ES2336051T3 - Metodos y composiciones para el tratamiento de la glomerulonefritis. - Google Patents

Abstract

SE MUESTRA EL USO DE ANTICUERPOS ANTI-C5, P.E., ANTICUERPOS MONOCLONALES, PARA TRATAR LA GLOMERULONEFRITIS (GN). LA ADMINISTRACION DE DICHOS ANTICUERPOS A NIVELES DE DOSIFICACION BAJOS HA MOSTRADO REDUCIR SIGNIFICATIVAMENTE LA INFLAMACION /ALARGAMIENTO Y OTRAS CONDICIONES PATOLOGICAS ASOCIADAS CON LA GN. TAMBIEN SE MUESTRAN NUEVOS ANTICUERPOS ANTI-C5 Y MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO CODIFICADORAS DE ANTICUERPOS ANTI-C5. ESTOS ANTICUERPOS SON UTILES PARA EL TRATAMIENTO DE GN Y DE OTRAS AFECCIONES INFLAMATORIAS QUE SUPONEN LA ACTIVACION PATOLOGICA DEL SISTEMA DEL COMPLEMENTO.

Description

Métodos y composiciones para el tratamiento de la glomerulonefritis.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al tratamiento de la glomerulonefritis (GN), y más en general a tratamientos terapéuticos que implican la inhibición farmacológica del sistema del complemento de un paciente. En particular, la invención se refiere al uso de anticuerpos específicos del componente del complemento humano C5 para llevar a cabo dicho tratamiento terapéutico. También se describen en el presente documento composiciones que comprenden anticuerpos monoclonales (mAb) nativos específicos del componente del complemento humano C5 que bloquean la actividad hemolítica del complemento y la generación de C5a, en concentraciones que alcanzan sustancialmente el límite estequiométrico teórico de 1 a 2 de anticuerpo a antígeno que puede alcanzar un anticuerpo bivalente. Además se describen mAb recombinantes que derivan (incluyendo derivados monovalentes) de estos mAb nativos que proporcionan sustancialmente las mismas actividades de bloqueo que los mAb.

Antecedentes de la invención I. Enfermedad mediada por complejo inmune

La formación de los complejos inmunes es la consecuencia típica de la interacción de antígenos con anticuerpos específicos. La respuesta inflamatoria que sucede cuando se acumulan dichos complejos en una zona delimitada, es un elemento importante de las defensas del huésped, que conduce a la eliminación del complejo inmune y a la destrucción del antígeno por células fagocíticas. En contraste, las enfermedades por complejo inmune son reflejo de exceso de formación o eliminación retardada del complejo, normalmente en condiciones de estimulación del antígeno excepcionales o desregulación inmunológica. En dichas circunstancias, los complejos inmunes se depositan o se forman en sitios de tejidos específicos y las respuestas inflamatorias resultantes conducen a estados patológicos debidos a daño tisular localizado o sistémico. El riñón, y más específicamente la estructura del riñón conocida como glomérulo, es un sitio particularmente importante de depósito del complejo inmune que produce el desarrollo de afecciones patológicas graves.

Estudios en seres humanos y estudios usando modelos animales de enfermedades humanas, han implicado al sistema del complemento en las patologías asociadas con una serie de trastornos asociados con el complejo inmune. La activación del complemento que media la patología asociada con estos trastornos puede ser una consecuencia de un mecanismo autoinmune, o puede ser de origen no inmunológico.

La respuesta de hipersensibilidad que ocurre cuando los anticuerpos se unen a los antígenos en tejidos o en la circulación, da como resultado la activación del complemento y la liberación de moléculas que median la inflamación. Este procedimiento se clasifica como mediado por la unión del anticuerpo a antígenos fijos unidos a célula o tejido (hipersensibilidad de tipo II) o a antígenos circulantes, que da como resultado la formación de complejos inmunes circulantes y su posterior deposición patógena en tejidos (hipersensibilidad de tipo III).

La hipersensibilidad de tipo II es mediada por la activación del complemento después de la unión de los anticuerpos a antígenos fijos de tejido. La respuesta inflamatoria que sucede resulta de la activación de los componentes proinflamatorios y líticos del sistema del complemento y el posterior reclutamiento de leucocitos estimulados en los sitios de formación de complejo inmune. La creciente permeabilidad vascular que resulta de las actividades anafilatóxicas de C3a y C5a potencia más la deposición de complejo inmune y el reclutamiento de leucocitos.

El entrecruzamiento de células o tejidos unidos a anticuerpo con células efectoras tales como neutrófilos, plaquetas, células NK y monocitos, por sus receptores Fc también tiene una función proinflamatoria. Dicho entrecruzamiento activa las células efectoras, estimulando la liberación de radicales de oxígeno, prostaglandinas y leucotrienos, cuya liberación es potenciada más por las acciones de los componentes del complemento activados.

Los ejemplos de afecciones mediadas por hipersensibilidad de tipo II incluyen el rechazo hiperagudo de órganos transplantados, estados hemolíticos y trombocitopénicos autoinmunes, síndrome de Goodpasture (y glomerulonefritos y hemorragia pulmonar asociados), miastenia grave, secuelas patológicas asociadas con la diabetes mellitus dependientes de insulina y pénfigo vulgar.

Las reacciones de hipersensibilidad de tipo III que implican antígenos circulantes también pueden producir el desarrollo de numerosas afecciones patológicas. Estas incluyen glomerulonefritis (discutida con detalle más adelante), vasculitis (una afección inflamatoria potencialmente mortal de los vasos sanguíneos grandes y/o pequeños), artritis reumatoide, dermatitis y otros trastornos.

Otras enfermedades asociadas con las reacciones de hipersensibilidad de tipo III incluyen las enfermedades autoinmunes tales como el lupus eritematoso sistémico (LES), muchas enfermedades infecciosas, enfermedades neoplásicas, y una gran variedad de otras afecciones (Dixon, y col. Immune Complex Injury. in Samter, (ed.) Immunological Diseases, 4ª ed. Little Brown & Co. Boston, 1987).

II. Glomerulonefritis

El glomérulo es un elemento estructural y funcional clave del riñón. Cada glomérulo es parte de una estructura mayor que sirve como unidad funcional principal del riñón y se llama nefrona. Hay aproximadamente un millón de nefronas en cada riñón. Cada glomérulo es una red de hasta 50 capilares paralelos encerrados en una estructura conocida como la cápsula de Bowman. La zona dentro de la cápsula de Bowman que no está ocupada por los capilares glomerulares se conoce como espacio de Bowman. El glomérulo funciona como un filtro, que separa el agua y determinados solutos de las proteínas y células de la sangre en el espacio de Bowman para el posterior procesamiento en los túbulos enrollados, asa de Henle y conducto colector de la nefrona.

La glomerulonefritis (GN) es una enfermedad del riñón caracterizada por la inflamación y el agrandamiento resultante de los glomérulos, que se debe típicamente a la formación de complejos inmunes. La acumulación de complejos inmunes en los glomérulos da como resultado las respuestas inflamatorias que implican, entre otros, hipercelularidad, que pueden causar el bloqueo parcial o total de los glomérulos, entre otros factores, por el estrechamiento de los lúmenes de los capilares. Un resultado de este proceso es la inhibición de la función de filtración normal de los glomérulos. El bloqueo se puede producir en gran número de glomérulos, comprometiendo directamente la función del riñón y causando a menudo la deposición anormal de proteínas en las paredes de los capilares que integran los capilares. Dicha deposición a su vez puede producir daño en las membranas basales glomerulares. Los glomérulos que no son bloqueados desarrollan mayor permeabilidad, permitiendo que grandes cantidades de proteínas pasen a la orina, una afección denominada proteinuria.

En muchos casos de GN grave, se forman en el espacio de Bowman estructuras patológicas llamadas semilunas, que impiden más la filtración glomerular. Estas estructuras también pueden verse mediante examen con microscopio de muestras de tejidos obtenidas por biopsia o necropsia, y por lo tanto no siempre se observan en los pacientes en los que ocurren. Las semilunas son una manifestación de hipercelularidad y se cree que surgen de la proliferación extensiva anormal de células epiteliales parietales, las células que forman el revestimiento interior de la cápsula de Bowman. La investigación clínica ha mostrado que hay una grosera correlación entre el porcentaje de glomérulos con semilunas y la gravedad clínica de la enfermedad, y por lo tanto la prognosis del paciente. Cuando están presentes en un gran número, las semilunas son una señal mala de pronóstico.

Los síntomas de la GN incluyen: proteinuria; velocidad de filtración glomerular (GFR) reducida; cambios electrolíticos en el suero incluyendo azotemia (uremia, nitrógeno de urea en la sangre excesivo - BUN) y retención de sales, conduciendo a la retención de agua que da como resultado la hipertensión y el edema; hematuria y sedimentos urinarios anormales incluyendo cilindros de eritrocitos; hipoalbuminemia; hiperlipidemia; y lipiduria.

En 1990, alrededor de 210.000 pacientes en Estados Unidos necesitaron hemodiálisis o transplante por insuficiencia renal crónica, con un coste anual de más de 7 mil millones de dólares, según el Sistema de datos renales de Estados Unidos (USRDS). El USRDS recopila datos sobre la enfermedad renal en Estados Unidos junto con el Instituto Nacional de la Diabetes y Enfermedades Renales y del Sistema Digestivo, División de enfermedades del riñón, urológicas y hematológicas del Instituto Nacional de Salud (NIDKKD). El USRDS calcula que los costes del tratamiento de la insuficiencia renal están aumentando en 20 por ciento cada año.

La GN es la tercera causa de muerte en los pacientes de enfermedad renal en estado terminal, superada solo por la diabetes y la hipertensión. Como resultado, existe una necesidad clara y desde hace tiempo en la comunidad médica, de tratamientos eficaces para esta afección. En todo el mundo se están llevando a cabo investigaciones dirigidas al desarrollo de nuevos tratamientos para la GN. En Estados Unidos, el NIDDKD, la Fundación Renal Nacional y otras organizaciones públicas y privadas patrocinan la investigación en este área. Solo la Fundación Renal Nacional suministra alrededor de 2 millones de dólares anuales para financiar los esfuerzos de los investigadores
del riñón.

III. Tratamientos actuales para la GN

La administración de corticosteroides, normalmente como terapia de dosis altas de metilprednisolona intravenosa en "pulsos" o de prednisona oral, actualmente se considera el agente farmacológico más eficaz disponible para el tratamiento de la GN. Dicha terapia de esteroides a menudo se administra en combinación con agentes inmunosupresores generales citotóxicos tales como azatioprina o ciclofosfamida. La inmunosupresión general y la mayor susceptibilidad a la infección resultante, junto con otros efectos secundarios debilitantes asociados con la administración tanto de esteroides como de fármacos citotóxicos, limita el uso eficaz de estos fármacos.

Los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) de tipo aspirina también se han usado para reducir la inflamación glomerular y la extensión de la GN. Sin embargo, estos fármacos no se usan de forma rutinaria para este propósito, probablemente debido a sus efectos antiinflamatorios relativamente débiles y a la propensión a causar efectos secundarios gastrointestinales y de otro tipo en muchos pacientes.

Se ha usado la administración de anticoagulantes tales como heparina o warfarina sódica, y de agentes antitrombóticos tales como ciproheptadina, dipiridamol o sulfinpirazona, basándose en las pruebas que sugieren la implicación del proceso de coagulación en la génesis de las semilunas glomerulares. Sin embargo, las pruebas objetivas del beneficio de dichas terapias en animales aquejados de GN semilunar inducida experimentalmente, no han sido consistentes. Los anticoagulantes también son fármacos peligrosos, ya que pueden potenciar episodios de hemorragia potencialmente mortales. En este aspecto son especialmente peligrosos en pacientes con insuficiencia renal avanzada.

Además de las estrategias farmacológicas, el intercambio intensivo de plasma (plasmaféresis) de 2 a 4 litros de plasma diarios (o en algunos casos tres veces a la semana) puede reducir notablemente los niveles altos de complejos inmunes circulantes cuando es necesaria la intervención aguda en el proceso inflamatorio. Dicho tratamiento es caro y requiere que el paciente esté conectado a la máquina de plasmaféresis durante muchas horas a la semana. Además, todos los procedimientos en los que se saca sangre y se devuelve a un paciente, están asociados con un mayor riesgo de infección. No obstante, actualmente se considera que el intercambio de plasma es el tratamiento no farmacológico más eficaz para eliminar los complejos inmunes circulantes que pueden causar GN.

Los niveles de complejos inmunes circulantes también se pueden disminuir eliminando o reduciendo la fuente del antígeno o antígenos contenidos en los complejos, por ejemplo, mediante terapia eficaz de una infección subyacente o cambio en un antibiótico. Sin embargo, aunque dicha terapia es casi siempre un tratamiento de elección, se debe tener mucho cuidado puesto que la reducción de la carga de antígeno altera la relación molar de antígeno a anticuerpo implicada en la formación de los complejos inmunes, y por lo tanto se puede producir una exacerbación temporal peligrosa del proceso inflamatorio (véase la siguiente discusión en Antecedentes de fisiología y patología).

IV. Ingeniería de anticuerpos

Los anticuerpos nativos son moléculas de proteína animales con múltiples subunidades con propiedades de unión al antígeno muy específicas. Los animales producen múltiples clases de anticuerpos. Hay 5 clases principales (IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) y una variedad de subclases. Los anticuerpos nativos están compuestos de dos o más subunidades heterodímeras que contiene cada una, una cadena pesada (H) y una ligera (L). Las diferencias entre las clases de anticuerpos vienen de sus cadenas H diferentes. Las cadenas H tienen un peso molecular de aproximadamente 53 kDa, mientras que las cadenas L tienen aproximadamente 23 kDa de masa.

Cada anticuerpo nativo individual tiene un tipo de cadena L y un tipo de cadena H, que están unidas entre sí por enlaces disulfuro para formar una subunidad heterodímera. Típicamente un anticuerpo nativo (p. ej., una IgG) tiene 2 de dichas subunidades, que también se mantienen unidas entre sí por enlaces disulfuro. Dentro de cada cadena, unidades de aproximadamente 110 restos de aminoácidos se pliegan para formar dominios compactos. Cada dominio se mantiene unido mediante un solo enlace disulfuro dentro de la cadena. Las cadenas L tienen dos dominios, mientras que las cadenas H tienen 4 ó 5. La mayoría de las cadenas H tienen una región bisagra después de los dos primeros dominios (es decir, la mayoría situados en el extremo amino). Los enlaces disulfuro que mantienen unidas entre sí las subunidades heterodímeras están situados en las regiones bisagra. La región bisagra es particularmente sensible a la escisión proteolítica, dando dicha proteolisis 2 ó 3 fragmentos (dependiendo del sitio preciso de escisión), un fragmento de no unión al antígeno que contiene solo regiones C de la cadena H (Fc) y un fragmento bivalente (Fab'2) o dos monovalentes (Fab) de unión al antígeno. La región bisagra permite que las regiones de unión al antígeno (cada una compuesta de una cadena ligera y los dos primeros dominios de una cadena pesada) se muevan libremente con respecto al resto del anticuerpo nativo, que incluye el resto de los dominios de la cadena pesada.

El primer dominio de cada cadena es muy variable en la secuencia de aminoácidos, proporcionando un amplio espectro de especificidades de unión del anticuerpo encontrados en cada individuo. Estos se conocen como los dominios pesado variable (VH) y ligero variable (VL). El segundo y subsiguientes dominios (si los hay) de cada cadena son relativamente invariantes en la secuencia de aminoácidos. Se conocen como los dominios pesado constante (CH) y ligero constante (CL).

Cada región variable contiene 3 bucles de secuencia hipervariable que proporcionan una estructura complementaria a la del antígeno y son críticos para determinan la especificidad de unión al antígeno del anticuerpo, puesto que son los sitios de contacto para la unión al antígeno. Estos bucles se conocen como regiones determinantes de la complementaridad o CDR. Cada dominio variable está compuesto de 3 CDR insertadas en 4 segmentos de región armazón (FR) mucho menos variables. Juntos, el conjunto de CDR y FR alineados son en gran parte responsables de determinar la conformación tridimensional de las regiones variables de las moléculas de anticuerpo.

Las CDR y FR son características que se han deducido de las propiedades estructurales de las regiones variables del anticuerpo. Diferentes investigadores han usado tanto la secuencia de aminoácidos (estructura primaria) como el modelado tridimensional (estructura secundaria y terciaria deducidas) de las regiones variables de los anticuerpos para definir las CDR y, por defecto, las FR. Aunque las posiciones de las CDR no están en discusión, no todos los expertos en la materia están de acuerdo con las localizaciones precisas de los límites de cada CDR en las regiones VH o VL; no hay un marcador estructural de corte claro que delinee los límites de las CDR/FR.

Actualmente en la materia se usan 2 definiciones de localización de CDR. Estas son la definición de "variabilidad de secuencia" de Kabat y col. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", 4ª ed. Washington, D.C.: Public Health Service, N.I.H.) y la definición de "variabilidad estructural" de Chothia y Lesk (J. Mol. Biol. 1987, 196:901). Tal como se usa en el presente documento, los términos VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, y VH CDR3 se refieren como mínimo a la región de superposición entre las regiones designadas para cada CDR por cada una de estas dos definiciones, y como máximo a la región total que abarca la combinación de las regiones designadas para cada CDR por cada una de estas dos definiciones.

Un problema que pretende abordar la ingeniería de anticuerpos es la actividad inmunitaria de un paciente humano que se produce como respuesta a un anticuerpo murino nativo (u otro animal no humano), típicamente un mAb, que se administra al paciente con propósito terapéutico. Esta actividad contra los anticuerpos murinos se caracteriza por una respuesta de anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) que puede tener efectos perjudiciales en la eficacia del tratamiento y la salud del paciente. Se ha encontrado que casi toda la actividad de estos anticuerpos anti-no humano humanos ("tipo HAMA") se dirige a los dominios constantes y a las regiones FR de los dominios variables de los anticuerpos no humanos nativos.

Mediante manipulación de las moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas H y L del anticuerpo, se pueden incorporar regiones variables no humanas en anticuerpos por lo demás compuestos de regiones constantes humanas. Los anticuerpos resultantes se denominan "anticuerpos quiméricos", y típicamente son menos propensos a provocar respuestas de tipo HAMA que los anticuerpos no humanos de los cuales derivan las regiones variables.

Una estrategia todavía más eficaz para eliminar el potencial de un anticuerpo no humano para provocar una respuesta de tipo HAMA es "inmunizarlo", es decir, sustituir sus regiones armazón no humanas por unas humanas. Un modo de lograr dicha humanización implica la inserción de fragmentos polinucleótidos que codifican las CDR no humanas del anticuerpo que se va a humanizar, en una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo por lo demás humano (con regiones constantes humanas si se desea), para así sustituir las CDR humanas y usar la molécula de ácido nucleico resultante para expresar el anticuerpo "humanizado" codificado.

La solicitud de patente europea 92308680 describe anticuerpos humanizados contra glóbulos de grasa de leche humana. La solicitud internacional WO 93/13133 describe una inmunoglobulina humana que reacciona específicamente con la proteína PGIIb/IIIa y su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con trombos.

Sin embargo, desgraciadamente, la humanización de anticuerpos no humanos tiene efectos impredecibles en las interacciones de anticuerpo y antígeno, p. ej., las propiedades de unión al antígeno. Parte de esta impredecibilidad viene de las propiedades de las CDR. Algunas CDR son más sensibles a la construcción de anticuerpos humanizados que retienen las propiedades del anticuerpo donador de CDR no humano, que otras. Aunque las CDR son clave para las propiedades de unión al antígeno de un anticuerpo, las CDR y FR deben interaccionar de forma adecuada si se va a retener la especificidad del antígeno de un anticuerpo después de humanización. Los efectos de la combinación con FR humanas particulares en CDR no humanas no caracterizadas, no se pueden predecir de forma fiable por ningún método conocido. Sin embargo, la humanización satisfactoria de un anticuerpo proporciona información que, en general, facilita la humanización satisfactoria de las CDR de este anticuerpo usando otras FR humanas o humanas alteradas. Además, están disponibles procedimientos que facilitan el diseño de FR humanas para potenciar la probabilidad de humanización satisfactoria.

Otro problema que aborda la ingeniería de anticuerpos incluye la producción eficaz de anticuerpos y la alteración de la farmacocinética del anticuerpo. La producción de proteínas recombinantes en general es más eficaz cuando se lleva a cabo en huéspedes bacterianos. El gran tamaño y la naturaleza multimérica de los anticuerpos nativos hace que su producción en bacterias sea difícil. Una estrategia para tratar los problemas de producción es usar métodos de ADN recombinante para construir anticuerpos que tienen sus cadenas H y L unidas por un péptido conector para formar un anticuerpo monocatenario (sc). Como se describe a continuación, hay varios tipos de anticuerpos sc que se pueden construir.

Como en el caso de la humanización, los efectos en las propiedades de unión al antígeno de la construcción de un tipo particular de anticuerpos sc usando cadenas H y L que no se han caracterizado con respecto a su capacidad de funcionar como parte de un anticuerpo sc, no se pueden predecir de forma fiable por ningún método conocido. Sin embargo, la construcción satisfactoria de cualquier tipo de anticuerpo sc a partir de un anticuerpo nativo particular proporciona información que, en general, facilita la construcción satisfactoria de otros tipos de anticuerpos sc a partir del anticuerpo nativo.

Los anticuerpos monocatenarios pueden incluir solo uno de cada uno de los dominios VH y VL, en cuyo caso se denominan anticuerpos scFv; pueden incluir solo uno de cada uno de los dominio VH, VL, CH y CL, en cuyo caso se denominan anticuerpos scFab; o pueden contener todas las regiones variables y constantes de un anticuerpo nativo, en cuyo caso se denominan anticuerpos sc de longitud completa.

Los diferentes tamaños de estos anticuerpos imparten a cada uno diferentes propiedades farmacocinéticas. En general, las proteínas más pequeñas son eliminadas de la circulación más rápidamente que las proteínas más grandes de la misma composición general. Por lo tanto, los anticuerpos sc de longitud completa y los anticuerpos nativos, en general, tienen la duración de la acción más larga, los anticuerpos scFab tienen duraciones de la acción más cortas, y los anticuerpos scFv tienen duraciones de la acción incluso más cortas. Por supuesto, dependiendo de la enfermedad que se va a tratar, se pueden desear agentes terapéuticos de acción más prolongada o más corta. Por ejemplo, los agentes terapéuticos para usar en la prevención de trastornos inmunitarios y hemostáticos asociados con procedimientos de circulación extracorpórea (que normalmente son de duración breve) preferiblemente son de actuación corta, mientras que los anticuerpos para el tratamiento de afecciones crónicas de larga duración (tales como enfermedad articular inflamatoria o GN) son preferiblemente de actuación relativamente larga.

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Se pueden encontrar discusiones detalladas de la ingeniería de anticuerpos en numerosas publicaciones recientes, que incluyen: Borrebaek, "Antibody Engineering, A Practical Guide", 1592, W.H. Freeman and Co. NY; y Borrebaek, "Antibody Engineering", 2ª ed. 1995, Oxford University Press, NY, Oxford.

Resumen de la invención

En vista de lo anterior, un objetivo de la presente invención es proporcionar una nueva estrategia para reducir la inflamación glomerular y la disfunción renal asociada con la GN.

La invención implica el uso de preparaciones que contienen anticuerpos contra el componente del complemento C5 humano, como se caracteriza en las reivindicaciones, como agentes farmacéuticos. Más en particular, la invención proporciona el uso de anticuerpos anti-C5 que se unen al componente del complemento C5 o a fragmentos activos del mismo. Preferiblemente, los anticuerpos bloquean la generación y/o actividad de los componentes del complemento C5a y C5b. Para la mayoría de las aplicaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En las realizaciones preferidas de la invención, la administración de la preparación de anticuerpo anti-C5 se inicia después de la aparición de síntomas de GN, por ejemplo, después de la aparición de proteinuria. Alternativamente, la invención se puede usar de forma profiláctica para tratar pacientes que tienen riesgo de una exacerbación aguda de la GN existente, p. ej., paciente que experimentan un empeoramiento de los síntomas del lupus eritematoso sistémico o enfermedades autoinmunes similares que han dado como resultado GN.

Como se muestra en los ejemplos presentados más adelante, los anticuerpos anti-C5 administrados después de la aparición de la GN eliminan esencialmente la inflamación/agrandamiento glomerular y reducen la disfunción renal (véanse los ejemplos 1 y 2).

Sin querer ligarse por ninguna teoría particular de funcionamiento, se cree que los anticuerpos anti-C5 tienen estos y otros efectos terapéuticos por su actividad en el bloqueo de la generación o actividad de fragmentos activos C5a y/o C5b del componente del complemento C5. Mediante este efecto de bloqueo, los anticuerpos inhiben los efectos proinflamatorios (anafilatóxicos) de C5a y la generación del complejo de ataque a la membrana (MAC) C5b-9. Es significativo que el bloqueo efectuado por los anticuerpos anti-C5, puesto que ocurre a nivel del componente del complemento C5, tiene la ventaja de mantener las importantes funciones opsónica, antiinfectiva y de eliminación de complejos inmunes del sistema del complemento, mediadas, entre otros, por el componente del complemento C3.

La invención proporciona además, composiciones que comprenden anticuerpos anti-C5, como los caracterizados en las reivindicaciones, que bloquean la actividad hemolítica del complemento y la generación de C5a. Estos anticuerpos son útiles para el tratamiento de la GN así como una serie de afecciones distintas. Estas incluyen el tratamiento de disfunciones inmunes y hemostáticas asociadas con la circulación extracorpórea (véase la patente de EE.UU. 5.853.722), tratamiento de enfermedades articulares inflamatorias (véase la patente de EE.UU. 7.279.158), y otras afecciones asociadas con el complemento, en particular enfermedades inflamatorias.

Aunque se pueden usar otros anticuerpos para tratar la GN de acuerdo con la presente invención, se prefieren los anticuerpos nuevos de la invención. Estos anticuerpos nuevos se unen a la cadena alfa de C5, pero no presentan unión sustancial al producto de escisión de la cadena alfa C5a (denominado en lo sucesivo y en las reivindicaciones "C5a libre"). Otros objetivos para la unión del anticuerpo descrito en el presente documento, incluyen los fragmentos de la cadena alfa de C5 humano que son inmunorreactivos con el anticuerpo más preferido de la invención, el anticuerpo 5G1.1 que se discute más adelante. Dichos objetivos incluyen el fragmento de hidrólisis ácida de C5 de 46 kDa (el fragmento "5G46k"), el fragmento de digestión tríptica de C5 de 27 kDa (el fragmento "5G27k"), el péptido de 325aa que abarca los restos de aminoácidos 725-1049 del SEQ ID NO: 2 (el péptido "5G325aa"), el péptido de 200 aminoácidos que abarca los restos de aminoácidos 850 a 1049 del SEQ ID NO: 2 (el péptido "5G200aa"), como se discute más adelante en el ejemplo 13.

Los nuevos anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos que se unen a un epítopo en la secuencia de aminoácidos Val Ile Asp His Gln Gly Thr Lys Ser Ser Lys Cys Val Arg Gln Lys Val Glu Gly Ser Ser, (SEQ ID NO:1) denominado en lo sucesivo epítopo KSSKC. Estos nuevos anticuerpos que se unen al epítopo KSSKC se denominan en lo sucesivo anticuerpos anti-KSSKC, y los anticuerpos monoclonales que se unen al epítopo KSSKC se denominan en lo sucesivo mAb anti-KSSKC.

Los nuevos anticuerpos de la invención tienen muchas ventajas frente a otros anticuerpos anti-C5, en particular con respecto a su uso como agentes terapéuticos antiinflamatorios. Estas incluyen la capacidad de bloquear sustancialmente tanto la actividad hemolítica del complemento como la generación del producto de escisión del complemento proinflamatorio C5a sustancialmente en la misma medida que la misma medida con la misma concentración de anticuerpo. Algunos de los anticuerpos preferidos de la invención tienen la propiedad ventajosa adicional de bloquear la unión de C5 a C3 o C4.

Los anticuerpos particularmente preferidos de la invención son anticuerpos anti-KSSKC nativos monoespecíficos. El mAb anti-KSSKC nativo 5G1.1 tiene la ventaja distinta de bloquear sustancialmente tanto la actividad hemolítica del complemento como la generación de C5a en una relación estequiométrica de anticuerpo a C5 que se aproxima al limite de unión teórico de uno a dos (anticuerpo a antígeno) que puede lograr un anticuerpo bivalente. Esta es una propiedad conveniente porque permite que se logren efectos terapéuticos con dosis menores del anticuerpo de las que se necesitarían con otros anticuerpos similares que no pueden funcionar con dicha relación.

La invención proporciona además mAb recombinantes que derivan (incluyendo derivados monovalentes) de estos mAb nativos. Estos incluyen mAb recombinantes anti-KSSKC. Preferiblemente, los anticuerpos de la invención proporcionan un nivel de bloqueo tanto de la actividad hemolítica del complemento como de la generación de C5a (en una base por mol de sitio de unión) que se obtiene cuando la concentración de anticuerpo está en un orden de magnitud del de los mAb nativos. En particular, los mAb recombinantes anti-KSSKC preferidos proporcionan un nivel de dicho bloqueo cuando la concentración de anticuerpo no es más de 3 veces la de los mAb nativos de la invención.

La invención proporciona además secuencias de ácido nucleico de polinucleótidos que codifican dichos mAb anti-KSSKC recombinantes, así como secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por estas moléculas de ácido nucleico de la invención.

La invención proporciona además secuencias de CDR que son útiles en la construcción de anticuerpos humanizados de la invención, así como péptidos y oligopéptidos que son útiles en la preparación y caracterización de los anticuerpos de la invención.

Los anticuerpos anti-C5 de la invención tienen actividad en el bloqueo de la generación o actividad de los fragmentos activos C5a y/o C5b del componente del complemento C5. Mediante este efecto de bloqueo, los anticuerpos inhiben los efectos proinflamatorios (anafilatóxicos) de C5a y la generación del complejo de ataque a la membrana (MAC) C5b-9. Es significativo que el bloqueo efectuado por los anticuerpos anti-C5, puesto que ocurre a nivel del componente del complemento C5, tiene la ventaja de mantener las importantes funciones opsónica, antiinfectiva y de eliminación de complejos inmunes del sistema del complemento, mediadas, entre otros, por el componente del complemento C3.

Breve descripción de los dibujos

las fig. 1A, 1B y 1C son fotomicrografías de secciones teñidas con PAS de riñones de ratón. Fig. 1A - ratón no inducido y no tratado. Fig. 1B - ratón con GN inducida tratado con PBS (control). Fig. 1C - ratón con GN inducida tratado con anti-C5. El aumento para cada una es el mismo, aproximadamente 400x;

las figs. 2A, 2B y 2C son fotomicrografías de secciones teñidas inmunoflorescentes de riñones de ratón. Fig. 2A - ratón no inducido y no tratado. Fig. 2B - ratón con GN inducida tratado con PBS (control). Fig. 2C - ratón con GN inducida tratado con anti-C5. El aumento para cada una es el mismo, aproximadamente 200x;

la fig. 3 son los resultados de ensayos hemolíticos (lisis celular) de suero de animales con GN inducida tratados con anticuerpos anti-C5 en PBS ("Anti-C5") o PBS solo ("PBS control"). También se muestran los resultados de los ensayos realizados con suero normal;

la fig. 4 son los resultados de ensayos de C5b-9 soluble ("sC5b-9"). "ND" indica no determinado.

las figs. 5A, 5B y 5C son fotomicrografías de inmunofluorescencia de secciones de riñón teñidas para C3 de ratón. Fig. 5A - ratón no inducido y no tratado. Fig. 5B - ratón con GN inducida tratado con PBS (control). Fig. 5C - ratón con GN inducida tratado con anti-C5. El aumento para cada una es el mismo, aproximadamente 400x;

la fig. 6 son los resultados de los ensayos de C3a de muestras de sangre humana en circulación. "ND" indica no determinado;

las figs. 7A y 7B son análisis farmacocinéticos de la reducción de la capacidad de lisis celular de sangre de ratón (fig. 7A) o humana (fig. 7B) después de tratamiento con anticuerpos anti-C5. La tinción inmunofluorescente de las figuras 2 y 5 está limitada a la red capilar glomerular (cresta) y por lo tanto el agrandamiento del glomérulo visto en la figura 1B no es visible en las figuras 2B y 5B;

la fig. 8 es un análisis de Scatchard de la unión de 5G1.1 nativo a C5;

la fig. 9 es un análisis de Scatchard de la unión de N19/8 nativo a C5;

la fig. 10 es la generación de C3a en muestras de sangre humana en circulación en presencia de 5G1.1 nativo;

la fig. 11 es la generación de sC5b-9 en muestras de sangre humana en circulación en presencia de 5G1.1 nativo;

la fig. 12 es la actividad hemolítica del suero de muestras de sangre humana en circulación en presencia de 5G1.1 nativo;

la fig. 13 es la actividad hemolítica del suero en presencia de m5G1.1 scFv;

la fig. 14 es la generación de C5a en presencia de m5G1.1 scFv;

la fig. 15 es la generación de C3a en muestras de sangre humana en circulación en presencia de m5G1.1 scFv;

la fig. 16 es la actividad hemolítica del suero en muestras de sangre humana en circulación en presencia de m5G1.1 scFv;

la fig. 17 es la generación de sC5b-9 en muestras de sangre humana en circulación en presencia de m5G1.1 scFv;

la fig. 18 es la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 5G1.1. Se muestra en minúsculas la secuencia derivada del cebador oligonucleótido 5' usado para la amplificación por PCR de la región variable. Los aminoácidos se numeran de acuerdo con Kabat y col, véase antes. Los aminoácidos recuadrados corresponden a las secuencias de péptidos obtenidas de la cadena ligera de 5G1.1 maduro o de un péptido de endoproteinasa Lys C de 5G1.1. Los restos de la región determinante de la complementaridad (CDR) de acuerdo con la definición de variabilidad de secuencia y la definición de variabilidad estructural, están subrayados y sobrerrayados, respectivamente;

la fig. 19 es la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 5G1.1. La secuencia derivada del cebador oligonucleótido 5' usado para la amplificación por PCR de la región variable se muestra en minúsculas. Los aminoácidos se numeran usando el esquema de Kabat y col., véase antes, con +1 indicando el primer aminoácido de la región variable madura procesado. Los aminoácidos recuadrados corresponden a la secuencia peptídica obtenida de la cadena pesada de 5G1.1 después de tratamiento con piroglutamato aminopeptidasa. Los restos de la región determinante de la complementaridad (CDR) de acuerdo con la definición de variabilidad de secuencia o de acuerdo con la definición de variabilidad estructural, están subrayados y sobrerrayados, respectivamente.

Antecedentes de fisiología y patología I. Introducción

Como se ha descrito antes, la presente invención se refiere a tratamientos terapéuticos para la GN y a la inhibición del componente del complemento C5. Para proporcionar antecedentes para la descripción de las realizaciones preferidas y los ejemplos presentados más adelante, se tratarán primero las discusiones generales del brazo del complemento del sistema inmunitario, las características fisiopatológicas de la GN y los estudios previos de la función del complemento en la patogénesis de la GN.

Se pueden encontrar discusiones generales del sistema del complemento y la GN, por ejemplo, en Glassock y Brenner, 1994; Couser, 1993; Couser, 1992; Couser, y col., 1992; Rich, 1992; Glassock y Brenner, 1987; Robbins y Cotran, 1979; y Guyton, 1971.

II. El sistema del complemento

El sistema del complemento actúa junto con otros sistemas inmunológicos del cuerpo para la defensa contra la intrusión de patógenos celulares y víricos. Hay al menos 25 proteínas del complemento, que se encuentran como una colección compleja de proteínas del plasma y cofactores de membrana. Las proteínas del plasma componen aproximadamente 10% de las globulinas en el suero de los vertebrados. Los componentes del complemento logran sus funciones defensivas inmunitarias mediante la interacción en una serie de escisiones enzimáticas y sucesos de unión a membrana intrincados pero precisos. La cascada del complemento resultante conduce a la producción de productos con funciones opsónicas, inmunorreguladoras y líticas.

La cascada del complemento avanza por una ruta clásica o una ruta alternativa. Estas rutas comparten muchos componentes, y aunque difieren en sus etapas iniciales, convergen y comparten los mismos componentes del "complemento terminal" (C5 a C9) responsables de la activación y destrucción de las células diana. La secuencia de ADNc completa de la secuencia de ADNc de pro-C5 humana la describe Haviland y col. (The Journal of Immunology. 146 (1): 362-368, 1991).

La ruta del complemento clásica se inicia típicamente por reconocimiento del anticuerpo y unión a un sitio antigénico en una célula diana. La ruta alternativa normalmente es independiente del anticuerpo, y se pude iniciar por determinadas moléculas en superficies de patógenos. Ambas rutas convergen en el punto en el que el componente del complemento C3 es escindido por una proteasa activa (que es diferente en cada ruta) para dar C3a y C3b. Otras rutas que activan el ataque del complemento pueden actuar más tarde en la secuencia de sucesos que conduce a diferentes aspectos de la función el complemento.

C3a es una anafilatoxina (véase la discusión más adelante). C3a se une a células bacterianas y otras células, así como a determinados virus y complejos inmunitarios, y los marca para la eliminación de la circulación. (C3b en esta función es conoce como opsonina). La función opsónica de C3b se considera que es la acción antiinfectiva más importante del sistema del complemento. Los pacientes con lesiones genéticas que bloquean la función de C3b son propensos a infección por una amplia variedad de organismos patógenos, mientras que los pacientes con lesiones posteriores en la secuencia de la cascada del complemento, es decir, pacientes con lesiones que bloquean las funciones de C5, son más propensos sólo a la infección por Neisseria, y por lo tanto sólo algo más propensos (Fearon, in Intensive Review of Internal Medicine. 2ª Ed. Fanta and Minaker, eds. Brigham and Women's and Beth Israel Hospitals, 1983).

C3b también forma un complejo con otros componentes únicos para cada ruta para formar C5 convertasa clásica o alternativa, que escinde C5 en C5a y C5b. Por lo tanto, C3 se considera la proteína central en la secuencia de reacciones del complemento, puesto que es esencial tanto para la ruta alternativa como para la clásica (Wurzner, y col., Complement Inflamm. 8:328-340, 1991). Esta propiedad de C3b es regulada por la proteasa Factor I del suero, que actúa en C3b para producir iC3b. Aunque todavía es funcional como opsonina, iC3b no puede formar C5 convertasa activa.

C5 es una beta globulina de 190 kDa que se encuentra en el suero normal en aproximadamente 75 \mug/ml (0,4 \muM). C5 está glicosilado, con aproximadamente 1,5-3 por ciento de su masa atribuida a hidratos de carbono. C5 maduro es un heterodímero de una cadena alfa de 115 kDa de 999 aminoácidos, que está unida por disulfuro a una cadena beta de 75 kDa de 656 aminoácidos. C5 es sintetizado como un producto proteínico precursor de cadena sencilla de un gen de una sola copia (Haviland y col., J. Immunol. 1991, 146:362-368). La secuencia de ADNc del transcrito de este gen predice un precursor pro-C5 secretado de 1659 aminoácidos de longitud con una secuencia líder de 18 aminoácidos (SEQ ID NO: 2).

El precursor pro-C5 se escinde después del aminoácido 655 y 659, para dar la cadena beta como un fragmento amino terminal (restos de aminoácidos +1 a 655 del SEQ ID NO: 2) y la cadena alfa como un fragmento carboxilo terminal (restos de aminoácidos 660 a 1658 del SEQ ID NO: 2), con 4 aminoácidos (restos de aminoácidos 656-659 del SEQ ID NO: 2) suprimidos entre las dos.

C5a es escindido de la cadena alfa de C5 por la C5 convertasa alternativa o clásica como un fragmento amino terminal que comprende los 74 primeros aminoácidos de la cadena alfa (es decir, los restos de aminoácidos 660-773 del SEQ ID NO: 2). Aproximadamente 20 por ciento de la masa de 11 kDa de C5a se atribuye a hidratos de carbono. El sitio de escisión para la acción de la convertasa es en o inmediatamente adyacente al resto de aminoácido 733 del SEQ ID NO: 2. Un compuesto que se uniera a o adyacente a este sitio de escisión tendría el potencial para boquear el acceso de las enzimas C5 convertasa al sitio de escisión y de esta forma actuar como un inhibidor del complemento.

C5 también puede activarse de forma distinta a la actividad de la C5 convertasa. La digestión limitada por tripsina (Minta y Man, J. Immunol. 1977, 119:1597-1602; Wetsel y Kolb, J. Immunol. 1982, 128:2209-2216) y el tratamiento ácido (Yammamoto y Gewurz, J. Immunol. 1978, 120:2008; Damerau y col., Molec. Immunol. 1989, 26:1133-1142) también pueden escindir C5 y producir C5b activo.

C5a es otra anafilatoxina (véase la discusión más adelante). C5a se combina con C6, C7 y C8 para formar el complejo C5b-8 en la superficie de la célula diana. Tras la unión de varias moléculas C9, se forma el complejo de ataque a la membrana (MAC, C5b-9, complejo del complemento terminal - TCC). Cuando se inserta un número suficiente de MAC en las membranas de las células diana, las aberturas que crean (poros de MAC) median la lisis osmótica rápida de las células diana. Concentraciones inferiores no líticas de MAC pueden producir otros efectos. En particular, la inserción en la membrana de un número pequeño de complejos C5b-9 en las células endoteliales y las plaquetas puede producir la activación celular perjudicial. En algunos casos la activación puede preceder a la lisis celular.

Como se ha mencionado antes, C3a y C5a son anafilatoxinas. Estos componentes del complemento activados pueden provocar la desgranulación de células cebadas, que liberan histamina y otros mediadores de la inflamación, dando como resultado la contracción del músculo liso, mayor permeabilidad vascular, activación de leucocitos, y otros fenómenos inflamatorios incluyendo la proliferación celular que produce hipercelularidad. C5a también puede funcionar como un péptido quimiotáctico que sirve para atraer granulocitos proinflamatorios al sitio de activación del complemento.

III. Fisiopatología de la GN

Aunque la GN puede acompañar a una amplia variedad de procesos patológicos, en general, se encuentra más habitualmente en el curso de enfermedades infecciosas, en autoinmunidad y como consecuencia de terapia por algún otro proceso patológico. El mecanismo causante de la GN normalmente es el depósito de complejos inmunes circulantes en el riñón. Los factores implicados en la patogénesis de la GN incluyen el antígeno específico y el anticuerpo implicado y los procesos inflamatorios que ocurren como consecuencia de la deposición de complejos inmunes.

Antígenos implicados en la formación de complejos inmunes que causan la GN: Los antígenos implicados en el desarrollo de GN se pueden clasificar ampliamente como endógenos, infecciosos y iatrogénicos (los encontrados como consecuencia de la práctica médica). En muchos casos el antígeno específico es desconocido, aunque se puede identificar la clase general.

El ejemplo mejor conocido de formación de complejos inmunes endógenos son los complejos de ADN anti-ADN producidos en relación con el lupus eritematoso sistémico (lupus, LES). Otras fuentes importantes de antígenos endógenos incluyen tumores malignos en los que la formación del complejo inmune puede contribuir al desarrollo de síndromes paraneoplásicos.

Las infecciones por organismos de muchos tipos, en particular infecciones crónicas, también están asociadas con el desarrollo de complejos inmunes que pueden producir GN. Las infecciones bacterianas y fúngicas que producen dichos complejos incluyen la infección por determinadas cepas de estreptococos, pseudomonas, infección gonocócica diseminada, lepra lepromatosa, endocarditis bacteriana subaguda, aspergilosis broncopulmonar, sífilis secundaria e infecciones crónicas en pacientes con fibrosis quística.

Las enfermedades víricas en las que la deposición de complejos inmunes puede ser una característica destacable, incluyen la infección de la hepatitis B, dengue, mononucleosis infecciosa y panencefalitis esclerosante subaguda. La GN también es una característica destacable en muchas infestaciones parasitarias tales como la GN observada en niños con malaria cuartana, así como toxoplasmosis, tripanosomiasis y esquistosomiasis.

Los antígenos iatrogénicos constituyen una clase especial de antígenos exógenos. Estos incluyen los responsables del prototipo de enfermedad por complejos inmunes, enfermedad del suero, que sigue a la formación de complejos inmunes entre constituyentes del suero heterólogos y anticuerpos autólogos. La enfermedad del suero se ha observado con regularidad desde principios de este siglo cuando las enfermedades infecciosas se trataban con antisueros heterólogos.

Puede ocurrir una enfermedad iatrogénica esencialmente indistinguible de la enfermedad del suero clásica como consecuencia de una terapia con dosis alta de antibióticos. Las manifestaciones de tipo enfermedad del suero de las respuestas inmunitarias a estos fármacos incluyen la GN y reflejan el hecho de que determinados fármacos, en particular los antibióticos \beta-lactámicos y sulfonamidas, son haptenos eficaces que son capaces de inducir respuestas de anticuerpos tras la conjugación espontánea con proteínas autólogas.

Factores que afectan a la formación y deposición de complejos inmunes: Las características tanto del antígeno como del anticuerpo determinan la probabilidad de la formación de complejos inmunes patológicos y la posterior deposición en el riñón. Entre estas destacan las concentraciones absolutas de los reaccionantes y sus relaciones molares relativas.

La mayoría de los antígenos presentan múltiples epítopos y normalmente estimulan una respuesta de anticuerpo policlonal. Todas las moléculas de anticuerpos naturales son al menos bivalentes. Estas propiedades permiten la formación de un amplio entramado de antígenos-anticuerpos, cuyo tamaño está determinado en gran medida por la afinidad de los anticuerpos y la relación molar de antígeno a anticuerpo.

En general, las respuestas de anticuerpo empiezan en condiciones en las que el antígeno está presente en exceso respecto al anticuerpo, y esta relación relativa cambia cuando la respuesta de los anticuerpos aumenta de magnitud. Los complejos formados inicialmente normalmente son pequeños y presentan poca o no presentan actividad patógena. En contraste, a menudo se forman complejos muy grandes cuando la cantidad de antígeno se vuelve limitante, más adelante en el curso de una respuesta de anticuerpos en condiciones de exceso de anticuerpos. Debido a que estos complejos muy grandes son eliminados fácilmente por el sistema reticuloendotelial en el hígado, también son relativamente no patógenos.

La formación de complejos inmunes que pueden producir GN se cree que ocurre durante condiciones de un pequeño exceso de antígenos o cerca del punto de equivalencia de anticuerpo-antígeno, cuando la formación del entramado es máxima y el tamaño del entramado es grande, pero no muy grande.

Varios factores influyen en la velocidad y localización de la precipitación de los complejos inmunes. Las interacciones entre las regiones Fc de las moléculas de anticuerpo promueven la precipitación rápida de complejos inmunes. La función de las interacciones Fc-Fc en la precipitación de los complejos inmunes se ilustra mediante estudios de las propiedades de los fragmentos de anticuerpos F(ab')2, que no contienen regiones Fc. Aunque la valencia de los fragmentos F(ab')2 no difiere de la de la mayoría de las inmunoglobulinas enteras, los fragmentos de anticuerpo
F(ab')2 forman entramados más lentamente.

La carga del antígeno tiene una función en la determinación de la localización en tejidos de sitios de deposición de precipitados de complejos inmunes. Los complejos con una carga positiva sustancial son atraídos con preferencia a la carga negativa fuerte de las membranas basales, en particular en el glomérulo renal.

La presencia localizada de antígeno puede dar cuenta en gran parte para determinados casos de la deposición de complejos inmunes específica de órgano. Enfermedades tales como el síndrome de Goodpasture (una forma rara de GN) normalmente no se clasifican como enfermedades por complejos inmunes porque los complejos se forman in situ en el riñón en lugar de formarse en la circulación y después depositarse. Una vez que se han formado los complejos inmunes, se cree que el posterior proceso inflamatorio es esencialmente el mismo que el observado después de la deposición de los complejos preformados. Sin embargo, el diferente modo de deposición distingue este síndrome de la GN típica causada por complejos inmunes circulantes.

Las características del flujo sanguíneo y la estructura vascular también son importantes para determinar la localización de los depósitos de complejos inmunes. Entre estas la permeabilidad capilar es importante. Debido a que su endotelio capilar es fenestrado, los glomérulos renales son sitios preferenciales para la deposición de los complejos inmunes. Las variables hemodinámicas que potencian la localización de complejos inmunes incluyen la turbulencia de flujo y mayor presión sanguínea, ambas presentes en los glomérulos renales.

Complemento y receptores del complemento como reguladores de la deposición de complejos inmunes: Además de sus funciones proinflamatorias, los componentes del complemento también pueden inhibir la deposición de complejos inmunes y resolubilizar precipitados de complejos inmunes de los sitios de deposición. Además, se sabe que los receptores de eritrocitos para C3b, p. ej., CR1, son importantes para la eliminación reticuloendotelial de complejos inmunes circulantes opsonizados.

El análisis del patrón clínico de la enfermedad por complejos inmunes en pacientes con deficiencias de componentes del complemento particulares, proporciona información con respecto a la función normal de estos componentes en la prevención de la deposición de complejos. La incidencia de la enfermedad por complejos inmunes en pacientes con deficiencias en Clq, Clr, Cls, C4, C2 o C3 varía de 60 a 90 por ciento, presentando la mayoría de estos pacientes un síndrome de tipo lupus. La enfermedad por complejos inmunes se asocia raramente con deficiencias en componentes de la ruta alternativa o de actuación tardía.

La unión de los componentes del complemento a los complejos inmunes previene la formación de entramados de antígenos-anticuerpos grandes e inhibe la inmunoprecipitación. Este proceso requiere la activación por la ruta clásica; el suero que es deficiente en Clq, C4 o C2 no inhibe eficazmente la formación del entramado y precipitación de complejos. La dependencia de la ruta clásica puede reflejar la unión inicial de los componentes C1, que impiden las interacciones Fc-Fc entre moléculas de IgG que contribuyen a la inmunoprecipitación. A esto le sigue la unión covalente de C3b a los complejos, que después inhibe la inmunoprecipitación y conduce a la solubilización de complejos previamente depositados.

Los procesos de solubilización también dependen de la activación de los componentes de la ruta alternativa. Por consiguiente, mediante la promoción de la eliminación de los complejos inmunes y la inhibición de su deposición en los sitios de inflamación, los componentes del complemento y sus receptores sirven como reguladores negativos de las enfermedades por complejos inmunes que pueden retrasar el desarrollo de la enfermedad.

Debe indicarse que la presente invención implica el bloqueo de las actividades del componente del complemento C5. El objetivo de este componente no altera las funciones de los componentes del complemento tempranos, y por lo tanto no compromete los efectos reguladores negativos de la deposición de complejos inmunes de estos componentes tempranos.

Inflamación mediada por complejos inmunes: Los basófilos son importantes en el inicio de las respuestas inflamatorias mediadas por complejos inmunes, puesto que la permeabilidad capilar está notablemente aumentada por acción de aminas vasoactivas tales como la histamina y el factor activante de plaquetas, que son liberados por estas células. La permeabilidad vascular también es promovida por la agregación de plaquetas en los sitios de una lesión inflamatoria, con la liberación del factor activante de plaquetas y la formación de microtrombos.

La desgranulación de basófilos puede reflejar los efectos de los anticuerpos IgE, así como la elaboración de los componentes del complemento anafilatoxinas, C3a y C5a.

Además de basófilos y plaquetas, los efectores celulares primarios de la inflamación mediada por complejos inmunes son leucocitos polimorfonucleares, monocitos y macrófagos.

IV. Estudios previos de la función del complemento en la patogénesis de la GN

Se ha realizado un trabajo extenso en un intento de entender la posible función del complemento en el desarrollo de la GN. Este trabajo ha incluido estudios sobre la GN usando una serie de modelos animales, entre otros de Unanue, y col., (1964); Cochrane, y col., (1965); Kniker, y col., (1965); Salant, y col., (1980); Groggel, y col., (1983); Falk y Jennette (1986); Jennette, y col., (1987); Passwell, y col., (1988); Schrijver, y col., (1988); Baker, y col., (1989); Schrijver, y col., (1990); Couser, y col., (1991); y Couser, y col., (1992).

Estos estudios han mostrado que el complemento tiene una función en la patogénesis de la GN. Sin embargo, no han establecido funciones inequívocas específicas para los diferentes componentes del complemento. En particular, no se han establecido de forma inequívoca las funciones relativas de C3 y otras anafilatoxinas comparado con las funciones de los componentes del complemento terminales en la patogénesis de la GN. También, algunos investigadores han descrito que la disminución del complemento no disminuye la lesión glomerular. Véase Kniker y col.,
(1965).

El trabajo anterior incluye el de Falk y Jennette (1986), que describieron resultados de experimentos en los que se intentó inducir GN en ratones que tenían un defecto genético que producía una deficiencia en el componente del complemento C5. La publicación concluye que C5 o algunos componentes del complemento terminales que dependen de C5, tienen una función en la patogénesis de la GN.

Es de destacar que, con respecto a la presente invención, Falk y Jennette no describen o sugieren de ninguna forma que se puede usar un anticuerpo contra C5 para tratar la GN. Realmente, no sería intuitivo usar un anticuerpo para tratar una enfermedad que implica típicamente la formación y deposición de complejos inmunes de anticuerpo-antígeno circulantes. Claramente, la creación de más complejos inmunes circulantes parecería la última forma de resolver un problema que puede ser causado por complejos inmunes circulantes. No obstante, como se demuestra con los sorprendentes resultados presentados más adelante, se ha encontrado que los anticuerpos anti-C5 bloquean eficazmente la GN, a pesar de que la creación de complejos inmunes circulantes adicionales es inherente a su modo de acción.

Baker y col. (1989), Couser y col. (1991), y Couser y col. (1992) (en lo sucesivo denominado colectivamente el trabajo de "C6") discuten experimentos en los que se administraron a ratas niveles altos de una preparación de anticuerpo policlonal anti-C6, después de lo cual se formaron complejos inmunes in situ en los riñones de las ratas. Es de destacar que, en relación con la presente invención, la preparación de anticuerpo anti-C6 no se administró a animales con enfermedad renal preexistente, es decir, no se usó como un tratamiento terapéutico. Además, el protocolo experimental usado en los experimentos de C6 no implicaba complejos inmunes circulantes, si no que implicaba complejos formados in situ. Por consiguiente, los experimentos no describían o sugerían la estrategia que no es intuitiva de la presente invención, en la que se forman más complejos inmunes circulantes en el procedimiento de tratamiento de un estado patológico causado por complejos inmunes circulantes.

Además, las dosificaciones de anticuerpos anti-C6 usadas en el trabajo de C6 eran demasiado altas para uso médico práctico. Específicamente, estos anticuerpos se usaron con una dosificación de 1 g/kg, una dosificación que correspondería a 70 g de anticuerpo para un individuo de 70 kg. En contraste, los anticuerpos anti-C5 usados en la práctica de la presente invención, se usan en concentraciones de o inferiores a 0,1 g/kg, es decir, un factor de al menos 10 veces menor que el usado en el trabajo de C6. Realmente, como se muestra en los ejemplos presentados a continuación, se ha encontrado que dosificaciones de anticuerpos anti-C5 tan bajas como 0,03 g/kg, es decir 33 veces menores que las usadas en el trabajo de C6, alcanzan efectos terapéuticos de la invención en el tratamiento de la GN. Para un individuo de 70 kg, este nivel de anticuerpos corresponde a una dosis de solo 2,1 g.

Los nuevos anticuerpos anti-KSSKC de la invención permiten el uso de niveles de dosificación incluso menores para tratar la GN y otras afecciones inflamatorias. Basándose en su nivel de actividad en la sangre humana, se espera que proporcionen inhibición del complemento completa con dosificaciones inferiores a 0,005 g/kg, y que proporcionen inhibición del complemento terapéuticamente eficaz con dosificaciones inferiores a 0,003 g/kg. Esta dosificación de 3 mg/kg es una décima parte de la dosificación discutida más adelante en los ejemplos 4 y 5 para el mAb anti-C5 (específico de cadena beta) N19/8. Algunos de los mAb anti-KSSKC de longitud completa de la invención, proporcionarán beneficios terapéuticos incluso con dosificaciones inferiores a 0,0022 g/kg. Esta es la dosis mínima que proporciona la inhibición completa del complemento, calculada a partir de los datos obtenidos usando el mAb anti-KSSKC 5G1.1 en sangre humana en un circuito de CPB, como se discute más adelante en el ejemplo 9.

Por consiguiente, se prefieren dosificaciones menores de 0,005 g/kg, siendo más preferidas dosificaciones inferiores a 0,003 g/kg, y siendo particularmente preferidas dosificaciones inferiores a 0,0022 g/kg. Para un individuo de 70 kg, estos niveles de dosificación de anticuerpos corresponden a una dosis inferior a 0,35 g para la dosificación más alta de las dosificaciones preferidas, inferior a 0,21 g para la dosificación más preferida, y menor o igual a 0,15 g para la dosificación la más preferida.

Por supuesto, los niveles de dosificación de mAb monocatenarios y otros mAb recombinantes de la invención se pueden ajustar de acuerdo con su nivel de actividad (p. ej., su afinidad de unión, su capacidad para bloquear la activación de C5 y/o su capacidad para bloquear la actividad hemolítica del complemento), su valencia y su peso molecular. Por ejemplo, los mAb scFv anti-KSSKC humanizados del ejemplo 11, tienen aproximadamente 27 kDa, aproximadamente una sexta parte de la masa de 155 kDa de un anticuerpo IgG de longitud completa, nativo. Estos anticuerpos bloquean completamente la actividad hemolítica del complemento y la generación de C5a en una relación de 3:1, 6 veces mayor que para 5G1.1 nativo (pero solo 3 veces mayor cuando se mira en términos de número de sitios de unión de anticuerpo-antígeno).

Por lo tanto, el número de moléculas de cada uno de estos scFv necesario para igualar el efecto de una sola molécula de 5G1.1 nativa debe aumentarse en un factor de 6 para ajustarse a la relación en la que el bloqueo es completo. Puesto que la masa de estas moléculas es aproximadamente una sexta parte de la masa de 5G1.1 nativo, las dosificaciones de 1tos scFv son del mismo orden que las del mAb 5G1.1 nativo.

Además de bajar los niveles de dosificación, los anticuerpos anti-C5 usados en la práctica de la presente invención (es decir, para tratar la GN) logran importantes efectos terapéuticos no logrados con los anticuerpos anti-C6. Específicamente, los animales de control y de ensayo en el trabajo de C6 presentaban tanto hipercelularidad como estrechamiento de los lúmenes capilares. En contraste directo, no se observaron dicha hipercelularidad ni estrechamiento de los lúmenes capilares cuando los individuos enfermos se trataron con anticuerpos anti-C5 (véase la figura 1).

Además, los anticuerpos anti-C5 usados en la presente invención logran una reducción del agrandamiento glomerular, proporcionando así una demostración clara de los efectos antiinflamatorios inesperadamente potentes de los anticuerpos anti-C5 usados en la práctica de la invención. En ninguna parte del trabajo de C6 se describe o sugiere un potente efecto antiinflamatorio.

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V. Anticuerpos monoclonales anti-C5 que bloquean la actividad hemolítica del complemento y bloquean la generación de C5a

Los mAb anti-C5 que tienen una capacidad conveniente de bloquear la actividad hemolítica del complemento y bloquear la generación de C5a (y por lo tanto se usan en el tratamiento de la GN y otras afecciones inflamatorias de acuerdo con la presente invención) se conocen en la materia desde 1982 (Moongkarndi y col. Immunobiol. 1982, 162:397; Moongkarndi y col. Immunobiol. 1983, 165:323). Los anticuerpos conocidos en la materia que son inmunorreactivos con C5 o fragmentos de C5, incluyen anticuerpos contra la cadena beta de C5 (Moongkarndi y col. Immunobiol. 1982, 162:397; Moongkarndi y col. Immunobiol. 1983, 165:323; Wurzner y col. 1991, véase antes; Mollnes y col. Scand. J. Immunol. 1988, 28:307-312); C5a (véase por ejemplo, Ames y col., J. Immunol. 1994, 152:4572-4581, patente de EE.UU. nº 4.686.100, y publicación de patente europea nº 0411306); y anticuerpos contra C5 no humano (véase por ejemplo, Giclas y col., J. Immunol. Meth. 1987, 105:201-209). Es de destacar que ninguno de estos mAb anti-C5 tiene las propiedades de los nuevos mAb anti-C5 de la invención, es decir, ninguno de ellos se une a la cadena alfa de C5 si no al producto de escisión de C5, C5a, ninguno de ellos tiene la capacidad de bloquear sustancialmente tanto la actividad hemolítica del complemento como la generación de C5a sustancialmente en la misma medida a la misma concentración de anticuerpo. Hay que destacar que se ha preparado un derivado de scFv del anticuerpo N19/8 de Wurzner y col., 1991, véase antes, y que N19/8 scFv tiene 50% menos de actividad inhibidora hacia la generación de C5a que el anticuerpo nativo N19/8 (véase el ejemplo 15). Esto a diferencia de 5G1.1 scFv, que retiene sustancialmente toda la actividad inhibidora hacia la generación de C5a (véase el ejemplo 12).

Sin querer ligarse a ninguna teoría particular de funcionamiento, se cree que estas distinciones se deben a las características de unión específicas de los anticuerpos de la invención. Por consiguiente, se cree que los anticuerpos que no se unen a los sitios en la cadena alfa de C5, y los anticuerpos que se unen al producto de escisión de C5, C5a (C5a libre), carecen de la capacidad de bloquear sustancialmente tanto la actividad hemolítica del complemento como la generación de C5a, sustancialmente en la misma medida a la misma concentración del anticuerpo.

Descripción de las realizaciones preferidas

Como se ha discutido antes, la presente invención se refiere al uso de anticuerpos anti-C5 en el tratamiento de pacientes que padecen GN, y a anticuerpos específicos de C5 y preparaciones de anticuerpos, como los caracterizados en las reivindicaciones. Preferiblemente, y cuando se usan para tratar la GN, los anticuerpos anti-C5 se usan en una cantidad eficaz para reducir sustancialmente (p. ej., reducir en al menos aproximadamente 50%) la capacidad de lisis celular del complemento presente en la sangre del paciente (la "capacidad de lisis celular del complemento presente en la sangre del paciente" también se denomina en el presente documento la "actividad del complemento en el suero de la sangre del paciente"). La reducción de la capacidad de lisis celular del complemento presente en la sangre del paciente se puede medir por métodos conocidos en la materia como, por ejemplo, el método de hemólisis de eritrocitos de pollo, descrito más adelante en el apartado de "Ensayos de lisis celular".

Para lograr las reducciones deseadas, los anticuerpos anti-C5 se pueden administrar en una variedad de formas de dosificación unitaria. La dosis variará de acuerdo con el anticuerpo particular. Por ejemplo, diferentes anticuerpos pueden tener diferentes masas y/o afinidades, y por lo tanto requieren diferentes niveles de dosificación. Los anticuerpos preparados como fragmentos Fab' también requerirán dosificaciones diferentes a las de las inmunoglobulinas intactas equivalentes, ya que tienen una masa considerablemente menor que las inmunoglobulinas intactas, y por lo tanto requieren menores dosificaciones para alcanzar los mismos niveles molares en la sangre del paciente.

La dosis también variará dependiendo de la forma de administración, los síntomas particulares del paciente que se está tratando, la salud general, afección, tamaño y edad del paciente, y el criterio del médico que la prescribe. Los niveles de dosificación de los anticuerpos para sujetos humanos en general son entre aproximadamente 1 mg por kg y aproximadamente 100 mg por kg por paciente por tratamiento, y preferiblemente entre aproximadamente 5 mg por kg y aproximadamente 50 mg por kg por paciente por tratamiento. En términos de concentraciones en el plasma las concentraciones de anticuerpos están preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 25 \mug/ml a aproximadamente 500 \mug/ml.

Sujeto al criterio del médico, un tratamiento terapéutico típico incluye una serie de dosis, que normalmente se administrarán simultáneamente con el seguimiento de los criterios de valoración clínicos tales como los niveles de BUN, niveles de proteinuria, etc., con los niveles de dosificación ajustados según sea necesario para lograr el resultado clínico deseado. Alternativamente, los niveles de actividad del complemento del suero disponibles en la sangre del paciente se siguen usando las técnicas expuestas más adelante en el apartado de "Ensayos de lisis celular" para determinar si son necesarias dosis adicionales o niveles de dosis mayores o menores de los anticuerpos, administrándose dichas dosis según sean necesarias para mantener al menos aproximadamente una 50% de reducción, y preferiblemente aproximadamente un 95% o más de reducción de la actividad del complemento del suero. Por supuesto, se pueden usar otros protocolos si se desea, según determine el médico.

La administración de anticuerpos anti-C5 en general se llevará a cabo por una vía intravascular, p. ej., por infusión intravenosa por inyección. Si se desea se pueden usar otras vías de administración. Se encuentran formulaciones adecuadas para inyección en Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17ª ed. (1985). Dichas formulaciones pueden ser estériles y no pirógenas, y en general incluirán un vehículo farmacéuticamente eficaz, tal como disolución salina, disolución salina tamponada (p. ej., tamponada con fosfato), disolución de Hank, disolución de Ringer, dextrosa/disolución salina, disoluciones de glucosa, y similares. Las formulaciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, según sean necesarias, tales como agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, agentes bactericidas, conservantes, estabilizantes y similares.

Las formulaciones de la invención se pueden distribuir como artículos de fabricación que comprenden material de envasado y los anticuerpos anti-C5. Cuando se prepara para usar en el tratamiento de la GN, el material de envasado incluirá una etiqueta que indica que la formulación es para usar en el tratamiento de la enfermedad renal y puede referirse específicamente a nefritis o glomerulonefritis.

El anticuerpo anti-C5 es preferiblemente un anticuerpo monoclonal, aunque si se desea también se pueden usar anticuerpos policlonales producidos y seleccionados por técnicas convencionales. Como se discute más adelante, los anticuerpos anti-C5 deben ser eficaces en la reducción de la capacidad de lisis celular del complemento presente en la sangre humana. Como se discute también más adelante, esta propiedad de los anticuerpos se puede determinar por métodos conocidos en la materia, tales como, por ejemplo, el método de hemólisis de eritrocitos de pollo descrito más adelante en el apartado de "Ensayos de lisis celular".

Los anticuerpos anti-C5 usados en la práctica de la invención se unen a C5. Preferiblemente, los anticuerpos anti-C5 se usan para tratar la GN en una cantidad eficaz para reducir la actividad de la C5 convertasa en la sangre del paciente en al menos aproximadamente 50%.

En una realización particularmente preferida de la invención, los anticuerpos anti-C5 no son inmunorreactivos contra epítopos en la cadena beta, si no que son inmunorreactivos contra epítopos en la cadena alfa del componente del complemento C5 humano purificado. En esta realización, los anticuerpos también pueden bloquear la conversión de C5 en C5a y C5b por la C5 convertasa. Esta capacidad se puede medir usando las técnicas descritas por Wurzner y col., Complement Inflamm. 8:328-340, 1991. En un ejemplo especialmente preferido de esta realización, pueden proporcionar este bloqueo sustancialmente en las mismas concentraciones necesarias para bloquear la actividad hemolítica.

Dentro de la cadena alfa, los anticuerpos más preferidos se unen a una región amino terminal, sin embargo, no se unen a C5a libre. Los objetivos particularmente preferidos para estos anticuerpos en la cadena alfa incluyen el fragmento 5G46k, el fragmento 5G27k, el péptido 5G325aa, el péptido 5G200aa, o el epítopo KSSKC. El alcance de la invención también incluye el fragmento 5G46k, el fragmento 5G27k, el péptido 5G325aa, el péptido 5G200aa, o el epítopo KSSKC, que son útiles como inmunógenos y ligandos de selección para producir los anticuerpos de la invención.

Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales reactivos con el componente del complemento C5, se pueden obtener de acuerdo con las enseñanzas de Sims y col., patente de EE.UU. nº 5.135.916. Como se discute en la misma, los anticuerpos se preparan usando componentes purificados del complemento del complejo de ataque a la membrana como inmunógenos. De acuerdo con la presente invención, se usa preferiblemente como inmunógeno el componente del complemento C5 o C5b. De acuerdo con un aspecto particularmente preferido de la presente invención, el inmunógeno es la cadena alfa de C5. Dentro de la cadena alfa, los inmunógenos más preferidos incluyen el fragmento 5G46k, el fragmento 5G27k, el péptido 5G325aa o el péptido 5G200aa. Un inmunógeno menos preferido es el epítopo KSSKC.

De acuerdo con la invención, los anticuerpos de la invención comparten todos determinadas propiedades funcionales. Estas son la capacidad para inhibir sustancialmente la actividad hemolítica del complemento e inhibir sustancialmente la conversión de C5 para producir C5a. Preferiblemente, pero no necesariamente, proporcionan estas funciones cuando se usan en una relación molar de anticuerpo a antígeno (C5) de 3:1 o menor.

Un anticuerpo particularmente preferido de la invención es el anticuerpo 5G1.1 (5G1.1, producido por el hibridoma 5G1.1, designación en ATCC HB-11625). Otros anticuerpos particularmente preferidos de la presente invención comparten las propiedades funcionales requeridas discutidas en el apartado precedente y tienen cualquiera de las siguientes características:

(1) compiten con 5G1.1 por la unión a partes de C5 - la cadena alfa de C5, el fragmento 5G46k, el fragmento 5G27k, el péptido 5G325aa, el péptido 5G200aa o el péptido KSSKC - que son específicamente inmunorreactivos con 5G1.1; y

(2) se unen específicamente a la cadena alfa de C5, el fragmento 5G46k, el fragmento 5G27k, el péptido 5G325aa, el péptido 5G200aa, y/o el péptido KSSKC. Dicha unión específica y competición por la unión, se pueden determinar por diferentes métodos conocidos en la materia, incluyendo el método de resonancia de plasmón de superficie (Johne y col., J. Immunol. Meth. 1993, 160:191-198).

(3) bloquean la unión de C5 a C3 o C4 (que son componente de la C5 convertasa).

También de acuerdo con la invención, los anticuerpos preferiblemente deben prevenir la escisión de C5 para formar C5a y C5b, previniendo de esta forma la generación de actividad anafilatóxica asociada con C5a y previniendo la unión del complejo de ataque a la membrana asociado con C5b. En una realización particularmente preferida, estos anticuerpos anti-C5 no impartirán la función de opsonización asociada con la activación del componente del complemento C3 por una C3 convertasa. La actividad de C3 convertasa en el plasma se puede medir ensayando en el plasma la presencia de C3a como se describe más adelante en el apartado "Histología". Preferiblemente, el anticuerpo anti-C5 no produce esencialmente reducción en los niveles de C3a en el plasma.

Se pueden encontrar en numerosas publicaciones métodos generales para la inmunización de animales (en este caso con C5 o C5b u otro inmunógeno preferido), aislamiento de anticuerpos policlonales o células productoras de anticuerpos, fusión de dichas células con células inmortales (p. ej., células de mieloma) para generar hibridomas que segregan anticuerpos monoclonales, selección en los líquidos sobrenadantes de hibridomas de la reactividad de anticuerpos monoclonales secretados con un antígeno deseado (en este caso C5 o C5b u otro inmunógeno preferido), la preparación de cantidades de dichos anticuerpos en líquidos sobrenadantes de hibridomas o líquido ascítico, y la purificación y conservación y dichos anticuerpos monoclonales. Estas incluyen Coligan, y col., eds. Current Protocols In Immunology. John Wiley & Sons, New York, 1992; Harlow y Lane, Antibodies. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988; Liddell y Cryer, A Practical Guide To Monoclonal Antibodies. John Wiley & Sons, Chichester, West Sussex, England, 1991; Montz, y col., Cellular Immunol. 127:337-351, 1990; Wurzner, y col., Complement Inflamm. 8:328-340, 1991; y Mollnes, y col., Scand. J. Immunol. 28:307-312, 1988.

Tal como se usa en el presente documento, el término "anticuerpos" se refiere a inmunoglobulinas producidas in vivo, así como a las producidas in vitro por un hibridoma, y fragmentos de unión a antígeno (p. ej., preparaciones de Fab') de dichas inmunoglobulinas, así como a proteínas de unión a antígeno expresadas de forma recombinante, incluyendo inmunoglobulinas, inmunoglobulinas quiméricas, inmunoglobulinas "humanizadas", fragmentos de unión al antígeno de dichas inmunoglobulinas, anticuerpos monocatenarios, y otras proteínas recombinantes que contienen dominios de unión al antígeno derivadas de inmunoglobulinas. Tal como se usa en el presente documento, "anticuerpos" también se refiere a péptidos sintéticos de unión al antígeno, que comprenden secuencias derivadas de las secuencias de los dominios de unión al antígeno de las inmunoglobulinas. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "mAb recombinantes" se refiere a proteínas de unión a antígeno expresadas de forma recombinante. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "sitio de unión anticuerpo-antígeno" se refiere a un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo que comprende al menos una secuencia de la CDR.

Los anticuerpos cuyas secuencias de aminoácidos son secuencias de inmunoglobulina de longitud completa que no se han truncado (p. ej., para producir un scFv o un Fab) o mutado (p. ej., cortado y empalmado para formar un anticuerpo quimérico o humanizado) se denominan en el presente documento anticuerpos "nativos". Las publicaciones que describen métodos para preparar dichos anticuerpos, además de las listadas inmediatamente antes, incluyen: Reichmann, y col., Nature. 332:323-327, 1988; Winter y Milstein, Nature. 349:293-299, 1991; Clackson, y col., Nature. 352:624-628, 1991; Morrison, Annu. Rev. Immunol., 10:239-265, 1992; Haber, Immunol. Rev. 130:189-212, 1992; y Rodrigues, y col., J. Immunol. 151:6954-6961, 1993.

Aunque el tratamiento de la GN de acuerdo con el procedimiento de la presente invención se puede llevar a cabo usando anticuerpos policlonales o monoclonales, se prefieren los anticuerpos monoespecíficos. Tal como se usa en el presente documento "anticuerpos monoespecíficos" se refieren a anticuerpos que se unen a una región específica de un antígeno particular. Todos los anticuerpos monoclonales son monoespecíficos, pero los anticuerpos policlonales normalmente no son monoespecíficos.

Sin embargo, como se sabe en la técnica, se pueden preparar anticuerpos policlonales monoespecíficos por diferentes métodos. Por ejemplo, se puede usar un péptido (p. ej., un oligopéptido, como se usa en lo sucesivo y en las reivindicaciones, un polímero de 5 a 200 aminoácidos) como inmunógeno. Otro procedimiento que permite preparar anticuerpos policlonales monoespecíficos es el uso de técnicas de purificación por afinidad de antígeno para aislar la población de anticuerpos monoespecíficos de una mezcla de anticuerpos policlonales. De acuerdo con la presente invención, se prefieren péptidos como inmunógenos para la producción y como ligandos de afinidad para la purificación de anticuerpos anti-KSSKC policlonales monoespecíficos.

Los anticuerpos monoclonales nativos (es decir, no diseñados) de la invención se preparan preferiblemente por medios convencionales, usando el fragmento 5G46k, el fragmento 5G27k, el péptido 5G200aa, el péptido 5G325aa, y/o el péptido KSSKC (p. ej., inmovilizados sobre una membrana de polipropileno como se describe más adelante en el ejemplo 13) como ligando(s) de selección. Esto implica ensayar en los líquidos sobrenadantes de hibridomas la unión a cada ligando de selección.

En una realización preferida, los mAb nativos de la invención se preparan usando como inmunógeno la cadena alfa de C5 humano, o fragmentos de la misma. Los fragmentos preferidos de la cadena alfa de C5 humano para este propósito, incluyen el fragmento 5G46k, el fragmento 5G27k y/o el fragmento 5G200aa. Aunque es menos preferido, el péptido KSSKC también se puede usar como inmunógeno.

Otro inmunógeno (aunque menos preferido) y ligando de selección para preparar anticuerpos dentro del alcance de los nuevos anticuerpos de la presente invención, es el "péptido del sitio de escisión", es decir, el péptido que abarca los aminoácidos de 725 a 754 del SEQ ID NO: 2 (el sitio de escisión de C5a) como se discute más adelante en el ejemplo 13.

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En otra realización preferida de la invención, los mAb nativos de la invención se preparan en ratones transgénicos que expresan inmunoglobulinas humanas (véase, por ejemplo Green y col., Nature Genet. 1994, 7:13-21). En este caso, se usan los mismos inmunógenos preferidos y ligandos de selección descritos para la preparación de otros mAb nativos.

En otra realización preferida de la invención, los mAb recombinantes de la invención se preparan por selección de bibliotecas de presentación de fagos que expresan polinucleótidos que codifican el mAb recombinante (preferiblemente codifican los mAb recombinantes humanos). Véase, por ejemplo Ames y col., 1994, véase antes; Smith y Scott, Meth. Enzymol. 1993, 217:228; Kay y col., Gene, 1993, 128:59-65. Esta selección se lleva a cabo con los ligados de selección descritos antes para preparar los mAb nativos. Los mAb recombinantes de la invención se preparan por subclonación de polinucleótidos que codifican mAb recombinantes en un vector de expresión adecuado, expresión en un huésped adecuado (como se describe más adelante) y aislamiento de los mAb recombinantes.

La presente invención proporciona vectores de expresión recombinante que incluyen fragmentos de ácido nucleico sintéticos, genómicos o derivados de ADNc, de la invención, es decir polinucleótidos que codifican mAb de la invención. La secuencia de nucleótidos que codifica cualquier de los mAb de la invención se puede insertar en un vector de expresión adecuado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia que codifica la proteína insertada. Las señales de transcripción y traducción necesarias también se pueden suministrar por el gen nativo o fuente y/o sus regiones flanqueadoras.

Se puede usar una variedad de sistemas de vectores huésped para expresar los vectores de expresión recombinantes de la invención. Estos incluyen, pero no se limitan a sistemas de células de mamíferos infectadas con virus recombinante (p. ej., virus vaccinia, adenovirus, retrovirus, etc.); sistemas de células de mamífero transfectadas con plásmidos recombinantes; sistemas de células de insectos infectadas con virus recombinantes (p. ej., baculovirus); microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de expresión de levaduras, o bacterias transformadas con ADN bacteriófago recombinante, ADN de plásmido recombinante, o ADN de cósmido (véase, por ejemplo, Goeddel, 1990).

Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y origen de replicación bacteriano derivado de plásmidos disponibles en el comercio, que comprenden elementos genéticos del vector de clonación conocido pBR322 (American Type Culture Collection -"ATCC"-, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos de América; Nº de acceso en ATCC 37017). Estas "secciones de la cadena principal" de pBR322 o secuencias funcionalmente equivalentes, se combinan con un promotor adecuado y el gen estructural que se va a expresar. Los promotores usados normalmente en los vectores de expresión microbianos recombinantes incluyen, pero no se limitan al sistema promotor de lactosa (Chang, y col., Nature 275:615), el promotor de triptófano (trp) (Goeddel, y col., 1980, Gene Expression Technology, Volume 185. Academic Press, Inc., San Diego, CA) y el promotor tac, o una fusión entre los promotores tac y trp denominada el promotor trc (Maniatis, 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Los promotores particularmente preferidos incluyen el promotor T7, que se usa junto con la expresión de la célula huésped de una ARN polimerasa T7 (véase Studier y col. 1990, Meth. Enzymol. 185:60-89), y el promotor trc, que se encuentra en varios vectores disponibles en el comercio, como se describe más adelante.

Los vectores de expresión bacterianos preferidos incluyen, pero no se limitan a los vectores pEt (véase, Studier y col. 1990, véase antes) y los vectores Trc. Muchos de los vectores pET están disponibles en el comercio en Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA). Un vector particularmente preferido es el vector pET Trc SO5/NI descrito más adelante (SEQ ID NO: 18). Un vector Trc, pTrc 99A, está disponible en Pharmacia. Otros vectores Trc incluyen los vectores pSE (Invitrogen, San Diego, CA).

Las bacterias preferidas para la expresión de mAb recombinantes incluyen Bacillus subtilis y más preferiblemente Escherichia coli. Una cepa particularmente preferida de E. coli es la cepa W3110 (denominación en ATCC 27325). En determinadas condiciones no habituales, puede ser necesario usar métodos genéticos de bacterias estándar para preparar cepas derivadas de W3110, por ejemplo, cuando hay presente un bacteriófago ("fago") contaminante en el laboratorio en el que se llevan a cabo las manipulaciones bacterianas. En general, y en particular para la preparación a gran escala, se prefiere usar la cepa W3110 no modificada u otra cepa completamente caracterizada.

En los casos en los que la contaminación de fagos es un problema y la desinfección no es factible o no es conveniente, se prefiere identificar el fago contaminante y entonces usar una cepa bacteriana completamente caracterizada que tenga una mutación conocida que haga a la bacteria resistente al fago. Preferiblemente la mutación es un mutante nulo para el receptor para el fago. Sin embargo, en algunos casos, puede ser aceptable el uso de una cepa derivada resistente al fago relativamente no caracterizada, en particular en el trabajo experimental a pequeña escala. Cuando se desean dichas cepas derivadas, se pueden preparar usando los métodos descritos más adelante en el ejemplo 11.

Para la mayoría de los propósitos se prefiere en general el uso de W3110 no modificada u otra cepa bacteriana completamente caracterizada. Esto es particularmente cierto para preparar agentes farmacéuticos que comprenden los mAb anti-KSSKC recombinantes de la invención. Esto se debe a los problemas, conocidos en la materia, del uso de cepas bacterianas que contienen mutaciones no caracterizadas o parcialmente caracterizadas para producir ingredientes de los agentes farmacéuticos.

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Los mAb recombinantes de la invención también se pueden expresar en huéspedes fúngicos, preferiblemente levaduras del género Saccharomyces tales como S. cerevisiae. También se pueden usar hongos de otros géneros tales como Aspergillus, Pichia o Kluyveromyces. Los vectores fúngicos en general contendrán un origen de replicación del plásmido de levadura de 2 \mum u otra secuencia de replicación autónoma (ARS), un promotor, ADN que codifica un mAb de la invención, secuencias que dirigen la poliadenilación y terminación de la transcripción, y un gen de marcador seleccionable. Preferiblemente, los vectores fúngicos incluirán un origen de replicación y marcadores seleccionables que permitan la transformación tanto en E. coli como en hongos.

Los sistemas promotores adecuados en hongos incluyen los promotores para la metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas tales como enolasa, hexoquinasa, piruvato quinasa, glucoquinasa, el promotor de alcohol deshidrogenasa reprimible por glucosa (ADH2), el promotor constitutivo del gen de la alcohol deshidrogenasa, ADH1, y otros. Véase, por ejemplo, Schena, y col. 1991 Meth. Enzymol. 194:389-398. Se pueden incorporar señales de secreción, tal como las que dirigen la secreción del factor alfa de levaduras o invertasa de levaduras, en los vectores fúngicos para promover la secreción de un mAb recombinante soluble en el medio de crecimiento fúngico. Véase Moir y col., 1991, Meth. Enzymol. 194:491-507.

Los vectores de expresión fúngicos preferidos se pueden montar usando secuencias de ADN de pBR322 para la selección y replicación en bacterias, y secuencias de ADN fúngico, incluyendo el promotor ADH1 y la secuencia de terminación de la alcohol deshidrogenasa ADH1, como se encuentra en el vector pAAH5 (Ammerer, 1983, Meth. Enzymol. 101:192). El promotor ADH1 es eficaz en levaduras en las que el ARNm de ADH1 se calcula que es 1-2% del poli(A)-ARN total.

Se pueden usar varios sistemas de cultivo de células de mamífero o de insecto para expresar los mAb recombinantes. Los sistemas de baculovirus adecuados para producir proteínas heterólogas en células de insectos se revisan en Luckow, y col., 1988. Los ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos adecuadas, incluyen las células COS de origen renal de mono, células L de ratón, células epiteliales mamarias C127 murinas, células de ratón Balb/3T3 cells, células de ovario de hámster chino (CHO), células 293 EBNA y HeLa humanas, mieloma, y células de riñón de cría de hámster (BHK), siendo particularmente preferidas las células de mieloma, células CHO y células 293 EBNA humanas.

Los vectores de expresión mamíferos pueden comprender elementos no transcritos tales como el origen de replicación, un promotor adecuado y potenciador unido al gen del mAb recombinante que se va a expresar, y otras secuencias flanqueadoras 5' ó 3' tales como sitios de unión al ribosoma, una secuencia de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de corte y empalme, y secuencias de terminación de la transcripción.

Las secuencias de control de la transcripción y traducción en los sistemas de vectores de expresión mamíferos para usar en células de vertebrado transformantes, se pueden proporcionar mediante fuentes víricas. Por ejemplo, los promotores y potenciadores usados habitualmente se obtienen de virus Polyoma, adenovirus, virus del simio 40 (SV40), y citomegalovirus humano, incluyendo el promotor y potenciador 1 del gen inmediato temprano de citomegalovirus (CMV).

Los vectores eucariotas particularmente preferidos para la expresión de mAb anti-KSSKC recombinantes son pAPEX-1 (SEQ ID NO: 3), y más preferiblemente pAPEX-3p, SEQ ID N0: 4. El vector pAPEX-1 es un derivado del vector pcDNAI/Amp (Invitrogen) que se modificó para aumentar los niveles de expresión de proteína.

Primero, se eliminó el intrón del antígeno t pequeño de SV40 3' no traducido, por deleción de un fragmento XbaI/HpaI de 601 pares de bases, puesto que este intrón es susceptible de corte y empalme aberrante en las regiones codificantes secuencia arriba (Evans y Scarpulla, 1989, Gene 84:135; Huang y Gorman, 1990, Molec. Cell Biol. 10:1805). Segundo, se introdujo un intrón de híbrido de inmunoglobulina-adenovirus quimérico en la región 5' no traducida mediante sustitución de un fragmento NdeI-NotI de 484 pares de bases por un fragmento correspondiente NdeI-NotI de 845 pares de bases, del vector pRc/CMV7SB (Sato y col., 1994, J. Biol. Chem. 269:17267). Finalmente, para aumentar los rendimientos de ADN plasmídico de E. coli, el casete de expresión del promotor de CMV resultante se transportó al vector pGEM-4Z (Promega Corp. Madison, WI).

El vector pAPEX-3 es un derivado del vector pDR2 (Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA) en el que primero se eliminó el gen EBNA por deleción de un fragmento ClaI/AccI de 2,4 kb. Después se sustituyó el promotor de RSV por el promotor de CMV y el intrón quimérico de adenovirus/inmunoglobulina por intercambio de un fragmento MluI/BamHI de 450 pb de pDR2 por un fragmento MluI/BamHI de 1,0 kb del vector pAPEX-1. Para la construcción de pAPEX-3P, se eliminaron un fragmento BstBI/SwaI de 1,7 kb que contenía el promotor tk de HSV y el gen de la higromicina fosfotransferasa (hyg) de pAPEX-3 y se sustituyeron por un fragmento SnaBI/NheI de 1,1 kb que contenía el promotor temprano de SV40 y el gen de la puromicina acetiltransferasa (pac) (Morgenstern y Land, 1990, Nucleic Acids Res. 18:3587-3596) más un fragmento XbaI/ClaI de 137 pb y una señal de poliadenilación de SV40 del vector pAPEX-1.

Una células huésped particularmente preferida para la expresión de insertos que codifican mAb recombinante en los vectores pAPEX es la línea celular 293 EBNa humana (Invitrogen, San Diego, CA).

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Otro vector eucariota preferido para la expresión de mAb recombinantes es pcDNAI/Amp (Invitrogen Corporation, San Diego, California). El vector de expresión pcDNAI/Amp contiene los elementos potenciador y promotor I del gen inmediato temprano de citomegalovirus humano, el intrón consenso del virus del simio 40 (SV40), secuencias de corte y empalme donadoras y aceptoras, y la señal de poliadenilación consenso de SV40. Este vector también contiene un origen de replicación de SV40 que permite la amplificación episomal en células (p. ej., células COS, células MOP8, etc.) transformadas con el antígeno T grande de SV40, y un gen de resistencia a la ampicilina para la propagación y selección de huéspedes bacterianos.

Los mAb recombinantes purificados se preparan cultivando sistemas de huésped/vector adecuados para expresar los productos de traducción de mAb recombinantes de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, que después se purifican del medio de cultivo o los extractos celulares del sistema huésped, p. ej., las bacterias, células de insecto, hongos o células de mamífero. La fermentación de hongos o células de mamífero que expresan proteínas mAb recombinantes que contienen la secuencia etiqueta de histidina (una secuencia que comprende un tramo de al menos 5 restos histidina) como producto secretado, simplifica mucho la purificación. Dicha secuencia etiqueta de histidina permite la unión en condiciones específicas a metales tales como níquel, y por lo tanto a columnas de níquel (u otro metal) para la purificación. Los mAb recombinantes también se pueden purificar por cromatografía de afinidad con proteína G (Proudfoot y col., 1992, Protein Express. Purif. 3:368).

La presente invención se describirá de forma más completa mediante los siguientes ejemplos. Los métodos y materiales que son comunes a diferentes ejemplos son los siguientes.

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Materiales y métodos Inducción de GN en ratones

Los ratones B10.D2/nSnJ hembra de 4 meses de edad con un peso medio de aproximadamente 25 g se obtuvieron en Jackson Laboratory, 3ar Harbor, MS. Se inyectó a los ratones 0,1 ml diarios (6 días a la semana) de una disolución de 40 mg/ml de apoferritina de caballo (HAF), que se preparó por dilución de una disolución salina de HAF (Sigma Chemical Company nº de catálogo A-3641) con PBS.

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Anticuerpos monoclonales anti-C5

Los anticuerpos monoclonales que se unen al componente del complemento C5 del ratón se prepararon por métodos estándar como una fracción de IgG de los líquidos sobrenadantes de cultivos de hibridoma BB5.1 (Frei y col., 1987), que se obtuvo de Dr. Brigitta Stockinger del National Institute for Medical Research, Mill Hill, Londres, Gran Bretaña.

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Histología

Los riñones se sometieron a análisis microscópico usando técnicas de inmunofluorescencia y tinción histoquímica estándar. La tinción con ácido peryódico de Schiff (PAS) de secciones de parafina de 5 \mum se hizo por métodos estándar usando el equipo de reacción histoquímica HARLECO PAS (EM Diagnostic Systems, Gibbstown, NJ, número 64945/93) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La tinción inmunofluorescente de secciones de criostato de 5 \mum se llevó a cabo por métodos estándar usando IgG, IgA e IgM C3 anti-ratón de oveja conjugado con FITC (Biodesign International, Kennebunk, ME, nº de catálogo W90280F) para detectar el componente del complemento C3 murino, o anti-ratón de cabra conjugdo con FITC (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, nº de catálogo 65-6411) para detectar los complejos inmunes.

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Ensayos de la orina

Los niveles de proteínas y glucosa se determinaron mediante aplicación en gotas de muestras de orina sobre varillas indicadoras CHEMSTRIP 2GP (Boehringer Mannheim Diagnostics, Indianapolis, IN, nº de catálogo 200743). Las zonas de detección de estas tiras cambian de color cuando se exponen a orina que contiene proteína o glucosa; una falta de cambio de color indica que no hay proteínas o glucosa detectables. El nivel del analito en la orina ensayada se obtiene emparejando los colores cambiados con la tabla de colores suministrada por el fabricante. La tabla de proteínas de la orina muestra colores que corresponden a cabtidades trazas, 30, 100 y 500 mg/dl.

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Ensayos de lisis celular

La capacidad de lisis celular del complemento en la sangre se puede determinar usando ensayos hemolíticos que se llevan a cabo como sigue: se lavan bien eritrocitos de pollo en GVBS (Rollins, y col., J. Immunol. 144:3478-3483, 1990, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, nº de catálogo G-6514) y se vuelven a suspender hasta 2x10^{8}/ml en GVBS. Se añade anticuerpo anti-eritrocito de pollo (fracción de IgG de anticuerpo anti-RBC-pollo, Intercell Technologies, Hopewell, NJ) a las células con una concentración final de 25 \mug/ml y las células se incuban durante 15 min a 23ºC. Las células se lavan 2x con GVBS y se vuelven a suspender 5x10^{6} células hasta 30 \mul en GVBS. Después se añade un volumen de 100 \mul de disolución de suero de ensayo para dar un volumen de mezcla de reacción de 130 \mul. Tal como se usa en el presente documento, la referencia al porcentaje de suero y/o aporte de suero en estos ensayos indica el porcentaje de suero en el volumen de 100 \mul de la disolución del suero de ensayo.

Para los ensayos de actividad del suero de ratón, el volumen de 100 \mul de disolución de ensayo de suero contenía 50 \mul de suero de ratón diluido (en GVBS) y 50 \mul de suero deficiente en C5 humano (Quidel Corporarion, San diego, CA). Para los ensayos de la actividad del suero humano, la disolución de ensayo de suero puede contener hasta 100% de plasma o suero humano, con líquidos sobrenadantes de hibridoma y/o añadiéndose GVBS para dar 100 \mul de volumen. Para los ensayos usados para la selección de líquidos sobrenadantes de hibridoma discutido más adelante en el ejemplo 7, cada 100 \mul de volumen de disolución de ensayo de suero contenía 50 \mul de líquido sobrenadante de hibridoma y 50 \mul de una disolución al 10% de suero humano en GVBS, dando un aporte de suero humano de 5%.

Después de incubación durante 30 min a 37ºC, se calculó el porcentaje de hemólisis con respecto a una muestra de control completamente lisada. La hemólisis se determinó centrifugando las células y midiendo la hemoglobina liberada en el líquido sobrenadante, como la densidad óptica a 415 nm.

Una reducción de 50% de la hemólisis después de tratamiento con los anticuerpos anti-C5 usados en la práctica de la invención, significa que el porcentaje de hemólisis después de tratamiento es la mitad del porcentaje de hemólisis antes de tratamiento.

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Ejemplo 1 Los anticuerpos anti-C5 inhiben la inflamación y el agrandamiento glomerular

Este ejemplo ilustra que los anticuerpos anti-C5 inhibirán la inflamación y agrandamiento glomerular.

El protocolo para estos experimentos era el siguiente. Se trataron ratones con GN inducida con anticuerpos anti-C5 o con PBS como control, 2 semanas después de la inducción de la GN. Cada ratón recibió 750 \mug de anticuerpos monoclonales anti-C5 en PBS (30 mg/kg en un ratón de 25 g) o un volumen igual de PBS solo. La cantidad inyectada era de 0,25 a 0,365 ml (la concentración de anticuerpos en PBS variaba), que se administraron por inyección intraperitoneal una vez al día, 6 días a la semana. Después de 2 semanas adicionales de inducción y tratamiento, los animales se sacrificaron y se recogieron y prepararon los riñones para el examen histológico como se ha descrito antes. También se obtuvieron los riñones de ratones de control no tratados y no inducidos de edad correspondiente.

La figura 1 muestra las secciones de riñones de ratón con un solo glomérulo situado en medio de intersticio que lo rodea y cortes transversales de los túbulos enrollados en cada sección. Como puede verse en las mismas, los riñones de los ratones con GN inducida, tratados con PBS (fig. 1B) desarrollaron patología glomerular semilunar grave, incluyendo hipercelularidad glomerular inflamatoria, engrosamiento de la membrana basal aparente, y agrandamiento glomerular, mientras que los glomérulos de los animales con GN inducida, tratados con anti-C5 (figura 1C) eran esencialmente indistinguibles de los glomérulos de los riñones sanos normales de los ratones no inducidos y no tratados (figura 1A).

Obsérvese que en los glomérulos con patología semilunar grave, el tamaño de la red de capilares glomerulares (cresta glomerular) no está aumentado, pero muestra signos de compresión por una proliferación en forma semilunar de células epiteliales y material PAS positivo, y la cápsula de Bowman está notablemente agrandada. Obsérvese también que en la sección del glomérulo enfermo mostrado en la fig. 1B, la red capilar está dividida por la mitad por una proyección de masa semilunar hipercelular.

Los glomérulos no inflamados del ratón no inducido y no tratado mostrado en la figura 1A es de aproximadamente 100 \mum de diámetro, el glomérulo inflamado del ratón con GN inducida y tratado con PBS mostrado en la fig. 1B es de aproximadamente 175 \mum de diámetro; el glomérulo no inflamado del ratón con GN inducida y tratado con anti-C5 mostrado en la fig. 1C es de aproximadamente 90 \mum de diámetro.

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Ejemplo 2 Los anticuerpos anti-C5 previenen/reducen la proteinuria asociada con la GN

Este ejemplo demuestra que el tratamiento con anticuerpos anti-C5 da como resultado la prevención/reducción de daño renal, que se pone de manifiesto por la falta de cantidades significativas de proteína en la orina (es decir, la presencia de menos de 100 mg/dl de proteína en la orina).

El protocolo para los experimentos de este ejemplo era el mismo que el usado en los experimentos del ejemplo 1. En este estudio se usaron 5 ratones con GN inducida y tratados con PBS, 6 ratones con GN inducida y tratados con anti-C5, y 4 ratones no inducidos y no tratados de edad correspondiente. Se analizó un primer grupo de muestras de orina antes del tratamiento después del periodo inicial de inducción de 2 semanas. Se analizó un segundo grupo de muestras de orina después del periodo de tratamiento de 2 semanas. Ninguno de los animales de control no inducidos y no tratados tenía proteína detectable en su orina en ninguno de estos tiempos de medición.

Los resultados obtenidos en los ratones con GN inducida se presentan en la tabla 1. Como puede verse en la misma, al final del periodo de tratamiento con PBS de 2 semanas, 4 de los 5 animales tratados con PBS (control) desarrollaron proteinuria significativa, es decir, al menos 100 mg/dl de proteína en la orina. El quinto animal (ratón D en la tabla 1) no tenía proteína detectable en la orina en ningún tiempo de medición, pero a diferencia de los otros ratones del estudio, se encontró que tenía niveles muy altos de glucosa en la orina después del periodo de tratamiento con PBS de 2 semanas, sugiriendo que este animales estaba fisiológicamente comprometido.

En el grupo de inducción de GN y tratamiento con anti-C5, el ratón que desarrolló proteinuria significativa al final del periodo inicial de inducción de 2 semanas (ratón 6 en la tabla 1) mejoró al final del periodo de tratamiento con anticuerpo de 2 semanas. Además, en contraste con el desarrollo de proteinuria significativa en 4 de los 5 ratones con GN inducida y tratados con PBS, ninguno de los ratones con GN inducida y tratados con anti-C5 presentó proteinuria significativa al final del periodo de tratamiento con anticuerpo de 2 semanas.

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Ejemplo 3 Los anticuerpos anti-C5 no inhiben la deposición de complejos inmunes glomerulares

Este ejemplo demuestra que los anticuerpos anti-C5 usados en la práctica de la invención logran sus efectos terapéuticos incluso aunque los complejos inmunes se depositen en los glomérulos de los animales tratados en niveles equivalentes a los vistos en los glomérulos de los animales tratados con PBS. El ejemplo ilustra además que el mecanismo de funcionamiento de los anticuerpos anti-C5 no es a través de la inhibición de la deposición de complejos inmunes en el glomérulo.

El protocolo usado en los experimentos de este ejemplo era el mismo que el usado en los experimentos del ejemplo 1. Se llevó a cabo la tinción inmunofluorescente como se ha descrito antes en secciones de los mismos riñones recogidos en el ejemplo 1.

Los resultados se muestran en la figura 2. Como puede verse en esta figura, se depositaron cantidades equivalentes de complejos inmunes en los glomérulos de los riñones tanto de los ratones con GN inducida y tratados con PBS (figura 2B) como en los ratones con GN inducida y tratados con anti-C5 (figura 2C), pero no en los controles no inducidos y no tratados (figura 2A). Los riñones de los ratones con GN inducida recogidos después del periodo de inducción de 2 semanas, pero antes del tratamiento, mostraron depósitos de complejo inmune en los glomérulos, pero en niveles menores (indicado por la menor intensidad de la fluorescencia) que en las secciones de riñón mostradas en las fig. 2B y fig. 2C.

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Ejemplo 4 Los anticuerpos anti-C5 inhiben la generación de C5b-9

Este ejemplo demuestra que los anticuerpos anti-C5 usados en la práctica de la invención inhiben la generación de C5b-9. La generación de C5b-9 se ensayó de 2 formas: (1) ensayando la capacidad de lisis celular (hemolítica) de las muestras de sangre y (2) midiendo los niveles de C5b-9 soluble en las muestras de sangre.

La figura 3 muestra los resultados de los ensayos de lisis celular realizados como se ha descrito antes, con suero de ratón añadido en el porcentaje indicado en el eje X ("% de entrada de suero"). En estos ensayos, se ensayó el suero de animales con GN inducida tratados con anticuerpos anti-C5 en PBS o PBS solo (véase antes) al final del periodo de tratamiento de 2 semanas. También se ensayó como control adicional el suero de ratones normales no inducidos y no inyectados ("suero de ratón normal") obtenido de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, nº de catálogo S-3269). Estos resultados indican que el anticuerpo monoclonal anti-C5 administrado a ratones con una dosificación de 30 mg/kg, bloqueaba completamente la capacidad de lisis celular de la sangre de ratones con niveles de aporte de suero 4 veces mayor que los niveles de suero normal que producían hemólisis máxima en este ensayo.

Se evaluaron los efectos de un anticuerpo monoclonal anti-C5 contra C5 humano en sangre humana en circulación. El hibridoma N19/8 (Wurzner, y col., 1991) se obtuvo de Dr. Otto Gotze, Department of Immunology, University of Gottingen, FRG. El anticuerpo monoclonal de C5 se preparó después de inmunización de los ratones con proteína C5 humana purificada como describen Wurzner, y col., (1991). El hibridoma de propagó en los ratones, y el anticuerpo monoclonal se recuperó y purificó como una fracción de IgG de líquido ascítico de ratón (Antibodies. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988; Current Protocols In Immunology. John Wiley & Sons, New York, 1992).

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Para llevar a cabo estos experimentos, así como otros descritos a continuación en los ejemplos 5 y 6, se extrajeron 300 ml de sangre humana entera de un donante humano sano y se sacó una muestra adicional de 1 ml como muestra de control para el análisis posterior. La sangre se diluyó hasta 600 ml por adición de disolución de lactato de Ringer que contenía heparina 10 U/ml. Se añadió el mAb anti-C5 (30 mg en PBS estéril) a la sangre diluida hasta una concentración final de 50 \mug/ml (los resultados usando las muestras de ensayo obtenidas de esta forma están marcadas como "muestra +anti-C5" en la fig. 4 y fig. 6). En un experimento de control, se añadió un volumen igual de PBS estéril a sangre diluida (los resultados usando las muestras de control obtenidos de esta forma están marcados como "muestra -anti-C5" en la fig. 4 y fig. 6).

Después, la sangre se usó para cebar el circuito extracorpóreo de una máquina de derivación cardiopulmonar (CPB) de oxigenador de membrana COBE CML EXCEL (Cobe BCT, Inc., Lakewood, CO) y se inició la circulación a través del circuito. El circuito se enfrió a 28ºC y se hizo circular durante 60 minutos. Después, el circuito se calentó a 37ºC y se hizo circular durante 30 minutos adicionales, y después de este tiempo se terminó el experimento. La circulación mecánica de la sangre de esta forma activa la cascada del complemento. Se tomaron muestras en varios tiempos de medición.

En cada tiempo de medición se tomó una parte alícuota de sangre, y se centrifugan partes subalícuotas para separar todas las células y el plasma que queda se diluyó 1:1 en disolución de conservación de muestra Quidel (Quidel Corporation, San Diego, CA) y se conservó a -80ºC para la posterior evaluación de la generación de C5b-9 soluble (sC5b-9). Las partes subalícuotas de plasma diluidas también se congelaron para evaluar la generación de C3a (véase el ejemplo 5, más adelante). Las partes subalícuotas de plasma no diluidas se congelaron a -80ºC para el análisis en ensayos hemolíticos para evaluar la farmacocinética de los efectos de los anticuerpos anti-C5 en la capacidad de lisis celular del complemento presente en la sangre (véase el ejemplo 6, más adelante). Estos experimentos también se discuten en la solicitud de patente de EE.UU. en tramitación con la presente nº de serie 08/217.391, presentada el 23 de marzo, 1994.

Los ensayos de sC5b-9 se llevaron a cabo antes de la adición del anticuerpo o del inicio del circuito de CPB (marcado como "Pre Tx" en la fig. 4 y fig. 6) usando sangre no diluida (es decir, la sangre de la muestra de 1 ml tomada antes de diluir la sangre con la disolución de lactato de Ringer - marcado "no dil" en la fig. 4 y fig. 6) y sangre diluida con disolución de lactato de Ringer (marcado "dil" en la fig. 4 y fig. 6). Las muestras de sangre diluida con disolución de lactato de Ringer a las que se había añadido el anticuerpo (marcadas "Post Tx" en la fig. 4 y fig. 6) se ensayaron en los tiempos indicados después de iniciar el circuito de CPB.

Como puede verse en la figura 4, aunque los niveles de sC5b-9 no eran más de 4 veces mayores en las muestras no tratadas después de 90 minutos de circulación que antes de la circulación, el anticuerpo anti-C5 inhibió completamente la generación de C5b-9 a lo largo del periodo de tiempo de 90 minutos de circulación, de modo que los niveles de sC5b-9 durante la circulación eran esencialmente equivalentes a las muestras de control, no hechas circular, en todos los tiempos de medición.

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Ejemplo 5 Los anticuerpos anti-C5 no inhiben la deposición o activación de C3

Este ejemplo demuestra que el tratamiento con anticuerpos anti-C5 no da como resultado la inhibición de la
activación del componente del complemento C3 o de la deposición de C3 o sus fragmentos activados en los
glomérulos.

La deposición de C3, o los fragmentos generados por su activación (p. ej., C3a y C3b), en los glomérulos de ratones con GN inducida y sin GN inducida se visualizó por tinción inmunoflorescente con una preparación de anticuerpo anti-C3 de ratón de oveja conjugado con FITC usando métodos estándar como se ha descrito antes. Como puede verse en la fig. 5, los riñones de los ratones con GN inducida y tratados con PBS (fig. 5B) y tratados con anticuerpo anti-C5 (fig. 5C) tenían niveles aproximadamente equivalentes de material inmunorreactivo con C3 en los glomérulos, mientras que los ratones de control no inducidos y no tratados tenían solo cantidades trazas de material inmnorreactivo con C3 en sus riñones (fig. 5A).

Obsérvese que el dibujo mostrado en la fig. 5A se sobreexpuso comparado con las de las fig. 5B y 5C para mostrar los niveles muy pequeños de reactividad presente en los riñones normales no inducidos. Los riñones de los ratones con GN inducida recogidos después del periodo de inducción de 2 semanas, pero antes del tratamiento, mostraron materiales inmunorreactivos con C3 en los glomérulos, pero con niveles menores (como indica la menor intensidad de la fluorescencia) que en las secciones de riñones mostradas en las fig. 5B y fig. 5C.

También se ensayó con los anticuerpos anti-C5 humanos la posible inhibición de la activación de C3 en sangre humana preparada y hecha circular como se ha descrito antes en el ejemplo 4. La activación del componente del complemento C3 se indicaba por la presencia en la sangre del producto de activación de C3, C3a. Los ensayos de C3a se llevaron a cabo como sigue.

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Se ensayó en las muestras de plasma que se habían diluido previamente en disolución de conservación de muestra Quidel y congelado (véase el ejemplo 4), la presencia de C3a usando el kit de EIA para C3a Quidel (Quidel Corporation, San Diego, CA) de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes. Las concentraciones de C3a en las muestras se expresa en ng/pocillo determinadas por comparación con una curva patrón generada a partir de muestras que contienen cantidades conocidas de C3a humano.

Como puede verse en la fig. 6, la adición del mAb anti-C5 no tenía efecto inhibidor en la producción de C3a durante la circulación de sangre humana en este experimento.

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Ejemplo 6 Farmacocinética de los anticuerpos anti-C5

La duración in vivo de la acción del mAb BB5.1 y un fragmento Fab' del mAb BB5.1 (preparado por métodos estándar) se determinó en ratones BALB/cByJ hembra normales (de aproximadamente 20 g de peso medio cada uno) que se obtuvieron de Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME. Se administró a los ratones una sola inyección intravenosa (de 35 mg/kg de peso corporal) del mAB o el fragmento Fab' del mAb (o un volumen igual de PBS como control). Se recogieron muestras de sangre del plexo retroorbital a las 1, 4, 24, 96 y 144 después de la administración de PBS; 4, 16 y 24 h después de la administración del fragmento Fab' del mAb BB5.1; y 4, 24, 48, 72, 96 y 144 h después de la administración del mAb BB5.1 intacto.

La fig. 7A muestra el transcurso del tiempo de la inhibición de la capacidad de lisis celular en la sangre de ratón (determinada por ensayo del suero obtenido de la sangre y diluido al 2,5%, como se ha descrito antes) después de la administración in vivo del mAb, el fragmento Fab' o PBS. Como se muestra en la figura, el mAB inhibió casi completamente la actividad hemolítica de la sangre a lo largo del periodo de ensayo de 6 días. Sin embargo, Fab' tenía una semivida de aproximadamente 24 horas.

Además de los experimentos anteriores, al final del periodo de ensayo de 6 días se sacrificaron todos los ratones. Se recogieron los riñones, pulmones e hígados y se examinaron mediante inspección general, así como por examen microscópico de las secciones teñidas. Todos los órganos de los animales tratados con anticuerpo anti-C5 aparecían iguales que los tomados de los animales de control tratados con PBS. El aspecto general de los ratones de ensayo y de control también era indistinguible antes de la necropsia.

También se ensayaron las propiedades farmacocinéticas de los anticuerpos anti-C5 humanos en sangre humana en circulación como se ha descrito antes en el ejemplo 4. Como se describe en el mismo, se ensayaron los efectos de inhibición de la hemólisis de un anticuerpo monoclonal anti-C5 humano a lo largo de un periodo de 90 minutos de circulación. Los resultados de estos ensayos se representan en la figura 7B, y muestran que el mAb anti-C5 N19/8 inhibía esencialmente de forma completa la capacidad de lisis celular de la sangre humana durante todo el periodo de 90 minutos de circulación.

Los resultados de estos experimentos demuestran que los anticuerpos anti-C5 sobrevivirán en el torrente sanguíneo durante un periodo de tiempo sustancial, haciendo que sea práctica la administración periódica.

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Ejemplo 7 Preparación de anticuerpos monoclonales anti-C5

Se preparó un anticuerpo monoclonal adecuado para usar en la práctica de la presente invención de acuerdo con las enseñanzas de Sims y col., patente de EE.UU. nº 5.135.916, como sigue.

Se inmunizaron ratones Balb/c 3 veces por inyección intraperitoneal con proteína C5 humana (Quidel Corporation, San Diego, CA, nº de catálogo A403). La primera inyección contenía 100 \mug de proteína C5 en una emulsión de adyuvante completo de Freund, la segunda inmunización contenía 100 \mug de proteína C5 en una emulsión de adyuvante incompleto de Freund y la tercera inmunización eran 100 \mug de proteína en PBS. Se inyectó a los ratones a intervalos de alrededor de 2 meses.

Las fusiones de los esplenocitos a células de mieloma para generar hibridomas se hicieron esencialmente como se describe en Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, New York, 1992, páginas 2.5.1 a 2.5.17). Un día antes de la fusión, los ratones se reforzaron por vía IV con 100 \mug de proteína C5. El día de la fusión, los ratones inmunizados se sacrificaron y se recogieron los bazos. Se usaron células de mieloma SP2/0-AG14 (ATCC CRL nº 1581) como pareja de fusión. Los cultivos de SP2/0-AG14 se dividieron el día antes de la fusión para inducir la división celular activa. Se usó una relación 1:10 (células de mieloma: esplenocitos) en las fusiones.

Las células se fusionaron usando PEG 1450 en PBS sin calcio (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, nº de catálogo P-7181) y se sembraron 1-2,5 x 10^{5} células por pocillo. Al día siguiente se inició la selección en medio EX-CELL 300 (JRH Biosciences, Lexena, KS, nº de catálogo 14337-78P) complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% inactivado con calor; glutamina, penicilina y estreptomicina (GPS); y HAT (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, nº de catálogo H-0262). Después, las fusiones se alimentaron cada dos días con medio complementado con FBS, GPS y HAT de nueva aportación. Se pudo ver la muerte celular tan pronto como a los 2 días y se pudieron ver grupos de células viables tan pronto como a los 5 días después de iniciar la selección. Después de 2 semanas de selección en HAT, los hibridomas supervivientes elegidos para el estudio posterior, se transfirieron a medio EX-CELL 300 complementado con FBS, GPS y HT (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, nº de catálogo H-0137) durante 1 semana, y después se cultivaron en medio EX-CELL 300 complementado con FBS y GPS.

Se seleccionaron los hibridomas con reactividad frente a C5 e inhibición de la hemólisis mediada por complemento 10-14 días después de la fusión, y se llevó a cabo al menos hasta que se analizaron los resultados de la selección. La selección para la inhibición de la hemólisis era el ensayo de lisis de eritrocitos de pollo descrito antes. La selección para la reactividad con C5 era un ELISA, que se llevó a cabo usando el siguiente protocolo:

Se incubó una parte alícuota de 50 \mul de una disolución de 2 \mug/ml de C5 (Quidel Corporation, San Diego, CA) en tampón de carbonato/bicarbonato de sodio, pH 9,5, durante una noche a 4ºC en cada pocillo de ensayo de una placa de 96 pocillos (Nunc-Immuno F96 Polysorp, A/S Nunc, Roskilde, Dinamarca). Después, los pocillos se sometieron a una etapa de lavado. (Cada etapa consistía en 3 lavados con TBST). Después, los pocillos se bloquearon con 200 \mul de disolución de bloqueo, BSA al 1% en TBS (BSA/TBS), durante 1 hora a 37ºC. Después de una etapa de lavado adicional, se incubó una parte alícuota de 50 \mul de líquido sobrenadante del hibridoma, en cada pocillo de ensayo durante 1 hora a 37ºC con una etapa de lavado subsiguiente. Como anticuerpo secundario (detección), se incubaron 50 \mul de una dilución 1:2000 de IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) en BSA/TBS, en cada pocillo de ensayo durante 1 hora a 37ºC, seguido de una etapa de lavado. Siguiendo los procedimientos del fabricante, se disolvieron 10 mg de o-fenilendiamina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, nº de catálogo P-8287) en 25 ml de tampón de fosfato-citrato (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, nº de catálogo P-4922) y se añadieron 50 \mul de esta disolución de sustrato a cada pocillo para permitir la detección de la actividad de la peroxidasa. Finalmente, para parar la reacción de detección de la peroxidasa, se añadió a cada pocillo una parte alícuota de 50 \mul de ácido clorhídrico 3 N. La presencia de anticuerpos reactivos con C5 en los líquidos sobrenadantes del hibridoma se obtuvo por una determinación de DO espectrofotométrica a 490 nm.

El líquido sobrenadante de un hibridoma denominado 5G1.1 dio ensayo positivo por ELISA y redujo sustancialmente la capacidad de lisis celular del complemento presente en sangre humana normal en el ensayo de hemólisis de eritrocitos de pollo. Análisis adicionales pusieron de manifiesto que el anticuerpo 5G1.1 reduce la capacidad de lisis celular del complemento presente en la sangre humana normal de forma tan eficaz que, incluso presente a una concentración molar de aproximadamente la mitad de C5 humano en el ensayo hemolítico, puede neutralizar casi completamente la actividad hemolítica del suero.

Se llevaron a cabo ensayos de inmunotransferencia para caracterizar mejor el mAb 5G1.1. Se sometió C5 humano (Quidel Corporation, San Diego, CA, nº de catálogo A403) a electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones reductoras, se transfirió a una membrana de nitrocelulosa, y se hibridó con el mAb 5G1.1 en forma de preparación de IgG purificada. Dos bandas eran inmunorreactivas con el mAB 5G1.1 en pesos moleculares aparentes correspondientes a los de las cadenas alfa y beta de la proteína C5 humana. Posteriormente se encontró que las 2 bandas inmunorreactivas con 5G1.1 vistas en la transferencia Western resultaban de la unión del anticuerpo 5G1.1 a la cadena alfa de C5 de 115 kDa y a un fragmento grande de la cadena alfa que tenía el mismo peso molecular aparente (aproximadamente 75 kDa) que la cadena beta de C5 y estaba presente en las preparaciones de C5 usadas para el experimento.

Se llevaron a cabo ensayos para determinar la actividad relativa del mAb N19/8 discutidos en los ejemplos 4 y 5 con el mAb 5G1.1 en ensayos hemolíticos funcionales, y para evaluar si estos mAb bloqueaban la escisión de C5 para dar C5a. Para este fin, los mAb N19/8 y 5G1.1 se compararon directamente en ensayos hemolíticos del complemento humano y de liberación de C5a.

Los ensayos hemolíticos realizados en presencia de suero humano al 20% en v/v pusieron de manifiesto que el mAb 5G1.1 bloqueaba de forma eficaz la actividad hemolítica del suero con una concentración final de 6,25 \mug/ml (relación molar 0,5/1 de 5G1.1/C5), mientras que el mAb N19/8 bloqueaba con una concentración mayor de 25,0 \mug/ml (relación molar 2,0/1 de N19/8 / C5). Cuando se ensayó en los líquidos sobrenadantes de estos ensayos la presencia de C5a, se encontró que el mAb 5G1.1 había inhibido eficazmente la generación de C5a con dosis idénticas a las necesarias para el bloqueo de la actividad hemolítica mediada por C5b-9.

En contraste, el mAb N19/8 era 10 veces menos eficaz en el bloqueo de la liberación de C5a en estos ensayos cuando se comparaba con el mAb 5G1.1. Además, la capacidad del mAb N19/8 para bloquear la hemólisis mediada por el complemento no era equivalente a su capacidad para bloquear la generación de C5a, en cuanto que una dosis de 25 \mug/ml de N19/8 bloqueaba completamente la hemólisis mientras que reducía la generación de C5a solo en 37%.

El hibridoma 5G1.1 se depositó en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, Estados Unidos de América, el 27 de abril, 1994, y se le asignó la denominación HB-11625. El depósito se hizo bajo el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes (1977).

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Ejemplo 8 Determinación de las constantes de afinidad (K_{p}) para los anticuerpos monoclonales anti-C5 humano 5G1.1 y N19/8

El procedimiento utilizado para determinar la constante de disociación (K_{D}) del equilibrio anticuerpo-antígeno en disolución era el descrito por Friguet y col., J. Immunol. Meth. 1985, 77:305-319. Este método se usó para determinar la K_{D} para los anticuerpos monoclonales anti-C5 humano N19/8 y 5G1.1. Los anticuerpos monoclonales se incubaron con el antígeno (C5) en disolución hasta alcanzar el equilibrio. La cantidad de anticuerpo que permanecía sin unir (libre) en el equilibrio, se midió usando el ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) convencional. Se ha demostrado que los valores de K_{D} obtenidos por este método son equivalentes a los obtenidos por otros métodos (inmunoprecipitación del antígeno radiomarcado y transferencia de fluorescencia). Este método ofrece la ventaja de tratar el antígeno sin modificar.

Las figuras 8 y 9 muestras las gráficas de Scatchard de la unión de los anticuerpos monoclonales anti-C5 humano 5G1.1 y N19/8 a C5 humano, medido por ELISA. En cada gráfica, (v) representa la fracción de anticuerpo unido y (a) representa la concentración de antígeno libre en el equilibrio. La K_{D} calculada para el mAb 5G1.1 era 30 pM, mientras que la K_{D} calculada para el mAb N19/8 era 43 pM. Estos resultados indican que las K_{D} para los mAb N19/8 y 5G1.1 son similares, y por lo tanto la disparidad funcional entre los dos anticuerpos no se puede explicar simplemente por las diferencias de afinidad para el antígeno C5.

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Ejemplo 9 Efecto del mAb 5G1.1 en la activación del complemento durante la CPB

Se llevaron a cabo experimentos que implicaban la recirculación de sangre humana en un circuito de CPB, como se ha descrito antes en los ejemplos 4 y 5, usando 3 dosis del mAb 5G1.1 (15 mg, 7,5 mg, 3,75 mg) así como controles en ausencia del mAb 5G1.1. En 5 de dichos experimentos de control realizados en esta serie, los niveles de C3a (fig. 10) y sC5b (fig. 11) aumentaron durante los primeros 30 min y continuaron aumentando a lo largo de todo el experimento. La adición del mAb 5G1.1 al circuito de PBS no tuvo efecto en la generación de C3a en estos experimentos.

A la inversa, la adición de las 2 dosis más altas (15 mg y 7,5 mg) del mAb 5G1.1 bloqueo completamente la generación de sC5b-9 en estos experimentos, mientras que la dosis más baja (3,75 mg) solo bloqueó parcialmente la generación de sC5b-9. Los ensayos hemolíticos realizados en las muestras de suero extraídas a lo largo del transcurso de estos experimentos pusieron de manifiesto que la actividad total del complemento del suero no se afectaba en los experimentos de control (fig. 12). En contraste, la dosis más alta del mAb 5G1.1 (15 mg) bloqueó completamente la actividad hemolítica del complemento, mientras que las dosis menores (7,5 mg y 3,75 mg), no consiguieron bloquear la actividad hemolítica.

Estos resultados muestran que la dosis de 7,5 mg bloqueó eficazmente la generación de C5b-9 en el circuito de PBS pero no pudo bloquear la actividad hemolítica mediada por C5b-9, sugiriendo que los ensayos hemolíticos solos pueden no reflejar con precisión la activación del complemento que ocurre durante la CPB. Estos resultados indican además que el mAb 5G1.1 puede bloquear completamente la activación en la sangre humana, medido por cualquiera de los criterios, con una dosificación de 15 mg/500 ml, una dosis que es aproximadamente equivalente a una dosis de 150 mg para un paciente de 70 kg.

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Ejemplo 10 Clonación de genes de la región variable de anti-KSSKC recombinante y anti-C5 Secuenciación de aminoácidos

Para determinar la secuencia de aminoácidos N-terminal del mAb 5G1.1, se preparó un gel de acrilamida al 12% (acrilamida/N,N'-metilen-bisacrilamida 37,5:1) y se sometió a preelectroforesis durante 45 minutos a 10 mA usando 1x tampón de preelectroforesis (bis-Tris 123 mM, pH 6,6, con el depósito del tampón del cátodo complementado con glutatión reducido 1 mM). Al día siguiente, el tampón de preelectroforesis en el depósito del cátodo se sustituyó por tampón de depósito del cátodo (ácido N-tris-(hidroximetil)-metil-2-aminoetanosulfónico 44 mM, bis-Tris 113 mM, dodecilsulfato de sodio al 0,1% (p/v) (SDS), ácido tioglicólico 0,067% (p/v) y el tampón de preelectroforesis en el depósito del ánodo se sustituyó por tampón de depósito del ánodo (bis-Tris 63 mM, pH 5,9).

Se añadieron 75 \mug de anticuerpo monoclonal 5G1.1 a tampón de muestra de Laemmli (Tris-HCl 30 mM pH 6,8, SDS al 3% (p/v), EDTA 10 mM, azul de bromofenol al 0,02% (p/v), glicerol al 5% (v/v), beta-mercaptoetanol al 2,5% (v/v)) y se sometió a electroforesis a 10 mA hasta que el rastro de colorante del azul de bromofenol alcanzó la parte inferior del gel. La proteína se transfirió a una membrana PROBLOTT (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando 1x tampón de transferencia (ácido ciclohexilaminopropanosulfónico 10 mM, ditiotreitol al 0,05% (p/v), metanol al 15% (v/v)) a 50 V durante 1 h.

Las bandas de proteínas se localizaron por tinción con Ponceau S al 0,2% (en ácido tricloroacético al 3%, ácido sulfosalicílico al 3%) seguido de destinción con agua. Las bandas se cortaron y se sometieron a análisis de secuencia de aminoácidos usando la química de Edman realizada en un secuenciador de proteínas de líquido pulsado (ABI modelo 477A), analizándose los aminoácidos PTH así obtenidos con un sistema de HPLC de microboro en línea (ABI modelo 120 A).

Para desbloquear el extremo amino de la cadena pesada de 5G1.1, se intercambiaron 10 mg de anticuerpo monoclonal 5G1.1 en tampón de reducción (guanidina-HCl 5 M, Tris-HCl 50 mM, ditiotreitol 10 mM, pH 8,5) usando una columna PD-10 (Pharmacia, Piscataway, NJ). Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, se añadió yodoacetamida 50 mM y la incubación se dejó continuar durante 30 minutos. Las cadenas ligera y pesada carbamidometiladas así obtenidas se separaron por cromatografía de exclusión por tamaños en una columna SUPEROSE 12 (Pharmacia) equilibrada con guanidina-HCl 5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8,5. La cadena pesada carbamidometilada se intercambió en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, usando una columna PD-10, se sometió a digestión con piroglutamato aminopeptidasa (PanVera, Madison, WI; 0,5 mU por mol de proteína de cadena pesada), y se secuenció como se ha descrito antes.

Para la determinación de la secuencia de aminoácidos internos, la cadena ligera de 5G1.1 carbamidometilada se intercambió en urea 2 M, Tris-HCl 25 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0, y se incubó con endoproteinasa Lys-C (Promega, Madison, WI; relación proteasa:proteína de 1:40) a 37ºC durante la noche. El material digerido se pasó por una columna de HPLC C18 de fase inversa (Beckman Instruments, Fullerton, CA) y se eluyó usando un gradiente lineal de acetonitrilo al 0-5% en ácido trifluoroacético al 0,1%. Los picos se sometieron al análisis de secuencia de aminoácidos como se ha descrito antes.

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Clonación por PCR

La clonación de la región pesada variable de 5G1.1 se realizó usando un conjunto de cebadores disponibles en el comercio (Mouse Ig-PRIMER SET, número de catálogo 69831-1, Novagen, Madison, WI). Se aisló el ARN total de las células de hibridoma de 5G1.1 usando la técnica de ácido/tiocianato de guanidinio (Chomczynski y Sacchi, Anal. Biochem. 1987, 162:156-159). Para la síntesis de la primera cadena del ADNc, se desnaturalizaron 10 \mug de ARN total a 65ºC durante 5 min, se enfriaron en hielo y se añadieron a una reacción de 100 \mul que contenía Tris 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, ditiotreitol 10 mM, 250 \muM de cada dNTP, 20 unidades de AMV transcriptasa inversa (Seikagaku America, Rockville, MD), y 10 pmoles del cebador 3' adecuado (como se describe en el protocolo del kit de Ig-PRIMER SET). Después de incubación a 37ºC durante 1 h, se añadieron 5 \mul de la reacción de síntesis de ADNc a una reacción de la PCR de 100 \mul que contenía: Tris-HCl 10 mM pH 9,0 a 25ºC, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,1% (p/v), Triton X-100 al 1,0% (v/v), 200 \muM de cada dNTP, 2,5 U de ADN polimerasa AMPLITAQ (Perkin-Elmer-Cetus, Norwalk, CT) y 25 pmoles de los cebadores 5' y 3' adecuados (como se describe en el protocolo del kit de Ig-PRIMER SET). Las condiciones de reacción eran 1 min a 95ºC, 1 min a 42ºC y 1 min a 72ºC durante 30 ciclos, seguido de una extensión final a 72ºC durante 10 min.

Los productos de la PCR que tenían el tamaño esperado (aproximadamente 450 pb) se clonaron en el vector pCRII (Invitrogen, San Diego, CA) usando un kit de clonación T/A (Invitrogen). El análisis de la secuencia de ADN de los fragmentos de ADN clonados se llevó a cabo por el método didesoxi de terminación de la cadena usando ADN plasmídico bicatenario como molde. Por este procedimiento se aisló una región variable de la cadena pesada única, con el plásmido resultante designado p5G1.1 VH 2-1-3. Se secuenciaron varios clones obtenidos de reacciones de la PCR de replicación independientes para detectar cualquier mutación introducida durante la amplificación por PCR de esta región variable.

Para clonar la región variable de la cadena ligera de 5G1.1, los cebadores de la PCR se diseñaron usando el programa UWGCG de TFASTA (University of Wisconsin, Madison, WI) para buscar en el subdirectorio de roedores de GenBank con la secuencia de aminoácidos problema de 19 aminoácidos Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr, que se obtuvo por la secuenciación de aminoácidos como se ha descrito antes. Se localizó una correspondencia exacta con esta secuencia en los genes de la línea germinal murina que codifica la región variable k2 v-kappa (Seidman y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1978 75:3881-3885). La secuencia de ADN de este gen de la línea germinal se usó para diseñar el oligonucleótido UDEC690 (SEQ ID NO: 5) para usar como cebador 5' de la región variable. También se sintetizó un cebador de la región constante del gen kappa murino, UDEC395 (SEQ ID NO: 6) y se usó en esta reacción. La clonación de la región ligera variable de 5G1.1 se llevó a cabo usando el cebador 5' de la región variable UDEC690 y el cebador de la región constante del gen kappa murino UDEC3.

Se aisló el PoliA-ARNm del hibridoma de 5G1.1. Se usó el procedimiento del ácido/tiocianato de guanidinio (Chomczynski y Sacchi, véase antes) para aislar el ARN total, y le siguió la cromatografía de oligo(dT)-celulosa de 1 mg de ARN total. Para la síntesis de la primera cadena del ADNc, se desnaturalizó 1 \mul de los 25 \mul de eluato de oligo(dT)-celulosa (que contenía aproximadamente 2 \mug de ARNm de 5G1.1 purificado) a 65ºC durante 5 min, se enfrió en hielo y se incubó en tampón de extensión (Tris 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, ditiotreitol 1 mM, 240 \muM de cada dNTP) que contenía UDEC395 100 nM (SEQ ID NO: 6) y 25 unidades de AMV transcriptasa inversa (Seikagaku America, Rockville, MD) a 42ºC durante 1 h. Se sometieron 5 \mul de la reacción de la primera cadena completada a amplificación por PCR usando el tampón de amplificación complementado con 2,5 unidades de ADN polimerasa AMPLITAQ (Perkin Elmer, Foster City, CA) y 500 nM de cada uno de los cebadores UDEC690 (SEQ ID NO: 5) y UDEC395 (SEQ ID NO: 6). La amplificación se llevó a cabo usando 30 ciclos, que consistía cada uno en 1 min a 95ºC, 1 min a 52ºC y 1 min a 72ºC, seguido de una sola incubación de 10 min a 72ºC.

El producto de la PCR resultante se purificó usando GENECLEAN de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Bio 101, La Jolla, CA), se hizo digerir con Sse8387 I y HindIII, se purificó en gel y se ligó al vector Bluescript II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA). Los plásmidos ligados se transformaron en la cepa bacteriana DH10B por electroporación.

El ADN plasmídico se purificó de los cultivos de bacterias transformadas por métodos convencionales, incluyendo la cromatografía en columna usando una columna QUIAGEN-TIP-500 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Quiagen, Chatsworth, CA) y se secuenció por el método didesoxi de Sanger de terminación de la cadena utilizando la enzima SEQUENASE (U.S. Biochemical, Cleveland, OH). Los clones obtenidos de una segunda reacción de PCR independiente verificaron que no se habían introducido mutaciones durante el procedimiento de amplificación. El plásmido resultante que contenía la región variable clonada se designó SK (+) 690/395. Este inserto que codifica la cadena ligera en este plásmido codificaba las secuencias de la cadena ligera tanto N-terminal como las internas, determinado por secuenciación de aminoácidos de 5G1.1, como se ha descrito antes.

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Ejemplo 11 Construcción y expresión de mAb recombinantes

Se preparan construcciones de ADN recombinantes que codifican los mAb recombinantes que comprenden las CDR de 5G1.1, por métodos de ADN recombinante convencionales, incluyendo procedimientos de subclonación de fragmentos de restricción y de PCR de superposición. Los ADN que codifican los mAb recombinantes incluyen:

(1) uno que codifica scFv no humanizado (murino) designado 5G1.1M1 scFv (SEQ ID NO: 7), en el que la CDR L1 son los restos de aminoácidos 28-34 del SEQ ID NO: 7, CDR L2 son los restos de aminoácidos 52-54 del SEQ ID NO: 7, CDR L3 son los restos de aminoácidos 93-98 del SEQ ID NO: 7, CDR H1 son los restos de aminoácidos 156-159 del SEQ ID NO: 7, CDR H2 son los restos de aminoácidos 179-183 del SEQ ID NO: 7, y CDR H3 son los restos de aminoácidos 226-236 del SEQ ID NO: 7;

(2) uno que codifica un scFv humanizado (CDR injertada) designado 5G1.1 scFv CB (SEQ ID NO: 8), en la que la CDR L1 son los restos de aminoácidos 26-36 del SEQ ID NO: 8, CDR L2 son los restos de aminoácidos 52-58 del SEQ ID NO: 8, CDR L3 son los restos de aminoácidos 91-99 del SEQ ID NO: 8, CDR H1 son los restos de aminoácidos 152-161 del SEQ ID NO: 8, CDR H2 son los restos de aminoácidos 176-192 del SEQ ID NO: 8, H3 son los restos de aminoácidos 225-237 del SEQ ID NO: 8;

(3) uno que codifica una cadena ligera quimérica (que puede formar la parte de la cadena ligera de un Fab) designado 5G1.1M1 VL HuK (SEQ ID NO: 9);

(4) uno que codifica un Fd quimérico (la parte de la cadena pesada de un Fab) designado 5G1.1M1 VH HuG1 (SEQ ID NO: 10);

(5) uno que codifica un Fd humanizado (CDR injertada y secuencia de la región armazón alterada) designado 5G1.1 VH + IGHRL (SEQ ID NO: 11), en el que la CDR H1 son los restos de aminoácidos 26-35 del SEQ ID NO: 11, CDR H2 son los restos de aminoácidos 50-60 del SEQ ID NO: 11, y CDR H3 son los restos de aminoácidos 99-111 del SEQ ID NO: 11;

(6) uno que codifica Fd humanizado (CDR injertada, región armazón no alterada) designado 5G1.1 VH + IGHRLC (SEQ ID NO: 12), CDR H1 son los restos de aminoácidos 26-35 del SEQ ID NO: 12, CDR H2 son los restos de aminoácidos 50-66 del SEQ ID NO: 12, y CDR H3 son los restos de aminoácidos 99-111 del SEQ ID NO: 12;

(7) uno que codifica una cadena ligera humanizada (CDR injertada y región armazón alterada) designado 5G1.1 VL + KLV56 (SEQ ID NO: 13), en el que CDR L1 son los restos de aminoácidos 26-36 del SEQ ID NO: 13, CDR L2 son los restos de aminoácidos 52-58 del SEQ ID NO: 13, y CDR L3 son los restos de aminoácidos 91-99 del SEQ ID NO: 13;

(8) uno que codifica una cadena ligera humanizada (CDR injertada, región armazón no alterada) designado 5G1.1 VL + KLV56B (SEQ ID NO: 14), en el que CDR L1 son los restos de aminoácidos 26-36 del SEQ ID NO: 14, CDR L2 son los restos de aminoácidos 52-58 del SEQ ID NO: 14, y CDR L3 son los restos de aminoácidos 91-99 del SEQ ID NO: 14;

(9) uno que codifica una cadena ligera humanizada (CDR injertada, región armazón no alterada) designado 5G1.1 VL + 012 (SEQ ID NO: 15), en el que CDR L1 son los restos de aminoácidos 24-34 del SEQ ID NO: 15, CDR L2 son los restos de aminoácidos 50-56 del SEQ ID NO: 15, y CDR L3 son los restos de aminoácidos 89-97 del SEQ ID NO: 15; y

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(10) uno que codifica un Fd humanizado (CDR injertada, región armazón no alterada) designado 5G1.1 VH + IGHRLD (SEQ ID NO: 16), en el que CDR H1 son los restos de aminoácidos 26-35 del SEQ ID NO: 16, CDR H2 son los restos de aminoácidos 50-60 del SEQ ID NO: 16, y CDR H3 son los restos de aminoácidos 99-111 del SEQ ID NO: 16.

(11) uno que codifica un scFv humanizado (CDR injertada, región armazón no alterada) designado 5G1.1 scFv DO12 (SEQ ID NO: 17), en el que CDR L1 son los restos de aminoácidos 26-36 del SEQ ID NO: 17, CDR L2 son los restos de aminoácidos 52-58 del SEQ ID NO: 17, CDR L3 son los restos de aminoácidos 91-99 del SEQ ID NO: 17, CDR H1 son los restos de aminoácidos 152-161 del SEQ ID NO: 17, CDR H2 son los restos de aminoácidos 176-186 del SEQ ID NO: 17, y CDR H3 son los restos de aminoácidos 225-237 del SEQ ID NO: 17.

De acuerdo con la invención, cada una de las diferentes CDR L1, L2 y L3 discutidas en (1) a (11) anteriores, se puede combinar con cualquiera de las otras CDR de cadena ligera, para hacer así un conjunto de 3 CDR de cadena ligera que comprenden una CDR L1, una L2 y una L3, como parte de un anticuerpo recombinante o anticuerpo peptídico sintético (es decir, un péptido sintético con la secuencia de un péptido recombinante de la invención).

De acuerdo con la invención, cada una de las diferentes CDR H1, H2 y H3 discutidas en (1) a (11) anteriores, se puede combinar con cualquiera de las otras CDR de cadena ligera, para hacer así un conjunto de 3 CDR de cadena ligera que comprenden una CDR H1, una H2 y una H3, como parte de un anticuerpo recombinante o anticuerpo peptídico sintético (es decir, un péptido sintético con la secuencia de un péptido recombinante de la invención).

De acuerdo con la invención, las parejas coincidentes de las regiones variables (p. ej., una región VL y una VH) de las diferentes moléculas de anticuerpo, Fd, y las cadenas ligeras descritas antes, se pueden combinar con dominios de región constante por ADN recombinante u otros métodos conocidos en la materia, para formar anticuerpos de longitud completa de la invención. Las regiones constantes particularmente preferidas para este propósito son las regiones constantes de IgG, que pueden no estar alteradas o estar construidas de una mezcla de dominios constantes de IgG de diferentes subtipos, p. ej. IgG1 e IgG4.

Las parejas coincidentes de los ADN que codifican Fd y la cadena ligera descritas inmediatamente antes, es decir (3) y (4), (5) y (7), (6) y (8), y (6) y (9), se subclonaron juntas en el vector APEX-3P, esencialmente como se describe más adelante en el ejemplo 15 para N19/8. Las construcciones de scFv de (1) y (2) se subclonaron en pET Trc SO5/NI usando técnicas convencionales.

Los plásmidos así obtenidos se introdujeron en la cepa bacteriana ME2 (plásmidos pET) por electroporación convencional, o en células 293 EBNA humanas (plásmidos APEX) por lipofección usando 2-3 \mul de reactivo TRANSFECTAM (Promega, Madison, WI) por \mug de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las cepas bacterianas ME1 y ME2 derivan de la cepa W3110 de Escherichia coli (designación en ATCC 27325).

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Preparación de los derivados de W3100, ME1 y ME2

El 5Gl.l-scFv murino no quimérico, no humanizado, "m5Gl.l-scFv", compuesto de la cadena ligera (3) y Fd (4), se expresó en un derivado de la cepa W3110 de E. coli K12. Este derivado se preparó por inactivación de un gen no caracterizado para proporcionar protección frente a infecciones por un bacteriófago lítico. La cepa W3110 de E. coli es una cepa particularmente preferidas porque está totalmente caracterizada y se usa habitualmente para las fermentaciones de productos de ADN recombinante.

Se hizo crecer una sola colonia de la cepa W3110 de E. coli durante la noche en medio L a 30ºC. Las células se recogieron por centrifugación y se volvieron a suspender en MgSO_{4} 10 mM. Se añadió un total de 0,1 ml del cultivo a 2,5 ml de agar blando L al 0,7% a 45ºC y se vertió rápidamente en una placa L. Se aplicaron como manchas puntuales 50 \mul de partes alícuotas de un lisato de fago purificado en placa, sin diluir, diluido a 10^{-2} y diluido a 10^{-4}, sobre la superficie del agar. Los lisatos de fago se habían filtrado previamente a través de membranas de 0,45 \mum y se conservaron en tubos estériles con una gota de cloroformo a 4ºC. Las manchas se dejaron secar en la superficie del agar blando y se incubaron durante una noche a 37ºC.

Al día siguiente se esparcieron sobre placas L 10^{9} UFC de fago y se dejaron secar. Usando un palillo plano estéril, células de colonias aisladas que crecían en las zonas de lisis de fago en las placas en las que se aplicaron las manchas, se aplicaron en estrías para colonias individuales en las placas en las que se esparcieron 10^{9} UFC de fagos y se incubaron durante la noche a 37ºC. Se volvió a comprobar la resistencia a fagos de las colonias individuales mediante aplicación cruzada en estrías después de la purificación de las colonias individuales. El ensayo de estrías cruzadas de sensibilidad a fago se llevó a cabo como sigue. Se esparcieron 50 \mul de fagos (10^{8} ufc/ml) en una línea vertical en la parte izquierda de la placa usando una pipeta Pasteur. Se ensayaron fagos adicionales en paralelo a la primera y a la derecha. Se dejó secar la placa y las cepas en las que se iba a comprobar la sensibilidad o resistencia se esparcieron en perpendicular y de un lado a otro de las líneas de todos los fagos en una sola franja de izquierda a derecha. Las cepas resistentes crecen en la zona de las estrías de fagos mientras que las cepas sensibles sufren la lisis.

Se ensayó en la cepa mutante resistente a fago ME1 la producción de fagos después de crecer durante la noche en medio L y tratamiento con agente deteriorante de ADN, la mitomicina C. La cepa no pudo producir fagos viables utilizando un ensayo en placa estándar y E. coli W3110 como la cepa indicadora sensible a fagos. Estos resultados sugieren que la cepa ME1 no alberga un profago residente.

Se construyó la cepa ME2 mediante integración específica del sitio del profago lambdaDE3 (Studier y col. 1990, Meth. Enzymol. 185:60-89) en el cromosoma de ME1. La expresión de la ARN polimerasa T7, dirigida por el fago, permite la expresión de genes diana clonados en vectores pET (Studier y col., véase antes) bajo el control del promotor de T7 en el huésped lisogenizado. La lisogenización se llevó a cabo en una infección de 3 modos con lambdaDE3, el fago auxiliar lambda, lambdaB10 y el fago de selección, lambdaB482 (Studier y col., véase antes).

Studier y colaboradores (1990, Meth. Enzymol. 185:60-89) construyeron lambdaDE3 (imm21) insertando el gen de la ARN polimerasa T7 detrás del promotor de E. coli lacUV5 en el sitio de clonación BamHI de lambdaD69 (imm21). Puesto que la clonación en el sitio BamHI de lambdaD69 interrumpe el gen de integrasa, lambdaDE3 no puede integrarse o escindirse del cromosoma por si mismo. El fago auxiliar lambdaB10 proporciona la función de integrasa de la que carece lambdaDE3 pero no puede formar un lisógeno por si mismo. El fago de selección, lambdaB482, produce la lisis de cualquier mutante de la variedad de huéspedes de lambdaDE3 que de lo contrario estaría entre las células supervivientes, pero no puede integrarse en células susceptibles ni producir la lisis de lisógenos lambdaDE3 puesto que tiene la misma región de inmunidad que lambdaDE3 (imm21).

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Protocolo de lisogenización

Se hizo crecer la cepa ME1 en medio L complementado con maltosa al 0,2% y MgSO_{4} 10 mM a 37ºC hasta una densidad de aproximadamente 10^{8} células/ml. Se incubó 1 \mul de células ME1 con 2 x 10^{8} unidades formadoras de placa (ufp) de lambdaDE3 y 10^{8} ufp de lambdaB10 y lambdaB482. La mezcla de huésped/fago se incubó a 37ºC durante 20 min para permitir la adsorción de fago en las células ME1. Se esparcieron varias diluciones de la suspensión de célula/fago en placas L para producir placas que contenían aproximadamente 30-200 lisógenos candidatos como colonias aisladas. Las placas se invirtieron y se incubaron a 37ºC durante la noche. Se seleccionaron varias colonias aisladas para la adquisición del profago lambdaDE3 como se describe más adelante.

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Verificación de lisógenos de lambdaDE3

Se ensayó en los candidatos de lisógenos de lambdaDE3 la capacidad para soportar el crecimiento del fago 4107 T7, un mutante por deleción del fago T7 que es completamente defectuoso salvo que se proporcione la ARN polimerasa T7 activa en trans. Solo los lisógenos de lambdaDE3 soportarán el crecimiento normal del fago en presencia de IPTG (isopropil-beta-tiogalactopiranósido). El fago T7 produce placas muy grandes en lisógenos de lambdaDE3 en presencia de IPTG, mientras que se observan placas muy pequeñas en ausencia de inductor. El tamaño de la placa en ausencia de ITPG es una indicación del nivel basal de expresión de la ARN polimerasa T7 en el lisógeno. Los lisógenos de lambdaDE3 putativos se hicieron crecer en caldo L complementado con maltosa al 0,2% y MgSO_{4} 10 mM a 37ºC hasta una densidad celular de aproximadamente 10^{8} células/ml. Se centrifugaron un total de 0,5 ml de células y el sedimento se volvió a suspender en 0,2 ml de un lisato de fago T7 que contenía 2 x 10^{4} ufc. Se dejó que el fago se adsorbiera durante 30 min a 37ºC. Se añadió la mitad de la suspensión (0,1 ml) a 3,0 ml de Top-agarosa fundida a 47ºC y se vertió en placas L. La parte alícuota restante de la suspensión de células/fago se vertió en una placa L complementada con IPTG 0,4 mM para comprobar la inducción de la ARN polimerasa T7. Las placas se invirtieron y se incubaron a 37ºC durante la noche.

También se ensayó en las cepas la presencia del lisógeno de lambdaDE3, demostrando que cada cepa era resistente a la infección por el fago lambdaB482, que está en el mismo grupo de inmunidad (imm21), por el método de estrías cruzadas descrito antes. Se eligió un lisógeno con un nivel de expresión basal bajo para la producción de proteína a partir de vectores pET. La cepa resultante, denominada ME2, es resistente a fagos y sobreexpresa la ARN polimerasa T7 en presencia de IPTG.

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Purificación de 5G1.1-scFv humanizado de E. coli

La construcción de ADNc de 5Gl.l-scFv humanizado (h5Gl.1-scFv) se clonó en el plásmido de expresión bacteriano pET Trc SO5/NI (SEQ ID NO: 18) y se transformó en la cepa de E. coli ME1. La cepa resultante que expresaba h5Gl.1-scFv se hizo crecer a 37ºC en fermentadores de recipiente de vidrio Applikon de 2 litros que contenían Caldo Terrific (bacto-triptona al 1,2% (p/v), extracto de levadura bacto al 2,4% (p/v), glicerol al 0,4% (v/v), KPO_{4} 90 mM, pH 7,0) complementado con ampicilina 100 \mug/ml. La producción de scFv recombinante se indujo por la adición de IPTG 1 mM cuando la DO_{550} del cultivo alcanzó 10. Después de 3 h adicionales de incubación a 37ºC, las células se recogieron por centrifugación y los sedimentos celulares se conservaron a -80ºC.

Las células se volvieron a suspender en EDTA 1 mM, pH 5,0 a 10 ml/g de peso y se lisaron mediante un solo paso por un microfluidizador (Modelo M110T, Microfluidics Corp., Newton, MA). Después de centrifugación a 17.500 x g durante 15 min, el sedimento de cuerpos de inclusión resultante se lavó volviéndolo a suspender en Trsi-HCl 20 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, desoxicolato al 0,15% (p/v) a 10 ml/g de cuerpos de inclusión, usando un Tekmar POLYTRON. Los cuerpos de inclusión se volvieron a sedimentar por centrifugación a 17.500 x g durante 15 min y se volvieron a suspender en Tris-HCl 20 mM, pH 9,0, urea 8 M a 10 ml/g. Después de agitación durante 1 h, la muestra se centrifugó a 14.000 x g durante 30 min, para sedimentar el material que permanecía insoluble.

El líquido sobrenadante del extracto se diluyó 10 veces con Tris-HCl 20 mM, pH 9,0, urea 7 M, sulfato cúprico 50 \muM y se dejó agitar durante al menos 16 horas a 4ºC para replegar el scFv. Después de añadir Biocryl BPA-1000 (TosoHaas, Montgomeryville, PA) como agente de floculación en 3 \mul/ml, la muestra se centrifugó a 15.000 x g durante 10 min para separar el material insoluble. La mezcla de replegado se intercambió en Tris 20 mM, pH 9,0, EDTA 1 mM por diafiltración y se concentró por ultrafiltración usando una celda agitada equipada con una membrana YM10 (Amicon, Beverly, MA).

Después se separó el scFV replegado adecuadamente del material agregado y proteínas contaminantes por cromatografía de intercambio aniónico usando flujo rápido por Q Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Se eluyó el scFv unido con Tris-HCl 20 mM, pH 9,0, EDTA 1 mM que contenía un gradiente lineal de NaCl (de 0 a 0,5 M). Las fracciones que contenían el scFv se combinaron, se concentraron por ultrafiltración usando una celda agitada equipada con una membrana YM10, y se aplicaron a una columna Sephacryl S200 HR 25/100 (Pharmacia) equilibrada en Tris-HCl 20 mM pH 9, EDTA 0,1 mM, NaCl 150 nM. Las fracciones que contenían el scFv se combinaron, se intercambiaron en disolución salina tamponada con fosfato por diafiltración, se concentraron por ultrafiltración, se filtraron a través de un filtro de 0,22 \mum Millex-GV (Millipore, Bedford, MA) y se conservaron a 4ºC.

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Purificación de m5G1.1-scFv de E. coli

La pasta de células bacterianas congeladas se descongeló y se volvió a suspender en 2,5 ml de EDTA 1 mM (pH 5) por gramo de pasta celular. Esta suspensión de células se lisó por paso a través de un microfluidizador (Microfluidics) con la cámara de interacción en línea y una presión de fondo de aproximadamente 126 kg/cm^{2}. Después, el lisato celular se centrifugó a 10.000 rpm en un rotor de centrífuga JA-10 a 4ºC durante 15 min. El líquido sobrenadante se decantó y se descartó.

El sedimento se volvió a suspender en 10 ml de Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, desoxicolato sódico al 0,15%, por gramo de sedimento. Esta suspensión se centrifugó como antes durante 10 min. Se decantó y descartó otra vez el líquido sobrenadante. Después, este sedimento lavado con detergente se volvió a suspender en 10 ml de urea 8 M, Tris-HCl 20 mM, pH 9, EDTA 1 mM. La suspensión se agitó a 4ºC durante 1 h y después se diluyó 10 veces con urea 7 M, Tris-HCl 20 mM, pH 9, y se agitó a 4ºC. Después se añadió CuSO_{4} hasta una concentración final de 50 \muM y se continuó agitando durante la noche a 4ºC.

La mayoría de las proteínas contaminantes (incluyendo las versiones de m5G1.1-scFv plegadas incorrectamente) se separaron después por precipitación, dilución (con agitación) de la muestra replegada 5 veces con tampón de modo que las concentraciones finales después de dilución eran urea 1,4 M, NaCl 25 mM, EDTA 1 mM, y acetato sódico 20 mM, a 4ºC. El pH del tampón de dilución cuando se preparó a temperatura ambiente era pH 5,0. Antes de la dilución, el pH del tampón de dilución se determinó a 4ºC. Después de la dilución, el pH de la muestra era mayor de pH 5,5. Después, el pH de la muestra se ajustó con HCl 6 N al pH inicial de pH 5,0 del tampón. La disolución se volvió turbia inmediatamente y se dejó agitando a 4-8ºC durante 0,5 a 24 horas.

El precipitado se separó por filtración de la muestra a través de una membrana de ultrafiltración con corte de exclusión de 300 kDa (Millipore Corporation, Bedford, MA). El permeado se recogió y se concentró 5 veces usando una membrana de ultrafiltración con corte de exclusión de 10 kDa (Millipore). Después, este retenido concentrado se diluyó 2 veces con acetato de sodio 20 mM, EDTA 1 mM, pH 5,0 con el fin de reducir la concentración de NaCl a 12,5 mM.

El retenido diluido después se cargó a 4ºC en una columna SP Sepharose FF (Pharmacia) equilibrada en urea 0,7 M, EDTA 1 mM, NaCl 10 mM, acetato sódico 20 mM, pH 5,0, con un caudal lineal de 5 cm/min. La altura del lecho era igual o mayor que 3,5 cm. Después de la carga, la columna se lavó con 40 volúmenes de columna (VC) de tampón de equilibrado. Después la columna se lavó con 20 VC de acetato sódico 20 mM, pH 5,0, EDTA 1 mM. El scFv unido después se eluyó usando citrato sódico 20 mM, pH 5,8, EDTA 1 mM. Se recogió un solo pico en aproximadamente 4 volúmenes de columna.

El eluato de la columna de SP Sepharose se ajustó a Tris-HCl 20 mM por adición de Tris-HCl 1 M, pH 8. El pH de la muestra se ajustó a 8,0 por adición de NaOH 1 N. Esta muestra se cargó en una columna de Q Sepharose FF (Pharmacia) equilibrada en Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM a temperatura ambiente con un caudal de 5 cm/min. Se recogieron las fracciones del flujo que contenían scFv.

Después las fracciones del flujo de Q Sepharose se ajustaron a NaCl 150 mM y se concentraron a 10 mg de scFv por ml usando una membrana de ultrafiltración con corte de exclusión de 10 kDa. Esta muestra concentrada después se cargó en una columna Sephacryl S200 equilibrada en disolución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 y se eluyó a 0,4 cm/min. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE y se tiñeron con plata. Las fracciones de los picos se combinaron después de descartar las fracciones del borde del frente y el final que contenían la mayoría de los contaminantes.

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Ejemplo 12 Análisis funcional de m5G1.1 scFv

La valoración de m5G1.1 scFv en ensayos hemolíticos puso de manifiesto que m5G1.1 scFv inhibía la lisis mediada por el complemento humano de una forma dependiente de la dosis (fig. 13). La comparación directa de la eficacia de m5G1.1 scFv frente a mAb 5G1.1 y Fab, demostraron que m5G1.1 scFv bloqueaba completamente la hemólisis mediada por C5b-9 en suero humano al 20% con 0,15 \muM, mientras que el mAb 5G1.1 y Fab la bloqueaban con 0,06-0,08 \muM. El análisis de la generación de C5a en estos ensayos puso de manifiesto resultados similares en cuanto que m5G1.1 scFv bloqueaba completamente la generación de C5a con 0,15 \muM, mientras que el mAb 5G1.1 y Fab la bloqueaban con 0,06-0,08 \muM (fig. 14). Considerados juntos, estos experimentos indicaban que a diferencia de N19/8, que perdía la mitad de su eficacia en el bloqueo de la generación de C5a tras ser diseñado como un scFv (SEQ ID NO: 19), el scFv de m5G1.1 murino retenía la capacidad de bloquear la generación tanto de C5a como de C5b-9.

Además, estos datos demuestran que m5G1.1 scFv retenía una actividad similar a la de la molécula original (el mAb 5G1.1 murino nativo) en cuanto que la concentración molar de scFv murino de 5G1.1 necesaria para bloquear completamente C5a y C5b-9 (0,15 \muM) era el doble de la necesaria para el mAb 5G1.1 y Fab (0,06-0,08 \muM).

Con el fin de determinar si m5G1.1 scFv retenía la capacidad de bloquear la activación del complemento en el modelo ex vivo de derivación cardiopulmonar, se añadieron 4,5 mg del scFv murino 5G1.1 producido con bacterias purificado al circuito de CPB y se siguió la activación del complemento. En experimentos de control, los niveles tanto de C3a como de C5b-9 aumentaron en el transcurso del tiempo del experimento. En un experimento único, la adición de 4,5 mg de m5G1.1 scFv al circuito de CPB no tenía efecto en la generación de C3a (fig. 15). A la inversa, la actividad hemolítica del complemento así como la generación de sc5b-9 se bloquearon completamente en este experimento (fig. 16 y 17).

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Ejemplo 13 Caracterización del epítopo reconocido por 5G1.1

Digestión tríptica: Se sometieron 20 \mug de C5 humano purificado (Advanced Technologies, San Diego, CA) a digestión enzimática con 1 \mug de tripsina tratada con TPCK (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ). Se dejó que la digestión continuara durante 3 minutos, y después de este tiempo se paró por adición de 20 \mug de inhibidor de tripsina de soja (Worthington). Después la reacción se desnaturalizó y se redujo por adición de tampón de muestra de proteína y se hirvió inmediatamente durante 5 min. Los fragmentos digeridos se fraccionaron por tamaño por SDS-PAGE en un gel al 12%. Después el gel se electrotransfirió en tampón de transferencia (metanol al 20% (v/v), Tris-base 25 mM pH 8,0, y glicina 192 mM) a nitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y se sometió a análisis de transferencia western ECL usando 5G1.1 o un anticuerpo monoclonal específico de C5a (G25/2, obtenido de Dr. Otto Götze, Department of Immunology, University of Göttingen, Alemania).

Los filtros se incubaron dos veces durante 30 min caca vez en disolución de bloqueo (NaCl 500 mM, Tris 5 mM pH 7,4, leche en polvo desnatada al 10% (v/v) y Tween-20 al 0,2% (v/v). Después los filtros se cambiaron a disolución de bloqueo de nueva aportación (20 ml) que contenía el anticuerpo primario y se incubaron durante 40 minutos en una plataforma oscilante. Los filtros se aclararon brevemente con disolución de lavado (NaCl 500 mM, Tris 35 mM pH 7,4, SDS al 0,1%, NP40 al 1% y ácido desoxicólico al 0,5%) para separar cualquier resto de leche, y después se añadió disolución de lavado de nueva aportación y se incubó durante 2 intervalos de 20 minutos en un agitador orbital. Los filtros se aclararon brevemente con 10 a 20 ml de disolución de anticuerpo secundario (NaCl 500 mM, Tris 5 mM pH 7,4, leche en polvo desnatada al 10% (v/v), Tween-20 al 0,2% (v/v) y NP40 al 1%) y después se incubaron con disolución de anticuerpo secundario de nueva aportación que contenía una dilución 1:2000 de anti-ratón de cabra conjugado con HRP durante 20 minutos en una plataforma oscilante. Después, los filtros se lavaron como se ha descrito antes, se incubaron en reactivo ECL (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) durante 1 minuto y después se expusieron a ECL Hyperfilm (Amersham).

Hidrólisis ácida: Se sometieron 20 \mug de C5 humano purificado (Advanced Technologies) a hidrólisis en ácido acético 1 N. Los 20 \mug de C5 humano (1 \mug/ml) se añadieron a 20 \mul de ácido acético 2 N y se incubaron durante 10 min a 100ºC. La muestra se desnaturalizó y se redujo con tampón de muestra de proteína, también a 100ºC durante 5 minutos. El ácido se neutralizó por adición de una disolución saturada de base de tris hasta que la muestra se volvió azul. Los productos de escisión después se fraccionaron por tamaño por SDS-PAGE y se sometieron a transferencia western como se ha descrito antes. Para la secuenciación N-terminal, el hidrolizado ácido fraccionado en el gel se transfirió a membrana de PVDF. La secuencia N-terminal se obtuvo por corte de la banda del fragmento de hidrólisis ácida de 46 kDa de una membrana de PVDF y se sometió a análisis de secuencia de aminoácidos como se ha discutido antes en el ejemplo 10.

Desglicosilación: Los fragmentos trípticos o hidrolizados con ácido reducidos y desnaturalizados se sometieron a desglicosilación con N-glicosidasa F (Peptide-N-Glycosidase F, Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Resultados: La hidrólisis ácida de C5 humano dio un fragmento con un peso molecular aparente por SDS-PAGE de 46 kDa que era inmunorreactivo tanto para el mAb anti-C5a G25/2 como el mAb anti-cadena alfa de C5 5G1.1. Las transferencias western hibridadas con ambos anticuerpos simultáneamente, así como el análisis por SDS-PAGE con tinción con plata, confirmaron la presencia de un solo fragmento de 46 kDa que era inmunorreactivo con ambos anticuerpos. La presencia de un solo fragmento inmunorreactivo que contenía sitios de unión tanto para 5G1.1 como para G25/2 sugería fuertemente que el epítopo de 5G1.1 estaba aproximadamente en los primeros 46 kDa del extremo N de la cadena alfa de C5.

Como se ha discutido antes en la descripción del sistema del complemento en el apartado "antecedentes de fisiología y patología", un compuesto (p. ej., un anticuerpo) que se une a un sitio en o inmediatamente adyacente al sitio de escisión de C5a, tendría el potencial de actuar como un inhibidor del complemento terminal. La potencial actividad inhibidora de los anticuerpos que se unen a este sitio conduce a la esperanza de que el anticuerpo 5G1.1 que se une a la cadena alfa de C5a se una a un epítopo en o cerca del sitio de escisión de C5a. El descubrimiento de que 5G1.1 se une al fragmento de hidrólisis ácida de 46 kDa de C5 apoya esta esperanza.

Los análisis de transferencia western de los productos de digestión tríptica identificaron un fragmento proteolítico que migraba a aproximadamente 27 kDa que era inmunorreactivo con 5G1.1. Igualmente, se observó un fragmento proteolítico inmunorreactivo que migraba a aproximadamente 29 kDa después del análisis de transferencia western con el mAb anti-C5a G25/2. Los experimentos en los que se hibridó simultáneamente una transferencia tanto con 5G1.1 como con G25/2 demostraron que cada banda era distinta y que su movilidad diferencial aparente no era una anomalía del gel. Esto era sorprendente, porque se pensó que el mAb 5G1.1 era probable que se uniera al sitio de escisión de la C5 convertasa. Por lo tanto, se esperaba que 5G1.1 fuera inmunorreactivo con cualquier fragmento de C5 de más de 12 kDa que presentaba inmunorreactividad con G25/2. Dicho fragmento contendría suficiente del extremo amino terminal de la cadena alfa de C5 para unirse específicamente al mAb anti-C5a y suficiente más allá para abarcar una región que incluye y se extiende más allá del sitio de escisión de la convertasa C5.

La inmunorreactividad de G25/2 con el fragmento de 29 KDa indicaba que este fragmento contenía la región N-terminal de la cadena alfa de C5 que se escinde para dar C5a. Además, debido a que 5G1.1 no era inmunorreactivo con esta banda, no era probable que el epítopo de 5G1.1 estuviera contenido en aproximadamente los primeros 29 kDa del extremo N de la cadena alfa de C5, y por lo tanto no se podría localizar cerca del sitio de escisión de la C5 convertasa.

Esta digestión tríptica y los datos de la cartografía de la hidrólisis ácida sugerían que el epítopo de 5G1.1 estaba contenido en una región que empezaba a aproximadamente 29 kDa (incluyendo las modificaciones postraduccionales) del extremo N de la cadena alfa de C5 y continuaba 17 kDa en una dirección C-terminal, es decir, terminando 46 kDa desde el extremo N, un descubrimiento sorprendente en vista de que se esperaba, como se ha discutido antes, que el anticuerpo se uniera en o inmediatamente adyacente al punto en el que C5a es escindido de la cadena alfa de C5, es decir, en o inmediatamente adyacente al resto de aminoácido 733 del SEQ ID NO: 2.

Las modificaciones postraduccionales pueden alterar la movilidad de proteínas durante la electroforesis por SDS-PAGE. Una de dichas modificaciones es la adición de hidrato de carbono por la glicosilación unida a N. Como se ha discutido antes en el apartado "Antecedentes de fisiología y patología", C5 es glicosilado, como lo es C5a. C5a es glicosilado en un resto de asparagina correspondiente al número de aminoácido 723 del precursor pro-C5 de longitud completa de C5 humano (SEQ ID NO: 2).

El análisis por ordenador de la cadena alfa de C5 humano sugiere potenciales sitios de glicosilación unidos a N en las posiciones correspondientes a los números de aminoácido 893, 1097 y 1612 del SEQ ID NO: 2. Con el fin de determinar la contribución del hidrato de carbono a la movilidad electroforética de los fragmentos tanto tríptico como ácido, se llevó a cabo la desglicosilación enzimática de los fragmentos y se siguió por análisis de transferencia western. Se determinó que cada fragmento tríptico perdía aproximadamente 3 kDa de peso molecular aparente, mientras que el fragmento ácido perdía aproximadamente 6 kDa.

Se interpretó que este resultado indicaba que los fragmentos trípticos se glicosilaban cada uno en un solo sitio, y que el fragmento ácido de 46 kDa se glicosilaba en dos sitios (uno de los cuales era el sitio de glicosilación conocido en C5a al que se ha hecho referencia antes). La menor movilidad observada después de la desglicosilación está de acuerdo con la predicción calculada de un segundo sitio de glicosilación unido a N en los primeros 233 aminoácidos de la cadena alfa de C5.

El análisis de secuencia N-terminal determinó que los 4 primeros aminoácidos del fragmento de 46 kDa generados por el tratamiento con ácido acético 1 N eran Thr Leu Gln Lys. Esta secuencia se encuentra solo una vez en la molécula precursora pro-C5 humana de longitud completa, en una posición correspondiente a los aminoácidos del 660 al 663 del SEQ ID NO: 2. Esta secuencia de 4 aminoácidos también corresponde a la secuencia del extremo amino de la cadena alfa de C5 humano y, por lo tanto, al extremo amino de C5a humano.

Con el fin de hacer el mapa más preciso del sitio de unión de 5G1.1, se llevó a cabo el análisis de superposición de péptidos. La secuencia predicha que debía estar contenida en la sección de 17 kDa de C5 humano descrita antes (SEQ ID NO: 2; aminoácidos 893 a 1019) junto con una extensión de 43 aminoácidos hacia el extremo N y 30 aminoácidos hacia el extremo C (un total de 200 aminoácidos), se sintetizó como una serie de 88 péptidos que se superponían, por síntesis en fase sólida en filtros de polipropileno (Research Genetics Inc., Huntsville, AL).

Las extensiones de 43 y 30 aminoácidos se añadieron para permitir posibles incorrecciones en la predicción del intervalo de esta región de 17 kDa. Dichas incorrecciones se deben probablemente a la incertidumbre de la extensión específica de la glicosilación de cada una de las diferentes regiones de C5a, así como a la movilidad en gel aberrante que se observa habitualmente cuando se analizan polipéptidos con cargas altas (tales como el fragmento 5G46k y el fragmento 5G27k) por SDS- PAGE. Como se ha discutido antes en el Resumen de la invención, un péptido de 200 aminoácidos correspondiente a la región cubierta por estos péptidos que se superponen se denomina en el presente documento el péptido "5G200aa".

Debido a que se esperaba que el anticuerpo 5G1.1 se uniera al sitio de escisión de C5a, se sintetizó un conjunto adicional de 8 péptidos que se superponían que abarcaban una sección de 30 aminoácidos que abarcaban el sitio de escisión de C5a (aminoácidos 725 a 754 del SEQ ID NO: 2). Un péptido que tiene la secuencia de esta sección de 30 aminoácidos se denomina en el presente documento el "péptido del sitio de escisión"). Un péptido de 325 aa que abarca los restos de aminoácidos 725-1049 del SEQ ID NO: 2 (este péptido abarca la región cubierta por el péptido del sitio de escisión y el péptido 5G200aa) se denomina en el presente documento el péptido "5G325aa".

Estos filtros se hibridaron con 5G1.1 como se ha descrito antes para el análisis de transferencia western ECL, y un conjunto de 4 péptidos que se superponían que abarcaban la región correspondiente a los restos de aminoácidos 3-19 del péptido KSSKC (SEQ ID NO: 1), dio cada uno una señal positiva que indicaba la unión del anticuerpo monoclonal, mientras que los péptidos correspondientes al sitio de escisión de C5a no se unían al anticuerpo 5G1.1.

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Ejemplo 14 Ensayo de unión de C3/C4

C3 y C4 son ambos componentes clave de la C5 convertasa clásica y C3 también es un componente clave de la C5 convertasa alternativa. Estas C5 convertasas son necesarias para la conversión de C5 en C5a y C5b activos. Por lo tanto, la capacidad para bloquear la unión de C5 a C3 y C4 es una propiedad conveniente para un anticuerpo que se va a usar en el tratamiento de enfermedades mediadas por el complemento, de acuerdo con la presente invención.

Placas de 96 pocillos de microtitulación se recubrieron con 50 \mul/pocillo de C3 o C4 humano purificado 10 \mug/ml (Quidel) durante 1 h a 37ºC. Después, las placas se bloquearon con 200 \mul/pocillo de TBS que contenía BSA al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de 3 lavados en BSA al 0,1% en TBS, se añadió C5 humano purificado (Quidel, 20 \mug/ml en TBS al 1% en BSA) a las placas en presencia (20 \mug/ml) o ausencia de un Fab 5G1.1 (derivado de 5G1.1 por digestión con papaína convencional) y se dejaron incubar durante 1 hora a 37ºC. Después de 3 lavados en BSA al 0,1%/TBS, se añadió un anticuerpo monoclonal dirigido contra la cadena beta de C5 (N19/8, 5 \mug/ml) a los pocillos para detectar C5 unido a C3 o C4. Después de 3 lavados finales en BSA al 0,1%/TBS, se reveló la placa usando un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante y el sustrato adecuado.

Los resultados de estos ensayos mostraron que el mAb 5G1.1 inhibía la unión de C5 humano purificado a C3 o C4 en al menos 60% a 90%. Tal como se usa en el presente documento y las reivindicaciones, dicha reducción de 60% a 90% en la unión de C3 o C4 es una "reducción sustancial" en la unión de C3 o C4.

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Ejemplo 15 Construcción y análisis funcional de Fab quimérico N19/8

Las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera del hibridoma N19-8 se clonaron por PCR usando Ig-Prime System (Novagen) como describe el fabricante. Los clones de múltiples reacciones de PCR independientes se secuenciaron para detectar mutaciones introducidas durante la amplificación por PCR. Se creó un ADNc quimérico de VL de N19-8/región constante kappa humana usando un plásmido que contenía la región variable de la cadena ligera de N19-8 y el plásmido pHuCK (Hieter y col., 1980 Cell, 22:197-207) como moldes en una reacción de PCR de superposición.

Igualmente, se creó un ADNc quimérico de VH de N19-8/Fd de IgG1 humana usando un plásmido que contenía la región variable de la cadena pesada de N19-8 y un plásmido que contenía el gen de IgG1 humana (obtenido de Ilan R. Kirsch, National Cancer Institute, Bethesda, MD) como moldes. Esta construcción de Fd contenía los 9 primeros aminoácidos de la región bisagra de IgG1, incluyendo el resto cisteína que normalmente forma un enlace disulfuro con el reto cisteína terminal de la cadena ligera kappa.

Los ADNc quiméricos resultantes se clonaron por separado en el vector APEX-1 usando los sitios de enzimas de restricción flanqueadores adecuados introducidos durante el procedimiento de amplificación por PCR, y se secuenciaron. Un fragmento que contenía el promotor, intrón e inserto de ADNc de uno de estos vectores APEX se subclonó posteriormente en el policonector del otro para producir un solo vector que dirigía la expresión tanto de la cadena ligera como de Fd. El casete de expresión en tándem de este vector APEX-1 se subclonó posteriormente en APEX-3P, que se transfectó en células 293 EBNA para la expresión de Fab quimérico.

Cuando se ensayó la capacidad de bloquear la actividad hemolítica del complemento y la generación de C5a, el Fab de N19/8 quimérico retenía la capacidad para bloquear la actividad hemolítica, pero perdía 50% de su capacidad de bloqueo de la generación de C5a.

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Reichmann, y col., 1988, Nature. 332. pág. 323-327.

Remington's Pharmaceutical Sciences. 17ª Ed. 1985, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA.

Rich, 1992, en Cecil Textbook of Medicine. 19ª Ed. (Wyngaarden, Smith, and Bennett, eds.) W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA, Cap. 249, pág. 1467-1470.

Robbins y Cotran, 1979, Pathologic Basis of Disease. 2ª Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA, pág. 1128-1129.

Rodrigues, y col., 1993, Journal of Immunology. 151. pág. 6954-6961.

Salant, y col., 1980, Journal of Clinical Investigations. 66, pág. 1339-1350.

Schrijver, y col., 1988, Laboratory Investigation. 59, pág. 484-491.

Schrijver, y col., 1990, Kidney International. 38, pág. 86-95.

Unanue and Dixon, 1964, Journal of Experimental Medicine. 119, pág. 965-982.

Winter y Milstein, 1991, Nature. 349, 293-299.

Wurzner, y col., 1991, Complement Inflammation. 8, 328-340.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Prevención/reducción de la proteinuria por el tratamiento con anticuerpos anti-C5

1

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Evans, Mark J.

\hskip3.9cm

Matis, Louis A.

\hskip3.9cm

Mueller, Eileen Elliott

\hskip3.9cm

Nye, Steven H.

\hskip3.9cm

Rollins, Scott

\hskip3.9cm

Rother, Russell P.

\hskip3.9cm

Springhorn, Jeremy P.

\hskip3.9cm

Squinto, Stephen P.

\hskip3.9cm

Thomas, Thomas C.

\hskip3.9cm

Wang, Yi

\hskip3.9cm

Wilkins, James A.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTO Y COMPOSICIONES PARA EL TRATAMIENTO DE LA GLOMERULONEFRITIS Y OTRAS ENFERMEDADES INFLAMATORIAS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 19

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Maurice M. Klee

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 1951 Burr Street

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Fairfield

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Connecticut

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

ZIP: 06430

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: 3,5 pulgadas, almacenamiento 1,4 Mb

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Macintosh Cetris 610

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: Sistema 7

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: WordPerfect 3.0

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/236.208

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 02-MAYO-1994

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Klee, Maurice M.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 30.399

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: ALX-138

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (203) 255-1400

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (203) 254-1101

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: péptido KSSKC

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1658 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: Polipéptido Pro-C5

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo Sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(x)

INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

AUTORES: Haviland, D.L.

\hskip4.7cm

Haviland, J.C.

\hskip4.7cm

Fleischer, D.T.

\hskip4.7cm

Hunt, A.

\hskip4.7cm

Wetsel, R.A.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TÍTULO: Secuencia de ADNc completa del complemento Pro-C5 humano

\vskip0.500000\baselineskip

(c)

REVISTA: Journal of Immunology

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

VOLUMEN: 146

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

PÁGINAS: 362-368

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

FECHA: 1991

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4059 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: Vector de expresión eucariota Apex-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

16

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8540 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: Vector de expresión eucariota Apex-3P

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: Cebador oligonucleótido UDEC690

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(IV)

ANTISENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: Cebador oligonucleótido UDEC395

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(IV)

ANTISENTIDO: Si

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 747 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: 5G1.1M1 scFv (murino)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 747 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: 5G1.1 scFv CB (humanizado)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

35

36

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 726 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: 5G1.1M1 VL Huk (cadena ligera quimérica)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

39

40

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 750 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: 5G1.1M1 vH +HuG1 (Fd quimérico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 750 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: 5G1.1 VH + IGHRL (Fd humanizado)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

47

48

49

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 750 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: 5G1.1 VH + IGHRL (Fd humanizado)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

51

52

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 726 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: 5G1.1 VL + KLV56 (Cadena ligera humanizada)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

530

54

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 726 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: 5G1.1 VL + KLV56B (Cadena ligera humanizada)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

56

57

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 711 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: 5G1.1 VL + 012 (Cadena ligera humanizada)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

59

60

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 750 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: 5G1.1 VH + IGHRLD (Fd humanizado)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

62

63

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 747 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: 5G1.1 scFv DO12 (scFv humanizado)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

65

66

67

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5248 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: vector de expresión procariota pET Trc SO5/NI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

68

69

70

71

72

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 813 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: N19/8 scFv (marcado con His)

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

74

75

76

Claims (14)

1. Un anticuerpo caracterizado porque comprende al menos un sitio de unión anticuerpo-antígeno, presenta unión específica al componente del complemento humano C5, estando dirigida dicha unión específica a la cadena alfa del componente del complemento humano C5, inhibe la activación del complemento en un fluido corporal humano y no se une específicamente al producto de activación del complemento humano C5a libre.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, caracterizado porque comprende:

i) una CDR1 de la cadena ligera variable que comprende los restos de aminoácidos 28-34 de la SEQ ID NO: 7, ii) una CDR2 de la cadena ligera variable que comprende los restos de aminoácidos 52-54 de la SEQ ID NO: 7; iii) una CDR3 de la cadena ligera variable que comprende los restos de aminoácidos 93-98 de la SEQ ID NO: 7; iv) una CDR1 de la cadena pesada variable que comprende los restos de aminoácidos 156-159 de la SEQ ID NO: 7; v) una CDR2 de la cadena pesada variable que comprende los restos de aminoácidos 179-183 de la SEQ ID NO: 7, y vi) una CDR3 de la cadena pesada variable que comprende los restos de aminoácidos 226-236 de la SEQ ID NO: 7.

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3. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende:

(a) una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo de la reivindicación 2,

(b) una secuencia de nucleótidos complementaria a (a); o

(c) tanto (a) como (b).

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4. El anticuerpo de la reivindicación 1, caracterizado porque comprende:

i) una CDR1 de la cadena ligera variable que comprende los restos de aminoácidos 26-36 de la SEQ ID NO: 8, ii) una CDR2 de la cadena ligera variable que comprende los restos de aminoácidos 52-58 de la SEQ ID NO: 8; iii) una CDR3 de la cadena ligera variable que comprende los restos de aminoácidos 91-99 de la SEQ ID NO: 8; iv) una CDR1 de la cadena pesada variable que comprende los restos de aminoácidos 152-161 de la SEQ ID NO: 8; v) una CDR2 de la cadena pesada variable que comprende los restos de aminoácidos 176-192 de la SEQ ID NO: 8, y vi) una CDR3 de la cadena pesada variable que comprende los restos de aminoácidos 225-237 de la SEQ ID NO: 8.

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5. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende:

(a) una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo de la reivindicación 4,

(b) una secuencia de nucleótidos complementaria a (a); o

(c) tanto (a) como (b).

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6. El anticuerpo de la reivindicación 1, caracterizado porque comprende:

i) una CDR1 de la cadena ligera variable que comprende los restos de aminoácidos 26-36 de la SEQ ID NO: 17, ii) una CDR2 de la cadena ligera variable que comprende los restos de aminoácidos 52-58 de la SEQ ID NO: 17; iii) una CDR3 de la cadena ligera variable que comprende los restos de aminoácidos 91-99 de la SEQ ID NO: 17; iv) una CDR1 de la cadena pesada variable que comprende los restos de aminoácidos 152-161 de la SEQ ID NO: 17; v) una CDR2 de la cadena pesada variable que comprende los restos de aminoácidos 176-186 de la SEQ ID NO: 17, y vi) una CDR3 de la cadena pesada variable que comprende los restos de aminoácidos 225-237 de la SEQ ID NO: 17.

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7. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende:

(a) una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo de la reivindicación 6,

(b) una secuencia de nucleótidos complementaria a (a); o

(c) tanto (a) como (b).

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8. El anticuerpo de la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de

i) SEQ ID NO: 7,

ii) SEQ ID NO: 8;

iii) SEQ ID NO: 17;

iv) una cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 3-109 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 3-122 de la SEQ ID NO: 10;

v) una cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 1-108 de la SEQ ID NO: 15 y una cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 1-122 de la SEQ ID NO: 16;

vi) una cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 1-108 de la SEQ ID NO: 15 y una cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 1-122 de la SEQ ID NO: 12;

vii) una cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 1-108 de la SEQ ID NO: 15 y una cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 1-122 de la SEQ ID NO: 11;

viii) una cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 3-110 de la SEQ ID NO: 14 y una cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 1-122 de la SEQ ID NO: 16;

ix) una cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 3-110 de la SEQ ID NO: 14 y una cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 1-122 de la SEQ ID NO: 12; o

x) una cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 3-110 de la SEQ ID NO: 14 y una cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 1-122 de la SEQ ID NO: 11.

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9. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende:

(a) una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo de la reivindicación 8,

(b) una secuencia de nucleótidos complementaria a (a); o

(c) tanto (a) como (b).

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10. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo recombinante que comprende un dominio constante humano.

11. Un vector de ácido nucleico caracterizado porque comprende una primera molécula de ácido nucleico unida covalente y operativamente a una segunda molécula de ácido nucleico, de modo que un huésped que contiene el vector expresa el polipéptido codificado por la primera molécula de ácido nucleico, siendo la primera molécula de ácido nucleico una molécula de ácido según cualquiera de las reivindicaciones 3, 5, 7 y 9.

12. Una célula huésped recombinante caracterizada porque comprende un vector de ácido nucleico según la reivindicación 11.

13. Un artículo de fabricación caracterizado porque comprende material de envasado y un agente farmacéutico contenido en dicho material de envasado, siendo dicho agente farmacéutico un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 6, 8 ó 10.

14. El uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 6, 8 ó 10, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la glomerulonefritis.