cry1Ac毒素竞争结合小菜蛾中肠BBMV，为Cry1Ab和Cry1Ac毒素的模拟物；经小菜蛾室内杀虫生物活性测定，3d致死率可达55.35％，可有效的替代Cry1Ac毒素用于生物防治虫害。

Description

一种改进的人源模拟Bt Cry杀虫蛋白功能效应物及其设计方 法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程和生物防治领域，具体涉及一种人源分子改造杀虫蛋白、编码基因及其设计方法与应用。
背景技术
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种昆虫病原菌，其主要杀虫活性物质为细胞内毒素伴胞晶体蛋白，对多种农业害虫具有特异性毒杀作用(Bravo andSoberon，2008)；Cry1Ac是Bt毒素的一种，其对鳞翅目昆虫的靶标受体主要包括中肠刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles，BBMV)上的碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)、氨肽酶(aminopeptidase N，APN)和钙粘蛋白(cadherin)。ALP作为Cry1A毒素的受体，可促进毒素对膜的插入和孔道形成。诸多从双翅目和鳞翅目昆虫物种中分离出的ALP已被鉴定为Cry1Ac毒素的受体。抗Cry1Ac毒素独特型单链抗体(Anti-idiotype antibody scFvs，Anti-Id scFvs)，可以模拟Cry1Ac毒素的结构与功能。
Bt毒素使用量增加使其在害虫抗药性及次生害虫上升等方面存在生态风险(Bravo and Soberon，2008；Pigott et al，2008)，这一现状促使高特异活性和新功能类的Bt毒素抗虫资源的积极开发，Cry1Ab毒素抗独特型单链抗体由于可模拟Cry1Ab毒素并与其竞争受体蛋白，已成为目前国内外科研的重点，专利号为ZL201410037000.9的中国专利公开了一种人源抗虫基因及其编码的抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体B12(以下简称B12)，其能模拟Bt毒素并用作生物农药防治虫害，取得了积极的效果，但是该抗体的可溶性表达蛋白丧失了与昆虫BBMV结合能力，杀虫效果不甚理想。
基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段。将不同来源的基因按预先设计的蓝图，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，在体外构建重组DNA分子，然后导入活细胞，产生出人类所需要的基因产物。如DeMaagd于2002年针对Cry1Ab毒素在替换上Cry1C毒素的domain III后，对甜菜夜蛾的毒性较Cry1C提高了近10倍。
随着对抗体结构与功能关系的认知不断加深，借助计算机模拟技术进行抗体改造可以在限定范围内有目的地进行设计，根据抗体-抗原结合的氨基酸位点分析进行设计与定向改造，Wong等(1995)在已知抗原-抗体复合物三维结构的基础上，对抗苯偶氮基胂酸酯(anti-p-azophenylarsonate)Fab重链108位上的Phe定点突变为Trp之后，相对野生抗体而言，突变体亲和力就提高了10倍；为进一步对抗体分子结合区域改造指明了方向，但目前结合链替换分子改造方法来提高抗Bt毒素抗独特型单链抗体亲和力的方法并通过Octet技术平台筛选的方法尚未见报道。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种人源分子改造杀虫蛋白、编码基因及其设计方法与应用，所述人源分子改造杀虫蛋白与小菜蛾(Plutella xylostella)中肠BBMV的亲和力比Cry1Ab毒素高，且与Cry1Ab和Cry1Ac毒素竞争结合小菜蛾中肠BBMV，为Cry1Ab和Cry1Ac毒素的模拟物。可有效的替代Cry1Ac毒素用于生物防治虫害，且具有杀虫效果。
本发明提供了一种人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv，所述杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明提供了上述人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv的设计方法，包括如下步骤：
1)对抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体B12_scFv和Cry1A类毒素的氨基酸序列进行BLAST比对分析，得到B12_scFv与Cry1A类毒素的相似序列，分别为H-CDR 1，L-CDR1，L-CDR2和GS-linker；
2)用所述GS-linker将两个包含L-CDR1和L-CDR2序列的轻链区(VL)首尾连接，得到人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv。
本发明提供了一种杀虫剂，包括上述人源分子改造杀虫蛋白或上述方法设计得到的人源分子改造杀虫蛋白。
本发明提供了一种编码人源分子改造杀虫蛋白的基因，所述基因包括(a)和(b)所示的基因：
(a)由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的的基因；
(b)在(a)限定的核苷酸序列基础上经密码子优化得到的基因。
优选的，所述(b)基因由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成。
本发明还提供了一种含有上述基因的重组载体。
本发明还提供了上述人源分子改造杀虫蛋白、上述设计方法得到的人源分子改造杀虫蛋白、上述杀虫剂、基因或重组载体在农作物害虫防治方面的应用。
优选的，所述害虫包括小菜蛾。
优选的，所述农作物包括十字花科农作物。
有益效果：
(1)本发明提供了一种人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv，所述人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的人源分子改造杀虫蛋白与小菜蛾BBMV的亲和力显著高于B12_scFv和Cry1Ab毒素；其可与Cry1Ab和Cry1Ac毒素竞争结合小菜蛾的BBMV，且与Cry1Ac的竞争性更强，为Cry1Ab和Cry1Ac毒素的模拟物。经小菜蛾室内杀虫生物活性测定，3d致死率可达55.35％，可有效的替代Cry1Ac毒素用于生物防治虫害。
同时本发明提供的人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv由B12_scFv基因分子改造拼接所获得，抗体骨架区未变，与B12_scFv同属于人源抗体，因此CCL-CCL_ScFv应用于农业虫害防治时，对人体危害小。
(2)本发明提供了上述人源分子改造杀虫蛋白的设计方法，先对抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体B12_scFv和Cry1A类毒素的氨基酸序列进行BLAST比对分析，得到B12_scFv与Cry1A类毒素的相似序列H-CDR 1，L-CDR 1和L-CDR2和GS-linker；再用GS-linker将两个包含L-CDR1和L-CDR 2序列的轻链区首尾连接，得到人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv。本发明提供的方法与传统抗体改造方法(易错PCR等)相比，避免了盲目性，成功率高；且以计算机分子模拟为基础，在已知蛋白三维结构及功能等方面信息的基础上，预测分子间结合区域并确定关键氨基酸残基，更加准确的反应了抗体蛋白作用界面的特征，从而使得分子模拟计算更加准确，大大提高了预测准确度。
附图说明
图1为本发明所述人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv设计图；
图2为本发明实施例3中B12_scFv、改造后的CCL-CCL_scFv、CCH-CCH_scFv和Bt毒素Cry1Ab的三维结构示意图；其中，图2-A为B12_scFv的三维结构示意图(选取scFvMAB198的1f3r.1.B作为模板)；图2-B为CCL-CCL_scFv的三维结构示意图(选取Anti-IL12 Anti-IL18DFab轻链区4hjj.1.c作为模板)；图2-C为CCH-CCH_scFv的三维结构示意图(选取双价双特异性抗体的5gs1.1.I作为模板)；图2-D为Cry1Ab的三维结构示意图(选取CryIA(a)1ciy作为模板)；图2-E为PxALP的三维结构图(选取人ALP1zef.1.A作为模板)；
图3为本发明实施例3中B12_scFv、改造后的CCL-CCL_scFv、CCH-CCH_scFv、Bt毒素Cry1Ab和PxALP进行分子对接时的三维结构模型示意图；其中，图3-A为B12_scFv的三维结构图；图3-B为CCL-CCL_scFv的三维结构图；图3-C为CCH-CCH_scFv的三维结构图；图3-D为Cry1Ab的三维结构图；图3-E为PxALP的三维结构图(选取人ALP1zef.1.A作为模板)；图3-F为B12_scFv与PxALP的分子对接三维结构图；图3-G为CCL-CCL_scFv与PxALP的分子对接三维结构图；图3-H为CCH-CCH_scFv与PxALP的分子对接三维结构图；图3-I为Cry1Ab与PxALP的分子对接三维结构图；
图4为本发明实施例3中B12_scFv、改造后的CCL-CCL_scFv、CCH-CCH_scFv和Bt毒素Cry1Ab分别与PxALP受体结合后的复合物中结合热点分析；其中，图4-A、图4-B、图4-C和图4-D分别为Cry1Ab、B12_scFv、CCL-CCL_scFv、CCH-CCH_scFv与ALP受体结合区域I结合热点的三维结构图，在其右侧为配体的主要结合结构域；图4-E、图4-F、图4-G和图4-H为Cry1Ab、B12_scFv、CCL-CCL_scFv、CCH-CCH_scFv与ALP受体结合区域II结合热点的三维结构图，在其左侧为配体的主要结合结构域；
图5为本发明实施例4中采用生物膜层表面干涉技术(Bio-layerinterferometry,BLI)ForteBioOctet分子相互作用技术平台及酶联免疫法(ELISA)以小菜蛾中肠刷状缘膜囊泡蛋白BBMV为靶抗原，对Cry1Ab、B12_scFv、CCL-CCL_scFv和CCH-CCH_scFv的结合活性测定及筛选结果；其中，图5-A为生物膜层表面干涉技术(Bio-layerinterferometry,BLI)ForteBio Octet分子相互作用技术平台对杀虫蛋白活结合活性的测定结果；图5-B为酶联免疫法(ELISA)对杀虫蛋白的筛选结果；
图6为本发明实施例4中采用生物膜层表面干涉技术(Bio-layerinterferometry,BLI)ForteBioOctet分子相互作用技术平台，以小菜蛾中肠刷状缘膜囊泡蛋白BBMV为靶抗原，对Cry1Ab和CCL-CCL_scFv亲和力常数的测定结果；其中，图6-A为不同稀释浓度下CCL-CCL_scFv与小菜蛾BBMV的结合曲线；图6-B为不同稀释浓度下Bt毒素Cry1Ab与小菜蛾BBMV的结合曲线；图6-C为亲和力常数；
图7为本发明实施例5中以2龄小菜蛾为试虫，利用表达纯化的B12_scFv、CCL-CCL_scFv、CCH-CCH_scFv与Bt毒素Cry1Ac进行生物活性测定结果；
图8为本发明实施例6中采用竞争性酶联免疫法(ELISA)，以小菜蛾中肠刷状缘膜囊泡蛋白BBMV为靶抗原，CCL-CCL_scFv与Bt毒素Cry1Ab和Cry1Ac做竞争性抑制实验的结果；图8-A为CCL-CCL_scFv与Bt毒素Cry1Ab和Cry1Ac竞争结合小菜蛾BBMV的ELISA吸光值变化图，图8-B为CCL-CCL_scFv与Bt毒素Cry1Ab和Cry1Ac竞争结合小菜蛾BBMV的抑制率。
具体实施方式
本发明提供了一种人源分子改造杀虫蛋白，所述杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
在本发明中，所述人源分子改造杀虫蛋白由人源抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体B12_phage分子经改造拼接设计获得。所述单链抗体B12_phage的来源见专利号为ZL201410037000.9，专利名称为“一种人源抗虫基因及其编码的抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体与应用”的专利。本发明所述B12_phage为噬菌体展示型scFv，scFv与噬菌体GIII蛋白融合表达；B12_scFv为可溶性表达的scFv，不含噬菌体展示外壳。B12_phage中scFv部分的(核酸/蛋白质)序列与B12_scFv的序列完全一致。
在本发明中，所述人源分子改造杀虫蛋白的设计方法优选包括如下步骤：
1)对抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体B12_scFv和Cry1A类毒素的氨基酸序列进行BLAST比对分析，得到B12_scFv与Cry1A类毒素的相似序列，分别为H-CDR1，L-CDR1(SEQ IDNo.4)，L-CDR2(SEQ ID No.5)和GS-linker(SEQ ID No.6)；
2)用所述GS-linker将两个包含L-CDR 1和L-CDR 2序列的轻链区(VL)首尾连接，得到人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv的氨基酸序列。
在本发明中，所述包含L-CDR 1和L-CDR 2序列的轻链区核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示。
本发明提供的人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv为Cry1Ab和Cry1Ac毒素的模拟物，其可与Cry1Ab和Cry1Ac毒素竞争结合小菜蛾的BBMV受体位点，所述人源分子改造杀虫蛋白与小菜蛾BBMV受体位点的亲和力显著高于B12_scFv和Cry1Ac毒素。
本发明提供了人源分子改造杀虫蛋白的编码基因，所述基因包括(a)和(b)所示的基因：
(a)由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的基因；
(b)在(a)限定的核苷酸序列基础上经密码子优化得到的基因。
在本发明中，所述编码基因(a)的核苷酸序列是由人源抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体B12_phage基因序列经分子改造拼接设计，由南京锐真生物有限公司人工合成获得。所述编码基因(b)的核苷酸序列为在(a)限定的核苷酸序列基础上经密码子优化得到的。在本发明中，所述密码子优化利用codonusagedatabase(http://www.kazusa.or.jp/codon/)根据大肠杆菌密码子使用偏好对CCL-CCL_scFv进行优化。在本发明中，所述编码基因(b)的核苷酸序列优选由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成。
在本发明中，所述人源分子改造杀虫蛋白的制备方法优选采用重组表达法制备。所述重组表达法制备人源分子改造杀虫蛋白的方法优选包括以下步骤：
(1)将编码人源分子改造杀虫蛋白的基因与载体分别进行双酶切，连接，获得重组载体；
(2)将所述重组载体导入表达系统内，诱导培养，得到重组表达的人源分子改造杀虫蛋白。
在本发明中，所述表达系统优选原核细胞表达系统。所述原核表达系统优选为大肠杆菌。所述大肠杆菌的菌株优选为大肠杆菌BL21(DE3)。所述载体优选包括pET-26b、pET28a，更优选为pET-26b。所述双酶切用酶优选为NcoI酶和NotI酶。双酶切的体系为NcoI酶和NotI酶各1ul，载体43ul，10×cutsmart缓冲液5ul，37度30min。T4连接体系为双酶切载体1ul，DNA片段7ul，T4连接酶1ul，10×T4连接酶反应液1ul。在本发明的实施例中，所述重组载体的构建方法为：在人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv的核酸序列N端添加NcoI酶切位点，C端添加NotI酶切位点，合成基因后经双酶切后转入pET-26b载体中。
本发明提供了一种杀虫剂，包括所述的人源分子改造杀虫蛋白或上述方法设计得到的人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv。
在本发明中，所述人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv在所述杀虫剂中的质量含量优选为0.1～99％，更优选为1～50％。
本发明对所述杀虫剂的制备方法不作特别限定，采用本领域常规方法，以人源分子改造杀虫蛋白配合本领域可接受的载体制得即可。
在本发明中，所述杀虫剂在使用时优选采用浸叶法或利用饲料浸泡晾干后喂虫。
本发明还提供了上述人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv、杀虫剂、基因或重组载体在农作物害虫防治方面的应用。
在本发明中，所述在农作物害虫防治方面的应用包括一切以防治农作物害虫为目的的制备本发明所述杀虫蛋白的方法、制备本发明所述杀虫蛋白编码基因的方法、制备本发明所述杀虫重组菌的方法、制备本发明所述杀虫剂的方法、将本发明所述杀虫蛋白、杀虫剂、杀虫重组菌施加到农作物种植区域的方法。
在本发明中，所述农作物害虫优选包括小菜蛾，所述农作物优选包括十字花科农作物，更优选为小白菜(青菜)。
本发明以B12_scFv基因分子改造拼接获得的人源分子改造杀虫蛋白，抗体骨架区未变，与B12_scFv同属于人源抗体。因此，将人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv应用于农业虫害防治时，对人体危害小。
制得人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv后，本发明将B12_scFv、CCL-CCL_scFv、CCH-CCH_scFv和Bt毒素Cry1Ab蛋白用PBS稀释至制定浓度，各取500μL铺于培养皿中饲料表面，晾干；阴性对照为PBS缓冲液，阳性对照为Bt毒素Cry1Ab蛋白。
每个饲料培皿中接入30头已饥饿4h的小菜蛾2龄幼虫，然后置于温度为25±1℃，相对湿度80±5％，光照条件大于14h的培养箱内饲养，3d后分别观察、记录死亡虫数，取出幼虫检查时以小毛笔轻触虫体，无明显反应者为死亡。每处理3次重复。试虫死亡率采用Abbott公式对死亡率进行校正，并以平均数±标准误表示(3次重复试验)。
校正死亡率＝(处理死亡率－对照死亡率)/(1－对照死亡率)×100％
各处理时间相同时各个样品之间的比较采用单因素方差分析(One－wayANOVA)和Tukey显著性检验，使用SPSS软件进行数据处理，处理结果表明：3d后，CCL-CCL_scFv对小菜蛾的校正致死率为55.35％，B12_scFv的校正致死率低于10％，3d后CCL-CCL_scFv较B12_scFv的校正致死率提高了近5倍。该结果证明本发明提供的人源分子改造杀虫蛋白可有效的替代Cry1Ac毒素用于生物防治虫害。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种人源分子改造杀虫蛋白、编码基因及其制备方法与应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例中所涉及的实验材料：
载体pET26b载体购于德国Novagene公司；NcoI、NotI酶、T4DNA连接酶均购于NEB公司；
PCR试剂购于全式金公司；
质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、PCR产物凝胶回收试剂盒购于Axygen公司；
大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购于全式金公司；
HRP Conjugated Anti-Histag Mouse Monoclonal Antibody and HRPConjugate Goat Anti-rabbit IgG购于GE公司；
CrylAb、Cry1Ac毒素购于上海佑隆生物科技有限公司；
96孔板(Costar3599)购于美国Corning公司；
实施例1
一种人源分子改造杀虫蛋白的设计及制备方法，具体步骤如下：
(1)对抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体B12_scFv和Cry1A类毒素(Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac)的氨基酸序列进行BLAST比对分析，分析B12与Cry1A类毒素的相似序列，分别为H-CDR 1，L-CDR 1，L-CDR 2和GS-linker。
(2)根据结果设计拼接，以抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体B12_scFv序列的的重链区(VH)利用轻链区(VL)进行替换，获得双重链抗体CCH-CCH_scFv；或轻链区(VL)利用重链区(VH)进行替换，获得双轻链抗体CCL-CCL_scFv，并再进行BLAST比对分析。
(3)对抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体B12_scFv、人源分子改造蛋白CCL-CCL_scFv和CCH-CCH_scFv的氨基酸序列、Cry1Ab毒素和小菜蛾中肠BBMV上的ALP分别同源建模：抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体B12_scFv选取scFvMAB198的1f3r.1.B作为同源建模的模板，人源分子改造蛋白CCH-CCH_scFv选取双价双特异性抗体的5gs1.1.I作为同源建模的模板，人源分子改造蛋白CCL-CCL_scFv选取Anti-IL12Anti-IL18DFab轻链区4hjj.1.c作为同源建模的模板，Cry1Ab毒素选择CryIA(a)1ciy作为同源建模的模板，PxALP选择人ALP1zef.1.A作为同源建模的模板。
(4)利用ZDOCK程序对抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体B12_scFv、CCL-CCL_scFv和CCH-CCH_scFv以及Cry1Ab毒素和小菜蛾中肠BBMV上的ALP的同源建模进行分子对接，将获得的对接复合物提交至MitchellLab的热点预测服务器KFC2，定义B12_scFv、CCL-CCL_scFv和CCH-CCH_scFv以及Cry1Ab毒素为配体，针对与Cry1Ab相同PxALP结合区域的配体热点进行分析。
(5)CCL-CCL_scFv和CCH-CCH_scFv核酸序列通过N端添加Nco I和C端添加NotI酶切位点并基因合成获得，转入pET-26b载体中，利用大肠杆菌BL21(DE3)进行表达。目的蛋白经GE的His-trap亲和柱纯化。
(6)利用生物膜层表面干涉技术(Bio-layer interferometry，BLI)ForteBioOctet分子相互作用技术平台及酶联免疫法(ELISA)，以小菜蛾中肠刷状缘膜囊泡蛋白BBMV为靶抗原，筛选出高BBMV结合活性的人源分子改造蛋白CCL-CCL_scFv，并测定亲和力常数。
(7)利用酶联免疫法(ELISA)，以小菜蛾中肠刷状缘膜囊泡蛋白BBMV为靶抗原，对人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv与Cry1Ab和Cry1Ac做竞争性结合抑制实验，以验证CCL-CCL_scFv模拟Cry1A类毒素的特性。
(8)对人源分子改造杀虫蛋白氨基酸序列进行大肠杆菌密码子优化，CCL-CCL_scFv氨基酸序列(a)经优化后得到CCL-CCL_scFv(b)。
实施例2
抗CrylAb毒素独特型单链抗体B12_scFv、改造后的CCL-CCL_scFv、CCH-CCH_scFv和Cry1A类毒素(Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac)的氨基酸序列进行BLAST比对分析：
抗CrylAb毒素独特型单链抗体B12(以下简称B12_phage，来源于噬菌体载体pIT2，为噬菌体展示型单链抗体(scFv)，即在噬菌体外壳的GIII蛋白上共表达的scFv，如图1左侧所示)的氨基酸序列已由专利号为ZL201410037000.9的中国专利公开，B12_scFv为B12_phage中的抗体序列，重组到原核表达载体pET-26b中，为可溶性表达scFv，如图1中间所示。
Bt毒素Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac氨基酸序列由NCBI蛋白质数据库获得，登录号为：AFK79795.1、ALJ10947.1和ALT07695.1。
B12_scFv氨基酸序列提交到BLAST网站上(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分别与Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac氨基酸序列进行比对，比对结果如表1所示。
表1：Blast分析结果
Figure GDA0002545727890000111
B12_scFv重链的H-CDR1区与Cry1A类蛋白的保守结构域Endotoxin_N端结构域有相似序列，Endotoxin_N端结构域主要是Bt杀虫毒素的N端结构，N-端螺旋域涉及到膜插入和孔隙的形成，推测B12_scFv重链的H-CDR1区有可能具有相似功能。B12_scFv的轻链L-CDR1和L-CDR 2区与Cry1A类蛋白的保守结构域Endotoxin_C端结构域有相似序列，Endotoxin_C端结构域主要是Bt杀虫毒素的C端结构，主要与受体结合相关。由此，我们推测B12_scFv的重链区主要为杀虫活性区，B12_scFv的轻链区主要为结合活性区。
根据上述的BLAST比对分析结果，为提高B12_scFv的结合活性，分别通过以抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体B12_scFv序列的的重链区(VH)利用轻链区(VL)进行替换，获得双重链抗体CCH-CCH_scFv，或轻链区(VL)利用重链区(VH)进行替换，获得双轻链抗体CCL-CCL_scFv(如图1所示)。
改造后的CCL-CCL_scFv、CCH-CCH_scFv的氨基酸序列提交到BLAST网站上分别与Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac氨基酸序列进行比对，比对结果如图1所示。CCL-CCL_scFv轻链L-CDR1和L-CDR 2区与Cry1A类蛋白的保守结构域Endotoxin_C端结构域有相似序列，CCH-CCH_scFv重链的H-CDR1区与Cry1A类蛋白的保守结构域Endotoxin_N端结构域有相似序列。
实施例3
B12_scFv、改造后的CCL-CCL_scFv、CCH-CCH_scFv以及Bt毒素Cry1Ab和小菜蛾(Plutella xyllostella)碱性磷酸酶ALP(PxALP)的同源建模和分子对接：
(1)同源建模
B12_phage的氨基酸序列已由专利号为ZL201410037000.9的中国专利公开。PxALP氨基酸序列由NCBI蛋白质数据库获得，登录号为：AHF20243.2；Bt毒素Cry1Ab氨基酸序列由NCBI蛋白质数据库获得，登录号为:ALJ10947.1。
改造后的CCL-CCL_scFv、CCH-CCH_scFv氨基酸序列根据B12_scFv和Cry1A类毒素(Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac)的氨基酸序列的BLAST比对分析结果，分别通过以抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体B12_scFv序列的的重链区(VH)利用轻链区(VL)进行替换或轻链区(VL)利用重链区(VH)进行替换获得(如图1所示)。
B12_scFv、Cry1Ab、改造后的CCL-CCL_scFv和CCH-CCH_scFv以及PxALP同源建模方法为：利用Swiss-model网站(https://www.swissmodel.expasy.org/)从PDB(ProteinDataBank,Brookhaven NationalLaboratory)数据库找到一致性较高的模板，并进行建模；在分别获得三维结构后，再利用SAVES网站(http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/)的Verify3D和ERRAT程序对上述三维结构进行打分，评价三维结构与一级序列的兼容性及其可靠性。
具体为：B12_scFv选取scFvMAB198的1f3r.1.B作为同源建模的模板，与模板氨基酸序列一致性为87.28％，其三维结构如图2-A所示，CCL-CCL_scFv选取Anti-IL12Anti-IL18DFab轻链区4hjj.1.c作为模板，与模板氨基酸序列一致性为67.41％，其三维结构如图2-B所示；CCH-CCH_scFv选取双价双特异性抗体的5gs1.1.I作为模板，与模板氨基酸序列一致性为61.84％，其三维结构如图2-C所示；Cry1Ab选取CryIA(a)1ciy作为模板，与模板氨基酸序列一致性为89.46％，其三维结构如图2-D所示；PxALP选取人ALP1zef.1.A作为模板，与模板氨基酸序列一致性为44.93％，其三维结构如图2-E所示。
对同源建模的B12_scFv、改造后的CCL-CCL_scFv、CCH-CCH_scFv以及Bt毒素Cry1Ab和PxALP三维结构模型的评价结果如表2所示：
表2三维结构模型评价结果
Figure GDA0002545727890000131
一个好的三维结构模型，ERRAT评价应高于50以及Verify3D评价中80％以上的氨基酸残基需大于0.2。如表2所示评价结果，上述5个同源建模的三维结构是合理可信的。
本步骤中蛋白三维结构输出使用PyMOL软件(The PyMOL Molecular GraphicsSystem,DeLano Scientific,San Carlos,CA,USA)完成。
(2)分子对接及热点预测：
定义PxALP为受体，Cry1Ab、B12_scFv、改造后的CCL-CCL_scFv和CCH-CCH_scFv为配体，利用ZDOCK程序(http://zdock.umassmed.edu/)对所构建的PxALP模型和四个配体模型的三维结构进行分子对接，首先针对Cry1Ab配体，选取前10的预测复合物，根据已知PxALP的结合位点进行筛选，并通过Cry1Ab配体上PxALP受体结合位点进行二次确定；根据PxALP与Cry1Ab间的结合热点区域筛选其他3个配体(B12_scFv、CCL-CCL_scFv和CCH-CCH_scFv)复合物。PyMOL软件输出的B12_scFv-PxALP、CCL-CCL_scFv-PxALP、CCH-CCH_scFv-PxALP和Cry1Ab-PxALP对接复合物空间结构示意图如图3-F、图3-G、图3-H、图3-I所示。
将上述4个对接复合物提交到Mitchell Lab的热点预测服务器KFC2 Hot SpotPrediction Server(网址为http://kfc.mitchell-lab.org/)(Darnell et al.，2007),预测结果如图4所示，热点预测服务器KFC2预测到PxALp受体中与4个配体结合的共有热点区域为TRP53(ALP受体结合区域I)和ALA409、TYR411、TYR433(ALP受体结合区域II)；与受体结合的4个配体的热点三维结构图如图4所示，其中图4-A、图4-B、图4-C和图4-D分别为Cry1Ab、B12_scFv、CCL-CCL_scFv、CCH-CCH_scFv与ALP受体结合区域I结合热点的三维结构图，在其右侧为配体的主要结合结构域；图4-E、图4-F、图4-G、图4-H分别为Cry1Ab、B12_scFv、CCL-CCL_scFv、CCH-CCH_scFv与ALP受体结合区域II结合热点的三维结构图，在其左侧为配体的主要结合结构域。
经比较，B12_scFv通过轻链L-CDR 1、2区和重链H-CDR3区的热点氨基酸与PxALP受体结合，改造后的CCL-CCL_scFv可通过N端轻链L-CDR1、2区和C端轻链L-CDR 1、2、3区的热点氨基酸与PxALP受体结合，改造后的CCH-CCH_scFv可通过C端重链H-CDR 1区和C端重链H-CDR 1、2区的热点氨基酸与PxALP受体结合。从分子对接模拟的结果综合来看，改造后的CCL-CCL_scFv与PxALP受体结合热点部位较母体B12_scFv有所增加，除与母体相同的热点结构域轻链L-CDR 1、2区外，还增加了轻链L-CDR3区，预测CCL-CCL_scFv较B12_scFv与ALP的结合能力更强，而CCH-CCH_scFv与B12_scFv结合能力相似，与前期BLAST的预测结果类似。
本步骤中涉及的所有程序都是由PyMOL软件完成并进行图像输出。
实施例4
对杀虫蛋白的筛选及亲和力测定：
(1)小菜蛾中肠BBMV制备
参照Wolfersberger的实验方法(Wolfersberger，1987)，使用Mg-EGTA沉降法制备小菜蛾中肠BBMV，具体做法为：取小菜蛾4龄末期幼虫，提取中肠，在预冷的0.15MNaCl中清洗，每500只中肠加入3mL匀浆缓冲液；反复匀浆冰浴后，加入等体积24mMMgCl2混匀，冰浴并低速离心后将上清液转入新的超速离心管中再超速离心；弃上清后倒置离心管待液体流尽后，将沉淀重悬于HEPES缓冲液中，分装后于-80℃贮存备用；BBMV蛋白浓度通过Bradford法测定。
(2)生物膜层表面干涉技术(Bio-layer interferometry，BLI)对杀虫蛋白的筛选
实验操作使用Octet分子相互作用技术平台(ForteBio)，数据分析使用DataAnalysis软件(ForteBio)。反应过程中所用材料：系统缓冲液PBS(137mM NaCl，2.7mMKCl，10mmol/LNa2HPO4，and2mMKH2HPO4，pH7.4)、kinetic buffer(1×PBS buffercontaining0.1％(wt/vol)BSA)和氨丙基(APS)生物传感器(Aminopropylsilane-coatedbiosensor tips)均为ForteBio标配产品。实验所用受体蛋白小菜蛾中肠BBMV使用PBS稀释至10μg/mL，待测样品B12_scFv、CCL-CCL_scFv、CCH-CCH_scFv和Bt毒素Cry1Ab用kineticbuffer稀释到指定浓度。所有试剂均用去离子水配制，用0.22μm滤膜过滤。
将APS生物传感器置于PBS缓冲液中平衡30s，与10μg/mL小菜蛾中肠BBMV固化5min，用kinetic buffer平衡封闭APS生物传感器1min，同时置于表达纯化的B12_scFv、CCL-CCL_scFv、CCH-CCH_scFv和Bt毒素Cry1Ab中结合5min，再置于BSA缓冲液解离5min。
实时监测结果如图5-A所示，CCL-CCL_scFv的结合活性最好，为慢结合慢解离，且结合未达到饱和状态；Cry1Ab结合活性较好，也为快结合慢解离，结合已达到饱和状态；CCH-CCH_scFv结合稍差，为慢结合快解离；B12_scFv结合效果不佳，表现为快结合快解离。
(3)常规酶联免疫法(ELISA)对杀虫蛋白的筛选
取30μg/mL小菜蛾中肠BBMV包被96微孔板4℃孵育过夜，100μl/孔，次日每孔加入200μl3％MPBS溶液，37℃孵育2h进行封闭；每孔用250μlPBST洗板，然后加入表达纯化的B12_scFv、CCL-CCL_scFv、CCH-CCH_scFv和Bt毒素Cry1Ab(2倍梯度稀释)，100μl/孔，37℃孵育2h；每孔用250μlPBST洗板，加入1:5000倍稀释的HRP-Anti-Histag标签抗体(Bt毒素Cry1Ab需加入Cry1Ab的多抗100μl/孔，37℃孵育1h，PBST洗板后，再加入HRP-羊抗兔IgG)，100μl/孔，37℃孵育1h；PBST洗板后加入四甲基联苯胺(TMB)显色液，100μl/孔，37℃反应10～20min，最后加入浓度为2mol/L的H2SO4快速终止反应，并用Thermo全自动酶标仪，测定OD450值。
结果如图5-B所示，在梯度稀释的样品中只有CCL-CCL_scFv和Cry1Ab有结合活性，其中CCL-CCL_scFv的结合活性最好，OD450值最高可达3.0以上。
(4)生物膜层表面干涉技术(Bio-layer interferometry,BLI)对CCL-CCL_scFv和Cry1Ab亲和力的测定
实验所用受体蛋白小菜蛾中肠BBMV使用PBS稀释至10μg/mL，待测样品CCL-CCL_scFv和Bt毒素Cry1Ab用kinetic buffer分别稀释至4μM、2μM、1μM和0.5μM。
将APS生物传感器置于PBS缓冲液中平衡30s，与10μg/mL小菜蛾中肠BBMV固化5min，用kinetic buffer平衡封闭APS生物传感器1min，同时置于表达纯化的CCL-CCL_scFv和Bt毒素Cry1Ab的梯度稀释溶液中结合5min,再置于kinetic buffer解离5min。
实时监测结果如图6-A，图6-B所示，图6-A为不同稀释浓度下CCL-CCL_scFv与小菜蛾BBMV的结合曲线，图6-B为不同稀释浓度下Bt毒素Cry1Ab与小菜蛾BBMV的结合曲线。亲和力常数如图6-C所示，CCL-CCL_scFv与小菜蛾BBMV亲和力常数为41.6±1.75nM，Cry1Ab与小菜蛾BBMV亲和力常数为127.1±2.21nM。
综上所述，在相同浓度下，改造后CCL-CCL_scFv的BBMV结合活性比Bt毒素Cry1Ab强。B12_scFv由于快结合快解离(BLI实时监测)，在ELISA检测(终点检测法)中未表现有结合活性。利用BLI技术筛选BBMV结合活性蛋白，具有省时、省样、高通量、实时监测数据的特点，较传统ELISA方法(10小时)简便。也较SPR法(BIAcore X100实验平台)使用方便、简单、快捷。
实施例5
对杀虫蛋白的生物活性测定
将B12_scFv、CCL-CCL_scFv、CCH-CCH_scFv和Bt毒素Cry1Ab蛋白用PBS稀释至制定浓度，各取500μL铺于培养皿中饲料表面，晾干；阴性对照为PBS缓冲液，阳性对照为Bt毒素Cry1Ab蛋白。
每个饲料培皿中接入30头已饥饿4h的小菜蛾2龄幼虫，然后置于温度为25±1℃，相对湿度80±5％，光照条件大于14h的培养箱内饲养，3d后分别观察、记录死亡虫数，取出幼虫检查时以小毛笔轻触虫体，无明显反应者为死亡。每处理3次重复。试虫死亡率采用Abbott公式对死亡率进行校正，并以平均数±标准误表示(3次重复试验)。
校正死亡率＝(处理死亡率－对照死亡率)/(1－对照死亡率)×100％
各处理时间相同时各个样品之间的比较采用单因素方差分析(One－wayANOVA)和Tukey显著性检验，使用SPSS软件进行数据处理，处理结果如图7所示。
生物活性测定结果表明，3d后CCL-CCL_scFv对小菜蛾的校正致死率为55.35％，B12_scFv的校正致死率低于10％，CCL-CCL_scFv较B12_scFv的校正致死率提高了近5倍。
实施例6
杀虫蛋白CCL-CCL_scFv与Bt毒素的竞争性抑制实验
利用常规酶联免疫法(ELISA)，以小菜蛾中肠刷状缘膜囊泡蛋白BBMV为靶抗原，对CCL-CCL_scFv与Bt毒素Cry1Ab和Cry1Ac做竞争性抑制实验。
Bt毒素Cry1Ab(40mg/mL)和Cry1Ac(55mg/mL)用PBS缓冲液2倍稀释。稀释后的Cry1Ab或Cry1Ac蛋白与等体积的CCL-CCL_scFv蛋白混匀，37℃孵育2h。
取30μg/mL小菜蛾中肠BBMV包被96微孔板过夜，100μl/孔，次日每孔加入200μl3％MPBS溶液，37℃孵育2h进行封闭；每孔用250μlPBST洗板，然后加入一系列CCL-CCL_scFv+Cry1Ab混合物、CCL-CCL_scFv+Cry1Ac混合物，100μl/孔，37℃孵育2h；每孔用250μlPBST洗板，加入1:5000稀释的HRP-Anti-Histag标签抗体，37℃孵育1h；PBST洗板后加入四甲基联苯胺(TMB)显色液，100μl/孔，37℃反应10-20min，最后加入浓度为2mol/L的H2SO4快速终止反应，并用Thermo全自动酶标仪，测定OD450值。
ELISA结果如图8-A所示，随着Bt毒素浓度的增加，CCL-CCL_scFv与小菜蛾BBMV的结合活性被抑制。抑制率如图8-B所示，Cry1Ab结合小菜蛾BBMV导致对CCL-CCL_scFv半抑制的浓度(IC50)为3.02μg/mL，Cry1Ac结合小菜蛾BBMV导致对CCL-CCL_scFv半抑制的浓度(IC50)为1.7μg/mL。Cry1Ab和Cry1Ac蛋白都可以与CCL-CCL_scFv竞争结合小菜蛾BBMV，CCL-CCL_scFv被Cry1Ac蛋白抑制的抑制率可达到90％。由此，可以确定CCL-CCL_scFv为Cry1Ab和Cry1Ac毒素的模拟物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种人源分子改造杀虫蛋白、编码基因及其设计方法与应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile
20 25 30
Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
65 70 75 80
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Ser His
85 90 95
Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
130 135 140
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
145 150 155 160
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
165 170 175
Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
180 185 190
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
195 200 205
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Ser His Pro Pro
210 215 220
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
225 230 235
<210> 2
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggccacgg acatccagat gacccagtct ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac 60
agagtcacca tcacttgccg ggcaagtcag agcattagca gctatttaaa ttggtatcag 120
cagaaaccag ggaaagcccc taagctcctg atctatgctg catcccggtt gcaaagtggg 180
gtcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct gggacagatt tcactctcac catcagcagt 240
ctgcaacctg aagattttgc aacttactac tgtcaacaga cttctcatcc tcctctgacg 300
ttcggccaag ggaccaaggt ggaaatcaaa cggtcgagcg gtggaggcgg ttcaggcgga 360
ggtggcagcg gcggtggcgg gtcgacggac atccagatga cccagtctcc atcctccctg 420
tctgcatctg taggagacag agtcaccatc acttgccggg caagtcagag cattagcagc 480
tatttaaatt ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta agctcctgat ctatgctgca 540
tcccggttgc aaagtggggt cccatcaagg ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc 600
actctcacca tcagcagtct gcaacctgaa gattttgcaa cttactactg tcaacagact 660
tctcatcctc ctctgacgtt cggccaaggg accaaggtgg aaatcaaacg g 711
<210> 3
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggccaccg acatccagat gacccaaagc ccgagcagcc tgagcgcgag cgtgggtgac 60
cgtgttacca ttacctgccg tgcgagccag agcatcagca gctacctgaa ctggtatcag 120
caaaagccgg gtaaagcgcc gaagctgctg atttacgcgg cgagccgtct gcaaagcggc 180
gtgccgagcc gtttcagcgg tagcggtagc ggtaccgatt ttaccctgac catcagcagc 240
ctgcagccgg aggacttcgc gacctactat tgccagcaaa ccagccaccc gccgctgacc 300
tttggccaag gtaccaaggt tgaaattaaa cgttctagcg gtggcggtgg cagcggtggc 360
ggtggcagcg gtggcggtgg cagcaccgat attcaaatga cccagtctcc ttcttcttta 420
tctgcgagcg tgggtgaccg tgtaaccatc acctgccgcg cgagccaaag cattagcagc 480
tatctgaatt ggtatcagca aaaaccgggc aaggcgccga aactgctgat ctatgcggcg 540
agccgtctgc agagcggcgt gccgagccgc tttagcggca gcggcagcgg caccgacttc 600
accctgacca ttagcagcct gcaaccggaa gactttgcga cctactattg ccaacagacc 660
agccatccgc cgctgacctt cggccagggc accaaagtgg aaatcaaacg c 711
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg
1 5
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 7
<211> 109
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Ser His Pro Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105

Claims (7)

1.一种人源分子改造杀虫蛋白，其特征在于，所述人源分子改造杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种杀虫剂，其特征在于，包括权利要求1所述的人源分子改造杀虫蛋白。
3.一种编码人源分子改造杀虫蛋白的基因，其特征在于，所述基因是(a)或(b)所示的基因：
(a)是SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的基因；
(b)在(a)限定的核苷酸序列基础上经密码子优化得到的基因；所述(b)是SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的基因。
4.一种含有权利要求3所述基因的重组载体。
5.权利要求1所述人源分子改造杀虫蛋白、权利要求2所述杀虫剂、权利要求3所述基因或权利要求4所述重组载体在农作物害虫防治方面的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述害虫是小菜蛾。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述农作物是十字花科农作物。
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