JPH02253164A - 抗脳由来アルカリフォスファターゼｉ特異抗体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、脳障害の診断に有用な脳由来アルカリフォス
ファターゼ（ＡＬＰ）　Ｉ型アイソザイムの測定に使用
する抗脳由来ＡＬＰ　Ｉ特異抗体の製造方法に関する。

［従来の技術及びその課題］ 頭部外傷患者や脳血管障害患者では、最終的に脳実質障
害の程度が患者の転帰を決定すると言える。脳実質障害
の診断や評価の方法としては、神経学的方法、画像診断
法（コンピュータ連動断層撮影、磁気共鳴画像、血管造
影）、電気生理学的方法（脳波、誘発電位、脳圧測定）
などが用いられてきた。しかしながら、これらの測定法
は、特殊な機器及び技術が必要なため一般的ではなく、
また早期診断及びモニタリングには不適である等の問題
点がある。更に最近では、生化学的方法により、脳実質
障害の程度を定量的に評価しようという試みもあるが、
未だ確立されているとは言えない。

ところで、生体に広く分布する酵素であるＡＬＰは、そ
のアイソザイムとして、電気泳動度により、■型から■
型までの６種の型が知られている。そして血清中のＡＬ
Ｐアイソザイムの測定は、古くから肝、骨、胎盤、小腸
等の臨床診断に利用されている。これらのうち、ＡＬＰ
　Ｉ型アイソザイムは分子■約２００万であり、悪性腫
瘍、閉鎖性黄痕の際に認められると報告されている。

［課題を解決するための手段］ かかる実情において、本発明者らはＡＬＰアイソザイム
について研究を行なっていたところ、正常人血清中には
存在しないが、脳障害を起こした患者の血清中には、肺
由来ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムが高頻度で認められるこ
と、更にこの肺由来ＡＬＰ　Ｔ型アイソザイムは正常人
血清中に存在するＡＩ、ＰＴ型アイソザイム（弁胴由来
ＡＬＰ　ＴＩ型アイソザイムが細胞膜と結合したもの。

以下、「弁胴由来ＡＬＰＩ型アイソザイム」と称する。

）とは物理化学的性質を異にすること、従って、血清中
の肺由来ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムの量を測定すれば脳
障害患者を診断できることを見出した。

そして、本発明者らは、この肺由来ＡＬＰ　Ｉ型アイソ
ザイムを免疫学的に測定せんと鋭意研究を行ない、当該
アイソザイムに特異的な抗体を得ることに成功し、本発
明を完成した。

すなわち本発明は、次の物理化学的性質分子量　　　　
　　　　　　　約１．５　、０００耐熱性（５６℃、５
分）　　残存活性約６０％フェニルアラニン　　　　　
　阻害せずＴｒｉｔｏｎ　Ｘ１００処理　　　　　泳動
度不変ノイラミニダーゼ処理　　　泳動度不変を有する
肺由来ＡＬＰ　Ｔ型アイソザイムを動物に免疫し、得ら
れる抗血清を弁胴由来ＡＬＰ　ＩＩ型及び■型アイソザ
イムで吸収することを特徴とする抗層由来ＡＬＰ　Ｉ特
異抗体の製造方法に係る第一の発明を提供するものであ
る。

また更に本発明は、上記肺由来ＡＬＰ　Ｔ型アイソザイ
ムを動物に免疫し、得られるリンパ球と骨髄腫細胞とを
細胞融合せしめ、得られたハイブリドーマより肺由来Ａ
ＬＰ　Ｉ型アイソザイムに対して特異的に反応するハイ
ブリドーマを選択し、該ハイブリドーマによって抗体を
産生させることを特徴とする抗層由来ＡＬＰ　Ｉ特異抗
体の製造方法に係る第二の発明をも提供するものである
。

本発明で用いられる肺由来ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムは
、例えば脳実質障害患者の血清または脳皮質から分離精
製することにより得られる。より具体的には、例えば脳
障害時に得た脳皮質部分の試料より、Ａ、　０ｈｋｕｂ
ｏらの方法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　　２４９
７１７４〜７１８０．１９８４）に従って、２５％ｖ／
ｖ　ｎ−ブタノールまたは中性緩衝液で抽出し、精製す
ることによって得られる。

第一の発明を実施するには、肺由来ＡＬＰ　Ｉ型アイソ
ザイムを、例えばフロイント完全アジュバントを用いて
エマルジョンを調製し、マウス、ラット、ウシ、ウサギ
、ヒツジ等の動物に投与し、約１週間後にフロインド不
完全アジュバントを用いてエマルジョンを調製し、追加
投与を行なう。４回目以降に血清中に高い抗体価がみら
れるので、この抗血清を採取する。

かくして得られた抗血清中には、肺由来ＡＬＰＩ型アイ
ソザイムと特異的に反応する抗層由来ＡＬＰＩ特異抗体
のほかに、弁胴由来ＡＬＰ　Ｉ型、Ｈ型及び■型アイソ
ザイムと反応する抗体も含まれている。従って、この抗
血清を弁胴由来ＡＬＰ　Ｈ型及び■型アイソザイムを用
いて吸収すれば、弁胴由来■型、Ｈ型及び■型アイソザ
イムに反応する抗体が除去され、抗層由来ＡＬＰ　Ｉ特
異抗体が得られる。

第二の発明を実施するには、上のごとくして免疫した動
物の牌細胞等からリンパ球を採取し、これを骨髄腫細胞
と細胞融合することによりハイブリドーマを得、肺由来
ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムに対して特異的に反応する抗
体を産生ずるハイブリドーマを選択し、これを増殖培養
させる。この細胞融合、ハイブリドーマの選択は常法に
よって行なうことができる。更に当該ハイブリドーマを
培養または動物の腹腔内にて増殖せしめ、その培養物ま
たは腹水より抗体を採取することにより肺由来ＡＬＰ　
Ｉ型アイソザイムに特異的なモノクローナル抗体が得ら
れる。

［作用及び発明の効果］ 本発明者らの見出した肺由来ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイム
は分子量約１５万であり、従来知られていた分子量約２
００万のＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムとは物理化学的性質
が異なる。この新規なＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムが脳実
質障害患者血清中に出現することから、血清中の肺由来
ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムを測定することにより脳実質
障害の診断が可能となる。

従来、ＡＬＰアイソザイムの測定法としては、電気泳動
法、阻害剤による方法、熱処理法、ゲルろ適法、ノイラ
ミニダーゼ処理法等が知られている。

しかし、これらの方法では、ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイム
のうち、肺由来のもののみを選択的に測定することはで
きない。

また、免疫学的方法による測定方法も知られているが、
肺由来ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムの測定に必要な抗層由
来ＡＬＰ　Ｉ特異抗体が存在しながったため、この方法
により測定することもできながった。

本発明方法により得られる抗層由来ＡＬＰ　Ｉ特異抗体
を用いれば、肺由来ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムを免疫学
的に測定することが可能である。そして本特異抗体は、
特異抗体を用い得る免疫学的方法であれば、どの測定シ
ステムにも適用することができる。このような測定シス
テムとしては、例えば凝集反応、凝集阻止法、免疫拡散
法、免疫比濁法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、競合
反応法（固相法、第２抗体法）、標識物質を用いる測定
システムとしてはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）　、
エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）　、リポソームイ
ムノアッセイ（ＬＩＬＡ）　、蛍光イムノアッセイ（Ｆ
ＩＡ）、化学イムノアッセイ、金属イムノアッセイ、ス
ピンイムノアッセイ（５ＩＡ）等が挙げられる。

肺由来ＡＬＰ　Ｔ型アイソザイムを測定するには、例え
ば抗層由来ＡＬＰ　Ｉ特異抗体をマイクロプレート上に
固相化し、試料と反応させた後、標識化した特異抗体を
添加して結合させ、その結合量から試料中の肺由来ＡＬ
Ｐ　Ｉ型アイソザイムの量を測定する方法、ラテックス
粒子、赤血球等の微粒子に特異抗体を吸着させ、これと
試料とを反応させて生じる凝集の度合いから測定する方
法、特異抗体と試料とを液相中で反応させ、生じた濁度
から測定する方法等が好ましい。

また本方法に使用される試料としては、血清が特に好ま
しい 以上のように、本発明方法によって提供される抗層由来
ＡＬＰ　Ｉ特異抗体により、脳実質障害の診断に有用な
肺由来ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムの免疫学的測定が可能
となる。抗層由来ＡＬＰ　Ｉ特異抗体を用いた肺由来Ａ
ＬＰ　Ｉ型アイソザイムの測定法は、臨床検査分野で一
般的検査法としてルーチンに行なわれている血清学的検
査法によって行なえることから、特殊な機器及び技術が
必要ない、早期診断に適している、疾患のモニタリング
マーカーになる等の利点がある。

［実施例］ 以下、実施例を挙げて更に具体的に説明するが、本発明
はこれらに限定されるものではない。

実施例１ 由　ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムの ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムの認められる脳障害患者血清
より、硫安塩析、ゲルろ過、イオン交換及びアフィニテ
ィークロマトグラフィーを用いてＡＬＰアイソザイムを
分離精製した。

すなわち、患者血清に等量の飽和硫安を加えて攪拌後放
置し、沈殿物を遠心により回収し、用いた血清と等量の
水に溶解した。この操作を３回繰返し、３回目はできる
だけ少量の水に溶解した。

これを遠心して沈殿物を取り除き、その上清をセファデ
ックスＧ２００を用いたカラムクロマトグラフイーによ
りゲルろ過を行なった。溶出には、１０ｍＭＭｇＣ１２
２及び０．１５Ｍ　ＮａＣＵを含む０．２Ｍホウ酸緩衝
液を用いた。分子量１５万前後でＡＬＰ活性が認められ
た分画を回収し、５ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８
，０）で−夜透析し、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセ
ルロースカラムにかけイオン交換クロマトグラフィーを
行なった。この素通り分画はＩｇＧが主であり、ＡＬＰ
活性は認められなかった。そこで残りを０゜０１〜０．
３ＭのＮａＣ１１のグラジェントにより溶出させ、０．
０１〜００５Ｍに溶出されるＡＬＰ活性の高い分画をプ
ールし、限外ろ過により濃縮した。このものの精製度を
オフテロニーにより確認したところ、ＩｇＧ及びＩｇＡ
が認められたため、抗ヒトＩｇＧ及びＩｇＡ抗体を吸着
させたアフィニティーカラムにかけてＩｇＧ及びＩｇＡ
を除去した。

このようにして得られたＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムは、
最終的にセルロースアセテート膜電気泳動及び５ｌ）Ｓ
−ＰＡＧＥで精製度を確認した。

実施例２ 抗Ｊづ工作］ソ （ａ）ポリクローナル特異抗体の作製 実施例１で得たＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムをウサギに免
疫し、抗血清を得た。

初回は１ｍｇ相当の精製ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムをＩ
ＴＩＩσの完全フロインドアジュバントと混和し、頚〜
腰推近辺の皮下へ６〜８カ所、大腿筋肉内、足踵などへ
数多く注射した。２回目以降は、前回注射から１週間目
に１ｍｇ〜５００μｇ相当のＡＬＰ　Ｉ型アイソザイム
と不完全フロインドアジュバント１ｍ１２を混和し、頚
〜腰椎近辺の皮下へ数多く注射した。都合４回の免疫後
、１週間目に各ウサギより３０ｍｆｌの採血を行ない、
遠心分離して抗血清を得た。３〜４日間隔で２〜３回採
血し、１力月休養後、再度免疫して５日目に採血し、以
後３〜４日間隔で３回採血した。これを何回も繰返して
大量の抗血清を得、−２０℃で保存した。

精製脳由来ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムを活性化したセフ
ァロース４Ｂに共有結合させ、アフィニティーカラム（
以下脳由来Ｉ型−４Ｂカラムと称す）を作製した。また
同様にして弁胴由来■型−４Ｂカラム及び■型−４Ｂカ
ラムも作製した。

脳由来Ｉ型アイソザイムの抗血清より硫安分画法により
ＩｇＧを精製し、これを脳由来Ｉ型−４Ｂカラムに通し
て抗体を吸着させた。この時、抗原抗体反応が生じやす
いように、０．５Ｍの食塩を含む０．０２Ｍホウ酸緩衝
液（ｐＨ８，０）を使用した。よく洗浄後、■型−４Ｂ
カラムに０１５Ｍ食塩を含む０．０ＩＮ塩酸を徐々に滴
下し、ＯＤモニターにより溶出液の蛋白濃度を監視しつ
つ抗体を収集した。収集した精製抗体は、直ちに中性緩
衝液（０，１５Ｍ食塩を含む０．２Ｍホウ酸緩衝液、　
ｐＨ８，０）で塩析中和した。次にこの精製抗体を弁胴
由来■型−４Ｂカラム及び■型−４Ｂカラムに通し、吸
収操作を行なってポリクローナルＡＬＰ　Ｔ特異抗体を
得た。

（ｂ）モノクローナル特異抗体の作製 実施例１で得られた精製ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムをＢ
ＡＬＢ／Ｃ純系マウスに免疫し、１週間後層殺して肺細
胞を採取した。これをマウス由来培養株Ｐ３Ｕ、細胞と
１０：１の割合で混和し、ポリエチレングリコールＴｙ
ｐｅ　１０００を５０％となるように加えて細胞融合さ
せた。次いで１５％ウシ胎児血清及び抗生物質を含むＨ
ＡＴ−ＭＥＭ選択培地（ヒポキサンチン・アミノプテリ
ン・チミジンを含む最小必須培地）に上記融合細胞を加
え、９６穴マイクロプレートに各ｗｅｌｌ　３Ｘ　１０
’個の細胞浮遊液となるように入れ、３７℃、５％ＣＯ
２インキユベータで１４日間培養した。

培養上清のＡＬＰＴ型アイソザイムに対する抗体の有無
を、該アイソザイムを被覆したマイクロプレートを使用
し、ＥＬＩＳＡ法にて検討した。抗体陽性のｗｅｌｌか
ら細胞を採取し、ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養増殖せ
しめ、限界希釈法にて単一クローンとした。

脳由来ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムに特異的に反応するモ
ノクローナル抗体を産生ずるクローンのみを選択し、培
養増殖した。この株化したハイブリドーマは、ヌードマ
ウス腹腔内に播種し、腹水中に大量のモノクローナル特
異抗体を産生ずることを確認した。この腹水がら、硫安
分画を採り、ゲルろ過またはＤＥＡＥイオン交換樹脂カ
ラムにより、純粋なモノクローナル特異抗体が精製され
た。

実施例３ 実施例１で得た肺由来ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムと、大
脳皮質から分離精製した肺由来ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイ
ムを抗原とし、実施例２（ａ）で得られた洗脳由来ＡＬ
Ｐ　Ｉ特異抗体と反応させたところ、沈降線が完全にゆ
合し、それぞれのＡＬＰが同じ物質であることが分かっ
た（第１図）。

実施例４ 実施例１で得た肺由来ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイム、並び
に弁胴由来ＡＬＰ　ｎ型及び■型アイソザイムの混合物
を抗原とし、実施例２（ａ）で得た洗脳由来ＡＬＰ　Ｉ
特異抗体との反応を調べたところ、該特異抗体はＡＬＰ
　ＩＩと■の混合物とは全く沈降線を生じず（第２図）
、肺由来ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムに特異的であると言
える。

特異抗体が、肺由来ＡＬＰ　Ｉ型アイソザイムに特異的
であることを示す図である。

以

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の物理化学的性質 分子量　約１５，０００ 耐熱性（５６℃、５分）　残存活性約６０％ フェニルアラニン　阻害せず ＴｒｉｔｏｎＸ１００処理　泳動度不変 ノイラミニダーゼ処理　泳動度不変 を有する脳由来アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）Ｉ
   型アイソザイムを動物に免疫し、得られる抗血清を非脳
   由来ＡＬＰII型及びIII型アイソザイムで吸収すること
   を特徴とする抗脳由来ＡＬＰ I 特異抗体の製造方法。
2. （２）次の物理化学的性質 分子量　約１５，０００ 耐熱性（５６℃、５分）　残存活性約６０％ フェニルアラニン　阻害せず ＴｒｉｔｏｎＸ１００処理　泳動度不変 ノイラミニダーゼ処理　泳動度不変 を有する脳由来アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）Ｉ
   型アイソザイムを動物に免疫し、得られるリンパ球と骨
   髄腫細胞とを細胞融合せしめ、得られたハイブリドーマ
   より脳由来ＡＬＰ I 型アイソザイムに対して特異的に
   反応するハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマに
   よって抗体を産生させることを特徴とする抗脳由来ＡＬ
   Ｐ I 特異抗体の製造方法。