PT758904E - Métodos e composições para o tratamento de glomerulonefrite - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Métodos e composições para o tratamento de glomerulonefrite"

CAMPO DO INVENTO O presente invento refere-se ao tratamento de glomerulonefrite (GN) e mais genericamente a tratamentos terapêuticos que envolvem a inibição farmacológica do sistema do complemento de um doente. Em particular, o invento refere-se à utilização de anticorpos específicos para a componente C5 do complemento humano para conseguir tal tratamento terapêutico. Também se descrevem aqui composições incluindo anticorpos monoclonais nativos (mAb) específicos para a componente C5 do complemento humano, que bloqueiam a actividade hemolitica do complemento e a geração de C5a em concentrações que atingem substancialmente o limite estequiométrico teórico de um para dois de anticorpo para antigénio, que podem ser atingidas por um anticorpo bivalente. Descrevem-se adicionalmente mAb recombinantes que são derivados (incluindo derivados monovalentes) destes mAb nativos que proporcionam substancialmente as mesmas actividades de bloqueio que os mAb nativos.

ANTERIORIDADE DO INVENTO I. Doença mediada por complexos imunitários A formação de complexos imunitários é a consequência típica da interacção de antigénios com anticorpos específicos. A resposta inflamatória que se desenvolve quando tais complexos se acumulam numa área limitada é um elemento importante das defesas normais do hospedeiro, levando à depuração do complexo imunitário e à destruição do antigénio por células fagocíticas. Contrariamente, as doenças de complexos imunitários são reflexos de um excesso de formação de complexo ou de depuração retardada, usualmente em condições de provocação excepcional por antigénios ou desregulação imunológica. Em tais circunstâncias, os complexos imunitários são depositados ou formados em locais de tecidos específicos e as respostas inflamatórias resultantes levam a estados de doença devidos a danos nos tecidos, localizados ou sistémicos. 2 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ Ο rim, e mais especificamente a estrutura do rim denominada glomérulo, é um local particularmente importante de deposição de complexos imunitários de que resulta o desenvolvimento de várias condições de doença graves.

Os estudos em seres humanos e estudos utilizando modelos animais de doenças humanas, implicaram o sistema do complemento nas patologias associadas a várias desordens relacionadas com complexos imunitários. A activação do complemento que medeia a patologia associada com estas doenças pode ser uma consequência de um mecanismo auto-imune ou pode ter origem não imunológica. A resposta de hipersensibilidade que ocorre quando os anticorpos se ligam a antigénios, quer em tecidos, quer na circulação, resulta da activação do complemento e da libertação de moléculas que medeiam inflamação. Este processo é classificado com sendo mediado pela ligação de anticorpo a antigénios ligados a células ou tecidos fixos (hipersensibilidade de tipo II) ou a antigénios em circulação, resultando na formação de complexos imunitários em circulação e na sua subsequente deposição patogénica em tecidos (hipersensibilidade de tipo III). A hipersensibilidade de tipo II é mediada através da activação do complemento que se segue à ligação de anticorpos a antigénios em tecidos fixos. A consequente resposta inflamatória resulta da activação das componentes pró-inflamatória e litica do sistema do complemento e do recrutamento subsequente de leucócitos estimulados para os locais de formação de complexos imunitários. A permeabilidade vascular aumentada que resulta das actividades de anafilotóxicas de C3a e C5a aumenta adicionalmente a deposição de complexos imunitários e o recrutamento de leucócitos. A ligação cruzada de anticorpos ligados a células ou tecidos com células efectoras tais como neutrófilos, plaquetas, células NK e monócitos através dos seus receptores de Fc também desempenha um papel pró-inflamatório. Esta ligação cruzada activa as células efectoras, estimulando a libertação de radicais de oxigénio, prostaglandinas e 3 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ leucotrienos, sendo esta libertação potenciada adicionalmente pelas acções das componentes do complemento activado.

Os exemplos de condições mediadas por hipersensibilidade do tipo II incluem rejeição hiperaguda de órgãos transplantados, estados auto-imunes hemoliticos e trombocitopénicos, sindrome de Goodpasture (e glomerulonefrite e hemorragia pulmonar associadas), miastenia grave, sequelas patológicas associadas a diabetes melittus dependente de insulina e pênfigo vulgar.

As reacções de hipersensibilidade de tipo III que envolvem antigénios em circulação podem também resultar no desenvolvimento de numerosas condições patológicas. Estas incluem glomerulonefrite (discutida detalhadamente em seguida), vasculite (uma condição inflamatória dos vasos sanguíneos grandes ou pequenos potencialmente com risco de vida), artrite reumatóide, dermatite e outras desordens.

Outras doenças associadas a reacções de hipersensibilidade de tipo III incluem doenças auto-imunes, tais como lúpus eritematoso sistémico (LES), muitas doenças infecciosas, doenças neoplásicas e uma vasta variedade de outras condições (Dixon, et al. Immune Complex Injury, em Samter, (ed.) Immunological Diseases, 4a ed. Little Brown & Co. Boston, 1987) . II. Glomerulonefrite 0 glomérulo é um elemento-chave estrutural e funcional do rim. Cada glomérulo faz parte de uma estrutura maior que funciona como a unidade funcional principal do rim, denominada nefrónio. Existem cerca de um milhão de nefrónios em cada rim. Cada glomérulo é uma rede consistindo em até cinquenta capilares paralelos envoltos numa estrutura denominada cápsula de Bowman. A área dentro da cápsula Bowman que não é ocupada pelos capilares glomerulares denomina-se espaço de Bowman. Os glomérulos funcionam como filtros, separando água e determinados solutos das proteínas e células do sangue para o espaço de Bowman, para processamento adicional nos tubos contornados, na ansa de Henle e no tubo colector do nefrónio. 4 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ A glomerulonefrite (GN) é uma doença do rim caracterizada por inflamação e resultante no aumento dos glomérulos que é tipicamente devida à formação de complexos imunitários. A acumulação de complexos imunitários nos glomérulos resulta em respostas inflamatórias, envolvendo inter alia hipercelularidade, que pode causar bloqueio total ou parcial do glomérulo através de estreitamento de lúmenes capilares, entre outros factores. Um resultado deste processo é a inibição da função de filtração normal do glomérulo. 0 bloqueio pode ocorrer num número elevado de glomérulos, comprometendo directamente a função renal e causando frequentemente deposição anómala de proteínas nas paredes dos capilares que formam o glomérulo. Por seu lado, esta deposição pode danificar as membranas basais glomerulares. Os glomérulos que não estão bloqueados desenvolvem permeabilidade aumentada, permitindo a passagem para a urina de quantidades elevadas de proteína, uma condição referida como proteinúria.

Em muitos casos de GN grave, formam-se estruturas patológicas, denominadas crescentes, dentro do espaço de Bowman, impedindo adicionalmente a filtração glomerular. Estas estruturas só podem ser observadas por exame microscópico de amostras de tecido obtidas por biopsia ou necropsia e portanto nem sempre são observadas nos doentes em que ocorrem. Os crescentes são uma manifestação de hipercelularidade e pensa-se que provêm da proliferação anómala extensa de células epiteliais parietais, as células que formam o revestimento interno da cápsula de Bowman. A investigação clinica demonstrou que há uma correlação grosseira entre a percentagem de glomérulos com crescentes e a gravidade clinica da doença e consequentemente com o prognóstico do doente. Quando presentes em números elevados, os crescentes são um sinal de prognóstico fraco.

Os sintomas de GN incluem: proteinúria; taxa de filtração glomerular (TFG) reduzida; alterações de electrólitos séricos incluindo azotemia (uremia, azoto de ureia no sangue (AUS) excessivo) e retenção de sais, levando a retenção de água, o que resulta em hipertensão e edema; hematúria e sedimentos urinários anómalos, incluindo cálculos de glóbulos vermelhos; hipo-albuminemia; hiperlipidemia; e lipidúria. 5 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Em 1990, mais de 210 000 doentes nos Estados Unidos necessitaram de hemodiálise ou transplante por insuficiência renal crónica, com um custo anual superior a 7 mil milhões de dólares, de acordo com o Sistema de Dados Renais dos Estados Unidos (USRDS - United States Renal Data System). O USRDS compila dados sobre a doença renal nos Estados Unidos conjuntamente com o Instituto Nacional da Diabetes e Doenças Digestivas e Renais - National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, Division of Kidney, Urologic and Hematologic Diseases, dos National Institutes of Health (NIDDKD). O USRDS estima que os custos de tratamento de insuficiência renal aumentam actualmente 20 porcento ao ano. A GN é a terceira principal causa de morte em doentes de doença renal em estágio terminal, somente ultrapassada por diabetes e hipertensão. Consequentemente, há uma necessidade óbvia e antiga da comunidade médica de tratamentos eficazes para esta condição. Actualmente, em todo o mundo há investigação que tem como objectivo o desenvolvimento de novos tratamentos para GN. Nos Estados Unidos, o NIDDKD, a Fundação Renal Nacional (National Kidney Foundation) e várias outras organizações públicas e privadas apoiam a investigação nesta área. A Fundação Renal Nacional só por si financia mais de dois milhões de dólares anualmente para apoiar os esforços de investigadores renais.

III. Tratamentos actuais para GN A administração de corticosteróides, tipicamente na forma de doses elevadas de metilprednisolona intravenosa em "pulsos" ou terapia oral de prednisona, é actualmente considerada o agente farmacológico mais eficaz disponível para o tratamento de GN. Tal terapia com esteróides é frequentemente administrada em combinação com agentes imunossupressores gerais citotóxicos, tais como azatioprina ou ciclofosfamida. A supressão imunitária global e a resultante susceptibilidade a infecção aumentada, conjuntamente com outros efeitos secundários debilitantes associados com administração de esteróides e fármacos citotóxicos, limitam a utilização eficaz destes fármacos. 6 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Foram também utilizados fármacos anti-inflamatórios não esteróides (ΑΙΝΕ) do tipo aspirina para reduzir a inflamação glomerular e aumento de GN. Contudo, estes fármacos não são utilizados rotineiramente para este fim, provavelmente devido aos seus efeitos anti-inflamatórios relativamente fracos e à tendência para causarem em muitos doentes efeitos secundários gastrointestinais e outros. A administração de anticoagulantes, tais como heparina ou warfarina sódica, e de agentes antitrombóticos, tais como ciproeptadina, dipiridamole ou sulfinpirazona, tem sido utilizada com base em evidências que sugerem o envolvimento do processo de coagulação na génese de crescentes glomerulares. No entanto, as evidências objectivas dos benefícios de tais terapias em animais com GN com crescentes induzidos experimentalmente têm sido inconsistentes. Além disso, os anticoagulantes são fármacos perigosos, dado que podem potenciar episódios hemorrágicos possivelmente fatais. São especialmente perigosos a este respeito em doentes com insuficiência renal avançada.

Além das abordagens farmacológicas, a permuta de plasma intensiva (plasmaférese) de 2 a 4 litros de plasma diariamente (ou em alguns casos três vezes por semana) pode reduzir drasticamente os niveis elevados de complexos imunitários em circulação quando é necessária uma intervenção aguda no processo inflamatório. Tal tratamento é caro e requer que o doente esteja ligado à máquina de plasmaférese durante muitas horas por semana. Além disso, todos os procedimentos em que se remove e se readministra o sangue de um doente estão associados com um risco aumentado de infecção. No entanto, considera-se actualmente que a permuta de plasma é o tratamento não farmacológico mais eficaz para a remoção de complexos imunitários em circulação que podem causar GN.

Os niveis de complexos imunitários em circulação podem também ser diminuídos eliminando ou reduzindo a fonte do antigénio ou antigénios contidos nos complexos através, por exemplo, de terapia eficaz de uma infecção subjacente ou alteração de um antibiótico. No entanto, embora tal terapia seja quase sempre um tratamento de eleição, tem que se ter muito cuidado dado que a redução da carga de antigénio altera 7 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ a razão molar de antigénio para anticorpo envolvidos na formação de complexos imunitários e, portanto, pode ocorrer uma exacerbação temporária perigosa do processo inflamatório (consultar discussão seguinte em Antecedentes de Fisiologia e Patologia). IV. Engenharia do anticorpo

Os anticorpos nativos são moléculas de proteína animal com múltiplas subunidades com propriedades de ligação ao antigénio altamente específicas. Os animais produzem várias classes de anticorpos. Há cinco classes principais (IgA, igD, IgE, igG e IgM) e uma variedade de subclasses. Os anticorpos nativos são constituídos por duas ou mais subunidades heterodiméricas, cada uma contendo uma cadeia pesada (H) e uma leve (L) . As diferenças entre as classes de anticorpos derivam das suas diferentes cadeias H. As cadeias H têm um peso molecular de cerca de 53 kDa, enquanto as cadeias L têm cerca de 23 kDa em massa.

Cada anticorpo nativo individual tem um tipo de cadeia L e um tipo de cadeia H, mantidas juntas por ligações dissulfureto para formar uma subunidade heterodimérica. Tipicamente, um anticorpo nativo (e.g., um igG) tem duas subunidades, que se mantêm juntas por pontes dissulfureto. Dentro de cada cadeia, há unidades de cerca de 110 resíduos de aminoácido que se dobram de modo a formar domínios compactos. Cada domínio é mantido por uma única ligação dissulfureto intra-cadeia. As cadeias L têm dois domínios, enquanto as cadeias H têm quatro ou cinco. A maior parte das cadeias H têm uma região de charneira após os primeiros dois domínios (i.e., localizados na parte mais perto do terminal amino). As ligações dissulfureto que ligam entre si as subunidades heterodiméricas estão localizadas nas regiões de charneira. A região de charneira é particularmente sensível a clivagem proteolítica, em que essa proteólise dá origem a dois ou três fragmentos (dependendo do local específico de clivagem), um fragmento que não liga antigénio contendo apenas regiões C da cadeia H (Fc) e um fragmento de ligação a antigénio bivalente (Fab'2) ou dois monovalentes (Fab). A região de charneira permite que as regiões de ligação ao antigénio (cada uma delas constituídas por uma cadeia leve e pelos primeiros dois domínios de uma 8 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ cadeia pesada) se movam livremente relativamente ao resto do anticorpo nativo, que inclui os restantes domínios da cadeia pesada. 0 primeiro domínio de cada cadeia tem uma sequência de aminoácidos altamente variável, que proporciona a vasta gama de especificidades de ligação dos anticorpos encontrada em cada indivíduo. Estes são denominados domínio variável pesado (VH) e domínio variável leve (VL). 0 segundo domínio e os domínios subsequentes (caso existam) de cada cadeia têm uma sequência de aminoácidos relativamente invariante. Estes são denominados domínio constante pesado (CH) e domínio constante leve (CL) .

Cada região variável contém três ansas de sequência hipervariável que proporcionam uma estrutura complementar à do antigénio e são críticas para determinar a especificidade de ligação ao antigénio do anticorpo, dado que são os locais de contacto para ligação ao antigénio. Estas ansas são denominadas regiões determinantes da complementaridade ou CDR. Cada domínio variável é composto por três CDR rodeadas por quatro segmentos de esqueleto (FR) muito menos variáveis. Conjuntamente, os conjuntos de CDR e FR colineares são em grande medida responsáveis por determinar a conformação tridimensional das regiões variáveis de moléculas de anticorpo.

As CDR e FR são características que foram deduzidas das propriedades estruturais de regiões variáveis de anticorpos. Tanto a sequência de aminoácidos (estrutura primária), como a modelação tridimensional (estrutura secundária e terciária deduzidas) das regiões variáveis dos anticorpos têm sido utilizadas por vários investigadores para definir as CDR e, por defeito, as FR. Enquanto as posições das CDR estão fora de questão, nem todos os especialistas concordam com a localização precisa das fronteiras de cada CDR nas regiões VH ou VL; não existe um marcador estrutural bem definido que marque os limites CDR/FR.

Actualmente são utilizadas genericamente na especialidade duas definições de localização das CDR. Estas são a definição de "variabilidade de sequência" de Kabat et al. ("Sequences of 9 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Proteins of Immunological Interest", 4a ed. Washington, D.C.: Public Health Service, N.I.H.) e a definição de "variabilidade estrutural" de Chothia e Lesk (J. Mol. Biol. 1987, 196:901). Tal como aqui utilizadas, as expressões CDRl de VL, CDR2 de VL, CDR3 de VL, CDRl de VH, CDR2 de VH e CDR3 de VH referem-se no minimo à região de sobreposição entres as regiões designadas para cada CDR por cada uma destas duas definições e no máximo à região total abrangida pela combinação das regiões designadas para cada CDR por cada uma destas duas definições.

Um dos problemas que a engenharia de anticorpos tenta resolver é a actividade imunitária de um doente humano que ocorre em resposta a um anticorpo murino nativo (ou outro animal não humano), tipicamente um mAb, que é administrado ao doente com objectivos terapêuticos. Esta actividade contra anticorpos murinos é caracterizada por uma resposta de anticorpos humanos anti-ratinho (HAMA) que pode ter efeitos nocivos na eficácia do tratamento e na saúde do doente. Verificou-se que quase toda a actividade de anticorpos humanos anti-não humanos ("tipo HAMA") é dirigida aos domínios constantes e às regiões FR dos domínios variáveis de anticorpos não humanos nativos.

Por manipulação de moléculas de ácido nucleico que codificam cadeias H e L de anticorpos, é possível incorporar regiões variáveis não humanas em anticorpos que são constituídos adicionalmente por regiões constantes humanas. Os anticorpos resultantes são denominados "anticorpos quiméricos" e têm tipicamente menos tendência a desencadear respostas do tipo HAMA do que os anticorpos não humanos, dos quais são derivadas as suas regiões variáveis.

Uma abordagem ainda mais eficaz para eliminar o potencial de anticorpos não humanos para desencadear uma resposta do tipo HAMA é "humanizá-los", i.e., substituir as suas regiões de esqueleto não humanas por regiões humanas. Um modo de conseguir esta humanização envolve a inserção de fragmentos polinucleotídicos que codificam CDR não humanas do anticorpo a humanizar numa molécula de ácido nucleico que de outro modo codifica um anticorpo humano (com regiões constantes humanas, caso pretendidas) de modo a substituir as CDR humanas e 10 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ utilizar a molécula de ácido nucleico resultante para expressar o anticorpo "humanizado" codificado. O pedido de patente europeia 92308680 descreve anticorpos humanizados contra glóbulos de gordura de leite humanos. O pedido internacional W093/13133 descreve uma imunoglobulina humana que reage especificamente com proteína PGIlb/llla e a sua utilização no tratamento de doenças relacionadas com trombos.

Infelizmente, contudo, a humanização de anticorpos não humanos tem efeitos imprevisíveis nas interacções anticorpo-antigénio, e.g., nas propriedades de ligação ao antigénio. Alguma desta imprevisibilidade é devida às propriedades das CDR. Determinadas CDR são mais adaptáveis do que outras à construção de anticorpos humanizados que mantêm as propriedades do anticorpo dador da CDR não humana. Embora as CDR sejam essenciais para as propriedades de ligação ao antigénio de um anticorpo, as CDR e as FR têm que interactuar adequadamente para que se mantenha a especificidade para com o antigénio de um anticorpo após humanização. Os efeitos da combinação com determinadas FR humanas nas CDR não humanas não caracterizadas não podem ser previstos com segurança por qualquer método conhecido. No entanto, a humanização bem sucedida de um anticorpo proporciona informação que, em geral, facilita a humanização bem sucedida das CDR desse anticorpo utilizando outras FR humanas ou humanas alteradas. Além disso, estão disponíveis abordagens que facilitam a manipulação de FR humanas para melhorar a probabilidade de humanização bem sucedida.

Outros problemas abordados pela engenharia dos anticorpos incluem produção eficiente de anticorpos e alteração da farmacocinética de anticorpos. A produção de proteína recombinante é em geral efectuada mais eficazmente em hospedeiros bacterianos. O seu grande tamanho e a natureza multimérica dos anticorpos nativos dificultam a sua produção em bactérias. Uma abordagem para lidar com os problemas de produção é a utilização de métodos de ADN recombinante para construir anticorpos que têm as suas cadeias H e L ligadas por um ligante peptídico para formar um anticorpo de cadeia única 11 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ (sc, "single Chain"). Tal como descrito seguidamente, há vários tipos de anticorpos sc que podem ser construídos.

Tal como no caso da humanização, os efeitos nas propriedades de ligação ao antigénio da construção de um determinado tipo de anticorpo sc, utilizando cadeias H e L que não foram caracterizadas relativamente à sua capacidade para funcionar como parte de um anticorpo sc, não podem ser previstas com segurança por qualquer modelo conhecido. No entanto, a construção bem sucedida de qualquer tipo de anticorpo sc de um determinado anticorpo nativo proporciona informação que, em geral, facilita a construção bem sucedida de outros tipos de anticorpos sc a partir do anticorpo nativo.

Os anticorpos de cadeia simples podem incluir um só de cada dos domínios VH e VL, caso em que se denominam anticorpos scFv; podem também incluir apenas um de cada dos domínios VH, VL, CH e CL, caso em que são denominados anticorpos scFab; ou podem conter todos os domínios das regiões variáveis e constantes de um anticorpo nativo, caso em que são denominados anticorpos sc de comprimento completo.

Os tamanhos diferentes destes anticorpos conferem-lhes propriedades farmacocinéticas diferentes. Em geral, as proteínas mais pequenas são depuradas da circulação mais rapidamente do que as proteínas maiores com a mesma composição geral. Assim, os anticorpos sc de comprimento completo e os anticorpos nativos apresentam, em geral, as maiores durações de acção, os anticorpos scFab apresentam durações de acção mais curtas e os anticorpos scFv apresentam durações de acção ainda mais curtas. Obviamente, dependendo da doença a tratar, podem ser desejáveis agentes terapêuticos com acção mais longa ou mais curta. Por exemplo, os agentes terapêuticos para utilização na prevenção de doenças imunitárias e hemostáticas associadas a procedimentos de circulação extracorpórea (que são tipicamente de curta duração) são de preferência de acção curta, enquanto os anticorpos para o tratamento de doenças crónicas prolongadas (tal como doença inflamatória das articulações ou GN) são de preferência de acção relativamente longa. 12 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Podem encontrar-se discussões detalhadas sobre engenharia de anticorpos em numerosas publicações recentes, incluindo: Borrebaek, "Antibody Engineering, A Practical Guide", 1992, W. H. Freeman e Co. NY; e Borrebaek, "Antibody Engineering", 2a ed. 1995, Oxford University Press, NY, Oxford.

SUMÁRIO DO INVENTO

Tendo em consideração a discussão anterior, é um objectivo do presente invento proporcionar uma nova abordagem para reduzir a inflamação glomerular e a insuficiência renal associadas a GN. 0 invento envolve a utilização de preparações contendo anticorpos para a componente C5 do complemento humano, tal como caracterizado nas reivindicações, como agentes terapêuticos. Mais particularmente, o invento proporciona a utilização de anticorpos anti-C5 que se ligam à componente C5 do complemento ou seus fragmentos activos. De preferência, os anticorpos bloqueiam a geração e/ou actividade das componentes C5a e C5b do complemento. Para a maioria das aplicações, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

Nas concretizações preferidas do invento, a administração da preparação de anticorpo anti-C5 é iniciada após o aparecimento de sintomas de GN, e.g., após o aparecimento de proteinúria. Alternativamente, o invento pode ser utilizado profilacticamente para tratar doentes que estão em risco de uma exacerbação aguda de GN existente, e.g., doentes que apresentam uma exacerbação de sintomas de lúpus eritematoso sistémico ou doenças auto-imunes semelhantes que resultaram em GN.

Tal como demonstrado nos exemplos apresentados seguidamente, os anticorpos anti-C5 administrados subsequentemente ao aparecimento de GN, eliminam essencialmente a inflamação/aumento glomerular e reduzem a insuficiência renal (consultar exemplos 1 e 2).

Embora não pretendendo uma limitação a qualquer teoria especifica, pensa-se que os anticorpos anti-C5 apresentam estes efeitos terapêuticos e outros através da sua actividade 13 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ de bloqueio da geração ou actividade de fragmentos activos C5a e/ou C5b da componente C5 do complemento. Através deste efeito de bloqueio, os anticorpos inibem os efeitos pró-inflamatórios (anafilotóxico) de C5a e a geração do complexo de ataque membranar C5b-9 (MAC). Significativamente, o bloqueio efectuado pelos anticorpos anti-C5, dado que ocorre ao nível da componente C5 do complemento, tem a vantagem de manter as importantes funções opsónica, anti-infecciosa e de depuração de complexos imunitários do sistema do complemento mediado, entre outros, pela componente C3 do complemento. 0 invento proporciona adicionalmente composições contendo anticorpos anti-C5, tal como caracterizados nas reivindicações, que bloqueiam a actividade hemolítica do complemento e a geração de C5a. Estes anticorpos são úteis para o tratamento de GN, bem como de várias outras doenças. Estas incluem o tratamento de disfunções imunitárias e hemostáticas associadas a circulação extracorpórea (consultar a patente US 5 853 722), tratamento de doenças inflamatórias das articulações (consultar patente US 7 279 158) e outras doenças associadas ao complemento, em particular doenças inflamatórias.

Embora possam ser utilizados outros anticorpos para tratar GN de acordo com o presente invento, são preferidos os novos anticorpos do invento. Estes novos anticorpos ligam-se à cadeia alfa de C5, mas não apresentam ligação substancial ao produto de clivagem da cadeia alfa C5a (doravante aqui e nas reivindicações denominado "C5a livre"). Outros alvos para ligação de anticorpo aqui descritos incluem fragmentos da cadeia alfa de C5 humano que são imunorreactivos com o anticorpo mais preferido do invento, o anticorpo 5G1.1, discutido seguidamente. Tais alvos incluem o fragmento de hidrólise ácida de C5 de 45 kDa (o fragmento "5G46k"), o fragmento de digestão tríptica de C5 de 27 kDa (o fragmento "5G27k"), o péptido de 325 aminoácidos que abrange os resíduos de aminoácido 725-1049 de SEQ ID NO:2 (o péptido "5G325aa"), o péptido de 200 aminoácidos que abrange os resíduos de aminoácido 850 a 1049 de SEQ ID NO: 2 (o péptido "5G200aa") -tal como discutido seguidamente no exemplo 13. 14 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Os novos anticorpos do invento incluem anticorpos que se ligam a um epitopo dentro da sequência de aminoácidos Vai Ile Asp His Gin Gly Thr Lys Ser Ser Lys Cys Vai Arg Gin Lys Vai Glu Gly Ser Ser, (SEQ id N0:1) doravante denominada epitopo KSSKC. Estes novos anticorpos que se ligam ao epitopo KSSKC denominam-se aqui doravante anticorpos anti-KSSKC e os anticorpos monoclonais que se ligam ao epitopo KSSKC são aqui doravante denominados mAb anti-KSSKC.

Os novos anticorpos do invento apresentam muitas vantagens relativamente a outros anticorpos anti-C5, particularmente no que diz respeito à sua utilização como agentes terapêuticos anti-inflamatórios. Estas incluem a capacidade de bloquear substancialmente tanto a actividade hemolítica do complemento, como a geração do produto de clivagem do complemento pró-inflamatório C5a substancialmente na mesma extensão à mesma concentração de anticorpo. Alguns dos anticorpos preferidos do invento apresentam a propriedade vantajosa adicional de bloquear a ligação de C5 a C3 ou C4.

Os anticorpos anti-KSSKC nativos mono-especificos são anticorpos do invento particularmente preferidos. 0 mAb anti-KSSKC nativo 5G1.1 apresenta a vantagem particular de bloquear substancialmente tanto a actividade hemolítica do complemento, como a geração de C5a a uma razão estequiométrica de anticorpo para C5 que se aproxima do limite de ligação teórico de um para dois (anticorpo para antigénio) que pode ser atingido por um anticorpo bivalente. Esta é uma propriedade desejável porque permite que atinjam efeitos terapêuticos doses mais pequenas de anticorpo do que as doses que seriam necessárias de anticorpos semelhantes que não podem ser funcionar numa tal razão. 0 invento proporciona adicionalmente mAb recombinantes que são derivados (incluindo derivados monovalentes) desses mAb nativos. Estes incluem mAb anti-KSSKC recombinantes. De preferência, os anticorpos do invento proporcionam um nivel de bloqueio tanto da actividade hemolítica do complemento, como da geração de C5a (numa base por mole de local de ligação) que é obtida quando a concentração de anticorpo está na ordem de grandeza dos mAb nativos. Os mAb anti-KSSKC recombinantes particularmente preferidos proporcionam um nível de tal 15 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ bloqueio quando a concentração de anticorpo não é superior a três vezes a dos mAb nativos do invento. 0 invento proporciona adicionalmente sequências de ácido nucleico de polinucleótidos que codificam tais mAb anti-KSSKC recombinantes, bem como sequências de aminoácidos dos polipéptidos codificados por estas moléculas de ácido nucleico do invento. 0 invento proporciona adicionalmente sequências CDR que são úteis na construção dos anticorpos humanizados do invento, bem como péptidos e oligopéptidos que são úteis na preparação e caracterização dos anticorpos do invento.

Os anticorpos anti-C5 do invento apresentam actividade de bloqueio da geração ou da actividade dos fragmentos activos C5a e/ou C5b da componente C5 do complemento. Através deste efeito de bloqueio, os anticorpos inibem os efeitos pró-inflamatórios (anafilotóxicos) de C5a e a geração do complexo de ataque membranar (MAC) C5b-9. É de salientar que o bloqueio efectuado pelos anticorpos anti-C5, dado que ocorre ao nível da componente C5 do complemento, tem a vantagem de manter as importantes funções opsónicas, anti-infecciosas e de depuração dos complexos imunitários do sistema do complemento mediadas pela componente C3 do complemento, entre outras.

DESCRIÇÃO SUCINTA DOS ESQUEMAS

Figuras ΙΑ, 1B e 1C - Fotomicrografias de secções de rins de ratinho coradas com PAS. Figura IA - ratinho não tratado e não induzido. Figura 1B - ratinho com GN induzida e tratado com PBS (controlo). Figura 1C - ratinho com GN induzida GN e tratado com anti-C5. Ampliação de cada uma das amostras, aproximadamente 400X.

Figuras 2A, 2B e 2C - Fotomicrografias de secções de rins de ratinho corados por imunofluorescência. Figura 2a - ratinho não induzido e não tratado. Figura 2B - ratinho com GN induzida e tratado com PBS (controlo). Figura 2C - ratinho com GN induzida e tratado com anti-C5. Ampliação de cada uma das amostras é a mesma, aproximadamente 200X. 16 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Figura 3 - Resultados de ensaios hemolíticos (lise celular) de soro de animais com GN induzida e tratados com anticorpos anti-C5 em PBS ("Anti-C5") ou só com PBS ("controlo com PBS"). Também se apresentam os resultados de ensaios efectuados com soro normal.

Figura 4 - Resultados de ensaios de C5b-9 solúvel ("sC5b-9"). "ND" indica que não foi determinado.

Figuras 5A, 5B e 5C - Fotomicrograf ias de imunofluorescência de secções de rim coradas para C3 de ratinho. Figura 5A - ratinho não induzido e não tratado. Figura 5B - ratinho com GN induzida e tratado com PBS (controlo). Figura 5C - ratinho com GN induzida e tratado com anti-C5. Ampliação de cada uma das amostras é a mesma, aproximadamente 400X.

Figura 6 - Resultados de ensaios de C3a de amostras de sangue humano de circulação. "ND" indica que não foi determinado.

Figuras 7A e 7B - Análises farmacocinéticas da redução da capacidade de lise celular de sangue de ratinho (figura 7A) ou de humano (figura 7B) após tratamento com anticorpos anti-C5. A coloração imunofluorescente das figuras 2 e 5 está confinada à rede capilar glomerular (tufo) e assim o aumento do glomérulo observado na figura 1B não é visível nas figuras 2B e 5B.

Figura 8 - Análise de Scatchard de ligação de 5G1.1 nativo a C5 .

Figura 9 - Análise de Scatchard de ligação de N19/8 nativo a C5 .

Figura 10 - Geração de C3a em amostras de sangue humano em circulação na presença de 5G1.1 nativo.

Figura 11 - Geração de sC5b-9 em amostras de sangue humano em circulação na presença de 5G1.1 nativo. 17 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Figura 12 - Actividade hemolítica de soro de amostras de sangue humano em circulação na presença de 5G1.1 nativo.

Figura 13 - Actividade hemolítica de soro na presença de scFv de m5Gl.1.

Figura 14 - Geração de C5a na presença de scFv de m5Gl.l.

Figura 15 - Geração de C3a em amostras de sangue humano em circulação na presença de scFv de m5Gl.l.

Figura 16 - Actividade hemolítica de soro de amostras de sangue humano em circulação na presença de scFv de 5G1.1.

Figura 17 - Geração de sC5b-9 em amostras de sangue humano em circulação na presença de scFv de m5Gl.l.

Figura 18 - Região variável de cadeia leve do anticorpo 5G1.1. Apresenta-se em minúsculas a sequência derivada do iniciador oligonucleotídico a 5' utilizado para amplificação por PCR da região variável. Os aminoácidos estão numerados de acordo com Kabat et al., supra. Os aminoácidos dentro de caixas correspondem às sequências peptídicas obtidas da cadeia leve de 5G1.1 madura ou de um péptido de endoproteinase Lys C de 5G1.1. Os resíduos da região determinante de complementaridade (CDR) de acordo com a definição de variabilidade de sequência e com a definição de variabilidade estrutural estão sublinhados e "sobrelinhados", respectivamente.

Figura 19 - Região variável de cadeia pesada do anticorpo 5G1.1. Apresenta-se em minúsculas a sequência derivada do iniciador oligonucleotídico a 5' utilizado para amplificação por PCR da região variável. Os aminoácidos estão numerados utilizado o esquema de Kabat et al. supra, em que +1 identifica o primeiro aminoácido da região variável madura processada. Os aminoácidos dentro de caixas correspondem à sequência peptídica obtida da cadeia pesada de 5G1.1 após tratamento com piroglutamato-aminopeptidase. Os resíduos da região determinante de complementaridade de acordo com a definição de variabilidade de sequência ou de acordo com a 18 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ definição de variabilidade estrutural estão sublinhados e "sobrelinhados", respectivamente.

ANTECEDENTES DE FISIOLOGIA E PATOLOGIA I. Introdução

Tal como descrito anteriormente, o presente invento refere-se a tratamentos terapêuticos para GN e para a inibição da componente C5 do complemento. No sentido de proporcionar antecedentes para a descrição das concretizações preferidas e dos exemplos apresentados seguidamente, começaremos por discutir na generalidade o braço do complemento do sistema imunitário, as caracteristicas patofisiológicas da GN e estudos prévios do papel do complemento na patogénese da GN.

Podem encontrar-se discussões gerais sobre o sistema do complemento e a GN em, por exemplo, Glassock e Brenner, 1994; Couser, 1993; Couser, 1992; Couser, et al., 1992; Rich, 1992; Glassock e Brenner, 1987; Robbins e Cotran, 1979; e Guyton, 1971. II. O sistema do complemento O sistema do complemento actua em conjunto com outros sistemas imunológicos do corpo para a defesa contra intrusão de patogénios celulares e virais. Existem pelo menos 25 proteínas do complemento, que se encontram como um conjunto complexo de proteínas plasmáticas e cofactores membranares. As proteínas plasmáticas constituem até cerca de 10% das globulinas no soro de vertebrados. As componentes do complemento conseguem as suas funções de defesa imunitária por interacção numa série de eventos intrincados, mas rigorosos, de clivagem enzimática e ligação à membrana. A cascata do complemento resultante leva à produção de produtos com funções opsónicas, imunorreguladoras e líticas. A cascata do complemento progride através da via clássica ou da via alternativa. Estas vias partilham muitas componentes e, embora sejam diferentes nas suas etapas iniciais, convergem e partilham as mesmas componentes de "complemento terminal" (C5 a C9) responsáveis pela activação e destruição de células- 19 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ alvo. A sequência de ADNc da sequência de ADNc de pró-C5 humano é divulgada em Haviland et al. (The Journal of Immunology, 146 (1): 362-368, 1991). A via do complemento clássica é tipicamente iniciada por reconhecimento e ligação de anticorpos a um local antigénico numa célula-alvo. A via alternativa é usualmente independente de anticorpos e pode ser iniciada por determinadas moléculas nas superfícies dos patogénios. Ambas as vias convergem no ponto em que a componente C3 do complemento é clivada por uma protease activa (que é diferente em cada uma das vias) formando C3a e C3b. Outras vias de activação de ataque do complemento podem agir mais tarde na sequência de eventos levando aos vários aspectos da função do complemento. C3a é uma anafilotoxina (consultar a discussão seguinte). C3b liga-se a células bacterianas e a outras, bem como a determinados vírus e complexos imunitários e marca-os para remoção de circulação. (Neste papel, C3b é denominado opsonina.) A função opsónica de C3b é considerada como sendo a acção anti-infecciosa mais importante do sistema do complemento. Os doentes com lesões genéticas que bloqueiam a função C3b são susceptíveis a infecção por uma vasta gama de organismos patogénicos, enquanto se verifica que os doentes com lesões que aparecem mais tarde na sequência da cascata do complemento, i.e., doentes com lesões que bloqueiam as funções C5, são mais susceptíveis apenas a infecção por Neisseria e apenas ligeiramente susceptíveis (Fearon, em Intensive Review of Internai Medicine, 2a Ed. Fanta e Minaker, ed. Brigham Women's and Beth Israel Hospitais, 1983). C3b também forma um complexo com outras componentes únicas de cada via para formar C5-convertase clássica ou alternativa, que cliva C5 em C5a e C5b. C3 é assim considerada a proteína central na sequência de reacções do complemento, dado que é essencial tanto à via alternativa, como à clássica (Wurzner, et al., Complement Inflamm. 8:328-340, 1991). Esta característica de C3b é regulada pela protease sérica Factor I, que actua em C3b para produzir iC3b. Embora seja ainda funcional como opsonina, iC3b não consegue formar uma C5-convertase activa. 20 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ C5 é uma beta-globulina de 190 kDa encontrada em soro normal a aproximadamente 75 pg/ml (0,4 μΜ) . C5 é glicosilada, com cerca de 1,5-3 porcento da sua massa atribuída a hidratos de carbono. A C5 madura é um heterodímero com uma cadeia alfa de 999 aminoácidos com 115 kDa que está ligada por uma ponte de dissulfureto a uma cadeia beta de 656 aminoácidos com 75 kDa. A C5 é sintetizada na forma de um produto proteico de cadeia única de uma única cópia de gene (Haviland et al. J. Immunol. 1991, 146:362-368). A sequência de ADNc do produto de transcrição deste gene permite prever um precursor pró-C5 excretado de 1659 aminoácidos conjuntamente com uma sequência de comando de 18 aminoácidos (SEQ ID NO:2). O precursor pró-C5 é clivado após o aminoácido 655 e 659, para formar a cadeia beta na forma de um fragmento amino-terminal (resíduos de aminoácido +1 a 655 de SEQ ID NO:2) e a cadeia alfa na forma de um fragmento carboxilo-terminal (resíduos de aminoácido 660 a 1658 de SEQ ID NO:2), com quatro aminoácidos (resíduos de aminoácido 656-659 de SEQ ID NO:2) eliminados entre as duas. C5a é clivada da cadeia alfa de C5 quer pela C5-convertase alternativa, quer clássica, na forma de um fragmento amino-terminal incluindo os primeiros 74 aminoácidos da cadeia alfa (í.e., resíduos de aminoácido 660-733 de SEQ ID NO:2). Aproximadamente 20 porcento da massa de 11 kDa de C5a é atribuída a hidratos de carbono. O local de clivagem de acção da convertase é no resíduo de aminoácido 733 de SEQ ID NO:2 ou imediatamente adjacente. Um composto que se ligasse a este local de clivagem ou numa posição adjacente teria o potencial de bloquear o acesso das enzimas C5-convertase ao local de clivagem e portanto actuaria como um inibidor do complemento. C5 também pode ser activada através de outra actividade diferente de C5-convertase. A digestão limitada por tripsina (Minta e Man, J. Immunol. 1977, 119:1597-1602; Wetsel e Kolb, J. Immunol. 1982, 128:2209-2216) e o tratamento com ácido (Yammamoto e Gewurz, J. Immunol. 1978, 120:2008; Damerau et al., Molec. Immunol. 1989, 26:1133-1142) também podem clivar C5 e produzir C5b activa. 21 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ C5a é outra anafilotoxina (consultar a discussão seguinte) . C5b combina-se com C6, C7 e C8 para formar o complexo C5b-8 à superfície da célula-alvo. Por ligação de várias moléculas de C9, forma-se o complexo de ataque membranar (MAC, C5b-9, complexo do complemento terminal- TCC) . Quando um número suficiente de MAC se inserem nas membranas das células-alvo, as aberturas que criam (poros MAC) medeiam a lise osmótica rápida das células-alvo. Concentrações inferiores, não liticas, dos MAC, podem produzir outros efeitos. Em particular, a inserção membranar de um pequeno número de complexos C5b-9 em células endoteliais e plaquetas pode causar activação celular prejudicial. Em alguns casos, a activação pode preceder a lise celular.

Tal como mencionado anteriormente, C3a e C5a são anafilotoxinas. Estas componentes do complemento activadas podem desencadear desgranulação de mastócitos, que liberta histamina e outros mediadores de inflamação, resultando em contracção do músculo liso, aumento da permeabilidade vascular, activação de leucócitos e outros fenómenos inflamatórios, incluindo proliferação celular, que resultam em hipercelularidade. A C5a também funciona como um péptido quimiotáctico que serve para atrair granulócitos pró-inflamatórios para o local de activação do complemento.

III. Patofisiologia da GN

Embora a GN possa acompanhar uma extraordinária gama de processos patológicos, em geral é mais frequentemente verificada no decorrer de doenças infecciosas, em auto-imunidade e como uma consequência de terapia para alguns outros processos de doença. O mecanismo responsável pela GN é tipicamente o depósito no rim de complexos imunitários em circulação. Os factores envolvidos na patogénese da GN incluem o antigénio e o anticorpo específicos envolvidos e os processos inflamatórios que ocorrem em consequência do depósito de complexo imunitário.

Antigénios envolvidos na formação de complexos imunitários que causam GN: Os antigénios envolvidos no desenvolvimento da GN podem ser classificados na generalidade como endógenos, infecciosos e iatrogénicos (os que se encontram como 22 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ consequência da prática médica). Em muitos casos, o antigénio especifico é desconhecido, embora usualmente se possa identificar a classe geral. 0 melhor exemplo conhecido da formação de complexos imunitários endógenos são os complexos de ADN anti-ADN produzidos em associação ao lúpus eritematoso sistémico (lúpus, LES). Outras fontes importantes de antigénios endógenos incluem malignidades em que a formação de complexos imunitários pode contribuir para o desenvolvimento de sindromes para-neoplásicas.

As infecções por organismos de muitos tipos, em particular as infecções crónicas, estão também associadas ao desenvolvimento de complexos imunitários que podem causar GN. As infecções bacterianas e fúngicas que podem produzir tais complexos incluem infecção por determinadas estirpes de estreptococos, Pseudomonas, infecção gonocócica disseminada, lepra lepromatosa, endocardite bacteriana subaguda, aspergilose broncopulmonar, sífilis secundária e infecções crónicas em doentes com fibrose cística.

As doenças víricas em que a deposição de complexo imunitário pode ser uma característica proeminente incluem infecção por hepatite B, dengue, mononucleose infecciosa e panencefalite esclerosante subaguda. A GN é também uma característica proeminente em muitas infecções parasíticas tais como a GN verificada em crianças com malária quartã, bem como toxoplasmose, tripanossomíase e esquistossomíase.

Os antigénios iatrogénicos constituem uma classe especial de antigénios exógenos. Tais incluem os responsáveis pela doença de complexo imunitário prototípica, doença do soro, que se segue à formação de complexos imunitários entre constituintes heterólogos do soro e anticorpos autólogos. A doença do soro foi observada regularmente no início deste século, quando as doenças infecciosas eram frequentemente tratadas com anti-soros heterólogos.

Pode ocorrer uma doença iatrogénica virtualmente indistinguível de doença do soro clássica em consequência de tratamento com doses elevadas de antibiótico. As manifestações 23 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ de respostas imunitárias do tipo doença do soro a estes fármacos incluem GN e reflectem o facto de determinados fármacos, em particular os antibióticos β-lactâmicos e sulfonamida, serem haptenos eficazes que são capazes de induzir respostas de anticorpos por conjugação espontânea com proteínas autólogas.

Factores que afectam a formação e deposição de complexos imunitários: As características tanto do antigénio, como do anticorpo determinam a probabilidade de formação patológica de complexos imunitários e subsequente deposição no rim. Entre estas, são especialmente importantes as concentrações absolutas de reagentes e as suas respectivas razões molares. A maioria dos antigénios apresenta múltiplos epitopos e tipicamente estimula uma resposta de anticorpos policlonais. Todas as moléculas de anticorpo de ocorrência natural são pelo menos bivalentes. Estas propriedades permitem a formação de uma rede extensa de antigénio-anticorpo, em que o seu tamanho é determinado principalmente pela afinidade dos anticorpos e pela razão molar de antigénio para anticorpo.

Em geral, as respostas de anticorpos iniciam-se em doenças em que o antigénio está presente em excesso relativamente ao anticorpo e esta razão relativa altera-se à medida que a intensidade da resposta de anticorpos aumenta. Os complexos formados inicialmente são usualmente pequenos e apresentam actividade patogénica pequena ou nula. Contrariamente, formam-se frequentemente complexos muito grandes à medida que a quantidade de antigénio se torna limitante, tardiamente no decorrer de uma resposta de anticorpos em doenças de excesso de anticorpo. Dado que estes complexos muito grandes são facilmente depurados pelo sistema reticuloendotelial no fígado, também são relativamente não patogénicos.

Pensa-se que a formação de complexos imunitários que pode causar GN ocorre durante doenças de ligeiro excesso de antigénio ou perto do ponto de equivalência anticorpo-antigénio, onde a formação de redes é máxima e o tamanho da rede é grande mas não muito grande. 24 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ Vários factores influenciam a velocidade e localização da precipitação de complexo imunitário. As interacções entre regiões Fc de moléculas de anticorpo promovem a precipitação rápida de complexos imunitários. O papel das interacções Fc-Fc na precipitação de complexo imunitário é ilustrado pelos estudos das propriedades de fragmentos de anticorpo F(ab')2 que não contêm regiões Fc. Embora a valência dos fragmentos F(ab')2 não seja diferente da maioria das imunoglobulinas completas, os fragmentos de anticorpo F(ab')2 formam redes mais lentamente. A carga do antigénio desempenha um papel na determinação da localização no tecido dos locais de deposição de precipitados de complexo imunitário. Os complexos com uma carga substancialmente positiva são atraídos preferencialmente para as membranas basais fortemente carregadas negativamente, em particular no glomérulo renal. A presença localizada de antigénio pode, em determinados casos, explicar a deposição de complexo imunitário especifica do órgão. As doenças tais como sindrome de Goodpasture (uma forma rara de GN) não são tipicamente classificadas como doenças de complexos imunitários porque os complexos são formados in situ no rim, em vez de serem pré-formados na circulação e depois depositados. Uma vez formados os complexos imunitários, pensa-se que o processo inflamatório subsequente é essencialmente igual ao verificado após deposição dos complexos pré-formados. No entanto, o modo diferente de deposição distingue esta sindrome de GN tipica causada por complexos imunitários em circulação.

As caracteristicas do fluxo sanguíneo e da estrutura vascular são também importantes para determinar a localização dos depósitos de complexo. Entre estes, é especialmente importante a permeabilidade capilar. Dado que o endotélio capilar dos glomérulos renais é fenestrado, estes são locais preferenciais para a deposição de complexos imunitários. As variáveis hemodinâmicas que aumentam a localização de complexo imunitário incluem turbulência do fluxo e pressão arterial aumentada, ambas presentes em glomérulos renais. 25 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Complemento e receptores do complemento como reguladores da deposição de complexos imunitários: Além das suas funções pró-inflamatórias, as componentes do complemento podem também inibir a deposição de complexo imunitário e ressolubilizar precipitados de complexo imunitário dos locais de deposição. Além disso, sabe-se que os receptores de eritrócito para C3b, e.g., CRl, são importantes para depuração reticuloendotelial dos complexos imunitários opsonizados em circulação. A análise do padrão clinico da doença de complexo imunitário em doentes com deficiências de determinadas componentes do complemento proporciona informação sobre o papel normal destas componentes na prevenção de deposição de complexo. A incidência de doença de complexo imunitário em doentes com deficiência de Clq, Clr, Cls, C4, C2 ou C3 varia de 60 a 90 porcento, com a maioria destes doentes apresentando sindrome do tipo lúpus. A doença de complexo imunitário está muito raramente associada a deficiências de componentes de acção tardia ou da via alternativa. A ligação de componentes do complemento a complexos imunitários evita a formação de redes antigénio-anticorpo grandes e inibe a precipitação imunitária. Este processo requer activação através da via clássica; o soro deficiente em Clq, C4 ou C2 não inibe eficazmente a formação de redes e a precipitação de complexo. A dependência da via clássica pode reflectir a ligação inicial de componentes Cl, impedindo as interacções Fc-Fc entre moléculas de IgG que contribuem para precipitação imunitária. Tal é seguido por ligação covalente de C3b aos complexos, que inibe adicionalmente a precipitação imunitária e leva à solubilização dos complexos depositados anteriormente. O processo de solubilização também depende da activação de componentes da via alternativa. Consequentemente, as componentes do complemento e seus receptores, através da promoção da depuração de complexos imunitários e inibição da sua deposição nos locais de inflamação, servem como reguladores negativos das doenças do complexo imunitário que podem retardar o desenvolvimento da doença. 26 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Deve salientar-se que ο presente invento envolve bloqueio das actividades da componente C5 do complemento. O facto de ter como alvo esta componente não altera as funções das componentes anteriores do complemento e assim não compromete os efeitos de regulação negativa da deposição de complexo imunitário dessas componentes anteriores.

Inflamação mediada por complexo imunitário: Os basófilos são importantes para iniciar as respostas inflamatórias mediadas por complexo imunitário, dado que a permeabilidade capilar aumenta acentuadamente pela acção de aminas vasoactivas, tais como histamina e factor de activação de plaquetas, que são libertadas por essas células. A permeabilidade vascular é também promovida por agregação das plaquetas em locais de uma lesão inflamatória, com a libertação de factor de activação de plaquetas e a formação de micro-trombos. A desgranulação de basófilos pode reflectir os efeitos dos anticorpos IgE, bem como a elaboração das componentes do complemento anafilotoxinas, C3a e C5a.

Além dos basófilos e plaquetas, os efectores celulares primários de inflamação mediada por complexos imunitários são os leucócitos polimorfonucleares, monócitos e macrófagos. IV. Estudos anteriores sobre o papel do complemento na

patoqénese da GN

Foi efectuado um trabalho extenso numa tentativa de perceber o possível papel do complemento no desenvolvimento da GN. Este trabalho incluiu estudos de GN utilizando vários modelos animais por, entre outros, Unanue, et al., (1964); Cochrane, et al., (1965); Kniker, et al., (1965); Salant, et al., (1980); Groggel, et al., (1983); Falk e Jennette (1986); Jennette, et al., (1987); Passwell, et al., (1988); Schrijver, et al., (1988); Baker, et al., (1989); Schrijver, et al., (1990); Couser, et al., (1991); e Couser, et al., (1992).

Estes estudos demonstraram que o complemento desempenha um papel na patogénese da GN. No entanto, não foram estabelecidos papéis específicos inequívocos para as várias componentes do 27 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ complemento. Em particular, não foram inequivocamente estabelecidos os papéis relativos de C3 e de outras anafilotoxinas comparativamente com os papéis das componentes do complemento terminais na patogénese da GN. Além disso, alguns investigadores relataram que a depleção do complemento não diminui a lesão glomerular. Consultar Kniker, et al., (1965) . 0 trabalho anterior inclui o de Falk e Jennette (1986), que relataram resultados de experiências em que se tentou induzir GN em ratinho com uma deficiência genética que resultou numa deficiência de componente C5 do complemento. 0 relatório conclui que C5 ou alguma componente do complemento terminal dependente de C5 desempenha um papel na patogénese da GN.

Significativamente, relativamente ao presente invento, Falk e Jennette não divulgam ou sugerem de modo algum que se possa utilizar um anticorpo para C5 para tratar a GN. De facto, seria contra-intuitivo utilizar um anticorpo para tratar uma doença que envolve tipicamente a formação e deposição de complexos imunitários anticorpo-antigénio em circulação. Simplesmente, a criação de mais complexos imunitários em circulação parceria ser a última via para resolver um problema que pode ser causado por complexos imunitários em circulação. No entanto, tal como demonstrado pelos resultados surpreendentes apresentados seguidamente, verificou-se que os anticorpos anti-C5 bloqueiam eficazmente a GN, embora a criação de complexos imunitários adicionais em circulação seja inerente ao seu modo de acção.

Baker et al. (1989), Couser et al. (1991) e Couser et al. (1992) (doravante denominados colectivamente como o trabalho "C6") discutem experiências em que se administraram niveis elevados de preparação de anticorpo policlonal anti-C6 a ratos, após o que se formaram complexos imunitários in situ nos rins dos ratos. Significativamente, em relação ao presente invento, a preparação de anticorpo anti-C6 não foi administrada a animais com doença renal preexistente, i.e., não foi utilizada como um tratamento terapêutico. Além disso, o protocolo experimental utilizado nas experiências C6 não envolveu complexos imunitários em circulação, mas apenas 28 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ envolveu complexos formados ίη situ. Assim, as experiências não divulgaram ou sugeriram a abordagem contra-intuitiva do presente invento em que se formam mais complexos imunitários em circulação no processo de tratamento de um estado de doença causado por complexos imunitários em circulação.

Além disso, as dosagens de anticorpo anti-C6 utilizadas no trabalho C6 foram demasiado elevadas para utilização na prática médica. Especificamente, estes anticorpos foram utilizados numa dosagem de 1 g/kg, uma dosagem que corresponderia a 70 g de anticorpo para um indivíduo de 70 kg (155 lb). Contrariamente, os anticorpos anti-C5 utilizados na prática do presente invento são utilizados a concentrações de 0,1 g/kg ou inferiores, i.e., um factor pelo menos dez vezes inferior ao utilizado no trabalho C6. De facto, tal como demonstrado pelos exemplos apresentados seguidamente, verificou-se que dosagens de anticorpo anti-C5 muito baixas, tais como 0,03 g/kg, i.e., 33 vezes inferiores às utilizadas no trabalho C6, atingem os efeitos terapêuticos do invento no tratamento da GN. Para um indivíduo de 70 kg, este nível de anticorpo corresponde a uma dose de apenas 2,1 g.

Os novos anticorpos anti-KSSKC do invento permitem a utilização de níveis de dosagem ainda mais baixos para tratar GN e outras doenças inflamatórias. Com base no seu nível de actividade no sangue humano, é esperado que proporcionem inibição completa do complemento em dosagens inferiores a 0,005 g/kg e que proporcionem inibição do complemento terapeuticamente eficaz em dosagens inferiores a 0,003 g/kg. Esta dosagem de 3 mg/kg é um décimo da dosagem discutida seguidamente nos exemplos 4 e 5 para o mAb anti-C5 N19/8 (específico da cadeia beta). Alguns dos mAb anti-KSSKC de comprimento completo do invento proporcionarão benefícios terapêuticos mesmo em dosagens inferiores a 0,0022 g/kg. Esta é a dose mínima que proporciona inibição completa do complemento, tal como calculada a partir dos dados obtidos utilizando o mAb anti-KSSKC 5G1.1 em sangue humano num circuito CPB, tal como discutido seguidamente no exemplo 9.

Assim, são preferidas dosagens inferiores a 0,005 g/kg, sendo mais preferidas dosagens inferiores a 0,003 g/kg e sendo particularmente preferidas dosagens inferiores a 0,0022 g/kg. 29 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Para um indivíduo de 70 kg, estes níveis de dosagem de anticorpo correspondem a uma dose inferior a 0,35 g para a dosagem mais elevada das dosagens preferidas, inferior a 0,21 g para a dosagem mais preferida e inferior ou igual a 0,15 g para a dosagem mais preferida.

Obviamente, os níveis de dosagem de mAb de cadeia simples e outros mAb recombinantes do invento têm que ser ajustados de acordo com o seu nível de actividade (e.g., a sua afinidade de ligação, a sua capacidade para bloquear a activação de C5 e/ou a sua capacidade para bloquear actividade hemolítica do complemento), a sua valência e o seu peso molecular. Por exemplo, os scFv de mAb anti-KSSKC humanizados do exemplo 11 têm aproximadamente 2 7 kDa, cerca de um sexto da massa de aproximadamente 155 kDa de um anticorpo IgG de comprimento completo nativo. Estes anticorpos bloqueiam completamente a actividade hemolítica do complemento e a geração de C5a numa razão de 3:1, seis vezes superior à de Gl.l nativo (mas apenas três vezes superior quando interpretado em termos de números de locais de ligação anticorpo-antigénio).

Assim, o número de moléculas de cada um destes scFv necessário para igualar o efeito de uma única molécula de 5G1.1 nativo tem que ser aumentado por um factor de seis para ajustar para a razão à qual o bloqueio é completo. Dado que a massa destas moléculas é aproximadamente um sexto da massa de 5G1.1 nativo, as dosagens dos scFv estão da mesma gama das de mAb 5G1.1 nativo.

Além da diminuição dos níveis de dosagem, os anticorpos anti-C5 utilizados na prática do presente invento (i.e., no tratamento de GN) conseguem efeitos terapêuticos importantes que não são conseguidos pelos anticorpos anti-C6. Especificamente, os animais de controlo e de ensaio no trabalho C6 apresentam tanto hipercelularidade, como estreitamento dos lúmenes capilares. Em contraste directo, não se verificou tal hipercelularidade ou estreitamento dos lúmenes capilares em indivíduos doentes quando tratados com anticorpos anti-C5 (consultar figura 1).

Além disso, os anticorpos anti-C5 utilizados no presente invento conseguem uma redução do aumento glomerular, 30 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ proporcionando assim uma demonstração nitida dos potentes efeitos anti-inflamatórios inesperados do anticorpo anti-C5 utilizado na prática do invento. Em nenhuma parte do trabalho C6 há qualquer divulgação ou sugestão de tal efeito anti-inf lamatório potente. V. Anticorpos monoclonais anti-C5 que bloqueiam a actividade hemolítica do complemento e bloqueiam a geração de C5a:

Os mAb anti-C5 que têm a capacidade desejável de bloquear a actividade hemolitica do complemento e de bloquear a geração de C5a (e são assim utilizados no tratamento de GN e outras doenças inflamatórias de acordo com o presente invento) são conhecidos na especialidade desde pelo menos 1982 (Moongkarndi et al. Immunobiol. 1982, 162:397; Moongkarndi et al.

Immunobiol. 1983, 165:323). Os anticorpos conhecidos na especialidade, que são imunorreactivos contra C5 ou fragmentos de C5, incluem anticorpos contra a cadeia beta de C5 (Moongkarndi et al. Immunobiol. 1982, 162:397; Moongkarndi et al. Immunobiol. 1983, 165:323; Wurzner et al. 1991, supra; Mollnes et al. Scand. J. Immunol. 1988, 28:307-312); C5a (consultar por exemplo, Ames et al. J. Immunol. 1994, 152:4572-4581, patente U.S. 4 686 100 e publicação de patente europeia N.° 0 411 306); e anticorpos contra C5 não humano (consultar por exemplo, Giclas et al. J. Immunol. Meth. 1987, 105:201-209). É de salientar que nenhum destes mAb anti-C5 tem as propriedades dos novos mAb anti-C5 do invento, i.e., nenhum deles se liga à cadeia alfa de C5 mas não ao produto de clivagem de C5, C5a, nenhum deles tem a capacidade de bloquear substancialmente tanto a actividade hemolitica do complemento, como a geração de C5a substancialmente na mesma extensão à mesma concentração de anticorpo. É de salientar que foi preparado um derivado scFv do anticorpo N19/8 de Wurzner et al. 1991, supra, e que o scFv de N19/8 tem uma actividade de inibição da geração de C5a 50% menor do que o anticorpo N19/8 nativo (consultar o exemplo 15) . Este comportamento é contrário ao de scFv de 5G1.1, que mantém substancialmente toda a sua actividade de inibição relativamente à geração de C5a (consultar o exemplo 12).

Embora não pretendo uma limitação a qualquer teoria de funcionamento em particular, pensa-se que estas diferenças são 31 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ devidas às características específicas de ligação dos anticorpos do invento. Assim, pensa-se que os anticorpos que não se ligam aos locais dentro da cadeia alfa de C5 e os anticorpos que se ligam ao produto de clivagem de C5, C5a, (C5a livre) não têm a capacidade de bloquear substancialmente tanto a actividade hemolítica do complemento, como a geração de C5a substancialmente na mesma extensão à mesma concentração de anticorpo.

DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Tal como discutido anteriormente, o presente invento refere-se à utilização de anticorpos anti-C5 no tratamento de doentes que sofrem de GN e a anticorpos específicos para C5 e preparações de anticorpos, tal como caracterizadas nas reivindicações. De preferência e quando utilizados para tratar GN, os anticorpos anti-C5 são utilizados numa quantidade eficaz para reduzir substancialmente (e.g., reduzir pelo menos cerca de 50%) a capacidade de lise celular do complemento presente no sangue do doente (a "capacidade de lise celular do complemento presente no sangue do doente" também é aqui denominada "actividade do complemento do soro do sangue do doente"). A redução da capacidade de lise celular do complemento presente no sangue do doente pode ser medida por métodos bem conhecidos na especialidade tais como, por exemplo, pelo método de hemólise de eritrócitos de galinha descrito seguidamente na secção "Ensaios de lise celular".

Para atingir as reduções necessárias, os anticorpos anti-C5 podem ser administrados em várias formas de dosagem unitária. A dose variará de acordo com o anticorpo específico. Por exemplo, os diferentes anticorpos podem ter massas e/ou afinidades diferentes e portanto necessitarem de diferentes níveis de dosagem. Os anticorpos preparados como fragmentos Fab' também necessitarão de dosagens diferentes do que as imunoglobulinas intactas equivalentes, dado que têm uma massa consideravelmente menor do que as imunoglobulinas intactas e assim requerem dosagens inferiores para atingir os mesmos níveis molares no sangue do doente. A dose também variará dependendo da forma de administração, dos sintomas específicos do doente a tratar, do 32 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ estado de saúde global, doença, tamanho e idade do doente e do critério do médico assistente. Os níveis de dosagem dos anticorpos para indivíduos humanos são geralmente entre cerca de 1 mg por kg e cerca de 100 mg por kg por doente por tratamento e, de preferência, entre cerca de 5 mg por kg e cerca de 50 mg por kg por doente por tratamento. Em termos das concentrações plasmáticas, as concentrações de anticorpo são de preferência na gama de cerca de 25 pg/ml a cerca de 500 pg/ml.

Dependendo do critério do médico, um tratamento terapêutico típico inclui uma série de doses, que serão usualmente administradas concomitantemente com a monitorização de pontos finais clínicos, tais como níveis de AUS, níveis de proteinúria, etc., com os níveis de dosagem ajustados conforme necessário para conseguir o resultado clínico pretendido. Alternativamente, os níveis de actividade do complemento de soro disponíveis no sangue do doente são monitorizados utilizando as técnicas apresentadas seguidamente na secção "Ensaios de lise celular" para determinar se são necessárias doses adicionais ou níveis de dosagem superiores ou inferiores de anticorpo, em que tais doses são administradas tal como necessário para manter pelo menos cerca de 50% de redução e, de preferência, cerca de 95% ou mais de redução de actividade do complemento de soro. Obviamente, caso seja desejado, podem ser utilizados outros protocolos, tal como determinado pelo médico. A administração dos anticorpos anti-C5 será em geral efectuada por uma via intravascular, e.g., através de infusão intravenosa por injecção. Caso se pretenda, podem utilizar-se outras vias de administração. Podem encontrar-se formulações adequadas para injecção em Remington's Pharmaceutical

Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17a ed. (1985). Tais formulações têm que ser estéreis e não pirogénicas e geralmente incluirão um transportador farmaceuticamente eficaz, tal como uma solução salina, solução salina tamponada (e.g., tampão de fosfato), solução de Hank, solução de Ringer, dextrose/solução salina, soluções de glicose e semelhantes. As formulações podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis caso necessárias, tais como agentes de ajuste de tonicidade, agentes molhantes, 33 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ agentes bactericidas, conservantes, estabilizantes e semelhantes.

As formulações do invento podem ser distribuídas como artigos de fabrico incluindo material de embalagem e os anticorpos anti-C5. Quando preparado para utilização no tratamento de GN, o material de embalagem incluirá um rótulo que indica que a formulação é para utilização no tratamento de doença renal e pode especificamente referir nefrite ou glomerulonefrite. 0 anticorpo anti-C5 é de preferência um anticorpo monoclonal, embora possam também ser utilizados, caso se pretenda, anticorpos policlonais produzidos e rastreados por técnicas convencionais. Tal como discutido anteriormente, os anticorpos anti-C5 têm que ser eficazes na redução da capacidade de lise celular do complemento presente no sangue humano. Tal como discutido anteriormente, esta propriedade dos anticorpos pode ser determinada por métodos bem conhecidos na especialidade tal como, por exemplo, pelo método de hemólise de eritrócitos de galinha descrito seguidamente na secção "Ensaios de lise celular".

Os anticorpos anti-C5 utilizados na prática do invento ligam-se a C5. De preferência, os anticorpos anti-C5 são utilizados para tratar GN numa quantidade eficaz para reduzir a actividade de C5-convertase disponível no sangue do doente em pelo menos 50%.

Numa concretização particularmente preferida do invento, os anticorpos anti-C5 não são imunorreactivos contra epítopos na cadeia beta, mas são imunorreactivos contra epítopos dentro da cadeia alfa da componente C5 do complemento purificada humana. Nesta concretização, os anticorpos são também capazes de bloquear a conversão de C5 em C5a e C5b pela C5-convertase. Esta capacidade pode ser medida utilizando as técnicas descritas em Wurzner, et al., Complement Inflamm 8:328-340, 1991. Num exemplo especialmente preferido desta concretização, eles podem proporcionar este bloqueio substancialmente nas mesmas concentrações necessárias para bloquear actividade hemolítica. 34 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Dentro da cadeia alfa, os anticorpos mais preferidos ligam-se a uma região amino-terminal, no entanto não se ligam a C5a livre. Os alvos particularmente preferidos destes anticorpos dentro da cadeia alfa incluem o fragmento 5G46k, o fragmento 5G27k, o péptido 5G325aa, o péptido 5G200aa ou o epitopo KSSKC. 0 âmbito do invento também inclui o fragmento 5G46k, o fragmento 5G27k, o péptido 5G325aa, o péptido 5G200aa ou o epitopo KSSKC que são úteis como imunogénios e ligandos de rastreio para produzir os anticorpos do invento.

Podem obter-se hibridomas que produzem anticorpos monoclonais reactivos com a componente C5 do complemento de acordo com as divulgações de Sims, et al.r patente U.S. 5 135 916. Tal como aqui discutido, os anticorpos são preparados utilizando componentes purificadas do complemento do complexo de ataque membranar como imunogénios. De acordo com o presente invento, utiliza-se de preferência como imunogénio a componente C5 ou C5b do complemento. De acordo com um aspecto particularmente preferido do presente invento, o imunogénio é a cadeia alfa de C5. Dentro da cadeia alfa, os imunogénios mais preferidos incluem o fragmento 5G46k, o fragmento 5G27k, o péptido 5G325aa ou o péptido 5G200aa. 0 epitopo KSSKC é um imunogénio menos preferido.

De acordo com o invento, os anticorpos do invento partilham todos determinadas propriedades funcionais necessárias. Estas são a capacidade de inibir substancialmente a actividade hemolítica do complemento e de inibir substancialmente a conversão de C5 para produzir C5a. De preferência, mas não necessariamente, proporcionam estas funções quando utilizados numa razão molar de anticorpo para antigénio (C5) de 3:1 ou menos.

Um anticorpo do invento particularmente preferido é o anticorpo 5G1.1 (5G1.1, produzido pelo hibridoma 5G1.1, denominação ATCC HB-11625) . Outros anticorpos do presente invento particularmente preferidos partilham as propriedades funcionais necessárias discutidas no parágrafo anterior e têm quaisquer das seguintes caracteristicas: (1) competem com 5G1.1 pela ligação a partes de C5 - a cadeia alfa de C5, o fragmento 5G46k, o fragmento 5G27k, o 35 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ péptido 5G325aa, ο péptido 5G200aa ou o péptido KSSKC - que são especificamente imunorreactivas com 5G1.1; e (2) ligam-se especif icamente à cadeia alfa de C5, ao fragmento 5G46k, ao fragmento 5G27k, ao péptido 5G325aa, ao péptido 5G200aa e/ou ao péptido KSSKC. Tal ligação especifica e competição pela ligação podem ser determinadas por vários métodos bem conhecidos na especialidade, incluindo o método de ressonância plasmónica de superfície (Johne et al., J. Immunol. Meth. 1993, 160:191-198). (3) bloqueiam a ligação de C5 quer a C3, quer a C4 (que são componentes da C5-convertase).

Também de acordo com o invento, os anticorpos devem de preferência evitar a clivagem de C5 para formar C5a e C5b, evitando assim a geração da actividade anafilotóxica associada a C5a e evitando a montagem do complexo de ataque membranar associado a C5b. Numa concretização particularmente preferida, estes anticorpos anti-C5 não prejudicarão a função de opsonização associada à activação da componente C3 do complemento por uma C3-convertase. A actividade plasmática de C3-convertase pode ser medida por ensaio do plasma quanto à presença de C3a, tal como descrito seguidamente na secção "Histologia". De preferência, o anticorpo anti-C5 não produz essencialmente qualquer redução dos niveis plasmáticos de C3a.

Podem encontra-se em muitas publicações métodos gerais para a imunização de animais (neste caso com C5 ou C5b ou outro imunogénio preferido), isolamento de anticorpos policlonais ou células que produzem anticorpos, fusão destas células com células imortalizadas (e.g., células de mieloma) para gerar hibridomas que excretam anticorpos monoclonais, rastreio de sobrenadantes de hibridoma para reactividade de anticorpos monoclonais excretados com um antigénio pretendido (neste caso C5 ou C5b ou outro imunogénio preferido), a preparação de quantidades destes anticorpos nos sobrenadantes de hibridoma ou fluidos asciticos e para a purificação e armazenamento destes anticorpos monoclonais. Tais incluem: Coligan, et ai., ed. Current Protocols In Immunology, John Wiley & Sons, New York, 1992; Harlow e Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 36 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ 1988; Liddell e Cryer, A Practical Guide To Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, Chichester, West Sussex, Inglaterra, 1991; Montz, et al., Cellular Immunol. 127:337-351, 1990; Wurzner, et al., Complement Inflamm. 8:328-340, 1991; e Mollnes, et al., Scand. J. Immunol. 28:307-312, 1988.

Tal como aqui utilizada, a expressão "anticorpos" refere-se a imunoglobulinas produzidas in vivo, bem como às produzidas in vitro por um hibridoma e fragmentos de ligação ao antigénio (e.g., preparações de Fab') destas imunoglobulinas, bem como proteínas de ligação ao antigénio expressas de forma recombinante, incluindo imunoglobulinas, imunoglobulinas quiméricas, imunoglobulinas "humanizadas", fragmentos de ligação ao antigénio destas imunoglobulinas, anticorpos de cadeia simples e outras proteínas recombinantes contendo domínios de ligação ao antigénio derivados de imunoglobulinas. Tal como aqui utilizado, "anticorpos" também se referem a péptidos sintéticos de ligação ao antigénio incluindo sequências derivadas das sequências de domínios de ligação ao antigénio de imunoglobulinas. Tal como aqui utilizada, a expressão "mAb recombinantes" refere-se a proteínas de ligação ao antigénio expressas de forma recombinante. Tal como aqui utilizada, a expressão "local de ligação anticorpo-antigénio" refere-se a um local de ligação ao antigénio de um anticorpo incluindo pelo menos uma sequência de CDR.

Os anticorpos cujas sequências de aminoácidos são sequências de imunoglobulinas de comprimento completo que não foram truncadas (e.g., para produzir um scFv ou um Fab) ou mutadas (e.g., sujeitas a splicing para formar um anticorpo quimérico ou humanizado) são aqui denominados anticorpos "nativos". As publicações que descrevem métodos para a preparação destes anticorpos, além das listadas no parágrafo anterior, incluem: Reichmann, et al., Nature, 332:323-327, 1988; Winter e Milstein, Nature, 349:293-299, 1991; Clackson, et al., Nature, 352:624-628, 1991; Morrison, Annu Rev Immunol, 10:239-265, 1992; Haber, Immunol Rev, 130:189-212, 1992; e Rodrigues, et al., J Immunol, 151:6954-6961, 1993.

Embora o tratamento da GN de acordo com o processo do presente invento possa ser efectuado utilizando anticorpos 37 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ policlonais ou monoclonais, são preferidos anticorpos mono-específicos. Tal como aqui utilizado "anticorpos mono-específicos" refere-se a anticorpos que se ligam a uma região específica de um determinado antigénio. Todos os anticorpos monoclonais são mono-específicos, mas os anticorpos policlonais não são tipicamente mono-específicos.

Contudo, tal como é conhecido na especialidade, podem preparar-se por vários métodos anticorpos policlonais mono-específicos. Por exemplo, pode ser utilizado como imunogénio um péptido (e.g., um oligopéptido - tal como utilizado doravante e nas reivindicações, um polímero de 5 a 200 aminoácidos). Outro procedimento que permite a preparação de anticorpos policlonais mono-específicos é a utilização de técnicas de purificação por afinidade com o antigénio para isolar uma população de anticorpos mono-específicos a partir de uma mistura de anticorpos policlonais. De acordo com o presente invento, preferem-se péptidos como imunogénios para a produção e como ligandos de afinidade para a purificação de anticorpos anti-KSSKC policlonais mono-específicos.

Os anticorpos monoclonais nativos (i.e., que não foram produzidos por engenharia genética) do invento são preparados de preferência por métodos convencionais, utilizando o fragmento 5G46k, o fragmento 5G27k, o péptido 5G200aa, o péptido 5G325aa e/ou o péptido KSSKC (e.g., imobilizado numa membrana de polipropileno, tal como descrito seguidamente no exemplo 13) como ligando(s) de rastreio. Tal envolve o ensaio de sobrenadantes de hibridomas quanto à ligação a cada ligando de rastreio.

Numa concretização preferida, os mAb nativos do invento são preparados utilizando como imunogénio a cadeia alfa de C5 humano ou seus fragmentos. Os fragmentos preferidos da cadeia alfa de C5 humano para este objectivo incluem o fragmento 5G46k, o fragmento 5G27k e/ou o fragmento 5G200aa. Embora menos preferido, também se pode utilizar o péptido KSSKC como imunogénio.

Outro imunogénio e ligando de rastreio (embora menos preferido) para a preparação de anticorpos dentro do âmbito dos novos anticorpos do presente invento é o "péptido de local 38 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ de clivagem", i.e., ο péptido que abrange os aminoácidos 725 a 754 de SEQ ID NO:2 (o local de clivagem C5a), tal como discutido seguidamente no exemplo 13.

Noutra concretização preferida do invento, os mAb nativos do invento são preparados em ratinhos transgénicos que expressam imunoglobulinas humanas (consultar, por exemplo, Green et al., Nature Genet. 1994, 7:13-21). Neste caso, utilizam-se os mesmos imunogénios e ligandos de rastreio preferidos, tal como descrito para a preparação de outros mAb nativos.

Noutra concretização preferida do invento, os mAb recombinantes do invento são preparados por rastreio de bibliotecas de exibição em fagos que expressam polinucleótidos que codificam mAb recombinantes (de preferência codificam mAb recombinantes humanos). Consultar, por exemplo, Ames et al., 1994, supra; Smith e Scott, Meth. Enzymol. 1993, 217:228; Kay et al., Gene, 1993, 128:59-65. Este rastreio é efectuado com os ligandos de rastreio descritos anteriormente para a preparação de mAb nativos. Os mAb recombinantes do invento são preparados por subclonagem de polinucleótidos que codificam mAb recombinante num vector de expressão adequado, que os expressa num hospedeiro adequado (tal como descrito seguidamente) e isolamento dos mAb recombinantes. 0 presente invento proporciona vectores de expressão recombinantes que incluem os fragmentos de ácido nucleico do invento, derivados de ADN sintético, genómico ou de ADNc, i.e. os polinucleótidos que codificam os mAb do invento. A sequência de nucleótidos que codifica qualquer dos mAb do invento pode ser inserida num vector de expressão adequado, i.e., um vector que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência de codificação da proteína inserida. Os sinais de transcrição e tradução necessários podem também ser proporcionados pelo gene nativo ou fonte e/ou as suas regiões flanqueadoras.

Podem ser utilizados vários sistemas de vectores hospedeiros para expressar os vectores de expressão recombinantes do invento. Estes incluem, sem limitações, sistemas de células de mamífero infectadas com vírus 39 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ recombinante (e.g., vírus vaccinia, adenovírus, retrovírus, etc.); sistemas de células de mamíferos transfectadas com plasmídeos recombinantes; sistemas de células de insectos infectadas com vírus recombinantes (e.g., baculovírus); microrganismos tais como leveduras contendo vectores de expressão de levedura ou bactérias transformadas com ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plasmídeos recombinantes ou ADN de cosmídeos (consultar, por exemplo, Goeddel, 1990).

Os vectores de expressão úteis para utilização bacteriana podem incluir um marcador seleccionável e uma origem de replicação bacteriana derivada de plasmídeos disponíveis comercialmente, contendo elementos genéticos do bem conhecido vector de clonagem pBR322 (American Type Culture Collection -"ATCC"-, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos da América; N.° de acesso ATCC 37017). Estas "secções de esqueleto" de pBR322 ou sequências funcionalmente equivalentes são combinadas com um promotor adequado e o gene estrutural a expressar. Os promotores utilizados usualmente em expressão microbiana recombinante incluem, sem limitação, o sistema promotor da lactose (Chang, et al., Nature 275:615), o promotor do triptofano (trp) (Goeddel, et al., 1980, Gene Expression Technology, Volume 185. Academic Press, Inc., San Diego, CA) e o promotor tac ou uma fusão entre os promotores tac e trp denominada promotor trc (Maniatis, 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) . Os promotores particularmente preferidos incluem o promotor de T7, que é utilizado conjuntamente com a expressão da célula hospedeira de uma ARN-polimerase de T7 (consultar Studier et al. 1990, Meth. Enzymol. 185:60-89) e o promotor trc, que é encontrado em vários vectores comercialmente disponíveis, tal como seguidamente descrito.

Os vectores de expressão bacterianos preferidos incluem, sem limitações, os vectores pET (consultar Studier et al. 1990, supra) e os vectores Trc. Muitos dos vectores pET estão comercialmente disponíveis de Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA). Um vector particularmente preferido é o vector pET Trc S05/NI seguidamente descrito (SEQ ID NO:18). Está disponível em Pharmacia um vector Trc, pTrc 99A. Outros 40 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ vectores Trc incluem os vectores pSE (Invitrogen, San Diego, CA) .

As bactérias preferidas para expressão de mAb recombinantes incluem Bacillus subtilis e, com maior preferência, Escherichia colí. Uma estirpe particularmente preferida de E. colí é a estirpe W3110 (denominação ATCC 27325). Em determinadas doenças pouco comuns pode ser necessário utilizar métodos de genética bacteriana padrão para preparar estirpes derivadas de W3110, por exemplo, quando está presente um bacteriófago contaminante ("fago") no laboratório em que se efectuam as manipulações bacterianas. Em geral, e em particular para preparação em grande escala de mAb anti-KSSKC recombinante do invento, é preferível utilizar W3110 não modificada ou outra estirpe completamente caracterizada.

Nos casos em que a contaminação por fagos é um problema e a desinfecção não é praticável ou desejável, é preferível identificar o fago contaminante e utilizar então uma estirpe bacteriana completamente caracterizada com uma mutação conhecida que torna a bactéria resistente ao fago. De preferência a mutação é um mutante nulo para o receptor do fago. Contudo, em alguns casos, pode ser aceitável gerar para utilização uma estirpe derivada resistente ao fago relativamente não caracterizada, particularmente em trabalho experimental em pequena escala. Quando se pretendem tais estirpes derivadas, estas podem ser preparadas utilizando os métodos descritos seguidamente no exemplo 11.

Para a maior parte dos objectivos é geralmente preferida a utilização de W3110 não modificada ou outra estripe bacteriana completamente caracterizada. Tal é particularmente relevante para a preparação de agentes farmacêuticos incluindo os mAb anti-KSSKC recombinantes do invento. Tal é devido aos problemas, bem conhecidos na especialidade, de utilizar estirpes bacterianas contendo mutações não caracterizadas ou parcialmente caracterizadas para a produção de ingredientes de agentes farmacêuticos.

Os mAb recombinantes do invento podem também ser expressos em hospedeiros fúngicos, de preferência leveduras do género Saccharomyces, tal como S. cerevisiae. Podem também ser 41 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ utilizados fungos de outros géneros, tais como Aspergillus, Pichia ou Kluyveromyces. Os vectores fúngicos conterão geralmente uma origem de replicação do plasmideo de levedura 2 pm ou outra sequência de replicação autónoma (ARS), um promotor, ADN que codifica um mAb do invento, sequências que dirigem poliadenilação e terminação da transcrição e um gene marcador seleccionável. De preferência, os vectores fúngicos incluem uma origem de replicação e marcadores seleccionáveis que permitem a transformação tanto em E. coli como em fungos.

Os sistemas promotores adequados em fungos incluem os promotores para metalotioneina, 3-fosfoglicerato-quinase ou outras enzimas glicoliticas, tais como enolase, hexoquinase, piruvato-quinase, glucoquinase, o promotor da álcool-desidrogenase repressivel por glicose (ADH2), o promotor constitutivo do gene da álcool-desidrogenase, ADHl e outros. Consultar, por exemplo, Schena, et al. 1991 Meth. Enzymol. 194:389-398. Podem incorporar-se sinais de secreção, tais como os que dirigem a secreção de factor alfa de levedura ou invertase de levedura, no vector fúngico para promover a secreção de um mAb recombinante solúvel para o meio de cultura do fungo. Consultar Moir, et al., 1991, Meth. Enzymol. 194:491-507.

Os vectores de expressão fúngicos preferidos podem ser montados utilizando sequências de ADN de pBR322 para selecção e replicação em bactérias e sequências de ADN fúngicas, incluindo o promotor ADHl e a sequência de terminação da álcool-desidrogenase ADHl, tal como presente no vector pAAH5 (Ammerer, 1983, Meth. Enzymol. 101:192). O promotor ADHl é eficaz em leveduras em que o ARNm de ADHl é estimado como 1 -2% do ARN poli(A) total.

Podem ser utilizados vários sistemas de cultura de células de mamífero ou de insecto para expressar mAb recombinantes. São revistos sistemas de baculovírus adequados para a produção de proteínas heterólogas em células de insecto em Luckow, et al., 1988. Os exemplos de linhas celulares hospedeiras de mamífero incluem células COS de origem em rim de macaco, células L de ratinho, células epiteliais mamárias C127 murinas, células Balb/3T3 de ratinho, células de ovário de hamster chinês (CHO), células EBNA 293 e HeLa humanas, células 42 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ de mieloma e células de rim de hamster bebé (BHK), sendo particularmente preferidas as células de mieloma, as células de CHO e as células EBNA 293 humanas.

Os vectores de expressão de mamífero podem incluir elementos não transcritos, tais como a origem de replicação, um promotor adequado e um potenciador ligado ao gene do mAb recombinante a expressar e outras sequências de flanqueamento a 5' ou a 3', tais como locais de ligação ao ribossoma, uma sequência de poliadenilação, locais dadores e aceitadores de splicing e sequências de terminação da transcrição.

As sequências de controlo da transcrição e da tradução em sistemas de vectores de expressão em mamífero a utilizar na transformação de células de vertebrados podem ser proporcionadas por fontes virais. Por exemplo, são habitualmente utilizados promotores e potenciadores derivados de vírus de Polioma, adenovírus, vírus símio 40 (SV40) e citomegalovírus humanos, incluindo o promotor e o potenciador do gene 1 imediato-precoce de citomegalovírus (CMV). São particularmente preferidos para a expressão de mAb anti-KSSKC recombinantes, os vectores eucarióticos pAPEX-1 (SEQ ID NO:3 e, com maior preferência, pAPEX-3p, SEQ ID NO:4. O vector pAPEX-1 é um derivado do vector pcDNAI/Amp (Invitrogen) que foi modificado para aumentar os níveis de expressão de proteína. Primeiro, removeu-se o intrão do antigénio t pequeno de SV40 não traduzido a 3' por deleção de um fragmento Xbal/Hpal de 601 pares de bases, dado que este intrão é susceptível de splicing aberrante nas regiões de codificação a montante (Evans e Scarpulla, 1989 Gene 84:135; Huang e Gorman, 1990, Molec. Cell Biol. 10:1805). Em segundo lugar, introduziu-se um intrão híbrido de adenovírus-imunoglobulina quimérico na região não traduzida a 5' por substituição de um fragmento Ndel-Notl de 484 pares de bases com um fragmento Ndel-Notl correspondente de 845 pares de bases do vector pRc/CMV7SB (Sato et ai., 1994, j. Biol. Chem. 269:17267). Finalmente, para aumentar os rendimentos do ADN plasmídico a partir de E. coli, a cassete de expressão do promotor de CMV resultante foi inserida no vector pGEM-4Z (Promega Corp. Madison, WI). 43 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ Ο vector ρΑΡΕΧ-3 é um derivado do vector pDR2 (Clontech Laboratories, Inc. Paio Alto, CA) no qual se removeu primeiro o gene EBNA por deleção de um fragmento Clal/Accl de 2,4 kb. 0 promotor de RSV foi então substituído pelo promotor de CMV e o intrão quimérico de adenovírus/imunoglobulina por permuta de um fragmento Mlul/BamHI de 450 pb de pDR2 com um fragmento MluI/BamHl de 1,0 kb do vector pAPEX-1. Para a construção de pAPEX-3P, removeu-se um fragmento BstBI/SwaI de 1,7 kb contendo o promotor tk de HSV e o gene da higromicina-fosfotransferase (hyg) de pAPEX-3 e substituiu-se por um fragmento SnaBI/Nhel de 1,1 kb contendo o promotor precoce de SV40 e o gene da puromicina-acetiltransferase (pac) (Morgenstern e Land, 1990, Nucleic Acids Res. 18:3587-3596) mais um fragmento Xbal/Clal de 137 pb contendo um sinal de poliadenilação de SV40 proveniente do vector pAPEX-1.

Uma célula hospedeira particularmente preferida para a expressão de inserções que codificam mAb recombinante nos vectores pAPEX é a linha celular EBNA 293 humana (Invitrogen, San Diego, CA).

Outro vector eucariótico preferido para a expressão de mAb recombinantes é pcDNAI/Amp (Invitrogen Corporation, San Diego, Califórnia). O vector de expressão pcDNAI/Amp contém o promotor do gene I imediato-precoce de citomegalovírus humano e elementos potenciadores, as sequências intrónicas dadoras e aceitadoras de splicing de consenso do vírus símio 40 (SV40) e o sinal de poliadenilação de consenso de SV40. Este vector também contém uma origem de replicação de SV40 que permite a amplificação epissómica em células (e.g., células COS, células MOP8, etc.) transformadas com antigénio T grande de SV40 e um gene de resistência a ampicilina e propagação e selecção em hospedeiros bacterianos.

Os mAb recombinantes purificados são preparados por cultura de sistemas hospedeiro/vector adequados para expressar os produtos de tradução de mAb recombinante das moléculas de ácido nucleico do presente invento, que são então purificados do meio de cultura ou extractos celulares do sistema hospedeiro, e.g., células bacterianas, células de insecto, fúngicas ou de mamífero. A fermentação de células de fungos ou de mamífero que expressam proteínas mAb recombinantes contendo 44 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ uma sequência marcadora de histidinas (uma sequência contendo uma parte de pelo menos 5 resíduos de histidina) como um produto de expressão facilita bastante a purificação. Esta sequência marcadora de histidina permite a ligação em condições específicas a metais tais como níquel e portanto a colunas de níquel (ou outro metal) para purificação. Os mAb recombinantes podem também ser purificados por cromatografia de afinidade com proteína G (Proudfoot et al., 1992, Protein Express. Purif. 3:368). 0 presente invento será descrito de forma mais completa pelos seguintes exemplos. Os métodos e materiais que são comuns aos vários exemplos são os seguintes.

Materiais e métodos

Indução de GN em ratinhos

Obtiveram-se ratinhos fêmea de quatro meses de idade BlO.D2/nSnJ com um peso médio de aproximadamente 25 g cada de Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME. Injectaram-se os ratinhos diariamente (seis dias por semana) com 0,1 mL de uma solução de apoferritina de cavalo (HAF) a 40 mg/mL que foi preparada por diluição de uma solução salina de HAF (Sigma Chemical Company, n.° de catálogo A-3641) com PBS.

Anticorpos monoclonais anti-C5

Preparam-se anticorpos monoclonais que se ligam à componente C5 do complemento do ratinho, por métodos padrão na forma de uma fracção de IgG a partir de sobrenadantes de culturas do hibridoma BB5.1 (Frei, et al., 1987), que foi obtido de Dr. Brigitta Stockinger do National Institute for Medicai Research, Mill Hill, Londres, Inglaterra.

Histologia

Submeteram-se os rins a análise microscópica utilizando técnicas padrão de coloração histoquímica e de imunofluorescência. A coloração com ácido periódico de Schiff (PAS) de secções de parafina de 5 pm foi por métodos padrão utilizando um kit de reacções histoquímicas HARLECO PAS (EM 45 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Diagnostic Systems, Gibbstown, NJ, número 64945/93) de acordo com as instruções do fabricante. A coloração por imunofluorescência de secções criogénicas de 5 pm foi efectuada por métodos padrão utilizando anticorpo de ovelha anti-C3 de ratinho conjugado com FITC (Biodesign International, Kennebunk, ME, n.° de catálogo W90280F) para detectar a componente C3 do complemento murino ou IgG, IgA e igM de cabra anti-ratinho conjugado com FITC (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, n.° de catálogo 65-6411) para detectar complexos imunitários.

Ensaios de urina

Determinaram-se os teores de proteína e glucose por deposição de pontos de amostras de urina em varetas medidoras CHEMSTRIP 2GP (Boehringer Mannheim Diagnostics, Indianapolis, IN, n.° de catálogo 200743). As áreas de detecção dessas varetas mudam de cor quando expostas a urina contendo proteína ou glucose; a ausência de alteração de cor indica inexistência de proteína ou glucose detectáveis. O nível de analito na urina a ensaiar é lido pela comparação das cores alteradas com tabelas de cores fornecidas pelo fabricante. A tabela de proteína na urina apresenta cores correspondentes a vestígios, 30, 100 e 500 mg/dL.

Ensaios de lise celular A capacidade de lise celular do complemento em sangue pode ser determinada utilizando ensaios hemolíticos que são efectuados do seguinte modo: lavam-se bem eritrócitos de galinha em GVBS (Rollins, et ai., J Immunol 144:3478-3483, 1990, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, n.° de catálogo G-6514) e ressuspendem-se até 2xl08/mL in GVBS. Adiciona-se anticorpo anti-eritrócitos de galinha (fracção IgG de anti-soro anti-eritrócitos de galinha, Intercell Technologies, Hopewell, NJ) às células numa concentração final de 25 pg/mL e incubam-se as células durante 15 min. a 23°C. Lavam-se as células 2x com GVBS e ressuspendem-se 5xl06 células até 30 pL em GVBS. Adiciona-se então um volume de 100 pL de solução de ensaio de soro para obter um volume de mistura reaccional final de 130 pL. Tal como aqui utilizada, a referência a 46 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ percentagem de soro e/ou entrada de soro nestes ensaios indica a percentagem de soro no volume de 100 pL de solução de ensaio de soro.

Para os ensaios de actividade de soro de ratinho o volume de 100 pL de solução de ensaio de soro continha 50 pL de soro de ratinho diluído (em GVBS) e 50 pL de soro humano deficiente em C5 (Quidel Corporation, San Diego, CA). Para os ensaios de actividade de soro humano, a solução de ensaio de soro pode conter até 100% de plasma ou soro humanos sendo os sobrenadantes de hibridoma e/ou GVBS adicionados para proporcionar o volume de 100 pL. Para os ensaios utilizados para rastrear sobrenadantes de hibridoma discutidos seguidamente no exemplo 7, cada solução de ensaio de soro com volume de 100 pL continha 50 pL de sobrenadante de hibridoma e 50 pL de uma solução a 10% de soro humano em GVBS, proporcionando uma entrada de soro humano a 5%.

Após incubação durante 30 min. a 37°C, calculou-se a percentagem de hemólise relativamente a uma amostra de controlo completamente lisada. Determinou-se a hemólise por sedimentação das células por centrifugação e medição da hemoglobina libertada para o sobrenadante sob a forma da densidade óptica a 415nm.

Uma redução de 50% na hemólise após tratamento com os anticorpos anti-C5 utilizados na prática do invento significa que a percentagem de hemólise após tratamento é metade da percentagem de hemólise antes do tratamento. EXEMPLO 1

Os anticorpos anti-C5 inibem a inflamação e aumento glomerulares

Este exemplo ilustra que os anticorpos anti-C5 inibirão a inflamação e o aumento glomerular. O protocolo para estas experiências foi como se segue. Trataram-se ratinhos induzidos com GN com anticorpos anti-C5 ou com PBS como um controlo após 2 semanas de indução de GN. Cada ratinho recebeu 750 pg de anticorpos monoclonais anti-C5 47 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ em PBS (30 mg/kg num ratinho de 25 g) ou um volume igual de

PBS sozinho. A quantidade injectada foi desde 0,25 a 0,365 mL (a concentração de anticorpos em PBS variou), que foi administrada por injecção intraperitoneal uma vez por dia, seis dias por semana. Após 2 semanas adicionais de indução e tratamento, sacrificaram-se os animais e recolheram-se os rins e prepararam-se para exame histológico com descrito anteriormente. Obtiveram-se igualmente rins de ratinhos de controlo com idades idênticas não induzidos e não tratados. A figura 1 mostra secções de rim de ratinho com um único glomérulo localizado centralmente entre o interstício circundante e secções transversais de tubos contornados em cada secção. Tal como pode ser aí observado, os rins dos ratinhos nos quais foi induzida GN e tratados com PBS (figura 1B) desenvolveram patologia glomerular crescêntica grave, incluindo hipercelularidade glomerular inflamatória, espessamento aparente da membrana basal e aumento glomerular, enquanto os glomérulos dos animais com indução de GN e tratados com anti-C5 (figura 1C) eram essencialmente indistinguíveis dos glomérulos dos rins saudáveis normais dos ratinhos não tratados e não induzidos (figura IA).

Note-se que nos glomérulos, com patologia crescêntica grave, o tamanho da rede capilar glomerular (tufo glomerular) não está aumentada mas apresenta sinais de compressão por uma proliferação em forma de crescente de células epiteliais e material positivo para PAS e a cápsula de Bowman apresenta-se drasticamente aumentada. Note-se também que na secção de glomérulo doente apresentada na figura 1B, a rede capilar está dividida ao meio por uma projecção da massa crescêntica hipercelular. O glomérulo não inflamado do ratinho não tratado e não induzido apresentado na figura IA tem aproximadamente 100 pm de diâmetro; o glomérulo inflamado do ratinho com indução de GN e tratado com PBS apresentado na figura 1B tem um diâmetro de aproximadamente 175 pm; o glomérulo não inflamado do ratinho com indução de GN e tratado com anti-C5 apresentado na figura 1C tem um diâmetro de aproximadamente 90 pm. 48 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ EXEMPLO 2

Os anticorpos anti-C5 evitam/reduzem a proteinúria associada a GN

Este exemplo demonstra que o tratamento com anticorpos anti-C5 resulta na prevenção/redução de danos no rim tal como evidenciado pela ausência de quantidades siqnificativas de proteína na urina (i.e. a presença de menos de 100 mq/dL de proteína na urina). O protocolo para as experiências deste exemplo foi o mesmo que se utilizou nas experiências do exemplo 1. Utilizaram-se neste estudo cinco ratinhos tratados com PBS e com indução de GN, 6 ratinhos tratados com anti-C5 e com indução de GN e 4 ratinhos não induzidos e não tratados, com idades equivalentes. Analisou-se um primeiro conjunto de amostras de urina antes do tratamento após o período de indução inicial de 2 semanas. Analisou-se um sequndo conjunto de amostras de urina após o período de tratamento de 2 semanas. Nenhum dos animais de controlo não induzidos e não tratados tinha proteína detectável na sua urina em qualquer destes pontos temporais.

Os resultados obtidos com os ratinhos com indução de GN são apresentados na tabela 1. Tal como aí apresentado, no final do período de tratamento com PBS de 2 semanas, 4 dos 5 animais tratados com PBS (controlo) desenvolveram proteinúria siqnificativa, i.e., pelo menos 100 mg/dL de proteína na urina. O quinto animal (ratinho D na tabela 1) não tinha proteína detectável na urina a qualquer dos pontos temporais mas ao contrário dos outros ratinhos do estudo, divulgou ter níveis muito elevados de glucose na urina após o período de tratamento com PBS de 2 semanas sugerindo que este animal estava fisiologicamente comprometido.

No grupo com indução de GN e tratado com anti-C5, o único ratinho que desenvolveu proteinúria significativa no final do período de indução inicial de 2 semanas (ratinho 6 na tabela 1) melhorou no final do período de 2 semanas de tratamento com anticorpo. Além disso, contrariamente ao desenvolvimento de proteinúria significativa em 4 dos 5 ratinhos com indução de GN e tratados com PBS, nenhum dos 49 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ ratinhos com indução de GN e tratados com anti-C5 apresentou proteinúria significativa no final do período de 2 semanas de tratamento com anticorpo. EXEMPLO 3

Os anticorpos anti-C5 não inibem a deposição glomerular de complexo imunitário

Este exemplo demonstra que os anticorpos anti-C5 utilizados na prática do invento atingem os seus efeitos terapêuticos apesar dos complexos imunitários se depositarem nos glomérulos de animais tratados a níveis equivalentes aos observados nos glomérulos de animais tratados com PBS. 0 exemplo ilustra adicionalmente que o mecanismo de operação dos anticorpos anti-C5 não é através de inibição de deposição do complexo imunitário no glomérulo. 0 protocolo utilizado nas experiências deste exemplo foi o mesmo que o utilizado nas experiências do exemplo 1. Efectuou-se coloração de imunofluorescência tal como descrito anteriormente nas secções dos mesmos rins que se recolheram no exemplo 1.

Apresentam-se os resultados na figura 2. Tal como se pode observar nesta figura depositaram-se quantidades equivalentes de complexos imunitários nos glomérulos dos rins de ratinhos com indução de GN e tratados com PBS (figura 2B) e dos ratinhos com indução de GN e tratados com anti-C5 (figura 2C), mas não nos controlos não induzidos e não tratados (figura 2A) . Os rins de ratinhos com indução de GN recolhidos após o período de indução de 2 semanas, mas antes do tratamento, apresentaram depósitos de complexo imunitário nos glomérulos mas a níveis inferiores (tal como indicado pela menor intensidade de fluorescência) comparativamente com as secções de rim apresentadas na figura 2B e figura 2C. EXEMPLO 4

Os anticorpos anti-C5 inibem a geração de C5b-9

Este exemplo demonstra que os anticorpos anti-C5 utilizados na prática do invento inibem a geração de C5b-9. Ensaiou-se a geração de C5b-9 de dois modos: (1) por ensaio da 50 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ capacidade de lise celular (hemolítica) das amostras de sangue e (2) por medição dos níveis de C5b-9 solúvel nas amostras de sangue. A figura 3 apresenta os resultados de ensaios de lise celular efectuados como descrito anteriormente com soro de ratinho adicionado à percentagem indicada no eixo dos XX ("% de soro de entrada"). Nestes ensaios, ensaiou-se soro de animais induzidos com GN tratados com anticorpos anti-C5 em PBS ou apenas com PBS (consultar anteriormente) no final do período de tratamento de duas semanas. Ensaiou-se igualmente o soro de ratinhos normais não induzidos e não injectados ("soro de ratinho normal") obtido de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, n.° de catálogo S-3269) como um controlo adicional. Estes resultados indicam que o anticorpo monoclonal anti-C5 administrado a ratinhos a uma dosagem de 30 mg/Kg bloqueou completamente a capacidade de lise celular do sangue do ratinho para níveis de entrada de soro 4 vezes superiores aos níveis normais de soro que produzem hemólise máxima no ensaio.

Avaliaram-se os efeitos de um anticorpo monoclonal anti-C5 desenvolvido contra C5 humano no sangue circulante humano. Obteve-se o hibridoma N19/8 (Wurzner, et ai., 1991) do Dr. Otto Gõtze, Departamento de Imunologia, Universidade de Gõttingen, Alemanha. Preparou-se o anticorpo monoclonal C5 após imunização de ratinhos com proteína C5 humana purificada tal como descrito em Wurzner, et al., (1991). Propagou-se o hibridoma em ratinhos e recuperou-se o anticorpo monoclonal e purificou-se como uma fracção IgG de fluido de ascites de ratinho (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988; Current Protocols In Immunology, John Wiley & Sons, New York, 1992).

Para efectuar estas experiências, assim como outras descritas seguidamente nos exemplos 5 e 6, retirou-se 300 mL de sangue humano completo de um dador humano saudável e removeu-se adicionalmente uma amostra de 1 mL como uma amostra de controlo para análise posterior. Diluiu-se o sangue até 600 mL por adição de solução de lactato de Ringer contendo heparina a 10 U/mL. Adicionou-se o mAb anti-C5 (30 mg em PBS estéril) ao sangue diluído para uma concentração final de 50 pg/mL (os resultados utilizando amostras de ensaio obtidas 51 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ deste modo estão marcadas como "amostra + anti-C5" na figura 4 e na figura 6). Numa experiência de controlo, adicionou-se um volume igual de PBS estéril a sangue diluído (os resultados utilizando amostras de controlo obtidas deste modo estão marcadas "amostra - anti-C5" na figura 4 e na figura 6).

Utilizou-se então o sangue para iniciar o circuito extracorpóreo de uma máquina de "bypass" cardiopulmonar (CPB) com oxigenador de membrana COBE CML EXCEL (Cobe bct, inc., Lakewood, CO) e iniciou-se a circulação através do circuito. Arrefeceu-se o circuito a 28°C e manteve-se circulação durante 60 minutos. Aqueceu-se então o circuito a 37°C e manteve-se a circulação durante 30 minutos adicionais, após o que se terminou a experiência. A circulação mecânica de sangue deste modo activa a cascata do complemento. Retiraram-se amostras a vários pontos temporais. A cada ponto temporal retirou-se uma alíquota de sangue e centrifugaram-se sub-alíquotas para remover todas as células e diluiu-se o plasma remanescente 1:1 em solução de conservação de amostra Quidel (Quidel Corporation, San Diego, CA) e armazenou-se a -80°C para avaliação subsequente da geração de C5b-9 solúvel (sC5b-9). Congelaram-se igualmente sub-alíquotas de plasma diluídas para avaliação da geração de C3a (consultar exemplo 5, seguidamente). Congelaram-se sub-alíquotas não diluídas de plasma a -80°C para análise em ensaios hemolíticos para avaliar a farmacocinética dos efeitos dos anticorpos anti-C5 na capacidade de lise celular do complemento presente no sangue (consultar exemplo 6, seguidamente). Estas experiências são também discutidas no pedido de patente US co-pendente com o número de série 08/217 391, apresentado em 23 de Março de 1994.

Efectuaram-se ensaios sC5b-9 antes da adição do anticorpo ou do início do circuito CPB (marcado como "Pre Tx" na figura 4 e na figura 6) utilizando sangue não diluído (í.e. sangue da amostra de 1 mL retirada antes da diluição do sangue com solução de lactato de Ringer - marcada como "ndil" na figura 4 e na figura 6) e sangue diluído em solução de lactato de Ringer (marcado "dil" na figura 4 e na figura 6). Ensaiaram-se amostras de sangue diluído em solução de lactato de Ringer ao qual se tinha adicionado anticorpo (marcado 52 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ "Post Τχ" na figura 4 e na figura 6) nos pontos temporais indicados após o inicio do circuito CPB.

Tal como se pode observar na figura 4, enquanto os níveis de sC5b-9 nas amostras não tratadas foram mais que 4 vezes superiores após 90 minutos de circulação do que antes da circulação, o anticorpo anti-C5 inibiu completamente geração de C5b-9 ao longo do periodo de tempo de circulação de 90 minutos de modo que os níveis de sC5b-9 durante a circulação foram essencialmente equivalentes às amostras de controlo e sem circulação a todos os pontos temporais. EXEMPLO 5

Os anticorpos anti-C5 não inibem a deposição ou activação de 03

Este exemplo demonstra que o tratamento com anticorpos anti-C5 não resulta na inibição da activação da componente C3 do complemento ou na deposição de 03 ou dos seus fragmentos activados nos glomérulos. A deposição de 03 ou dos fragmentos gerados pela sua activação (e.g., C3a e C3b) nos glomérulos de ratinhos com indução de GN e sem indução de GN foi visualizada por coloração de imunofluorescência com uma preparação de anticorpo anti-C3 de ratinho conjugado com FITC utilizando métodos padrão, tal como anteriormente descrito. Tal como se pode observar na figura 5, os rins de ratinhos com indução de GN e tratados com PBS (figura 5B) e tratados com anticorpo anti-C5 (figura 5C) apresentavam níveis aproximadamente equivalentes de material imunorreactivo com C3 nos glomérulos, enquanto os ratinhos de controlo não tratados e não induzidos apresentavam apenas vestígios de material imunorreactivo com C3 nos seus rins (figura 5A).

Note-se que a imagem apresentada na figura 5A foi sobre-exposta comparativamente com as da figura 5B e da figura 5C para evidenciar os níveis muito reduzidos de reactividade presentes em rins não induzidos normais. Os rins de ratinhos com indução de GN recolhidos após o período de indução de 2 semanas, mas antes do tratamento, apresentaram material imunorreactivo com C3 nos glomérulos mas a níveis mais 53 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ reduzidos (tal como indicado pela menor intensidade de fluorescência) do que nas secções de rim apresentadas na figura 5B e na figura 5C.

Testaram-se igualmente anticorpos anti-C5 humano relativamente a possível inibição da activação de C3 em sangue humano preparado e circulado tal como anteriormente descrito no exemplo 4. A activação da componente C3 do complemento foi indicada pela presença no sangue do produto de activação de C3, C3a. Os ensaios a C3a foram efectuados como seguidamente descrito.

Ensaiaram-se as amostras de plasma que tinham sido anteriormente diluídas em solução de conservação de amostra Quidel e congeladas (consultar exemplo 4) relativamente à presença de C3a, utilizando o kit Quidel C3a EIA (Quidel Corporation, San Diego, CA) de acordo com as especificações do fabricante. As concentrações de C3a nas amostras expressam-se como ng/poço tal como determinado por comparação com uma curva padrão gerada a partir de amostras contendo quantidades conhecidas de C3a humano.

Tal como observado na figura 6, a adição do mAb anti-C5 não tinha qualquer efeito de inibição na produção de C3a durante a circulação de sangue humano nesta experiência. EXEMPLO 6

Farmacocinética de anticorpos anti-C5

Determinou-se a duração in vivo da acção do mAb BB5.1 e de um fragmento Fab' do mAb BB5.1 (preparado por métodos padrão) em ratinhos fêmea BALB/cByj normais (com uma média de pesos de aproximadamente 20 g cada) que se obtiveram de Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME. Deu-se aos ratinhos uma injecção intravenosa única (a 35 mg/kg de peso corporal) do mAB ou do fragmento Fab' do mAb (ou um volume equivalente de PBS como controlo) . Recolheram-se amostras de sangue do plexo retro-orbital às horas 1, 4, 24, 96 e 144 após administração de PBS; 4, 16 e 24 horas após administração do fragmento Fab' do mAb BB5.1; e 4, 24, 48, 72, 96 e 144 horas após administração do mAb BB5.1 intacto. 54 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ A figura 7Α apresenta a evolução temporal de inibição da capacidade de lise celular do complemento em sangue de ratinho (determinada por ensaio do soro obtido do sangue e diluído para 2,5%, tal como anteriormente descrito) após a administração in vivo do mAb, do fragmento Fab' ou de PBS. Tal como apresentado na figura, o mAb inibiu quase completamente a actividade hemolítica do sangue ao longo do período de ensaio de 6 dias. 0 Fab', contudo, teve uma meia vida de aproximadamente 24 horas.

Além das experiências anteriores, no final do 6o dia do período de ensaio sacrificaram-se todos os ratinhos.

Recolheram-se os rins, os pulmões e os fígados e analisaram-se por inspecção grosseira assim como por exame microscópico das secções coradas. Todos os órgãos dos animais tratados com anticorpo anti-C5 pareceram semelhantes aos retirados dos animais tratados com controlo de PBS. 0 aspecto geral dos ratinhos de ensaio e de controlo foi também indistinguível antes da necropsia.

Ensaiaram-se também as propriedades farmacocinéticas dos anticorpos anti-C5 humanos em sangue humano circulante tal como descrito anteriormente no exemplo 4. Tal como aí descrito, ensaiaram-se os efeitos de inibição de hemólise de um anticorpo monoclonal anti-C5 humano ao longo de um período de circulação de 90 minutos. Os resultados destes ensaios encontram-se num quadro na figura 7B e mostram que o mAb N19/8 anti-C5 inibiu essencialmente de forma completa a capacidade de lise celular do sangue humano durante o período de circulação completo de 90 minutos.

Os resultados destas experiências demonstram que os anticorpos anti-C5 sobreviverão na corrente sanguínea durante um período de tempo substancial, tornando assim prático a administração periódica. EXEMPLO 7

Preparação de anticorpos monoclonais anti-C5

Preparou-se um anticorpo monoclonal adequado para utilização na prática do presente invento de acordo com os 55 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ princípios de Sims, et al., patente U.S. 5 135 916, como se segue. imunizaram-se ratinhos Balb/c três vezes por injecção intraperitoneal com proteína C5 humana (Quidel Corporation, San Diego, CA, n.° de catálogo A403). A primeira injecção continha 100 pg de proteína C5 em emulsão de adjuvante completo de Freund, a segunda imunização continha 100 pg de proteína C5 em emulsão de adjuvante incompleto de Freund e a terceira imunização foi 100 pg de proteína em PBS. Injectaram-se os ratinhos em intervalos de aproximadamente 2 meses.

Efectuaram-se fusões de esplenócitos com células de mieloma para gerar hibridomas essencialmente como descrito em Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, New York, 1992, páginas 2.5.1 a 2.5.17). Um dia antes da fusão reforçaram-se os ratinhos IV com 100 pg de proteína C5. No dia da fusão sacrificaram-se os ratinhos imunizados e recolheram-se os baços. Utilizaram-se células de mieloma SP2/0-AG14 (ATCC CRL#1581) como parceiro de fusão.

Dividiram-se culturas SP2/0-AG14 no dia anterior à fusão para induzir divisão celular activa. Utilizou-se uma razão de 1:10 (células de mieloma:esplenócitos) nas fusões.

Fundiram-se as células utilizando PEG 1450 em PBS sem cálcio (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, n.° de catálogo P-7181) e plaquearam-se a 1-2,5 x 105 células por poço. Iniciou-se selecção em meio EX-CELL 300 (JRH Biosciences,

Lexena, KS, n.° de catálogo 14337-78P) suplementado com soro fetal bovino (FBS) inactivado pelo calor a 10%; glutamina, penicilina e estreptomicina (GPS); e HAT (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, n.° de catálogo H-0262), no dia seguinte. Alimentaram-se então as fusões dia sim, dia não com FBS, GPS e meio HAT suplementado frescos. Pode observar-se morte celular logo aos 2 dias e puderam observar-se agregados de células viáveis logo aos 5 dias após o início da selecção.

Após duas semanas de selecção em HAT, transferiram-se os hibridomas sobreviventes para estudo posterior para meio EX-CELL 300 suplementado com FBS, GPS e HT (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, n.° de catálogo H-0137) durante 1 semana e seguidamente cultivaram-se em meio EX-CELL 300 suplementado com FBS e GPS. 56 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Rastrearam-se os hibridomas para reactividade relativamente a C5 e inibição de hemólise mediada pelo complemento 10-14 dias após fusão e efectuou-se pelo menos até à análise dos resultados do rastreio. O rastreio para inibição de hemólise foi o ensaio de lise de eritrócitos de galinha anteriormente descrito. O rastreio para reactividade de C5 foi uma ELISA, que foi efectuada utilizando o protocolo seguinte:

Incubou-se uma aliquota de 50 pL de uma solução de C5 a 2 pg/mL (Quidel Corporation, San Diego, CA) em tampão de carbonato/bicarbonato de sódio, pH 9,5, durante a noite a 4°C em cada poço de ensaio de uma placa de 96 poços (Nunc-Immuno F96 Polysorp, A/S Nunc, Roskilde, Dinamarca). Submeteram-se então os poços a uma etapa de lavagem. (Cada etapa de lavagem consistiu de três lavagens com TBST.) Seguidamente, bloquearam-se os poços de ensaio com 200 pL de solução de bloqueio, BSA a 1% em TBS (BSA/TBS) durante 1 hora a 37°C. Após uma etapa de lavagem adicional incubou-se uma aliquota de 50 pL do sobrenadante de hibridoma em cada poço de ensaio durante 1 hora a 37°C com uma etapa de lavagem subsequente. Como anticorpo secundário (detecção), incubaram-se 50 pL de uma diluição 1:2000 de IgG de cabra anti-ratinho conjugado com peroxidase de rábano (HRP) em BSA/TBS em cada poço de ensaio durante 1 hora a 37°C, seguido por uma etapa de lavagem. Seguindo os procedimentos do fabricante, dissolveram-se 10 mg de O-fenilenodiamina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, n.° de catálogo P-8287) em 25 mL de tampão fosfato-citrato (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, n.° de catálogo P-4922) e adicionaram-se 50 pL desta solução de substrato a cada poço para permitir detecção de actividade de peroxidase. Finalmente, para parar a reacção de detecção de peroxidase, adicionou-se a cada poço uma aliquota de 50 pL de ácido clorídrico 3N. Detectou-se a presença de anticorpos reactivos com C5 num sobrenadante de hibridomas por determinação espectrofotométrica da D.O. a 490 nm. O sobrenadante de um hibridoma designado como 5G1.1 apresentou resultado positivo em ELISA e reduziu substancialmente a capacidade de lise celular do complemento presente em sangue humano normal no ensaio de hemólise de eritrócitos de galinha. As análises posteriores revelaram que 57 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ ο anticorpo 5G1.1 reduz a capacidade de lise celular do complemento presente em sangue humano normal de forma tão eficaz que este pode neutralizar quase completamente a actividade hemolítica do soro quando se encontra presente a aproximadamente metade da concentração molar de C5 humano no ensaio hemolitico.

Efectuaram-se análises de transferência imunológica para caracterizar adicionalmente o mAb 5G1.1. Submeteu-se C5 humano (Quidel Corporation, San Diego, CA, n.° de catálogo A403) a electroforese em gel de poliacrilamida sob condições redutoras, transferiu-se para uma membrana de nitrocelulose e sondou-se com o mAb 5G1.1 como uma preparação de IgG purificada. Duas bandas apresentaram reactividade imunitária com o mAb 5G1.1 a pesos moleculares aparentes correspondentes aos das cadeias alfa e beta da proteína C5 humana. Verificou-se subsequentemente que as duas bandas imunorreactivas com 5G1.1 observadas nesta transferência de "Western" resultavam da ligação do anticorpo 5G1.1 à cadeia alfa de C5 de 115 kDa e a um fragmento grande da cadeia alfa que tinha o mesmo peso molecular aparente (aproximadamente 75 kDa) do que a cadeia beta de C5 e estava presente nas preparações de C5 utilizadas para a experiência.

Efectuaram-se ensaios para determinar a actividade relativa do mAb N19/8 discutido nos exemplos 4 e 5 com o mAb 5G1.1 em ensaios hemolíticos funcionais e para avaliar se estes mAb bloqueavam a clivagem de C5 para proporcionar C5a. Com este propósito, os mAb N19/8 e 5G1.1 foram comparados directamente em ensaios hemolíticos e de libertação de C5a do complemento humano.

Os ensaios hemolíticos efectuados na presença de soro humano a 20% v/v revelaram que o mAb 5G1.1 bloqueou eficazmente a actividade hemolítica do soro a uma concentração final de 6,25 pg/ml (0,5/1 de razão molar de 5G1.1/C5) enquanto o mAb N19/8 bloqueou a uma concentração superior de 25,0 pg/ml (2,0/1 de razão molar de N19/8/C5) . Quando se ensaiaram os sobrenadantes desses ensaios relativamente à presença de C5a, verificou-se que o mAb 5G1.1 inibiu eficazmente a geração de C5a a doses idênticas às requeridas para o bloqueio de actividade hemolítica mediada por C5b-9. 58 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Contrariamente, verificou-se que ο mAb Ν19/8 era 10 vezes menos eficaz a bloquear a libertação de C5a nesses ensaios comparativamente com o mAb 5G1.1. Além disso, a capacidade do mAb N19/8 bloquear hemólise mediada por complemento não foi equivalente à sua capacidade de bloquear geração de C5a na medida em que uma dose de 25 pg/ml de N19/8 bloqueou completamente hemólise enquanto reduziu a geração de C5a em apenas 37%.

Depositou-se o hibridoma 5G1.1 em American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, Estados Unidos da América a 27 de Abril de 1994 e atribuiu-se-lhe a designação HB-11625. Este depósito foi efectuado ao abrigo do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para Efeitos do Procedimento em Matéria de Patente (1977). EXEMPLO 8

Determinação das constantes de afinidade (KD) para os anticorpos monoclonais anti-C5 humanos, 5G1.1 e N19/8 0 procedimento utilizado para determinar a constante de dissociação (KD) dos equilíbrios anticorpo-antigénio em solução foi a descrita por Friguet et ai., J. Immunol. Meth. 1985, 77:305-319. Utilizou-se este método para determinar a KD para os anticorpos monoclonais anti-C5 humanos, N19/8 e 5G1.1. Incubaram-se os anticorpos monoclonais com o antigénio (C5) em solução até se atingir o equilíbrio. Mediu-se a proporção de anticorpo que permanece desligada (livre) em equilíbrio utilizando um ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA) convencional. Mostrou-se que os valores experimentais de KD obtidos por este método são equivalentes aos obtidos por outros métodos (imunoprecipitação de antigénio marcado radioquimicamente e transferência de fluorescência). Este método apresenta a vantagem de se aplicar a antigénio não modificado.

As figuras 8 e 9 apresentam os gráficos de Scatchard da ligação dos anticorpos monoclonais anti-C5 humanos, 5G1.1 e N19/8 a C5 humano tal como medido por ELISA. Em cada gráfico (v) representa a fracção de anticorpo ligado e (a) representa 59 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ a concentração de antigénio livre no equilíbrio. O valor calculado de KD para o mAb 5G1.1 foi 30 pM enquanto o valor calculado de KD para o mAb N19/8 foi 43 pM. Estes resultados indicam que o KD para os mAb 5G1.1 e N19/8 são semelhantes e consequentemente a disparidade funcional entre os dois anticorpos não pode ser explicada simplesmente pelas diferenças de afinidade pelo antigénio C5. EXEMPLO 9

Efeito do mAb 5G1.1 na activação do complemento durante CPB

Efectuaram-se experiências envolvendo recirculação de sangue humano num circuito CPB, tal como anteriormente descrito nos exemplos 4 e 5, utilizando três doses do mAb 5G1-1 (15 mg, 7,5 mg, 3,75 mg) assim como controlos na ausência do mAb 5G1.1. Em cinco de tais experiências de controlo efectuadas nesta série, os níveis de C3a (figura 10) e de sC5b-9 (figura 11) aumentaram durante os primeiros 30 min e continuaram a aumentar ao longo de toda a experiência. A adição do mAb 5G1.1 ao circuito CPB não teve qualquer efeito na geração de C3a nestas experiências.

Contrariamente, a adição das duas doses mais elevadas (15 mg e 7,5 mg) do mAb 5G1.1 bloqueou completamente a geração de sC5b-9 nestas experiências enquanto a dose mais baixa (3,75 mg) apenas bloqueou parcialmente a geração de sC5b-9. Os ensaios hemolíticos efectuados em amostras de soro retiradas ao longo dos pontos temporais destas experiências revelaram que a actividade do complemento do soro total não foi afectada em experiências de controlo (figura 12) . Contrariamente, a dose mais elevada do mAb 5G1.1 (15 mg) bloqueou completamente a actividade hemolítica enquanto as duas doses mais baixas (7,5 mg e 3,75 mg) não conseguiram bloquear actividade hemolítica.

Estes resultados mostram que a dose de 7,5 mg bloqueou eficazmente geração de C5b-9 no circuito CPB mas não conseguiu bloquear actividade hemolítica mediada por C5b-9, sugerindo que os ensaios hemolíticos sozinhos podem não reflectir adequadamente a activação do complemento que ocorre durante CPB. Estes resultados indicam adicionalmente que o mAb 5G1.1 pode bloquear completamente a activação do complemento em 60 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ sangue humano, tal como medido por qualquer dos critérios, a uma dosagem de 15mg/500ml uma dose que é aproximadamente equivalente a uma dose de 150 mg para um doente de 70 kg. EXEMPLO 10

Clonagem dos genes da região variável anti-KSSKC recombinante de anti-C5

Sequenciação de aminoácidos:

Para determinar a sequência de aminoácidos N-terminal do mAb 5G1.1, preparou-se um gel de poliacrilamida a 12% (37,5:1 acrilamida/N,N'-metilenobis-acrilamida) e efectuou-se uma pré-electroforese durante 45 minutos a 10 mA utilizando tampão de pré-electrof orese lx (bis-Tris 123 mM, pH 6,6, com o reservatório de tampão do cátodo suplementado com glutationa reduzida 1 mM) . No dia seguinte, substituiu-se o tampão de pré-electroforese no reservatório do cátodo por tampão de reservatório de cátodo (ácido N-tris-(hidroximetil)metil-2-aminoetanossulfónico 44 mM, bis-Tris 113 mM, dodecilsulfato de sódio (SDS) a 0,1% (p/v), ácido tioglicólico a 0,067% (p/v)) e substituiu-se o tampão de pré-electroforese no reservatório do ânodo por tampão de reservatório de ânodo (bis-Tris 63 mM, pH 5,9).

Adicionaram-se 75 pg de anticorpo monoclonal 5G1.1 a tampão de amostra de Laemmli (Tris-HCl 30 mM pH 6,8, SDS a 3% (p/v), EDTA 10 mM, azul de bromofenol a 0,02% (p/v), glicerol a 5% (v/v), beta-mercaptoetanol a 2,5% (v/v)) e submeteu-se a electroforese a 10 mA até o corante de detecção de azul de bromofenol atingir a base do gel. Transferiu-se a proteina para uma membrana PROBLOTT (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando tampão de transferência IX (ácido ciclo-hexilaminopropanossulfónico 10 mM, ditiotreitol a 0,05% (p/v), metanol a 15% (v/v)) a 50 V durante uma hora.

Localizaram-se as bandas de proteina por coloração com Ponceau S a 0,2% (em ácido tricloroacético a 3%, ácido sulfossalicilico a 3%) seguido de descoloração com água. Excisaram-se as bandas e submeteram-se a análise de sequência de aminoácidos utilizando química de Edman efectuada num sequenciador de proteínas por impulsos de líquido (ABI 61 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ modelo 477Α), sendo os aminoácidos PTH assim obtidos analisados com um sistema de HPLC microbore em linha (ABI modelo 120A).

Para desbloquear o terminal amino da cadeia pesada de 5G1.1, permutaram-se 10 mg de anticorpo monoclonal 5G1.1 para tampão redutor (guanidina-HCl 5 M, Tris-HCl 50 mM, ditiotreitol 10 mM, pH 8,5) utilizando uma coluna PD-10 (Pharmacia, Piscataway, NJ). Após uma incubação de uma hora à temperatura ambiente, adicionou-se iodoacetamida 50 mM e continuou-se a incubação durante 30 minutos. As cadeias pesada e leve carbamidometiladas assim obtidas foram separadas por cromatografia de exclusão de tamanho numa coluna SUPEROSE 12 (Pharmacia) equilibrada com guanidina-HCl 5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8,5. Permutou-se a cadeia pesada carbamidometilada para fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0 utilizando uma coluna PD-10, submeteu-se a digestão com piroglutamato-aminopeptidase (PanVera, Madison, WI; 0,5 mU por nmol de proteína de cadeia pesada) e sequenciou-se como anteriormente descrito.

Para determinação da sequência de aminoácidos interna, permutou-se a cadeia leve de 5G1.1 carbamidometilada para ureia 2 M, Tris-HCl 25 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0 e incubou-se com endoproteinase Lys-C (Promega, Madison, wi; razão proteaserproteína de 1:40) a 37°C durante a noite. Aplicou-se o material digerido a uma coluna C18 de HPLC de fase reversa (Beckman Instruments, Fullerton, CA) e eluiu-se utilizando um gradiente linear de 0-50% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1%. Submeteram-se os picos a análise de sequência de aminoácidos como anteriormente descrito.

Clonaqem por PCR: A clonagem da região pesada variável de 5G1.1 foi efectuada utilizando um conjunto de iniciadores disponíveis comercialmente (Mouse Ig-PRIMER SET, n.° de catálogo 69831-1, Novagen, Madison, WI) . Isolou-se o ARN total de células de hibridoma 5G1.1 utilizando a técnica de ácido/tiocianato de guanidina (Chomczynski e Sacchi, Anal. Biochem. 1987, 162:156-159). Para síntese de primeira cadeia de ADNc, desnaturaram-se dez microgramas de ARN total a 65°C durante 5 min., arrefeceu-se em gelo e adicionou-se a 100 μΐ de uma reacção contendo Tris 10 mM pH 8,3, KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM, ditiotreitol 62 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ 10 mM, dNTP cada um a 250 μΜ, 20 unidades de transcritase inversa AMV (Seikagaku America, Rockville, MD) e 10 pmol do iniciador 3' apropriado (tal como descrito no protocolo do kit Ig-PRIMER SET). Após incubação a 37°C durante uma hora, adicionaram-se cinco microlitros da reacção de síntese de ADNc a 100 microlitros de uma reacção de PCR contendo: Tris-HCl 10 mM pH 9,0 a 25°C, KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM, gelatina a 0,1% (p/v), Triton X-100 a 1,0% (v/v), dNTP cada um a 200 μΜ, 2,5 U de ADN-polimerase AMPLITAQ (Perkin-Elmer-Cetus, Norwalk, CT) e 25 pmol dos iniciadores 5' e 3' apropriados (tal como descrito no protocolo do kit Ig-PRIMER SET) . As condições reaccionais foram 1 minuto a 95°C, 1 minuto a 42°C e 1 minuto a 72°C durante 30 ciclos, seguido de uma extensão final a 72°C durante 10 minutos.

Clonaram-se os produtos de PCR com o tamanho esperado (aproximadamente 450 pb) para o vector pCRll (Invitrogen, San Diego, CA) utilizando um kit de clonagem T/A (Invitrogen). Efectuou-se análise de sequência de adn dos fragmentos de ADN clonados pelo método de terminação de cadeias didesoxi utilizando ADN de plasmídeo em cadeia dupla como molde. Isolou-se uma região variável de cadeia pesada única por este procedimento e designou-se o plasmídeo resultante como p5Gl.l VH 2-1-3. Sequenciaram-se vários clones obtidos de replicados independentes de reacções de PCR para detectar quaisquer mutações introduzidas durante a amplificação por PCR desta região variável.

Para clonar a região variável de cadeia leve de 5G1.1 conceberam-se iniciadores de PCR utilizando o programa de UWGCG, TFASTA (University of Wisconsin, Madison, WI) para rastrear o subdirectório de roedores do GenBank com uma sequência de aminoácidos de busca de um 19mero Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Glu Thr Vai Thr, que se obteve por sequenciação de aminoácidos tal como anteriormente descrito. Localizou-se uma sequência exactamente igual no gene da linha germinal murina que codifica a região variável v-capa k2 (Seidman et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1978 75:3881-3885). Utilizou-se a sequência de ADN deste gene de linha germinal para conceber o oligonucleótido UDEC690 (SEQ ID NO: 5) para utilização como um iniciador 5' de região variável. Sintetizou-se igualmente um iniciador de região 63 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ constante do gene capa murino, UDEC395 (SEQ ID NO:6) e utilizou-se nesta reacção. Efectuou-se clonagem da região leve variável de 5G1.1 utilizando o iniciador 5' de região variável de UDEC690 e o iniciador da região constante do gene capa murino UDEC395.

Isolou-se ARNm poliA do hibridoma 5G1.1. Utilizou-se o procedimento ácido/tiocianato de guanidinio (Chomczynski e Sacchi, anteriormente) para isolar ARN total, seguido de cromatografia em oligo(dT)-celulose de 1 mg de ARN total. Para a síntese de ADNc de primeira cadeia, desnaturou-se um microlitro dos 25 microlitros de eluato de oligo(dT)-celulose (contendo aproximadamente 2 microgramas de ARNm de 5G1.1 purificado) a 65°C durante 5 min., arrefeceu-se em gelo e incubou-se em tampão de extensão (Tris 10 mM pH 8,3, KC1 50 mM, ditiotreitol 1 mM, dNTP cada um a 240 μΜ) contendo UDEC395 (SEQ ID NO:6) 100 nM e 25 unidades de transcritase inversa AMV (Seikagaku America, Rockville, MD) a 42°C durante uma hora. Submeteram-se cinco microlitros da reacção de primeira cadeia completa a amplificação por PCR utilizando tampão de amplificação suplementado com 2,5 unidades de ADN polimerase AMPLITAQ (Perkin Elmer, Foster City, CA) e cada um dos iniciadores UDEC690 (SEQ ID NO:5) e UDEC395 (SEQ ID NO:6) a 500 nM. Efectuou-se amplificação utilizando 30 ciclos consistindo cada um de 1 minuto a 95°C, 1 minuto a 52°C e 1 minuto a 72°C, seguido de uma única incubação de dez minutos a 72°C.

Purificou-se o produto de PCR resultante utilizando GENECLEAN de acordo com as instruções do fabricante (Bio 101, La Jolla, CA), digeriu-se com Sse8387 I e Hind III, purificou-se em gel e ligou-se para o vector Bluescript II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) . Transformaram-se plasmídeos ligados para a estirpe bacteriana DH10B por electroporação.

Purificou-se ADN plasmídico de culturas das bactérias transformadas por métodos convencionais incluindo cromatografia em coluna utilizando uma coluna QUIAGEN-TIP-500 de acordo com as instruções do fabricante (Quiagen, Chatsworth, CA) e sequenciou-se pelo método de terminação de cadeias didesoxi de Sanger utilizando enzima SEQUENASE (U.S. Biochemical, Cleveland, OH) . Os clones obtidos de uma segunda 64 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ reacção de PCR independente permitiram verificar que não tinham sido introduzidas mutações durante o processo de amplificação. 0 plasmideo resultante contendo a região variável clonada designou-se SK (+) 690/395. Esta inserção que codifica a cadeia leve neste plasmideo codifica para as sequências de N-terminal e interna da cadeia leve determinadas por sequenciação de aminoácidos de 5G1.1, tal como descrito anteriormente. EXEMPLO 11

Construção e expressão de mAb recombinantes

Prepararam-se construções de ADN recombinante que codificam mAb recombinantes incluindo as CDR de 5G1.1, por métodos de ADN recombinante convencionais incluindo procedimentos de PCR de subclonagem e de sobreposição de fragmentos de restrição. Os ADN que codificam mAb recombinantes resultantes incluem: (1) um ADN que codifica um scFv não humanizado (murino) designado por 5G1.1M1 scFv (SEQ ID NO:7), em que CDR LI são os resíduos de aminoácido 28-34 de SEQ ID NO: 7, CDR L2 são os resíduos de aminoácido 52-54 de SEQ ID NO: 7, CDR L3 são os resíduos de aminoácido 93-98 de SEQ ID NO: 7, CDR Hl são os resíduos de aminoácido 156-159 de SEQ ID NO:7, CDR H2 são os resíduos de aminoácido 179-183 de SEQ ID NO:7 e CDR H3 são os resíduos de aminoácido 226-236 de SEQ ID NO: 7; (2) um ADN que codifica um scFv humanizado (com enxerto de CDR) designado por scFv de 5G1.1 CB (SEQ ID NO:8), em que CDR Ll são os resíduos de aminoácido 26-36 de SEQ ID NO:8, CDR L2 são os resíduos de aminoácido 52-58 de SEQ ID NO:8, CDR L3 são os resíduos de aminoácido 91-99 de SEQ ID NO:8, CDR Hl são os resíduos de aminoácido 152-161 de SEQ ID NO: 8, CDR H2 são os resíduos de aminoácido 176-192 de SEQ ID NO: 8, H3 são os resíduos de aminoácido 225-237 de SEQ id NO: 8; (3) um ADN que codifica uma cadeia leve quimérica (que pode formar a parte de cadeia leve de um Fab) designado por 5G1.1M1 VL HuK (SEQ ID NO:9); 65 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ (4) um ADN que codifica um Fd quimérico (a parte de cadeia pesada de um Fab) designada por 5G1.1M1 VH HuGl (SEQ ID NO:10); (5) um ADN que codifica um Fd humanizado (com enxerto de CDR e alteração de sequência de esqueleto) designado por 5G1.1 VH + ighrl (SEQ ID NO:ll), em que CDR Hl são os residuos de aminoácido 26-35 de SEQ ID NO: 11, CDR H2 são os residuos de aminoácido 50-60 de SEQ ID NO: 11 e CDR H3 são os residuos de aminoácido 99-111 de SEQ ID NO:ll; (6) um ADN que codifica um Fd humanizado (com enxerto de CDR mas sem alteração de esqueleto) designado por 5G1.1 VH + IGHRLC (SEQ ID NO: 12), CDR Hl são os residuos de aminoácido 26-35 de SEQ ID NO: 12, CDR H2 são os residuos de aminoácido 50-66 de SEQ ID NO: 12 e CDR H3 são os residuos de aminoácido 99-111 de SEQ ID NO:12; (7) um ADN que codifica uma cadeia leve humanizada (com enxerto de CDR e alteração de sequência de esqueleto) designado por 5G1.1 VL + KLV56 (SEQ ID NO: 13), em que CDR LI são os residuos de aminoácido 26-36 de SEQ ID NO: 13, CDR L2 são os residuos de aminoácido 52-58 de SEQ ID NO: 13 e CDR L3 são os residuos de aminoácido 91-99 de SEQ ID NO:13; (8) um ADN que codifica uma cadeia leve humanizada (com enxerto de CDR mas sem alteração de esqueleto) designado por 5G1.1 VL + KLV56B (SEQ ID NO: 14), em que CDR Ll são os residuos de aminoácido 26-36 de SEQ ID NO: 14, CDR L2 são os residuos de aminoácido 52-58 de SEQ ID NO: 14 e CDR L3 são os residuos de aminoácido 91-99 de SEQ ID NO:14; (9) um ADN que codifica uma cadeia leve humanizada (com enxerto de CDR mas sem alteração de esqueleto) designado por 5G1.1 VL + 012 (SEQ ID NO: 15), em que CDR Ll são os residuos de aminoácido 24-34 de SEQ ID NO:15, CDR L2 são os residuos de aminoácido 50-56 de SEQ ID NO: 15 e CDR L3 são os residuos de aminoácido 89-97 de SEQ ID NO:15; e (10) um ADN que codifica um Fd humanizado (com enxerto de CDR mas sem alteração de esqueleto) designado por 5G1.1 VH + IGHRLD (SEQ ID NO: 16), em que CDR Hl são os residuos de aminoácido 26-35 de SEQ ID NO: 16, CDR H2 são os residuos de 66 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ aminoácido 50-60 de SEQ ID NO:16 e CDR H3 são os resíduos de aminoácido 99-111 de SEQ ID NO:16. (11) um ADN que codifica um scFv humanizado (com enxerto de CDR mas sem alteração de esqueleto) designado por scFv de 5G1.1 D012 (SEQ ID NO: 17), em que CDR Ll são os resíduos de aminoácido 26-36 de SEQ ID NO: 17, CDR L2 são os resíduos de aminoácido 52-58 de SEQ ID NO: 17, CDR L3 são os resíduos de aminoácido 91-99 de SEQ ID NO: 17, CDR Hl são os resíduos de aminoácido 152-161 de SEQ ID NO:17, CDR H2 são os resíduos de aminoácido 176-186 de SEQ ID NO:17 e CDR H3 são os resíduos de aminoácido 225-237 de SEQ ID NO:17;

De acordo com o invento, uma de cada das diferentes CDR Ll, L2 e L3 discutidas de (1) a (11) anteriormente podem ser combinadas com qualquer das outras CDR de cadeia leve de modo a produzir um conjunto de 3 CDR de cadeia leve incluindo uma CDR Ll, uma CDR L2 e uma CDR L3, como parte de um anticorpo recombinante ou anticorpo peptídico sintético (í.e., um péptido sintético com a sequência de um péptido recombinante do invento).

De acordo com o invento, uma de cada das diferentes CDR Hl, H2 e H3 discutidas de (1) a (11) anteriormente podem ser combinadas com qualquer das outras CDR de cadeia leve de modo a produzir um conjunto de 3 CDR de cadeia leve incluindo uma CDR Hl, uma CDR H2 e uma CDR H3, como parte de um anticorpo recombinante ou anticorpo peptídico sintético (i.e., um péptido sintético com a sequência de um péptido recombinante do invento).

De acordo com o invento, podem combinar-se pares equivalentes das regiões variáveis (e.g., uma região VL e uma região VH) das diferentes moléculas de anticorpo, Fd e cadeias leves anteriormente descritas, com domínios de região constante por ADN recombinante ou outros métodos conhecidos na especialidade para formar anticorpos de comprimento completo do invento. As regiões constantes especialmente preferidas para este objectivo são regiões constantes IgG, que podem não ser alteradas ou podem ser construídas como uma mistura de domínios constantes dos diferentes subtipos de IgG, e.g., IgGl e IgG4. 67 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Subclonaram-se conjuntamente os ADN que codificam pares correspondentes de Fd e cadeia leve descritos imediatamente acima - í.e. (3) e (4), (5) e (7), (6) e (8), e (6) e (9) - no vector APEX-3P essencialmente como descrito seguidamente no exemplo 15 para N19/8. Subclonaram-se as construções de scFv de (1) e (2) em pET Trc S05/NI utilizando técnicas convencionais.

Introduziram-se os plasmideos assim obtidos na estirpe bacteriana ME2 (plasmideos pET) por electroporação convencional ou em células EBNA 293 humanas (plasmideos APEX) por lipofecção utilizando 2-3 microlitros de reagente TRANSFECTAM (Promega, Madison, WI) por micrograma de ADN de acordo com as instruções do fabricante. As estirpes bacterianas MEl e ME2 são derivadas de Escherichia coli estirpe W3110 (designação ATCC 27325) preparadas como se segue.

Preparação dos derivados MEl e ME2 de W3110:

Expressou-se o 5Gl.l-scFv murino, não quimérico e não humanizado "scFv de m5Gl.l" - constituído pela cadeia leve (3) e por Fd (4) - num derivado de E. coli K12 estirpe W3110. Preparou-se este derivado por inactivação de um gene não caracterizado para proporcionar protecção contra infecções por um bacteriófago lítico. A estirpe W3110 de E. coli é uma estirpe particularmente preferida porque se encontra completamente caracterizada e é habitualmente utilizada para fermentações de produção de ADN recombinante.

Cresceu-se uma colónia única de E. coli estirpe W3110 durante a noite em meio L a 30°C. Recolheram-se as células por centrifugação e ressuspenderam-se em MgS04 10 mM. Adicionou-se um total de 0,1 ml da cultura a 2,5 ml de ágar-ágar macio L a 0,7% a 45°C e deitou-se rapidamente numa placa L. Depositaram-se na superfície do ágar-ágar manchas de alíquotas de cinquenta microlitros de um lisado de fago purificado em placa, não diluído, diluído a 10”2 e diluído a 10'4. Os lisados de fago tinham sido anteriormente filtrados através de membranas de 0,45 pm e armazenados em tubos estéreis com uma gota de clorofórmio a 4°C. Deixaram-se secar as manchas na 68 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ superfície do ágar-ágar macio e incubou-se durante a noite a 37°C.

No dia seguinte espalharam-se placas L com 109 pfu de fagos e deixou-se secar. Utilizando um palito de ponta plana estéril, riscaram-se células provenientes de colónias isoladas crescendo nas zonas de lise de fago nas placas de mancha para colónias únicas nas placas com espalhamento de 109 PFU de fagos e incubou-se durante a noite a 37°C. Tornou-se a verificar as colónias únicas relativamente à resistência a fagos por riscagem cruzada após purificação de colónia única. 0 ensaio de riscagem cruzada para sensibilidade de fago foi efectuado como se segue. Espalharam-se cinquenta μΐ de fagos (108 pfu/ml) numa linha vertical no lado esquerdo da placa utilizando uma pipeta de Pasteur. Ensaiaram-se fagos adicionais em posição paralela à primeira e à sua direita. Deixou-se secar a placa e espalharam-se as estirpes a verificar relativamente à sensibilidade ou resistência perpendicularmente e atravessando as linhas de todos os fagos num arrastamento único da esquerda para a direita. As estirpes resistentes crescem na área dos riscos de fago enquanto as estirpes sensíveis lisam.

Ensaiou-se a estirpe mutante resistente a fagos ME1 relativamente à produção de fagos após crescimento durante a noite em meio L e tratamento com o agente de danificação de ADN, mitomicina C. A estirpe não foi capaz de produzir fagos viáveis utilizando um ensaio de placas padrão e E. coli W3110 como uma estirpe indicadora sensível a fagos. Estes resultados sugerem que a estirpe MEl não contém um prófago residente. A estirpe ME2 foi construída por integração específica do local do prófago lambdaDE3 (Studier et al. 1990, Meth. Enzymol. 185:60-89) no cromossoma MEl. A expressão da ARN-polimerase de T7, dirigida pelo prófago, permite expressão de genes alvo clonados em vectores pET (Studier et al.r supra) sob o controlo do promotor T7 no hospedeiro lisado tornado lisogénico. Obteve-se essa capacidade de ser lisogénico numa infecção em três frentes com lambdaDE3, o fago auxiliador de lambda, lambdaBlO e o fago de selecção, lambdaB482 (Studier et al., supra). 69 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

LambdaDE3 (imm21) foi construído por Studier e colaboradores (1990, Meth. Enzymol. 185:60-89) por inserção do gene da ARN-polimerase de T7 antes do promotor lacUV5 de E. coli no local de clonagem BamRl de lambdaD69 (imm21) . Dado que a clonagem no local BamHl de lambdaD69 interrompe o gene integrase, lambdaDE3 não se pode integrar ou excisar-se do cromossoma por si próprio. O fago auxiliador lambdaBlO proporciona a função de integrase que lambdaDE3 não tem mas não pode formar uma fago lisogénico por si próprio. O fago de selecção, lambdaB482, lisa qualquer dos mutantes da gama de hospedeiros de lambdaDE3 que de outro modo estariam entre as células sobreviventes, mas não se pode nem integrar em células susceptíveis nem lisar lambdaDE3 lisogénico dado que tem a mesma região de imunidade que lambdaDE3 .

Protocolo para tornar lisogénico:

Cresceu-se a estirpe MEl em meio L suplementado com maltose a 0,2% e MgSCh 10 mM a 37°C até uma densidade de aproximadamente 108 células/ml. Incubou-se um μΐ de células MEl com 2 x 108 unidades formadoras de placas (pfu) de lambdaDE3 e 108 pfu de lambdaBlO e lambdaB482. Incubou-se a mistura hospedeiro/fago a 37°C durante 20 min para permitir adsorção de fago a células MEl. Espalharam-se várias diluições da suspensão célula/fago em placas L para produzir placas contendo aproximadamente 30-200 candidatos a lisogénicos como colónias isoladas. Inverteram-se as placas e incubaram-se a 37°C durante a noite. Rastrearam-se várias colónias isoladas relativamente a aquisição do prófago lambdaDE3 como seguidamente descrito.

Verificação dos lisogénios lambdaDE3:

Ensaiaram-se candidatos a lisogénicos lambdaDE3 relativamente à sua capacidade para suportar crescimento do fago T7 4107, um mutante de deleção do fago T7 que é completamente deficiente a não ser que se proporcione ARN-polimerase de T7 activa em trans. Apenas os lisogénicos lambdaDE3 suportarão o crescimento normal do fago na presença de IPTG (isopropil-beta-tiogalactopiranósido). O fago T7 produz placas muito grandes em lisogénicos lambdaDE3 na presença de IPTG mas observam-se placas muito pequenas na 70 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ ausência de indutor. Ο tamanho da placa na ausência de IPTG é uma indicação do nível basal de expressão de ARN-polimerase de T7 no lisogénico. Cresceram-se possíveis lisogénicos de lambdaDE3 em meio L suplementado com maltose a 0,2 % e MgSCh 10 mM a 37°C até uma densidade celular de aproximadamente 108 células/ml. Centrifugou-se um total de 0,5 ml de células e ressuspendeu-se o sedimento em 0,2 ml de um lisado de fago T7 contendo 2 x 104 pfu. Deixou-se o fago adsorver durante 30 min a 37°C. Adicionou-se metade da suspensão (0,1 ml) a 3,0 ml de ágar-ágar de topo fundida a 47°C e deitou-se em placas L. Deitou-se a alíquota remanescente de suspensão célula/fago numa placa L suplementada com IPTG 0,4 mM para verificar indução de ARN-polimerase de T7. Inverteram-se as placas e incubaram-se a 37°C durante a noite.

Ensaiaram-se igualmente as estirpes para a presença do lisogénico lambdaDE3 demonstrando que cada estirpe era resistente a infecção pelo fago lambdaB482, que pertence ao mesmo grupo de imunidade (imm21), pelo método de riscagem cruzada anteriormente descrito. Escolheu-se um lisogénico com um nível reduzido de expressão basal para produção de proteína a partir de vectores pET. A estirpe resultante, designada ME2, é resistente a fago e sobre-expressa ARN-polimerase de T7 na presença de IPTG.

Purificação de 5Gl.l-scFv humanizado a partir de E. colí:

Clonou-se a construção de ADNc de 5Gl.l-scFv humanizado (scFv de h5Gl.l) no plasmídeo de expressão bacteriano pET Trc S05/NI (SEQ ID NO:18) e transformou-se para E. coli estirpe MEl. Cresceu-se a estirpe resultante que expressa scFv de h5Gl.l a 37°C num vaso de fermentação de vidro de 2 litros Applikon contendo meio Terrific Broth (bacto-triptona a 1,2% (p/v), extracto de levedura bacto a 2,4% (p/v), glicerol a 0,4% (v/v), KP04 90 mM, pH 7,0) suplementado com ampicilina a 100 pg/ml. Induziu-se a produção de scFv recombinante por adição de IPTG 1 mM quando a D.O.550 da cultura atingiu 10. Após 3 h adicionais de incubação a 37°C, recolheram-se as células por centrifugação e armazenaram-se os sedimentos celulares a -80°C. 71 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Ressuspenderam-se as células em EDTA 1 mM, pH 5,0 a 10 ml por grama de peso e lisaram-se por uma passagem única através de um microfluidificador (modelo M110T, Microfluidics Corp., Newton, MA) . Após centrifugação a 17 500 x g durante 15 min lavou-se o sedimento resultante de corpos de inclusão por ressuspensão em Tris-HCl 20 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, desoxicoleato a 0,15% (p/v) 10 ml por grama de corpos de inclusão utilizando um Tekmar POLYTRON. Sedimentaram-se novamente os corpos de inclusão por centrifugação a 17 500 x g durante 15 min e ressuspenderam-se em Tris-HCl 20 mM, pH 9,0, ureia 8 M a 10 ml por g. Após agitação durante 1 h, centrifugou-se a amostra a 14 000 x g durante 30 min para sedimentar o material insolúvel remanescente.

Diluiu-se o sobrenadante de extracto 10 vezes com Tris-HCl 20 mM pH 9,0, ureia 7 M, sulfato cúprico 50 μΜ e deixou-se com agitação durante pelo menos 16 horas a 4°C para re-dobrar o scFv. Após adição de Biocryl BPA-1000 (TosoHaas,

Montgomeryville, PA) como um agente de floculação a 3 μΐ por ml, centrifugou-se a amostra a 15 000 x g durante 10 minutos para remover materiais insolúveis. Permutou-se a mistura de re-dobramento em Tris 20 mM, pH 9,0, EDTA 1 mM por diafiltração e concentrou-se por ultrafiltração utilizando uma célula com agitação equipada com uma membrana YM10 (Amicon, Beverly, MA).

Separou-se então o scFv adequadamente dobrado do material agregado e proteínas contaminantes por cromatografia de permuta aniónica utilizando Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia, Piscataway, NJ). O scFv ligado eluiu com Tris-HCl 20 mM pH 9,0, EDTA 1 mM contendo um gradiente linear de NaCl (0 a 0,5 M). Combinaram-se as fracções contendo o scFv, concentraram-se por ultrafiltração utilizando uma célula com agitação equipada com uma membrana YM10 e aplicou-se a uma coluna Sephacryl S200 HR 26/100 (Pharmacia) equilibrada em Tris-HCl 20 mM pH 9,0, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM. Combinaram-se as fracções contendo o scFv, permutaram-se para solução salina tamponada de fosfato por diafiltração, concentraram-se por ultrafiltração, filtraram-se através de um filtro de 0,22 pm Millex-GV (Millipore, Bedford, MA) e armazenaram-se a 4°C. 72 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Purificação de scFv de m5Gl.l a partir de E. colí:

Descongelou-se pasta celular bacteriana congelada e ressuspendeu-se em 2,5 ml de EDTA 1 mM (pH 5) por grama de pasta celular. Lisou-se esta suspensão de células por passagem através de um microfluidificador (Microfluidics) com a câmara de interacção em linha e uma pressão de retorno de aproximadamente 18 000 psi. Centrifugou-se então o lisado celular a 10 000 rpm num rotor de centrífuga JA-10 a 4°C durante 15 min. Decantou-se e rejeitou-se o sobrenadante.

Ressuspendeu-se o sedimento em 10 ml de Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, desoxicoleato de sódio a 0,15% por grama de sedimento. Centrifugou-se esta suspensão como anteriormente durante 10 min. Decantou-se e rejeitou-se novamente o sobrenadante. Este sedimento lavado com detergente foi então ressuspenso em 10 ml de ureia 8 M, Tris-HCl 20 mM, pH 9, EDTA 1 mM. Agitou-se a suspensão a 4°C durante lhe diluiu-se então 10 vezes com ureia 7 M, Tris-HCl 20 mM, pH 9 e agitou-se a 4°C. Adicionou-se então CuS04 para uma concentração final de 50 μΜ e continuou-se a agitar durante a noite a 4°C.

Removeu-se então a maioria das proteínas contaminantes (incluindo versões de scFv de m5Gl.l com dobramento incorrecto) por precipitação por diluição (com agitação) da amostra re-dobrada cinco vezes com tampão de modo a que as concentrações finais após diluição fossem ureia a 1,4 M, NaCl 25 mM, edta 1 mM e acetato de sódio 20 mM a 4°C. O pH do tampão de diluição quando preparado a temperatura ambiente foi pH 5,0. Antes da diluição determinou-se o pH do tampão de diluição a 4°C. Após diluição o pH da amostra foi superior a pH 5,5. Ajustou-se então o pH da amostra com HC1 6 N ao pH 5,0 inicial do tampão. A solução tornou-se imediatamente turva e deixou-se em agitação a 4-8°C durante 0,5 a 24 horas.

Removeu-se o precipitado por filtração da amostra através de uma membrana de ultrafiltração com um limite de exclusão de 300 kDa (Millipore Corporation, Bedford, MA) . Recolheu-se a solução que passou pela membrana e concentrou-se 5 vezes utilizando uma membrana de ultrafiltração com um limite de exclusão de 10 kDa (Millipore). A solução concentrada retida 73 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ na membrana foi então diluída 2 vezes com acetato de sódio 20 mM, EDTA 1 mM, pH 5,0 de modo a reduzir a concentração de NaCl para 12,5 mM.

Carregou-se então a solução retida diluída a 4°C numa coluna SP Sepharose FF (Pharmacia) equilibrada com ureia 0,7 M, EDTA 1 mM, NaCl 10 mM, acetato de sódio 20 mM, pH 5,0 a um caudal linear de 5 cm/min. A altura do leito foi igual ou superior a 3,5 cm. Após carga, lavou-se a coluna com 40 volumes de coluna (CV) de tampão de equilíbrio. Lavou-se então a coluna com 20 CV de acetato de sódio 20 mM, pH 5,0, EDTA 1 mM. Eluiu-se então o scFv ligado utilizando citrato de sódio 20 mM, pH 5,8, EDTA 1 mM. Recolheu-se um pico único em aproximadamente 4 volumes de coluna.

Ajustou-se então o eluído de SP Sepharose com Tris-HCl 20 mM por adição de Tris-HCl 1 M, pH 8. Ajustou-se o pH da amostra a 8,0 por adição de NaOH 1 N. Carregou-se esta amostra numa coluna Q Sepharose FF (Pharmacia) equilibrada em Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM à temperatura ambiente a um caudal de 5 cm/min. Recolheu-se a fracção de eluído contendo o scFv.

Ajustou-se então a fracção de eluído da Q Sepharose a NaCl 150 mM e concentrou-se a 10 mg de scFv por ml utilizando uma membrana de ultrafiltração com um limite de exclusão de 10 kDa. Esta amostra concentrada foi então carregada numa coluna Sephacryl S200 equilibrada em solução salina tamponada de fosfato, pH 7,4 e eluída a 0,4 cm/min. Analisaram-se as fracções por SDS-PAGE e coloração com prata. Combinaram-se as fracções de pico após rejeição das fracções dos ombros de início e de final do pico que continham a maioria dos contaminantes. EXEMPLO 12

Análise funcional de scFv de m5Gl.l A titulação do scFv de m5Gl.l em ensaios hemolíticos revelou que scFv de m5Gl.l inibe lise mediada pelo complemento humano de um modo dependente da dose (figura 13). A comparação directa da eficácia do scFv de m5Gl.l relativamente a mAb e Fab de 5G1.1 demonstrou que o scFv de m5Gl.l bloqueou completamente hemólise mediada por C5b-9 em soro humano a 20% 74 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ a 0,15 μΜ enquanto ο mAb e ο Fab de 5G1.1 bloquearam a 0,06-0,08 μΜ. A análise de geração de C5a nestes ensaios revelou resultados semelhantes na medida em que scFv de 5G1.1 bloqueou completamente geração de C5a a 0,15 μΜ enquanto o mAb e o Fab de 5G1.1 bloquearam a 0,06-0,08μΜ (figura 14). Tomadas conjuntamente estas experiências indicaram que ao contrário de N19/8, que perdeu metade da sua eficácia de bloqueio de geração de C5a ao ser alterada racionalmente como um scFv (SEQ ID NO: 19), o scFv de 5G1.1 murino reteve a capacidade de bloquear a geração tanto de C5a como de C5b-9.

Adicionalmente, estes dados demonstram que o scFv de m5Gl.l reteve actividade semelhante à da molécula parental (o mAb 5G1.1 nativo murino) dado que a concentração molar de scFv de 5G1.1 murino necessária para bloquear completamente C5a e C5b-9 (0,15 μΜ) foi da ordem do dobro da necessária para o mAb e o Fab de 5G1.1 (0,06-0,08 μΜ).

De modo a determinar se o scFv de mSGl.l retinha a capacidade de bloquear a activação do complemento no modelo ex vivo de "bypass" cardiopulmonar, adicionaram-se 4,5 mg de scFv de 5G1.1 murino produzido por bactérias e purificado ao circuito CPB e monitorizou-se a activação do complemento. Em experiências de controlo ambos os níveis de C3a e de C5b-9 aumentaram ao longo do decurso temporal da experiência. Numa única experiência, a adição de 4,5 mg do scFv de m5Gl.l ao circuito CPB não teve qualquer efeito na geração de C3a (figura 15). Contrariamente, a actividade hemolitica do complemento assim como a geração de sC5b-9 foi completamente bloqueada nesta experiência (figura 16 e figura 17). EXEMPLO 13

Caracterização do epítopo reconhecido por 5G1.1

Digestão tríptica: Submeteram-se vinte microgramas de C5 humano purificado (Advanced Technologies, San Diego, CA) a digestão enzimática com 1 pg de tripsina tratada com TPCK (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ) . Deixou-se progredir a digestão durante 3 minutos, após o que esta foi parada por adição de 20 pg de inibidor de tripsina de soja (Worthington). A reacção foi então desnaturada e reduzida por adição de tampão de amostra de proteína e ferveu-se 75 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ imediatamente durante 5 min. Fraccionaram-se por tamanho os fragmentos digeridos através de SDS-PAGE num gel a 12%. Efectuou-se então uma electro-transferência do gel em tampão de transferência (metanol a 20% (v/v), Tris-base 25 mM pH 8,0, e glicina 192 mM) para nitrocelulose (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) e submeteu-se a análise de transferência de "Western" ECL utilizando 5G1.1 ou um anticorpo monoclonal especifico de C5a (G25/2, obtido do Dr. Otto Gõtze, Departamento de imunologia, Universidade de Gõttingen, Alemanha).

Incubaram-se os filtros duas vezes durante 30 minutos cada em solução de bloqueio (NaCl 500 mM, Tris 5 mM pH 7,4, leite em pó magro a 10% (v/v) e Tween-20 a 0,2% (v/v)). Mudaram-se então os filtros para solução de bloqueio fresca (20 ml) contendo o anticorpo primário e incubou-se durante 40 minutos numa plataforma com agitação. Enxaguaram-se os filtros rapidamente com solução de lavagem (NaCl 500 mM, Tris 35 mM pH 7,4, SDS a 0,1%, NP40 a 1% e ácido desoxicólico a 0,5%) para retirar restos de leite e seguidamente adicionou-se solução de lavagem fresca e incubou-se durante dois intervalos de 20 minutos num agitador orbital. Enxaguaram-se os filtros rapidamente com 10 a 20 ml de solução de anticorpo secundário (NaCl 500 mM, Tris 5 mM pH 7,4, leite em pó magro a 10% (v/v), Tween-20 a 0,2% (v/v) e NP-40 a 1%) e seguidamente incubou-se com solução de anticorpo secundário fresca contendo uma diluição 1:2000 de anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com HRP durante 20 minutos numa plataforma com agitação. Lavaram-se então os filtros como anteriormente descrito, incubaram-se em reagente ECL (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) durante 1 minuto e seguidamente expuseram-se a ECL Hyperfilm (Amersham).

Hidrólise ácida: Submeteram-se vinte microgramas de C5 humano purificado (Advanced Technologies) a hidrólise em ácido acético IN. Adicionaram-se os 20 pg de C5 humano (1 pg/μΐ) a 20 μΐ de ácido acético 2n e incubou-se durante 10 min a 100°C. Desnaturou-se e reduziu-se a amostra com tampão de amostra de proteína, também a 100°C, durante 5 minutos. Neutralizou-se o ácido por adição gota a gota de uma solução de tris base até a amostra ficar azul. Fraccionaram-se então os produtos de clivagem por tamanhos utilizando SDS-PAGE e submeteu-se a 76 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ transferência de "Western" como anteriormente descrito. Para sequenciação de N-terminal transferiu-se o produto de hidrólise ácida fraccionado em gel para uma membrana PVDF. Obteve-se a sequência N-terminal por excisão da banda de 46 kDa do fragmento de hidrólise ácida de uma membrana de PVDF e submeteu-se a análise de sequência de aminoácidos como discutido anteriormente no exemplo 10.

Desglicosilação: Submeteram-se a desglicosilação com N-glicosidase F (péptido-N-glicosidase F, Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN) fragmentos de C5 hidrolisados com ácido ou tripticos, reduzidos e desnaturados, de acordo com as instruções do fabricante.

Resultados: A hidrólise ácida de C5 humano proporcionou um fragmento com um peso molecular aparente por SDS-PAGE de 46 kDa que reagiu imunologicamente tanto para mAb anti-C5a G25/2 como para mAb anti-cadeia alfa de C5 5G1.1. As transferências de "Western" efectuadas com ambos os anticorpos simultaneamente, assim como a análise de SDS-PAGE com coloração com prata, confirmaram a presença de um único fragmento de 46 kDa que reagiu imunologicamente com ambos os anticorpos. A presença de um único fragmento imunorreactivo contendo locais de ligação para 5G1.1 e para G25/2 sugere fortemente que o epitopo 5G1.1 esteja contido aproximadamente nos primeiros 46 kDa do N-terminal da cadeia alfa de C5.

Tal como discutido anteriormente na descrição do sistema do complemento na secção "Antecedentes de fisiologia e patologia", um composto (e.g., um anticorpo) que se ligue a um local que é local de clivagem de C5a, ou que seja imediatamente adjacente a esse local, teria potencial para actuar como um inibidor do complemento terminal. A actividade de inibição potencial de ligação de anticorpos a este local levou à expectativa que o anticorpo 5G1.1 que liga cadeia alfa de C5 se ligasse a um epitopo no local de clivagem de C5a ou perto deste. A revelação de que 5G1.1 se liga ao fragmento de hidrólise ácida de 46 kDa de C5 veio apoiar esta expectativa. A análise de transferência de "Western" dos produtos de digestão triptica identificou um fragmento proteolitico que migra a aproximadamente 27 kDa e que era imunorreactivo com 77 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ 5G1.1. De igual modo, observou-se um fragmento proteolítico e imunorreactivo que migra a aproximadamente 29 kDa após análise de transferência de "Western" com o mAb anti-C5a G25/2. As experiências em que a transferência foi simultaneamente sondada com 5G1.1 e com G25/2 demonstraram que cada banda era diferente e que a sua mobilidade diferencial aparente não foi uma anomalia do gel. Tal foi surpreendente porque se pensou ser provável que o mAb 5G1.1 se ligasse ao local de clivagem de C5-convertase. Esperava-se assim que o 5G1.1 fosse imunorreactivo com qualquer fragmento de C5 de tamanho superior a 12 kDa que apresentasse imunorreactividade com G25/2. Tal fragmento conteria uma quantidade suficiente da extremidade do terminal amino da cadeia alfa de C5 para se ligar especificamente ao mAb anti-C5a e muito para além disso de modo a abranger uma região incluindo o local de clivagem da C5-convertase e para além deste. A imunorreactividade de G25/2 com o fragmento de 29 kDa indicou que esse fragmento contém a região N-terminal da cadeia alfa de C5 que é clivada para originar C5a. Além disso, por 5G1.1 não ser imunorreactivo com esta banda, não é provável que o epitopo 5G1.1 esteja contido aproximadamente nos primeiros 29 kDa do N-terminal da cadeia alfa de C5 e consequentemente não pode estar localizado perto do local de clivagem de C5-convertase.

Estes dados de mapeamento por digestão tríptica e hidrólise ácida sugeriram que o epitopo 5G1.1 estava contido no interior de uma região que se inicia a cerca de 29 kDa (incluindo modificações pós-tradução) do terminal N da cadeia alfa de C5 e que continua 17 kDa na direcção C-terminal, i.e., finaliza a 46 kDa do terminal N. Tal constitui uma revelação surpreendente tendo em conta o esperado, discutido anteriormente, que o anticorpo se ligaria ao ponto de clivagem de C5a na cadeia alfa de C5 ou numa posição imediatamente adjacente a este, i.e., ao residuo de aminoácido 733 de SEQ ID NO:2 ou numa posição imediatamente adjacente a este.

As modificações pós-tradução podem alterar a mobilidade de proteínas durante electroforese em SDS-PAGE. Tal modificação é a adição de um hidrato de carbono através de glicosilação ligada a N. Tal como discutido anteriormente na secção 78 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ "Antecedentes de fisiologia e patologia" C5 está glicosilado, assim como C5a. C5a está glicosilada num resíduo de asparagina correspondente ao aminoácido número 723 do precursor pró-C5 de comprimento completo de C5 humano (SEQ ID NO:2). A análise de computador da cadeia alfa de C5 humano sugere locais de glicosilação ligada a N potenciais nas posições correspondentes aos aminoácidos números 893, 1097 e 1612 de SEQ ID NO:2. A fim de determinar a contribuição do hidrato de carbono para a mobilidade electroforética tanto dos fragmentos trípticos como dos fragmentos ácidos, efectuou-se desglicosilação enzimática dos fragmentos e seguiu-se por análise de hibridação de "Western". Determinou-se que cada fragmento tríptico perdeu aproximadamente 3 kDa de peso molecular aparente enquanto o fragmento ácido perdeu aproximadamente 6 kDa.

Interpretou-se este resultado como indicando que os fragmentos trípticos foram glicosilados individualmente num único local e que o fragmento ácido de 46 kDa foi glicosilado em dois locais (um dos quais foi o local de glicosilação conhecido em C5a anteriormente referido). A mobilidade diminuída observada após desglicosilação está de acordo com a previsão por computador de um segundo local de glicosilação ligado a N no interior dos primeiros 233 aminoácidos da cadeia alfa de C5. A análise de sequência N-terminal determinou que os primeiros quatro aminoácidos do fragmento de 46 kDa gerados por tratamento com ácido acético 1 N foi Thr Leu Gin Lys. Esta sequência encontra-se apenas uma vez na molécula de precursor pró-C5 de comprimento completo humano, numa posição correspondente aos aminoácidos 660 a 663 de SEQ ID NO:2. Esta sequência de quatro aminoácidos também corresponde à sequência do terminal amino da cadeia alfa de C5 humano e consequentemente ao terminal amino de C5a humano.

De modo a mapear de modo mais exacto o local de ligação de 5G1.1 efectuou-se análise de péptidos sobrepostos. Sintetizou-se a sequência que se previu estar contida no interior da secção de 17 kDa de C5 humano anteriormente descrita (SEQ ID NO:2; aminoácidos 893 a 1019) conjuntamente 79 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ com uma extensão de 43 aminoácidos na direcção do N-terminal e de 30 aminoácidos na direcção do C-terminal (um total de 200 aminoácidos) como uma série de 88 péptidos sobrepostos, por síntese em fase sólida em filtros de polipropileno (Research Genetics Inc., Huntsville, AL).

Adicionaram-se as extensões de 43 e 30 aminoácidos para permitir possíveis incorrecções na previsão da gama desta região de 17 kDa. Tais incorrecções são provavelmente devidas a incerteza sobre a extensão específica de glicosilação de cada uma das várias regiões de C5a, assim como a mobilidade aberrante no gel que é habitualmente observada quando se analisam polipéptidos altamente carregados (tal como o fragmento 5G46k e o fragmento 5G27k) em SDS-PAGE. Tal como discutido anteriormente no sumário do invento, um péptido de 200 aminoácidos correspondente à região abrangida por estes péptidos sobrepostos é aqui referida como o péptido "5G200aa".

Devido à expectativa de que o anticorpo 5G1.1 se ligaria ao local de clivagem de C5a, sintetizou-se um conjunto adicional de 8 péptidos sobrepostos que abrangeram uma secção de 30 aminoácidos que se estende desde o local de clivagem C5a (aminoácidos 725 a 754 de SEQ ID NO:2). Um péptido com a sequência desta secção de 30 aminoácidos é aqui referido como "péptido de local de clivagem". Um péptido de 325aa abrangendo os resíduos de aminoácido 725-1049 de SEQ ID NO:2 (este péptido inclui a região abrangida pelo péptido de local de clivagem e o péptido 5G200aa) é aqui referido como o péptido "5G325aa".

Sondaram-se estes filtros com 5G1.1 como anteriormente descrito para análise de transferência de "Western" ECL e um conjunto de 4 péptidos sobrepostos abrangendo a região correspondente aos resíduos de aminoácido 3-19 do péptido KSSKC (SEQ ID NO:l) apresentaram sinais positivos indicativos de ligação de anticorpo monoclonal, enquanto péptidos correspondentes ao local de clivagem C5a não se ligaram ao anticorpo 5G1.1. 80 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ EXEMPLO 14

Ensaio de ligação C3/C4 C3 e C4 são ambas componentes-chave da C5-convertase clássica e C3 é também uma componente chave da C5-convertase alternativa. Estas C5-convertases são necessárias para a conversão de C5 a C5a e C5b activos. A capacidade de bloquear ligação de C5 a C3 e a C4 é assim uma propriedade pretendida para que um anticorpo seja utilizado no tratamento de doenças mediadas pelo complemento de acordo com o presente invento.

Revestiram-se placas de microtitulação de 96 poços com 50 μΐ/poço de uma solução a 10 pg/ml de C3 ou C4 humanos purificados (Quidel) durante 1 hora a 37°C. Bloquearam-se então as placas com 200 μΐ/poço de TBS contendo BSA a 1% durante 1 hora à temperatura ambiente. Após três lavagens em TBS, BSA a 0,1%, adicionou-se C5 humano purificado (Quidel, 20 pg/ml em TBS, BSA a 1%) às placas na presença (20 pg/ml) ou ausência de Fab de 5G1.1 (derivado de 5G1.1 por digestão convencional com papaina) e deixou-se incubar durante 1 hora a 37°C. Após três lavagens em TBS/BSA a 0,1%, adicionou-se às paredes um anticorpo monoclonal dirigido contra a cadeia beta de C5 (N19/8, 5 pg/ml) para detectar C5 ligado a C3 ou a C4. Após três lavagens finais em TBS/BSA a 0,1%, revelou-se a placa utilizando um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano e o substrato adequado.

Os resultados destes ensaios mostraram que o mAb 5G1.1 inibiu a ligação de C5 humano purificado quer a C3 quer a C4 em pelo menos 60% a 90%. Tal como aqui utilizado e nas reivindicações, uma tal redução de 60% a 90% em ligação a C3 ou C4 constitui uma "redução substancial" na ligação a C3 ou C4. EXEMPLO 15

Construção e análise funcional de Fab quimérico de N19/8

Clonaram-se as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve do hibridoma N19-8 por PCR utilizando o Ig-Prime System (Novagen) como descrito pelo fabricante. Sequenciaram-se clones de várias reacções de PCR independentes para detectar mutações introduzidas durante a amplificação por PCR. Criou-se 81 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ um ADNc quimérico com a região constante de N19-8 VL/capa humano utilizando um plasmideo contendo a região variável de cadeia leve de N19-8 e o plasmideo pHuCK (Hieter et al.r 1980 Cell, 22:197-207) como moldes numa reacção de PCR com sobreposição.

De igual modo, criou-se um ADNc quimérico N19-8 VH/lgGl Fd humano utilizando um plasmideo contendo a região variável de cadeia pesada N19-8 e um plasmideo contendo o gene de igGl humano (obtido de Ilan R. Kirsch, National Câncer Institute, Bethesda, MD) como moldes. Esta construção Fd continha os primeiros nove aminoácidos da região de charneira de igGl, incluindo o resíduo de cisteina que normalmente forma uma ponte dissulfureto com o resíduo de cisteina terminal da cadeia leve capa.

Os ADNc quiméricos resultantes foram clonados separadamente no vector APEX-1 utilizando locais de enzima de restrição flanqueadores apropriados introduzidos durante o procedimento de amplificação por PCR e sequenciaram-se. Sub-clonou-se subsequentemente um fragmento contendo o promotor, o intrão e uma inserção de ADNc de um desses vectores APEX no poliligante do outro para produzir um único vector dirigindo a expressão da cadeia leve e de Fd. A cassete de expressão em tandem deste vector APEX-1 foi subsequentemente subclonada para APEX-3P, que foi transfectado para células EBNA 293 para expressão do Fab quimérico.

Quando ensaiado relativamente à capacidade de bloquear actividade hemolitica do complemento e geração de C5a, ο N19/8 hemolitica mas perdeu 50% da sua capacidade de bloquear a geração de C5a.

REFERÊNCIAS

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Winter e Milstein, 1991, Nature. 349, 293-299.

Wurzner, et al., 1991, Complement Inflammation. 8, 328- 340. TABELA 1

Prevenção/redução de proteinúria por tratamento com anticorpos anti-C5

Antes do tratamento Após o tratamento Proteína na urina (mg/dL) Proteína na urina (mg/dL)

Controlo de PBS

Ratinho A nenhuma 100 Ratinho B Nenhuma 500 Ratinho C Nenhuma 500 Ratinho D1 Vestígios vestígios Ratinho E 100 100

Tratados com anti-C5

Ratinho 1 Nenhuma nenhuma Ratinho 2 Nenhuma 30 Ratinho 3 30 vestígios Ratinho 4 30 30 Ratinho 5 30 30 Ratinho 6 100 30 1 O ratinho D tinha mais de 500 mg/dL de glicose na urina após o tratamento. 85 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE:

Mark J.Evans,

Louis A.Matis,

Eileen Elliott Mueller,

Steven H.Nye,

Scott Rollins,

Russell P.Rother,

Jeremy P.Springhorn,

Stephen P.Squinto,

Thomas C.Thomas,

Yi Wang,

James A.Wilkins,

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: MÉTODO E COMPOSIÇÕES PARA 0 TRATAMENTO

DE GLOMERULONEFRITE E OUTRAS DOENÇAS INFLAMATÓRIAS (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 19 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Maurice M. Klee (B) RUA: 1951 Burr Street (C) CIDADE: Fairfield (D) ESTADO: Connecticut

(E) PAÍS: EUA (F) ZIP: 06430 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: armazenagem de 3,5 polegadas, 1,4Mb (B) COMPUTADOR: Macintosh Cetris 610 (C) SISTEMA OPERATIVO: System 7 (D) SOFTWARE: WordPerfect 3.0 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DE PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DE PEDIDO: US 08/236,208 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 02-MAIO-1994 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Maurice M. Klee (B) NÚMERO DE REGISTO: 30,399 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: ALX-138 (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (203) 255-1400 (B) TELEFAX: (203) 254-1101 86 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (Β) TIPO: Aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear

(A) DESCRIÇÃO: péptido KSSKC (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l:

Vai Ile Asp His Gin Gly Thr Lys Ser Ser 5 10

Lys Cys Vai Arg Gin Lys Vai Glu Gly Ser Ser 15 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1658 Aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear (A) DESCRIÇÃO: Polipéptido Pro-C5 (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (x) INFORMAÇÃO SOBRE PUBLICAÇÕES: (A) AUTORES: D.L.Haviland, J.C.Haviland, D.T.Fleischer, A.Hunt, R.A.Wetsel, (B) TÍTULO: Complete cDNA Sequence of Human Complement Pro- C5 (C) JORNAL: Journal of Immunology (D) VOLUME: 146 (F) PÁGINAS: 362-368 (G) DATA: 1991 87 87 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Met Gly Leu Leu Gly Ile Leu Cys Phe Leu -15 -10

Ile Phe Leu Gly Lys Thr Trp Gly Gin Glu Gin Thr Tyr Vai -5 -1 5

Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg Vai Gly Ala Ser Glu Asn 10 15 20

Ile Vai Ile Gin Vai Tyr Gly Tyr Thr Glu Ala Phe Asp Ala 25 30

Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe Ser Tyr 88 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ 35 40

Ser Ser Gly His Vai His Leu 50 55

Asn Ser Ala lie Leu Thr Ile 65

Gly Gin Asn Pro Vai Ser Tyr 80

Lys His Phe Ser Lys Ser Lys 95 45

Ser Ser Glu Asn Lys Phe Gin 60

Gin Pro Lys Gin Leu Pro Gly 70 75

Vai Tyr Leu Glu Vai Vai Ser 85 90

Arg Met Pro Ile Thr Tyr Asp 100

Asn Gly Phe Leu Phe Ile His Thr Asp Lys Pro Vai Tyr Thr 105 110 115

Pro Asp Gin Ser Vai Lys Vai Arg Vai Tyr Ser Leu Asn Asp 120 125 130

Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Vai Leu Thr Phe Ile 135 140 145

Asp Pro Glu Gly Ser Glu Vai Asp Met Vai Glu Glu Ile Asp 150 155 160

His Ile Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser 165 170

Asn Pro Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Lys Ala Lys Tyr Lys 175 180 185

Glu Asp Phe Ser Thr Thr Gly Thr Ala Tyr Phe Glu Vai Lys 190 195 200

Glu Tyr Vai Leu Pro His Phe Ser Vai Ser Ile Glu Pro Glu 210 215 205 89 89 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Tyr Asn Phe Ile Gly Tyr Lys Asn Phe Lys Asn Phe Glu Ile 220 225 230

Thr Ile Lys Ala Arg Tyr Phe Tyr Asn Lys Vai Vai Thr Glu 235 240

Ala Asp Vai Tyr Ile Thr Phe Gly Ile Arg Glu Asp Leu Lys 245 250 255

Asp Asp Gin Lys Glu Met Met Gin Thr Ala Met Gin Asn Thr 260 265 270

Met Leu Ile Asn Gly Ile Ala Gin Vai Thr Phe Asp Ser Glu 275 280 285

Thr Ala Vai Lys Glu Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Glu Asp Leu 290 295 300

Asn Asn Lys Tyr Leu Tyr Ile Ala Vai Thr Vai Ile Glu Ser 305 310

Thr Gly Gly Phe Ser Glu Glu Ala Glu Ile Pro Gly Ile Lys 315 320 325

Tyr Vai Leu Ser Pro Tyr Lys Leu Asn Leu Vai Ala Thr Pro 330 335 340

Leu Phe Leu Lys Pro Gly Ile Pro Tyr Pro Ile Lys Vai Gin 345 350 355

Vai Lys Asp Ser Leu Asp Gin Leu Vai Gly Gly Vai Pro Vai 360 365 370

Ile Leu Asn Ala Gin Thr Ile Asp Vai Asn Gin Glu Thr Ser 375 380

Asp Leu Asp Pro Ser Lys Ser Vai Thr Arg Vai Asp Asp Gly 385 390 395 90 90 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Vai Ala Ser Phe Vai Leu Asn Leu Pro Ser Gly Vai Thr Vai 400 405 410

Leu Glu Phe Asn Vai Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Glu 415 420 425

Glu Asn Gin Ala Arg Glu Gly Tyr Arg Ala Ile Ala Tyr Ser 430 435 440

Ser Leu Ser Gin Ser Tyr Leu Tyr Ile Asp Trp Thr Asp Asn 445 450

His Lys Ala Leu Leu Vai Gly Glu His Leu Asn Ile Ile Vai 455 460 465

Thr Pro Lys Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile Thr His Tyr Asn 470 475 480

Tyr Leu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Ile Ile His Phe Gly Thr 485 490 495

Arg Glu Lys Phe Ser Asp Ala Ser Tyr Gin Ser Ile Asn Ile 500 505 510

Pro Vai Thr Gin Asn Met Vai Pro Ser Ser Arg Leu Leu Vai 515 520

Tyr Tyr Ile Vai Thr Gly Glu Gin Thr Ala Glu Leu Vai Ser 525 530 535

Asp Ser Vai Trp Leu Asn Ile Glu Glu Lys Cys Gly Asn Gin 540 545 550

Leu Gin Vai His Leu Ser Pro Asp Ala Asp Ala Tyr Ser Pro 555 560 565 91 91 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Gly Gin Thr Vai Ser Leu Asn Met Ala Thr Gly Met Asp Ser 570 575 580

Trp Vai Ala Leu Ala Ala Vai Asp Ser Ala Vai Tyr Gly Vai 585 590

Gin Arg Gly Ala Lys Lys Pro Leu Glu Arg Vai Phe Gin Phe 595 600 605

Leu Glu Lys Ser Asp Leu Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Leu 610 615 620

Asn Asn Ala Asn Vai Phe His Leu Ala Gly Leu Thr Phe Leu 625 630 635

Thr Asn Ala Asn Ala Asp Asp Ser Gin Glu Asn Asp Glu Pro 640 645 650

Cys Lys Glu Ile Leu Arg Pro Arg Arg Thr Leu Gin Lys Lys 655 660

Ile Glu Glu Ile Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser Vai Vai Lys 665 670 675

Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Vai Asn Asn Asp Glu Thr 680 685 690

Cys Glu Gin Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys 695 700 705

Ile Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Vai Vai Ala Ser Gin Leu 710 715 720

Arg Ala Asn Ile Ser His Lys Asp Met Gin Leu Gly Arg Leu 725 730

His Met Lys Thr Leu Leu Pro Vai Ser Lys Pro Glu Ile Arg 735 740 745 92 92 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Ser Tyr Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Glu Vai His Leu Vai 750 755 760

Pro Arg Arg Lys Gin Leu Gin Phe Ala Leu Pro Asp Ser Leu 765 770 775

Thr Thr Trp Glu Ile Gin Gly Ile Gly Ile Ser Asn Thr Gly 780 785 790

Ile Cys Vai Ala Asp Thr Vai Lys Ala Lys Vai Phe Lys Asp 795 800

Vai Phe Leu Glu Met Asn Ile Pro Tyr Ser Vai Vai Arg Gly 805 810 815

Glu Gin Ile Gin Leu Lys Gly Thr Vai Tyr Asn Tyr Arg Thr 820 825 830

Ser Gly Met Gin Phe Cys Vai Lys Met Ser Ala Vai Glu Gly 835_ 840 845

Ile Cys Thr Ser Glu Ser Pro Vai Ile Asp His Gin Gly Thr 850 855 860

Lys Ser Ser Lys Cys Vai Arg Gin Lys Vai Glu Gly Ser Ser 865 870

Ser His Leu Vai Thr Phe Thr Vai Leu Pro Leu Glu Ile Gly 875 880 885

Leu His Asn Ile Asn Phe Ser Leu Glu Thr Trp Phe Gly Lys 890 895 900

Glu Ile Leu Vai Lys Thr Leu Arg Vai Vai Pro Glu Gly Vai 905 910 915 93 93 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Vai Thr Leu Asp Pro Arg Gly 920 925 930

Ile Tyr Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe Pro Tyr Arg 935 940

Ile Pro Leu Asp Leu Vai Pro Lys Thr Glu Ile Lys Arg Ile 945 950 955

Leu Ser Vai Lys Gly Leu Leu Vai Gly Glu Ile Leu Ser Ala 960 965 970

Vai Leu Ser Gin Glu Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro 975 980 985

Lys Gly Ser Ala Glu Ala Glu Leu Met Ser Vai Vai Pro Vai 990 995 1000

Phe Tyr Vai Phe His Tyr Leu Glu Thr Gly Asn His Trp Asn 1005 1010

Ile Phe His Ser Asp Pro Leu Ile Glu Lys Gin Lys Leu Lys 1015 1020 1025

Lys Lys Leu Lys Glu Gly Met Leu Ser Ile Met Ser Tyr Arg 1030 1035 1040

Asn Ala Asp Tyr Ser Tyr Ser Vai Trp Lys Gly Gly Ser Ala 1045 1050 1055

Ser Thr Trp Leu Thr Ala Phe Ala Leu Arg Vai Leu Gly Gin 1060 1065 1070

Vai Asn Lys Tyr Vai Glu Gin Asn Gin Asn Ser Ile Cys Asn 1075 1080

Ser Leu Leu Trp Leu Vai Glu Asn Tyr Gin Leu Asp Asn Gly 1085 1090 1095 94 94 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Ser Phe Lys Glu Asn Ser Gin Tyr Gin Pro Ile Lys Leu Gin 1100 1105 1110

Gly Thr Leu Pro Vai Glu Ala Arg Glu Asn Ser Leu Tyr Leu 1115 1120 1125

Thr Ala Phe Thr Vai Ile Gly Ile Arg Lys Ala Phe Asp Ile 1130 1135 1140

Cys Pro Leu Vai Lys Ile Asp Thr Ala Leu Ile Lys Ala Asp 1145 1150

Asn Phe Leu Leu Glu Asn Thr Leu Pro Ala Gin Ser Thr Phe 1155 1160 1165

Thr Leu Ala Ile Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Asp Lys 1170 1175 1180

Thr His Pro Gin Phe Arg Ser Ile Vai Ser Ala Leu Lys Arg 1185 1190 1195

Glu Ala Leu Vai Lys Gly Asn Pro Pro Ile Tyr Arg Phe Trp 1200 1205 1210

Lys Asp Asn Leu Gin His Lys Asp Ser Ser Vai Pro Asn Thr 1215 1220

Gly Thr Ala Arg Met Vai Glu Thr Thr Ala Tyr Ala Leu Leu 1225 1230 1235

Thr Ser Leu Asn Leu Lys Asp Ile Asn Tyr Vai Asn Pro Vai 1240 1245 1250

Ile Lys Trp Leu Ser Glu Glu Gin Arg Tyr Gly Gly Gly Phe 1255 1260 1265 95 95 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Tyr Ser Thr Gin Asp Thr Ile Asn Ala Ile Glu Gly Leu Thr 1270 1275 1280

Glu Tyr Ser Leu Leu Vai Lys Gin Leu Arg Leu Ser Met Asp 1285 1290

Ile Asp Vai Ser Tyr Lys His Lys Gly Ala Leu His Asn Tyr 1295 1300 1305

Lys Met Thr Asp Lys Asn Phe Leu Gly Arg Pro Vai Glu Vai 1310 1315 1320

Leu Leu Asn Asp Asp Leu Ile Vai Ser Thr Gly Phe Gly Ser 1325 1330 1335

Gly Leu Ala Thr Vai His Vai Thr Thr Vai Vai His Lys Thr 1340 1345 1350

Ser Thr Ser Glu Glu Vai Cys Ser Phe Tyr Leu Lys Ile Asp 1355 1360

Thr Gin Asp Ile Glu Ala Ser His Tyr Arg Gly Tyr Gly Asn 1365 1370 1375

Ser Asp Tyr Lys Arg Ile Vai Ala Cys Ala Ser Tyr Lys Pro 1380 1385 1390

Ser Arg Glu Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ser His Ala Vai Met 1395 1400 1405

Asp Ile Ser Leu Pro Thr Gly Ile Ser Ala Asn Glu Glu Asp 1410 1415 1420

Leu Lys Ala Leu Vai Glu Gly Vai Asp Gin Leu Phe Thr Asp 1425 1430

Tyr Gin Ile Lys Asp Gly His Vai Ile Leu Gin Leu Asn Ser 1435 1440 1445 96 96 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Ile Pro Ser Ser Asp Phe Leu Cys Vai Arg Phe Arg Ile Phe 1450 1455 1460

Glu Leu Phe Glu Vai Gly Phe Leu Ser Pro Ala Thr Phe Thr 1465 1470 1475

Vai Tyr Glu Tyr His Arg Pro Asp Lys Gin Cys Thr Met Phe 1480 1485 1490

Tyr Ser Thr Ser Asn Ile Lys Ile Gin Lys Vai Cys Glu Gly 1495 1500

Ala Ala Cys Lys Cys Vai Glu Ala Asp Cys Gly Gin Met Gin 1505 1510 1515

Glu Glu Leu Asp Leu Thr Ile Ser Ala Glu Thr Arg Lys Gin 1520 1525 1530

Thr Ala Cys Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Ala Tyr Lys Vai Ser 1535 1540 1545

Ile Thr Ser Ile Thr Vai Glu Asn Vai Phe Vai Lys Tyr Lys 1550 1555 1560

Ala Thr Leu Leu Asp Ile Tyr Lys Thr Gly Glu Ala Vai Ala 1565 1570 (

Glu Lys Asp Ser Glu Ile Thr Phe Ile Lys Lys Vai Thr Cys 1575 1580 1585

Thr Asn Ala Glu Leu Vai Lys Gly Arg Gin Tyr Leu Ile Met 1590 1595 1600

Gly Lys Glu Ala Leu Gin Ile Lys Tyr Asn Phe Ser Phe Arg 1605 1610 1615 97 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

Tyr Ile Tyr Pro Leu Asp Ser Leu Thr Trp Ile Glu Tyr Trp 1620 1625 1630

Pro Arg Asp Thr Thr Cys Ser Ser Cys Gin Ala Phe Leu Ala 1640 1635

Asn Leu Asp Glu Phe Ala Glu Asp Ile Phe Leu Asn Gly Cys 1645 1650 1655 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4059 pares de bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Dupla (D) TOPOLOGIA: Circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO:

Apex-1 Eucariota Vector de Expressão (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3:

ACGCGTTGAC ATTGATTATT GACTAGTTAT GTCATTAGTT CATAGCCCAT ATATGGAGTT TAAATGGCCC CGCCTGGCTG ACCGCCCAAC AATAATGACG TATGTTCCCA TAGTAACGCC GTCAATGGGT GGACTATTTA CGGTAAACTG GTGTATCATA TGCCAAGTAC GCCCCCTATT GCCCGCCTGG CATTATGCCC AGTACATGAC GGCAGTACAT CTACGTATTA GTCATCGCTA TAATAGTAAT CAATTACGGG 50 CCGCGTTACA TAACTTACGG 100 GACCCCCGCC CATTGACGTC 150 AATAGGGACT TTCCATTGAC 200 CCCACTTGGC AGTACATCAA 250 GACGTCAATG ACGGTAAATG 300 CTTATGGGAC TTTCCTACTT 350 TTACCATGGT GATGCGGTTT 400

TGGCAGTACA TCAATGGGCG AAGTCTCCAC CCCATTGACG AACGGGACTT TCCAAAATGT GGCGGTAGGC GTGTACGGTG GAACCGTCAG AATTCTGTTG TCTTTCCAGT ACTCTTGGAT· CGCCACCGAG GGACCTGAGC TCGACTGTTG GGGTGAGTAC CTAAGATTGT CAGTTTCCAA CGCGGTGATG CCTTTGAGGG TCTTTTTGTT GTCAAGCTTG ACTTGAGTGA CAATGACATC TCCCAGGTCC AACTGCAGGT TAGTAACGGC CGCCAGTGTG CGGCCGCTCG AGCATGCATC TACAAATAAA GCAATAGCAT ACTGCATTCT AGTTGTGGTT TCTGGATCGA TCCCGCCATG GGACCTCTTC GTTGTGTAGG

TGGATAGCGG TTTGACTCAC TCAATGGGAG TTTGTTTTGG CGTAACAACT CCGCCCCATT GGAGGTCTAT ATAAGCAGAG GGCTCGCGGT TGATTACAAA CGGAAACCCG TCGGCCTCCG GAGTCCGCAT CGACCGGATC TCCCTCTCAA AAGCGGGCAT AAACGAGGAG GATTTGATAT TGGCCGCGTC CATCTGGTCA AGGTGTGGCA GGCTTGAGAT CACTTTGCCT TTCTCTCCAC CGACCGGCTT GGTACCGAGC CTGGAATTCT GCAGATATCC TAGAACTTGT TTATTGCAGC CACAAATTTC ACAAATAAAG TGTCCAAACT CATCAATGTA GTATCAACGC CATATTTCTA TACCGCTGTA TTCCTAGGGA GGGGATTTCC 450 CACCAAAATC 500 GACGCAAATG 550 CTCGTTTAGT 600 CTCTTCGCGG 650 AACGGTACTC 700 GGAAAACCTC 750 GACTTCTGCG 800 TCACCTGGCC 850 GAAAAGACAA 900 CTGGCCATAC 950 AGGTGTCCAC 1000 TCGGATCCAC 1050 ATCACACTGG 1100 TTATAATGGT 1150 CATTTTTTTC 1200 TCTTATCATG 1250 TTTACAGTAG 1300 AATAGTAGAG 1350 99 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ GCACCTTGAA CTGTCTGCAT CAGCCATATA GCCCCCGCTG TTCGACTTAC 1400 AAACACAGGC ACAGTACTGA CAAACCCATA CACCTCCTCT GAAATACCCA 1450 TAGTTGCTAG GGCTGTCTCC GAACTCATTA CACCCTCCAA AGTCAGAGCT 1500 GTAATTTCGC CATCAAGGGC AGCGAGGGCT TCTCCAGATA AAATAGCTTC 1550 TGCCGAGAGT CCCGTAAGGG TAGACACTTC AGCTAATCCC TCGATGAGGT 1600 CTACTAGAAT AGTCAGTGCG GCTCCCATTT TGAAAATTCA CTTACTTGAT 1650 CAGCTTCAGA AGATGGCGGA GGGCCTCCAA CACAGTAATT TTCCTCCCGA 1700 CTCTTAAAAT AGAAAATGTC AAGTCAGTTA AGCAGGAAGT GGACTAACTG 1750 ACGCAGCTGG CCGTGCGACA TCCTCTTTTA ATTAGTTGCT AGGCAACGCC 1800 CTCCAGAGGG CGTGTGGTTT TGCAAGAGGA AGCAAAAGCC TCTCCACCCA 1850 GGCCTAGAAT GTTTCCACCC AATCATTACT ATGACAACAG CTGTTTTTTT 1900 TAGTATTAAG CAGAGGCCGG GGACCCCTGG GCCCGCTTAC TCTGGAGAAA 1950 AAGAAGAGAG GCATTGTAGA GGCTTCCAGA GGCAACTTGT CAAAACAGGA 2000 CTGCTTCTAT TTCTGTCACA CTGTCTGGCC CTGTCACAAG GTCCAGCACC 2050 TCCATACCCC CTTTAATAAG CAGTTTGGGA ACGGGTGCGG GTCTTACTCC 2100 GCCCATCCCG CCCCTAACTC CGCCCAGTTC CGCCCATTCT CCGCCCCATG 2150 GCTGACTAAT ΤΤΤΤΤΤΤΑΤΤ TATGCAGAGG CCGAGGCCGC CTCGGCCTCT 2200 GAGCTATTCC AGAAGTAGTG AGGAGGCTTT TTTGGAGGCC TAGGCTTTTG 2250 CAAAAAGGAG CTCCCAGCAA AAGGCCAGGA ACCGTAAAAA GGCCGCGTTG 2300 100 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ CTGGCGTTTT TCCATAGGCT CCGCCCCCCT GACGAGCATC ACAAAAATCG 2350 ACGCTCAAGT CAGAGGTGGC GAAACCCGAC AGGACTATAA AGATACCAGG 2400 CGTTTCCCCC TGGAAGCTCC CTCGTGCGCT CTCCTGTTCC GACCCTGCCG 2450 CTTACCGGAT ACCTGTCCGC CTTTCTCCCT TCGGGAAGCG TGGCGCTTTC 2500 TCAATGCTCA CGCTGTAGGT ATCTCAGTTC GGTGTAGGTC GTTCGCTCCA 2550 AGCTGGGCTG TGTGCACGAA CCCCCCGTTC AGCCCGACCG CTGCGCCTTA 2600 TCCGGTAACT ATCGTCTTGA GTCCAACCCG GTAAGACACG ACTTATCGCC 2650 ACTGGCAGCA GCCACTGGTA ACAGGATTAG CAGAGCGAGG TATGTAGGCG 2700 GTGCTACAGA GTTCTTGAAG TGGTGGCCTA ACTACGGCTA CACTAGAAGG 2750 ACAGTATTTG GTATCTGCGC TCTGCTGAAG CCAGTTACCT TCGGAAAAAG 2800 AGTTGGTAGC TCTTGATCCG GCAAACAAAC CACCGCTGGT AGCGGTGGTT 2850 TTTTTGTTTG CAAGCAGCAG ATTACGCGCA GAAAAAAAGG ATCTCAAGAA 2900 GATCCTTTGA TCTTTTCTAC GGGGTCTGAC GCTCAGTGGA ACGAAAACTC 2950 ACGTTAAGGG ATTTTGGTCA TGAGATTATC AAAAAGGATC TTCACCTAGA 3000 TCCTTTTAAA TTAAAAATGA AGTTTTAAAT CAATCTAAAG TATATATGAG 3050 TAAACTTGGT CTGACAGTTA CCAATGCTTA ATCAGTGAGG CACCTATCTC 3100 AGCGATCTGT CTATTTCGTT CATCCATAGT TGCCTGACTC CCCGTCGTGT 3150 AGATAACTAC GATACGGGAG GGCTTACCAT CTGGCCCCAG TGCTGCAATG 3200 ATACCGCGAG ACCCACGCTC ACCGGCTCCA GATTTATCAG CAATAAACCA 3250 101 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

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Apex-3P Eucariota Vector de Expressão 3300 3350 3400 "5 Λ C Λ JW 3500 3550 3600 3650 3700 3750 3800 3850 3900 3950 4000 4050 4059 102 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4: GTGACCAATA CAAAACAAAA GCGCCCCTCG TACCAGCGAA GAAGGGGCAG 50 AGATGCCGTA GTCAGGTTTA GTTCGTCCGG CGGCGGGGGA TCTGTATGGT 100 GCACTCTCAG TACAATCTGC TCTGATGCCG CATAGTTAAG CCAGTATCTG 150 CTCCCTGCTT GTGTGTTGGA GGTCGCTGAG TAGTGCGCGA GCAAAATTTA 200 AGCTACAACA AGGCAAGGCT TGACCGACAA TTGCATGAAG AATCTGCTTA 250 GGGTTAGGCG TTTTGCGCTG CTTCGCGATG TACGGGCCAG ATATACGCGT 300 TGACATTGAT TATTGACTAG TTATTAATAG TAATCAATTA CGGGGTCATT 350 AGTTCATAGC CCATATATGG AGTTCCGCGT TACATAACTT ACGGTAAATG 400 GCCCGCCTGG CTGACCGCCC AACGACCCCC GCCCATTGAC GTCAATAATG 450 ACGTATGTTC CCATAGTAAC GCCAATAGGG ACTTTCCATT GACGTCAATG 500 GGTGGACTAT TTACGGTAAA CTGCCCACTT GGCAGTACAT CAAGTGTATC 550 ATATGCCAAG TACGCCCCCT ATTGACGTCA ATGACGGTAA ATGGCCCGCC 600 TGGCATTATG CCCAGTACAT gaccttatgg GACTTTCCTA CTTGGCAGTA 650 103 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ CATCTACGTA TTAGTCATCG 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SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5: CGCCTGCAGG ACATCCAGAT GACTCAGTCT 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Iniciador oligonucleotídico UDEC395 (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Sim (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6: CCCAAGCTTA CTGGATGGTG GGAAGATGGA 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 747 pares de bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Dupla (D) TOPOLOGIA: linear 112 112 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: 5G1.1M1 scFv (murino) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7: ATG GCC GAC ATC CAG ATG ACT CAG TCT CCA 30 Met Ala Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro 1 5 10 GCT TCA CTG TCT GCA TCT GTG GGA GAA ACT 60 Ala Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Glu Thr 15 20 GTC ACC ATC ACA TGT GGA GCA AGT GAG AAT 90 Vai Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn 25 30 ATT TAC GGT GCT TTA AAT TGG TAT CAG CGG 120 Ile Tyr Gly Ala Leu Asn Trp Tyr Gin Arg 35 40 113 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ ΑΑΑ CAG GGA AAA TCT CCT CAG CTC CTG ATC 150 Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Ile 45 50 TAT GGT GCA ACC AAC TTG GCA GAT GGC ATG 180 Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met 55 60 TCA TCG AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGT 210 Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 65 70 AGA CAG TAT TAT CTC AAG ATC AGT AGC CTG 240 Arg Gin Tyr Tyr Leu Lys Ile Ser Ser Leu 75 80 CAT CCT GAC GAT GTT GCA ACG TAT TAC TGT 270 His Pr o Asp Asp Vai Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 CAA AAT GTG TTA AAT ACT CCT CTC ACG TTC 300 Gin Asn ValT Leu Asn Thr Pro Leu Thr Phe 95 100 GGT GCT GGG ACC AAG TTG GAG CTG AAA CGG 330 Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 105 110 ACC GGA GGT GGC GGG TCG GGT GGC GGG GGA 360 Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 TCG GGT GGC GGA GGG TCG CAG GTT CAG CTG 390 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin Vai Gin Leu 125 130 114 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ CAG CAG TCT GGA GCC GAG CTG ATG AAG CCT 420 Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro 135 140 GGG GCC TCA GTG AAG ATG TCC TGC AAG GCT 450 Gly Ala Ser Vai Lys Met Ser Cys Lys Ala 145 150 ACT GGC TAC ATA TTC AGT AAC TAC TGG ATA 480 Thr Gly Tyr Ile Phe Ser Asn Tyr Trp Ile 155 160 CAG TGG ATA AAG CAG AGG CCT GGA CAT GGC 510 Gin Trp Ile Lys Gin Arg Pro Gly His Gly 165 170 CTT GAG TGG ATT GGT GAG ATT TTA CCT GGA 540 Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly 175 180 AGT GGT TCT ACT GAG TAC ACT GAG AAC TTC 570 Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Thr Glu Asn Phe 185 190 AAG GAC AAG GCC GCA TTC ACT GCA GAT ACA 600 Lys Asp Lys Ala Ala Phe Thr Ala Asp Thr 195 200 TCC TCC AAC ACA GCC TAC ATG CAA CTC AGC 630 Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser 205 210 AGC CTG ACA TCA GAG GAC TCT GCC GTC TAT 660 Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr 215 220 115 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ TAC TGT GCA AGA TAT TTC TTC GGT AGT AGC 690 Tyr Cys Ala Arg Tyr Phe Phe Gly Ser Ser 225 230 CCC AAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA 720 Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Ala 235 240 GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA TGA 747 Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 245 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 747 pares de bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: 5G1.1 scFv CB (humanizado) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8: ATG GCC GAT ATC CAG ATG ACC CAG TCC CCG 30 Met Ala Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro 1 5 10 TCC TCC CTG TCC GCC TCT GTG GGC GAT AGG 60 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg 15 20 GTC ACC ATC ACC TGC GGC GCC AGC GAA AAC 90 Vai Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn 25 30 116 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ ATC TAT GGC GCG CTG AAC TGG TAT CAA CGT 120 Ile Tyr Gly Ala Leu Asn Trp Tyr Gin Arg 35 40 AAA CCT GGG AAA GCT CCG AAG CTT CTG ATT 150 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 45 50 TAC GGT GCG ACG AAC CTG GCA GAT GGA GTC 180 Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Vai 55 60 CCT TCT CGC TTC TCT GGA TCC GGC TCC GGA 210 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 65 70 ACG GAT TTC ACT CTG ACC ATC AGC AGT CTG 240 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 75 80 CAG CCT GAA GAC TTC GCT ACG TAT TAC TGT 270 Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys ' 85 90 CAG AAC GTT TTA AAT ACT CCG TTG ACT TTC 300 Gin Asn Vai Leu Asn Thr Pro Leu Thr Phe 95 100 GGA CAG GGT ACC AAG GTG GAA ATA AAA CGT 330 Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 105 110 ACT GGC GGT GGT GGT TCT GGT GGC GGT GGA 360 Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 117 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ TCT GGT GGT GGC GGT TCT CAA GTC CAA CTG 390 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin Vai Gin Leu 125 130 GTG CAA TCC GGC GCC GAG GTC AAG AAG CCA 420 Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro 135 140 GGG GCC TCA GTC AAA GTG TCC TGT AAA GCT 450 Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala 145 150 AGC GGC TAT ATT TTT TCT AAT TAT TGG ATT 480 Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Asn Tyr Trp Ile 155 160 CAA TGG GTG CGT CAG GCC CCC GGG CAG GGC 510 Gin Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly 165 170 CTG GAA TGG ATG GGT GAG ATC TTA CCG GGC 540 Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Leu Pro Gly 175 180 TCT GGT AGC ACC GAA TAT ACC GAA AAT TTT 570 Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Thr Glu Asn Phe 185 190 AAA GAC CGT GTT ACT ATG ACG CGT GAC ACT 600 Lys Asp Arg Vai Thr Met Thr Arg Asp Thr 195 200 TCG ACT AGT ACA GTA TAC ATG GAG CTC TCC 630 Ser Thr Ser Thr Vai Tyr Met Glu Leu Ser 205 210 118 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ AGC CTG CGA TCG GAG GAC ACG GCC GTC TAT 660 Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 215 220 TAT TGC GCG CGT TAT TTT TTT GGT TCT AGC 690 Tyr Cys Ala Arg Tyr Phe Phe Gly Ser Ser 225 230 CCG AAT TGG TAT TTT GAT GTT TGG GGT CAA 720 Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Gin 235 240 GGA ACC CTG GTC ACT GTC TCG AGC TGA 747 Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 245 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 726 pares de bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: 5G1.1M1 VL HuK (cadeia leve quimérica) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9: ATG GGA ATC CAA GGA GGG TCT GTC CTG TTC 30 Met Gly Ile Gin Gly Gly Ser Vai Leu Phe -25 -20 GGG CTG CTG CTC GTC CTG GCT GTC TTC TGC 60 Gly Leu Leu Leu Vai Leu Ala Vai Phe Cys -15 -10 119 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ CAT TCA GGT CAT AGC CTG CAG GAC ATC CAG 90 Ηίε Ser Gly His Ser Leu Gin Asp Ile Gin -5 1 5 ATG ACT CAG TCT CCA GCT TCA CTG TCT GCA 120 Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala 10 15 TCT GTG GGA GAA ACT GTC ACC ATC ACA TGT 150 Ser Vai Gly Glu Thr Vai Thr Ile Thr Cys 20 25 GGA GCA AGT GAG AAT ATT TAC GGT GCT TTA 180 Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala Leu 30 35 AAT TGG TAT CAG CGG AAA CAG GGA AAA TCT 210 Asn Trp Tyr Gin Arg Lys Gin Gly Lys Ser 40 45 CCT CAG CTC CTG ATC TAT GGT GCA ACC AAC 240 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Thr Asn 50 55 TTG GCA GAT GGC ATG TCA TCG AGG TTC AGT 270 Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser 60 65 GGC AGT GGA TCT GGT AGA CAG TAT TAT CTC 300 Gly Ser Gly Ser Gly Arg Gin Tyr Tyr Leu 70 75 AAG ATC AGT AGC CTG CAT CCT GAC GAT GTT 330 Lys Ile Ser Ser Leu His Pro Asp Asp Vai 80 85 120 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ GCA ACG TAT TAC TGT CAA AAT GTG TTA AAT 360 Αΐ a Thr Tyr Tyr Cys Gin Asn Vai Leu Asn 90 95 ACT CCT CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG 390 Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 100 105 TTG GAG CTG AAA CGA ACT GTG GCT GCA CCA 420 Leu Glu Leu Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro 110 115 TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG 450 Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 120 125 CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG 4S0 Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai 130 135 TGC CTG CTG-AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG 510 Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 140 145 GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC 540 Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala 150 155 CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC 570 Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai 160 165 ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC 600 Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 170 175 121 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA 630 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 180 185 GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC 660 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 190 195 TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG 690 Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 200 205 ccc GtC AUA AAb AGC ttC AAC AGG UUÀ GaG izi) Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 210 215 TGT TAG 726

Cys (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 750 pares de bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: 5G1.1M1 VH +HuGl (Fd quimérico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10: ATG AAA TGG AGC TGG GTT ATT CTC TTC CTC 30 Met Lys Trp Ser Trp Vai Ile Leu Phe Leu -15 -10 CTG TCA GTA ACT GCA GGT GTC CAC TCC CAG 60

Leu Ser Vai Thr Ala Gly Vai His Ser Gin -5 1 122 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ GTT CAG CTG CAG CAG TCT GGA GCT GAG CTG 90 Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu 5 10 ATG AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG ATG TCC 120 Met Lys Pro Gly Ala Ser Vai Lys Met Ser 15 20 TGC AAG GCT ACT GGC TAC ATA TTC AGT AAC 150 Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Ile Phe Ser Asn 25 30 TAC TGG ATA CAG TGG ATA AAG CAG AGG CCT 180 Tyr Trp Ile Gin Trp Ile Lys Gin Arg Pro 35 40 GGA CAT GGC CTT GAG TGG ATT GGT GAG ATT 210 Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile 45 50 TTA CCT GGA AGT GGT TCT ACT GAG TAC ACT 240 Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Thr 55 60 GAG AAC TTC AAG GAC AAG GCC GCA TTC ACT 270 Glu Asn Phe Lys Asp Lys Ala Ala Phe Thr 65 70 GCA GAT ACA TCC TCC AAC ACA GCC TAC ATG 300 Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met 75 80 CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCA GAG GAC TCT 330 Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 85 90 123 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ GCC GTC TAT TAC TGT GCA AGA TAT TTC TTC 360 Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Phe Phe 95 100 GGT AGT AGC CCC AAC TGG TAC TTC GAT GTC 390 Gly Ser Ser Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Vai 105 110 TGG GGC GCA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC 420 Trp Gly Ala Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser 115 120 TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC 450 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe 125 130 ccc CTG GCG CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT 480 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 135 140 GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC 510 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai 145 150 AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG 540 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai 155 160 TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC 570 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC 600 Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser 175 180 124 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG 630 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser val Val 185 190 ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG 660 Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin 195 200 ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC 690 Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro 205 210 AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG 720 Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Val Glu 215 220 CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TAA 750 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 750 pares de bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: 5G1.1 VH + IGHRL (Fd Humanizado) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:11: ATG AAG TGG AGC TGG GTT ATT CTC TTC CTC 30

Met Lys Trp Ser Trp Vai Ile Leu Phe Leu -15 -10 125 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ CTG TCA GTA ACT GCC GGC GTC CAC TCC CAA 60 Leu Ser Vai Thr Ala Gly Vai His Ser Gin -5 1 GTC CAA CTG GTG CAA TCC GGC GCC GAG GTC 90 Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai 5 10 AAG AAG CCA GGG GCC TCA GTC AAA GTG TCC 120 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser 15 20 TGT AAA GCT AGC GGC TAT ATT TTT TCT AAT 150 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Asn 25 30 TAT TGG ATT CAA TGG GTG CGT CAG GCC CCC 180 Tyr Trp Ile Gin Trp Vai Arg Gin Ala Pro 35 40 GGG CAG GGC CTG GAA TGG ATG GGT GAG ATC 210 Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile 45 50 TTA CCG GGC TCT GGT AGC ACC GAA TAT GCC 240 Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Ala 55 60 CAA AAA TTC CAG GGC CGT GTT ACT ATG ACT 270 Gin Lys Phe Gin Gly Arg Vai Thr Met Thr 65 70 GCG GAC ACT TCG ACT AGT ACA GCC TAC ATG 300 Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 75 80 126 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ GAG CTC TCC AGC CTG CGA TCG GAG GAC ACG 330 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 85 90 GCC GTC TAT TAT TGC GCG CGT TAT TTT TTT 360 Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Phe Phe 95 100 GGT TCT AGC CCG AAT TGG TAT TTT GAT GTT 390 Gly Ser Ser Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Vai 105 110 TGG GGT CAA GGA ACC CTG GTC ACT GTC TCG 420 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser 115 120 AGC GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC 450 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe 125 130 CCC CTG GCG CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT 480 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 135 140 GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC 510 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai 145 150 AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG 540 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai 155 160 TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC 570 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 127 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC 600 Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser 175 180 TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG 630 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai 185 190 ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG 660 Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin 195 200 ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC 690 Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro 205 210 AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG 720 Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu 215 220 CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TAA 750 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 750 pares de bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: 5G1.1 VH + IGHRLC (Fd Humanizado) 128 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12: ATG AAG TGG AGC TGG GTT ATT CTC TTC CTC 30 Met Lys Trp Ser Trp Vai Ile Leu Phe Leu -15 -10 CTG TCA GTA ACT GCC GGC GTC CAC TCC CAA 60 Leu Ser Vai Thr Ala Gly Vai His Ser Gin -5 1 GTC CAA CTG GTG CAA TCC GGC GCC GAG GTC 90 Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai 5 10 AAG AAG CCA GGG GCC TCA GTC AAA GTG TCC 120 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser 15 20 TGT AAA GCT AGC GGC TAT ATT TTT TCT AAT 150 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Asn 25 30 TAT TGG ATT CAA TGG GTG CGT CAG GCC CCC 180 Tyr Trp Ile Gin Trp Vai Arg Gin Ala Pro 35 40 GGG CAG GGC CTG GAA TGG ATG GGT GAG ATC 210 Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile 45 50 TTA CCG GGC TCT GGT AGC ACC GAA TAT ACC 240 Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Thr 55 60 GAA AAT TTT AAA GAC CGT GTT ACT ATG ACG 270 Glu Asn Phe Lys Asp Arg Vai Thr Met Thr 70 65 129 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ CGT GAC ACT TCG ACT AGT ACA GTA TAC ATG 300 Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Vai Tyr Met 75 80 GAG CTC TCC AGC CTG CGA TCG GAG GAC ACG 330 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 85 90 GCC GTC TAT TAT TGC GCG CGT TAT TTT TTT 360 Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Phe Phe 95 100 GGT TCT AGC CCG AAT TGG TAT TTT GAT GTT 390 Gly Ser Ser Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Vai 105 110 TGG GGT CAA GGA ACC CTG GTC ACT GTC TCG 420 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser 115 120 AGC GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC 450 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe 125 130 CCC CTG GCG CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT 480 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 135 14Q GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC 510 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai 145 150 AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG 540 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai 155 160 130 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC 570 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC 600 Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser 175 180 TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG 630 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai 185 190 ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG 660 Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin 195 200 ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC 690 Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro 205 210 AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG 720 Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu 215 220 CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TAA 750 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 726 pares de bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: 5G1.1 VL +KLV56 (cadeia leve humanizada) 131 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:13: ATG GGA ATC CAA GGA GGG TCT GTC CTG TTC 30 Met Gly Ile Gin Gly Gly Ser Vai Leu Phe -25 -20 GGG CTG CTG CTC GTC CTG GCT GTC TTC TGC 60 Gly Leu Leu Leu Vai Leu Ala Vai Phe Cys -15 -10 CAT TCA GGT CAT AGC CTG CAG GAT ATC CAG 90 His Ser Gly His Ser Leu Gin Asp Ile Gin -5 1 5 ATG ACC CAG TCC CCG TCC TCC CTG TCC GCC 120 Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 10 15 TCT GTG GGC GAT AGG GTC ACC ATC ACC TGC 150 a t 7—. T v αχ r* 1 .. υιγ * . TV_ vai lili xxe mV._ 11110 Cys 20 25 GGC GCC AGC GAA AAC ATC TAT GGC GCG CTG 180 Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala Leu 30 35 AAC TGG TAT CAA CGT AAA CCT GGG AAA GCT 210 Asn Trp Tyr Gin Arg Lys Pro Gly Lys Ala Λ Λ 7X V/ A C CCG AAG CTT CTG ATT TAC GGT GCG ACG AAC 240 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Thr Asn 50 55 CTG GCA GAT GGA GTC CCT TCT CGC TTC TCT 270 Leu Ala Asp Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser 60 65 132 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ GGA TCC GGC TCC GGA ACG GAT TAC ACT CTG 300 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu 70 75 ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAG GAC TTC 330 Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe ao 85 GCT ACG TAT TAC TGT CAG AAC GTT TTA AAT 360 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Asn Vai Leu Asn 90 95 ACT CCG TTG ACT TTC GGA CAG GGT ACC AAG 390 Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys 100 105 GTG GAA ATA AAA CGA ACT GTG GCT GCA CCA 420 Vai Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro 110 115 TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG 450 Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 120 125 CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG 480 Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai 130 135 TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG 510 Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 140 145 GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC 540 Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala 150 155 133 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC 570 Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai 160 165 ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC 600 Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 170 175 AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA 630 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 180 185 GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC 660 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala 190 195 TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG 690 Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 200 205 CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG 720 Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 210 215 TGT TAG 726 Cys (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 726 pares de bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: 5G1.1 VL +KLV56B (Cadeia leve humanizada) 134 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:14: ATG GGA ATC CAA GGA GGG TCT GTC CTG TTC 30 Met Gly Ile Gin Gly Gly Ser Vai Leu Phe -25 -20 GGG CTG CTG CTC GTC CTG GCT GTC TTC TGC 60 Gly Leu Leu Leu Vai Leu Ala Vai Phe Cys -15 -10 CAT TCA GGT CAT AGC CTG CAG GAT ATC CAG 90 His Ser Gly His Ser Leu Gin Asp Ile Gin -5 1 5 ATG ACC CAG TCC CCG TCC TCC CTG TCC GCC 120 Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 10 15 TCT GTG GGC GAT AGG GTC ACC ATC ACC TGC 150 Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys 20 25 GGC GCC AGC GAA AAC ATC TAT GGC GCG CTG 180 Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala Leu 30 35 AAC TGG TAT CAA CGT AAA CCT GGG AAA GCT 210 Asn Trp Tyr Gin Arg Lys Pro Gly Lys Ala 40 45 CCG AAG CTT CTG ATT TAC GGT GCG ACG AAC 240 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Thr Asn 50 55 CTG GCA GAT GGA GTC CCT TCT CGC TTC TCT 270 Leu Ala Asp Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser 60 65 135 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ GGA TCC GGC TCC GGA ACG GAT TTC ACT CTG 300 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 70 75 ACC ATC AGC AGT CTG CAG CCT GAA GAC TTC 330 Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe 80 85 GCT ACG TAT TAC TGT CAG AAC Γ!ΦΦ WA 4 ΦΦ71 x in Λ7ΙΦ nn x 360 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Asn Vai Leu Asn 90 95 ACT CCG TTG ACT TTC GGA CAG GGT ACC AAG 390 Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys 100 105 GTG GAA ATA AAA CGA ACT GTG GCT GCA CCA 420 Vai Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro 110 115 TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG 450 Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 120 125 CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG 480 Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai 130 135 TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG 510 Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 140 145 GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC 540 Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala 150 155 136 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC 570 Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai 160 165 ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC 600 Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 170 175 AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA 630 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 180 185 GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC 660 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala 190 195 TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG 690 Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 200 205 CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG 720 Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 210 215 TGT TAG 726 Cys (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 711 pares de bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: 5G1.1 VL + 012 (Cadeia leve humanizada) 137 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:15: ATG GAC ATG AGG GTC CCC GCT CAG CTC CTG 30 Met Asp Met Arg Vai Pro Ala Gin Leu Leu -20 -15 GGG CTC CTG CTA CTC TGG CTC CGA GGT GCC 60 Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Arg Gly Ala -10 -5 AGA TGT GAT ATC CAC ATG ACC CAG TCC CCG 90 Arg Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro 1 5 TCC TCC CTG TCC GCC TCT GTG GGC GAT AGG 120 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg 10 15 GTC ACC ATC ACC TGC GGC GCC AGC GAA AAC 150 Vai Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn 20 25 ATC TAT GGC GCG CTG AAC TGG TAT CAA CAG 180 Ile Tyr Gly Ala Leu Asn Trp Tyr Gin Gin 30 35 AAA CCC GGG AAA GCT CCG AAG CTT CTG ATT 210 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 40 45 TAC GGT GCG ACG AAC CTG GCA GAT GGA GTC 240 Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Vai 50 55 CCT TCT CGC TTC TCT GGA TCC GGC TCC GGA 270 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 60 65 138 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ ACG GAT TTC ACT CTG ACC ATC AGC AGT CTG 300 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 70 75 CAG CCT GAA GAC TTC GCT ACG TAT TAC TGT 330 Gin Pro GlU Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 80 85 CAG AAC GTT TTA AAT ACT CCG TTG ACT TTC 360 Gin Asn Vai Leu Asn Thr Pro Leu Thr Phe 90 95 GGA CAG GGT ACC AAG GTG GAA ATA AAA CGA 390 Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 100 105 ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC 420 Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe 110 115 CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA 450 Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 120 125 ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC 480 Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG 510 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp 140 145 AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC 540 Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn 150 155 139 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC 570 Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser 160 165 AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC 600 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 170 175 CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA 630 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT 660 His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His 190 195 CAG GGC CTG AGC TCG CCC GTC ACA AAG AGC 690 Gin Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser 200 205 TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAG 711 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 750 pares de bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: 5G1.1 VH + IGHRLD (Fd Humanizado) 140 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:16: ATG AAG TGG AGC TGG GTT ATT CTC TTC CTC 30 Met Lys Trp Ser Trp Vai Ile Leu Phe Leu -15 -10 CTG TCA GTA ACT GCC GGC GTC CAC TCC CAA 60 Leu Ser Vai Thr Ala Gly Vai His Ser Gin -5 1 GTC CAA CTG GTG CAA TCC GGC GCC GAG GTC 90 Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai 5 10 AAG AAG CCA GGG GCC TCA GTC AAA GTG TCC 120 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser 15 20 TGT AAA GCT AGC GGC TAT ATT TTT TCT AAT 150 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Asn 25 30 TAT TGG ATT CAA TGG GTG CGT CAG GCC CCC 180 Tyr Trp Ile Gin Trp Vai Arg Gin Ala Pro 35 40 GGG CAG GGC CTG GAA TGG ATG GGT GAG ATC 210 Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile 45 50 TTA CCG GGC TCT GGT AGC ACC GAA TAT GCC 240 Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Ala 55 60 CAA AAA TTC CAG GGC CGT GTT ACT ATG ACT 270 Gin Lys Phe Gin Gly Arg Vai Thr Met Thr 65 70 141 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ CGT GAC ACT TCG ACT AGT ACA GTA TAC ATG O O Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Vai Tyr Met 75 80 GAG CTC TCC AGC CTG CGA TCG GAG GAC ACG 330 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 85 90 GCC GTC TAT TAT TGC GCG CGT TAT TTT TTT 360 Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Phe Phe 95 100 GGT TCT AGC CCG AAT TGG TAT TTT GAT GTT 390 Gly Ser Ser Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Vai 105 110 TGG GGT CAA GGA ACC CTG GTC ACT GTC TCG 420 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser 115 120 AGC GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC 450 Ser Ala Ser "Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe 125 130 CCC CTG GCG CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT 480 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 135 140 GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC 510 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai 145 150 AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG 540 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai 155 160 142 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC 570 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC 600 Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser 175 180 TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG 630 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai 185 190 ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG 660 Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin 195 200 ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC 690 Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro 205 210 AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG 720 Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu 215 220 CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TAA 750 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 747 pares de bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: 5G1.1 scFv D012 (scFv Humanizado) 143 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:17: ATG GCC GAT ATC CAG ATG ACC CAG TCC CCG 30 Met Ala Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro 1 5 10 TCC TCC CTG TCC GCC TCT GTG GGC GAT AGG 60 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg 15 20 GTC ACC ATC ACC TGC GGC GCC AGC GAA AAC 90 Vai Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn 25 30 ATC TAT GGC GCG CTG AAC TGG TAT CAA CAG 120 Ile Tyr Gly Ala Leu Asn Trp Tyr Gin Gin 35 40 AAA CCT GGG AAA GCT CCG AAG CTT CTG ATT 150 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 45 50 TAC GGT GCG ACG AAC CTG GCA GAT GGA GTC 180 Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Vai 55 60 CCT TCT CGC TTC TCT GGA TCC GGC TCC GGA 210 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 65 70 ACG GAT TTC ACT CTG ACC ATC AGC AGT CTG 240 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 75 80 144 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ CAG CCT GAA GAC TTC GCT ACG TAT TAC TGT 270 Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 CAG AAC GTT TTA AAT ACT CCG TTG ACT TTC 300 Gin Asn Vai Leu Asn Thr Pro Leu Thr Phe 95 100 GGA CAG GGT ACC AAG GTG GAA ATA AAA CGT 330 Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 105 110 ACT GGC GGT GGT GGT TCT GGT GGC GGT GGA 360 Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 TCT GGT GGT GGC GGT TCT CAA GTC CAA CTG 390 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin Vai Gin Leu 125 130 GTG CAA TCC GGC GCC GAG GTC AAG AAG CCA 420 Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro - 135 140 GGG GCC TCA GTC AAA GTG TCC TGT AAA GCT 450 Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala 145 150 AGC GGC TAT ATT TTT TCT AAT TAT TGG ATT 480 Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Asn Tyr Trp Ile 155 160 CAA TGG GTG CGT CAG GCC CCC GGG CAG GGC 510 Gin Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly 165 170 145 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ CTG GAA TGG ATG GGT GAG ATC TTA CCG GGC 540 Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Leu Pro Gly 175 180 TCT GGT AGC ACC GAA TAT GCC CAA AAA TTC 570 Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Ala Gin Lys Phe 185 190 CAG GGC CGT GTT ACT ATG ACG CGT GAC ACT 600 Gin Gly Arg Vai Thr Met Thr Arg Asp Thr 195 200 TCG ACT AGT ACA GTA TAC ATG GAG CTC TCC 630 Ser Thr Ser Thr Vai Tyr Met Glu Leu Ser 205 210 AGC CTG CGA TCG GAG GAC ACG GCC GTC TAT 660 Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 215 220 TAT TGC GCG CGT TAT TTT TTT GGT TCT AGC 690 Tyr Cys Ala Arg Tyr Phe Phe Gly Ser Ser 225 230 CCG AAT TGG TAT TTT GAT GTT TGG GGT CAA 720 Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Gin 235 240 GGA ACC CTG GTC ACT GTC TCG AGC TGA 747 Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 245 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5248 pares de bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Dupla (D) TOPOLOGIA: Circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO:

pET Trc S05/NI vector de expressão eucariota 146 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:18: TGGCGAATGG GACGCGCCCT GTAGCGGCGC ATTAAGCGCG GCGGGTGTGG 50 TGGTTACGCG CAGCGTGACC GCTACACTTG CCAGCGCCCT AGCGCCCGCT 100 CCTTTCGCTT TCTTCCCTTC CTTTCTCGCC ACGTTCGCCG GCTTTCCCCG 150 TCAAGCTCTA AATCGGGGGC TCCCTTTAGG GTTCCGATTT AGTGCTTTAC 200 GGCACCTCGA CCCCAAAAAA CTTGATTAGG GTGATGGTTC ACGTAGTGGG 250 CCATCGCCCT GATAGACGGT TTTTCGCCCT TTGACGTTGG AGTCCACGTT 300 CTTTAATAGT GGACTCTTGT TCCAAACTGG AACAACACTC AACCCTATCT 350 CGGTCTATTC TTTTGATTTA TAAGGGATTT TGCCGATTTC GGCCTATTGG 400 TTAAAAAATG AGCTGATTTA ACAAAAATTT AACGCGAATT TTAACAAAAT 450 ATTAACGTTT ACAATTTCAG GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA 500 CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT CAAATATGTA TCCGCTCATG 550 AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA GGAAGAGTAT 600 GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT 650 GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT 700 GAAGATCAGT TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG 750 147 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ 1700

CGGTAAGATC CTTGAGAGTT TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA 800 GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG TATTATCCCG TATTGACGCC 850 GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA ATGACTTGGT 900 TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA 950 GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC 1000 TTACTTCTGA CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA 1050 CAACATGGGG GATCATGTAA CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA 1100 ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA CCACGATGCC TGCAGCAATG 1150 GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA CTCTAGCTTC 1200 CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 1250 TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA 1300 GCCGGTGAGC GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG 1350 TAAGCCCTCC CGTATCGTAG TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA 1400 TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA TAGGTGCCTC ACTGATTAAG 1450 CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT AGATTGATTT 1500 AAAACTTCAT ΤΤΤΤΑΑΤΤΤΑ AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA 1550 ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA 1600 GACCCCGTAG AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG 1650 CGTAATCTGC TGCTTGCAAA CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT 148 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT TTCCGAAGGT AACTGGCTTC 1750 AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC CGTAGTTAGG 1800 CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA 1850 TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG 1900 TTGGACTCAA GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC 1950 GGGGGGTTCG TGCACACAGC CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC 2000 TGAGATACCT ACAGCGTGAG CTATGAGAAA GCGCCACGCT TCCCGAAGGG 2050 AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA CAGGAGAGCG 2100 CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG 2150 GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG 2200 GGGCGGAGCÇ TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT 2250 GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG 2300 ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG AGTGAGCTGA TACCGCTCGC 2350 CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG AAGCGGAAGA 2400 GCGCCTGATG CGGTATTTTC TCCTTACGCA TCTGTGCGGT ATTTCACACC 2450 GCATATATGG TGCACTCTCA GTACAATCTG CTCTGATGCC GCATAGTTAA 2500 GCCAGTATAC ACTCCGCTAT CGCTACGTGA CTGGGTCATG GCTGCGCCCC 2550 GACACCCGCC AACACCCGCT GACGCGCCCT GACGGGCTTG TCTGCTCCCG 2600 GCATCCGCTT ACAGACAAGC TGTGACCGTC TCCGGGAGCT GCATGTGTCA 2650 149 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ GAGGTTTTCA CCGTCATCAC CGAAACGCGC GAGGCAGCTG CGGTAAAGCT 2700 CATCAGCGTG GTCGTGAAGC GATTCACAGA TGTCTGCCTG TTCATCCGCG 2750 TCCAGCTCGT TGAGTTTCTC CAGAAGCGTT AATGTCTGGC TTCTGATAAA 2800 GCGGGCCATG TTAAGGGCGG TTTTTTCCTG TTTGGTCACT GATGCCTCCG 2850 TGTAAGGGGG ATTTCTGTTC ATGGGGGTAA TGATACCGAT GAAACGAGAG 2900 AGGATGCTCA CGATACGGGT TACTGATGAT GAACATGCCC GGTTACTGGA 2950 ACGTTGTGAG GGTAAACAAC TGGCGGTATG GATGCGGCGG GACCAGAGAA 3000 AAATCACTCA GGGTCAATGC CAGCGCTTCG TTAATACAGA TGTAGGTGTT 3050 CCACAGGGTA GCCAGCAGCA TCCTGCGATG CAGATCCGGA ACATAATGGT 3100 GCAGGGCGCT GACTTCCGCG TXTCCAGACT TTACGAAACA CGGAAACCGA 3150 AGACCATTCA TGTTGTTGCT CAGGTCGCAG ACGTTTTGCA GCAGCAGTCG 3200 CTTCACGTTC GCTCGCGTAT CGGTGATTCA TTCTGCTAAC CAGTAAGGCA 3250 ACCCCGCCAG CCTAGCCGGG TCCTCAACGA CAGGAGCACG ATCATGCGCA 3300 CCCGTGGGGC CGCCATGCCG GCGATAATGG CCTGCTTCTC GCCGAAACGT 3350 TTGGTGGCGG GACCAGTGAC GAAGGCTTGA GCGAGGGCGT GCAAGATTCC 3400 GAATACCGCA AGCGACAGGC CGATCATCGT CGCGCTCCAG CGAAAGCGGT 3450 CCTCGCCGAA AATGACCCAG AGCGCTGCCG GCACCTGTCC TACGAGTTGC 3500 ATGATAAAGA AGACAGTCAT AAGTGCGGCG ACGATAGTCA TGCCCCGCGC 3550 CCACCGGAAG GAGCTGACTG GGTTGAAGGC TCTCAAGGGC ATCGGTCGAG 3600 150 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ ATCCCGGTGC CTAATGAGTG AGCTAACTTA CATTAATTGC GTTGCGCTCA 3650 CTGCCCGCTT TCCAGTCGGG AAACCTGTCG TGCCAGCTGC ATTAATGAAT 3700 CGGCCAACGC GCGGGGAGAG GCGGTTTGCG TATTGGGCGC CAGGGTGGTT 3750 TTTCTTTTCA CCAGTGAGAC GGGCAACAGC TGATTGCCCT TCACCGCCTG 3800 GCCCTGAGAG AGTTGCAGCA AGCGGTCCAC GCTGGTTTGC CCCAGCAGGC 3850 GAAAATCCTG TTTGATGGTG GTTAACGGCG GGATATAACA TGAGCTGTCT 3900 TCGGTATCGT CGTATCCCAC TACCGAGATA TCCGCACCAA CGCGCAGCCC 3950 GGACTCGGTA ATGGCGCGCA TTGCGCCCAG CGCCATCTGA TCGTTGGCAA 4000 CCAGCATCGC AGTGGGAACG ATGCCCTCAT TCAGCATTTG CATGGTTTGT 4050 TGAAAACCGG ACATGGCACT CCAGTCGCCT TCCCGTTCCG CTATCGGCTG 4100 AATTTGATTG CGAGTGAGAT ATTTATGCCA GCCAGCCAGA CGCAGACGCG 4150 CCGAGACAGA ACTTAATGGG CCCGCTAACA GCGCGATTTG CTGGTGACCC 4200 AATGCGACCA GATGCTCCAC GCCCAGTCGC GTACCGTCTT CATGGGAGAA 4250 AATAATACTG TTGATGGGTG TCTGGTCAGA GACATCAAGA AATAACGCCG 4300 GAACATTAGT GCAGGCAGCT TCCACAGCAA TGGCATCCTG GTCATCCAGC 4350 GGATAGTTAA TGATCAGCCC ACTGACGCGT TGCGCGAGAA GATTGTGCAC 4400 CGCCGCTTTA CAGGCTTCGA CGCCGCTTCG TTCTACCATC GACACCACCA 4450 CGCTGGCACC CAGTTGATCG GCGCGAGATT TAATCGCCGC GACAATTTGC 4500 GACGGCGCGT GCAGGGCCAG ACTGGAGGTG GCAACGCCAA TCAGCAACGA 4550 151 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ

CTGTTTGCCC GCCAGTTGTT GTGCCACGCG GTTGGGAATG TAATTCAGCT CCGCCATCGC CGCTTCCACT TTTTCCCGCG TTTTCGCAGA AACGTGGCTG GCCTGGTTCA CCACGCGGGA AACGGTCTGA TAAGAGACAC CGGCATACTC TGCGACATCG TATAACGTTA CTGGTTTCAC ATTCACCACC CTGAATTGAC TCTCTTCCGG GCGCTATCAT GCCATACCGC GAAAGGTTTT GCGCCATTCG ATGGTGTCCG GGATCTCGAC GCTCTCCCTT ATGCGACTCC TGCATTAGGA AGCAGCCCAG TAGTAGGTTG AGGCCGTTGA GCACCGCCGC CGCAAGGAAT GGTGCATGCG GTACCAGCTG TTGACAATTA ATCATCCGGC TCGTATAATA GTACTGTGTG GAATTGTGAG CGCTCACAAT TCCACACATC TAGAAATAAT TTTGTTTAAC TTTAAGAAGG AGATATACCA TGGAGATCTG GATCCATCGA TGAATTCGAG CTCCGTCGAC AAGCTTGCGG CCGCACTCGA GCACCACCAC CACCACCACT GAGATCCGGC TGCTAACAAA GCCCGAAAGG AAGCTGAGTT GGCTGCTGCC ACCGCTGAGC AATAACTAGC ATAACCCCTT GGGGCCTCTA AACGGGTCTT GAGGGGTTTT TTGCTGAAAG GAGGAACTAT ATCCGGAT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 813 pares de bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: N19/8 scFv (marcado com His) 4600 4650 4700 4750 4800 4850 4900 4950 5000 5050 5100 5150 5200 5248 152 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:19: ATG GCC AAT ATT GTG CTG ACC CAA TCT CCA 30 Met Ala Asn Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro 1 5 10 GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG CAG AGG 60 Ala Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly Gin Arg 15 20 GCC ACC ATA TCC TGC AGA GCC AGT GAA AGT 120 Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser 25 30 GTT GAT AGT TAT GAC AAT AGT TTT ATG CAC 150 Vai Asp Ser Tyr Asp Asn Ser Phe Met His 35 40 TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC 180 Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 45 50 AAA CTC CTC ATC TTT CTT GCA TCC AAC CTA 210 Lys Leu Leu Ile Phe Leu Ala Ser Asn Leu 55 60 GAA TCT GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC 240 Glu Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly 65 70 AGT GGG TCT AGG ACA GAC TTC ACC CTC ACC 270 Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr 75 80 ATT GAT CCT GTG GAG GCT GAT GAT GCT GCA 300 Ile Asp Pro Vai Glu Ala Asp Asp Ala Ala 85 90 153 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ ACC TAT TAC TGT CAG CAA AAT AAT GAG GTT 330 Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Asn Glu Vai 95 100 CCG AAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG 360 Pro Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 105 110 GAA ATA AAA CGG ACC GGA GGT GGC GGG TCG 390 Glu Ile Lys Arg Thr Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 GGT GGC GGG GGA TCG GGT GGC GGA GGG TCG 420 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 125 130 GAC GTC AAG CTC GTG GAG TCT GGG GGA GAC 450 Asp Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Asp 135 140 TTA GTG AAG CTT GGA GGG TCC CTG AAA CTC 480 Leu Vai Lys Leu Gly Gly Ser Leu Lys Leu 145 150 TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT 510 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 155 160 AGC TAT TAT ATG TCT TGG GTT CGC CAG ATT 540 Ser Tyr Tyr Met Ser Trp Vai Arg Gin Ile 165 170 TCA GAG AAG AGG CTG GAG TTG GTC GCA GCC 570 Ser Glu Lys Arg Leu Glu Leu Vai Ala Ala 175 180 154 ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ ATT AAT AGT AAT GGT GAT AGC ACC TAC TAT 600 Ile Asn Ser Asn Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr 185 190 CCA GAC ACT GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC 630 Pro Asp Thr Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile 195 200 TCC AGA GAC AAT GCC AAG AGC ACC CTG GAT 660 Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Asp 205 210 CTG CAA ATG AGC AGT CTG AAG TCT GAG GAC 690 Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp 215 220 ACA GCC TTG TAT TTC TGT GTA AGA GAG ACT 720 Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Vai Arg Glu Thr 225 230 TAT TAC TAC GGG ATT AGT CCC GTC TTC GAT 750 Tyr Tyr Tyr Gly Ile Ser Pro Vai Phe Asp 235 240 GTC TGG GGC ACA GGG ACC ACG GTC ACC GTC 780 Vai Trp Gly Thr Gly Thr Thr Vai Thr Vai 245 250 TCC TCA CTC GAG CAC CAC CAC CAC CAC CAC 810 Ser Ser Leu Glu His His His His His His 255 260 TGA 813

Lisboa, 2010-02-03

Claims (14)

1. ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo caracterizado por compreender pelo menos um local de ligação anticorpo-antigénio, apresentar ligação especifica à componente C5 do complemento humano, sendo a referida ligação especifica direccionada para a cadeia alfa da componente C5 do complemento humano, inibir a activação do complemento num fluido corporal humano e não se ligar especificamente ao produto de activação do complemento humano C5a livre.
2. 2. Anticorpo da reivindicação 1, caracterizado por compreender: i) uma CDRl de cadeia leve variável compreendendo os resíduos de aminoácido 28-34 de SEQ ID NO: 7, ii) uma CDR2 de cadeia leve variável compreendendo os residuos de aminoácido 52-54 de SEQ ID NO: 7, iii) uma CDR3 de cadeia leve variável compreendendo os resíduos de aminoácido 93-98 de SEQ ID NO:7, iv) uma CDRl de cadeia pesada variável compreendendo os resíduos de aminoácido 156-159 de SEQ ID NO: 7, v) uma CDR2 de cadeia pesada variável compreendendo os resíduos de aminoácido 179-183 de SEQ ID NO: 7, e vi) uma CDR3 de cadeia pesada variável compreendendo os resíduos de aminoácido 226-236 de SEQ ID NO:7.
3. 3. Molécula de ácido nucleico isolada compreendendo: (a) uma sequência de nucleótidos que codifica o anticorpo da reivindicação 2, (b) uma sequência de nucleótidos complementar a (a); ou (c) tanto (a) como (b) .
4. 4. Anticorpo da reivindicação 1, caracterizado por compreender: i) uma CDRl de cadeia leve variável compreendendo os resíduos de aminoácido 26-36 de SEQ ID NO:8, ii) uma CDR2 de cadeia leve variável compreendendo os resíduos de aminoácido 52-58 de SEQ ID NO: 8, iii) uma CDR3 de cadeia leve variável compreendendo os resíduos de aminoácido 91-99 de SEQ ID NO:8, iv) uma CDRl de cadeia pesada variável compreendendo os resíduos de aminoácido 152-161 de SEQ ID NO: 8, v) uma CDR2 de cadeia pesada variável compreendendo os resíduos de aminoácido 176-192 de SEQ ID NO:8, e vi) uma CDR3 de cadeia pesada ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ 2/4 variável compreendendo os resíduos de aminoácido 225-237 de SEQ ID NO:8.
5. 5. Molécula de ácido nucleico isolada compreendendo: (a) uma sequência de nucleótidos que codifica o anticorpo da reivindicação 4, (b) uma sequência de nucleótidos complementar a (a); ou (c) tanto (a) como (b) .
6. 6. Anticorpo da reivindicação 1, caracterizado por compreender: i) uma CDRl de cadeia leve variável compreendendo os resíduos de aminoácido 26-36 de SEQ ID NO: 17, ii) uma CDR2 de cadeia leve variável compreendendo os resíduos de aminoácido 52-58 de SEQ ID NO: 17, iii) uma CDR3 de cadeia leve variável compreendendo os resíduos de aminoácido 91-99 de SEQ ID NO:17, iv) uma CDRl de cadeia pesada variável compreendendo os resíduos de aminoácido 152-161 de SEQ ID NO:17, v) uma CDR2 de cadeia pesada variável compreendendo os resíduos de aminoácido 176-186 de SEQ ID NO: 17, e vi) uma CDR3 de cadeia pesada variável compreendendo os resíduos de aminoácido 225-237 de SEQ ID NO:17.
7. 7. Molécula de ácido nucleico isolada compreendendo: (a) uma sequência de nucleótidos que codifica o anticorpo da reivindicação 6, (b) uma sequência de nucleótidos complementar a (a); ou (c) tanto (a) como (b) .
8. 8. Anticorpo da reivindicação 1, caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos de i) SEQ ID NO:7; ii) SEQ ID NO:8; iii) SEQ ID NO:17; iv) uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 3-109 de SEQ ID NO:9 e uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 3-122 de SEQ ID NO:10; v) uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 1-108 de SEQ ID NO: 15 e uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 1-122 de SEQ ID NO:16; ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ 3/4 vi) uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 1-108 de SEQ ID NO: 15 e uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 1-122 de SEQ ID NO:12; vii) uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 1-108 de SEQ ID NO:15 e uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 1-122 de SEQ ID NO:11; viii) uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 3-110 de SEQ ID NO: 14 e uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 1-122 de SEQ ID NO:16; ix) uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 3-110 de SEQ ID NO: 14 e uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 1-122 de SEQ ID NO:12; ou x) uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 3-110 de SEQ ID NO:14 e uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 1-122 de SEQ ID NO:11.
9. 9. Molécula de ácido nucleico isolada compreendendo: (a) uma sequência de nucleótidos que codifica o anticorpo da reivindicação 8, (b) uma sequência de nucleótidos complementar a (a); ou (c) tanto (a) como (b) .
10. 10. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 em que o anticorpo é um anticorpo recombinante compreendendo um domínio constante humano.
11. 11. Vector de ácido nucleico caracterizado por compreender uma primeira molécula de ácido nucleico ligada covalentemente e operativamente a uma segunda molécula de ácido nucleico de modo a que um hospedeiro contendo o vector expresse o polipéptido codificado pela primeira molécula de ácido nucleico, sendo a primeira molécula de ácido nucleico uma molécula de ácido nucleico tal como reivindicada em qualquer das reivindicações 3, 5, 7 e 9.
12. 12. Célula hospedeira recombinante caracterizada por compreender um vector de ácido nucleico tal como reivindicado na reivindicação 11.
13. 13. Artigo de fabrico caracterizado por compreender material de embalagem e um agente farmacêutico contido no ΕΡ Ο 758 904/ΡΤ 4/4 interior do referido material de embalagem, sendo o referido agente farmacêutico um anticorpo tal como reivindicado em qualquer das reivindicações 1, 2, 4, 6, 8 ou 10.
14. 14. Utilização de um anticorpo tal como reivindicado em qualquer das reivindicações 1, 2, 4, 6, 8 ou 10 na preparação de um medicamento para o tratamento de glomerulonefrite. Lisboa, 2010-02-03