KR20200013072A - Tau에 대한 항체 - Google Patents

Tau에 대한 항체 Download PDF

Info

Publication number
KR20200013072A
KR20200013072A KR1020207002242A KR20207002242A KR20200013072A KR 20200013072 A KR20200013072 A KR 20200013072A KR 1020207002242 A KR1020207002242 A KR 1020207002242A KR 20207002242 A KR20207002242 A KR 20207002242A KR 20200013072 A KR20200013072 A KR 20200013072A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
tau
antibody
aggregation
antibodies
seq
Prior art date
Application number
KR1020207002242A
Other languages
English (en)
Inventor
데이비드 홀츠만
홍 지앙
마크 다이아몬드
나질라 포리
브랜던 홈스
Original Assignee
워싱턴 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 워싱턴 유니버시티 filed Critical 워싱턴 유니버시티
Priority to KR1020207033554A priority Critical patent/KR102494798B1/ko
Publication of KR20200013072A publication Critical patent/KR20200013072A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Abstract

본 발명은 tau에 대한 항체 및 이의 이용 방법들에 관계한다.

Description

TAU에 대한 항체{ANTIBODIES TO TAU}
정부 지원
본 발명은 National Institute of Neurological Disorders and Stroke에서 제공하는 1R01NS071835에 따라 정부 지원하에 이루어졌다. 정부는 본 발명의 특정 권리를 보유한다.
발명의 분야
본 발명은 tau에 대한 항체 및 이의 사용 방법등에 관한 것이다.
발명의 배경
미세관(microtubule) 연합된 단백질 tau의 응집은 알츠하이머 질환 (AD)과 전두측두엽 치매를 포함하는 몇 가지 신경퇴행성 장애와 연관된다. AD에서, 병적 tau 응집은 뇌를 통하여 기존 신경 막을 따라 점진적으로 확산된다. AD는 치매의 가장 흔한 원인이며, 공중 보건 문제가 점차 증가되고 있다. 미국에서 5백만이 현재 이 병을 앓고 있으며, 2050년까지 천삼백만으로 증가될 것으로 예상된다. 알츠하이머 질환은 기억, 인지기능 상실로 이어지고, 결국 독립심의 상실로 이어진다. 환자와 가족에게 심각한 개인적 그리고 경제적 비용을 치르게 한다. tau 응집과 연관된 AD와 기타 신경퇴행성 질환 유병율의 증가 및 심각성으로 인하여, 더 다은 치료 및 검출 방법의 개발이 시급하다.
컬러 사진에 대한 언급
본 출원은 칼러로 찍힌 최소 한 장의 사진을 포함한다. 칼러 사진과 본 출원 공개 사본은 요청에 의해 필요 경비와 함께 특허청에 제공될 것이다.
알츠하이머 질환과 모든 타우병증(tauopathies) 간에 공통적인 최소한의 연관은 tau의 응집 상태다. 이러한 모든 질병 조건하에, 단량체 tau는 폴리머형태로 정돈된 원섬유로 전환되는 것으로 알려져있다. 원섬유 tau 응집으로 구성된 신경원섬유매듭(NFTs)는 타우병증(tauopathies)의 신경병적 특징이다. 뇌에서 tau 병증의 확산은 ＂공여자＂ 세포로부터 방출되어 ＂수령＂ 세포로 진입하는 tau 응집 형태에 의해 야기될 수 있으며, 이 tau 응집 형태는 미스폴딩을 더 포함하고, 직접적인 단백질-단백질 접촉을 통하여 수령 세포에서 tau 응집을 더 포함한다는 것이 출원인이 의해 발견되었다. tau 응집이 세포에서 세포로의 확산을 실행하는 tau 응집의 특이적 형태는 ＂tau 씨드(seeds)＂라고 하며, 본 명세서에서 이 활성은 ＂씨딩 활성＂이라고 할 수 있는데, 그 이유는 이러한 형태의 tau 응집이 이 것이 진입하는 세포(가령, ＂수령 세포＂)에서 tau 응집을 심거나 또는 tau 응집되도록 하기 때문이다.
Tau는 단량체 형태와 상이한 응집된 형태 모두 존재할 수 있다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 ＂tau 응집＂은 2개 또는 그 이상의 tau 단량체를 포함하는 분자 복합체를 말한다. 이론에 결부되지 않고, tau 응집은 서로 결합된 단량체의 수가 거의 무한대일 수 있다. 예를 들면, tau 응집은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 tau 단량체를 포함할 수 있다. 대안으로, tau 응집은 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 그 이상의 tau 단량체를 포함할 수 있다. tau 응집은 또한 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000개 또는 그 이상의 tau 단량체를 포함할 수 있다. 용어 ＂원섬유 tau 응집＂과 ＂tau 원섬유(fibril)＂는 tau 응집 형태를 말하며, 본 명세서에서 호환된다. 원섬유 tau 응집은 tau를 포함하는 폴리머형태로 배열된 섬유다. Tau 원섬유는 일반적으로 가용성이 아니지만, 더 짧은 어셈블리 또는 올리고머는 가용성일 수 있다. Tau 응집은 또한 가용성 tau 올리고머와 원시섬유(protofibrils)로도 불릴 수 있는데, 이는 tau 응집 동안 중간생성물로써 작용을 할 수 있다. tau 응집의 정의에는 또한 용어 ＂tau 씨드＂가 포함되는데, 이는 세포에 의해 내화되었을 때, 또는 시험관에서 단량체 tau에 노출되었을 때 세포내 tau 응집을 핵화시키거나 또는 ＂씨딩＂할 수 있는 tau 응집을 말한다. Tau 씨딩 활성은 본 명세서에서 설명된 것과 같이 세포의 tau 응집 분석에서 평가될 수 있다.
또한, 출원인은 tau에 특이적으로 결합하는 항체와 이의 사용 방법들을 발견하였다. 한 측면에서, 본 발명은 tau에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 tau 응집의 세포-세포간 전파를 효과적으로 보여주는 및/또는 효과적으로 감소시키는 수단을 제공한다. 본 발명의 항체들은 단백질 원섬유의 분해(disaggregation)를 촉진시키고, 세포 안에서 단량체 tau가 응집된 tau로 전환되는 것을 차단시키고, tau 응집의 세포내 분해를 촉진시키고, tau 응집이 이웃 세포로 진입되는 것을 막거나 또는 이의 조합에 의해 tau 응집을 지연 및/또는 감소시킬 수 있다. 또다른 측면에서, 본 발명은 대상(subject)으로 부터 획득한 생물학적 유체 시료 내에서 tau 응집을 탐지하는 수단을 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 대상으로 부터 획득한 생물학적 유체 시료 내에서 tau 응집 양을 측정하는 수단을 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 대상으로 부터 획득한 생물학적 유체 시료 내에서 측정된 tau 응집 양에 근거하여 대상을 분류하는 수단을 제공한다. 대상으로 부터 획득한 생물학적 유체 시료 내에서 측정된 tau 응집 양에 근거하여 대상을 분류하는 수단은 대상의 일생에서 tau 응집과 연합된 증상 및/또는 질환이 발달될 대상을 식별해내는데 이용될 수 있다.
본 발명은 항-tau 항체가 세포들로부터 방출되는 세포외 tau에 결합됨으로써 원섬유 tau 응집의 전파를 지연시킬 수 있고, 이로 인하여 이웃 세포들에게 tau 응집의 진입을 막고, tau 응집의 확산을 지연시킬 수 있다는 발견을 포괄한다. 한 측면에서, 본 발명은 tau 응집이 세포 안으로 진입되는 것을 막는 수단을 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 세포내 tau 응집을 감소시키는 수단을 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 tau 씨딩 활성을 감소시키는 수단을 제공한다. tau 응집이 이웃 세포로 진입을 막는데 유용한 본 발명의 항체는 tau 안에 에피토프에 결합하는 항체들을 포함한다.
I. tau에 결합하는 항체
인간에게는 엑손 2, 3, 및 10의 또다른 접합에 의해 생성되는 6가지 형태의 tau 아이소폼이 있다. 이 아이소폼은 352 내지 441개의 아미노산 범위를 갖는다. 엑손 2와 3은 N-단부에서 각각 29-개 아미노산 삽입부를 인코드한다 (그런 이유로 N이라 불리며, tau 아이소폼은 2N (양쪽 삽입부), 1N (오직 엑손 2), 또는 0N (어느쪽도 없음)일 수 있다. 모든 tau 아이소폼은 미세관 결합 도메인의 3개 반복부를 보유한다. C-단부에서 엑손 10의 혼입은 엑손 10에 의해 인코드되는 4번째 미세관 결합 도메인의 혼입으로 이어진다. 그러한 이유로, tau 아이소폼은 미세관 결합 도메인의 4개 반복부 (엑손 10 포함)를 포함하거나 또는 미세관 결합 도메인의 3개 반복부 (엑손 10 배제)를 포함할 수 있다. 본 발명의 항-tau 항체는 임의의 tau 아이소폼에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 예시적인 구체예에 있어서, 본 발명의 항-tau 항체는 엑손 10을 포함하는 tau 이소폼에 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
상기에서 명시된 바와 같이, tau는 가용성 및 불용성 구획에서(compartments), 단량체 형태 또는 응집된 형태로, 질서를 갖는 또는 무질서한 구조로, 세포내와 세포외에서 발견될 수 있으며, 그리고 다른 단백질 또는 분자와 복합될 수 있다. 본 발명의 항-tau 항체는 설명된 바와 같이 하나 또는 그 이상의 형태의 tau에 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 항-tau 항체는 tau 단량체에 결합한다. 다른 구체예들에 있어서, 항-tau 항체는 tau 응집에 결합한다. 여전히 다른 구체예들에 있어서, 항-tau 항체는 tau 원섬유에 결합한다. 상이한 구체예들에 있어서, 항-tau 항체는 tau 단량체 및 tau 응집에 결합한다. 대체 구체예들에 있어서, 항-tau 항체는 tau 응집 및 tau 원섬유에 결합한다. 상이한 구체예들에 있어서, 항-tau 항체는 tau 원섬유 및 tau 단량체에 결합한다.
본 명세서에서 유용한 항-tau 항체는 생물학적 시료 안에 존재하는 tau 응집에 특이적으로 결합하는 모든 항체를 또한 포함한다. 본 명세서에서 유용한 항-tau 항체는 tau 응집의 세포간 전파를 감소시키는 모든 항체를 포함한다. 환언하면, 유용한 항체는 본 발명의 항체 없이 수령 세포로 진입되는 양과 비교하였을 때, tau가 수령 세포에 진입을 지연 및/또는 그 양을 감소시킨다. 그런 이유로, 유용한 항체는 수령 세포 안에서 발생되는 tau 응집 양을 감소시킨다.
한 측면에서, 본 명세서에서 유용한 항체는 단리되고, 특징화되고, 정제된 항체들에서 기능적이며, 그리고 살아있는 대상에게 투여되었을 때 기능적 치료 조성물에 사용을 위하여 회수된(획득된) 항체들을 포함한다. 또다른 측면에서, 본 명세서에서 유용한 항체는 단리되고, 특징화되고, 정제된 항체들에서 기능적이며, 그리고 살아있는 대상에서 획득된 생물학적 시료 내에서 tau 응집을 탐지하기 위하여 그리고 대상의 일생에 걸쳐 tau 응집과 연합된 증상의 발달을 예측하기 위한 분석에 이용하기 위하여 회수된(획득된) 항체들을 포함한다. 또다른 측면에서, 본 명세서에서 유용한 항체는 단리되고, 특징화되고, 정제된 항체들에서 기능적이며, 그리고 살아있는 대상에서 획득된 생물학적 시료 내에서 tau 응집을 탐지하기 위하여 그리고 대상의 일생에 걸쳐 tau 응집과 연합된 증상의 발달 위험이 증가된 대상을 분류하기 위한 분석에 이용하기 위하여 회수된(획득된) 항체들을 포함한다. 또다른 측면에서, 본 명세서에서 유용한 항체는 단리되고, 특징화되고, 정제된 항체들에서 기능적이며, 그리고 표 A에 열거된 것들 뿐만 아니라 이의 변이체(예를 들면, 인간화된 형태, 키메라 형태, 그리고 면역학적 단편들)이 된다.
Figure pat00001
용어 ＂항체＂는 용어 ＂단클론 항체＂를 포함한다. ＂단클론 항체＂는 단일 복사체 또는 클론, 가령, 임의의 진핵생물, 원핵생물, 또는 파아지 클론이 포함된 클론으로부터 유도된 항체를 지칭한다. ＂단클론 항체＂는 하이브리도마 기술을 통하여 생산된 항체에 한정되지 않는다. 단클론 항체는 당분야에 공지된 가령, 하이브리도마 기술 뿐만 아니라 재조합 기술, 파아지 디스플레이 기술, 합성 기술 또는 이러한 기술과 당분야에 이미 공지된 다른 기술의 복합을 이용하여 만들 수 있다. 더욱이, 단클론 항체는 탐지가능한 라벨로 라벨될 수 있으며, 고형상에 고정되거나 및/또는 당분야에 공지된 방법들에 따라 이종(heterologous) 화합물 (가령, 효소 또는 톡신)에 접합될 수 있다.
더욱이, ＂항체＂는 기능적 단클론 항체, 또는 면역학적으로 효과적인 이의 단편; 이를 테면, Fab, Fab＇, 또는 F(ab＇)2 단편을 의미한다. 본 명세서의 일부 내용에 있어서, 단편은 강조를 하기 위하여 특별히 언급된 것이지만, 그럼에도 불구하고, 단편의 특정화와 관계없이, 용어 ＂항체＂는 이러한 단편 뿐만 아니라 단일 쇄 형태가 포함되는 것으로 이해될 것이다. 단백질이 의도된 표적에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 한, 이 단백질은 용어 ＂항체＂ 안에 포함된다. 또한 예를 들어 단일 쇄, 형태 일반적으로 특이성을 가진 항체의 Fv 영역으로 지정된 단일 쇄 또한 ＂항체＂에 포함된다. 바람직하게는, 그러나 반드시 필수적인 것은 아니지만, 이 발견에 유용한 항체는 재조합적으로 생산되는데, 이들을 인간화된 형태로 전환시키기 위하여 적절한 특이성을 가진 전형적으로 뮤린 또는 다른 비-인간 항체의 조작이 필요하다. 항체들은 글리코실화될 수 있으며, 또는 글리코실화되지 않을 수 있다. 항체들은 공지된 바와 같이 이황화 결합을 통하여 적절하게 교차-연계된다.
본 명세서에서 유용한 항체의 기본 항체 단위는 사량체(tetramer)를 포함한다. 각 사량체는 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄로 구성되며, 각 쌍은 한 개의 ＂경쇄＂ (약 25 kDa)와 한 개의 ＂중쇄＂ (약 50-70 kDa)를 가진다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인지를 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산으로 된 가변 영역을 포함한다. 각 쇄의 카르복시-말단 부분은 주로 작동체(effector) 기능을 담당하는 불변 영역으로 정의된다.
본 명세서에서 유용한 항-tau 항체는 단리되고, 특징화되고, 정제되어, 기능을 하며, 이들을 제조하기 위한 공정으로부터 유용한 형태로 회수(획득된)되고, 따라서 치료적으로, 의약적으로 또는 진단적으로 충분한 양으로 이용될 수 있는 항체를 포함한다.
경쇄는 감마, 뮤(mu), 알파 및 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 입실론으로 분류되며, 차례로 IgO, IgM, IgA, IgD 및 IgE으로 항체의 동형(isotype)으로 특징된다. 경쇄와 중쇄 안에, 가변 영역과 불변 영역은 약 12 또는 그 이상의 아미노산으로 된 ＂J＂ 영역에 의해 연결되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산으로 된 ＂D＂ 영역을 포함한다.
각 경쇄/중쇄의 가변 영역 쌍들은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 고유 항체는 두 개의 결합 부위를 갖는다. 이 쇄들은 상보성 결정 영역(이하 ＂CDRs＂로 통칭함)이라고도 불리는 3개의 초가변 영역에 연결된 상대적으로 보존된 골격 영역(FR) 구조로 된 동일한 일반적인 구조를 나타낸다. 2개 쇄로부터 CDRs은 기본골격 영역과 나란이 정렬되어, 특이적 에피토프에 결합할 수 있다. N-말단에서 부터 C-말단까지, 경쇄와 중쇄는 각각 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 도메인을 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산 할당은 공지의 협정에 따른다 (Kabat ＂Sequences of Proteins of Immunological Interest＂ National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991; Chothia, et al, J. Mol. Bio. (1987) 196:901-917; Chothia, et al., Nature (1989) 342:878-883 참고).
한 측면에서, 단클론 항-tau 항체는 포유동물의 면역접종의 표준 기술에 의해 적절한 특이성을 가지도록 생성되고, 상기 포유동물의 항체-생산 세포로부터 하이브리도마가 형성되거나 또는 그렇지않으면 이들을 불사화시키고, 그리고 하이브리도마 또는 불사화된 세포들을 배양하여 적절한 특이성에 대해 평가된다. 현재 경우, 이러한 항체는 예를 들면, 인간, 토끼, 렛 또는 마우스에게 tau 단백질 코딩 서열의 영역 또는 적절한 이의 하위영역을 포괄하는 에피토프를 제시하는 펩티드로 면역접종하여 만들어질 수 있다. 재조합 조작을 위한 물질은 이를 생산하는 하이브리도마 또는 다른 세포로부터 원하는 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 되찾음으로써 획득될 수 있다. 이들 뉴클레오티드 서열은 조작되고, 단리되고, 특징화되고, 정제되고, 그리고 회수되어 원한다면 본 명세서의 용도를 위하여 인간화된 형태로 제공된다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이 ＂인간화된 항체＂는 비-인간 상보성 결정 영역 (＂CDR＂)을 보유하는 항체의 서열을 변경시킴으로써 인간 항체 생식계로부터 유도된 부분적인 또는 전장의 아미노산 서열로 구성된 항-tau 항체를 포함한다. 이러한 변경중 가장 간단한 변경은 뮤린 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 간단히 대체하는 것으로 구성될 수 있으며, 따라서 약학 용도로 수용가능한 충분히 낮은 면역원성을 보유할 수 있는 인간/뮤린 키메라가 생성된다. 그러나, 바람직하게는 항체의 가변 영역과 심지어 CDR 또한 당분야에 현재 잘 공지된 기술에 의해 인간화된다. 가변 영역의 기본골격 영역은 비-인간 CDR을 실질적으로 온전하게 남겨두고 대응하는 인간 기본골격 영역으로 대체하거나, 또는 인간 게놈으로부터 유도된 세열로 CDR을 대체한다. CDRs은 tau에 대한 결합 활성 및 친화력은 온전한 인간 생식계통 기본골격 영역 또는 실질적으로 인간의 기본골격에서 유지되거나 또는 강화되도록 또한 무작위로 돌연변이될 수 있다. 실질적인 인간 기본골격은 공지의 인간 기본골격 서열과 90%, 95%, 또는 99% 서열 상동성을 갖는다. 완전하게 유용한 인간 항체는 유전학적으로 변형된 마우스에서 또한 만들어질 수 있는데, 마우스의 면역계는 인간 면역계에 대응하도록 변경되었다. 상기에서 언급된 바와 같이, 단일 쇄 형태를 제시하는 단편이 포함된 항체의 면역학적으로 특이적 단편을 이용하기 위하여 이 발명의 방법에 충분히 이용된다.
더우기, 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 ＂인간화된 항체＂는 인간 기본골격, 비-인간 항체로부터 최소한 하나의 CDR을 포함하는 항-tau 항체를 말하며, 그리고 이때 임의의 불변 영역은 인간 면역글로블린 불변 영역과 실질적으로 동일한데, 예를 들면 최소한 약 85-90%, 바람직하게는 최소한 95% 동일하다. 그러한 이유로, 가능한한 CDRs을 제외하고, 인간화된 항체의 모든 부분은 하나 또는 그 이상의 고유 인간 면역글로블린 서열의 대응하는 쌍에 실질적으로 동일하다.
원한다면, 인간화된 면역글로블린의 기획은 다음과 같이 실행될 수 있다. 아미노산이 다음의 범주에 속할 때, 이용되는 인간 면역글로블린(수용체 면역글로블린)의 기본골격 아미노산은 CDR-제공 비-인간 면역글로블린 (공여자 면역글로블린)의 기본골격 아미노산으로 대체된다: (a) 수용체 면역글로블린의 인간 기본골격 영역의 아미노산은 그 위치에서 인간 면역글로블린에 대해 비통상적이며, 반면 공여자 면역글로블린에서 대응하는 아미노산은 그 위치에서 인간 면역글로블린에 대해 전형적이며; (b) 아미노산 위치는 CDRs중 하나에 바로 인접하고; 또는 (c) 기본골격 아미노산의 임의의 측쇄 원자는 3차원 면역글로블린 모델에서 CDR 아미노산의 임의의 원자의 약 5-6 옹스트롱 (중심에서 중심까지)내에 있다 (Queen, et al., op. cit., and Co, ct al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2869). 수용체 면역글로블린의 인간 기본골격 영역내 각 아미노산과 공여자 면역글로블린에서 대응하는 아미노산이 그 위치에서 인간 면역글로블린에 대해 비통상적인 경우, 이러한 아미노산은 그 위치에서 인간 면역글로블린에 전형적인 아미노산으로 대체된다.
모든 경우에서, 본 발명의 항체는 tau에 특이적으로 결합한다. 예시적인 구체예들에 있어서, 본 발명의 항체는 인간 tau에 특이적으로 결합한다. 본 명세서에서 구절 ＂특이적으로 결합한다＂란 친화력 상수 또는 상호작용 친화도(Affinity of nteraction)(KD)가 0.1 pM 내지 10 nM, 바람직하게는 0.1 pM 내지 1 nM 범위를 가지고 단백질에 결합하는 항체를 말한다. 다양한 종으로부터 tau 서열이 당업계에 공지되어 있고, 항체가 tau에 결합하는 지를 결정하는 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 실시예를 참고한다.
본 발명의 항체는 또한 단일 쇄 가변 단편 (scFv)으로 공지된 융합 단백질로 이용될 수 있다. 이들 scFvs는 링커에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 구성된다. 반드시 그런 것은 아니지만 대부분의 경우 링커는 펩티드일 수 있다. 링커 펩티드의 길이는 바람직하게는 약 10 내지 25개 아미노산이다. 바람직하게는, 링커 펩티드는 글리신, 뿐만 아니라 세린 또는 트레오닌이 풍부하다. ScFvs는 파아지 디스플레이를 시행하는데 이용될 수 있으며 또는 유동 세포분석, 면역조직화학에 이용되거나, 또는 도메인들을 표적화하는데 이용될 수 있다. scFvs를 만들고, 이용하는 방법들은 당업계에 공지되어 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 scFvs는 인간 불변 도메인에 접합된다(conjugated). 일부 구체예들에 있어서, 중쇄 불변 도메인은 IgG 도메인, 이를 테면 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 유도된다. 다른 구체예들에 있어서, 중쇄 불변 도메인은 IgA, IgM, 또는 IgE로부터 유도될 수 있다.
tau에 결합하는 본 발명의 단리된 항체는 몇 가지 에피토프중 하나를 바람직하게 인지한다. 한 구체예에 있어서, tau에 결합하는 본 발명의 단리된 항체는 표 A에 열거된 에피토프를 인지한다. 또다른 구체예에서, tau에 결합하는 본 발명의 단리된 항체는 서열 번호: 1 (DRKDQGGYTMHQD)의 아미노산 서열 안에 에피토프를 인지한다. 바람직하게는, 단리된 항체는 서열 번호: 1의 최소한 6개의 연속 아미노산 내에, 서열 번호: 1의 최소한 7개의 연속 아미노산 내에, 서열 번호: 1의 최소한 8개의 연속 아미노산 내에, 서열 번호: 1의 최소한 9개의 연속 아미노산 내에, 서열 번호: 1의 최소한 10개의 연속 아미노산 내에, 서열 번호: 11의 최소한 6개의 연속 아미노산 내에, 서열 번호: 1의 최소한 12개의 연속 아미노산 내에, 그리고 서열 번호: 1의 최소한 13개의 연속 아미노산이 포함된, 서열 번호: 1의 최소한 3개의 아미노산 내에 있는 에피토프를 인지한다. 예시적인 구체예에 있어서, 서열 번호: 1 내에 에피토프를 인지하는 본 발명의 단리된 항체는 항체 HJ8.5이다. 또다른 예시적인 구체예에서, 서열 번호: 1 내에 에피토프를 인지하는 본 발명의 단리된 항체는 항체 HJ8.1.1이다.
또다른 구체예에서, tau에 결합하는 본 발명의 단리된 항체는 서열 번호: 2 (KTDHGAE)의 아미노산 서열 안에 에피토프를 인지한다. 바람직하게는, 단리된 항체는 서열 번호: 2의 최소한 4개 연속 아미노산 내에, 서열 번호: 2의 최소한 5개 연속 아미노산 내에, 서열 번호: 2의 최소한 6개 연속 아미노산 내에, 그리고 서열 번호: 2의 최소한 7개 연속 아미노산이 포함된, 서열번호:2의 최소한 3개의 연속 아미노산 내 에피토프를 인지한다. 예시적인 구체예에 있어서, 서열 번호: 2 내에 에피토프를 인지하는 본 발명의 단리된 항체는 항체 HJ8.1.2이다. 또다른 예시적인 구체예에서, 서열 번호: 2 내에 에피토프를 인지하는 본 발명의 단리된 항체는 항체 HJ8.4이다.
또다른 구체예에서, tau에 결합하는 본 발명의 단리된 항체는 서열 번호: 3 (PRHLSNV)의 아미노산 서열 안에 에피토프를 인지한다. 바람직하게는, 단리된 항체는 서열 번호: 3의 최소한 4개 연속 아미노산 내에, 서열 번호: 3의 최소한 5개 연속 아미노산 내에, 서열 번호: 3의 최소한 6개 연속 아미노산 내에, 그리고 서열 번호: 3의 최소한 7개 연속 아미노산이 포함된, 서열번호: 3의 최소한 3개의 연속 아미노산 내 에피토프를 인지한다. 예시적인 구체예에 있어서, 서열 번호: 3 내에 에피토프를 인지하는 본 발명의 단리된 항체는 항체 HJ8.2이다. 또다른 예시적인 구체예에서, 서열 번호: 3 내에 에피토프를 인지하는 본 발명의 단리된 항체는 항체 HJ8.3이다.
여전히 또다른 구체예에서, tau에 결합하는 본 발명의 단리된 항체는 서열 번호: 4 (EPRQ)의 아미노산 서열 안에 에피토프를 인지한다. 바람직하게는, 단리된 항체는 서열 번호: 4의 최소한 4개 연속 아미노산이 포함된 서열번호: 4의 최소한 3개의 연속 아미노산 내 에피토프를 인지한다. 예시적인 구체예에 있어서, 서열 번호: 4 내에 에피토프를 인지하는 본 발명의 단리된 항체는 항체 HJ8.8이다.
여전히 또다른 구체예에서, tau에 결합하는 본 발명의 단리된 항체는 서열 번호: 5 (AAGHV)의 아미노산 서열 안에 에피토프를 인지한다. 바람직하게는, 단리된 항체는 서열 번호: 5의 최소한 4개 연속 아미노산, 서열 번호: 5의 최소한 5개 연속 아미노산이 포함된 서열번호: 5의 최소한 3개의 연속 아미노산 내 에피토프를 인지한다. 예시적인 구체예에 있어서, 서열 번호: 5 내에 에피토프를 인지하는 본 발명의 단리된 항체는 항체 HJ8.7이다.
추가 구체예에서, tau에 결합하는 본 발명의 단리된 항체는 서열 번호: 6 (TDHGAEIVYKSPVVSG)의 아미노산 안에 에피토프를 인지한다. 바람직하게는, 단리된 항체는 서열 번호: 6의 최소한 6개 연속 아미노산, 서열 번호: 6의 최소한 7개 연속 아미노산, 서열 번호: 6의 최소한 8개 연속 아미노산, 서열 번호: 6의 최소한 9개 연속 아미노산, 서열 번호: 6의 최소한 10개 연속 아미노산, 서열 번호: 6의 최소한 11개 연속 아미노산, 서열 번호: 6의 최소한 12개 연속 아미노산, 서열 번호: 6의 최소한 13개 연속 아미노산, 서열 번호: 6의 최소한 14개 연속 아미노산, 서열 번호: 6의 최소한 15개 연속 아미노산, 그리고 서열 번호: 6의 최소한 16개 연속 아미노산이 포함된, 서열 번호: 6의 최소한 5개 연속 아미노산 안의 에피토프를 인지한다. 예시적인 구체예에 있어서, 서열 번호: 6 내에 에피토프를 인지하는 본 발명의 단리된 항체는 항체 HJ9.1이다.
또다른 구체예에서, tau에 결합하는 본 발명의 단리된 항체는 서열 번호: 7 (EFEVMED)의 아미노산 서열 안에 에피토프를 인지한다. 바람직하게는, 단리된 항체는 서열 번호: 7의 최소한 4개 연속 아미노산, 서열 번호: 7의 최소한 5개 연속 아미노산, 서열 번호: 7의 최소한 6개 연속 아미노산, 그리고 서열 번호: 7의 최소한 7개 연속 아미노산이 포함된, 서열 번호: 7의 최소한 3개 연속 아미노산 내 에피토프를 인지한다. 예시적인 구체예에 있어서, 서열 번호: 7 내에 에피토프를 인지하는 본 발명의 단리된 항체는 항체 HJ9.2이다. 예시적인 구체예에 있어서, 서열 번호: 7 내에 에피토프를 인지하는 본 발명의 단리된 항체는 항체 HJ9.4이다. 예시적인 구체예에 있어서, 서열 번호: 7 내에 에피토프를 인지하는 본 발명의 단리된 항체는 항체 HJ9.5이다.
여전히 또다른 구체예에서, tau에 결합하는 본 발명의 단리된 항체는 서열 번호: 8 (GGKVQIINKK)의 아미노산 서열 안에 에피토프를 인지한다. 바람직하게는, 단리된 항체는 서열 번호: 8의 최소한 4개 연속 아미노산, 서열 번호: 8의 최소한 5개 연속 아미노산, 서열 번호: 8의 최소한 6개 연속 아미노산, 서열 번호: 8의 최소한 7개 연속 아미노산, 서열 번호: 8의 최소한 8개 연속 아미노산, 서열 번호: 8의 최소한 9개 연속 아미노산 그리고 서열 번호: 8의 최소한 10개 연속 아미노산이 포함된, 서열 번호: 8의 최소한 3개 연속 아미노산 내 에피토프를 인지한다. 예시적인 구체예에 있어서, 서열 번호: 8 내에 에피토프를 인지하는 본 발명의 단리된 항체는 항체 HJ9.3이다.
바람직한 항체는 HJ8.5로 지정된 하이브리도마로부터 유도된 마우스 항체의 인간화된 형태다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 ＂~로부터 유도된＂이란 ＂유도된＂ 항체가 항체 생산 하이브리도마 HJ8.5로부터 최소한 하나의 CDR 영역을 포함한다는 의미다. 다른 방식으로 말하자면, ＂유도된 항체＂는 서열 번호: 16, 17, 18, 19, 20 및 21로 구성된 집단으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 최소한 하나의 CDR 영역을 포함한다.
한 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 하이브리도마 HJ8.5로부터 유도될 수 있으며, 그리고 서열 번호:12의 경쇄 가변 영역에 대하여 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 포함하는 핵산 서열에 의해 인코드될 수 있거나, 또는 서열 번호:13의 중쇄 가변 영역에 대하여 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 포함하는 핵산 서열에 의해 인코드될 수 있다. 또다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 하이브리도마 HJ8.5로부터 유도될 수 있으며, 그리고 서열 번호:14의 경쇄 가변 영역에 대하여 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 포함하는 핵산 서열에 의해 인코드될 수 있거나, 또는 서열 번호:15의 중쇄 가변 영역에 대하여 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 포함하는 핵산 서열에 의해 인코드될 수 있다. 상기 각 구체예에 있어서, 항체는 인간화될 수 있다.
tau에 결합하는 본 발명의 항체의 예시적인 구체예에 있어서, 항체는 서열 번호:12의 경쇄 핵산 서열과 서열 번호:13의 중쇄 핵산 서열을 포함한다 [가령 여기에서 언급된 단클론 항체는 HJ8.5이다]. tau에 결합하는 본 발명의 항체의 또다른 예시적인 구체예에서, 항체는 서열 번호:14의 경쇄 핵산 서열과 서열 번호:15의 중쇄 핵산 서열을 포함한다 [가령 여기에서 언급된 단클론 항체는 HJ8.5이다].
한 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 이를 테면 표 B의 항체 1의 경쇄 CDR1을 포함할 수 있다. 또다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 표 B의 항체 4의 경쇄 CDR2를 포함할 수 있다. 또다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 표 B의 항체 6의 경쇄 CDR3을 포함할 수 있다. 대안 구체예에서, 본 발명의 항체는 이를 테면 표 B의 항체 2, 3, 및 5의 2개 또는 3개 경쇄 CDRs의 조합을 포함할 수 있다.
유사하게, 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 이를 테면 표 B의 항체 7의 경쇄 CDR1을 포함할 수 있다. 또다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 표 B의 항체 10의 경쇄 CDR2를 포함할 수 있다. 또다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 표 B의 항체 12의 경쇄 CDR3을 포함할 수 있다. 대안 구체예에서, 본 발명의 항체는 이를 테면 표 B의 항체 8, 9, 및 11의 2개 또는 3개 경쇄 CDRs의 조합을 포함할 수 있다
대안으로, 본 발명의 항체는 이를 테면, 표 B의 항체 13-48의 하나 또는 그 이상의 경쇄 CDRs 그리고 하나 또는 그 이상의 중쇄 CDRs을 포함할 수 있다.
Figure pat00002
Figure pat00003
다양한 구체예들에 있어서, 본 발명의 항체는 인간화된다. 예를 들면, 한 구체예에서, 인간화된 본 발명의 항체는 0 내지 2개의 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열 서열 번호: 16의 CDR1, 0 내지 2개의 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열 서열 번호: 17의 CDR2, 그리고 0 내지 2개의 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열 서열 번호: 18의 CDR3이 포함된 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 또는 인간화된 본 발명의 항체는 0 내지 2개의 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열 서열 번호: 19의 CDR1, 0 내지 2개의 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열 서열 번호: 20의 CDR2, 그리고 0 내지 2개의 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열 서열 번호: 21의 CDR3이 포함된 중쇄 가변 영역을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 인간화된 본 발명의 항체는 0 내지 2개의 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열 서열 번호: 16의 CDR1, 0 내지 2개의 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열 서열 번호: 17의 CDR2, 0 내지 2개의 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열 서열 번호: 18의 CDR3이 포함된 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 또는 인간화된 본 발명의 항체는 0 내지 2개의 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열 서열 번호: 19의 CDR1, 0 내지 2개의 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열 서열 번호: 20의 CDR2, 그리고 0 내지 2개의 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열 서열 번호: 21의 CDR3이 포함된 중쇄 가변 영역을 포함한다. 예시적인 구체예에 있어서, 인간화된 본 발명의 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 16의 CDR1, 아미노산 서열 서열 번호: 17의 CDR2, 아미노산 서열 서열 번호: 18의 CDR3이 포함된 경쇄 가변 영역과, 아미노산 서열 서열 번호: 19의 CDR1, 아미노산 서열 서열 번호: 20의 CDR2, 아미노산 서열 서열 번호: 21의 CDR3이 포함된 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 본 발명은 서열 번호: 16, 17, 18, 19, 20, 그리고 21의 대응하는 핵산 서열을 또한 포함하는데, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정되며, 그리고 본 발명의 항체를 발현시키기 위하여, 벡터 또는 다른 큰 DNA 분자, 이를 테면 염색체 안에 혼입시킬 수 있다.
II. 사용 방법
한 측면에서, 본 발명은 살아있는 대상에게 투여되는 기능적 치료 조성물에 이용되는 항체를 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 살아있는 대상으로부터 획득된 생물학적 유체의 시료 안에 tau를 탐지하기 위하여 면역분석에 이용되는 항체를 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 살아있는 대상으로부터 획득된 생물학적 유체의 시료 안에 tau 응집 양을 측정하기 위한 면역분석에 이용되는 항체를 제공한다. 대상으로부터 획득된 생물학적 유체의 시료 안에 tau 응집 양을 이용하여 대상을 tau 응집량이 많은 또는 응집량이 적은 대상으로 분류할 수 있으며, 그리고 대상의 일생에서 tau 응집과 관련된 증상 및/또는 질환의 발달 위험을 예측하는데 더 이용될 수 있다.
적합한 대상은 인간, 가축 동물, 반려 동물, 실험 동물, 그리고 동물원 동물을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 한 구체예에 있어서, 상기 대상은 설치류, 가령 마우스, 렛, 기니아 피그, 등이 될 수 있다. 또다른 구체예에서, 상기 대상은 가축 동물일 수 있다. 적합한 가축 동물의 비-제한적 예로는 돼지, 소, 말, 염소, 양, 라마, 그리고 알파카가 포함될 수 있다. 여전히 또다른 구체예에 있어서, 상기 대상은 반려 동물일 수 있다. 반려 동물의 비-제한적 예로는 애완동물, 이를 테면 개, 고양이, 토끼 그리고 새가 포함될 수 있다. 여전히 또다른 구체예에 있어서, 상기 대상은 동물원 동물일 수 있다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, ＂동물원 동물＂은 동물원에서 볼 수 있는 동물을 말한다. 이러한 동물은 비-인간 영장류, 큰 고양이, 늑대 및 곰이 포함될 수 있다. 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 동물은 실험실 동물이다. 실험실 동물의 비-제한적 예는 설치류, 갯과, 고양잇과 그리고 비-인간 영장류가 포함될 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 동물은 설치류다. 설치류의 비-제한적인 예로는 마우스, 렛, 기니아 피그 등이 포함될 수 있다. 상기 동물이 마우스인 구체예들에 있어서, 상기 마우스는 C57BL/6 마우스, Balb/c 마우스, 129sv, 또는 임의의 다른 실험실 계통일 수 있다. 예시적인 구체예에 있어서, 상기 대상은 C57BL/6J 마우스다. 바람직한 구체예에서, 상기 대상은 인간이다.
A. 처리 방법
한 측면에서, 본 발명은 대상의 뇌에서 tau 응집 확산을 감소시키는 방법을 포함한다. 또다른 측면에서 본 발명은 tau 씨드에 의해 유도되는 tau의 세포내 응집을 감소시키는 방법을 제공한다. 각 측면에서, 상기 방법은 약학적으로 효과적인 양의 항-tau 항체를 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 적합한 항체는 상기 Section I에서 설명된다. 바람직한 구체예에서, 항체는 인간화된 항체, 키메라 항체 또는 면역학적 이의 단편이 포함된 표 1의 항체와 표 2의 항체로 구성된 집단으로부터 선택된다.
대상은 약학적으로 효과적인 양의 항-tau 항체를 투여하기 전, tau 응집과 연합된 증상을 보유하거나 또는 보유하지 않을 수 있다. 다르게 표현하자면, 대상은 tau 응집과 연합된 증상을 경험하거나 또는 경험하지 않을 수 있다. 당업자는 병적 tau 응집은 tau 응집과 연합된 증상의 진단 또는 발병 전에 시작될 가능성이 있음을 인지할 것이다. 일부 구체예들에 있어서, 대상은 tau 응집과 연합된 증상을 가지고 있다. 다른 구체예들에 있어서, 대상은 tau 응집과 연합된 증상을 가지고 있지 않다. 여전히 다른 구체예들에 있어서, 대상은 탐지가능한 tau 병리학을 보유하지만, 임의의 다른 tau 응집과 연합된 증상을 가지고 있지 않다. 대상의 뇌 안에 tau 응집 확산의 감소는 tau의 병적 응집과 연합된 증상의 발달 및/또는 진행을 감소시킬 수 있다.
원섬유 tau 응집의 전파 저지는 tau 응집의 생성 및 확산과 연합된 병리를 치료할 수 있다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 ＂치료하는＂ 또는 ＂치료＂에는 tau 응집과 연합된 증상중 최소한 한 가지 증상 또는 징후의 방지, 약화, 반전 또는 개선이 포함된다. tau 응집과 연합된 증상의 한 가지 정의는 부분적으로 tau 원섬유로 구성된 tau 응집의 형성에 의해 야기되는 임의의 증상을 지칭한다. tau 응집과 연합된 증상을 갖는 예시적인 장애는 진행핵상마비, 권투선수 치매 (만성 외상뇌병증), 전두측두엽 치매 그리고 염색체 17에 연계된 파킨슨증, Lytico-Bodig 질환 (괌의 파긴슨성 치매 컴플렉스), 매듭-우위 치매(tangle-predominant dementia), 신결절신경아교종 및 신경절세포종, 수막혈관주위세포종, 아급성경화범뇌염, Pick＇s 질환, 피질기저퇴행, 호은성의 입자 질환 (AGD), 전두엽성 변성, 알츠하이머 질환, 및 전두측두엽 치매를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 이들 장애의 진단 방법들은 당업계에 잘 공지되어 있다.
예시적인 tau 응집과 연합된 증상은 손상된 인지 기능, 변형 거동, 감정 조절장애, 발작, 그리고 손상된 신경계 구조 또는 기능을 포함할 수 있다. 손상된 인지 기능은 기억, 주위, 집중, 언어, 추상적 사고, 창의성, 실행 기능, 계획, 및 조직화의 곤란을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 변형 거동은 신체적 또는 언어적 공격성, 충동성, 감소된 억제, 무감동, 감소된 자주성(initiation), 인성의 변화, 알코올, 담배 및 약물의 남용 그리고 기타 중독-관련된 행동을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 감정 조절장애는 우울, 불안, 조증, 과민 그리고 감정 무절제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 발작은 강직간대 발작(generalized tonic-clonic seizures), 복합 부분 발작, 그리고 비-간질성, 정신성 발작을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 손상된 신경계 구조 또는 기능은 수두증(hydrocephalus), 파킨슨증, 수면 장애, 정신병, 균형 및 협응 손상을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 여기에는 운동 손상 이를 테면 단불완전마비, 반신불완전마비, 사지불완전마비, 실조, 도리깨질증 및 떨림이 포함된다. 여기에는 후각, 촉각, 미각, 시각 및 청각 감각이 포함된, 감각 손상 또는 이상기능이 포함된다. 더욱이, 여기에는 자율 신경계 손상 이를 테면 장 및 방광 기능이상, 성 기능이상, 혈압 및 체온 조절장애가 포함된다. 끝으로, 여기에는 시상하부 및 뇌하수체의 기능이상에 기여하는 호르몬 손상 이를 테면 성장호르몬, 갑상샘자극호르몬, 황체화 호르몬, 난포자극호르몬, 생식샘자극호르몬, 프로락틴, 그리고 다수의 기타 호르몬 및 조절물질의 결핍 및 조절장애가 포함된다. tau 응집과 연합된 증상을 탐지하고 평가하는 방법들은 당업계에 잘 공지되어 있다.
일부 구체예들에 있어서, tau 응집과 연합된 증상은 치매를 말한다. 치매는 자체가 특이적 질환은 아니지만, 일상의 활동을 수행하는 개인의 능력을 감소시키는데 충분한 심각한 기억 및 기타 사고력의 감소와 연관된 광범위한 증상을 설명하는 종합적인 용어다. 치매는 tau 응집과 연합된 많은 질환의 공유적 임상적 특징이기도 하다. 당업자는 치매의 중증도를 진단하는데 이용가능한 여러 방법들을 잘 알고 있을 것이다. 예를 들면, 치매에 대한 몇 가지 인지 테스트와 선별 질문지는 당업계에 공지되어 있고, 모두다 다양한 수준의 민감도와 특수성을 가진다. 비-제한적 예로는 간이 정신 상태 검사 (MMSE), 약식 정신 검사 테스트 점수 (AMTS), 변형된 간이 정신 상태 검사 (3MS), 인지 능력 선별 기구(CASI), 선-추적 검사, 시계 그리기 검사, 노인의 인지 감소에 대한 정보 질문지, 인지에 관한 일반의의 평가, 임상 치매 등급(CDR), 노화와 치매를 구별하기 위한 8개 항목 정보 인터뷰 (AD8)를 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 치매 증상의 중증도는 CDR을 이용하여 정량화된다. CDR을 이용하여, 등급 0은 증상이 없음을 나타내고, 등급 0.5는 매우 가벼운 증상을 나타내고, 등급 1은 경도 증상, 등급 2는 중간 증상, 그리고 등급 3은 심각한 증상을 나타낸다. 따라서, 대상의 CDR의 임의 증가는 인지 능력이 악화되며, 치매의 증가를 말한다. 더욱이, CDR이 0에서 0이상으로 증가됨은 치매의 발달 또는 개시를 나타낸다.
일부 구체예들에 있어서, tau 응집과 연합된 증상은 tau 병리학을 말한다. 용어 ＂tau 병리학＂이란 tau의 병적 응집을 말한다. 일부 구체예들에 있어서, tau 병리학은 신경섬유다발을 말한다. 다른 구체예들에 있어서, tau 병리학은 과인산화된 tau를 말한다. 여전히 다른 구체예들에 있어서, tau 병리학은 질환이 없는 개체에서 발견되는 것보다 1.2 내지 대략 40-배 높은, 혈액, 혈장, 혈청, CSF, 또는 ISF, 임의의 지역에서 탐지가능한 높은 수준의 tau 응집을 말한다. tau의 병적 응집을 탐지하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 실시예에서 더 상세하게 설명된다.
예시적인 구체예에 있어서, 대상의 뇌에서 tau 응집 확산을 감소시키는 방법은 약학적으로 효과적인 양의 항-tau 항체를 상기 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 이때 항체는 0 내지 2개의 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열 서열 번호: 16의 CDR1이 포함된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체, 0 내지 2개의 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열 서열 번호: 17의 CDR2가 포함된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체 0 내지 2개의 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열 서열 번호: 18의 CDR3이 포함된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체, 0 내지 2개의 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열 서열 번호: 19의 CDR1이 포함된 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체, 0 내지 2개의 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열 서열 번호: 20의 CDR2가 포함된 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체, 그리고0 내지 2개의 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열 서열 번호: 21의 CDR3이 포함된 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체로 구성된 집단에서 선택된다.
또다른 예시적인 구체예에서, 대상의 뇌에서 tau 응집 확산을 감소시키는 방법은 약학적으로 효과적인 양의 항-tau 항체를 상기 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 이때 항체는 tau에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 1 (DRKDQGGYTMHQD)이 포함된 에피토프를 인지한다.
또다른 예시적인 구체예에서, 대상의 뇌에서 tau 응집 확산을 감소시키는 방법은 약학적으로 효과적인 양의 항-tau 항체를 상기 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 이때 항체 tau에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 1 (DRKDQGGYTMHQD)이 포함된 에피토프를 인지한다.
제약학적 등급에서 바람직한, 면역학적으로 활성 단편이 포함된 약학적으로 효과적인 양의 항체는 대상에게 투여될 수 있다. 투여는 표준 효과 기술을 이용하여 중추 신경계의 주변 (가령, 중추 신경계에 투여하지 않고) 또는 중추 신경계에 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 말초 투여는 정맥내, 복막내, 피하내, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 볼, 혀밑, 또는 좌약 투여가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 중추 신경계 (CNS)에 직접 투여하는 것을 포함하는 국소 투여는 요추(lumbar), 뇌실안(intraventricular) 또는 실질조직내( intraparenchymal) 카테테르를 통하여 또는 외과적으로 이식된 조절 방출 제형을 이용하는 것이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
효과적인 투여용 약학 조성물은 선택된 투여 방식에 적합하도록 신중하게 기획되며, 그리고 약학적으로 수용가능한 부형제, 이를 테면 양립가능한 분산제, 완충액, 계면활성제, 보존제, 가용화제, 등장성 물질, 안정화제 및 이와 유사한 물질이 적절하게 이용된다. Remington＇s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa., 16Ed ISBN: 0-912734-04-3, 최신판(본 명세서에 참고자료로 편입된)는 실무자들에게 일반적으로 알려진 것과 같은 제형 기술의 개요를 제공한다. 이는 본 발견에 유용한 항체의 용해도 특징을 변경하는데 특히 유용할 수 있는데, 예를 들면, 항체를 리포좀 안에 포집시킴으로써 또는 극성 집단을 차단시킴으로써 항체를 더욱 친지성이 되도록 만들 수 있다.
정맥내 또는 복막내 또는 피하내 주사에 의한 효과적인 말초계 전달은 살아있는 환자에게 바람직한 투여 방법이다. 이러한 주사를 위한 적합한 운반체들은 단단하다. 그러나, 또한, 투여는 비강 에어로졸 또는 좌약에 의해 점막을 통하여 효과를 가질 수 있다. 이러한 투여 방법을 위한 적합한 제형은 잘 알려져있으며, 일반적으로 막을 통과하는 전달을 실행할 수 있는 계면활성제가 포함된다. 이러한 계면활성제는 대개 스테로이드로부터 유도되거나 또는 양이온 지질, 이를 테면 N-[1-(2,3-디올레일)프로필]-N,N,N-트리메틸 암모늄 클로라이드 (DOTMA) 또는 다양한 화합물, 이를 테면 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 포스파티딜 글리세롤 및 이와 유사한 것들이다.
투여되는 제형내 인간화된 항체의 농도는 효과적인 양이며, 중량의 약 0.1% 정도의 낮은 범위에서 약 15 또는 약 20% 범위의 높은 범위가 되고, 유체 용적, 점성 등에 근거하여 주로 선택되고, 필요하다면 선택된 특정 투여 방법에 따라 선택될 것이다. 살아있는 환자에게 주사를 위한 전형적인 조성물은 인산염 완충된 염수의 1-5 mL 살균 완충된 물과 본 발명의 인간화된 항체의 임의의 하나 또는 조합 1-5000 mg을 포함하도록 만들어질 수 있다. 상기 제형은 제형이 만들어진 후 살균 여과될 수 있거나, 또는 미생물학적으로 수용가능하도록 만들어질 수 있다. 정맥내 주입을 위한 전형적인 조성물은 1-250 mL의 유체, 이를 테면 살균 Ringer 용액과 1-100 mg/ml 또는 그 이상의 항-tau 항체 농도를 보유할 수 있다. 발견된 치료제는 냉동되거나 또는 보관을 위하여 동결건조되고, 사용전 적합한 무균제에서 재구성될 수 있다. 동결건조 및 재구성으로 인하여 항체 활성이 다양한 수준으로 상실될 수 있다 (가령 통상적인 면역글로블린의 경우, IgM 항체는 IgG 항체 보다 더 많은 활성 상실을 가지는 경향이 있다). 투여되는 약량은 효과적인 투여량(dosages)이며, 보충되도록 조정될 수 있다. 일반적으로 제약학적 등급의 품질인 제형의 pH는 항체 안정성 (화학적 그리고 물리적)을 유지하고, 투여될 때 환자에게 편안함을 주도록 선택될 것이다. 일반적으로, 4 내지 8 범위의 pH가 용인된다. 투여량은 성공적인 투여를 제공받은 개인의 체격, 체중, 다른 물리적-생리학적 특징에 따라 변화될 것이다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 ＂효과적인 양＂이란 물질이 투여된 환자에게 특정가능하고 유익한 효과, 가령, 유의적인 효과를 유도하는 물질, 이를 테면 화합물의 양을 말한다. 본 발견에 따라 투여되는 화합물의 효과적인 양 또는 투여량은 투여되는 화합물, 투여 경로, 치료되는 증상의 상태, 그리고 유사한 환자 및 투여 상태 고려등을 포함하는 사안의 환경에 따라 결정될 수 있다. 한 측면에서, 전형적인 투여량은 본 명세서에서 설명된 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 항-tau 항체를 포함한다. 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 더 바람직하게는 약 0.1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 또는 0.5 mg/kg 내지 약 50 mg/kg 범위가 될 수 있다. 투여 빈도는 증상을 효과적으로 치료하기 위하여 필요에 따라 매일, 또는 주당 또는 한달에 1회, 2회 3회 또는 그 이상이 될 수 있다. 대안으로, 투여 빈도는 증상을 효과적으로 치료하기 위하여 필요에 따라 3달에 최소한 한번이 될 수 있다. 예를 들면, 약 5주마다, 약 6주마다, 약 7주마다, 약 8주마다, 약 9주마다, 약 10주마다, 약 11주마다, 또는 약 12주마다 투여가 될 수 있다.
질환 자체에 대해 치료를 위한 투여 시기 및 치료 기간은 사안의 환경에 의해 결정될 것이다. 치료는 tau 응집과 연합된 질환의 진단 이후 시작될 수 있다. 대안으로, 치료는 tau 응집과 연합된 증상의 임상적 확인 이후 시작될 수 있다. 더우기, 치료는 tau 병리학의 탐지이후 시작될 수 있다. 치료는 병원 또는 진료소에서 즉시 시작될 수 있고, 병원에서 퇴원 후 또는 외래 환자 진료소에서 진료본 후 나중에 시작될 수 있다. 치료 기간은 1회 기반으로 투여되는 단일 투여에서 부터 일생을 통한 치료과정 범위가 될 수 있다.
비록 전술한 방법이 가장 편리하고 가장 적합할 수 있지만, 본 명세서에서 적절한 제형이 이용된다면, 적합한 조정, 투여를 위한 다른 효과적인 기술, 이를 테면 뇌실란 투여, 경피 투여 및 구강 투여에 의한 단백질 이를 테면 인간화된 항체의 효과적인 투여가 이용될 수 있다.
또한, 생물분해성 필름 및 매트릭스, 또는 삼투성 미니-펌프, 또는 덱스트란 비드, 알긴산염, 또는 콜라겐 기반의 운반 시스템을 이용하여 조절 방출 제형을 이용하는 것이 바람직할 수도 있다.
전형적인 투약 수준은 표준 임상 기술을 이용하여 결정되고, 최적화될 수 있으며, 투여 방식에 따라 달라질 것이다.
B. 생물학적 유체내에서 tau 응집을 탐지하는 방법
한 측면에서, 본 발명은 대상으로부터 획득된 생물학적 유체의 시료 안에서 tau 응집을 탐지하는 수단을 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 대상으로부터 획득된 생물학적 유체의 시료 내에서 tau 응집 양을 측정하는 수단을 제공한다. 상기 방법은 전반적으로 (i) 대상으로부터 생물학적 유체의 시료를 얻고, 그리고 (ii) tau에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 시료내 tau 응집 양을 측정하는 것을 포함한다. 적합한 항체는 상기 Section I에서 설명된다. 적합한 대상은 상기에서 설명된다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 ＂생물학적 유체＂는 대상으로부터 얻은 유체를 말한다. tau 응집이 포함된 임의의 생물학적 유체가 적합하다. 비-제한적 예로는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, CSF 및 ISF를 포함한다. 상기 유체는 ＂그 자체＂로 이용될 수 있고, 세포의 성분들이 유체로부터 단리될 수 있거나, 또는 표준 기술을 이용하여 유체로부터 단백질 분획이 단리될 수 있다.
당업자가 인지할 수 있는 바와 같이, 생물학적 유체의 시료를 수거하는 방법은 생물학적 유체의 성질 및 실행되는 분석 유형에 따라서 변형될 수 있으며, 변형될 것이다. 당업계에 일반적으로 공지된 임의의 다양한 방법들이 이용되어 생물학적 유체의 시료를 수거할 수 있다. 일반적으로 말하자면, 상기 방법은 바람직하게는 본 발명에 따라 tau 응집이 정확하게 탐지되고, 그 양이 측정되도록 시료의 일체성을 유지시킨다.
시료가 일단 획득된 후, 항-tau 항체를 이용하여 tau 응집을 탐지하고, 그 양을 측정하기 위하여 시험관내에서 처리된다. 일부 구체예들에 있어서, 시료내 tau 응집 농도는 탐지 및 측정 전 증가된다. 일부 구체예들에 있어서, tau 응집은 최소한 한 가지 단리된 항-tau 항체를 이용한 탐지 및 측정에 앞서 시료로부터 면역침전된다. 다른 구체예들에 있어서, tau 응집은 최소한 두 가지 단리된 항-tau 항체를 이용한 탐지 및 측정에 앞서 시료로부터 면역침전된다. 최소한 두 가지 항체를 이용하여 tau 응집을 면역침전시키는 구체예들에 있어서, 바람직하게는 제 1 항체는 tau의 제 1 에피토프에 결합하고, 제 2 항체는 tau의 제 2의 비-중첩 에피토프에 결합한다. tau의 2개의 별개 에피토프에 결합하는 2개 항체의 사용은 모든 가능한 tau 응집 이형태체(conformer)를 포획하는데 더 효과적일 수 있다. 면역침전을 위한 적합한 항체 쌍의 비-제한적 예들이 표 C에 열거된다. 바람직한 구체예에서, tau 응집은 최소한 2개의 단리된 항-tau 항체를 이용하여 탐지 및 측정 전 시료로부터 면역침전되며, 이때 최소한 제 1 항체는 서열 번호: 1 안의 에피토프를 인지하고, 최소한 제 2 항체는 서열 번호: 8 안의 에피토프를 인지한다. 당업자는 시료 안의 tau 응집을 탐지 및 측정에 앞서 농축시키거나 또는 면역침전시킬 필요가 있는지에 대하여 통상적인 실험을 통하여 결정할 수 있고, 당업계 공지된 방법을 이용하여 실행할 수 있다.
Figure pat00004
항체를 이용하여 단백질을 탐지하고 그 양을 측정하는 방법들은 당업계에 잘 공지되어 있다. 적합한 항체를 이용하여 단백질을 탐지하고 그 양을 측정하는 당업계에 공지된 모든 방법은 본 발명의 범위내에서 고려된다. 비-제한적 예는 ELISA, 샌드위치 면역분석, 방사능면역분석, 면역블랏 또는 웨스턴 블랏, 유동 세포분석, 면역조직화학, 그리고 어래이(array)가 포함된다.
일반적으로 tau 응집을 탐지하고, 그 양을 측정하는 항체-기반 방법은 항체와 tau 응집 간에 복합체 형성을 허용하는데 효과적인 조건하에 tau 응집이 포함된 일부 또는 모든 시료를 항-tau 항체에 접촉시키는 것을 포함한다. 전형적으로, 전체 시료가 필요한 것은 아니고, 당업자가 시간 경과를 통하여 시료내 tau 응집을 반복적으로 탐지하고 그 양을 측정할 수 있으면 된다. 상기 방법은 용액내에서 일어날 수 있으며, 또는 항체 또는 tau 응집은 고형 표면에 고정될 수 있다. 적합한 표면의 비-제한적 예로는 미량적정 플레이트, 테스트 튜브, 비드, 수지 및 기타 폴리머들을 포함한다. 기질에 부착은 당업자가 인지할 수 있는 다양한 방식으로 일어날 수 있다. 예를 들면, 기질 및 항체는 이들 둘의 후속적 부착을 위하여 화학적 기능적 집단으로 유도될 수 있다. 예를 들면, 기질은 아미노기, 카르복실기, 옥소기 또는 티올기를 포함하나 이에 국한되지 않은 화학적 기능기로 유도화될 수 있다. 이러한 기능적 기를 이용하여, 항체는 기능적 기에 직접 부착되거나, 링커를 이용하여 간접적으로 부착될 수 있다. 항-tau 항체는 기질에 비-공유적으로 또한 부착될 수 있다. 예를 들면, 바이오티닐화된 항-tau 항체가 준비될 수 있는데, 스트렙타아비딘에 의해 공유적으로 피복된 표면에 결합할 수 있고, 이로서 부착된다. 대안으로, 항체는 기술 이를 테면 광중합화 및 사진석판술(photolithography)을 이용하여 표면 상에 합성될 수 있다.
복합체 형성을 허용하는데 충분한 시간 동안 효과적인 조건하에 시료를 항체에 접촉시키는 것은 일반적으로 항-tau 항체 조성물을 시료에 추가하고 (또는 면역침전된 또는 농축된 tau 응집에 추가하고) 그리고 존재하는 임의의 항원에 항-tau 항체가 결합되도록 충분한 시간 동안 혼합물을 항온처리하는 것과 관련된다. 이 시간 이후, 복합체는 세척될 수 있고, 그 다음 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 복합체가 탐지되고, 그 양이 측정된다. 항체 -폴리펩티드 복합체를 탐지하고 그 양을 측정하는 방법은 라벨 또는 표식의 탐지에 일반적으로 기초된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 ＂라벨＂은 항체, 또는 다른 기질 물질에 부착된 임의의 물질을 말하는데, 이때 이 물질은 탐지 방법에 의해 탐지가능하다. 적합한 라벨의 비-제한적 예로는 발광 분자, 화학발광 분자, 형광색소, 형광 소거 물질, 색을 띈 분자, 방사성동위원소, 섬광물질(scintillants), 바이오틴, 아비딘, 스트렙타아비딘, 단백질 A, 단백질 G, 항체 또는 이의 단편, 폴리히스티딘, Ni2+, Flag 테그, myc 테그, 중금속, 그리고 효소 (알칼리 포스파타제, 퍼옥시다제 그리고 루시퍼라제 포함)를 포함한다. 라벨 또는 표식의 탐지에 기초하여 항체-폴리펩티드 복합체를 탐지하고 그 양을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
바람직한 구체예에서, 시료 안에 tau 응집 양을 측정하는 방법은 2개의 포획 항체와 탐지 항체가 포함된 면역분석이며, 이때 각 포획 항체는 다른 것들과 구별되는 tau 에피토프를 인지하는 단리된 항-tau 항체이며, 탐지 항체는 라벨에 부착된 단리된 항-tau 항체다. 상기 탐지 항체는 2개의 포획 항체중 하나와 동일한 항체일 수 있고, 대안으로, 상기 탐지 항체는 포획 항체에 의해 인지되지 않은 tau 에피토프를 인지할 수 있다. 전형적으로, 제 1 포획 항체와 제 2 포획 항체는 약 10:1 내지 약 1:10, 약 5:1 내지 약 1:5, 약 3:1 내지 약 1:3, 또는 약 2:1 내지 약 1:2의 양으로 이용된다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 포획 항체와 제 2 포획 항체는 대략 대등한 농도로 이용된다. 적합한 쌍의 포획 항체의 비-제한적 예는 표 D 및 표 E에 공개된 항체가 포함된다. 적합한 탐지 항체의 비-제한적인 예로는 표 A에 열거된 항체, 뿐만 아니라 tau에 특이적으로 결합하고, 그리고 서열 번호: 1-11로 구성된 집단에서 선택된 아미노산 서열 안에 있는 에피토프를 인지하는 항체가 포함된다. 예시적인 구체예에 있어서, 제 1 포획 항체는 tau에 특이적으로 결합하고, 그리고 서열 번호:7 안에 있는 에피토프를 인지하는 단리된 항체이며, 제 2 포획 항체는 tau에 특이적으로 결합하고, 그리고 서열 번호:8 안에 있는 에피토프를 인지하는 단리된 항체이며, 그리고 탐지 항체는 tau에 특이적으로 결합하고, 그리고 서열 번호:8 안에 있는 에피토프를 인지하는 단리된 항체이다.
Figure pat00005
Figure pat00006
또다른 측면에서, 본 발명은 상기 대상으로부터 획득된 생물학적 유체의 시료 안에서 측정된 tau 응집 양에 기초하여 대상을 분류하는 수단을 제공한다. 상기 방법은 전반적으로 (i) 대상으로부터 생물학적 유체의 시료를 얻고, tau에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 시료내 tau 응집 양을 측정하고, (ii) 시료 안의 tau 응집 양을 기준 값과 비교하고, 그리고 (iii) 시료 안에서 측정된 tau 응집 양에 근거하여 상기 대상을 tau 응집이 많은 대상 또는 tau 응집이 적은 대상으로 분류하는 것을 포함한다. 대상으로부터 생물학적 유체의 시료를 획득하고, tau에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 시료 안에 tau 응집 양을 측정하는 방법은 상기에서 상세하게 설명되며, 실시예에서 더 설명된다.
당업계에 공지된 임의의 적합한 기준 값이 이용될 수 있다. 예를 들면, 적합한 기준 값은 tau 응집의 임상적으로 탐지가능한 증상을 보유하지 않은 동일한 종의 대상 또는 대상 집단으로부터 획득된 생물학적 유체의 시료 안에 tau 응집 양이 될 수 있다. 또다른 예로써, 적합한 기준 값은 탐지가능한 tau 병리학을 보유하지 않은 동일한 종의 대상 또는 대상 집단으로부터 획득된 생물학적 유체의 시료 안에 tau 응집 양이 될 수 있다. 또다른 예로써, 적합한 기준 값은 임상적 치매 등급 점수가 0 (CDR = 0)인 동일한 종의 대상 또는 대상 집단으로부터 획득된 생물학적 유체의 시료 안에 tau 응집 양이 될 수 있다. 또다른 예로써, 적합한 기준 값은 당분야에 공지된 방법에 의해 측정되었을 때 분석의 배경 신호가 될 수 있다. 또다른 예로써, 적합한 기준 값은 동일한 대상으로부터 획득된 기준 시료 내 tau 응집 양의 측정치가 될 수 있다. 기준 시료는 테스트 시료와 동일한 유형의 생물학적 유체를 포함하며, 그리고 상기 대상이 tau의 임상적으로 탐지가능한 증상이 없을 때 이 대상으로부터 획득될 수 있다. 당업자는 상기 대상이 건강할 때 대상으로부터 기준 시료를 획득하는 것이 항상 가능하거나 또는 바람직하지 않다는 것을 인지할 것이다. 예를 들면, 치료 효과를 관찰할 때, 기준 시료는 치료 시작 전 대상으로부터 획득된 시료가 될 수 있다. 이러한 예에서, 대상은 tau 병리를 보유할 수 있지만, tau 응집의 다른 증상 (가령 치매, 인지 감소 등)이 없을 수 있으며 또는 상기 대상은 tau 병리와 tau 응집의 하나 또는 그 이상의 다른 증상을 보유할 수 있다. 추가 예에서, 적합한 기준 시료는 tau 응집을 보유하지 않은 것으로 나타난 개인 또는 개인의 집단으로부터 얻은 생물학적 유체일 수 있다.
본 발명에 따라, 대상은 시료 안에 측정된 tau 응집 양에 근거하여 분류될 수 있다. 상기 대상으로부터 얻은 생물학적 유체의 시료 안에서 측정된 tau 응집 양에 근거한 대상의 분류는 상기 대상의 일생에서 tau 응집과 연합된 질환 및/또는 증상이 발생할 대상을 식별하는데 이용될 수 있다. 일반적으로 말하자면, 대상은 기준 값과 비교하였을 때 많은 양의 tau 응집 또는 적은 양의 tau 응집을 보유하는 것으로 분류될 수 있으며, 이때 많은 양의 tau 응집은 기준 값 이상의 양이 되고, 적은 양은 기준 값과 대등한 또는 기준 값 미만의 양이 된다. 바람직한 구체예들에 있어서, 대상이 많은 양의 tau 응집을 보유하는 것으로 분류되기 위하여, 기준 값과 비교하였을 때 생물학적 유체의 시료 안의 tau 응집 양은 최소한 2-배 증가된다. 예를 들면, 기준 값과 비교하였을 때 시료 안의 tau 응집 양은 최소한 2-배, 최소한 5-배, 최소한 10-배, 최소한 15-배, 최소한 20-배, 최소한 25-배, 최소한 30-배, 최소한 35-배, 최소한 40-배, 최소한 45-배, 또는 최소한 50-배 증가된다. 대상으로부터 획득한 생물학적 유체의 시료 안의 tau 응집 양이 기준 값과 비교하여 최소한 2-배 증가되었을 때, 그리고 기준 값이 tau 응집의 탐지가능한 증상이 없는 하나 또는 그 이상의 질환 없는 개인으로부터 획득한 생물학적 유체와 동일한 유형의 시료(또는 이에 대등한 시료인 경우), 상기 대상은 대상의 일생에서 tau 응집과 연합된 질환 및/또는 증상이 발생할 가능성이 더 많다.
정의
본 명세서에서 이용된 바와 같이, ＂항체＂는 tau를 특이적으로 인지하는 면역글로블린 유도된 분자를 말한다. 본 발명의 항체는 전장 항체 (IgM, IgG, IgA, IgE)이거나 또는 항체 단편 (Fab, F(ab＇)2, scFv)일 수 있다. 항체는 키메라이거나 또는 인간화될 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, ＂CDR＂은 ＂상보성 결정 영역＂을 말한다. CDRs은 초가변 영역으로 또한 지칭될 수도 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, ＂경쇄＂는 항체의 작은 폴리펩티드 소단위다. 전형적인 항체는 2개의 경쇄와 2개의 중쇄를 포함한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, ＂중쇄＂는 항체의 큰 폴리펩티드 소단위다. 항체의 중쇄는 일련의 면역글로블린 도메인들을 포함하는데, 최소한 한 개의 가변 도메인과 최소한 한 개의 불변 도메인이 포함된다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, ＂인간화된＂이란 인간 세포 배양에서 발현이 가능한 구조체를 만들기 위하여 재조합 DNA를 이용하여 단클론 항체가 만들어지는 공정을 말한다. 이러한 구조체를 만드는 임의의 공지된 기술은 본 발명의 목적에 사용될 것이다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, ＂단일 쇄 가변 단편＂ 또는 ＂scFv＂ 또는 ＂scFvs＂는 링커에 의해 연결된 면역글로블린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 융합 단백질을 지칭한다. 일부 구체예에서, 링커는 약 10 내지 25개의 아미노산으로 된 펩티드다.
도면의 간단한 설명
도 1은 N-말단 (A) 및 C-말단 (B) 인간 tau (htau)의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 인간 Tau (A) 및 마우스 Tau (B)에 대한 HJ8.1의 KD를 나타내는 도표다.
도 3은 인간 Tau (A) 및 마우스 Tau (B)에 대한 HJ8.2의 KD를 나타내는 도표다.
도 4는 인간 Tau (A) 및 마우스 Tau (B)에 대한 HJ8.3의 KD를 나타내는 도표다.
도 5는 인간 Tau (A) 및 마우스 Tau (B)에 대한 HJ8.4의 KD를 나타내는 도표다.
도 6은 인간 Tau (A) 및 마우스 Tau (B)에 대한 HJ8.5의 KD를 나타내는 도표다.
도 7은 인간 Tau (A) 및 마우스 Tau (B)에 대한 HJ8.7의 KD를 나타내는 도표다.
도 8 은 인간 Tau (A) 및 마우스 Tau (B)에 대한 HJ8.8의 KD를 나타내는 도표다.
도 9 는 인간 Tau (A) 및 마우스 Tau (B)에 대한 HJ9.1의 KD를 나타내는 도표다.
도 10은 인간 Tau (A) 및 마우스 Tau (B)에 대한 HJ9.2의 KD를 나타내는 도표다.
도 11은 인간 Tau (A) 및 마우스 Tau (B)에 대한 HJ9.3의 KD를 나타내는 도표다.
도 12는 인간 Tau (A) 및 마우스 Tau (B)에 대한 HJ9.4의 KD를 나타내는 도표다.
도 13은 인간 Tau (A) 및 마우스 Tau (B)에 대한 HJ9.5의 KD를 나타내는 도표다.
도 14 는 야생형 및 P301S tg 마우스의 ISF에서 전장(full lengh) tau 존재를 보여주는 면역블랏(immunoblot)을 나타낸다. (A) Tau KO (KO), 야생형 (WT) 마우스 및 P301S tg (P301S tg) 마우스의 해마 용해물은 항-tau 항체 BT-2 또는 항-액틴 항체를 이용만 면역블랏에 의해 분석되었다. 웰당 13 마이크로그램의 단백질이 적하되었다. 내생성 뮤린 tau에 상응하는 4개 밴드와 인간 tau에 상응하는 1개 밴드는 각각 흰색 원과 검정색 원으로 나타낸다. P301S tg 해마 용해질 안에 인간 tau 형태를 나타내는 39kDa 밴드가 또한 존재한다. 이것은 tau 분해 산물을 나타낼 수 있다. 야생형 (WT) 및 P301S tg (P301S tg) 마우스의 ISF tau는 항-tau 단클론 항체 HJ9.3 (B) 또는 HJ8.1 (C)에 의해 면역침전되었으며, 면역블랏에 의해 분석되었다. 밴드는 바이오티닐화된 BT-2 항체에 의해 시각화되었다. 회색 및 검정색 화사표는 각각 내생성 뮤린 tau 및 인간 tau를 나타낸다.
도 15 (A) 는 본 연구에 이용된 상이한 돌연변이체 tau 구조체의 조직을 나타내며, 그리고 (B-D)는 Tau RD 단백질은 형질감염된 HEK293 세포들에서 원섬유(fibrillar) 응집(aggregates)을 형성한다는 것을 보여주는 영상이다. (A) 실험 기획안에 따라, 각각의 돌연변이체 tau는 카르복실 단부에서 시안(cyan) 또는 황색 형광 단백질 (CFP 또는 YFP), 또는 헤마글루티닌 (HA) 테그에 융합되었다. (B) 다양한 형태의 RD에 의해 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포들의 SDS-불용성 물질들 상에서 실시된 원자력 현미경검사(AFM)에서 RD(ΔK)-HA와 RD(LM)-HA는 명백한 원섬유 종(species)을 만든다는 것이 나타났다. 응집-저항성 RD(PP)-HA에서는 원섬유가 탐지되지 않았다. (n=2), 눈금자, 1μm. (C) 다양한 형태의 RD-YFP 및 YFP로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포들은 X-34, 아밀로이드-특이적 염료로 착색되었다. RD(wt)-YFP, RD(ΔK)-YFP 및 RD(LM)-YFP에 의해 형성된 봉입체(Inclusions)는 공촛점 현미경검사에 의해 시각화되며, 또한 X-34에 대해 양성으로 착색되었다. YFP 단독 또는 RD(PP)- YFP의 발현시 X-34 양성 세포들은 탐지되지 않았다. 화살표는 X-34로 착색된 봉입체를 나타낸다. (n=3) (D) 형질감염되지 않은 세포들 (NT) 그리고 다양한 형태의 RD-YFP/CFP는 HEK293 세포들에게 형질감염되었으며, 이어서 Triton/SDS 추출 및 RD 영역에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅을 하였다. 단량체 및 더 높은 고차 분자 종 모두 탐지되었다. (S= 가용성 단백질 그리고 P= 펠렛 불용성 단백질). 이는 3회 반복되었고, 동일한 결과를 가져왔다.
도 16은 HEK293 세포들에서 Tau RD 응집은 FRET에 의해 탐지됨을 보여준다. 형광 공명 에너지 전달 (FRET)에 의한 세포내 RD 단백질 응집을 정량화하기 위하여, YFP 및 CFP에 융합된 다양한 다양한 RD 돌연변이체 (wt, ΔK, PP, LM)들은 HEK293 세포들에게 공동-형질감염되었다. (A). RD(LM)-CFP/YFP로 공동-형질감염된 HEK293 세포들을 영상화하였으며 세포내 응집 형성은 FRET 수용체 광퇴색(photobleaching) 현미경검사를 이용하여 정량화되었다. 수용체 광퇴색 전(Pre)과 후(Post) 공여자 신호는 RD(LM)-CFP/ YFP 봉입체가 18.2%± 0.058 SD (n=6)의 평균 FRET 효과를 나타낸다는 것을 확인시켰다. 상부 및 하부 패널은 각각 광퇴색 전과 후의 수용체와 공여자 채널을 나타낸다. 상단 우측 영상은 산출된 산출된 FRET 효율의 대표적인 열 지도(heat map)이다. 막대그림의 눈금자는 픽셀-픽셀 기반에서 산출된 FRET 효율을 나타낸다. Tau RD 응집의 FRET 효율은 이 세포에서 ~34%이었다. (B). FPR을 이용하여, 다양한 구조체로부터 상대적 FRET가 결정되었다. RD(PP)-CFP/YFP로부터 유의적인 FRET는 관찰되지 않았다. 그러나, RD(ΔK)-CFP/YFP 및 RD(LM)-CFP/YFP 각각은 강력한 FRET 신호를 만들었다 (n=3). (C). RD(ΔK)-CFP/YFP를 발현시키는 HEK293 세포들은 9시간 동안 다양한 농도의 RD(wt)-HA 원섬유 (0.01, 0.03, 0.1 및 0.3 μM의 단량체 등가)에 노출되었다. 세포외 RD(wt)-HA 원섬유는 RD(ΔK)-CFP/YFP의 용량-의존적 응집을 유도하였다 (n=3). (*는 p-값 <0.05를 나타내며, **는 p-값 <0.001을 나타내며, 오차 막대는 SEM을 나타낸다).
도 17은 세포들 간에 Rau-RD 응집의 전이와 추가 응집을 유도하는 것을 보여주는 영상 및 그래프다. (A). RD(ΔK)-YFP로 형질감염된 HEK293 세포들은 RD(LM)-HA를 발현시키는 등가의 세포 수로 48시간 동안 공동-배양되었다. 세포들은 4% 파라포름알데히드로 고정되었고, 그리고 면역형광/X-34 착색이 실시되었다. 다수 세포들은 봉입체 안에 RD(LM)-HA 및 RD(ΔK)-YFP의 공편재화(colocalization)를 나타내었다. 이들 봉입체은 또한 X-34에 대하여 양성 착색되었고, 이는 베타 쉬트 구조 (닫힌 화살표)를 나타낸다. 또한, 일부 RD(LM)-HA 봉입체는 X-34에 대하여 양성 착색되었지만, RD(ΔK)- YFP 봉입체와 공편재화되지는 않았다(개방 화살표). (B). RD(ΔK)-CFP/YFP를 발현시키는 세포와 RD(LM)-HA를 발현시키는 두 집단 세포들은 48시간 동안 공동-배양되었다. RD(PP)-HA 또는 형질감염안된 세포들, NT는 대조군으로 이용되었다. FRET는 RD(LM)-HA와의 공동-배양에 의해 증가되었지만, 그러나 RD(PP)-HA, 또는 허위-형질감염된 세포들로는 증가되지 않았다(n=3). (C). tau 방출의 기전으로써 tau 응집에 의해 유도된 세포 사멸을 테스트하기 위하여, HEK293 세포들은 48 h 동안 RD-HA (PP, ΔK, 또는 LM)로 형질감염되거나, 또는 허위-형질감염되었다. 허위-형질감염된 세포들은 세포 사멸을 유도하기 위하여 37℃에서 다양한 농도의 스타우로스포린 (1, 2, 4, 20 μM)으로 처리되었다. 그 다음 세포는 5 μg/ml의 프로피디움 요오드화물에 노출되었으며, 형광은 플레이트 판독기를 통하여 결정되었다. 다양한 형질감염된 집단에서 세포 사멸에 대한 증거는 관찰되지 않았다. (**는 p-값 <0.001을 나타내고, 오차 막대는 SEM을 나타낸다).
도 18 은 세포들 간에 RD 응집이 미스폴링(misfolding)을 전파하는 것을 보여주는 영상 및 그래프다. HEK293 세포들은 다양한 RD-CFP 및 RD-HA 구조체로 공동-형질감염되었다. 15 h 후, 이들 세포는 48시간 동안 RD(ΔK)-YFP 또는 RD(PP)-YFP를 발현시키는 세포들과 공동-배양되었으며 (A) FRET 현미경검사를 실행하여 공동-응집이 직접적인 단백질 접촉에 의해 발생되었는지를 결정하였다. YFP의 광퇴색 전과 후에 CFP 신호가 측정되었다. RD(LM)-CFP 및 RD(LM)-YFP 응집은 14.2% ± 0.053 SD (n=11)의 평균 FRET 효율을 가지며, 이는 RD(LM)-CFP 및 RD(LM)-YFP가 직접 접촉됨을 나타낸다. 상부 및 하부 패널은 광퇴색 전(Pre)과 후(Post) 각각 수용체와 공여자를 나타낸다. 산출된 FRET 효율의 대표적인 열 지도는 상부 우측에 있다. 막대그림은 픽셀-픽셀 기반에서 산출된 FRET 효율을 나타낸다. Tau RD 응집의 FRET 효율은 이 세포에서 ~25%이었다. 쌍을 이루지 않은(unpaired) CFP로부터 음성 값을 유도하였다. (B) RD(ΔK)-CFP/RD-HA를 발현시키는 세포들이 RD(ΔK)-YFP를 발현시키는 세포들과 공동-배양되었을 때 FRET 신호가 관찰되었다. RD(ΔK)-CFP의 응집이 tau의 응집-경향이 있는 형태, ΔK 또는 LM 돌연변이체의 공동-발현에 의해 유도되었을 때 이 신호가 증가되었다. RD-CFP 또는 RD-YFP가 β-쉬트 형성을 차단시키는 PP를 포함할 때 (n=3), 유의적인 신호는 없었다. (C) 미스폴딩의 증폭을 테스트하기 위하여, CFP 단독 또는 RD(LM)-CFP를 발현시키는 세포 집단은 다양한 수준으로 미스폴딩을 촉진시키기 위하여 PP, ΔK, 또는 LM 돌연변이를 가진 RD-HA를 발현시키는 세포들에게 48시간 동안 사전 노출되었다. 그 다음 공동-배양된 집단은 분열되고, RD(ΔK)-YFP를 발현시키는 세포들과 함께 48시간 동안 공동 배양되어 세포-세포 이전과 FRET에 의해 보고된 응집 정도가 결정된다. RD(LM)-HA 세포들의 RD(ΔK)-CFP 세포 집단에 사전 노출은 RD(PP)-HA에 노출 사전 노출과 비교하여 2.6배 FRET 신호를 증가시켰다 세포들의 제2 집단내에서 순수 CFP를 발현시키는 세포들의 삽입은 응집-경향이 있는 RD-HA 돌연변이체에 사전 노출 효과를 완전하게 차단시켰다 (n=3). (*는 p-값 <0.05를 나타내며, **는 p-값 <0.001을 나타내며, 오차 막대는 SEM을 나타낸다).
도 19는 세포외 배지를 통하여 tau 응집의 증식을 보여주는 그래프 및 면역블랏을 나타낸다. (A) RD(LM)-HA로 형질감염된 HEK293 세포들은 FRET 분석에 앞서 동량의 RD(ΔK)-CFP/YFP 세포들과 48시간 동안 공동-배양되었다. 세포 배양 배지의 용적을 증가시키면, 세포 이동(trans-cellular) 응집 효율이 감소되었다. (B) RD(LM)-HA를 발현시키는 세포들로부터 RD(ΔK)-CFP/YFP를 발현시키는 세포들에게로 조건화된 배지의 이동은 응집을 60% 유도시키는데 충분하였다. (C) HJ9.3 항체를 배지에 추가하면 FRET가 감소되는데, 이는 응집 전파 간섭과 일관된다. (D) 비-특이적 IgG는 전파에 효과가 없었다. (E) HJ9.3은 동일 세포 안에서 공동-발현된 RD(ΔK)-CFP/YFP의 세포내 응집에 효과가 없었다. (F) 세제(detergent) 분획화(fractionation)와 웨스턴 블랏(western blot)에 의해 측정하였을 때, HJ9.3은 공동-배양된 세포들 안에서 RD(ΔK)-YFP를 유도시키는 RD(LM)-HA 효과를 차단시켰다. (T= 전체 단백질, S= 가용성 단백질 그리고 P= 펠렛 불용성 단백질, (G) 이들 세가지 독립 웨스턴 블랏의 정량 분석에서 HJ9.3에 노출시킨 후 전체 분획과 비교하여 펠렛 분획이 ~60% 감소된 것으로 나타났다 (H) RD(LM)-YFP 및 mCherry를 발현시키는 세포들은 공동-배양되었고, 유동 세포분석(flow cytometry)에 의해 분석되었다. HJ9.3은 이중 양성 세포들의 비율을 2.07%에서 1.31%로 감소시켰다. 세포측정(cytometry) 직전에 혼합된 세포들은 배경 대조군이었다 (*는 p-값 <0.05를 나타내며, **는 p-값 <0.001을 나타내며, 오차 막대는 SEM을 나타낸다).
도 20은 RD(ΔK)-YFP로 형질감염된 (상부 패널) 또는 허위-형질감염된 (하부 패널) HEK293 세포의 영상을 나타낸다. HJ9.3은 48시간 동안 배양 배지에 추가되었다. 실험 종료시, 세포들은 고정되었고, 투과가능하도록 만들었고(permeabilize), 그리고 항-마우스 이차 항체 (Alexa 546으로 라벨됨)로 착색되었다. 공촛점 현미경검사를 이용하여 HJ9.3/tau 복합체의 국소화가 분석되었다. 상부 패널에서는 많은 복합체들이 RDΔ(K) -YFP가 발현될 때 많은 복합체들이 확인되지만 RDΔ(K) -YFP가 없을 때는 전혀 확인되지 않음(하부 패널)을 보여준다. 직교 분석(우측 패널)에서 대부분의 복합체는 세포 표면에 존재한다는 것이 설명되지만, 특별한 세포내 복합체도 관찰되었다.
도 21은 Tau 원섬유가 세포-세포 전파를 중재한다는 것을 보여주는 영상과 그래프를 나타낸다. (A) 조건화된 배지는 HJ9.3 또는 대조군 IgG 항체 (1:1000)로 0 시간 또는 48시간 동안 공동 배양된 형질감염된 세포 집단으로부터 수거되었고, 이어서 면역침전과 웨스턴 블랏되었다. HJ9.3은 세포 배지로부터 tau RD 종을 특이적으로 포획하였지만, IgG는 그러지 못하였다. RD(ΔK)- YFP 또는 RD(LM)-YFP의 발현시 고차 응집 종이 존재하였지만, RD(PP)-YFP에서는 존재하지 않았다. (B) 3가지 독립적인 웨스턴 블랏의 분석에서 48h 항온처리 후 tau에서 ~10배 증가가 나타났다. (C) 세포들은 다양한 시간 동안 HJ9.3에 노출되었다. (D) 48 h 동안 HJ9.3에 노출된 정제된 항체/항원 복합체들은 영상화를 위하여 AFM 칩에 예치되었다. RD(ΔK)-HA와 RD(LM)-HA를 발현시키는 세포의 배지에서 명백한 원섬유 종이 관찰되었지만, RD(PP)-HA는 오직 무정형 응집만을 만들었다. 눈금자, 1μm.
도 22 는 재조합 인간 tau에 대항하는 HJ8.5와 HJ9.4 활성을 보여주는 개요도와 그래프를 나타낸다. (A) 상이한 단클론 전장 tau 항체의 존재와 부재하에 RD (LM)-CFP와 RD(ΔK280)-YFP 세포들의 공동-배양이 설명되는 개요도이다. (B) HJ8.5, HJ9.3과 HJ9.4는 tau 전파를 차단시킬 수 있음을 설명하는 그래프다. (C) HJ8.5, HJ9.3과 HJ9.4는 ELISA 분석에서 RD-tau 원섬유를 탐지할 수 있음을 보여주는 그래프다.
도 23은 (A) 뇌실계내부(intracerebroventricular) 주사를 위한 실험 계획과 (B) 각 마우스의 측면 뇌실 안에 삼투 펌프의 이식을 위한 실험 계획을 설명하는 개요도다. (C) 크레실 바이올렛 착색.에 의해 캐뉼라의 위치를 확인하는 영상이다.
도 24는 (A) Coomassie 블루 착색과 (B) 주입 전과 주입 후 펌프로부터 얻은 항체를 이용하여 재조합 최장 인간 tau 아이소폼(isoform) hTau40에 대한 면역블랏팅에 의해 P301S tg 마우스에서 6주 주입 후 항-tau 항체의 영상을 나타낸다.
도 25는 전체 tau에 대한 HJ8.7-BT2B ELISA에서 주입된 tau 항체의 간섭이 없음을 보여주는 그래프다. 표시된 농도의 항체는 ELISA에 앞서 재조합 인간 tau 단백질과 사전-항온처리되었다.
도 26은 운반체/PBS (상부 패널) 또는 상이한 항-tau 단클론 항체 (하부 패널에서와 같이 라벨된 HJ8.5, HJ9.3)로 처리된 9월령의 P301S tg 마우스의 조롱박피질의 관상 부분의 영상을 보여준다. 단면들은 tau의 비정상적으로 인산화된 형태를 인지하는 바이오티닐화된 AT8 항체로 착색되었다.
도 27은 (A) 해마 CA2 및 CA3, (B) 편도핵, (C) 조롱박 피질,그리고 (D) 뇌후각 뇌피질에서 신경원섬유 매듭(neurofibrillary tangles)의 AT8 착색에 의해 덮힌 지역 비율을 나타내는 도표이다.
도 28 은 ELISA에 의해 tau 원섬유와 RD-tau 단량체의 HJ9.3 항체의 탐지를 보여주는 도표다. 상이한 농도의 RD-wt tau 단량체와 원섬유는 ELISA 플레이트 상에 피복되었다. HJ9.3은 일차 항체로 이용되었다. 탐지를 위하여 항-마우스 HRP 연계된 항체가 이용되었다.
도 29 는 세포 배지 안에 원섬유의 이전을 통하여 발생된 tau 응집의 세포간 전파를 설명하는 개요도다. 공여자 세포 안에 단백질 응집은 이 세포를 탈출하고(A), 수령 세포 안으로 진입하고(B), 그리고 고유의 폴드된 단백질과 직접적으로 접촉하여 (C) 미스폴드된 상태를 증폭시킨다 (D). 이와 같은 세포-세포 이동은 배지로 직접 방출되는 원섬유에 의해 중재된다. 이들 원섬유는 세포-세포 전파를 간섭하는 항-tau 항체(HJ9.3)에 의해 세포외 공간내에서 가둬질 것이다 (E).
도 30. 표면 플라스몬 공명 (SPR)과 면역블랏팅에 의한 항-tau 항체의 특징화. 이 도면은 고정된 재조합 인간 tau (최장 아이소폼 hTau40, 441 aa) 및 고정된 마우스 tau (최장 아이소폼 mTau40, 432 aa)를 향한 각 항-tau의 결합을 보여주는 SPR 센서그램(sensorgrams)을 나타낸다. 각 항체는 다양한 농도 (0.11, 0.23, 0.46, 0.90, 1.8, 3.7, 7.5 μg/ml)로 운용되었으며, 플랏은 대응하는 색에 나타낸다. (A) 고정된 인간 tau 및 고정된 마우스 tau (B)에 HJ9.3 항체의 SPR 센서그램. (C) 고정된 인간 tau 및 고정된 마우스 tau (D)에 HJ9.4 항체의 SPR 센서그램. 고정된 (E) 인간 및 (F) 마우스 tau에 HJ9.5 항체의 SPR 센서그램. (G) 3 월령 tau 녹아웃 (KO)의 RAB 가용성 분획, 3 월령 야생형 (WT), 3 월령 P301S (3mo) 및 9 월령 P301S (9mo) 마우스는 표시된 항-tau 항체를 이용하여 면역블랏에 의해 분석되었다.
도 31. 고정된 인간 tau 원섬유에 대한 항-tau 항체들간의 상호작용의 SPR 센서그램. 고정된 인간 tau 원섬유에 대하여 다양한 농도로 운영된 HJ9.3 (A), HJ9.4 (B) 및 HJ8.5 (C) 항 tau 항체의 SPR 센서그램.
도 32. 상이한 분석들에서 항-tau 항체의 특징화. 알츠하이머 질환 (AD) 조직의 조롱박 피질과 전두 피질 영역으로부터 3 월령 tau 녹아웃 (KO), 3 월령 야생형 (WT), 3 월령 P301S (3mo), 12 월령 P301S (12mo) 마우스의 뇌 단면들의 면역 착색은 바이오티닐화된 HJ8.5 항체로 착색되었다. 12 월령 P301S 현미경사진에서 삽입부(insert)는 신경망(neuropil) 착색의 확산에 추가하여 세포 체(body) 착색을 보여준다. 검정 화살표는 확대된 영역을 가르킨다. 인간 AD 뇌 피질 현미경사진에서 삽입부는 고 높은 확대상태에서 신경원섬유 매듭 (NFT)의 착색을 나타낸다. 검정 화살표는 확대된 영역을 가르킨다. 눈금자는 동일 확대 영상인 tau KO가 있는 패널에서 250 μm이다. P301S 12mo 및 AD 삽입부에서 눈금자 50 μm.
도 33. Tau-항체는 FRET 분석에 의해 탐지되었을 때 P301S tau 응집의 취입 및 씨딩(seeding) 활성을 차단시킨다. RD(ΔK280)-CFP/YFP를 발현시키는 HEK293 세포들은 24 시간 동안 1xTBS 뇌 용해질의 전체 단백질 2.5 μg에 노출되었다. (A) 12 월령 P301S 마우스로부터 수거한 뇌 용해질은 녹아웃 (KO) 마우스 (n=7), 야생형 (WT) 마우스 (n=6) 또는 어린 3-월령 P301S 마우스 (n=2)의 용해질과 비교하였을 때 훨씬 더 높은 씨딩 활성(n=5)을 유도하였다(****p<0.0001). (B) HEK293 세포들은 RD (ΔK280)-CFP와 RD (ΔK280)-YFP로 공동-형질감염되었다. 18 시간 후, 항-tau 항체 (HJ8.5, HJ9.3 및 HJ9.4) 또는 대조군 항체 (HJ3.4, 항 Aβ 항체)의 유도와 함께 또는 유도없이 사전-항온처리된 P301S 뇌 용해질이 세포에 추가되었다. P301S 뇌 용해질로 항온처리된 모든 tau 항체들은 씨딩 활성을 유의적으로 차단시켰다. 통계학적 유의성은 일원(one-way) ANOVA에 이어서 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어를 이용한 다중 비교용 Dunnett＇s post hoc 테스트에 의해 결정되었다(***p>0.001). (C) 다양한 농도 (0.125 μg/ml, 0.25 μg/ml, 0.5 μg/ml, 1 μg/ml 및 2 μg/ml)의 이들 항체의 적정(titration)은 고정량의 P301S 뇌 용해질로 실행되었다. 24 시간 후, FRET 분석이 실행되었다. 우리가 이용한 모든 tau-항체중에서 HJ8.5는 P301S 뇌 용해질의 취입 및 씨딩 활성 차단에 가장 효과적이었다. 통계학적 유의성은 이원(two-way) ANOVA에 이어서 다중 비교를 위한 Bonferroni post hoc 테스트에 의해 결정되었다. (** p < 0.0001, * p < 0.01, 값들은 평균 ± SEM을 나타낸다).
도 34. P301S Tau 응집에 결합된 tau 항체의 세포 취입은 탐지되지 않았다. P301S 뇌 용해질은 3시간 동안 HEK293 세포에 추가되었다. tau의 탐지를 위하여, 3가지 상이한 항-tau 또는 대조군 (HJ3.4, Aβ 항체) 항체는 모두 Alexa-fluor546 항-마우스 IgG 착색에 이용되었다. 또한, P301S 뇌 용해질은 3가지 상이한 항-tau 항체 및 HJ3.4 항체와 함께 또는 이들 없이 사전-항온처리되었고, 그 다음 HEK293 세포에 추가되었고, 고정되었고, 그리고 투과가능하도록 되었다. Alexa-fluor546 항-마우스 IgG를 이용하여 내화된 항체가 식별되었다. 4＇,6＇-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI; 청색으로 나타냄)은 핵 착색에 이용되었다.
도 35. 항체의 ICV 주입 및 상이한 처리 방법에 의한 항체 효과의 실험 계획 (A) 항체 또는 운반체 (PBS)는 뇌실계내부 주사에 의해 뇌의 좌측 뇌실로 주입을 위한 실험 계획. (B) 좌측 측면 뇌실로 외과적으로 이식된 프로브 위치를 확인하기 위하여 관상으로 절단된 뇌 영역의 대표적 크레실 바이올렛 착색. 이 연구에서, 우리는 좌측 측면 뇌실 안으로 정확하게 프보르가 위치된 마우스를 포함시켰다.
도 36. 항-tau 항체는 P301S 마우스 뇌에서 AT8 착색을 강력하게 감소시켰다. PBS (A), HJ3.4 항체 (B), HJ8.5 항체 (C), HJ9.3 항체 (D) 및 HJ9.4 항체 (E) 처리된 9 월령 P301S 마우스의 대표적인 관상 단편은 조롱박 피질 및 편도핵이 포함된 영역들 안에서 바이오티닐화된 AT8 항체로 착색되었다. 눈금자는 250 μm이다. A 내지 E 삽입부는 포스포릴화된 tau의 바이오티닐화된 AT8 항체 착색의 고차 확대를 나타낸다, 눈금자는 50 μm이다.
도 37. 특정 항-tau 항체는 P301S 마우스 뇌에서 AT8 착색을 상당히 감소시켰다. 9월령 P301S 마우스에서 항-tau 항체 HJ8.5 (N=13), HJ9.3 (N=15), HJ9.4 (N=13), 항-Aβ 항체, HJ3.4 (N=8), 또는 PBS (N=16)로 처리된 마우스내 조롱박 피질 (A), 뇌후각 뇌피질 (B), 편도핵 (C) 및 해마 CA1 영역 (D)에서 비정상적으로 포스포릴화된 tau의 바이오티닐화된 AT8 착색으로 덮힌 영역의 비율. PBS 또는 HJ3.4 항체 처리된 마우스와 비교하였을 때, 항-tau 항체 처리된 마우스에서 몇 가지 상이한 뇌 영역에서 AT8 착색이 감소되었다. HJ8.5는 최대 효과를 가졌다. ** p < 0.01, * p < 0.05, 값들은 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 38. 수컷과 암컷 P301S 마우스에서 바이오티닐화된 AT8 항체 착색의 정량화. 항-tau 항체 (HJ8.5, HJ9.3 및 HJ9.4), 대조군 항체 (HJ3.4)와 PBS 처리된 마우스의 조롱박 피질 (A 및 E), 뇌후각 뇌피질 (B 및 F), 편도핵 (C 및 G) 그리고 해마 CA1 영역 (D 및 H)에서 수컷 (A)과 암컷 P301S 마우스 (B)의 비정상적으로 포스포릴화된 tau의 바이오티닐화된 AT8 착색으로 덮힌 영역의 비율
도 39. 일부 항-tau 항체는 P301S 마우스 뇌에서 신경원섬유 매듭의 ThioS 착색을 상당히 감소시켰다. (A) PBS, HJ3.4, HJ8.5, HJ9.3 및 HJ9.4 항체로 3개월간 처리된 9 월령 P301S 마우스의 조롱박 피질내 신경원섬유 매듭의 ThioS 착색의 대표적인 영상. 신경원섬유 매듭의 ThioS 착색은 PBS 또는 HJ3.4 항체 처리된 마우스와 비교하였을 때 HJ8.5항체 처리된 마우스에서 감소되었다. 눈금자는 100 μm를 나타낸다. (B) 항-tau 항체와 대조군 처리된 마우스 모두에서 1(착색없음) 부터 5(최대 착색)까지 점수를 매김으로써 ThioS 착색의 반-정량적 평가. HJ8.5 항체 처리된 마우스는 PBS 또는 HJ3.4 항체 처리된 마우스와 비교하였을 때 상당히 감소된 ThioS 착색을 가졌다. *p<0.05, **p<0.01.
도 40. 포스포-tau 착색과 활성화된 미세아교세포(microglial) 착색 간에 상관관계. (A) HJ8.5 (N=6), HJ9.3 (N=6) 및 PBS 처리된 9 월령 P301S 마우스 (각 집단마다 N=6)에서 포스포-tau의 바이오티닐화된 AT8착색은 PHF1 착색, 또다른 포스포-tau 항체와 상당한 상관관계를 나타내었다. (B) 모든 집단(각 집단에서 N=6)에서 활성화된 미세아교세포의 CD86 착색과 포스포-tau의 바이오티닐화된 AT8 착색 사이에 강력한 상관관계가 관찰되었다 (C) 대표적인 70% FA 분획 시료 (N=4)의 면역블랏팅은 다중클론 마우스 항-tau 항체 (Abcam)로 분석되었다.
도 41. 활성화된 미세아교세포의 CD68 착색. P301S 마우스에서 미세아교세포 활성화에 대하여 평가되었다. PBS (A), HJ3.4 항체 (B), HJ8.5 항체 (C), HJ9.3 항체 (D) 및 HJ9.4 항체 (E)로 처리된 9 월령 P301S 마우스의 조롱박 피질내 활성화된 미세아교세포의 CD68 착색의 대표적인 영상.
도 42. 불용성 tau 수준은 P301S 마우스에서 항체 HJ8.5 및 HJ9.3에 의해 감소되었다. 처리된 모든 마우스 [PBS (N=16), HJ3.4 항체 (N=8) HJ8.5 (N=13), HJ9.3 (N=15), HJ9.4 (N=13)]의 피질은 RAB (A), RIPA (B) 및 70% FA (C)로 순차적으로 추출되었으며, 이들의 tau 수준은 ELISA에 의해 정량화되었다. 집단 간에 RAB 및 RIPA 분획물에서 가용성 tau 수준에서는 통계학적 차이가 없었다. 그러나, PBS 또는 HJ3.4 항체 처리된 집단과 비교하였을 때, HJ8.5 및 HJ9.3 항-tau 항체 처리된 마우스에서 70% FA 분획물내 불용성 tau 수준은 상당히 감소되었다. HJ9.4 항체 처리된 마우스에서 불용성 tau 수준은 대조군 집단과는 차이가 없었다 (**p<0.01). Ser202 및 Thr205 (F) 수준에서 인간 tau (D), 마우스 tau (E) 및 포스포 tau의 수준은 ELISA에서 특이적 항-인간, 항-마우스, 또는 항-포스포 tau 항체로 70% FA 분획에서 평가되었다 (각 집단에서 n=6 마리의 마우스). 항-tau 항체 처리된 마우스의 모든 집단에서 인간 tau 수준은 감소되었고, 마우스 tau 수준은 변화가 없었다. 70% FA 분획에서 AT8 반응성에 의해 탐지되었을 때 포스포 tau at Ser202 및 Thr205에서 포스포 tau는 대조군과 비교하였을 때 항-tau 항체 처리된 마우스에서 감소되었지만, 총 인간 tau와는 유사하였다.
도 43. 항-tau 항체 처리된 P301S 마우스는 FRET 분석에서 탐지되었을 때 피질 추출물에서 감소된 tau 씨딩 활성을 보유한다. (A) Tau 씨딩 활성은 FRET 분석에 의해 HEK293세포에서 PBS (N=16), HJ3.4 (N=8), HJ8.5 (N=13), HJ9.3 (N=15), 및 HJ9.4 (N=13) 처리된 마우스 모두 RAB 가용성 분획물로 측정되었다. HEK293 세포는 RD (ΔK280)-CFP 및 RD (ΔK280)-YFP로 공동-형질감염되었다. 18 시간 후, RAB 가용성 분획물은 세포에 추가되었다. 씨딩 활성은 PBS 또는 HJ3.4 항체 처리된 마우스와 비교하였을 때, HJ8.5 및 HJ9.3 항체 처리된 마우스에서 상당히 감소되었다. HJ9.4 항체 처리된 마우스에서 RAB 가용성 분획물은 PBS 또는 HJ3.4 항체 RAB 가용성 분획물과 비교하였을 때 감소된 씨딩 활성을 보유하지 않았다 (***p<0.001, 값들은 평균 ± SEM을 나타낸다). (B) RAB 가용성 분획물은 tau 녹아웃, PBS, 또는 항-tau 항체 처리된 마우스로부터 면역침전되었다. 항체/비드 복합체로부터 임의의 씨딩 활성 용출은 FRET 분석으로 측정되었다. PBS 처리된 마우스와 비교하여 HJ8.5 및 HJ9.3 항체 처리된 마우스에서 상당히 적은 씨딩 활성이 관찰되었다 (****p<0.0001, 값은 평균 ± SEM을 나타낸다). (C) ELISA에 의하면 모든 처리된 집단의 9 월령 P301S 뇌 피질 영역의 70% 분획물은 RAB 가용성 분획물로 실행된 FRET 분석과 상당한 상관관계를 나타내었다. (D) 평가된 모든 처리된 마우스의 9 월령 P301S 뇌 피질의 RAB 가용성 분획물에 존재하는 tau 수준 (X-축)과 씨딩 활성 (Y-축)의 비교. 이들 두 측정간에 유의적인 상관관계는 없었다. (E) 3 월령 녹아웃 (KO), 3 월령 야생형 (WT), 3 월령 P301S, 그리고 9 월령 PBS-처리된 P301S 마우스의 RAB 가용성 분획물내 tau 종들은 SDD-AGE에서 분리되었고, 이어서 웨스턴 블랏팅되었다. 다클론성 마우스 항-tau 항체는 tau 종들을 탐지하는데 이용되었다. 고분자량 tau 종은 3 월령 P301S 마우스와 9 월령 P301S 마우스 모두의 RAB 가용성 분획에 존재하고, 9 월령 P301S 마우스에 더 많은 양이 존재한다.
도 44. 보행(locomotor) 활성, 감각운동 기능 또는 조건화된 공포 테스트에서 청각 신호 성분상에 있어서 집단간의 유의적인 차이는 없었다. rmANOVAs의 결과는 결함 판(holeboard) 테스트 (A), 렛지(ledge) 테스트 (B) 또는 임의의 다른 감각운동 측정(나타내지 않음), 또는 가속 로타로드(accelerating rotarod) (C)에서 전체 보행에 대한 처리와 관련된 유의적인 주요 또는 상호작용 효과를 밝히지 못하였다. 3일차 조건화된 공포 테스트에서 변경된 환경 기준으로부터 데이터는 유의적인 처리 효과를 산출하였고 (*p=0.027) 그리고 후속 비교에서 이 효과의 대부분은 HJ9.4 마우스와 PBS+HJ3.4 대조군 집단 사이에 유의적인 차이로 인한 것임을 보여주었다 (p=0.0007). (D). 그러나, 청각 신호 데이터 (min 3-10)에서 rmANOVA이후 처리의 유의적인 주요 또는 상호 효과가 발견되지 않았는데, 이것은 이 시간 동안 집단 안에 부동(freezing) 수준이 유의적으로 상이하지 않았음을 암시한다 (E). 2일차에 관련된 공포 테스트 동안 부동에 있어서 활성 수준이 영향을 끼치는지를 평가하기 위하여, 결함 판 테스트 동안 측정된 전체 보행과 관련된 공포 테스트 동안 부동에 소요된 시간% 사이에 Pearson 상관계수(r)를 산출하였고, 이들은 유의적으로 관련되지 않았음을 알아내었다 (p=0.39) (F).
도 45. P301S tau 유전자변이(transgenic) 마우스에서 관련된 공포 조건화 결함은 HJ8.5 및 HJ9.4 항체 처리에 의해 구제되었다. (A) 조건화된 공포 테스트 1일차에 이들 데이터에서 rmANOVAs 이후 치료와 관련된 유의적인 주요 또는 상호작용 효과가 없는 것으로 나타난 바와 같이, 2-min 기준 조건 또는 소리/쇼크 (T/S) 훈련 동안 부동 수준에서 집단간에 차이는 관찰되지 않았다. (B) 대조적으로, 처리(*p=0.019)와 미세한 상호작용(Minutes 상호작용)에 의한 유의적인 처리 (**p=0.0001)의 유의적인 효과는 2일차에 관련 공포 테스트 동안 부동 수준에서 rmANOVA 이후 관찰되었다. 오직 HJ9.4 집단만 8분과 비교하여 1분에서 유의적인 습관화(habituation)를 보였다 (#p=0.002). (C) 후속적으로 계획된 비교에서 HJ8.5 및 HJ9.4 tau 항체 집단에서 부동은 8-분 세션을 평균하였을 때 PBS+HJ3.4 대조군과 비교하여 유의적으로 증가되었음을 보여주었다(차례로 **p=0.006 및 *p=0.022). 그러나, 데이터의 추가 분석에서 HJ9.4 집단과 PBS+HJ3.4 대조군 사이에 최대 차이는 2 분 시점 동안에 발생되었지만(†p=0.004), HJ8.5 처리된 마우스와 대조군 집단 사이의 최대 차이는 ＂B＂에서 나타낸 것과 같이 4-7분 시점(††p<0.004)에서 발현되었음을 나타낸다.
도 46은 샌드위치 Tau ELISA 분석을 이용하여 씨딩 활성에 대하여 양성인 혈장 시료와 씨딩 활성에 대하여 음성인 혈장 시료를 구별지을 수 있음을 보여주는 그래프다. 씨당 활성은 Kfoury et al 2012 J Biol Chem 287(23)에서 설명된 것과 같이 측정될 수 있다. tau 응집 양은 건강한 젊은이들로부터 수거된 혈장의 신호 (가령, 분석의 배경 신호) 이상으로 상대적인 배수-변화 유도로 보고된다.
도 47은 tau 세포의 전파 분석에서 본 발명의 항-tau 항체 효과를 나타내는 그래프다. 각 집단에서, 첫번째 막대는 추가된 항체 없는 배지를 나타내며, 이는 전파의 기본 효율이 된다. (A) HJ8.1 및 HJ8.2; (B) HJ8.3 및 HJ8.4; (C) HJ8.5 및 HJ8.7; (D) HJ8.8 및 HJ9.1; (E) HJ9.2 및 HJ9.3; (F) HJ9.4 및 HJ9.5.
도 48은 세포-기반 분석에서 항-tau 항체의 등몰 혼합물 또는 개별 항-tau 항체의 tau 전파 효과를 나타내는 그래프다.
도 49에서 (A)는 HJ9.3 항체는 RD(ΔK)-CFP/YFP가 동일한 세포 안에서 공동-발현될 때 세포내 tau 응집에 효과가 없음을 보여주는 그래프이며, (B)는 tau 응집의 세포간 전파에 있어서 비-특이적 IgG는 효과가 없음을 보여주는 그래프다.
도 50은 유동 세포분석에 의해 측정되었을 때, HJ9.3은 tau 응집 취입을 저해시킨다는 것을 보여주는 그래프다. 형광 염료에 의해 화학적으로 라벨된 재조합 RD 원섬유에 세포들이 노출되었다. 트립신처리화(trypsinization) 및 분산 후, 흐름 세포측정기(flow cytometer)를 이용하여 세포의 수를 헤아렸다. HJ9.3은 용량-의존적으로 형광에 의해 라벨된 세포들의 수를 감소시켰으며, 이는 응집 취입의 저해를 나타낸다.
실시예들
다음의 실시예들은 본 발명의 바람직한 구체예들을 설명하기 위하여 포함된다. 당업자는 실시예에서 공개된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 작용한다고 발명자들이 발견한 기술이며, 따라서 이의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주된다는 것을 인지해야 한다. 그러나, 당업자는 본 공개 내용에 근거하여, 공개된 특정 구체예에서 많은 변화가 있을 수 있으며, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고, 여전히 유사한 또는 비슷한 결과를 얻을 수 있음을 인지해야 한다.
실시예 1-8의 소개
신경세포 및 교세포에서 미세관 연합된 단백질 tau의 응집은 알츠하이머 질환 (AD), 진행핵상마비, 그리고 전두측두엽 치매가 포함된 20가지 이상의 신경퇴행성 장애와 관련된다. 인간 연구에 의한 최근 증거에서 tau 병리는 뇌를 통하여 무작위로 분포되지 않지만, 대신 기존 신경 연결망과 연계된다. AD의 원섬유 tau 병리학은 공지의 해부학적 연결을 따라 진행되지만, 망 퇴행의 기전은 아직 밝혀지지 않았다. 중요한 것은 인간과 마우스 뇌에서 단백질 응집은 한 세포에서 다른 세포로 이동할 수 있다고 최근 병적 연구에서 제안된다. 더욱이, 인간 질환-연합된 재조합 단백질 이를 테면 tau, SOD-1, α- 시누클레인(synuclein) 그리고 폴리구타민(polygutamines)의 원섬유 형태는 세포외 공간으로부터 용이하게 취입되어 세포내 미스폴딩을 촉발한다. 이러한 현상은 프라이온(prion) 전파를 회상하게 하는데, 엑소좀과 나노튜브의 터넬링(tunneling)이 세포간 확산을 중재한다고 제안되었다. tau 응집은 세포-세포의 직접적 접촉 또는 세포외 공간을 통하여 세포에서 세포로 단백질 미스폴딩을 전파시키는 지에 대해서는 미결이다. 더욱이, 응집의 실제 세포간 전파를 중재할 수 있고, 이것에 의해 응집이 ＂공여자＂ 세포로부터 방출되어 제 2 ＂수령＂ 세포로 진입하고, 그리고 더욱 간접 기전과는 상반되는 단백질-단백질 직접 접촉을 통하여 미스폴딩이 더 유도되는지에 대해서는 아직 결정되지 않았다. 여기에서 tau 원섬유가 직접 세포외 공간으로 방출되어, 이 기전에 의해 응집을 전파시킬 수 있는 지가 테스트된다.
실시예 1 항-tau 항체
*표준 기술을 이용하여 2가지의 일련의 항-tau 항체가 만들어졌다: HJ8 시리즈 (재조합 인간 tau에 대항한 마우스 단클론 항체), 및 HJ9 시리즈 (재조합 마우스 tau에 대항한 마우스 단클론 항체) (표 1). 많은 항체에 대한 결합 에피토프의 지도가 만들어졌다 (표 A).
Figure pat00007
HJ8 및 HJ9 시리즈 항체의 마우스 tau와 인간 tau에 대한 결합 친화력을 특징짓기 위하여, Biacore＇s SPR 기술이 이용되었다. Biacore 센서 칩 CM-5 (카르복시메틸화된 덱스트란 매트릭스)는 1:1 비율의 EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드)와 NHS (N-히드록시숙시니미드)를 이용함으로써 활성화되었다. 2). 그 다음 마우스 tau 또는 인간 Tau의 리간드는 (Biacore CM-5 센서 칩 상에 분당 5 μl의 유속에서 고정되었다(20ug/ml, 10 mM 아세테이트 나트륨 pH 3.5). Biacore CM-5 센서 칩 상에 남아있는 결합안된 지역은 1 M 에탄올아민 pH 8.5을 통과시켜 탈활성화되었다.
센서 칩 표면을 준비한 후, 상이한 농도 (0.78nM - 400nM)의 피분석물 (가령 항체)은 여과된 탈기된 0.01 M Hepes 완충액, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20, pH 7.4에서 분당 10 μl의 유속으로 주입되었다. 모든 시료는 반복 운용되었다. 단일 항체 농도로 각 주기/운용 후, 칩의 표면은 10 mM 글리신 pH 1.7로 재생되어 결합된 항체/피분석물이 제거되고, 표면에 부착된 단량체/원섬유/리간드만 남겨진다.
SPR 센소그램 (도 2-13)으로부터, 연합율 또는 결합율(On rate) (Ka), 해리율 또는 이탈율(Off rate) (Kd) 그리고 친화력 상수 또는 상호작용 친화도 (KD, 여기에서 KD = Kd/Ka)가 얻어진다 (표 2 및 3).
Figure pat00008
Figure pat00009
실시예 2 전장 tau는 ISF에 존재한다.
마우스와 인간 tau를 모두 인지하는 tau 항체를 이용하여 야생형 마우스와 P301S 인간 tau 유전자변이 마우스 (P301S tg 마우스, 방법란에서 상세하게 설명됨)의 ISF 시료로부터 면역침전되었다. ISF내 단량체 tau의 양이 상대적으로 낮기 때문에 면역침전 분석에서 잘 작용하는 2가지 항-tau 단클론 항체가 이용되었다. 면역침전 이후, tau는 면역블랏에 의해 분석되었다. 내생 뮤린 tau 아이소폼는 48-62 kDa으로 이동된다. 야생형 뇌 용해질에서, tau는 SDS-PAGE 상에 4개의 별개 밴드로 나타났다 (도 14A). 야생형 마우스에서 가장 풍부한 종은 48 kDa으로 이용되었다. P301S tg 마우스 뇌에서 4개의 내생성 뮤린 tau 밴드에 추가하여 과발현된 인간 1N4R tau는 55 kDa 뿐만 아니라 39 kDa 밴드로 이용한 강력한 밴드로 관찰되었고, 이는 tau 분해 산물을 나타낼 수 있다.
전체 뇌 용해질과는 대조적으로, 면역침전시 야생형 마우스로부터 ISF내 tau의 미세관 결합 영역(MTBR)을 인지하는 항체 HJ9.3에 의해 단일 tau 밴드가 탐지되었다(도 14B). 이 밴드는 마우스 뇌 용해질에서 관찰된 가장 큰 아이소폼 2N4R에 대응되었다. P301S tg 마우스의 ISF에서 인간-특이적 tau 밴드는 전술한 마우스 tau 밴드와 공동-침전되었고, 그리고 분자량이 조금 더 적다 (도 14B). 이들 두 밴드는 tau HJ8.1에 대항하여 생성된 또다른 마우스 단클론 항체에 의해서도 침전되었다(도 14C). 이들 데이터는 ELISA에 의해 평가될 때 ISF내 대부분의 종이 전장의 단량체 tau일 가능성을 암시한다.
실시예 3. Tau RD 단백질은 형질감염된 HEK293 세포들에서 원섬유 응집을 형성한다.
tau 유전자는 6개의 단백질 아이소폼을 인코드하고, 그리고 다중 돌연변이는 주로 유전되는 신경퇴행성 질환의 원인이 되었다. 접합(splicing)에 따라, tau 단백질은 이 단백질의 응집-경향이 있는 코어로 구성된 3개 또는 4개 반복 영역을 보유하는데, 이를 반복 도메인 (RD)이라고 한다. tau RD의 발현은 유전자변이 마우스에서 병리를 야기하고, 그리고 전장의 tau의 절두(truncation)는 환자에게서 원섬유를 포함하는 단편을 형성시킨다는 증거가 있다. 이 구조는 배양된 세포 안에서 확실하게 원섬유를 형성하기 때문에 전장의 tau대신 이용되었다. tau 응집을 증가시키는 것으로 알려진 다양한 돌연변이들이 4개-반복 RD 단백질에 만들어졌다: ΔK280 (ΔK로 명명됨), P301L, 그리고 V337M. P301L 및 V337M 돌연변이체는 한 개의 단백질에서 복합되어 (LM으로 명명됨), 이미 설명된 것과 유사하게 강력하에 응집을 증가시키는 능력을 가진 RD의 돌연변이체 형태를 만들었다. 이러한 ＂비-생리학적(nonphysiologic)＂ 돌연변이체는 세포내 응집의 효과적인 형성에 의존적인 이전 사건 및 미스 폴딩의 세포 이전 전파 분석을 가능하게 하고, 그리고 ＂생리학적(physiologic)＂ ΔK 돌연변이체의 응집 표현형과 유사하지만 덜 강력한 응집 표현형을 보완한다. 또한 2개의 프롤린 치환이 ΔK 돌연변이체, I227P 및 I308P (PP로 명명됨) 안에 만들어졌으며, 이는 β-쉬트 형성과 원섬유화를 저해시키지만, 이들이 무정형 응집 형성을 차단시키지는 못한다. 각 돌연변이체 tau 형태는 카르복실 단부에서 시안(cyan) 또는 황색 형광 단백질 (CFP 또는 YFP), 또는 HA 테그에 융합되었다. 구조체는 도 15A에 나타낸다.
tau RD 세포내 응집 특징을 평가하기 위하여, 다양한 형태의 RD는 HEK293 세포에게 일시적으로 형질감염되었다. 원자력 현미경검사 (AFM)를 이용하여 SDS-불용성 물질이 평가되었다. RD(ΔK)-HA 및 RD(LM)-HA는 분명한 원섬유 종을 만들었다 (도 15B). 세포 안에 RD(ΔK)-HA 및 RD(LM)-HA 응집은 또한 베타 쉬트 원섬유를 라벨시키고, 청색 스펙스텀에서 방출되는 X- 34, 티오플라빈 유도체에 대해 양성 착색되었다 (도 15C). 추가적으로, 세제 분획화를 이용하여 광 현미경검사에 의해 보이는 봉입체가 생화학적 상관성을 보유하는지를 테스트하였다. SDS 불용성 펠렛 (1% Triton X-100/1X PBS + 가용성 펠렛 단리를 위한 프로테아제 저해제, 이어서 불용성 펠렛의 SDS/RIPA), 단량체 및 올리고머와 일치되는 더 높은 분자량의 종들이 탐지되었다 (도 15D).
출원인은 사전에 세포내 헌팅턴 단백질 응집을 정량화시키기 위하여 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 이용하였다. 이 방법을 이용하여 tau RD 응집을 추적할 수 있는지를 테스트하기 위하여, 다양한 RD 돌연변이체 (wt, ΔK, PP, LM)는 황색 형광 단백질 (YFP: FRET 수용체) 그리고 시안 형광 단백질 (CFP: FRET 공여자)에 융합되었다. 이들 구조체는 HEK293 세포들에게 공동-형질감염되었으며(RD-CFP/RD-YFP로 표시됨), 그리고 세포내 응집 형성은 FRET 수용체 광퇴색 공촛점 현미경검사 및 형광 플레이트 판독기 (FPR)를 이용한 스펙트럼 방출 FRET를 이용하여 정량화되었다. 공촛점 현미경검사의 경우, RD(LM)-CFP/ RD(LM) YFP를 공동-발현시키는 세포들이 영상화되었으며, 공여자 신호는 부분적 그리고 완전한 수용체 광퇴색 전과 후에 측정되었다. 광퇴색 이후 공여자 신호의 증가는 18.2% ± 0.058의 평균 FRET 효율을 가져왔고 (n=6, 데이터는 ± 표준 편차), 이는 FRET-쌍을 이룬 RD 종 사이에 분자간 상호작용을 확인시킨다 (도 16A). FPR과 함께 스펙트럼 FRET에 의한 RD-CFP/YFP 응집을 측정하기 위하여, 확립된 방법들이 이용되었다. 이는 신호 탐지 한계 안에서 공여자 소거(quenching)를 최대화시키기 위하여 3:1의 비율로 RD-YFP와 RD-CFP의 공동-형질감염에 기초하였다. RD(PP)-CFP/YFP로부터 유의적인 FRET는 관찰되지 않았다. 그러나, RD(ΔK)-CFP/YFP와 RD(LM)- CFP/YFP 각각 강력한 FRET 신호를 생성하였는데 (도 16B), 현미경검사 발견을 입증한다.
다양한 세포들이 세포외 배지로부터 재조합 tau 원섬유를 취입할 것이라는 것은 이미 관찰되었다. 이는 천연적으로 폴드된 YFP에 융합된 전장 tau 단백질의 세포내 원섬유화를 촉발시킨다. 이 현상을 확인하기 위하여, FRET를 이용하여 다양한 양의 재조합 RD 원섬유에 의해 유도된 RD(ΔK)-CFP/YFP의 응집을 관찰하였다. HEK293 세포들은 RD(ΔK)- CFP/YFP와 함께 공동-형질감염되었고, 15시간 동안 배양되었다. 다양한 농도의 RD-HA 원섬유 (0.01, 0.03, 0.1 및 0.3 μM의 동량의 단량체)는 배지에 9시간 동안 추가되었다. 원섬유는 그 다음 배지 교환에 의해 제거되었고, 세포들은 고정되고, FRET를 이용하여 분석되기에 앞서 4시간 동안 회수되도록 허용되었다. 처리안된 RD(ΔK)- CFP/YFP 세포들과 비교하여, 재조합 원섬유에 의해 유도된 FRET 신호의 약량 의존적 증가가 관찰되었다 (도 16C). 요약하면, 세포 안에서 tau RD 응집과 원섬유 형성의 미세한 분자, 생화학적, 그리고 생물리학적 측정 간에 상관관계가 관찰되었다. 특정 제약 내에서, 구체적으로 단백질 발현 수준에 대한 대조군과 함께, 플레이트 판독기-기반 FRET 분석은 이 공정의 용이한 측정을 제공한다.
실시예 4 RD 응집의 세포 이전 유도
출원인은 한 세포에서 공동 배양물의 경험이 없는(
Figure pat00010
) 세포로 이전될 것이라는 것은 이미 밝혀내었다. 그러나 이러한 이전된 응집은 수령 세포에서 응집을 더 유도할 수 있는지, 또는 응집의 유도가 직접적인 단백질-단백질 상호작용에 근거하는 지는 아직 밝혀지지 않았다. 공여자 세포 집단으로부터 유도된 RD(LM)-HA 응집이 공동-배양시에 상이한 수령 집단에서 RD(ΔK)-YFP와 함께 봉입체를 형성할 수 있는지에 대하여 우선 테스트되었다. 세포들중 한 집단은 응집-경향이 있는 RD(LM)- HA로 형질감염되었고, 그리고 별도의 집단은 RD(ΔK)-YFP로 형질감염되었다. 그 다음 날, 세포 집단은 함께 재-도말되었고, 48시간 동안 공동-배양되었다. 고정 후, 이들은 HA 항체를 이용하여 면역착색되었고, 그리고 X-34로 카운터착색되었다. 봉입체 안에 공동-국소화된 RD(LM)-HA 및 RD(ΔK)-YFP를 가진 많은 세포들이 관찰되었다(도 17A). 빈번하게 이들 봉입체는 또한 X-34에 대하여 양성 착색되었으며, 이는 베타 쉬트 구조를 나타낸다. RD(LM)-HA를 발현시키는 세포들과 함께 공동-배양됨으로써 유도된 RD(ΔK)-CFP/YFP의 응집을 모니터하기 위하여 FRET 분석을 이용함으로써 이들 연구는 연장되었다. 이 경우에서, 2개 세포 집단이 공동-배양된다. 공여자 집단은 RD(LM)-HA를 발현시키고, 수령 집단은 RD(ΔK)- CFP/YFP를 발현시켰다. tau RD(PP)-HA의 β- 쉬트-저항성 형태 또는 허위 형질감염된 세포들은 음성 대조군으로 이용되었다. 48 h 시간 후 세포 단층들로부터 FRET가 측정되었다. RD(PP)-HA 또는 허위 형질감염된 세포들과 비교하여 RD(LM)-HA와 공동-배양에 의해 유도된 FRET의 강력한 증가가 관찰되었다 (도 17B). RD(LM)-HA 세포들과 RD(WT)-CFP/YFP 수령 세포들의 공동-배양 후 FRET 신호의 약간의 증가가 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않음). 이 결과들은 베타-쉬트가 풍충부한 봉입체 안에서 공동-국소화를 촉발시키기 위하여 한 세포에서 다른 세포로 응집-경향이 있는 하나의 tau 종의 이동을 암시하였다. 응집 방출은 세포 사멸 이후에 잠재적으로 발생될 수 있지만, 그러나 다양한 형질감염된 집단의 프로피디움 요오드화물 착색을 이용하여도 이것에 대한 증거는 관찰되지 않았다 (도 17C).
실시예 5 직접적 단백질 접촉에 의한 미스폴딩의 증식
강력하게 제의되지만, 이들 결과는 공동-응집이 공여자로부터 유도된 tau RD 간의 분자간 연합이 수령 세포들내 대응하는 단백질 접촉과 함께 직접적 단백질 접촉을 통하여 발생되는 지에 관하여 공식적으로 다룰 수는 없을 것이다. 이 질문을 해결하기 위하여 FRET가 이용되었다. 제 1, RD(LM)-CFP는 공여자 세포 집단 내에서 공동-발현되었고, 그리고 RD(LM)-YFP는 제 2 수령 집단에서 공동-발현되었다. 세포 단층들로부터 48시간 후에 공촛점 현미경검사와 FPR과 함께 FRET가 측정되었다. 공촛점 현미경검사를 이용하여, YFP의 광퇴색 전과 후에 CFP 신호가 측정되었다. ~14.2%의 평균 FRET 효율이 기록되었고, 이는 봉입체가 직접 접촉된 RD(LM)-CFP와 RD(LM)-YFP를 포함한다는 것을 나타낸다 (도 18A). RD-CFP의 응집을 유도하기 위하여 라벨안된 상이한 형태의 RD를 이용하여 FPR을 통하여 상대적인 FRET 신호가 비교되었다. 제 1, RD(ΔK)-CFP와 RD(LM)-HA는 공여자 세포 집단에서 공동-발현되었고, 그리고 RD(ΔK)-YFP는 제 2 수령 세포 집단에서 공동-발현되었다. RD(LM)-HA는 RD(ΔK)-CFP 응집 및 이동 모두의 강화제로 작용하여, RD(ΔK) -YFP 수령 세포들 안으로 이의 후속적 이전을 촉진시킨다. 이로써 공동-배양된 세포들 안에서 작지만 재생가능한 FRET 신호 증가로 이어졌다. 이 신호는 β-쉬트 형성을 차단시키는 PP 돌연변이가 포함된 CFP- 또는 YFP-테그된 RD 구조체가 포함될 때 사라졌는데 (도 18B), 이것은 쌍을 형성하는 구성원 모두가 베타 쉬트 구조를 형성시키는 능력을 보유해야만 한다는 것을 나타낸다. 이전 실험들과 함께, 이들 결과로부터 직접적 접촉에 의한 미스폴딩의 전파가 일어나는데, 가령 한 세포로부터 응집이 나와서 제 2 세포 안에 있는 자연적으로 폴드된 단백질과 접촉하고 미스폴딩을 촉발시킨다는 것이 암시되었다. 이 데이터는 미스폴딩의 증폭은 연속적인 세포 공동-배양에서 또한 일어날 수 있음을 암시하였다. ＂공여자＂ 세포 집단을 응집 씨드에 사전-노출시키면 수령 세포 집단 내에서 탐지되는 최종 응집을 증가시킬 수 있을 것으로 예측되었다. 이것은 3가지 세포 집단을 연속적으로 배양하여 테스트되었다. 제 1 집단은 응집 ＂씨드＂를 형성하기 위하여 다양한 형태의 비-형광 RD-HA를 발현시켰다. 제 2 집단은 CFP 또는 RD(ΔK)-CFP를 발현시켰는데, 응집 유지를 허용하지 않거나(CFP) 또는 허용성 RD(ΔK)-CFP 이다. 이들 두 집단은 미스폴딩 증폭을 허용하기 위하여 48시간 동안 공동-배양되었다. 그 다음, 복합된 제1 집단과 제2 집단의 50%는 RD(ΔK)-YFP를 발현시키는 제 3 세포 집단과 함꼐 48시간 동안 공동-배양되었다. 이 제 3 수령 집단은 RD(ΔK)-CFP 세포내 응집 및 전파 정도를 나타내는 ＂리포터(reporter)＂로 삼는다. RD(LM)-HA를 RD(ΔK)-CFP 집단에 사전-노출은 응집-경향이 있는 tau에 사전-노출되지 않은 세포들과 비교하여 최종 FRET를 약 2.6배 증가시켰다. 예상했던 것과 같이, 제 2 집단 세포에 순수 CFP를 발현시키는 세포의 삽입으로 tau RD ＂씨드＂에 사전 노출 효과는 완전하게 차단되었다 (도 18C). 이들 데이터들은 함께 연속적으로 배양된 세포 집단내에서 tau 응집 증폭을 나타낸다.
실시예 6. 응집의 세포외 공간으로의 방출에 의해 중재되는 세포-세포 전파
단백질 응집이 세포 간을 이용하는 기전은 아직 밝혀지지 않았다. 예를 들면, 일부는 나노튜브의 터넬링을 통하여 프라이온 단백질 전파를 제의했지만, 다른 일부는 엑소좀을 제의하였다. tau 단백질에 대한 항체는 생체내에서 병리를 감소시키는 것으로 이미 보고되었기 때문에, tau 응집은 세포외 공간으로 직접 방출되어야 할 것이다. 세포-세포 접촉에 기반을 둔 세포간 이동은 세포외 배지의 용적과는 독립적이어야 하지만, SOD1에서 설명된 것과 같이 tau의 세포간 이동은 세포외 용적에 민감할 수 있다고 예측되었다. 시작하기 위하여, 다양한 용적으로 설정된 배지에서 공동-배양 효과가 우선 테스트되었다. 세포 배양 배지 용적을 증가시키면 응집의 세포간 이동 효율이 감소되었음이 관찰되었다 (도 19A). 더욱이, RD(LM)-HA를 발현시키는 세포로부터 조건화된 배지의 이전은 RD-CFP/YFP를 발현시키는 세포내에서 응집을 유도하는데 충분하였다 (도 19B). 이들 결과는 세포외 공간을 통하여 세포 간에 tau 이동과 일치하지만, 그러나 이 단백질이 엔도좀에 포집되었는지는 단정할 수가 없다.
포집된 tau에 접근이 지질 막에 의해 차단될 수 있기 때문이며, 반면 자유 tau는 항체에 접근가능할 것이다. 따라서, tau를 면역침전시킬 수 있는 마우스 단클론 항체 (HJ9.3)가 세포간 전파를 차단시킬 수 있는지에 대하여 테스트되었다. 상기에서 설명된 tau RD 전파의 세포의 모델의 변형이 이용되었는데, 이때 RD(LM)-HA 및 RD(ΔK)-CFP는 한 세포 집단 안에서 공동발현되었으며, FRET 분석에 앞서 RD(ΔK)-YFP를 발현시키는 세포와 48시간 동안 공동-배양되었다. 48 h 공동-배양 기간 동안 집단(pooled) 마우스 IgG에 대하여 HJ9.3이 테스트되었다. HJ9.3을 이용하여 세포간 전파에서 용량 의존적 감소가 관찰되었고, 한편 비-특이적 IgG는 효과가 없었다 (도 19C 및 D). 중요한 것은, RD(ΔK)-CFP 및 RD(ΔK)-YFP의 세포내 응집에 있어서 두 단백질이 동일한 세포 안에서 공동 발현될 때, HJ9.3은 효과가 없었고 (도 19E), 이것은 항체가 세포내 응집을 직접적으로 저해하지 않음을 나타낸다. 생화학을 이용하여 tau 미스폴딩의 유도 평가에 의해 세포간 전파에서 자유 tau의 역할이 더 테스트되었다. 세제 분획화 및 웨스턴 블랏에 의한 응집 유도가 확인되었으며, 불용성 분획에서 RD(LM)-HA와의 공동배양에 의해 유도된 RD(ΔK)-YFP가 증가된 것으로 나타났다. HJ9.3은 공동-배양된 세포들에서 RD-YFP의 불용성을 유도하는 RD(LM)-HA의 효과를 차단시켰다 (도 19F 및 G).
항체 추가 효과는 자유 tau가 세포간에 직접 전달됨을 암시하지만, 항체 저항 기전은 여전히 불확실하게 남아있다. HJ9.3이 tau 원섬유가 세포 안으로 취입되는 것을 차단한다고 가정하였다. 이 사상을 테스트하기 위하여, 유동 세포분석을 이용하여 응집의 세포간 이동에서 항체의 효과를 감시하였다. 출원인은 세포측정 파라다임을 이미 확립하여, 세포의 한 집단은 mCherry으로 라벨되었고, 제 2 집단은 tau-YFP 융합을 포함한다. 공동-배양 후, 이중-양성 (YFP/mCherry) 세포들의 상대적 비율에 근거하여 세포간 이동을 감시하는 것이 가능하다. HEK293 세포 집단은 tau RD(LM)-YFP로 형질감염되었고, 제 2 집단은 mCherry를 발현시키는 렌티바이러스로 형질유도되었다. 두 집단을 세척하고 재현탁시킨 후, 세포들은 그 다음 배지 안에서 HJ9.3 없이 또는 약 10배 희석물의 HJ9.3 존재하에 48시간 동안 공동-배양되었다. 세포들은 수거되었고, 유동 세포분석을 이용하여 이중 양성 세포의 상대적 수가 측정되었다. 음성 대조군은 분류(sorting)에 앞서 혼합된 동일한 세포 집단으로 구성되었다. 각 데이터 점은 생물학적 삼중(triplicates)으로 구성되었다. 공동-배양된 세포들은 사전혼합된 세포의 0.142%와 비교하였을 때(배경), 훨씬 더 많은 RD(LM)-YFP/mCherry 이중 양성 세포들을 보유하였다 (2.07%). HJ9.3은 이중 양성 세포들의 비율을 2.07%에서 1.31%로 감소시켰다 (도 19H). 이는 FRET에 의해 측정되었을 때 응집의 세포간 전파에 있어서 이 항체의 효과와 유사하다. FRET 및 유동 세포분석에 의해 측정되었을 때 전파 차단에서 이 항체의 효능의 차이는 아마도 이 사건을 측정하는데 이용된 두 기술간의 차이때문일 것이다.
응집의 세포간 이동에 있어서 HJ9.3 항체의 효과를 더 감시하기 위하여, HJ9.3/항체 복합체가 침착된 위치를 한정시키는 시도에서 직접적 면역형광이 이용되었다. RD(ΔK)-YFP 세포들 또는 형질감염안된 세포들은 HJ9.3 존재하에 48 시간 동안 배양되었다. 세포는 4% PFA로 고정되었고, 0.25% TritonX-100을 이용하여 투과가능하도록 만들었고, 그 다음 염소 항-마우스 Alexa 546 라벨된 이차 항체에 노출되었다. 극소수의 HJ9.3/tau 복합체는 세포들 내부에 존재하였다. 그러나, 대부분 복합체는 세포 외부에서 발견되었는데, 주로 세포 막에 결합되어 있었다. 이 항체 장식은 비-형질감염된 세포에서는 존재하지 않았고, 이는 신호가 HJ9.3/tau 복합체에 특이적임을 나타낸다 (도 20). 따라서 HJ9.3은 세포 밖에서 응집을 포착하여 tau 응집 취입을 차단시킨다.
실시예 7. Tau 원섬유는 세포-세포 전파를 중재한다.
전파 분석에서 HJ9.3의 활성은 책임을 갖는 tau 종을 한정하는 기회를 만들었다. HJ9.3을 이용하여 세포 배지로부터 tau를 추출하였다. HJ9.3 또는 대조군 IgG는 다양한 RD 구조체 (wt, PP, ΔK, LM)를 발현시키는 세포의 배지에 추가되었다. 항체들은 48 시간 배양 기간 시작 또는 종료시에 추가되었다. 단백질-G-아가로즈 비드를 이용하여 항체/항원 복합체의 친화력 정제를 위하여 배지는 수거되었다. 복합체는 세척되었고, 그 다음 웨스턴 블랏에 의한 분석을 위하여 SDS 로딩 완충액 내에서 가열되었다. HJ9.3은 세포 배지로부터 tau RD 종을 특이적으로 포획하였지만, IgG는 인식할 수준의 효과가 없었다 (도 21A). HJ9.3이 배양 기간을 통하여 존재하였을 때 배지에 존재하는 tau 단백질이 ~10배 증가된 것으로 관찰되었는데, 이는 배양 기간 종료시 추가한 것과 반대였다 (도 21B). RD(ΔK)-HA 및 RD(LM)-HA 형질감염된 세포들의 배지에서 더 높은 차원의 분자량 종이 또한 기록되었는데, 이는 RD 응집과 일치된다. RD(PP)-Htau는 배지 안에 존재하는 최소 단백질이었고, 웨스턴 블랏에서 더 높은 차원의 종은 관찰되지 않았다. 기존에 설명된 실험의 시간 일정 (0h, 3h, 6h, 9h, 12h, 24h 및 48 h)에서 배지에 tau 수준은 시간-의존적으로 증가됨을 나타내었고, 이는 HJ9.3 항온처리는 조건화된 배지 안에 존재하는 tau 단백질의 항정상태 수준을 또한 증가시킬 수 있음을 암시한다 (도 21C). 이와 함께, 이들 데이터는 HJ9.3이 세포안으로 응집 취입의 간섭에 의해 세포간 전파를 차단시킨다는 것을 나타내는데, 세포 안팍으로 tau 응집의 항정상태 유동과 일치된다.
세포간 전파를 조정하는 tau 종의 정확한 특징은 알려져있지 않다. 따라서, HJ9.3을 이용하여 AFM을 통한 영상화를 위하여 이들 종을 포획하였다. 다양한 tau 돌연변이체로 형질감염된 HEK293 세포들은 HJ9.3 존재하에 배양되었다. 48 시간 후 항체/항원 복합체는 단백질-G 아가로즈 비드를 이용하여 정제되었다. 그 다음 복합체는 높은 염 완충액 안에서 비드로부터 용리되었고, 영상화를 위하여 AFM 상에 두었다. RD(ΔK)-HA 및 RD(LM)-HA를 발현시키는 세포 배지에서 분명한 원섬유 종이 탐지되었지만, RD(PP)-HA는 단지 무정형 응집만을 만들었고 (도 21D), 그리고 허위-형질감염된 세포들은 신호를 내지 않았다 (데이터 나타내지 않음). 이러한 발견은 세포외 공간으로 이들을 방출시킴으로써 tau 응집의 세포간 전파를 조정하는 자유 tau 원섬유와 일치된다.
실시예 8. 생체내 tau 병리에서 항-tau 항체의 효과
전장, 재조합 인간 tau에 대한 두 가지 추가 항체의 활성이 전파 분석에서 테스트되었다. RD(LM)-CFP 및 RD(ΔK)-YFP 세포들은 상이한 tau 에피토프들을 표적으로 하는 상이한 단클론 항체 (HJ8.5, HJ9.3 및 HJ9.4, 도 22A) 존재 또는 부재하에 48시간 동안 공동-배양되었다. Aβ 펩티드에 대한 HJ3.4 항체는 음성 대조군으로 이용되었다. 이들 3가지 항-tau 항체는 모두 세포들간에 RD-tau의 응집전(pro-aggregation) 돌연변이체의 세포간 전파를 차단시켰다(도 22B). 음성 대조군, HJ3.4는 세포간 전파를 차단시키지 못하였다. HJ8.5, HJ9.3 및 HJ9.4는 또한 ELISA에 의해 RD-tau 원섬유를 탐지하였다 (도 22C).
생체내에서 세포에서 세포로 tau 응집 전파를 차단시키기 위하여, tau 상에 상이한 에피토프를 표적으로 하는 항체를 이용한 수동 면역 방법이 이용되었다. 항-tau 항체, HJ8.5 및 HJ9.3, 또는 운반체는 6 월령, P301S tg 마우스에게 Alzet 삼투 펌프(2006 model, 도 23A)를 이용한 뇌실계내부 주사를 통하여 측면 뇌실로 각각 주입되었다 Alzet 펌프 어셈블리에 부착된 뇌 캐뉼라는 정수리에서 전후 0.4 mm, 중앙에서 측면으로 1.0 mm 그리고 배복에서 2.5 mm의 위치에서 각 마우스의 좌측 측면 뇌실에 외과적으로 이식되었다(도 23B). 치료 후, 캐뉼라의 위치는 크레실 바이올렛 착색으로 확인되었다 (도 23C). Alzet 삼투 펌프는 6주 후에 재배치되었고, 실험은 84일차에 끝냈다.
실험 기획이 항체 분해 및/또는 비활성을 초래하지 않았는지를 확인하기 위하여, 마우스 뇌 안에 주입 6주 후 Alzet 펌프로부터 항체가 수거되었고, SDS-PAGE 겔상에 로딩되었다. 이 겔은 Coomassie 블루 염료로 우선 착색되었고(도 24A) 그리고 6 주 주입 전과 후에 펌프로부터 빼낸 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅에 의해 분석되었다 (도 24B). 생체내 생리학적 온도에서 Alzet 펌프 안에서 6주 후에 모든 항체는 안정적이며, 활성적이었다. 상이한 주입 항체를 재조합 인간 tau 단백질에 고정(spiking)은 총 tau를 측정하기 위한 HJ8.7 - BT2B ELISA 분석을 간섭하지 않았다는 것이 추가 확인되었다 (도 25).
항체 처리가 병적 tau 착색을 감소시켰는지를 결정하기 위하여, 운반체/PBS 또는 항-tau 단클론 항체로 처리된 9-월령, P301S tg 마우스의 조직 단편에서 tau 착색이 평가되었다. 조롱박 피질의 관상 단면은 tau의 비정상적으로 포스포릴화된 형태를 인지하는 바이오티닐화된 AT8 항체로 착색되었다. 예비 면역조직화학 데이터의 정량적 분석에서 비정상적으로 포스포릴화된 tau 로드(load)는 마우스 뇌에서 HJ8.5 및 HJ9.3의 주입후 눈에 띄게 감소되었음을 보여주었다 (도 26 및 27). 이들 효과의 생화학적 분석은 진행중이다. 성공적이라면, tau 전파 및 병리에 대항한 수동 면역주사는 알츠하이머 질환, 전두측두엽 치매 또는 기타 타우병증(tauopathies)을 치료하는 치료요법적 접근방법이 될 수 있을 것이다.
실시예 3-7에 대한 논의
응집의 주형화된 형태학적 변화 및 세포간 전파와 관련된 프라이온-유사 기전은 타우병증(tauopathies) 및 기타 신경퇴행성 질환의 무자비한 진행을 설명할 수 있을 것이라고 이미 제안되어 왔었다. 이는 공여자 세포로부터 단백질 응집의 방출, 수령 세포로의 진입, 그리고 미스폴딩된 상태를 증폭시키기 위하여 자연적으로 폴드된 단백질과의 직접적 접촉과 일관될 수 있다. 그러나, 타우병증 모델을 뒷받침하기 위한 기전적 증거가 완벽하지 않고, 이러한 방식으로 tau 미스폴딩의 세포간 전파는 이전에 설명되지 않았다. 실시예 3-7은 분비된 tau 응집을 통하여 배양된 세포들에서 tau 응집의 세포 전파를 현재 설명하고, 유사한 기전을 제안한다. 추출된 물질의 X-34 착색과 AFM을 이용하여 형질감염된 세포내에서 RD tau 원섬유의 자발적 형성이 우선 기록되었다. 그 다음 공촛점 현미경검사를 이용하여 세포내 봉입체 안에 2가지 별도의 세포로부터 유도된 tau의 우연한 일치가 관찰되었다. 이는 응집-경향이 있는 형태의 단백질, RD(LM)-HA를 발현시키는 세포와 공동-배양될 때 tau RD(ΔK)-YFP의 세재 불용성이 증가된 것과 연합되었다. 동일 세포들 안에서 공동-발현된 RD(LM)-CFP/YFP 사이에 FRET를 이용하여 응집에서 증가가 또한 기록되었다. 이는 수용체 광퇴색 (현미경검사), 그리고 스펙트럼 방법(FPR)에 의해 탐지되었다. 전파가 직접적 단백질 접촉에 의해 발생되었다는 것을 기록하기 위하여 별도 세포 집단에서 발현된 RD(LM)-CFP와 RD(LM)-YFP 사이에 FRET가 그 다음 이용되었다. 그 다음 이 방법은 연속 배양 조건에서 세포 집단 내 tau 단백질 미스폴딩의 증폭을 기록하는 것까지 연장되었다. tau 응집의 세포간 전파는 세포외 공간으로 직접적으로 방출되는 원섬유에 의해 중재되는데, 그 이유는 이전이 세포외 용적에 민감하고, 조건화된 배지는 세포내 응집을 증가시킬 수 있고, 그리고 항-tau 항체 (HJ9.3)는 세포간 전파를 간섭하였으며, 그리고 세포외 tau 원섬유를 포획하였기 때문이다. 다양한 기술을 이용하여, 출원인은 따라서 주형화된 형태학적 변화를 통하여 세포간 응집 전파를 기록하였으며, 이러한 현상을 설명하기 위하여 간단한 모델을 제안한다 (도 29).
세포간 전파(Trans-cellular propagation) - 세포들 간에 응집화된 tau의 자발적인 이동이 이미 설명되었지만, tau 단백질 응집이 세포 상에서 간접 효과와 상반되는, 단백질의 직접 접촉에 의해 세포들간에 미스폴드된 상태를 증식시킬 수 있다. α-시누클레인의 세포 배양 연구에서 역시 전파가 제안되었지만, 공여자 세포들로부터 유도된 종들(가령, 응집 vs. 이량체 vs. 단량체)의 특징이 무엇인지, 그리고 수령 세포들에서 이들이 형성되었는지에 대해서는 분명하지 않다. 유사하게, SOD1 응집은 추가 응집을 유도하기 위하여 배지를 통하여 세포들간에 이전시킬 수 있지만, 그러나 담당 단백질 이형태체(conformer)의 정확한 성질과 직접적 단백질-단백질 접촉이 발생하는지에 대해서는 아직 밝혀지지 않았다. 정제된 Aβ42와 tau 원섬유를 유전자변이 마우스 뇌로 주사하면 인근에 tau 원섬유의 발생과 함께 내생성 tau의 응집이 유도되지만, 주사된 단백질에 의한 씨딩을 배제하는 것은 어렵다. 출원인의 실험과 후속적으로 다른 사람들의 작업에서 세포의 외부로부터 세포의 내부로 재조합 단백질에 의해 tau 응집의 이동 및 유도가 기록되었다. 그러나, 한 세포에서 또다른 세포로 전파: 응집 이동, 수령 세포안에서 단백질이 원섬유 상태로 전환, 그리고 미스폴드된 종의 증식에 관하여 진짜로 설명한 기존 연구는 없었다.
이 작업은 몇 가지 방식으로 이들 현상을 설명하였다. 우선, RD(ΔK)-YFP를 발현시키는 세포와 응집-경향이 있는 형태의 tau RD(LM)-HA와의 공동-배양은 β-쉬트 양성 봉입체 안에 공동-국소화를 유도한다는 것이 발견되었다. 그 다음, RD(LM)-HA를 발현시키는 세포와 RD(ΔK)-CFP 및 RD(ΔK)-YFP를 모두 발현시키는 또다른 집단의 공동-배양은 FRET 신호의 증가로 이어지는 것으로 관찰되었으며, 이는 FRET 쌍을 발현시키는 세포 안으로 RD(LM)-HA의 이동이 이들 응집을 유도하였다는 것이 제안된다. 직접적 접촉과 세포들 간에 tau 응집의 공동 응집을 설명하기 위하여, RD(ΔK)-CFP 및 RD(ΔK)- YFP는 별개 집단에서 발현되었다. 이는 세포간 이동으로부터 유도된 FRET 신호와 공동-응집이 유도되었는데, 이는 구조체중 하나에 β-쉬트 형성을 방해하는 프롤린 돌연변이를 포함하는 경우 사라졌다. RD-CFP 응집의 이전에 의해 전장 tau-YFP 응집의 유도 또한 관찰되었지만, 효율은 감소되었다 (데이터 나타내지 않음). 끝으로, 단백질 응집의 세포간 이동에 의해 유도된 FRET 효율은 RD(LM)-HA 발현 세포들과 RD(ΔK)-CFP를 발현시키는 세포의 예비 공동 배양에 의해 상당히 증가되었는데, 이는 세포 집단내 응집 상태가 증폭될 수 있음을 설명한다.
tau 응집 전파의 항체 조정 - 주로 세포외 Aβ 펩티드에 대항하는 항체들은 뇌에서 Aβ 응집을 방지시키고, 기존 응집을 제거할 수 있다. 잠재적인 부작용이 있지만, 이러한 항체는 치료용으로 전망이 있다. 그러나, 타우증(tauopathy)과 시누클레인병증(synucleinopathy)의 마우스 모델에서 백신접종의 성공은 표적 단백질이 주로 세포내(intracellular) 단백질이라는 사실의 견지에서 미스테리다. tau- RD에 대항하는 HJ9.3, 마우스 단클론 항체가 tau 응집의 세포간 전파를 저해하였다는 것이 관찰되었다. 그러나, 이 항체는 tau의 세포내 응집에 있어서 효과는 없었다. 세포 배지를 이 항체에 장기 노출은 배지에서 항정상태의 tau 수준을 상당히 증가시켰다. 이것은 HJ9.3이 한 세포에서 또다른 세포로 응집의 이전을 차단시켰다는 것을 설명한 유동 세포분석 연구에 의해 확증되었다. 최종적으로, 세포 표면에서 포획된 HJ9.3/tau 복합체가 관찰되었다. 이 항체의 효과는 프라이온의 경우에 제안되었던 tau 원섬유가 세포외 공간으로 방출되며, 엑소좀 안에서 주로 세포-세포 이전을 통하여 또는 나노튜브의 터널링을 통하여 미스폴딩이 증식되지 않음을 강력하게 암시하였다. 더욱이, HJ9.3에 의해 포획되지 않았다면, 세포 외부에 존재하는 응집은 세포 안으로 다시 취입될 가능성이 있다. 치료 항체용으로 단백질 원섬유의 분해, 세포 안에서 전환의 차단, 그리고 세포내 분해 촉진이 포함된 다양한 방식의 저해를 상상할 수 있다. HJ9.3을 이용한 우리 결과는 타우병증을 차단시키는데 이용될 수 있는 한 기전으로 세포 취입 간섭과 대부분 일치되며, 신경퇴행성 질환을 위한 치료 항체의 개발 및 최적화를 고려하는 새로운 방법을 제시한다.
원섬유 tau를 통하여 세포간 전파(Trans-cellular propagation via fibrillar tau) - tau 응집의 전파의 차단에 HJ9.3의 효과는 이 항체를 담당 종을 포획하는데 사용허락 되었다. 조건화된 배지로부터 tau의 면역-친화력 정제에 의해 원섬유 tau가 드러났다. 대조군 세포들의 배지에서 tau 원섬유가 관찰되지 않았고, 또는 β-쉬트-저항성 RD(PP)-HA를 발현시키는 세포들의 배지로부터 tau 원섬유가 관찰되지 않았는데, 이것은 무정형 응집을 만들었다. RD(ΔK)- HA 및 RD(LM)-HA 발현은 각각 세포외 공간으로 원섬유 분비를 야기하였다. 한 세포 안에 단백질 응집이 인접 세포 안의 응집에 어떻게 영향을 줄 수 있는지는 명확하지 않지만, 사이토킨, 엑소좀, 또는 세포들간의 직접적 연결이 이들 과정을 촉진시킬 수 있음은 공식적으로 가능하다. 이들 가능성을 완전하게 배제시킬 수 없다. 그러나, 이들 결과는 세포외 공간을 통하여 전파 조절물질로써 자유 원섬유 종과 대부분 일치된다. 이 작업은 배양물에서 한 세포로부터 또다른 세포로 단백질 응집의 전파 기전에 대한 몇 가지 중요한 의문에 답을 제안하며, 따라서 생체내에서 이것들이 어떻게 그렇게 하는지에 대한 답도 제안한다. 세포간 전파를 감시하는 본 명세서에서 설명된 상기 방법들과 연관하여, 타우병증(tauopathies) 및 다른 신경퇴행성 질환의 더욱 효과적인 치료를 위한 약리학적 그리고 생물학적 물질로 이 공정을 겨냥하는 것이 가능할 수 있다.
실시예 1-8을 위한 방법들
항체들
최장 마우스 재조합 tau 아이소폼 mTau40 (432 aa) 및 최장 인간 tau 아이소폼 hTau40 (441 aa)는 Eva Mandelkow의 실험실에서 제작되어 tau ELISA에서 표준으로 이용되었다. 인간 및 마우스 tau (잔기 218-225에서 에피토프)를 모두 인지하는 마우스 단클론 항체 Tau-5는 L. Binder의 실험실로부터 구하였다(LoPresti et al., 1995; Porzig et al., 2007). tau 녹-아웃 마우스 인간 tau 및 마우스 tau에 대항하여 차례로 면역주사에 의해 단클론 항체 HJ8.1 및 HJ9.3가 생성되었다(The Jackson Laboratory). 이둘 항체는 웨스턴 블랏, 면역침전, 그리고 ELISA 분석에서 마우스 및 인간 tau를 인지한다. HJ9.3은 tau의 미세관 결합 영역 (MTBR)을 인지한다. 인간 및 마우스 tau (잔기 194-198에서 위치한 에피토프)를 모두 인지하는 마우스 단클론 항체 BT-2는 Pierce에서 구하였다. Tau에 대항한 토끼 다중클론 항체 (ab64193, 반복 도메인 영역에 위치한 에피토프)는 Abcam, Cambridge, MA에서 구입하였다. 헤마글루티닌 HA (HA.11 Clone 16B12)에 대항한 마우스 단클론 항체는 Covance, Emeryville, CA에서 구입하였다. 토끼 다중클론 GFP 항체 (sc-8334)는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다.
플라스미드
단백질 발현을 위하여 미세관 연합된 단백질 tau의 4개 반복 도메인(RD)을 인코드하는 서열이 이용되었다. 야생형 형태에 추가하여, 다양한 tau 돌연변이체 가 만들어졌다: ΔK280 Δ(K); P301L/V337M (LM); ΔK280/ I227P/I308P (PP). 이들 서열은 C-말단 헤마글루티닌 (HA) 테그가 있는 pcDNA3.1 (Invitrogen) 안에, 또는 pEYFP-N1 또는 pECFP-N1 (Clontech) 안에 서브클론되어, C말단 형광 단백질 융합을 만들었다.
동물들
P301S 인간 T34 아이소폼 tau (1N4R)를 과다발현시키는 P301S tg 마우스 (line PS19)가 생성되었고, 이미 특징화되었고, B6C3 배경에 있다. P301S tg 마우스는 Jackson Laboratory으로부터 구하였다. Tau 녹아웃 마우스는 Jackson Laboratory으로부터 구하였다. 연령 및 유전적 배경이 정합되는 비-유전자변이 마우스 새끼는 야생형 마우스로 이용되었다. 이 연구의 모든 실험에서 수컷과 암컷 모두 이용되었다.
면역침전 및 면역블랏 분석
면역침전 및 면역블랏 분석. 해마의 현미투석(microdialysis) 시료는 P301S tau 유전자변이 마우스 및 야생형 마우스로부터 15시간 동안 분당 1.0 1로 수거되었다. ISF는 제조업자의 지시에 따라 HJ8.1 또는 HJ9.3 tau 항체가 피복된 Dynadeads (Invitrogen)에 의해 면역침전되었다. 침전된 분획물은 변성된 4-12% Bis-Tris 미니-겔(Invitrogen) 상에 로딩되었고 니트로셀룰로오즈 막으로 이동되었다. 바이오티닐화된 BT-2 항체 (Pierce) 및 폴리- HRP-접합된 스트렙타아비딘 (Thermo Scientific)은 침전된 항체의 간섭을 제거하기 위하여 이용되었다. HEK293 세포들은 10% 태아 소 혈청, 100 μg/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle Medium (DMEM)에서 배양되었다. 배양물은 37℃에서 5% CO2 가습 대기하에 유지되었다. 일시적 형질감염을 위하여, Optimem 배지에 도말된 세포들은 제조업자들의 추천에 따라 Lipofectamine/Plus 시약 및 600 ng의 적절한 DNA 구조체 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 형질감염되고, 그리고 추가 분석을 위하여 24시간 또는 48시간 후에 회수되었다.
세제 분획화 및 웨스턴 블랏 분석
HEK293 세포들은 12-웰 플레이트내에서 웰당 400,000개 세포로 도말되었다. 다음 날 세포는 600 ng의 플라스미드로 형질감염되었다. 48 시간 후, 세포들은 3 분 동안 37℃에서 0.05% 트립신으로 회수되여 7000 x g에서 간단하게 펠렛화시키고, 그리고 프로테아제 저해재가 함유된 PBS내 1% 트리톤 100μl에서 용해되었다. 가용성 세포액 단백질은 10분간 14,000 x g에서 원심분리에 의해 수거되었다. 불용성 단백질은 RIPA/SDS 완충액에 펠렛을 재현탁시키고, 핵산의 벤조나제 뉴클레아제 절단 후 20,000 x g에서 15 분동안 원심분리시켜 획득되었다. 공동-배양 실험을 위하여, RD(LM)-HA 및 RD(ΔK)-YFP로 형질감염된 동수의 세포들은 수확 및 웨스턴 블랏팅 전 48시간 동안 함께 공동-배양되었다. 각 분획으로부터 동량의 HEK293 세포 단백질 추출물은 4%-20% 폴리아크릴아미드 겔(Biorad), tau RD에 대항하는 항체 (RD 영역내 에피토크를 인지하는) 1:2000 희석액 (ab64193, Abcam, Cambridge, MA) 및/또는 GFP에 대항하는 항체 1:1000 희석액 (sc-8334, Santa Cruz Biotechnology, Inc.)을 이용하여 분석되었다. 화학발광-기반 퍼옥시다제-접합된 이차 항체 반응이 실행되었으며, X-레이 필름에 의해 탐지되었다. Image J 분석 소프트웨어를 이용하여 정량화가 실행되었다.
공동-배양 실험: FRET에 의해 RD-CFP/YFP 공동-응집 측정
HEK293 세포들은 12-웰 플레이트내에서 웰당 300,000개 세포로 도말되었다. 전술한 것과 같이, 다음 날 세포는 600 ng의 플라스미드로 형질감염되었다. 공동-형질감염된 세포들은 150 ng의 RD-CFP 구조체와 450 ng의 RD-YFP 구조체 복합물을 제공받았다. 15시간 후, 세포들은 37℃에서 3분 동안 0.05% 트립신으로 회수되었으며, 세포 분획물은 4중 중복으로 96-웰 플레이트 상에 재-도말되거나, 또는 현미경검사에 의한 영성화를 위하여 ibidi μ-슬라이드(ibidi GmbH, Germany) 상에 재-도말되었다. 세포는 그 다음 48시간 동안 추가 배양된 후 4% 파라포름알데히드로 고정되고, 분석되었다.
공동-배양 실험: RD-HA에 의한 RD-YFP 응집 유도 측정
HEK293 세포들은 12-웰 플레이트에서 RD(ΔK)-YFP 또는 RD(LM)- HA로 형질감염되었다. 15 시간 후, 세포들은 ibidi μ-슬라이드 상에 함께 재-도말되었고, 추가 48시간 동안 공동-배양되었다. 그 다음 이들은 현미경검사에 의한 분석을 위하여 항-HA 항체와 X-34와 함께 고정되었고, 착색되었다.
공동-배양 실험: 공동-배양에서 전파 분석
12-웰 플레이트 내 HEK293 세포들의 두 집단은 300 ng RD(LM)-HA 및 300 ng RD(ΔK) -CFP 함께, 또는 RDΔ(K) - YFP로 공동-형질감염되었다. 15시간 후, 동일한 비율의 두 집단은 96-웰 플레이트 포멧에서 48시간 동안 공동-배양되었다. 그 다음 세포들은 4% 파라포름알데히드로 고정되었고, FRET 분석은 Fluorescent Plate Reader (FPR)를 이용하여 실행되었다. FRET 현미경검사 분석을 위하여, 12-웰 플레이트 내 HEK293 세포들의 두 집단은 600ng RD(LM)-CFP 또는 RD(LM)-YFP로 형질감염되었다. 15시간 후, 동일한 비율의 두 집단은 ibidi μ-슬라이드에서 48시간 동안 공동-배양되었다. 그 다음 세포들은 4% 파라포름알데히드로 고정되었고, FRET 수용체 광퇴색이 실행되었다.
공동-배양 실험: 연속 배양에서 tau 응집의 증폭
HEK293 세포들은 12- 웰 플레이트에서 다양한 형태의 비-형광 RD-HA 600 ng과 함께 형질감염되었고, 24시간 동안 배양되었다. 제 2 집단의 세포들은 CFP 또는 RD(ΔK) -CFP로 형질감염되었다. 동일한 비율의 제 1 및 제 2 집단은 48시간 동안 공동-배양되었다. 이 시점에서, 이 집단의 50%은 96-웰 플레이트 내에서 RD(ΔK)-YFP로 형질감염된 세포 집단과 함께 48시간 동안 도말되었다. 그 다음 FPR을 이용한 FRET 분석을 위하여 세포들은 4% 파라포름알데히드로 고정되었다.
배지 이전 및 조건화된 배지 실험
HEK293 세포들은 12-웰 플레이트에서 600 ng의 RD(LM)-HA로 형질감염되거나 또는 150 ng의 RD(ΔK)-CFP 구조체와 450 ng의 RD(ΔK)- YFP 구조체의 조합으로 공동-형질감염되었다. 15 h 후, 세포들은 37℃에서 3분 동안 0.05% 트립신으로 회수되었다. RD(ΔK)- YFP/CFP 및 RD(LM)-HA를 발현시키는 대등한 수의 세포들은 세포 배양 배지의 양을 변화시키면서 48시간 동안 공동 배양되었다. 그 다음 세포들은 4% 파라포름알데히드로 고정되었고, FRET 분석이 실행되었다. 조건화된 배지 실험을 위하여, 형질감염 후 15 h 뒤, 형질감염 복합체가 포함된 RD(LM)-HA 세포들의 배지는 새로운 배지로 교체되었다. RD(ΔK)- YFP/CFP를 발현시키는 세포들은 37℃에서 3분 동안 0.05% 트립신으로 회수되었고, 96-웰 플레이트에 재도말도었다. 24 h 후, RD(LM)-HA로 형질감염된 세포로부터 조건화된 배지가 수거되었고, RD(ΔK)-YFP/CFP를 발현시키는 세포에게 추가되었다. 48 h 후, 세포들은 4% 파라포름알데히드로 고정되었고, FRET 분석이 실행되었다.
형광 공명 에너지 전달 (FRET) 분석: 광퇴색과 함께 현미경 검사에 의한 FRET 측정
앞서 설명된 것과 같이 공동형질감염 및 공동-배양 실험을 위하여 형질감염된 HEK293 세포들은 FRET 수용체 광퇴색 현미경검사를 위하여 준비되었다. 모든 영상은 C-Apochromat 40x 1.2 NA 렌즈 (Carl Zeiss Advanced Imaging Microscopy, 07740 Jena, Germany 100 X (CFP )를 이용하여 얻었다. 디지탈 영상은 Zeiss Axiovert 200M에서 Zeiss LSM510 Meta NLO Multiphoton/Confocal 공촛점 레이져 주사 현미경 시스템을 이용하여 얻었다. 영상화에 이용된 채널은 다음과 같다: 공여자 CFP는 458nm 아르곤 레이져와 480-520nm 밴드 통과 필터로 수거된 형광을 이용하여 자극되었고; 수용체 YFP는 아르곤 레이져와 560nm의 긴-통과 밴드 필터로 수거된 형광을 이용하여 자극되었. 강도가 FRET 효율의 추정치를 반영한 영상을 만들기 위하여, CFP 초기 영상 값은 픽셀-픽셀 기반에서 광 퇴색 이후 획득된 최종 CFP 영상 값으로부터 공제되었고, 그리고 이 차이에 100을 곱하고, 최종 CFP 영상 강도로 나누었다. 100 X (CFPfinal - CFPinitial)/CFPfinal. 부분적인 수용체 광퇴색을 위하여 적절한 조정이 있었다. NIH ImageJ 1.44 소프트웨어를 이용하여 영상 산술적 그리고 그레이-스켈레토-색 영상 전환(Image arithmetic and grayscaleto- color image conversion)이 실행되었다
FRET 분석: 형광-플레이트 판독기(Fluorescence Plate Reader)
스펙트럼 FRET 측정(FRET/공여자)은 이미 설명된 방법에 따라 TecanM1000 형광 플레이트 판독기를 이용하여 얻었다. 공여자와 수용체가 동일 단백질에 융합되지 않을 때, 스펙트럼 FRET 측정은 세포 안에서 발현되는 상대적 양의 공여자와 수용체 단백질의 상대적 양에 대한 신중한 조절에 따라 달라진다. 플레이트 판독기 상의 모든 값은 허위-형질감염된 세포들에 대하여 공제된 제1 배경이다. 각 웰에서 YFP 신호 (Smpl485ex/528em FRET )를 이용하여 RD-YFP 발현 수준을 예측하고, 그리고 RD-CFP/YFP가 독립적으로 변화되지 않은 실험 조건하에서 유사하게 추정되었다. 이것은 겉보기 FRET의 변화가 단순히 RD 발현 수준에서 변화로 인한 가능성을 제거하는데 도움이 된다. 전반적인 FRET 측정에 대해 공여자 여기(excitation) 신호 (435nm)에 의한 수용체 활성화(528nm)의 상대적 분포는 수용체에 대한 ＂교차 활성화(crossover activation)＂ 분획, X 결정에 의해 수정되었고, 이때 X=435ex/528em에서 측정된 RD-YFP 신호를 485ex/528em에서 측정된 신호로 나눈 값. 여기에서 ＂교차 활성화＂는 실험에서 접하는 RD-YFP의 상이한 발현 수준에 대해 기본적으로 일정하다. 각 시료에서 ＂측정된＂ FRET 값은 435ex/528em에서 기록되며, ＂공여자＂ 값 (CFP)은 435ex/485em에서 기록되었다. 각 웰에서 ＂실질적인＂ FRET/공여자 값은 다음과 같이 반영된다:
FRETactual = (Smpl435ex/528em -X*(Smpl435ex/528em))/Smpl435ex/528em
FRET에 의한 단백질 응집을 측정하는 방법은 안드로겐 수용체와 헌팅턴 단백질 응집의 약리학적 뿐만 아니라 유전적 조작에서 미묘한 변화의 탐지를 확실하게 허용하였으며, 이는 시각적 그리고 생화학적 분석에 의해 확증되었다. 측정된 FRET의 상대적 양은 수용체:공여자 비율에 따라 달라지기 때문에, 동일한 세포 안에서 RD-CFP와 RD-YFP가 공동-발현될 때 3:1의 정수비가 이용되었다. 이것은 최대 FRET 효율에 가깝고, 공여자 신호 측정에서 수용가능한 신호:잡음을 허용한다.
원자력 현미경(AFM)
RIPA-불용성 단백질은 형질감염된 HEK293 세포들로부터 추출되어, 10분간 미카 칩(mica chips)(Ted Pella, Inc) 상에서 항온처리되었다. 그 다음 시료는 100μl ddH2O로 2회 세척되었고, 실온에서 건조되도록 두었다. 다음 날, MFP-3D 원자력 현미경(Asylum Research)을 이용하여 원자력 현미경 검사가 실행되었다.
면역형광 및 공촛점 현미경검사
앞서 설명된 것과 같이 공동-배양 실험을 위하여 형질감염된 HEK293 세포들은 면역형광 및 X-34 착색을 위하여 준비되었다. 실온에서 15분간 4% 파라포름알데히드에 고정 후, 세포는 5분간 실온에서 PBS에서 2회 세척되었고, 실온에서 10분 동안 0.25% Triton X-100에서 투과가능하도록 만들었다. 세포는 실온에서 3시간 동안 PBS내 1% 정상적인 염소 혈청, 20 mg/ml BSA, 0.25% Triton X-100이 포함된 차단 용액으로 차단되었다. HA에 대한 일차 마우스 단클론 항체(Covance, Emeryville, CA)는 차단 용액에서 1:20000으로 희석되었고, 4℃에서 하룻밤 동안 세포에게 제공되었다. 그 다음 0.1% Triton X-100이 함유된 PBS로 3회 각 5분 동안 세척되었고, 차단 용액에서 1:400으로 희석된 항-마우스 Alexa546-접합된 이차 항체 (Invitrogen)와 함께 항온처리되었다. 그 다음 세포들은 0.1% Triton X-100이 포함된 PBS로 3차례 각 5분간 세척되었고, 그리고 40% 에탄올, 60% PBS, 및 20 mM NaOH의 용액에서 준비된 1 μM X-34에 10분간 실온에서 노출되었다. 그 다음 세포는 40% EtOH, 60% PBS에서 각 2분씩 3회 세척되었고, 1X PBS에서 각 5분씩 2회 헹궜다. 영상은 공촛점 현미경검사 (405 Confocal Microscope- Zeiss)를 이용하여 얻었다. 전파의 HJ9.3 항체 차단 기전을 특징화시키기 위하여, HEK293 세포들은 RD(ΔK)-YFP로 형질감염되거나 또는 허위 형질감염되었다. HJ9.3 존재 하에 48시간 동안 RD(ΔK)-YFP 세포들 또는 허위-형질감염된 세포들을 배양한 후, 세포들은 4% PFA로 고정되었고, 0.25% TritonX-100을 이용하여 투과가능하도록 만들었고, 그 다음 염소 항-마우스 Alexa 546 라벨된 이차 항체에 노출되었다. 영상은 공촛점 현미경검사 (Confocal Microscope- Zeiss)를 이용하여 얻었다.
프로피디움 요오드화물 (PI) 세포 사멸 분석
HEK293 세포들은 96-웰 플레이트에서 웰당 75,000개 세포로 도말되었다. 다음 날, 세포들은 100 ng의 다양한 형태의 비-형광 RD-HA 플라스미드로 사중 형질감염되거나 또는 DNA 없이 형질감염 복합체에 노출되었다. 다음 날, 형질감염 복합체가 포함된 배지는 제거되었고, 새로운 배지로 대체되었다. 비-형질감염된 세포들은 세포 사멸에 대한 양성 대조군으로써 다양한 농도의 스타우로스포린 (1, 2, 4, 20 μM)으로 30 분간 37℃에서 처리되었다. 스타우로스포린 용액은 그 다음 제거되었고, 모든 세포들은 5 μg/ml의 프로피디움 요오드화물에 10 분간 37℃에서 노출되었다. 그 다음 프로피디움 요오드화물 용액은 페놀-없는 배지로 교체되었고, 535nm 여기(excitation) 및 617 nm 방사(emission)에서 플레이트 판독기 상에서 형광이 판독되었다.
면역침전(Immunoprecipitation)
형질감염된 세포 집단은 3h, 6h, 9h, 12h, 24h 또는 48 h 동안 단독으로 또는 마우스 단클론 항체 HJ9.3 (1:1000는 2.5 ng/μl의 항체에 상응) 또는 복합(pooled) 마우스 IgG 항체 존재하에 공동-배양되었다. 조건화된 배지가 수거되었고, 단백질-G-아가로즈 비드 (100 μl의 50% 슬러리 비드-Pierce)가 배지에 추가되었고, 회전하면서 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리되었다. 18 h 후, 500 μl의 결합 완충액 (Pierce)이 치료에 추가되었고, 3분 동안 2000 x g에서 원심분리되었다. 상청액은 버리고, 세척 단계는 3회 반복되었다. 비드에 결합된 단백질은 그 다음 실온에서 5분간 항온처리와 함께 고염 용리액 완충액 (50μl)을 이용하여 용리되었다. 그 다음 시료는 2000 x g에서 3분간 원심분리되었고, 상청액은 수거되었다. 이 용리 단계는 총 100μl의 용출물에 대해 한 번 반복되었다. 초기에 HJ9.3 또는 IgG에 노출되지 않은 조건화된 배지의 또다른 시료는 HJ9.3 (1:1000) 또는 IgG 항체와 함께 회전시키면서 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리되었고, 이어서 상기에서 설명된 것과 같이 동일한 면역침전되었다. 모든 조건으로부터 시료는 4-20% 폴리아크릴아미드 겔 (BioRad) 상에서 분석되었고, 그리고 TBS/Tween 에서 5% 분유에서 1:2000 희석액으로 tau RD에 대한 토끼 다중클론 항체로(ab64193, Abcam, Cambridge, MA) 탐지되었다. 화학발광-기반 퍼옥시다제접합된 이차 항체 반응이 실행되었으며, X-레이 필름에 의해 탐지되었다.
흐름세포측정(Flow Cytometry)
HEK293 세포들은 10-cm 플레이트에서 ~80% 합류되도록 도말되었다. 그 다음 세포들은 24 μg의 RD(LM)-YFP 구조체로 형질감염되거나 또는 mCherry 렌티바이러스로 형질도입되었다. 다음 날, 세포들은 37℃에서 3분 동안 0.05% 트립신으로 회수되었고, 새로운 배지에 재현탁되었다. 두 세포 집단은 48시간 동안 단독 또는 Tau-RD에 대한 마우스 단클론 항체 HJ9.3 1:1000 또는 1:10,000 희석액 (1:1000은 2.5 ng/μl의 항체에 상응함) 존재하에 공동-배양되었다. 이 시점 이후, 세포들은 수거되었고, 1% FBS 및 1mM의 EDTA가 포함된 Hanks 균형 배지에 재현탁되었다. 세포측정 직전의 사전혼합된 세포는 음성 대조군으로 이용되었다. 세포들은 MoFlo 고속 세포 분류기 (Beckman Coulter)를 이용하여 카운트되었고, 그리고 이중 양성 세포들의 비율은 각 조건에서 분석되었다. 각 조건은 3가지 생물학적 복제(replicates)이며, 각 실험 조건에서 50,000개 세포들이 분석되었다.
항-tau 단클론 항체의 뇌실(ICV) 주사
이 연구에서는 P301S 인간 T34 아이소폼 (1N4R)을 발현시키는 P301S tau 유전자변이 마우스가 이용되었다. 이들 마우스는 6월령에서 tau 병리가 발생되었다. 따라서, 항체는 6월령시점에서 뇌실 주사에 의해 좌측 측면 뇌실로 주입되었고, 이러한 주입은 12주간 실행되었다. 처리 후, 마우스 뇌는 ELISA 및 면역블랏팅에 의한 면역조직화학 및 생화학 분석을 위하여 처리되었다.
뇌실 주사는 Alzet 삼투 펌프, 2006 모델을 이용하여 실행되었다. Alzet 펌프 어셈블리에 부착된 뇌 캐뉼라는 정수리에서 전후 0.4 mm, 중앙에서 측면으로 1.0 mm 그리고 배복에서 2.5 mm의 위치에 각 마우스의 좌측 측면 뇌실에 외과적으로 이식되었다. 치료 후, 캐뉼라의 위치는 크레실 바이올렛 착색으로 확인되었다.
실시예 9-15에 대한 개요
Tau는 집합적으로 타우병증(tauopathies)이라고 불리는 몇 가지 신경퇴행성 질환에서 세포내 응집을 형성하는 미세관-연합된 단백질이다. 타우병증은 알츠하이머 질환 (AD), 진행성 핵상 마비 (PSP), 피질기저퇴화 (CBD), 그리고 전두측두엽 치매 (FTD)가 포함된다. Tau는 미세관에 결합하여 미세관의 어셈블리를 촉진시키는 매우 가용성이 큰 그리고 자연적으로 폴드되지 않은 단백질이다. 타우병증(tauopathies)에서 tau는 변성된 축삭 및 수상 돌기 및 세포체(bodies) 안에서 적절한 착색으로 볼 수 있는 과인산화된 신경원섬유 매듭 (NFTs) 안에 축적된다. tau 병리는 인간 및 유전자변이 마우스 모델에서 진행성 신경 기능이상과 시냅스 상실, 그리고 기능 감퇴와 관련된다.
인간 타우병증(tauopathies)에서 병리는 비록 숨은 기전은 아직 밝혀지지 않았지만, 뇌의 한 영역에서 또다른 영역으로 질환-특이적 패턴이 진행된다. 프라이온 가설은 tau 응집이 원래 세포로부터 탈출하여 인접 세포들에 진입되고, 이때 이들 응집은 더 많은 tau 응집을 심고, 병리를 전파시킨다고 생각한다. 재조합 tau 원섬유가 배양된 세포들에서 전장의 세포내 tau 응집을 유도하고, 세포간에 tau 이동 형태를 응집시켰다는 것이 발명자들에 의해 이미 관찰되었다(Frost et al., 2009; Nat Rev Neurosci 11, 155-159). 더욱이, 세포내 tau 원섬유는 배지로부터 자유롭게 방출되며, 배지에서 수령 세포내 고유 tau와 직접 상호작용에 의해 응집을 전파한다는 것을 발명자들에 의해 발견되었다. 항-tau 항체 (HJ9.3)는 tau 응집이 수령 세포들 안으로 취입되는 것을 방해함으로써 이 공정을 차단시킨다 (Kfoury et al., 2012; J Biol Chem 287, 19440-19451). 재조합 tau를 이용한 유사한 실험에 추가하여, AD 뇌로부터 쌍을 이룬 나선 필라멘트가 세포질 tau 응집을 유도한다는 것을 보여주었다. 인간 P301S tau 유전자변이 마우스에서 얻은 뇌 추출물을 야생형 인간 tau를 발현시키는 마우스의 뇌 안에 주사하면 야생형 인간 tau가 필라멘트로 어셈블리되는 것을 유도하고, 병리의 확산이 유도된다. 재조합 전장 또는 절두된 tau 원섬유의 주사 후에 유사한 효과가 발생되었고, 시간-의존적 방식으로 주사 부위로부터 연결된 뇌 영역으로 전파된 NFT-유사 봉입체의 신속한 유도를 야기하였다. 최종적으로, 뇌후각 뇌피질에서 선택적 tau 발현은 톱니모양의 뇌회 및 해마 안의 세포들에서 축삭 말단 영역에서 후기 병리를 야기시켰고, 이는 응집의 스냅스 이동과 일치된다. 증가된 작업량은 세포들 간에 tau 응집 이전을 뒷받침하고, 그리고 치료 항체로 표적화될 수 있다는 것을 뒷받침한다.
AD 및 파킨슨 질환 (PD) 양태을 모방하는 마우스 모델에서, Aβ 및 알파 시누클레인에 대한 항체를 이용한 수동 면역주사는 뇌에서 Aβ 및 알파-시누클레인 침착을 감소시킬 수 있고, 행동 결함을 개선시킬 수 있다. tau 포스포 펩티드를 이용하여 타우병증 마우스 모델에서 활성 면역주사는 tau 병리를 감소시키고, 일부 연구에서 거동 결함이 개선되었다. 그러나, 한 연구에서 전장 재조합 tau를 가진 C57BL/6 야생형 마우스의 활성 면역주사는 tau 병리 및 신경학적 결함를 유도하였다. 두 가지 수동 백신주사 연구에서, 병리 개시전에 항체가 제공될 때 tau 병리가 감소되었고, 운동 기능이 개선되었다. 몇 가지 tau 면역주사 연구에서 일부 유익한 효과가 나타났지만, 병리 개시 이후 투여된 항-tau 항체의 최대 기대 효과, 표적에 대한 최적의 tau 종, 그리고 치료 효과의 기전은 여전히 밝혀지지 않고 남아있다.
실시예 9. 항-tau 항체의 특징
단량체가 아닌 tau 응집은 배양된 세포들에 의해 취입되며, 내화된 tau 응집은 수령 세포내에서 세포내 tau 응집을 촉발시킨다는 것이 발명자들에 의해 이미 관찰되었다 (Frost et al., 2009; Nat Rev Neurosci 11, 155-159; Kfoury et al., 2012; J Biol Chem 287, 19440-19451). 8가지 마우스 단클론 항체 HJ8 시리즈 (전장 인간 tau에 대하여 생성된)와 5가지 항체 HJ9 시리즈 (전장 마우스 tau에 대하여 생성된)는 tau 응집이 포함된 뇌 용해질 추가에 의해 유도된 세포의 tau 응집을 측정하는 Kfoury et al. (2012; J Biol Chem 287, 19440-19451)에서 이미 설명된 개조된 세포 바이오센스 시스템에서 특징화되었다. 상기 항체는 tau 단량체에 효과적으로 결합하고, 신경원섬유 매듭을 착색시키는 사실에도 불구하고 씨딩 차단에 다양한 효과를 보유하였다. 본 명세서에서 제시된 연구를 위하여 씨딩을 차단시키는데 있어서 상이한 능력을 가진 3가지 항체가 선택되었다.
생체내에서 테스트하기에 앞서, 모두 IgG2b 동형인 항체의 결합 친화력 및 에피토프가 결정되었다. 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 위하여 인간 및 마우스 tau는 센서 칩 CM5 상에 고정되었다 (도 30). 마우스 tau에 대하여 생성된 HJ9.3 항체는 동일한 결합 상수(KD = Kd/Ka = 100 pM) (도 30G)에 의해 인간 (도 30A) 및 마우스 (도 30B) tau를 모두 인지한다. 연합 (Ka) 및 해리 (Kd)는 1:1 (Langmuir) 상호작용 모델과 함께 Fit 역학 동시 Ka/Kd (Global fitting)를 선택하는 BIAevaluation 소프트웨어 (Biacore AB)를 이용하여 산출되었다. HJ9.3의 인간 (Ka = 7.5 x 104 Ms-1, Kd = 7.5 x 10-6 s-1) 및 마우스 tau (Ka = 8.6 x 104 Ms-1, Kd = 9.1 x 10-6 s-1)에 대한 Ka 및 Kd는 이둘 모두에 강력한 결합을 나타낸다. HJ9.3의 에피토프는 아미노산 306-320 사이의 반복 도메인 (RD) 영역에 지도가 그려졌다 마우스 tau에 대한 HJ9.4는 마우스 tau 에 대하여 높은 친화력 KD (2.2 pM)를 보유하였는데, 높은 연합 상수 (Ka = 2.28 x 105 Ms-1)와 매우 낮은 해리 상수 (Kd = 5.1 x 10-7 s-1) (도 30D 및 표 4)를 보유하였다. 그러나, 동일한 항체는 인간 tau에 대하여 훨씬 낮은 친화력 (KD = 6.9 nM)을 가졌고 (도 30C 및 표 4), 마우스 tau와 유사한 연합 상수 (Ka = 1.5 x 105 Ms-1)를 가지지만, 훨씬 더 빠른 해리 상수 (Kd = 1.07 x 10-3 s-1)를 가졌다. 따라서, 인간 tau와 HJ9.4의 상호작용은 마우스보다는 덜 안정적이다. 이 항체에 대한 에피토프는 아미노산 7-13이다. HJ8.5는 인간 tau에 대하여 생성되었다. 이 항체는 인간 tau에 결합하지만 (도 30E) 마우스 tau에 결합되지 않는다 (도 30F). KD (0.3 pM) (도 30E and 표 4)와 낮은 해리상수 (Kd = 4.38 x 10-8 s-1)는 HJ8.5가 매우 높은 친화력으로 인간 tau에 결합함을 나타낸다. HJ8.5의 에피토프는 아미노산 25-30로 그려졌다 3가지 항-tau 항체는 모두 SPR 상에서 인간 tau 원섬유에 강력하게 결합한다 (도 31). 원섬유는 다수의 동일한 에피토프들을 가지고 있기 때문에, 해리 및 결합 상수는 바로 산출될 수 없다.
Figure pat00011
이들 항체는 또한 면역블랏팅 및 면역착색에 의해 평가되었다. 웨스턴 블랏에서, 3개 항체 모두 인간 tau에 결합하였다 (도 30H). HJ9.3 및 HJ9.4는 마우스 tau에 결합하지만, HJ8.5는 결합하지 않는다 (도 30H). 발명자들의 이전 발견과 일관되게 (Yamada et al., 2011; J Neurosci 31, 13110-13117), 3 월령의 P301S 마우스와 비교하였을 때 9월령에서 덜 어셈블리된 완충액 (RAB) 가용성 tau가 나타났다. HJ8.5는 3 월령 및 9-12 월령 유전자변이 P301S 마우스 뇌에서 인간 tau를 착색시켰다는 것이 또한 발견되었다. Tau 면역반응성은 세포체 및 과정을 통하여 제시되었다(도 32). tau 응집을 가진 9-12 월령 P301S 마우스에서, HJ8.5는 세포체 안에서 tau 응집을 탐지하였다(도 32A). 다른 항체들도 유사한 결과를 나타났다 (표 5). 모든 항체는 AD 뇌에서 신경원섬유 매듭 및 신경망 실에 결합되었다 (도 32).
Figure pat00012
실시예 10. Tau-항체는 P301S tau 응집의 취입 및 씨딩 활성을 차단한다
P301S 뇌 용해질에 존재하는 씨딩을 평가하기 위하여, 발명자들(Kfoury et al., 2012)에 의해 이미 설명된 세포 바이오센서 시스템이 개작되었다. 이는 시안 또는 황색 형광 단백질 (RD(ΔK)-CFP /YFP)에 융합된 ΔK280 돌연변이가 포함된 tau의 반복 도메인 (aa 243-375)의 발견에 기초된다. 외생성 응집이 이들 세포에 취입되면, RD(ΔK)-CFP/YFP의 세포내 응집이 촉발되고, 이는 형광 플레이트 판독기 상에 기록되는 형광 공명 에너지 전달 (FRET)에 의해 탐지된다. 바이오센서 세포 시스템에 추가된 12 월령 P301S 마우스의 확실한 뇌 용해질은 RD(ΔK)-CFP/YFP 리포터의 강력한 응집을 유도하였고, 이는 tau 씨딩 활성의 존재를 나타낸다 (도 33A). 12-mo P301S 뇌 균질액 마우스의 씨딩 활성은 50 nM (단량체 당량)의 재조합 전장 원섬유에 대채로 상응한다 (데이터 나타내지 않음).
tau 녹아웃 마우스, 야생형 마우스, 또는 tau 병리가 없는 3 월령 P301S 마우스의 용해질에 의한 응집 유도는 거의 없었다 (도 33A). 이들 용해질의 취입 및 씨딩 활성을 차단시키는 능력에 대하여 항-tau 항체 (HJ8.5, HJ9.3 및 HJ9.4)가 평가되었다. HJ3.4 (마우스 단클론 항-Aβ 항체)는 음성 대조군이었다. 항-tau 항체는 효과적으로 씨딩 활성을 차단하였다 (도 33B). 이들의 상대적 효과를 결정하기 위하여, 항체 (0.125, 0.25, 0.5, 1, 2 μg/ml)는 고정량의 P301S 뇌 용해질에 대하여 적정되었다 (도 33C). HJ8.5 항체는 대조군과 비교하였을 때 0.25 μg/ml의 낮은 농도에서 씨딩 활성을 차단시켰다. 0.5 μg/ml에서, HJ8.5 및 HJ9.3 항체는 모두 대조군과 비교하였을 때 취입 및 씨딩 활성을 상당히 차단시켰다. HJ9.4는 취입 및 씨딩 활성의 차단에 있어서 가장 효과가 적었고, 마우스 tau에 대한 이의 더 높은 친화력과 일치된다. 3가지 항-tau 항체는 모두 post-hoc 세포의 침투화 및 착색에 의해 탐지된 것과 같이, HEK293 세포들에 의해 취입된 후 내화된 tau 응집을 탐지하였다. 그러나, 이들 항체가 P301S 뇌 용해질과 함께 또는 용해질 없이 사전-항온처리되었을 때, 이들 항체중 어느 것도 항-마우스 이차 항체와 착색시 세포 내부에서 탐지되지 않았다 (도 34). 다른 방식의 저해가 가능하지만, 이들 데이터는 tau 응집의 세포 취입 차단에 근거한 기전과 일치된다.
실시예 11. 항-tau 항체의 뇌실내 주입
상기 마우스 콜로니에서, P301S 마우스는 5월령때부터 시작된 세포내 tau 병리가 처음 발생되었다. 만성 뇌실계내부 (ICV) 투여에 의한 3가지 항체의 효과를 테스트하기 위하여, 카테테르는 6월령때 각 마우스의 좌측 측면 뇌실에 외과적으로 이식되었으며, Alzet 피하내 삼투압 미니-펌프를 통하여 3개월 동안 항-tau 항체가 지속적으로 주입되었다 (도 35A). 항-Aβ 항체 HJ3.4 및 인산염 완충된 염수 (PBS)는 음성 대조군으로 이용되었다. 6주 후, 각 펌프는 새로운 항체 용액 또는 PBS가 채워진 것으로 대체되었다. 뇌 절개시, 각 마우스의 좌측 측면 뇌실에 카테테르 배치는 크레실 바이올렛 착색에 의해 확인되었다 (도 35B). 정확하게 위치한 카테테르를 가진 마우스들만 분석에 포함되었다. 6주 후 생체내에서 항체의 안정성을 테스트하기 위하여 (도 35A), 동물로부터 제거될 때 잔류 펌프 내용물이 수거되었고, SDS-PAGE 및 Coomassie 블루 착색을 이용하여 항체들이 평가되었다. 경쇄 및 중쇄는 단편화 없이 온전하였고, 웨스턴 블랏에서 tau 결합 활성을 보유하였다 (데이터 나타내지 않음). 주입 동안 CSF 및 혈청에서 항-tau 항체의 농도를 예측하기 위하여, 바이오티닐화된 HJ8.5 (HJ8.5B)는 48시간 동안 투여되었다 (일일 ~7.2 μg) (도 35A). 유리 HJ8.5B의 농도는 CSF에서 7.3 μg/ml이었고, 혈청에서 6.2 μg/ml이었는데, 이는 CNS로부터 말초로 상당한 항체가 제거되었음을 나타낸다 (표 6). 인간 tau에 결합된 HJ8.5B는 비록 유리 항체보다는 농도가 낮았지만 CSF와 혈청 모두에서 또한 탐지되었다 (표 6).
Figure pat00013
실시예 12. 항-tau 항체 치료는 비정상적으로 포스포릴화된 tau를 감소시킨다.
치료 3개월 후 P301S 마우스에서 tau 병리 정도를 결정하기 위하여, tau 병리에 대한 다중 착색이 실행되었다. 뇌 단편은 항-포스포 tau 항체 AT8과 함께 면역착색에 의해 우선 평가되었다 (도 36). AT8은 마우스와 인간 tau의 포스포릴화된 잔기 Ser202와 Thr205에 결합한다 (도 36). PBS 및 HJ3.4로 처리된 마우스에서, AT8은 다수의 뇌 영역 특히, 조롱박 피질, 뇌후각 뇌피질, 편도핵, 및 해마에서 뉴론 세포체 및 신경망을 강력하게 착색시켰다 (도 36A 및 36B). HJ8.5 처리는 특히 신경망에서 AT8 착색을 강력하게 감소시켰다 (도 36C). HJ9.3 및 HJ9.4는 또한 AT8 착색을 감소시켰지만, 그 효과는 다소 덜하였다 (도 36D 및 36E). 조롱박 피질 (도 37A), 뇌후각 뇌피질 (도 37B), 및 편도핵 (도 37C)에서 AT8 착색의 정량적 분석에서 모든 항-tau 항체 처리된 마우스에서 포스포-tau가 상당히 다양하게 감소됨이 설명되었다. HJ8.5 항체는 조롱박 피질, 뇌후각 뇌피질, 및 편도핵에서 AT8 착색을 상당히 감소시켰다. HJ9.3은 HJ8.5와 비교하였을 때 약간 감소된 효과를 가졌고, HJ9.4는 뇌후각 뇌피질과 편도핵 모두에서 상당한 효과를 가졌지만 조롱박 피질에서는 효과가 없었다 (도 37). 해마는 다른 뇌영역 주로 세포체와 비교하였을 때 더욱 더 가변적인 AT8 착색을 나타내었고, 따라서 대조군 집단과 비교하여 처리 군에서 통계학적으로 상이하지 않았다 (도 37D). 수컷 P301S 마우스는 암컷보다 더 많은 tau 병리를 가지는 것으로 보고되었기 때문에, 성별 및 처리 효과 모두 평가되었다 (도 38). 치료 효과에 추가적으로 수컷 마우스에서 분석된 모든 뇌 영역에서 상당히 더 많은 AT8 착색이 있었다 (표 7). 그러나, 항체의 효과는 성별 조정 후 여전히 상당히 유의적이며 실질적으로 동일하였다 (표 8). 수컷과 암컷에서 대조군과 처리군은 별도로 또한 비교되었으며, 항체 HJ8.5의 효과가 가장 유의적이었다 (도 38A 및 38B).
Figure pat00014
Figure pat00015
실시예 13. 다중 착색 양식의 상관관계
tau 아밀로이드 침착에 대하여 테스트하기 위하여, 뇌 단면을 착색시키는데 티오플라빈 S (ThioS)가 이용되었다 (도 39). ThioS 착색은 대조군 및 항-tau 항체 처리된 마우스 모두에서 정보를 제공받지 않은(blinded) 평가자에 의해 1(착색 없음)부터 5(최대 착색)까지 점수를 부여함으로써 반-정량적으로 평가되었다. 반-정량적 평가에 의해 HJ8.5 치료는 PBS 및 HJ3.4과 비교하였을 때 ThioS 착색을 상당히 감소시켰다 (도 39A 및 39B). PBS, HJ8.5, 및 HJ9.3 (각 집단에서 n=6)으로 처리된 마우스는 tau 포스포-잔기 Ser396 및 Ser404를 인지하는 PHF1 단클론 항체로 또한 착색되었다. AT8 및 PHF1 착색은 상이한 tau 에피토프에 대한 2가지 항-포스포 tau 항체가 유사한 결과를 제공한다는 것을 보여주어 상당한 상관관계가 있었다 (r = 0.630, p = 0.005) (도 40A).
타우병증(tauopathies)이 포함된 많은 신경퇴행성 질환은 단백질 응집 및 세포 손상 주변 뇌 영역에서 미세아교세포 활성화를 보여준다. 미세아교세포 활성화는 항-CD68 항체를 이용하여 처리 집단에서 평가되었다 (도 41). HJ8.5 및 HJ9.3 치료는 대조군과 비교하였을 때 조롱박 피질, 뇌후각 뇌피질, 및 편도핵에서 미세아교세포 활성을 감소시켰다 (도 41A-41D). HJ9.4는 HJ8.5 및 HJ9.3과 비교하여 조롱박 피질에서 더 약한 효과를 가지고 (도 41C-41E), AT8 착색 결과와 일치한다 (도 37A). 미세아교세포 활성은 모든 시료에서 AT8 착색과 상당한 상관관계가 있다 (r = 0.511, p = 0.0038) (도 40B).
실시예 14. 항-tau 항체는 세제-불용성 tau 및 씨딩 활성을 감소시킨다.
피질에서 가용성 및 불용성 tau 수준을 결정하기 위하여, RAB (수성 완충액)를 이용한 생화학적 추출, 방사능 면역침전 분석 (RIPA)(세제 완충액), 및 70% 포름산 (FA)을 이용한 연속 추출을 실행하여 최종 펠렛을 가용화시켰다. 전체 tau는 동일한 KD (0.34 pM)값으로 인간 및 마우스 tau를 모두 탐지하는 항-tau 항체 HJ8.7를 이용한 ELISA에 의해 정량화되었다. 분석 전에 양성 대조군에 이들 항체를 고정시킴으로써 이들 치료 항체가 ELISA를 간섭할 가능성은 배제되었으며, 간섭이 관찰되지 않았다 (데이터 나타내지 않음). 도 37에는 병적 분석에 의해 평가된 모든 마우스가 분석되었다. RAB (도 42A) 또는 RIPA (도 42B) 가용성 분획물에서 전체 tau 수준은 모든 집단간에 유사하였다. 세제-불용성/70% FA 가용성 분획물은 ELISA 및 웨스턴 블랏에 앞서 시료를 중화시켜 분석되었다. 연구된 모든 동물이 분석되었고, HJ8.5 및 HJ9.3은 대조군과 비교하여 >50% 세제-불용성 tau를 감소시켰다 (도 42C). 웨스턴 블랏에 의해 설명되는 대표 시료 (각 집단에서 n=4)는 HJ8.5 및 HJ9.3 처리된 마우스에서 불용성 tau 수준을 감소시켰다(도 40C). PBS 또는 HJ3.4와 비교하여 HJ9.4-처리된 집단에서 불용성 tau 수준은 차이가 없었다. 인간 및 마우스 tau는 한 집단(N=6)에서 세제-불용성/70% FA 가용성 분획물에서 구체적으로 평가되었는데, 이때 평균 AT8 착색은 도 37의 결과의 평균 값으로 나타낸다. 70% FA 가용성 분획에서 마우스 tau보다 인간 tau가 상당히 더 많았고, 이 분획에서 항체는 인간 tau를 상당히 낮추었지만, 마우스 tau는 낮추지 못하였다 (도 42D 및 42E). 이들 동일 시료에서 AT8 면역반응성 신호 수준은 ELISA에 의해 평가되었다. 항체 처리된 시료에서 AT8 신호는 더 낮았고 (도 42F), 이는 이 분획에서 전체 tau 에 대하여 확인된 것과 유사하다.
뇌에서 tau 응집의 감소는 씨딩 활성의 감소와 관련될 것이라고 가정하였다. 따라서, 세포의 바이오센서 분석을 이용하여 상이한 치료 집단에서 얻은 피질 RAB 가용성 분획물 안에서 P301S의 씨딩 활성이 테스트되었다. P301S 마우스에서 ISF를 평가하는 발명자들의 이전 데이터는 세포외 tau 응집이 생화학적으로 가용성인 tau와 불용성인 tau 모듬과 대등하게 존재할 가능성을 제시하였다(Yamada et al., 2011; J Neurosci 31, 13110-13117). 우선, RD(ΔK)-CFP/YFP의 세포내 응집은 PBS 또는 HJ3.4로 처리된 마우스의 용해질로 이 세포를 처리한 후 평가되었다. 이들 집단의 용해질은 FRET 신호를 강력하게 유도하였다 (도 43A). HJ8.5 및 HJ9.3으로 처리된 마우스의 피질 조직의 용해질에서 상당히 적은 씨딩 활성이 관찰되었다 (도 43A). 항체/비드 복합체로부터 씨딩 활성의 용리는 동일한 패턴을 만들었기 때문에 이것은 뇌 용해질에서 잔류 항체로 인한 것이 아니다 (도 43B). 따라서 HJ8.5 및 HJ9.3은 P301S tau 유전자변이 마우스 뇌에서 씨딩 활성을 감소시킨다. HJ9.4는 씨딩 활성을 상당히 감소시키지 않았다 (도 43A). 씨딩 활성은 ELISA(Pearson＇s r = 0.529, p = 0.0001)에 의해 탐지된 세제-불용성/포름산-가용성 tau의 양과 상당히 관련있었지만 (도 43C), 그러나 RAB 분획물에서 전체 tau와는 관련없었다 (도 43D). 씨딩 활성은 RAB 가용성 분획에 존재하는 tau 응집으로 인한 것이라고 가정하였다. 이를 점검하기 위하여, 반-변성 세제-아가로즈 겔 전기영동(Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis) (SDD-AGE)이 실행되었고, 웨스턴 블랏이 이어서 실행되었다. tau 단량체에 추가하여, 3 월령 P301S 마우스에는 더 높은 분자량의 tau 종이 존재하며, 9 월령 P301S 마우스에 더 많은 양이 존재하는 것으로 관찰되었다 (도 43E). 더 높은 분자량 종의 성분은 FRET 분석에서 탐지되는 씨딩 활성을 구성할 것 같으며, 그리고 세제-불용성/포름산-가용성 분획에 존재하는 tau와 대등할 수 있다.
실시예 15. 항-tau 항체는 환경적 공포(contextual fear) 장애를 구출한다.
9월령의 P301S Tau 유전자변이 마우스 연구에서, 대조군과 항-tau 항체 처리된 집단은 다양한 거동에 대하여 비교되었다. 상기 집단은 보행 활성, 탐색(exploration), 또는 감각운동 기능의 측정에서 차이가 없었다 (도 44). P301S 마우스에서 인지 장애를 구제하는 항-tau 항체 치료 능력은 조건화된 공포 과정에서 상기 마우스의 행위를 평가함으로써 평가되었다. 1일차 시점에서 4마리 치료 집단 마우스 모두다 훈련실에서 처음 2분간 기본적으로 유사한 부동(freezing) 수준을 나타내었다. 이는 rmANOVA에 의해 확인되었으며, 치료와 관련된 전반적인 주요 효과 또는 상호작용을 밝히지 못하였다 (도 45A). 또한, 4마리 집단 모두다 소리 충격(T/S) 조건화된 자극-조건화안된 자극 (CS-US) 페어링 동안 유사한 부동 수준을 나타내었다 (도 45A). 3가지 T/S 페어링에 걸쳐 집단간에 부동 수준의 전반적인 차이가 없는 것은 치료의 비-유의적인 효과와 Minutes 상호작용에 의한 비-유의적인 유전자유형으로 기록되었다.
1일차에 테스트되는 동안 집단간에 차이가 없는 것과는 대조적으로, 2일차에 2개의 항-tau 항체 집단과 PBS+HJ3.4 대조군 마우스 사이에서 실행된 환경적 공포 테스트에서 부종 수준에 뚜렷한 차이가 있었다 (도 45B). 후속적으로 계획된 비교에서 HJ8.5 마우스는 8-분 테스트 과정에서 HJ9.4 마우스에서 다소 적은 수준을 나타낸 것과 같이 [F(1,45)=5.60, p=0.022] PBS+HJ3.4 대조군 집단과 비교하였을 때 평균화된 상당히 상승된 부동 수준을 나타내었다(도 45C) [F(1,45)=8.30, p=0.006]. 따라서, HJ8.5는 연상 학습 보존에서 전반적으로 더 강력한 효과를 가지는 것으로 보인다.
실시예 9-15에 대한 논의
타우병증(tauopathies)의 발병기전에 대한 한 가지 모델은 한 세포에서 생성된 응집이 이탈되거나 세포외 공간으로 방출되어 이웃 또는 연결된 세포에서 응집을 촉진시킨다는 것이다. 뇌 용해질의 tau 씨딩 활성을 특이적으로 차단하는 치료 항체의 선택은 능동 또는 수동 tau 백신화의 기존 보고보다는 더 강력하지 않다면 최소한 이 만큼 강력한 생체대 반응이 예측된다고 관찰되었다. 실험은 세포외 tau 응집의 존재에 민감한 세포의 바이오센서 분석으로 시작되었다. P301S 유전자변이 마우스의 뇌 용해질은 추가 세포내 응집을 유도할 수 있는 씨딩 활성을 보유하였다고 밝혀졌다. 항-tau 항체의 패널을 스크리닝한 후, tau 씨딩 활성의 차단에 있어서 가변 활성으로 선택되었다. 이들 항체는 P301S 타우병증 마우스에게 병리가 개시된 시점(6월)에 시작하여 3개월에 걸쳐 ICV로 주입되었다. 항체 주입으로 CSF 및 혈청에 모두 존재하는 인식가능한 농도의 항체가 야기되었으며, 이는 CNS로부터 말초로 항체의 유출에 대한 기존 보고와 일치된다. 시험관에서 가장 효과적인 항체인 HJ8.5로 처리하면 신경망으로부터 tau를 상당히 감소시킴으로써 tau 병리가 상당히 감소되었다. 이 효과는 여러 독립 착색, 불용성 tau의 생화학적 분석, 뇌 용해질에 존재하는 잔류 tau 씨딩 활성에 의해 탐지되었다. 더욱이, 이 치료는 이 모델에서 탐지된 거동학적 결함을 개선시켰다. 모든 항체는 tau 응집이 세포 안으로 취입을 차단시키고, 그리고 분석에서 세포외 응집의 존재 또는 부재시 세포내에서 이들이 관찰되지 않는다. 이들 항체의 효과는 세포-자율적인 것으로 기존에 간주된 신경병리의 발병 기전에서 세포외 tau에 대한 명백한 역할을 암시한다. 더욱이 이 작업은 발명자들의 기존 연구를 연장시키는데, 응집 흐름은 세포내 병리의 환경에서 발생될 수 있으며, 세포외 종을 표적화시킴으로써 응집 제거를 도울 수 있는 치료 가능성을 키울 수 있다고 제시한다. 끝으로, 이 작업은 치료 항체의 기획에 대한 중요한 영향을 가지며, 특히 씨딩 활성을 표적화함으로써 가장 효과적인 물질을 만들 수 있다고 제시한다.
기전-기초된 항체 요법(Mechanism-based antibody therapy) tau 병리에 대한 몇 가지 선행 능동 및 수동 말초 면역요법들 또한 tau 병리를 감소시키고, 거동 결함을 개선시켰지만, 항체 선택에 대한 근본적인 이유는 포스포-에피토프에서 신경원섬유 매듭과의 반응성에 기초되거나, 또는 명시되지 않았다. 전장 tau를 마우스에게 면역주사함으로써 실행된 한 가지 tau 면역주사 연구는 야생형 마우스에서 병리를 유발시켰다. 그러나, tau 유전자변이 모델에서 포스포-tau 펩티드를 이용한 후속적인 능동 면역주사 방법은 tau 병리를 감소시켰고, 거동 개선을 보였다. 수등 면역주사 연구에서 JNPL3 tau 유전자변이 마우스에게 타우병증 개시전 2-3월령에서 복막으로 PHF1 항체가 투여되었다. PHF-1은 비정상적으로 포스포릴화된 tau의 병적 형태를 표적으로 한다. 치료는 tau 병리를 감소시켰으며, 거동을 개선시켰다. 그러나, 치료는 불용성 포스포릴화된 tau를 감소시켰지만, 전체적인 불용성 tau는 변화되지 않았다. 또다른 수동 면역주사 연구에서 JNPL3 및 P301S 마우스 (타우병증 개시전 2-3월령)에게 응집-연합된 에피토프를 표적으로 하는 PHF1 또는 MC1 항체가 지엽적으로 투여되었다. 두 치료는 tau 병리를 개선시켰고, 운동 기능 이상의 개시를 지연시켰다. 이들 기존 연구에서, 항체 작용 기전은 명확하지 않고, 어느 것도 명쾌하게 테스트되지 않았다. 또한 일부는 세포내 기전을 제안하였다. 더욱이, 항체가 CNS로 주입되거나 한편 다른 연구에서 말초 주입을 이용하였고, 그리고 상이한 동물 모델이 이용된 경우 본 명세서에서 제공된 실시예에서 설명된 tau 병리의 감소 규모를 야기시킨 연구는 없었다.
본 연구는 세포외 tau 씨드가 발병기전의 주요 성분이라는 예측을 테스트하기 위하여 기획되었다. 본 연구는 예측된 활성 범위를 가진 물질을 테스트할 목적으로 시험관에서 tau 씨딩을 차단시킬 수 있는 항체를 선택하는 선별 과정으로 시작되었다. 생체내에서 테스트된 모든 항체는 응집 취입 및 씨딩을 효과적으로 차단시키고, 이들의 관찰된 활성에 대하여 기본을 제공한다. 또한, 앞으로의 연구에서 항체 친화력, 에피토프, 동형, 당화 및 tau의 포스포릴화된 형태에 결합되는 능력의 상관관계를 평가하는 것이 중요할 수 있다. 또한 항-tau 항체의 직접적인 CNS 주입의 효과를 보고하는 첫번째 연구다. 이용된 항체들은 각각 상이한 tau 에피토프를 표적으로 하고 어느것도 포스포-tau를 표적으로 하지 않음에도 불구하고, 셋중 둘은 면역조직학적으로 그리고 생화학적으로 비정상적인 tau 로드를 상당히 감소시켰으며, 이 둘은 기억을 상당히 개선시켰는데, 하나는 다른 하나보다 상당히 더 크게 개선시켰다. tau 병리에서 효과는 고유한 씨딩 활성의 감소와 상당히 연관있었다.
HJ8.5 및 HJ9.3은 생체내에서 병적 tau 씨드를 상당히 감소시켰다. tau 병리에서 상당한 감소는 이웃 세포에서 tau 응집 유도를 막음으로써 발생될 수 있을 지도 모른다. HJ9.4는 강력하게 병리를 감소시키지 못하였지만, 편도핵에서 tau 병리를 감소시켰다. 항체들 가운데 상이한 뇌 영역에서 효과의 차이는 항체의 결합 친화력에서 미묘한 차이를 가지는 영역-특이적 응집 이형태체 형성으로 인한 것일 수도 있다.
세포외 tau 응집이 생체내에서 항-tau 항체에 의해 일단 격리되면, 이들의 대사적 운명은 여전히 명확하지 않다. 항체 투여 후 3개월 후, 미세아교세포 활성의 감소가 발견되었고, 이는 아마도 tau-관련된 병리 및 신경 퇴행의 감소로 인한 것일 수 있다. 그러나, 이는 관련된 미세아교세포 활성화의 감소와 함께 세포외 응집의 좀더 효과적인 제거로 인할 것일 수도 있다. 항-Aβ 항체로 수 개월간의 수동 면역주사는 미세아교세포증을 감소시키는 것으로 또한 이해되었다. 항체/tau 복합체가 생체내에서 제거되는 기전과 이들이 tau 병리를 감소시키는 기전은 확정적으로 명확해져야 한다. 항-α-시누클레인 항체를 이용한 면역주사는 리소좀 분해를 촉진시킴으로써 α-시누클레인 응집을 소탕한다고 제시되었다. 항-α-시누클레인 항체를 이용한 최근 연구에서 항체는 짐작컨데 Fc 수용체들을 통한 미세아교세포를 통하여 α-시누클레인 소탕을 표적으로 하였다는 것을 보여주었다. 뉴런은 Fcγ수용체들을 발현시키고, 그리고 높은 친화력 FcγRI 수용체에 의해 항원과 복합된 IgG를 내화시킬 수 있을 것이다. 내화된 tau 항체는 엔도좀에서 tau를 또한 접촉할 수 있고, 결국 엔도좀/자가포식현상-리소좀 시스템에 의해 세포내 tau 응집 제거를 유도할 수 있다. 본 명세서에서 설명된 연구에서 이용된 항-tau 항체는 세포외 tau 어셈블리에 결합할 수 있지만, 세포 안에서 유의적인 국소화의 증거는 발견되지 않았다. 그러나, 생체내 세포들이 항체/tau 복합체를 취입하여 tau 응집 제거 뿐만 아니라 염증에 영향을 준다는 가능성은 배제되지 않는다. 예를 들면, 바이러스와 복합된 항체는 세포질 IgG 수용체 TRIM21에 결합할 수 있고 항체/바이러스 복합체를 프로테아좀으로 표적화시킬 수 있다는 것이 최근에 밝혀졌다. 또한, TRIM21에 결합된 항체는 면역 신호생성을 활성화시키는 것을 보여주었다. TRIM21와 항체/비-감염성 항원 복합체의 상호작용은 아직 보이지 않지만, 이러한 기전이 항-tau 항체와 관련있는지를 결정하는 것은 흥미로울 수 있다. 흥미로운 것은 타우병증의 P301S 모델에서, 고유 면역계는 유의적인 tau 병리 발생전에 활성화되며, 조기 면역억제가 tau 병리를 감쇠시킨다는 증거 또한 있다. 항체는 염증에 의해 유도된 tau 응집을 포획하고, 그 다음 응집-유도된 염증 및 질환 진행을 감소시키는 것도 가능하다.
세포외 tau 및 tau 병리의 확산 본 명세서에서 제시된 작업은 발병기전에서 세포외 tau의 역할을 함축적으로 테스트한다. 세포외 tau 응집은 이들의 원천이 재조합 단백질이거나 포유동물 세포로부터 추출된 tau이건 간에 세포 내부에서 고유 tau의 원섬유 형성을 촉발시킬 수 있다는 것은 명명백백하다. 유리(free) tau 응집의 역할은 우리의 기존 작업에 근거할 때 세포간 전파 조절물질로써 원래 가정되었는데 (가령 막에 포집되지 않은), 이때 세포 배지에 추가된 HJ9.3은 내화를 차단시켰고, 유리 원섬유를 면역침전시켰다 (Kfoury et al., 2012; J Biol Chem 287, 19440-19451).
동물 모델에서, tau 응집은 한 영역에서 다른 영역으로 보기에 확산될 수 있다 (가령 뇌후각 뇌피질에서 톱니모양의 뇌회 및 해마에서 하류 신경세포로). 발명자들은 단량체 tau가 비-병적 상태에서도 생체내에서 뇌 간질 유체로 일정하게 방출된다는 것을 발견하였다 (Yamada et al., 2011; J Neurosci 31, 13110-13117). 발명자들은 외생성 응집이 가용성 ISF tau의 수준을 감소시킬 수 있다는 것을 또한 발견하였는데, 이는 씨딩 및/또는 격리 현상이 이 공간에서 일어날 수 있음을 암시한다 (Yamada et al., 2011; J Neurosci 31, 13110-13117). 이와 함께, 세포외 tau 응집이 형성되고, 인접 세포, 연결된 세포에 의해 취입되거나, 또는 동일한 세포 안으로 되돌아갈 수 있고, 이로 인하여 단백질 미스폴딩의 부하가 증가된다는 개념은 많은 증거에 의해 뒷받침된다. 이 증거에 의해 세포외 씨딩 활성의 포획하는 치료가 질환을 개선시킬 수 있다는 것이 명백하게 예측된다. 본 명세서에서 제시된 실시예들에서 설명된 발견들은 이러한 사상과 일치된다.
발병기전에서 tau 유동의 역할 사실상 모든 신경세포에서 프라이온 프로모터를 통한 돌연변이체 tau 발현을 구동하는 마우스 모델 이를 테면 P301는 세포간 응집의 전파를 차단시키는 항체 치료로 이익을 얻어야 한다는 것을 선험에서 예측할 수 없을 것이다. 이론적으로, 병리는 응집-경향이 있는 단백질을 발현시키는 모든 신경세포에서 독립적으로 발생할 수 있다. 그러나, 발명자들에 의한 기존 조직배양 작업에서 세포 배지에 추가된 HJ9.3은 시간 경과에 따라 응집의 항정상태를 증가시켰기 때문에 tau 응집의 유동에 대한 역할을 제시하였다. 응집 유동 모델은 추가 테스트를 요구하지만, 본 명세서에서 제시된 결과는 항체 치료가 세포내 tau 병리를 상당히 감소시켰기 때문에 이 사상과 일관된다. tau 취입을 차단시키는 항체는 세포외 공간에 ＂싱크(sink)＂를 만들 수 있고, 이는 아마도 미세아교세포가 관련된 또다른 기전에 의한 제거를 촉진할 수 있을 것으로 예상된다.
치료 항체와 씨딩 활성의 표적화 약학 산업은 세포 안에 축적되는 응집-경향이 있는 단백질을 표적으로 하는 치료 항체의 개발 노력을 증가시키는데 기여하고 있다. 주요 기전은 병이 든 뇌에서 축적되는 것으로 알려진 에피토프에 결합할 것이라는 것이다. 이러한 방식은 생체내에서 최적의 활성을 가진 항체로 이어지거나 또는 이어지지 않을 수 있다. 본 명세서의 실시예들은 뇌 안에 존재하는 씨딩 활성의 차단에 있어서 효과를 강조하는 치료 항체 개발의 새로운 모델을 지원한다. 이러한 방법을 이용하여 기존에 보고된 것보다 더 높은 명시적 효과를 가진 항체들이 확인되었다. 프라이온 가설의 연장에서, 뚜렷한 tau 응집 ＂압박(strains)＂은 상이한 유형의 타우병증을 가진 환자들에서 지배적일 수 있고, 이들은 상이한 항체에 대하여 독특한 민감성을 가질 수 있는 것으로 추가 제안된다. 임의의 경우에서, 본 명세서에서 설명된 항체 효과의 민감성 시험관 분석의 이용으로 좀더 효과적인 항체-기반의 치료 개발과 최적화가 허용될 수 있다.
항-tau 항체, 특히 HJ8.5 항체의 강력한 보호 효과는 이러한 유형의 접근법이 인간 타우병증(tauopathies)의 치료 전략으로 고려되어야 한다는 것을 제시한다. ICV 방식을 통한 항체의 만성 투여가 가능하지만, 추가 연구에서 예방 및 처리 방식에 제공될 때 이들 항체의 말초 투여에서 PK/PD 반응을 결정하는 것도 중요할 수 있다. 또한, tau 씨딩 분석은 항체에 의한 표적 만남을 감시하는데 유용할 수 있다.
실시예 9-15를 위한 실험적 절차
항체들 HJ9.3 및 HJ9.4 마우스 단클론 항체는 마우스 tau에 대해 tau 녹아웃 마우스 (The Jackson laboratory)를 면역주사함으로써 만들어졌으며, HJ8.5 및 HJ8.7 단클론 항체는 인간 tau에 대해 tau 녹아웃 마우스를 면역주사함으로써 만들어졌다. HJ9.3, HJ9.4 및 HJ8.7 단클론 항체는 마우스 및 인간 tau를 모두 인지한다. 그러나, HJ8.5 단클론 항체는 인간 tau에만 결합된다 (에피토프는 잔기 25-30에 있다 [NCBI 기준 서열: NP_005901]). HJ9.3 항체는 tau의 RD 영역을 인지한다 (에피토프는 잔기 306-320에 있음). HJ9.4 항체는 tau의 N-말단 영역을 인지한다 (에피토프는 잔기 7-13에 있음). 대조군 항체로써, HJ3.4 마우스 단클론 항체가 이용되었는데, 이는 인간 Aβ 서열의 N-말단 영역을 인지한다 (에피토프는 잔기 1-16에 있음). HJ8.5, 9.3, 및 9.4 단클론 항체는 IgG2b 동형이다. 토끼 다중클론 tau 항체 (ab64193, 에피토프는 반복 도메인 영역에 위치함)는 Abcam에서 구입하였다. 마우스 단클론 바이오티닐화된 BT-2 항체는 인간 및 마우스 tau를 인지하고(에피토프는 잔기 194-198에 있음) 그리고 Pierce로부터 구입하였다. 렛 항-마우스 단클론 CD68 항체는 AbD SeroTec로부터 구입하였다. 바이오티닐화된 AT8 항체는 Thermo scientific로부터 구입하였다.
표면 플라스몬 공명 표면 플라스몬 공명 실험은 BIAcore 2000 표면 플라스몬 공명 기구(GE Healthcare-BIAcore)에서 실행되었다. Biacore 센서 칩 CM-5는 EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드)와 NHS (N-히드록시숙시니미드) 1:1 비율을 이용하여 7분간 활성화되었다. 센서 칩 표면은 10 mM 아세테이트 나트륨 pH 3.5 안에 5 μg/ml의 재조합 인간 또는 마우스 tau 또는 인간 tau 원섬유로 분당 5 μl의 유속으로 고정시킴으로써 포화되었다. 남아있는 결합안된 영역은 1 M 에탄올아민 pH 8.5에 의해 차단되었다. 참고용으로, 하나의 유동 세포는 NHS 및 EDS로 활성화되고, 이어서 1M 에탄올아민에 의해 차단되었다. 그 다음 모든 항-tau 항체는 여과된, 탈기된 0.01 M Hepes 완충액, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20, pH 7.4에서 상이한 농도 (0.11, 0.23, 0.46, 0.9, 1.8, 3.7, 7.5 μg/ml)로 분당 10 μl의 유속으로 주사되었다. 모든 시료는 이중으로 실시되었다. 단일 항체 농도로 각 운용 후, tau에 결합된 항체를 제거하기 위하여 칩에 고정된 tau를 흩트리지 않고 칩의 표면은 10 mM Glycine pH 1.7을 이용하여 재생되었다. BIAevaluation 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다 (GE healthcare-BIAcore).
Tau 원섬유화 8μM 재조합 전장 인간 tau는 실온에서 45분간 2mM 디티오트레톨과 함께 항온처리되었고, 그 다음 10 mM HEPES 및 100mM NaCl 및 8μM 헤파린이 전체 용적 200 μl에대해 추가되었고, 37℃에서 7일간 항온처리됨으로써 원섬유가 형성되었다. 원섬유 형성 후, 시료 안에 남아있는 tau의 단량체는 제조업자(Millipore)의 지시에 따라 100 kDa Microcon 원심분리 필터를 이용하여 분리되었다 .
바이오티닐화된 HJ8.5 항체의 IP 및 ICV 투여 마우스 단클론 HJ8.5 항체는 제조업자의 지시에 따라 바이오티닐화되었다 (Sulfo-NHS-LC-Biotin kit, Pierce). 바이오티닐화된 HJ8.5 (HJ8.5B)는 5-6 월령 P301S 마우스 (n=3)에게 50mg/kg으로 복막 주사(IP)에 의해 투여되었다. 48시간 후, 마우스는 희생되었다. 혈청 및 CSF는 수거되었고, 사용될 때까지 -80 ℃ 에 저장되었다. HJ8.5B는 5-6 월령 P301S 마우스 (n=3)의 좌측 측면 뇌실안에 외과적으로 이식된 삼투 펌프에 의해 뇌실계내부 주사 (ICV)로 투여되었다. 이 항체는 48시간 동안 지속적으로 주입되었다. 48시간 후, 마우스는 희생되었다. 혈청 및 CSF는 수거되었고, 사용될 때까지 -80 ℃에 저장되었다.
뇌심실내(ICV) 주사 절차 ICV 주입은 Alzet 삼투 펌프, 2006 모델 (Durect)에 의해 실행되었다. 상기 마우스의 나이는 외과수술 당시 6월령이었다. 외과술 이전, L-모양의 캐뉼라를 튜브 (3 cm, 길이)에 부착시키고, 그 다음 항체 또는 운반체 (인산염 완충액 염수- PBS, pH 7.4)를 나르는 Alzet 펌프에 부착되었다. 이 어셈블리는 측면 뇌실 안에 펌프를 배치하기 전 펌프를 활성화시키기 위하여 37 ℃에서 60시간 동안 PBS에서 항온처리되었다. 이 어셈블리는 이소플루란 마취하에 뇌의 표면 정수리에서 전후 0.4 mm, 중앙에서 측면으로 1.0 mm 그리고 배복에서 2.5 mm의 위치에 각 마우스의 좌측 측면 뇌실에 정위 장치(David Kopf Instruments)를 이용하여 외과적으로 이식되었다. 곡면으로 된 끝이 무딘 단부로 된 가위를 이용하여 피하내 주머니를 만들어서 Alzet 삼투 펌프는 피부 아래 위치시켰다. 각 이식된 캐뉼라는 치과용 시멘트와 작은 고정 스테인레스 강 나사로 고정되었다. 시멘트가 건조된 후 피부를 봉합하였다. 펌프내 항체 (2 mg/ml) 또는 PBS는 뇌의 좌측 측면 뇌실 안으로 지속적으로 주입되었다. 이들 삼투 펌프는 최대 200 μl의 용적을 수용하고, 펌프는 하루에 3.6 μl의 유속으로 펌프하여 하루 7.2 μg의 항체가 주입된다. 각 마우스에서 삼투 펌프는 주입 6주 후 한번씩 교환되었다. Alzet 펌프 안에 남아있는 용액은 각 마우스에서 제거한 후 수집되고, -80℃에 보관되었다. 9월령의 나이에 모든 마우스는 희생되었다. 모든 외과적으로 이식된 마우스는 단독으로 가두어두었다.
조직학 치료 12주 후, P301S 마우스는 펜토바르비탈 200 mg/kg의 복막으로 투여에 이어서 냉각 Dulbecco＇s PBS에 3U/ml의 헤파린의 주입에 의해 마취되었다. 뇌가 제거되었고, 두 반구로 절단되었다. 뇌의 좌측 측면은 24시간 동안 4% 파라포름알데히드에 고정되었고, PBS내 30% 슈크로즈로 이동되었고, 분말화된 건조 얼음에서 냉동시키기 전 4℃에 보관되며, -80℃에서 저장되었다. 절반의 뇌는 동결 슬라이딩 마이크로톰에 의해 50 μm 단면으로 관상 절단되고, 모든 단편은 사용전까지 -20℃에서 동결보존 용액 (0.2M 인산염 완충된 염수, 30% 슈크로즈, 30% 에틸렌 글리콜)에 보관되었다. 해마와 피질은 생화학 분석을 위하여 각 뇌의 새로 관주된 우측 반구로부터 해부되었다. 모든 해부된 조직들은 분석때까지 -80℃에서 보관되었다. 좌측 측면 뇌실 안에 캐뉼라의 배치는 300 μm로 따라 떼어낸 뇌 단면을 기존에 설명된 것과 같이 크레실 바이올렛에 의한 착색에 의해 확인되었다(Holtzman et al., 1996; Ann Neurol 39, 114-122). 착색된 조직들은 NanoZoomer 디지탈 병리학 시스템(Hamamatsu Photonics)을 이용하여 스캔되었다.
세포 배양 / 씨딩 분석: P301S 뇌 용해질 및 항체 치료 HEK293 세포들은 10% 태아 소 혈청, 100 μg/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco＇s Modified Eagle Medium (DMEM)에서 배양되었다. 배양물은 5% CO2, 37 ℃의 가습된 대기에서 유지되었다. 일시적인 형질감염을 위하여, HEK293 세포들은 최적의 배지에서 12-웰 플레이트에서 웰당 250,000개 세포로 도말되었고, 제조업자의 권유에 따라 Lipofectamine 2000 시약과 600 ng의 적절한 DNA 구조체 (Invitrogen)를 이용하여 형질감염되었다. 공동-형질감염된 세포들은 150 ng의 RD(ΔK280)-CFP 구조체와 450 ng의 RD(ΔK280)-YFP 구조체의 조합을 제공받았다. 15 h 후, 세포들은 0.05% 트립신으로 37℃에서 3분 동안 수확되었고, 그 다음 15시간 동안 4중으로 96-웰 플레이트에서 재-도말되었다. 그 다음, 모든 항-tau 단클론 항체 (HJ8.5, 9.3 and 9.4) 또는 HJ3.4 항체 (단클론 항-Aβ 항체)와 함께 사전-항온처리된 P301S 뇌 용해질 [프로테아제 (Roche) 그리고 포스파타제 저해제 (Roche)와 함께 1x TBS에서 준비됨]은 회전하면서 4℃에서 16시간 동안 다양한 농도(0.125 μg/ml, 0.25 μg/ml, 0.5 μg/ml, 1 μg/ml 및 2 μg/ml)로 추가되었다. 상이한 항체로 3개월 동안 처리된 P301S 마우스에서 씨딩 활성을 결정하기 위하여, 처리된 모든 마우스의 RAB 가용성 분획물은 다양한 농도로 세포에 또한 추가되었다. 세포들은 4% 파라포름알데히드로 고정되기 전 추가 24시간 동안 배양되었고, 그리고 FRET 분석이 실행되었다.
면역침전 PBS 또는 항체-처리된 마우스로부터 RAB 가용성 분획물은 단백질-G-아가로즈 비드에 교차 연계된 마우스 단클론 항-tau 항체 HJ9.3 및 HJ8.5 존재하에 (키트 추천-Pierce Crosslink 면역침전 키트) 4℃에서 24시간 동안 엔드-오버-엔드 회전(end-over-end rotation)과 함께 항온처리되었다. 또한, 항체 처리된 마우스의 RAB 가용성 분획물은 접합안된 단백질-G-아가로즈 비드 존재하에 4℃에서 24시간 동안 엔드-오버-엔드 회전(end-over-end rotation)시키면서 항온처리되었다. 18 h 후, 500 μl의 결합/세척 완충액 (Pierce)을 시료에 추가하였고, 3분간 2000 x g에서 원심분리하였다. 상청액은 버리고, 세척 단계는 3회 반복되었다. 비드에 결합된 단백질은 5분간 실온에서 항온처리하면서 낮은 pH 용리 (25 μl)를 이용하여 용리되었다. 그 다음 시료는 2000 x g에서 3분간 원심분리되었고, 상청액은 수거되었다. 이 용리 단계는 총 50 μl 용출액으로 1번 반복되었다. tau 응집이 포함된 tau-면역침전물(IP)은 씨딩 분석과 함께 추가 분석을 위한 초기 뇌 용해질에 대등한 양으로 공동-형질감염된 RD(ΔK)-CFP/YFP 세포들에게 다시 제공되었다.
뇌 조직 추출 각 뇌의 피질은 30 μl/mg의 RAB 완충액 [100 mM MES, 1 mM EDTA, 0.5 mM MgSO4, 750 mM NaCl, 20 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 프로테아제 저해제 (Roche)와 포스파타제 저해제 (Roche)가 보충됨]에서 균질화되었다. 간단하게 말하자면, 시료는 4℃에서 Optima MAX-TL 초원심분리기(Beckman)를 이용하여 20분간 50,000 g에서 원심분리되었다. 상청액은 RAB 가용성 분획물로 수집되었고, 펠렛은 RIPA 완충액 [150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0.5% 데옥시콜산, 1% Triton X-100, 0.5% SDS-25 mM EDTA, pH 8.0, 프로테아제 저해제 (Roche)와 포스파타제 저해제 (Roche)가 보충됨], 30 μl/mg에서 재현탁되었고, 그리고 4℃에서 20분간 50,000g에서 원심분리되었다. 상청액은 RIPA 가용성 분획물로 수거되었다. 펠렛은 70% 포름산, 10 μl/mg에서 추가 재현탁되었고, 그리고 4℃에서 20분간 50,000g에서 원심분리되었다. 상청액은 RIPA 가용성 분획물로 수거되었다. 모든 분획물은 분석될 때까지 -80℃에서 보관되었다.
전기영동 및 면역블랏팅 4-12% NuPAGE Bis-Tris 겔 (Invitrogen)에 의해 환원 조건하에 겔 전기영동이 실행되었고, IBlot 기구(Invitrogen)를 이용하여 PVDF 막으로 이전되었다. 70% 포름산 분획물은 로딩전 중화되었고, 10N NaOH 및 중화 완충액 (1mol/L Tris 베이스; 0.5 mol/L NaH4PO4) 1:1 혼합물로 1:3으로 희석함으로써 겔 전기영동을 받게되었다. 각 운영에는 사전-착색된 분자량 표준 ＂SeeBlue＂ (Invitrogen)가 포함되었다. 막은 0.1%의 Tween 20이 포함된 Tris 완충된 염수(TBS)에 5% 우유로 차단되었다. 그 다음 막은 각 5분 동안 3회 세척되었다. 토끼 다중클론 tau 항체 (Abcam, 1:2000)은 포름산 분획물에서 탐지 tau를 위한 일차 항체로 이용되었다. 삼투 펌프로부터 주입 전과 후에 수거된 치료된 마우스 항-tau 항체는 일차 항체로 또한 이용되었다. 막은 후속적으로 염소 항-토끼 또는 염소 항 마우스 이차 항체 (GE Healthcare, 1:2000)로 항온처리되었다. 모든 막은 ECL 프라임 물질 (GE Healthcare)로 현상(develop)되었다. 밴드는 G:Box Chemiluminescent Imager (Syngene)로 가시화되었다.
뇌 균질액으로부터 tau에 대한 항-tau 항체의 면역반응성을 결정하기 위하여, 9 월령의 P301S와 3 월령 P301S 마우스의 RAB 가용성 분획물, 3 월령의 야생형 마우스 그리고 3 월령의 tau 녹아웃 마우스 시료는 SDS-PAGE와 이어서 웨스턴 블랏팅에 의해 분리되었다. 각 RAB 가용성 분획물의 전체 단백질 1 μg은 환원 조건하에 4-12% NuPAGE Bis-Tris 겔 (Invitrogen) 상에 로딩되었고, IBlot 기구 (Invitrogen)를 이용하여 니트로셀룰로오즈 막으로 이전되었다. 막은 0.05% tween 20 (TBST)과 함께 TBS내 5% 우유로 차단되었고, 일차 항체 (HJ8.5, HJ9.3 및 HJ9.4)와 함께 항온처리되었다. HRP-접합된 당나귀 항-마우스 IgG (1:2000, Santa cruz)가 이차 항체로 이용되었고, 막은 Lumigen TMA6 (GE Healthcare)를 이용하여 현상되었다.
tau에 결합된 자유 HJ8.5B 및 HJ8.5B를 탐지하기 위한 ELISA 자유 HJ8.5B의 농도는 IP 또는 ICV 투여 후 48시간 후 마우스의 혈청 및 CSF에서 측정되었다. 96개 웰 ELISA 플레이트는 4℃에서 50 ng/ml의 재조합 인간 tau로 피복되었다. ELISA 플레이트는 37℃에서 1시간 동안 4% BSA로 차단되었다. 그 다음 플레이트는 5차례 세척되며, 시료 완충액 (0.25% BSA/PBS, 300 nM Tris pH 7.4, 프로테아제 저해해가 보충됨)에 희석된 혈청 및 CSF 시료와 함께 항온처리되었고, 4 ℃에서 하룻밤 동안 항온처리되었다. 다음날, 플레이트는 PBS로 8차례 세척되었으며, 이어서 실온 암 상태에서 1.5시간 동안 스트렙타아비딘-폴리-양고추냉이 과산화효소-40 (1:6000, Fitzgerald)이 추가되었다. 그 다음 플레이트는 PBS로 8차례 세척되었으며, Super Slow ELISA TMB (Sigma)로 현상되고, 650 nm에서 판독되었다. 상이한 농도의 HJ8.5B가 이용되어 혈청 및 CSF 시료에 추가하여 각 플레이트에서 운영된 표준 곡선이 만들어졌다.
tau에 결합된 HJ8.5B의 농도는 96 웰 ELISA 플레이트를 20 μg/ml의 HJ8.7 항체로 4 ℃에서 피복시킴으로써 측정되었다. ELISA 플레이트는 37℃에서 1시간 동안 4% BSA로 차단되었다. 그 다음 플레이트는 5차례 세척되며, 시료 완충액에 희석된 혈청 및 CSF 시료와 함께 항온처리되었고, 4 ℃에서 하룻밤 동안 항온처리되었다. 다음날, 플레이트는 PBS로 8차례 세척되었으며, 이어서 실온 암 상태에서 1.5시간 동안 스트렙타아비딘-폴리-양고추냉이 과산화효소-40 (1:6000, Fitzgerald)와 함께 항온처리되었다. 그 다음 플레이트는 PBS로 8차례 세척되었으며, Super Slow ELISA TMB (Sigma)로 현상되고, 650 nm에서 판독되었다. 재조합 tau와 복합된 정제된 HJ8.5B의 상이한 희석액을 이용하여 각 플레이트에서 표준 곡선이 만들어졌다.
Tau 샌드위치 ELISA 분석 전체 tau 수준을 측정하기 위하여, ELISA 하프 96 웰 플레이트 (Costar)는 탄산염 완충액 pH 9.6에서 HJ8.7 항체 (20 μg/ml)로 피복되었고, 쉐이커에서 하룻밤 동안 4℃에서 항온처리되었다. ELISA 플레이트는 BioTek ELx405 플레이트 세척기로 PBS로 5차례 세척되었으며, 그리고 37℃에서 1시간 동안 4% BSA로 차단되었다. 그 다음 플레이트는 5차례 세척되었으며, 이어서 웰은 시료 완충액 (0.25% BSA/PBS, 300 nM Tris pH 7.4, 프로테아제 저해해가 보충됨)에 희석된 RAB, RIPA, 또는 70% FA 생화학적으로 추출된 가용성 뇌 조직 분획물과 함께 항온처리되었고, 4 ℃에서 하룻밤 동안 항온처리되었다. 70% FA 분획물은 1M Tris pH 11로 1:20으로 희석되고, 이어서 시료 완충액으로 희석됨으로써 중화되었다. 다음날, 플레이트는 PBS로 8차례 세척되었으며, 이어서 37 ℃에서 1.5시간 동안 0.5% BSA/PBS에서 바이오티닐화된 마우스 단클론 항-tau 항체 BT-2 항체 (0.3 μg/ml, Pierce)가 추가되었다. 그 다음 플레이트는 PBS로 8차례 세척되었고, 실온 암 상태에서 1.5시간 동안 스트렙타아비딘-폴리-양고추냉이 과산화효소-40 (1:4000)이 추가되었다. 그 다음 플레이트는 PBS로 8차례 세척되었으며, Super Slow ELISA TMB (Sigma)로 현상되고, BioTek Synergy 2 플레이트 판독기의 650 nm에서 흡수도가 판독되었다. 재조합 인간 tau를 이용하여 각 플레이트에서 표준을 만들었다. 각 플레이트에서 일차 항체가 배제된 음성 대조군 웰이 포함되었다. Eva-Maria Mandelkow의 실험실에서 만들어진 최장 재조합 인간 (hTau40, 441aa) 및 마우스 tau (mTau40, 432aa) 아이소폼이 ELISA 분석에서 표준으로 이용되었다.
70% FA 분획물에서 인간 tau의 수준을 결정하기 위하여, ELISA 96 웰 플레이트는 마우스 단클론 항체 Tau5 (20 μg/ml) 및 탐지를 위하여 마우스 단클론 항-인간 tau 특이적 바이오티닐화된 HT7 항체 (0.2 ug/ml, Thermo Scientific)로 피복되었다. 70% FA 분획물에서 마우스 tau 수준의 경우, ELISA 96 웰 플레이트는 단클론 항-마우스 tau 특이적 HJ9.2 항체 (20 μg/ml)로 피복되었고, 단클론 바이오티닐화된 HJ8.7은 탐지용으로 이용되었다. 재조합 인간 및 마우스 tau는 각 플레이트에서 표준으로 이용되었다. Ser202 및 Thr205 위치에서 포스포 tau 수준을 결정하기 위하여, ELISA 하프 96 웰 플레이트는 마우스 단클론 HJ8.7 항체 (20 μg/ml)로 피복되었고, 바이오티닐화된 AT8 항체 (0.2 ug/ml, Thermo Scientific)가 탐지 항체로 이용되었다.
면역조직화학(Immunohistochemistry) 뇌 안에 비정상적으로 포스포릴화된 tau의 존재를 탐지하기 위하여, 모든 처리된 마우스로부터 300 μm 공간을 두고 50 μm 관상 뇌 절편 3개가 평가되었다. 뇌 절편은 Tris-완충된 염수 (TBS)내 3% 우유와 0.25% (vol/vol) Triton-X로 차단되었으며, 이어서 4℃에서 ser202 및 thr205에서 포스포릴화된 tau를 인지하는 바이오티닐화된 AT8 항체 (Thermo Scientific, 1:500)와 함께 하룻밤 동안 항온처리되었다. 잔기 ser396 및 ser404에서 비정상적으로 포스포릴화된 tau를 인지하는 바이오티닐화된 PHF1 항체 (1:200)는 AT8과 PHF1 항체 착색 사이의 상관관계를 결정하는데 이용되었다. 상관관계 연구를 위하여, HJ8.5, HJ9.3, 및 PBS-처리된 집단으로부터 무작위로 마우스(N=6)가 선별되었다. 착색된 조직은 NanoZoomer 디지탈 병리학 시스템을 이용하여 스캔되었다. AT8 착색과 활성화된 미세아교세포 착색 간의 상관관계를 결정하기 위하여, 모든 처리된 집단 (N= 6)의 선택된 마우스의 뇌 절편은 TBS내 10% 정상 염소 혈청과 0.25% (vol/vol) Triton-X로 차단되었고, 4℃에서 하룻밤 동안 렛 항-마우스 CD68 항체 (AbD SeroTec, 1:500)와 함께 항온처리되었다. 그 다음 절편들은 바이오티닐화된 염소 항-렛 IgG 항체와 함께 항온처리되었다 (Vector, 1:2000). 모든 절편들은 NanoZoomer 슬라이드 스캐너 (Hamamatsu Photonics)로 스캔되었다. 모든 영상은 NDP 뷰어 소프트웨어에 의해 전해지며, ImageJ 소프트웨어 (National Institutes of Health)를 이용하여 정량화되었다. AT8 착색을 위하여, 상기 마우스 뇌 도해에서 Bregma 좌표 -1.4, -1.7, 및 -2.0 mm에서 절편에 대략적으로 대응하는 300 μm 떨어진 각 마우스의 3개 뇌 절편이 이용되었다. 이들 절편들은 비정상적으로 포스포릴화된 바이오티닐화된 AT8 항체 착색이 차지한 면적의 비율을 결정하는데 이용되었다. 모든 전환된 영상은 AT8 착색을 정량화시키기 위하여 균일하게 문턱값을 넘겼으며, 이들 3개 절편의 평균을 이용하여 각 마우스에서 비정상적으로 포스포릴화된 tau 착색된 영역의 비율이 결정되었다. PHF-1 및 CD68 착색을 위하여, 상기 마우스 뇌 도해에서 Bregma 좌표 -2.3 및 -2.6mm에 대응하는 300 μm 떨어진 각 마우스의 2개 뇌 절편이 이용되었다. ThioS 착색을 결정하기 위하여, 처리된 모든 집단 (N= 6)으로 부터 무작위로 선택된 마우스의 뇌 절편은 50% 에탄올 (0.25 mg/ml)내 ThioS로 3 분간 착색되었고, 이어서 50% 에탄올 및 증류수에서 세척되었다. 그 다음 슬라이스를 탑재하고, 건조시키고, 영상은 Nanozoomer와 함께 현미경검사에 의해 평가되었다. 각 마우스의 2개 뇌 절편은 PHF-1 및 CD68 착색에 이용된 것에 이웃된 설명된 것과 같이 이용되었다.
세미-변성-아가로즈 겔 전기영동 (SDD-AGE) 3 월령의 tau 녹아웃 (KO), 3 월령의 야생형 (WT), 3 월령의 P301S 그리고 9 월령의 PBS-처리된 P301S 마우스의 상이한 RAB 가용성 분획물에 존재하는 tau 종들을 분리하기 위하여, 이미 설명된 세미-변성 세제-아가로즈 겔 전기영동 (SDD-AGE) 방법에 약간의 변형을 가하여 이용되었다. 시료는 0.2% SDS와 함께 완충액 G(20 mM Tris, 200 mM 글리신)에서 수평 1.5% 아가로즈 겔에서 이동되었다. 그 다음 시료는 실온에서 7분간 시료 완충액 (60 mM Tris-HCl pH 6.8, 0.2% SDS, 5% 글리세롤 및 0.05% 브로모페놀 블루)에서 항온처리되었다. 전기영동 후, 겔로부터 단백질은 Immobilon-P PVDF 쉬트 (Millipore)로 이동되었다. 막은 항-tau 특이적 토끼 다중클론 항체 (Abcam)를 이용하여 1:2000에서 블랏되었다. 블랏은 GE ECL Plus 시스템을 이용하여 현상되었다.
면역형광(Immunofluorescence) HEK293 세포들은 폴리 D-리신이 피복된 24웰 플레이트 상에서 웰당 75,000개 세포로 도말되었다. 이용된 항-tau 항체가 HEK293 세포들에 의해 취입된 tau 종들을 탐지할 수 있는지를 결정하기 위하여, 세포들은 2시간 동안 P301S 뇌 용해질로 처리되고, PBS로 3회 세척되었으며, 실온에서 15분간 4% 파라포름알데히드로 고정되었으며, 이어서 실온에서 PBS로 3회 세척되었다. 세포들은 10분 동안 0.1% Triton X-100으로 투과가능하도록 되었으며, PBS로 3회 세척되었으며, 그 다음 10% 정상적인 염소 혈청 및 20 mg/ml BSA가 포함된 PBS 안에 0.25% Triton X-100으로 차단되었다. 그 다음 세포들은 Alexa-fluor 546에 접합된 항-마우스 이차 항체와 함께 항온처리되었다. 항체가 세포들 안으로 유입될 수 있는 지를 결정하기 위하여, P301S 뇌 용해질은 Aβ에 대한 상이한 항-tau 항체 HJ8.5, HJ9.3, 및 HJ9.4 또는 HJ3.4 항체와 함께 또는 이들 없이 사전-항온처리되었다. 그 다음 용해질은 2시간 동안 HEK293 세포에 추가되었고, 고정되었고, 그리고 투과가능하도록 되었다. Alexa-fluor 546에 접합된 제 2 항체는 항체를 식별하는데 이용되었다. 4＇,6＇-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI; 청색으로 나타냄)은 핵 착색에 이용되었다. 모든 영상은 공촛점 현미경검사 (Confocal Microscope- Zeiss)를 이용하여 얻었다.
병적 그리고 생화학적 데이터의 통계학적 분석 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내며, 그리고 처리 집단과 대조군을 비교하기 위하여 일원 ANOVA와 Dunnett＇s post hoc 테스트에 의해 상이한 조건들이 비교되었다. 통계학적 유의성은 P < 0.05에서 설정되었다. GraphPad Prism 5.04 (Windows 용) (GraphPad Software Inc.)을 이용하여 통계가 실행되었다. AT8 착색의 정량적인 평가를 위하여, 성별은 유의적인 인지이며, 따라서 결과는 SAS 버젼 9.2 소프트웨어를 이용하여 성별에 의해 조정되었다.
치료 및 성별을 인자로써 적용한 통계학적 분석 대조군 집단 (PBS 및 HJ3.4) 평균은 각 치료 집단과 비교되었다. (PBS의 평균+ HJ3.4의 평균)/2 VS 처리 평균). 이원 ANOVA를 이용하여 성별 및 치료가 유의적인 인자인지를 테스트하였고, 이는 PROC GLM, SAS 버젼 9.2에 의해 이루어졌으며, 이들의 p 값들은 표 7에 나타낸다 모든 비교에 접근하기 위하여 SAS Version 9.2의 PROC GLM에 대비 서술이 이용되었다. 이원 ANOVA에서 조정 인자로써 성별이 적용되었고, 적용 전후의 값들은 도 38D에 나타낸다.
거동 테스트 보행 활성과 탐색 행동 그리고 감각운동 배터리와 로타로드(rotarod) 상에서의 종합 검사에서 마우스를 평가하여 조건적 공포 테스트의 결과를 해석하기 위한 추가 대조 데이터를 제공하였고, 이는 인지 기능 평가에 이용되었다. 조건화된 공포 테스트는 일련의 테스트에서 마지막으로 실행되어, 다른 거동 색인에서 간단한 사지충격(footshocks)의 효과를 배제시켰다.
결함판(Holeboard) 탐색, 감각운동 배터리 및 로타로드 모든 마우스는 결함 판 탐색 테스트에서 평가되는데, 이때 전체 보행(전체 신체 이동) 및 구멍(hole pokes)은 30분 간격으로 정량화되어, 보행 활성 및 탐색의 색인이 제공되었다. 이 프로토콜은 4개 코너와 4개 측면 구멍이 포함된 자동화된 결함 판 기구 (41 x 41 x 38.5 cm high)의 이용과 관련되는데, 측면 구멍은 코너 구멍들 사이에 등거리에 있다 (Learning Holeboard; MotorMonitor, Kinder Scientific, LLC, Poway, CA). 광선 기구(Photobeam instrumentation)를 이용하여 테스트 과정 동안 전체 보행 및 탐색 구멍을 정량화하였다. 이 과정은 우리의 전반적인 결함 판 탐색/후각 선호 테스트의 습관화 요소로 작용되었다. 마우스는 균형 (렛지, 플랫포옴), 조화 (pole, 60°및 90°경사진 스크린), 강도 (역전된 스크린), 그리고 작은 국한된 영역 밖으로의 이동 시작 (걷기 시작)을 평가하기 위하여 이용된 7가지 감각 운동의 밧데리에서 또한 테스트되었다. 이 밧데리는 기존 공개에서 이용되었으며, 더 상세한 과정 설명은 Wozniak et al. (2004; Neurobiol Dis 17, 403-414)에서 볼 수 있다. 로타로드 테스트는 기존 공개된 방법과 유사한데 세가지 유형의 시험이 포함된다 : 1) 고정 막대 (60 s 최대; 2) 정속 로타로드 (2.5 rpm, 60 s 최대;그리고 3) 가속 로타로드 (0-180s에 걸쳐 2.5-10.5 rpm). 우리 프로토콜은 운동 학습을 제한시키기 위하여 3일 간격을 둔 3차례 테스트 과정에서 한 개의 고정 막대 시도, 2개의 정속 로타로드 시험 그리고 2개의 가속 로타로드 시험에 각 마우스를 테스트하는 것으로 구성된다.
조건화된 공포. 조건화된 공포 테스트에서 마우스들이 평가되었는데, 이 테스트는 실행된 최종 행동 측정이었다. 간략하게 설명하자면, 상기 마우스는 2개의 Plexiglas 조건화 챔버 (26 cm x 18 cm, 및 18 cm 높이) (Med-Associates, St. Albans, VT)에서 훈련받고, 테스트되는데, 각 쳄버는 구별가능하고 상이한 시각적, 후각적 그리고 촉각 신호를 담고 있다. 각 마우스는 5분 동안 조건화 쳄버에 두고, 2-분 기준 시간 동안 부동 거동이 정량화되었다. 3분에 시작하고, 그 다음 60초 간격으로, 상기 마우스는 3가지 소리-충격 페어링에 노출되었는데, 각 페어링은 광대역 백색 소음으로 구성된 80 dB 소리 (조건화된 자극; CS)을 20초 제공하고 이어서 소리의 마지막 초 동안 제공되는 1.0 mA 연속 사지충격 (조건화안된 자극; CS)이 포함된다. 광대역 백색 소음은 연령에 따라 발생될 수 있는 청각 결함 가능성을 피하기 위한 노력으로 주파수-특이적 소리 대신에 이용되었다. 다음날 마우스는 다시 조건화 쳄버로 되돌려 보내고, 환경적 공포 조건을 평가하기 위하여 8분 기간에 걸쳐 부동 거동이 정량화되었다. 24시간 후, 상기 마우스는 상이한 신호들이 포함된 다른 쳄버 안에 넣고, 2-분 ＂변경된 환경＂ 및 청각 신호(소리; CS)가 제공되는 후속 8분 동안 부동 거동이 정량화되었다. ＂부동 기준(freezing threshold)＂이 조정되면서 거동의 동시 시각화가 허용되는 FreezeFrame 영상 분석 소프트웨어 (Actimetrics, Evanston, IL)를 이용하여 부동이 정량화되었는데, 0.75s 간격 동안 부동 또는 부동이 아닌 것으로 거동이 분류된다. 부동은 정상적인 호흡과 연관된 것을 제외하고 이동이 없는 것으로 정의되며, 데이터는 부동에 소요되는 시간 비율로 제시된다. 환경적 공포 조건 정도를 평가하기 위하여, 각 치료 집단내에서 분석을 실행하였는데, 1일차에 2-분 기준에 걸쳐 평균된 부동에 소요되는 시간을 2일차에 환경적 공포 테스트의 첫 2분 동안 부동에 소요되는 시간과 비교하고, 뿐만아니라 전체 8-분 과정에 걸쳐 평균된 부동 수준과도 비교하는 것을 포함한다. 충격 민감성은 Khuchua et al. (2003; Neuroscience 119, 101-111)에서 기존에 설명된 절차에 따라 조건화된 공포 테스트 완료 후 평가되었다.
행동 데이터의 통계학적 분석 분산 분석 (ANOVA) 모델은 전형적으로 거동 데이터를 분석하는데 이용되었다 (Systat 12, Systat Software, Chicago, IL). 조건화된 공포 데이터는 대상간의 변수 간의 하나 (치료)와 대상내 변수간의 하나 (반복된 측정) (Minutes)가 포함된 반복된 측정(rm) ANOVA 모델을 이용하여 분석되었다. 알파 수준의 Huynh-Feldt 조정은 rmANOVA 모델에 내재된 구형/화합물 균형 추정의 방해로부터 보호하기 위하여 2개 수준 이상이 포함된 대상내 효과에 대해 이용되었다 PBS+HJ3.4 대조군 집단과 3가지 다른 항체 치료 집단 (가령, HJ8.5, HJ9.3, HJ9.4) 각각 사이에 계획된 비교는 특정 주요 가설을 테스트하기 위하여 ANOVA 모델내에서 실행되었다. 다른 경우에서, 관련된 유의적인 전반적 ANOVA 효과에 따라 쌍(pair-wise) 비교가 실행되었는데, 적절한 경우 Bonferroni 수정을 받았다. 결함 판 테스트 동안 기록된 전체 보행과 2일차 환경적 공포 테스트 동안 부동에 소유된 시간 비율 사이에 Person 상관계수(r)이 또한 산출되었다.
실시예 16. Tau ELISA 분석
환자의 혈장 시료에서 병적 tau 응집이 존재하는지를 탐지하기 위하여 ELISA 분석이 개발되었다. 이 분석에 이용된 항체들은 마우스 단클론 항-tau HJ9.3 및 HJ9.2가 포함된다. HJ9.3은 원-스텝 항체 바이오티닐화 키트 (HJ9.3-Bio)를 이용하여 바이오티닐화된다. 이 샌드위치 ELISA는 포획 항체로 등가 농도의 HJ9.3 및 HJ9.2를 이용한다. 96-웰 하프 영역 플레이트 (Costar 3690)는 중탄산염 완충액 pH 9.6에서 준비된 20 μg/ml의 HJ9.2/HJ9.3 (50μl/웰)으로 피복되며, 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리되었다. 4 % BSA/PBS를 이용한 차단 단계이후, 혈장 시료 (시료 완충액에서 1:4호 희석됨: 0.25% BSA/PBS, 300nM Tris PH 7.4~8.0, 1X 프로테아제 저해제)는 웰당 삼중으로 적용된다 (50μl/웰). 그 다음 플레이트는 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리된다. 탐지를 위하여 0.5% BSA/PBS에서 준비된 HJ9.3-Bio 0.3μg/ml는 37℃에서 1.5시간 동안 웰에 추가되었다. 0.5% BSA/PBS에서 1:4,000 희석으로 이차 스트렙타아비딘-폴리HRP40 항체 (50 μl/웰, 실온에서 쉐이커 상에서 암상태 1.5시간)는 TMB 슈퍼 슬로우 기질을 이용한 효소 반응을 통하여 최종 탐지에 이용된다. ELISA는 혈장내 희귀한 종의 탐지를 최적화하도록 기획되었다. 초기 구체예들은 응집의 포획을 최적화하기 위하여 항체 쌍으로 ELISA 플레이트 표면을 피복하는 것을 포함하였다. 그러나 분석의 민감도를 증가시키기 위하여 더 많은 용적의 유체 시료로부터 항체 피복된 비드를 이용하는 것도 대등하게 타당할 것이다. 건강한 젊은 참여자로부터 수거된 음성 혈장은 분석의 배경 신호를 산출하는데 이용되었다. 실험 시료내에 Tau 씨드 존재는 음성 혈장의 신호에 이상의 배수 유도로 보고된다.
전-임상 및 공개된 씨딩 분석에 이미 테스트된 알츠하이머 질환 (AD) 환자의 혈장 시료 세트가 샌드위치 tau ELISA 분석을 실증하는데 이용되었다. 씨딩 활성이 없는(음성) 12명의 대조군 환자 (CDR 0)와 씨딩 활성을 갖는(양성) 12명의 환자 (CDR > 0)는 새로 개발된 ELISA 분석을 이용하여 테스트되었다. 이들 환자는 바이오센서 세포의 분석에 근거하여 CSF와 혈장에 씨딩 활성을 가지거나 또는 가지지 않는 것으로 이미 결정되었다. 이 세포의 분석에서, ΔK280 돌연변이가 포함된 tau 단백질의 RD 단편은 시안 또는 황색 형광 단백질에 융합된다. 이는 FRET를 통하여 형광 공명 에너지 전달을 측정함으로써 응집을 탐지할 수 있다. 세포외 응집은 세포 안으로 들어와, tau FRET 리포터 단백질들의 세포내 응집을 촉발시킨다.
도 45에 나타낸 것과 같이, 양성 씨딩 활성을 가진 AD 환자의 혈장내 씨드의 명백한 tau 존재와 비교하였을 때 음성 씨딩 활성을 가진 환자의 혈장내에서 tau 응집은 탐지되지 않았다. 이 무(free) 세포-기반 분석은 알츠하이머 질환이 포함된 많은 타우병증의 비-침습성 진단 도구로 더 많은 임상 환경에서 이용될 수 있다. 더욱이, 시료 집단을 풍부하게 함으로써 임상 시험 기획을 촉진시켜 치매가 발생될 운명인 초기 병리를 가진 환자의 탐지가 허용될 수 있다. 끝으로, 항-tau 또는 다른 항-치매 요법의 효과를 감시하는데 이용될 수 있다.
실시예 17
한 집단에서 다른 집단으로 tau 응집의 전파를 측정하기 위하여 세포의 전파 분석이 제공되었다. 반복 도메인 (RD)으로 구성된 tau 단편은 CFP-테그된 형태의 응집을 촉진시키기 위하여 2개 질환-연합된 돌연변이(LM: P301L/V337M), 또는 한개 질환-연합된 돌연변이 (ΔK: ΔK280)와 함께 테그안된 형태로 이용되었다. 세포들중 한 집단은 RD(LM) 및 RD(ΔK280)-CFP로 형질감염되었고, 또다른 집단은 RD(ΔK280)-YFP로 형질감염되었다. 형광 플레이트 판독기상에서 96-웰 포멧에서 4중으로 성장된 세포로부터 FRET가 기록되었다. FRET 신호는 RD-CFP 응집이 RD-YFP를 함유한 세포로 또는 이역으로 이동될 때 유도된다. 다중 항체는 표시된 다양한 희석액으로 배지에 추가되었다. 항체의 출발 농도는 ~1mg/ml이었다. 예를 들면, 10-3 희석액은 ~1μg/ml의 최종 농도를 나타낸다. 24시간 후, 세포들이 고정되었고, FRET 측정이 기록되었다. 개별 항체의 데이터는 도 47에 제공된다. 일부 항체 (가령 HJ8.2, HJ9.1)는 응집의 세포간 전파를 방지하는데 매우 효과가 있었다. 다른 것들은 중간 수준으로 효과적이었으며 (가령 HJ9.3), 그리고 일부는 기본적으로 효과가 없었다 (HJ8.7). 각 집단에서, 첫번째 막대는 추가된 항체 없는 배지를 나타내며, 이는 전파의 기본 효율이 된다.
항체의 상승작용을 테스트하기 위하여, 표시된 농도 범위에 걸쳐 희석된 개별 항체의 환경에서 전파 효과가 결정되었고, 또는 항체는 등몰로 혼합되고, 동일한 범위에서 적정되었다. 일부 쌍은 강력한 상승작용이 있었고 (가령 HJ9.3/9.4), 다른 일부는 서로 간섭되었다 (HJ8.5/9.1) (도 48).
tau 응집 취입에서 항체 효과는 유동 세포분석에 의해 또한 측정될 수 있다. 형광 염료에 의해 화학적으로 라벨된 재조합 RD 원섬유에 세포들이 노출되었다. 트립신처리화 및 분산 후, 흐름 세포측정기(flow cytometer)를 이용하여 세포의 수를 헤아렸다. HJ9.3 용량-의존적으로 형광에 의해 라벨된 세포들의 수를 감소시키는데, 이는응집 취입의 저해를 나타낸다 (도 50).
SEQUENCE LISTING <110> WASHINGTON UNIVERSITY David, HOLTZMAN M. JIANG, Hong KFOURY, Najla HOLMES, Brandon Marc, DIAMOND <120> ANTIBODIES TO TAU <130> 047563-458812 <150> US 61/667,515 <151> 2012-07-03 <150> US 61/694,989 <151> 2012-08-30 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 1 Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His Gln Asp 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 2 Lys Thr Asp His Gly Ala Glu 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYTHENSIZED <400> 3 Pro Arg His Leu Ser Asn Val 1 5 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 4 Glu Pro Arg Gln 1 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 5 Ala Ala Gly His Val 1 5 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 6 Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly 1 5 10 15 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 7 Glu Phe Glu Val Met Glu Asp 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 8 Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 9 Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His 1 5 10 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 10 Thr Asp His Gly Ala Glu 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 11 Lys Thr Asp His Gly Ala 1 5 <210> 12 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 12 gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctgggaca gagggccacc 60 atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acatctagat atagttatat acactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctctggagg aggaggatgc tgcaacatat tactgtcacc acagttggga gattccgctc 300 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa 333 <210> 13 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 13 gaagtgaagg ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60 tcctgtgttg tctctggatt cactttcagt aactactggg tgaactgggt ccgccagtct 120 ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctcaa attagattga aatctgataa ttatgcaaca 180 cattatgagg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 240 gtctatctgc aaatgaacaa cctaagggct gaagacagtg gaatttatta ctgcactaac 300 tgggaagact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345 <210> 14 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 14 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Arg Tyr Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Leu Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Ser Trp 85 90 95 Glu Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 15 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 15 Glu Val Lys Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Glu Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Ser Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Asn Trp Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 16 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Arg Tyr Ser Tyr Ile His 1 5 10 15 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 17 Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 18 His His Ser Trp Glu Ile Pro Leu Thr 1 5 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 19 Asn Tyr Trp Val Asn 1 5 <210> 20 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 20 Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Glu Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 21 Trp Glu Asp Tyr 1

Claims (17)

  1. tau에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 및 서열 번호: 8로 구성된 집단에서 선택된 아미노산 서열 안의 에피토프를 인지하는 단리된 항체.
  2. 청구항 1에 있어서, 이때 항체는 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15로 구성된 집단에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  3. 청구항 1에 있어서, 이때 항체는 서열 번호: 12와 서열 번호: 13으로 구성된 집단에서 선택된 핵산 서열에 의해 인코드된, 단리된 항체.
  4. tau에 특이적으로 결합하고, 0 내지 2개의 아미노산 치환을 가진, 서열 번호:18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는, 단리된 항체.
  5. tau에 특이적으로 결합하고, 0 내지 2개의 아미노산 치환을 가진, 서열 번호:21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는, 단리된 항체.
  6. 전술한 임의의 한 항에 있어서, 이때 항체는 단일 쇄 항체, 항체 단편, 키메라 항체, 또는 인간화된 항체로 구성된 집단에서 선택되는, 단리된 항체.
  7. 전술한 임의의 한 항에 있어서 이때 항체는 세포의 tau 응집 분석에서 tau 씨딩 활성을 특이적으로 차단할 수 있는, 단리된 항체.
  8. 대상의 뇌에서 tau 응집 확산을 감소시키는 방법에 있어서, 상기 방법은 약학적으로 효과적인 양의 항-tau 항체를 상기 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 이때 항-tau 항체는 전술한 어느 한 항에 따른 단리된 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 이때 상기 방법은 대상에서 최소한 한 개의 tau 응집과 연합된 증상을 개선시키는 것을 더 포함하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 이때 최소한 한 개의 tau 응집과 연합된 증상은 tau 병리학, 손상된 인지 기능, 변형된 거동, 비정상적인 언어 기능, 감정 조절장애, 발작, 손상된 신경계 구조 또는 기능, 그리고 알츠하이머 질환 발생 위험 증가로 구성된 집단에서 선택되는, 방법.
  11. 청구항 8에 있어서, 이때 투여는 효과적인 전신 경로 투여를 포함하는, 방법.
  12. 청구항 8에 있어서, 이때 투여는 중추 신경계에 직접 투여가 포함된 효과적인 국소 경로 투여를 포함하는, 방법.
  13. 전술한 청구항 1-7중 임의의 한 항에 따른 최소한 2개의 단리된 항체가 포함된 면역분석.
  14. 청구항 13에 있어서, 이때 면역분석은 최소한 2개의 포획 항체와 탐지 항체를 포함하고, 이때 각 포획 항체는 서로 구별되는 tau 에피토프를 인지하는 단리된 항-tau 항체인, 면역분석.
  15. 청구항 14에 있어서, 이때 제 1 포획 항체는 tau에 특이적으로 결합하여 서열 번호:7안에 있는 에피토프를 인지하는 단리된 항체이며, 제 2 포획 항체는 tau에 특이적으로 결합하고, 그리고 서열 번호:8 안에 있는 에피토프를 인지하는 단리된 항체이며, 그리고 탐지 항체는 tau에 특이적으로 결합하여 서열 번호: 8 안에 있는 에피토프를 인지하는 단리된 항체인, 면역분석.
  16. 대상으로부터 획득한 생물학적 유체의 시료 안에 tau 응집 양을 측정하는 방법에 있어서, 상기 방법은 청구항 13-15중 임의의 한 항에 따른 면역분석을 이용하여 tau 응집을 측정하는 것을 포함하는 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 이때 tau 응집은 단리된 항-tau 항체를 이용하여 시료로부터 면역침전되며, 그 다음 면역침전된 tau 응집이 측정되는, 방법.
KR1020207002242A 2012-07-03 2013-07-03 Tau에 대한 항체 KR20200013072A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020207033554A KR102494798B1 (ko) 2012-07-03 2013-07-03 Tau에 대한 항체

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261667515P 2012-07-03 2012-07-03
US61/667,515 2012-07-03
US201261694989P 2012-08-30 2012-08-30
US61/694,989 2012-08-30
PCT/US2013/049333 WO2014008404A1 (en) 2012-07-03 2013-07-03 Antibodies to tau

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR20157002867A Division KR20150036346A (ko) 2012-07-03 2013-07-03 Tau에 대한 항체

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207033554A Division KR102494798B1 (ko) 2012-07-03 2013-07-03 Tau에 대한 항체

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200013072A true KR20200013072A (ko) 2020-02-05

Family

ID=49882495

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207002242A KR20200013072A (ko) 2012-07-03 2013-07-03 Tau에 대한 항체
KR1020207033554A KR102494798B1 (ko) 2012-07-03 2013-07-03 Tau에 대한 항체
KR20157002867A KR20150036346A (ko) 2012-07-03 2013-07-03 Tau에 대한 항체

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207033554A KR102494798B1 (ko) 2012-07-03 2013-07-03 Tau에 대한 항체
KR20157002867A KR20150036346A (ko) 2012-07-03 2013-07-03 Tau에 대한 항체

Country Status (17)

Country Link
US (2) US9834596B2 (ko)
EP (2) EP2870176A4 (ko)
JP (3) JP6345655B2 (ko)
KR (3) KR20200013072A (ko)
CN (2) CN104781278B (ko)
AU (3) AU2013286680B2 (ko)
BR (1) BR112014033116B1 (ko)
CA (1) CA2877397A1 (ko)
HK (1) HK1209768A1 (ko)
IL (3) IL236409B (ko)
IN (1) IN2015KN00007A (ko)
MX (2) MX359555B (ko)
MY (1) MY171473A (ko)
NZ (2) NZ739622A (ko)
RU (2) RU2018132044A (ko)
SG (3) SG10201913370PA (ko)
WO (1) WO2014008404A1 (ko)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2018132044A (ru) 2012-07-03 2018-10-19 Вашингтон Юниверсити Антитела против тау
BR112015003326A2 (pt) * 2012-08-16 2017-07-04 Ipierian Inc métodos de tratamento de uma tauopatia
US8980270B2 (en) 2013-01-18 2015-03-17 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
PE20152004A1 (es) * 2013-03-13 2016-02-07 Prothena Biosciences Ltd Inmunoterapia tau
JP2017512751A (ja) 2014-02-14 2017-05-25 アイピエリアン，インコーポレイティド タウペプチド、抗タウ抗体、およびそれらの使用方法
WO2015165961A1 (en) 2014-04-29 2015-11-05 Affiris Ag Treatment and prevention of alzheimer's disease (ad)
EP3486256A3 (en) * 2014-06-26 2019-08-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Antibodies and antigen-binding fragments that specifically bind to microtubule-associated protein tau
ZA201608812B (en) 2014-06-26 2019-08-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Antibodies and antigen-binding fragments that specifically bind to microtubule-associated protein tau
TWI734975B (zh) * 2014-06-27 2021-08-01 美商Ｃ２Ｎ醫療診斷有限責任公司 人類化抗-tau抗體
US10830775B2 (en) 2014-09-30 2020-11-10 Washington University Tau kinetic measurements
MA41451A (fr) * 2015-02-04 2017-12-12 Univ Washington Constructions anti-tau
TWI669314B (zh) 2015-02-26 2019-08-21 美國禮來大藥廠 針對ｔａｕ之抗體及其用途
TWI790642B (zh) 2015-06-05 2023-01-21 美商建南德克公司 抗-tau抗體及使用方法
NZ738058A (en) * 2015-07-06 2021-07-30 UCB Biopharma SRL Tau-binding antibodies
CN107849105B (zh) 2015-07-06 2021-09-17 Ucb生物制药有限责任公司 Tau结合抗体
GB201512203D0 (en) 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
JO3711B1 (ar) 2015-07-13 2021-01-31 H Lundbeck As أجسام مضادة محددة لبروتين تاو وطرق استعمالها
EP3334761B1 (en) * 2015-08-13 2023-07-19 New York University Antibody-based molecules selective for the {p}ser404 epitope of tau and their uses in the diagnosis and treatment of tauopathy
CN109580954B (zh) * 2015-09-16 2022-03-22 北京九强生物技术股份有限公司 一种人肌钙蛋白i的超敏定量测定试剂盒及其检测方法
CU24537B1 (es) 2016-05-02 2021-07-02 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos monoclonales que compiten por unirse a tau humano con el anticuerpo 3d6
PE20190208A1 (es) 2016-05-02 2019-02-07 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau
KR102506091B1 (ko) 2016-05-02 2023-03-07 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 타우 면역요법
TN2018000419A1 (en) 2016-07-12 2020-06-15 H Lundbeck As Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof.
EP3496750A2 (en) 2016-08-09 2019-06-19 Eli Lilly and Company Combination therapy
MA46836A (fr) 2016-11-15 2019-09-25 H Lundbeck As Agents, utilisations et procédés pour le traitement d'une synucléinopathie
CN110248959B (zh) 2016-12-07 2023-06-30 基因泰克公司 抗tau抗体和使用方法
KR20230146126A (ko) 2016-12-07 2023-10-18 제넨테크, 인크. 항-타우 항체 및 이의 이용 방법
CN106749658B (zh) * 2016-12-15 2019-11-12 北京师范大学 抑制Tau蛋白聚集的抗体型分子伴侣
WO2018109058A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 H. Lundbeck A/S Agents, uses and methods
US10364286B2 (en) * 2016-12-22 2019-07-30 H. Lundbeck A/S Monoclonal anti-alpha-synuclein antibodies for preventing tau aggregation
CN110520440A (zh) 2017-02-17 2019-11-29 戴纳立制药公司 抗τ抗体及其使用方法
CA3055957A1 (en) * 2017-03-09 2018-09-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Treatment of pediatric brain tumors with targeting of cd47 pathway
AU2018263935A1 (en) 2017-05-02 2019-12-19 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
TW202340244A (zh) * 2017-10-16 2023-10-16 日商衛材R&D企管股份有限公司 抗tau抗體及其用途
JP2021519268A (ja) 2018-03-23 2021-08-10 アッヴィ・ドイチュラント・ゲー・エム・ベー・ハー・ウント・コー・カー・ゲー 安定な水性抗タウ抗体製剤
US11629175B2 (en) 2018-04-27 2023-04-18 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Method for preparing PHFS-like Tau aggregates
CA3107788A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Eli Lilly And Company Combination of anti-tau antibody and oga inhibitor for treatment of diseases characterized by aberrant tau aggregation
CN109613242A (zh) * 2018-11-01 2019-04-12 深圳天辰医疗科技有限公司 一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒及其制备方法
JP2022524588A (ja) 2019-03-03 2022-05-09 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド タウ認識抗体
AU2020241856A1 (en) 2019-03-18 2021-08-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. CRISPR/Cas dropout screening platform to reveal genetic vulnerabilities associated with tau aggregation
AU2020241858A1 (en) * 2019-03-18 2021-08-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. CRISPR/Cas screening platform to identify genetic modifiers of tau seeding or aggregation
CN110055280A (zh) * 2019-03-19 2019-07-26 深圳大学 一种稳定表达mCherry-tau的细胞系及其构建方法与应用
EP4001305A4 (en) * 2019-07-15 2022-10-12 Adel Inc. ANTI-TAU ANTIBODIES AND ITS USE
JP2022551478A (ja) 2019-10-09 2022-12-09 ブルーロック セラピューティクス エルピー 持続的トランスジーン発現を伴う細胞
AU2020394842A1 (en) * 2019-12-04 2022-06-30 Ac Immune Sa Novel molecules for therapy and diagnosis
US20220145363A1 (en) * 2020-11-09 2022-05-12 Meso Scale Technologies, Llc. Methods and kits for detecting tau
US20240101654A1 (en) 2020-12-29 2024-03-28 Neurimmune Ag Human anti-tau antibodies
CA3214310A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Rupesh Nanjunda Anti-tau antibodies and uses thereof
BR112023019205A2 (pt) 2021-03-26 2023-10-24 Janssen Biotech Inc Anticorpos humanizados contra tau de filamento helicoidal pareado e usos dos mesmos

Family Cites Families (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK546988A (da) 1987-10-02 1989-04-03 Du Pont Immunobestemmelse og reagenssaet til anvendesle herved
EP0600951A4 (en) 1991-08-01 1996-10-30 Paul H Voorheis Diagnostic method for alzheimer's disease.
US5733734A (en) 1991-08-14 1998-03-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of screening for Alzheimer's disease or disease associated with the accumulation of paired helical filaments
JP3909084B2 (ja) 1991-10-25 2007-04-25 エヌ・ブイ・インノジェネティクス・ソシエテ・アノニム 微小管結合タンパク質タウに対するモノクローナル抗体
CA2125298A1 (en) 1991-12-06 1993-06-10 Eva-Maria Mandelkow Tools for the diagnosis and treatment of alzheimer's disease
US7408027B1 (en) 1991-12-06 2008-08-05 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenchaften Tools for the diagnosis and treatment of Alzheimer's disease
JPH06239899A (ja) 1993-02-12 1994-08-30 Teijin Ltd ヒトタウ蛋白に対する抗体、並びに該抗体を利用する体液中のヒトタウ蛋白の測定方法
JPH10506381A (ja) 1994-07-29 1998-06-23 イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ 特定のサブクラスまたは形態のホスホリレーションされたｔａｕのエピトープに特異的なモノクローナル抗体、それらを分泌するハイブリドーマ、これらの抗体の抗原認識およびそれらの応用
WO1997034145A1 (fr) 1996-03-13 1997-09-18 Mitsubishi Chemical Corporation Anticorps a proteine tau antiphosphorylee et procede de detection de la maladie d'alzheimer l'utilisant
WO1998022120A1 (en) 1996-11-19 1998-05-28 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Diagnostic and therapeutic reagents for alzheimer's disease
US6797478B1 (en) 1998-03-05 2004-09-28 University Of Cincinnati Method of detecting axonal damage, from associated disease states using tau monoclonal antibodies
RU2238947C2 (ru) * 1998-07-14 2004-10-27 Янссен Фармацевтика Н.В. Нейротрофический фактор роста человека (эновин), кодирующая его выделенная молекула нуклеиновой кислоты, вектор (варианты), фармацевтическая композиция (варианты), антитело, способ обнаружения фактора роста, набор, способ идентификации агониста или антагониста (варианты)
ES2229817T3 (es) 1998-09-08 2005-04-16 Innogenetics N.V. Uso de la tau como un marcador para la deteccion temprana del daño del sistema nervioso central (cns).
US6495376B1 (en) * 1999-02-18 2002-12-17 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods and compositions for regulating protein-protein interactions
US6589746B1 (en) 1999-10-21 2003-07-08 University Of Cincinnati Method of detecting axonally-derived protein tau in patients with traumatic CNS injury
US20020182660A1 (en) 2000-02-18 2002-12-05 Fong Kei-Lai L. N- and C-terminus specific immunoassays for full length beta-amyloid peptide-Abeta(1-40), Abeta(1-39), Abeta(1-40), Abeta(1-42) , and Abeta(1-43)
AT500379B8 (de) 2001-02-02 2009-08-15 Axon Neuroscience Tau-proteine
AR035119A1 (es) 2001-08-16 2004-04-14 Lilly Co Eli Anticuerpos humanos antagonistas anti-htnfsf13b
EP3960855A1 (en) 2001-12-28 2022-03-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for stabilizing proteins
LT1507556T (lt) 2002-05-02 2016-10-10 Wyeth Holdings Llc Kalicheamicino darinio ir nešiklio konjugatai
GB0210121D0 (en) 2002-05-02 2002-06-12 Celltech R&D Ltd Biological products
US8288608B2 (en) 2002-07-12 2012-10-16 Axon Neuroscience Se Transgenic animal expressing alzheimer's tau protein
JP4393382B2 (ja) 2002-08-14 2010-01-06 三菱化学株式会社 中枢性タウ蛋白質特異的抗体
FI20030652A0 (fi) 2003-04-30 2003-04-30 Susann Eriksson Parannettu immunomääritys
CN1871259A (zh) 2003-08-22 2006-11-29 比奥根艾迪克Ma公司 具有改变的效应物功能的经改进的抗体和制备它的方法
US7238788B2 (en) 2004-02-18 2007-07-03 University Of Iowa Foundation Antibodies to phosphorylated tau, methods of making and methods of use
KR20100087403A (ko) 2005-02-19 2010-08-04 주식회사 피플바이오 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머로부터 멀티머를 분별 검출하는 방법
WO2007019273A2 (en) 2005-08-04 2007-02-15 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Phosphorylation of tau by abl
ES2321996B1 (es) 2006-01-26 2010-03-05 Consejo Superior Investig. Cientificas Uso de compuestos que se unen al dominio de union a microtubulos de tau en la elaboracion de composiciones farmaceuticas, dichas composiciones farmaceuticas y su aplicacion en el tratamiento de tauopatias.
US8012936B2 (en) 2006-03-29 2011-09-06 New York University Tau fragments for immunotherapy
US20080220449A1 (en) 2007-02-08 2008-09-11 Oligomerix, Inc. Biomarkers and assays for Alzheimer's disease
ES2501565T3 (es) 2008-04-24 2014-10-02 Bristol-Myers Squibb Company Uso de epotilona D en el tratamiento de enfermedades asociadas a Tau incluyendo enfermedad de Alzheimer
CN101307108B (zh) 2008-06-25 2012-04-04 南京川博生物技术有限公司 抗磷酸化Tau蛋白抗体及其在AD症异常磷酸化Tau蛋白水平测定上的用途
CA2937492C (en) * 2008-11-11 2019-08-13 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Inhibition of mammalian target of rapamycin
US9605054B2 (en) 2009-02-23 2017-03-28 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Composition and method for treating a tauopathy
US20110305706A1 (en) 2009-02-23 2011-12-15 Scott Thomas Brady Compositions and Methods for Treating a Disease Mediated by Soluble Oligomeric Amyloid Beta
UA107571C2 (xx) 2009-04-03 2015-01-26 Фармацевтична композиція
US8409584B2 (en) 2009-05-05 2013-04-02 New York University Immunotherapy targeting of the shared abnormal conformational state of amyloidogenic peptides/proteins
CA2765099A1 (en) 2009-06-10 2010-12-16 New York University Phosphorylated tau peptide for use in the treatment of tauopathy
CN102596236B (zh) * 2009-07-30 2015-06-24 辉瑞疫苗有限责任公司 抗原性Tau肽及其用途
JP6124591B2 (ja) 2009-08-28 2017-05-10 ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム タウオリゴマーに結合する抗体
JP5909447B2 (ja) * 2009-09-14 2016-04-26 バンヤン・バイオマーカーズ・インコーポレーテッド ニューロン損傷診断のためのマイクロｒｎａ、自己抗体およびタンパク質マーカー
US8648044B2 (en) 2009-09-24 2014-02-11 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) FKBP52-tau interaction as a novel therapeutical target for treating the neurological disorders involving tau dysfunction
WO2011109112A2 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Method of detecting tau protein and tau fragments in serum
CN103502272B (zh) * 2010-10-07 2016-06-15 Ac免疫有限公司 识别Tau的磷酸化特异抗体
AU2013205313B2 (en) 2010-10-07 2016-05-19 Ac Immune S.A. Phosphospecific antibodies recognising tau
SI2627672T1 (sl) 2010-10-11 2018-10-30 Biogen International Neuroscience Gmbh Človeška protitelesa anti-tau
CA2826286C (en) 2011-01-31 2021-09-21 Intellect Neurosciences Inc. Treatment of tauopathies
US8697076B2 (en) 2011-04-27 2014-04-15 Northwestern University Antibodies selective for pathological tau dimers and prefibrillar pathological tau oligomers and their uses in treatment, diagnosis and monitoring of tauopathies
US20120321594A1 (en) 2011-05-06 2012-12-20 New York University Methods of controlling axon or dendrite development of neuronal cells
JP6457263B2 (ja) 2011-05-20 2019-01-23 オリゴメリックス インコーポレイテッド タウプロテアーゼ組成物および使用方法
GB201111361D0 (en) * 2011-07-04 2011-08-17 Nordic Bioscience As Biochemical markers for neurodegenerative conditions
GB201112056D0 (en) 2011-07-14 2011-08-31 Univ Leuven Kath Antibodies
US9926353B2 (en) 2011-07-19 2018-03-27 New York University Immunotherapeutic modulation of amyloidogenic disease using non-fibrillogenic, non-amyloidogenic polymerized proteins and peptides
AU2012311234B2 (en) 2011-09-19 2017-09-28 Axon Neuroscience Se Protein-based therapy and diagnosis of tau-mediated pathology in Alzheimer's disease
EP3135689B1 (en) 2011-10-07 2018-12-19 AC Immune S.A. Phosphospecific antibodies recognising tau
WO2013063086A1 (en) 2011-10-24 2013-05-02 Intellect Neurosciences, Inc. Compositions and methods for treatment of proteinopathies
MY186066A (en) 2011-12-20 2021-06-18 Janssen Biotech Inc Anti-phf-tau antibodies and their uses
RU2644242C2 (ru) 2012-04-05 2018-02-08 Ац Иммуне С.А. Гуманизированное тау-антитело
WO2013177104A2 (en) 2012-05-21 2013-11-28 Felder Mitchell S Treatment for tauopathies
US20150183854A1 (en) 2012-05-31 2015-07-02 Teijin Pharma Limited Therapeutic agent or prophylactic agent for dementia
RU2018132044A (ru) 2012-07-03 2018-10-19 Вашингтон Юниверсити Антитела против тау
BR112015003326A2 (pt) 2012-08-16 2017-07-04 Ipierian Inc métodos de tratamento de uma tauopatia
CA2885924C (en) 2012-08-21 2022-12-13 Institute For Molecular Medicine, Inc. Compositions and methods related to diseases associated with deposits of amyloid, tau, and alpha-synuclein
US20140056901A1 (en) 2012-08-21 2014-02-27 The Institute For Molecular Medicine Anti-tau antibodies and compositions for and methods of making and using in treatment, diagnosis and monitoring of tauopathies
CA2887933A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Arizona Board Of Agents, On Behalf Of Arizona State University Antibody based reagents that specifically recognize toxic oligomeric forms of tau
US9910048B2 (en) 2012-12-03 2018-03-06 Washington University Method for detection of aggregates in biological samples
US8921150B2 (en) 2012-12-06 2014-12-30 Taiwan Semiconductor Manufacturing Co., Ltd. Process to achieve contact protrusion for single damascene via
US9200068B2 (en) 2012-12-18 2015-12-01 Regents Of The University Of Minnesota Compositions and methods related to tauopathy
WO2014096321A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antibodies specific to tau phosphorylated at serine 422 and uses for the treatment and diagnosis of tauopathies
PT2935326T (pt) 2012-12-21 2020-09-14 Biogen Ma Inc Anticorpos anti-tau humanos
US8980270B2 (en) 2013-01-18 2015-03-17 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
PE20152004A1 (es) 2013-03-13 2016-02-07 Prothena Biosciences Ltd Inmunoterapia tau
WO2014159244A2 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Merck Patent Gmbh O-GlcNAc TAU ANTIBODY AND USE THEREOF
US9598485B2 (en) 2013-03-15 2017-03-21 Ac Immune S.A. Anti-tau antibodies and methods of use
US9688747B2 (en) 2013-03-15 2017-06-27 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods and compositions for the generation and use of conformation-specific antibodies
TWI734975B (zh) 2014-06-27 2021-08-01 美商Ｃ２Ｎ醫療診斷有限責任公司 人類化抗-tau抗體

Also Published As

Publication number Publication date
CN104781278A (zh) 2015-07-15
NZ739622A (en) 2020-01-31
EP2870176A4 (en) 2016-09-28
MX2014016024A (es) 2015-04-13
RU2668159C2 (ru) 2018-09-26
KR102494798B1 (ko) 2023-02-06
AU2013286680B2 (en) 2018-07-05
HK1209768A1 (en) 2016-04-08
MX2022000026A (es) 2022-03-22
IN2015KN00007A (ko) 2015-07-31
KR20200134339A (ko) 2020-12-01
AU2020223765A1 (en) 2020-09-17
JP2015530971A (ja) 2015-10-29
RU2015103228A (ru) 2016-08-20
EP2870176A1 (en) 2015-05-13
RU2015103228A3 (ko) 2018-03-05
JP6345655B2 (ja) 2018-06-20
CN108623682A (zh) 2018-10-09
IL236409B (en) 2020-10-29
IL236409A0 (en) 2015-02-26
CA2877397A1 (en) 2014-01-09
IL289241A (en) 2022-02-01
BR112014033116B1 (pt) 2021-12-21
SG10201708959WA (en) 2017-11-29
EP3838921A3 (en) 2021-09-01
US9834596B2 (en) 2017-12-05
EP3838921A2 (en) 2021-06-23
US20150183855A1 (en) 2015-07-02
CN104781278B (zh) 2018-06-12
SG11201408626YA (en) 2015-03-30
RU2018132044A (ru) 2018-10-19
MX359555B (es) 2018-10-02
JP2020125310A (ja) 2020-08-20
BR112014033116A2 (pt) 2018-03-06
KR20150036346A (ko) 2015-04-07
JP2018184398A (ja) 2018-11-22
NZ703423A (en) 2018-02-23
AU2013286680A1 (en) 2015-01-22
AU2018229564A1 (en) 2018-10-04
MY171473A (en) 2019-10-15
US20180037641A1 (en) 2018-02-08
SG10201913370PA (en) 2020-03-30
WO2014008404A1 (en) 2014-01-09
IL277643A (en) 2020-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102494798B1 (ko) Tau에 대한 항체
Schofield et al. Preclinical development of a high affinity α-synuclein antibody, MEDI1341, that can enter the brain, sequester extracellular α-synuclein and attenuate α-synuclein spreading in vivo
RU2555526C2 (ru) Антитела, связывающиеся с протофибриллами, и их применение в методах терапии и диагностики болезни паркинсона, деменции, ассоциированной с образованием диффузных телец леви, и других альфа-синуклеинопатий
US9090680B2 (en) Antibodies that specifically bind to abeta oligomers and uses thereof
CN106574258B (zh) 抗-运甲状腺素蛋白人源化抗体
US20200181250A1 (en) Anti-transthyretin human antibody
JP2020511963A (ja) ヒトアルファ−シヌクレインに対する抗体
US9085614B2 (en) Antibodies that specifically bind to Aβ oligomers and uses thereof
WO2023143425A1 (zh) 改善认知障碍的方法
JP2022506947A (ja) 患者由来アミロイド異種移植非ヒト動物モデル
KR20230039734A (ko) 항-Aβ 항체
US20230365665A1 (en) ANTIBODY COMPOSITIONS TARGETING NON-PHOSPHORYLATED a-SYNUCLEIN AGGREGATES
US20240034775A1 (en) Compositions and methods for treating epilepsy
EP4249509A1 (en) Anti-netrin-1 antibody against arthritis-associated pain
Jiang et al. Single-Domain Antibody-Based Protein Degrader for Synucleinopathies
WO2022060236A1 (en) ANTIBODY COMPOSITIONS TARGETING NON-PHOSPHORYLATED α-SYNUCLEIN AGGREGATES
US20130217045A1 (en) Use of Functional Autoantibodies in Alzheimer Disease

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application