CN107847606A - 包含自降解基团的缀合物及其相关方法 - Google Patents

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吴英秀
蔡济旭
宋昊永
郑哲雄
朴允姬
崔孝汀
朴庆恩
金炯來
金真影
闵智暎
金星民
李秉洙
禹东贤
郑智恩
李受璘
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Abstract

在一些方面，本发明涉及抗体‑药物缀合物，其包含抗体、连接子和活性剂。抗体‑药物缀合物可以包含自降解基团。连接子可以包含O‑取代的肟，例如其中肟的氧原子被将肟共价连接至活性剂的基团取代；并且肟的碳原子被将肟共价连接至抗体的基团取代。

Description

包含自降解基团的缀合物及其相关方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年11月25日提交的美国临时申请序列号62/260,046的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
抗体-药物缀合物(ADC)技术是一种靶向技术，其允许选择性地对癌细胞进行凋亡。典型地，ADC通过使用抗体靶向癌细胞然后在细胞中释放毒性物质(即药物)而起作用，从而引发细胞死亡。由于ADC技术允许将药物准确地递送至靶向癌细胞并在特定条件下释放，同时使得对健康细胞的附带损伤最小化，ADC技术增加了治疗性抗体的功效并降低了不良反应的风险。
抗体-药物缀合物的基本结构是“抗体-连接子-低分子药物(毒素)”。连接子理想地允许药物对靶向癌细胞表现出作用，例如在从抗体中分离(例如通过酶介导的水解)之后，在药物到达靶细胞之后。连接子还通过连接抗体和药物而起作用。因此，抗体-药物缀合物的功效和毒性部分取决于连接子的稳定性，因此，连接子在药物安全性中起重要作用。
抗体-药物缀合物的连接子可大致分为不可裂解的或可裂解的。使用包含抗体的半胱氨酸的硫醚将许多不可裂解的连接子连接到抗体上。配对药物一般不能与体内抗体解离。然而，在广泛使用的硫醇-马来酰亚胺方法的情况下，抗体-药物缀合物是不稳定的，这可能导致药物在到达靶细胞之前或之后与缀合物解离。
例如可通过溶酶体酶将可裂解的连接子水解。可裂解的连接子可以包含二硫键，例如包括抗体的半胱氨酸。允许通过硫醇交换反应解离的二硫化物连接子部分依赖于将抗体-药物缀合物吸收到靶细胞中和将二硫化物暴露于作为还原环境的细胞溶质中。然而，因为血液中存在各种类型的硫醇(例如白蛋白和谷胱甘肽)，药物可以在到达其靶标之前与抗体解离。
最近，已经描述了一种制备抗体-药物缀合物的新方法，使用C-末端氨基酸序列的蛋白质异戊二烯化来安装修饰的类异戊二烯单元，其允许药物或其它活性剂以温和的和位点特异性的方式附着于抗体上(例如参见美国专利公开号2012/0308584)。进一步改善是可能的。
鉴于上述情况，用于抗体-药物缀合物的改进连接子是需要的。
发明内容
在一些方面，本发明涉及抗体-药物缀合物(ADCs)。抗体-药物缀合物可以包含自降解基团，例如用于从抗体和连接子释放活性剂。
在一些实施方式中，本发明涉及抗体-药物缀合物，其包含抗体、连接子和活性剂(例如药物)。连接子可以包含O-取代的肟。在优选的实施方式中，肟的氧原子被将肟共价连接到活性剂的基团取代，并且肟的碳原子被将肟共价连接到抗体的基团取代。在替代实施方式中，肟的碳原子被将肟共价连接到活性剂的基团取代，并且肟的氧原子被将肟共价连接到抗体的基团取代。在其它实施方式中，连接子不包含肟。例如连接子可以包含另一个结合单元，例如由环加成反应产生的杂环(例如取代的三唑)而不是肟。
在一些实施方式中，本发明涉及由式(I)表示的抗体-药物缀合物，其包含对抗原具有结合特异性的抗体(A)、连接子和活性剂(B)，例如具有所需功能或活性的药物、毒素、配体或检测探针等。
其中
G是糖或糖酸，优选葡糖醛酸或其衍生物；
A表示抗体；
B表示活性剂，例如药物；
W表示吸电子基团，优选-C(O)NR'-，其中C(O)与苯环键合，NR'与L键合；
每个Z独立地表示(C1-C8)烷基、卤素、氰基或硝基，优选氢；
n是0至3的整数，优选3；
L包含将A共价连接至W的3至100个原子，优选3至50个原子的链；以及
R1和R2各自独立地表示氢、(C1-C8)烷基或(C3-C8)环烷基，优选氢，或者R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C8)环烷基环；以及
连接A和B的部分在一起(即从L到OC(＝O))形成连接子。
另外的可裂解基团包括缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基氨基甲酸酯(VC-PABC)。
在一些实施方式中，L包括肟。
在一些实施方式中，糖或糖酸是单糖。G可以为其中，R3是氢或羧基保护基团；并且每个R4独立地为氢或羟基保护基团。例如R3可以是氢，每个R4可以是氢。
在一些实施方式中，W为-C(O)-，-C(O)NR'-，-C(O)O-，-S(O)2NR'-，-P(O)R”NR'-，-S(O)NR'-或-PO2NR'-，在每种情况中，其中，C(O)、S或P与苯环直接键合，且R'和R”各自独立地为氢，(C1-C8)烷基，(C3-C8)环烷基，(C1-C8)烷氧基，(C1-C8)烷硫基，单或二(C1-C8)烷基氨基，(C3-C20)杂芳基或者(C6-C20)芳基。在优选实施方式中，W是-C(O)NR'-，其中，C(O)与苯环键合并且NR'与L键合。
在优选实施方式中，Z表示氢并且n是3。
在优选实施方式中，R1和R2各自表示氢。
在优选实施方式中，G是葡糖醛酸；W是-C(O)NR'-，其中，C(O)与苯环键合并且NR'与L键合；每个Z表示氢；n是3；且R1和R2各自表示氢。
在一些实施方式中，连接子包含具有1至100个碳原子，优选1至50个碳原子的亚烃基。该亚烃基优选包括至少一个不饱和键。该亚烃基优选包括至少一个亚杂芳基。在优选实施方式中，该亚烃基的碳原子被选自氮(N)、氧(O)和硫(S)中的一个或多个杂原子代替。在一些实施方式中，该亚烃基进一步被一个或多个具有1至20个碳原子的烃基取代。
在一些实施方式中，连接子包含氨基酸。例如亚烃基的至少一个碳原子可以被氮代替，连接子可以包含亲水性氨基酸的至少两个原子，并且氮可以与亲水性氨基酸的羰基形成肽键。
在优选实施方式中，W表示-C(O)NR'-，并且W的氮是亲水性氨基酸的氮原子。
在优选实施方式中，亲水氨基酸是精氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，鸟氨酸，脯氨酸，丝氨酸或苏氨酸。
在一些实施方式中，氨基酸将连接子的肟与连接子的聚乙二醇单元共价连接。
在优选实施方式中，亲水性氨基酸是包含具有在水溶液中性pH下带电荷部分的侧链的氨基酸。在某些实施方式中，亲水性氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施方式中，亲水性氨基酸是鸟氨酸或赖氨酸。亲水性氨基酸可以是精氨酸。
在一些实施方式中，连接子包含肽，并且肽包含至少一个亲水性氨基酸，优选具有侧链的氨基酸，所述侧链具有在水溶液中性pH下带电荷的部分(例如胺、胍或羧基部分)。所述肽的每个氨基酸可以独立地选自丙氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，赖氨酸，鸟氨酸，脯氨酸，丝氨酸和苏氨酸。在某些优选实施方式中，所述肽包含至少一种天冬氨酸或谷氨酸。在优选实施方式中，W表示-C(O)NR'-，并且W的氮是肽中N-末端氨基酸的氮。在一些实施方式中，肽将连接子的肟与连接子的聚乙二醇单元共价连接。该肽可以包含2至20个氨基酸。该肽可以由2至20个氨基酸组成。
在优选实施方式中，连接子通过硫醚键与抗体共价结合，并且硫醚键包含抗体的半胱氨酸的硫原子。
抗体可以包含氨基酸基序，优选在抗体的C-末端，例如被类异戊二烯转移酶识别的；并且硫醚键可以包含氨基酸基序的半胱氨酸的硫原子。氨基酸基序可以是选自CXX，CXC，XCXC，XXCC和CYYX的序列，其中C表示半胱氨酸；Y在每次出现时独立地表示脂肪族氨基酸；并且X在每次出现时独立地表示谷氨酰胺，谷氨酸，丝氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸或亮氨酸。在优选的实施方式中，硫醚键包含氨基酸基序的半胱氨酸的硫原子。
在一些实施方式中，氨基酸基序是CYYX序列，并且Y在每次出现时独立地表示丙氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸或缬氨酸。例如氨基酸基序可以是CVIM或CVLL。
在优选实施方式中，氨基酸基序前面的7个氨基酸中的至少一个是甘氨酸。在优选实施方式中，氨基酸基序前面的7个氨基酸中的至少三个各自独立地选自甘氨酸和脯氨酸。在一些实施方式中，所述氨基酸基序前面的1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸中的每一个都是甘氨酸，优选7个。在某些优选实施方式中，氨基酸基序前面的7个氨基酸中的至少三个各自独立地选自甘氨酸，天冬氨酸，精氨酸和丝氨酸。
在一些实施方式中，抗体包含氨基酸序列GGGGGGGCVIM，优选在C-末端。
连接子可以包含至少一个由表示的异戊二烯基单元，优选使得硫醚键包含异戊二烯基单元的碳原子。
在优选实施方式中，至少一个异戊二烯基单元是类异戊二烯转移酶的底物或产物。在一些实施方式中，连接子包含肟，并且至少一个异戊二烯基单元将肟与抗体共价连接。例如，连接子可以包含或者
在一些实施方式中，连接子可以包含或者
在优选实施方式中，连接子包含至少一个由或者中任一个表示的聚乙二醇单元。在优选实施方式中，连接子包含1至12个-OCH2CH2-单元。在某些优选实施方式中，连接子可以包含3至12个-OCH2CH2-单元。连接子可以包含5至12个-OCH2CH2-单元或6或12个-OCH2CH2-单元。在一些实施方式中，连接子包含肟，并且至少一个聚乙二醇单元将肟与活性剂共价连接。
在一些实施方式中，连接子包含由-(CH2)r(V(CH2)p)q-表示的连接单元，其中：
r是1至10的整数，优选2；
p是0至12的整数，优选2；
q是1至20的整数；
V是单键，-O-，-S-，-NR21-，-C(O)NR22-，-NR23C(O)-，-NR24SO2-或-SO2NR25-，优选-O-；以及
R21至R25独立地为氢，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷基(C6-C20)芳基或(C1-C6)烷基(C3-C20)杂芳基。
在一些实施方式中，连接子包含由-(CH2)r(V(CH2)p)q-，-((CH2)pV)q-，-(CH2)r(V(CH2)p)qY-，-((CH2)pV)q(CH2)r-，-Y(((CH2)pV)q-或-(CH2)r(V(CH2)p)qYCH2-表示的连接单元，
其中：
r是从0至10的整数；
p是1至10的整数；
q是1至20的整数；
V和Y各自独立地为单键，-O-，-S-，-NR21-，-C(O)NR22-，-NR23C(O)-，-NR24SO2-，或者-SO2NR25-；
R21至R25各自独立地为氢，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷基(C6-C20)芳基或(C1-C6)烷基(C3-C20)杂芳基。
在这些连接子的某些优选实施方式中，q是4至20的整数。在其它优选实施方式中，q是2至12的整数。在一些实施方式中，q是6至20的整数。
在这些连接子的一些实施方式中，r是2。在这些连接子的优选实施方式中，p是2。在一些实施方式中，r是2；p是2；q是2、5或11；且V是-O-。在一些实施方式中，V和Y各自独立地为-O-。
在一些实施方式中，连接子包含由-(CH2CH2X)w-表示的连接单元，其中：
X表示-O-，(C1-C8)亚烃基或-NR21-，优选-O-；
R21表示氢，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷基(C6-C20)芳基或(C1-C6)烷基(C3-C20)杂芳基，优选氢；以及
w为1至20的整数，优选为1，3，6或12。
在一些实施方式中，X是-O-并且w是6至20的整数。
在一些实施方式中，连接子包含通过1,3-偶极环加成反应，异狄尔斯-阿尔德反应，亲核取代反应，非醇醛型羰基反应，碳-碳复合键加成，氧化反应，或点击反应形成的结合单元。结合单元可以通过乙炔与叠氮化物之间的反应，或者醛基或酮基与肼或烷氧基胺之间的反应来形成。结合单元可以由式A，B，C或D中的任一个表示，优选C：
其中：
L1是单键或具有1至30个碳原子的亚烃基，优选12；
R11是氢或具有1至10个碳原子的烃基，优选甲基；以及
L2是具有1至30个碳原子的亚烃基，例如10或11，优选11。
连接子可以包含：
或者其中：
V是单键，-O-，-S-，-NR21-，-C(O)NR22-，-NR23C(O)-，-NR24SO2-，或者-SO2NR25-，优选-O-；
R21至R25各自独立地为氢，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷基(C6-C20)芳基，或(C1-C6)烷基(C3-C20)杂芳基；
r是1至10的整数，优选2或3；
p是0至10的整数，优选1或2；
q是1至20的整数，优选1至6；以及
L1是单键。
在某些实施方式中，抗体-药物缀合物包含以下结构：
其中，A表示抗体；B表示活性剂；并且n是1至20的整数，优选1至10。
在某些实施方式中，抗体-药物缀合物包含以下结构：
其中A表示抗体；B表示活性剂；并且n是1至20的整数，优选1至10。
在某些优选实施方式中，连接子包含O-取代的肟。例如，肟的氧原子可以被将肟共价连接到活性剂的基团取代，并且肟的碳原子可以被将肟共价连接到抗体的基团取代。在一些实施方式中，肟的氧原子可以被将肟共价连接到抗体的基团取代，并且肟的碳原子可以被将肟共价连接到活性剂的基团取代。
在一些实施方式中，抗体-药物缀合物包含以下结构：
其中A表示抗体；B表示活性剂；且n是0至20的整数，优选1至10。
在一些实施方式中，抗体-药物缀合物包含以下结构：
其中A表示抗体；B表示活性剂；且n是1至20的整数，优选1至10。
在一些方面，本发明涉及包含如本文所述的抗体-药物缀合物的药物组合物。在一些方面，本发明涉及治疗受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用包含如本文所述的抗体-药物缀合物的药物组合物。
在一些方面，本发明涉及制备如本文所述的抗体-药物缀合物的方法。该方法可以包含将生物分子与前药反应。例如，生物分子可以包含抗体和酮或醛，前药可以包含烷氧基胺，并且该反应可以产生肟，从而将抗体共价连接至前药。该方法可以包含异戊二烯化抗体。例如，该抗体可以包含被类异戊二烯转移酶识别的氨基酸基序，异戊二烯化抗体可以包含将抗体与类异戊二烯转移酶和类异戊二烯转移酶底物温育，并且该底物可以包含前药。因此，将抗体与类异戊二烯转移酶和底物温育可以将抗体与前药共价连接。
在一些实施方式中，抗体是单克隆抗体，多克隆抗体，抗体片段，Fab，Fab'，Fab'-SH，F(ab')2，Fv，单链Fv(“scFv”)，双链抗体，线性抗体，双特异性抗体，多特异性抗体，嵌合抗体，人源化抗体，人抗体或包含抗体的抗原结合部分的融合蛋白。抗体可以选自：莫罗单抗-CD3阿昔单抗(muromonab-CD3abciximab)，利妥昔单抗(rituximab)，达克珠单抗(daclizumab)，帕利珠单抗(palivizumab)，英夫利昔单抗(infliximab)，曲妥珠单抗(trastuzumab)，依那西普(etanercept)，巴利昔单抗(basiliximab)，吉妥单抗(gemtuzumab)，阿仑单抗(alemtuzumab)，替伊莫单抗(ibritumomab)，阿达木单抗(adalimumab)，阿法赛特(alefacept)，奥马珠单抗(omalizumab)，依法利珠单抗(efalizumab)，托西莫单抗(tositumomab)，贝伐珠单抗(bevacizumab)，那他珠单抗(natalizumab)，兰尼单抗(ranibizumab)，依库丽单抗(eculizumab)，利洛纳塞(rilonacept)，赛妥珠单抗(certolizumab)，罗米司亭(romiplostim)，AMG-531，戈利木单抗(golimumab)，尤特克单抗(ustekinumab)，ABT-874，贝拉西普(belatacept)，贝利木单抗(belimumab)，阿塞西普(atacicept)，抗-CD20抗体，卡那单抗(canakinumab)，托珠单抗(tocilizumab)，托西珠单抗(atlizumab)，美泊利单抗(mepolizumab)，帕妥株单抗(pertuzumab)，HuMaxCD20，曲美木单抗(tremelimumab)，替西木单抗(ticilimumab)，伊匹单抗(ipilimumab)，IDEC-114，奥英妥珠单抗(inotuzumab)，阿柏西普(aflibercept)，HuMax-CD4，特普利珠单抗(teplizumab)，奥特西珠单抗(otelixizumab)，卡妥索单抗(catumaxomab)，抗-EpCAM抗体IGN101，阿德木单抗(adecatumomab)，地妥西单抗(dinutuximab)，壬土西单抗(girentuximab)，狄迪诺塞麦(denosumab)，巴匹珠单抗(bapineuzumab)，莫维珠单抗(motavizumab)，福谷单抗(efumgumab)，瑞西巴库(raxibacumab)，抗-CD20抗体，LY2469298和维妥珠单抗(veltuzumab)。
在某些实施方式中，抗体不特异性结合CD19或EGFR。
在一些实施方式中，活性剂是化学治疗剂或毒素。活性剂可以选自：
(a)埃罗替尼，硼替佐米，氟维司群，索坦，来曲唑，甲磺酸伊马替尼，PTK787/ZK222584，奥沙利铂，5-氟尿嘧啶，亚叶酸，雷帕霉素，拉帕替尼，洛那法尼，索拉非尼，吉非替尼，AG1478，AG1571，噻替派，环磷酰胺，白消安，英丙舒凡，哌泊舒凡，苯丙多巴，卡波醌，美妥替哌，乌瑞替派，乙烯亚胺，六甲嘧胺，三亚乙基蜜胺，三乙烯磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺，三羟甲基蜜胺，泡番荔枝辛(bullatacin)，泡番荔枝辛酮(bullatacinone)，喜树碱，托泊替康，苔藓抑素，卡丽丝汀(callystatin)，CC-1065，阿多来新，卡折来新，比折来新，念珠藻素1，念珠藻素8，多拉司他汀，倍癌霉素，KW-2189，CB1-TM1，软珊瑚醇，水鬼蕉碱，匍枝珊瑚醇，海绵抑制素，苯丁酸氮芥，萘氮芥，胆磷酰胺，雌氮芥，异环磷酰胺，氮芥，美法仑，新氮芥，胆甾醇苯乙酸氮芥，松龙苯芥，曲磷胺，尿嘧啶氮芥，亚硝基脲氮芥，氯脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀，雷莫司汀，卡奇霉素，卡奇霉素γ1，卡奇霉素ω1，达内霉素，达内霉素A，氯膦酸盐，埃斯培拉霉素，新制癌菌素生色团，阿克拉霉素类，放射菌素，安替比林，重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C，卡柔比星，洋红霉素，嗜癌霉素，色霉素，放线菌素D，道诺菌素，地托比星，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，阿霉素，吗啉代-阿霉素，氰基吗啉代-阿霉素，2-吡咯烷子基-阿霉素，脂质体阿霉素和去氧阿霉素，表柔比星，依索比星，麻西罗霉素，丝裂霉素C，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素，培洛霉素，泊非霉素，嘌呤霉素，三铁阿霉素，罗多比星，链黑菌素，链脲霉素，杀结核菌素，乌苯美司，新制癌菌素，佐柔比星，5-氟尿嘧啶，二甲叶酸，甲氨蝶呤，蝶罗呤，三甲曲沙，氟达拉滨，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤，盐酸环胞苷，阿扎胞苷，6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨，氟尿苷，二甲睾酮，屈他雄酮丙酸盐，环硫雄醇，美雄烷，睾内酯，氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦，亚叶酸，醋葡醛内酯，醛磷酰胺糖苷，氨基乙酰丙酸，恩尿嘧啶，安吖啶，巴斯布西(bestrabucil)，比生群，依达曲沙，地磷酰胺，地美可辛，地吖醌，依氟鸟氨酸，依利醋铵，依托格鲁，硝酸镓，羟基脲，蘑菇多糖，氯尼达明，美登素，安丝菌素，丙脒腙，米托蒽醌，莫哌达醇，二胺硝吖啶，喷司他丁，蛋氨氮芥，吡柔比星，洛索蒽醌，2-乙基酰胼，甲基苄胼，云芝多糖-K，雷佐生，根霉素，西索菲兰，锗螺胺，细交链孢菌酮酸，三亚胺醌，2,2′,2″-三氯三乙胺，T-2毒素，黏液霉素Α，杆抱菌素A和蛇形菌素，乌拉坦，长春地辛，达卡巴嗪，甘露醇氮芥，二溴甘露醇，二溴卫矛醇，溴丙哌嗪，干胞嘧啶(gacytosine)，阿拉伯糖苷，环磷酰胺，噻替派，紫杉醇，紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂，多西紫杉醇，苯丁酸氮芥，吉西他滨，6-硫代鸟嘌呤，巯基嘌呤，顺铂，卡铂，长春碱，铂，鬼臼乙叉甙，异氨喋呤环磷酰胺，米托蒽醌，长春新碱，长春瑞滨，诺消灵，替尼泊苷，依达曲沙，柔红霉素，氨喋呤，希罗达，伊拜膦酸盐，CPT-11，拓扑异构酶抑制剂RFS2000，二氟甲基鸟氨酸，视黄酸，卡培他滨或任何上述物质的药学上可接受的盐、溶剂化物或酸；
(b)单核因子，淋巴因子，传统多肽激素，甲状旁腺激素，甲状腺素，松弛素(relaxin)，松弛素原(prorelaxin)，糖蛋白激素，促卵泡激素，促甲状腺激素，黄体化激素，肝细胞生长因子，成纤维细胞生长因子，催乳素，胎盘催乳素，肿瘤坏死因子-α，肿瘤坏死因子-β，抗缪勒氏管激素，小鼠促性腺激素相关肽，抑制素，活化素，血管内皮生长因子，血小板生成素，促红细胞生成素，成骨诱导因子，干扰素，干扰素-α，干扰素-β，干扰素-γ，集落刺激因子(“CSF”)，巨噬细胞-CSF，粒细胞-巨噬细胞-CSF，粒细胞-CSF，白细胞介素(“IL”)，IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，肿瘤坏死因子，TNF-α，TNF-β，多肽因子，LIF，试剂盒配体或任何上述物质的组合；
(c)白喉毒素，肉毒杆菌毒素，破伤风毒素，痢疾毒素，霍乱毒素，鹅膏素，α-鹅膏素，鹅膏素的衍生物，吡咯开苯并吖庚三烯(pyrrolobenzodiazepine)，吡咯开苯并吖庚三烯的衍生物，河豚毒素，裸藻毒素(brevetoxin)，雪卡毒素(ciguatoxin)，蓖麻毒蛋白，AM毒素，澳瑞他汀(auristatin)，微管蛋白裂解素(tubulysin)，格尔德霉素(geldanamycin)，美登素，卡奇霉素，柔红霉素，阿霉素，甲氨蝶呤，长春地辛，SG2285，多拉司他汀，多拉司他汀类似物，念珠藻素，喜树碱，喜树碱衍生物或代谢产物(例如SN-38)，根霉素，根霉素衍生物，CC-1065，CC-1065类似物或衍生物，倍癌霉素，烯二炔抗生素，埃斯培拉霉素，埃博霉素，阿佐夫得(azonafide)，阿普立定(aplidine)，类毒素或任何上述物质的组合；
(d)亲和配体，其中，所述亲和配体是底物，抑制剂，刺激剂，神经递质，放射性同位素或任何上述物质的组合；
(e)放射性标记32P，35S，荧光染料，电子致密试剂，酶，生物素，链霉抗生物素蛋白，二氧肟基(dioxigenin)，半抗原，免疫原性蛋白，具有靶向互补序列的核酸分子或任何上述物质的组合；
(f)免疫调节化合物，抗癌剂，抗病毒剂，抗菌剂，抗真菌剂和抗寄生虫剂，或任何上述物质的组合；
(g)他莫昔芬，雷洛昔芬，屈洛昔芬，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬，那洛昔芬，LY117018，奥那司酮或托瑞米芬；
(h)4(5)-咪唑，氨鲁米特(aminoglutethimide)，醋酸甲地孕酮，依西美坦，来曲唑或阿那曲唑；
(i)氟他胺，尼鲁米特(nilutamide)，比卡鲁胺(bicalutamide)，亮丙瑞林，戈舍瑞林(goserelin)或曲沙他滨(troxacitabine)；
(j)芳香酶抑制剂；
(k)蛋白激酶抑制剂；
(l)脂质激酶抑制剂；
(m)反义寡核苷酸；
(n)核酶；
(o)疫苗；以及
(p)抗血管生成剂。
在一些实施方式中，至少一种活性剂是托利布林(taltobulin)或阿佐夫得(azonafide)。
在一些实施方式中，缀合物包含选自以下的部分：
活性剂可以为鹅膏素，澳瑞他汀，卡奇霉素，喜树碱，念珠藻素，柔红霉素，多拉司他汀，阿霉素，倍癌霉素，埃博霉素，埃斯培拉霉素，格尔德霉素，美登素，甲氨蝶呤，甲基澳瑞他汀E(“MMAE”)，甲基澳瑞他汀F(“MMAF”)，吡咯开苯并吖庚三烯，根霉素，SG2285，tubulysin，长春地辛，类毒素或上述任何物质的衍生物。例如，活性剂可以为鹅膏素，MMAE，或者MMAF或者上述任何物质的衍生物。
在一些实施方式中，B为：
其中，y是1至10的整数。
在某些实施方式中，抗体-药物缀合物包含至少两个连接子。抗体-药物缀合物可以包含至少两种活性剂，例如可以相同或不同。
相关抗体-药物缀合物的结构和组分公开于PCT/KR2015/005299中，其通过引用整体并入本文，特别是本文公开的用于抗体-药物缀合物的化学式和通用结构、其组成部分(例如连接子，裂解基团等)及其制备和应用。在某些优选实施方式中，本发明的各种缀合物和其它方面特别排除PCT/KR2015/005299中公开的各种结构和方法。
在一些方面，本发明涉及包含如本文所述的抗体-药物缀合物的药物组合物。药物组合物可以进一步包含治疗有效量的化学治疗剂。在一些方面，本发明涉及治疗受试者的癌症的方法，包含将所述药物组合物施用于受试者。
受试者可以是哺乳动物。在一些实施方式中，所述受试者选自啮齿动物，兔形动物，猫科动物，犬科动物，猪，羊，牛，马和灵长类动物。在某些优选实施方式中，所述受试者是人。
在一些方面，本发明涉及制备如本文所述的抗体-药物缀合物的方法，其包含将生物分子与前药反应。生物分子可以包含抗体和酮或醛，前药可以包含烷氧基胺，并且该反应可以产生肟，从而将抗体共价连接至前药。在某些优选实施方式中，抗体不特异性结合CD19或EGFR。该方法可以包含异戊二烯化抗体，从而产生生物分子。例如，抗体可以包含被类异戊二烯转移酶识别的氨基酸基序，并且异戊二烯化抗体可以包含将抗体与类异戊二烯转移酶和类异戊二烯转移酶底物温育。例如底物可以包含酮或醛。类异戊二烯转移酶可以是例如法尼酰基转移酶(farnesyltransferase)或香叶烯基转移酶(geranylgeranyltransferase)。
在一些实施方式中，本发明涉及用于制备如本文所述的抗体-药物缀合物的方法，其包含异戊二烯化抗体，其中，所述抗体包含被类异戊二烯转移酶识别的氨基酸基序，并且异戊二烯化所述抗体包含将所述抗体与类异戊二烯转移酶和类异戊二烯转移酶底物温育。在优选实施方式中，底物包含活性剂。在某些优选实施方式中，抗体不特异性结合CD19或EGFR。
附图说明
图1显示了基于β-葡糖苷酸的连接子的活性药物释放机制。
图2是描述来自实验例1的β-葡糖醛酸酶水解连接子的图。
图3是描述来自实验例2的两种药物-连接子缀合物的血浆稳定性的图。
图4是描述实施例68中所述的化合物47a的血浆稳定性的图。
图5是描述实施例70中所述的化合物49a的血浆稳定性的图。
图6是描述实施例69中所述的化合物48a的血浆稳定性的图。
图7由两个平面组成，图7A和图7B。图7A显示了将药物缀合至抗体(DAR2)的策略。图7B显示了将药物缀合至抗体(DAR4)的策略。
图8示出了在连接子中具有不同PEG长度的DAR2MMAE-缀合物对于JIMT-1(HER2阳性)和MCF7细胞(HER2阴性)的相对体外活性。
图9示出了在连接子部分中具有不同PEG长度的DAR4MMAE-缀合物对于JIMT-1(HER2阳性)和MCF7细胞(HER2阴性)的相对体外活性。
图10示出了具有各种连接子类型的DAR4ADCs中的人β-葡糖醛酸酶的反应性。将12μM的ADCs与0.01μM的人β-葡糖醛酸酶(R&DSystems)在37℃下温育3小时。
图11示出了小鼠或人血浆中ADC2和Kadcyla的血浆稳定性。
图12示出了7天的ADC33和ADC34的人血浆稳定性。
图13示出了赫赛汀(Herceptin)和ADC2的大鼠PK谱图。
图14示出了ADC23和ADC34的大鼠PK谱图。
图15示出了通过将连接子-毒素从2g替换为11j改善的MMAE类ADCs的大鼠PK谱图。
图16示出了通过分支连接子单元改善的大鼠PK谱图。
图17示出了极性氨基酸对MMAEADC中大鼠PK谱图的影响。
图18示出了通过在具有DAR2的ADC中具有或不具有极性氨基酸的分支连接子-毒素改善的大鼠PK谱图。
图19示出了连接子-毒素单元中的Asp对具有DAR4的ADC的大鼠PK谱图的影响。
图20示出了连接子-毒素单元中的Glu对具有DAR4的ADC的大鼠PK谱图的影响。
图21示出了使用MMAF(ADC23)或MMAE(ADC24)的代表性胺型DAR4ADC的体内效果。
图22示出了使用MMAF(ADC34)或MMAE(ADC33)的代表性酰胺型DAR4ADC的体内效果。
具体实施方式
在一些方面，本发明涉及抗体-药物缀合物(ADC)。抗体-药物缀合物可以包含自降解基团，例如用于从ADC中分离的活性剂。然而，如本领域技术人员认识到的，这样的缀合物的抗体部分可以被任何合适的配体取代，因此，本发明等同于涉及配体-药物缀合物。因此，在不背离上下文的情况下，本文中对抗体-药物缀合物的引用和讨论应当被理解为等同适用于配体-药物缀合物及其相应的中间体(例如配体-连接子缀合物)。然而，在涉及本文公开的各种配体-药物缀合物的所有方面中，所述配体优选是抗体。
在一些实施方式中，本发明涉及抗体-药物缀合物，其包含抗体、连接子和活性剂(例如药物)。连接子可以包含O-取代的肟。在优选实施方式中，肟的氧原子被将肟共价连接到活性剂的基团取代，并且肟的碳原子被将肟共价连接到抗体的基团取代。在一些实施方式中，肟的碳原子被将肟共价连接到活性剂的基团取代，并且肟的氧原子被将肟共价连接到抗体的基团取代。在一些实施方式中，连接子不包含肟。例如连接子可以包含由环加成产生的杂环(例如取代的三唑)而不是肟。
ADC可由式(I)表示，包含对分子具有结合特异性的抗体(A)、连接子和活性剂(B)，例如具有所需功能或活性的药物、毒素、配体或检测探针等：
其中
G是糖或糖酸，优选葡糖醛酸或其衍生物；
A表示抗体；
B表示活性剂，例如药物；
W表示吸电子基团，优选-C(O)NR'-，其中C(O)与苯环键合，NR'与L键合；
每个Z独立地表示(C1-C8)烷基、卤素、氰基或硝基，优选氢；
n是0至3的整数，优选3；
L包含将A共价连接至W的3至100个原子；以及
R1和R2各自独立地表示氢、(C1-C8)烷基或(C3-C8)环烷基，优选氢，或者R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C8)环烷基环。
连接A和B的部分在一起(即从L到OC(＝O))形成连接子。
在一些实施方式中，缀合物具有下式：
其中G表示糖、糖酸或修饰的糖，优选糖或糖酸，最优选葡糖醛酸；
A表示配体；
B表示活性剂；
W表示-C(O)-，-C(O)NR'-，-C(O)O-，-S(O)2NR'-，-P(O)R”NR'-，-S(O)NR'-或-PO2NR'-，在每种情况中，其中，C(O)、S或P与苯环直接键合，且R'和R″各自独立地为氢，(C1-C8)烷基，(C3-C8)环烷基，(C1-C8)烷氧基，(C1-C8)烷硫基，单或二(C1-C8)烷基氨基，(C3-C20)杂芳基或者(C6-C20)芳基；每个Z各自独立地表示氢，(C1-C8)烷基或吸电子基团(例如酰胺，羧酸，羧酸酯，卤素，氰基或硝基)，优选氢、(C1-C8)烷基、卤素、氰基或硝基，最优选氢；
n是1至3的整数，优选3；
m是0或1，优选1；
L是将A共价连接至W的连接子(例如包含肟)；
R1和R2各自独立地表示氢，(C1-C8)烷基或(C3-C8)环烷基，优选氢；或者R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C8)环烷基环。
在一些实施方式中，缀合物具有下式：
或其药学上可接受的盐，其中
A表示配体；
B表示活性剂；
G表示糖、糖酸或修饰的糖，优选糖或糖酸，最优选葡糖醛酸；
W表示-C(O)-，-C(O)NR'-，-C(O)O-，-S(O)2NR'-，-P(O)R”NR'-，-S(O)NR'-或-PO2NR'-，在每种情况中，其中，C(O)、S或P与苯环直接键合，且R'和R″各自独立地为氢，(C1-C8)烷基，(C3-C8)环烷基，(C1-C8)烷氧基，(C1-C8)烷硫基，单或二(C1-C8)烷基氨基，(C3-C20)杂芳基或者(C6-C20)芳基；
每个Z各自独立地表示氢，(C1-C8)烷基或吸电子基团(例如酰胺，羧酸，羧酸酯，卤素，氰基或硝基)，优选氢、(C1-C8)烷基、卤素、氰基或硝基，最优选氢；
n是1至3的整数，优选3；
L表示将A共价连接至W的连接子(包含肟)；
R1和R2各自独立地表示氢，(C1-C8)烷基或(C3-C8)环烷基，优选氢；或者R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C8)环烷基环。
由以下结构表示的配体-药物缀合物可以包含配体；连接子；和活性剂：
其中：
G是糖或糖酸，优选葡糖醛酸；
A表示配体；
B表示活性剂；
W表示吸电子基团，优选-C(O)NR'-，其中C(O)与苯环键合，NR'与L键合；
每个Z各自独立地表示氢，(C1-C8)烷基或吸电子基团(例如酰胺，羧酸，羧酸酯，卤素，氰基或硝基)，优选氢、(C1-C8)烷基、卤素、氰基或硝基，最优选氢；
n是1至3的整数，优选3；
L包含将A共价连接至W的3至100个原子；
R1和R2各自独立地表示氢，(C1-C8)烷基或(C3-C8)环烷基，优选氢；或者R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C8)环烷基环；以及
连接A和B的部分在一起(即从L到OC(＝O))形成连接子。
具有由以下结构表示的配体-药物缀合物可以包含配体、连接子和活性剂：
其中：
G表示糖、糖酸或修饰的糖，优选糖或糖酸，最优选葡糖醛酸；
A表示配体；
B表示活性剂；
W表示-C(O)-，-C(O)NR'-，-C(O)O-，-S(O)2NR'-，-P(O)R”NR'-，-S(O)NR'-或-PO2NR'-，在每种情况中，其中，C(O)、S或P与苯环直接键合，且R'和R″各自独立地为氢，(C1-C8)烷基，(C3-C8)环烷基，(C1-C8)烷氧基，(C1-C8)烷硫基，单或二(C1-C8)烷基氨基，(C3-C20)杂芳基或者(C6-C20)芳基；
每个Z各自独立地表示氢，(C1-C8)烷基或吸电子基团(例如酰胺，羧酸，羧酸酯，卤素，氰基或硝基)，优选氢、(C1-C8)烷基、卤素、氰基或硝基，最优选氢；
n是1至3的整数，优选3；
L表示将A共价连接至W的连接子；
R1和R2各自独立地表示氢，(C1-C8)烷基或(C3-C8)环烷基，优选氢；或者R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C8)环烷基环。
由以下结构表示的配体-药物缀合物可以包含配体、连接子和活性剂：
或其药学上可接受的盐，其中
A表示配体；
B表示活性剂；
G表示糖、糖酸或修饰的糖，优选糖或糖酸，最优选葡糖醛酸；
W表示-C(O)-，-C(O)NR'-，-C(O)O-，-S(O)2NR'-，-P(O)R”NR'-，-S(O)NR'-或-PO2NR'-，在每种情况中，其中，C(O)、S或P与苯环直接键合，且R'和R″各自独立地为氢，(C1-C8)烷基，(C3-C8)环烷基，(C1-C8)烷氧基，(C1-C8)烷硫基，单或二(C1-C8)烷基氨基，(C3-C20)杂芳基或者(C6-C20)芳基；
每个Z各自独立地表示氢，(C1-C8)烷基或吸电子基团(例如酰胺，羧酸，羧酸酯，卤素，氰基或硝基)，优选氢、(C1-C8)烷基、卤素、氰基或硝基，最优选氢；
n是1至3的整数，优选3；
L表示将A共价连接至W的连接子；
R1和R2各自独立地表示氢，(C1-C8)烷基或(C3-C8)环烷基，优选氢；或者R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C8)环烷基环。
连接子可以包含例如通过易于酶裂解的键(例如糖苷键)偶联的糖或糖酸。该糖或糖酸由式(I)中G表示。糖或糖酸优选为单糖。糖或糖酸可以是葡糖醛酸或其衍生物，其能够通过β-葡糖醛酸糖酶从ADC中裂解。葡糖醛酸或其衍生物可以由式(II)表示：
其中R3是氢或羧基保护基团，优选氢，并且每个R4独立地是氢或羟基保护基团，优选氢。
羧基保护基团可以是任何例如在有机合成中用于掩蔽羧酸的合适的保护基团，如甲基，甲氧基甲基，甲硫基甲基，四氢吡喃基，苄氧基甲基，苯甲酰甲基，N-邻苯二甲酰亚氨基甲基，2,2,2-三氯乙基，2-卤代乙基，2-(对甲苯磺酰基)乙基，叔丁基，肉桂基，苄基，三苯甲基，双(邻硝基苯基)甲基，9-蒽甲基，2-(9,10-二氧代)蒽基甲基，胡椒基，2-三甲基甲硅烷基乙基，三甲基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基。在一些实施方式中，整个R3-OC(＝O)-部分被羧基掩蔽部分例如2-烷基-1,3-恶唑啉基替代。
羟基保护基团可以是任何例如在有机合成中用于掩蔽羟基的合适的保护基团，如乙酰基，甲基，乙氧基乙基，苯甲酰基，苄基，4-甲氧基苄基，3,4-二甲氧基苄基，四氢吡喃基(THP)，四氢呋喃基(THF)，叔丁基三甲基甲硅烷基(TBDMS)，三甲基甲硅烷基(TMS)，三乙基甲硅烷基(TES)，三异丙基甲硅烷基(TIPS)，叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)，三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)，β-甲氧基乙氧基甲基(MEM)，甲氧基甲基(MOM)，烯丙基或三苯甲基。
吸电子基团W可以是-C(O)-，-C(O)NR'-，-C(O)O-，-S(O)2NR'-，-P(O)R”NR'-，-S(O)NR'-或-PO2NR'-，优选-C(O)NR'-，且R'和R”可以各自独立地为氢，(C1-C8)烷基，(C3-C8)环烷基，(C1-C8)烷氧基，(C1-C8)烷硫基，单或二(C1-C8)烷基氨基，(C3-C20)杂芳基或者(C6-C20)芳基，优选氢；在这样的实施方式中，W优选定向为使得羰基，磷酰基，磺酰基或亚磺酰基直接与苯环键合。当Z表示吸电子基团时，Z可表示本段中所述W的任何部分。
连接子可以包含选自-C(O)-，-C(O)NR'-，-C(O)O-，-S(O)2NR'-，-P(O)R”NR'-，-S(O)NR'-和-PO2NR'-的吸电子基团，优选-C(O)NR'-，其中，R'和R”可以各自独立地为氢，(C1-C8)烷基，(C3-C8)环烷基，(C1-C8)烷氧基，(C1-C8)烷硫基，单或二(C1-C8)烷基氨基，(C3-C20)杂芳基或者(C6-C20)芳基，优选氢。
L和/或连接子可以包含具有1至100个碳原子，优选16至50个碳原子或50至100个碳原子的取代或未取代的亚烃基，并且满足以下(i)至(iv)中至少一个，优选至少两个：
(i)亚烃基包括至少一个不饱和键，优选3或4个双键且不含三键，
(ii)亚烃基包括至少一个亚杂芳基，
(iii)亚烃基的至少一个碳原子被选自氮(N)、氧(O)和硫(S)中的一个或多个杂原子代替，优选至少一个氮和至少一个氧(例如在肟中)，以及
(iv)亚烃基被一个或多个具有1至20个碳原子的烃基取代，优选被2或3个甲基取代。
例如L和/或连接子可以包含至少一个异戊二烯基单元，优选两个均由式(III)表示的异戊二烯基单元，其优选可被类异戊二烯转移酶识别，例如作为类异戊二烯转移酶产物或底物的一部分。
在优选实施方式中，抗体的半胱氨酸与异戊二烯基单元的碳原子形成硫醚键，从而将抗体共价连接至连接子。
L和/或连接子可包含通过1,3-偶极环加成反应，异狄尔斯-阿尔德反应，亲核取代反应，非醇醛型羰基反应，碳-碳复合键加成，氧化反应，或点击反应形成的结合单元。结合单元可以通过乙炔与叠氮化物之间的反应，或者非醇醛型羰基反应例如醛或酮基团与肼或烷氧基胺之间的反应来形成；这样的结合单元可以由式(A)，(B)，(C)或(D)表示。
L1是单键或具有1至30个碳原子，优选12个碳原子的亚烃基；
R11是氢或具有1至10个碳原子的烃基，优选甲基；以及
L2是具有1至30个碳原子的亚烃基，例如10或11个，优选11个碳原子。在一些实施方式中，L1和/或L2可包含至少一个由式(III)表示的异戊二烯基单元，优选两个异戊二烯基单元。L2可以由至少一个由式(III)表示的异戊二烯基单元组成，优选两个异戊二烯基单元组成。在优选实施方式中，异戊二烯基单元的碳原子与抗体的半胱氨酸的硫原子形成硫醚键，最优选在重链或轻链的C-末端形成，从而共价连接抗体和连接子。
抗体-药物缀合物可以包含由上述式(D)表示的结合单元，其中L2由至少一个异戊二烯基单元，优选两个异戊二烯基单元组成。结合单元可以是O-取代的肟，即结合单元的氮可以与取代的氧共价健合。异戊二烯基单元的碳原子可以与抗体的半胱氨酸的硫原子形成硫醚键，最优选在重链或轻链的C-末端形成，从而共价连接结合单元和抗体。
L和/或连接子可以包含由或者表示的异戊二烯基，例如，其中，异戊二烯基的碳原子与抗体的半胱氨酸的硫原子形成硫醚键，从而共价连接异戊二烯基和抗体。异戊二烯基的氮可以将异戊二烯基共价连接到L和/或连接子的聚乙二醇单元上。
在一些实施方式中，L和/或连接子可以包含由
或者表示的异戊二烯基，例如，其中，异戊二烯基的碳原子与抗体的半胱氨酸的硫原子形成硫醚键，从而共价连接异戊二烯基和抗体。异戊二烯基的氮可以将异戊二烯基共价连接到L和/或连接子的聚乙二醇单元上。
点击化学反应可以在温和条件下实施，这可以在抗体存在而不使抗体变性下进行。点击化学反应显示出高反应特异性。因此，即使抗体具有各种官能团(例如胺，羧基，甲酰胺和胍)，也可以进行点击化学反应，而不影响抗体的氨基酸侧链。例如，叠氮基团和乙炔基团之间的点击化学反应可以在抗体存在下发生，而不改变抗体的氨基酸侧链官能团。此外，无论反应物的性质如何，点击化学反应都可以精确地靶向特定官能团，例如在自然界中很少发现的官能团。在一些情况下，可选择反应物来提高总体反应效率。例如叠氮化物-乙炔点击化学反应可以以高收率产生三唑(参见例如Hia，RK等，Chem.Rev.，109：5620(2009)；Meldal，M&Tornoe，CW，Chem Rev.,108:2952(2008)；Kolb，HC等，Angew.ChemieInt.Ed.Engl.，40：2004(2001)，其各自通过引用并入本文)。
天然蛋白中不存在叠氮和乙炔官能团。因此，氨基酸侧链、N-末端胺或C-末端羧基都不应受利用这些官能团的点击化学反应的影响。
式I的L部分和/或连接子还可以包括由-(CH2)r(V(CH2)p)q-或-(CH2CH2X)w-表示的连接单元，其中
V是单键，-O-，-S-，-NR21-，-C(O)NR22-，-NR23C(O)-，-NR24SO2-，或-SO2NR25-，优选-O-；
X是-O-，(C1-C8)亚烃基或-NR21-，优选-O-；
R21至R25各自独立地为氢，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷基(C6-C20)芳基或(C1-C6)烷基(C3-C20)杂芳基，优选氢；
r是1至10的整数，优选2或3；
p是0至12的整数，优选1或2；
q是1至20的整数；以及
w为1至20的整数，优选为1，3，6或12。
在一些实施方式中，p是11或12的整数。在一些实施方式中，q是11至20的整数，例如11，12，13，14，15或16。在一些实施方式中，w是11至20的整数，例如11，12，13，14，15或16。
在某些优选实施方式中，q是4至20的整数。在其它优选实施方式中，q是2至12的整数。
L和/或连接子优选包含由式(A)，(B)，(C)或(D)表示的结合单元和由-(CH2)r(V(CH2)p)q-或-(CH2CH2X)w-表示的连接单元。
在优选实施方式中，L和/或连接子包含至少一个由或者中任一个表示的聚乙二醇单元。聚乙二醇单元可以是-OCH2CH2-。抗体-药物缀合物可以包含1至20个聚乙二醇单元，例如1至12个聚乙二醇单元，5至12个聚乙二醇单元，6至12个聚乙二醇单元，5至20个聚乙二醇单元或6至20个聚乙二醇单元。抗体-药物缀合物可以包含1至20个-OCH2CH2-单元，例如1至12个-OCH2CH2-单元，5至12个-OCH2CH2-单元，6至12个-OCH2CH2-单元，5至20个-OCH2CH2-单元，或6至20个-OCH2CH2-单元。在其中L和/或连接子包含肟的实施方式中，聚乙二醇单元优选将肟共价连接至活性剂。在其中L和/或连接子包含肟的实施方式中，聚乙二醇单元优选将肟共价连接至W，例如，其中W由-C(O)NR'-表示。
L和/或连接子优选包含由-(CH2CH2O)n-表示的聚乙二醇基团，其中n为1至20，例如1至12，5至12，6至12，5至20或6至20。在其中L和/或连接子包含肟的实施方式中，聚乙二醇基团优选将肟共价连接至活性剂。在其中L和/或连接子包含肟的实施方式中，聚乙二醇基团优选将肟共价连接至W，例如，其中W由-C(O)NR'-表示。聚乙二醇基团的碳可以与W的原子(例如-C(O)NR'-的氮)形成共价键，和/或聚乙二醇基团的氧可以是肟的氧。
在一些实施方式中，L优选由以下两种结构中的一种表示，因此，连接子可以包含以下两种结构中的一种：
其中n是1至20的整数。例如，n可以是2至20，3至20，4至20，5至20，6至20，7至20，8至20，9至20，10至20，2至16，3至16，4至16，5至16，6至16，7至16，8至16，9至16或10至16中的整数。
L和/或连接子可以包含 或其中
V表示单键，-O-，-S-，-NR21-，-C(O)NR22-，-NR23C(O)-，-NR24SO2-或-SO2NR25-，优选-O-；
R21至R25独立地表示氢，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷基(C6-C20)芳基或(C1-C6)烷基(C3-C20)杂芳基；
r是1至10的整数，优选2或3；
p是0至10的整数，优选1或2；
q是1至20的整数，优选1至6；和
L1是单键。
在一些实施方式中，q是11至20的整数，例如11，12，13，14，15或16。
在一些实施方式中，L和/或连接子包含亲水性氨基酸，例如以增加抗体-药物缀合物、抗体-药物缀合物的连接子和/或前体的水溶性。亲水性氨基酸可以位于活性剂的近侧，靠近抗体，或者位于连接子的任何位置。具体而言，亲水性氨基酸可以将L和/或连接子的肟与L和/或连接子的聚乙二醇单元共价连接。肽可以将L和/或连接子的肟与L和/或连接子的聚乙二醇单元共价连接。
在一些实施方式中，抗体-药物缀合物包含肽，并且所述肽包含至少一个亲水性氨基酸。肽可以包含2至20个氨基酸。该肽的大部分氨基酸可以独立地选自丙氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，赖氨酸，鸟氨酸，脯氨酸，丝氨酸和苏氨酸。例如，肽的每个氨基酸可以独立地选自丙氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，赖氨酸，鸟氨酸，脯氨酸，丝氨酸和苏氨酸。
在一些实施方式中，抗体-药物缀合物具有如上所述的式(I)的结构，或其中裂解基团具有本文所定义的任何裂解基团结构式的相应结构。
在某些这样的实施方式中，W可以表示-C(O)NR'-，并且W的氮可以是亲水性氨基酸的氮原子。类似地，W可以表示-C(O)NR'-，并且W的氮可以是肽中N-末端氨基酸的氮原子。
亲水性氨基酸可以是天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。亲水性氨基酸可以是α-氨基酸或β-氨基酸。亲水性氨基酸可以是精氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，鸟氨酸，脯氨酸，丝氨酸或苏氨酸，也可以是D-氨基酸或L-氨基酸。在某些优选实施方式中，亲水性氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸，例如L-天冬氨酸或L-谷氨酸。在其它优选实施方式中，亲水性氨基酸是赖氨酸或鸟氨酸，例如L-赖氨酸或L-鸟氨酸。在某些实施方式中，亲水性氨基酸是精氨酸，例如L-精氨酸。在某些实施方式中，亲水性氨基酸包含具有在水溶液中性pH值下带电荷的部分的侧链(例如胺，胍或羧基部分)。
肽可以包含天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸。肽可以包含α-氨基酸和/或β-氨基酸。在一些实施方式中，所述肽基本上由α-氨基酸组成。在一些实施方式中，所述肽基本上由天然存在的氨基酸组成。所述肽可以包含选自丙氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，赖氨酸，鸟氨酸，脯氨酸，丝氨酸和苏氨酸的氨基酸，基本上由其组成或甚至由其组成，所述氨基酸中的任何一个可以是L-氨基酸，和/或D-氨基酸。在一些实施方式中，所述肽基本上由L-氨基酸组成。在某些实施方式中，肽不包含疏水性氨基酸，例如选自异亮氨酸，甲硫氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸或缬氨酸的氨基酸；换句话说，在这样的实施方式中，肽不含或基本上不含这些氨基酸。在优选的实施方式中，肽不包含异亮氨酸，甲硫氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸和缬氨酸中的任何一种。
亲水性氨基酸可以将L和/或连接子的肟与L和/或连接子的聚乙二醇单元共价连接。肽可以将L和/或连接子的肟与L和/或连接子的聚乙二醇单元共价连接。
在一些实施方式中，抗体-药物缀合物包含以下结构：
其中A表示抗体，B表示活性剂，m是0至20的整数(例如2，3，4，5，6，7，8，9或10)，n是1至20的整数(优选2至20，例如4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16)，R1为氢或甲基，并且R2为氨基酸的侧链，优选亲水性氨基酸，最优选天冬氨酸或谷氨酸。
在一些实施方式中，抗体-药物缀合物包含以下结构：
其中A表示抗体，B表示活性剂，m是0至20的整数(例如2，3，4，5，6，7，8，9或10)，n是1至20的整数(优选2至20，例如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16)，R1为氢或甲基，并且R2为氨基酸的侧链，优选亲水性氨基酸，最优选天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施方式中，n是0至20的整数，优选0或2。
在一些实施方式中，抗体-药物缀合物包含以下结构：
其中A表示抗体，B表示活性剂，x是1至20的整数(例如2，3，4，5，6，7，8，9或10)，y是1至20的整数(例如2，3，4，5，6，7，8，9或10)，z是1至20的整数(优选2至20，例如4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16)，且R1为氢或甲基。在一些实施方式中，n是0至20的整数，优选0或2。
在一些实施方式中，抗体-药物缀合物包含以下结构：
其中A表示抗体，B表示活性剂，R1是氢或甲基，x是0至20的整数(例如0，1，2，3，4或5)，y是0至20的整数(例如2，3，4，5，6，7，8，9或10)，z是1至20的整数(优选2至20，例如4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16)，且每个R2独立地选自氨基酸侧链，优选亲水性氨基酸侧链。例如，在某些优选实施方式中，x是1且R2是天冬氨酸或谷氨酸的侧链。
在优选实施方式中，抗体包含能够被类异戊二烯转移酶识别的氨基酸基序。例如，抗体的至少一个C-末端可以包含能够被类异戊二烯转移酶识别的氨基酸基序(例如作为底物，例如在形成抗体-药物缀合物之前；或者作为类异戊二烯转移酶的产物，例如在形成抗体-药物缀合物之后)。抗体可进一步包含间隔子(spacer)，例如将抗体的肽链连接至氨基酸基序的氨基酸或一段氨基酸。间隔子可以由1至20个连续的氨基酸组成，优选7至20个氨基酸。在一些实施方式中，甘氨酸和脯氨酸是用于间隔子的优选氨基酸，并且可以以任何组合使用，例如一系列至少约1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个甘氨酸或一系列约1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个甘氨酸。在其它实施方式中，氨基酸基序各自独立地选自甘氨酸，天冬氨酸，精氨酸和丝氨酸。抗体可以包含在羧基末端的添加或缺失，例如相对于不包含在ADC中的抗体的形式。
类异戊二烯转移酶的实例包括法尼酰基蛋白转移酶(FT酶)和香叶烯基转移酶(GGT酶)，其可以催化法尼基或香叶基-香叶基转移至靶蛋白的至少一种C-末端半胱氨酸。GGT酶可分为GGT酶I或GGT酶II。FT酶和GGT酶I可以识别CAAX基序，且GGT酶II可以识别XXCC，XCXC，或CXX基序，其中C表示半胱氨酸，A表示脂肪族氨基酸(例如异亮氨酸，缬氨酸，甲硫氨酸，亮氨酸)，且每个X独立地表示例如谷氨酰胺，谷氨酸，丝氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，或亮氨酸(参见Nature Rev.Cancer,5(5):405-12(2005)；Nature ChemicalBiology 17:498-506(2010)；Lane KT,Bees LS,J.Lipid Research,47:681-699(2006)；Kasey PJ,Seabra MC,J.Biological Chemistry,271(10):5289-5292(1996)，其中各自通过引用在此全部并入本文)。
根据本发明的抗体-药物缀合物可以包含氨基酸基序，例如CYYX，XXCC，XCXC或CXX，优选CYYX(其中，C表示半胱氨酸，Y表示脂肪族氨基酸，例如亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸和/或甲硫氨酸，X表示决定类异戊二烯转移酶底物特异性的氨基酸，例如谷氨酰胺，谷氨酸，丝氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸和/或亮氨酸)。
可以使用来自各种来源的类异戊二烯转移酶。例如，类异戊二烯转移酶可以从人，动物，植物，细菌，病毒或其它来源获得。在一些实施方式中，使用天然存在的类异戊二烯转移酶。在一些实施方式中，可以使用天然修饰的或人工修饰的类异戊二烯转移酶。例如，类异戊二烯转移酶可以包含一个或多个氨基酸取代、添加和/或缺失，和/或类异戊二烯转移酶可以通过添加组氨酸标签，GST，GFP，MBP，CBP，Isopeptag，BCCP，Myc标签，钙调蛋白标签，FLAG标签，HA标签，麦芽糖结合蛋白标签，Nus标签，谷胱甘肽-S-转移酶标签，绿色荧光蛋白标签，硫氧还蛋白标签，S标签，Softag 1，Softag 3，Strep标签，SBP标签和Ty标签等中的至少一个而被修饰。
类异戊二烯转移酶识别等底物和/或底物。术语等底物是指包含化学修饰的底物类似物。类异戊二烯转移酶可以在抗体的C-末端烷基化特定的氨基酸基序(例如，CAAX基序)(参见例如Duckworth,BP等,ChemBioChem,8:98(2007)；Uyen TT等,ChemBioChem,8:408(2007)；Labadie,GR等,J.Org.Chem.,72(24):9291(2007)；Wollack,JW等,ChemBioChem,10:2934(2009)，其中各自通过引用在此并入本文)。可以使用可以烷基化C-末端半胱氨酸的类异戊二烯转移酶和等底物产生官能化抗体。
等底物可以是例如式IV的化合物。
C-末端CAAX基序的半胱氨酸可以使用类异戊二烯转移酶结合到等底物上。在一些实施方式中，部分基序(例如AAX)随后可通过蛋白酶除去，例如仅留下类异戊二烯所结合的半胱氨酸。半胱氨酸可以任选地在羧基末端例如通过酶甲基化(参见例如Bell,IM,J.Med.Chem.,47(8):1869(2004))，其通过引用并入本文)。
本发明的抗体-药物缀合物可以使用本领域已知的任何方法制备，包括分子生物学和细胞生物学方法。例如，可以使用瞬时或稳定的转染方法。编码能够被类异戊二烯转移酶识别的特定氨基酸基序的基因序列可以使用标准PCR和/或连接技术插入到已知的质粒载体中，从而表达在C-末端具有特定氨基酸基序的抗体。具有至少一个能够被类异戊二烯转移酶识别的氨基酸基序的抗体因此可以在合适的宿主例如CHO细胞中或在大肠杆菌(E.coli)中表达。
术语“抗体”是指通过在免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合不同分子的免疫球蛋白分子。本文使用的术语“抗体”包括完整多克隆抗体，完整单克隆抗体，抗体片段(例如Fab，Fab'，F(ab')2，Fd和Fv片段)，单链Fv(scFv)突变体，多特异性抗体(例如由两种或更多种完整抗体产生的双特异性抗体)，嵌合抗体，人源化抗体，人抗体，包括抗体的抗原决定部分的融合蛋白和任何其它包括抗原识别位点的经修饰的免疫球蛋白分子。抗体可以是免疫球蛋白的五大类中的任何一种：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM或其亚类(同种型)(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)，基于其重链恒定结构域的同一性，分别被称为α，δ，ε，γ和μ。不同种类的免疫球蛋白具有不同的和众所周知的亚基结构和三维构型。术语“抗体”不是指与免疫球蛋白序列不具有同源性的分子。例如，本文使用的术语“抗体”不包括“重复抗体”。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括由抗体片段形成的Fab，Fab'，F(ab')2，Fd和Fv片段，线性抗体，单链抗体和多特异性抗体。
术语“单克隆抗体”是指涉及单一抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的同源抗体群。这与通常包括针对多种不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体形成对比。术语“单克隆抗体”包括抗体片段(诸如Fab，Fab'，F(ab')2，Fd，Fv)，单链(scFv)突变体，包括抗体部分的融合蛋白和任何其它修饰的免疫球蛋白分子，包括抗原识别位点以及完整和全长的单克隆抗体，但不限于此。另外，“单克隆抗体”是指以许多方法制备的这种抗体，包括但不限于杂交瘤，噬菌体选择，重组表达和转基因动物。
术语“人源化抗体”是指非人(例如鼠)抗体的形式，其是特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其含有最小非人(例如鼠)序列的片段。一般而言，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中来自互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和性和性能的来自非人物种(例如，小鼠，大鼠，兔和仓鼠)的CDR的残基代替(参见例如，Jones等，Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等,Science,239:1534-1536(1988))。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被来自具有所需特异性、亲和力和/或结合能力的非人物种的抗体中的相应残基代替。人源化抗体可以通过取代Fv框架区中和/或代替的非人残基内的其它残基来进一步被修饰，以改进和优化抗体特异性，亲和力和/或结合能力。一般而言，人源化抗体包括基本上全部的至少一个，并且通常两个或三个可变结构域，其含有全部或基本上全部的对应于非人免疫球蛋白的CDR，而全部或基本上全部的框架区(FRs)具有人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还可以包括免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的那一部分。用于产生人源化抗体的方法的实例在美国专利号5,225,539中已描述，其通过引用并入本文。
如本文所用的术语“人抗体”是指使用本领域已知的任何技术通过人核苷酸序列编码的抗体或具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体的该定义包括完整的全长抗体和/或其片段。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两种或更多种，其中一种优选为人。通常，轻链和重链的可变区对应于来源于具有所需特异性、亲和性和性能的一种哺乳动物物种(例如小鼠，大鼠，兔等)的抗体的可变区，而恒定区与来源于另一物种(通常是人)的抗体中的序列同源，例如以避免在该物种中引起免疫应答。
术语“表位”和“抗原决定簇”在本文中可互换使用，是指能够被特定抗体识别和特异性结合的抗原部分。当抗原是或包含多肽或蛋白质时，表位可由连续和/或非连续的氨基酸形成，例如通过蛋白质的二级，三级和/或四级折叠并置。由连续氨基酸形成的表位通常在蛋白质变性时被保留，而由三级折叠形成的表位在蛋白质变性后可能会丢失。表位通常在独特的空间构象中包括3个或更多个，5个或更多个，或8至10个或更多个氨基酸。
抗体与表位或抗原性分子“特异性结合”，这意味着抗体与替代物(包括不相关的蛋白质)相比更频繁，更迅速地以更大的持续时间，更大的亲和性或前述与表位或抗原性分子的某种组合相互作用或关联。在具体实施方式中，“特异性结合”是指例如抗体以约0.1mM或更小，但更通常地小于约1μM的KD与蛋白质结合。在具体实施方式中，“特异性结合”是指抗体有时以约0.1μM或更小的KD与蛋白质结合，并且在其它时间以约0.01μM或更小的KD与蛋白质结合。由于不同物种中同源蛋白之间的序列同一性，特异性结合可能包括识别超过一种物种中特定蛋白的抗体。应该理解的是，特异性结合至第一靶标的抗体或结合残基可以或不可以特异性结合第二靶标。如上所述，“特异性结合”不一定需要(尽管可以包括)独占性结合，即与单个靶标结合。通常但非必需，本文使用的术语“结合”是指特异性结合。
可使用本领域已知的方法获得抗体(包括其片段/衍生物和单克隆抗体)(参见例如McCafferty等，Nature 348：552-554(1990)；Clackson等，Nature352：624-628；Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)；Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Waterhouse等，Nucleic Acids Res.21：2265-2266(1993)；Morimoto等，J Biochemical&Biophysical Methods 24：107-117(1992)；Brennan等人，Science 229：81(1985)；Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992)；Kohler等，Nature 256：495(1975)；Kilpatrick等，Hybridoma 16(4)：381-389(1997)；Wring等，J.Pharm.Biomed.Anal(5)：695-707(1999)；Bynum等，Hybridoma 18(5)：407-411(1999)，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551 1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year Immuno.7：33(1993)；Barbas等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA91：3809-3813(1994)；Schier等，Gene 169：147-155(1995)；Yelton等，J.Immunol。155：1994-2004年(1995年)；杰克逊等。J.Immunol。154(7)：3310-9(1995)；Hawkins等人，J.Mol.Biol。生物学。美国专利第226：889-896(1992)美国专利第4,816,567号，第5,514,548号，第5,545,806号，第5,569,825号，第5,591,669号，第5,545,807号；PCT专利申请公开号WO 97/17852，各自通过引用全部并入本文)。
抗体可以为莫罗单抗，利妥昔单抗，达克珠单抗，帕利珠单抗，英夫利昔单抗，曲妥珠单抗，依那西普，巴利昔单抗，吉妥单抗，阿仑单抗，替伊莫单抗，阿达木单抗，阿法赛特，奥马珠单抗，依法利珠单抗，托西莫单抗，贝伐珠单抗，那他珠单抗，兰尼单抗，依库丽单抗，利洛纳塞，赛妥珠单抗，罗米司亭，AMG-531，戈利木单抗，尤特克单抗，ABT-874，贝拉西普，贝利木单抗，阿塞西普，抗-CD20抗体，卡那单抗，托珠单抗，托西珠单抗，美泊利单抗，帕妥株单抗，HuMax CD20，曲美木单抗，ticilimumab，伊匹单抗，IDEC-114，奥英妥珠单抗，阿柏西普，HuMax-CD4，teplizumab，otelixizumab，卡妥索单抗，抗-EpCAM抗体IGN101，阿德木单抗，dinutuximab，girentuximab，狄迪诺塞麦，bapineuzumab，motavizumab，efumgumab，瑞西巴库，抗-CD20抗体，LY2469298和维妥珠单抗。
在某些优选实施方式中，抗体不特异性结合CD19或EGFR(表皮生长因子受体)。在其它实施方式中，抗体可以是抗CD19或EGFR抗体。
当抗体包含至少一条轻链和至少一条重链时，抗体的至少一条轻链或抗体的至少一条重链或两者均可以包含具有能够被类异戊二烯转移酶识别的氨基酸基序的氨基酸区。由于抗体可以包含四条多肽链(例如两条重链和两条轻链)，所以抗体可以包含四个氨基酸基序，其中的每一个可以用于通过连接子将活性剂缀合至抗体上。因此，抗体-药物缀合物可以包含4个连接子，每个连接子缀合至活性剂，例如各自缀合至抗体不同链的C-末端。因此，抗体-药物缀合物可以包含至少一个连接子和至少一个活性剂。抗体-药物缀合物可以包含至少两个连接子，并且抗体-药物缀合物可以包含至少两个活性剂。抗体-药物缀合物可以包含1，2，3或4个连接子。抗体-药物缀合物可以包含1，2，3或4个活性剂。在包含2个或更多个活性剂的抗体-药物缀合物中，活性剂可以全部相同，可以全部不同，或者可以以任何混合物或比例存在。
活性剂可以是药物，毒素，亲和配体，检测探针或任何上述的组合。
活性剂可以选自埃罗替尼；硼替佐米；氟维司群；索坦；来曲唑；甲磺酸伊马替尼；PTK787/ZK222584；奥沙利铂；5-氟尿嘧啶；亚叶酸；雷帕霉素(Sirolimus)；拉帕替尼；洛那法尼；索拉非尼；吉非替尼；AG1478；AG1571；烷化剂(例如噻替派或环磷酰胺)；烷基磺酸盐(白消安，英丙舒凡或哌泊舒凡)；氮丙啶(苯丙多巴，卡波醌，美妥替哌或乌瑞替派)；乙烯亚胺，甲基三聚氰胺(methylmelamine)，六甲嘧胺，三亚乙基蜜胺，三乙烯磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺，三羟甲基蜜胺；番荔素(例如泡番荔枝辛或bullatacinone)；喜树碱；喜树碱的衍生物或代谢物(例如SN-38)；托泊替康；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括它的阿多来新，卡折来新，比折来新合成类似物)；念珠藻素(例如念珠藻素1或念珠藻素8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成的类似物如KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素；氮芥(例如苯丁酸氮芥，萘氮芥，胆磷酰胺，雌氮芥，异环磷酰胺，氮芥，盐酸氧氮芥，美法仑，新氮芥，胆甾醇苯乙酸氮芥，松龙苯芥，曲磷胺或尿嘧啶氮芥)；亚硝脲(例如亚硝基脲氮芥，氯脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀或雷莫司汀)；抗生素(例如烯二炔抗生素如选自卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ω1I的卡奇霉素，或者包括达内霉素A的达内霉素)；双膦酸盐(例如氯膦酸盐)；埃斯培拉霉素，新制癌菌素生色团，或相关色蛋白烯二炔抗生素生色团，阿克拉霉素类，放射菌素，安替比林(antrmycin)，重氮丝氨酸(azaserine)，博来霉素，放线菌素C，卡柔比星(carabicin)，洋红霉素(carninomycin)，嗜癌霉素(carzinophilin)，色霉素(chromomycins)，放线菌素D，道诺菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubucin)，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，阿霉素(例如吗啉代-阿霉素，氰基吗啉代-阿霉素，2-吡咯烷子基-阿霉素，脂质体阿霉素或去氧阿霉素)，表柔比星，依索比星，麻西罗霉素，丝裂霉素(例如丝裂霉素C，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素，培洛霉素，泊非霉素，嘌呤霉素，三铁阿霉素，罗多比星，链黑菌素，链脲霉素，杀结核菌素，乌苯美司，新制癌菌素或佐柔比星)；抗代谢物(例如5-氟尿嘧啶)；叶酸类似物(例如二甲叶酸，甲氨蝶呤，蝶罗呤或三甲曲沙)；嘌呤类似物(例如氟达拉滨，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤或硫鸟嘌呤)；嘧啶类似物(例如盐酸环胞苷，阿扎胞苷，6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨或氟尿苷)；雄激素(例如二甲睾酮，屈他雄酮丙酸盐，环硫雄醇，美雄烷)，或睾内酯)；抗肾上腺(例如氨鲁米特，米托坦或曲洛司坦)；叶酸补充物(例如亚叶酸)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；巴斯布西；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵；埃博霉素；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；氯尼达明；美登木素(例如美登素或安丝菌素)；单端孢霉烯族毒素类(特别为T-2毒素，黏液霉素Α，杆抱菌素A或蛇形菌素)；丙脒腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基酰胼；甲基苄胼；云芝多糖-K复合物；雷佐生；根霉素；西索菲兰；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(特别为T-2毒素，黏液霉素Α，杆抱菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；溴丙哌嗪；干胞嘧啶；阿拉伯糖苷；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类(例如紫杉醇)，ABRAXANETM无克列莫佛，紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂；多西紫杉醇；苯丁酸氮芥；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂类似物(例如顺铂或卡铂)；长春碱；铂；鬼臼乙叉甙；异氨喋呤环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨，诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨喋呤；希罗达；伊拜膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂(RFS2000)；二氟甲基鸟氨酸；视黄素(例如视黄酸)；卡培他滨和任何上述物质的药学上可接受的盐，溶剂化物，酸或衍生物，但不一定限于此。
活性剂可以选自(i)用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂如抗雌激素类和和选择性雌激素受体调节剂，例如包括他莫昔芬，雷洛昔芬，屈洛昔芬，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬，那洛昔芬，LY117018，奥那司酮和托瑞米芬；(ii)抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，其可调节肾上腺中雌激素的产生，例如4(5)-咪唑，氨鲁米特，醋酸甲地孕酮，依西美坦，来曲唑和阿那曲唑；(iii)抗雄激素，例如氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；(iv)芳香酶抑制剂；(v)蛋白激酶抑制剂；(vi)脂质激酶抑制剂；(vii)反义寡核苷酸，特别是抑制粘附细胞中涉及的信号传导途径中的基因表达的那些反义寡核苷酸，例如PKC-α，Raf，H-Ras；(viii)核酶，例如VEGF抑制剂，如核酶和HER2表达抑制剂；(ix)疫苗，例如基因疗法疫苗；疫苗，LEUVECTIN疫苗，VAXID疫苗；rlL-2；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；(x)抗血管生成剂，如贝伐单抗；和(xi)其药学上可接受的盐，溶剂化合物，酸或衍生物。
另外，可以使用细胞因子作为活性剂。细胞因子是许多细胞分泌的小细胞信号蛋白分子，是广泛用于细胞间通讯的一类信号分子。细胞因子包括单核因子，淋巴因子和传统的多肽激素等。细胞因子的实例包括生长激素(例如人生长激素，N-甲硫氨酰人生长激素或牛生长激素)；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素(例如促卵泡激素(FSH)，促甲状腺激素(TSH)或黄体化激素(LH))；肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α，肿瘤坏死因子-β；抗缪勒氏管激素；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整合素，血小板生成素(TPO)；神经生长因子(例如NGF-β)；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)(例如TGF-α或TGF-β)；胰岛素类生长因子-I，胰岛素类生长因子-II；促红细胞生成素(EPO)；成骨诱导因子；干扰素(例如干扰素-α，干扰素-β或干扰素-γ)；集落刺激因子(CSF)(例如集落刺激因子(M-CSF)，粒细胞-集落刺激因子(GM-CSF)或粒细胞-CSF(G-CSF))；白细胞介素(IL)(例如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11或IL-12)；肿瘤坏死因子(TNF)(例如TNF-α或TNF-β)；和多肽因子(例如LIF或试剂盒配体)，但并不限于此。此外，术语“细胞因子”还包括来自天然来源的细胞因子或天然序列细胞因子的重组细胞培养物和生物活性等同物。
术语“毒素”是指对活细胞或生物体有毒的物质。毒素可以是能够在接触身体组织或被身体组织吸收之后，例如通过与一种或多种生物大分子(如酶或细胞受体)的相互作用而引起细胞功能障碍或细胞死亡的小分子、肽或蛋白质。毒素包括植物毒素和动物毒素。动物毒素的实例包括白喉毒素，肉毒杆菌毒素，破伤风毒素，痢疾毒素，霍乱毒素，河豚毒素，裸藻毒素和雪卡毒素，但并不限于此。植物毒素的实例包括蓖麻毒蛋白和AM-毒素，但并不限于此。
小分子毒素的实例包括澳瑞他汀，微管蛋白抑制剂，格尔德霉素(Kerr等，1997，Bioconjugate Chem.8(6)：781-784)，美登素(EP 1391213，ACR2008,41,98-107)，卡奇霉素(美国专利申请号2009/0105461,Cancer Res.1993,53,3336-3342)；柔红霉素，阿霉素，甲氨蝶呤，长春地辛，SG2285(Cancer Res.2010,70(17)，6849-6858)，多拉司他汀，多拉司他汀类似物，澳瑞他汀(美国专利号5,635,483)，念珠藻素，喜树碱，喜树碱衍生物或代谢物(例如SN-38)，根霉素衍生物，CC-1065类似物或衍生物，倍癌霉素，烯二炔抗生素，埃斯培拉霉素，埃博霉素，吡咯开苯并吖庚三烯(PBD)衍生物，鹅膏素，鹅膏素的衍生物，α-鹅膏素，阿普立定(aplidine)，阿佐夫得和类毒素，但并不限于此。毒素可以通过微管蛋白结合，DNA结合，拓扑异构酶抑制等显示细胞毒性和细胞生长抑制活性。
“可检测部分”或“标记”是指通过光谱，光化学，生物化学，免疫化学，放射性或化学手段可检测的组合物。例如，有用的标记包括32P，35S，荧光染料，电子致密试剂，酶(例如ELISA中常用的酶)，生物素-链霉抗生物素蛋白，二氧肟基(dioxigenin)，半抗原和可得到抗血清或单克隆抗体的蛋白质或具有靶向互补序列的核酸分子。可检测部分通常产生可测量的信号，例如放射性，发色或荧光信号，其可用于定量样品中结合的可检测部分的量。信号的定量可以通过例如闪烁计数，密度测定，流式细胞术，ELISA或通过质谱直接分析完整的或随后消化的肽(可以评估一种或多种肽)来实现。
如本文所用，术语“探针”是指可以(i)提供可检测信号，(ii)与第一探针或第二探针相互作用以修饰由第一或第二探针提供的可检测信号(例如荧光共振能量转移(FRET))，(iii)稳定与抗原或配体的相互作用或增加结合亲和性；(iv)通过诸如电荷，疏水性等物理参数影响电泳迁移率或细胞侵入活性，或(v)控制配体亲和性，抗原-抗体结合或离子复合物形成的材料。
活性剂可以是免疫调节化合物，抗癌剂，抗病毒剂，抗菌剂，抗真菌剂，抗寄生虫剂或其组合。
免疫调节化合物可以选自氨基己酸，咪唑硫嘌呤，溴麦角环肽(bromocriptine)，苯丁酸氮芥，氯喹，环磷酰胺，环孢霉素，环孢霉素A，达那唑，脱氢表雄酮，地塞米松，依那西普，氢化可的松，羟化氯喹，英夫利昔单抗，美洛昔康(meloxicam)，甲氨蝶呤，麦考酚酸莫酯(mycophenylate mofetil)，泼尼松，西罗莫司和他克莫司。抗癌剂可以选自1-甲基-4-苯基吡啶离子，5-乙炔基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-甲酰胺(EICAR)，5-氟尿嘧啶，9-氨基喜树碱，放线菌素D，天冬酰胺酶，比卡鲁胺，卡氮芥(BCNU)，博来霉素，博来霉素A2，博来霉素B2，白消安，喜树碱，喜树碱的衍生物或代谢物(例如SN-38)，卡铂，亚硝基脲氮芥，CB1093，苯丁酸氮芥，顺铂，克立那托(crisnatol)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，阿糖胞苷(cytarabine)，阿糖胞苷(cytosine arabinoside)，环磷酰胺(cytoxan)，达卡巴嗪，放线菌素D，道诺菌素，氨烯咪胺，去铁胺(deferoxamine)，去甲氧-竹红菌素(demethoxy-hypocrellin)A，紫杉萜(docetaxel)，去氧氟尿苷，阿霉素，EB1089，表柔比星，鬼臼乙叉甙，氟尿嘧啶，氟达拉滨，氟他胺，吉西他滨，戈舍瑞林，羟基脲，去甲氧基柔红霉素，异环磷酰胺，干扰素-α，干扰素-γ，依立替康，KH1060，醋酸亮丙瑞林，洛莫司汀，洛弗斯塔特因(lovastatin)，甲地孕酮，美法仑，巯基嘌呤，甲氨蝶呤，丝裂霉素，丝裂霉素C，米托蒽醌，霉酚酸，氮芥，亚硝基脲，紫杉醇，培洛霉素，光敏剂Pe4，酞菁染料(phthalocyanine)，吡柔比星，普卡霉素(plicamycin)，甲苄肼(procarbazine)，雷洛昔芬，雷替曲塞(raltitrexed)，来那度胺(revlimid)，病毒唑(ribavirin)，十字孢碱(staurosporine)，他莫昔芬，替尼泊苷，沙利度胺(thalomid)，毒胡萝卜素(thapsigargin)，硫鸟嘌呤，噻唑羧胺核苷(tiazofurin)，托泊替康，苏消安(treosulfan)，曲美沙特(trimetrexate)，肿瘤坏死因子，硼替佐米(velcade)，戊脉安(verapamil)，维替泊芬(verteporfin)，长春碱，长春新碱，长春瑞宾(vinorelbine)和佐柔比星。抗病毒剂可以选自pencicyclovir，伐昔洛韦(valacyclovir)，gancicyclovir，膦甲酸，病毒唑，碘苷(idoxuridine)，阿糖腺苷(vidarabine)，屈氟尿苷(trifluridine)，开糖环鸟苷(acyclovir)，famcicyclovir，金刚烷胺，金刚烷乙胺，西多福韦(cidofovir)，反义寡核苷酸，免疫球蛋白和干扰素。抗菌剂可以选自氯霉素，万古霉素，甲硝唑，甲氧苄氨嘧啶(trimethoprin)，磺胺甲唑，奎奴普丁(quinupristin)，达福普汀(dalfopristin)，利福平(rifampin)，奇霉素(spectinomycin)和呋喃妥因(nitrofurantoin)。抗真菌剂可以选自两性霉素B，念珠菌素，菲律宾菌素(filipin)，哈霉素，那他霉素，制霉菌素(nystatin)，裂霉素(rimocidin)，联苯苄唑，布康唑，克霉唑，益康唑，芬替康唑(fenticonazole)，异康唑(isoconazole)，酮康唑，卢立康唑，咪康唑，奥莫康唑(omoconazole)，奥昔康唑，舍他康唑(sertaconazole)，硫康唑(sulconazole)，噻康唑(tioconazole)，康唑，氟康唑，艾沙康唑(isavuconazole)，伊曲康唑(itraconazole)，泊沙康唑(posaconazole)，里氟康唑(ravuconazole)，特康唑(terconazole)，伏立康唑(voriconazole)，阿巴芬净(abafungin)，阿莫罗芬(amorolfin)，布替那芬(butenafine)，萘替芳(naftifine)，特比萘芬(terbinafine)，阿尼芬净(anidulafungin)，卡泊芬净(caspofungin)，米卡芬净(micafungin)，苯甲酸，环吡司(ciclopirox)，氟胞嘧啶(flucytosine)，灰黄霉素，卤丙炔氧苯(haloprogin)，托萘酯(tolnaftate)，十一烯酸，结晶紫，秘鲁香脂(balsamofperu)，环吡司乙醇胺(ciclopiroxolamine)，吡罗克酮乙醇胺(piroctoneolamine)，吡硫锌和硫化硒。抗寄生虫剂可以选自甲苯咪唑，双羟萘酸噻嘧啶(pyrantelpamoate)，噻苯咪唑(thiabendazole)，乙胺嗪(diethylcarbamazine)，双氢除虫菌素(ivermectin)，氯硝柳胺(niclosamide)，吡喹酮(praziquantel)，阿苯达唑(albendazole)，利福平，两性霉素B，美拉胂醇(melarsoprol)，依氟鸟氨酸(eflornithine)，甲硝哒唑(metronidazole)，磺甲硝咪唑(tinidazole)和米替福新(miltefosine)。
抗体可以包含选自Ab-HC-(G)zCVIM，Ab-HC-(G)zCVLL，Ab-LC-(G)zCVIM和Ab-LC-(G)zCVLL，Ab-HC(G)zCVIM/LC-(G)zCVIM，Ab-HC-(G)zCVLL/LC-(G)zCVIM，Ab-HC-(G)zCVIM/LC-(G)zCVLL和Ab-HC-(G)zCVLL/LC-(G)zCVLL的氨基酸基序，其中Ab表示抗体，-HC-表示重链，-LC-表示轻链，G表示甘氨酸，C表示半胱氨酸，V表示缬氨酸，I表示异亮氨酸，M表示甲硫氨酸，L表示亮氨酸，z是0至20的整数，优选1至10。
抗体-药物缀合物可以具有式(V)或(VI)的结构。
Z是氢，(C1-C8)烷基，卤素，氰基或硝基，优选氢；
X是-O-，(C1-C8)亚烃基或-NR21-，优选-O-；
R21是氢，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷基(C6-C20)芳基或(C1-C6)烷基(C3-C20)杂芳基；
n为1至3的整数，优选3，n为2或者2以上的整数时，每个Z彼此相同或不同，优选相同；
r是1至10的整数，优选3；
w是1至20的整数，优选2至10，最优选3；
x是0至10的整数，优选0；
g是1至10的整数，优选1或2，最优选1；
-S-mAb是抗体；和
B是活性剂。
在一些实施方式中，w是11至20的整数，例如11，12，13，14，15或16。
在一些实施方式中，B选自以下任何一种结构：
其中y是1至10的整数。
使用本领域技术人员已知的制备组合物的方法，抗体-药物缀合物可以用于将活性剂转移至受试者靶细胞以治疗受试者。在一些方面，本发明涉及包含如本文所述的抗体-药物缀合物的组合物(例如药物组合物)。
组合物可以以可注射的形式制备，既可以是液体溶液，也可以是悬浮液。也可以制备适于注射的固体形式，例如作为乳剂，或者将抗体-药物缀合物包封在脂质体中。抗体-药物缀合物可以与药学上可接受的载体组合，其包括不诱导产生对接受载体的受试者有害的抗体的任何载体。合适的载体通常包含缓慢代谢的大分子，例如蛋白质，多糖，聚乳酸，聚乙醇酸，聚合氨基酸，氨基酸共聚物，脂质聚集体等。
组合物还可以含有稀释剂，例如水，盐水，甘油和乙醇。辅助物质(例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲物质等)也可以存在于其中。该组合物可以通过注射非肠道施用，其中这样的注射可以是皮下或肌内注射。在一些实施方式中，组合物可以被施用到肿瘤中。组合物可以被插入(例如注射)到肿瘤中。另外的制剂适用于其它形式的施用，例如栓剂或口服施用。口服组合物可以以溶液，悬浮液，片剂，丸剂，胶囊剂或缓释制剂的形式施用。
组合物可以以与剂量和制剂相容的方式施用。该组合物优选包含治疗有效量的抗体-药物缀合物。术语“治疗有效量”是指以有效治疗或预防疾病或病症的多剂量方案施用的单一剂量或组合物。剂量可以根据待治疗的受试者，受试者的健康和身体状况，期望的保护程度以及其它相关因素而变化。活性成分(例如抗体-药物缀合物)的准确量可以取决于医生的判断。例如，治疗有效量的抗体-药物缀合物或含有其的组合物可以施用于患有癌症或肿瘤的患者以治疗癌症或肿瘤。
根据本发明的抗体-药物缀合物或含有其的组合物可以以其药学上可接受的盐或溶剂化物的形式施用。在一些实施方式中，根据本发明的抗体-药物缀合物或含有其的组合物可以与药学上可接受的载体，药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的添加剂一起施用。可以使用标准方法(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.，Easton，PA，第18版，1990)来测量药学上可接受的盐或溶剂化物，赋形剂和添加剂的有效量和类型。
关于癌症或肿瘤的术语“治疗有效量”是指可以减少癌细胞数量；减小癌细胞的大小；抑制癌细胞侵入外围系统或减少侵入；抑制癌细胞向其它系统扩散或减少扩散；抑制癌细胞生长；和/或改善至少一种与癌症相关的症状的量。在治疗癌症时，药物的有效性可以通过肿瘤进展时间(TTP)和/或缓解率(RR)来评估。
本文使用的术语“药学上可接受的盐”包括有机盐和无机盐。其实例包括盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，硫酸盐，柠檬酸盐，乙酸盐，草酸盐，氯化物，溴化物，碘化物，硝酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，酸式磷酸盐，异烟酸盐，乳酸盐，水杨酸盐，酸式柠檬酸盐，酒石酸盐，油酸盐，丹宁酸盐，pantonate，酒石酸氢盐，抗坏血酸盐，琥珀酸盐，马来酸盐，龙胆酸盐，延胡索酸盐，葡糖酸盐，葡糖醒酸盐(glucoronate)，糖酸盐，甲酸盐，苯甲酸盐，谷氨酸盐，甲磺酸盐，乙磺酸盐，苯磺酸盐，对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即1,1'-亚甲基双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。药学上可接受的盐可以包括另一种分子(例如乙酸根离子，琥珀酸根离子和/或其它反离子)。
可用于本文所述的抗体-药物缀合物的药学上可接受的溶剂化物的示例性溶剂化物包括水，异丙醇，乙醇，甲醇，二甲基亚砜，乙酸乙酯，乙酸和乙醇胺。
如本文所用，“预防”病症或病状的治疗剂是指在统计学样品中相对于未治疗的对照样品减少经治疗样品中的病症或病状的发生，或延迟发作或相对于未治疗的对照样品减少病症或病状中一种或多种症状严重性的化合物。
术语“治疗”包括预防性和/或治疗性治疗。术语“预防性或治疗性”治疗是本领域公认的，并且包括向宿主施用一种或多种主题组合物。如果在临床表现不希望的病状(例如宿主动物的疾病或其它不需要的状态)之前施用，则治疗是预防性的(即其保护宿主免于产生不想要的病状)，而如果在表现出不希望的病症之后施用，治疗是治疗性的(即意图减轻，改善或稳定存在的不想要的病状或其副作用)。
在一些实施方式中，本发明涉及治疗受试者的癌症的方法，其包含向受试者施用包含如本文所述的抗体-药物缀合物的药物组合物。在优选实施方式中，受试者是哺乳动物。例如，受试者可以选自啮齿动物，兔形动物，猫科动物，犬科动物，猪，羊，牛，马和灵长类动物。在某些优选实施方式中，所述受试者是人。
以下通过实施例对本发明的构成进行详细说明，但以下实施例仅用于帮助理解本发明。本发明的范围不限于此。此外，除非特别说明，否则说明书中描述的试剂，溶剂和原料可容易地从商业供应商获得。
实施例
下表列出了以下实施例中使用的缩写：
实施例1.化合物1i的制备
化合物1b的制备
在室温下，向5-甲酰基水杨酸1a(10.0g，60.1mmol)的THF(30mL)悬浮液中加入DIPEA(29.8mL，180mmol)和苄基溴(7.15mL，60.1mmol)。然后将反应混合物加热回流。在回流18小时后，将反应混合物用2N盐酸水溶液(100mL)稀释。所得混合物用EtOAc(2×100mL)萃取。将合并的有机层用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化残余物以生产化合物1b(12.9g，83％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ11.38(s,1H),9.86(s,1H),8.40(s,1H),8.01(d,J＝8.8Hz,1H),7.44(m,5H),7.12(d,J＝8.0Hz,1H),5.42(s,2H)。
化合物1c的制备
向化合物1b(5.0g，19.5mmol)和化合物M(8.5g，21.4mmol，参见实施例66)的MeCN(100mL)溶液中加入分子筛(10g)和Ag2O(18.0g，78.0mmol)。在N2下，在室温下搅拌12小时后，将反应混合物浓缩。然后将浓缩的反应混合物用H2O(100mL)稀释并用EtOAc(2×200mL)萃取。将合并的有机层用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化残余物以生产化合物1c(8.63g，77％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ9.94(s,1H),8.28(s,1H),8.02(d,J＝8.8Hz,1H),7.46-7.28(m,6H),5.41-5.32(m,6H),4.27(d,J＝9.2Hz,1H),3.71(s,3H),2.05(m,9H)。
化合物1d的制备
在0℃向化合物1c(3.10g，5.41mmol)i-PrOH/CHCl3(9mL/45mL)溶液中加入硅胶(3g)和NaBH4(0.41g，10.82mmol)。在N2下，在0℃下搅拌2小时后，将反应混合物用H2O(100mL)淬灭并用EtOAc(200mL)萃取。将有机层用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法纯化粗产物以生产呈白色固体的化合物1d(2.73g，87％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.74(s,1H),7.48-7.34(m,6H),7.16(d,J＝8.8Hz,1H),5.35-5.26(m,5H),5.15(m,1H),4.17(m,1H),3.73(s,3H),2.04(s,9H),1.73(t,1H)。
化合物1e的制备
向化合物1d(2.40g，4.17mmol)的EtOH(150mL)溶液中加入Pd/C(10wt.％，240mg)。在氢气下，将反应混合物在室温下搅拌10分钟。然后将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用EtOH(100mL)洗涤。浓缩滤液以得到作为白色固体的粗产物1e，(2.10g)，其未经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.06(s,1H)7.61(dd,J＝8.8Hz,1H),7.23(d,J＝8.0Hz1H),5.43-5.29(m,5H),4.17(s,2H),4.32(d,J＝8.4Hz,1H)3.69(s,3H),2.11-2.08(t,9H),1.24(t,1H)。
化合物1f的制备
在室温下，向粗化合物1e(2.10g，4.33mmol)的DMF(50mL)溶液中加入K2CO3(1.79g，13.01mmol)和烯丙基溴(0.41mL，4.76mmol)。在室温下搅拌3小时后，将反应混合物用2N盐酸水溶液(100mL)稀释。所得混合物用EtOAc(200mL)萃取。将有机层用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化残余物以生产化合物1f(2步为1.55g，70％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.74(s,1H),7.45(dd,J＝8.0Hz,2.0Hz,1H),7.16(d,J＝8.8Hz,1H),6.02(m,1H),5.40-5.26(m,5H),5.16(m,1H),4.76(m,2H),4.66(s,2H),4.19(m,1H),3.73(s,3H),2.07-2.05(m,9H),1.68(t,1H)。
化合物1g的制备
在氮气下且在0℃，向化合物1f(2.50g，4.77mmol)的DMF(20mL)溶液中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(1.30g，4.29mmol)和DIPEA(0.80mL，4.77mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟，升温至室温1小时。将反应混合物用H2O(100mL)稀释并用EtOAc(200mL)萃取。将有机层用盐水(100mL)洗涤并用无水MgSO4干燥。过滤并减压浓缩后，将得到的粗产物用柱色谱纯化以生产化合物1g(2.80g，85％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.28(d,J＝15.2Hz,2H),7.85(d,J＝2.4Hz,1H),7.55(dd,J＝3.2Hz,2.4Hz,1H),7.38(d,J＝15.2Hz,2H),7.20(d,J＝8.8Hz,1H)6.03(m,1H),5.42-5.19(m,8H),4.78(d,J＝5.2Hz,2H),4.12(d,J＝7.2Hz,1H),3.74(s,3H)。
化合物1h的制备
在0℃将化合物1g(528mg，0.77mmol)，MMAE(500mg，0.7mmol)和无水HOBt(19mg，0.14mmol)溶于DMF(3mL)，然后加入吡啶(0.7mL)和DIPEA(0.24mL，1.39mmol)。在N2下且在室温下搅拌24小时后，将反应混合物用H2O/饱和NH4Cl水溶液(100mL/50mL)稀释并用EtOAc(2×100mL)萃取。将合并的有机层用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化残余物以生产化合物1h(600mg，67％)。EI-MSm/z:[M+H]+1269.5,[M+Na]+1291.5。
化合物1i的制备
在室温下向化合物1h(600mg，0.47mmol)和三苯基膦(31mg，0.12mmol)的DCM(10mL)溶液中加入吡咯烷(0.047mL，0.57mmol)和Pd(PPh3)4(27mg，0.02mmol)。搅拌2小时后，将反应混合物用H2O/1N盐酸水溶液(50mL/50mL)稀释中并用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机层用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱(Hex/EtOAc1/1至EtOAc)纯化残余物以生产呈白色固体的化合物1i(480mg，82％)。EI-MSm/z:[M+H]+1228.4,[M+Na]+1250.4。
实施例2.化合物1j的制备
通过制备实施例1中的化合物1i的类似方法由MMAF-OMe制备化合物1j。
实施例3.化合物2g的制备
化合物2a的制备
在室温和氮气下将2-(2-(2-氯乙氧基)乙氧基)乙醇(10g，59.3mmol)溶于DMF(90mL)中，然后向其中加入NaN3(5.78g，88.9mmol)。在100℃下搅拌13小时后，向其中加入氯仿(200mL)和蒸馏水(300mL)，萃取有机层，并将萃取的有机层用无水Na2SO4干燥，减压浓缩。将残余物进行柱色谱以生产化合物2a(10.3g，99％)。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ3.75-3.73(m,2H),3.70-3.68(m,6H),3.63-3.61(m,2H),3.40(t,J＝5.4Hz,2H),2.20(t,J＝6.0Hz,1H)。
化合物2b的制备
在0℃和氮气下，将CBr4(21.4g，64.6mmol)溶于DCM(100mL)中，然后向其中加入三苯基膦(16.9g，64.6mmol)的DCM(100mL)溶液和化合物2a(10.3g，58.7mmol)，并将混合物在室温下搅拌13小时。反应完成后，向其中加入DCM(300mL)，蒸馏水(300mL)以萃取有机层，将萃取的有机层用无水Na2SO4干燥，减压浓缩。将残余物进行柱色谱以生产化合物2b(12g，85％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ3.83(t,J＝6.4Hz,2H),3.72-3.67(m,6H),3.48(t,J＝6.0Hz,2H),3.40(t,J＝4.8Hz,2H)。
化合物2c的制备
在室温和氮气下将化合物2b(1g，4.20mmol)溶解在MeCN中，然后向其中加入N-Boc-羟胺(643mg，4.82mmol)和DBU(0.66mL，4.41mmol)。在60℃搅拌13小时后，向其中加入DCM(300mL)和蒸馏水(300mL)以萃取有机层，并将萃取的有机层用无水Na2SO4干燥，减压浓缩。将残余物进行柱色谱以生产化合物2c(748mg，70％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.55(s,1H),4.05-4.03(m,2H),3.76-3.74(m,2H),3.74-3.69(m,6H),3.42(t,J＝4.8Hz,2H),1.49(s,9H)。
化合物2d的制备
将化合物2c(200mg，0.688mmol)溶于MeOH(5mL)中，然后向其中加入Pd/C(10wt.％，70mg)并在氢气下搅拌3小时。反应完成后，将反应混合物进行硅藻土过滤，减压浓缩以生产化合物2d(180mg，98％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.04-4.01(m,2H),3.74-3.62(m,7H),3.55(t,J＝5.2Hz,1H),2.88(t,J＝5.2Hz,1H),2.81(t,J＝5.2Hz,1H),1.64(s,2H),1.48(s,9H)。
化合物2e的制备
将DIPEA(0.042mL，0.32mmol)和PyBOP(126mg，0.24mmol)加入到DMF(4mL)中的化合物1i(200mg，0.16mmol)和化合物2d(51mg，0.19mmol)的搅拌混合物中。在N2和室温下搅拌4小时后，将反应混合物用H2O(100mL)稀释并用EtOAc(2×100mL)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。所得残余物经柱色谱纯化以得到化合物2e(142mg，60％)。EI-MSm/z:[M+H]+1474.7。
化合物2f的制备
在-20℃向化合物2e(142mg，0.096mmol)的MeOH(2mL)溶液中加入LiOH一水合物(36mg，0.86mmol)的H2O(2mL)溶液。在0℃下搅拌1小时后，将反应混合物用H2O/2N盐酸水溶液稀释(50mL/2mL)并用CHCl3(2×100mL)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩以得到粗化合物2f(128mg)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+1334.5。
化合物2g的制备
在0℃向粗化合物2f(105mg，0.08mmol)DCM(3mL)溶液中加入HCl(4M，在1mL1,4-二恶烷中)。1小时后，通过N流除去溶剂和过量的HCl，然后通过HPLC纯化残余物，以生产呈白色固体的化合物2g(47mg，46％)。EI-MSm/z:[M+H]+1234.4。
实施例4.化合物2h的制备
通过制备实施例3中的化合物2g的类似方法由化合物1j和化合物2d制备化合物2h。EI-MSm/z:[M+H]+1248.9。
实施例5.化合物3f的制备
化合物3a的制备
将六乙二醇(1.0g，3.54mmol)，Ag2O(1.23g，5.31mmol)和KI(117mg，0.71mmol)在DCM(10mL)中的混合物超声处理15分钟。将该悬浮液冷却至-30℃，逐滴加入对甲苯磺酰氯(688mg，3.61mmol)的DCM(13mL)溶液。然后将混合物逐渐升温至0℃并在此温度下保持15分钟。然后将反应混合物用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩以生产糖浆状残余物。然后，通过柱色谱(EtOAc至EtOAc/MeOH 10/1)纯化糖浆状残余物。将纯级分真空蒸发以得到化合物3a(1.18g，77％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.80(d,J＝8.4Hz,2H),7.34(d,J＝8.4Hz,2H),4.16(m,2H),3.72-3.58(m,22H),2.97(br,1H),2.45(s,3H)。
化合物3b的制备
将化合物3a(1.18g，2.71mmol)和NaN3(264mg，4.07mmol)溶于DMF(3mL)中。然后将反应混合物在100℃加热。在100℃15小时后，将反应混合物过滤并浓缩。通过柱色谱(EtOAc至EtOAc/MeOH 10/1)纯化残余物以得到化合物3b(728mg，87％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ3.75-3.70(m,2H),3.69-3.63(m,18H),3.62-3.60(m,2H),3.39(d,J＝5.2Hz,2H),3.07(br,1H)。
化合物3c的制备
在0℃向搅拌的化合物3b(728mg，2.36mmol)的THF(10mL)溶液中加入三乙胺(0.73mL，5.21mmol)和甲磺酸酐(619mg，3.55mmol)。2小时后，将LiBr(1.03g，11.8mmol)加入到搅拌的溶液中，并将所得的反应混合物回流5小时。冷却至室温后，将反应混合物减压浓缩。通过柱色谱(EtOAc至EtOAc/MeOH 10/1)纯化残余物以得到化合物3c(810mg，92％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ3.81(t,J＝6.4Hz,2H),3.69-3.65(m,18H),3.47(t,J＝6.4Hz,2H),3.39(t,J＝5.2Hz,2H)。
化合物3d的制备
在0℃将NaH(在油中60％，564mg，12.9mmol)加入到化合物3c(3.42g，9.24mmol)和N，N-二Boc-羟胺(2.80g，12.0mmol，通过PCT公开号WO2004/018466A2合成，在此通过引用并入)的DMF(20mL)溶液中。将反应混合物温热至室温并在此温度下保持2小时。减压蒸发溶剂，且残余物通过柱色谱(EtOAc/Hex1/20至1/5)纯化以生产化合物3d(3.51g，73％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.08(t,J＝4.8Hz,2H),3.73(t,J＝4.8Hz,2H),3.69-3.62(m,18H),3.39(t,J＝5.6Hz,2H),1.53(s,18H)。
化合物3e的制备
在0℃向化合物3d(123mg，0.23mmol)和Pd/C(10wt.％，25mg)的MeOH(5mL)搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.05mL，0.21mmol)。在氢气和室温下搅拌5小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(100mL)洗涤。将滤液浓缩以生产无色油状的化合物3e(118mg，95％)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.98(t,J＝4.4Hz,2H),3.61-3.51(m,22H),2.95(br,3H),1.46(s,18H).EI-MSm/z:[M+H]+497.6。
化合物3f的制备
通过制备实施例3中的化合物2g的类似方法由化合物1i和化合物3e制备化合物3f。EI-MSm/z:[M+H]+1366.6,[M+Na]+1389.6。
实施例6.化合物3g的制备
通过制备实施例3中的化合物2g的类似方法由化合物1j和化合物3e制备化合物3g。EI-MSm/z:[M+H]+1380.6,[M+Na]+1403.6。
实施例7.化合物4f的制备
化合物4a的制备
向搅拌着的十二聚乙二醇(1.8g，3.2mmol)的DCM(18mL)溶液中加入对甲苯磺酰氯(656mg，3.4mmol)，Ag2O(1.13g，4.9mmol)和KI(108mg，0.65mmol)。在室温下搅拌30分钟后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用DCM(50mL)洗涤。将滤液浓缩。将得到的残余物经柱色谱纯化以生产淡黄色油状的化合物4a(490mg，21％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.81(d,2H),7.35(d,2H),4.16(t,2H),3.72-3.58(m,46H),2.82(brs,1H),2.45(s,3H)。
化合物4b的制备
将化合物4a(490mg，0.69mmol)和NaN3(68mg，1.04mmol)溶于DMF(16mL)中，并将反应混合物在100℃加热3小时。将反应混合物过滤并浓缩。粗产物通过柱色谱纯化以得到化合物4b(267mg，67％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ3.72-3.60(m,46H),3.39(t,2H),2.84(t,1H),3.40(m,2H)。
化合物4c的制备
在0℃向搅拌的化合物4b(265mg，0.46mmol)的THF(10mL)溶液中加入4-甲基吗啉(0.066mL，0.60mmol)和甲磺酸酐(121mg，0.69mmol)。2小时后，将LiBr(120mg，1.38mmol)加入到搅拌溶液中，并将所得反应混合物回流6小时。冷却至室温后，将反应混合物减压浓缩。通过柱色谱(EtOAc至EtOAc/MeOH 10/1)纯化残余物以得到化合物4c(178mg，60％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ3.81(t,2H),3.65(m,42H),3.47(t,2H),3.39(t,2H)。
化合物4d的制备
在0℃将NaH(60％于油中，14mg，0.33mmol)添加至化合物4c(175mg，0.27mmol)和N-Boc-羟胺(47mg，0.35mmol)的DMF(5mL)搅拌混合物中。将反应混合物升温至室温并在此温度下保持12小时。减压蒸发溶剂，并将通过柱色谱(MeOH/CHCl31/20至1.5/20)纯化残余物以生产化合物4d(148mg，78％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.00(t,2H),3.66(m,44H),3.39(t,2H),1.47(d,9H)。
化合物4e的制备
在0℃向化合物4d(148mg，0.21mmol)和Pd/C(10wt.％，28mg)的MeOH(5mL)搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.053mL，0.21mmol)。在氢气和室温下搅拌30分钟后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(30mL)洗涤。将滤液浓缩以生产无色油状化合物4e(142mg，96％)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.00(t,2H),3.92(t,2H),3.76-3.64(m,42H),3.18(t,2H)1.47(s,9H)。
化合物4f的制备
通过制备实施例3中的化合物2g的类似方法由化合物1i和化合物4e制备化合物4f。EI-MSm/z:[M+H]+1631.9。
实施例8.化合物4g的制备
通过制备实施例3中的化合物2g的类似方法由化合物1j和化合物4e制备化合物4g。EI-MSm/z:EI-MSm/z[M+H]+1645.3。
实施例9.化合物5e的制备
化合物5a的制备
在0℃和氮气下向2-氨基乙醇(10g，164mmol)的DCM(70mL)溶液中加入三乙胺(3.9mL，28.1mmol)和氯甲酸苄酯(30mL，213mmol)的DCM(30mL)溶液。24小时后，将反应混合物浓缩。所得残余物用H2O(50mL)稀释并用EtOAc(3×100mL)萃取。将有机层合并，用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物5a(17g，53％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.40-7.27(m,5H),5.11(s,2H),3.72(s,2H),3.56(s,2H),2.13(brs,1H)。
化合物5b的制备
在0℃和氮气下向化合物5a(5.0g，25.6mmol)的DCM(70mL)和三乙胺(3.9mL,28.1mmol)溶液中加入DMAP(100mg，5.12mmol)和对甲苯磺酰氯(5.4g，28.1mmol)的DCM(30mL)溶液。在0℃15小时后，将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(100mL)稀释并用DCM(2×100mL)萃取。将有机层合并，用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物5b(8.29g，92％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(d,J＝7.6Hz,2H),7.40-7.28(m,7H),5.07(s,3H),4.09(s,2H),3.45(s,2H),2.43(s,3H)。
化合物5c的制备
在0℃和氮气下向化合物5b(2.0g，7.23mmol)的THF(20mL)溶液中加入N,N-二Boc-羟胺(1.7g，7.44mmol)和NaH(300mg，6.86mmol)。在室温下搅拌17小时后，将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(50mL)稀释并用EtOAc(3×50mL)萃取。将有机层合并，用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物5c(375mg，16％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45-7.27(m,5H),5.11(s,2H),4.01(brs,2H),3.44(d,J＝4.8Hz,2H),1.52(s,18H).EI-MSm/z:[M+H]+410.7。
化合物5d的制备
向化合物5c(187mg，0.45mmol)的MeOH(20mL)溶液中加入Pd/C(10重量％，20mg)，然后将反应混合物在氢气和室温下搅拌4小时。将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(20mL)洗涤。将滤液浓缩以生产无色油状化合物5d(120mg)，其不经进一步纯化而使用。
化合物5e的制备
通过制备实施例3中的化合物2g的类似方法由化合物1i和化合物5d制备化合物5e。EI-MSm/z:[M+H]+1146.4。
实施例10.化合物5f的制备
通过制备实施例3中的化合物2g的类似方法由化合物1j和化合物5d制备化合物5f。EI-MSm/z:[M+H]+1160.3。
实施例11.化合物6e的制备
化合物6a的制备
将DIPEA(1.2mL，9.96mmol)和HBTU(1.69g，6.22mmol)加入到Z-Asp(OMe)-OH(500mg，1.78mmol)和化合物2d(642mg，2.98mmol)的DMF(5mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下将反应混合物搅拌22小时。将反应混合物用H2O(100mL)稀释并用EtOAc(2×100mL)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化所得的残余物以得到化合物6a(368mg，40％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.85-7.70(m,1H),7.45-7.28(m,5H),7.04(s,1H),6.02(d,J＝8.4Hz,1H),5.11(s,2H),4.65-4.50(m,1H),4.00(d,J＝3.6Hz,2H),3.72-3.30(m,10H),2.80(dd,J＝5.6Hz,2H),1.46(s,9H)。
化合物6b的制备
在0℃向化合物6a(150mg，0.28mmol)和Pd/C(10wt.％，20mg)的MeOH(5mL)的搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.07mL，0.28mmol)。在氢气和室温下搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(20mL)洗涤。将滤液浓缩以生产无色油状化合物6b(169mg)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+1]+393.7。
化合物6c的制备
将DIPEA(0.022mL，0.12mmol)和HBTU(20mg，0.05mmol)加入到化合物1i(50mg，0.04mmol)和化合物6b(22mg，0.05mmol)的DMF(1mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下将反应混合物搅拌14小时。然后，将反应混合物用H2O(10mL)稀释并用EtOAc(2×20mL)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化所得的残余物以得到化合物6c(38mg，60％)。EI-MSm/z:[M+H]+1604.5。
化合物6d的制备
在0℃向化合物6c(38mg，0.023mmol)的MeOH(1mL)溶液中加入LiOH一水合物(5mg，0.118mmol)的H2O(1mL)溶液。在0℃下2小时后，用AcOH将溶液的pH值调节至4-5，减压浓缩。将残余物溶于DMSO(1.5mL)中并通过HPLC纯化以生产化合物6d(26mg，78％)。EI-MSm/z:[M+H]+1450.5。
化合物6e的制备
将TFA(0.3mL)加入到化合物6d(26mg，0.018mmol)的DCM(1.5mL)搅拌的溶液中。在0℃下搅拌2小时后，通过N2流除去溶剂和过量的TFA。然后将残余物溶于DMSO(1mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干以生产呈白色固体的化合物6e(19.5mg，80％)。EI-MSm/z:[M+H]+1350.6。
实施例12.化合物7e的制备
化合物7a的制备
在0℃将NaH(60wt.％，500mg，12.49mmol)加入到化合物4c(6.10g，9.61mmol)和N,N-二Boc-羟胺(2.69g，11.53mmol)的DMF(90mL)的搅拌混合物中。将反应混合物加热至室温并在此温度下保持12小时。将反应混合物减压蒸发，通过柱色谱纯化所得的残余物。将纯级分真空蒸发以得到化合物7a(5.70g，75％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.05(t,2H),3.71(t,2H),3.64(m,42H),3.37(t,2H),1.51(d,18H)。
化合物7b的制备
在0℃向化合物7a(5.70g，7.21mmol)和Pd/C(10wt.％，570mg)的MeOH(100mL)的搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，1.9mL，7.2mmol)。在氢气和室温下搅拌30分钟后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(30mL)洗涤。将滤液浓缩以生产无色油状化合物7b(5.10g，87％)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.21(t,2H),4.07(s,2H),3.95-3.78(m,42H),3.32(s,2H)1.63(s,18H)。
化合物7c的制备
将DIPEA(0.25mL，1.42mmol)和HBTU(337g，0.89mmol)加入到Z-Asp(OMe)-OH(100mg，0.36mmol)和化合物7b(340mg，0.43mmol)的DMF(10mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下将反应混合物搅拌20小时。然后，将反应混合物用H2O(100mL)稀释并用EtOAc(2×100mL)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化所得的残余物以得到化合物7c(123mg，58％)。EI-MSm/z:[M+H]+1024.2。
化合物7d的制备
在0℃向化合物7c(120mg，0.12mmol)和Pd/C(10wt.％，20mg)的MeOH(5mL)的搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.03mL，0.12mmol)。在氢气和室温下搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(20mL)洗涤。将滤液浓缩以生产无色油状化合物7d(120mg)，其不经进一步纯化而使用。
化合物7e的制备
通过制备实施例11中的化合物6e的类似方法由化合物1i和化合物7d制备化合物7e。EI-MSm/z:[M+H]+1747.1。
实施例13.化合物8f的制备
化合物8a的制备
向2-(2-(2-氯乙氧基)乙氧基)乙醇(5.0g，29.6mmol)的丙酮(30mL)溶液中加入NaI(13.3g，88.9mmol)。将反应混合物回流12小时。反应完成后，将反应混合物过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物8a(7.0g，91％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ3.80-3.73(m,4H),3.72-3.65(m,4H),3.63-3.61(m,2H),3.27(t,J＝6.4Hz,2H)。
化合物8b的制备
在0℃和氮气下，将NaH(500mg，12.49mmol)加入到化合物8a(2.0g，7.69mmol)和N,N-二Boc-羟胺(2.33g，10.00mmol)的DMF(20mL)的搅拌混合物中。在室温下搅拌17小时后，反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(50mL)稀释并用EtOAc(3×50mL)萃取将有机层合并，用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物8b(1.54g，54％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45-7.27(m,5H),5.11(s,2H),4.01(brs,2H),3.44(d,J＝4.8Hz,2H),1.52(s,18H).EI-MSm/z:[M+H]+410.7。
化合物8c的制备
在0℃和氮气下向化合物8b(123mg，0.242mmol)的DMSO(2mL)和DCM(2mL)的搅拌溶液中加入SO3吡啶复合物(116mg，0.726mmol)和三乙胺(0.17mL，1.21mmol)。1小时后，反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(10mL)稀释并用DCM(2×10mL)萃取。将有机层合并，用无水MgSO4干燥，过滤。减压浓缩以得到化合物8c(88mg)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ9.74(s,1H),4.19(s,2H),3.77-3.69(m,6H),3.42(m,2H)。
化合物8d的制备
在0℃和氮气下向α-谷氨酸(500mg，0.339mmol)的MeOH(10mL)溶液中加入亚硫酰氯(0.148mL，2.04mmol)。24小时后，浓缩反应混合物以生产化合物8d(697mg)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.40-7.27(m,5H),5.11(s,2H),3.72(s,2H),3.56(s,2H),2.13(brs,1H)。
化合物8e的制备
在氮气和室温下向化合物8d(34mg，0.16mmol)和化合物8c(88mg，0.24mmol)的MeOH(5mL)溶液中加入NaCNBH3(10mg，0.16mmol)。3小时后，将反应混合物过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物8e(53mg，63％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45-7.25(m,10H),5.60(brs,2H),5.03(s,4H),3.80-3.25(m,20H),2.81(s,4H)。
化合物8f的制备
通过制备实施例11中的化合物6e的类似方法由化合物1i和化合物8e制备化合物8f。EI-MSm/z:[M+H]+1365.0。
实施例14.化合物9j的制备
化合物9a的制备
在0℃和氮气下，向六甘醇(10.48g，37.12mmol)的DCM(400mL)溶液中加入咪唑(3.20g，44.54mmol)。5分钟后，将反应混合物在相同温度和氮气气氛下滴加到TBSCl(5.60g，37.12mmol)的DCM(50mL)溶液中。在0℃下将反应混合物搅拌并在氮气下温热至室温21小时。反应完成后，将反应混合物用水(200mL)稀释并用DCM(2×100mL)萃取。将有机层用无水Na2SO4干燥并减压浓缩。通过柱色谱纯化所得的残余物。将纯级分真空蒸发以得到化合物9a(6.70g，46％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ3.77-3.71(m,4H),3.66-3.60(m,18H),3.56-3.54(t,2H),0.89(s,9H),0.06(s,6H)。
化合物9b的制备
在0℃和氮气下向化合物9a(3.32g，8.37mmol)的无水THF(40mL)溶液中加入NaH(55％于油中，438mg，10.05mmol)。30分钟后，在氮气下，在相同温度下将MeI(0.78mL，12.56mmol)加入到反应混合物中。搅拌反应混合物并在氮气下温热至室温18小时。反应完成后，用H2O(10mL)淬灭并用EA(3×10mL)萃取。将有机层合并，用饱和NH4Cl水溶液(5mL)和盐水(10mL)洗涤。用无水Na2SO4干燥并减压蒸发。通过柱色谱纯化所得的残余物。将纯级分真空蒸发以得到化合物9b(3.16g，92％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ3.78-3.75(t,2H),3.65(s,20H),3.57-3.54(t,4H),3.38(s,3H),0.89(s,9H),0.06(s,6H)。
化合物9c的制备
在0℃和氮气下向化合物9b(3.16g，7.69mmol)的丙酮(100mL)溶液中加入Jones试剂(10mL)。搅拌反应混合物并在氮气下温热至室温17小时。反应完成后，将反应混合物过滤并减压蒸发。将残余物用H2O(100mL)稀释并用CHCl3(3×50mL)萃取。将有机层合并，用无水Na2SO4干燥并减压蒸发。所得到的粗制化合物9c(2.28g，95％)不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.16(s,2H),3.76-3.75(t,2H),3.69-3.67(m,16H),3.57-3.55(t,2H),3.38(s,3H)。
化合物9d的制备
将DIPEA(3.8mL，22.03mmol)，HOBt(1.29g，9.55mmol)和EDC·HCl(1.83g，9.55mmol)加入到化合物9c(2.28g，7.34mmol)和H-Lys(Z)-OMe盐酸盐(2.91g，8.81mmol)的DMF(30mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物浓缩。通过柱色谱纯化得到的化合物9d(1.23g，72％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38-7.31(m,5H),5.10(s,2H),5.00(s,1H)4.68-4.62(m,1H),4.03(s,2H),3.75(s,3H),3.68-3.64(m,16H),3.56(t,2H),3.39(s,3H),3.20(m,2H),1.89(m,1H),1.74(m,1H),1.55(m,1H),1.40(m,1H).EI-MSm/z:[M+H]+586.8,[M+Na]+608.9。
化合物9e的制备
在0℃和氮气下向化合物9d(2.16g，3.68mmol)的THF/MeOH/H2O(18mL/6mL/6mL)溶液中加入LiOH一水合物(307mg，7.31mmol)。在室温下将反应混合物搅拌1小时。然后用1N盐酸水溶液将溶液的pH调节至2-3。将反应混合物倒入H2O(20mL)中并用DCM(3×50mL)萃取。将有机层合并，用Na2SO4干燥。过滤并浓缩生产的化合物9e(2.28g，99％)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.34-7.30(m,5H),5.08(s,2H),4.66-4.60(q,1H),4.01(s,2H),3.67-3.55(m,18H),3.37(s,3H),3.20(m,2H),1.87(m,1H),1.72(m,1H),1.53(m,1H),1.38(m,1H)。
化合物9f的制备
将DIPEA(0.45mL，2.63mmol)，HOBt(154mg，0.11mmol)和EDC·HCl(218mg，0.88mmol)加入到化合物9e(502mg，0.88mmol)和化合物7b(700mg，0.88mmol)的DMF(8mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入H2O(20mL)中并用EtOAc(3×20mL)萃取。将合并的有机层用NaHCO3水溶液(20mL)和盐水(20mL)洗涤并用无水Na2SO4干燥。过滤并减压浓缩后，通过柱色谱纯化所得的残余物以得到化合物9f(499mg，43％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.35-7.30(m,5H),6.83(s,1H),5.15(s,1H),5.08(s,2H),4.43(q,1H)4.07(t,1H),3.65-3.60(m,54H),3.55-3.53(m,4H),3.37(s,3H),3.16(m,2H),1.85(m,1H),1.53-1.52(d,19H),1.38(m,2H).EI-MSm/z:[M+H]+1337.5。
化合物9g的制备
在0℃向化合物9f(499mg，0.37mmol)和Pd/C(10wt.％，50mg)的MeOH(20mL)的搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.1mL，0.37mmol)。在氢气和室温下搅拌90分钟后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(10mL)洗涤。将滤液浓缩以生产无色油状化合物9g(458mg，98％)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+1218.6。
化合物9h的制备
将DIPEA(0.019mL，0.11mmol)和HBTU(18mg，0.05mmol)加入到化合物1i(45mg，0.04mmol)和化合物9g(57mg，0.05mmol)的DMF(0.5mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下将反应混合物搅拌14小时。将反应混合物用H2O/DMSO(1.5mL/1.5mL)稀释并通过HPLC纯化以生产化合物9h(65mg，57％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1181.7。
化合物9i的制备
在0℃向化合物9h(65mg，0.03mmol)的MeOH(1.5mL)溶液中加入LiOH一水合物(10mg，0.24mmol)的H2O(1.5mL)溶液。在0℃下1小时后，用AcOH将溶液的pH值调节至4-5并减压浓缩。然后将反应混合物溶解于H2O/DMSO(1.5mL/1.5mL)中并通过HPLC纯化以生产化合物9i(45mg，55％)。EI-MSm/z:1/2[M+Na]+1098.7。
化合物9j的制备
将TFA(0.2mL)加入到化合物9i(45mg，0.02mmol)的DCM(1mL)的搅拌溶液中。在0℃下搅拌30分钟后，通过N2流除去溶剂和过量的TFA。然后将残余物溶解于H2O/DMSO(1mL/1mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干以生产呈白色固体的化合物9j(14mg，32％)。EI-MSm/z：1/2[M+H]+1026.3。
实施例15.化合物10c的制备
化合物10a的制备
将DIPEA(0.03mL，0.17mmol)，HOBt(10mg，0.075mmol)和EDC·HCl(14mg，0.075mmol)加入到化合物9e(33mg，0.058mmol)和化合物7d(54mg，0.058mmol)的DMF(3mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入H2O(10mL)中并用EtOAc(3×10mL)萃取。将合并的有机层用1N盐酸水溶液(8mL)，NaHCO3饱和水溶液(8mL)和盐水(8mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩后，通过柱色谱纯化残余物以生产化合物10a(61mg，73％)。EI-MSm/z：[M+H]+1445.0，[M+H-Boc]+1344.9。
化合物10b的制备
在0℃向化合物10a(60mg，0.04mmol)和Pd/C(10wt.％，30mg)的MeOH(10mL)的搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.01mL，0.01mmol)。在氢气和室温下搅拌3小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(40mL)洗涤。将滤液浓缩以生产无色油状化合物10b(56mg，100％)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+1311.0,[M+Na+]+1332.9。
化合物10c的制备
通过制备实施例14中的化合物9j的类似方法由化合物1i和化合物10b制备化合物10c。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1083.8。
实施例16.化合物10d的制备
通过制备实施例14中的化合物9j的类似方法由化合物1j和化合物10b制备化合物10d。EI-MSm/z:[M+H]+2181.3,1/2[M+H]+1091.3。
实施例17.化合物11j的制备
化合物11a的制备
在室温下向化合物3a(8.0g，18.3mmol)的THF(50mL)溶液中加入LiBr(7.9g，91.6mmol)。在回流下搅拌17小时后，将反应混合物过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物11a(3.2g，50％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ3.95-3.50(m,24H)。
化合物11b的制备
在0℃向化合物11a(3.2g，12.3mmol)的丙酮(20mL)溶液中加入Jones试剂(20mL)。在0℃下15小时后，将反应混合物过滤并浓缩。将残余物用H2O(50mL)稀释并用EtOAc(2×100mL)萃取。将有机层合并并用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物11b(3.2g，72％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.16(s,2H),3.95-3.30(m,20H)。
化合物11c的制备
在0℃和氮气下向化合物11b(3.2g，8.90mmol)的MeOH(30mL)溶液中加入草酰氯(1.15mL，13.3mmol)。16小时后，将反应混合物浓缩并通过柱色谱纯化以生产化合物11c(2.7g，81％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.17(s,2H),3.80-3.60(m,21H),3.47(t,J＝6.4Hz,2H)。
化合物11d的制备
将化合物11c(1.0g，2.67mmol)和NaN3(261mg，4.01mmol)溶于DMF(3mL)中。将反应混合物在100℃加热5小时。反应完成后，将反应混合物过滤并浓缩。通过柱色谱法(EtOAc至EtOAc/MeOH 10/1)纯化残余物以生产化合物11d(854mg，95％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.17(s,2H),3.76-3.64(m,21H),3.39(t,J＝5.2Hz,2H)。
化合物11e的制备
在0℃向化合物11d(854mg，2.54mmol)的MeOH(25mL)的搅拌溶液中加入2MNaOH水溶液(6.3mL，12.64mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。然后将溶液减压浓缩。用2NHCl水溶液酸化所得悬浮液，同时在0℃冷却。用CHCl3(8×50mL)萃取残余物。将有机层合并，用Na2SO4干燥，浓缩以生产化合物11e(783mg，96％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.16(s,2H),3.76-3.65(m,18H),3.40(t,J＝5.2Hz,2H)。
化合物11f的制备
将DIPEA(0.47mL，2.72mmol)，HOBt(160mg，1.18mmol)和EDC·HCl(226mg,1.18mmol)加入到化合物9e(520mg，0.91mmol)和化合物2d(270mg，0.91mmol)的DMF(5mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入H2O(20mL)中并用EtOAc(3×30mL)萃取。将合并的有机层用1N盐酸水溶液(15mL)，NaHCO3饱和水溶液(15mL)和盐水(15mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩后，通过柱色谱纯化残余物以生产化合物11f(631mg，85％)。
EI-MSm/z:[M+H]+819.1,[M+H-Boc]+719.1[M+Na+]+841.1。
化合物11g的制备
在0℃向化合物11f(300mg，0.36mmol)和Pd/C(10wt.％，70mg)的MeOH(20mL)的搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.08mL，0.08mmol)。在氢气和室温下搅拌3小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(40mL)洗涤。将滤液浓缩以生产无色油状化合物11g(200mg，99％)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+685.1,[M+Na]+707.1。
化合物11h的制备
将DIPEA(0.024mL，0.41mmol)，HOBt(24mg，0.18mmol)和EDC·HCl(34mg，0.18mmol)加入到化合物11g(100mg，0.14mmol)和化合物11e(44mg，0.14mmol)的DMF(5mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入H2O(10mL)中并用DCM(3×10mL)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩后，通过柱色谱纯化残余物以生产化合物11h(73mg，53％)。EI-MSm/z:[M+H]+988.4,[M+Na-Boc]+888.2,[M+Na]+1010.4。
化合物11i的制备
在0℃向化合物11h(73mg，0.07mmol)和Pd/C(10wt.％，10mg)的MeOH(7mL)的搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.018mL，0.018mmol)。在氢气和室温下搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(30mL)洗涤。浓缩滤液以生产无色油状化合物11i(72mg，99％)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+962.4,[M+Na]+984.4。
化合物11j的制备
通过制备实施例14中的化合物9j的类似方法由化合物1i和化合物11i制备化合物11j。EI-MSm/z:[M+H]+1932.5。
实施例18.化合物11k的制备
通过制备实施例14中的化合物9j的类似方法由化合物1j和化合物11i制备化合物11k。EI-MSm/z:[M+H]+1947.1。
实施例19.化合物12c的制备
化合物12a的制备
将DIPEA(0.13mL，0.77mmol)和HBTU(110mg，0.35mmol)加入到化合物9g(235mg，0.1929mmol)和Z-Asp(OMe)-OH(54mg，0.212mmol)的DMF(5mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入H2O(20mL)中并用EtOAc(3×20mL)萃取。将合并的有机层用1N盐酸水溶液(7mL)，NaHCO3饱和水溶液(7mL)和盐水(7mL)洗涤，用并无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩后，通过柱色谱纯化残余物以生产化合物12a(260mg，93％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.07(t,1H),7.62(t,1H),7.54-7.52(m,1H),5.73(s,2H),4.27-4.25(q,1H),3.96(t,2H),3.88(s,2H),3.82(s,2H),3.58-3.48(m,52H),3.19-3.18(m,3H),3.04-3.03(m,3H),1.44(s,18H),1.39-1.37(m,3H),1.21-1.19(m,3H).EI-MSm/z:[M+H-2Boc]+1031.6。
化合物12b的制备
在0℃向化合物12a(260mg，0.179mmol)和Pd/C(10wt.％，72mg)的MeOH(20mL)的搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.040mL，0.179mmol)。在氢气和室温下搅拌3小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(40mL)洗涤。将滤液浓缩以生产无色油状化合物12b(242mg，100％)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+625.0,[M+H-Boc]+525.0,[M+H-2Boc]+424.9。
化合物12c的制备
通过制备实施例14中的化合物9j的类似方法由化合物1i和化合物12b制备化合物12c。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1083.5。
实施例20.化合物12d的制备
通过制备实施例14中的化合物9j的类似方法由化合物1j和化合物12b制备化合物12d。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1090.5。
实施例21.化合物13e的制备
化合物13a的制备
将DIPEA(0.22mL，1.25mmol)和HBTU(356mg，0.94mmol)加入到Z-Glu(OMe)-OH(222mg，0.75mmol)和化合物7b(500mg，0.62mmol)的DMF(5.0mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下将反应混合物搅拌14小时。将反应混合物用水(200mL)稀释并用EA(3×100mL)萃取。有机层用无水MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱纯化所得的残余物以得到化合物13a(370mg，57％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.34(br,5H),6.73(br,1H),5.72(d,J＝7.6Hz,1H),5.06(br,2H),4.28-4.18(m,1H),4.07(t,J＝4.4Hz,2H),3.76-3.71(m,2H),3.70-3.50(m,45H),3.48-3.42(m,2H),2.53-2.36(m,2H),2.20-2.08(m,1H),2.00-1.88(m,1H),1.53(s,18H).EI-MSm/z:[M+Na]+1061.2。
化合物13b的制备
在0℃下，将1,4-二恶烷中的4N HCl(0.08mL，0.32mmol)加入到化合物13a(370mg，0.35mmol)和Pd/C(38mg)的MeOH(8mL)的搅拌混合物中。在氢气和室温下搅拌20小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(400mL)洗涤。将滤液浓缩以生产黄色液体化合物13b(301mg，90％)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.41(br,1H),8.09(br,3H),4.13(br,1H),3.85-3.56(m,51H),2.55(br,2H),2.38-2.18(m,2H),1.53(s,18H).EI-MSm/z:[M+H]+905.0。
化合物13c的制备
将DIPEA(0.165mL，0.96mmol)和HBTU(279mg，0.74mmol)加入到化合物13b(300mg，0.32mmol)和化合物9e(366mg，0.64mmol)的DMF(5.0mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下将反应混合物搅拌14小时。将反应混合物用水(200mL)稀释并用EtOAc(3×100mL)萃取。将有机层用无水MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱纯化所得的残余物以得到化合物13c(290mg，62％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.40-7.32(m,7H),7.00(br,1H),6.73(br,1H),5.07(br,2H),4.44-4.36(m,2H),4.07(t,J＝4.8Hz,2H),4.02(br,2H),3.73(t,J＝5.2Hz,2H),3.71-3.52(m,68H),3.24-3.14(m,2H),2.52-2.34(m,3H),2.18-2.06(m,2H),1.98-1.82(m,4H),1.76-1.64(m,3H),1.53(s,18H).EI-MSm/z:[M+H]+1459.7。
化合物13d的制备
在0℃将Pd/C(21mg)加入到化合物13c(290mg，0.19mmol)的MeOH(5mL)的搅拌混合物中。在氢气和室温下搅拌20小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(400mL)洗涤。将滤液浓缩以生产黄色液体化合物13c(247mg，94％)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.74(br,1H),7.30(br,1H),4.66-4.48(m,2H),4.07(t,J＝5.2Hz,2H),4.01(br,2H),3.74-3.62(m,70H),3.57-3.53(m,2H),3.04-2.98(m,2H),2.24-2.15(m,2H),2.14-2.06(m,2H),1.99-1.86(m,4H),1.84-1.74(m,2H),1.53(s,18H).EI-MSm/z:[M+H]+1325.5。
化合物13e的制备
通过制备实施例14中的化合物9j的类似方法由化合物1i和化合物13d制备化合物13e。EI-MSm/z:[M+H]+2181.5。
实施例22.化合物13f的制备
通过制备实施例14中的化合物9j的类似方法由化合物1j和化合物13d制备化合物13f。EI-MSm/z:[M+H]+2195.5。
实施例23.化合物14m的制备
化合物14a的制备
在室温下向6-氨基-1-己醇(5.0g，42.6mmol)的DCM(30mL)溶液中加入二碳酸二叔丁酯(9.3g，42.6mmol)。搅拌18小时后，在0℃向反应混合物中加入三乙胺(8.7mL，63.9mmol)和叔丁基二甲基甲硅烷基氯(7.7g，51.2mmol)。在室温下24小时后，将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(200mL)稀释。所得混合物用EtOAc(100mL)萃取。将有机层用盐水(100mL)洗涤并用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化残余物以生产化合物14a(12g，84％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.50(brs,1H),3.58(t,J＝6.8Hz,2H),3.10(d,J＝6.4Hz,2H),1.72-1.20(m,17H),0.88(s,9H),0.04(s,6H)。
化合物14b的制备
在0℃和氮气下向化合物14a(6.0g，18.1mmol)的THF(30mL)溶液中加入NaH(60％于油中，2.4g，54.2mmol)和甲基碘(3.4mL，54.2mmol)。14小时后，将反应混合物用H2O(50mL)稀释并用EtOAc(2×100mL)萃取。将有机层合并，用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物14b(4.3g，69％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ3.59(t,J＝6.4Hz,2H),3.17(brs,2H),2.82(s,3H),1.62-1.21(m,17H),0.88(s,9H),0.04(s,6H)。
化合物14c的制备
在0℃和氮气下向化合物14b(4.3g，12.4mmol)的THF(15mL)溶液中加入TBAF(1M于THF中，15mL，14.9mmol)。5小时后，将反应混合物用H2O(50mL)稀释并用乙醚(2×100mL)萃取。将有机层合并，用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物14c(3.0g，98％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ3.63(brs,2H),3.20(brs,2H),2.82(s,3H),1.65-1.23(m,17H)。
化合物14d的制备
在0℃和氮气下向化合物14c(3.0g，12.9mmol)的THF(30mL)溶液中加入四溴化碳(6.4g，19.4mmol)和三苯基膦(5.1g，19.4mmol)。2小时后，将反应混合物通过硅胶过滤并用乙醚(100mL)洗涤。将滤液浓缩并通过柱色谱纯化以生产化合物14d(3.3g，86％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ3.40(t,J＝6.8Hz,2H),3.19(brs,2H),2.83(s,3H),1.90-1.70(m,2H),1.65-1.40(m,13H),1.38-1.25(m,2H)。
化合物14e的制备
在0℃将DIPEA(53.0mL，302.5mmol)和EDC.HCl(35.7g，186.2mmol)加入到化合物2d(35.0g，116.4mmol)和5-甲酰基水杨酸(21.3g，128.0mmol)的DCM(1.6L)的搅拌混合物中。在氮气和室温下将反应混合物搅拌20小时。将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(1.5L)稀释并用DCM(2×1.5L)萃取。将合并的有机层用盐水(1.5L)洗涤并用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物14e(28.2g，59％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ13.37(brs,1H),9.86(s,1H),8.20(s,1H),8.07(brs,2H),7.90(d,J＝8.4Hz,1H),7.07(d,J＝8.4Hz,1H),4.06-4.01(m,2H),3.79-3.66(m,10H),1.47(s,9H)。
化合物14f的制备
向化合物14e(28.0g，67.9mmol)的MeCN(500mL)溶液中加入化合物M(29.7g，74.7mmol)，分子筛(30g)和Ag2O(62.9g，272mmol)。在氮气和室温下搅拌12小时后，将反应混合物浓缩，用H2O(800mL)稀释并用EtOAc(1L)萃取。将合并的有机层用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化残余物以生产化合物14f(30.1g，61％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ9.99(s,1H),8.54(s,1H),7.99(d,J＝8.8Hz,1H),7.68(s,1H),7.44(brs,1H),7.18(d,J＝8.8Hz,1H),5.45-5.30(m,4H),4.26(d,J＝9.2Hz,1H),4.02-3.97(m,2H),3.80-3.55(m,13H),2.06(s,9H),1.46(s,9H)。
化合物14g的制备
在0℃向化合物14f(29.0g，39.8mmol)的i-PrOH/CHCl3(90mL/450mL)溶液中加入硅胶(16.7g)和NaBH4(3.70g，99.5mmol)。在氮气和0℃下搅拌2小时后，将反应混合物用H2O(500mL)淬灭并用EtOAc(1L)萃取。将有机层用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物14g(24.1g，83％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.98(s,1H),7.72(s,1H),7.46(d,J＝8.8Hz,1H),7.41(br,1H),7.04(d,J＝8.8Hz,1H),5.41-5.24(m,4H),4.67(d,J＝6.6Hz,2H),4.19(d,J＝8.8Hz,1H),3.99-3.93(m,2H),3.79-3.65(m,12H),3.59-3.50(m,1H),2.08-2.00(m,10H),1.46(s,9H)。
化合物14h的制备
在0℃和氮气下向化合物14g(23.7g，31.5mmol)的DMF(50mL)溶液中加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(8.9g，29.3mmol)和DIPEA(5.65mL，31.5mmol)。在0℃将反应混合物搅拌30分钟，并温热至室温1小时。将反应混合物用H2O(500mL)稀释并用EtOAc(500mL)萃取。将有机层用盐水(2×200mL)洗涤，用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产白色泡沫化合物14h(22.4g，77％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.28(d,J＝7.2Hz,2H),8.13(s,1H),7.68(brs,1H),7.52(d,J＝8.8Hz,1H),7.47(br,1H),7.38(d,J＝7.2Hz,2H),7.08(d,J＝8.8Hz,1H),5.44-5.24(m,6H),4.21(d,J＝9.6Hz,1H),4.00(brs,2H),3.80-3.64(m,12H),3.64-3.54(m,1H),2.06(s,9H),1.47(s,9H)。
化合物14i的制备
在0℃和氮气下将α-鹅膏素(60.0mg，0.065mmol)溶于DMSO(2mL)中，并加入化合物14d(114mg，0.39mmol)和叔丁醇钾(0.065mL，0.065mmol)。在0℃4小时后，用乙酸将溶液的pH值调节至4-5。将残余物溶于DMSO(1mL)中并通过HPLC纯化以生产白色固体化合物14i(29mg，39％)。EI-MSm/z:[M-Boc]+1032.4。
化合物14j的制备
在0℃向化合物14i(29mg，0.026mmol)的DCM(3mL)溶液中加入TFA(0.5mL)。在0℃2小时后，通过N2流除去溶剂和过量的TFA，并将得到的残余物通过HPLC纯化以生产白色固体化合物14j(26mg，99％)。EI-MSm/z:[M+H]+1032.3,[M+Na]+1054.3。
化合物14k的制备
在0℃将化合物14j(13mg，0.011mmol)，化合物14h(10mg，0.011mmol)和无水HOBt(0.3mg，0.002mmol)溶于DMF(0.5mL)中。然后加入吡啶(0.2mL)和DIPEA(0.004mL，0.023mmol)。在氮气和室温下搅拌24小时后，将反应混合物溶解于DMSO(1mL)中并通过HPLC纯化以生产化合物14k(11mg，54％)。EI-MSm/z:[M+H]+1788.1。
化合物14l的制备
在-20℃向化合物14k(11mg，0.006mmol)的MeOH(0.2mL)溶液中加入LiOH一水合物(1.3mg，0.03mmol)的H2O(0.2mL)溶液。在0℃1小时后，用乙酸将溶液的pH值调节至4-5。将得到的溶液溶解于DMSO(1mL)中并通过HPLC纯化以生产白色固体化合物141(7.5mg，75％)。EI-MSm/z:[M+H]+1648.6。
化合物14m的制备
在0℃向化合物141(7.5mg，0.0045mmol)的DCM(3mL)溶液中加入TFA(0.5mL)。在0℃2小时后，通过N2流除去溶剂和过量的TFA。然后通过HPLC纯化残余物以生产白色固体化合物14m(6.2mg，85％)。EI-MSm/z:[M+H]+:1548.5。
实施例24.化合物15b的制备
化合物15a的制备
通过与制备实施例23的化合物14h的方法类似的方法由化合物3e制备化合物15a。EI-MSm/z:[M+H]+1128.3,[M+H-Boc]+1028.3,[M+H-2Boc]+928.2。
化合物15b的制备
通过与制备实施例23的化合物14m的方法类似的方法由化合物14j和化合物15a制备化合物15b。EI-MSm/z:[M+H]+1681.6。
实施例25.化合物16f的制备
化合物16a的制备
向草酰氯(2.8mL，32.5mmol)的DCM(5mL)的搅拌溶液中加入DMSO(3.08mL，43.4mmol)的DCM(15mL)溶液，然后-78℃将反应混合物在搅拌30分钟。在-78℃向该溶液中加入化合物2a(3.8g，21.7mmol)并搅拌1小时。加入三乙胺(15.1mL，108mmol)的DCM(20mL)溶液，然后使反应混合物温热至室温，用H2O(100mL)稀释并用DCM(2×100mL)萃取。将有机层合并，用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化残余物以生产化合物16a(1.8g，48％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ9.74(s,1H),4.19(s,2H),3.77-3.69(m,6H),3.42(m,2H)。
化合物16b的制备
在0℃向化合物16a(1.0g，3.32mmol)和化合物2d(1.72g，9.96mmol)的MeOH(15mL)溶液中加入AcOH(0.19mL，3.32mmol)。在0℃搅拌30分钟后，加入NaCNBH3(658mg，9.96mmol)，用2小时温热至室温。反应完成后，将反应混合物用H2O(50mL)稀释，然后用DCM(3×100mL)萃取。将有机层合并，用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法纯化残余物以生产淡黄色油状化合物16b(800mg，41％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(brs,1H),4.01(m,2H),3.69-3.65(m,24H),3.39(m,4H),3.04(m,6H),1.47(s,9H)。
化合物16c的制备
向化合物16b(350mg，0.60mmol)的MeOH(10mL)溶液中加入Pd/C(10wt.％，300mg)。在氢气和室温下搅拌8小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(100mL)洗涤。将得到的化合物16c浓缩为无色油状物(300mg，94％)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.02(m,2H),3.71(m,2H),3.65-3.55(m,22H),2.92(m,4H),2.76(t,J＝5.2Hz,6H),1.47(s,9H).EI-MSm/z:[M+H]+527.6。
化合物16d的制备
将DIPEA(0.40mL，2.24mmol)和PyBOP(711mg，1.34mmol)加入到化合物1j(1.57g，1.23mmol)和化合物16c(300mg，0.56mmol)的DMF(15mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌4小时后，将反应混合物稀释于H2O(200mL)中并用EtOAc(3×100mL)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物溶于H2O/DMSO(5mL/5mL)中并通过HPLC纯化以生产化合物16d(1.57g，91.8％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1502.7。
化合物16f的制备
在0℃向化合物16d(1.10g，0.36mmol)的MeOH/THF(5mL/10mL)溶液中滴加NaOH(175mg，4.32mmol)的H2O(3mL)溶液。在0℃3小时后，使用2N盐酸水溶液将溶液的pH值调节至pH值4并浓缩。在0℃用DCM(12mL)和TFA(3mL)稀释残余物。在0℃2小时后，通过N2流除去溶剂和过量的TFA。将残余物溶于H2O/MeCN(7.5mL/7.5mL)中并通过HPLC纯化以生产白色固体化合物16f(432mg，46％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1298.5。
实施例26.化合物16g的制备
通过制备实施例25中的化合物16f的类似方法由化合物1i和化合物16c制备化合物16g。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1284.5。
实施例27.化合物17d的制备
化合物17a的制备
向草酰氯(0.62mL，7.3mmol)的DCM(4mL)的搅拌溶液中加入DMSO(1.04mL,14.6mmol)的DCM(10mL)溶液，然后在-78℃将反应混合物搅拌30分钟。在-78℃向该溶液中加入化合物3b(1.5g，4.88mmol)并搅拌1小时。加入三乙胺(2.72mL，19.50mmol)的DCM(7mL)溶液，然后使反应混合物温热至室温。减压浓缩后，通过柱色谱(EtOAc至EtOAc/MeOH 10/1)纯化残余物以生产化合物17a(1.23g，82％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ9.73(s,1H),4.16(s,2H),3.75-3.61(m,18H),3.39(t,J＝5.2Hz,2H)。
化合物17b的制备
在0℃将NaCNBH3(257mg，4.09mmol)加入到化合物17a(1.30g，4.25mmol)和化合物2d(492mg，1.63mmol)的MeOH(5mL)的搅拌混合物中。然后用2小时将反应混合物逐渐加热至室温。反应完成后，将反应混合物减压浓缩。通过柱色谱(EtOAc至EtOAc/MeOH 10/1)纯化残余物以生产化合物17b(620mg，45％)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.96(br,1H),3.79(t,J＝4.8Hz,2H)3.59(t,J＝4.8Hz,4H),3.56-3.46(m,38H),3.44-3.37(m,10H),2.66-2.56(m,6H),1.39(s,9H)。
化合物17c的制备
向化合物17b(300mg，0.35mmol)的MeOH(7mL)溶液中加入Pd/C(10wt.％，38mg)。在氢气和室温下搅拌4小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(400mL)洗涤。将得到的化合物17c浓缩为无色油状物(253mg，90％)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.79(t,J＝4.4Hz,2H),3.55-3.45(m,38H),3.42(t,J＝6.0Hz,10H),2.66-2.56(m,10H),1.39(s,9H).EI-MSm/z:[M+H]+791.0。
化合物17d的制备
通过制备实施例25中的化合物16f的类似方法由化合物1i和化合物17c制备化合物17d。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1415.6。
实施例28.化合物18c的制备
化合物18a的制备
在0℃将NaCNBH3(197mg，3.14mmol)加入到化合物17a(998mg，3.26mmol)和化合物3e(670mg，1.25mmol)的MeOH(4mL)的搅拌混合物中。然后用2小时将反应混合物逐渐加热至室温。反应完成后，将反应混合物减压浓缩。通过柱色谱(EtOAc至EtOAc/MeOH 10/1)纯化残余物以生产化合物18a(668mg，49％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.97(m,2H)3.63-3.57(m,6H),3.56-3.44(m,46H),3.44-3.36(m,12H),2.66-2.61(m,6H),1.45(s,18H)。
化合物18b的制备
向化合物18a(60mg，0.055mmol)的MeOH(1.2mL)溶液中加入Pd/C(10wt.％，6mg)。在氢气和室温下搅拌4小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(400mL)洗涤。将得到的化合物18b浓缩为无色油状物(55mg，96％)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.97(m,2H),3.62-3.57(m,4H),3.54-3.45(m,50H),3.45-3.39(m,10H),2.66-2.61(m,10H),1.46(s,18H).EI-MSm/z:1/2[M+H]+1023.3。
通过制备实施例25中的化合物16f的类似方法由化合物1i和化合物18b制备化合物18c。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1481.7。
实施例29.化合物19c的制备
化合物19a的制备
在0℃将NaCNBH3(197mg，3.14mmol)加入到化合物17a(118mg，0.16mmol)和化合物4e(232mg，0.76mmol)的MeOH(1mL)的搅拌混合物中。然后用2小时将反应混合物逐渐加热至室温。反应完成后，减压蒸发反应混合物。通过柱色谱(EtOAc至EtOAc/MeOH 10/1)纯化残余物以生产化合物19a(135mg，68％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.72(brs,1H)4.02(t,2H),3.72-3.53(m,86H),3.39(t,4H),2.77(bs,4H),1.47(s,9H).EI-MSm/z:[M+H]+1239.6。
化合物19b的制备
0℃向化合物19a(133mg，0.107mmol)的MeOH(2mL)溶液中加入Pd/C(10wt.％，26mg)，并加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.054mL，0.21mmol)在。在氢气和室温下搅拌40分钟后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(40mL)洗涤。将得到的化合物19b浓缩成无色油状物(132mg，97％)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.79(s,1H),4.06-4.02(m,8H),3.88(m,2H),3.73-3.64(m,80H),3.22(s,4H),1.47(s,9H).EI-MSm/z:[M+H]+:1187.5。
化合物19c的制备
通过制备实施例25中的化合物16f的类似方法由化合物1i和化合物19b制备化合物19c。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1614.5。
实施例30.化合物20q的制备
化合物20a的制备
向2-(2-(2-氯乙氧基)乙氧基)乙醇(5.0g，29.6mmol)的丙酮(30mL)溶液中加入NaI(13.3g，88.9mmol)。将反应混合物回流12小时。反应完成后，将反应混合物过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物20a(7.0g，91％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ3.80-3.73(m,4H),3.72-3.65(m,4H),3.63-3.61(m,2H),3.27(t,J＝6.4Hz,2H)。
化合物20b的制备
在0℃向化合物20a(7.0g，26.9mmol)的丙酮(200mL)溶液中加入Jones试剂(20mL)。在0℃15小时后，将反应混合物过滤并浓缩。将残余物用H2O(150mL)稀释并用EtOAc(2×100mL)萃取。将有机层合并，用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物20b(7.0g，94％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.22(s,2H),3.85-3.70(m,6H),3.35-3.25(m,2H)。
化合物20c的制备
在0℃和氮气下向化合物20b(7.0g，25.5mmol)的MeOH(70mL)溶液中加入草酰氯(3.2mL，38.3mmol)。16小时后，将反应混合物浓缩并通过柱色谱纯化以生产化合物20c(5.7g，77％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.19(s,2H),3.80-3.67(m,9H),3.27(t,J＝6.8Hz,2H)。
化合物20d的制备
在0℃和氮气下向化合物20c(2.5g，8.67mmol)和N，N-二Boc-羟胺(2.6g，11.2mmol)的DMF(30mL)溶液中加入NaH(60％于油中，454mg，10.4mmol)。15小时后，将反应混合物用H2O(50mL)稀释并用EtOAc(3×100mL)萃取。将有机层合并，用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物20d(1.87g，73％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.17(s,2H),4.08(m,2H),3.78-3.65(m,9H),1.53(s,18H)。
化合物20e的制备
在0℃和氮气下向化合物20d(1.87g，6.38mmol)的THF/MeOH/H2O(45mL/15mL/15mL)溶液中加入NaOH(600mg，15.9mmol)。在室温下将反应混合物搅拌3小时。然后用1N盐酸水溶液将溶液的pH值调节至4-5。将反应混合物倒入H2O(100mL)中并用EtOAc(2×100mL)萃取。将有机层合并，用MgSO4干燥，过滤并浓缩。生产无色油状化合物20e(1.6g，90％)，其不经进一步纯化即可使用。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.17(s,2H),4.08-4.02(m,2H),3.80-3.67(m,6H),1.48(s,9H)。
化合物20f的制备
将Pd/C(10wt.％，1.0g)加入到化合物2a(6.7g，38.2mmol)的MeOH(38mL)溶液中。在氢气和室温下搅拌8小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(100mL)洗涤。将得到的化合物20f浓缩为无色油状物(5.6g，99％)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ3.95-3.25(m,12H),2.90(s,2H)。
化合物20g的制备
在0℃和氮气下将氯甲酸苄酯(6mL，42.2mmol)缓慢加入到化合物20f(5.6g，38.2mmol)和三乙胺(8mL，57.6mmol)的THF(200mL)溶液中30分钟。在0℃搅拌1小时后，将反应混合物浓缩，通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物20g(5.7g，53％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45-7.20(m,5H),5.61(brs,1H),5.07(s,2H),3.85-3.20(m,12H)。
化合物20h的制备
在室温和氮气下向化合物20g(2.7g，9.53mM)的DCM(30mL)溶液中加入三乙胺(1.9mL，12.3mmol)和对甲苯磺酰氯(2.3g，10.4mmol)。8小时后，将反应混合物用H2O(50mL)稀释并用DCM(3×100mL)萃取。将有机层合并，用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物20h(3.51g，84％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(d,J＝7.2Hz,2H),7.45-7.25(m,7H),5.20(brs,1H),5.09(s,2H),4.20-4.05(m,2H),3.75-3.25(m,10H),2.43(s,3H)。
化合物20i的制备
将化合物20h(3.51g，8.02mmol)和NaN3(3.8g，57.6mmol)的DMF(27mL)溶液在100℃下加热15小时。反应完成后，将反应混合物过滤并浓缩。将残余物用H2O(50mL)稀释并用EtOAc(2×100mL)萃取。将有机层合并，用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物20i(2.05g，83％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45-7.25(m,5H),5.20(brs,1H),5.10(s,2H),3.80-3.25(m,12H)。
化合物20j的制备
在室温下将三苯基膦(2.09g，7.97mmol)加入到化合物20i(2.05g，6.64mmol)的THF(27mL)溶液中。在氮气下搅拌2小时后，加入H2O(0.6mL，33.2mmol)并将反应混合物回流3小时。然后将反应混合物浓缩并通过柱色谱纯化以生产化合物20j(1.78g，95％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45-7.25(m,5H),5.63(brs,1H),5.10(s,2H),3.80-3.25(m,10H),2.88(s,2H)。
化合物20k的制备
向草酰氯(1.4mL，15.9mmol)的DCM(14mL)的搅拌溶液中加入DMSO(2.3mL，31.9mmol)的DCM(28mL)溶液，然后在-78℃将反应混合物搅拌30分钟。在-78℃向该溶液中加入化合物20g(3.01g，10.6mmol)。在0℃在-78℃下搅拌1小时后，加入三乙胺(7.4mL，53.1mmol)，使反应温热至室温。将反应混合物倒入H2O(100mL)中并用EtOAc(2×100mL)萃取。将有机层合并，用MgSO4干燥。过滤并浓缩生产化合物20k(2.6g)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ9.70(s,1H),7.45-7.25(m,5H),5.25(brs,1H),5.10(s,2H),3.80-3.25(m,10H)。
化合物20l的制备
在室温和氮气下向化合物20j(1.78g，6.30mmol)和化合物20k(2.13g，7.56mmol)的MeOH(63mL)溶液中加入NaCNBH3(674mg，10.7mmol)。3小时后，将反应混合物过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物生以产化合物20l(2.01g，58％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45-7.25(m,10H),5.60(brs,2H),5.03(s,4H),3.80-3.25(m,20H),2.81(s,4H)。
化合物20m的制备
将DIPEA(0.4mL，2.28mmol)和PyBOP(713mg，1.36mmol)加入到化合物20l(500mg，0.91mmol)和化合物20e(306mg，1.09mmol)的DMF(10mL)的搅拌溶液中。在氮气和室温下搅拌6小时后，将反应混合物用水(100mL)稀释并用EtOAc(3×100mL)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物20m(318mg，43％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45-7.25(m,10H),5.47(brs,1H),5.37(brs,1H),5.09(s,4H),3.80-3.25(m,34H),1.46(s,9H).EI-MSm/z:[M+H]+808.9。
化合物20n的制备
向化合物20m(318mg，0.39mmol)的MeOH(30mL)溶液中加入Pd/C(10wt.％，1.0g)。在氢气和室温下搅拌3小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(100mL)洗涤。将得到的化合物20n(180mg)浓缩为无色油状物，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+541.2。
化合物20o的制备
在0℃将DIPEA(0.034mL，0.19mmol)和PyBOP(63mg，0.12mmol)加入到化合物1i(130mg，0.10mmol)和化合物20n(26mg，0.04mmol)的DMF(3mL)的混合溶液中。在0℃搅拌30分钟后，在氮气下使反应经20小时温热至室温。将反应混合物倒入H2O(50mL)中并用EtOAc(3×50mL)萃取。将有机层合并，过滤并减压浓缩。将残余物溶于DMSO(1mL)中并通过HPLC纯化以生产白色固体化合物20o(28mg，10％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1481.5,1/2[M+Na]+1503.8。
化合物20p的制备
在-5℃向化合物20o(28mg，0.009mmol)的MeOH(1mL)溶液中加入LiOH一水合物(2mg，0.047mmol)的H2O(1mL)溶液。将反应混合物在-5℃搅拌1小时。反应结束后，用醋酸将溶液的pH值调整至4-5。将残余物溶于DMSO(1mL)中并通过HPLC纯化以生产白色固体化合物20p(16mg，67％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+:1341.4。
化合物20q的制备
在0℃向化合物20p(16mg，0.0059mmol)的DCM(2mL)溶液中加入TFA(0.2mL)。在0℃2小时后，通过N2流除去溶剂和过量的TFA。将残余物溶于DMSO(1mL)中并通过HPLC纯化以生产白色固体化合物20q(8.5mg，56％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+:1291.3。
实施例31.化合物21i的制备
化合物21a的制备
向化合物3b(9.0g，29.2mmol)的MeOH(146mL)溶液中加入Pd/C(10wt.％，3.0g)，并将反应混合物在氢气和室温下搅拌5小时。然后将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(100mL)洗涤。将得到的化合物21a浓缩为无色油状物(8.2g，100％)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ3.80-3.60(m,24H),3.01(t,J＝4.8Hz,2H)。
化合物21b的制备
在0℃和氮气下向化合物21a(8.24g，29.2mmol)的THF(190mL)溶液中加入三乙胺(6.1mL，43.9mmol)和氯甲酸苄酯(4.6mL，32.2mmol)。将反应混合物浓缩，通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物21b(5.59g，46％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45-7.20(m,5H),5.61(brs,1H),5.09(s,2H),3.85-3.50(m,22H),3.39(m,2H)。
化合物21c的制备
在0℃和氮气下向化合物21b(3.09g，7.43mmol)的THF(75mL)溶液中加入4-甲基吗啉(1.1mL，9.66mmol)和甲磺酸酐(1.43g，8.18mmol)。在0℃5小时后，加入NaN3(969mg，14.9mmol)和DMF(20mL)。回流16小时后，过滤反应混合物并浓缩。将残余物用H2O(50mL)稀释并用EtOAc(2×100mL)萃取。将有机层合并，用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物21c(2.62g，80％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45-7.20(m,5H),5.45(brs,1H),5.09(s,2H),3.85-3.25(m,24H)。
化合物21d的制备
在室温下将三苯基膦(1.87g，7.13mmol)加入到化合物21c(2.62g，5.94mmol)的THF(30mL)溶液中。在氮气下搅拌2小时后，加入H2O(0.54mL，29.7mmol)并将反应混合物回流3小时。将反应混合物浓缩并通过柱色谱纯化以生产化合物21d(2.47g，95％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45-7.25(m,5H),5.63(brs,1H),5.09(s,2H),3.80-3.25(m,22H),3.00-2.80(m,2H)。
化合物21e的制备
向草酰氯(0.78mL，9.02mmol)的DCM(14mL)的搅拌溶液中加入DMSO(1.3mL，18.1mmol)的DCM(6mL)溶液，然后在-78℃将反应混合物搅拌30分钟。在-78℃向该溶液中加入化合物21b(2.5g，6.01mmol)。在-78℃搅拌1小时后，加入三乙胺(4.2mL，30.1mmol)，使反应温热至室温。将反应混合物倒入H2O(100mL)中并用EtOAc(2×100mL)萃取。将有机层合并，用MgSO4干燥。过滤并浓缩生产化合物21e(2.29g)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ9.70(s,1H),7.45-7.25(m,5H),5.25(brs,1H),5.10(s,2H),3.80-3.25(m,24H)。
化合物21f的制备
在室温和氮气下向化合物21d(2.47g，5.95mmol)和化合物21e(2.29g，5.52mmol)的MeOH(50mL)溶液中加入NaCNBH3(530mg，8.44mmol)。3小时后，将反应混合物过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物21f(2.05g，51％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45-7.25(m,10H),5.47(brs,1H),5.37(brs,1H),5.09(s,4H),3.80-3.25(m,48H)。
化合物21g的制备
将DIPEA(0.27mL，1.53mmol)和HBTU(350mg，0.92mmol)加入到化合物21f(380mg，0.61mmol)和化合物20e(206mg，0.73mmol)的DMF(6mL)的搅拌溶液中。在氮气和室温下搅拌6小时后，将反应混合物用水(100mL)稀释并用EtOAc(3×100mL)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物21g(210mg，42％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45-7.25(m,10H),5.47(brs,1H),5.37(brs,1H),5.09(s,4H),3.80-3.25(m,34H),1.46(s,9H)。
化合物21h的制备
向化合物21g(210mg，0.19mmol)的MeOH(30mL)溶液中加入Pd/C(10wt.％，1.0g)，然后在氢气和室温下将反应混合物搅拌4小时。将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(50mL)洗涤。将得到的化合物21h(30mg)浓缩为无色油状物，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+805.2,[M+Na]+827.2。
化合物21i的制备
通过制备实施例30中的化合物20q的类似方法由化合物1i和化合物21h制备化合物21i。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1423.7,1/2[M+Na]+1445.2。
实施例32.化合物22h的制备
化合物22a的制备
在室温下向化合物3a(8.0g，18.3mmol)的THF(50mL)溶液中加入LiBr(7.9g，91.6mmol)。在回流下搅拌17小时后，将反应混合物过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物22a(3.2g，50％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ3.95-3.50(m,24H)。
化合物22b的制备
在0℃向化合物22a(3.2g，12.3mmol)的丙酮(20mL)溶液中加入Jones试剂(20mL)。在0℃15小时后，将反应混合物过滤并浓缩。将残余物用H2O(50mL)稀释并用EtOAc(2×100mL)萃取。将有机层合并，用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法纯化粗产物以生产化合物22b(3.2g，72％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.16(s,2H),3.95-3.30(m,20H)。
化合物22c的制备
在0℃和氮气下向化合物22b(3.2g，8.90mmol)的MeOH(30mL)溶液中加入草酰氯(1.15mL，13.3mmol)。16小时后，将反应混合物浓缩并通过柱色谱纯化以生产化合物22c(2.7g，81％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.17(s,2H),3.80-3.60(m,21H),3.47(t,J＝6.4Hz,2H)。
化合物22d的制备
在0℃和氮气下将NaH(60％于油中，378mg，8.63mmol)加入到化合物22c(2.7g，7.23mmol)和N,N-二Boc-羟胺(2.2g，9.4mmol)的DMF(30mL)溶液中。17小时后，将反应混合物浓缩。将残余物用H2O(50mL)稀释并用EtOAc(3×100mL)萃取。将有机层合并，用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物22d(2.1g，55％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.17(s,2H),4.08(t,J＝5.2Hz,2H),3.78-3.60(m,21H),1.53(s,18H)。
化合物22e的制备
在0℃和氮气下向化合物22d(2.1g，3.99mmol)的THF/MeOH/H2O(30mL/10mL/10mL)溶液中加入NaOH(400mg，9.98mmol)。在室温下将反应混合物搅拌3小时。然后用1N盐酸水溶液将溶液的pH值调节至4-5。将反应混合物倒入H2O(50mL)中并用EtOAc(2×100mL)萃取。将有机层合并，用MgSO4干燥。过滤并浓缩生产无色油状化合物22e(1.6g)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.90(s,1H),4.15(s,2H),4.03(brs,2H),3.80-3.60(m,18H),1.47(s,9H)。
化合物22f的制备
将DIPEA(0.13mL，0.73mmol)和HBTU(187mg，0.49mmol)加入到化合物21f(200mg，0.24mmol)和化合物22e(152mg，0.36mmol)的DMF(5mL)的搅拌溶液中。在氮气和室温下将反应混合物搅拌6小时。用H2O(100mL)稀释反应混合物并用EtOAc(3×100mL)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物22f(100mg，34％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1205.6。
化合物22g的制备
向化合物22f(100mg，0.08mmol)的MeOH(20mL)溶液中加入Pd/C(10wt.％，20mg)，然后在氢气和室温下将反应混合物搅拌4小时。将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(20mL)洗涤。将得到的化合物(22g)浓缩为无色油状物(70mg)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+937.4,[M+Na]+959.3。
化合物22h的制备
通过制备实施例30中的化合物20q的类似方法由化合物1i和化合物22g制备化合物22h。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1489.4。
实施例33.化合物23h的制备
化合物23a的制备
向化合物4a(483mg，0.69mmol)的THF(10mL)溶液中加入LiBr(180mg，2.06mmol)。将反应混合物在氮气下回流12小时。然后将反应混合物减压浓缩。通过柱色谱纯化残余物以生产化合物23a(330mg，78％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ3.81(t,J＝6.4Hz,2H),3.72-3.59(m,44H),3.47(t,J＝6.4Hz,2H)。
化合物23b的制备
在0℃向化合物23a(330mg，0.54mmol)的丙酮(2mL)溶液中加入Jones试剂(2mL)。在0℃15小时后，将反应混合物过滤并浓缩。将残余物用H2O(15mL)稀释并用EtOAc(2×20mL)萃取。将有机层合并，用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。得到的粗化合物23b不经进一步纯化而使用。
化合物23c的制备
在0℃和氮气下向粗化合物23b(266mg，0.43mmol)的MeOH(5mL)溶液中加入草酰氯(0.054mL，0.64mmol)。16小时后，将反应混合物浓缩并通过柱色谱纯化以生产化合物23c(2步为200mg，58％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.17(s,2H),3.81(t,J＝6.4Hz,2H),3.79-3.64(m,43H),3.48(t,J＝6.4Hz,2H)。
化合物23d的制备
在0℃和氮气下向化合物23c(200mg，0.31mmol)的DMF(3mL)溶液中加入N，N-二Boc-羟胺(95mg，0.40mmol)和NaH(60％于油中，16mg，0.37mmol)。17小时后，将反应混合物浓缩。将残余物用H2O(5mL)稀释并用EtOAc(3×10mL)萃取。将有机层合并用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物23d(120mg，49％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.17(s,2H),4.13(t,J＝8.0Hz,2H),3.75-3.64(m,45H),1.53(s,18H)。
化合物23e的制备
在0℃和氮气下向化合物23d(120mg，0.15mmol)的THF/MeOH/H2O(3mL/1mL/1mL)溶液中加入NaOH(15mg，0.38mmol)。在室温下将反应混合物搅拌1小时。然后用1N盐酸水溶液将溶液的pH值调节至4-5。将反应混合物倒入H2O(10mL)中并用CHCl3(2×20mL)萃取。将有机层合并，用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩生产化合物23e(100mg)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.23(t,J＝8.0Hz,2H),4.15(s,2H),4.08(t,J＝4.0Hz,1H),4.01(t,J＝4.0Hz,1H),3.74-3.64(m,40H),1.53(s,9H)。
化合物23f的制备
将DIPEA(0.052mL，0.29mmol)和HBTU(75mg，0.20mmol)加入到化合物21f(80mg，0.09mmol)和化合物23e(100mg，0.15mmol)的DMF(3mL)的搅拌溶液中。在室温和氮气下搅拌6小时后，将反应混合物用H2O(50mL)稀释并用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物23f(140mg，97％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38-7.31(m,10H),5.44(br,2H),5.09(s,4H),4.34(s,2H),4.26-4.17(m,4H),4.09-4.08(m,1H),4.07(br,1H),3.73-3.47(m,76H),3.39-3.38(m,4H),1.53(s,9H).EI-MSm/z:[M+Na]+1491.6,[M+H-Boc]+:1369.6。
化合物23g的制备
向化合物23f(140mg，0.09mmol)的MeOH(20mL)溶液中加入Pd/C(10wt.％，20mg)，然后在氢气和室温下将反应混合物搅拌4小时。将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(20mL)洗涤。将得到的化合物23g浓缩为无色油状物(120mg)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+1201.7,[M+Na]+1223.7。
化合物23h的制备
通过制备实施例30中的化合物20q的类似方法由化合物1i和化合物23g制备化合物23h。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1620.3,1/2[M+Na]+1632.1。
实施例34.化合物241的制备
化合物24a的制备
在0℃将Jones试剂(90mL)缓慢加入到化合物2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]乙醇(15.0g，88.9mmol)的丙酮(600mL)溶液中。在0℃15小时后，将反应混合物过滤并浓缩。将残余物用H2O(200mL)稀释并用CHCl3(5×300mL)萃取。将有机层合并，用无水MgSO4干燥。将得到的化合物24a(20.0g)浓缩，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.18(s,2H),3.81-3.64(m,8H)。
化合物24b的制备
在0℃和氮气下向化合物24a(20.0g，88.9mmol)的MeOH(500mL)溶液中加入草酰氯(11.5mL，133.4mmol)30分钟。16小时后，将反应混合物浓缩并通过柱色谱纯化以生产化合物24b(13.0g，75％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.18(s,2H),3.78-3.67(m,9H),3.65(t,J＝5.6Hz,2H)。
化合物24c的制备
将化合物24b(13.0g，66.1mmol)和NaN3(6.4g，99.2mmol)溶于DMF(130mL)中。在100℃搅拌2小时后，将反应混合物用盐水(200mL)稀释并用CHCl3(2×100mL)萃取。将有机层合并，用无水MgSO4干燥。将得到的化合物24c浓缩(11.7g，87％)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.18(s,2H),3.76-3.67(m,9H),3.41(t,J＝5.6Hz,2H)。
化合物24d的制备
在0℃向化合物24c(11.5g，56.6mmol)的THF/MeOH/H2O(300mL/100mL/100mL)溶液中加入NaOH(4.53g，113.2mmol)。在0℃和氮气下2小时后，用4M盐酸水溶液将溶液的pH值调节至2。将反应混合物倒入H2O(100mL)中并用CHCl3(3×500mL)萃取。将有机层合并，用MgSO4干燥。过滤并浓缩以生产无色油状化合物24d(10.7g，99％)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.19(s,2H),3.79-3.77(m,2H),3.72-3.70(m,4H),3.44(t,J＝5.2Hz,2H)。
化合物24e的制备
向三颈烧瓶中连续加入H2O(40mL)，1,4-二恶烷(70mL)和H-Lys(Z)-OH(10g，35.7mmol)。搅拌混合物直到完全溶解。通过加入2M的Na2CO3水溶液将pH值调节至约10.5。加入氯甲酸苄酯(6.69g，39.2mmol)，同时通过同时加入2MNa2CO3水溶液将pH值保持在约10-11。加完后，在20℃将反应混合物搅拌1小时。然后加入EtOAc(50mL)，用c-HCl将所得混合物的pH值调节至2-3。将有机层分离并将水层用EtOAc(50mL)萃取。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥。过滤并减压浓缩，得到淡黄色油状化合物24e(14.7g，99％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.33-7.27(m,10H),5.07-5.04(d,4H),4.08(m,1H),3.09(t,2H),1.51(brs,1H),1.49(bs,1H),1.47-1.40(m,4H)。
化合物24f的制备
将DIPEA(0.40mL，2.37mmol)，HOBt(143mg，1.06mmol)和EDC·HCl(240mg，1.25mmol)加入到化合物24e(400mg，0.96mmol)和化合物2d(261mg，0.86mmol)的DMF(3mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入H2O(50mL)中，用EtOAc(3×50mL)萃取，用NaHCO3水溶液(50mL)和盐水(50mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥。过滤并减压浓缩后，通过柱色谱纯化所得的残余物以得到化合物24f(380mg，59％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.16(s,1H),7.34-7.28(m,10H),7.49(s,1H)5.08-5.07(m,5H),4.17(m,1H),3.99(t,2H),3.68-3.16(m,10H),3.17(d,2H),1.66(m,1H),1.51-1.27(m,14H).EI-MSm/z:[M+H]+661.0。
化合物24g的制备
在0℃向化合物24f(370mg，0.55mmol)和Pd/C(10wt.％，74mg)的MeOH(10mL)的搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.27mL，1.1mmol)。在氢气和室温下搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(40mL)洗涤。将滤液浓缩以生产无色油状化合物24g(223mg，87％)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.02(s,1H),8.62(s,1H),8.22(br,2H),7.90(br,2H),3.81(t,2H),3.56(m,4H),3.46(t,2H),3.39-3.27(m,26H),2.75(m,2H),1.73(q,2H),1.55(p,2H),1.40-1.33(m,14H)。
化合物24h的制备
将DIPEA(1.6mL，9.45mmol)，HOBt(746mg，5.52mmol)和EDC·HCl(1.19g，6.42mmol)加入到化合物24g(1.0g，5.29mmol)和化合物24d(1.1g，2.35mmol)的DMF(15mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入H2O(20mL)中，用DCM(3×50mL)萃取并用无水Na2SO4干燥。过滤并减压浓缩后，通过柱色谱纯化所得的残余物以得到化合物24h(1.25g，70％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.36(s,1H),7.30(d,1H),7.08(s,1H),7.68(t,1H),4.46(q,1H),4.07-3.98-4.01(m,4H),3.98(s,2H),3.75-3.663(m,H)3.57(t,2H),3.44(m,6H),3.28(m,2H),1.87(m,1H),1.66(m,1H),1.59-1.52(p,2H),1.48(s,9H),1.41-1.33(m,2H).EI-MSm/z:[M+H]+735.0。
化合物24i的制备
在0℃向化合物24h(1.2g，0.163mmol)和Pd/C(10wt.％，250mg)的MeOH(30mL)的搅拌混合物中加入4N HCl(1,4-二恶烷，0.81mL，3.26mmol)。在氢气和室温下搅拌1.5小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(100mL)洗涤。将滤液浓缩以生产无色油状化合物24i(1.39g，99％)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.99(s,1H),8.22(t1H)7.74(t,1H),7.61(d,1H),4.31,(q,1H),3.93(s,2H),3.86(s,2H),3.79(t,2H),3.60-3.50(m,18H),3.06(q,2H),2.97(p,4H),1.60-1.49(m,2H),1.39(m,11H),1.20(m,2H).EI-MSm/z:[M+H]+683。
化合物24j的制备
将DIPEA(0.021mL，0.125mmol)和HBTU(29mg，0.078mmol)加入到化合物1i(85mg，0.069mmol)和化合物24i(23mg，0.031mmol)的DMF(0.7mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物溶解于H2O/DMSO(1.5mL/1.5mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并浓缩以生产化合物24j(67mg，68％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1552.5。
化合物24k的制备
在0℃向化合物24j(67mg，0.021mmol)的MeOH(1.7mL)溶液中加入LiOH一水合物(16mg，0.388mmol)的H2O(1.7mL)溶液。在0℃搅拌2小时后，用醋酸(0.018mL)中和反应混合物并减压浓缩。将反应混合物溶解于H2O/DMSO(1.5mL/1.5mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并浓缩以生产化合物24k(37mg，62％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1412.3。
化合物241的制备
将TFA(0.4mL)加入到化合物24k(37mg，0.013mmol)的DCM(2.0mL)的搅拌溶液中。在0℃搅拌2小时后，用N2吹除溶剂和过量的TFA。将残余物溶于H2O/乙腈(1mL/1mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干以生产白色固体化合物24l(19.8mg，53％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1362.3。
实施例35.化合物25e的制备
化合物25a的制备
将化合物22c(1.0g，2.67mmol)和NaN3(261mg，4.01mmol)溶于DMF(3mL)中。将反应混合物在100℃加热5小时。反应完成后，将反应混合物过滤并浓缩。通过柱色谱(EtOAc至EtOAc/MeOH 10/1)纯化残余物以生产化合物25a(854mg，95％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.17(s,2H),3.76-3.64(m,21H),3.39(t,J＝5.2Hz,2H)。
化合物25b的制备
在0℃向化合物25a(854mg，2.54mmol)的MeOH(25mL)的搅拌溶液中加入2MNaOH水溶液(6.3mL，12.64mmol)。在室温下将反应混合物搅拌3小时。然后将溶液减压浓缩。将所得悬浮液用2N盐酸水溶液酸化，同时在0℃冷却。将残余物用CHCl3(8×500mL)萃取。将有机层合并用Na2SO4干燥，浓缩以生产化合物25b(783mg，96％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.16(s,2H),3.76-3.65(m,18H),3.40(t,J＝5.2Hz,2H)。
化合物25c的制备
将DIPEA(0.30mL，1.70mmol)和HBTU(483mg，1.27mmol)加入到化合物25b(337mg，1.05mmol)和化合物24g(198mg，0.42mmol)的DMF(3mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物浓缩并通过柱色谱(EtOAc至EtOAc/MeOH 10/1)纯化以生产化合物25c(358mg，84％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.98(s,1H),8.09(t,J＝5.2Hz,1H),7.63(t,J＝5.2Hz,1H),7.55(d,J＝8.4Hz,1H),4.31-4.25(m,1H),3.90(s,2H),3.84(s,2H),3.80(m,2H),3.62-3.46(m,34H),3.42-3.36(m,6H),3.25-3.17(m,2H),3.08-3.03(m,2H),1.61-1.51(m,2H),1.39(s,9H),1.26-1.10(m,7H).EI-MSm/z:[M+H]+999.1。
化合物25d的制备
向化合物25c(358mg，0.35mmol)的MeOH(7mL)溶液中加入Pd/C(10wt.％，38mg)和HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.18mL，0.72mmol)。在氢气和室温下搅拌5小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(400mL)洗涤。将滤液浓缩以生产无色油状化合物25d(314mg，93％)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.98(s,1H),8.10(m,1H),7.68(m,1H),7.57(m,1H),4.31-4.25(m,1H),3.90(s,2H),3.84(s,2H),3.80(m,2H),3.62-3.46(m,30H),3.42-3.36(m,10H),3.45-3.16(m,4H),3.08-3.03(m,3H),2.72-2.66(m,3H),1.61-1.51(m,2H),1.39(s,9H),1.26-1.10(m,6H).EI-MSm/z:[M+H]+947.1。
化合物25e的制备
通过制备实施例34中的化合物24l的类似方法由化合物1i和化合物25d制备化合物25e。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1493.7。
实施例36.化合物25f的制备
通过制备实施例34中的化合物24l的类似方法由化合物1j和化合物25d制备化合物25f。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1508.2。
实施例37.化合物26e的制备
化合物26a的制备
将DIPEA(0.65mL，0.004mmol)，HOBt(218mg，1.61mmol)和EDC·HCl(364mg，1.9mmol)加入到化合物24e(1.0g，2.43mmol)和化合物3e(810mg，1.52mmol)的DMF(10mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入H2O(50mL)中并用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机层用1N盐酸水溶液(30mL)，NaHCO3饱和水溶液(30mL)和盐水(30mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩后，通过柱色谱纯化残余物以生产化合物26a(988mg，73％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.33-7.26(m,8H),6.85(s,1H),5.63(s,1H),5.08-5.02(s,4H),4.16-4.11(m,1H),4.09-4.05(m,2H),3.72-3.70(m,2H),3.62-3.59(m,14H),3.53(s,2H),3.44-3.43(m,2H),3.18-3.16(m,2H),1.82(m,1H),1.72(s,7H),1.66(m,1H),1.52(s,18H),1.38-1.36(m,2H),1.24-1.27(s,1H).EI-MSm/z:[M+H-2Boc]+693.1。
化合物26b的制备
在0℃向化合物26a(988mg，1.1mmol)和Pd/C(10wt.％，196mg)的MeOH(6mL)的搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.55mL，2.2mmol)。在氢气和室温下搅拌1.5小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(40mL)洗涤。将滤液浓缩以生产黄色形式化合物26b(767mg，99％)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+625.0,[M+H-Boc]+525.0,[M+H-2Boc]+424.9。
化合物26c的制备
将DIPEA(0.2mL，1.14mmol)，HOBt(89mg，0.66mmol)和EDC·HCl(142mg，0.74mmol)加入到化合物26b(200mg，0.29mmol)和化合物25b(202mg，0.63mmol)的DMF(5mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入H2O(10mL)中并用DCM(3×10mL)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩后，通过柱色谱纯化残余物以生产化合物26c(270mg，77％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.07(t,1H),7.62(t,1H),7.54-7.52(m,1H),5.73(s,2H),4.27-4.25(q,1H),3.96(t,2H),3.88(s,2H),3.82(s,2H),3.58-3.48(m,52H),3.19-3.18(m,3H),3.04-3.03(m,3H),1.44(s,18H),1.39-1.37(m,3H),1.21-1.19(m,3H).EI-MSm/z:[M+H-2Boc]+1031.6。
化合物26d的制备
在0℃向化合物26c(160mg，0.13mmol)和Pd/C(10wt。％，28mg)的MeOH(20mL)的搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.07mL，0.28mmol)。在氢气和室温下搅拌30分钟后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(30mL)洗涤。将滤液浓缩以生产无色油状化合物26d(140mg，91％)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+1179.7。
化合物26e的制备
通过制备实施例34中的化合物24l的类似方法由化合物1i和化合物26d制备化合物26e。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1560.6,1/3[M+H]+1040.7。
实施例38.化合物27e的制备
化合物27a的制备
将DIPEA(0.19ml，1.1mmol)，HOBt(64mg，0.47mmol)和EDC·HCl(91mg，0.47mmol)加入到化合物24e(228mg，0.55mmol)和化合物4e(256mg，0.36mmol)的DMF(4mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌4小时后，将反应混合物倒入H2O(10mL)中并用EtOAc(3×15mL)萃取。将合并的有机层用1N盐酸水溶液(20mL)，NaHCO3饱和水溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩后，通过柱色谱纯化残余物以生产化合物27a(d327mg，85％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.73(s,1H),7.33-7.26(m,11H),6.91(s,1H),5.67(br,1H)5.08-5.07(m,5H),4.15(m,1H),4.02(t,2H),3.72-3.44(m,46H),3.16(d,2H),1.82(m,1H),1.63(m,1H),1.55-1.36(m,13H)。
化合物27b的制备
在0℃向化合物27a(327mg，0.309mmol)和Pd/C(10wt.％，65mg)的MeOH(6mL)的搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.15mL，0.618mmol)。在氢气和室温下搅拌1.5小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(40mL)洗涤。将滤液浓缩以生产无色油状化合物27b(244mg，91％)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+789.2。
化合物27c的制备
将DIPEA(0.19ml，1.13mmol)，HOBt(95mg，0.707mmol)和EDC·HCl(135mg，0.707mmol)加入到化合物25b(227mg，0.707mmol)和化合物27b(244mg，0.283mmol)的DMF(6mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌3小时后，将反应混合物倒入H2O(5mL)中并用DCM(3×10mL)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩后，通过柱色谱纯化残余物以生产化合物27c(339mg，85％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.69(s,1H),7.29(d,1H),6.99(s,1H),6.82(s,1H),4.39(q,1H),3.99-3.94(m,6H),3.69-3.58(m,80H),3.51(t,2H),3.44-3.34(m,8H),3.25(m,2H),1.68-1.64(m,1H).1.53-1.48(m,2H),1.44(s,9H),1.33(m,2H).EI-MSm/z:[M+H]+1395.6。
化合物27d的制备
在0℃向化合物27c(339mg，0.242mmol)和Pd/C(10wt.％，67mg)的MeOH(6mL)的搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.12mL，0.484mmol)。在氢气和室温下搅拌30分钟后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(30mL)洗涤。将滤液浓缩以生产无色油状化合物27d(300mg，87％)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+1343.5。
化合物27e的制备
通过制备实施例34中的化合物24l的类似方法由化合物1i和化合物27d制备化合物27e。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1692.5。
实施例39.化合物28d的制备
化合物28c的制备
通过制备实施例35中的化合物25d的类似方法由H-D-Lys(Z)-OH制备化合物28c。
化合物28d的制备
通过制备实施例35中的化合物25e的类似方法由化合物1i和化合物28c制备化合物28d。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1494.9。
实施例40.化合物28e的制备
通过制备实施例35中的化合物25e的类似方法由化合物1j和化合物28c制备化合物28e。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1509.2。
实施例41.化合物29j的制备
化合物29a的制备
在0℃和氮气下向六甘醇(25.0g，88.5mmol)的DCM(100mL)溶液中加入三乙胺(61.7mL，443mmol)和对甲苯磺酰氯(50.6g，266mmol)。在0℃5小时后，将反应混合物倒入1N盐酸水溶液(200mL)中并用DCM(2×200mL)萃取。将合并的有机层用NaHCO3饱和水溶液(100mL)和盐水(100mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩后，通过柱色谱纯化残余物以生产棕色油状化合物29a(45.0g，87％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.79(d,J＝7.6Hz,4H),7.34(d,J＝7.6Hz,4H),4.16-4.14(m,4H),3.69-3.67(m,4H),3.64-3.56(m,16H),2.44(s,6H)。
化合物29b的制备
向化合物29a(17.6g，29.7mmol)的DMF(100mL)溶液中加入NaN3(9.65g，148mmol)和四丁基碘化铵(550mg，1.49mmol)。将反应混合物加热至80℃。在80℃搅拌16小时后，使反应混合物冷却至室温。将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用DCM(100mL)洗涤。浓缩后，通过柱色谱纯化残余物以生产化合物29b(9.4g，94％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ3.68(m,20H),3.39(t,4H)。
化合物29c的制备
向29b(8.4g，24.9mmol)的DCM(24mL)和甲苯(24mL)溶液中加入1N盐酸(40.3mL)和三苯基膦(6.9g，23.6mmol)。在室温下和氮气下将反应混合物搅拌16小时。减压除去溶剂后，将H2O(20mL)加入到反应混合物中，并将水层用EtOAc(20mL)萃取。然后将水相的pH值调节至13。所得水相用DCM(3×30mL)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以生产无色油状化合物29c(6.6g，84％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ3.67(m,20H),3.52(t,2H),3.39(t,2H),2.86(t,2H).EI-MSm/z:[M+H]+306.9。
化合物29d的制备
在0℃将DIPEA(2.67mL，15.4mmol)和HBTU(3.49g，9.21mmol)加入到L-谷氨酸二甲酯盐酸盐(1.3g，6.14mmol)和化合物20e(1.72g，6.14mmol)的DMF(15mL)的搅拌混合物中。在0℃将反应混合物搅拌30分钟，在氮气下16小时内温热至室温。将反应混合物倒入水(50mL)中并用DCM(3×50mL)萃取。将合并的有机层用0.5N HCl(50mL)，NaHCO3饱和水溶液(50mL)和盐水(50mL)依次洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并减压浓缩后，通过柱色谱纯化得到的粗产物以生产化合物29d(2.18g，81％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.00(s,1H),8.04(d,1H),4.34(m,1H),3.93(s,1H),3.77(s,1H),3.63(s,3H),3.58(s,9H),3.38-3.34(t,2H),2.14(m,H),1.90(m,1H),1.39(s,9H).EI-MSm/z:[M+H]+437.35。
化合物29e的制备
在氮气和室温下向化合物29d(2.18g，4.99mmol)的THF:MeOH:H2O(12mL:4mL:4mL)溶液中加入NaOH(499mg，12.5mmol)。3小时后，将反应混合物的pH值调节至4并浓缩。然后将残余物用DCM/MeOH(80mL/20mL)萃取。将得到的化合物29e浓缩成黄色油状物(1.0g，49％)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H-Boc]+309.20。
化合物29f的制备
在0℃将DIPEA(1.7mL，9.79mmol)和HBTU(2.79g，7.35mmol)加入到化合物29e(1.0g，2.45mmol)和化合物29c(2.25g，7.35mmol)DMF(10mL)的搅拌混合物中。在0℃将反应混合物搅拌30分钟，在氮气下16小时内温热至室温。将反应混合物倒入水(50mL)中并用DCM(3×50mL)萃取。将合并的有机层用0.5N HCl水溶液(50mL)，NaHCO3饱和水溶液(50mL)和盐水(50mL)依次洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并减压浓缩后，通过柱色谱纯化得到的粗产物以生产化合物29f(611mg，25％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.97(s,1H),8.08(t,1H),7.85(t,1H),7.64(d,1H),4.27(m,1H),3.83(s,2H),3.82-3.61(m,2H),3.61-3.50(m,42H),3.42-3.37(m,8H),3.28-3.15(m,4H),2.90(s,H),2.08-2.04(m,2H),1.88(m,1H),1.75(m,1H),1.39(s,9H).EI-MSm/z:[M+H]+986.73。
化合物29g的制备
向化合物29f(611mg，0.62mmol)的MeOH(50mL)的搅拌混合物中加入Pd/C(10wt.％，132mg，0.62mmol)。在氢气和室温下搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(40mL)洗涤。将滤液浓缩以生产无色油状化合物29g(518mg，粗品)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+933.85。
化合物29h的制备
将DIPEA(0.026mL，0.150mmol)和HBTU(40mg，0.105mmol)加入到化合物29g(35mg，0.037mmol)和化合物1i(106mg，0.086mmol)的DMF(3mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌16小时后，将反应混合物用水(20mL)稀释并用EtOAc(3×10mL)萃取。将合并的有机层用0.5N HCl(20mL)，NaHCO3饱和水溶液(20mL)和盐水(20mL)依次洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并减压浓缩后，通过柱色谱纯化得到的粗产物以生产化合物29h(81.4mg，65％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1677.94,1/3[M+H]+1119.03。
化合物29i的制备
在-10℃向化合物29h(81mg，0.024mmol)的MeOH(1mL)溶液中加入LiOH一水合物(8.1mg，0.19mmol)的H2O(1mL)溶液。在-10℃搅拌2小时后，用乙酸中和反应混合物并减压浓缩。然后将反应混合物溶解在H2O/DMSO(1.5mL/1.5mL)中并通过HPLC纯化以生产白色固体化合物29i(53mg，72％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1537.86,1/3[M+H]+1025.66。
化合物29j的制备
在0℃将TFA(0.3mL)加入到化合物29i(53mg，0.017mmol)的DCM(1.0mL)的搅拌溶液中。搅拌1小时后，通过N2流除去溶剂和过量的TFA。然后将残余物溶于H2O/MeCN(1mL/1mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干以生产白色固体化合物29j(23.1mg，43％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1487.99,1/3[M+H]+992.40。
实施例42.化合物29k的制备
通过制备实施例41中的化合物29j的类似方法由化合物1j和化合物29g制备化合物29k。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1501.93,1/3[M+H]+1001.69。
实施例43.化合物30b的制备
化合物30a的制备
通过制备实施例41中的化合物29g的类似方法由D-谷氨酸二甲酯盐酸盐制备化合物30a。EI-MSm/z:[M+H]+933.89。
化合物30b的制备
通过制备实施例41中的化合物29j的类似方法由化合物1i和化合物30a制备化合物30b。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1488.07,1/3[M+H]+992.40。
实施例44.化合物30c的制备
通过制备实施例41中的化合物29j的类似方法由化合物1j和化合物30a制备化合物30c。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1501.93,1/3[M+H]+1001.69。
实施例45.化合物31f的制备
化合物31a的制备
向三颈烧瓶中连续加入H2O(18mL)，1,4-二恶烷(30mL)和L-鸟氨酸单盐酸盐(3.0g，17.8mmol)。搅拌混合物直到完全溶解。通过加入2MNa2CO3水溶液将pH值调节至约10.5。加入氯甲酸苄酯(6.37g，37.4mmol)，同时保持pH值在约10-11，同时加入2MNa2CO3水溶液。加入结束后，将反应混合物在20℃搅拌1小时。然后加入EtOAc(50mL)，用c-HCl将所得混合物的pH值调节至2-3。将有机层分离并将水层用EtOAc(50mL)萃取。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，并用Na2SO4干燥。过滤并减压浓缩以得到化合物31a(7.1g)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.54(s,1H),7.54(s,1H),7.44-7.29(m,10H),7.24-7.22(m,1H),5.16-5.00(d,4H),3.95-3.89(m,1H),3.00-2.96(m,2H),1.98-1.57(m,1H),1.56-1.46(m,3H)。
化合物31b的制备
在0℃将DIPEA(1.41mL，8.12mmol)和HBTU(1.85g，4.87mmol)加入到化合物31a(1.30g，3.25mmol)和化合物2d(891mg，3.57mmol)的DMF(10mL)的搅拌混合物中。在0℃将反应混合物搅拌30分钟，在氮气下16小时内温热至室温。将反应混合物倒入水(50mL)中并用DCM(3×50mL)萃取。将合并的有机层用0.5N HCl水溶液(50mL)，NaHCO3饱和水溶液(50mL)和盐水(50mL)依次洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并减压浓缩后，通过柱色谱纯化得到的粗产物以生产化合物31b(1.2g，57％)。EI-MSm/z:[M+H]+647.54,[M+H-Boc]+547.47。
化合物31c的制备
向化合物31b(1.2g，1.86mmol)的MeOH(50mL)的搅拌混合物中加入Pd/C(10wt.％，59mg，5.57mmol)。在氢气和室温下搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(40mL)洗涤。将滤液浓缩以生产化合物31c(717mg)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.93(s,1H),3.81(t,2H),3.55(t,2H),3.51(s,5H),3.42-3.22(m,13H),1.37(s,9H)。
化合物31d的制备
在0℃将DIPEA(0.55mL，3.17mmol)和HBTU(902mg，2.38mmol)加入到化合物31c(300mg，0.79mmol)和化合物25b(637mg，1.98mmol)的DMF(5mL)的搅拌混合物中。在0℃将反应混合物搅拌30分钟，在氮气下16小时内温热至室温。将反应混合物倒入水(30mL)中并用DCM(3×30mL)萃取。将合并的有机层用0.5N HCl水溶液(30mL)，NaHCO3饱和水溶液(30mL)和盐水(30mL)依次洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并减压浓缩后，通过柱色谱纯化得到的粗产物以生产化合物31d(551mg，71％)。EI-MSm/z:[M+H]+985.87。
化合物31e的制备
向化合物31d(491mg，0.50mmol)的MeOH(30mL)的搅拌混合物中加入Pd/C(10wt.％，106mg，1.00mmol)。在氢气和室温下搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(40mL)洗涤。将滤液浓缩以生产化合物31e(452mg)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+933.94。
化合物31f的制备
通过制备实施例35中的化合物25e的类似方法由化合物1i和化合物31e制备化合物31f。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1488.20,1/3[M+H]+992.54。
实施例46.化合物31g的制备
通过制备实施例35中的化合物25e的类似方法由化合物1j和化合物31e制备化合物31g。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1502.23,1/3[M+H]+1001.86。
实施例47.化合物32c的制备
化合物32a的制备
将DIPEA(0.6mL，7.07mmol)和HBTU(972mg，5.30mmol)加入到化合物24g(483mg，0.855mmol)和Fmoc-NH-PEG5-CH2CH2COOH(1.0g，3.89mmol)的DMF(10mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入H2O(30mL)中并用EtOAc(3×30mL)萃取。将合并的有机层用1N HCl水溶液(10mL)，NaHCO3饱和水溶液(10mL)和盐水(10mL)依次洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩后，通过柱色谱纯化所得的残余物以生产化合物32a(1.16g，90％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(d,4H),7.60(d,4H),7.39(t,4H),7.31(t,4H),4.39(d,4H),4.33(m,1H),4.22(m,2H),4.09(m,2H),3.71-3.39(m,52H),3.19(m,2H),2.51(m,4H),1.50(m,1H),1.46(m,1H),1.43(s,9H),1.25(m,2H).EI-MSm/z:[M+H]+1520.0。
化合物32b的制备
在室温下向化合物32a(500mg，0.328mmol)的THF(8mL)溶液中加入哌啶(2mL)。搅拌20分钟后，将反应混合物减压浓缩。通过柱色谱纯化所得的残余物以生产化合物32b(175mg，50％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.41(m,1H),4.01(m,2H),3.75-3.56(m,43H),3.54(m,2H),3.24(m,2H),2.89(m,3H),2.52(m,4H),1.83(m,1H),1.80(m,1H),1.53(s,9H),1.39(m,2H).EI-MSm/z:[M+H]+975.5。
化合物32c的制备
通过制备实施例35中的化合物25e的类似方法由化合物1i和化合物32b制备化合物32c。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1508.8。
实施例48.化合物32d的制备
通过制备实施例35中的化合物25e的类似方法由化合物1j和化合物32b制备化合物32d。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1522.8。
实施例49.化合物33e的制备
化合物33a的制备
将DIPEA(1.98mL，11.37mmol)和HBTU(2.15g，5.68mmol)加入到化合物24e(1.57g，3.79mmol)和化合物6b(1.30g，3.15mmol)的DMF(37mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入H2O(40mL)中并用EtOAc(3×40mL)萃取。将合并的有机层用1N HCl水溶液(40mL)，NaHCO3饱和水溶液(40mL)和盐水(40mL)依次洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩后，通过柱色谱纯化残余物以生产化合物33a(2.2g，88％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.99(s,1H),8.19(d,1H),7.79(t,1H),7.47(d,1H),7.34-7.31(m,5H),7.24(t,1H),5.01(d,4H),4.55(q,1H),3.91(q,1H),3.79(t,2H),3.55-3.48(m,9H),3.24-3.11(m,2H),2.75-2.54(m,2H),1.57-1.49(m,2H),1.38(s,9H),1.25(m,2H).EI-MSm/z:[M+H]+790.47,[M+Na]+812.4。
化合物33b的制备
在0℃向化合物33a(2.2g，2.78mmol)和Pd/C(10wt.％，400mg)的MeOH(60mL)的搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，1.39mL，5.56mmol)。在氢气和室温下搅拌3小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(40mL)洗涤。将滤液浓缩以生产化合物33b(1.67g，99％)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.98(s,1H),8.87(d,1H),8.28(bs,3H),8.12(1H),7.96(bs,3H),4.51(q,1H),3.77(t,2H),3.72(bs,1H),3.57(s,3H),3.52-3.47(m,7H),3.12(s,3H),2.76-2.61(m,4H)1.71(q,2H),1.55(q,2H)1.36(s,9H).EI-MSm/z:[M+H]+522.4,[M+Na]+544.3。
化合物33c的制备
将DIPEA(1.95mL，11.23mmol)和HBTU(3.19g，8.42mmol)加入到化合物25b(1.98g，6.17mmol)和化合物33b(1.67g，2.80mmol)的DMF(20mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物浓缩并通过柱色谱纯化以生产化合物33c(2g，63％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.97(s,1H),8.28(d,1H),7.82(t,1H),7.65(s,1H),7.64(s,1H),4.54(q,1H),4.25(q,1H),3.91(s,2H),3.84(s,2H),3.80(t,2H),3.60-3.49(m,48H),3.26-3.12(m,3H),3.07(q,2H),2.75-2.54(m,2H),1.65-1.55(m,2H),1.39(s,10H),1.21(m,3H).EI-MSm/z:[M+H]+1128.8,[M+Na]+1150.7。
化合物33d的制备
在0℃向化合物33c(1g，0.88mmol)和Pd/C(10wt.％，200mg)的MeOH(20mL)的搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.44mL，0.88mmol)。在氢气和室温下搅拌3小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(20mL)洗涤。将滤液浓缩以生产化合物33d(936mg，92％)，其未经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.98(s1H),8.30(d,1H),7.70(t,2H),4.54(q,1H),4.26(q,1H),3.93(s,2H),3.85(s,2H),3.80(t,2H),3.61-3.49(m,46H),3.22-3.12(m,4H),3.06(q,2H),2.97(q,4H),2.76-2.54(m,2H),1.64-1.55(m,2H),1.39(s,10H),1.26(m,3H).EI-MSm/z:[M+H]+1076.8。
化合物33e的制备
通过制备实施例35中的化合物25e的类似方法由化合物1i和化合物33d制备化合物33e。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1552.2。
实施例50.化合物33f的制备
通过制备实施例35中的化合物25e的类似方法由化合物1j和化合物33d制备化合物33f。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1566.4。
实施例51.化合物34e的制备
化合物34a的制备
将DIPEA(0.8mL，4.56mmol)和HBTU(1.3g，3.42mmol)加入到化合物24g(530mg，1.14mmol)和Z-Asp(OMe)-OH(704mg，2.5mmol)的DMF(5mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入H2O(50mL)中并用EtOAc(3×30mL)萃取。将合并的有机层用1N HCl水溶液(40mL)，NaHCO3饱和水溶液(40mL)和盐水(40mL)依次洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩后，通过柱色谱纯化残余物以生产化合物34a(713mg，68％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.97(s,1H),7.88(m,3H),7.64(d,2H),7.51(d,2H),7.35(m,10H),5.02(m,4H),4.43-4.31(m,2H),4.17(m,1H),3.80(t,2H),3.58-3.50(m,12H),3.41-3.16(m,6H),2.98(m,2H),2.79-2.67(m,3H),2.57(m,2H),1.60-1.34(m,13H)。
化合物34b的制备
向化合物34a(530mg，0.58mmol)的MeOH(5mL)溶液中加入Pd/C(20wt.％，106mg)和HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.29mL，1.16mmol)。在氢气和室温下搅拌3小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(30mL)洗涤。将滤液浓缩以生产化合物34b(420mg，100％)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.97(s,1H),8.62(d,1H),8.54(s,1H),8.27(m,4H),7.02(s,1H),4.17(m,2H),4.02(m,1H),3.76(t,2H),3.61(m,4H),3.51-3.11(m,12H),3.09-2.77(m,8H),1.60-1.24(m,13H).EI-MSm/z:[M+H]+651.5。
化合物34c的制备
将DIPEA(0.4mL，2.32mmol)和HBTU(660mg，1.74mmol)加入到化合物34b(420mg，0.58mmol)和化合物25b(299mg，0.93mmol)的DMF(5mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入H2O(30mL)中并用EtOAc(3×30mL)萃取。将合并的有机层用1N HCl水溶液(20mL)，NaHCO3饱和水溶液(20mL)和盐水(20mL)依次洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩后，通过柱色谱纯化残余物以生产化合物34c(466mg，70.8％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.28(s,1H),7.78(q,1H),7.31(d,1H),7.71(s,1H),6.94(s,1H),4.85(m,2H),4.35(m,1H),4.07-4,03(m,6H),3.75-3.41(m,56H),3.23(q,2H),2.92-2.84(m,4H),1.91-1.32(m,15H).EI-MSm/z:[M+2H]+1158.1。
化合物34d的制备
在0℃向化合物34c(260mg，0.21mmol)和Pd/C(10wt.％，52mg)的MeOH(20mL)的搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.10mL，0.41mmol)。在氢气和室温下搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(50mL)洗涤。将滤液浓缩以生产化合物34d(249mg，100％)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+2H]+1206.1。
化合物34e的制备
通过制备实施例35中的化合物25e的类似方法由化合物1i和化合物34d制备化合物34e。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1610.4。
实施例52.化合物34f的制备
通过制备实施例35中的化合物25e的类似方法由化合物1j和化合物34d制备化合物34f。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1624.3。
实施例53.化合物35g的制备
化合物35a的制备
将DIPEA(0.61mL，3.52mmol)和HBTU(665mg，1.175mmol)加入到Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH(500mg，1.17mmol)和化合物2d(424mg，1.404mmol)的DMF(10mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入H2O(30mL)中并用EtOAc(3×30mL)萃取。将合并的有机层用1N HCl水溶液(20mL)，NaHCO3饱和水溶液(20mL)和盐水(20mL)依次洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩后，通过柱色谱纯化所得的残余物以生产化合物35a(708mg，89％)。EI-MSm/z:[M+H]+672.7。
化合物35b的制备
在室温下向化合物35a(708mg，1.04mmol)的THF(8mL)溶液中加入哌啶(2mL)。搅拌20分钟后，将反应混合物减压浓缩。通过柱色谱纯化所得的残余物以生产化合物35b(400mg，85％)。EI-MSm/z:[M+H]+450.1。
化合物35c的制备
将DIPEA(0.19mL，1.1mmol)和HBTU(253mg，0.66mmol)加入到化合物28a(203mg，0.484mmol)和化合物35b(200mg，0.44mmol)的DMF(10mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入H2O(30mL)中并用EtOAc(3×30mL)萃取。将合并的有机层用1N HCl水溶液(10mL)，NaHCO3饱和水溶液(10mL)和盐水(10mL)依次洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩后，通过柱色谱纯化残余物以生产化合物35c(235mg，63％)。EI-MSm/z:[M+H]+847.0。
化合物35d的制备
向化合物35c(235mg，0.277mmol)的MeOH(15mL)溶液中加入Pd/C(10wt.％，30mg)。在氢气和室温下搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(50mL)洗涤。将滤液浓缩以生产化合物35d(160mg，100％)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+578.7。
化合物35e的制备
将DIPEA(0.145mL，1.758mmol)和HBTU(262mg，1.465mmol)加入到化合物35d(160mg，0.276mmol)和化合物25b(187mg，0.581mmol)的DMF(3mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入H2O(30mL)中并用EtOAc(3×30mL)萃取。将合并的有机层用1N HCl水溶液(10mL)，NaHCO3饱和水溶液(10mL)和盐水(10mL)依次洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩后，通过柱色谱纯化残余物以生产化合物35e(260mg，79％)。EI-MSm/z:[M+H]+1185.4。
化合物35f的制备
向化合物35e(70mg，0.059mmol)的MeOH(5mL)溶液中加入Pd/C(10wt.％，15mg)。在氢气和室温下搅拌90分钟后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(30mL)洗涤。将滤液浓缩以生产化合物35f(67mg，100％)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+:1133.3。
化合物35g的制备
通过制备实施例35中的化合物25e的类似方法由化合物1i和化合物35f制备化合物35g。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1559.9。
实施例54.化合物36e的制备
化合物36a的制备
将DIPEA(0.3mL，3.10mmol)和HBTU(474mg，2.275mmol)加入到Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH(484mg，1.138mmol)和化合物28b(223mg，0.569mmol)的DMF(7mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入H2O(30mL)中并用EtOAc(3×30mL)萃取。将合并的有机层用1N HCl水溶液(20mL)，NaHCO3饱和水溶液(20mL)和盐水(20mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩后，通过柱色谱纯化残余物以生产化合物36a(593mg，86％)。EI-MSm/z:[M+H]+1208.3。
化合物36b的制备
在室温下向化合物36a(593mg，0.49mmol)的THF(8mL)溶液中加入哌啶(1mL)。搅拌20分钟后，将反应混合物减压浓缩。通过柱色谱纯化所得的残余物以生产化合物36b(166mg，44％)。EI-MSm/z:[M+H]+763.9。
化合物36c的制备
将DIPEA(0.15mL，0.84mmol)和HBTU(247mg，0.63mmol)加入到化合物36b(166mg，0.21mmol)和化合物25b(147mg，0.441mmol)的DMF(3mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入H2O(30mL)中并用EtOAc(3×30mL)萃取。将合并的有机层用1N HCl水溶液(10mL)，NaHCO3饱和水溶液(10mL)和盐水(10mL)依次洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩后，通过柱色谱纯化残余物以生产化合物36c(195mg，68％)。EI-MSm/z:[M+H]+1370.6。
化合物36d的制备
向化合物36c(195mg，0.14mmol)的MeOH(10mL)溶液中加入Pd/C(10wt.％，30mg)。然后在氢气和室温下将反应混合物搅拌90分钟。将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(30mL)洗涤。将滤液浓缩以生产化合物36d(187mg，100％)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+1318.6。
化合物36e的制备
通过制备实施例35中的化合物25e的类似方法由化合物1i和化合物36d制备化合物36e。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1624.4。
实施例55.化合物37d的制备
化合物37a的制备
将DIPEA(0.083mL，0.71mmol)和HBTU(136mg，0.36mmol)加入到炔丙基胺(0.018mL，0.285mmol)和化合物1j(300mg，0.238mmol)的DMF(3mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入H2O(10mL)中并用EtOAc(3×10mL)萃取。将合并的有机层用1N HCl水溶液(10mL)，NaHCO3饱和水溶液(10mL)和盐水(10mL)依次洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩后，通过柱色谱纯化所得的残余物以生产化合物37a(300mg，97％)。EI-MSm/z:[M+H]+1294.0。
化合物37b的制备
在0℃向化合物37a(300mg，0.24mmol)的THF(2mL)和MeOH(2mL)溶液中加入LiOH一水合物(50mg，1.20mmol)的H2O(2mL)溶液。在0℃搅拌2小时后，用醋酸中和反应混合物并减压浓缩。然后将残余物溶于H2O/DMSO(1.5mL/1.5mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并浓缩以生产化合物37b(165mg，60％)。EI-MSm/z:[M+H]+1140.8。
化合物37c的制备
将CuSO4·5H2O(1mg)和抗坏血酸钠(2mg)加入到化合物37b(50mg，0.042mmol)和化合物25c(23mg，0.02mmol)的THF(2mL)和H2O(2mL)的搅拌混合物中。通过加入1MNa2CO3水溶液将pH值调节至约7。在20℃搅拌1小时后，将反应混合物溶解于H2O/DMSO(1.5mL/1.5mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并浓缩以生产化合物37c(32.4mg，48％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1638.2。
化合物37d的制备
将TFA(0.4mL)加入到化合物37c(32.4mg，0.01mmol)的DCM(2mL)溶液中。在0℃搅拌2小时后，通过N2流除去溶剂和过量的TFA。然后将残余物溶于H2O/MeCN(1mL/1mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干以生产白色固体化合物37d(19.6mg，62％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1590.2。
实施例56.化合物38b的制备
化合物38a的制备
将CuSO4·5H2O(1mg)和抗坏血酸钠(2mg)加入到化合物37b(60mg，0.052mmol)和化合物16b(14mg，0.025mmol)的THF(2mL)和H2O(2mL)的搅拌混合物中。通过加入1MNa2CO3水溶液将pH值调节至约7。在20℃搅拌1小时后，将反应混合物溶解于H2O/DMSO(1.5mL/1.5mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并浓缩以生产化合物38a(61mg，82％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1430.2。
化合物38b的制备
将TFA(0.4mL)加入到化合物38a(59.8mg，0.02mmol)的DCM(2.0mL)溶液中。在0℃搅拌2小时后，通过N2流除去溶剂和过量的TFA。然后将残余物溶于H2O/AN(1mL/1mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干以生产白色固体化合物38b(14.6mg，24％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1380.1。
实施例57.化合物38e的制备
化合物38c的制备
将DIPEA(0.075mL，0.428mmol)和HBTU(122mg，0.321mmol)加入到炔丙基胺(0.016mL，0.256mmol)和化合物1i(264mg，0.214mmol)的DMF(3mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入H2O(10mL)中并用EtOAc(3×10mL)萃取。将合并的有机层用1N HCl水溶液(10mL)，NaHCO3饱和水溶液(10mL)和盐水(10mL)依次洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩后，通过柱色谱纯化残余物以生产化合物38c(270mg，100％)。EI-MSm/z:[M+H]+1266.2。
化合物38d的制备
在0℃向化合物38c(270mg，0.213mmol)的THF(2mL)和MeOH(2mL)溶液中加入LiOH一水合物(36mg，0.853mmol)的H2O(2mL)溶液。在0℃搅拌2小时后，用醋酸中和反应混合物并减压浓缩。然后将残余物溶于H2O/DMSO(1.5mL/1.5mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并浓缩以生产化合物38d(168mg，70％)。EI-MSm/z:[M+H]+1126.1。
化合物38e的制备
通过制备实施例56中的化合物38b的类似方法由化合物38d和化合物16b制备化合物38e。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1366.2。
实施例58.化合物39e的制备
化合物39a的制备
在0℃将化合物1g(27mg，0.039mmol)，化合物14j(45mg，0.039mmol)和无水HOBt(1mg，0.0078mmol)溶于DMF(2mL)。然后加入吡啶(0.2mL)和DIPEA(0.014mL，0.078mmol)。在氮气和0℃至室温下搅拌24小时后，将反应混合物溶解于DMSO(1mL)中并通过HPLC纯化以生产白色固体化合物39a(36mg，58％)。EI-MSm/z:[M+H]+1582.9,[M+Na]+1604.5。
化合物39b的制备
将化合物39a(35mg，0.022mmol)和三苯基膦(1.5mg，0.005mmol)溶于DCM(2mL)中。在室温下将吡咯烷(0.0025mL，0.026mmol)和Pd(PPh3)4(1.3mg，0.001mmol)加入到反应混合物中，然后搅拌2小时。将反应混合物用H2O(50mL)稀释并用正丁醇(2×50mL)萃取。将合并的有机层用无水MgSO4干燥，减压蒸发。将得到的残余物溶于DMSO(1mL)中并通过HPLC纯化以生产白色固体化合物39b(34mg，粗品)。EI-MSm/z:[M+H]+:1542.7。
化合物39c的制备
将DIPEA(0.0026mL，0.039mmol)和PyBOP(4.7mg，0.023mmol)加入到化合物39b(15mg，0.009mmol)和化合物16c(2.0mg，0.0038mmol)的DMF(0.3mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌13小时后，将反应混合物溶解于DMSO(1.5mL)中并通过HPLC纯化以生产白色固体化合物39c(12mg，35％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1788.5。
化合物39d的制备
在0℃向化合物39c(12mg，0.0033mmol)的MeOH(1mL)溶液中加入LiOH一水合物(1.4mg，0.033mmol)的H2O(1mL)溶液。在0℃2小时后，用醋酸将溶液的pH值调节至4-5，并将反应混合物减压浓缩。将得到的残余物溶于DMSO(1.5mL)中并通过HPLC纯化以生产化合物39d(11mg，98％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1648.6。
化合物39e的制备
在0℃将TFA(0.5mL)加入到化合物39d(11mg，0.003mmol)的DCM(3.0mL)的搅拌溶液中。在0℃2小时后，通过N2流除去溶剂和过量的TFA。然后将残余物溶于DMSO(1mL)中并通过HPLC纯化以生产白色固体化合物39e(1.2mg，11％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1598.3。
实施例59.化合物40c的制备
化合物40a的制备
将DIPEA(0.004mL，0.021mmol)和HBTU(5.0mg，0.013mmol)加入到化合物39b(20mg，0.012mmol)和化合物25d(5.0mg，0.005mmol)的DMF(1.5mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物溶解于DMSO(1.0mL)中并通过HPLC纯化以生产化合物40a(14.5mg，30％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1998.8。
化合物40b的制备
在0℃向化合物40a(10mg，0.0025mmol)的MeOH(1mL)溶液中加入LiOH一水合物(1.0mg，0.025mmol)的H2O(1mL)溶液。在0℃2小时后，用醋酸中和反应混合物并减压浓缩。然后将残余物溶于DMSO(1.5mL)中并通过HPLC纯化以生产化合物40b(6.9mg，74％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1858.3。
化合物40c的制备
将TFA(0.2mL)加入到化合物40b(6.9mg，0.0018mmol)的DCM(2.0mL)的搅拌溶液中。在0℃搅拌2小时后，通过N2流除去溶剂和过量的TFA。然后将残余物溶于DMSO(1mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干以生产白色固体化合物40c(1.5mg，23％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1808.6。
实施例60.化合物41c的制备
化合物41a的制备
将DIPEA(0.116mL，0.66mmol)和PyBOP(127mg，0.24mmol)加入化合物16c(280mg，0.22mmol)和化合物1j(587mg，1.10mmol)的DMF(10mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌2小时后，将反应混合物用H2O(200mL)稀释并用EtOAc(2×100mL)萃取。将合并的有机层用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物以生产化合物41a(250mg，64％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+883.2,[M+H]+1766。
化合物41b的制备
将DIPEA(0.0017mL，0.0096mmol)和PyBOP(2.0mg，0.0038mmol)加入到化合物41a(5.7mg，0.0032mmol)和化合物39b(5.0mg，0.0032mmol)的DMF(0.5mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌3小时后，将反应混合物溶解于MeCN(1mL)中并通过HPLC纯化以生产化合物41b(8.0mg，75％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1645。
化合物41c的制备
在0℃向化合物41b(8.0mg，0.0024mmol)的MeOH(0.5mL)溶液中加入LiOH一水合物(1.2mg，0.028mmol)的H2O(0.1mL)溶液。在0℃2小时后，用2N HCl水溶液中和反应混合物并减压浓缩。将所得残余物用DCM(2mL)和H2O(3滴)稀释。然后在0℃加入TFA(0.1mL)。在0℃2小时后，通过N2流除去溶剂和过量的TFA。然后将残余物溶于DMSO(1mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干以生产白色固体化合物41c(3.1mg，44％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1448,1/2[M+Na]+1459。
实施例61.化合物42d的制备
化合物42a的制备
将DIPEA(0.026mL，0.23mmol)和HBTU(22mg，0.06mmol)加入到化合物1j(60mg，0.048mmol)和化合物25d(214mg，0.19mmol)的DMF(3mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物溶解于DMSO(1.0mL)中并通过HPLC纯化以生产化合物42a(64mg，58％)。EI-MSm/z:[M+H]+2286.8。
化合物42b的制备
将DIPEA(0.011mL，0.06mmol)和HBTU(14mg，0.036mmol)加入到化合物42a(68mg，0.03mmol)和化合物39b(46mg，0.03mmol)的DMF(3mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物溶解于DMSO(1.0mL)中并通过HPLC纯化以生产化合物42b(60mg，52％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1906.3。
化合物42c的制备
在0℃向化合物42b(60mg，0.016mmol)的MeOH(2mL)溶液中加入LiOH一水合物(5mg，0.126mmol)的H2O(2mL)溶液。在0℃2小时后，用醋酸中和反应混合物并减压浓缩。然后将残余物溶于DMSO(1mL)中并通过HPLC制备纯化以生产化合物42c(37mg，65％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1759.3。
化合物42d的制备
将TFA(0.3mL)加入到化合物42c(37mg，0.01mmol)的DCM(3mL)的搅拌溶液中。在0℃搅拌2小时后，通过N2流除去溶剂和过量的TFA。然后将残余物溶于DMSO(1mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干以生产白色固体化合物42d(15mg，45％)。EI-MSm/z:1/2[M+H]+1659.6。
实施例62.化合物43i的制备
化合物43a的制备
将DIPEA(10.4mL，23.8mmol)和HBTU(13.5g，35.7mmol)加入到H-Lys(z)-OMe盐酸盐(7.0g，23.8mmol)和化合物24e(9.86mg，23.8mmol)的DMF(50mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌8小时后，将反应混合物用水(100mL)稀释并用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机层用0.5N HCl水溶液HCl(50mL)，NaHCO3饱和水溶液(50mL)和盐水(50mL)依次洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并减压浓缩后，通过柱色谱纯化得到的粗产物以生产化合物43a(9.3g，57％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.22(d,1H),7.37-7.29(m,15H),7.22(m,2H),5.00(s,6H),4.18(m,1H),4.00(m,1H),3.59(s,3H),2.96(m,4H),1.67-1.50(m,4H),1.38-1.29(m,4H),1.19-1.18(m,4H).EI-MSm/z:[M+Na]+712.96。
化合物43b的制备
在0℃和氮气下向化合物43a(9.3g，13.5mmol)的THF:MeOH:H2O(60mL:30mL:30mL)溶液中加入LiOH一水合物(1.13g，26.9mmol)。2小时后，将反应混合物用1N HCl水溶液酸化至pH值4，并用EtOAc(3×100mL)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥。过滤并减压浓缩以得到化合物43b(9.1g，粗品)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+677.48,2[M+H]+1353.82。
化合物43c的制备
将DIPEA(1.47mL，8.44mmol)，HOBt(484mg，3.58mmol)和EDC·HCl(809mg，4.22mmol)加入到化合物43b(2.5g，3.71mmol)和化合物3e(1.8g，3.38mmol)的DMF(20mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入水(50mL)中并用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机层用0.5N HCl水溶液(50mL)，NaHCO3饱和水溶液(50mL)和盐水(50mL)依次洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并减压浓缩后，通过柱色谱纯化所得的残余物以生产化合物43c(2.3g，59％)。EI-MSm/z:[M+H]+1155.92,[M+H-Boc]+1055.83。
化合物43d的制备
向化合物43c(2.3g，1.99mmol)和Pd/C(10wt.％，424mg，3.98mmol)的MeOH(200mL)的搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.99mL，3.98mmol)。在氢气和室温下搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(100mL)洗涤。将滤液浓缩以生产化合物43d(1.5g，粗品)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+753.29。
化合物43e的制备
将DIPEA(0.14mL，0.80mmol)，HOBt(59mg，0.43mmol)和EDC·HCl(102mg，0.53mmol)加入到化合物43d(2.5g，3.71mmol)和化合物25b(150g，0.46mmol)的DMF(5mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入水(50mL)中并用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机层用1N HCl水溶液(30mL)，NaHCO3饱和水溶液(30mL)和盐水(30mL)依次洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并减压浓缩后，通过柱色谱纯化得到的粗产物以生产无色油状化合物43e(100mg，45％)。EI-MSm/z:[M+Na]+1685.11,1/2[M+H-Boc]+731.82。
化合物43f的制备
向化合物43e(100mg，0.06mmol)和Pd/C(10wt.％，20mg0.192mmol)的MeOH(20mL)的搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.045mL，0.18mmol)。在氢气和室温下搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(30mL)洗涤。将滤液浓缩以生产棕色泡沫化合物43f(95mg)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+1586.30,1/2[M+H]+793.02。
化合物43g的制备
将DIPEA(0.030mL，0.170mmol)和HBTU(36mg，0.094mmol)加入到化合物43f(45mg，0.028mmol)和化合物1j(114mg，0.091mmol)的DMF(3mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌16小时后，将反应混合物溶解于H2O/DMSO(1.5mL/1.5mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并浓缩以生产化合物43g(31mg，21％)。EI-MSm/z:1/3[M+H-Boc]+1705.74,1/4[M+H-2Boc]+1254.79。
化合物43h的制备
在-20℃向化合物43g(31mg，0.006mmol)的MeOH(1mL)溶液中加入LiOH一水合物(3.7mg，0.088mmol)的H2O(1mL)溶液。在-20℃搅拌2小时后，用醋酸中和反应混合物并减压浓缩。然后将反应混合物溶解在H2O/DMSO(1.5mL/1.5mL)中并通过HPLC纯化以生产白色固体化合物43h(18mg，64％)。EI-MSm/z:1/3[M+H-Boc]+1735.19,1/4[M+H]+1301.95,1/5[M+H-Boc]+1021.71。
化合物43i的制备
在0℃将TFA(0.3mL)加入到化合物43h(18mg，0.004mmol)的DCM(1.0mL)的搅拌溶液中。搅拌1小时后，通过N2流除去溶剂和过量的TFA。然后将残余物溶于H2O/MeCN(1mL/1mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干以生产白色固体化合物43i(6mg，33％)。EI-MSm/z:1/3[M+H]+1547.75,1/4[M+H]+1161.14。
实施例63.化合物43j的制备
通过制备实施例62中的化合物43i的类似方法由化合物1i和化合物43f制备化合物43j。EI-MSm/z:1/3[M+H]+1532.37,1/4[M+H]+1149.69。
实施例64.化合物44i的制备
化合物44a的制备
将DIPEA(1.9mL，11.0mmol)和HBTU(2.5g，6.64mmol)加入到化合物H-Lys(z)-OMe盐酸盐(1.3g，4.43mmol)和化合物43b(3.0g，4.43mmol)的DMF(30mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物用水(100mL)稀释并用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机层用0.5N HCl水溶液(50mL)，NaHCO3饱和水溶液(50mL)和盐水(50mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并减压浓缩后，通过柱色谱纯化所得的残余物以生产化合物44a(3.9g，93％)。EI-MSm/z:[M+H]+953.42。
化合物44b的制备
在氮气和室温下向化合物44a(2.1g，2.20mmol)的THF:MeOH:H2O(24mL:8mL:8mL)溶液中加入LiOH一水合物(185mg，4.40mmol)。2小时后，将反应混合物用1N HCl水溶液酸化至pH值4，并用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥。过滤并减压浓缩以得到化合物44b(2.0g)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+939.35,[M+Na]+961.37。
化合物44c的制备
将DIPEA(0.93mL，5.33mmol)和HBTU(1.21g，3.20mmol)加入到化合物44b(2.0g，2.13mmol)和化合物3e(1.14g，2.13mmol)的DMF(20mL)的搅拌混合物中在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物倒入水(50mL)中并用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机层用0.5N HCl水溶液(50mL)，NaHCO3饱和水溶液(50mL)和盐水(50mL)依次洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并减压浓缩后，通过柱色谱纯化所得的残余物以生产化合物44c(2.60g，86％)。EI-MSm/z:[M+H]+1418.44,[M+Na]+1440.39,[M+H-Boc]+1318.47。
化合物44d的制备
向化合物44c(2.60g，1.83mmol)和Pd/C(10wt.％，781mg7.34mmol)的MeOH(50mL)的搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.9mL，3.67mmol)。然后在氢气和室温下将反应物搅拌2小时。将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(50mL)洗涤。将滤液浓缩以生产黄色形式的化合物44d(1.73g)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+H]+881.90。
化合物44e的制备
将DIPEA(1.58mL，9.08mmol)和HBTU(2.58g，6.81mmol)加入到化合物44d(1.0g，1.13mmol)和化合物25b(1.82g，5.67mmol)的DMF(20mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物用水(100mL)稀释并用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机层用0.5N HCl(50mL)，NaHCO3饱和水溶液(50mL)和盐水(50mL)依次洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤并在减压下浓缩后，通过柱色谱纯化得到的残余物已生产化合物44e(848mg，36％)。EI-MSm/z:1/2[M+H-2Boc]+947.63。
化合物44f的制备
向化合物44e(848mg，0.40mmol)和Pd/C(10wt.％，172mg，1.62mmol)的MeOH(50mL)的搅拌混合物中加入HCl(4N在1,4-二恶烷中，0.4mL，1.62mmol)。在氢气和室温下搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用MeOH(50mL)洗涤。将滤液浓缩以生产化合物44f(625mg，粗品)，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:1/2[M+H]+996.40,1/3[M+H]+664.59。
化合物44g的制备
将DIPEA(0.067mL，0.386mmol)和HBTU(110mg，0.289mmol)加入到化合物44f(96mg，0.048mmol)和化合物1j(303mg，0.24mmol)的DMF(3mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌16小时后，将反应混合物溶解于H2O/DMSO(1.5mL/1.5mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并浓缩以生产化合物44g(67mg，20％)。EI-MSm/z:1/3[M+H]+2315.93,1/4[M+H]+1737.60,1/5[M+H]+1390.37。
化合物44h的制备
在-20℃向化合物44g(67mg，0.009mmol)的MeOH(1mL)溶液中加入LiOH一水合物(8.1mg，0.192mmol)的H2O(1mL)溶液。在-20℃搅拌2小时后，用醋酸中和反应混合物并减压浓缩。然后将反应混合物溶解于H2O/DMSO(1.5mL/1.5mL)中并通过HPLC纯化以生产白色固体化合物44h(27.9mg，45％)。EI-MSm/z:1/3[M+H]+2110.24,1/4[M+H]+1582.97,1/4[M+H-Boc]+1557.91。
化合物44i的制备
在0℃将TFA(0.3mL)加入到化合物44h(27.9mg，0.004mmol)的DCM(1.0mL)的搅拌溶液中。搅拌1小时后，通过N2流除去溶剂和过量的TFA。然后将残余物溶于H2O/MeCN(1mL/1mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干以生产白色固体化合物44i(13.6mg，50％)。EI-MSm/z:1/3[M+H]+2043.49,1/4[M+H]+1532.96,1/5[M+H]+1226.62。
实施例65.化合物44j的制备
通过制备实施例64中的化合物44i的类似方法由化合物1i和化合物44f制备化合物44j。EI-MSm/z:1/3[M+H]+2025.37,1/4[M+H]+1519.10,1/5[M+H]+1215.60。
实施例66.化合物45k的制备
化合物L的制备
在室温和氮气下将D-葡糖醛酸-6,3-内酯(25.0g，141.9mmol)溶于MeOH(250mL)中，并向其中缓慢加入NaOH(141mg)的MeOH(100mL)溶液。搅拌24小时后，将反应混合物减压浓缩，然后在10℃以下加入吡啶(66mL)和乙酸酐(71mL)。在室温下搅拌4小时后，将反应混合物减压浓缩并进行柱色谱以生产化合物L(41.6g，77％)。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ5.77(d,J＝7.8Hz,1H),5.31(t,J＝9.6Hz,1H),5.24(t,J＝9.6Hz,1H),5.14(m,1H),4.17(d,J＝9Hz,1H),3.74(s,3H),2.12(s,3H),2.04(m,9H)。
化合物M的制备
在0℃和氮气下将化合物L(10.0g，26.6mmol)溶于HBr(33％的AcOH溶液，20mL)中。将反应混合物温热至室温。搅拌2小时后，加入甲苯(50mL)并将混合物减压浓缩。通过柱色谱纯化所得的残余物以生产化合物M(10.9g，99％)。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ6.64(d,J＝3.6Hz,1H),5.61(t,J＝3.6Hz,1H),5.24(t,J＝3.6Hz,1H),4.85(m,1H),4.58(d,d,J＝10.2Hz,1H),3.76(s,3H),2.10(s,3H),2.06(s,3H),2.05(s,3H)。
化合物45a的制备
在0℃和氮气下，将3-氨基-1-丙醇(3.0g，66.57mmol)溶于DCM(150mL)中，向其中加入二碳酸二叔丁酯(16g，73.23mmol)。在室温下将所得混合物搅拌12小时。反应完成后，减压浓缩溶剂。将残余物进行柱色谱以生产化合物45a(6.4g，92％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.78(s,1H),3.65(m,2H),3.30(m,2H),2.90(s,1H),1.68(m,2H),1.48(s,9H)。
化合物45b的制备
在0℃和氮气下将化合物45a(6.04g，34.47mmol)和三乙胺(14.4mL，103.4mmol)溶于THF中，然后用甲磺酸酐(7.21g，41.36mmol)缓慢处理。在室温和氮气下将所得混合物搅拌12小时。反应完成后，减压浓缩溶剂。将残余物进行柱色谱以生产化合物45b(9.01g，98％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.73(s,1H),4.30(t,J＝5.9Hz,2H),3.31-3.24(m,2H),3.04(s,3H),1.94(t,J＝6.1Hz,2H),1.44(s,9H)。
化合物45c的制备
在氮气和室温下将化合物45b(3.0g，11.84mmol)溶于DMF(40mL)中，然后用NaN3(924mg，14.21mmol)处理，并将所得混合物在60℃搅拌12小时。反应完成后，向其中加入EtOAc(50mL)，蒸馏水(50mL)和1N HCl水溶液(5mL)。将有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物进行柱色谱以生产化合物45c(2.3g，99％)。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ4.63(s,1H),3.36(t,J＝6.6Hz,2H),3.24-3.18(m,2H),1.80-1.75(m,2H),1.45(s,9H)。
化合物45d的制备
在0℃和氮气下将化合物45c(3.8g，18.98mmol)溶于DCM(10mL)中，然后向其中缓慢加入4M-HCl的二恶烷溶液(10mL)。搅拌12小时后，将反应混合物减压浓缩以生产化合物45d(2.5g，99％)。1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.06(s,3H),3.47(t,J＝6.6Hz,2H),2.82(t,J＝7.2Hz,2H),1.84-1.79(m,2H)。
化合物45e的制备
在0℃和氮气下将化合物45d(58mg，0.42mmol)和5-甲酰基水杨酸(100mg，0.60mmol)溶于DMF(2mL)中，然后加入DIPEA(0.2mL，1.20mmol)和PyBop(375mg，0.72mmol)加入到反应混合物中。在室温下搅拌3小时后，向其中加入EtOAc(30mL)和蒸馏水(10mL)。将有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物进行柱色谱以得到化合物45e(82mg，79％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ13.39(s,1H),9.87(s,1H),8.29(s,1H),7.89(dd,J＝1.6,7.2Hz.1H),7.60(s,1H),7.10(d,J＝8.8Hz,1H),3.63-3.57(m,2H),3.48(t,J＝6.4Hz,2H),1.99-1.92(m,2H)。
化合物45f的制备
在室温和氮气下将化合物45e(78mg，0.31mmol)和化合物M(125mg，0.31mmol)溶于MeCN(3mL)中，然后加入氧化银(291mg，1.26mmol)和分子筛(125mg)。在室温下搅拌3小时后，将该混合物进行硅藻土过滤，并将滤液减压浓缩。将残余物进行柱色谱以生产化合物45f(160mg，90％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ10.00(s,1H),8.66(d,J＝2.4Hz,1H),8.02(dd,J＝2.0,6.4Hz,1H),7.46(t,J＝6.4Hz,1H),7.14(d,J＝8.4Hz,1H),5.48-5.33(m,4H),4.28(d,J＝8.8Hz,1H),3.74(s,3H),3.73-3.64(m,1H),3.50-3.42(m,3H),2.09-2.07(m,9H),2.00-1.92(m,2H)。
化合物45g的制备
在0℃和氮气下将化合物45f(160mg，1.51mmol)溶于2-丙醇(0.4mL)和氯仿(2mL)中，然后向其中加入硅胶(2g)和硼氢化钠(27mg，0.71mmol)。在0℃搅拌2小时后，将反应物硅藻土过滤，并将滤液减压浓缩。将残余物进行柱色谱以生产化合物45g(115mg，71％)。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ8.06(d,J＝2.4Hz,1H),7.50-7.44(m,2H),7.01(d,J＝9.0Hz,1H),5.45-5.31(m,4H),4.38(s,2H),4.22(d,J＝9.0Hz,1H),3.74(s,3H),3.67-3.61(m,1H),3.46-3.41(m,3H),2.07-2.04(m,9H),1.97-1.91(m,2H)。
化合物45h的制备
在0℃和氮气下将化合物45g(100mg，0.18mmol)溶于DMF(1mL)中，然后向其中加入二(4-硝基苯)碳酸酯(110mg，0.35mmol)和DIPEA(0.050mL，0.27mmol)。在室温下搅拌2小时后，向其中加入EtOAc(30mL)和蒸馏水(10mL)。将有机层用无水Na2SO4干燥并减压浓缩。将残余物进行柱色谱以生产化合物45h(75mg，58％)。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ8.29-8.27(m,2H),8.23(d,J＝2.4Hz,1H),7.54(dd,J＝2.4,6.6Hz,1H),7.49(t,J＝6.4Hz,1H),7.39-7.37(m,2H),7.04(d,J＝8.4Hz,1H),5.45-5.29(m,4H),5.28(s,2H),4.23(d,J＝9.0Hz,1H),3.75(s,3H),3.68-3.64(m,1H),3.46-3.42(m,3H),2.08-2.05(m,9H),1.98-1.93(m,2H)。
化合物45i的制备
在室温和氮气下将化合物45h(50mg，0.068mmol)溶于DMF(0.8mL)中，然后向其中加入MMAF-OMe(51mg，0.068mmol)。将所得混合物用HOBT(2mg，0.013mmol)，吡啶(0.24mL)和DIPEA(0.012mL，0.068mmol)处理。在室温下搅拌18小时后，向其中加入EtOAc(20mL)和蒸馏水(10mL)。将有机层用无水Na2SO4干燥并减压浓缩。将残余物进行柱色谱以生产化合物45i(71mg，78％)。EI-MSm/z:[M+H]+1339。
化合物45j的制备
在室温和氮气下将化合物45i(30mg，0.022mmol)和苯基乙炔(3.7μL，0.033mmol)溶于EtOH(0.2mL)和水(30μL)中，然后向其中加入0.1MCuSO4水溶液(30μL)和1.0M抗坏血酸钠水溶液(30μL)。将所得混合物用HOBT(2mg，0.013mmol)，吡啶(0.24mL)和DIPEA(12μL，0.068mmol)处理。在室温下搅拌5小时后，向其中加入EtOAc(20mL)和蒸馏水(5mL)。将有机层经无水Na2SO4干燥并减压浓缩。将残余物进行柱色谱以生产化合物45j(26mg，81％)。EI-MSm/z:[M+H]+1441。
化合物45k的制备
在0℃和氮气下将化合物45j(20mg，0.013mmol)溶于MeOH(0.2mL)中，然后向其中加入LiOH·H2O(6mg，0.14mmol)的水(0.2mL)溶液。在室温下搅拌1小时后，加入氯仿(10mL)，MeOH(1mL)，蒸馏水(10mL)和0.5N HCl水溶液。向其中加入HCl(1mL)。将有机层用无水Na2SO4干燥并减压浓缩。将残余物进行柱色谱以生产化合物45k(17mg，87％)。EI-MSm/z:[M+H]+1286。
实施例67.化合物46b的制备
化合物46a的制备
在0℃和氮气下将5-甲酰基水杨酸(1.0g，6.02mmol)溶于DMF(20mL)中，然后向其中加入N-溴代琥珀酰亚胺(1.07g，6.11mmol)，并将混合物在70℃搅拌3小时。反应完成后，向其中加入EtOAc(100mL)，2N HCl水溶液(2mL)和蒸馏水(100mL)。将有机层用无水Na2SO4干燥并减压浓缩。将残余物进行柱色谱以生产化合物46a(1.2g，84％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.64(s,1H),8.19(d,J＝2.4Hz,1H),8.00(d,J＝2.0Hz,1H),3.16(s,1H)。
化合物46b的制备
通过制备实施例4中的化合物2h的类似方法由化合物46a制备化合物46b。EI-MSm/z:[M+H]+1328。
实施例68至70.化合物47a，化合物48a和化合物49a的制备
采用韩国专利公开公报号10-2014-0035393中公开的方法制备化合物N。
实施例68.化合物47a的制备
在室温和氮气下将化合物2h(20mg，0.014mmol)溶解于EtOH(0.7mL)中，然后向其中加入化合物N(3.7mg，0.017mmol)，在45℃下搅拌2小时。反应完成后，使用HPLC获得化合物47a(10.2mg，49％)。EI-MSm/z:[M+H]+1441。
实施例69和70.化合物48a和49a的制备
通过制备实施例68中的化合物47a的类似方法制备化合物48a(实施例69)和化合物49a(实施例70)。化合物48a的EI-MS为m/z:[M+H]+1353，化合物49a的EI-MS为m/z:[M+H]+1520。
比较例66.化合物50k的制备
化合物50a的制备
在室温和氮气下将4-溴丁酸乙酯(5.0mL，34.6mmol)溶于MeOH(75mL)中，然后向其中加入NaN3(4.5g，69.2mmol)的水(25mL)溶液，并在85℃搅拌8小时。反应完成后，将溶剂减压浓缩，向其中加入氯仿(300mL)，蒸馏水(200mL)。将如上所述获得的有机层用无水Na2SO4干燥并减压浓缩。将残余物进行柱色谱以生产化合物50a(5.1g，94％)。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ4.15(q,J＝7.2Hz,2H),3.36(t,J＝7.2Hz,2H),2.41(t,J＝7.2Hz,2H),1.94-1.89(m,2H),1.28(t,J＝8.4Hz,3H)。
化合物50b的制备
在0℃和氮气下将化合物50a(2.0g，12.7mmol)溶于MeOH(32mL)中，然后向其中缓慢加入KOH(3.56g，63.6mmol)的水(26mL)溶液。在室温下搅拌6小时后，将溶剂减压浓缩，向其中加入氯仿(300mL)，1N HCl水溶液(100mL)和蒸馏水(100mL)。将如上所述获得的有机层用无水Na2SO4干燥并减压浓缩。将得到的残余物进行柱色谱以生产化合物50b(1.28g，78％)。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ3.38(t,J＝7.2Hz,2H),2.48(t,J＝7.2Hz,2H),1.95-1.90(m,2H)。
化合物50c的制备
在0℃和氮气下将化合物50b(850mg，6.58mmol)溶于MeOH(10mL)中，然后向其中加入草酰氯(1.1mL，13.2mmol)和DMF(1滴)，并在室温下搅拌6小时。反应完成后，将溶剂减压浓缩以生产化合物50c(965mg)，其不经进一步纯化而使用。
化合物50d的制备
在0℃和氮气下将4-羟基-3-硝基苯甲酸(5.0g，27.3mmol)溶于THF(120mL)中，然后向其中加入1MBH3-THF复合物(54.6mL，54.6mmol)，并在室温搅拌20小时。反应完成后，向其中加入EtOAc(200mL)，0.5N HCl水溶液(20mL)和蒸馏水(100mL)。将如上所述获得的有机层用无水Na2SO4干燥并减压浓缩。将得到的残余物进行柱色谱以生产化合物50d(4.2g，91％)。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ8.06(d,J＝1.2Hz,1H),7.59(dd,J＝1.2,7.8Hz,1H),7.12(d,J＝8.4Hz,1H),4.83(s,2H)。
化合物50e的制备
在室温和氮气下将化合物50d(937mg，5.54mmol)溶于MeCN(15mL)中，向其中加入化合物M(2.0g，5.04mmol)，氧化银(4.66g，20.1mmol)和分子筛(2.0g)，并在室温下搅拌14小时。反应完成后，用硅藻土过滤混合物，并将滤液减压浓缩。将得到的残余物进行柱色谱以生产化合物50e(1.0g，40％)。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ7.81(d,J＝1.8Hz,1H),7.54(dd,J＝1.8,6.6Hz,1H),7.37(d,J＝8.4Hz,1H),5.37-5.27(m,3H),5.20(d,J＝6.6Hz,1H),4.72(d,J＝6.0Hz,2H),4.21(d,J＝9.0Hz,1H),3.75(s,3H),2.12(s,3H),2.06(s,3H),2.05(s,3H),2.04-2.02(m,1H)。
化合物50f的制备
将化合物50e(900mg，6.35mmol)溶于EtOAc(100mL)中，然后向其中加入氧化铂(IV)(84.2mg，0.370mmol)，并在室温和氢气下搅拌3小时。反应完成后，用硅藻土过滤混合物，并将滤液减压浓缩以生产化合物50f(700mg，83％)，其不经进一步纯化而使用。
化合物50g的制备
在0℃和氮气下将化合物50f(350mg，0.77mmol)溶于DCM(10mL)中，然后向其中加入化合物50c(136mg，0.92mmol)和DIPEA(0.27mL，1.54mmol)，并在室温下搅拌20分钟。反应完成后，向其中加入EtOAc(50mL)和蒸馏水(50mL)。将如上所述获得的有机层用无水Na2SO4干燥并减压浓缩。将得到的残余物进行柱色谱以生产化合物50g(280mg，65％)。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ8.37(d,J＝1.2Hz,1H),8.00(s,1H),7.07(dd,J＝1.8,6.6Hz,1H),6.93(d,J＝8.4Hz,1H),5.43-5.28(m,3H),5.06(d,J＝7.8Hz,1H),4.63(s,2H),4.19(d,J＝9.6Hz,1H),3.76(s,3H),3.44-3.41(m,2H),2.56(t,J＝7.8Hz,2H),2.17-2.00(m,12H)。
化合物50h的制备
在0℃和氮气下将化合物50g(250mg，0.44mmol)溶于DMF(4mL)中，然后向其中加入双(4-硝基苯)碳酸酯(270mg，0.88mmol)和DIPEA(0.12mL，0.66mmol)，并在室温下搅拌1小时。反应完成后，向其中加入EtOAc(50mL)和蒸馏水(50mL)。将如上所述获得的有机层用无水Na2SO4干燥并减压浓缩。将得到的残余物进行柱色谱以生产化合物50h(290mg，90％)。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ8.54(d,J＝1.8Hz,1H),8.28-8.25(m,2H),8.02(s,1H),7.40-7.36(m,2H),7.11(dd,J＝1.8,6.6Hz,1H),6.96(d,J＝8.4Hz,1H),5.44-5.29(m,3H),5.23(s,2H),5.10(d,J＝7.8Hz,1H),4.21(d,J＝9.6Hz,1H),3.76(s,3H),3.45-3.42(m,2H),2.58(t,J＝7.2Hz,2H),2.11-2.00(m,12H)。
化合物50i的制备
在室温和氮气下将化合物50h(250mg，0.34mmol)溶于DMF(4mL)中，然后向其中加入MMAF-OMe(255mg，0.34mmol)。将所得混合物用HOBT(9mg，0.068mmol)，吡啶(1.2mL)和DIPEA(0.060mL，0.34mmol)处理。在室温下搅拌2天后，向其中加入EtOAc(50mL)，2N HCl水溶液(5mL)和蒸馏水(50mL)。将如上所述获得的有机层经用无水Na2SO4干燥并减压浓缩。将残余物进行柱色谱以生产化合物50i(340mg，74％)。EI-MSm/z:[M+H]+1339。
化合物50j的制备
在0℃和氮气下将化合物50i(210mg，0.156mmol)溶于MeOH(2mL)中，然后向其中加入LiOH·H2O(66mg，1.56mmol)的水(2mL)溶液。在室温下搅拌1.5小时后，向其中加入氯仿(50mL)，MeOH(5mL)，蒸馏水(50mL)和0.5N HCl水溶液。向其中加入HCl(5mL)。将如上所述获得的有机层用无水Na2SO4干燥并减压浓缩。将所得残余物进行柱色谱以生产化合物50j(107mg，57％)。EI-MSm/z:[M+H]+1184。
化合物50k的制备
在室温和氮气下将化合物50j(10mg，0.008mmol)和苯基乙炔(0.92μL，0.008mmol)溶于EtOH(0.15mL)和水(10μL)中，然后向其中加入0.1MCuSO4水溶液(10μL)和1.0M抗坏血酸钠水溶液(10μL)。在室温下搅拌5小时后，向其中加入EtOAc(10mL)和蒸馏水(5mL)。将如上所述获得的有机层用无水Na2SO4干燥并减压浓缩。将得到的残余物进行柱色谱以生产化合物50k(5mg，46％)。EI-MSm/z:[M+H]+1286。
实施例71.化合物51h的制备
通过与制备实施例23中的化合物14h的方法类似的方法由化合物7b制备化合物51a。EI-MSm/z:[M+H]+1392.8,[M+H-Boc]+1292.7,[M+Na]+1414.8。
化合物51b的制备
在0℃将化合物51a(1.8g，1.29mmol)，丙炔胺(0.1mL，1.55mmol)和无水HOBt(35mg，0.25mmol)溶于DMF(5mL)中，然后加入吡啶(0.2mL)和DIPEA(0.45mL，2.59mmol)。在氮气和室温下搅拌24小时后，将反应混合物用H2O(100mL)和NH4Cl饱和水溶液(50mL)稀释。用EtOAc(2×100mL)萃取后，将合并的有机层用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化残余物以生产化合物51b(1.15g，68％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.01(s,1H),7.48-7.31(m,2H),7.02(d,J＝8.4Hz,1H),5.45-5.20(m,4H),5.09(s,2H),4.19(d,J＝9.2Hz,1H),4.10-4.05(m,2H),3.97(s,2H),3.85-3.45(m,49H),2.24(s,1H),2.05(s,9H),1.53(s,18H).EI-MSm/z:[M+Na]+1330.3。
化合物51c的制备
在0℃向化合物51b(1.15g，0.879mmol)的THF/MeOH(20mL/20mL)溶液中加入LiOH一水合物(151mg，3.603mmol)的H2O(20mL)溶液。在0℃2小时后，用醋酸中和反应混合物并减压浓缩。将所得残余物溶于DMSO(5mL)中并通过HPLC制备纯化以生产化合物51c(600mg，60％)。EI-MSm/z:[M+H]+1169.2。
化合物51d的制备
将DIPEA(0.92mL，5.30mmol)和HBTU(1.0g，2.64mmol)加入到4-叠氮基丁酸(228mg，1.76mmol)和N-Me-Ala-OMe(298mg，1.94mmol)的DMF(10mL)的搅拌混合物中。在氮气和室温下搅拌14小时后，将反应混合物用H2O(50mL)稀释并用EtOAc(2×50mL)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化所得的残余物以得到化合物51d(310mg，77％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ5.22(q,1H),3.71(s,3H),3.39(t,J＝6.6Hz,2H),2.95(s,3H),2.52-2.39(m,2H),1.98-1.92(m,2H),1.41(d,3H)。
化合物51e的制备
在-20℃向化合物51d(310mg，1.36mmol)的MeOH(3mL)溶液中加入LiOH一水合物(114mg，2.72mmol)的H2O(3mL)溶液。在0℃搅拌1小时后，将反应混合物用H2O/2N HCl水溶液(50mL/2mL)稀释中并用Et2O(2×30mL)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥。过滤并浓缩以生产化合物51e(246mg)，其不经进一步纯化而使用。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ5.15(q,1H),3.39(t,J＝6.6Hz,2H),2.98(s,3H),2.49-2.45(m,2H),1.98-1.92(m,2H),1.41(d,3H)。
化合物51f的制备
在氮气下向美登木醇(50mg，0.088mmol)和化合物51e(113mg，0.528mmol)的DCM(6mL)溶液中加入DIC(0.087mL，0.557mmol)的DCM(1.4mL)溶液。1分钟后，加入ZnCl2(1M的Et2O溶液，0.11mL，0.11mmol)溶液。在室温下搅拌2小时后，将反应混合物用EtOAc(10mL)稀释。将有机层用NaHCO3饱和水溶液(4mL)和盐水(2mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥并减压蒸发。通过柱色谱纯化所得的残余物以得到非对映体美登木素化合物51f(50mg，74％)的混合物。EI-MSm/z:[M+H]+761.7。
化合物51g的制备
将CuSO4·5H2O(2mg)和抗坏血酸钠(10mg)加入到化合物51f(78mg，0.102mmol)和化合物51c(132mg，0.112mmol)的DMSO(4mL)和H2O(1mL)的搅拌混合物中。通过加入1MNa2CO3水溶液将pH值调节至约7。在20℃搅拌1小时后，将反应混合物溶解于H2O/DMSO(1.5mL/1.5mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并浓缩以生产化合物51g(72.1mg，37％)。EI-MSm/z:[M+H]+1930.9,[M+H-Boc]+1830.9。
化合物51h的制备
将TFA(0.2mL)加入到化合物51g(72.1mg，0.037mmol)的DCM(1mL)的搅拌溶液中。在0℃搅拌2小时后，通过N2流除去溶剂和过量的TFA。然后将残余物溶于H2O/MeCN(1mL/1mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干以生产白色固体化合物51h(更多极性异构体17mg和更少极性异构体6.0mg，36％)。EI-MSm/z:[M+H]+1730.8。
实施例72.化合物52c的制备
化合物52a的制备
在0℃将托利布林乙酯(TFA盐，80mg，0.029mmol)，化合物14h(128mg，0.0142mmol)和无水HOBt(3.5mg，0.026mmol)溶于DMF(3mL)中。然后加入吡啶(0.5mL)和DIPEA(0.045mL，0.26mmol)。在氮气和室温下搅拌24小时后，将反应混合物用H2O(10mL)稀释并用EtOAc(2×10mL)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化所得的残余物以得到化合物52a(70mg，43％)。EI-MSm/z:[M+H]+1258.6,[M+H-Boc]+1158.6。
化合物52b的制备
在-20℃向化合物52a(70mg，0.055mmol)的MeOH(1.4mL)溶液中加入LiOH一水合物(11.7mg，0.275mmol)的H2O(1.4mL)溶液。在0℃1小时后，用醋酸将溶液的pH值调节至4-5。将得到的溶液溶解于DMSO(1mL)中并通过HPLC纯化以生产白色固体化合物52b(4.5mg，8％)。EI-MSm/z:[M+H]+1090.4。
化合物52c的制备
在0℃向化合物52b(4.5mg，0.0041mmol)的DCM(1mL)溶液中加入TFA(0.2mL)。在0℃2小时后，通过N2流除去溶剂和过量的TFA。然后通过HPLC纯化残余物以生产白色固体化合物52c(2.4mg，59％)。EI-MSm/z:[M+H]+990.4。
实施例73.化合物53f的制备
化合物53b的制备
在0℃将化合物53a(300mg，0.31mmol，化合物53a由专利WO2013/055987A1中公开的方法制备)，化合物15a(355mg，0.31mmol)和无水HOBt(10mg，0.06mmol)溶于DMF(0.5mL)。然后加入吡啶(0.3mL)和DIPEA(0.14mL，0.78mmol)。在氮气和室温下搅拌23小时后，将反应混合物用H2O/NH4Cl饱和水溶液(100mL/50mL)稀释并用EtOAc(2×100mL)萃取。将合并的有机层用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化残余物以生产化合物53b(250mg，41％)。EI-MSm/z:[M+H]+1943.6,[M+Na]+1965.6。
化合物53c的制备
在0℃和氮气下向化合物53b(300mg，0.31mmol)的THF/H2O(2mL/1mL)的溶液中加入醋酸(3mL)。22小时后，将反应混合物用H2O(100mL)稀释并用EtOAc(2×100mL)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化所得的残余物以得到化合物53c(140mg，68％)。EI-MSm/z:[M+H]+1713.6。
化合物53d的制备
在氮气和室温下向化合物53c(120mg，0.07mmol)的DCM(10mL)溶液中加入氯铬酸吡啶鎓(158mg，0.42mmol)和分子筛(50mg)。搅拌18小时后，将反应混合物用硅藻土垫过滤并减压浓缩。得到的化合物53d(95mg，75％)为无色油状物，其不经进一步纯化而使用。EI-MSm/z:[M+Na]+1732.8。
化合物53e的制备
在0℃向化合物53d(95mg，0.056mmol)的MeOH(1mL)溶液中加入LiOH一水合物(12mg，0.278mmol)的H2O(1mL)溶液。在0℃2小时后，用醋酸中和反应混合物并减压浓缩。将得到的残余物溶于DMSO(1mL)中并通过HPLC制备纯化以生产化合物53e(6mg，7％)。EI-MSm/z:[M+H]+1569.7。
化合物53f的制备
将TFA(0.2mL)加入到化合物53e(6mg，0.004mmol)的DCM(2mL)的搅拌溶液中。在0℃搅拌2小时后，通过N2流除去溶剂和过量的TFA。然后将残余物溶于DMSO(1mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干以生产白色固体化合物53f(2.7mg，53％)。EI-MSm/z:[M+H]+1251.3。
实施例74.化合物54a的制备
通过制备实施例73中的化合物53f的类似方法由化合物53a和化合物14h制备化合物54a。
实施例75.化合物55a的制备
通过制备实施例73中的化合物53f的类似方法由化合物53a和化合物51a制备化合物55a。EI-MSm/z:[M+H]+1516.7,1/2[M+H]+758.7
实施例76.化合物56d的制备
化合物56b的制备
在0℃将化合物56a(盐酸盐，100mg，0.27mmol，通过Curr.Med.Chem.2009,16,1192-1213中公开的方法制备化合物56a)，化合物14h(242mg，0.27mmol)和无水HOBt(7.3mg，0.05mmol)溶于DMF(3mL)中。然后加入吡啶(0.4mL)和DIPEA(0.09mL，0.60mmol)。在氮气和室温下搅拌16小时后，用NH4Cl饱和水溶液(10mL)稀释反应混合物并用EtOAc(2×20mL)萃取。将合并的有机层用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化残余物以生产化合物56b(184mg，63％)。EI-MSm/z:[M+H]+1091.9,[M+H-Boc]+991.7。
化合物56c的制备
在-20℃向化合物56b(90mg，0.08mmol)的MeOH(2mL)溶液中加入LiOH一水合物(17mg，0.41mmol)的H2O(2mL)溶液。在-20℃搅拌2小时后，用醋酸中和反应混合物并减压浓缩。然后将反应混合物溶解于H2O/DMSO(1.5mL/1.5mL)中并通过HPLC纯化以生产黄色固体化合物56c(35mg，45％)。EI-MSm/z:[M+H]+951.7,[M+H-Boc]+851.5。
化合物56d的制备
在0℃将TFA(0.3mL)加入到化合物56c(35mg，0.04mmol)的DCM(2.0mL)的搅拌溶液中。搅拌1小时后，通过N2流除去溶剂和过量的TFA。然后将残余物溶于H2O/MeCN(1mL/1mL)中并通过HPLC纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干以生产黄色固体化合物56d(24.9mg，68％)。EI-MSm/z:[M+H]+851.6。
实施例77.化合物57a的制备
通过制备实施例76中的化合物56d的类似方法由化合物56a和化合物15a制备化合物57a。EI-MSm/z:[M+H]+983.3。
实施例78.ADC2合成
实施例79.ADC2合成
实施例80.ADC86合成
实施例81.ADC86合成
实施例82.ADC4合成
实施例83.ADC4合成
实施例84.ADC75合成
实施例85.ADC75合成
实验例1.关于β-葡糖醛酸糖酶的响应性比较试验。
为了比较实施例66的化合物45k和比较例66的化合物50k相对于β-葡糖醛酸苷酶的相互响应性，进行如下比较试验。
将实施例66的化合物45k和比较例66的化合物50k各自制备成500μM和50μM的DMSO储备溶液。其中分别将880μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液和100μL化合物45k和化合物50k储备溶液彼此混合(其最终浓度分别为50μM和5μM)以制备反应溶液。向反应溶液中加入20μL大肠杆菌β-葡糖醛酸酶(1mg/ml，Sigma：EC3.2.1.31型IX-A；1mg/mL于PBS中；3.6μg，13μmol)后，在37℃的恒温水浴中开始反应。在0分钟，25分钟，60分钟和90分钟分别分配100μL的混合溶液，并向其中加入200μL乙腈。对混合物样品进行离心(4℃，15分钟，14000rpm)以获得由每种上清液释放的MMAF，使用LC-MS/MS定量分析MMAF(该实验通过类似于美国专利号8,568,728中公开方法的方法进行，通过引用并入本文)。
试验结果如图2所示，从图2可以确认通过β-半乳糖苷酶酶反应后经1,6-消除反应MMAF明显迅速地从每个实施例66的化合物45k和比较例66的化合物50k释放出来(美国专利号8,568,728，通过引用并入本文)。
实验例2.血浆稳定性比较测试连接子毒素
比较实施例66的化合物45k和比较例66的化合物50k的血浆稳定性。
将10μL的化合物45k或50k以5mM溶解于DMSO中，将各组合物与990μL的小鼠血浆混合，从而制备50μM的样品以评价血浆稳定性。血浆/化合物溶液在37℃温育7天。在温育6天期间，在0，1，2和7天取100μL等分试样并与200μL含有内标的乙腈混合以监测血浆蛋白沉淀。通过离心乙腈/血浆样品(4℃，15分钟，14000rpm)获得上清液，通过对上清液进行LC-MS/MS定量每种化合物和产物的量(该实验使用类似于J.ChromatographyB，780：451-457(2002)中公开的那些方法进行)。
实施例66的化合物45k和比较例66的化合物50k的LS-MS/MS结果示于图3和表1。比较例66的化合物50k的稳定性和实施例66的化合物45k的稳定性分别为14％和80％(1天)。因此，实施例66的化合物45k在小鼠血浆中的稳定性优于比较例66的化合物50k在小鼠血浆中的稳定性。
表1.化合物45k和化合物50k在小鼠血浆中的稳定性
使用上述方法(图4-6)进行化合物47a，48a和49a的血浆稳定性。
实验例3.抗体-药物缀合物的制备
步骤1.异戊二烯化抗体的方法(根据韩国专利公开公报号10-2014-0035393的方法制备)
制备抗体的异戊二烯化反应混合物并在30℃下反应16小时。使用包含添加到每条轻链的C-末端的GGGGGGGCVIM序列(“G7CVIM”)的抗体。G7CVIM序列添加在重链(ADC86-91)或重链和轻链(ADC75-77)的C-末端。所用抗体的序列来源如下表2。
表2.ADC制备所使用的抗体列表
反应混合物由含有24μM抗体，200nM FTase(Calbiochem#344145)和144μM的LCB14-0606的缓冲溶液(50mM Tris-HCl(pH7.4)，5mM MgCl2，10μM ZnCl2，0.25mM DTT)(根据韩国专利公开公布号10-2014-0035393的方法内部制备，其通过引用并入本文)。反应完成后，通过FPLC纯化异戊二烯化抗体。
步骤2.制备ADC的方法
通过将100mM乙酸钠缓冲液(pH4.5，10％DMSO)，12μM异戊二烯化抗体和120μM连接子-毒素(室内)并在30℃温和地搅拌以制备异戊二烯化抗体和连接子-毒素之间的肟键形成反应混合物。将反应温育24小时后，经由FPLC和疏水相互作用色谱-HPLC通过脱盐来纯化抗体-药物缀合物。
表3.抗-HER2ADCs(DAR2)列表
表4.抗-HER2ADCs(DAR4)列表
表5.抗-HER2ADCs(DAR4<)列表
表6.使用鹅膏素作为有效载荷的抗-HER2ADCs列表
表7.使用靶向各种蛋白质的抗体的ADCs列表
实验例4.抗-HER2ADCs的细胞毒性
使用商品化的人乳腺癌细胞系MCF-7(HER2阴性至正常)，OE-19(HER2阳性)，NCI-N87(HER2阳性)，SK-OV-3(HER2阳性)，JIMT-1(HER2阳性)和SK-BR-3(HER2阳性)。根据市售细胞系提供的规格培养细胞系。
测量抗体，药物和缀合物相对于癌细胞系的抗增殖活性。将细胞以每孔1×104个细胞铺展在96孔组织培养板中。温育24小时后，以各种浓度加入抗体，药物和缀合物。使用SRB测定计数72小时后的活细胞的数量。使用SpectraMax 190(Molecular Devices，USA)在540nm处测量吸光度。
表8.不同抗-HER2ADCs(DAR2)的IC50值
表9.不同PEG长度-ADCs的IC50值
表10.具有不同类型连接子的MMAF ADCs的IC50值
ADC 连接子-毒素 SK-BR-3 JIMT-1 NCI-N87 SK-OV-3 MCF-7
ADC23 16f 0.05 0.12 0.35 0.44 >33.33
ADC34 25f 0.03 0.10 - - >33.33
ADC38 28e 0.03 0.05 - - >33.33
ADC40 29k 0.02 0.06 - - >33.33
ADC42 30c 0.03 0.04 - - >33.33
ADC44 31g 0.03 0.05 - - >33.33
ADC46 32d 0.04 0.08 - - >33.33
ADC48 33f 0.03 0.08 - - >33.33
ADC50 34f 0.03 0.05 - - >33.33
ADC53 37d 0.03 0.05 - - >33.33
ADC54 38b 0.05 0.12 - - >33.33
表11.具有不同类型连接子的MMAE ADCs的IC50值
表12.混合ADCs的IC50值
两种不同毒素缀合的ADCs和相同毒素缀合的ADCs的比较。
表13.各种DAR-ADCs的IC50值
实验例5.爱必妥(Erbitux，LC)-葡糖醛酸酯连接子-MMAF的细胞毒性
表达高水平EGFR的A431细胞和表达低水平EGFR的MCF-7细胞以约1000个细胞/孔铺展在96孔板的100μL培养基中。表达中等水平EGFR的HCC-827细胞以约5000个细胞/孔铺展在96孔板的100μL培养基中。细胞在37℃，5％CO2中温育24小时。然后，将单甲基奥瑞他汀F-OMe(MMAF-OMe)，爱必妥(LC)-G7CVIM和包含爱必妥(LC)-G7CVIM和MMAF的抗体药物缀合物ADC64的系列稀释液以浓度100至0.00128nM加入到细胞中。将细胞温育72小时，然后在每孔中加入100μL冰冷的10％三氯乙酸，在4℃下固定1小时。使用SRB染料(SulforhodamineB，Sigma S1402)和运行Softmax Pro v5的Molecular Devices SpectraMax 190平板读数器计数活细胞，监测540nm处的吸光度(表14)。
爱必妥(LC)-G7CVIM对于每个细胞系(A431，MCF-7和HCC-827)具有大于100nM的IC50。MMAF-OMe对于MCF-7细胞的IC50为1.81nM，对于HCC-827细胞为1.99nM，对于A431细胞为1.11nM。抗体-药物缀合物ADC64，65和66对于MCF-7细胞的IC50大于100nM，且对于HCC-827细胞分别为0.47，0.17，0.11nM。ADC64对于A431细胞显示1.3nM，因此显示出优于MMAF-OMe的特异性和优于爱必妥(LC)-G7CVIM的效力。
表14.抗-EGFR mAb，基于爱必妥的ADCs的IC50值
实验例6.ABT-806(LC)-葡糖醛酸连接子-MMAF的细胞毒性
针对三星医疗中心(首尔，大韩民国)建立的患者来源的细胞系进行基于ABT-806的ADCs的细胞毒性测试。将细胞维持在具有补充L-谷氨酰胺(200nM)，bFGF(20ng/mL)，EGF(20ng/mL)，N2补充物和B27补充物的Media(Thermo Fisher Scientific)中。对于存活率测试，将细胞等分至96孔板(5000个细胞/孔)并在37℃，5％CO2下培养1天，然后处理。ADC处理后，将细胞温育72小时。向每个孔中加入100μL试剂(Promega)以分析细胞存活率。温育10分钟后，用发光计分析发光信号。
如预期的那样，DAR4ADCs(ADC74，ADC75)比DAR2ADC(ADC73)具有更好的效力。有些病人的细胞对有效载荷显示出一点点不同。22和780细胞对MMAF比MMAE更敏感，464细胞则相反。
表15.基于ABT-806的ADCs对患者来源的细胞系的细胞毒性活性
实验例7.抗-CD19ADCs的细胞毒性
将人类伯基特氏淋巴瘤细胞(Burkitt’s lymphoma cells)Ramos细胞以20000个细胞/孔接种在96孔板中的100μL生长培养基中。将细胞在37℃，5％CO2下温育1天。在100μL培养基中将33.33nM至5.1pM的抗-CD19抗体DI-B4-(LC)-G7CVIM和ADCs的系列稀释液加入到孔中，并将细胞与抗体&ADCs温育72小时。使用WST-1(TaKaRa MK400)和运行Softmax Prov5的Molecular Devices SpectraMax 190平板读数器监测450nm处的吸光度(表16)以评估细胞存活率。
在Ramos细胞中的实验与K562细胞(不表达CD19的人骨髓性白血病细胞)的实验平行进行，作为评估任何非特异性细胞毒性的阴性对照。
ADC68和ADC69对Ramos细胞的IC50显示为0.09nM，优于未缀合的DI-B4(表16)。对于K562对照细胞，没有抗体显示低于33.33nM的细胞毒性。
表16.基于抗-CD19抗体的ADCs的细胞毒性活性
实验例8.基于利妥昔单抗的ADCs的细胞毒性
将人类伯基特氏淋巴瘤细胞Ramos细胞以20000个细胞/孔接种在96孔板中的100μL生长培养基中。将细胞在37℃，5％CO2下温育1天。在100μL培养基中将33.33nM至5.1pM的利妥昔单抗(LC)-G7CVIM和ADCs的系列稀释液加入到孔中，并将细胞与抗体&ADCs温育72小时。使用WST-1(TaKaRa MK400)和运行Softmax Pro v5的Molecular Devices SpectraMax190平板读数器，监测450nm处的吸光度(表17)以评估细胞存活率。
在Ramos细胞中的实验与K562细胞(不表达CD20的人骨髓性白血病细胞)的实验平行进行，作为评估任何非特异性细胞毒性的阴性对照。
ADC70，ADC71和ADC72对Ramos细胞分别显示4.56nM，1.47nM和1.78nM的IC50，这优于未缀合的抗-CD20抗体(表17)。对于K562对照细胞，没有抗体显示低于33.33nM的细胞毒性。
表17.基于利妥昔单抗的ADCs的细胞毒性活性
实验例9.β葡糖醛酸糖敏感性的差异
将0.06M乙酸钠缓冲液(pH5.2)中的ADCs分装到1.5mL微管中。将混合物中ADC的最终浓度调节至12μM。将0.001μg的人β-葡糖醛酸酶(R&D systems：6144-GH-020)加入到每个管中。然后，将混合物在37℃水浴中温育3小时。通过加入冷PBS缓冲液(pH7.4)至15倍稀释终止反应。通过HIC-HPLC分析β-葡糖醛酸酶的ADC-模式的变化。酶活性的功效通过剩余的百分数显现(图10)。
易感的属性似乎是连接子-毒素部分的分支单元(BR)。当Lys位于BR中时，毒素释放非常有效地发生。酰胺和胺比Lys显示出更小的敏感性。
实验例10.ADCs的血浆稳定性
为了比较ADC2(赫赛汀-LBG-MMAF，DAR2)和Kadcyla之间的血浆稳定性，将这些ADC在小鼠和人血浆中温育5秒(0h)或96小时(96h)，然后使用SK-BR3细胞进行SRB体外细胞毒性测试72小时。血浆温育的ADC2保留了强效的细胞毒性(IC50无变化；对于MP为0.06(0h)和0.07nM(96h)，对于HP为0.08(0h)和0.08nM(96h))，而血浆温育的Kadcyla显示出与0hKadcyla相比降低的细胞毒性(IC50增加；对于MP为0.26(0h)和1.59nM(96h)，对于HP为0.29(0h)和4.21nM(96h))(图11)。
为了表征由各种抗体构成的ADCs的血浆稳定性，将ADCs在人血浆中温育5秒(0小时)或168小时(168小时)，然后使用SK-BR3细胞进行SRB体外细胞毒性测试72小时。(表18-20和图12)
表18.基于赫赛汀的ADCs的血浆稳定性(nM)
表19.基于抗-CD19抗体的ADCs的血浆稳定性(nM)
表20.基于抗-CD20抗体的ADCs的血浆稳定性(nM)
实验例11.和ADCs的药代动力学
给雄性Sprague Dawley大鼠静脉注射3mg/kg剂量的抗体或抗体-药物缀合物。施用后在多个时间点取血样，在冰水中冷冻，分离血浆。将血浆在-80℃冷冻直至进行LC/MS/MS分析。
将20μL的各样品与340μL的PBS和60μL的蛋白质A磁珠混合，并在室温下在轻微振荡下温育2小时。珠子用PBS洗涤三次。然后，将25μL的内标(10μg/mL的同位素标记肽)，75μL的RapiGestSF(Waters)和10μL的二硫苏糖醇加入到珠子中。振荡混合物1分钟，然后在60℃温育1小时。向混合物中加入25μL碘乙酸，振荡混合物1分钟，然后在室温下温育30分钟。将10μL测序级改性胰蛋白酶(Promega)加入到混合物中，将混合物振荡1分钟，并将混合物在37℃温育过夜。向该混合物中加入15μL盐酸，振荡1分钟，在37℃下保温30分钟。将混合物在4℃以5000×g离心10分钟，并将上清液转移至HPLC小瓶中。
液相色谱-质谱系统由两个Shimadzu LC-20AD泵，Shimadzu CBM-20AHPLC泵控制器(Shimadzu Corporation,Columbia,MD,USA)，CTCHTSPAL自动进样器(CEAPTechnologies,Carrboro,NC,USA)和三重飞行时间5600质谱仪(TripleTOFMS)(ABSciex，FosterCity，CA，USA)组成。分析柱是Phenomenex Kinetex XB-C18柱，2.1×30(2.6μm)。用水/乙腈梯度进行HPLC并用0.1％甲酸酸化。注射体积为10μL。配备有DuosprayTM离子源的Triple TOF MS被用来完成高分辨率的实验。Triple TOF MS以正离子模式运行。高纯氮气用于喷雾器/DuosprayTM和帘式气体。气源温度设定在500℃，帘流量为30L/min。离子喷雾电压设定为5500V，去簇电位为145V，碰撞能量为38V。产物离子模式被用作扫描模式。使用(Microsoft)操作的TF Version1.6(ABSciex)进行仪器控制和数据采集。使用Version 2.1.1(ABSciex)进行峰整合。使用Version2.1.1进行计算，获得峰面积比，标准曲线回归，样品浓度值和描述性统计。使用浓度为0.1，0.4，1，2，5，10，20，40，80和100μg/mL的标准溶液来校准LC/MS/MS。图13显示了具有代表性的PK谱图。ADC2(赫赛汀(LC)-MMAF，DAR2)的PK谱图与赫赛汀非常相似。
实验例12.分支的连接子-毒素中的PEG(连接单元)组合效应
为了确定影响ADC的PK谱图的关键属性，测试连接单元的不同长度和结构(PEG数量和排列)。如实验例9中所述完成PK分析的实验。尽管ADC23(DAR4ADC)在体外和体内比DAR2ADC具有更有效的功效，但PK图谱半衰期和AUC降低(图14)。通过替换连接子-毒素从16f到25f(将额外的连接单元(3倍的PEG)附着到分支单元(BR)后，PK图谱已经恢复到赫赛汀图谱(图14)。这些效果很好地再现于基于MMAE的ADC，ADC24和ADC33(图15)。由于MMAE比MMAF更疏水，基于MMAE的ADC已在PK图谱恶化(如图ADC1和ADC24)。添加更长PEG单元是用于延长半衰期和AUC的传统应用，然而，当比较ADC5与ADC1时，PEG单元号的3至12个简单伸长没有显示出很大的差异，在另一方面，通过用线性连接子单元(化合物2g或4f)替换为分支连接子单元(化合物11j，ADC15)，PK图谱显著改善(图16)，表明PK的关键属性可能不是简单的长度，而是连接单元的结构。
实验例13.亲水性连接单元在ADC的PK中的作用
用于ADC的许多有效载荷具有疏水特性，导致不良的PK特性。为了补偿疏水性，将亲水性化合物作为连接单元的一部分进行测试。插入亲水化合物(例如Asp)可增强ADC的AUC和半衰期(图17，18，19)。在DAR2的情况下，包括Asp的连接单元的ADC显示出比赫赛汀更高的AUC(图17，18)。在具有DAR4的ADC中可观察到极性氨基酸(例如Asp或Glu)的补偿作用(图19，20)。ADC49(2Asp)和ADC52(2D-Glu)的AUC和半衰期分别优于ADC47(1Asp)和ADC51(1D-Glu)。
实验例14.体内功效
冷冻的JIMT-1细胞原液在37℃，5％CO2条件下解冻并培养。存活率超过95％的最佳条件下的JIMT-1细胞用于植入。将悬浮于50L冷盐水中的5×106个细胞植入balb/c裸小鼠的右后腿。每组5只小鼠用于实验。定期监测肿瘤形成和生长。通过公式计算肿瘤体积；体积＝(a2b)/2，“a”是指短径，“b”是指长径。
当肿瘤体积达到约200mm3时，根据肿瘤体积选择具有平均值的小鼠并分组。然后，用PBS(载体对照)或图21和22所示的ADC处理小鼠。在实验期间，在3-4天间隔内每周测定2次肿瘤大小。绘制对于从第一天施用至结束时间所测定的肿瘤体积的肿瘤生长曲线。
有代表性的ADC通过单次注射进行测试。一般而言，含有Lys的分支单元(BR)的ADC比含有酰胺的BR的ADC具有更好的功效。
参考文献
本文引用的每一个专利，公开的专利申请和非专利参考文献均通过引用整体并入本文。
等同物
本领域技术人员会认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明的具体实施方式的许多等同物。这样的等同物旨在由所附权利要求涵盖。

Claims (108)

1.一种配体-药物缀合物，包含配体、连接子和活性剂，其中：
所述连接子包含O-取代的肟，并且：
a)所述肟的氧原子被将所述肟共价连接到活性剂的基团取代；
且所述肟的碳原子被将所述肟共价连接到配体的基团取代；或者
b)所述肟的碳原子被将所述肟共价连接到活性剂的基团取代；
且所述肟的氧原子被将所述肟共价连接到配体的基团取代。
2.如权利要求1所述的缀合物，其具有式I的结构：
其中：
G表示糖或糖酸，优选表示葡糖醛酸；
A表示配体；
B表示活性剂；
W表示吸电子基团，优选-C(O)NR'-，其中C(O)与苯环键合且NR'与L键合；
每个Z独立地表示氢，(C1-C8)烷基或吸电子基团(例如酰胺，羧酸，羧酸酯，卤素，氰基或硝基)，优选氢，(C1-C8)烷基，卤素，氰基或硝基，最优选氢；
n是1至3的整数，优选3；
L包含将A共价连接至W的3至50个原子的链，包括所述肟；
R1和R2各自独立地表示氢，(C1-C8)烷基或(C3-C8)环烷基，优选氢，或者R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C8)环烷基环；以及
连接A和B的部分在一起(即从L到OC(＝O))形成所述连接子。
3.如权利要求1所述的缀合物，其具有下式：
其中：
G表示糖，糖酸或修饰的糖，优选糖或糖酸，最优选葡糖醛酸；
A表示配体；
B表示活性剂；
W表示-C(O)-，-C(O)NR'-，-C(O)O-，-S(O)2NR'-，-P(O)R”NR'-，-S(O)NR'-或-PO2NR'-，在每种情况中，其中，C(O)，S或P与苯环直接键合，且R'和R”各自独立地为氢，(C1-C8)烷基，(C3-C8)环烷基，(C1-C8)烷氧基，(C1-C8)烷硫基，单或二(C1-C8)烷基氨基，(C3-C20)杂芳基或者(C6-C20)芳基；
每个Z各自独立地表示氢，(C1-C8)烷基或吸电子基团(例如酰胺，羧酸，羧酸酯，卤素，氰基或硝基)，优选氢、(C1-C8)烷基、卤素、氰基或硝基，最优选氢；
n是1至3的整数，优选3；
m是0或1，优选1；
L是将A共价连接至W的连接子，包含所述肟；
R1和R2各自独立地表示氢，(C1-C8)烷基或(C3-C8)环烷基，优选氢；或者R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C8)环烷基环。
4.如权利要求1所述的缀合物，其具有下式：
或其药学上可接受的盐，其中
A表示配体；
B表示活性剂；
G表示糖，糖酸或修饰的糖，优选糖或糖酸，最优选葡糖醛酸；
W表示-C(O)-，-C(O)NR'-，-C(O)O-，-S(O)2NR'-，-P(O)R”NR'-，-S(O)NR'-或-PO2NR'-，在每种情况中，其中，C(O)，S或P与苯环直接键合，且R'和R”各自独立地为氢，(C1-C8)烷基，(C3-C8)环烷基，(C1-C8)烷氧基，(C1-C8)烷硫基，单或二(C1-C8)烷基氨基，(C3-C20)杂芳基或者(C6-C20)芳基；
每个Z各自独立地表示氢，(C1-C8)烷基或吸电子基团(例如酰胺，羧酸，羧酸酯，卤素，氰基或硝基)，优选氢、(C1-C8)烷基、卤素、氰基或硝基，最优选氢；
n是1至3的整数，优选3；
L表示将A共价连接至W的连接子，包含所述肟；
R1和R2各自独立地表示氢，(C1-C8)烷基或(C3-C8)环烷基，优选氢；或者R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C8)环烷基环。
5.如权利要求2至4中任一项所述的缀合物，其中，每个Z独立地表示氢，(C1-C8)烷基或酰胺，羧酸，羧酸酯，卤素，氰基或硝基。
6.如权利要求5所述的缀合物，其中，每个Z独立地表示氢，(C1-C8)烷基，卤素，氰基或硝基。
7.一种配体-药物缀合物，包含配体、连接子和具有式I结构的活性剂：
其中：
G表示糖或糖酸，优选葡糖醛酸；
A表示配体；
B表示活性剂；
W表示吸电子基团，优选-C(O)NR'-，其中C(O)与苯环键合，NR'与L键合；
每个Z各自独立地表示氢，(C1-C8)烷基或吸电子基团(例如酰胺，羧酸，羧酸酯，卤素，氰基或硝基)，优选氢、(C1-C8)烷基、卤素、氰基或硝基，最优选氢；
n是1至3的整数，优选3；
L包含将A共价连接至W的3至100个原子的链；
R1和R2各自独立地表示氢，(C1-C8)烷基或(C3-C8)环烷基，优选氢；或者R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C8)环烷基环；以及
连接A和B的部分在一起(即从L到OC(＝O))形成所述连接子。
8.一种配体-药物缀合物，包含配体、连接子和活性剂，其具有下式：
其中：
G表示糖，糖酸或修饰的糖，优选糖或糖酸，最优选葡糖醛酸；
A表示配体；
B表示活性剂；
W表示-C(O)-，-C(O)NR'-，-C(O)O-，-S(O)2NR'-，-P(O)R”NR'-，-S(O)NR'-或-PO2NR'-，在每种情况中，其中，C(O)，S或P与苯环直接键合，且R'和R”各自独立地为氢，(C1-C8)烷基，(C3-C8)环烷基，(C1-C8)烷氧基，(C1-C8)烷硫基，单或二(C1-C8)烷基氨基，(C3-C20)杂芳基或者(C6-C20)芳基；
每个Z各自独立地表示氢，(C1-C8)烷基或吸电子基团(例如酰胺，羧酸，羧酸酯，卤素，氰基或硝基)，优选氢、(C1-C8)烷基、卤素、氰基或硝基，最优选氢；
n是1至3的整数，优选3；
m是0或1，优选1；
L是将A共价连接至W的连接子；
R1和R2各自独立地表示氢，(C1-C8)烷基或(C3-C8)环烷基，优选氢；或者R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C8)环烷基环。
9.一种配体-药物缀合物，包含配体、连接子和活性剂，其具有下式：
或其药学上可接受的盐，其中
A表示配体；
B表示活性剂；
G表示糖，糖酸或修饰的糖，优选糖或糖酸，最优选葡糖醛酸；
W表示-C(O)-，-C(O)NR'-，-C(O)O-，-S(O)2NR'-，-P(O)R”NR'-，-S(O)NR'-或-PO2NR'-，在每种情况中，其中，C(O)，S或P与苯环直接键合，且R'和R”各自独立地为氢，(C1-C8)烷基，(C3-C8)环烷基，(C1-C8)烷氧基，(C1-C8)烷硫基，单或二(C1-C8)烷基氨基，(C3-C20)杂芳基或者(C6-C20)芳基；
每个Z独立地表示氢，(C1-C8)烷基或吸电子基团(例如酰胺，羧酸，羧酸酯，卤素，氰基或硝基)，优选氢、(C1-C8)烷基、卤素、氰基或硝基，最优选氢；
n是1至3的整数，优选3；
L表示将A共价连接至W的连接子；
R1和R2各自独立地表示氢，(C1-C8)烷基或(C3-C8)环烷基，优选氢；或者R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C8)环烷基环。
10.如权利要求7至9中任一项所述的缀合物，其中，每个Z独立地表示氢，(C1-C8)烷基或酰胺，羧酸，羧酸酯，卤素，氰基或硝基。
11.如权利要求10所述的缀合物，其中，每个Z独立地表示氢，(C1-C8)烷基，卤素，氰基或硝基。
12.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中，所述配体是抗体。
13.如权利要求2至12中任一项所述的缀合物，其中，所述糖或糖酸是单糖。
14.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中：
G是
R3是氢或羧基保护基团；和
每个R4独立地为氢或羟基保护基团。
15.如权利要求14所述的缀合物，其中，R3是氢并且每个R4是氢。
16.如权利要求2至15中任一项所述的缀合物，其中，W是-C(O)-，-C(O)NR'-，-C(O)O-，-S(O)2NR'-，-P(O)R”NR'-，-S(O)NR'-或-PO2NR'-，在每种情况中，其中，C(O)，S或P与苯环直接键合，且R'和R”各自独立地为氢，(C1-C8)烷基，(C3-C8)环烷基，(C1-C8)烷氧基，(C1-C8)烷硫基，单或二(C1-C8)烷基氨基，(C3-C20)杂芳基或者(C6-C20)芳基。
17.如权利要求16所述的缀合物，其中，W是-C(O)NR'-，其中C(O)与苯环键合并且NR'与L键合。
18.如权利要求2至17中任一项所述的缀合物，其中，Z表示氢并且n是3。
19.如权利要求2至18中任一项所述的缀合物，其中，R1和R2各自表示氢。
20.如权利要求2至19中任一项所述的缀合物，其中：
G是葡糖醛酸；
W是-C(O)NR'-，其中，C(O)与苯环键合，NR'与L键合；
每个Z表示氢；
n是3；以及
R1和R2各自表示氢。
21.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中，所述连接子包含具有1至100个碳原子，优选1至50个碳原子的亚烃基，并且：
该亚烃基包括至少一个不饱和键；
该亚烃基包括至少一个亚杂芳基；
该亚烃基的碳原子被选自氮(N)、氧(O)和硫(S)中的一个或多个杂原子取代；或者
该亚烃基进一步被一个或多个具有1至20个碳原子的烃基取代。
22.如权利要求21所述的缀合物，其中，所述亚烃基的至少一个碳原子被氮代替，所述连接子包含至少两个亲水性氨基酸原子，并且，所述氮与所述亲水性氨基酸的羰基形成肽键。
23.如权利要求2至22中任一项所述的缀合物，其中，W表示-C(O)NR'-，并且W的氮是亲水性氨基酸的氮原子。
24.如权利要求22或23所述的缀合物，其中，所述亲水性氨基酸为精氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，鸟氨酸，脯氨酸，丝氨酸或苏氨酸。
25.如权利要求22或23所述的缀合物，其中，所述氨基酸将所述连接子的肟共价连接至所述连接子的聚乙二醇单元。
26.如权利要求25所述的缀合物，其中，所述亲水氨基酸是精氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，鸟氨酸，脯氨酸，丝氨酸或苏氨酸。
27.如权利要求22或23所述的缀合物，其中，所述亲水氨基酸是包含具有在水溶液中性pH值下带电荷的部分的侧链的氨基酸。
28.如权利要求27所述的缀合物，其中，所述亲水性氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。
29.如权利要求27所述的缀合物，其中，所述亲水性氨基酸是鸟氨酸或赖氨酸。
30.如权利要求27所述的缀合物，其中，所述亲水性氨基酸是精氨酸。
31.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中，所述连接子包含肽，并且所述肽包含至少一个亲水性氨基酸，优选具有侧链的氨基酸，该侧链具有在水溶液中性pH值下带电荷的部分(例如胺，胍或羧基部分)。
32.如权利要求31所述的缀合物，其中，所述肽的每个氨基酸独立地选自丙氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，赖氨酸，鸟氨酸，脯氨酸，丝氨酸和苏氨酸。
33.如权利要求32所述的缀合物，其中，所述肽包含至少一种天冬氨酸或谷氨酸。
34.如权利要求32或33所述的缀合物，其中，W表示-C(O)NR'-，并且W的氮是肽中N-末端氨基酸的氮。
35.如权利要求32或33所述的缀合物，其中，所述肽将所述连接子的肟共价连接至所述连接子的聚乙二醇单元。
36.如权利要求32至35中任一项所述的缀合物，其中，所述肽包含2至20个氨基酸。
37.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中，所述连接子通过硫醚键共价结合到所述配体，并且所述硫醚键包含所述配体的半胱氨酸的硫原子。
38.如权利要求37所述的缀合物，其中：
所述配体包含氨基酸基序，优选在所述配体的C-末端被类异戊二烯转移酶识别；和
所述硫醚键包含所述氨基酸基序的半胱氨酸的硫原子。
39.如权利要求38所述的缀合物，其中：
所述氨基酸基序是CYYX序列；
C表示半胱氨酸；
Y在每次出现时独立地表示脂肪族氨基酸；
X在每次出现时独立地表示谷氨酰胺，谷氨酸，丝氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸或亮氨酸；和
所述硫醚键包含所述氨基酸基序的半胱氨酸的硫原子。
40.如权利要求39所述的缀合物，其中：
所述氨基酸基序是CYYX序列；和
Y在每次出现时独立地表示丙氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸或缬氨酸。
41.如权利要求40所述的缀合物，其中，所述氨基酸基序是CVIM或CVLL序列。
42.如权利要求38至41中任一项所述的缀合物，其中，所述氨基酸基序前面的7个氨基酸中的至少一个是甘氨酸。
43.如权利要求42所述的缀合物，其中，所述氨基酸基序前面的7个氨基酸中的至少三个各自独立地选自甘氨酸和脯氨酸。
44.如权利要求42所述的缀合物，其中，所述氨基酸基序前面的7个氨基酸中的至少三个各自独立地选自甘氨酸，天冬氨酸，精氨酸和丝氨酸。
45.如权利要求43或44所述的缀合物，其中，所述氨基酸基序前面的1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸中的每一个都是甘氨酸。
46.如权利要求45所述的缀合物，其中，所述配体包含氨基酸序列GGGGGGGCVIM，优选在C-末端。
47.如权利要求37至46中任一项所述的缀合物，其中，所述连接子包含至少一个由表示的异戊二烯基单元，优选使得所述硫醚键包含所述异戊二烯基单元的碳原子。
48.如权利要求47所述的缀合物，其中，所述至少一个异戊二烯基单元是类异戊二烯转移酶的底物或产物。
49.如权利要求47或48所述的缀合物，其中，所述连接子包含肟，并且所述至少一个异戊二烯基单元将所述肟与所述配体共价连接。
50.如权利要求49所述的缀合物，其中，所述连接子包含：
51.如权利要求49所述的缀合物，其中，所述连接子包含：
52.如权利要求49所述的缀合物，其中，所述连接子包含：
53.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中，所述连接子包含至少一个由中任一个表示的聚乙二醇单元。
54.如权利要求53所述的缀合物，其中，所述连接子包含1至12个-OCH2CH2-单元。
55.如权利要求53所述的缀合物，其中，所述连接子包含3至12个-OCH2CH2-单元。
56.如权利要求53所述的缀合物，其中，所述连接子包含5至12个-OCH2CH2-单元。
57.如权利要求53所述的缀合物，其中，所述连接子包含6或12个-OCH2CH2-单元。
58.如权利要求53所述的缀合物，其中，所述连接子包含3个-OCH2CH2-单元。
59.如权利要求53至58中任一项所述的缀合物，其中，所述连接子包含肟，并且所述至少一个聚乙二醇单元将所述肟与所述活性剂共价连接。
60.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中，所述连接子包含由-(CH2)r(V(CH2)p)q-表示的连接单元，其中：
r是1至10的整数，优选2；
p是0至12的整数，优选2；
q是1至20的整数；
V是单键，-O-，-S-，-NR21-，-C(O)NR22-，-NR23C(O)-，-NR24SO2-或-SO2NR25-，优选-O-；以及
R21至R25独立地为氢，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷基(C6-C20)芳基或(C1-C6)烷基(C3-C20)杂芳基。
61.如权利要求1至59中任一项所述的缀合物，其中，所述连接子包含由-(CH2)r(V(CH2)p)q-，-((CH2)pV)q-,-(CH2)r(V(CH2)p)qY-，-((CH2)pV)q(CH2)r-，-Y(((CH2)pV)q-或-(CH2)r(V(CH2)p)qYCH2-表示的连接单元，
其中：
r是从0至10的整数；
p是1至10的整数；
q是1至20的整数；
V和Y各自独立地为单键，-O-，-S-，-NR21-，-C(O)NR22-，-NR23C(O)-，-NR24SO2-，或者-SO2NR25-；以及
R21至R25各自独立地为氢，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷基(C6-C20)芳基或(C1-C6)烷基(C3-C20)杂芳基。
62.如权利要求60或61所述的缀合物，其中，q是4至20的整数。
63.如权利要求60或61所述的缀合物，其中，q是2至12的整数。
64.如权利要求60或61所述的缀合物，其中，q是6至20的整数。
65.如权利要求60或61所述的缀合物，其中，q是2，5或11。
66.如权利要求60至65中任一项所述的缀合物，其中，r是2。
67.如权利要求60至66中任一项所述的缀合物，其中，p是2。
68.如权利要求61至67中任一项所述的缀合物，其中，V和Y各自独立地为-O-。
69.如权利要求60或61所述的缀合物，其中：
r是2；
p是2；
q是2，5或11；以及
V是-O-。
70.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中，所述连接子包含由-(CH2CH2X)w-表示的连接单元，其中：
X表示-O-，(C1-C8)亚烃基或-NR21-，优选-O-；
R21表示氢，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷基(C6-C20)芳基或(C1-C6)烷基(C3-C20)杂芳基，优选氢；以及
w为1至20的整数，优选为1，3，6或12。
71.如权利要求70所述的缀合物，其中，X是-O-，且w是6至20的整数。
72.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中，所述连接子包含通过1,3-偶极环加成反应，异狄尔斯-阿尔德反应，亲核取代反应，非醇醛型羰基反应，碳-碳复合键加成，氧化反应，或点击反应形成的结合单元。
73.如权利要求72所述的缀合物，其中，所述结合单元通过乙炔与叠氮化物之间的反应，或者醛基或酮基与肼或烷氧基胺之间的反应来形成。
74.如权利要求73所述的缀合物，其中，所述结合单元由式A，B，C或D中的任一个表示，优选C：
其中：
L1是单键或具有1至30个碳原子的亚烃基，优选12；
R11是氢或具有1至10个碳原子的烃基，优选甲基；和
L2是具有1至30个碳原子的亚烃基，优选11。
75.如权利要求74所述的缀合物，其中，所述连接子包含：
V是单键，-O-，-S-，-NR21-，-C(O)NR22-，-NR23C(O)-，-NR24SO2-，或-SO2NR25-，优选-O-；
R21至R25各自独立地为氢，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷基(C6-C20)芳基，或(C1-C6)烷基(C3-C20)杂芳基；
r是1至10的整数，优选2或3；
p是0至10的整数，优选1或2；
q是1至20的整数，优选1至6；以及
L1是单键。
76.如权利要求75所述的缀合物，其包含以下结构：
其中，A表示配体；B表示活性剂；并且n是1至20的整数。
77.如权利要求75所述的缀合物，其包含以下结构：
其中，A表示配体；B表示活性剂；并且n是1至20的整数。
78.如权利要求76或77所述的缀合物，其中，所述配体是抗体。
79.如权利要求2至78中任一项所述的缀合物，其中：
所述连接子包含O-取代的肟；其中
a)所述肟的氧原子被将所述肟共价连接到活性剂的基团取代，并且所述肟的碳原子被将所述肟共价连接到配体的基团取代；
b)所述肟的氧原子被将所述肟共价连接到配体的基团取代，
并且所述肟的碳原子被将所述肟共价连接到活性剂的基团取代。
80.如权利要求79所述的缀合物，其包含以下结构：
其中，A表示配体；B表示活性剂；并且n是0至20的整数。
81.如权利要求79所述的缀合物，其包含以下结构：
其中，A表示配体；B表示活性剂；并且n是0至20的整数。
82.如权利要求79至81中任一项所述的缀合物，其中，所述配体是抗体。
83.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中，所述配体是单克隆抗体，多克隆抗体，抗体片段，Fab，Fab'，Fab'-SH，F(ab')2，Fv，单链Fv(“scFv”)，双链抗体，线性抗体，双特异性抗体，多特异性抗体，嵌合抗体，人源化抗体，人抗体或包含抗体的抗原结合部分的融合蛋白。
84.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中，所述配体选自：莫罗单抗-CD3阿昔单抗，利妥昔单抗，达克珠单抗，帕利珠单抗，英夫利昔单抗，曲妥珠单抗，依那西普，巴利昔单抗，吉妥单抗，阿仑单抗，替伊莫单抗，阿达木单抗，阿法赛特，奥马珠单抗，依法利珠单抗，托西莫单抗，贝伐珠单抗，那他珠单抗，兰尼单抗，依库丽单抗，利洛纳塞，赛妥珠单抗，罗米司亭，AMG-531，戈利木单抗，尤特克单抗，ABT-874，贝拉西普，贝利木单抗，阿塞西普，抗-CD20抗体，卡那单抗，托珠单抗，托西珠单抗，美泊利单抗，帕妥株单抗，HuMaxCD20，曲美木单抗，替西木单抗，伊匹单抗，IDEC-114，奥英妥珠单抗，阿柏西普，HuMax-CD4，特普利珠单抗，奥特西珠单抗，卡妥索单抗，抗-EpCAM抗体IGN101，阿德木单抗，奥马珠单抗，地妥西单抗，壬土西单抗，狄迪诺塞麦，巴匹珠单抗，莫维珠单抗，福谷单抗，瑞西巴库，抗-CD20抗体，LY2469298和维妥珠单抗。
85.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中，所述配体是抗体，并且所述抗体不特异性结合CD19或EGFR。
86.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中，所述活性剂是化学治疗剂或毒素。
87.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中，所述活性剂选自：
(a)埃罗替尼，硼替佐米，氟维司群，索坦，来曲唑，甲磺酸伊马替尼，PTK787/ZK222584，奥沙利铂，5-氟尿嘧啶，亚叶酸，雷帕霉素，拉帕替尼，洛那法尼，索拉非尼，吉非替尼，AG1478，AG1571，噻替派，环磷酰胺，白消安，英丙舒凡，哌泊舒凡，苯丙多巴，卡波醌，美妥替哌，乌瑞替派，乙烯亚胺，六甲嘧胺，三亚乙基蜜胺，三乙烯磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺，三羟甲基蜜胺，泡番荔枝辛，泡番荔枝辛酮，喜树碱，托泊替康，苔藓抑素，卡丽丝汀，CC-1065，阿多来新，卡折来新，比折来新，念珠藻素1，念珠藻素8，多拉司他汀，倍癌霉素，KW-2189，CB1-TM1，软珊瑚醇，水鬼蕉碱，匍枝珊瑚醇，海绵抑制素，苯丁酸氮芥，萘氮芥，胆磷酰胺，雌氮芥，异环磷酰胺，氮芥，美法仑，新氮芥，胆甾醇苯乙酸氮芥，松龙苯芥，曲磷胺，尿嘧啶氮芥，亚硝基脲氮芥，氯脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀，雷莫司汀，卡奇霉素，卡奇霉素γ1，卡奇霉素ω1，达内霉素，达内霉素A，氯膦酸盐，埃斯培拉霉素，新制癌菌素生色团，阿克拉霉素类，放射菌素，安替比林，重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C，卡柔比星，洋红霉素，嗜癌霉素，色霉素，放线菌素D，道诺菌素，地托比星，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，阿霉素，吗啉代-阿霉素，氰基吗啉代-阿霉素，2-吡咯烷子基-阿霉素，脂质体阿霉素和去氧阿霉素，表柔比星，依索比星，麻西罗霉素，丝裂霉素C，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素，培洛霉素，泊非霉素，嘌呤霉素，三铁阿霉素，罗多比星，链黑菌素，链脲霉素，杀结核菌素，乌苯美司，新制癌菌素，佐柔比星，5-氟尿嘧啶，二甲叶酸，甲氨蝶呤，蝶罗呤，三甲曲沙，氟达拉滨，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤，盐酸环胞苷，阿扎胞苷，6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨，氟尿苷，二甲睾酮，屈他雄酮丙酸盐，环硫雄醇，美雄烷，睾内酯，氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦，亚叶酸，醋葡醛内酯，醛磷酰胺糖苷，氨基乙酰丙酸，恩尿嘧啶，安吖啶，巴斯布西，比生群，依达曲沙，地磷酰胺，地美可辛，地吖醌，依氟鸟氨酸，依利醋铵，依托格鲁，硝酸镓，羟基脲，蘑菇多糖，氯尼达明，美登素，安丝菌素，丙脒腙，米托蒽醌，莫哌达醇，二胺硝吖啶，喷司他丁，蛋氨氮芥，吡柔比星，洛索蒽醌，2-乙基酰胼，甲基苄胼，云芝多糖-K，雷佐生，根霉素，西索菲兰，锗螺胺，细交链孢菌酮酸，三亚胺醌，2,2′,2″-三氯三乙胺，T-2毒素，黏液霉素Α，杆抱菌素A和蛇形菌素，乌拉坦，长春地辛，达卡巴嗪，甘露醇氮芥，二溴甘露醇，二溴卫矛醇，溴丙哌嗪，干胞嘧啶，阿拉伯糖苷，环磷酰胺，噻替派，紫杉醇，紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂，多西紫杉醇，苯丁酸氮芥，吉西他滨，6-硫代鸟嘌呤，巯基嘌呤，顺铂，卡铂，长春碱，铂，鬼臼乙叉甙，异氨喋呤环磷酰胺，米托蒽醌，长春新碱，长春瑞滨，诺消灵，替尼泊苷，依达曲沙，柔红霉素，氨喋呤，希罗达，伊拜膦酸盐，CPT-11，拓扑异构酶抑制剂RFS2000，二氟甲基鸟氨酸，视黄酸，卡培他滨或任何上述物质的药学上可接受的盐，溶剂化物或酸；
(b)单核因子，淋巴因子，传统多肽激素，甲状旁腺激素，甲状腺素，松弛素，松弛素原，糖蛋白激素，促卵泡激素，促甲状腺激素，黄体化激素，肝细胞生长因子，成纤维细胞生长因子，催乳素，胎盘催乳素，肿瘤坏死因子-α，肿瘤坏死因子-β，抗缪勒氏管激素，小鼠促性腺激素相关肽，抑制素，活化素，血管内皮生长因子，血小板生成素，促红细胞生成素，成骨诱导因子，干扰素，干扰素-α，干扰素-β，干扰素-γ，集落刺激因子(“CSF”)，巨噬细胞-CSF，粒细胞-巨噬细胞-CSF，粒细胞-CSF，白细胞介素(“IL”)，IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，肿瘤坏死因子，TNF-α，TNF-β，多肽因子，LIF，试剂盒配体或任何上述物质的组合；
(c)白喉毒素，肉毒杆菌毒素，破伤风毒素，痢疾毒素，霍乱毒素，鹅膏素，α-鹅膏素，鹅膏素的衍生物，吡咯开苯并吖庚三烯，吡咯开苯并吖庚三烯的衍生物，河豚毒素，裸藻毒素，雪卡毒素，蓖麻毒蛋白，AM毒素，澳瑞他汀，微管蛋白裂解素，格尔德霉素，美登素，卡奇霉素，柔红霉素，阿霉素，甲氨蝶呤，长春地辛，SG2285，多拉司他汀，多拉司他汀类似物，念珠藻素，喜树碱，喜树碱衍生物或代谢产物(例如SN-38)，根霉素，根霉素衍生物，CC-1065，CC-1065类似物或衍生物，倍癌霉素，烯二炔抗生素，埃斯培拉霉素，埃博霉素，阿佐夫得，阿普立定，类毒素或任何上述物质的组合；
(d)亲和配体，其中，所述亲和配体是底物，抑制剂，刺激剂，神经递质，放射性同位素或任何上述物质的组合；
(e)放射性标记，32P，35S，荧光染料，电子致密试剂，酶，生物素，链霉抗生物素蛋白，二氧肟基，半抗原，免疫原性蛋白，具有靶向互补序列的核酸分子或任何上述物质的组合；
(f)免疫调节化合物，抗癌剂，抗病毒剂，抗菌剂，抗真菌剂和抗寄生虫剂，或任何上述物质的组合；
(g)他莫昔芬，雷洛昔芬，屈洛昔芬，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬，那洛昔芬，LY117018，奥那司酮或托瑞米芬；
(h)4(5)-咪唑，氨鲁米特，醋酸甲地孕酮，依西美坦，来曲唑或阿那曲唑；
(i)氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，亮丙瑞林，戈舍瑞林或曲沙他滨；
(j)芳香酶抑制剂；
(k)蛋白激酶抑制剂；
(l)脂质激酶抑制剂；
(m)反义寡核苷酸；
(n)核酶；
(o)疫苗；和
(p)抗血管生成剂。
88.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中，至少一种活性剂是托利布林。
89.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中，至少一种活性剂是阿佐夫得。
90.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中，所述缀合物包含选自以下的部分：
91.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中，所述活性剂为鹅膏素，澳瑞他汀，卡奇霉素，喜树碱，念珠藻素，柔红霉素，多拉司他汀，阿霉素，倍癌霉素，埃博霉素，埃斯培拉霉素，格尔德霉素，美登素，甲氨蝶呤，甲基澳瑞他汀E(“MMAE”)，甲基澳瑞他汀F(“MMAF”)，吡咯开苯并吖庚三烯，根霉素，SG2285，微管蛋白裂解素，长春地辛，类毒素或上述任何物质的衍生物。
92.如权利要求91所述的缀合物，其中，所述活性剂是鹅膏素，MMAE或MMAF或上述任一种物质的衍生物。
93.如权利要求2-92中任一项所述的缀合物，其中，B是：
其中，y是1至10的整数。
94.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其包含至少两个连接子。
95.如权利要求94所述的缀合物，其包含至少两种活性剂，其可以是相同的或不同的。
96.一种药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的缀合物。
97.如权利要求96所述的药物组合物，其还包含治疗有效量的化学治疗剂。
98.一种治疗受试者的癌症的方法，其包含将权利要求96或97所述的药物组合物施用于受试者。
99.如权利要求98所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物。
100.如权利要求99所述的方法，其中，所述受试者选自啮齿类动物，兔形动物，猫科动物，犬科动物，猪，羊，牛，马和灵长类动物。
101.如权利要求98所述的方法，其中，所述受试者是人。
102.一种制备配体-药物缀合物的方法，其包括将生物分子与前药反应，其中：
所述生物分子包含配体和酮或醛；
所述前药包含烷氧基胺；
所述反应产生肟，从而将所述配体共价连接至所述前药；和
优选配体不特异性结合CD19或EGFR。
103.如权利要求102所述的方法，其中，所述配体是抗体。
104.如权利要求102或103所述的方法，还包括异戊二烯化所述配体，从而产生所述生物分子，其中：
所述配体包含被类异戊二烯转移酶识别的氨基酸基序；
异戊二烯化所述配体包含将所述配体与类异戊二烯转移酶和类异戊二烯转移酶底物一起温育；
所述底物包含所述酮或醛；和
优选所述配体不特异性结合CD19或EGFR。
105.如权利要求104所述的方法，其中，所述配体是抗体。
106.如权利要求104或权利要求105所述的方法，其中，所述类异戊二烯转移酶是法尼酰基转移酶或香叶烯基转移酶。
107.一种制备配体-药物缀合物的方法，其包含异戊二烯化配体，其中：
所述配体包含被类异戊二烯转移酶识别的氨基酸基序；
异戊二烯化所述配体包含将所述配体与类异戊二烯转移酶和类异戊二烯转移酶底物一起温育；
所述底物包含活性剂；和
优选所述配体不特异性结合CD19或EGFR。
108.如权利要求107所述的方法，其中，所述配体是抗体。
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