JP2686812B2 - 抗脳由来アルカリフォスファターゼｉ特異抗体の製造方法 - Google Patents
抗脳由来アルカリフォスファターゼｉ特異抗体の製造方法Info
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- JP2686812B2 JP2686812B2 JP1074730A JP7473089A JP2686812B2 JP 2686812 B2 JP2686812 B2 JP 2686812B2 JP 1074730 A JP1074730 A JP 1074730A JP 7473089 A JP7473089 A JP 7473089A JP 2686812 B2 JP2686812 B2 JP 2686812B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、脳障害の診断に有用な脳由来アルカリフォ
スファターゼ（ALP）Ｉ型アイソザイムの測定に使用す
る抗脳由来ALP I特異抗体の製造方法に関する。
スファターゼ（ALP）Ｉ型アイソザイムの測定に使用す
る抗脳由来ALP I特異抗体の製造方法に関する。
［従来の技術及びその課題］ 頭部外傷患者や脳血管障害患者では、最終的に脳実質
障害の程度が患者の転帰を決定すると言える。脳実質障
害の診断や評価の方法としては、神経学的方法、画像診
断法（コンピュータ連動断層撮影，磁気共鳴画像，血管
造影）、電気生理学的方法（脳波，誘発電位，脳圧測
定）などが用いられてきた。しかしながら、これらの測
定法は、特殊な機器及び技術が必要なため一般的ではな
く、また早期診断及びモニタリングは不適である等の問
題点がある。更に最近では、生化学的方法により、脳実
質障害の程度を定量的に評価しようという試みもある
が、未だ確立されているとは言えない。
障害の程度が患者の転帰を決定すると言える。脳実質障
害の診断や評価の方法としては、神経学的方法、画像診
断法（コンピュータ連動断層撮影，磁気共鳴画像，血管
造影）、電気生理学的方法（脳波，誘発電位，脳圧測
定）などが用いられてきた。しかしながら、これらの測
定法は、特殊な機器及び技術が必要なため一般的ではな
く、また早期診断及びモニタリングは不適である等の問
題点がある。更に最近では、生化学的方法により、脳実
質障害の程度を定量的に評価しようという試みもある
が、未だ確立されているとは言えない。
ところで、生体に広く分布する酵素であるALPは、そ
のアイソザイムとして、電気泳動法により、Ｉ型からVI
型までの６種の型が知られている。そして血清中のALP
アイソザイムの測定は、古くから肝、骨、胎盤、小腸等
の臨床診断に利用されている。これらのうち、ALP I型
アイソザイムは分子量約200万であり、悪性腫瘍、閉鎖
性黄疸の際に認められると報告されている。
のアイソザイムとして、電気泳動法により、Ｉ型からVI
型までの６種の型が知られている。そして血清中のALP
アイソザイムの測定は、古くから肝、骨、胎盤、小腸等
の臨床診断に利用されている。これらのうち、ALP I型
アイソザイムは分子量約200万であり、悪性腫瘍、閉鎖
性黄疸の際に認められると報告されている。
［課題を解決するための手段］ かかる実情において、本発明者らはALPアイソザイム
について研究を行なっていたところ、正常人血清中には
存在しないが、脳障害を起こした患者の血清中には、本
発明者によって見出された新規な脳由来ALP I型アイソ
ザイムが高頻度で認められること、更にこの脳由来ALP
I型アイソザイムは正常人血清中に存在するALP I型アイ
ソザイム（非脳由来ALP II型アイソザイムが細胞膜と結
合したもの。以下、「非脳由来ALP I型アイソザイム」
と称する。）とは物理化学的性質を異にすること、従っ
て、血清中の脳由来ALP I型アイソザイムの量を測定す
れば脳障害患者を診断できることを見出した。
について研究を行なっていたところ、正常人血清中には
存在しないが、脳障害を起こした患者の血清中には、本
発明者によって見出された新規な脳由来ALP I型アイソ
ザイムが高頻度で認められること、更にこの脳由来ALP
I型アイソザイムは正常人血清中に存在するALP I型アイ
ソザイム（非脳由来ALP II型アイソザイムが細胞膜と結
合したもの。以下、「非脳由来ALP I型アイソザイム」
と称する。）とは物理化学的性質を異にすること、従っ
て、血清中の脳由来ALP I型アイソザイムの量を測定す
れば脳障害患者を診断できることを見出した。
そして、本発明者らは、この脳由来ALP I型アイソザ
イムを免疫学的に測定せんと鋭意研究を行ない、当該ア
イソザイムに特異的な抗体を得ることに成功し、本発明
を完成した。
イムを免疫学的に測定せんと鋭意研究を行ない、当該ア
イソザイムに特異的な抗体を得ることに成功し、本発明
を完成した。
すなわち本発明は、次の物理化学的性質 分子量 約15,000 耐熱性（56℃,5分） 残存活性約60％ フェニルアラニン 阻害せず Triton X100処理 泳動度不変 ノイラミニダーゼ処理 泳動度不変 を有する脳由来ALP I型アイソザイムを動物に免疫し、
得られる抗血清を非脳由来ALP II型及びIII型アイソザ
イムで吸収することを特徴とする抗脳由来ALP I特異抗
体の製造方法に係る第一の発明を提供するものである。
得られる抗血清を非脳由来ALP II型及びIII型アイソザ
イムで吸収することを特徴とする抗脳由来ALP I特異抗
体の製造方法に係る第一の発明を提供するものである。
また更に本発明は、上記脳由来ALP I型アイソザイム
を動物に免疫し、得られるリンパ球と骨髄腫細胞とを細
胞融合せしめ、得られたハイブリドーマより脳由来ALP
I型アイソザイムに対して特異的に反応するハイブリド
ーマを選択し、該ハイブリドーマによって抗体を産生さ
せることを特徴とする抗脳由来ALP I特異抗体の製造方
法に係る第二の発明をも提供するものである。
を動物に免疫し、得られるリンパ球と骨髄腫細胞とを細
胞融合せしめ、得られたハイブリドーマより脳由来ALP
I型アイソザイムに対して特異的に反応するハイブリド
ーマを選択し、該ハイブリドーマによって抗体を産生さ
せることを特徴とする抗脳由来ALP I特異抗体の製造方
法に係る第二の発明をも提供するものである。
本発明で用いられる脳由来ALP I型アイソザイムは、
例えば脳実質障害患者の血清または脳皮質から分離精製
することにより得られる。より具体的には、例えば脳障
害時に得た脳皮質部分の試料より、A.Ohkuboらの方法
（J.Biol.Chem.,249,7174〜7180,1984）に従って、25％
v/v n−ブタノールまたは中性緩衝液で抽出し、精製す
ることによって得られる。
例えば脳実質障害患者の血清または脳皮質から分離精製
することにより得られる。より具体的には、例えば脳障
害時に得た脳皮質部分の試料より、A.Ohkuboらの方法
（J.Biol.Chem.,249,7174〜7180,1984）に従って、25％
v/v n−ブタノールまたは中性緩衝液で抽出し、精製す
ることによって得られる。
第一の発明を実施するには、脳由来ALP I型アイソザ
イムを、例えばフロインド完全アジュバントを用いてエ
マルジョンを調製し、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、
ヒツジ等の動物に投与し、約１週間後にフロインド不完
全アジュバントを用いてエマルジョンを調製し、追加投
与を行なう。４回目以降に血清中に高い抗体価がみられ
るので、この抗血清を採取する。
イムを、例えばフロインド完全アジュバントを用いてエ
マルジョンを調製し、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、
ヒツジ等の動物に投与し、約１週間後にフロインド不完
全アジュバントを用いてエマルジョンを調製し、追加投
与を行なう。４回目以降に血清中に高い抗体価がみられ
るので、この抗血清を採取する。
かくして得られた抗血清中には、脳由来ALP I型アイ
ソザイムと特異的に反応する抗脳由来ALP I特異抗体の
ほかに、非脳由来ALP I型、II型及びIII型アイソザイム
と反応する抗体も含まれている。従って、この抗血清を
非脳由来ALP II型及びIII型アイソザイムを用いて吸収
すれば、非脳由来Ｉ型、II型及びIII型アイソザイムに
反応する抗体が除去され、抗脳由来ALP I特異抗体が得
られる。
ソザイムと特異的に反応する抗脳由来ALP I特異抗体の
ほかに、非脳由来ALP I型、II型及びIII型アイソザイム
と反応する抗体も含まれている。従って、この抗血清を
非脳由来ALP II型及びIII型アイソザイムを用いて吸収
すれば、非脳由来Ｉ型、II型及びIII型アイソザイムに
反応する抗体が除去され、抗脳由来ALP I特異抗体が得
られる。
第二の発明を実施するには、上のごとくして免疫した
動物の脾細胞等からリンパ球を採取し、これを骨髄腫細
胞と細胞融合することによりハイブリドーマを得、脳由
来ALP I型アイソザイムに対して特異的に反応する抗体
を産生するハイブリドーマを選択し、これを増殖培養さ
せる。この細胞融合、ハイブリドーマの選択は常法によ
って行なうことができる。更に当該ハイブリドーマを培
養または動物の腹腔内にて増殖せしめ、その培養物また
は腹水より抗体を採取することにより脳由来ALP I型ア
イソザイムに特異的なモノクローナル抗体が得られる。
動物の脾細胞等からリンパ球を採取し、これを骨髄腫細
胞と細胞融合することによりハイブリドーマを得、脳由
来ALP I型アイソザイムに対して特異的に反応する抗体
を産生するハイブリドーマを選択し、これを増殖培養さ
せる。この細胞融合、ハイブリドーマの選択は常法によ
って行なうことができる。更に当該ハイブリドーマを培
養または動物の腹腔内にて増殖せしめ、その培養物また
は腹水より抗体を採取することにより脳由来ALP I型ア
イソザイムに特異的なモノクローナル抗体が得られる。
［作用及び発明の効果］ 本発明者らの見出した脳由来ALP I型アイソザイムは
分子量約15,000であり、従来知られていた分子量約200
万のALP I型アイソザイムとは物理化学的性質が異な
る。この新規なALP I型アイソザイムが脳実質障害患者
血清中に出現することから、血清中の脳由来ALP I型ア
イソザイムを測定することにより脳実質障害の診断が可
能となる。
分子量約15,000であり、従来知られていた分子量約200
万のALP I型アイソザイムとは物理化学的性質が異な
る。この新規なALP I型アイソザイムが脳実質障害患者
血清中に出現することから、血清中の脳由来ALP I型ア
イソザイムを測定することにより脳実質障害の診断が可
能となる。
従来、ALPアイソザイムの測定法としては、電気泳動
法、阻害剤による方法、熱処理法、ゲルろ過法、ノイラ
ミニダーゼ処理法等が知られている。しかし、これらの
方法では、ALP I型アイソザイムのうち、脳由来のもの
のみを選択的に測定することはできない。
法、阻害剤による方法、熱処理法、ゲルろ過法、ノイラ
ミニダーゼ処理法等が知られている。しかし、これらの
方法では、ALP I型アイソザイムのうち、脳由来のもの
のみを選択的に測定することはできない。
また、免疫学的方法による測定方法も知られている
が、脳由来ALP I型アイソザイムの測定に必要な抗脳由
来ALP I特異抗体が存在しなかったため、この方法によ
り測定することもできなかった。
が、脳由来ALP I型アイソザイムの測定に必要な抗脳由
来ALP I特異抗体が存在しなかったため、この方法によ
り測定することもできなかった。
本発明方法により得られる抗脳由来ALP I特異抗体を
用いれば、脳由来ALP I型アイソザイムを免疫学的に測
定することが可能である。そして本特異抗体は、特異抗
体を用い得る免疫学的方法であれば、どの測定システム
にも適用することができる。このような測定システムと
しては、例えば凝集反応、凝集阻止法、免疫拡散法、免
疫比漏法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、競合反応法
（固相法、第２抗体法）、標識物質を用いる測定システ
ムとしてはラジオイムノアッセイ（RIA）、エンザイム
イムノアッセイ（EIA）、リポソームイムノアッセイ（L
ILA）、蛍光イムノアッセイ（FIA）、化学イムノアッセ
イ、金属イムノアッセイ、スピンイムノアッセイ（SI
A）等が挙げられる。
用いれば、脳由来ALP I型アイソザイムを免疫学的に測
定することが可能である。そして本特異抗体は、特異抗
体を用い得る免疫学的方法であれば、どの測定システム
にも適用することができる。このような測定システムと
しては、例えば凝集反応、凝集阻止法、免疫拡散法、免
疫比漏法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、競合反応法
（固相法、第２抗体法）、標識物質を用いる測定システ
ムとしてはラジオイムノアッセイ（RIA）、エンザイム
イムノアッセイ（EIA）、リポソームイムノアッセイ（L
ILA）、蛍光イムノアッセイ（FIA）、化学イムノアッセ
イ、金属イムノアッセイ、スピンイムノアッセイ（SI
A）等が挙げられる。
脳由来ALP I型アイソザイムを測定するには、例えば
抗脳由来ALP I特異抗体をマイクロプレート上に固相化
し、試料と反応させた後、標識化した特異抗体を添加し
て結合させ、その結合量から試料中の脳由来ALP I型ア
イソザイムの量を測定する方法、ラテックス粒子、赤血
球等の微粒子に特異抗体を吸着させ、これと試料とを反
応させて生じる凝集の度合いから測定する方法、特異抗
体と試料とを液相中で反応させ、生じた濁度から測定す
る方法等が好ましい。
抗脳由来ALP I特異抗体をマイクロプレート上に固相化
し、試料と反応させた後、標識化した特異抗体を添加し
て結合させ、その結合量から試料中の脳由来ALP I型ア
イソザイムの量を測定する方法、ラテックス粒子、赤血
球等の微粒子に特異抗体を吸着させ、これと試料とを反
応させて生じる凝集の度合いから測定する方法、特異抗
体と試料とを液相中で反応させ、生じた濁度から測定す
る方法等が好ましい。
また本方法に使用される試料としては、血清が特に好
ましい。
ましい。
以上のように、本発明方法によって提供される抗脳由
来ALP I特異抗体により、脳実質障害の診断に有用な脳
由来ALP I型アイソザイムの免疫学的測定が可能とな
る。抗脳由来ALP I特異抗体を用いた脳由来ALP I型アイ
ソザイムの測定法は、臨床検査分野で一般的検査法とし
てルーチンに行なわれている血清学的検査法によって行
なえることから、特殊な機器及び技術が必要ない、早期
診断に適している、疾患のモニタリングマーカーになる
等の利点がある。
来ALP I特異抗体により、脳実質障害の診断に有用な脳
由来ALP I型アイソザイムの免疫学的測定が可能とな
る。抗脳由来ALP I特異抗体を用いた脳由来ALP I型アイ
ソザイムの測定法は、臨床検査分野で一般的検査法とし
てルーチンに行なわれている血清学的検査法によって行
なえることから、特殊な機器及び技術が必要ない、早期
診断に適している、疾患のモニタリングマーカーになる
等の利点がある。
［実施例］ 以下、実施例を挙げて更に具体的に説明するが、本発
明はこれらに限定されるものではない。
明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ 脳由来ALP I型アイソザイムの精製 ALP I型アイソザイムの認められる脳障害患者血清よ
り、硫安塩析、ゲルろ過、イオン交換及びアフィニティ
ークロマトグラフィーを用いてALPアイソザイムを分離
精製した。
り、硫安塩析、ゲルろ過、イオン交換及びアフィニティ
ークロマトグラフィーを用いてALPアイソザイムを分離
精製した。
すなわち、患者血清に等量の飽和硫安を加えて攪拌後
放置し、沈殿物を遠心により回収し、用いた血清と等量
の水に溶解した。この操作を３回繰返し、３回目はでき
るだけ少量の水に溶解した。これを遠心して沈殿物を取
り除き、その上清をセファデックスG200を用いたカラム
クロマトグラフィーによりゲルろ過を行なった。溶出に
は、10mM MgCl2及び0.15M NaClを含む0.2Mホウ酸緩衝液
を用いた。分子量15万前後でALP活性が認められ分画を
回収し、5mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）で一夜透析
し、同緩衝液で平衡化したDEAEセルロースカラムにかけ
イオン交換クロマトグラフィーを行なった。この素通り
分画はIgGが主であり、ALP活性は認められなかった。そ
こで残りを0.01〜0.3MのNaClのグラジエントにより溶出
させ、0.01〜0.05Mに溶出されるALP活性の高い分画をプ
ールし、限外ろ過により濃縮した。このものの精製度を
オクテロニーにより確認したところ、IgG及びIgAが認め
られたため、抗ヒトIgG及びIgA抗体を吸着させたアフィ
ニティーカラムにかけてIgG及びIgAを除去した。
放置し、沈殿物を遠心により回収し、用いた血清と等量
の水に溶解した。この操作を３回繰返し、３回目はでき
るだけ少量の水に溶解した。これを遠心して沈殿物を取
り除き、その上清をセファデックスG200を用いたカラム
クロマトグラフィーによりゲルろ過を行なった。溶出に
は、10mM MgCl2及び0.15M NaClを含む0.2Mホウ酸緩衝液
を用いた。分子量15万前後でALP活性が認められ分画を
回収し、5mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）で一夜透析
し、同緩衝液で平衡化したDEAEセルロースカラムにかけ
イオン交換クロマトグラフィーを行なった。この素通り
分画はIgGが主であり、ALP活性は認められなかった。そ
こで残りを0.01〜0.3MのNaClのグラジエントにより溶出
させ、0.01〜0.05Mに溶出されるALP活性の高い分画をプ
ールし、限外ろ過により濃縮した。このものの精製度を
オクテロニーにより確認したところ、IgG及びIgAが認め
られたため、抗ヒトIgG及びIgA抗体を吸着させたアフィ
ニティーカラムにかけてIgG及びIgAを除去した。
このようにして得られたALP I型アイソザイムは、最
終的にセルロースアセテート膜電気泳動及びSDS−PAGE
で精製度を確認した。
終的にセルロースアセテート膜電気泳動及びSDS−PAGE
で精製度を確認した。
実施例２ 抗体の作製 （ａ）ポリクローナル特異抗体の作製 実施例１で得たALP I型アイソザイムをウサギに免疫
し、抗血清を得た。
し、抗血清を得た。
初回は1mg相当の精製ALP I型アイソザイムを1mlの完
全フロインドアジュバントと混和し、頚〜腰椎近辺の皮
下へ６〜８ヵ所、大腿筋肉内、足蹠などへ数多く注射し
た。２回目以降は、前回注射から１週間目に1mg〜500μ
ｇ相当のALP I型アイソザイムと不完全フロインドアジ
ュバント1mlを混和し、頚〜腰椎近辺の皮下へ数多く注
射した。都合４回の免疫後、１週間目各ウサギより30ml
の採血を行ない、遠心分離して抗血清を得た。３〜４日
間隔で２〜３回採血し、、１ヵ休養後、再度免疫して５
日目に採血し、以後３〜４日間隔で３回採血した。これ
を何回も繰返して大量の抗血清を得、−20℃で保存し
た。
全フロインドアジュバントと混和し、頚〜腰椎近辺の皮
下へ６〜８ヵ所、大腿筋肉内、足蹠などへ数多く注射し
た。２回目以降は、前回注射から１週間目に1mg〜500μ
ｇ相当のALP I型アイソザイムと不完全フロインドアジ
ュバント1mlを混和し、頚〜腰椎近辺の皮下へ数多く注
射した。都合４回の免疫後、１週間目各ウサギより30ml
の採血を行ない、遠心分離して抗血清を得た。３〜４日
間隔で２〜３回採血し、、１ヵ休養後、再度免疫して５
日目に採血し、以後３〜４日間隔で３回採血した。これ
を何回も繰返して大量の抗血清を得、−20℃で保存し
た。
精製脳由来ALP I型アイソザイムを活性化したセファ
ロース4Bに共有結合させ、アフィニティーカラム（以下
脳由来Ｉ型−4Bカラムと称す）を作製した。また同様に
して非脳由来II型−4Bカラム及びIII型−4Bカラムも作
製した。
ロース4Bに共有結合させ、アフィニティーカラム（以下
脳由来Ｉ型−4Bカラムと称す）を作製した。また同様に
して非脳由来II型−4Bカラム及びIII型−4Bカラムも作
製した。
脳由来Ｉ型アイソザイムの抗血清より硫安分画法によ
りIgGを精製し、これを脳由来Ｉ型−4Bカラムに通して
抗体を吸着させた。この時、抗原抗体反応が生じやすい
ように、0.5Mの食塩を含む0.02Mホウ酸緩衝液（pH8.0）
を使用した。よく洗浄後、Ｉ型−4Bカラムに0.15M食塩
を含む0.01N塩酸を徐々に滴下し、ODモニターにより溶
出液の蛋白濃度を監視しつつ抗体を収集した。収集した
精製抗体は、直ちに中性緩衝液（0.15M食塩を含む0.2M
ホウ酸緩衝液,pH8.0）で塩析中和した。次のこの精製抗
体を非脳由来II型−4Bカラム及びIII型−4Bカラムに通
し、吸収操作を行なってポリクローナルALP I特異抗体
を得た。
りIgGを精製し、これを脳由来Ｉ型−4Bカラムに通して
抗体を吸着させた。この時、抗原抗体反応が生じやすい
ように、0.5Mの食塩を含む0.02Mホウ酸緩衝液（pH8.0）
を使用した。よく洗浄後、Ｉ型−4Bカラムに0.15M食塩
を含む0.01N塩酸を徐々に滴下し、ODモニターにより溶
出液の蛋白濃度を監視しつつ抗体を収集した。収集した
精製抗体は、直ちに中性緩衝液（0.15M食塩を含む0.2M
ホウ酸緩衝液,pH8.0）で塩析中和した。次のこの精製抗
体を非脳由来II型−4Bカラム及びIII型−4Bカラムに通
し、吸収操作を行なってポリクローナルALP I特異抗体
を得た。
（ｂ）モノクローナル特異抗体の作製 実施例１で得られた精製ALP I型アイソザイムをBALB/
C純系マウスに免疫し、１週間後署殺して脾細胞を採取
した。これをマウス由来培養株P3U1細胞と10:1の割合で
混和し、ポリエチレングリコールType 1000を50％とな
るように加えて細胞融合させた。次いで15％ウシ胎児血
清及び抗生物質を含むHAT−MEM選択培地（ヒポキサンチ
ン・アミノプテリン・チミジンを含む最小必須培地）に
上記融合細胞を加え、96穴マイクロプレートに各well3
×104個の細胞浮遊液となるように入れ、37℃、５％CO2
インキュベータで14日間培養した。培養上清のALP I型
アイソザイムに対する抗体の有無を、該アイソザイムを
被覆したマイクロプレートを使用し、ELISA法にて検討
した。抗体陽性のwellから細胞を採取し、RPMI−1640倍
地で培養増殖せしめ、限界希釈法にて単一クローンとし
た。脳由来ALP I型アイソザイムに特異的に反応するモ
ノクローナル抗体を産生するクローンのみを選択し、培
養増殖した。この株化したハイブリドーマは、ヌードマ
ウス腹腔内に播種し、腹水中に大量のコノクローナル特
異抗体を産生することを確認した。この腹水から、硫安
分画を採り、ゲルろ過またはDEAEイオン交換樹脂カラム
により、純粋なモノクローナル特異抗体が精製された。
C純系マウスに免疫し、１週間後署殺して脾細胞を採取
した。これをマウス由来培養株P3U1細胞と10:1の割合で
混和し、ポリエチレングリコールType 1000を50％とな
るように加えて細胞融合させた。次いで15％ウシ胎児血
清及び抗生物質を含むHAT−MEM選択培地（ヒポキサンチ
ン・アミノプテリン・チミジンを含む最小必須培地）に
上記融合細胞を加え、96穴マイクロプレートに各well3
×104個の細胞浮遊液となるように入れ、37℃、５％CO2
インキュベータで14日間培養した。培養上清のALP I型
アイソザイムに対する抗体の有無を、該アイソザイムを
被覆したマイクロプレートを使用し、ELISA法にて検討
した。抗体陽性のwellから細胞を採取し、RPMI−1640倍
地で培養増殖せしめ、限界希釈法にて単一クローンとし
た。脳由来ALP I型アイソザイムに特異的に反応するモ
ノクローナル抗体を産生するクローンのみを選択し、培
養増殖した。この株化したハイブリドーマは、ヌードマ
ウス腹腔内に播種し、腹水中に大量のコノクローナル特
異抗体を産生することを確認した。この腹水から、硫安
分画を採り、ゲルろ過またはDEAEイオン交換樹脂カラム
により、純粋なモノクローナル特異抗体が精製された。
実施例３ 実施例１で得た脳由来ALP Iアイソザイムと、大脳皮
質から分離精製した脳由来ALP I型アイソザイムを抗原
とし、実施例２（ａ）で得られた抗脳由来ALP I特異抗
体と反応させたところ、沈降線が完全にゆ合し、それぞ
れのALPが同じ物質であることが分かった（第１図）。
質から分離精製した脳由来ALP I型アイソザイムを抗原
とし、実施例２（ａ）で得られた抗脳由来ALP I特異抗
体と反応させたところ、沈降線が完全にゆ合し、それぞ
れのALPが同じ物質であることが分かった（第１図）。
実施例４ 実施例１で得た脳由来ALP I型アイソザイム、並びに
非脳由来ALP II型及びIII型アイソザイムの混合物を抗
原とし、実施例２（ａ）で得た抗脳由来ALP I型特異抗
体との反応を調べたところ、該特異抗体はALP IIとIII
の混合物とは全く沈降線を生じず（第２図）、脳由来AL
P I型アイソザイムに特異的であると言える。
非脳由来ALP II型及びIII型アイソザイムの混合物を抗
原とし、実施例２（ａ）で得た抗脳由来ALP I型特異抗
体との反応を調べたところ、該特異抗体はALP IIとIII
の混合物とは全く沈降線を生じず（第２図）、脳由来AL
P I型アイソザイムに特異的であると言える。
第１図は、実施例で得られた脳障害患者の血清から分離
精製したALP Iと大脳皮質から分離精製したALP Iとが同
一物質であることを示す図、第２図は、本発明で得られ
たポリクローナルALP I特異抗体が、脳由来ALP I型アイ
ソザイムに特異的であることを示す図である。
精製したALP Iと大脳皮質から分離精製したALP Iとが同
一物質であることを示す図、第２図は、本発明で得られ
たポリクローナルALP I特異抗体が、脳由来ALP I型アイ
ソザイムに特異的であることを示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｃｈｕｎｇ−ｈｕａ Ｉ Ｈｓｕｅｈ Ｃｈｉｅｎ Ｙｅｎ Ｔｓａ Ｃｈｉ ｈ，３（１） （1980） Ｐ．19−24
Claims (2)
- 【請求項１】次の物理化学的性質 分子量 約15,000 耐熱性（56℃,5分） 残存活性約60％ フェニルアラニン 阻害せず Triton X100処理 泳動度不変 ノイラミニダーゼ処理 泳動度不変 を有する脳由来アルカリフォスファターゼ（ALP）Ｉ型
アイソザイムを動物に免疫し、得られる抗血清を非脳由
来ALP II型及びIII型アイソザイムで吸収することを特
徴とする抗脳由来ALP I特異抗体の製造方法。 - 【請求項２】次の物理化学的性質 分子量 約15,000 耐熱性（56℃,5分） 残存活性約60％ フェニルアラニン 阻害せず Triton X100処理 泳動度不変 ノイラミニダーゼ処理 泳動度不変 を有する脳由来アルカリフォスファターゼ（ALP）Ｉ型
アイソザイムを動物に免疫し、得られるリンパ球と骨髄
腫細胞とを細胞融合せしめ、得られたハイブリドーマよ
り脳由来ALP I型アイソザイムに対して特異的に反応す
るハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマによって
抗体を産生させることを特徴とする抗脳由来ALP I特異
抗体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1074730A JP2686812B2 (ja) | 1989-03-27 | 1989-03-27 | 抗脳由来アルカリフォスファターゼｉ特異抗体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1074730A JP2686812B2 (ja) | 1989-03-27 | 1989-03-27 | 抗脳由来アルカリフォスファターゼｉ特異抗体の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02253164A JPH02253164A (ja) | 1990-10-11 |
| JP2686812B2 true JP2686812B2 (ja) | 1997-12-08 |
Family
ID=13555635
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1074730A Expired - Lifetime JP2686812B2 (ja) | 1989-03-27 | 1989-03-27 | 抗脳由来アルカリフォスファターゼｉ特異抗体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2686812B2 (ja) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6089209A (ja) * | 1983-10-20 | 1985-05-20 | Mitsubishi Electric Corp | 監視装置 |
| JPS6154509A (ja) * | 1984-08-23 | 1986-03-18 | Meidensha Electric Mfg Co Ltd | プロセス設備の故障表示装置 |
| JPS62229496A (ja) * | 1986-03-31 | 1987-10-08 | 株式会社山武 | 警報内容の識別表示方法 |
-
1989
- 1989-03-27 JP JP1074730A patent/JP2686812B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｃｈｕｎｇ−ｈｕａ Ｉ Ｈｓｕｅｈ Ｃｈｉｅｎ Ｙｅｎ Ｔｓａ Ｃｈｉｈ，３（１） （１９８０） Ｐ．１９−２４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02253164A (ja) | 1990-10-11 |
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