KR101264216B1 - 항-5ｔ4 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-5T4 항체, 항-5T4 항체/약물 접합체 및 이를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.
항-5T4 항체, 항-5T4 항체/약물 접합체, 칼리케아미신, 5T4-양성 암

Description

항-5Ｔ4 항체 및 이의 용도{Anti-5T4 antibodies and uses thereof}
관련 출원
2007년 2월 23일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/891,248호 및 2006년 3월 10일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/781,346호를 우선권으로 청구하며, 이들 각각은 전문이 본원에 참조로 인용된다.
본 발명은 일반적으로 신생물성 또는 악성 질환의 진단 및/또는 치료를 위한 항-5T4 항체 및 항체/약물 접합체(즉, 면역접합체)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항-5T4 항체 및 항체/약물 접합체를 제조하기 위한 분리된 가변 영역 핵산 및 폴리펩타이드에 관한 것이다.
고 친화성 모노클로날 항체의 유용성은 표적화된 면역요법의 개발을 촉진시켜왔다. 이러한 접근법에 따르면, 치료제를 한정된 표적 세포 집단에 대한 결합 특이성을 갖는 항체에 커플링시킨다. 모노클로날 항체에 접합된 치료제에는 세포독소(cytotoxin), 생물학적 반응 개질제, 효소(예를 들면, 리보뉴클레아제), 아폽토시스(apoptosis)-유도 단백질 및 펩타이드 및 방사성 동위원소가 포함된다. 항체/세포독소 접합체는 일반적으로 면역세포독소라고 한다. 메토트렉세이트와 같은 저-분자량 약물에 커플링된 항체는 통상적으로 화학항체/약물 접합체로 불린다. 면역조절제로서 기술되는 접합체는 림포카인, 성장 인자 및 보체-활성화 코브라 뱀독 인자(CVF)와 같은 생물학적 반응 개질제를 함유한다. 방사성 표지된 항체는 방사성요법 및 영상화에 사용될 수 있는 방사성 동위원소를 포함한다.
종양 세포로의 항체-매개된 약물 전달은 정상 조직에서 이의 흡수를 최소화시킴으로써 약물 효능을 증강시킨다[참조: Reff et al. (2002) Cancer Control 9:152-66; Sievers (2000) Cancer Chemother. Pharmacol. 46 Suppl:S18-22; Goldenberg (2001) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39:195-201]. MYLOTARG®(겜투즈마브 오조가미신)은 당해 원리에 따라 작동하고 노인 환자에서 급성 골수성 백혈병 치료용으로 허가된 시판되는 표적화된 면역요법제이다[참조: Sievers et al. (1999) Blood 93: 3678-84]. 이러한 경우에, 표적화 분자는 칼리케아미신에 접합된 항-CD33 모노클로날 항체이다.
그럼에도 불구하고, 사람에서 표적화된 면역요법은 비-사람 모노클로날 항체에 대한 부작용으로 인하여 일부 제한되어 왔다. 설치류 항체를 사용한 초기 임상 시험은, 사람 항-마우스 항체(HAMA) 및 사람 항-랫트 항체(HARA) 반응이 신속한 항체 제거(clearance)를 초래함을 입증하였다. 유전자이식된(transgenic) 마우스 또는 파아지 디스플레이 라이브러리(phage display library)를 사용하여 제조한, 키메릭(chimeric) 항체, 사람화된 항체, PRIMATIZED® 항체 및 사람 항체를 포함하는 면역원성 항체는 현재까지 많이 개발되지 않았다[참조: Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-5; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-33; Newman et al. (1992) Biotechnology (NY) 10:1455-60; Green et al.(1994) Nat. Genet. 7:13-21; Marks et al.(1991) J. Mol. Biol. 222:581-97]. HAMA 반응을 피하게 되면, 치료학적 반응을 달성하기 위해 높은 투여량 및 반복된 투여량 투여를 허용할 수 있다.
약물 표적화용 후보 항체에는 종양태아(oncofetal) 항원, 즉, 태아 세포 및 신생물 세포에 존재하고, 정상 성인 세포에는 주로 존재하지 않는 항원을 인지하는 항체가 포함된다[참조: Magdelenat (1992) J. Immunol. Methods 150: 133-43]. 5T4 종양태아 항원은 42 kDa의 비-글리코실화된 코어를 포함하는 72 kDa의 고도로 글리코실화된 막관통(transmembrane) 당단백질이다[참조: Hole et al. (1988) Br. J. Cancer 57: 239-46, Hole et al. (1990) Int. J. Cancer 45: 179-84; PCT 국제 특허 공보 제WO89/07947호; 미국 특허 제5,869,053호]. 5T4는 2개의 류신-풍부 반복부(LRR) 및 표적화된 요법에 사용가능한 부위인 개재(intervening) 친수성 영역을 특징으로 하는 세포외 도메인을 포함한다[참조: Myers et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9319-24].
사람 5T4는 방광, 유방, 자궁경부, 자궁내막, 폐, 식도, 난소, 췌장, 위 및 고환의 암종을 비롯한 다양한 암 종류에서 발현되며, 태반내 융합세포영양막(syncytiotrophoblast)을 제외하고는, 실질적으로 정상 조직에 존재하지 않는다[참조: Southall et al. (1990) Br. J. Cancer 61: 89-95 (immunohistological distribution of 5T4 antigen in normal and malignant tissues); Mieke et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3: 1923-1930 (low intercellular adhesion molecule 1 and high 5T4 expression on tumor cell correlate with reduced disease-free survival in colorectal carcinoma patients); Starzynska et al. (1994) Br. J. Cancer 69: 899-902 (prognostic significance of 5T4 oncofetal antigen expression in colorectal carcinoma); Starzynska et al. (1992) Br. J. Cancer 66: 867-869 (expression of 5T4 antigen in colorectal and gastric carcinoma); Jones et al. (1990) Br. J. Cancer 61: 96-100 (expression of 5T4 antigen in cervical cancer); Connor and Stern (199) Int. J. Cancer 46: 1029-1034 (loss of MHC class-I expression in cervical carcinomas); Ali et al. (2001) Oral Oncology 37: 57-64 (pattern of expression of the 5T4 oncofoetal antigen on normal, dysplastic and malignant oral mucosa); PCT 국제 특허공보 제WO89/07947호; 미국 특허 제5,869,053호]. 예를 들어, 5T4가 발현되지 않는 것으로 보고된 조직에는 간, 피부, 비장, 흉선, 중추신경계(CNS), 부신 및 난소가 포함된다. 5T4가 국소적으로 또는 낮게 발현되는 것으로 보고된 조직에는 간, 피부, 비장, 림프절, 편도, 갑상선, 전립선 및 정낭이 포함된다. 5T4의 약한-보통의 광범위한 발현은 신장, 폐, 췌장, 인두 및 위장관에서 보고되었다. 5T4가 고도로 발현되는 것으로 보고된 유일한 조직은 융합세포영양막이며; 5T4는 정상 혈청 또는 임신한 여성의 혈청에는 존재하지 않는다(즉, 10 ng/ml 미만의 수준). 종양에서 5T4의 과발현은 질병 진행과 관련되어 있으며, 5T4 발현의 평가는 단기간 예후를 이용하여 환자를 확인하는데 유용한 접근법으로서 제안되어 왔다[참조: Mulder et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3: 1923-30, Naganuma et al. (2002) Anticancer Res. 22: 1033-1038, Starzynska et al. (1994) Br. J. Cancer 69: 899-902, Starzynska et al. (1998) Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 10: 479-484, Wrigley et al. (1995) Int. J. Gynecol. Cancer 5: 269-274].
5T4 항원의 입체적 에피토프(conformational epitope)를 인지하는, H8 항체라고도 하는 mAb5T4[참조: Shaw et al. (2002) Biochem. J. 363: 137-45, PCT 국제 특허공보 제WO98/55607호], 랫트 모노클로날 항체[참조: Woods et al. (2002) Biochem. J. 366: 353-65], 및 5T4로 불리는 마우스 모노클로날 항체(미국 특허 제5,869,053호)를 포함하는 몇몇 항-5T4 항체들이 기술되어 있다. 단일 쇄 항-5T4 항체 및 치료용 분자에 융합된 항-5T4 항체 서열을 포함하는 융합 단백질이 또한 기술된 바 있다. 예를 들면, 사람 IgG1 불변 도메인 또는 쥐 B7.1의 세포외 도메인에 융합된 항-5T4 항체 서열은 5T4를 발현하는 종양 세포주의 세포용해를 유도한다[참조: Myers et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9: 884-896, Shaw et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta. 1524: 238-246; 미국 특허원 공보 제2003/0018004호]. 유사하게, 슈퍼항원에 융합된 단일 쇄 항-5T4 항체는 시험관내에서 비-소세포 폐 암종 세포의 T 세포-의존성 세포용해를 자극할 수 있다[참조: Forsberg et al. (2001) Br. J. Cancer 85: 129-136]. PNU-214936, 즉 돌연변이된 슈퍼항원 스타필로코커스 장세포독소(staphylococcal enterocytotoxin) A(SEA)에 융합된 모노클로 날 항체 5T4의 쥐 Fab 단편을 사용한 임상 1기 시험에서, 제한된 독성 및 일부 항-종양 반응이 나타났다[참조: Cheng et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22(4):602-609]. 대안적인 치료학적 접근법으로서, 재조합 5T4 백신이 또한 암 치료용으로 제안되고 있다[참조: Mulryan et al. (2002) Mol. Cancer Ther. 1: 1129-37; 영국 특허원 공보 제2,370,571호 및 제2,378,704호; EP 특허원 공보 제EP 1,160,323호 및 제1,152,060호].
본 발명은 신규 항-5T4 항체, 항-5T4/약물 접합체, 상기 기술된 항체 및 항체/약물 접합체를 제조하는 방법 및 이들의 진단학적 및 치료학적 사용 방법을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 신규한 항-5T4 항체, 이의 접합체 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. 또한, 분리된 항-5T4 폴리펩타이드 및 이를 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다.
본 발명의 항-5T4 항체에는 (a) 쥐 A1, A2 또는 A3 항체의 항원 결합 도메인을 포함하거나; (b) 5T4 결합에 대해 쥐 A1, A2 또는 A3 항체와 경쟁하거나; (c) A1, A2 또는 A3 항체에 의해 결합되는 5T4 에피토프에 결합하거나; (d) 상기 (a) 내지 (c)의 항체의 5T4-결합 단편을 포함하는, 사람 5T4 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 포함된다. 본 발명의 항-5T4 항체는 키메릭 항체, 사람화된 항체, 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab)2 단편, Fv 단편, 4량체 항체, 4가 항체, 다중특이적 항체, 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 융합 단백질 또는 쥐 모노클로날 항체일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 사람화된 항-5T4 항체에는 하나 이상의 중쇄 가변 영역 또는 하나 이상의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체가 포함되며, 여기서 당해 사람화된 항체 또는 항체 단편은 (a) 쥐 A1, A2 또는 A3 항체의 항원 결합 도메인을 포함하거나; (b) 5T4 결합에 대해 쥐 A1, A2 또는 A3 항체와 경쟁하거나; (c) A1, A2 또는 A3 항체에 의해 결합되는 5T4 에피토프에 결합하거나; (d) 상기 (a) 내지 (c)의 항체의 5T4-결합 단편을 포함한다.
본 발명의 항-5T4 항체는 사람 5T4 항원에 대해 적어도 약 1 x 10-7 M 내지 약 1 x 10-12 M의 결합 친화도를 갖는다. 기술된 항-5T4 항체 및 이의 접합체는 생체 내에서 5T4-발현 세포의 표적화에 의해 특이적인 결합을 나타낼 수도 있다.
본 발명의 대표적 항-5T4 항체에는 (a) 서열번호 2의 잔기 20-138의 아미노산 서열; (b) 서열번호 2의 잔기 20-138과 85% 이상 동일한 아미노산 서열; (c) 서열번호 6의 잔기 19-135의 아미노산 서열; (d) 서열번호 6의 잔기 19-135와 86% 이상 동일한 아미노산 서열; (e) 서열번호 10의 잔기 20-141의 아미노산 서열; (f) 서열번호 10의 잔기 20-141과 91% 이상 동일한 아미노산 서열; (g) 서열번호 49, 51, 52, 54, 56, 77, 78, 81 또는 82 중 어느 하나의 아미노산 서열; (h) 서열번호 51과 91% 이상 동일한 아미노산 서열; (i) 서열번호 54와 78% 이상 동일한 아미노산 서열; (j) 서열번호 77과 89% 이상 동일한 아미노산 서열; (k) 서열번호 78과 79% 이상 동일한 아미노산 서열; (l) 서열번호 81과 80% 이상 동일한 아미노산 서열; 또는 (m) 서열번호 82와 78% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체가 포함된다.
본 발명의 대표적 항-5T4 항체에는 (a) 서열번호 4의 잔기 21-127의 아미노산 서열; (b) 서열번호 4의 잔기 21-127과 94% 이상 동일한 아미노산 서열; (c) 서열번호 8의 잔기 23-130의 아미노산 서열; (d) 서열번호 8의 잔기 23-130과 96% 이상 동일한 아미노산 서열; (e) 서열번호 12의 잔기 21-127의 아미노산 서열; (f) 서열번호 12의 잔기 21-127과 98% 이상 동일한 아미노산 서열; (g) 서열번호 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 79, 80, 83 또는 84 중 어느 하나의 아미노산 서열; (h) 서열번호 60과 83% 이상 동일한 아미노산 서열; (i) 서열번호 70과 93% 이상 동일한 아미노산 서열; (j) 서열번호 76과 85% 이상 동일한 아미노산 서열; (k) 서열번호 76과 85% 이상 동일한 아미노산 서열; (l) 서열번호 79와 88% 이상 동일한 아미노산 서열; (m) 서열번호 80과 84% 이상 동일한 아미노산 서열; (n) 서열번호 83과 90% 이상 동일한 아미노산 서열; 또는 (o) 서열번호 84와 91% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체가 포함된다.
예를 들면, 항-5T4 항체는 (a) 서열번호 2의 잔기 20-138의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4의 잔기 21-127의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; (b) 서열번호 6의 잔기 19-135로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 잔기 23-130으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 (c) 서열번호 10의 잔기 20-141로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 12의 잔기 21-127로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 키메릭 및 사람화된 항-5T4 항체는 사람 카파 경쇄 불변 영역으로부터 유래된 사람 경쇄 불변 영역 및 사람 IgG1로부터 유래된 사람 중쇄 불변 영역 또는 사람 IgG4 중쇄 불변 영역과 같은 사람 불변 영역으로부터 유래된 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 대표적 사람화된 항-5T4 항체에는 (a) 사람 항체 골격(framework) 영역의 잔기를 포함하는 골격 영역; 및 (b) 서열번호 4, 8 또는 12의 경쇄 가변 영역의 하나 이상의 CDR 또는 서열번호 2, 6 또는 10의 중쇄 가변 영역의 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체가 포함된다. 예를 들면, 사람 항체 골격 영역의 잔기는 (a) DPK24 서브그룹 IV 생식세포 계열(germ line) 클론, VκIII 서브그룹 (DPK23, DPK22, DPK20, DPK21), 또는 VκI 서브그룹 생식세포 계열 클론 (DPK9, DPK1, O2, DPK7)의 사람 항체 경쇄 골격 영역; (b) DP-21 (VH7), DP-54 (VH3-07), DP-47 (VH3-23), DP-53 (VH-74), DP-49 (VH3-30), DP-48 (VH3-13), DP-75, DP-8 (VH1-2), DP-25, VI-2b 및 VI-3 (VH1-03), DP-15 및 V1-8 (VH1-08), DP-14 및 V1-18 (VH1-18), DP-5 및 V1-24P (VH1-24), DP-4 (VH1-45), DP-7 (VH1-46), DP-10, DA-6 및 YAC-7 (VH1-69), DP-88 (VH1-e), DP-3 및 DA-8 (VH1-f)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사람 항체 중쇄 골격 영역; (c) 상기 (b)의 중쇄 골격 영역의 컨센서스(consensus) 서열; 또는 (d) 상기 (a) 내지 (c)의 골격 영역과 63% 이상 동일한 골격 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 대표적 사람화된 항-5T4 항체는 또한 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 또 는 12의 2개 이상의 CDR, 예를 들면, 서열번호 4, 8 또는 12의 경쇄 가변 영역의 2개 또는 모든 3개의 CDR, 또는 서열번호 2, 6 또는 10의 중쇄 가변 영역의 2개 또는 모든 3개의 CDR, 또는 서열번호 4, 8 또는 12의 경쇄 가변 영역의 하나 이상의 CDR 및 서열번호 2, 6 또는 12의 중쇄 가변 영역의 하나 이상의 CDR, 또는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12의 모든 CDR을 포함할 수 있다.
본 발명의 대표적 키메릭 및 사람화된 항-5T4 항체에는 (a) 서열번호 2의 잔기 20-138의 아미노산 서열; (b) 서열번호 2의 잔기 20-138과 85% 이상 동일한 아미노산 서열; (c) 서열번호 6의 잔기 19-135의 아미노산 서열; (d) 서열번호 6의 잔기 19-135와 86% 이상 동일한 아미노산 서열; (e) 서열번호 10의 잔기 20-141의 아미노산 서열; (f) 서열번호 10의 잔기 20-141과 91% 이상 동일한 아미노산 서열; (g) 서열번호 49의 잔기 1-119의 아미노산 서열; (h) 서열번호 49의 잔기 1-119와 90% 이상 동일한 아미노산 서열; 또는 (i) 도 9A 내지 9C에 도시된 사람화된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체가 포함된다.
본 발명의 추가의 키메릭 및 사람화된 항-5T4 항체에는 (a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 58-414의 뉴클레오타이드 서열; (b) 서열번호 5의 뉴클레오타이드 55-405의 뉴클레오타이드 서열; (c) 서열번호 9의 뉴클레오타이드 58-423의 뉴클레오타이드 서열; (d) 서열번호 48의 뉴클레오타이드 1-358의 뉴클레오타이드 서열; (e) 도 9A 내지 9C에 도시된 사람화된 A1, A2 또는 A3 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (f) 상기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열과 90% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열; 또는 (g) 엄중한(stringent) 하이브리드화 조건 하에서 상기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나의 상보체에 특이적으로 하이브리드화하는 핵산을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체가 포함된다.
대표적 키메릭 및 사람화된 항-5T4 항체에는 (a) 서열번호 4의 잔기 21-127의 아미노산 서열; (b) 서열번호 4의 잔기 21-127과 94% 이상 동일한 아미노산 서열; (c) 서열번호 8의 잔기 23-130의 아미노산 서열; (d) 서열번호 8의 잔기 23-130과 96% 이상 동일한 아미노산 서열; (e) 서열번호 12의 잔기 21-127의 아미노산 서열; (f) 서열번호 12의 잔기 21-127과 98% 이상 동일한 아미노산 서열; 또는 (g) 도 9A 내지 9C에 도시된 사람화된 A1, A2 또는 A3 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체가 포함된다.
또한, (a) 본 발명의 키메릭 또는 사람화된 항-5T4 항체 또는 항체 단편; 및 (b) 항체에 직접 또는 간접적으로 결합된 약물을 포함하는, 약물 전달용 항체/약물 접합체가 제공된다. 대표적인 약물은 세포독소, 방사성 동위원소, 면역조절제, 항혈관신생제, 항증식제, 아폽토시스 촉진제(pro-apoptotic agent), 화학요법제 및 치료용 핵산과 같은 치료제가 포함된다. 세포독소는 예를 들면, 항생제, 튜불린 중합 억제제, 알킬화제, 단백질 합성 억제제, 단백질 키나제 억제제, 포스파타제 억제제, 토포아이소머라제 억제제 또는 효소일 수 있다. 칼리케아미신, 칼리케아미신, N-아세틸-γ-칼리케아미신, 또는 N-아세틸-γ-칼리케아미신 디메틸 하이드라지드와 같은 이의 유도체와 같은 항생제 세포독소가 항암 요법에 특히 유용하다.
기술된 항-5T4 항체/약물 접합체는 약물에 항체를 결합시키기 위한 링커(linker)를 포함할 수 있다. 대표적인 링커에는 4-(4'-아세틸페녹시)부탄산(AcBut), 3-아세틸페닐 산성산(AcPac) 및 4-머캅토-4-메틸-펜탄산(Amide)이 포함된다. 항체/약물 접합체는 또한 약물 혼입을 향상시키기 위하여 폴리에틸렌 글리콜 또는 기타 제제를 포함할 수 있다.
약물을 5T4-발현 세포에 전달하기 위해, 본 발명은, 세포를 (i) 키메릭 또는 사람화된 항-5T4 항체, 및 (ii) 사람화된 항-5T4 항체에 직접 또는 간접적으로 결합된 약물을 포함하는 항체/약물 접합체와 접촉시키는 방법을 제공한다. 상기한 방법에 따라, 약물이 표적 세포 안에 내재화(internalization)된다. 또한, 5T4-양성 암을 갖는 피험자에게 (i) 키메릭 또는 사람화된 항-5T4 항체 또는 항체 단편 및 (ii) 사람화된 항-5T4 항체 또는 항체 단편에 직접 또는 간접적으로 결합된 치료제를 포함하는 항-5T4 항체/약물 접합체의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하는 치료 방법이 본원에 기술된다. 본 발명의 항-5T4 요법은 개선된 효과를 위해 임의의 다른 공지된 요법과 병용할 수 있다. 제2 치료제를 항-5T4 항체/약물 접합체와 함께 동시에 투여하거나 임의의 순서로 연속적으로 투여할 수 있다.
또한, 여기에 기술된 사람화된 항-5T4 항체의 생산에 유용한 사람화된 항-5T4 가변 영역을 암호화하는 분리된 핵산도 제공된다. 사람화된 항-5T4 중쇄 가변 영역을 암호화하는 대표적 핵산에는 (a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 58-414의 뉴클레오타이드 서열; (b) 서열번호 5의 뉴클레오타이드 55-405의 뉴클레오타이드 서열; (c) 서열번호 9의 뉴클레오타이드 58-423의 뉴클레오타이드 서열; (d) 서열번호 48, 50, 53, 또는 55 중 어느 하나를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (e) 조회 범위(query coverage)가 100%인 경우에 서열번호 50과 89% 동일한 뉴클레오타이드 서열; (f) 조회 범위가 100%인 경우에 서열번호 53과 82% 동일한 뉴클레오타이드 서열; 또는 (g) 엄중한 하이브리드화 조건 하에서 상기 (a) 내지 (d) 중 어느 하나의 상보체에 특이적으로 하이브리드화하는 핵산이 포함된다. 사람화된 항-5T4 경쇄 가변 영역을 암호화하는 대표적 핵산에는 (a) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 61-381의 뉴클레오타이드 서열; (b) 서열번호 7의 뉴클레오타이드 67-390의 뉴클레오타이드 서열; (c) 서열번호 11의 뉴클레오타이드 61-381의 뉴클레오타이드 서열; (d) 서열번호 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73 또는 75 중 어느 하나의 사람화된 A1, A2 또는 A3 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (e) 조회 범위가 100%인 경우에 서열번호 59와 84% 동일한 뉴클레오타이드 서열; (f) 조회 범위가 100%인 경우에 서열번호 69와 86% 동일한 뉴클레오타이드 서열; (g) 조회 범위가 100%인 경우에 서열번호 75와 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열; 또는 (h) 엄중한 하이브리드화 조건 하에서 상기 (a) 내지 (d) 중 어느 하나의 상보체에 특이적으로 하이브리드화하는 핵산이 포함된다.
도 1A 내지 1C는 쥐 항-5T4 항체 A1, A2 및 A3의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한 것이다. 당해 아미노산 서열에서, 상보성 결정 영역(CDR)은 밑줄로 표시되어 있고 리더(leader) 서열은 이중 밑줄로 표 시되어 있다.
도 2는 CT26/5T4 세포 용해물을 사용하여 제조되고, 명시된 항체로 프로빙(probing)된 웨스턴 블롯이다.
도 3A 및 3B는 H8 및 A1 항체의 2가지 독립적 제제에 대한 반응 곡선 및 결합 반응속도론을 도시하는 선 그래프이다. 제제는 실질적으로 동등하다.
도 4A 내지 도 4C는 MDAMB435/5T4 세포에 의한 H8, A1, A2 및 A3 항체의 조절을 보여주는 선 그래프이다. 세포 표면에서의 항체의 수준은 시간에 따라 감소되는 반면(도 4A, 4C (실선)), 상청액 중의 항체의 수준은 일정하게 유지된다(도 4B, 4C (점선)). MCF, 평균 세포 형광; supt, 상청액.
도 5는 사람 엑토도메인(ectodomain) 5T4 Fc 작제물, 마우스 엑토도메인 5T4 Fc 작제물 및 사람/마우스 5T4 키메라 작제물의 개요도이다. 이들 작제물은 실시예 4에 기술된 바와 같은 에피토프 맵핑(mapping)을 위해 사용되었다.
도 6A 및 6B는 사람 5T4 엑토도메인 Fc 융합 단백질에 대한 사람화된 H8 및 각각의 명시된 항체의 경쟁적 결합의 그래프 결과를 도시한 것이다. HuH8, 사람화된 H8 항체; ChiA1, 키메릭 A1 항체; ChiA1 + C67F, C67F 돌연변이를 보유한 키메릭 A1 항체; ChiA2, 키메릭 A2 항체; muA2, 쥐 A2 항체; ChiA3, 키메릭 A3 항체; ChiA3+C91Y, C91Y 돌연변이를 보유한 키메릭 A3 항체; muA3, 쥐 A3 항체; No Ab, 항체 없음(대조군).
도 7은 H8, A1, A2 및 A3에 의해 결합되는 사람 5T4 에피토프를 도시하는 선형 도식이다. 명시된 잔기는 문헌[참조: Myers et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(12):9319-9324]에 기술되어 있고 또한 GenBank 등록번호 Z29083 (서열번호 87)로서 입수가능한 5T4 항원의 잔기이다. LRR, 류신-풍부 반복부.
도 8은 실시예 6에 기술된 바와 같이 수행된 구상체(spheroid) 검정의 결과를 도시한 것이다. A1 및 A3 항체를 사용하여 제조된 항-5T4/칼리케아미신 접합체는 대조군 세포(MDAMB435/neo)와 비교해서 5T4-발현 세포(MDAMB435/5T4)의 성장을 유의적으로 억제하였다. CMA-676, 항-CD33/칼리케아미신 접합체; huH8-AcBut-CalichDMH, 4-(4'-아세틸페녹시)부탄산(AcBut)을 사용하여 칼리케아미신에 접합된 사람화된 H8 항체; CalichDMH, 비접합된 칼리케아미신; A1-AcBut-CalichDMH, 4-(4'-아세틸페녹시)부탄산(AcBut)을 사용하여 칼리케아미신에 접합된 A1 항체; A3-AcBut-CalichDMH, 4-(4'-아세틸페녹시)부탄산(AcBut)을 사용하여 칼리케아미신에 접합된 A3 항체.
도 9A 내지 9H는 사람화된 A1 중쇄 가변 영역 버전 1의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열(서열번호 48-49); 사람화된 A1 중쇄 가변 영역(huA1 VH) 버전 1.2 및 2.0의 아미노산 서열; 사람화된 A1 경쇄 가변 영역 (huA1 VL) 버전 1.0, 2.0 및 3.0의 아미노산 서열; 사람화된 A2 중쇄 가변 영역 버전 1.0 및 2.0 (huA2 VH)의 아미노산 서열; 사람화된 A2 경쇄 가변 영역 버전 1.0 및 2.0 (huA2 VL)의 아미노산 서열; 사람화된 A3 중쇄 가변 영역 버전 1.0 및 2.0 (huA3 VH)의 아미노산 서열; 및 사람화된 A3 경쇄 가변 영역 버전 1.0 및 2.0 (huA32 VL)의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. CDR은 밑줄로 표시되어 있다.
도 10A 및 10B는 사람화된 항-5T4 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 대표적 사람 중쇄 가변 영역 골격 서열을 도시한 것이다. 도 1OA는 서브그룹 I의 사람 중쇄 가변 영역 서열(서열번호 14-24) 및 이로부터 유래된 컨센서스 골격 서열(서열번호 25-27)의 정렬이다. 도 10B는 VH 7 및 VH 3 서브그룹의 사람 생식세포 계열 유전자의 서열(서열번호 88-93)을 도시한 것이다.
도 11은 서브그룹 VκIII의 사람 경쇄 가변 영역 서열(서열번호 29-34)의 정렬이다. 박스 안의 서열, CDR.
도 12는 서브그룹 VκI의 사람 경쇄 가변 영역 서열(서열번호 35-44)의 정렬이다. 박스 안의 서열, CDR.
도 13은 사람화된 항-5T4 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 Vk 1 및 Vk IV 서브그룹의 추가적 사람 생식세포 계열 서열(서열번호 94-99)을 도시한 것이다.
도 14는 키메릭 및 사람화된 항-5T4 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 대표적 사람 불변 영역의 아미노산 서열(서열번호 45-47)을 도시한 것이다.
도 15는 전체길이 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이 5T4 항원의 아미노산 서열 및 부분적 검은 꼬리 마모셋 5T4 항원의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 밑줄친 서열, 리더 서열. 각 서열에 있어, 5T4 엑토도메인은 아미노산 30-356을 포함한다.
I. 항-5T4 항체
본 발명은 사람 5T4 항원에 결합하고, 표적화된 면역요법을 개발하는데 유용한 신규 쥐 항체를 제공한다. 사람 5T4 항원은 영양막 세포 및 많은 암세포 종류의 표면에서 발견되는 72 kDa의 비-글리코실화된 인단백질이다[참조: Hole et al. (1988) Br. J. Cancer 57: 239-46, Hole et al. (1990) Int. J. Cancer 45: 179-184; PCT 국제 특허공보 제WO89/07947호; 미국 특허 제5,869,053호].
본 발명의 쥐 항-5T4 항체는 A1, A2 및 A3로 지정되고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조되었다. 또한, 사람 5T4 항원에 특이적으로 결합하는, A1, A2 및 A3로부터 유래된 항-5T4 항체가 제공된다. 예를 들면, 본 발명의 항-5T4 항체에는 A1, A2 및 A3 항체의 항원 결합 잔기를 포함하는 항체; 5T4 항원에 대한 결합에 대해 A1, A2 또는 A3 항체와 경쟁하는 항체; 및 A1, A2 또는 A3 항체와 동일한 5T4 에피토프에 결합하는 항체가 포함된다.
특히, 기술된 A1, A2 및 A3 항체 각각은 사람 5T4 항원 상의 특유의 에피토프를 인식하는 항원 결합 부위를 포함한다. 이들 항체 각각은 또한 H8에 의해 결합되는 에피토프와 상이한 에피토프에 결합하고, A1, A2 및 A3 각각은 사람 5T4에 대한 결합에 대해 H8과 경쟁하지 못한다. 실시예 4 내지 5 및 도 6 내지 7 참조. 따라서, 본 발명은 사람 5T4의 잔기 30-163에 특이적으로 결합하는 항체(예를 들면, A3), 사람 5T4의 잔기 224-276에 특이적으로 결합하는 항체(예를 들면, A1) 및 사람 5T4의 잔기 224-355에 특이적으로 결합하는 항체(예를 들면, A2)를 제공한다. 또한, A1, A2 또는 A3 항체에 의해 결합되는 에피토프를 포함하는 사람 5T4 항원을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 천연 또는 전체길이 5T4 항원의 잔기 30-163, 224-276 및 224-355를 포함하는 5T4 항원성 단편을 제공한다.
기술된 항-5T4 항체의 특이적 결합이란, 다수의 상이한 항원을 포함하는 여러 다른 종류들로 이루어진 샘플에서 사람 5T4 항원에 대한 항체의 선택적인 결합을 말한다. 통상적으로, 특이적 결합은, 결합 친화도가 적어도 약 10-9 M 이상, 적어도 약 10-11 M 이상, 또는 적어도 약 10-12 M 이상을 포함하는, 적어도 약 10-8 M 이상과 같이, 적어도 약 10-7 M 이상인 경우에 일어난다. 예를 들면, 사람 5T4 항원에 대한 본 발명의 항체의 특이적 결합에는 약 1 x 10-8 내지 약 1 x 10-12 M의 범위, 또는 약 1 x 10-8 내지 약 1 x 10-11 M의 범위, 또는 약 1 x 10-8 내지 약 1 x 10-10 M의 범위, 또는 약 1 x 10-9 내지 약 1 x 10-10 M의 범위와 같은 적어도 약 1 x 10-7 내지 약 1 x 10-12의 범위에서의 결합이 포함된다. 특이적 결합은 또한 피험자에게 항체가 투여된 후에 5T4-발현 세포에 대한 항-5T4 항체의 선택적 표적화도 지칭한다.
본 발명의 항-5T4 항체는 4량체 구조(예를 들면, 천연 항체와 유사한)를 가질 수 있거나, 하나 이상의 면역글로불린 경쇄 가변 영역 또는 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 영역을 갖는 임의의 다른 구조 또는 이의 5T4-결합 단편(예를 들면, Fab, 변형된 Fab, F(ab')2 또는 Fv 단편)을 포함할 수 있다. 또한, 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR), 그러나 모든 6개 미만의 CDR이 항원 결합 영역을 구성하는 단일 도메인 항체도 포함된다. 본 발명은 키메릭 항체, 사람화된 항체, 초사람화된(superhumanized) 항체, 디아바디(diabody), 단일 쇄 항체, 4가 항체 및/또는 다중특이적 항체(예를 들면, 이특이적 항체)를 또한 포함한다. 이들 항체 기술어(記述語)는 상호 배제적이지 않다.
천연 항체는 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 약 150,000 달톤의 4량체(H2L2) 당단백질이다. 2개의 중쇄는 디설파이드 결합에 의해 각각 서로 결합되어 있으며 각각의 중쇄는 디설파이드 결합에 의해 경쇄에 결합되어 있다. 경쇄 및 중쇄 각각은 또한 아미노-말단 가변 영역 및 불변 영역을 특징으로 한다. 가변 영역은, 항체마다 크게 상이하고 특정 항원에 대한 특정 항체의 결합 친화도 및 특이성을 실질적으로 결정하는 서열을 포함한다. 각각의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 정렬되어 항원-결합 도메인을 형성한다.
키메릭 항체는 2가지 이상의 상이한 종의 서열을 포함한다. 한 예로서, 재조합 클로닝 기술을 사용하여, 비-사람 항체(즉, 항원으로 면역화시킨 비-사람 종에서 제조된 항체)의 항원-결합 부위를 함유하는 가변 영역 및 사람 면역글로불린으로 유래된 불변 영역을 포함하도록 할 수 있다.
본 발명의 키메릭 항-5T4 항체에는 A1, A2 및 A3 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 즉 (a) 서열번호 2의 잔기 20-138의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4의 잔기 21-127의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역; (b) 서열번호 6의 잔기 19-135의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 8의 잔기 23-130의 경쇄 아미노산 서열; 및 (c) 서열번호 10의 잔기 20-141의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 12의 잔기 21-127의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체가 포함된다. 대표적 사람화된 항-5T4 항체는 서열번호 49의 아미노산 1-119로서 제시된 중쇄 가변 영역, 또는 도 9A 내지 9C에 도시된 사람화된 중쇄 가변 영역 중 어느 하나 및 도 9A 내지 9C에 도시된 사람화된 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 본 발명의 대표적 키메릭 및 사람화된 항-5T4 항체의 제법은 실시예 7에 기술되어 있다.
본 발명의 항-5T4 항체는 또한 A1, A2 또는 A3 가변 영역으로부터 유래되거나 이와 실질적으로 유사하거나 사람화된 A1, A2 및 A3 가변 영역과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 실질적으로 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 관련하여, 실질적으로 동일한 서열은 서열번호 1 내지 12 중 어느 하나의 가변 영역 서열 또는 도 9A 내지 9C에 도시된 사람화된 A1, A2 및 A3 가변 영역과 약 90% 이상 동일하고, 예를 들면, 91% 이상 동일하거나, 92% 이상 동일하거나, 93% 이상 동일하거나, 94% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일하거나, 96% 이상 동일하거나, 97% 이상 동일하거나, 98% 이상 동일하거나, 99% 이상 동일하다.
본 발명의 대표적 키메릭 항-5T4 항체, 즉 5T4 항원에 특이적으로 결합하는 항체에는 또한 (a) 서열번호 2의 잔기 20-138, 서열번호 6의 잔기 19-135, 서열번호 10의 잔기 20-141 또는 도 9A 내지 9C에 도시된 사람화된 A1, A2 또는 A3 중쇄 가변 영역 중 어느 하나로서 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열; (b) 서열번호 2의 잔기 20-138과 85% 이상 동일한 중쇄 가변 영역 아미노산 서열; (c) 서열번호 6의 잔기 19-135와 86% 이상 동일한 중쇄 가변 영역 아미노산 서열; (d) 서열번호 10의 잔기 20-141과 91% 동일한 중쇄 가변 영역 아미노산 서열; (e) 서열번호 49의 잔기 1-119와 90% 이상 동일한 중쇄 가변 영역 아미노산 서열; 또는 (f) 도 9A 내지 9C에 도시된 사람화된 A1, A2 또는 A3 가변 영역 중 어느 하나로부터 유래된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 항체가 포함된다.
5T4 항원에 특이적으로 결합하는 키메릭 또는 사람화된 항-5T4 항체의 중쇄 가변 영역은 (a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 58-414, 서열번호 5의 뉴클레오타이드 55-405, 서열번호 9의 뉴클레오타이드 58-423, 서열번호 48의 뉴클레오타이드 1-358의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산; 또는 도 9A 내지 9C에 도시된 사람화된 A1, A2 또는 A3 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산; (b) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 58-414, 서열번호 5의 뉴클레오타이드 55-405 또는 서열번호 9의 뉴클레오타이드 58-423의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 90% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화될 수 있다. 예를 들면, 키메릭 항-5T4 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 58-414와 98% 이상 동일한 핵산, 서열번호 5의 뉴클레오타이드 55-405와 98% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, 또는 서열번호 48의 뉴클레오타이드 1-358과 89% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화될 수 있다. 키메릭 항-5T4 항체의 중쇄 가변 영역은 또한, 엄중한 하이브리드화 조건, 예를 들면, 65℃에서 0.1X SSC의 최종 세척 조건 하에서 서열번호 1의 뉴클레오타이드 58-414, 서열번호 5의 뉴클레오타이드 55-405, 서열번호 9의 뉴클레오타이드 58-423 또는 서열번호 48의 뉴클레오타이드 1-358의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 상보체에 특이적으로 하이브리드화하는 핵산에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명의 대표적 키메릭 항-5T4 항체에는 (a) 서열번호 4의 잔기 21-127, 서열번호 8의 잔기 23-130, 서열번호 12의 잔기 21-127 또는 도 9A 내지 9C에 도시된 사람화된 A1, A2 또는 A3 경쇄 가변 영역의 잔기로서 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열; 또는 (b) 서열번호 4의 잔기 21-127, 서열번호 8의 잔기 23-130 또는 서열번호 12의 잔기 21-127과 90% 이상 동일한 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 항체가 추가로 포함된다. 예를 들면, 경쇄 가변 영역 아미노산 서열에는 (a) 서열번호 4의 잔기 21-127과 94% 이상 동일한 경쇄 가변 영역 아미노산 서열; (b) 서열번호 8의 잔기 23-130과 96% 이상 동일한 경쇄 가변 영역 아미노산 서열; (c) 서열번호 12의 잔기 21-127과 98% 이상 동일한 경쇄 가변 영역 아미노산 서열; 또는 (d) 도 9A 내지 9C에 도시된 사람화된 A1, A2 또는 A3 경쇄 가변 영역 중 어느 하나로부터 유래된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열이 포함될 수 있다.
5T4 항원에 특이적으로 결합하는 키메릭 항-5T4 항체의 경쇄 가변 영역은 (a) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 61-381, 서열번호 7의 뉴클레오타이드 67-390, 서열번호 11의 뉴클레오타이드 61-381 또는 도 9A 내지 9C에 도시된 사람화된 A1, A2 또는 A3 경쇄 가변 영역 중 어느 하나를 암호화하는 뉴클레오타드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산; 또는 (b) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 61-381, 서열번호 7의 뉴클레오타이드 67-390 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 61-381과 90% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화될 수 있다. 예를 들면, 키메릭 항-5T4 항체의 경쇄 가변 영역은 (a) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 61-381과 97% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열; (b) 서열번호 7의 뉴클레오타이드 67-390과 98% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열; 또는 (c) 서열번호 11의 뉴클레오타이드 61-381과 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화될 수 있다. 5T4 항원에 특이적으로 결합하는 키메릭 항-5T4 항체의 경쇄 가변 영역은 또한, 엄중한 하이브리드화 조건, 예를 들면, 65℃에서 0.1X SSC의 최종 세척 조건 하에서 서열번호 3의 뉴클레오타이드 61-381, 서열번호 7의 뉴클레오타이드 67-390 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 61-381의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 상보체에 특이적으로 하이브리드화하는 핵산에 의해 암호화될 수 있다.
사람화된 항체는 항원 결합에 관여하는 가변 영역 잔기(즉, 상보성 결정 영역의 잔기, 축약된 상보성 결정 영역의 잔기 또는 항원 결합에 관여하는 다른 임의의 잔기)는 비-사람 종으로부터 유래되는 반면, 나머지 가변 영역 잔기(즉, 골격 영역의 잔기) 및 불변 영역은 적어도 부분적으로는, 사람 항체 서열로부터 유래된다. 사람화된 항체의 골격 영역 잔기 및 불변 영역 잔기의 서브셋트는 비-사람 공급원으로부터 유래될 수 있다. 사람화된 항체의 가변 영역은 또한 사람화된(즉, 사람화된 경쇄 또는 중쇄 가변 영역) 것으로서 기술된다. 통상적으로, 항원을 사용한 면역화에 사용되는 종은 마우스, 랫트, 토끼, 비-사람 영장류 또는 기타 비-사람 포유동물 종과 같은 비-사람 종이다. 사람화된 항체는 통상적으로 종래의 키메릭 항체보다 덜 면역원성이고 사람에게 투여후 개선된 안정성을 나타낸다[참조: Benincosa et al. (2000) J. Pharmacol. Exp. Ther. 292:810-6; Kalofonos et al. (1994) Eur. J. Cancer 3OA: 1842-50; Subramanian et al. (1998) Pediatr. Infect. Dis. J. 17:110-5].
상보성 결정 영역(CDR)은 항원 결합에 관여하는 항체 가변 영역의 잔기이다. CDR을 표시하기 위한 몇가지 번호매김 시스템이 통상적으로 사용된다. 카벳(Kabat) 정의는 서열 가변성을 기초로 하며, 코티아(Chothia) 정의는 구조적 루프(loop) 영역의 위치에 기초한다. AbM 정의는 카벳 및 코티아 접근법 간의 절충안이다. 경쇄 가변 영역의 CDR은 카벳, 코티아 또는 AbM 알고리즘에 따른 24번 및 34번(CDR1-L), 50번 및 56번(CDR2-L), 및 89번 및 97번(CDR3-L) 위치의 잔기에 의해 결합된다. 카벳 정의에 따르면, 중쇄 가변 영역의 CDR은 31번 및 35B번(CDR1-H), 50번 및 65번(CDR2-H), 및 95번 및 102번(CDR3-H)(카벳에 따른 번호매김) 위치의 잔기에 의해 결합된다. 코티아 정의에 따르면, 중쇄 가변 영역의 CDR은 26번 및 32번(CDR1-H), 52번 및 56번(CDR2-H), 및 95번 및 102번(CDR3-H)(코티아에 따른 번호매김) 위치의 잔기에 의해 결합된다. AbM 정의에 따르면, 중쇄 가변 영역의 CDR은 26번 및 35B번(CDR1-H), 50번 및 58번(CDR2-H), 및 95번 및 102번(CDR3-H)(카벳에 따른 번호매김)의 위치의 잔기에 의해 결합된다[참조: Martin et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9268-9272; Martin et al. (1991) Methods Enzymol. 203: 121-153; Pedersen et al. (1992) Immunomethods 1: 126; 및 Rees et al. (1996) In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, pp. 141-172].
특이성 결정 영역(SDR)은 항원과 직접적으로 상호작용하는 CDR내 잔기이다. SDR은 초가변(hypervariable) 잔기에 상응한다[참조: Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-9].
골격 잔기는 초가변 잔기 또는 CDR 잔기가 아닌 항체 가변 영역의 잔기이다. 골격 잔기는 A1, A2 또는 A3 항체의 골격 영역과 실질적으로 유사한 사람 골격과 같은 천연 사람 항체로부터 유래될 수 있다. 개개 서열들 간의 컨센서스를 나타내는 인공 골격 서열도 또한 사용될 수 있다. 사람화를 위해 골격 영역을 선별하는 경우, 사람에서 광범위하게 나타나는 서열은 적게 나타나는 서열보다 바람직할 수 있다. 항원 접촉에 관여하는 것으로 생각되는 쥐 잔기 및/또는 항원-결합 부위의 구조적 완전성에 관여하는 잔기를 복원시키기 위해 또는 항체 발현을 개선시키기 위해 사람 골격 수용자 서열을 추가로 돌연변이시킬 수 있다. 사람화 설계에 의해 도입되는 해독후 단백질 변형 부위를 확인하고 이를 회피하기 위해 펩타이드 구조 예측을 사용하여 사람화된 가변 중쇄 및 경쇄 영역 서열을 분석할 수 있다.
사람화된 항체는 아래에 기술되는 바와 같이, 베니어링(veneering), 상보성 결정 영역(CDR)의 이식, 축약된 CDR의 이식, 특이성 결정 영역(SDR)의 이식 및 프랑켄슈타인 어셈블리(Frankenstein assembly)를 포함하는 각종 방법 중 어느 하나를 사용하여 제조할 수 있다. 사람화된 항체에는 또한 하나 이상의 변화가 CDR 내에 도입된 초사람화된 항체가 포함된다. 예를 들면, CDR내 비-사람 잔기를 사람 잔기로 치환시킬 수 있다. 이러한 일반적 접근법을 표준 돌연변이유발 및 합성 기술과 병용하여 임의의 바람직한 서열의 항-5T4 항체를 생산할 수 있다.
베니어링은 용매가 접근할 수 있는 항체의 외부를 사람 아미노산 서열로 표면치환(resurfacing)함으로써 설치류 또는 다른 비-사람 항체에서 잠재적으로 면역원성인 아미노산 서열을 감소시키는 개념에 기초한다. 따라서, 베니어링된 항체는 비변형된 비-사람 항체보다, 사람 세포에 대해 덜 외래물질로서 간주된다[참조: Padlan (1991) Mol. Immunol. 28:489-98]. 비-사람 항체는 사람 항체의 골격 영역내 동일한 위치에서의 것들과는 상이한, 비-사람 항체내 노출된 외부 골격 영역 잔기를 확인하고, 확인된 잔기를 사람 항체내 동일한 위치에 통상적으로 존재하는 아미노산으로 대체함으로써 베니어링된다.
CDR의 이식은 수용자 항체(예를 들면, 사람 항체 또는 바람직한 골격 잔기를 포함하는 다른 항체)의 하나 이상의 CDR을 공여자 항체(예를 들면, 비-사람 항체)의 CDR로 대체시켜 수행한다. 수용자 항체는 후보 수용자 항체 및 공여자 항체 사이의 골격 잔기의 유사성을 기준으로 선택할 수 있다. 예를 들면, 프랑켄슈타인 접근법에 따라, 관련된 비-사람 항체의 각각의 골격 영역과 실질적 서열 상동성을 갖는 사람 골격 영역을 동정하고, 비-사람 항체의 CDR을 상이한 사람 골격 영역의 복합체 상에 이식한다. 본 발명의 항체를 제조하는데 유용한 관련 방법은 또한 미국 특허원 공보 제2003/0040606호에 기술되어 있다.
축약된 CDR의 이식은 관련된 접근법이다. 축약된 CDR은 경쇄내 27d 내지 34, 50 내지 55 및 89 내지 96번 위치, 및 중쇄내 31 내지 35b번, 50 내지 58번, 및 95 내지 101번 위치[문헌(참조: Kabat et al. (1987))의 번호매김 협약]의 것들을 포함하는 특이성-결정 잔기 및 인접한 아미노산을 포함한다[참조: Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-9]. 특이성-결정 잔기(SDR)의 이식은, 항체 결합 부위의 결합 특이성 및 친화성이 각각의 상보성 결정 영역(CDR)내에서 가장 고도로 가변적인 잔기로 측정된다는 이해를 전제로 한다. 이용가능한 아미노산 서열 데이터의 분석과 병용된, 항체-항원 복합체의 3차원 구조의 분석을 사용하여, CDR내 각각의 위치에 존재하는 아미노산 잔기의 구조적 비유사성에 기초하는 서열 가변성을 모델링할 수 있다. SDR은 접촉 잔기로 이루어진 최소로 면역원성인 폴리펩타이드 서열로서 확인된다[참조: Padlan et al. (1995) FASEB J. 9:133-139].
일반적으로, 사람 수용자 골격은 이들이 공여자 항체의 골격 영역과 실질적으로 유사한지 또는 어떠한 것이 가변 영역 하위계열(subfamily)의 컨센서스 서열과 가장 유사한지에 기초하여 선별된다. 이식 후, 항체 결합, 기능성, 코돈 용법(codon usage), 발현 수준 등을 최적화하기 위해, 공여자 및/또는 수용자 서열 내에서 골격 영역 내로의 비-사람 잔기의 도입을 포함하는 추가의 변화가 이루어질 수 있다[참조: PCT 국제 공보 제WO 91/09967호]
중쇄 가변 골격 영역으로의 CDR의 이식을 위해, 유용한 골격 서열은 DP-21 (VH7), DP-54 (VH3-07), DP-47 (VH3-23), DP-53 (VH-74), DP-49 (VH3-30), DP-48 (VH3-13), DP-75, DP-8(VH1-2), DP-25, VI-2b 및 VI-3 (VH1-03), DP-15 및 V1-8 (VH1-08), DP-14 및 V1-18 (VH1-18), DP-5 및 V1-24P (VH1-24), DP-4 (VH1-45), DP-7 (VH1-46), DP-10, DA-6 및 YAC-7 (VH1-69), DP-88 (VH1-e), DP-3 및 DA-8 (VH1-f)로부터 유래될 수 있다. 사람화를 위한 골격 잔기를 함유하는 대표적 중쇄 가변 영역은 서열번호 13 내지 24 및 88 내지 93에 제시되어 있다. VH1 골격 잔기의 컨센서스를 나타내는 대표적 골격은 서열번호 25 내지 27로서 제시되어 있다. 또한 도 10A 내지 10B 참조.
경쇄 가변 골격 영역으로의 CDR의 이식을 위해, 유용한 골격 서열은 DPK24 서브그룹 IV 생식세포 계열 클론, VκIII 서브그룹(DPK23, DPK22, DPK20, DPK21) 또는 VκI 서브그룹 생식세포 계열 클론(DPK9, DPK1, 02, DPK7)로부터 유래될 수 있다. 사람화를 위한 골격 잔기를 함유하는 대표적 경쇄 가변 영역은 서열번호 28 내지 34, 35 내지 44 및 94 내지 99로서 제시되어 있다. 도 11 내지 14 참조.
본 발명의 대표적 사람화된 항-5T4 항체에는 서열번호 2, 6 또는 10 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 또는 서열번호 4, 8 또는 12 중 어느 하나의 경쇄 가변 영역의 CDR로부터 선택된 비-사람 항-5T4 항체의 하나 이상의 CDR을 갖는 항체가 포함된다. 예를 들면, 사람화된 항-5T4 항체는 서열번호 2, 6 또는 10 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 또는 서열번호 4, 8 또는 12 중 어느 하나의 경쇄 가변 영역의 CDR로부터 선택된 2개 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 사람화된 항-5T4 항체는 또한 서열번호 2, 6 또는 10 중 어느 하나의 2개 또는 3개의 CDR을 갖는 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 서열번호 4, 8 또는 12 중 어느 하나의 2개 또는 3개의 CDR을 갖는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다.
본 발명의 사람화된 항-5T4 항체는 제1 쇄의 가변 영역(즉, 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역)이 사람화되고 제2 쇄의 가변 영역이 사람화되지 않도록(즉, 비-사람 종에서 생산된 항체의 가변 영역) 작제할 수 있다. 이러한 항체는 반-사람화된(semi-humanized) 항체라고 하는 사람화된 항체의 한 종류이다. 반-사람화된 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 비-사람 항-5T4 항체에는 본원에서 기술되는 A1, A2 및 A3 항체 뿐만 아니라, PCT 국제 공보 제WO 98/55607호 및 문헌[참조: Forsberg et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(19): 124430-12436]에 기술된 H8 항체 또는 문헌[참조: Woods et al. (2002) Biochem. J. 366: 353-65]에 기술된 랫트 모노클로날 항체가 포함된다. 예를 들면, 반-사람화된 항-5T4 항체는 서열번호 49의 아미노산 1-119로서 제시된 중쇄 가변 영역 또는 도 9A 내지 9C에 도시된 사람화된 A1, A2 또는 A3 중쇄 가변 영역의 아미노산 및 서열번호 4, 8 또는 12 중 어느 하나의 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
키메릭 및 사람화된 항-5T4 항체의 불변 영역은 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, 이들의 임의의 동종형(isotype)(예를 들면, IgG의 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 동종형) 중 어느 하나 뿐만 아니라, 이의 돌연변이된 버전으로부터 유래될 수 있다. 사람 동종형의 선택 및 동종형내 특정 아미노산의 변형은 숙주 방어 기전의 활성화를 증진시키거나 제거할 수 있고 항체 생체분포를 변경시킬 수 있다[참조: Reff et al. (2002) Cancer Control 9: 152-66]. 본 발명의 키메릭 및 사람화된 항체를 제조하는데 유용한 대표적 불변 영역은 서열번호 45 내지 47로서 제시되어 있다. 변이체 또는 돌연변이체 버전에 포함된 사람 람다 경쇄 불변 영역을 또한 사용할 수 있다. 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 서열의 클로닝을 위해, 인트론 서열(intronic sequence)을 제거할 수 있다.
키메릭 및 사람화된 항-5T4 항체는 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 작제할 수 있다. 예를 들면, 가변 영역을 암호화하는 중복 올리고뉴클레오타이드를 함께 어닐링(annealing)시키고 이를 사람 항체 불변 영역을 함유하는 발현 벡터 속으로 연결시켜 가변 영역을 제조할 수 있다[참조: Harlow & Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual . Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 및 미국 특허 제4,196,265호; 제4,946,778호; 제5,091,513호; 제5,132,405호; 제5,260,203호; 제5,677,427호; 제5,892,019호; 제5,985,279호; 제6,054,561호]. 동종이량체 및 이종이량체를 포함하는 2개의 온전한 4량체 항체를 포함하는 4가 항체(H4L4)는 예를 들면, PCT 국제 공보 제WO 02/096948호에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 항체 이량체는 또한, 쇄내 디설파이드 결합 형성을 촉진하는 항체 불변 영역내 시스테인 잔기(들)의 도입을 통해, 이종이작용성 가교-링커를 사용하여[참조: Wolff et al. (1993) Cancer Res. 53: 2560-5], 또는 이중 불변 영역을 포함시키기 위한 재조합 생산에 의해[참조: Stevenson et al. (1989) Anticancer Drug Des. 3: 219-30] 제조될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은, 예를 들면, 절두된(truncated) 항체 서열의 발현에 의해 또는 전체길이 항체의 해독후 분해에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 항-5T4 항체, 즉 A1, A2 및 A3 항체의 변이체 뿐만 아니라 이의 키메릭 및 사람화된 버전은 각종 변화, 치환, 삽입 및 결실을 포함하도록 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들면, 항체 서열을 항체 발현을 위해 사용되는 세포 종류에서의 코돈 용법을 위해 최적화시킬 수 있다. 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 재이용(salvage) 수용체 결합 에피토프를, 이미 존재하지 않는 경우, 항체 중쇄 서열내로 혼입시킬 수 있다[참조: 미국 특허 제5,739,277호]. 항체 안정성을 향상시키기 위한 다른 유용한 변형에는 241번 잔기의 세린을 프롤린으로 치환시키는 IgG4의 변형이 포함된다[참조: Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30: 105-108]. 다른 유용한 변화에는 항체를 약물과 접합시키는데 있어서의 효율성을 최적화하기 위해 요구되는 치환이 포함된다. 예를 들어, 항체는 약물 부착을 위한 아미노산을 포함하도록 이의 카복실 말단에서 변형될 수 있는데, 예를 들면, 하나 이상의 시스테인 잔기를 부가할 수 있다. 불변 영역을 변형시켜 탄수화물 또는 다른 잔기 결합을 위한 부위를 도입시킬 수 있다.
본 발명의 항-5T4 항체의 변이체는 부위-지시된 돌연변이유발 또는 재조합 클로닝을 포함하는 표준 재조합 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 항-5T4 항체의 다양한 레퍼토리(repertoire)는 유전자이식된 비-사람 동물에서 유전자 정렬 및 유전자 전환 방법을 통해 제조할 수 있으며[참조: 미국 특허 공보 제2003/0017534호], 이어서, 이를 기능 검정을 사용하여 관련 활성에 대해 시험한다. 본 발명의 특정 양태에서, 항-5T4 변이체는 CDR 돌연변이[참조: Yang et al. (1995) J. Mol. Biol. 254: 392-403], 쇄 셔플링(chain shuffling)[참조: Marks et al. (1992) Biotechnology (NY) 10: 779-783], 이.콜라이(E. coli)의 돌연변이유발 균주의 사용[참조: Low et al. (1996) J. Mol. Biol. 260: 359-368], DNA 셔플링[참조: Patten et al. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8: 724-733], 파아지 디스플레이(phage display)[참조: Thompson et al. (1996) J. Mol. Biol. 256: 77-88], 및 성별 PCR[참조: Crameri et al. (1998) Nature 391: 288-291]을 위한 친화성 성숙화 프로토콜을 사용하여 수득된다. 면역요법 적용의 경우, 관련 기능 검정에는 아래에 기술된 바와 같이, 사람 5T4 항원에 대한 특이적 결합, 항체 내재화, 및 종양을 보유한 동물에게 투여되는 경우에 종양 부위(들)로의 표적화가 포함된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-5T4 항체를 발현하는 세포 및 세포주를 제공한다. 대표적인 숙주 세포에는 포유동물 및 사람 세포, 예를 들면, CHO 세포, HEK-293 세포, HeLa 세포, CV-1 세포 및 COS 세포가 포함된다. 이종 작제물을 숙주 세포 속으로 형질전환시킨 후 안정한 세포주를 생성하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 대표적인 비-포유동물 숙주 세포에는 곤충 세포가 포함된다[참조: Potter et al. (1993) Int. Rev. Immunol. 10(2-3):103-112]. 항체는 또한 유전자이식된 동물[참조: Houdebine (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13(6):625-629] 및 유전자이식된 식물[참조: Schillberg et al. (2003) Cell Mol. Life Sci. 60(3):433-45]에서 생산할 수 있다.
II. 항-5T4 핵산 및 폴리펩타이드
본 발명은 항-5T4 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 분리된 핵산 및 상기 기술된 핵산에 의해 암호화되는 분리된 폴리펩타이드를 추가로 제공한다. 본 발명의 핵산 및 폴리펩타이드는 A1, A2 및 A3 가변 영역, 사람화된 A1, A2 및 A3 가변 영역 및 이들의 변이체의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 포함한다. 분리된 핵산 및 폴리펩타이드를 사용하여 키메릭 및 사람화된 항-5T4 항체를 제조할 수 있다.
II.A. 항-5T4 핵산
핵산은 일본쇄, 이본쇄, 또는 트리플렉스(triplex) 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 및 이들의 중합체이다. 달리 구체적으로 한정하지 않는 한, 핵산은 참조 천연 핵산과 유사한 특성을 지니는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유할 수 있다. 핵산에는 유전자, cDNA, mRNA 및 cRNA가 포함된다. 핵산은 합성될 수 있거나, 또는 임의의 유기체를 포함하는 임의의 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있다. 항-5T4 항체를 암호화하는 핵산을 클로닝하기 위한 대표적인 방법은 실시예 1 및 7에 기술되어 있다.
본 발명의 대표적 핵산은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 및 48 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특히, A1, A2 및 A3 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 각각 서열번호 2의 잔기 20-138, 서열번호 6의 잔기 19-135 및 서열번호 10의 잔기 20-141로서 각각 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 암호화하는, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 58-41, 서열번호 5의 뉴클레오타이드 55-405 및 서열번호 9의 뉴클레오타이드 58-423을 각각 포함한다. 사람화된 A1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 48의 뉴클레오타이드 1-358을 포함한다. A1, A2 및 A3 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 각각 서열번호 4의 잔기 21-127, 서열번호 8의 잔기 23-130 및 서열번호 12의 잔기 21-127로서 각각 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 암호화하는, 서열번호 3의 뉴클레오타이드 61-381, 서열번호 7의 뉴클레오타이드 67-390 및 서열번호 11의 뉴클레오타이드 61-381을 각각 포함한다. 본 발명의 추가의 핵산은 도 9A 내지 9C에 도시된 사람화된 A1, A2 및 A3 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 핵산은 또한, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 및 48 중 어느 하나의 가변 영역 암호화 서열과 90% 이상 동일한, 예를 들면, 약 91% 이상 동일하거나 약 92% 이상 동일한, 예를 들면, 93% 이상 동일하거나, 94% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일하거나, 96% 이상 동일하거나, 97% 이상 동일하거나, 98% 이상 동일하거나, 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 및 48 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 또한 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 핵산은 (a) 서열번호 1의 가변 영역 암호화 서열과 98% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열; (b) 서열번호 3의 가변 영역 암호화 서열과 97% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열; (c) 서열번호 5의 가변 영역 암호화 서열과 98% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열; (d) 서열번호 7의 가변 영역 암호화 서열과 98% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열; (e) 서열번호 11의 가변 영역 암호화 서열과 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열; 또는 (f) 서열번호 48의 가변 영역 암호화 서열과 89% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 아래에 기술된 바와 같이 조회 서열로서 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 48 중 어느 하나의 서열을 암호화하는 전체길이 가변 영역 또는 도 9A 내지 9H에 도시된 사람화된 A1, A2 및 A3 가변 영역 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 사용한 서열 비교 알고리즘을 사용하거나, 또는 가시적 관측에 의해, 서열을 최대 상응성에 대해 비교한다. 실시예 1과 표 1 및 실시예 7과 표 11을 참조.
실질적으로 동일한 서열은 다형성 서열, 즉 집단 내의 대안적(alternative) 서열 또는 대립형질유전자일 수 있다. 대립형질 차이는 1개 염기쌍 정도로 작을 수 있다. 실질적으로 동일한 서열은 또한 사일런트 돌연변이(silent mutation)를 포함하는 서열을 포함하는 돌연변이유발된 서열을 포함할 수 있다. 돌연변이는 하나 이상의 잔기 변화, 하나 이상의 잔기의 결실, 또는 하나 이상의 추가의 잔기의 삽입을 포함할 수 있다.
실질적으로 동일한 핵산은 또한 엄중한 조건 하에서 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 48 중 어느 하나의 전체길이; 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 48 중 어느 하나의 가변 영역 암호화 서열의 전체길이; 또는 도 9A 내지 9H에 도시된 사람화된 A1, A2 및 A3 가변 영역 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 하이브리드화하거나 또는 실질적으로 하이브리드화하는 핵산으로 정의된다. 핵산 하이브리드화와 관련하여, 비교되는 2개의 핵산 서열을 프로브 및 표적이라고 명명할 수 있다. 프로브는 참조 핵산 분자이고, 표적은 핵산 분자의 이종 집단내에서 흔히 발견되는 시험 핵산 분자이다. 표적 서열은 시험 서열의 동의어이다.
하이브리드화 연구를 위해, 유용한 프로브는 본 발명의 핵산 분자의 약 14개 또는 40개 이상의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이거나 이를 모사하는 프로브이다. 바람직하게는, 프로브는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 48 중 어느 하나; 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 48 중 어느 하나의 서열을 암호화하는 가변 영역의 전체길이; 또는 도 9A 내지 9C에 도시된 사람화 A1, A2 및 A3 가변 영역 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드의 14 내지 20개 뉴클레오타이드, 또는 경우에 따라 더 긴 뉴클레오타이드, 예를 들면, 30, 40, 50, 60, 100, 200, 300 또는 500개 뉴클레오타이드 또는 전체길이까지를 포함한다. 이러한 단편은 예를 들면, 단편의 화학적 합성에 의해, 핵산 증폭 기술의 적용에 의해 또는 선택된 서열을 재조합 생산용 재조합 벡터내로 도입시킴에 의해 용이하게 제조할 수 있다.
특이적 하이브리드화는, 서열이 복합적 핵산 혼합물(예를 들면, 전체 세포 DNA 또는 RNA)에 존재하는 경우, 분자가 엄중한 조건 하에서 특정 뉴클레오타이드 서열에만 결합하거나, 듀플렉스화(duplexing)되거나, 또는 하이브리드화됨을 말한다. 특이적 하이브리드화는 하이브리드화 조건의 엄중성에 따라 프로브와 표적 서열 사이의 미스매치(mismatch)를 포함할 수 있다.
서던 및 노던 블롯 분석과 같은 핵산 하이브리드화 실험과 관련하여 엄중한 하이브리드화 조건 및 엄중한 하이브리드화 세척 조건은 서열 및 환경 둘 모두에 의존적이다. 보다 긴 서열은 보다 높은 온도에서 특이적으로 하이브리드화한다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광범위한 안내는 문헌[참조: Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I chapter 2, Elsevier, New York]에서 찾아볼 수 있다. 일반적으로, 고도의 엄중한 하이브리드화 및 세척 조건은 정해진 이온 농도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 낮도록 선택한다. 통상적으로, 엄중한 조건 하에서, 프로브는 이의 표적 서브서열(subsequence)에 특이적으로 하이브리드화될 것이지만, 다른 서열에는 특이적으로 하이브리드화되지 않을 것이다.
Tm은, (정해진 이온 농도 및 pH 하에서) 완전하게 매치된 프로브에 표적 서열의 50%가 하이브리드화하는 온도이다. 매우 엄중한 조건은 특정 프로브에 대한 Tm과 같게 선택된다. 약 100개 이상의 상보성 잔기를 갖는 상보성 핵산의 서던 또는 노던 블롯 분석에 대한 엄중한 하이브리드화 조건의 예는 42℃에서 1mg의 헤파린을 함유한 50% 포름아미드 중에서 밤새 하이브리드화하는 것이다. 고도의 엄중한 세척 조건의 예는 65℃에서 0.1X SSC 중에서 15분이다. 엄중한 세척 조건의 예는 65℃에서 0.2X SSC 완충액 중에서 15분이다[참조: Sambrook et al., eds (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, SSC 완충액의 기술 참조]. 흔히, 낮은 엄중성 세척 후에 고도의 엄중성 세척을 수행하여 백그라운드(background) 프로브 시그날을 제거한다. 약 100개 이상의 뉴클레오타이드의 듀플렉스에 대한 중간 엄중성 세척 조건의 예는 45℃에서 1X SSC 중에서 15분이다. 약 100개 이상의 뉴클레오타이드의 듀플렉스에 대한 낮은 엄중성 세척의 예는 40℃에서 4X 내지 6X SSC 중에서 15분이다. 짧은 프로브(예를 들면, 약 10 내지 50개 뉴클레오타이드)의 경우, 엄중한 조건은 통상적으로, pH 7.0 내지 8.3에서 약 1M Na+ 이온 미만의 염 농도, 통상적으로 약 0.01 내지 1M Na+ 이온 농도(또는 기타 염)를 포함하고, 온도는 통상적으로 약 30℃ 이상이다. 엄중한 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제를 첨가하여 달성할 수 있다. 일반적으로, 특정 하이브리드화 검정에서 비관련 프로브에 대해 관측되는 것보다 2배(또는 그 이상)인 시그날 대 노이즈 비는 특정 하이브리드화의 검출을 나타낸다.
다음은 본 발명의 참조 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드를 확인하는데 사용할 수 있는 하이브리드화 및 세척 조건의 예이다: 프로브 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA 중에서 표적 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드한 후, 50℃에서 2×SSC, 0.1% SDS 중에서 세척하며; 보다 바람직하게는, 프로브 및 표적 서열은 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA 중에서 하이브리드화한 후 50℃에서 1×SSC, 0.1% SDS 중에서 세척하고; 더욱 바람직하게는, 프로브 및 표적 서열은 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA 중에서 하이브리드화한 후, 50℃에서 0.5×SSC, 0.1% SDS 중에서 세척하고; 더욱 바람직하게는, 프로브 및 표적 서열은 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA 중에서 하이브리드화한 후 50℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS 중에서 세척하고; 더욱 바람직하게는, 프로브 및 표적 서열은 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA 중에서 하이브리드화한 후, 65℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS 중에서 세척한다.
2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 추가의 명시는 핵산에 의해 암호화되는 단백질이 실질적으로 동일하거나, 전체적으로 3차원 구조를 공유하거나, 또는 생물학적 작용성 등가물이라는 것이다. 이들 용어는 본원에서 하기에 추가로 정의한다. 엄중한 조건 하에서 서로 하이브리드화하지 않는 핵산 분자는, 상응하는 단백질이 실질적으로 동일한 경우에는 여전히 실질적으로 동일한 것이다. 이는, 예를 들면, 2개의 뉴클레오타이드 서열이 유전자 코드에 의해 허용되는 보존적으로 치환된 변이체를 포함하는 경우에 발생할 수 있다.
보존적으로 치환된 변이체는 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 3번째 위치가 혼합된-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 축퇴 코돈 치환을 갖는 핵산 서열이다[참조: Batzer et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; 및 Rossolini et al. (1994) Mol. Cell Probes 8:91-98].
본 발명의 핵산에는 또한 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 48 중 어느 하나 또는 도 9A 내지 9C에 도시된 사람화된 A1, A2 및 A3 가변 영역 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 핵산, 및 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 48의 서브서열과 연장된 서열, 또는 도 9A 내지 9C에 도시된 사람화된 A1, A2 및 A3 가변 영역 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 이들의 상보적 서열이 포함된다. 상보적 서열은 염기쌍 사이의 수소 결합의 형성시 서로 쌍을 이룰수 있는 역평행(antiparallel) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 2개의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 본원에 사용되는 상보성 서열이란 용어는 하기 제시된 동일한 뉴클레오타이드 비교 방법에 의해 추정될 수 있는 바와 같이 실질적으로 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 의미하거나, 또는 본원에 기술된 것들과 같이 상대적으로 엄중한 조건 하에서 해당 핵산 분절에 하이브리드화할 수 있는 것으로 정의된다. 상보성 핵산 분절의 특정 예는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
서브서열은 보다 긴 핵산 서열의 일부를 포함하는 핵산의 서열이다. 대표적인 서브서열은 본원에서 위에 기술된 프로브 또는 프라이머이다. 본원에 사용되는 프라이머라는 용어는 선택된 핵산 분자의 약 8개 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 바람직하게는 10 내지 20개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 20 내지 30개 뉴클레오타이드를 포함하는 연속 서열을 의미한다. 본 발명의 프라이머는 충분한 길이 및 적절한 서열의 올리고뉴클레오타이드를 포함함으로써 본 발명의 핵산 분자에서 중합을 개시한다.
연장된 서열은 핵산 속으로 혼입된 추가의 뉴클레오타이드(또는 기타 유사한 분자)를 포함한다. 예를 들어, 폴리머라제(예를 들면, DNA 폴리머라제)는 핵산 분자의 3' 말단에서 서열을 부가할 수 있다. 또한, 뉴클레오타이드 서열은 프로모터, 프로모터 영역, 인핸서, 폴리아데닐화 시그날, 인트론 서열, 추가의 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위 및 기타 암호화 분절과 같은 기타 DNA 서열과 조합될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 핵산이 작용성 프로모터에 작동적으로 연결되어 있는 재조합 발현용 벡터를 포함하여, 기술된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 핵산에 작동적으로 연결되는 경우, 프로모터는 핵산의 전사가 제어되고 프로모터 영역에 의해 조절되도록 핵산과 기능적으로 조합된다. 벡터는 플라스미드, 코스미드(cosmid) 및 바이러스 벡터와 같은, 숙주 세포 내에서 복제할 수 있는 핵산을 말한다.
본 발명의 핵산은 클로닝되거나, 합성되거나, 변경되거나, 돌연변이유발되거나, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 핵산을 분리하는데 사용되는 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 염기 쌍 변화, 결실 또는 작은 삽입을 생성시키기 위한 부위-특이적인 돌연변이유발은 당해 분야에 또한 공지되어 있다[참조: Sambrook et al. (eds.) (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover & Hames (1995) DNA Cloning: A Practical Approach. 2nd ed. IRL Press at Oxford University Press, Oxford/New York; Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology. 3rd ed. Wiley, New York].
II.B. 항-5T4 폴리펩타이드
본 발명은 또한 분리된 항-5T4 폴리펩타이드를 제공한다. 폴리펩타이드 및 단백질은 각각 펩타이드 결합에 의해 결합된 아미노산의 단일 쇄로 구성된 화합물을 말한다. 대표적 중쇄 가변 영역 폴리펩타이드는 서열번호 2의 잔기 20-138, 서열번호 6의 잔기 19-135, 서열번호 10의 잔기 20-141 및 서열번호 49의 잔기 1-119로서 제시된다. 대표적 경쇄 가변 영역 폴리펩타이드는 서열번호 4의 잔기 21-127, 서열번호 8의 잔기 23-130 및 서열번호 12의 잔기 21-127로서 제시된다. 본 발명의 추가의 폴리펩타이드는 도 9A 내지 9C에 도시된 사람화된 A1, A2 및 A3 가변 영역의 아미노산을 포함한다.
본 발명의 추가의 폴리펩타이드는 기술된 항-5T4 폴리펩타이드와 실질적으로 유사한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 폴리펩타이드, 예를 들면, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 49의 가변 영역과 약 90% 이상 동일한, 예를 들면, 약 91% 이상 동일하거나, 92% 이상 동일하거나, 93% 이상 동일하거나, 94% 이상 동일하거나, 95% 이상 동일하거나, 96% 이상 동일하거나, 97% 이상 동일하거나, 98% 이상 동일하거나, 99% 이상 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 폴리펩타이드를 포함한다. 서열은 조회 서열 또는 이의 가변 영역 서열로서 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 49 중 어느 하나 또는 도 9A 내지 9C에 도시된 사람화된 A1, A2 또는 A3 가변 영역 서열 중 어느 하나의 전체길이 서열을 사용한 서열 비교 알고리즘을 사용하거나, 또는 가시적 관측에 의해 최대 상응성을 비교한다. 본 발명은 추가로 본원에 기술된 핵산들 중 어느 하나에 의해 암호화되는 폴리펩타이드를 포함한다.
예를 들면, 본 발명의 대표적 폴리펩타이드에는 (a) 서열번호 2의 잔기 20-138과 85% 이상 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드; (b) 서열번호 4의 잔기 21-127과 94% 이상 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드; (c) 서열번호 6의 잔기 19-135와 86% 이상 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드; (d) 서열번호 8의 잔기 23-130과 96% 이상 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드; (e) 서열번호 10의 잔기 20-141과 91% 이상 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드; (f) 서열번호 12의 잔기 21-127과 98% 이상 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드; 및 (g) 서열번호 49의 잔기 1-119과 90% 이상 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 포함된다. 실시예 1과 표 2 및 실시예 7과 표 11을 참조.
본 발명의 폴리펩타이드는 천연 아미노산, 합성 아미노산, 유전자에 의해 암호화된 아미노산, 유전자에 의해 비-암호화된 아미노산 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 L-형 및 D-형 아미노산 둘 모두를 포함할 수 있다.
유전자에 의해 비-암호화된 대표적인 아미노산에는 2-아미노아디프산; 3-아미노아디프산; β-아미노프로피온산; 2-아미노부티르산; 4-아미노부티르산(피페리딘산); 6-아미노카프로산; 2-아미노헵탄산; 2-아미노이소부티르산; 3-아미노이소부티르산; 2-아미노피멜산; 2,4-디아미노부티르산; 데스모신; 2,2'-디아미노피멜산; 2,3-디아미노프로피온산; N-에틸글리신; N-에틸아스파라긴; 하이드록시리신; 알로-하이드록시리신; 3-하이드록시프롤린; 4-하이드록시프롤린; 이소데스모신; 알로-이소류신; N-메틸글리신(사르코신); N-메틸이소류신; N-메틸발린; 노르발린; 노르류신; 및 오르니틴이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
대표적인 유도체화된 아미노산에는, 예를 들면, 유리 아미노 그룹이 유도체화되어 아민 하이드로클로라이드, p-톨루엔 설포닐 그룹, 카보벤족시 그룹, t-부틸옥시카보닐 그룹, 클로로아세틸 그룹 또는 포르밀 그룹을 형성한 분자가 포함된다. 유리 카복실 그룹은 유도체화되어 염, 메틸 및 에틸 에스테르, 또는 다른 종류의 에스테르 또는 히드라지드를 형성할 수 있다. 유리 하이드록실 그룹은 유도체화되어 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성할 수 있다. 히스티딘의 이미다졸 질소는 유도체화되어 N-임-벤질히스티딘을 형성할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-5T4 폴리펩타이드의 단편, 예를 들면, 5T4 항원 결합 부위를 구성하는 단편을 제공한다. 기술된 서열보다도 긴 폴리펩타이드 서열도 또한 제공된다. 예를 들면, 하나 이상의 아미노산을 항체 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 부가할 수 있다. 이러한 추가의 아미노산은 정제 적용을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 적용에서 사용될 수 있다. 연장된 단백질을 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 항-5T4 폴리펩타이드는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 49 중 어느 하나의 보존적으로 치환된 변이체인 아미노산을 포함하는 단백질을 포함한다. 보존적으로 치환된 변이체는 하나 이상의 잔기가 작용면에서 유사한 잔기로 보존적으로 치환된 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 말한다.
보존적 치환의 예에는 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 하나의 비-극성(소수성) 잔기의 다른 잔기로의 치환; 아르기닌과 리신 간의 치환, 글루타민과 아스파라긴 간의 치환, 글리신과 세린 간의 치환과 같은, 하나의 극성(친수성) 잔기의 다른 잔기로의 치환; 리신, 아르기닌 또는 히스티딘과 같은 하나의 염기성 잔기의 다른 잔기로의 치환; 또는 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 하나의 산성 잔기의 다른 잔기로의 치환이 포함된다.
본 발명의 분리된 폴리펩타이드는 당업자에게 공지된 다양한 표준 기술을 사용하여 정제하고 특성 규명할 수 있다[참조: Schroder & Lubke (1965) The Peptides. Academic Press, New York; Bodanszky (1993) Principles of Peptide Synthesis. 2nd rev. ed. Springer-Verlag, Berlin/ New York; Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology. 3rd ed. Wiley, New York].
II.C. 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 비교
2개 이상의 뉴클레오타이드 또는 단백질 서열과 관련하여, "동일한" 또는 "동일성%"란 용어는 본원에 기술된 서열 비교 알고리즘 중의 하나를 사용하거나 가시적 관측에 의해 측정된 바에 따라, 최대 상응성에 대해 비교하고 정렬하는 경우, 동일하거나, 특정 %의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 갖는 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 말한다.
뉴클레오타이드 또는 단백질 서열과 관련하여 "실질적으로 동일한"이란 용어는, 특정 서열이 하나 이상의 결실, 치환 또는 첨가에 의해 자연적으로 존재하는 서열의 서열과 상이하고, 이의 최종적 효과는 사람화된 항-5T4 핵산 또는 폴리펩타이드의 생물학적 기능을 유지하는 것을 의미한다.
2개 이상의 서열의 비교를 위해, 통상적으로 하나의 서열은 하나 이상의 시험 서열과 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터 프로그램에 입력하고, 서브서열 동등물을 경우에 따라 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 선택한다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 선택된 프로그램 매개변수를 기초로 하여, 참조 서열에 대한 지정된 시험 서열(들)의 서열 동일성%를 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들면, 문헌[참조: Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math 2:482-489]의 국지적 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[참조: Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[참조: Pearson & Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448]의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 계산 실행 [위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group) 제조의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA] 또는 가시적 관측에 의해 수행할 수 있다[참조: Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology. 3rd ed. Wiley, New York].
서열 동일성% 및 서열 유사성%를 측정하는데 바람직한 알고리즘은 문헌[참조: Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 기술된 BLAST 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터[National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)]를 통해 공개적으로 이용가능하다. BLAST 알고리즘 매개변수는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. 2개의 뉴클레오타이드 서열을 비교하기 위해, BLASTn 디폴트(default) 매개변수는 W=11(단어길이) 및 E=10(예상치)로 설정되며, 또한 구성 복잡성이 낮은 조회 서열의 잔기를 차폐하기 위한 저-복잡성 필터의 사용을 포함한다. 2개의 아미노산 서열의 비교를 위해, BLASTp 프로그램 디폴트 매개변수는 W=3(단어 길이), E=10(예상치), BLOSUM62 스코어링 행렬(scoring matrix)의 사용, 갭 존재 값(gap costs of existences)=11 및 연장=1, 및 구성 복잡성이 낮은 조회 서열의 잔기를 차폐하기 위한 저-복잡성 필터의 사용으로 설정된다. 실시예 1 참조.
III. 항-5T4 항체/약물 접합체
본 발명은 추가로 본 발명의 항-5T4 항체를 포함하는 항체/약물 접합체를 제공한다. 또한, 당해 약물이 항체에 직접 또는 간접적으로 결합되도록 하는, 항체/약물 접합의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 항체/약물 접합체는 다음 식의 접합체이다:
5T4Ab(-X-W)m
상기 식에서,
5T4Ab는 본원에 기술된 항-5T4 항체 또는 항체 단편이고;
X는 항-5T4 항체 또는 항체 단편과 반응할 수 있는 임의의 반응성 그룹의 생성물을 포함하는 링커이며;
W는 약물이고;
m은 정제된 접합 생성물에 대한 평균 로딩량(예를 들면, 약물이 접합체의 약 3 내지 10 중량%를 구성하도록 하는 m)이며;
(-X-W)m은 약물 유도체이다.
또한, 본 발명의 항체/약물 접합체의 제조 방법이 제공된다. 한 예로서, 식 5T4Ab(-X-W)m의 항체/약물 접합체는 (a) 약물이 항-5T4 항체의 3 내지 10 중량%가 되도록 약물 유도체를 항-5T4 항체에 첨가하는 단계; (b) 비-친핵성, 단백질-상용성인 pH 약 7 내지 9 범위의 완충된 용액 (여기서, 당해 용액은 (i) 적합한 유기 공용매, 및 (ii) 하나 이상의 담즙산 또는 이의 염을 포함하는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함한다) 중에서 약물 유도체 및 항-5T4 항체를 항온처리하여 (여기서, 항온처리는 약 30℃ 내지 약 35℃ 범위의 온도에서 약 15분 내지 약 24시간 범위의 시간 동안 수행한다) 항체/약물 접합체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 제조된 접합체를 크로마토그래피 분리하여, 3 내지 10중량% 범위의 약물 로딩량과 저 접합 분획(LCF)을 갖는 항체/약물 접합체를 비접합된 항-5T4 항체, 약물 유도체, 및 응집된 접합체로부터 분리하는 단계에 의해 제조될 수 있다.
III.A. 약물
약물은 생물학적 또는 검출가능한 활성을 갖는 임의의 물질, 예를 들면, 치료제, 검출가능한 표지, 결합제 등 및 생체내에서 활성제로 대사되는 전구약물(prodrug)이다. 약물은 또한 약물이 본 발명의 항체와 접합될 수 있게 작용화된 약물 유도체일 수 있다. 일반적으로, 이러한 종류의 접합체를 면역접합체라고 한다.
치료제는 이를 필요로 하는 피험자에서 상태를 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있는 조성물이다. 본 발명에서 유용한 치료제에는 항암제, 즉 편평세포/선종성 폐 암종(비-소세포 폐 암종), 침습성 유방 암종, 직장결장 암종, 위 암종, 편평세포 자궁경부 암종, 침습성 자궁내막 선암종, 침습성 췌장 암종, 난소 암종, 편평세포 방광 암종 및 융모막암종으로부터의 암 세포와 같은 5T4-발현 세포에서 항암 활성을 갖는 제제가 포함된다.
대표적인 치료제에는 세포독소, 방사성 동위원소, 화학요법제, 면역조절제, 항혈관신생제, 항증식제, 아폽토시스 촉진제 및 세포증식억제성 및 세포용해성 효소(예를 들면, RNAse)가 포함된다. 약물에는 또한 면역조절제, 항혈관신생제, 항증식제 또는 아폽토시스 촉진제를 암호화하는 유전자와 같은 치료용 핵산이 포함될 수 있다. 이러한 약물 기술용어들은 서로 배타적이지 않으므로, 치료제는 하나 이상의 상기 용어를 사용하여 기술될 수 있다. 예를 들어, 선택된 방사성 동위원소는 또한 세포독소이다. 치료제는 상기 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체로서 제조될 수 있다. 일반적으로, 약물로서 방사성 동위원소를 갖는 접합체를 방사면역접합체라고 하며, 약물로서 화학요법제를 갖는 접합체를 화학면역접합체라고 한다.
면역접합체에서 사용하기에 적합한 약물의 예에는 탁산, 마이탄신, CC-1065 및 듀오카르마이신, 칼리케아미신 및 기타 에네딘, 및 아우리스타틴이 포함된다. 다른 예에는 항-폴레이트, 빈카 알칼로이드 및 안트라사이클린이 포함된다. 식물 독소, 기타 생물활성 단백질, 효소(예를 들면, ADEPT), 방사성 동위원소, 광감작제(즉, 광역학적 요법용)를 또한 면역접합체에서 사용할 수 있다. 또한, 접합체는 세포독성제로서, 예를 들면, 리포좀 또는 중합체와 같은 제2 담체를 사용하여 제조할 수 있다.
세포독소란 용어는 일반적으로 세포의 기능을 억제하거나 방지하고/하거나 세포를 파괴하는 제제를 말한다. 대표적인 세포독소에는 항생제, 튜불린 중합 억제제, DNA에 결합하여 이를 파괴하는 알킬화제, 및 단백질 키나제, 포스파타제, 토포아이소머라제, 효소 및 사이클린과 같은 필수적인 세포 단백질의 기능 또는 단백질 합성을 파괴하는 제제가 포함된다. 대표적인 세포독소에는 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 아클라루비신, 조루비신, 미톡산트론, 에피루비신, 카루비신, 노갈라마이신, 메노가릴, 피타루비신, 발루비신, 사이타라빈, 겜시타빈, 트리플루리딘, 안시타빈, 에녹시타빈, 아자시티딘, 독시플루리딘, 펜토스타틴, 브록수리딘, 카페시타빈, 클라드리빈, 데시타빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 고우게로틴, 푸로마이신, 테가푸르, 티아조푸린, 아드리아마이신, 시스플라틴, 카르보플라틴, 사이클로포스파미드, 다카르바진, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 미톡산트론, 블레오마이신, 메클로르에타민, 프레드니손, 프로카르바진, 메토트렉세이트, 플루로우라실, 에토포시드, 탁솔, 탁솔 유사체, 시스-플라틴 및 카르보-플라틴과 같은 플라틴, 미토마이신, 티오테파, 탁산, 빈크리스틴, 다우노루비신, 에피루비신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 타목시펜, 이다루비신, 돌라스타틴/아우리스타틴, 헤미아스테를린, 에스퍼라미신 및 마이탄시노이드가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 특정 양태에서, 세포독소는 LL-E33288 복합체, 예를 들면, 감마-칼리케아미신(γ1) 또는 N-아세틸 감마-칼리케아미신으로도 불리는 칼리케아미신과 같은 항생제이다[참조: 미국 특허 제4,970,198호]. 본 발명의 항체/약물 접합체를 제조하는데 사용하기 적합한 칼리케아미신의 추가의 예는 전문이 본원에 인용된 미국 특허 제4,671,958호; 제5,053,394호; 제5,037,651호; 제5,079,233호; 및 제5,108,912호에 기술되어 있다. 이들 화합물은 항-5T4 항체에 칼리케아미신을 접합시키기에 유용한 히드라지드 또는 다른 작용성 그룹과 같은 작용성 그룹을 도입시킴과 동시에 적절한 티올과 반응시켜 디설파이드를 형성시킬 수 있는 메틸트리설파이드를 함유한다. 칼리케아미신의 디설파이드 유사체, 예를 들면, 전문이 본원에 인용된 미국 특허 제5,606,040호 및 제5,770,710호에 기술된 유사체를 사용할 수 있다.
방사선요법 적용을 위해, 본 발명의 항-5T4 항체는 고 에너지 방사성 동위원소를 포함할 수 있다. 당해 동위원소는 예를 들면, 항체 내에 존재하는 시스테인 잔기에서 항체에 직접적으로 결합될 수 있거나, 또는 킬레이트를 사용하여 항체와 방사성 동위원소의 결합을 매개할 수 있다. 방사선요법에 적합한 방사성 동위원소에는, α-방출기, β-방출기 및 오제 전자(auger electron)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 진단상 적용에 유용한 방사성 동위원소에는 양전자방출기 및 γ-방출기가 포함된다. 본 발명의 항-5T4 항체를, 예를 들면, 항체의 티로신 잔기 상에서 추가로 요오드화시켜 항체의 검출 또는 치료 효과를 촉진시킬 수 있다.
항-5T4 항체에 접합될 수 있는 대표적인 방사성 동위원소에는 18불소, 64구리, 65구리, 67갈륨, 68갈륨, 77브롬, 80m브롬, 95루테늄, 97루테늄, 103루테늄, 105루테늄, 99m테크네튬, 107수은, 203수은, 123요오드, 124요오드, 125요오드, 126요오드, 131요오드, 133요오드, 111인듐, 113인듐, 99m레늄, 105레늄, 101레늄, 186레늄, 188레늄, 121m텔루륨, 99테크네튬, 122m텔루륨, 125m텔루륨, 165툴륨, 167툴륨, 168툴륨, 90이트륨 및 이들로부터 유도된 니트라이드 또는 옥사이드 형태가 포함된다. 다른 적합한 방사성 동위원소에는 213비스무쓰, 213납 및 225악티늄과 같은 알파 방출기가 포함된다.
본 발명의 항체/약물 접합체는 면역조절제, 즉 체액성 면역 반응(예를 들면, 항원-특이적인 항체의 생산) 및 세포-매개된 면역 반응(예를 들면, 림프구 증식)을 포함하는 면역 반응을 유도하는 제제를 포함할 수 있다. 대표적인 면역조절제에는 사이토킨, 크산틴, 인터루킨, 인터페론 및 성장 인자(예를 들면, TNF, CSF, GM-CSF 및 G-CSF), 및 에스트로겐(디에틸스틸베스트롤, 에스트라디올), 안드로겐(테스토스테론, HALOTESTIN®(플루옥시메스테론)), 프로게스틴(MEGACE®(메게스트롤 아세테이트), PROVERA®(메드록시프로게스테론 아세테이트)), 및 코르티코스테로이드(프레드니손, 덱사메타손, 하이드로코르티손)와 같은 호르몬이 포함된다.
본 발명에 유용한 면역조절제에는 종양에 대한 호르몬 작용을 차단하는 항-호르몬, 및 사이토킨 생산을 억제하고, 자가-항원 발현을 하향조절하거나 MHC 항원을 차폐하는 면역억제제가 포함된다. 대표적인 항-호르몬에는 항-에스트로겐, 예를 들면, 타목시펜, 랄록시펜, 4(5)-이미다졸을 억제하는 아로마타제, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY 117018, 오나픈스톤 및 토레미펜; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤라이드 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 및 항-부신 제제(anti-adrenal agent)가 포함된다. 대표적인 면역억제제에는 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘, 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 브로모크립틴, 다나졸, 답손, 글루타르알데하이드, MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-이디오타입(anti-idiotypic) 항체, 사이클로스포린 A, 글루코코르티코스테로이드와 같은 스테로이드, 사이토킨 또는 사이토킨 수용체 길항제(예를 들면, 항-인터페론 항체, 항-IL10 항체, 항-TNFα 항체, 항-IL2 항체), 스트렙토키나제, TGFβ, 라파마이신, T-세포 수용체, T-세포 수용체 단편 및 T 세포 수용체 항체가 포함된다.
본 발명에서 유용한 추가의 약물에는 혈관 형성을 억제하는 항혈관신생제, 예를 들면, 파르네실트랜스퍼라제 억제제, COX-2 억제제, VEGF 억제제, bFGF 억제제, 스테로이드 설파타제 억제제(예를 들면, 2-메톡시에스트라디올 비스-설파메이트 (2-MeOE2bisMATE)), 인터루킨-24, 트롬보스폰딘, 메탈로스폰딘 단백질, 클래스 I 인터페론, 인터루킨 12, 프로타민, 안지오스타틴, 라미닌, 엔도스타틴 및 프롤락틴 단편이 포함된다.
항증식제 및 아폽토시스 촉진제에는 PPAR-감마(예를 들면, 사이클로펜테논 프로스타글란딘(cyPGs)), 레티노이드, 트리테르피노이드(예를 들면, 사이클로아르탄, 루판, 우르산, 올레아난, 프리에델란, 담마란, 쿠쿠르비타신 및 리모노이드 트리테르페노이드), EGF 수용체의 억제제(예를 들면, HER4), 라파마이신, CALCITRIOL®(1,25-디하이드록시콜레칼시페롤(비타민 D)), 아로마타제 억제제(FEMARA® (레트로존)), 텔로머라제 억제제, 철 킬레이트제(예를 들면, 3-아미노피리딘-2-카복스알데하이드 티오세미카르바존(트리아핀)), 아폽틴(바이러스 단백질 3 - 닭 빈혈 바이러스로부터의 VP3), Bcl-2 및 Bcl-X(L)의 억제제, TNF-알파, FAS 리간드, TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드(TRAIL/Apo2L), TNF-알파/FAS 리간드/TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드(TRAIL/Apo2L) 신호전달의 활성화제, 및 PI3K-Akt 생존 경로 신호전달의 억제제(예를 들면, UCN-01 및 겔다나마이신)가 포함된다.
대표적인 화학요법제에는 티오테파 및 사이클로포스파미드와 같은 알킬화제; 부설판, 임프로설판 및 피포설판과 같은 알킬 설포네이트; 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파와 같은 아지딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메키오레타민, 메키오레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파르나이드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴과 같은 니트로스우레아; 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 클로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신과 같은 항생제; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-Fu)과 같은 항-대사물; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 니아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에녹시타빈, 플록수리딘, 5-EU와 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테쓰이미드, 미토탄, 트릴론스탄과 같은 항-부신; 프롤린산과 같은 엽산 보충물; 아세글라톤; 알도포스파르니드 글리코사이드; 아미놀레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테뉴아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2'-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드(Ara-C); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들면, 파클리탁셀(TAXOL®, 미국 뉴저지주 프린스턴 소재의 브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology) 제조원) 및 도세탁셀(TAXOTERE®, 프랑스 안토니 소재의 롱-프랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer) 제조원); 키오람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카르보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 빈오렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아이니노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포아이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레틴산; 에스페르아미신; 및 카페시타빈이 포함된다.
항-5T4 항체에 접합될 수 있고 본 발명의 치료 방법에 따라 사용될 수 있는 추가의 치료제에는 광역학적 요법용 광감작제(미국 특허공보 제2002/0197262호 및 미국 특허 제5,952,329호); 열요법용 마그네틱 입자(미국 특허공보 제2003/0032995호); 펩타이드, 리간드, 세포 부착 리간드 등과 같은 결합제, 및 활성이 더 높은 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 설페이트 함유 전구약물, 펩타이드 함유 전구약물, β-락탐-함유 전구약물, 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물 또는 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로사이토신 및 기타 5-플루오로우리딘 전구약물과 같은 전구약물이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
항-5T4 항체를 사용한 진단 방법을 위해, 약물은 시험관내 또는 생체내에서 5T4-발현 세포의 존재를 검출하는데 사용되는 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 섬광조영술, 자기 공명 영상 또는 초음파를 사용하여 검출할 수 있는 표지와 같이, 생체내에서 검출할 수 있는 방사성 동위원소를 임상 진단 적용을 위해 사용할 수 있다. 유용한 섬광조영술 표지에는 양전자 방출기 및 γ-방출기가 포함된다. 마그네틱 공급원 영상화용으로 대표적인 조영제로는 상자성 또는 초상자성 이온(예를 들면, 철, 구리, 망간, 크롬, 에르븀, 유로퓸, 디스프로슘, 홀뮴 및 가돌리늄), 산화철 입자 및 수용성 조영제가 있다. 초음파 검출을 위해, 가스 또는 액체를 마이크로버블(microbubble) 조영제로서 방출되는 다공성 무기 입자속 안에 포획시킬 수 있다. 시험관내 검출에 유용한 검출가능한 표지에는 형광발색단, 검출가능한 에피토프 또는 결합제 및 방사성 표지가 포함된다.
III.B. 링커 분자
약물은 본 발명의 키메릭 및 사람화된 항-5T4 항체에 직접 또는 링커 분자를 통해 간접적으로 접합된다. 링커 분자는 안정하거나 가수분해될 수 있으며, 이로써 세포 안으로 도입된 후에 방출된다. 약물이 항체로부터 절단되도록 하는 주요 기전에는 리소좀(히드라존, 아세탈 및 시스-아코니테이트-유사 아미드)의 산성 pH에서의 가수분해, 리소좀 효소(카텝신 및 기타 리소좀 효소)에 의한 펩타이드 절단 및 디설파이드의 환원이 포함된다. 이러한 다양한 절단 기전의 결과로서, 약물을 항체에 연결시키는 기전은 매우 다양하며 어떠한 적합한 링커라도 사용될 수 있다. 바람직하게는, 접합 방법에 의해 예를 들면, 약 10% 미만의 최소의 저 접합 분획(LCF, 대부분 비접합된 항체의 분획)을 갖는 샘플이 제조된다.
적합한 접합 방법의 하나의 예는 항체에서 자연적으로 발생하는 탄수화물의 산화에 의해 생성된 알데하이드에 하이드라지드 및 기타 친핵체를 접합시키는 것에 의존한다. 하이드라존-함유 접합체는 바람직한 약물-방출 특성을 제공하는 도입된 카보닐 그룹으로 제조할 수 있다. 접합체는 또한 한쪽 말단에는 디설파이드가 있고, 중간에는 알킬 쇄가 있으며, 다른 말단에는 하이드라진 유도체가 있는 링커를 사용하여 제조할 수 있다. 안트라사이클린은 이러한 기술을 사용하여 항체에 접합시킬 수 있는 세포독소의 한가지 예이다.
하이드라존 이외의 작용 그룹을 함유하는 링커는 리소좀의 산성 환경에서 절단될 가능성을 갖는다. 예를 들어, 에스테르, 아미드 및 아세탈/케탈과 같은, 세포내에서 절단가능한 하이드라존 이외의 부위를 함유하는 티올-반응성 링커로부터 접합체를 제조할 수 있다. 캄프토테신은 이들 링커를 사용하여 접합될 수 있는 하나의 세포독성제이다. 5 내지 7원의 환 케톤으로부터 제조되어 하나의 산소는 세포독성제에 부착되고 다른 산소는 항체 부착용 링커에 부착된 케탈이 또한 사용될 수 있다. 안트라사이클린은 또한 이들 링커와 함께 사용하기에 적합한 세포독소의 예이다.
pH 민감성 링커 계열의 또다른 예로는 아미드 결합에 병치된(juxtaposed) 카복실산을 갖는 시스-아코니테이트가 있다. 카복실산은 산성 리소좀에서 아미드 가수분해를 촉진시킨다. 유사 유형의 가수분해 속도 촉진을 달성하는, 수개의 다른 유형의 구조를 갖는 링커가 또한 사용될 수 있다. 마이탄시노이드는 C-9에 부착된 링커와 접합될 수 있는 세포독소의 예이다.
약물 접합체를 위한 또다른 가능한 방출 방법은 리소좀 효소에 의한 펩타이드의 효소적 가수분해이다. 하나의 예로, 펩타이드를 아미드 결합을 통해 파라-아미노벤질 알코올에 부착시킨 후, 카바메이트 또는 카보네이트를 벤질 알코올과 세포독성제 사이에 제조한다. 펩타이드가 절단되면 아미노벤질 카바메이트 또는 카보네이트가 붕괴되거나 자기파멸(self-immolation)된다. 이러한 방법으로 예시되는 세포독성제에는 안트라사이클린, 탁산, 미토마이신 C 및 아우리스타틴이 포함된다. 하나의 예로, 페놀이 카바메이트 대신에 링커의 붕괴에 의해 방출될 수도 있다. 또다른 변형으로, 디설파이드 환원이 파라-머캅토벤질 카바메이트 또는 카보네이트의 붕괴를 개시하기 위해 사용된다.
항체에 접합된 다수의 세포독성제는 있어도 극히 낮은 수용해성을 갖고, 접합체의 응집으로 인해 접합체 상의 약물 로딩이 제한될 수 있다. 이를 극복하기 위한 하나의 접근법은 가용화 그룹을 링커에 부가하는 것이다. PEG 디-산, 티올-산, 또는 항체에 부착된 말레이미드-산, 디펩타이드 스페이서(spacer), 및 안트라사이클린 또는 듀오카마이신 유사체의 아민에의 아미드 결합을 갖는 것을 포함하는, PEG 및 디펩타이드로 이루어진 링커를 사용하여 제조한 접합체를 사용할 수 있다. 또다른 예로는 세포독성제에 디설파이드 결합되고, 항체에는 아미드 결합된 PEG-함유 링커를 사용하여 제조된 접합체가 있다. PEG 그룹을 혼입시키는 접근법이 응집 및 약물 로딩의 한계를 극복하는데 유리할 수 있다.
본 발명의 항체/약물 접합체의 제조에 바람직한 대표적인 링커에는 하기 화학식의 링커가 포함된다.
(CO - Alk1 - Sp1 - Ar - Sp2 - Alk2 - C(Z1) = Q - Sp)
상기 식에서,
Alk1 및 Alk2는 독립적으로 결합, 또는 분지되거나 비-분지된 (C1-C10) 알킬렌 쇄이고;
Sp1은 결합, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR'-, -N(CH2CH2)2N- 또는 -X-Ar'-Y-(CH2)n-Z이며, 이때, X, Y 및 Z는 독립적으로 결합, -NR'-, -S- 또는 -0-이고, 단, n=O인 경우, 하나 이상의 Y 및 Z는 결합이어야 하며, Ar'은 (C1-C5)알킬, (C1-C4)알콕시, (C1-C4)티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR', -CONHR', -(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR' 또는 -S(CH2)nCONHR' 중 1개, 2개 또는 3개의 그룹으로 임의로 치환된, 1,2-, 1,3- 또는 1,4-페닐렌이고, 단, Alk1이 결합인 경우, Sp1은 결합이며;
n은 O 내지 5의 정수이고;
R'은 -OH, (C1-C4)알콕시, (C1-C4)티오알콕시, 할로겐, 니트로, (C1-C3)디알킬아미노 또는 (C1-C3)트리알킬암모늄-A- 중 1개 또는 2개의 그룹으로 임의로 치환된 분지되거나 비-분지된 (C1-C5) 쇄이며, 이때, A-은 염을 완성시키는 약제학적으로 허용되는 음이온이고;
Ar은 (C1-C6)알킬, (C1-C5)알콕시, (C1-C4)티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR' 또는 -S(CH2)nCONHR' 중 1개, 2개 또는 3개의 그룹으로 임의로 치환된 1,2-, 1,3- 또는 1,4-페닐렌이고, 이때, n 및 R'은 상기 정의된 바와 같거나, 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- 또는 2,7-나프틸리덴 또는
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이며,
여기서, 각각의 나프틸리덴 또는 페노티아진은 (C1-C6)알킬, (C1-C5)알콕시, (C1-C4)티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR' 또는 -S(CH2)nCONHR' 중 1개, 2개, 3개 또는 4개의 그룹으로 임의로 치환되고, 이때, n 및 R'는 상기 정의된 바와 같으며, 단, Ar이 페노티아진인 경우, Sp1은 질소에만 연결된 결합이고;
Sp2는 결합, -S- 또는 -O-이고, 단, Alk2가 결합인 경우, Sp2는 결합이며;
Z1은 H, (C1-C5)알킬, 또는 (C1-C5)알킬, (C1-C5)알콕시, (C1-C4)티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR', -ONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR' 또는 -S(CH2)nCONHR' 중 1개, 2개 또는 3개의 그룹으로 임의로 치환된 페닐이고, 이때, n 및 R'는 상기 정의된 바와 같으며;
Sp는 직쇄 또는 분지쇄의 2가 또는 3가 (C1-C18) 라디칼, 2가 또는 3가 아릴 또는 헤테로아릴 라디칼, 2가 또는 3가 (C3-C18) 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼, 2가 또는 3가 아릴- 또는 헤테로아릴-아릴 (C1-C18) 라디칼, 2가 또는 3가 사이클로알킬- 또는 헤테로사이클로알킬-알킬 (C1-C18) 라디칼 또는 2가 또는 3가 (C2-C18) 불포화 알킬 라디칼이고, 이때, 헤테로아릴은 바람직하게는 푸릴, 티에닐, N-메틸피롤릴, 피리디닐, N-메틸이미다졸릴, 옥사졸릴, 피리미디닐, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, N-메틸카바조일, 아미노코우르마리닐 또는 펜아지닐이며, 이때, Sp가 3가 라디칼인 경우, Sp는 저급 (C1-C5)디알킬아미노, 저급 (C1-C5)알콕시, 하이드록시 또는 저급 (C1-C5)알킬티오 그룹에 의해 추가로 치환될 수 있고;
Q는 =NHNCO-, =NHNCS-, =NHNCONH-, =NHNCSNH- 또는 =NHO이다.
바람직하게는, Alk1은 분지되거나 비-분지된 (C1-C10)알킬렌 쇄이고; Sp'은 결합, -S-, -0-, -CONH-, -NHCO- 또는 -NR'이며, 이때, R'은 상기 정의된 바와 같고, 단, Alk1이 결합인 경우, Sp1은 결합이며;
Ar은 n 및 R'이 상기 정의된 바와 같은 (C1-C6)알킬, (C1-C5)알콕시, (C1-C4)티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR' 또는 -S(CH2)nCONHR' 중 1개, 2개 또는 3개의 그룹으로 임의로 치환된 1,2-, 1,3- 또는 1,4-페닐렌이거나, Ar은 (C1-C6)알킬, (C1-C5)알콕시, (C1-C4)티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR' 또는 -S(CH2)nCONHR' 중 1개, 2개, 3개 또는 4개의 그룹으로 각각 임의로 치환된 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- 또는 2,7-나프틸리덴이다.
Z1은 (C1-C5)알킬, 또는 (C1-C5)알킬, (C1-C4)알콕시, (C1-C4)티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR' 또는 -S(CH2)nCONHR' 중 1개, 2개 또는 3개의 그룹으로 임의로 치환된 페닐이고; Alk2 및 Sp2는 모두 결합이고; Sp 및 Q는 바로 위에 정의된 바와 같다.
전문이 본원에 인용된 미국 특허 제5,773,001호에는 친핵성 약물, 특히 칼리케아미신으로부터 제조된 하이드라지드 및 관련 친핵체와 함께 사용될 수 있는 링커가 기술되어 있다. 이들 링커는, 약물과 링커 사이에 형성된 결합이 가수분해성일 때 더 우수한 활성이 얻어지는 경우에 특히 유용하다. 이들 링커는, (1) 항체와의 반응을 위한 그룹(예, 카복실산), 및 (2) 약물과의 반응을 위한 카보닐 그룹(예, 알데하이드 또는 케톤)을 포함한 2개의 작용 그룹을 함유한다. 카보닐 그룹은 약물 상의 하이드라지드 그룹과 반응하여 하이드라존 결합을 형성할 수 있다. 이러한 결합은 표적 세포와의 결합 후 접합체로부터 치료제가 방출되게 하는 가수분해성이다.
하나의 예로서, 항-5T4 항체는, (1) 세포독성 약물이 단백질성 담체의 4.5중량% 내지 11중량%인 세포독성 약물 유도체를 항-5T4 항체에 첨가하고; (2) 약 7 내지 9 범위의 pH를 갖는 비-친핵성 단백질-상용성의 완충된 용액에서 세포독성 약물 유도체와 항-5T4 항체를 항온처리하여 단량체성 세포독성 약물/항체 접합체를 제조하고 [이때, 상기 용액은 (a) 적합한 유기 공용매 및 (b) 하나 이상의 C6-C18 카복실산 또는 이의 염을 포함하는 첨가제를 추가로 포함하며, 상기 항온처리는 약 30℃ 내지 약 35℃ 범위의 온도에서 약 15분 내지 24시간 범위의 시간 동안 수행한다]; 및 (3) 상기 (2) 단계에서 제조된 접합체를 크로마토그래피 분리 공정을 수행하여 비접합된 항체, 세포독성 약물 유도체 및 응집된 접합체로부터 10% 미만의 저 접합 분획(LCF)을 갖고, 3중량% 내지 10중량% 범위의 세포독성 약물의 로딩량을 갖는 단량체성 접합체를 분리함에 의해 세포독성 약물에 접합될 수 있다.
상기 (3) 단계의 크로마토그래피 분리에는 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 한외여과/투석여과, HPLC, FPLC 또는 세파크릴(Sephacryl) S-200 크로마토그래피와 같은 공정이 포함될 수 있다. 크로마토그래피 분리는 또한 페닐 세파로스 6 고속 유동(Phenyl Sepharose 6 Fast Flow) 크로마토그래피 매질, 부틸 세파로스 4 고속 유동 크로마토그래피 매질, 옥틸 세파로스 4 고속 유동 크로마토그래피 매질, 토요펄 에테르(Toyopearl Ether)-650M 크로마토그래피 매질, 매크로-프렙(Macro-Prep) 메틸 HIC 매질 또는 매크로-프렙 t-부틸 HIC 매질을 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 수행할 수 있다.
항-5T4 항체/약물 접합체를 제조하기 위한 대표적인 방법에는 전문이 본원에 인용된 공동-계류중인 미국 특허원 공개번호 제2004-082764A1호 및 미국 특허원 제10/699,874호에 공개된 CMC-544의 제조에 대하여 기재된 방법이 포함된다. 접합은 다음의 조건: 10mg/ml 항체, 8.5%(w/w) 칼리케아미신 유도체, 37.5 mM 데카논산나트륨, 9%(v/v) 에탄올, 50mM HEPES (N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄설폰산)), pH 8.5, 32℃, 1시간을 사용하여 수행할 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 부틸 세파로스 FF 수지, 0.65M 인산칼륨 로딩 완충액, 0.49M 인산칼륨 세척 완충액 및 4mM 인산칼륨 용출 완충액을 사용하여 수행할 수 있다. 완충액 교환은 크기 배제 크로마토그래피, 한외여과/투석여과 또는 다른 적합한 수단에 의해 수행할 수 있다. 항체/약물 접합체는 1.5% 덱스트란-40, 0.9% 슈크로스, 0.01% TWEEN®-80, 20mM 트리스/50mM NaCl, pH 8.0 중에 제형화될 수 있다. 5% 슈크로스, 0.01% TWEEN®-8O, 20mM 트리스/10mM NaCl, pH 8.0을 함유한 대안적 제형 용액이 또한 사용될 수 있다. 동결건조 주기는 제형에 따라 조절된다. 제형화된 덩어리의 농도는 0.5mg의 접합체/ml일 수 있다. 각각의 바이알은 1mg의 접합체, 즉 2ml의 총량을 함유할 수 있다. 다른 총량 용적, 예를 들어, 5ml의 총량도 경우에 따라 제조될 수 있다.
다른 대표적인 방법에는 또한 미국 특허원 공개번호 제20060002942호에 기재된 CMD-193에 대해 기재된 방법이 포함된다. 접합은 다음 조건: 10mg/ml 항체, 7%(w/w) 칼리케아미신 유도체, 10mM 데옥시콜레이트, 50mM HEPBS (N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄설폰산)), 9%(v/v) 에탄올, pH 8.2, 32℃, 1시간을 사용하여 수행할 수 있다. 반응물을 0.66M 인산칼륨 pH 8.56으로 10배 희석할 수 있고, 부틸 세파로스 FF 수지, 0.60M 인산칼륨 로딩 완충액 및 세척 완충액 및 20mM 트리스/25mM NaCl 용출 완충액을 사용하여 HIC를 수행할 수 있다. 완충액 교환은 재생 셀룰로스 막을 사용한 한외여과/투석여과를 사용하여 수행할 수 있다. 접합체를 20mM 트리스/10mM NaCl pH 8.0(10 투석용적(diavolume))에 대하여 장용여과할 수 있다. 항체/약물 접합체는 5% 슈크로스, 0.01% TWEEN®-80, 20mM 트리스/10mM NaCl, pH 8.0 중에 제형화될 수 있다. 제형화 후 덩어리 접합체의 농도는 1mg/ml일 수 있고, 바이알 총량은 5mg/바이알, 즉, 5ml의 총량일 수 있으나, 다른 총량 용적도 경우에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 사용되는 링커는 4-(4-아세틸페녹시)부탄산(AcBut)이다. 항체/약물 접합체는 β-칼리케아미신, γ-칼리케아미신 또는 N-아세틸 γ-칼리케아미신 또는 이의 유도체를 3-머캅토-3-메틸 부타노일 하이드라지드, AcBut 링커 및 본 발명의 항-5T4 항체와 반응시킴으로써 제조된다[참조: 미국 특허 제5,773,001호]. 이러한 링커에 의해, 1일당 예상된 2%의 NAc-γ DMH를 방출하면서 순환 중에 실질적으로 안정하고, 산성 리소좀 중에 NAc-γ DMH를 용이하게 방출하는 접합체가 제조된다. 본 발명의 다른 양태에서, 항체/약물 접합체는 링커 분자로서 3-아세틸페닐 산성산(AcPac) 또는 4-머캅토-4-메틸-펜탄산(아미드)를 사용하여 제조된다.
방사성 동위원소의 접합에 유용한 대표적 링커에는 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트(DTPA)-이소티오시아네이트, 석신이미딜 6-하이드라지늄 니코티네이트 하이드로클로라이드(SHNH) 및 헥사메틸프로필렌 아민 옥심(HMPAO)이 포함된다[참조: Bakker et al. (1990) J. Nucl. Med. 31: 1501-1509, Chattopadhyay et al. (2001) Nucl. Med. Biol. 28: 741-744, Dewanjee et al. (1994) J. Nucl. Med. 35: 1054-63, Krenning et al. (1989) Lancet 1: 242-244, Sagiuchi et al. (2001) Ann. Nucl. Med. 15: 267-270; 미국 특허 제6,024,938호]. 대안으로, 표적화 분자는, 방사성 동위원소가 여기에 직접 결합될 수 있도록 유도체화될 수 있다[참조: Yoo et al. (1997) J. Nucl. Med. 38: 294-300]. 요오드화 방법은 또한 당업계에 공지되어 있고, 대표적 프로토콜은 예를 들어 문헌[참조: Krenning et al. (1989) Lancet 1:242-4 및 Bakker et al. (199O) J. Nucl. Med. 31:1501-9]에서 찾을 수 있다.
항체/약물 접합체 당 약물 분자의 수를 더 증가시키기 위해서, 약물을 직쇄 또는 분지쇄 폴리에틸렌 글리콜 중합체 및 단량체를 포함한 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합시킬 수 있다. PEG 단량체는 화학식 -(CH2CH2O)-의 단량체이다. 약물 및/또는 펩타이드 유사체는 직접 또는 간접적으로, 즉, 당과 같은 적합한 스페이서 그룹을 통해 PEG에 결합시킬 수 있다. PEG/항체/약물 조성물은 또한 생체내 약물 안정성 및 표적 부위로의 전달을 촉진시키기 위해 추가의 친지성 및/또는 친수성 잔기를 포함할 수 있다. PEG-함유 조성물을 제조하기 위한 대표적 방법은 특히 미국 특허 제6,461,603호; 제6,309,633호; 및 제5,648,095호에서 찾을 수 있다.
예를 들면, 항체-칼리케아미신 접합체 중의 칼리케아미신의 양을 증가시키기 위해, 항체를 칼리케아미신과 접합시키기 전에, 예를 들어 PEG-SPA, PEG-SBA 또는 PEG-비스-말레이미드를 사용하여 PEG에 접합시킨다. PEG를 사용하여 제조한 항체/약물 접합체는 표적 항원에 대한 감소된 결합 친화도를 나타낼 수 있지만, 약물 로딩이 증가되어 여전히 효과적이다. 데옥시콜레이트 및 데카노에이트와 같은 첨가제를 낮은 수준의 비접합된 항체 및 낮은 수준의 응집물을 갖는 항체/칼리케아미신 접합체를 제조하기 위해 사용할 수 있다.
칼리케아미신을 포함한 많은 약물의 소수성 특성은 항체/약물 접합체의 응집을 일으킬 수 있다. 보다 높은 약물 로딩/수율 및 감소된 응집을 갖는 단량체성 항체/약물 접합체를 제조하기 위해, 접합 반응은 (i) 공용매로서의 프로필렌 글리콜 및 (ii) 하나 이상의 C6-C18 카복실산을 포함하는 첨가제를 함유하는 비-친핵성, 단백질-상용성, 완충된 용액 중에서 수행될 수 있다. 유용한 산에는 C7 내지 C12 산, 예를 들어 옥탄산 또는 카프릴산 또는 이의 염이 포함된다. 프로필렌 글리콜 이외의 다른 단백질-상용성 유기 공용매, 예를 들어 에틸렌 글리콜, 에탄올, DMF, DMSO 등이 또한 사용될 수 있다. 몇몇 또는 모든 유기 공용매는 약물을 접합 혼합물 내로 이동시키는데 위해 사용된다. N-하이드록시석신이미드(OSu) 에스테르 또는 다른 필적하는 활성화된 에스테르를 사용한 항체/약물 접합체의 제조에 유용한 완충액에는 포스페이트 완충된 염수(PBS) 및 N-2-하이드록시에틸 피페라진-N'-2-에탄설폰산(HEPES 완충액)이 포함된다. 접합 반응에 사용된 완충된 용액은 아민 및 친핵물이 실질적으로 없어야 한다. 또다른 접근으로서, 접합 반응은 추가의 첨가제 없이 t-부탄올을 함유한 비-친핵성, 단백질-상용성의 완충된 용액 중에서 수행될 수 있다[참조: 미국 특허 제5,712,374호 및 제5,714,586호]. 접합 및 칼리케아미신-함유 접합체를 위한 추가의 방법은 미국 특허 제5,739,116호 및 제5,877,296호에 기재되어 있다.
단량체성 접합체의 형성에 최적인 반응 조건은 온도, pH, 칼리케아미신 유도체 투입 및 첨가제 농도와 같은 반응 변수들의 변화에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 프로필렌 글리콜의 대표적 양은 총 용액의 용적에 대해 10% 내지 60%, 예를 들어 10% 내지 40%, 또는 약 30%의 범위이다. 하나 이상의 C6-C18 카복실산 또는 이의 염을 포함하는 첨가제의 대표적 양은 20mM 내지 100mM, 예를 들어 40mM 내지 90mM, 또는 약 60mM 내지 90mM의 범위이다. C6-C18 카복실산 또는 이의 염의 농도는 150-300 mM로 증가시킬 수 있고, 공용매는 1% 내지 10%로 떨어뜨릴 수 있다. 본 발명의 대표적 양태에서, 카복실산은 옥탄산, 데카논산 또는 상응하는 염이다. 예를 들면, 200mM 카프릴산을 5% 프로필렌 글리콜 또는 에탄올과 함께 사용할 수 있다. 접합 반응은 약간 상승된 온도(30 내지 35℃) 및 pH(8.2 내지 8.7)에서 수행될 수 있다. 항체의 농도는 1 내지 15 mg/ml의 범위일 수 있고, 칼리케아미신 유도체, 예를 들면, N-아세틸 γ-칼리케아미신 DMH AcBut OSu 에스테르의 농도는 항체의 약 4.5중량% 내지 11중량% 범위일 수 있다. 다른 약물의 접합에 적합한 조건은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 결정될 수 있다.
III.C. 항체/약물 접합체의 정제
접합 후, 단량체성 접합체를 통상적인 방법, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 이온 교환 크로마토그래피(IEC) 또는 크로마토포커싱(CF; chromatofocusing)에 의해 비접합된 반응물 및/또는 접합체의 응집된 형태로부터 분리할 수 있다. 정제된 접합체는 단량체성이고, 일반적으로 3중량% 내지 10중량%의 약물을 함유한다. 항체/약물 접합체를 또한 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 사용하여 정제할 수 있는데, 이는 (1) LCF 함량 및 응집물을 효율적으로 감소시키는 능력; (2) 대량 반응 용적의 조절; 및 (3) 생성물의 최소 희석을 포함하여 SEC 보다 몇몇 이점을 제공한다. 제조 규모 용으로 적합한 고 용량 HIC 매질에는 페닐 세파로스 6 고속 유동 크로마토그래피 매질, 부틸 세파로스 4 고속 유동 크로마토그래피 매질, 옥틸 세파로스 4 고속 유동 크로마토그래피 매질, 토요펄 에테르-650M 크로마토그래피 매질, 매크로-프렙 메틸 HIC 매질 또는 매크로-프렙 t-부틸 HIC 매질이 포함된다. 한외여과/투석여과를 또한 완충액 교환을 위해 사용할 수 있다.
대표적 정제 공정에서, 원심분리 세포 제거 단계, 단백질 A 친화성 포획 단계 후 1 또는 2개의 직교 크로마토그래피 연마 단계, 바이러스 여과 단계 및 농축 및 제형화를 위한 횡류식 여과 단계를 포함한 다수의 단계를 수행한다. 정제 공정을 통해, 바람직하게는 5% 미만의 응집물, 20ppm 미만의 단백질 A, 50ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 갖고 50% 이상의 총 회수율을 갖는 생성물이 수득된다.
통상적인 항-5T4/칼리케아미신 제제는 항체 1몰당 5 내지 7몰의 칼리케아미신을 함유하는 접합된 항체를 주로(약 95%) 함유한다. 접합체는 실험실 규모(10 내지 200mg)에서 재현가능하게 제조되었다. ㎍ 칼리케아미신/mg 모노클로날 항체로 표현된 약물 로딩량은 칼리케아미신 농도(㎍/mL)를 항체 농도(mg/mL)로 나누어 측정한다. 이들 값은 280nm 및 310nm에서 접합체 용액의 UV 흡광도를 측정하여 결정한다. 이는 평균 로딩량이고, 실제 로딩량은 평균 로딩량 값을 중심으로 한 유사-정규 분포이며, 즉, 몇몇 항체는 평균 보다 많이 로딩되고, 몇몇 항체는 평균 보다 적게 로딩됨을 유의하는 것이 중요하다. 분석적 HIC-HPLC(소수성 상호작용 고성능 액체 크로마토그래피)를 사용하여 측정할 수 있는 비접합된 항체(저 접합된 분획물)는 비접합된 칼리케아미신이 거의 없거나 전혀 갖지 않는 항체 집단이다. 이 값은 항체 상의 칼리케아미신 분포의 측정치이고, 투여되는 칼리케아미신 양에는 일반적으로 영향을 미치지 않는다. ELISA를 사용하여 측정할 수 있는 비접합된 칼리케아미신은 항체와 접합되지 않은 칼리케아미신의 양을 말하고, 총 칼리케아미신의 %로서 표현된다. 약물-로딩 검정은 비접합된 것과 접합된 칼리케아미신을 구별하지 않는다. 비접합된 칼리케아미신의 양은 약물-로딩 검정을 사용하는 경우 검출불가능하거나 무시가능한 정도이므로, 이들 검정은 접합된 칼리케아미신의 양을 효과적으로 측정한다.
분석적 방법은 사람화된 항-5T4 칼리케아미신 접합체의 방출 및 안정성 검사를 위한 분석을 위해 사용될 수 있다. 접합체를 동일성(IEF), 농도(총 단백질 및 총 칼리케아미신 로딩), 순도(비접합된 칼리케아미신, 저 접합된 항체, 응집체 함량 및 감소된 SDS-PAGE) 및 면역친화성(항원 결합 ELISA)에 대하여 평가할 수 있다. 당업자에게 공지된 추가적인 검정을 사용할 수 있다. 이들 검정을 사용하여, 배치-대-배치 일관성을 상업적 제조에서 유지할 수 있다.
III.D. 항체/약물 접합체의 약동학
5T4-표적화된 면역접합체의 약동학을 평가하고, 다양한 동물에서 비접합된 칼리케아미신의 약동학과 비교할 수 있다. 예를 들면, 이는 암컷 누드 마우스, 수컷 Sprague-Dawley 랫트 및 암컷 사이노몰거스 원숭이에서 단일 정맥내 일시 투여 후 실시할 수 있다. 항-5T4 항체의 약동학은 일반적으로 다양한 종에서 낮은 제거율, 낮은 분포 용적 및 길고 뚜렷한 최종 반감기를 특징으로 한다. 비접합된 칼리케아미신 유도체의 혈청 농도는 정량 한계 미만일 것으로 예상된다. 단일-투여 독성 범위 연구에서 이들 접합체의 독성 프로필은 필적하는 용량에서 다른 항체/칼리케아미신 접합체의 경우에 얻어진 것과 유사할 것으로 예상된다.
IV. 항-5T4 항체 및 항체/약물 접합체의 특성규명을 위한 기능 검정
본 발명은 5T4 결합 활성, 세포 표면 상에 제시된 5T4 항원과의 결합 후 세포 내재화 및 피험자에서 5T4 발현 세포로의 표적화를 포함하여 항-5T4 항체의 활성을 특성규명하는 시험관내 및 생체내 검정을 추가로 기재하고 있다. 기재된 본 발명의 항체는 세포독소와 접합되는 경우, 5T4 발현 암세포의 성장 억제 및/또는 5T4 발현 세포에서의 세포 사멸의 유도를 포함한 항암 활성을 유도할 수 있다. 본 발명의 항-5T4 항체는 하나 이상의 상기 활성을 포함할 수 있다.
항-5T4 항체와 5T4 항원과의 결합을 검출하기 위한 기술은, 예를 들어 실시예 2에 기재된 BIACORE® 검정을 포함하여 당업계에 공지되어 있다. 추가의 대표적 기술에는 원심분리, 친화성 크로마토그래피 및 기타 면역화학적 방법이 포함된다[참조: Manson (1992) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey, United States of America; Ishikawa (1999) Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay, Elsevier, Amsterdam/New York]. 항원 결합 검정은 분리된 5T4 항원 또는 5T4-발현 세포를 사용하여 수행할 수 있다. 실시예 2를 참조한다.
항-5T4 항체의 결합 특이성은 결합 에피토프의 정의, 즉, 항원 결합에 참여하는 인접하지 않은 잔기 및/또는 항원 결합에 영향을 미치는 잔기들의 정의를 포함한 잔기들의 확인에 의해 추가로 기재될 수 있다. 실시예 4-5를 참조한다.
5T4-발현 세포에 의한 항-5T4 항체 및 항체/약물 접합체의 내재화는 시간에 따라 5T4-발현 세포 표면에 결합된 항체 또는 접합체의 양을 측정함으로써 분석할 수 있다. 항체 및 항체/약물 접합체의 막 국소화를 평가하기 위한 대표적인 기술은 실시예 3에 기재되어 있다.
기능 검정에는 또한 항체/약물 접합체의 항암 활성, 예를 들어 존재하는 암 세포를 파괴하는 능력 또는 암 세포의 성장을 지연시키거나 예방하는 능력을 평가하기 위한 방법이 포함된다. 본 발명의 항체/약물 접합체에 의해 표적화된 암에는 원발성 및 전이된 종양 둘다 및 피험자에서 임의의 조직의 암종, 예를 들어 백혈병 및 림프종과 같은 암종 및 혈액성 암종이 포함된다.
성장 억제 활성을 갖는 항-5T4 항체는 5T4-발현 세포를 제거하거나 5T4-발현 세포의 증식을 예방 또는 감소시킬 수 있다. 세포 성장 억제의 빠른 시험관내 평가를 위한 대표적 방법은 문헌[참조: Jones et al. (2001) J. Immunol. Methods 254:85-98]에 기재되어 있다.
항-5T4 항체는 또한 세포 사멸, 예를 들어 핵 DNA 분해, 핵 변성 및 응축, 막 완전성의 손실 및 식세포작용을 특징으로 하는 프로그래밍된 세포 사멸을 유도하는 능력을 포함할 수 있다. 세포를 평가하는 대표적인 분석은 문헌[참조: Hoves et al. (2003) Methods 31:127-34; Peng et al. (2002) Chin. Med. Sci. J. 17:17-21; Yasuhara et al. (2003) J. Histochem. Cytochem. 51:873-885]에 기재되어 있다.
예를 들면, 시험관내 항-5T4 항체/칼리케아미신 접합체의 세포독성을 평가하기 위해, MDAMB435/5T4 세포 (사람 5T4 항원을 과발현하는 사람 유방 암종 세포) 및 MDAMB435/neo 세포(대조군 세포)를 본래 문헌[참조: Boghaert et al. (2004), Clin. Cancer Res., 10: 4538-4549]에 기재된 바와 같이 항체-칼리케아미신 접합체 또는 유리 칼리케아미신의 존재 하에서 배양한다. 각각의 제제의 세포독성은 ED50(ng/ml)으로 보고되고, 이는 처리하지 않은 대조군과 비교하여 세포 배양물의 50% 감소를 일으키는 접합체로서 또는 유리 약물로서 주어지는 칼리케아미신의 양이다. 배양물 중의 세포의 수는 약물 노출 후 생염색(vital dye)(MTS)을 사용하여 측정한다. 또한, 실시예 6을 참조한다.
항체/칼리케아미신 접합체의 세포독성은 또한 구상체(spheroid) 성장에 적합한 방식으로 배양된 MDAMB435/5T4 및 MDAMB435/neo 세포를 사용하여 평가할 수 있다. 세포를 항체/칼리케아미신 접합체 또는 유리 칼리케아미신의 존재 하에서 배양하고, 약물노출 후 각각의 구상체 치수를 측정하였다. 구상체 성장을 억제하는 각각의 제제의 효율성은 ED50(ng/ml), 즉 처리하지 않은 대조군과 비교하여 구상체 성장의 50% 억제를 일으키는 접합체로서 또는 유리 약물로서 주어지는 칼리케아미신의 양으로서 보고된다. 실시예 6을 참조한다.
생체내 항-5T4 항체/칼리케아미신 접합체의 세포독성을 평가하기 위해서, 종양은 MDAMB435/5T4 세포 (사람 5T4 항원을 과발현하는 사람 유방 암종 세포), NCI-H157 세포 (사람 비-소세포 폐암 세포), PC14PE6 세포(사람 비-소세포 폐암 세포) 또는 N87 세포(사람 위 암종 세포)의 피하 주사에 의해 누드 마우스에서 제조한다. 항체/칼리케아미신 접합체 및 대조군 화합물을 종양-보유 마우스에게, 예를 들어, 4일 간격으로 제공된 총 3회의 투여, 예를 들어, 1, 5 및 9일차에 복강내 주사로 투여한다. 측정가능한 치료적 결과에는 종양 세포 성장의 억제가 포함된다.
항-5T4 항체/칼리케아미신 접합체의 표적화 능력을 추가로 평가하기 위해서, 본래 문헌[참조: Onn et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9(15):5532-5539]에 기재된 바와 같이 비-소세포 및 소세포 암에 대한 동소(orthotopic) 모델을 사용할 수 있다. 간략히 설명하면, 사람 폐 선암종(PC14PE6) 세포를 누드 마우스의 꼬리 정맥에 주사하고 나면, 이동하여 폐에서 종양을 형성한다. 종양은 폐 실질조직에서 고형 결절로서 나타날 수 있고, 현탁된 종양 세포를 함유한 출혈성 흉막 삼출을 일으킬 수 있다. 대조군 화합물 및 항체/칼리케아미신 접합체를 종양-보유 마우스에게, 예를 들어, 종양 세포 주사 후 6일차에 시작하여 4일 간격으로 총 3회 투여, 예를 들어, 6, 10 및 14일차에 복강내 주사에 의해 투여한다. 측정가능한 치료적 결과에는 흉막 삼출 감소와 생존 증가가 포함된다.
V. 항-5T4 항체 및 항체/약물 접합체의 용도
본 발명의 항-5T4 항체 및 항체/약물 접합체는 5T4-발현 세포와 관련된 적용의 경우에 시험관내 및 생체내 모두에서 유용하다. 5T4를 발현하는 암에는 편평세포/선종 폐 암종(비-소세포 폐 암종), 침윤성 유방 암종, 결장 암종, 위 암종, 편평세포 자궁경부 암종, 침윤성 자궁내막 선암종, 침윤성 췌장 암종, 난소 암종, 편평세포 방광 암종 및 융모막암종이 포함된다. 5T4는 기관지, 유방, 결장, 직장, 위, 자궁경부, 자궁내막, 췌장, 난소, 융모막 및 정낭의 암종에서 높은 수준으로 검출된다.
V.A. 시험관내 적용
본 발명은 항-5T4 항체를 사용한 시험관내 방법을 제공한다. 예를 들면, 기술된 항체는 단독으로 또는 5T4-양성 암 세포에 특이적으로 결합하여 암 샘플로부터 이러한 세포를 격감시키는 세포독성제 또는 다른 약물과 함께 사용될 수 있다. 5T4-발현 세포를 세포독소에 접합된 항-5T4 항체를 포함하는 항체/약물 접합체와 접촉시켜 아폽토시스를 유도하고/하거나 세포 증식을 억제하는 방법이 또한 제공된다. 대표적인 시험관내 방법은 "항-5T4 항체 및 항체/약물 접합체의 특성규명을 위한 기능 검정"이라는 제목 하에 본원에서 앞서 기술되어 있다.
본 발명의 항-5T4 항체는 또한 5T4 항원에 특이적으로 결합하는 이들의 능력을 토대로 하여 시험관내에서 5T4-양성 세포를 검출하는데 유용성을 갖는다. 5T4-발현 세포를 검출하는 방법은 (a) 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 제조하고; (b) 항-5T4 항체를 생물학적 샘플과 시험관내에서 접촉시키고; (c) 항-5T4 항체의 결합을 검출함을 포함할 수 있다. 검출을 용이하게 하기 위하여, 항체를 표지에 접합시킬 수 있다.
V.B. 생체내 검출 및 진단
본 발명의 항-5T4 항체는 또한 예를 들어 수술중 보조를 제공하는 진단에 유용하거나 용량 결정에 유용한 생체내 검출 방법에 사용될 수 있다. 표지된 항-5T4 항체를 피험자에게 투여 후 및 결합에 충분한 시간 후, 항체에 결합된 5T4-발현 세포의 생체분포를 가시화할 수 있다. 상기한 진단 방법은 치료 방법과 함께 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항-5T4 항체는 검출 및 치료의 이중 목적을 위하여 투여될 수 있다.
대표적인 비-침윤성 검출 방법에는 섬광조영술 (예: SPECT(단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영), PET(양전자 방출 단층촬영), 감마 카메라 영상 및 직선형 스캐닝), 자기 공명 영상 (예: 통상 자기 공명 영상, 자화 전달 영상(MTI), 양성자 자기 공명 분광법(MRS), 확산 강조 영상(DWI) 및 기능적 MR 영상(fMRI)) 및 초음파가 포함된다.
V.C. 치료적 적용
본 발명은 추가로 피험자에서 5T4-발현 암 세포의 세포용해를 유도하는데 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 항-5T4 항체/약물 접합체는 암세포 및 비-신생물성 증식 질환의 세포, 예를 들어 과형성, 화생, 또는 가장 특히, 이상형성 세포의 성장을 억제하는데 유용하다[이러한 비정상적인 성장 상태의 고찰을 위해서는 문헌(참조: DeVita, Jr. et a. (2001), Cancer : Principles and Practice, 6th edition, Lippincott Williams & Wilkins)을 참조한다].
항-5T4 항체/약물 접합체를 사용하여 표적화하는데 적당한 암에는 유방, 결장, 직장, 폐, 입인두, 후두인두, 식도, 위, 췌장, 간, 담낭, 담관, 소장, 신장, 방광 및 요로상피를 포함하는 요로, 암컷 생식관, 자궁경부, 자궁, 난소, 수컷 생식관, 전립선, 정낭, 고환, 내분비선, 갑상선, 부신, 뇌하수체, 피부, 뼈, 연조직, 혈관, 뇌, 신경, 눈, 수막에서의 5T4-발현 원발성 및 전이성 종양이 포함된다. 다른 관련 암으로는 무통성, 공격성, 저등급, 중등급 또는 고등급의 백혈병 또는 림프종을 포함한 5T4-발현 백혈병 및 림프종(예: 호지킨(Hodgkin) 림프종 및 비-호지킨 림프종)이 있다.
특히, 5T4는 편평세포/선종성 폐 암종(비-소세포 폐 암종), 침윤성 유방 암종, 결장 암종, 위 암종, 편평세포 자궁경부 암종, 침윤성 자궁내막 선암종, 침윤성 췌장 암종, 난소 암종, 편평세포 방광 암종 및 융모막암종의 세포 상에 발현되는 것으로 공지되어 있다. 5T4는 기관지, 유방, 결장, 직장, 위, 자궁경부, 자궁내막, 췌장, 난소, 융모막 및 정낭의 암종 상에서 높은 수준으로 검출된다. 5T4 항원의 세포 표면 분포는 균일하거나 불균일할 수 있다. 결장 암종, 위 암종 및 난소 암종에서, 5T4의 발현은 질환 진행과 직접적으로 관련이 있다. 유방 암종에서, 전이 결절 상의 5T4 염색의 증가된 강도가 관찰되지만, 5T4 발현은 질환 단계와 관련이 없다. 암은 또한 유방, 결장, 위, 식도, 이자, 십이지장, 폐, 방광 및 신장 암종 및 위 및 섬 세포 신경내분비 종양을 포함한 루이스(Lewis) Y 탄수화물 항원을 발현할 수 있다[참조: 미국 특허 제6,310,185호].
따라서, 본 발명의 항-5T4/약물 접합체로 치료될 환자는, 5T4 항원의 증가된 발현을 포함하지만 이에 제한되지는 않는, 생체마커 발현을 기준으로 선택하여, 환자 집단이 종양 기원 또는 조직학보다는 증가된 표적 발현에 대해 선택되도록 할 수 있다. 표적 발현은 염색되는 세포 수와 염색되는 세포의 강도를 결합한 함수로서 측정될 수 있다. 예를 들면, 5T4의 고발현의 분류에는 30% 이상(즉, 40%, 50% 또는 60%)의 세포가 (1 내지 4등급에서) 3+ 수준에서 면역조직화학적 염색에 의해 5T4에 대해 양성으로 검사된 환자들이 포함되는 반면, 5T4의 중등 발현은 1+ 내지 2+에서 20% 이상의 세포가 염색된 환자들이 포함될 수 있다.
또한, 5T4 항원의 발현 이외의 생체마커를, 예를 들어, 다중-약물 내성(MDR)을 기준으로 한 종양의 특성규명을 포함한 환자 선택을 위해 사용할 수 있다. 거의 50%의 사람 암은 화학요법에 대해 완전하게 내성이거나 일시적으로만 반응하고, 이후, 통상적으로 사용되는 항암 약물에 의해 더 이상 영향을 받지 않는다. 이러한 현상을 MDR이라고 하고, 이는 몇몇 종양 종류에 의해 본래 발현되며, 나머지는 화학요법 치료에의 노출 후 MDR를 갖게 된다. 약물 유출 펌프 P-당단백질은 세포독성 화학요법과 관련된 대다수의 MDR을 매개한다. 암 환자 종양 표본에 존재하는 MDR 기전의 표현형 및 기능적 분석은, 특정한 MDR 기전(들)을 특정한 종양 종류에서 화학요법에 대한 내성과 관련시키기 위해 수행될 수 있다.
암 성장 또는 비정상 증식은 세포내에서 더 발전된 암 형태 또는 질환 상태로의 변화를 시사하는 다수의 지표 중의 어느 하나를 말한다. 암 세포 또는 비-신생물성 증식 질환 세포의 성장 억제는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 지연된 종양 성장 및 전이 억제에 의해 분석할 수 있다. 암 성장의 억제를 측정하는 다른 지표에는 암 세포 생존 감소, 종양 용적 감소 또는 형태학 (예를 들어, 컴퓨터 단층촬영(CT), 음파촬영술 또는 다른 영상 방법을 사용하여 측정됨), 종양 혈관계 파괴, 지연된 과민성 피부 시험에서 향상된 수행도, 세포용해 T-림프구 활성의 증가 및 종양-특이적 항원 수준의 감소가 포함된다.
어떠한 단일 실시 방식에도 제한되는 의도 없이, 항-5T4 항체/약물 접합체의 항원-유도된 표적화 뿐만 아니라 수동적 표적화 둘 모두는 항종양 효능에 기여할 수 있다. 항원-유도된 표적화는, 대조군 조직 (즉, 5T4-발현 세포의 실질적 결여가 의심되고, 투여된 항-5T4/약물 접합체의 결합 및/또는 축적이 의심되는 조직)과 비교하여 표적 조직 (즉, 5T4-발현 세포를 포함하고 항-5T4/약물 접합체의 축적을 위해 의도된 부위를 포함하는 조직) 내의 펩타이드 또는 펩타이드 유사체의 선택적인 이동 및/또는 축적을 말한다. 항체/약물 접합체의 선택적인 국소화는, 일반적으로 표적 조직내 항체/약물 접합체의 양이 대조군 조직내 항체/약물 접합체의 양보다 약 2배, 예를 들어 약 5배 이상 또는 약 10배 이상이 되는 것이다.
수동적 표적화는 일반적으로 혈관계내 국소 변화로 인한 종양 부위에서의 항체 또는 항체/약물 접합체의 격리화를 말한다. 예를 들면, 항-5T4/약물 접합체는 증가된 VEGF 생성으로 인해 천공된(fenestrated) 종양 부위에서 혈관계를 벗어나, 5T4-발현 세포에 결합하여, 항-5T4/약물 접합체의 내재화를 유발할 수 있다. 종양의 불량한 정맥 및 림프 유출은 또한 결합되지 않은 항-5T4/약물 접합체의 격리화를 일으킨다. 산 불안정 링커를 갖는 약물에 접합된 항체는 약물을 방출할 수 있고, 약물은 이어서 종양 세포내로 확산된다. 수동적 표적화의 항-종양 효과는 항원-유도된 표적화에 의해 유도된 정도로 강력하거나 영구적이지 않지만, 총 효능에는 기여할 수 있다.
V.D. 제형
본 발명의 항-5T4 항체 및 항-5T4/약물 접합체는 안전하고 효능이 있는 임상 사용을 위해 용이하게 제조되고 제형화된다. 피험자에게 투여하는데 적합한 제형에는 항산화제, 완충제, 세균 발육억제제, 항균제 및 항진균제(예: 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 및 티메로살), 대상 수용자의 체액과 등장성인 제형이 되게 하는 용질 (예: 당, 염 및 폴리알코올), 현탁화제 및 증점제를 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사 용액이 포함된다. 적합한 용매에는 물, 에탄올, 폴리올 (예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이의 혼합물이 포함된다. 제형은 단위-투여 또는 다중-투여 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 의도된 적용에 적합한 동위원소로 방사선표지된 후에 및 피험자 투여에 사용하기 직전 멸균 액체 담체의 첨가만을 필요로 하는 동결되거나 동결건조된(냉동건조된) 상태로 보관될 수 있다. 본 발명의 항-5T4 항체 및 항체/약물 접합체는 바람직하게는 아래에 기술된 유효량으로 제형화된다.
하나의 예로서, 대표적인 항-5T4 항체 또는 항-5T4/약물 접합체 제형은 40mg/ml 항체 또는 항체/약물 접합체, 25 mM 아세테이트, 150 mM 트레할로스, 0.9% 벤질 알코올, 0.02% 폴리소르베이트 20 (pH 5.0)을 포함하고, 2 내지 8℃에서 2년 보관의 최소 저장 수명을 갖는다. 또다른 예로서, 항-5T4 항체 또는 항-5T4/약물 접합체 제형은 9.0 mg/ml 염화나트륨 중의 10mg/ml 항체 또는 항체/약물 접합체, 7.35 mg/ml 시트르산나트륨 2수화물, 0.7 mg/ml 폴리소르베이트 80 및 멸균수 (pH 6.5)를 포함할 수 있다. 실험 마우스 모델에게 투여하기 위한 항-5T4/칼리케아미신 접합체의 대표적 제형은 2㎍ 또는 4㎍ 칼리케아미신(실시예 3, 4 및 7 참조)을 포함하고, 이는 사람에게 투여하는데 따라 계량될 수 있다.
항-5T4 항체 또는 항체/약물 접합체의 안정한 동결건조된 제형은, (a) 항체/약물 접합체를 1.5중량% 내지 5중량% 농도의 동결보호제, 0.5 내지 1.5중량% 농도의 중합체성 팽화제, 농도 0.01M 내지 0.1M의 전해질, 0.005중량% 내지 0.05중량% 농도의 용해 촉진제, 용액의 최종 pH가 7.8 내지 8.2가 되도록 하는 5 내지 50mM 농도의 완충제 및 물을 포함한 용액 중에 0.5 내지 2mg/ml의 최종 농도로 용해시키고; (b) 상기 용액을 +5℃ 내지 +10℃의 온도에서 바이알에 분배하고; (c) 상기 용액을 -35℃ 내지 -50℃의 동결 온도에서 동결시키고; (d) 상기 동결시킨 용액을 저장 온도 -10℃ 내지 -40℃에서 24 내지 78시간 동안 20 내지 80마이크론의 1차 건조 압력에서 초기 동결 건조시키고; (e) 상기 (d) 단계의 동결 건조된 생성물을 보관 온도 +10℃ 내지 +35℃에서 15 내지 30시간 동안 20 내지 80마이크론의 건조 압력에서 2차 건조시킴에 의해 제조할 수 있다.
동결보호제의 동결건조에 유용한 대표적인 동결보호제에는 알디톨, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 폴리에틸렌 글리콜, 알돈산, 우론산, 알다르산, 알도스, 케토스, 아미노 당, 알디톨, 이노시톨, 글리세르알데하이드, 아라비노스, 라익소스, 펜토스, 리보스, 자일로스, 갈락토스, 글루코스, 헥소스, 아이도스, 만노스, 탈로스, 헵토스, 글루코스, 프럭토스, 글루콘산, 소르비톨, 락토스, 만니톨, 메틸 α-글루코피라노시드, 말토스, 이소아스코르브산, 아스코르브산, 락톤, 소르보스, 글루카르산, 에리트로스, 트레스, 아라비노스, 알로스, 알트로스, 글로스, 아이도스, 탈로스, 에리트룰로스, 리불로스, 자일룰로스, 프시코스, 타가토스, 글루쿠론산, 글루콘산, 글루카르산, 갈락투론산, 만누론산, 글루코사민, 갈락토사민, 슈크로스, 트레할로스, 뉴라민산, 아라비난, 프럭탄, 푸칸, 갈락탄, 갈락투로난, 글루칸, 만난, 자일란, 레반, 푸코이단, 카라기난, 갈락토카롤로스, 펙틴, 펙틴산, 아밀로스, 풀룰란, 글리코겐, 아밀로펙틴, 셀룰로스, 덱스트란, 푸스툴란, 키틴, 아가로스, 케라틴, 콘드로이틴, 더마탄, 히알루론산, 알긴산, 크산탄검, 전분, 슈크로스, 글루코스, 락토스, 트레할로스, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 글리세롤 및 펜타에리트리톨이 포함된다.
예를 들면, 동결보호제 슈크로스는 1.5중량%의 농도로 사용될 수 있고, 중합체성 팽화제 덱스트란 40 또는 하이드록시에틸 전분 40은 0.9중량%의 농도로 사용될 수 있으며, 동결건조화 용액 중에 사용되는 전해질은 염화나트륨이고, 이는 0.05M 농도로 존재하며, 완충제 트로메타민은 0.02M의 농도로 사용될 수 있다. 용해 촉진제 (예: 폴리소르베이트 80과 같은 계면활성제)를 또한 동결건조화 공정 동안 사용할 수 있다. 일반적으로 이러한 용해 촉진제는 계면활성제이다. 동결건조된 제형의 제조를 위한 대표적인 단계에는 바이알을 -45℃의 온도에서 동결시키는 단계; 동결된 용액을 60마이크론의 1차 건조 압력 및 -30℃의 보관 온도에서 60시간 동안 초기 동결 건조시키는 단계; 및 동결-건조시킨 생성물을 60마이크론의 건조 압력 및 +25℃의 온도의 보관 온도에서 24시간 동안 2차 건조시키는 단계가 포함된다.
항-5T4 항체 및 항체/약물 접합체는 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들어 크고 서서히 대사되는 고분자, 예를 들어 단백질, 폴리펩타이드, 리포좀, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자 중에 제형화된다. 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들어 무기산 염, 예를 들어 염산염, 브롬산염, 인산염 및 황산염 또는 유기산 염, 예를 들어 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트가 또한 사용될 수 있다. 제형은 액체, 예를 들어 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 추가로 함유할 수 있고/있거나 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제가 이러한 조성물 중에 존재할 수 있다. 이러한 담체는, 조성물을 환자 섭취용 정제, 환제, 당의정, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리 및 현탁액제로 제형화할 수 있게 한다.
V.E. 용량 및 투여
본 발명의 항-5T4 항체 및 항-5T4/약물 접합체는 비경구, 예를 들어 정맥내, 피하, 복강내 및 근육내 투여를 통해 투여될 수 있다. 폐 경로로 조성물을 전달하기 위하여, 조성물은 에어로졸 또는 조제 스프레이, 즉, 경비강 투여로서 투여될 수 있다. 협막내, 연수내 또는 심실내 투여는 중추신경계(CNS) 암 및 CNS-관련 암 치료를 위해 사용될 수 있다. 항-5T4 항체 및 항-5T4/약물 접합체는 또한 경피, 경피부, 국소, 장, 질내, 설하 또는 직장 투여될 수 있다. 정맥내 투여는 임상에서 통상적으로 사용될 수 있다. 전달 방법은 고려사항, 예를 들어 치료될 상태 및 부위, 항체 제형의 유형 및 조성물의 치료적 효능에 따라 선택된다.
본 발명은, 유효량의 항-5T4 항체 및 항-5T4/약물 접합체, 즉 목적하는 생물학적 반응을 유도하기에 충분한 항-5T4 항체 또는 항-5T4/약물 접합체의 양을 피험자에게 투여함을 제공한다. 예를 들면, 암-보유 피험자에게 투여하는 경우, 유효량은 암 세포 세포용해, 암 세포 증식 억제, 암 세포 아폽토시스의 유도, 암 세포 항원의 감소, 지연된 종양 성장 및/또는 전이 억제를 포함한 항암 활성을 유도하기에 충분한 양을 포함한다. 종양 수축은 효능에 대한 임상 대용 마커로서 충분히 허용된다. 충분히 허용되는 또다른 효능 마커는 무진행 생존이다. 항-5T4/칼리케아미신 접합체는 일반적으로 중요한 효능 매개변수, 예를 들어 생존 중앙값의 향상, 종양 진행으로의 시간 및 전반적 반응 속도에서 25% 이상의 향상을 나타낸다.
일반적으로, 유효량은 약 0.01 mg/m2 내지 약 50 mg/m2, 예를 들어 약 0.1 mg/m2 내지 약 20 mg/m2, 또는 약 15 mg/m2의 범위일 것이고, 이러한 용량은 항-5T4 항체의 양을 기준으로 계산된다. 항-5T4/약물 접합체의 유효량은 또한 접합된 약물의 양을 기준으로 계산될 수 있다. 예를 들면, 실험 마우스 모델에게 투여하기 위한 항-5T4/칼리케아미신 접합체의 대표적인 용량은 2㎍ 또는 4㎍의 칼리케아미신을 포함하고, 이는 사람에게 투여하기 위해서 적절히 정량될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항-5T4/칼리케아미신 접합체는 3주에 한번씩 6회 주기 이하로 사람 환자에게 투여될 수 있다. 방사선표지된 항-5T4 항체의 경우, 유효량은 항체의 결합 친화도 및 방사성 동위원소에 따라서 통상적으로 약 1 mCi 내지 약 300 mCi, 일반적으로 약 5 mCi 내지 100 mCi의 범위이다.
기술된 항-5T4 항체를 사용하여 5T4-양성 세포를 검출하기 위해서, 본 발명의 조성물의 검출가능한 양, 즉 항체의 존재가 시험관내 또는 생체내에서 측정될 수 있는 만큼의 항-5T4 항체의 용량을 피험자에게 투여한다. 방사성 동위원소를 사용한 섬광조영술 영상화의 경우, 방사성 동위원소의 통상적인 용량은 약 10 μCi 내지 50 mCi, 또는 약 100 μCi 내지 25 mCi, 또는 약 500 μCi 내지 20 mCi, 또는 약 1 mCi 내지 10 mCi, 또는 약 10 mCi의 활성을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 중의 활성 성분의 실제 용량 수준은 목적하는 진단 또는 치료 결과를 달성하기에 유효한 조성물의 양이 투여되도록 달라질 수 있다. 투여 방법도 달라질 수 있다. 단일 주사 또는 수회 주사가 사용될 수 있다. 선택된 용량 수준 및 방법은 치료학적 조성물의 활성 및 안정성(즉, 반감기), 제형, 투여 경로, 다른 약물 또는 치료와의 병용, 검출되고/되거나 치료될 질환 또는 질병 및 치료될 피험자의 과거 병력 및 물리적 상태를 포함한 다양한 요인에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 항-5T4 항체 및 항-5T4/약물 접합체에 있어서, 치료학적 유효량은 처음에는 세포 배양 분석 또는 동물 모델, 예를 들어 설치류, 토끼, 개, 돼지 및/또는 영장류에서 추정될 수 있다. 동물 모델을 사용하여 적합한 농도 범위 및 투여 경로를 결정할 수도 있다. 이어서, 이러한 정보는 사람에서 유용한 투여 경로 및 용량을 결정하는데 사용될 수 있다. 통상적으로, 최소 용량을 투여되고, 용량 제한 세포독성의 부재 하에서 용량을 단계적으로 상승시킨다. 유효량 또는 용량의 결정 및 조절뿐만 아니라 이러한 조절을 하는 시점 및 방법의 평가는 의학 분야의 숙련자에게 공지되어 있다.
병용 요법의 경우, 항-5T4 항체, 항-5T4/약물 접합체 및/또는 추가적인 치료제 또는 진단제는 의도된 치료 또는 진단 수행에 적합한 임의의 시간 계획 내에 투여된다. 따라서, 단일 제제들은 실질적으로 동시에 (즉, 단일 제형으로서, 또는 수분 또는 수시간 이내에) 또는 임의의 순서로 연속적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 단일 제제 치료는 서로 약 1년 이내에, 예를 들어 약 10, 8, 6, 4, 또는 2개월 이내에, 또는 4, 3, 2 또는 1주 이내에, 또는 약 5, 4, 3, 2 또는 1일 이내에 투여될 수 있다.
제형, 용량, 투여 방법 및 측정가능한 치료 결과와 관련된 추가의 지시는 문헌[참조: Berkow et al. (2000) The Merck Manual of Medical Information, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, New Jersey; Ebadi (1998) CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology. CRC Press, Boca Raton, Florida; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pennsylvania; Katzung (2001) Basic & Clinical Pharmacology, Lange Medical Books/McGraw-Hill Medical Pub. Div., New York; Hardman et al. (2001) Goodman & Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, The McGraw-Hill Companies, Columbus, Ohio; Speight & Holford (1997) Avery's Drug Treatment : A Guide to the Properties , Choices , Therapeutic Use and Economic Value of Drugs in Disease Management, Lippincott, Williams, & Wilkins, Philadelphia, Pennsylvania]을 참조한다.
V.F. 병용 요법
기술된 항-5T4 항체 및 항-5T4/약물 접합체는 초기 치료로서 또는 통상적인 치료에 반응하지 않는 상태의 치료를 위해 투여될 수 있다. 또한, 항-5T4 항체 및 항-5T4/약물 접합체를 다른 요법 (예: 수술적 절제술, 방사선, 추가적인 항암 약물 등)과 함께 사용하여 몇몇 항암제의 간세포독성을 감소시키고/시키거나 부가적이거나 약효가 증가된 치료 효과를 유도할 수 있다. 본 발명의 항-5T4 항체 및 항-5T4/약물 접합체는 추가적인 제제와 공동-투여 또는 공동-제형화되거나, 임의의 순서로 추가적인 제제와 연속적으로 투여되도록 제형화될 수 있다.
병용 요법에 유용한 대표적인 제제에는 항-5T4/약물 접합체 제조에 유용한 본원에서 앞서 기술된 임의의 약물이 포함된다. 본 발명의 항-5T4 항체 및 항-5T4/약물 접합체는 또한 기재된 항-5T4 항체 이외의 항-5T4 항체를 포함한 다른 치료용 항체 및 항체/약물 접합체 뿐만 아니라 항체 및 상이한 항원을 표적화하는 접합체와 함께 사용될 수 있다. 단독 또는 항체/약물 접합체로서 사용될 수 있는 대표적인 항체에는 항-CD19 항체, 항-CD20 항체 (예: RITUXAN®, ZEVALIN®, BEXXAR®), 항-CD22 항체, 항-CD33 항체 (예: MYLOTARG®), 항-CD33 항체/약물 접합체, 항-루이스 Y 항체 (예: Hu3S193, Mthu3S193, AGmthu3S193), 항-HER-2 항체 (예: HERCEPTIN®(트라스투주맙), MDX-210, OMNITARG®(퍼투주맙, rhuMAb 2C4)), 항-CD52 항체 (예: CAMPATH®), 항-EGFR 항체 (예: ERBITUX®(세툭시맙), ABX-EGF(파니투무맙)), 항-VEGF 항체 (예: AVASTIN®(베바시주맙)), 항-DNA/히스톤 복합체 항체 (예: ch-TNT-1/b), 항-CEA 항체 (예: CEA-Cide, YMB-1003) hLM609, 항-CD47 항체 (예: 6H9), 항-VEGFR2 (또는 키나제 삽입 도메인-함유 수용체, KDR) 항체 (예: IMC-1C11), 항-Ep-CAM 항체 (예: ING-1), 항-FAP 항체 (예: 시브로투주맙), 항-DR4 항체 (예: TRAIL-R), 항-프로게스테론 수용체 항체 (예: 2C5), 항-CA19.9 항체 (예: GIVAREX®) 및 항-피브린 항체 (예: MH-1)가 포함된다.
항-5T4 항체/약물 접합체는 또한 치료 방법의 일부로서 세포독성제의 하나 이상의 배합물과 함께 투여될 수 있다. 이러한 목적에 유용한 세포독성제에는 CHOPP(사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진); CHOP(사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손); COP (사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손); CAP-BOP(사이클로포스파미드, 독소루비신, 프로카바진, 블레오마이신, 빈크리스틴 및 프레드니손); m-BACOD(메토트렉세이트, 블레오마이신, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 덱사메타손 및 류코보린; ProMACE-MOPP(프레드니손, 메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 에토포시드, 류코보린, 메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진); ProMACE-CytaBOM(프레드니손, 메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 에토포시드, 류코보린, 사이타라빈, 블레오마이신 및 빈크리스틴); MACOP-B(메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손, 블레오마이신 및 류코보린); MOPP(메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진); ABVD(아드리아마이신/독소루비신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 다카바진); ABV(아드리아마이신/독소루비신, 블레오마이신, 빈블라스틴)와 교대로 MOPP(메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진); ABVD(아드리아마이신/독소루비신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 다카바진)와 교대로 MOPP(메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진); ChIVPP(클로람부실, 빈블라스틴, 프로카바진, 프레드니손); IMVP-16(이포스파미드, 메토트렉세이트, 에토포시드); MIME(메틸-gag, 이포스파미드, 메토트렉세이트, 에토포시드); DHAP(덱사메타손, 고용량 사이타리빈 및 시스플라틴); ESHAP(에토포시드, 메틸프레디솔론, HD 사이타라빈 및 시스플라틴); CEPP(B)(사이클로포스파미드, 에토포시드, 프로카바진, 프레드니손 및 블레오마이신); CAMP(로무스틴, 미톡산트론, 사이타라빈 및 프레드니손); 및 CVP-1(사이클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손); DHAP(시스플라틴, 고용량 사이타라빈 및 덱사메타손); CAP(사이클로포스파미드, 독소루비신, 시스플라틴); PV(시스플라틴, 빈블라스틴 또는 빈데신); CE(카보플라틴, 에토포시드); EP(에토포시드, 시스플라틴); MVP(미토마이신, 빈블라스틴 또는 빈데신, 시스플라틴); PFL(시스플라틴, 5-플루로우라실, 류코보린); IM(이포스파미드, 미토마이신); IE(이포스파미드, 에토포시드); IP(이포스파미드, 시스플라틴); MIP(미토마이신, 이포스파미드, 시스플라틴); ICE(이포스파미드, 카보플라틴, 에토포시드); PIE(시스플라틴, 이포스파미드, 에토포시드); 비오렐빈 및 시스플라틴; 카보플라틴 및 파클리탁셀; CAV(사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴); CAE(사이클로포스파미드, 독소루비신, 에토포시드); CAVE(사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 에토포시드); EP(에토포시드, 시스플라틴); 및 CMCcV(사이클로포스파미드, 메토트렉세이트, 로무스틴, 빈크리스틴)이 포함된다.
항-5T4 항체 및 항-5T4/칼리케아미신 접합체는 전신성 항암 약물, 예를 들어 에피틸론(BMS-247550, Epo-906), 탁산의 재제형화(아브락산, 자이오탁스), 미세소관 억제제(MST-997, TTI-237)와 함께, 또는 표적화된 세포독소, 예를 들어 CMD-193 및 SGN-15와 함께 사용될 수 있다. 추가적인 유용한 항암제에는 TAXOTERE®, TARCEVA®, GEMZAR®(겜시타빈), 5-FU, AVASTIN®, ERBITUX®, TROVAX®, 아나투모맙 마페나톡스, 레트라졸, 독세탁셀 및 안트라사이클린이 포함된다.
병용 요법에 있어서, 항-5T4 항체, 항-5T4/약물 접합체 및/또는 하나 이상의 추가적인 치료제 또는 진단제는 의도된 치료 또는 진단의 수행에 적합한 임의의 시간 계획 내에 투여된다. 따라서, 단일 제제는 실질적으로 동시에 (즉, 단일 제형으로서, 또는 수분 또는 수시간 이내에) 또는 임의의 순서로 연속적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 단일 제제 치료는 서로 약 1년 이내에, 예를 들어 약 10, 8, 6, 4 또는 2개월 이내에, 또는 4, 3, 2 또는 1주 이내에, 또는 약 5, 4, 3, 2 또는 1일 이내에 투여될 수 있다. 항-5T4 항체 또는 항-5T4/칼리케아미신 접합체를 제2 치료제와 함께 투여하는 것은 바람직하게는 단독 투여보다 더 우수한 효과를 유도한다.
다음의 실시예는 본 발명의 방식을 예시하기 위해서 포함되었다. 다음 실시예의 특정 양태는 본 발명의 실시에서 잘 수행되도록 본 공동발명자들에 의해 발견되거나 고려된 기술 및 방법에 관해서 기술하고 있다. 이들 실시예는 공동발명자 들의 표준 실험 실시를 예시한다. 본 공개 및 당업자의 일반적 수준에 비추어, 당업자는 다음의 실시예가 단지 예시 목적이고 많은 변화, 변형 및 대안들이 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시예 1
쥐 항-5T4 항체
항-5T4 항체를 사람 5T4 항원 및 면역화를 위한 표준 방법을 사용하여 마우스에서 제조하였다. A1, A2 및 A3 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주는 개개의 B 세포와 골수종 세포와의 융합에 의해 제조되었다.
A1, A2 및 A3 항-5T4 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 SMART® cDNA 합성 시스템[판매원: Clontech Laboratories Inc., Mountain View, California]을 사용하여 클로닝한 후, PCR 증폭시켰다. cDNA를 POWERSCRIPTTM 역전사효소[판매원: Clontech Laboratories Inc.]와 함께 올리고(dT) 및 SMART® IIA 올리고[판매원: Clontech Laboratories Inc.]를 사용하여 A1, A2 또는 A3 하이브리도마 세포로부터 분리된 1㎍의 전체 RNA로부터 합성하였다. 이어서, cDNA를 VENT® 폴리머라제[판매원: New England Biolabs Inc., Ipswich, Massachusetts]와 함께 SMART® IIA 올리고 서열에 어닐링되는 프라이머 및 마우스 불변 영역 특이적 프라이머(경쇄용 마우스 카파, A1 중쇄용 마우스 IgG2a, A2 중쇄용 마우스 IgG2b 및 A3 경쇄용 마우스 IgG1)를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 PCR 생성물을 pED6 발현 벡터 속으로 서브클로닝하고, 핵산 서열을 결정하였다. 이러한 방법은, 어떠한 것도 DNA 서열의 사전 지식이 요구되지 않는다는 이점이 있다. 또한, 수득된 DNA 서열은 축퇴 PCR 프라이머를 사용하여 변형되지 않는다.
A1, A2 및 A3 중쇄 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 1의 뉴클레오타이드 58-414, 서열번호 5의 뉴클레오타이드 55-405 및 서열번호 9의 뉴클레오타이드 58-423으로 제시된다. A1, A2 및 A3 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 2의 잔기 20-138, 서열번호 6의 잔기 19-135 및 서열번호 10의 잔기 20-141로서 제시된다. A1, A2 및 A3 경쇄 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 3의 뉴클레오타이드 61-381, 서열번호 7의 뉴클레오타이드 67-390 및 서열번호 11의 뉴클레오타이드 61-381로서 제시된다. A1, A2 및 A3 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 4의 잔기 21-127, 서열번호 8의 잔기 23-130 및 서열번호 12의 잔기 21-127로서 제시된다. 또한 도 1A 내지 1C를 참조한다.
A1, A2 및 A3 항-5T4 가변 영역 서열의 신규성을 평가하기 위해, BLASTp 검색(단백질 조회 서열용)을 기대치(Expect)=10, 단어 크기(Word Size)=3, 저 복잡성 필터 및 BLOSUM62 매트릭스, 허용하는 갭 존재 값(gap costs of existences)=11 및 연장=1의 기본 매개변수를 사용하여 수행하였다. BLASTn 검색(뉴클레오타이드 조회 서열용)은 기대치=10, 단어 크기=11 및 저 복잡성 필터의 기본 매개변수를 사용하여 수행하였다. BLAST 검색 결과는 E 값에 따라 랭크된 조회 서열과 관련된 서열의 목록으로서 기록되고, 이는 데이터베이스에서 확인된 매치의 통계적 유의성의 지표이다. BLAST 분석을 위해 사용된 가변 영역 서열과 가장 가깝게 관련된 서열은 표 1 (BLASTn) 및 표 2 (BLASTp)에서 확인된다.
Figure 112008070916106-pct00002
Figure 112008070916106-pct00003
실시예 2
쥐 항-5T4 항체의 결합 특이성 및 친화성
A1, A2 및 A3 항체의 결합 특이성 및 친화성을 평가하기 위해서, BIACORE® 분석을 CM5 칩 상에 고정된 사람 5T4 항원을 사용하여 수행하였다. BIACORE® 기술은 항체를 층위에 고정된 5T4 항원과 결합시키는 경우 표면 층에서의 굴절률 변화를 사용한다. 결합은 표면으로부터 굴절되는 레이저 빛의 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 검출된다. 시그날 반응속도론 온(on) 속도 및 오프(off) 속도의 분석은 비특이적 상호작용과 특이적 상호작용을 구별할 수 있게 한다. H8 항-5T4 항체는 대조군으로서 사용하였다. H8은 PCT 국제 공개번호 제WO 98/55607호 및 문헌[참조: Forsberg et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(19): 124430-12436]에 기재된 하이브리도마-생성된 모노클로날 마우스 IgG1 항체이다.
Figure 112008070916106-pct00004
BIACORE® 결과는 A2 및 A3 항체와 비교하는 경우 H8 및 A1 항체가 5T4에 대하여 더 높은 친화성을 갖는다는 것을 보여준다. A2는 상대적으로 낮은 친화성 항체이다. 특별한 시스테인이 A1 중쇄 가변 영역의 잔기 67 및 A3 중쇄 가변 영역의 잔기 91에 존재한다. 이러한 잔기를 페닐알라닌(A1) 또는 티로신(A3)으로 치환시켜도 항체 결합 특성 또는 발현 수준이 변화되지 않았다.
H8, A1, A2 및 A3 항체의 결합 친화도는 또한 CT26/5T4 세포 용해물을 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였고, H8, A1 및 A3에 의한 강한 결합이 확인되었다. 도 2를 참조한다.
5T4 항원을 발현하는 세포에 결합하는 H8, A1, A2 및 A3 항체의 능력은 PC14PE6 세포의 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 사용하여 검정하였다. 모든 항체는 5T4-발현 PC14PE6 세포에의 특이적 결합을 나타내었지만, A2 결합 수준은 H8, A1 및 A3에 있어서 관찰된 것보다 상당히 더 낮았다. 표 4를 참조한다.
Figure 112008070916106-pct00005
항체 생산에서 가능한 변이성을 평가하기 위해서, A1 및 H8의 2개의 독립적인 제제를 검사하였다. 각각의 항체의 결합 및 반응속도론 특성은 각각의 제제와 비교한 경우 유의적으로 상이하지 않았다. 도 3A 내지 3B를 참조한다.
실시예 3
5T4-발현 세포에 의한 쥐 항-5T4 항체의 내재화
5T4 항원에의 결합시 항체의 내재화를 평가하기 위해서, 세포 표면에서와 상청액 중에서 검출된 H8 및 A1 항체의 양을 시간의 함수로서 측정하였다. 비-효소적으로 분리된 MDAMB435/5T4 세포(사람 유방암 세포)를 4℃에서 1시간 동안 항-5T4 항체에 노출시켰다. 세포를 세척하고, 37℃에서 4시간 또는 24시간 동안 배지 중에 배양하였다. 세포막에 결합된 항체 대 결합되지 않은 항체(즉, 상청액 중에 존재)의 양을 FACS를 사용하여 측정하였다. MDAMB435/5T4 세포의 표면으로부터 5T4 항체가 없어지는 것은 세포 표면에서 5T4 항원/항체 복합체의 조절을 증명하는 것이고, 이는 내재화 및/또는 분리를 나타내는 것일 수 있다. 도 4A 내지 4C를 참조한다.
실시예 4
5T4 키메라를 사용한 에피토프 맵핑
각각의 A1, A2, A3 및 H8 항체가 결합하는 에피토프를 확인하기 위해, ELISA 분석은 (1) 결실되거나 돌연변이된 서열을 갖는 5T4 엑토도메인 Fc 작제물 및 (2) COS-1 세포에서 일시적으로 발현된 5T4 키메라 작제물을 사용하여 수행하였다. 엑토도메인은 아미노-말단 영역, 2개의 류신-풍부 반복부 및 개재 친수성 영역을 포함한다. 사람 IgG1 유래의 Fc 불변 영역 및 5T4 엑토도메인을 함유하는 융합 단백질은 마우스 5T4(아미노산 1-361), 랫트 5T4(아미노산 1-361), 사이노몰거스 원숭이 5T4(아미노산 1-355), 침팬지 5T4(아미노산 1-355) 및 검은 꼬리 마모셋(아미노산 1-355)을 사용하여 제조하였다. 5T4 키메라 작제물은 도 5에 제시되어 있다. 결합 결과는 표 5에 요약되어 있고, 이는 각각의 H8, A1, A2 및 A3 항체에 의한 특이적 결합, 부분적 결합 또는 결합 결여를 나타낸다. 사람화된 H8 및 키메릭 A1, A2 및 A3 항체는 각각 쥐 H8, A1, A2 및 A3과 유사한 결합 특성을 나타내었다.
이러한 결과를 근거로 하여, 사람화된 H8 항체가 잔기 173과 252 사이에서 사람 5T4에 결합하는 것으로 결정하였다. 사람화된 H8은 잔기 344에서 N-연결된 글리코실화된 또는 글리코실화되지 않은 5T4에 결합하므로, 사람화된 H8과 사람 5T4와의 결합이 막 근위부가 아닌 것이 확인된다. A1 항체는 잔기 173과 252 사이에서 사람 5T4와 1차 접촉을 갖고, 잔기 282와 361 사이에서 사람 5T4와 2차 접촉을 갖는다. A2 항체는 잔기 282와 361 사이에서 사람 5T4에 결합한다. A3 항체는 잔기 83과 163 사이에서 사람 5T4의 첫번째 류신-풍부 반복 영역에 결합한다. 각각의 항체에 의해 결합된 에피토프는 도 7에 제시되어 있다.
Figure 112008070916106-pct00006
사람 및 사이노몰거스 원숭이 유래의 5T4 엑토도메인에 대해 관찰된 상이한 결합을 근거로 하여, 항체 결합에 관여하는 잔기가 구별되도록 표적화된 돌연변이를 제조하였다. 사람화된 H8 항체의 결합은 아래의 표 6에 기록된 돌연변이된 5T4 엑토도메인 각각, 즉, 표시된 위치에서 사이노몰거스 원숭이 유래의 잔기를 포함하는 사람 5T4 엑토도메인에 대해 검정하였다. 이들 결과는, 사람 5T4 항원의 잔기 213 및 214는 사람화된 H8에 의해 결합된 에피토프를 위해 필요하다는 것을 보여주었다.
Figure 112008070916106-pct00007
직접적 결합 검정 외에도, 비오티닐화된 사람화된 H8 항체 및 각각의 A1, A2 또는 A3 항체를 사용하여 경쟁적 결합 검정을 수행하였다. 사람 5T4에의 결합 억제는 관찰되지 않아, 각각의 A1, A2 및 A3은 H8 항체에 의해 결합된 것과 상이한 5T4 에피토프에 결합한다는 것을 지지하였다. 도 6A-6을 참조한다.
실시예 5
BIACORE®를 사용한 에피토프 맵핑
H8, A1, A2 및 A3 항체의 에피토프 맵핑도 결합된 사람 5T4 항원을 함유한 CM5 칩을 사용한 BIACORE®를 사용하여 수행하였다. 칩을 H8, A1, A2 또는 A3 항체로 포화시키고, 1차 반응을 측정하였다. 이어서, 칩을 H8, A1, A2 및 A3 항체 가운데로부터의 2차 항체로 포화시켜 2차 반응을 측정하였다. 수회의 실험을 위해, 칩을 10mM의 글리신, pH 1.5에서 결합된 항체의 분리에 의해 재생시킨 후, 완충액 세척을 하였다. 결과를 하기 표 7에 요약한다. 제시된 %는 CM5 칩과의 2차 항체에 의한 직접적 결합시 측정된 반응 단위를 1차 항체로 포화시킨 CM5 칩과 2차 항체의 결합시 측정된 반응 단위로 나눈 것이다. 이러한 결과는 H8, A1, A2 및 A3 각각이 사람 5T4 상의 상이한 에피토프에 결합한다는 것을 보여준다. H8 및 A3 항체에 의해 결합된 에피토프는 입체적으로 서로 유사하여, H8 결합을 A3의 존재 하에서 검정하는 경우 항원과의 결합 속도가 감소되며 그 역도 성립한다. 유사한 결과가 키메릭 및 사람화된 H8, A1, A2 및 A3 항체를 사용하여 얻어졌고, 이들은 본원에서 아래의 실시예 7에 기술된 바와 같이 제조되었다. 표 8을 참조한다.
Figure 112008070916106-pct00008
Figure 112008070916106-pct00009
키메릭 작제물(실시예 4 참조) 및 BIACORE®를 사용하여 측정된 에피토프 맵핑 연구를 종합한 결과는 도 7에 제시되어 있다.
실시예 6
항-5T4/칼리케아미신 접합체의 효능
다양한 치료에 노출시킨 후 생존 세포의 수를 측정하기 위해 생염색(vital dye)(MTS)을 사용하였다. MTS(비-방사선활성 세포 증식 검정 키트)는 Promega사(Madison, Wisconsin)로부터 구입하고, 제조사의 설명서에 따라 사용하였다. 각각의 세포주에 있어서, 보정 곡선(2시간 후 세포 수 대 광학 밀도)을 적합한 초기 접종 밀도를 추정하기 위해 정했다. 이어서, 세포를 웰당 750 내지 5,000개 세포의 밀도로 96-멀티웰 디쉬에 접종하였다. 접종 직후, 세포를 다양한 농도(0, 0.01, 0.05, 0.1, 1, 10, 100 및 500 ng칼리케아미신 당량/ml)의 칼리케아미신, CMA-676 및 항-5T4 항체의 칼리케아미신 접합체에 노출시켰다. 약물-노출 96시간 동안 생존하는 세포의 수를 측정한 후, ED50을 용량-반응 곡선으로부터 유도된 지수형 회귀 매개변수를 근거로 계산하였다. ED50은 약물 노출 96시간 후 세포 수를 50% 감소시킨 약물(CalichDMH)의 농도로서 정의하였다. 칼리케아미신 당량(cal. eq.)은 순수 물질 또는 접합체로서 제공된 칼리케아미신의 농도이다. 항체에 결합된 칼리케아미신의 양에 따라(항체 약물 로딩), 상이한 칼리케아미신 당량이 상이한 단백질 농도를 나타낼 수 있다.
MTS 검정 결과를 표 9에 제시한다. A1 및 A3 항-5T4 검정을 사용하여 제조한 항체/칼리케아미신 접합체는 실질적으로 MDAMB435/5T4 세포의 생존능력을 감소시켰다. 선택성 값은 접합체의 특이적 활성을 비-특이적 활성과 비교함으로써 계산하였다. 즉, 5T4 발현 세포에 대한 배수 CalichDMH를 5T4를 발현하지 않는 세포에 대한 배수 CalichDMN 값으로 나누었다. 비특이적 항체, 예를 들어 hp67.6 (CMA-676)이 사용된 경우, 배수 CalichDMH 값은 선택성이 1인 것과 거의 동일하다.
Figure 112008070916106-pct00010
항-5T4/칼리케아미신 접합체의 세포독성을 또한 생체내 세포 환경에 보다 더 근접시킨 3차원 구상체 세포 배양을 사용하여 분석하였다. 구상체는 본질적으로 문헌[참조: Yuhas et al. (1977) Cancer Res. 37:3639-3643]에 따라서 제조하였다. 간략히 설명하면, 5ml 배양 배지 중의 105개 세포를 배양 배지[판매원: Sigma, St. Louis, Missouri] 중의 5ml의 0.65% 조직 배양 등급 한천으로 미리 피복한 60mm 폴리스티렌 세포 배양 디쉬 위에 접종하였다. 디쉬를 37℃ 및 5% CO2 대기로 5 내지 6일 동안 배양하였다. 0.2mm 직경의 구상체를 선택하고, 24웰 다중웰 디쉬에 위치시켰다. 각각의 웰은 0.5ml 한천 하층, 1개의 구상체 및 1ml의 배양 배지 상층을 함유하였다. 이어서, 구상체를 다양한 농도 (0, 0.091, 0.365, 1.46, 5.86, 23.44, 93.75 및 375ng 칼리케아미신 당량/ml)의 칼리케아미신, CMA-676 및 A1 및 A3 항-5T4 항체 및 AcBut 링커를 사용하여 제조한 항-5T4/칼리케아미신 접합체에 노출시켰다. 항-5T4/칼리케아미신 접합체 둘 모두는 MDAMB435/5T4 세포의 성장을 상당히 억제시켰다. 도 8을 참조한다.
실시예 7
키메릭 및 사람화된 항-5T4 항체의 제조 및 결합 특성
쥐 H8 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 및 사람 IgG4 중쇄 불변 영역 및 사람 카파 경쇄 불변 영역을 갖는 키메릭 H8, A1, A2 및 A3 항체를 작제하였다. A1 중쇄 가변 영역의 위치 67에 존재하는 시스테인을 페닐알라닌으로 임의로 치환하였고, A3 중쇄 가변 영역의 위치 91에 존재하는 시스테인을 티로신으로 임의로 치환하였다. 이들 변이체는 서열번호 2 (A1 VH) 및 서열번호 10 (A3 VH)에 제시되어 있다. 인트론 서열의 존재 또는 부재 및 시스테인 잔기의 치환은 항체 발현에 영향을 미치지 않았다. IgG 불변 영역을 암호화하는 서열의 클로닝을 위해, 인트론 서열을 임의로 결실시켰다.
사람화된 H8은 PCT 국제 공개번호 제WO 2006/031653호에 기재된 바와 같이 제조하였다. 사람화된 A1 항체는 본원에서 아래에 추가로 기술된 바와 같이 CDR 이식에 의해 제조하였다. 쥐 A1, A2 및 A3 항체의 CDR은 서열 변이성 뿐만 아니라 구조적 루프 영역의 위치를 근거로 하는 AbM 정의를 사용하여 확인되었다. 일반적으로, 사람 수용체 골격은 쥐 항체의 골격 영역과 실질적으로 유사한 것을 근거로 선택되었으나, 이는 가변 영역 하위계열의 컨센서스 서열과 가장 유사하였다. 또한, 사람에서 골격 유전자 좌의 표현에 대해 고려하였고, 광범위하게 표현된 서열이 일반적으로 덜 많은 서열보다 더 바람직하였다. 사람 골격 수용체 서열의 추가의 돌연변이를 수행하여 항원 접촉과 관련된 것으로 여겨지는 쥐 잔기 및/또는 항원 결합 부위의 구조적 완전성과 관련된 잔기를 복원하였다. 아미노산 잔기는 또한 CHO 세포의 코돈 선택성을 위하여, 그리고 제한 효소 부위를 제거하기 위하여 최적화될 수 있다. 펩타이드 구조 예측 프로그램을 사용하여 사람화 설계에 의해 도입된 해독후 단백질 변형 부위를 확인하여 회피하도록 사람화된 가변 중 및 경 영역 서열을 분석할 수 있다.
사람화된 A1 중쇄 가변 영역(A1 VH 버전 1.0)을, 사람 DP-21 골격 영역(VH7 서브그룹, 등록번호 CAA43346호, 서열번호 88) 상에 이식된 쥐 A1의 CDR을 포함하도록 작제하였고, 이는 골격 돌연변이(S82A) 및 하나의 역돌연변이(E46K)를 함유한다. 변이체는 역돌연변이(A1 VH 버전 1.1 및 1.2)를 제거함으로써 제조하였다. 제2의 사람화된 A1 중쇄 가변 영역은 A1 CDR을 사람 DP-54 생식세포 계열 골격 영역 상에 이식함으로써 제조하였다 (A1 VH 버전 2.0). 여섯(6)개 역돌연변이를 수행하여 A1 VH 버전 2.1을 제조하였다. 아래에 추가로 기재된 바와 같이, 2개의 A1 중쇄 가변 영역은 5T4 결합 특성을 보유하였다. DP-21 및 DP-54 골격 영역은 이들 길이에 걸쳐 63% 아미노산 서열 동일성을 나타내어, 이는 특정 에피토프에 결합하는 능력을 포함한 항체의 결합 특이성을 유지하면서 많은 아미노산 변화를 만들 수 있다는 것을 나타낸다. 사람화된 A1 중쇄 가변 영역의 유사성을 표 10에 제시한다. 사람화된 A1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 대표적인 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 48, 50, 53 및 55에 제시되어 있다. 사람화된 A1 중쇄 가변 영역의 대표적인 아미노산 서열은 서열번호 49, 51, 52, 54 및 56에 제시되어 있다. 또한 도 9A 내지 9B를 참조한다.
사람화된 A1 경쇄 가변 영역은 사람 DPK24(VKIV 서브그룹), DPK9(VKI 서브 그룹) 및 DPK23(VKIII 서브그룹) 생식세포 계열 골격 영역 상에 이식된 쥐 A1의 CDR을 포함하도록 작제하였다. 사람화된 A1 경쇄 가변 영역내로 S67Y 역돌연변이의 혼입후, 각각의 이들 골격으로 제조된 골격은 5T4 결합을 증명하였다. 표 13을 포함하여 아래를 참조한다. DPK24 골격 영역은 DPK9 및 DPK23에 대한 그 길이에 있어서 각각 74% 및 73%의 아미노산 서열 동일성을 나타낸다. DPK9 골격 영역은 DPK23에 대한 그 길이에 있어서 74% 아미노산 서열 동일성을 나타낸다. 사람화된 A1 경쇄 가변 영역의 유사성은 표 10에 제시되어 있다. 사람화된 경쇄 가변 골격 영역의 다수의 버전은, 특정 에피토프와의 결합 능력을 포함하는 항체의 결합 특이성을 유지하면서 다수의 아미노산 변화를 만들 수 있다는 것을 나타낸다. 사람화된 A1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 대표적인 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73 및 75에 제시되어 있다. 사람화된 A1 경쇄 가변 영역의 대표적인 아미노산 서열은 서열번호 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74 및 76에 제시되어 있다. 또한 도 9C 내지 9F를 참조한다.
Figure 112008070916106-pct00011
사람화된 A2 및 A3 항체를 유사한 방법을 사용하여 설계하였다. 사람화된 A2 중쇄 가변 영역 및 사람화된 A2 경쇄 가변 영역의 대표적인 아미노산 서열은 각각 서열번호 77-78 및 서열번호 79-80에 제시되어 있다. 또한 도 9G를 참조한다. 사람화된 A3 중쇄 가변 영역 및 사람화된 A3 경쇄 가변 영역의 대표적인 아미노산 서열은 각각 서열번호 81-82 및 서열번호 83-84에 제시되어 있다. 또한 도 9H를 참조한다.
사람화된 A1, A2 및 A3 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 신규성을 평가하기 위해서, BLASTn 및 BLASTp 분석을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 결과를 표 11에 제시한다.
Figure 112008070916106-pct00012
Figure 112008070916106-pct00013
도 10A 내지 10B는 사람화된 A1, A2 및 A3 항-5T4 항체의 제조를 위한 골격으로서 사용될 수 있는 추가의 중쇄 가변 영역 서열을 나타낸다. 도 11 내지 13은 사람화된 A1, A2 및 A3 항-5T4 항체의 제조를 위한 골격으로서 사용될 수 있는 추가의 경쇄 가변 영역 서열을 나타낸다. 도 14는 키메릭 및 사람화된 A1, A2 및 A3 항-5T4 항체의 제조를 위해 사용될 수 있는 대표적인 불변 영역을 나타낸다.
키메릭 및 사람화된 H8, A1, A2 및 A3 항체의 결합 특이성 및 친화성을 평가하기 위해서, BIACORE® 분석을 CM5 칩 상에 고정된 사람 5T4 항원을 사용하여 수행하였다. 실시예 2를 참조한다. 키메릭 A1, A2 및 A3 항체에 대한 결과를 아래의 표 12에 제시한다.
Figure 112008070916106-pct00014
일반적으로, 키메라화/사람화는 사람 5T4에 대한 H8, A1, A2 및 A3의 친화성을 증가시켰다. 표 3과 비교한다. 결합 친화도의 증가는 주로 더 빠른 결합 보다는 항체 및 항원의 더 느린 분리로부터 일어나는 것으로 보인다. 키메릭 A2 및 A3 항체는 키메라화 후 가장 향상된 결합 특성을 나타내었다.
모든 사람화된 A1 중쇄 가변 영역은 5T4 결합 특성을 보유하였다. 또한, 사람화된 A1 중쇄 가변 영역으로부터 K46 역돌연변이의 제거는 5T4 결합 특성에는 영향을 미치지 않았다. 사람화된 A1 경쇄 가변 영역은 절충된 5T4 결합 특성을 나타내었다. DPK9 및 DPK23 골격을 사용하여 작제한 사람화된 A1 경쇄 가변 영역은 DPK24 골격을 사용하여 작제한 사람화된 A1 경쇄 가변 영역 보다 더 높은 친화성으로 5T4와 결합하였다. 역돌연변이를 도입하여 5T4 결합을 복구하고/하거나 최적화하였다. 쥐 A1 골격 영역에서 보여지는 바와 같이 위치 67의 세린 잔기를 티로신 잔기로 치환시켜, 5T4 항원 결합 특성이 완전하게 복구되었다. 표 13을 참조한다.
Figure 112008070916106-pct00015
실시예 8
항-5T4 항체의 종 교차-반응성
본원에 기재된 항-5T4 항체의 교차-종 반응성을 검정하여 생체내 효능 연구 및 독성학 분석을 위한 관련 종을 결정하였다. 상이한 5T4 엑토도메인의 결합 활성 및 관련성의 상호관계를 사용하여 또한 각각의 항체에 의해 결합된 에피토프를 추가로 기술하였다. 결합 검정은 사람 IgG1 Fc에 융합된 다양한 종 유래의 5T4 엑토도메인을 사용하여 수행하였다. 사람 5T4에 대한 각각의 엑토도메인 영역의 동일성(%)을 표 14에 제시한다.
Figure 112008070916106-pct00016
사람, 마우스, 랫트, 개 및 소로부터의 5T4의 전체길이 또는 부분적 서열은 GenBank 등록번호 Z29083(사람, 서열번호 87), AJ012160(마우스), BC087011(랫트), XM539020(개) 및 XM593502(소)로서 이전에 공개되었다. 침팬지 5T4의 가상 부분적 서열은 mRNA 및 게놈 서열의 정열을 사용하여 생성되었다. 5T4 단백질을 암호화하는 핵산은 사이노몰거스 원숭이 및 검은 꼬리 마모셋으로부터 분리되었다. 이들 추가의 5T4 항원의 아미노산 서열은 도 15에 제시되어 있고, 또한 서열번호 86(사이노몰거스 원숭이) 및 서열번호 85(검은 꼬리 마모셋)로서 제시되어 있다.
사이노몰거스 원숭이 및 검은 꼬리 마모셋 서열의 신규성을 평가하기 위해서, BLAST 분석을 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 조회 서열로서 전체길이 검은 꼬리 마모셋 5T4 아미노산 서열을 사용하는 경우, 가장 가까운 피험자 서열은 사람 5T4(GenBank 등록번호 NP_006661.1)와 94% 동일성(302/320 아미노산)인 것으로 확인되었다. 서열은 또한 카복실 말단에서 상이하여, 서열번호 85의 아미노산 1-19는 가장 가까운 피험자 서열과 함께 정렬되지 않았다. 조회 서열로서 전체길이 사이노몰거스 원숭이 5T4 아미노산 서열을 사용하는 경우, 가장 가까운 비-가상 피험자 서열은 99% 동일성(364/366 아미노산)을 갖는 사이노몰거스 원숭이(GenBank 등록번호 BAE00432.1)로부터의 영양막 당단백질 전구체로서 확인되었다. 서열은 또한 카복실 말단에서 상이하여, 서열번호 86의 아미노산 1-25는 가장 가까운 비-가상 피험자 서열과 함께 정렬되지 않았다.
항-5T4 항체의 결합을 검정하기 위해서, 5T4 엑토도메인/Fc 융합 단백질을 COS-1 세포 속으로 일시적으로 형질감염시키고, ELISA 검정을 수행하였다. 관련없는 사람 IgG4 및 IgG1 항체를 대조군으로서 사용하였다. 항-5T4 항체의 교차-종 반응성을 표 15에 요약한다.
Figure 112008070916106-pct00017
<110> Wyeth <120> Anti-5T4 antibodies and uses thereof <130> 040000-0359813 <150> US 60/781,346 <151> 2006-03-10 <150> US 60/891,248 <151> 2007-02-23 <160> 99 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 414 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(57) <223> leader sequence <220> <221> misc_feature <222> (58)..(414) <223> heavy chain variable region <220> <221> misc_difference <222> (260)..(260) <223> n is g or t <400> 1 atggattggc tgtggaactt gctattcctg atggcagctg cccaaagtat ccaagcacag 60 atccagttgg tgcagtctgg acctgagctg aagaagcctg gagagacagt caagatctcc 120 tgcaaggctt ctggatatac cttcacaaac tttggaatga actgggtgaa gcagggtcca 180 ggagagggtt taaagtggat gggctggata aacaccaaca ctggagagcc aagatatgct 240 gaagagttca agggacggtn tgccttttct ttggaaacca ctgccagcac tgcctatttg 300 cagatcaaca acctcaaaaa tgaggacacg gctacatatt tctgtgcaag agactgggac 360 ggtgcctact tctttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 414 <210> 2 <211> 138 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE 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gatacacttt cactgactat gttataagct gggtgaagca gagaactgga 180 cagggccttg agtggattgg agagatttat cctggaagta atagtattta ttacaatgag 240 aagttcaagg gcagggccac actgactgca gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag 300 ctcagcagcc tgacatctga ggactctgcg gtctatttct gtgcaatggg gggtaactac 360 ggctttgact attggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 405 <210> 6 <211> 135 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(18) <223> leader sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(135) <223> heavy chain variable region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(53) <223> CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(84) <223> CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (117)..(124) <223> CDR3 <400> 6 Met Glu Trp Arg Ile Phe Leu Phe Ile Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val 1 5 10 15 His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Arg Pro Glu Leu Val Lys Pro 20 25 30 Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 35 40 45 Asp Tyr Val Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Asn Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu 65 70 75 80 Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr 85 90 95 Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 100 105 110 Phe Cys Ala Met Gly Gly Asn Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 7 <211> 390 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(66) <223> leader sequence <220> <221> misc_feature <222> (67)..(390) <223> light chain variable region <400> 7 atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtcc 60 agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctct aggggaacgg 120 gtcaccttga cctgcactgc cagctcaagt gtaaattcca attacttaca ctggtaccag 180 cagaagccag gatcctcccc caaactctgg atttatagca catccaacct ggcttctgga 240 gtcccagctc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctctt actctctcac aatcagcagc 300 atggaggctg aagatgctgc cacttattac tgccaccagt atcatcgttc cccgctcacg 360 ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa 390 <210> 8 <211> 130 <212> PRT <213> Mus 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light chain variable region <400> 11 atggagacac attctcaggt ctttgtatac atgttgctgt ggttgtctgg tgttgaagga 60 gacattgtga tgacccagtc tcacatattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 120 atcacctgca aggccagtca ggatgtggat actgctgtag cctggtatca acagaaacca 180 gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggctcactgg agtccctgat 240 cgcttcacag gcagtggatc tgggacggat ttcactctca ccattagcaa tgtgcagtct 300 gaagacttgg cagattattt ctgtcagcaa tatagcagct atccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaagc tggaaataaa a 381 <210> 12 <211> 127 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> leader sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(127) <223> light chain variable region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(54) <223> CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(76) <223> CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (109)..(117) <223> CDR3 <400> 12 Met Glu Thr His Ser Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Val Glu Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Ile Phe Met Ser 20 25 30 Thr Ser Val 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from human and mouse sequences <400> 50 caggtgcagc tggtgcaatc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata taccttcaca aactttggaa tgaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg ataaacacca acactggaga gccaagatat 180 gctgaagagt tcaagggacg gtttgtcttc tccttggaca cctctgtcag cactgcctat 240 ctgcagatct ccagcctgaa ggctgaggac actgccgtgt attactgtgc cagagactgg 300 gacggtgcct acttctttga ctactggggc caaggcaccc ttgtcacagt ctcctca 357 <210> 51 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> derived from human and mouse sequences <400> 51 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 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Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 93 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg <210> 94 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro 85 90 95 <210> 95 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro 85 90 95 <210> 96 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro 85 90 95 <210> 97 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro 85 90 95 <210> 98 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro 100 <210> 99 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Leu Pro 85 90 95

Claims (47)

  1. 서열번호 2에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 하나 이상의 중쇄 가변 영역과 서열번호 4에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 하나 이상의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 사람 5T4 항원에 특이적으로 결합하는 분리된 항체, 또는 이의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 키메릭(chimeric) 항체, 사람화된 항체, 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab)2 단편, Fv 단편, 4량체 항체, 4가 항체, 다중특이적 항체, 또는 융합 단백질인 항체.
  3. 제1항에 있어서, 쥐 모노클로날 항체인 항체.
  4. 제1항에 있어서, 사람 5T4 항원에 대해 1 ×10-7 M 내지 1 ×10-12 M의 결합 친화도를 갖는 항체.
  5. 제1항에 있어서, 생체 내에서 5T4-발현 세포를 특이적으로 표적화하는 항체.
  6. 제3항에 있어서, 쥐 모노클로날 항체가 서열번호 2의 잔기 20-138번의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  7. 제3항에 있어서, 쥐 모노클로날 항체가 서열번호 4의 잔기 21-127의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  8. 제3항에 있어서, 쥐 모노클로날 항체가 서열번호 2의 잔기 20-138의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열번호 4의 잔기 21-127의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  9. 제2항에 있어서, 키메릭 또는 사람화된 항-5T4 항체인 항체.
  10. 제9항에 있어서, 사람 불변 영역을 포함하는 키메릭 또는 사람화된 항체.
  11. 제10항에 있어서, 사람 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 키메릭 또는 사람화된 항체.
  12. 제10항에 있어서, 사람 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 영역을 포함하는 키메릭 또는 사람화된 항체.
  13. 제12항에 있어서, 사람 IgG4 중쇄 불변 영역이 241번 위치에서 프롤린을 포함하는 키메릭 또는 사람화된 항체.
  14. 삭제
  15. 제9항에 있어서, 하나 이상의 경쇄 가변 영역 및 하나 이상의 중쇄 가변 영역이,
    (a) 서열번호 14-23, 77 및 88-93 중 어느 하나의 사람 항체 중쇄 골격 영역;
    (b) 서열번호 28-34, 35-44 및 94-99 중 어느 하나의 사람 항체 경쇄 골격 영역;
    (c) 상기 (a)의 중쇄 골격 영역의 컨센서스(consensus) 서열; 및
    (d) 상기 (a) 내지 (c)의 골격 영역과 63% 이상 동일한 골격 영역
    으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사람 골격 잔기를 포함하는, 사람화된 항체.
  16. 삭제
  17. 제9항에 있어서,
    (a) 서열번호 2의 잔기 20-138의 아미노산 서열; 또는
    (b) 서열번호 49, 51, 52, 54 또는 56 중 어느 하나의 아미노산 서열
    을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 키메릭 또는 사람화된 항체.
  18. 제9항에 있어서,
    (a) 서열번호 4의 잔기 21-127의 아미노산 서열; 또는
    (b) 서열번호 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74 또는 76 중 어느 하나의 아미노산 서열
    을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 키메릭 또는 사람화된 항체.
  19. (a) 제1항에 따른 항체; 및
    (b) 상기 항체에 직접 또는 간접적으로 결합된 약물을 포함하는,
    약물 전달용 항체/약물 접합체.
  20. 제19항에 있어서, 약물이 세포독소(cytotoxin), 방사성 동위원소, 면역조절제, 항혈관신생제, 항증식제, 아폽토시스 촉진제(pro-apoptotic agent), 화학요법제 및 치료용 핵산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치료제인 항체/약물 접합체.
  21. 제20항에 있어서, 치료제가 세포독소인 항체/약물 접합체.
  22. 제20항에 있어서, 세포독소가 항생제, 튜불린 중합 억제제, 알킬화제, 단백질 합성 억제제, 단백질 키나제 억제제, 포스파타제 억제제, 토포아이소머라제 억제제 또는 효소인 항체/약물 접합체.
  23. 제20항에 있어서, 세포독소가 항생제인 항체/약물 접합체.
  24. 제23항에 있어서, 항생제가 칼리케아미신인 항체/약물 접합체.
  25. 제24항에 있어서, 칼리케아미신이 칼리케아미신의 N-아세틸 유도체 또는 디설파이드 유사체인 항체/약물 접합체.
  26. 제25항에 있어서, 칼리케아미신이 N-아세틸-γ-칼리케아미신인 항체/약물 접합체.
  27. 제19항에 있어서, 약물이 링커(linker)를 통해 항체에 결합된 항체/약물 접합체.
  28. 제27항에 있어서, 링커가 4-(4'아세틸페녹시)부탄산(AcBut), 3-아세틸페닐 산성산(AcPac), 4-머캅토-4-메틸-펜탄산(Amide) 및 이의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항체/약물 접합체.
  29. 제1항에 있어서, 서열번호 87의 잔기 173-252 및 276-355를 포함하는 사람 5T4 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 항체.
  30. 제9항에 있어서,
    (a) 서열번호 4의 잔기 21-127의 아미노산 서열, 및 서열번호 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74 또는 76 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 2의 잔기 20-138의 아미노산 서열, 및 서열번호 49, 51, 52, 54 또는 56 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는, 키메릭 또는 사람화된 항체.
  31. 제9항에 있어서,
    (a) 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는, 사람화된 항체.
  32. 삭제
  33. 삭제
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