CN109563482A - 含表达异于分泌免疫球蛋白和细胞溶解功能的膜免疫球蛋白的b淋巴细胞系的组合物和方法 - Google Patents

含表达异于分泌免疫球蛋白和细胞溶解功能的膜免疫球蛋白的b淋巴细胞系的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本文公开了用于在分离的细胞毒性B淋巴细胞系中产生一种或多种免疫球蛋白的组合物和方法。分离的细胞系包含分离的B淋巴细胞系，其能够表达对第一抗原具有反应性的至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白和对第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白，并且还能够表达传导信号以表达细胞毒性效应分子的至少一种外源掺入的重组B细胞受体。

Description

含表达异于分泌免疫球蛋白和细胞溶解功能的膜免疫球蛋白 的B淋巴细胞系的组合物和方法
优先权申请的所有主题在这些主题不与本文不一致的情况下通过引用并入本文。
发明内容
本文公开了用于在重组B淋巴细胞系中产生免疫球蛋白的组合物和方法。本文公开了用于用免疫治疗产品治疗脊椎动物受试者的疾病的组合物和方法。所述免疫治疗产品可包括产生一种或多种抗体的重组B淋巴细胞系。所述免疫治疗产品可包括重组B淋巴细胞系，其是特殊的抗原呈递细胞。
本文公开了用于在分离的B淋巴细胞系中产生一种或多种免疫球蛋白的组合物和方法。本文公开了用于在分离的B淋巴细胞系中产生一种或多种免疫球蛋白的组合物和方法，其在分离的B淋巴细胞系中通过膜免疫球蛋白指导细胞信号传导。脊椎动物受试者中的免疫细胞疗法可以包括向脊椎动物受试者施用分离的B淋巴细胞系，其合成各自具有不同的靶抗原的分泌型免疫球蛋白和膜免疫球蛋白。脊椎动物受试者中的免疫细胞疗法可包括向脊椎动物施用包含分离的B淋巴细胞系的抗原呈递细胞，其指导抗原内化和加工以产生特异性抗原呈递细胞。所述分离的B淋巴细胞系可产生抗原呈递细胞，其在捕获、内化和呈递由内源或外源衍生的膜免疫球蛋白识别的抗原方面是特殊的或优越的。本文公开了用于用免疫治疗产品治疗脊椎动物受试者的疾病的组合物和方法。所述免疫治疗产品可包括具有对第一抗原具有反应性的内源衍生或外源衍生的膜免疫球蛋白的分离的B淋巴细胞系，其中分离的B淋巴细胞系产生一种或多种对第二抗原具有反应性的分泌型免疫球蛋白。所述免疫治疗产品可包括分离的B淋巴细胞系，该分离的B淋巴细胞系可以是产生一种或多种分泌型免疫球蛋白的单克隆B淋巴细胞系或多克隆B淋巴细胞系。所述免疫治疗产品可包括产生一种或多种分泌抗体(例如识别相同抗原上不同表位的抗体)的分离的B淋巴细胞系。所述免疫治疗产品可包括作为一种或多种抗原呈递细胞的分离的B淋巴细胞系。
分离的B淋巴细胞系可包括施用于脊椎动物受体的免疫治疗产品，以在脊椎动物受试者中发展长寿命的分离的B淋巴细胞，用于慢性疾病的免疫监视。所述免疫治疗产品可以包括具有内源衍生的或外源衍生的膜免疫球蛋白的分离的B淋巴细胞系，其可以施用于脊椎动物受试者以向脊椎动物受试者提供抗原呈递细胞。
如本文所述的分离的细胞系可包含：分离的B淋巴细胞系，其能够表达对第一抗原具有反应性的至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白和对第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白。所述分离的B淋巴细胞系能够表达对所述第二抗原具有反应性的至少一种内源膜免疫球蛋白的所述分离的B淋巴细胞系。所述至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白可包含一种或多种外源掺入的膜免疫球蛋白多肽。所述至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白可包含编码所述至少一种膜免疫球蛋白的至少一种外源掺入的核酸，其中所述细胞系能够表达所述至少一种膜免疫球蛋白。所述至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白包含编码所述至少一种膜免疫球蛋白的至少两种外源掺入的核酸。所述至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白可包含编码两种重链(H)免疫球蛋白和两种轻链(L)免疫球蛋白的核酸。所述至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白可包含编码一种重链(H)免疫球蛋白和一种轻链(L)免疫球蛋白的核酸。所述至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白可包含编码一种单链Fv免疫球蛋白的核酸。编码所述至少一种膜免疫球蛋白的所述外源掺入的核酸可存在于所述分离的B淋巴细胞系中的一个或多个染色体基因座中。所述分离的B淋巴细胞系能够破坏对所述第二抗原具有反应性的所述内源膜免疫球蛋白的表达。编码所述至少一种膜免疫球蛋白的至少两种外源掺入的核酸可以存在于分离的B淋巴细胞系中的Ig H链和Ig L链染色体基因座中。编码所述至少一种膜免疫球蛋白的至少一种外源掺入的核酸可以存在于分离的B淋巴细胞系中的一个或多个非Ig L或非Ig H染色体基因座中。编码所述至少一种膜免疫球蛋白的至少一种外源掺入的核酸可以存在于分离的B淋巴细胞系中的染色体外复制遗传元件中。编码所述至少一种膜免疫球蛋白的至少一种外源掺入的核酸可以源自B淋巴细胞系。由第一抗原活化的至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白能够控制对所述第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白的表达。所述分离的B淋巴细胞系可包含幼稚B淋巴细胞、未成熟B淋巴细胞、过渡B淋巴细胞、成熟B淋巴细胞、滤泡B淋巴细胞、记忆B淋巴细胞、浆母细胞或血浆细胞中的至少一种。分离的B淋巴细胞系可包含B淋巴细胞的多克隆群。分离的B淋巴细胞系可包含B淋巴细胞的单克隆群。所述膜免疫球蛋白可包含膜锚、细胞质结构域和细胞外配体结合结构域中的至少一种。
本发明描述的一种分离的重组细胞系可以包含：分离的B淋巴细胞系，其能够表达对第一抗原具有反应性的至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白和编码对第二抗原具有反应性的分泌型免疫球蛋白的至少一种外源掺入的核酸。所述分离的B淋巴细胞系能够表达编码对所述第二抗原具有反应性的膜免疫球蛋白的至少一种外源掺入的核酸的所述分离的B淋巴细胞系。所述分离的B淋巴细胞系能够表达编码对第三种抗原具有反应性的分泌型免疫球蛋白的至少一种外源掺入的核酸。所述第二抗原和所述第三抗原可以是单一抗原多肽的不同表位。所述至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白可包含至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白多肽。所述至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白可包含编码至少一种膜免疫球蛋白多肽的至少一种外源掺入的核酸，其中所述细胞系能够表达所述至少一种膜免疫球蛋白多肽。所述编码所述至少一种膜免疫球蛋白的所述至少一种外源掺入的核酸可存在于所述分离的B淋巴细胞系中的一个或多个染色体基因座中。所述编码所述至少一种膜免疫球蛋白的至少两种外源掺入的核酸存在于所述分离的B淋巴细胞系中的Ig H链和Ig L链染色体基因座中。所述编码所述至少一种膜免疫球蛋白的所述至少一种外源掺入的核酸可存在于所述分离的B淋巴细胞系中的一个或多个非Ig L染色体基因座或非Ig H染色体基因座中。所述编码所述至少一种膜免疫球蛋白的所述至少一种外源掺入的核酸可存在于所述分离的B淋巴细胞系中的染色体外复制遗传元件中。所述编码所述至少一种膜免疫球蛋白的所述核酸可源自B淋巴细胞系。由所述第一抗原活化的所述至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白能够控制对所述第二抗原具有反应性的所述至少一种外源掺入的分泌型免疫球蛋白的表达。所述分离的B淋巴细胞系可包含幼稚B淋巴细胞、未成熟B淋巴细胞、过渡B淋巴细胞、成熟B淋巴细胞、滤泡B淋巴细胞、记忆B淋巴细胞、浆母细胞或血浆细胞中的至少一种。所述分离的B淋巴细胞系可包含B淋巴细胞的多克隆群。所述分离的B淋巴细胞系可包含B淋巴细胞的单克隆群。所述膜免疫球蛋白可包含膜锚、细胞质结构域和细胞外配体结合结构域中的至少一种。
在一实施方案中，经修饰的B淋巴细胞包括用于表现细胞的细胞毒性的结构或功能特征。例如，在一实施方案中，经修饰的B淋巴细胞或细胞系产生一种或多种抗体，并且具有对靶抗原具有特异性的一种或多种B细胞受体(如本文所述的膜免疫球蛋白)，所述靶抗原例如肿瘤抗原(包括但不限于属于“正常”细胞抗原的突变形式的抗原，以及通过翻译后修饰而修饰的抗原，以及以异常方式或异常水平表达的抗原)。在一实施方案中，经修饰的B淋巴细胞或细胞系能够与体液免疫组分和细胞免疫组分一起产生完全免疫应答。因此，细胞毒性表达可包括分泌的一种或多种抗体。细胞毒性表达还可包括诱导死亡的直接的细胞与细胞接触(例如，通过裂解、坏死、细胞凋亡等)。各种实施方案的目标之一是通过本文所述的经修饰的B淋巴细胞提供高度特异性的、高效的靶细胞杀伤。在一实施方案中，靶细胞包括癌细胞(例如，肿瘤或其他癌细胞)。在一实施方案中，靶细胞包括与自身免疫疾病或感染有关的细胞。在一实施方案中，靶细胞包括对来自细胞、组织或器官移植的供体细胞(例如，移植物抗宿主病)具有反应性的供体或宿主细胞。在一实施方案中，靶细胞包括与病理性炎症或感染有关的细胞。
如本文所述的在分离的B淋巴细胞系中产生免疫球蛋白的方法可包括：从(例如通过感染)暴露于至少一种第二抗原免疫或用该至少一种第二抗原免疫的脊椎动物受试者中分离表达对该至少一种第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白的B淋巴细胞系；向该分离的B淋巴细胞系中引入对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白，以产生重组B淋巴细胞系；以及选择该分离的B淋巴细胞系，其表达对至少一种第一抗原具有反应性的膜免疫球蛋白，并表达对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白。权利要求所述的方法可以包括施用至少一种第一抗原以刺激重组B淋巴细胞系；并且评估在重组B淋巴细胞系中产生对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白。在该方法中，向该至少一种分离的重组B淋巴细胞系中引入对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白可包括引入对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白多肽。向至少一种分离的重组B淋巴细胞系中引入对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白可以包括引入编码对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种膜免疫球蛋白的至少一种外源核酸。该方法可以包括将重组B淋巴细胞系暴露于至少一种第一抗原以活化重组B淋巴细胞系以表达对至少一种第二抗原具有反应性的内源性分泌型免疫球蛋白。该方法可包括从重组B淋巴细胞系或从重组B淋巴细胞系的培养物中分离对至少一种第二抗原具有反应性的内源性分泌型免疫球蛋白。在该方法中，用第一抗原活化至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白能够控制至少一种外源掺入的核酸的表达，所述核酸编码对第二抗原具有反应性的至少一种分泌型免疫球蛋白。该分离的B淋巴细胞系可包含幼稚B淋巴细胞、未成熟B淋巴细胞、过渡B淋巴细胞、成熟B淋巴细胞、滤泡B淋巴细胞、记忆B淋巴细胞、浆母细胞或血浆细胞中的至少一种。该分离的B淋巴细胞系可包括至少一种记忆B淋巴细胞。
在一实施方案中，已经通过嵌合B细胞受体或重组B细胞受体修饰的分离的B淋巴细胞系包括在构建经修饰的B细胞受体中利用scFv片段。在一实施方案中，如本文所述，还可以构建转录因子(例如，在单独的载体上)以成为经修饰的B细胞系的一部分。
用于治疗患有疾病或病症(例如，自身免疫疾病、癌症或感染等)的受试者的方法包括施用治疗有效量的如本文所公开的分离的经修饰的B淋巴细胞系。已经认识到，可以利用免疫疗法和细胞疗法程序的标准方法确定给予受试者的治疗有效量的细胞。
用本文所述的免疫治疗产品治疗脊椎动物受试者的疾病的方法可包括：从(例如通过感染)暴露于至少一种第二抗原免疫或用该至少一种第二抗原免疫的脊椎动物受试者中分离表达对该至少一种第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白的B淋巴细胞系；向该分离的B淋巴细胞系中引入对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白，以产生重组B淋巴细胞系；以及选择该重组B淋巴细胞系，其表达对至少一种第一抗原具有反应性的膜免疫球蛋白，并表达对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白，该重组B淋巴细胞系用于施用给一种或多种脊椎动物受试者。该方法可包括施用至少一种第一抗原以刺激重组B淋巴细胞系；并且测试在重组B淋巴细胞系中存在对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白。该方法可包括给脊椎动物受试者施用包含分离的B淋巴细胞系的药物组合物；并对脊椎动物施用至少一种第一抗原以刺激分离的B淋巴细胞系以产生对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白。该方法可包括确认在脊椎动物受试者的血流中存在对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白。该方法可包括施用至少一种第一抗原以刺激重组B淋巴细胞系；测试对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白的存在；并且对脊椎动物受试者施用包含经刺激的重组B淋巴细胞系的药物组合物。重组B淋巴细胞系可以是一种或多种脊椎动物受试者中的一种的自体同源物。重组B淋巴细胞系可以与一种或多种脊椎动物受试者同种异体。
在如本文所述的分离的细胞系中产生至少一种免疫球蛋白的方法可以包括：向至少一种分离的B淋巴细胞系中引入对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白，以产生至少一种第一分离的B淋巴细胞系；选择表达对至少一种第一抗原具有反应性的膜免疫球蛋白的至少一种第一分离的B淋巴细胞系；将编码对至少一种第二抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白的至少一种外源核酸引入至少一种第一分离的B淋巴细胞系中，以产生至少一种分离的重组B淋巴细胞系；以及选择该至少一种分离的重组B淋巴细胞系，其表达对至少一种第二抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白。该方法可包括选择至少一种分离的重组B淋巴细胞系，其表达对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白。该方法可包括施用至少一种第一抗原以刺激至少一种分离的重组B淋巴细胞系；并测试在至少一种分离的重组B淋巴细胞系中存在对至少一种第二抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白。该方法可包括向至少一种第一分离的B淋巴细胞系中引入对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白。该方法可包括将编码对至少一种第三抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白的至少一种外源核酸序列引入至少一种分离的重组B淋巴细胞系中，以产生至少一种分离的第二重组B淋巴细胞系；并且选择至少一种分离的第二重组B淋巴细胞系，其表达对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种分泌型免疫球蛋白和对至少一种第三抗原具有反应性的至少一种分泌型免疫球蛋白。该方法可包括施用至少一种第一抗原以刺激至少一种分离的第二重组B淋巴细胞系；并且测试在重组B淋巴细胞系中存在对至少一种第三抗原具有反应性的至少一种外源性分泌型免疫球蛋白。在该方法中，向至少一种分离的B淋巴细胞系中引入对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白可包括引入对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白。向至少一种分离的B淋巴细胞系中引入对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白可以包括引入编码对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种膜免疫球蛋白的外源核酸。向至少一种第一分离的B淋巴细胞系中引入对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白可包括引入对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白多肽。向至少一种第一分离的B淋巴细胞系引入对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白可以包括引入编码对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种膜免疫球蛋白的至少一种外源核酸。该方法可包括将至少一种分离的重组B淋巴细胞系暴露于至少一种第一抗原，并测试至少一种分离的重组B淋巴细胞系的活化，以表达对至少一种第二抗原具有反应性的外源性分泌型免疫球蛋白。该方法可包括从至少一种分离的重组B淋巴细胞系或从至少一种分离的重组B淋巴细胞系的培养物中分离对至少一种第二抗原具有反应性的外源性分泌型免疫球蛋白。在该方法中，用第一抗原活化至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白能够控制至少一种外源掺入的核酸的表达，所述核酸编码对第二抗原具有反应性的至少一种分泌型免疫球蛋白。该至少一种分离的B淋巴细胞系可包含幼稚B淋巴细胞、未成熟B淋巴细胞、过渡B淋巴细胞、成熟B淋巴细胞、滤泡B淋巴细胞、记忆B淋巴细胞、浆母细胞或血浆细胞中的至少一种。该至少一种分离的B淋巴细胞系可包括至少一种记忆B淋巴细胞。
用本文所述的免疫治疗产品治疗脊椎动物受试者的疾病的方法可包括：向至少一种分离的B淋巴细胞系中引入对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白，以产生至少一种第一分离的B淋巴细胞系；选择表达对至少一种第一抗原具有反应性的膜免疫球蛋白的至少一种第一分离的B淋巴细胞系；将编码对至少一种第二抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白的至少一种外源核酸引入至少一种第一分离的B淋巴细胞系中，以产生至少一种分离的重组B淋巴细胞系；选择该至少一种分离的重组B淋巴细胞系，其表达对至少一种第二抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白，该至少一种分离的重组B淋巴细胞系用于施用给一种或多种脊椎动物受试者。该方法可包括选择至少一种分离的重组B淋巴细胞系，其表达对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白。该方法可包括施用至少一种第一抗原以刺激至少一种分离的重组B淋巴细胞系；并测试在至少一种分离的重组B淋巴细胞系中存在对至少一种第二抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白。该方法可包括向脊椎动物受试者施用包含至少一种分离的重组B淋巴细胞系的药物组合物；并且对所述脊椎动物施用至少一种第一抗原以刺激所述至少一种分离的重组B淋巴细胞系，以产生对所述至少一种第二抗原具有反应性的一种或多种外源性分泌型免疫球蛋白。该方法可包括确认在脊椎动物受试者的血流中存在对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种外源性分泌型免疫球蛋白。该方法可包括施用至少一种第一抗原以刺激至少一种分离的重组B淋巴细胞系，以产生对至少一种第二抗原具有反应性的一种或多种外源性分泌型免疫球蛋白；并且对脊椎动物受试者施用包含经刺激的至少一种分离的重组B淋巴细胞系的药物组合物。该方法可包括向至少一种第一分离的B淋巴细胞系中引入对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白。该方法可包括将编码对至少一种第三抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白的至少一种外源核酸引入至少一种分离的重组B淋巴细胞系中，以产生至少一种分离的第二重组B淋巴细胞系；并且选择至少一种分离的第二重组B淋巴细胞系，其表达对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种分泌型免疫球蛋白和对至少一种第三抗原具有反应性的分泌型免疫球蛋白。该方法可包括向脊椎动物受试者施用包含至少一种分离的第二重组B淋巴细胞系的药物组合物；并且向所述脊椎动物施用所述至少一种第一抗原以刺激所述至少一种分离的第二重组B淋巴细胞系，以产生对所述至少一种第二抗原具有反应性的一种或多种外源性分泌型免疫球蛋白和对至少一种第三抗原具有反应性的所述一种或多种外源性分泌型免疫球蛋白。该方法可包括确认在脊椎动物受试者的血流中的对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种外源性分泌型免疫球蛋白和对至少一种第三抗原具有反应性的一种或多种外源性分泌型免疫球蛋白的存在。该方法可以包括向脊椎动物受试者施用至少一种第一抗原以刺激至少一种分离的第二重组B淋巴细胞系，以产生对至少一种第二抗原具有反应性的外源性分泌型免疫球蛋白和对至少一种第三抗原具有反应性的一种或多种外源性分泌型免疫球蛋白；并且对脊椎动物受试者施用包含经刺激的至少一种分离的第二重组B淋巴细胞系的药物组合物。重组B淋巴细胞系与一种或多种脊椎动物受试者中的一种可以是自体同源物。重组B淋巴细胞系与一个或多个脊椎动物受试者可以是同种异体物。
如本文所述的在分离的细胞系中产生至少一种免疫球蛋白的方法可以包括：将编码对至少一种第一抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白的至少一种外源核酸引入至少一种第一分离的B淋巴细胞系中，以产生至少一种分离的重组B淋巴细胞系；选择该至少一种分离的重组B淋巴细胞系，其表达对至少一种第一抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白；向该至少一种分离的B淋巴细胞系中引入对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白，以产生至少一种第一分离的B淋巴细胞系；以及选择表达对至少一种第二抗原具有反应性的膜免疫球蛋白的至少一种第一分离的B淋巴细胞系。
用本文所述的免疫治疗产品治疗脊椎动物受试者的疾病的方法可包括：将编码对至少一种第一抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白的至少一种外源核酸引入至少一种第一分离的B淋巴细胞系中，以产生至少一种分离的重组B淋巴细胞系；选择该至少一种分离的重组B淋巴细胞系，其表达对至少一种第一抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白；向该至少一种分离的B淋巴细胞系中引入对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白，以产生至少一种第一分离的B淋巴细胞系；以及选择表达对至少一种第二抗原具有反应性的膜免疫球蛋白的至少一种第一分离的B淋巴细胞系，该至少一种分离的重组B淋巴细胞系用于施用给脊椎动物受试者。
前述发明内容仅仅是说明性的，且无意以任何方式进行限制。除了上述说明性的方面、实施方式和特征之外，通过参考附图和接下来的详细描述，进一步的方面、实施方式和特征也将变得显而易见。
附图说明
图1是记忆B淋巴细胞的假设免疫球蛋白基因的示意图。
图2A、2B、2C是染色体14上的非功能性和功能性免疫球蛋白重链基因的示意图。
图3A、3B、3C是在具有重链基因的免疫球蛋白基因座处置换以表达膜IgG和分泌型IgG的示意图。
图4A、4B、4C、4D是产生具有针对第一抗原的膜免疫球蛋白和针对第二抗原的分泌型免疫球蛋白的重组B淋巴细胞的方案的示意图。
图5是在分离的B淋巴细胞系中产生免疫球蛋白的方法的示意图。
图6是在分离的B淋巴细胞系中产生免疫球蛋白的方法的示意图。
图7是在分离的B淋巴细胞系中产生免疫球蛋白的方法的示意图。
图8A是重组B细胞受体蛋白的示意图。
图8B是重组B细胞受体表达载体的示意图。
图8C是具有插入的基因的染色体14的示意图。
图8D是具有转录因子的表达载体的示意图。
具体实施方式
在接下来的详细描述中参照了附图，附图形成本文的一部分。在附图中，除非上下文另有规定，否则类似的符号通常标识类似的部件。在详细描述、附图以及权利要求中所描述的说明性实施方式没有意图进行限制。在不背离本文所阐述的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方式，也可以做出其他变化。
本文公开了用于在分离的B淋巴细胞系中产生一种或多种免疫球蛋白的组合物和方法。本文公开了用于在分离的B淋巴细胞系中产生一种或多种免疫球蛋白的组合物和方法，该分离的B淋巴细胞系通过在该分离的B淋巴细胞系中的膜免疫球蛋白指导细胞信号传导。脊椎动物受试者中的免疫细胞疗法可以包括向脊椎动物受试者施用分离的B淋巴细胞系，其合成各自具有不同的靶抗原的分泌型免疫球蛋白和膜免疫球蛋白。脊椎动物受试者中的免疫细胞疗法可包括向脊椎动物施用抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞由指导抗原内化和加工以产生特异性抗原呈递细胞的分离的B淋巴细胞系组成。分离的B淋巴细胞系可产生抗原呈递细胞，其在捕获、内化和呈递由内源或外源衍生的膜免疫球蛋白识别的抗原方面是特殊的或优越的。本文公开了用于用免疫治疗产品治疗脊椎动物受试者的疾病的组合物和方法。免疫治疗产品可包括分离的B淋巴细胞系，其具有对第一抗原具有反应性的内源衍生或外源衍生的膜免疫球蛋白，其中分离的B淋巴细胞系产生对第二抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白。免疫治疗产品可包括分离的B淋巴细胞系，其可以是产生一种或多种分泌抗体的单克隆B淋巴细胞系或多克隆B淋巴细胞系。免疫治疗产品可包括产生一种或多种分泌抗体(例如识别相同抗原上不同表位的抗体)的分离的B淋巴细胞系。免疫治疗产品可包括分离的B淋巴细胞系作为一种或多种抗原呈递细胞。
分离的B淋巴细胞系可包括免疫治疗产品，所述免疫治疗产品施用于脊椎动物受试者，以在脊椎动物受试者中发展长寿命的分离的B淋巴细胞，以用于慢性疾病的免疫监视。该免疫治疗产品可以包括具有内源衍生的或外源衍生的膜免疫球蛋白的分离的B淋巴细胞系，该分离的B淋巴细胞系可以施用于脊椎动物受试者以向脊椎动物受试者提供抗原呈递细胞。
如本文所述的分离的细胞系可包括分离的B淋巴细胞系，其能够表达对第一抗原具有反应性的至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白和至少一种对第二抗原具有反应性的内源性分泌型免疫球蛋白。至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白可包括外源掺入的膜免疫球蛋白多肽。所述至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白可包括编码膜免疫球蛋白多肽的外源掺入的核酸，其中所述细胞系能够表达膜免疫球蛋白多肽。
如本文所述的分离的重组细胞系可包括分离的B淋巴细胞系，该分离的B淋巴细胞系能够表达对第一抗原具有反应性的至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白和编码对第二抗原具有反应性的分泌型免疫球蛋白的至少一种外源掺入的核酸。
如本文所述的在分离的B淋巴细胞系中产生免疫球蛋白的方法可包括：从例如通过感染暴露于至少一种第二抗原免疫或用该至少一种第二抗原免疫的脊椎动物受试者中分离表达对该至少一种第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白的B淋巴细胞系；向该分离的B淋巴细胞系中引入对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白，以产生重组B淋巴细胞系；以及选择该分离的B淋巴细胞系，其表达对至少一种第一抗原具有反应性的膜免疫球蛋白，并表达对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白。
用本文所述的免疫治疗产品治疗脊椎动物受试者的疾病的方法可包括：从例如通过感染暴露于至少一种第二抗原免疫或用该至少一种第二抗原免疫的脊椎动物受试者中分离表达对该至少一种第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白的B淋巴细胞系；向该分离的B淋巴细胞系中引入对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白，以产生重组B淋巴细胞系；以及选择该重组B淋巴细胞系，其表达对至少一种第一抗原具有反应性的膜免疫球蛋白，并表达对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白，该重组B淋巴细胞系用于施用给一种或多种脊椎动物受试者。
在如本文所述的分离的细胞系中产生至少一种免疫球蛋白的方法可以包括：向至少一种分离的B淋巴细胞系中引入对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白，以产生至少一种第一分离的B淋巴细胞系；选择表达对至少一种第一抗原具有反应性的膜免疫球蛋白的至少一种第一分离的B淋巴细胞系；将编码对至少一种第二抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白的至少一种外源核酸引入至少一种第一分离的B淋巴细胞系中，以产生至少一种分离的重组B淋巴细胞系；以及选择该至少一种分离的重组B淋巴细胞系，其表达对至少一种第二抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白。
用本文所述的免疫治疗产品治疗脊椎动物受试者的疾病的方法可包括：向至少一种分离的B淋巴细胞系中引入对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白，以产生至少一种第一分离的B淋巴细胞系；选择表达对至少一种第一抗原具有反应性的膜免疫球蛋白的至少一种第一分离的B淋巴细胞系；将编码对至少一种第二抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白的至少一种外源核酸引入至少一种第一分离的B淋巴细胞系中，以产生至少一种分离的重组B淋巴细胞系；选择该至少一种分离的重组B淋巴细胞系，其表达对至少一种第二抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白，该至少一种分离的重组B淋巴细胞系用于施用给一种或多种脊椎动物受试者。
如本文所述的在分离的细胞系中产生至少一种免疫球蛋白的方法可以包括：将编码对至少一种第一抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白的至少一种外源核酸引入至少一种第一分离的B淋巴细胞系中，以产生至少一种分离的重组B淋巴细胞系；选择该至少一种分离的重组B淋巴细胞系，其表达对至少一种第一抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白；向该至少一种分离的B淋巴细胞系中引入对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白，以产生至少一种第一分离的B淋巴细胞系；以及选择表达对至少一种第二抗原具有反应性的膜免疫球蛋白的至少一种第一分离的B淋巴细胞系。
用本文所述的免疫治疗产品治疗脊椎动物受试者的疾病的方法可包括：将编码对至少一种第一抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白的至少一种外源核酸引入至少一种第一分离的B淋巴细胞系中，以产生至少一种分离的重组B淋巴细胞系；选择该至少一种分离的重组B淋巴细胞系，其表达对至少一种第一抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白；向该至少一种分离的B淋巴细胞系中引入对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白，以产生至少一种第一分离的B淋巴细胞系；以及选择表达对至少一种第二抗原具有反应性的膜免疫球蛋白的至少一种第一分离的B淋巴细胞系，该至少一种分离的重组B淋巴细胞系用于施用给脊椎动物受试者。
分离的重组细胞系包括能够表达对第一抗原具有反应性的至少一种内源膜免疫球蛋白和编码对第二抗原具有反应性的至少一种分泌型免疫球蛋白的至少一种外源掺入的核酸的分离的B淋巴细胞系。
在一实施方案中，经修饰的B淋巴细胞包括用于表现细胞细胞毒性的结构或功能特征。例如，在一实施方案中，经修饰的B淋巴细胞或细胞系产生一种或多种抗体，并且具有一种或多种对靶抗原具有特异性的B细胞受体(如本文所述的膜免疫球蛋白)，例如肿瘤抗原(包括但不限于为“正常”细胞抗原的突变形式的抗原，以及通过翻译后修饰而被修饰的抗原，以及以异常方式或异常水平表达的抗原)。在一实施方案中，经修饰的B淋巴细胞或细胞系能够与体液免疫组分和细胞免疫组分一起产生完全免疫应答。
在一实施方案中，表现出细胞毒性的经修饰的B淋巴细胞能够(直接或间接)表达穿孔素、颗粒酶和其他细胞毒性组分中的至少一种。例如，在一实施方案中，B细胞受体(膜结合的免疫球蛋白)在与肿瘤细胞结合(即B细胞受体与肿瘤细胞的抗原结合)时发出信号以引发细胞毒性效应物。在一实施方案中，经修饰的淋巴细胞能够分泌(例如，通过固定补体或结合ADCC[抗体依赖性细胞介导的细胞毒性])对相同的肿瘤细胞有毒的抗体。
在一实施方案中，经修饰的B淋巴细胞来自例如接种肿瘤抗原后的B细胞，或通过修饰抗体或B细胞受体(例如，嵌合B细胞受体或重组B细胞受体)中至少一种的表达来自供体外周血淋巴细胞。
在一实施方案中，经修饰的B淋巴细胞被修饰以通过重组B细胞受体或嵌合受体的表达来表达细胞毒性，所述重组B细胞受体或嵌合受体具有scFv和用于细胞外跨膜和细胞质结构域的膜免疫球蛋白以及来自IL21受体和TLR或另一信号传导分子的细胞质结构域，以从该经修饰的B淋巴细胞引发颗粒酶、穿孔素等的表达。
在一实施方案中，经修饰的B淋巴细胞被修饰以表达对第一抗原具有特异性的重组B细胞受体或嵌合B细胞受体和识别第二抗原的抗体，提供对靶细胞(例如肿瘤细胞、自身免疫细胞、感染细胞、炎性细胞、坏死细胞、调节细胞(例如调节性T细胞，调节性B细胞和髓源性抑制细胞))的增加的特异性以及增加的细胞毒性和抗体介导的杀伤。
在一实施方案中，具有嵌合B细胞受体或重组B细胞受体的经修饰的B淋巴细胞已经被修饰以特异性地与一种或多种靶细胞反应，并且对一种或多种靶细胞显示出细胞毒性。在一实施方案中，经修饰的B淋巴细胞或细胞系被特别改造用于与一种或多种肿瘤细胞或肿瘤细胞类型反应。在一实施方案中，通过实验室技术和任选地通过使用计算机数据和/或B淋巴细胞的各种组分的建模来改造经修饰的B淋巴细胞或细胞系。
在一实施方案中，具有嵌合B细胞受体或重组B细胞受体的经修饰的B淋巴细胞包括经修饰的受体，经修饰的受体能够在该受体接合时转导诱导细胞毒性效应分子表达的信号。
在一实施方案中，重组B细胞受体或嵌合B细胞受体包括引发细胞毒性效应分子表达的异源细胞外、跨膜和细胞质信号传导结构域。
在一实施方案中，重组B细胞受体或嵌合B细胞受体包括源自常见γ链、IL-21R、Toll样受体(TLR)或CD40中的至少一种的细胞质结构域。在一实施方案中，重组B细胞受体或嵌合B细胞受体能够引发细胞毒性效应分子的表达，例如穿孔素、颗粒酶B、Fas配体、TRAIL或其他的表达。
在一实施方案中，重组B细胞受体或嵌合B细胞受体包括对一种或多种靶抗原具有特异性的至少一个细胞外结构域。在一实施方案中，重组B细胞受体或嵌合B细胞受体包括识别第一抗原并分泌识别第二抗原的抗体的经修饰的受体。在一实施方案中，重组B细胞受体或嵌合B细胞受体包括识别一种抗原的第一表位并分泌识别相同抗原的第二表位的抗体的经修饰的受体。因此，经修饰的B细胞(具有重组B细胞受体或嵌合B细胞受体)可以通过实验室技术设计和改造，以对肿瘤细胞具有更高的特异性和更高的细胞毒活性。
在一实施方案中，表现出细胞毒性的经修饰的B细胞进一步包括在本文所述的B细胞的实施方案中，该B细胞表现出对一种抗原具有特异性的嵌合B细胞受体或重组B细胞受体并分泌对不同抗原而不是其B细胞受体具有特异性的抗体。此类记忆B细胞还可包括如本文所述的靶向细胞毒性特征。
在一实施方案中，靶细胞包括已被病毒、支原体、细菌、酵母或其他微生物感染的细胞。在一实施方案中，靶细胞包括肿瘤细胞，例如原发性肿瘤细胞、循环肿瘤细胞或转移性肿瘤细胞。在一实施方案中，靶细胞包括自身免疫细胞。
在一实施方案中，制备经修饰的B淋巴细胞的方法包括通过实验室技术改造细胞。在一实施方案中，使用经修饰的B淋巴细胞治疗疾病的方法包括向受试者施用治疗有效量的经修饰的B淋巴细胞。制备经修饰的B淋巴细胞的方法的具体示例在本文的预示实施例部分中有更详细的描述。
在一实施方案中，如本文所述的经修饰的B淋巴细胞或细胞系被改造，并用于向受试者施用以进行治疗。如本文所述，在一实施方案中，受试者患有活动性疾病。在一实施方案中，受试者患有慢性疾病。在一实施方案中，受试者已暴露于致病剂并且可能或可能尚未患有疾病症状。在一实施方案中，受试者患有潜伏性疾病。
在重组B淋巴细胞系中产生免疫球蛋白的方法包括：从例如通过感染暴露于至少一种第一抗原免疫或用该至少一种第一抗原免疫的脊椎动物受试者中分离表达对该至少一种第一抗原具有反应性的至少一种内源膜免疫球蛋白的B淋巴细胞系；向该分离的B淋巴细胞系中引入编码对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种分泌型免疫球蛋白的至少一种外源核酸，以产生重组B淋巴细胞系；以及测定对该至少一种第二抗原具有反应性的至少一种外源性分泌型免疫球蛋白的存在，以选择重组B淋巴细胞系。
一种用免疫治疗产品治疗脊椎动物受试者的疾病的方法包括：从例如通过感染暴露于至少一种第一抗原免疫或用该至少一种第一抗原免疫的脊椎动物受试者中分离表达对该至少一种第一抗原具有反应性的至少一种内源膜免疫球蛋白的B淋巴细胞系；向该分离的B淋巴细胞系中引入编码对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种分泌型免疫球蛋白的至少一种外源核酸中的至少一种；测定对该至少一种第二抗原具有反应性的至少一种外源性分泌型免疫球蛋白的存在，以选择用于给脊椎动物受试者施用的重组B淋巴细胞系。
分离的B淋巴细胞可用于免疫治疗：
-长寿的分离的B淋巴细胞可用于慢性病的免疫监视。
-具有识别抗原的膜免疫球蛋白的分离的B淋巴细胞可以作为特异性抗原呈递细胞以将抗原呈递给T淋巴细胞。
-使用多克隆自体分离的B淋巴细胞免疫治疗是一种有价值的方案。例如，流感免疫B淋巴细胞可以用逆转录病毒载体一起转染。替代地，可以用疫苗免疫并转染多个分离的B淋巴细胞，例如多克隆B淋巴细胞，从而识别相同抗原的不同表位。
如本文所示，许多方案可用于产生分离的B淋巴细胞系，如详细描述和实施例中更详细地陈述的。可以通过用模型抗原(例如二硝基苯酚(DNP))或流感抗原使个体免疫来开发能够表达对第一抗原具有反应性的至少一种内源膜免疫球蛋白或能够表达对第一抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白的分离的B淋巴细胞系，以引发具有对DNP模型抗原或流感抗原具有反应性的内源性膜免疫球蛋白(例如B细胞受体(BCR))和/或对DNP抗原或流感抗原具有反应性的内源可溶性免疫球蛋白(例如，抗体)的记忆B细胞。
可以通过从对流感病毒感染免疫的个体中分离人B细胞并通过用Epstein Barr病毒(EBV)感染分离的B细胞而使人B细胞永生化，开发能够表达对广泛中和的流感抗原具有反应性的至少一种外源性分泌型免疫球蛋白的分离的B淋巴细胞系。可以使用从EBV永生化的B淋巴细胞系克隆免疫球蛋白重(H)链和轻(L)链基因的方法。参见例如于2010年6月22日授权的Grawunder等人的美国专利No.7,741,077和Early et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:857-861,1979，其通过引用并入本发明。为了促进同源重组，将编码分泌型抗流感抗体的H链和L链的免疫球蛋白基因克隆到质粒靶向载体中，以分别在染色体14和2上的相应的非功能性种系Ig基因座中获得靶向整合。替代地，从患有慢性病毒感染的患者获得的记忆B细胞可以通过用编码膜免疫球蛋白(例如抗DNP抗体)的外源Ig基因替换其功能性表达的Ig基因来进行基因工程改造。编码抗DNP抗体的Ig H和Ig L链基因可以通过使用同源重组方法插入染色体14和2上的功能性表达的Ig基因座中。参见例如美国专利No.5,202,238、No.6,570,061和No.6,841,383。
可以改造表达抗DNP膜IgG的记忆B细胞以表达编码对流感具有特异性的分泌型IgG抗体的Ig基因。可以改造抗流感IgG1H链基因(即，γ1-H链基因)以去除跨膜结构域(TM)、细胞质氨基酸(Cyt)和polyA添加位点的编码序列，以便产生仅编码分泌型H链的γ1-H链基因。
为了获得编码针对癌症(例如PSA)或感染性疾病的特异性抗体的人免疫球蛋白(Ig)基因，构建了产生抗PSA抗体的杂交瘤细胞系。例如，用PSA对具有人Ig基因的转基因小鼠(例如，可获自Abgenix Inc.,Fremont,CA)免疫，并将它们的B细胞与骨髓瘤细胞融合伴侣(例如，SP2/0细胞，其可从美国菌种保藏中心(Manassas，VA)获得)融合，以产生表达人抗体的杂交瘤细胞克隆(参见例如美国专利No.8,013,128，同上)。使用免疫测定法筛选来自杂合克隆的上清液，以检测结合PSA蛋白的人IgG抗体。将产生识别PSA的抗体的杂交瘤克隆进行扩增，并且使用BiacoreTM A100仪器(可从GE Healthcare，Piscataway，NJ获得)测试来测量针对PSA的抗体亲和力和特异性(参见例如GEHealthcare,Application Note 84,“Early kinetic screening of hybridomas…”，其通过引用并入本文)。选择表达针对PSA的高亲和力抗体的杂交瘤用于克隆其人Ig基因，例如通过同源重组进行。
编码膜免疫球蛋白的工程化免疫球蛋白基因在哺乳动物细胞系中表达，而膜IgG从该细胞系中纯化。例如，使用标准重组DNA方法将卡巴(κ)L链基因和经修饰的γ-1H链基因插入慢病毒表达载体中(参见例如2007年5月24日公开的Yang等人的美国专利公开No.2007/0116690，其通过引用并入本文)。病毒载体用于转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(其可从美国菌种保藏中心(Manassas，VA)获得)，其被改造以表达膜免疫球蛋白。
为了确保重组记忆B细胞可安全用于患者，可将自杀基因引入B细胞中。为了通过重组记忆B细胞阻止不受控制的增殖(和其他不良事件)，使用逆转录病毒表达载体引入自杀基因(单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因(HSV-TK))。插入和表达HSV-TK基因并活化细胞毒性前药(如更昔洛韦)的方法是已知的(参见例如2003年6月10日授权给Gold和Lebkowski的美国专利No.6,576,464和1999年12月7日授权给Barber等人的美国专利No.5,997,859，其通过引用并入本文)。为了阻止被认为不安全或导致不良事件的重组B细胞的生长，向表达HSV-TK的B细胞提供20μM更昔洛韦(得自Roche Laboratories，Nutley，NJ的Cytovene IV)。通过表达HSV-TK的B细胞将更昔洛韦转化为毒性代谢物导致其死亡。不表达HSV-TK的细胞不受更昔洛韦的损害。
分离的细胞系可包括分离的B淋巴细胞系或分离的重组B淋巴细胞系，其识别感染性细菌或病毒疾病的一种或多种抗原，例如流感抗原。表1包括构建包含外源衍生的(exogenously-derived)和/或内源衍生的(endogenously-derived)膜免疫球蛋白和外源衍生的和/或内源衍生的分泌型免疫球蛋白的分离的B淋巴细胞系或分离的重组B淋巴细胞系的方案的示例。来自分离的重组B淋巴细胞系的分泌型免疫球蛋白可包含一种或多种分泌型抗流感广泛中和抗体(Flu BNAb)。抗流感广泛中和抗体可以针对相同流感抗原(FluBNAb1和Flu BNAb2)上的两个或更多个表位。来自分离的重组B淋巴细胞系的分泌型抗流感免疫球蛋白可包括针对流感抗原的一种或多种分泌型多克隆抗体(Flu Abn)。
B淋巴细胞方案1是产生分离的重组B淋巴细胞的方案。方案1用DNP-KLH(二硝基苯基-Keyhole Limpet Hemocyanin)给脊椎动物受试者免疫并选择包含识别DNP的膜免疫球蛋白和识别DNP的分泌型免疫球蛋白的记忆B淋巴细胞。可以用核酸载体转染抗DNP B淋巴细胞，所述核酸载体包括编码膜和分泌型抗流感广泛中和抗体(BNAb)的免疫球蛋白基因。
可将分离的重组抗流感B型淋巴细胞转移至脊椎动物受试者以保护脊椎动物受试者免受流感感染。当出现流感症状或大流行病发作时，可以通过将DNP-KLH注射到脊椎动物受试者中来随意活化长寿命的抗流感B型淋巴细胞。
B淋巴细胞方案2是产生分离的重组B淋巴细胞的方案。方案2从脊椎动物受试者中分离记忆B淋巴细胞。用核酸载体转染分离的记忆B淋巴细胞，所述核酸载体包括仅编码抗DNP膜免疫球蛋白而不编码抗DNP分泌型免疫球蛋白的免疫球蛋白基因。可以选择具有抗DNP膜免疫球蛋白的B淋巴细胞，并将其用编码两种抗流感BNAb的免疫球蛋白基因转染至流感抗原的两个不同表位。编码每种BNAb的免疫球蛋白基因可编码膜和分泌形式的BNAb。
可将分离的重组抗流感B型淋巴细胞转移至脊椎动物受试者以保护脊椎动物受试者免受流感感染。当流感症状出现或大流行病发作时，可以通过将DNP-KLH注射到脊椎动物受试者中，随意活化长寿命抗流感B型淋巴细胞以产生两种抗流感BNAb。通过将流感抗原注射到脊椎动物受试者中，也可以随意活化长寿命的抗流感B型淋巴细胞以产生两种抗流感BNAb。与方案1不同，当B淋巴细胞被DNP-KLH或流感抗原活化时，不会产生针对DNP-KLH的分泌型免疫球蛋白。
B淋巴细胞方案3是产生多克隆分离的重组B淋巴细胞的方案。方案3用流感疫苗给脊椎动物受试者免疫(例如三联季节性流感疫苗)。在脊椎动物受试者中选择表达识别流感疫苗抗原的膜免疫球蛋白的记忆B淋巴细胞。用编码抗DNP膜免疫球蛋白的免疫球蛋白基因转染所选择的多克隆抗流感记忆B淋巴细胞。
可将多克隆抗流感B型淋巴细胞转移至脊椎动物受试者以保护脊椎动物受试者免受流感感染。当出现流感症状或大流行病时，可以通过将DNP-KLH注射到脊椎动物受试者体内，大量活化多克隆的长寿命的抗流感B细胞。此外，个体B淋巴细胞克隆可被其同源流感抗原活化。
B淋巴细胞方案4是产生多克隆分离的重组B淋巴细胞的方案。方案4用流感疫苗(例如三联季节性疫苗)给脊椎动物受试者免疫。在脊椎动物受试者中选择表达识别流感疫苗抗原的膜免疫球蛋白的记忆B淋巴细胞。用编码膜形式和分泌形式的抗流感BNAb的免疫球蛋白基因转染多克隆抗流感B淋巴细胞。
可将分离的重组多克隆抗流感B型淋巴细胞转移至脊椎动物受试者以保护脊椎动物受试者免受流感感染。当出现流感症状或大流行病时，可以通过向脊椎动物受试者注射全谱流感疫苗抗原，大量活化多克隆的长寿命的抗流感B型淋巴细胞。每个B淋巴细胞产生BNAb和与流感反应的克隆特异性免疫球蛋白。
在一些方面，包含由第一抗原活化的至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白的分离的B淋巴细胞系能够控制对第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白的表达。外源掺入的膜免疫球蛋白作为特定配体(例如第一抗原)的受体。第一抗原与外源掺入的膜免疫球蛋白的结合控制通过外源掺入的膜免疫球蛋白进行的信号转导，以控制对第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白的表达。第一抗原与外源掺入的膜免疫球蛋白的结合控制通过膜免疫球蛋白进行的信号转导，以控制B淋巴细胞的活化或B淋巴细胞的分化。
图1是记忆B淋巴细胞的假设免疫球蛋白基因的示意图。重(H)链基因位于染色体14上。卡巴(κ)L链基因位于染色体2上。拉姆达(λ)L链基因位于22号染色体上。功能性等位基因和非功能性等位基因存在于染色体14和2上。两个λL链等位基因都被描述为是无功能性的。如实施例3中所示，将编码抗PSA膜抗体的H链和L链的免疫球蛋白基因克隆到靶向质粒载体中，以使得能分别在染色体14和2上的相应非功能性Ig基因座中靶向整合。
图2是染色体14上的非功能性和功能性免疫球蛋白重链基因的示意图。母本染色体14种系构型的遗传结构显示在图2A中。可变区(VH)、D片段(D)、J片段(JH)、IgM恒定区(CHμ)、分泌尾管(TP)和μ膜锚(TM和Cyt)的外显子显示在图2B中。功能性重排的父本染色体14的遗传结构用重组的V、D和J片段(VHD1J2)显示，如图2C所示。显示了分泌型和膜μ-H链编码的和交替的多腺苷酸化位点的遗传结构。注意，简化了Ig基因结构，仅显示了一个恒定区(CH)外显子。还省略了启动子和增强子序列。
如实施例3中所示，抗PCLA免疫球蛋白H和L链基因整合到成熟B细胞的Ig基因座中，其分别在染色体14和2上功能性重排。关于功能性重排的H链基因座，参见图2B。
图3是用工程化表达膜IgG和分泌IgG的重链基因取代免疫球蛋白基因的示意图。具有交替多腺苷酸化位点的分泌型和膜γ-H链基因的遗传结构显示在图3A中。具有工程化膜γ-H链基因的母本染色体14的遗传结构显示在图3B中。具有工程化分泌型γ-H链基因的父本染色体14的遗传结构显示在图3C中。注意，简化了Ig基因结构，仅显示了一个恒定区(CH)外显子。还省略了启动子和增强子序列。
如实施例3中所示，可以改造抗PCLA IgG H链基因(即，γ-H链基因)以去除跨膜结构域(TM)和细胞质氨基酸(Cyt)的编码序列以产生仅编码分泌型H链的γ-H链基因(图3C)。
图4A、4B、4C、4D是产生重组B淋巴细胞的方案的示意图，所述重组B淋巴细胞具有针对第一抗原的膜免疫球蛋白和针对第二抗原的分泌型免疫球蛋白。图4A显示分离的记忆B淋巴细胞，其具有编码抗DNP膜免疫球蛋白的内源DNA和编码抗-流感广泛中和抗体(BNAb)分泌型免疫球蛋白的外源DNA。图4B显示分离的记忆B淋巴细胞，其具有编码抗DNP膜免疫球蛋白的外源DNA和编码抗-流感广泛中和抗体(BNAb)分泌型免疫球蛋白的外源DNA。图4C显示了分离的记忆B淋巴细胞，其具有编码抗流感Abs分泌型免疫球蛋白的内源DNA和编码抗DNP膜免疫球蛋白的外源DNA。图4D显示了分离的记忆B淋巴细胞，其具有编码抗流感BNAb分泌型免疫球蛋白的外源DNA和用脂质体递送的外源抗DNP膜免疫球蛋白多肽。
图5是501用于在分离的B淋巴细胞系中产生至少一种免疫球蛋白的方法500的示意图，其包括502从用至少一种第二抗原免疫的脊椎动物受试者中分离表达对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白的B淋巴细胞系；503将对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白引入分离的B淋巴细胞系中，以产生重组B淋巴细胞系；504选择表达对至少一种第一抗原具有反应性的膜免疫球蛋白并表达对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白的分离的B淋巴细胞系。
图6是601用于在分离的B淋巴细胞系中产生至少一种免疫球蛋白的方法600的示意图，其包括602将对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种外源膜免疫球蛋白引入至少一种分离的B淋巴细胞系中，以产生至少一种第一分离的B淋巴细胞系；603选择表达对至少一种第一抗原具有反应性的膜免疫球蛋白的至少一种第一分离的B淋巴细胞系；604将编码对至少一种第二抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白的至少一种外源核酸引入至少一种第一分离的B淋巴细胞系中，以产生至少一种分离的重组B淋巴细胞系；以及605选择表达对至少一种第二抗原具有反应性的一种或多种分泌型免疫球蛋白的至少一种分离的重组B淋巴细胞系。
图7是701用于在重组B淋巴细胞系中产生至少一种免疫球蛋白的方法的示意图700，该方法包括702从用至少一种第一抗原免疫的脊椎动物受试者中分离表达对至少一种第一抗原具有反应性的至少一种内源性膜免疫球蛋白的B淋巴细胞系；703将编码对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种分泌型免疫球蛋白的至少一种外源核酸引入分离的B淋巴细胞系中，以产生重组B淋巴细胞系；并且704测定存在对至少一种第二抗原具有反应性的至少一种外源性分泌型免疫球蛋白，以选择该重组B淋巴细胞系。
图8A说明了重组B细胞受体蛋白1000，其具有与IgG重链结构域连接的单链可变片段1005，该IgG重链结构域包含铰链片段1008，与铰链片段1008连接的CH3结构域1010、跨膜1015和细胞质1020结构域，细胞质1020结构域附接至IL-21的受体细胞质结构域1025。
图8B包括重组B细胞受体表达载体1050的图示，其包括CMV启动子1028，与CMV启动子1028连接的重组B细胞受体1030，与重组B细胞受体1030附接的poly-A位点1035和新霉素抗性基因1040。
图8C是具有插入的穿孔素基因的染色体14上的活性γ重链基因座1100的图示，其包含Ig可变基因启动子1045、与Ig可变基因启动子1045连接的穿孔素cDNA 1048和下游的Igα恒定区1049以及跨膜结构域1051和细胞质结构域1052。
图8D包括具有插入的转录因子基因的仙台(Sendai)病毒表达载体1150的图示，其包含：病毒NP基因1060，与病毒NP基因1060连接的病毒P/V基因1062，三个转录因子T-bet1064、RunX3 1066和Eomes 1068，以及在3′端的病毒L基因1070。
在用免疫治疗产品治疗脊椎动物受试者的疾病的方法中，重组B淋巴细胞系可以是一种或多种脊椎动物受试者中的一者的自体同源物。替代地，在用免疫治疗产品治疗脊椎动物受试者的疾病的方法中，重组B淋巴细胞系可以是一种或多种脊椎动物受试者之一的同种异体。在该情况下，重组B淋巴细胞系对一个或多个脊椎动物受试者中的一者是同种异体。在每种情况下，在有必要时，可以修饰重组B淋巴细胞系以减少或消除重组B淋巴细胞系中MHC I类(MHC I)蛋白或错配HLA抗原的表达，从而避免同种异体移植物排斥，以及减少或消除在同种异体重组B淋巴细胞的受体中的移植物抗宿主病。参见，例如，美国申请序列号12/804,650和美国申请序列号12/804,647，它们通过引用并入本发明。
用不匹配的同种异体供体重组B淋巴细胞处理脊椎动物受试者，所述重组B淋巴细胞经工程改造以阻断其细胞表面上的主要组织相容性I类(MHC I)蛋白的呈递。用慢病毒表达载体转染同种异体供体重组B淋巴细胞，该载体指导微RNA(miRNA)的表达，该微RNA(miRNA)抑制β2-微球蛋白(β2M)蛋白翻译并阻断MHC I组装和在细胞表面上的呈递。将基因工程改造的重组B淋巴细胞注射到患者体内。移植的重组B淋巴细胞中的MHC I产生的抑制由调节模块和效应分子强力霉素控制。在必须根除重组B淋巴细胞的情况下，施用强力霉素以抑制miRNA的表达，从而允许β2M和MHC I在细胞表面上的表达并引起同种异体反应性免疫应答。
用重组B淋巴细胞处理脊椎动物受试者，所述重组B淋巴细胞降低主要组织相容性I类(MHC I)蛋白在其细胞表面上的表达，以避免移植细胞的免疫排斥。经工程改造的重组B淋巴细胞还含有自杀机制，其可以在不受控制的与重组B淋巴细胞相关的增殖或其他不利事件的情况下通过施用前药更昔洛韦而被活化。
用重组B淋巴细胞处理脊椎动物受试者，所述重组B淋巴细胞经过修饰以减少其错配的HLA抗原的表达并且因此避免同种异体移植排斥。用编码微小RNA(miRNA)的慢病毒载体感染重组B淋巴细胞，所述微小RNA抑制受体不共享的特定供体HLA等位基因的表达。错配的HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-DRBI和HLA-DQB1等位基因的产生被miRNA阻断，并且相应的HLA蛋白不被经修饰的供体重组B淋巴细胞表达。
通过用重组B淋巴细胞移植来处理脊椎动物受试者。通过表达靶向MHC I蛋白以进行破坏的病毒基因，修饰同种异体重组B淋巴细胞以降低MHC I类(MHC I)蛋白的表达。用编码巨细胞病毒(CMV)蛋白(独特序列11(US11))的慢病毒表达载体转导重组B淋巴细胞，以靶向MHC I蛋白以进行破坏并避免同种异体移植物排斥(参见例如Lin et al.,Cellular andMolecular Immunology 4:91-98,(2007)，其通过引用并入本文)。
预示实施例
实施例1
表达以下两种不同抗体的重组记忆B淋巴细胞：1)B细胞受体(BCR)，其识别模型抗原，二硝基苯酚-钥孔血蓝蛋白(DNP-KLH)，和2)分泌抗体，其中和多种流感病毒株。
产生针对流感病毒的分泌型广泛中和的免疫球蛋白并产生针对模型抗原的膜免疫球蛋白的分离的重组B淋巴细胞系可用于哺乳动物受试者的细胞疗法。作为细胞疗法，可以将重组B淋巴细胞系注射到哺乳动物受试者中，以提供免受流感病毒感染的免疫保护。通过用模型抗原(二硝基苯酚-钥孔血蓝蛋白(DNP-KLM))注射哺乳动物受试者(或体外细胞培养物)，可以在体内或离体活化重组B淋巴细胞系以产生广泛中和的流感抗体。可以基于在整个群体中爆发流感感染的时间来选择刺激哺乳动物受试者中的流感病毒感染的免疫保护的时间。
用模型抗原(二硝基苯酚(DNP))对个体免疫，以引发具有对DNP模型抗原具有特异性的B细胞受体(BCR)的记忆B细胞。记忆B细胞响应于用与缀合至载体蛋白(钥孔血蓝蛋白(KLH))的DNP免疫而发展。在右臂皮下注射1mg DNP-KLH(参见例如BiosearchTechnologies DNP-KLH Product Info Sheet，其通过引用并入本文)进行初次免疫。参见例如Rentenaar et al.,Kidney International 62:319-328,2002，其通过引用并入本文。在免疫后约12-14天，使用二硝基苯酚-人血清白蛋白-生物素(DNP-HSA-生物素)和藻红蛋白-链霉抗生物素蛋白(可从Biosearch Technologies，Novato，CA获得)和荧光素-抗CD27抗体分离表达对DNP具有特异性的BCR的记忆B细胞，以识别记忆B细胞。通过用荧光活化细胞分选仪(例如，可从Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ获得的)进行细胞分选来分离DNP特异性记忆B细胞。例如，参见在2008年5月27日授权给Ettinger等人的美国专利No.7,378,276和在2011年8月9日授权给Brown等人的美国专利No.7,993,864，其通过引用并入本文。
表达结合DNP的BCR的记忆B细胞经基因工程改造以表达分泌型抗体，该抗体是与多种流感病毒株反应的广泛中和抗体。表达含有膜IgG抗体的抗DNP BCR的记忆B细胞具有生产性重排和表达的膜免疫球蛋白重(H)链基因，其位于染色体14(两个亲本染色体14拷贝中的一个)上。然而，另一个亲本染色体14具有不能有效地重排并且不被表达的免疫球蛋白(Ig)H链基因。参见图1、2A和2B。这种称为“等位基因排斥”的现象产生仅表达一条Ig重链(和一条Ig轻(L)链)并且因此仅表达一种抗体的个体B细胞(参见例如Abbas et al.,Cellular and Molecular Immunology,7th Ed.,Elsevier Saunders,Philadelphia,PA,2012，其通过引用并入本文)。为了产生制造两种不同抗体的B细胞，通过用功能性表达的免疫球蛋白基因(对于H和L链)替换非功能性的非表达的免疫球蛋白基因来修饰表达抗DNPBCR的记忆B细胞。例如，置换免疫球蛋白基因可以编码分泌型抗体，其是广泛中和的抗流感抗体。
编码与多种流感病毒株反应的广泛中和抗体的免疫球蛋白基因可以从产生抗体的人B细胞克隆的染色体DNA中分离。例如，从对流感病毒感染免疫的个体分离的人B细胞通过用Epstein Barr病毒(EBV)感染该分离的B细胞而永生化。来自单个EBV转化的B细胞克隆的上清液在免疫测定中测试识别流感病毒的抗体。描述了使B细胞永生化和检测抗病毒抗体的方法(参见例如，Zhang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107:732-737,2010andCorti et al.,J.Clin.Investigation 120:1663-1673,2010，其通过引用并入本文)。
可以使用克隆Ig重(H)链和轻(L)链基因的方法。参见例如2010年6月22日授权给Grawunder等人的美国专利No.7,741,077和Early et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:857-861,1979，其通过引用并入此处。例如，表达人抗流感抗体，IgG1(κ)，的EBV转化的B细胞系在培养基中生长，并用作使用利用苯酚/氯仿的标准方法分离信使RNA(mRNA)和基因组DNA的来源。参见例如Sambrook et al.,In:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2ndEd.,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989。编码IgG1H链和κL链的mRNA在使用聚合酶链式反应(PCR)和逆转录酶(RT)进行扩增后进行分子克隆。用于扩增IgH链mRNA和Ig L链mRNA的方法和Ig基因引物描述于美国专利No.7,741,077(同上)中。将H链和L链mRNA(作为互补DNA扩增)克隆到质粒载体(例如，可获自Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA的2.1-TOPO质粒)中。测定Ig H链可变(V)区(包括Vh、D和J片段)和κL链V区(包括Vk和Jk片段)的DNA序列。V区DNA序列可以通过自动DNA测序确定(DNA测序服务可从Charles River Laboratories International,Inc.,Wilmington,MA获得)。
为了分离相应的基因组Ig基因，将从抗B细胞系(见上文)分离的基因组DNA用作人H链基因和κL链基因的PCR扩增的模板。用于扩增V区基因的PCR引物(寡核苷酸)(包括它们各自的启动子和上游(即V基因的5’端)侧翼区)通过搜索由克隆的Ig mRNA建立的具有V区DNA序列的人基因组数据库来确定。例如，可以用计算机程序BLAST从可获自国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的人类基因组核苷酸数据库搜索匹配H链和L链V区的序列。人类RefSeq基因组数据库和BLAST软件可在线获得(参见例如万维网blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。描述了用于扩增Ig恒定区、增强子序列、H链膜锚、poly A加成位点和下游侧翼区的引物(即Ig基因的3'端)(参见例如，美国专利No.7,741,077，同上)。PCR扩增的基因组片段可以克隆到质粒载体如2.1-TOPO(可从Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA获得)中。
表达抗DNP膜IgG的记忆B细胞经工程改造以表达编码对流感具有特异性的分泌型IgG抗体的Ig基因。可以改造抗流感IgG1H链基因(即，γ1-H链基因)以去除用于跨膜结构域(TM)、细胞质氨基酸(Cyt)和polyA加成位点的编码序列以产生仅编码分泌型H链的γ1-H链基因。参见图3C和Abbas et al.，同上。使用分子生物学中的标准方法改造Ig基因(参见例如Sambrook et al.,In:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold SpringHarbor Press,Cold Spring Harbor,NY,1989，其通过引用并入本文)以去除膜外显子并保留与功能性抗流感Ig基因相关的启动子和增强子序列(参见例如Abbas et al.，同上)。编码抗病毒抗体的Ig H链和Ig L链基因可以通过使用同源重组的方法插入非表达的Ig基因座中(参见例如1993年4月13日授权给Perry等人的美国专利No.5,202,238；2003年5月27日授权给Rajewsky和Zou的美国专利No.6,570,061和2005年1月11日授权给Reff等人的美国专利No.6,841,383，其通过引用并入本文)。鉴定和靶向记忆B细胞中的个体Ig基因座的DNA序列的方法是已知的(参见例如2011年8月3日在线发表的Suk et al.,Genome Research。DOI/10.1101/gr.125047.111，其通过引用并入本文)。由未表达的免疫球蛋白基因座(即，非功能性免疫球蛋白基因)确定的DNA序列用于靶向与抗流感免疫球蛋白基因的重组。
为了促进同源重组，将编码分泌型抗流感抗体的H链和L链的Ig基因克隆到质粒靶向载体中，以分别在染色体14和2上的相应的非功能性种系Ig基因座中获得靶向整合。参见图1和图2A。例如，将JH片段的DNA序列5'端(参见图2A)克隆到在靶向质粒中的抗流感γ1-H链基因的上游(5')，并且将μ-H链膜锚定外显子的下游(3')序列克隆到γ1-H链基因的下游(3')，以促进染色体14上的种系H链基因座的重组。描述了构建含有靶序列、替换基因和选择标记的靶向载体的方法(参见例如，同上的美国专利No.5,202,238，同上的美国专利No.6,570,061和同上的美国专利No.6,841,383)。
编码分泌型抗流感抗体的靶向载体用于取代表达膜抗DNP IgG的记忆B细胞中的非功能性种系μ-H链基因和非功能性κL链基因。靶向载体质粒通过限制酶消化而线性化，并通过电穿孔转移到记忆B细胞中，然后选择靶向载体质粒。描述了用于初级哺乳动物细胞的电穿孔的方法和试剂(参见例如可从BioRad Inc.，Hercules，CA获得的“ElectroporationGuide”，其通过引用并入本文)。电穿孔后的记忆B细胞在含有选择药物(如G418和甲氨蝶呤)的组织培养基中培养，以选择分别存在于H和L链靶向载体上的选择标记基因，即新霉素抗性基因和二氢叶酸还原酶。描述了选择标记基因及其用途(参见例如美国专利No.6,841,383，同上)。测试对G418和甲氨蝶呤具有抗性的电穿孔记忆B细胞表达结合流感的分泌型IgG。在记忆B细胞的转染和选择后，使用标准免疫测定法鉴定产生对流感具有特异性的分泌型IgG抗体的那些B细胞以评估B细胞上清液(参见例如Zhang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107:732-737,2010，其通过引用并入本文)。
为了确保重组记忆B细胞可安全地用于患者，将自杀基因引入B细胞中。为了通过重组记忆B细胞阻止不受控制的增殖(和其他不良事件)，使用逆转录病毒表达载体引入自杀基因，单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因(HSV-TK)。插入和表达HSV-TK基因并活化细胞毒性前药(如更昔洛韦)的方法是已知的(参见例如2003年6月10日授权给Gold和Lebkowski的美国专利No.6,576,464和1999年12月7日授权给Barber等人的美国专利No.5,997,859，其通过引用并入本文)。为了阻止被认为不安全或导致不良事件的重组B细胞的生长，向表达HSV-TK的B细胞提供20μM更昔洛韦(可作为Cytovene IV得自Roche Laboratories，Nutley，NJ)。通过表达HSV-TK的B细胞将更昔洛韦转化为毒性代谢物导致其死亡。不表达HSV-TK的细胞不受更昔洛韦的损害。
可以在体外活化和扩增重组记忆B细胞以评估它们分泌型抗流感抗体的增殖、活化和产生。如上所述分离的工程化抗DNP记忆B细胞在体外与DNP-HSA一起培养以活化细胞。例如，在组织培养瓶中，在含有约1μg/ml的DNP-HAS的标准培养基(例如可获自Sigma-Aldrich Chem.Co.，St.Louis，Mo.的RPMI 1640无血清培养基)中培养约105至106细胞/mL的记忆B细胞。描述了活化记忆B细胞的方法(参见例如美国专利No.7,378,276，同上)。为了评估活化，在培养3-5天后，在增殖测定中测试细胞。向等份的培养物补充3H-胸苷并再培养16小时。通过使用液体闪烁计数器测量3H-胸苷摄取(参见例如美国专利No.7,378,276，同上)。没有DNP-HSA的记忆B细胞的等同培养物用作增殖测定的阴性对照。为了评估由活化的记忆B细胞进行的抗体产生，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测试源自3-5天培养物的培养物上清液，以检测和定量抗流感抗体。描述了用ELISA检测和定量抗流感抗体的方法(参见例如在线发表于2009年4月21日的Khurana et al.,PLoS Med.；doi:10.1371/journal.pmed.1000049和Corti et al.,Science 333:850-856,2011，其通过引用并入本文)。源自重组细胞系的纯化抗流感抗体(参见例如Wrammert et al.,Nature 453:667-671,2008，其通过引用并入本文)可用于产生将在ELISA测定中的吸光度和抗体浓度相关的标准曲线。来自未活化(即在没有DNP-HA的条件下培养)的重组记忆B细胞的上清液用作抗流感抗体ELISA的阴性对照样品。
可以通过用模型抗原DNP-KLH注射哺乳动物受试者(或体外细胞培养物)而在体内或离体活化重组B淋巴细胞系以产生分泌型广泛中和的流感抗体，以激活从重组B淋巴细胞系产生分泌型抗体。可以基于在整个群体中爆发流感感染的时间来选择刺激哺乳动物受试者中的免疫保护而免受流感病毒感染的时间。
实施例2
经工程改造以表达识别二硝基酚(DNP)的B细胞受体(BCR)和识别丙型肝炎病毒的分泌抗体的记忆B淋巴细胞。
产生针对丙型肝炎病毒(HCV)的分泌型免疫球蛋白并产生针对模型抗原的膜免疫球蛋白的分离的重组B淋巴细胞系可用于哺乳动物受试者的细胞疗法。可以将重组B淋巴细胞系注射到哺乳动物受试者中作为过继细胞疗法，以提供免疫保护免受丙型肝炎病毒的感染。可以通过用模型抗原二硝基苯酚-钥孔血蓝蛋白(DNP-KLH)注射哺乳动物受试者(或体外细胞培养物)，在体内或离体活化重组B淋巴细胞系以产生分泌型抗HCV抗体。可以基于哺乳动物受试者暴露于HCV的时间或基于受试者中症状的出现来选择刺激哺乳动物受试者中的免疫保护以免受HCV感染的时间。
表达膜IgG(也称为表面IgG或B细胞受体(BCR))的记忆B细胞从患有慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者的外周血中分离。通过以下方式从患者的外周血中分离多克隆记忆B细胞：1)使用Ficoll Hypaque密度梯度(可获自Sigma Aldrich，St.Louis，MO)分离外周血单核细胞；2)使用磁珠(可获自Stem Cell Technology，Vancouver，BC)对总B细胞进行阴性选择，和3)用识别膜IgG和CD27的荧光单克隆抗体、记忆B细胞标记物来标记细胞并执行荧光活化细胞分选。参见例如在2008年5月27日授权给Ettinger等人的美国专利No.7,378,276和在2011年8月9日授权给Brown等人的美国专利No.7,993,864，其通过引用并入本文。
编码对DNP具有特异性的膜IgG抗体的免疫球蛋白(Ig)基因可以从用DNP-KLH免疫的健康志愿者获得(参见例如Biosearch Technologies：DNP-KLH产品信息表，其通过引用并入本文)。通过用荧光活化细胞分选仪(例如，可从Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ获得的)进行细胞分选，分离具有识别DNP的膜IgG的记忆B细胞。例如，参见同上的美国专利No.7,378,276和同上的美国专利No.7,993,864。编码抗DNP抗体的Ig基因从个体B细胞中分离(参见例如Tiller et al.,J.Immunol.Methods 329:112-124,2008，其通过引用并入本文)。对于单独的抗DNP B细胞，通过使用Superscript逆转录酶(可获自Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)和Taq DNA聚合酶(可获自Qiagen，Valencia，CA)进行逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)来扩增Ig重(H)链基因转录物和相应的Ig轻(L)链基因转录物。用于扩增Ig H链和Ig L链的反应条件和寡核苷酸引物是已知的(参见例如Tiller et al.,同上)。分离编码Ig H和L链可变(V)区基因的DNA片段并将其克隆到含有Ig H和L链恒定区基因(例如Cγ1和Ck)的哺乳动物表达载体中。使用DNA测序仪(例如，使用可获自Applied Biosystems，Carlsbad，CA的3130Genetic Analyzer)测定克隆的抗DNP Ig基因(γ1-H链和κ-L链)的DNA序列。IgG1H链基因(即，γ1-H链基因)经过工程改造以去除编码H链的分泌形式的“尾片”和多腺苷酸化位点，因此只有膜γ1-H链由工程化基因编码(参见例如图3B，和Abbas et al.,Cellular and Molecular Immunology,7th Ed.,ElsevierSaunders,Philadelphia,PA,2012，其通过引用并入本文)。例如，克隆的γ1-H链基因可以用引物通过PCR扩增，所述引物扩增γ1-H链恒定区基因，但省略编码分泌形式的γ1-H链的尾片和多聚腺苷酸化位点(参见图3B)。引物还可以将RNA剪接供体位点添加到γ1-H链基因的3'末端和独特的限制酶位点(例如，Not I的位点；可从New England Biolabs，Ipswich，MA获得的酶)。使用含有限制酶位点的PCR引物对编码RNA剪接受体位点、膜锚定外显子和γ1-H链基因的其余部分的单独DNA片段进行PCR扩增，所述限制酶位点使得能够重组编码膜形式的γ1-H链的γ1-H基因。参见图3B。描述了扩增和组装Ig基因的方法(参见例如美国专利No.7,741,077，同上)。
从患有慢性HCV感染的患者获得的记忆B细胞通过用编码识别DNP的膜IgG(κ)的Ig基因替换其功能性表达的Ig基因进行基因工程改造(参见上文)。编码抗DNP抗体的Ig H和L链基因可以通过使用同源重组的方法插入到染色体14和2上的功能性表达的Ig基因座中(参见例如1993年4月13日授权给Perry等人的美国专利No.5,202,238；2003年5月27日授权给Rajewsky和Zou的美国专利No.6,570,061和2005年1月11日授权给Reff等人的美国专利No.6,841,383，其通过引用并入本文)。为了靶向整合到功能性γ1-H链基因座中，来自JH簇和μ恒定区基因(CHμ；参见图2A)之间的内含子的靶向序列被置于抗DNPγ-H链基因的5'端，而γ1膜锚外显子下游的序列被置于γ-H链基因的3'端(参见图3A)。类似的靶向序列(即，来自Jk-Ck内含子和Ck基因的3'端的)用于将抗DNPκL链基因靶向功能性Ck基因。用于抗DNPH和L链的靶向载体分别包括选择标记基因，例如潮霉素抗性和组氨醇脱氢酶。含有潮霉素和组氨醇的培养基用于选择表达分泌型IgG抗DNP抗体的工程化成熟B细胞。Ig基因表达中必需的基本转录启动子序列和增强子序列保留在Ig基因整合素(integrants)中(参见Abbas et al.，同上)。在记忆B细胞的转染和选择后，使用附着于磁珠的DNP-KLH分离产生对DNP具有特异性的膜IgG抗体的那些细胞(方案和分离装置可从Miltenyi Biotec，Auburn，CA获得)。
为了产生产生两种不同抗体的B细胞，表达抗DNP膜IgG的工程化记忆B细胞被改造以用功能性Ig基因(对于H和L链)替换它们的非功能性种系Ig基因。例如，替代Ig基因可以编码分泌型抗体，即抗HCV抗体。编码抗病毒HCV抗体的Ig基因可以从产生抗病毒抗体的人B细胞克隆的染色体DNA中分离。例如，来自对HCV免疫的个体的人B细胞通过用Epstein Barr病毒(EBV)感染而永生化，并且来自个体B细胞克隆的上清液在免疫测定中针对识别HCV的抗体进行测试。描述了永生化B细胞和检测抗病毒抗体的方法(参见例如Zhang et al.,同上，和Corti et al.,J.Clin.Investigation 120:1663-1673,2010，其通过引用并入本文)。
可使用方法来克隆Ig重(H)链和轻(L)链基因(参见例如2010年6月22日授权给Grawunder等人的美国专利No.7741077和Early et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:857-861,1979，其通过引用并入本文)。例如，表达人抗HCV抗体IgG1(κ)的EBV转化的B细胞系在培养物中生长并用作使用利用苯酚/氯仿的标准方法分离信使RNA(mRNA)和基因组DNA的来源(参见例如Sambrook et al.,In:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2ndEd.,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)。使用聚合酶链式反应(PCR)和逆转录酶(RT)扩增后，分子克隆编码IgG1H链和κL链的mRNA。用于扩增H链和L链mRNA的方法和Ig基因引物描述于美国专利No.7,741,077(同上)中。将H链和L链mRNA(扩增为互补DNA)克隆到质粒载体(例如，可获自Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA的2.1-TOPO质粒)和Ig H链可变(V)区(包括Vh、D和J片段)的DNA序列中，并确定κL链V区(包括Vk和Jk片段)。V区DNA序列可以通过自动DNA测序确定(DNA测序服务可从Charles RiverLaboratories International,Inc.,Wilmington,MA获得)。
为了分离相应的基因组Ig基因，从抗HCV B细胞系(见上文)分离的基因组DNA用作人H链基因和κL链基因的PCR扩增的模板。用于扩增V区基因的PCR引物(寡核苷酸)(包括它们各自的启动子和上游(即V基因的5'端)侧翼区通过搜索从克隆的Ig mRNA建立的带有V区DNA序列的人基因组数据库来确定。例如，可以用计算机程序BLAST从National Center forBiotechnology Information获得的人基因组核苷酸数据库搜索匹配H链和L链V区的序列。人类RefSeq基因组数据库和BLAST软件可在线获得(参见例如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。描述了用于扩增Ig恒定区、增强子序列、H链膜锚、poly A加成位点和下游侧翼区的引物(即Ig基因的3'端)(参见例如，美国专利No.7,741,077，同上)。PCR扩增的基因组片段可以克隆到质粒载体如2.1-TOPO(可从Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA获得)中。表达抗DNP膜IgG抗体的记忆B细胞经工程改造以表达编码对HCV具有特异性的分泌型IgG抗体的Ig基因。可以改造抗HCV IgG H链基因(即，γ1-H链基因)以去除用于跨膜结构域(TM)、细胞质氨基酸(Cyt)和polyA加成位点的编码序列以产生仅编码分泌型H链的γ-H链基因。参见图3和Abbas et al.，同上。使用分子生物学中的标准方法改造Ig基因(参见例如Sambrook et al.,In:Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY,1989，其通过引用并入本文)以去除膜外显子并保留与功能性抗HCV Ig基因相关的启动子和增强子序列(参见例如Abbas et al.，同上)。编码抗病毒抗体的Ig H和Ig L链基因可以通过使用同源重组的方法插入非表达的Ig基因座中(参见例如1993年4月13日授权给Perry等人的美国专利No.5,202,238，同上,美国专利No.6,570,061，同上，和美国专利No.6,841,383，同上)。
为了促进同源重组，将编码分泌型抗HCV抗体的H链和L链的Ig基因克隆到质粒靶向载体中，以分别在染色体14和2上的相应的种系Ig基因座中获得靶向整合。参见图1。例如，种系μ-H链基因上游的JH片段的序列5'端(参见图2：“母本染色体14种系构型”)被克隆到在靶向质粒中的HCVγ-H链基因的上游(5')，并且将μ-H链膜锚定外显子的下游(3')序列克隆到γ-H链基因的下游(3')，以促进染色体14上的种系H链基因座的重组。描述了构建含有靶序列、替换基因和选择标记的靶向载体的方法(参见例如，同上的美国专利No.5,202,238，同上的美国专利No.6,570,061和同上的美国专利No.6,841,383)。
编码分泌型抗HCV抗体的靶向载体用于取代表达膜抗DNP的记忆B细胞中的非功能性种系μ-H链基因和非功能性κL链基因。靶向载体质粒通过限制酶消化而线性化，并通过电穿孔转移到记忆B细胞中，然后选择靶向载体质粒。描述了用于初级哺乳动物细胞的电穿孔的方法和试剂(参见例如可从BioRad Inc.，Hercules，CA获得的“ElectroporationGuide”，其通过引用并入本文)。电穿孔后的记忆B细胞在含有药物(如G418和甲氨蝶呤)的组织培养基中培养，以选择分别存在于H和L链靶向载体上的选择标记基因(即新霉素抗性基因和二氢叶酸还原酶)。描述了选择标记基因及其用途(参见例如美国专利No.6,841,383，同上)。测试对G418和甲氨蝶呤具有抗性的电穿孔记忆B细胞表达结合HCV的分泌型IgG。在记忆B细胞的转染和选择后，使用标准免疫测定法鉴定产生对HCV具有特异性的分泌型IgG抗体的那些细胞以评估B细胞上清液(参见例如Zhang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107:732-737,2010，其通过引用并入本文)。
可以在体外活化表达两种不同抗体的工程化记忆B细胞并测定其分泌型抗HCV抗体的增殖和产生。用二硝基苯酚-人血清白蛋白(DNP-HSA可从Biosearch Technologies，Novato，CA获得)体外培养工程化的抗DNP记忆B细胞以活化细胞。例如，在37℃下，在组织培养瓶中，在含有约1μg/ml的DNP-HAS的标准培养基(例如可获自Sigma-Aldrich Chem.Co.，St.Louis，Mo.的RPMI 1640无血清培养基)中培养约105至106细胞/mL的记忆B细胞。此外，记忆B细胞培养物可包括1μg/ml的抗CD40抗体和100ng/ml的白细胞介素-21(均可从R&DSystems,Minneapolis,MN获得)以活化细胞并促进抗体产生。描述了活化记忆B细胞的方法(参见例如美国专利No.7,378,276，同上)。为了评估活化，在培养3-5天后，在增殖测定中测试细胞。向等份的培养物补充3H-胸苷并再培养16小时。通过使用液体闪烁计数器测量3H-胸苷摄取(参见例如美国专利No.7,378,276，同上)。在没有DNP-HAS的情况下孵育的记忆B细胞的等同培养物用作增殖测定的阴性对照。为了评估由活化的记忆B细胞生产的抗HCV抗体，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测试源自约3-5天的培养物的培养物上清液，以检测和定量抗HCV抗体。描述了用ELISA检测和定量抗病毒抗体的方法(参见例如Corti et al.,Science 333:850-856,2011，其通过引用并入本文)。将病毒粒子或病毒蛋白吸附到微量滴定板上以捕获抗病毒抗体，并使用第二抗体(例如，抗-IgG)来检测抗病毒抗体。可以使用ELISA检测浓度范围为约1ng/ml至10,000ng/ml的抗病毒抗体。由重组细胞系产生的纯化的抗HCV抗体(参见例如Wrammert et al.,Nature 453:667-671,2008，其通过引用并入本文)可用于创建用于确定在ELISA测定中的抗体浓度度的标准曲线。来自未活化(即在没有DNP-HSA的条件下培养)的工程化记忆B细胞的上清液用作抗HCV抗体ELISA的阴性对照样品。
为了确保工程化记忆B细胞对患者安全，在B细胞中引入自杀基因。为了阻止不受控制的增殖(和/或其他不利事件)，使用逆转录病毒表达载体将自杀基因(单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因(HSV-TK))引入工程化记忆B细胞中。插入和表达HSV-TK基因并活化细胞毒性前药(如更昔洛韦)的方法是已知的(参见例如2003年6月10日授权给Gold和Lebkowski的美国专利No.6,576,464和1999年12月7日授权给Barber等人的美国专利No.5,997,859，其通过引用并入本文)。如果工程化B细胞被认为是不安全的或导致不良事件，则表达HSV-TK的B细胞用20μM更昔洛韦(作为Cytovene IV可从Roche Laboratories，Nutley，NJ获得)处理。通过表达HSV-TK的B细胞将更昔洛韦转化为毒性代谢物导致其死亡。不表达HSV-TK的细胞不受更昔洛韦的损害。
表达抗DNP BCR和抗病毒(抗HCV)分泌抗体的工程化记忆B细胞可以扩增并用于慢性HCV感染患者的过继细胞治疗。可以通过向患者施用DNP-HSA在体外(如上所述)或体内活化B细胞。可以进行皮下施用约100mg DNP-KLH的免疫以活化工程化记忆B细胞(参见例如Rentenaar et al.，同上)。可以刺激多次活化以响应HCV感染。
实施例3
经工程改造以表达对前列腺特异性抗原具有特异性的膜抗体和对前列腺癌脂质抗原具有特异性的第二分泌抗体的成熟B淋巴细胞。
产生针对前列腺癌脂质抗原(PCLA)的分泌型免疫球蛋白并产生针对前列腺特异性抗原(PSA)的膜免疫球蛋白的分离的重组B淋巴细胞系可用于细胞疗法以治疗哺乳动物受试者中的前列腺癌。可以作为过继细胞疗法将重组B淋巴细胞系注射到哺乳动物受试者中，以在前列腺癌细胞上提供针对PSA的免疫反应性，并且处理PSA并将其呈递给T淋巴细胞。重组B淋巴细胞系可以通过受试者中产生的内源性PSA活化，以产生分泌型抗PCLA抗体。也可以通过用外源性前列腺特异性抗原(PSA)注射哺乳动物受试者(或体外细胞培养物)在体内或离体活化重组B淋巴细胞系以产生分泌型抗PCLA抗体。可以基于哺乳动物受试者中前列腺癌细胞的检测来选择确定刺激哺乳动物受试者中的前列腺癌细胞的免疫反应性的时间。
从前列腺癌患者中分离出表达由膜IgM和IgD组成的B细胞受体(BCR)的多克隆成熟B细胞。成熟B细胞可以从患者的外周血白细胞中获得。例如，大约109个白细胞可以使用白细胞分离过程收获(参见例如，Bensinger et al.,Blood 81:3158-3163,1993，其通过引用并入本文)和大约5％(即，5×107个细胞)是B细胞。通过使用对B细胞标志物CD19、IgD、CD38和CD21(可从Becton Dickinson/Pharmingen，San Diego，CA获得)具有特异性的抗体从患者的白细胞中分离成熟B细胞。描述了使用磁珠(可从Miltenyi Biotech，Auburn，CA获得)和荧光活化细胞分选仪(FACS)纯化成熟B细胞的方法(参见例如美国专利No.7,378,276，同上)。表达膜IgM和IgD的成熟B细胞在体外培养并经基因工程改造以表达两种不同的抗体。
对成熟B细胞进行基因工程改造以表达对前列腺特异性抗原(PSA)具有特异性的膜IgG抗体。PSA是与前列腺癌相关的蛋白抗原，其可以使用重组DNA方法产生并纯化用作抗原(参见例如，2011年9月6日授权给Gudas等人的美国专利No.8,013,128，其通过引用并入此处)。为了获得编码对PSA具有特异性的抗体的人免疫球蛋白(Ig)基因，构建产生抗PSA抗体的杂交瘤细胞系。例如，用PSA对具有人Ig基因的转基因小鼠(例如，可获自AbgenixInc.，Fremont，CA的)免疫，并将它们的B细胞与骨髓瘤细胞融合伴侣，例如SP2/0细胞(可从American Type Culture Collection，Manassas，VA获得)融合以产生表达人抗体的杂交瘤细胞克隆(参见例如美国专利No.8,013,128，同上)。使用免疫测定法筛选来自杂合克隆的上清液，以检测结合PSA蛋白的人IgG抗体。将产生识别PSA的抗体的杂交瘤克隆扩增，并且使用BiacoreTM A100仪器(可从GE Healthcare，Piscataway，NJ获得)测试来自每个克隆的抗体以测量针对PSA的抗体亲和力和特异性(参见例如GE Healthcare,Application Note 84,“Early kinetic screening of hybridomas…”，其通过引用并入本文)。选择表达针对PSA的高亲和力抗体的杂交瘤以用于克隆其人Ig基因。可以使用克隆Ig重(H)链和轻(L)链基因的方法。参见例如2010年6月22日授权给Grawunder等人的美国专利No.7,741,077和Early et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:857-861,1979，其通过引用并入此处。例如，表达人抗PSA抗体，IgG1(κ)，的杂交瘤细胞系在培养基中生长，并用作使用利用苯酚/氯仿的标准方法分离信使RNA(mRNA)和基因组DNA的来源(参见例如Sambrooket al.,In:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)。编码IgG1H-链和κL-链的mRNA在使用聚合酶链式反应(PCR)和逆转录酶(RT)进行扩增后进行分子克隆。用于扩增该H链mRNA和L链mRNA的方法和Ig基因引物描述于美国专利No.7,741,077(同上)中。将H链和L链mRNA(作为互补DNA扩增)克隆到质粒载体(例如，可获自Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA的2.1-TOPO质粒)，并且测定Ig H链可变(V)区(包括Vh、D和J片段)和κL链V区(包括Vk和Jk片段)的DNA序列。V区DNA序列可以通过自动DNA测序确定(DNA测序服务可从Charles RiverLaboratories International,Inc.,Wilmington,MA获得)。为了分离相应的基因组Ig基因，将从抗PSA细胞瘤分离(参见上文)的基因组DNA用作人H链基因和κL链基因的PCR扩增的模板。用于扩增V区基因的PCR引物(寡核苷酸)(包括它们各自的启动子和上游(即V基因的5'端)侧翼区)通过搜索由克隆的Ig mRNA建立的具有V区DNA序列的人基因组数据库来确定。例如，可以用计算机程序BLAST在获自国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)的人类基因组核苷酸数据库中搜索匹配H链和L链V区的序列。人类RefSeq基因组数据库和BLAST软件可在线获得(参见例如万维网blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。描述了用于扩增Ig恒定区、增强子序列、H链膜锚、poly A加成位点和下游侧翼区的引物(即Ig基因的3'端)(参见例如，美国专利No.7,741,077，同上)。PCR扩增的基因组片段可以克隆到质粒载体如2.1-TOPO(可从Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA获得)中。IgG1H链基因(即，γ1-H链基因)可以经过工程改造以去除编码H链的分泌形式的“尾片”和多腺苷酸化位点，因此只有膜γ1-H链由工程化基因编码(参见例如图3，和Abbas et al.,Cellular and Molecular Immunology,7th Ed.,Elsevier Saunders,Philadelphia,PA,2011，其通过引用并入此处)。例如，克隆的γ1-H链基因可以用引物通过PCR扩增，所述引物扩增γ1-H链恒定区基因，但省略编码分泌形式的γ1-H链的尾片和多聚腺苷酸化位点。引物还可以将RNA剪接供体位点添加到γ1-H链基因的3'末端和独特的限制酶位点(例如，Not I的位点；可从New England Biolabs，Ipswich，MA获得的酶)。使用含有限制酶位点的PCR引物对编码γ1-H链基因的膜锚定外显子和其余部分的单独DNA片段进行PCR扩增，所述限制酶位点使得能够重组编码膜形式的γ1-H链的γ1-H基因。参见图3。描述了扩增和组装Ig基因的方法(参见例如美国专利No.7,741,077，同上)。
将编码分泌型抗PSA膜抗体的H链和L链的Ig基因克隆到质粒靶向载体中，以分别在染色体14和2上的相应的非功能性种系Ig基因座中实现靶向整合。参见图1。例如，将JH基因的序列5'端(参见图2A)克隆到在靶向质粒中的抗PSAγ1-H链基因的上游(5')，并且将μ-H链膜锚定外显子(TM和Cyt)的下游(3')序列克隆到γ1-H链基因的下游(3')，以促进染色体14上的种系H链基因座的重组。描述了构建含有靶序列、替换基因和选择标记的靶向载体的方法(参见例如1993年4月13日授权给Perry等人的美国专利No.5,202,238；2003年5月27日授权给Rajewsky和Zou的美国专利No.6,570,061，以及2005年1月11日授权给Reff等人的美国专利No.6841383，其通过引用并入本文)。将被构建以取代成熟B细胞中的非功能性种系μ-H链基因和非功能性κL链基因的靶向载体在体外转移到成熟B细胞中。靶向载体质粒通过限制酶注入而线性化，并通过电穿孔转移到成熟B细胞中，然后选择靶向载体质粒。描述了用于初级哺乳动物细胞的电穿孔的方法和试剂(参见例如可从BioRad Inc.，Hercules，CA获得的“Electroporation Guide”，其通过引用并入本文)。电穿孔后的成熟B细胞在含有药物(如G418和甲氨蝶呤)的组织培养基中培养，以选择存在于H和L链靶向载体上的选择标记基因(即分别为新霉素抗性基因和二氢叶酸还原酶)。描述了选择标记基因及其用途(参见例如美国专利No.6,841,383，同上)。测试对G418和甲氨蝶呤具有抗性的电穿孔成熟B细胞表达结合流感的膜IgG。例如，使用附着有PSA的磁珠分离表达对PSA具有特异性的膜IgG的工程化成熟B细胞，并且在用Ig基因转染之前在体外繁殖细胞以获得对不同前列腺肿瘤相关抗原具有特异性的第二抗体。
表达抗PSA膜IgG抗体的成熟B细胞被改造以表达编码对前列腺癌脂质抗原(PCLA)具有特异性的分泌型IgG抗体的Ig基因。提取PCLA且获得对PCLA特异性的单克隆抗体的方法是已知的(参见例如Zhang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107:732-737,2010，其通过引用并入本文)。可以如上所述获得对PCLA具有特异性的人IgG抗体和相应的Ig基因(参见例如美国专利No.7,741,077，同上，和Early et al.，同上)。可以改造抗PCLA IgG H链基因(即，γ-H链基因)以除去用于跨膜结构域和细胞质氨基酸的编码序列，以产生仅编码分泌型H链的γ-H链基因。参见图3和Abbas et al.，同上。抗PCLA Ig基因整合到成熟B细胞的功能重排Ig基因座中，其包括染色体14上的μ-H链基因和染色体2上的κL链基因(例如，参见图2；仅显示了H链基因)。使用如上所述的同源重组的方法将抗PCLAγ-H链基因和L链基因靶向整合到相应的功能性H和L链基因位点(即分别为染色体14和2)中(参见美国专利No.6,570,061，同上，美国专利No.6,841,383，同上)。为了靶向整合到功能性μ-H链基因座中，来自JH簇和μ恒定区基因(CHμ)之间的内含子的靶向序列被置于抗-PCLAγ-H链基因的5'端，而μ膜锚外显子下游的序列被置于γ-H链基因的3'端(参见图2)。类似的靶向序列(即，来自Jk-Ck内含子和Ck基因的3'端的)用于将抗PCLAκ轻链基因靶向功能性Ck基因。用于抗PCLAH和L链的靶向载体分别包括不同的选择标记基因，潮霉素抗性和组氨醇脱氢酶。含有潮霉素和组氨醇的培养基用于选择表达分泌型IgG抗PCLA抗体的工程化成熟B细胞。Ig基因表达中必需的基本转录启动子序列和增强子序列保留在Ig基因整合素(integrants)中(参见Abbas et al.，同上)。在成熟B细胞的转染和选择后，使用标准免疫测定法鉴定产生对PCLA具有特异性的分泌型IgG抗体的那些细胞，以评估B细胞上清液(参见例如Zhang et al.，同上)。在体外培养工程化的成熟B细胞并用PSA刺激以活化细胞并刺激抗PCLA IgG抗体的分泌。
为了确保工程化成熟B细胞对患者安全，在B细胞中引入自杀基因。为了阻止不受控制的增殖(和/或其他不利事件)，使用逆转录病毒表达载体将自杀基因(单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因(HSV-TK))引入工程化记忆B细胞中。插入和表达HSV-TK基因并活化细胞毒性前药(如更昔洛韦)的方法是已知的(参见例如2003年6月10日授权给Gold和Lebkowski的美国专利No.6,576,464和1999年12月7日授权给Barber等人的美国专利No.5,997,859，其通过引用并入本文)。如果工程化B细胞被认为是不安全的或导致不良事件，则表达HSV-TK的B细胞用20μM更昔洛韦(作为Cytovene IV可从Roche Laboratories，Nutley，NJ获得)处理。通过表达HSV-TK的B细胞将更昔洛韦转化为毒性代谢物导致其死亡。不表达HSV-TK的细胞不受更昔洛韦的损害。
将分离的重组B淋巴细胞施用给前列腺癌患者以提供针对PCLA的抗体并处理PSA且将其呈递给T细胞。将工程化以表达抗PSA膜IgG和抗PCLA分泌型IgG的自体B细胞在体外用约1μg/mL PSA培养约3至5天，然后在注射前在无血清培养基中洗涤。静脉内注射约5-10×108个B细胞，分别用免疫测定和流式细胞术监测患者外周血中的抗PCLA抗体的浓度和工程化B细胞的数量。
实施例4
向来自接种流感疫苗的患者的记忆B淋巴细胞提供对DNP具有特异性的并通过施用DNP-HSA活化的膜抗体。
产生针对流感病毒的分泌型广泛中和的免疫球蛋白并产生针对模型抗原的膜免疫球蛋白的分离的重组B淋巴细胞系可用于哺乳动物受试者的细胞疗法。作为细胞疗法，可以将重组B淋巴细胞系注射到哺乳动物受试者中，以提供免受流感病毒感染的免疫保护。通过用模型抗原(二硝基苯酚-钥孔血蓝蛋白(DNP-KLH))注射哺乳动物受试者(或体外细胞培养物)，可以在体内或离体活化重组B淋巴细胞系以产生广泛中和的流感抗体。可以基于在整个群体中爆发流感感染的时间来选择刺激哺乳动物受试者中的流感病毒感染的免疫保护的时间。
用流感疫苗使个体免疫以获得具有对流感病毒具有特异性的B细胞受体(BCR)的记忆B细胞。记忆B细胞响应于用流感病毒的亚单位疫苗免疫而发展，所述亚单位疫苗可以引发广泛中和的抗体(参见例如Ekiert et al.,Science 324:246-251,2009，其通过引用并入此处)。在右臂皮下注射1mg流感病毒疫苗(例如，来自病毒血凝素(HA)蛋白的保守表位)进行初次免疫。免疫接种后约12-14天，使用流感HA蛋白-生物素和藻红蛋白(PE)-链霉抗生物素蛋白和荧光素-抗CD27抗体分离表达对流感具有特异性的BCR的记忆B细胞以鉴定记忆B细胞(生物素、链霉抗生物素蛋白和抗体是可从Becton Dickinson/Pharmingen，SanDiego，CA获得)。通过用荧光活化细胞分选仪(例如，可从Becton Dickinson，FranklinLakes，NJ获得的)进行细胞分选分离流感特异性记忆B细胞。例如，参见在2008年5月27日授权给Ettinger等人的美国专利No.7,378,276，和在2011年8月9日授权给Brown等人的美国专利No.7,993,864，其通过引用并入此处。表达对流感HA表位具有特异性的膜IgG的记忆B细胞在体外培养并在用对二硝基苯酚(DNP)具有特异性的膜免疫球蛋白转染之前进行扩增。例如，在37℃下，在组织培养瓶中，在标准培养基(例如，可可获自Sigma-Aldrich Chem.Co.,St.Louis,Mo.的RPMI 1640无血清培养基)中按约105至106个细胞/mL培养记忆B细胞，该标准培养基含有约1μg/ml的流感HA肽(参见例如，Ekiert et al.，同上)。此外，记忆B细胞培养物可包含1μg/ml的抗CD40抗体和100ng/ml的白细胞介素-21(均可获自R&D Systems,Minneapolis,MN)以活化细胞(参见例如美国专利No.7,378,276，同上)。使用重组DNA方法生产对DNP具有特异性的膜免疫球蛋白，并将其插入记忆B细胞的膜中，从而产生抗流感抗体。编码对DNP具有特异性的膜IgG抗体的免疫球蛋白(Ig)基因可以从用DNP-KLH免疫的健康志愿者获得(参见例如Biosearch Technologies：DNP-KLH产品信息表，其通过引用并入本文)。通过用荧光活化细胞分选仪(例如，可从BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ获得的)进行细胞分选，分离具有识别DNP的膜IgG的记忆B细胞。例如，参见同上的美国专利No.7,378,276和同上的美国专利No.7,993,864。
编码抗DNP抗体的免疫球蛋白基因从个体B细胞中分离(参见例如Tiller et al.,J.Immunol.Methods 329:112-124,2008，其通过引用并入本文)。对于每个单独的抗DNP B细胞，通过使用Superscript逆转录酶(可获自Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)和TaqDNA聚合酶(可获自Qiagen，Valencia，CA)进行逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)来扩增Ig重(H)链基因转录物和相应的Ig轻(L)链基因转录物。用于扩增Ig H链和Ig L链的反应条件和寡核苷酸引物是已知的(参见例如Tiller et al.,同上)。分离编码Ig H和Ig L链可变(V)区基因的DNA片段并将其克隆到含有Ig H和Ig L链恒定区基因(例如Cγ1和Ck)的哺乳动物表达载体中。使用DNA测序仪(例如，使用可获自Applied Biosystems，Carlsbad，CA的3130Genetic Analyzer)测定克隆的抗DNP Ig基因(γ1-H链和κ-L链)的DNA序列。IgG1H链基因(即，γ1-H链基因)经过工程改造以去除编码H链的分泌形式的“尾片”和多腺苷酸化位点，因此只有膜γ1-H链由工程化基因编码(参见例如图3B，和Abbas et al.,Cellular andMolecular Immunology,7th Ed.,Elsevier Saunders,Philadelphia,PA,2012，其通过引用并入本文)。例如，克隆的γ1-H链基因可以用引物通过PCR扩增，所述引物扩增γ1-H链恒定区基因，但省略编码分泌形式的γ1-H链的尾片和多聚腺苷酸化位点。使用含有限制酶位点的PCR引物对编码γ1膜锚定外显子和γ1-H链基因的其余部分的单独DNA片段进行PCR扩增，所述限制酶位点使得能够重组编码膜形式的γ1-H链的γ1-H基因。参见图3B。描述了扩增和组装Ig基因的方法(参见例如美国专利No.7,741,077，同上)。
编码抗DNP膜抗体的基因工程化免疫球蛋白基因在哺乳动物细胞系中表达，并且膜IgG从细胞系中纯化。例如，使用标准重组DNA方法将卡巴(κ)L链基因和经修饰的γ-1H链基因插入慢病毒表达载体中(参见例如2007年5月24日公开的Yang等人的美国专利公开No.2007/0116690，其通过引用并入本文)。病毒载体用于转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(其可从美国菌种保藏中心(Manassas，VA)获得)，其被改造以表达膜免疫球蛋白。可以使用表达膜免疫球蛋白的方法。参见例如Price et al.,J.Immunol.Methods 343:28-41,2009，其通过引用并入本文。为了鉴定和分离表达抗DNP膜IgG的CHO克隆，使用藻红蛋白缀合的抗人IgG抗体来标记CHO细胞并使用FACS对它们进行分选(参见例如Price et al.，同上)。分离并扩增产生抗DNP膜IgG的CHO细胞系，并使用免疫亲和柱从CHO细胞裂解物中纯化膜IgG。由蛋白A-Sepharose(可获自Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO)构建的亲和柱用于从工程化CHO细胞的裂解物中纯化膜IgG。例如，可以在含有0.15M NaCl、0.01M TrisHCl、pH 8.2、1mMEDTA、2mM苯甲基磺酰氟、0.5％Nonidet P-40和1mg/mL HSA的缓冲液中裂解细胞(参见例如Schneider et al.,J.Biol.Chem.257:10766-10769,1982，其通过引用并入本文)。纯化的抗DNP膜IgG用于构建脂质体，该脂质体与对流感抗原具有特异性的记忆B细胞融合(参见上文)。
含有抗DNP膜IgG的脂质体由磷脂和纯化的抗DNP膜IgG抗体构建。具有掺入的抗DNP膜IgG抗体的脂质体可以与对流感病毒具有特异性的记忆B细胞融合，以获得具有掺入B细胞膜的抗DNP膜免疫球蛋白的记忆B细胞。脂质体可以由胆固醇和L-α-磷脂酰胆碱制备。参见例如美国专利公开No.2005/0208120，其通过引用并入本文。胆固醇和L-α-磷脂酰胆碱在氯仿中以2：7的摩尔比混合，并使用氩气流蒸发掉氯仿。将脂质体重悬浮于pH8的140mMNaCl、10mM Tris HCl、0.5％脱氧胆酸盐中并超声处理3分钟。通过将膜IgG与脂质体以1:10的摩尔比组合并在4℃下相对于磷酸盐缓冲盐水透析72小时，将纯化的抗DNP膜抗体(参见上文)插入脂质体中。脂质体的特征在于评估脂质体大小和掺入脂质体中的抗DNP膜IgG蛋白的量。使用动态光散射和流式细胞术测定脂质体大小(参见例如Albani的美国专利申请No.2005/0208120，其通过引用并入本文)。例如，含有抗DNP抗体的脂质体可具有约50纳米的平均直径。为了测量脂质体上的抗DNP IgG蛋白，在用FITC标记的抗-IgG抗体染色后，在流式细胞仪上分析脂质体。基于FITC荧光，前向散射和侧向散射对脂质体进行分选，以分离和计数具有IgG的脂质体。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量脂质体上的抗DNP IgG蛋白。通过流式细胞术分析脂质体并通过ELISA测量IgG和其他蛋白的方法是已知的(参见例如美国专利申请No.2005/0208120，同上)。
将含有抗DNP膜IgG的脂质体与对流感病毒具有特异性的记忆B细胞(见上文)融合，以获得具有抗DNP B细胞受体的记忆B细胞。在表面上具有抗DNP BCR的纯化脂质体与记忆B细胞电融合(参见例如Zimmermann et al.,IEEE Transactions On Plasma Science28:72-82,2000，其通过引用并入本文)。例如，将比例为1：1的脂质体与记忆B细胞悬浮在含有0.1mM乙酸钙、0.5mM乙酸镁和1mg/ml牛血清白蛋白的低渗缓冲液中。将渗透压调节至约75m Osm，并将约200μL含有约2×104至2×105个细胞的细胞悬浮液置于电融合室中(电融合发生器和室可从BTX Instrument Division,Harvard Apparatus,Inc.Holliston,MA获得)。通过施加5V的幅值和2MHz频率的交变场持续约30秒来比对细胞。然后通过施加20V至40V的幅值和15μsec持续时间的矩形融合脉冲来启动融合。再次施加交替场持续30秒以在融合发生时将细胞和脂质体保持在适当位置。将细胞转移至培养瓶中并让其生长2至5周。
融合的记忆B细胞的特征在于评估它们的抗DNP BCR和它们的抗流感抗体的产生。使用荧光DNP-HSA和FACS分析测试融合的记忆B细胞的膜抗DNP抗体。上文描述了使用流式细胞术评估膜抗DNP IgG抗体的方法(参见实施例2)。当用DNP-HSA刺激时，可以在体外活化融合的记忆B细胞以产生抗流感抗体，并且可以基于流感病毒血凝素蛋白或流感病毒粒子使用ELISA测量分泌型抗流感病毒抗体的产生。测量抗流感抗体和记忆B细胞活化的方法是已知的(参见例如美国专利No.7,378,276，同上和实施例1)。
作为治疗性和预防性细胞疗法，将具有流感病毒感染风险的人类患者施用可在体内活化的重组融合记忆B细胞。当需要抗流感抗体应答时，通过向患者施用DNP-HSA，体内活化重组记忆B细胞。例如，当患者在“流感季节”之前健康时，大约108-109个融合的B细胞可以作为预防剂注射。当需要时，通过给患者皮内注射100μg的DNP-HSA，可以活化融合的记忆B细胞。例如，融合记忆B细胞可在患者暴露于流感病毒后或处于感染的第一迹象后被活化。可以通过对患者的外周血取样并用流感病毒粒子作为抗原进行ELISA来监测抗流感抗体的产生。此外，可以基于来自流感病毒的保守表位通过ELISA确定多种流感病毒株的广泛中和抗体的存在(参见例如Ekiert et al.，同上)。
实施例5
被工程化以产生两种不同的抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抗体的自体记忆B淋巴细胞的构建。
产生针对甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的两种不同的分泌型免疫球蛋白并产生针对第三种金黄色葡萄球菌抗原的膜免疫球蛋白的分离的重组B淋巴细胞系可用于哺乳动物受试者的细胞疗法。作为细胞疗法，可以将重组B淋巴细胞系注射到哺乳动物受试者中，以提供免疫保护而免受MRSA的感染。可以通过用金黄色葡萄球菌抗原注射哺乳动物受试者(或体外细胞培养物)，在体内或离体活化重组B淋巴细胞系以产生针对MRSA的抗体。可以基于所述受试者暴露于MRSA或基于MRSA感染的症状的出现来选择刺激哺乳动物受试者中的免疫保护以免受MRSA感染的时间。
感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的患者经历了反复发作的感染，用他自己的长寿记忆B细胞进行治疗，这些B细胞经过基因工程改造以表达两种不同的抗-金黄色葡萄球菌单克隆抗体(MAb)。表达膜IgG(也称为表面IgG或B细胞受体(BCR))的记忆B细胞从患有复发性MRSA感染的患者的外周血中分离。通过以下方式从患者的外周血中分离具有未知的抗原特异性的多克隆记忆B细胞：1)使用Ficoll Hypaque密度梯度(可获自SigmaAldrich，St.Louis，MO)分离外周血单核细胞；2)使用磁珠(可获自Stem Cell Technology，Vancouver，BC)对总B细胞进行阴性选择，和3)用识别IgG和CD27的荧光单克隆抗体、记忆B细胞标记物来标记细胞并执行荧光活化细胞分选。参见例如在2008年5月27日授权给Ettinger等人的美国专利No.7,378,276和在2011年8月9日授权给Brown等人的美国专利No.7,993,864，其通过引用并入本文。使用基因工程方法修饰纯化的记忆B细胞以引入编码两种不同抗-金黄色葡萄球菌抗体的免疫球蛋白(Ig)基因。
编码第一抗-金黄色葡萄球菌IgG抗体的Ig基因从产生抗体的杂交瘤细胞系中分离。描述了构建产生对聚-N-乙酰葡糖胺(PNAG)具有特异性的IgG抗体的杂交瘤细胞系的方法，该聚-N-乙酰葡糖胺针对抗N-金黄色葡萄球菌具有保护作用(参见例如，Kelly-Quintoset al.,Infection and Immunity 74:2742-2750,2006，其通过引用并入本文)。
例如，用PNAG对具有人Ig基因的转基因小鼠(例如，可获自Abgenix Inc.，Fremont，CA的)免疫，并将它们的B细胞与骨髓瘤细胞融合伴侣，例如SP2/0细胞(可从American Type Culture Collection，Manassas，VA获得)融合以产生表达人抗体的杂交瘤细胞克隆(参见例如美国专利No.8,013,128，同上)。选择表达针对PNAG的高亲和力抗体的杂交瘤以用于克隆其Ig基因。已知克隆Ig重(H)链和轻(L)链基因的方法(参见例如2010年6月22日授权给Grawunder等人的美国专利No.7,741,077和Early et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:857-861,1979，其通过引用并入此处)。例如，表达抗PNAG抗体，IgG1(κ)，的杂交瘤细胞系在培养基中生长，并用作使用利用苯酚/氯仿的标准方法分离信使RNA(mRNA)和基因组DNA的来源(参见例如Sambrook et al.,In:Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)。编码IgG1H-链和κL-链的mRNA在使用聚合酶链式反应(PCR)和逆转录酶(RT)进行扩增后进行分子克隆。用于扩增该H链mRNA和L链mRNA的方法和Ig基因引物描述于美国专利No.7,741,077(同上)中。将H链和L链mRNA(作为互补DNA扩增)克隆到质粒载体(例如，可获自Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA的2.1-TOPO质粒)，并且测定Ig H链可变(V)区(包括Vh、D和J片段)和κL链V区(包括Vk和Jk片段)的DNA序列。V区DNA序列可以通过自动DNA测序确定(DNA测序服务可从Charles River Laboratories International,Inc.,Wilmington,MA获得)。
为了分离相应的基因组Ig基因，将从抗PNAG细胞瘤分离(如上述那样分离)的基因组DNA用作H链基因和κL链基因的PCR扩增的模板。用于扩增V区基因的PCR引物(寡核苷酸)(包括它们各自的启动子和上游(即V基因的5'端)侧翼区)通过搜索由克隆的Ig mRNA建立的具有V区DNA序列的人基因组数据库来确定。例如，可以用计算机程序BLAST在可获自国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的人类基因组核苷酸数据库中搜索匹配H链和L链V区的序列。人类RefSeq基因组数据库和BLAST软件可在线获得(参见例如万维网blast.ncbi.nlm.nih/gov/blast.cgi)。描述了用于扩增Ig恒定区、增强子序列、H链膜锚、poly A加成位点和下游侧翼区的引物(即Ig基因的3'端)(参见例如，美国专利No.7,741,077，同上)。PCR扩增的基因组片段可以克隆到质粒载体如2.1-TOPO(可从Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA获得)中。IgG1H链基因(即，γ1-H链基因)可以经过工程改造以去除编码H链的分泌形式的“尾片”和多腺苷酸化位点，因此只有膜γ1-H链由工程化基因编码(参见例如图3B，和Abbas et al.,Cellular and Molecular Immunology,7th Ed.,Elsevier Saunders,Philadelphia,PA,2011，其通过引用并入此处)。例如，克隆的γ1-H链基因可以用引物通过PCR扩增，所述引物扩增γ1-H链恒定区基因，但省略编码分泌形式的γ1-H链的尾片和多聚腺苷酸化位点。使用含有限制酶位点的PCR引物对编码γ1-H链基因的膜锚定外显子和其余部分的单独DNA片段进行PCR扩增，所述限制酶位点使得能够重组编码膜形式的γ1-H链的γ1-H基因。参见图3B。描述了扩增和组装Ig H和L链基因的方法(参见例如美国专利No.7,741,077，同上)。
编码抗PNAG抗体的重链(H)和轻链(L)的Ig基因克隆到靶向质粒载体中，以使得能分别靶向整合和替换染色体14和2(例如，参见图1)上相应的功能重排的Ig H和Ig L链基因。使用同源重组将基因靶向Ig基因座的方法是已知的(参见例如1993年4月13日授权给Perry等人的美国专利No.5,202,238；2003年5月27日授权给Rajewsky和Zou的美国专利No.6,570,061和2005年1月11日授权给Reff等人的美国专利No.6,841,383，其通过引用并入本文)。为了靶向整合到功能性γ1-H链基因座中，来自JH簇和μ恒定区基因(CHμ；参见图2A)之间的内含子的靶向序列被置于抗PNAGγ-H链基因的5'端，而γ1膜锚外显子下游的序列被置于γ-H链基因的3'端(参见图3A)。类似的靶向序列(即，来自JK-CK内含子和CK基因的3'端)用于将抗PNAGκ轻链基因靶向功能性CK基因内。抗PNAG H和L链的靶向载体分别包括能选择的标记基因，例如潮霉素抗性和ZeocinTM博来霉素抗性。含有潮霉素B和ZeocinTM博来霉素的培养基用于选择表达膜IgG抗PNAG抗体的工程化记忆B细胞(方案、选择剂和可选择的标记可从Invitrogen，Carlsbad，CA获得)。Ig基因表达所必要的必需转录启动子序列和增强子序列保留在Ig替换基因中(参见Abbas et al.，同上)。在转染、同源重组和选择后，使用附着有PNAG的磁珠分离表达对金黄色葡萄球菌PNAG具有特异性的膜IgG的重组记忆B细胞(磁珠和方案可从Miltenyi Biotech Inc.，Auburn，CA获得)。在用编码对不同金黄色葡萄球菌抗原具有特异性的第二抗体的Ig基因转染之前，体外培养表达抗PNAG膜抗体的记忆B细胞。
使用重组DNA方法产生记忆B细胞以表达对PNAG具有特异性的膜抗体，并将该记忆B细胞进一步进行基因工程改造以表达第二抗金黄色葡萄球菌MAb。对免疫显性葡萄球菌抗原A(IsaA)具有特异性的单克隆抗体(MAb)在记忆B细胞中表达。为了获得对金黄色葡萄球菌感染具有预防和治疗活性的抗IsaA MAb，使用纯化的重组IsaA蛋白构建杂交瘤细胞系以使小鼠免疫并选择杂交瘤克隆(参见例如Lorenz et al.,Antimicrob.AgentsChemoth.55:165-173,2011，其通过引用并入本文)。为克隆抗IsaA抗体可变区基因，从选定的杂交瘤细胞系中提取信使RNA，并将其用作用于利用逆转录酶(RT)和使用聚合酶链反应(PCR)扩增(即RT-PCR)而进行互补DNA合成的模板。描述了在抗体表达载体中扩增和克隆重链和轻链的可变区的方法(参见例如，Kelly-Quintos et al.，同上)。例如，编码完整伽马(γ)-1H链和拉姆达(λ)L链的质粒表达载体可以使用限制酶和标准分子生物学方法构建(参见例如Sambrook et al.，同上)。为了促进抗-IsaA抗体在记忆B细胞中的转染和表达，可以将γ1-H链基因和λ-L链基因转移至慢病毒载体(参见例如在2011年5月10日授权给Yang等人的美国专利No.7,939,059，其通过引用并入本文)。用重组慢病毒感染记忆B细胞导致载体序列在记忆B细胞的基因组DNA中的随机位点(即，未靶向)整合，并产生分泌型IgG1(λ)抗IsaA抗体。方案和慢病毒表达载体可从Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA获得；参见例如User Manual:“ViraPowerTMHiPerfomTMLentiviral Expression System”，其通过引用并入本文。例如，用滴定的重组慢病毒原液感染一瓶的记忆B细胞，以便每个细胞产生约1.0个转导单位的多重感染。将细胞和慢病毒在37℃、5％的CO2中培养过夜；然后，用新鲜培养基替换含有慢病毒的培养基并孵育过夜。在第三天，将细胞置于选择性培养基中(例如，含有杀稻瘟素的培养基可从Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA获得)以选择含有慢病毒载体的稳定转导的细胞。对杀虫剂具有抗性的记忆B细胞的克隆也被选择用于潮霉素B和ZeocinTM以选择表达两种抗MRSA抗体的克隆。为了鉴定和纯化表达两种抗金黄色葡萄球菌抗体的记忆B细胞，使用磁珠(可获自Miltenyi Biotec Inc.，Auburn，CA)纯化具有对PNAG具有特异性的表面IgG的记忆B细胞，并将其用PNAG体外培养。描述了获得用于人记忆B细胞的PNAG和培养条件的方法(参见例如，Kelly-Quintos et al.，同上，和美国专利No.7,378,276，同上)。用ELISA测试来自培养物的上清液的抗IsaA IgG抗体(参见例如Lorenz etal.，同上)，并选择产生抗-IsaA抗体的记忆B细胞并将其扩增用于过继免疫疗法。
作为治疗性和预防性细胞疗法，将具有MRSA感染风险的人类患者施用可在体内活化的重组记忆B细胞。当需要抗MRSA抗体应答时，通过向患者施用金黄色葡萄球菌抗原，体内活化重组记忆B细胞。例如，当患者是健康的或者最近感染了MRSA时，可以将约108-109个重组B细胞作为预防剂注射。当需要时，通过给患者皮内注射100μg的金黄色葡萄球菌抗原，可以活化重组记忆B细胞。例如，记忆B细胞可在患者暴露于MRSA后或处于感染的第一迹象后被活化。可以通过对患者的外周血取样并用MRSA抗原作为靶向抗原进行ELISA来监测抗MRSA抗体的产生。
实施例6
过继免疫治疗耐药性细菌感染与自体记忆B淋巴细胞工程化产生两种不同的抗金黄色葡萄球菌抗体。
被工程化以产生两种不同的抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抗体的自体记忆B淋巴细胞对耐药性细菌感染的过继免疫治疗。
产生针对甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的两种不同的分泌型免疫球蛋白并产生针对金黄色葡萄球菌抗原的膜免疫球蛋白的分离的重组B淋巴细胞系可用于哺乳动物受试者的细胞疗法。作为细胞疗法，可以将重组B淋巴细胞系注射到哺乳动物受试者中，以提供免疫保护而免受MRSA的感染。可以通过用金黄色葡萄球菌抗原注射哺乳动物受试者(或体外细胞培养物)，在体内或离体活化重组B淋巴细胞系以产生针对MRSA的抗体。可以基于可以基于在整个群体中爆发MRSA感染的时间来选择刺激哺乳动物受试者中的免疫保护以免受MRSA感染的时间。
为了保护和治疗患有复发性MRSA感染的患者，给患者施用自体重组B细胞。对患者的记忆B细胞进行基因工程改造以表达识别两种金黄色葡萄球菌抗原的两种抗体：聚-N-乙酰葡糖胺(PNAG)和免疫显性金黄色葡萄球菌抗原(IsaA)。重组记忆B细胞在体外在培养基(例如RPMI 1640，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中活化和扩增，所述培养基含有：同源抗原，PNAG，约100ng/mL，和活化细胞因子，例如白细胞介素-2(Roche，Indianapolis，IN)、白细胞介素-4、白细胞介素-21和抗CD40抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)。在培养约5天后，收集记忆B细胞，洗涤并浓缩，然后输注给患者。在患者中输注约5×108个重组B细胞，并且将重组B细胞扩增且维续，然后对患者的外周血进行取样。描述了输注和跟踪遗传工程改造的淋巴细胞的方法(参见例如Kalos et al.,Sci.Transl.Med.3,95ra73,2011；DOI:10.1126/scitranslmed.3002842，其通过引用并入本文)。例如，对从患者全血中获得的基因组DNA的定量PCR分析可用于确定每微克基因组DNA的抗PNAG Ig基因和抗IsaA Ig基因的拷贝数。用ABITaqman技术(可获自Life Technologies Corp.，Carlsbad，CA)分析大约100-200ng的基因组DNA。通过分析掺有抗金黄色葡萄球菌Ig基因的已知拷贝数的对照基因组DNA来验证对转染的Ig基因具有特异性的PCR引物。还可以使用流式细胞术和荧光标记的PNAG组合抗-IgG抗体来评估在外周血中持久存在的基因工程化B细胞的数量。例如，藻红蛋白(PE)-缀合的PNAG和异硫氰酸荧光素(FITC)-缀合的抗IgG用于将重组B细胞染色并对它们计数。用于流式细胞术的方案、试剂和仪器可从Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ获得。此外，可以使用ELISA分析患者外周血中抗IsaA IgG(λ)抗体的水平。可以用重组纯化的IsaA蛋白和抗-IgG或抗-L-链抗体构建ELISA。构建和进行ELISA的方法是已知的(参见例如Kelly-Quintos et al.，同上)。
重组记忆B细胞可以在体内以及体外活化以产生抗金黄色葡萄球菌抗体。记忆B细胞可以通过从感染患者的金黄色葡萄球菌释放的PNAG或通过注射纯化的PNAG在体内活化。从金黄色葡萄球菌中纯化PNAG的方法是已知的(参见例如Lorenz et al.，同上)。记忆B细胞通过PNAG与其B细胞受体(BCR)的结合以及通过与T细胞和细胞因子的相互作用在体内活化(参见例如Abbas et al.，同上)。为了增强重组记忆B细胞的活化，可以给PNAG施用免疫佐剂(例如氢氧化铝)。可以响应于复发的MRSA感染来执行记忆B细胞的重复的活化。
作为治疗性和预防性细胞疗法，将具有MRSA感染风险的人类患者施用可在体内活化的重组记忆B细胞。当需要抗MRSA抗体应答时，通过向患者施用PNAG抗原，体内活化重组记忆B细胞。例如，当患者是健康的或者最近感染了MRSA时，可以将约108-109个重组B细胞作为预防剂注射。当需要时，通过给患者皮内注射100μg的PNAG，可以活化重组记忆B细胞。例如，记忆B细胞可在患者暴露于MRSA后或处于感染的第一迹象后被活化。可以通过对患者的外周血取样并用MRSA抗原作为靶向抗原进行ELISA来监测抗MRSA抗体的产生。此外，MRSA的抗体的存在可以通过ELISA基于来自MRSA的保守表位来确定(参见例如Ekiert et al.，同上)。
实施例7
用重组B细胞受体构建细胞毒性B细胞。
B淋巴细胞响应来自传染病微生物或癌细胞的结合抗原产生抗体，但当用抗原和选择的细胞因子共刺激时，它们也可产生细胞毒性分子。例如，用细胞因子、白细胞介素-21(IL-21)和抗原刺激B细胞可导致会造成细胞死亡的细胞毒性分子(例如颗粒酶B)的产生。通过改造识别疾病相关抗原和传导信号以诱导细胞毒性效应子功能的表达的重组B细胞受体(BCR)来构建可用于过继性细胞疗法的细胞毒性B细胞。
用单链抗体、膜免疫球蛋白(Ig)结构域和IL-21受体的细胞质结构域构建重组B细胞受体。在这种情况下，单链抗体(单链可变片段(SCFv))对肿瘤相关抗原(前列腺癌脂质抗原(PCLA))具有特异性。SCFv连接至参与B细胞活化的信号传导的包括：铰链(H)、恒定区3(CH3)、跨膜(TM)和细胞质(Cyto)结构域的膜Ig重链结构域，并且最后，连接至发出信号以从B细胞中引发细胞毒性功能的IL-21受体细胞质结构域。参见图8A。因此，在这些工程化B细胞中的重组B细胞受体的基因转移和表达产生对抗原PCLA有响应的经修饰的B细胞。在暴露于癌细胞上的PCLA后，经修饰的B细胞产生细胞毒性效应分子，例如颗粒酶B，并杀死表达PCLA的前列腺癌细胞。
分离编码结合PCLA的抗体的免疫球蛋白(Ig)基因并将其改造以构建用于在患病受试者自身的B细胞中转移和表达的重组BCR基因。PCLA(一种与前列腺癌相关的糖脂抗原)从前列腺癌细胞系获得并用作抗原。糖脂抗原用于选择结合PCLA的单链抗体可变片段(SCFv)。已经描述了含有通过接头肽连接的Ig可变区基因的SCFv，并且该SCFv可以适用于该实施方案，并且可以使用从噬菌体展示单链可变片段(SCFv)文库中选择抗体的方法。选择在前列腺癌细胞上紧密结合PCLA的SCFv蛋白(和相应的SCFv基因)用于构建重组BCR。
抗PCLA SCFv基因附着于编码膜IgG1重链(H)链的结构域的片段，以产生重组B细胞受体。膜IgG1重链的铰链片段1008、羧基末端重链恒定区结构域(CH3)1010、跨膜结构域(TM)1015和细胞质结构域1020在SCFv 1005基因的3'末端编码。参见图8A。构建膜IgG H链的详细方法可以适用于该实施方案。IgG1跨膜和细胞质结构域是52个氨基酸片段，其与包含B细胞受体的相关的跨膜B细胞信号蛋白，Igα和Igβ，相互作用[(参见例如Abbas et al.,Cellular and Molecular Immunology,7th Edition,pp.159-161,2012,Elsevier,Philadelphia,PA)]。
重组B细胞受体的最后片段含有白细胞介素-21(IL-21)受体1025的细胞质结构域。IL-21受体可以发出信号以在B细胞中引发细胞毒性效应子功能。例如，用抗Ig抗体和IL-21共刺激人B细胞(即，刺激膜IgG)引发细胞毒性效应物(如颗粒酶B和穿孔素)的表达。已经鉴定了IL-21受体蛋白的细胞质结构域，并且已经描述了IL-21受体的结构和信号传导。关于重组B细胞受体蛋白的模型，参见图8A。
编码SCFv、IgG恒定结构域和IL-21受体细胞质结构域的DNA片段使用聚合酶链式反应从DNA克隆扩增或合成(例如，Custom DNA合成可从Life Technologies Corp.，GrandIsland，NY 14072获得)。编码抗-CDLA SCFv的片段可以从上面选择的噬菌体克隆中扩增。免疫球蛋白恒定区、跨膜结构域和细胞质结构域序列可以通过基于公众可获得的序列的自动DNA合成来合成，并且IL-21受体序列和亚结构域是可用的。编码重组B细胞受体的基因可以使用剪接重叠延伸方法由DNA片段组装。
将重组B细胞受体基因插入哺乳动物细胞表达载体中以转移到人B细胞中。描述了具有巨细胞病毒(CMV)启动子元件、选择标记基因和poly A添加信号的表达载体。参见图8B。质粒载体在CMV启动子的控制下指导重组B细胞受体的表达并携带可选择的标记基因以使得能用药物选择表达载体的B细胞(例如，Neo表达赋予对G418的抗性；两种抗性基因，Neo和药物G418，都可从InVivoGen，San Diego，CA获得)。使用可从Lonza Inc.，Allendale，NJ07401获得的设备、试剂盒和方案将编码重组B细胞受体的质粒载体转染到原代人B细胞(从外周血中分离)中(参见例如，Human B Cell Protocol Kit，其通过引用并入此处)。表达重组B细胞受体的转染的G418抗性B细胞通过流式细胞术使用对重组B细胞受体中存在的SCFv具有特异性的抗体进行鉴定。替代地，PCLA抗原可用于鉴定表达重组B细胞受体的B细胞，例如，通过流式细胞术鉴定和分选细胞来实现。
表达重组B细胞受体的B细胞在体外测试刺激后的细胞毒性效应子功能。用对重组BCR的SCFv或Ig H链恒定区组分(例如，抗人IgG)具有特异性的抗体刺激表达抗PCLA重组BCR的细胞毒性B细胞，并通过使用免疫测定来分析细胞培养物上清液中颗粒酶B的存在。Granzyme B ELIspot测定试剂盒(可从Cell Sciences，Canton，MA获得)可用于测定培养物中产生颗粒酶B的细胞的数量。Immunospot Analyzer和Immunospot 3软件(CTL CellularTechnology Ltd.，Cleveland，OH)可用于检测和对产生经修饰的B细胞的颗粒酶B计数。
为了确定重组细胞毒性B细胞杀死靶细胞，使用基于流式细胞术的测定法测定靶细胞的在暴露于重组细胞毒性B细胞后的凋亡的百分比。例如，将约250,000个重组细胞毒性B细胞加入10,000个前列腺癌细胞(例如表达PCLA的PC3细胞系)中。在共培养约3天后，通过用膜联蛋白V和碘化丙啶染色确定靶细胞(即PC3)的凋亡；通过流式细胞术确定凋亡细胞的百分比。将具有不表达PCLA的靶细胞系(例如HeLa)的匹配的阴性对照培养物与PC3培养物进行比较。此外，分析了具有不同比例的效应细胞(重组细胞毒性B细胞)与靶细胞(PC3细胞)的培养物。例如，分析具有效应细胞和靶向细胞(效应细胞：靶向细胞的比例为5：1、10：1、25：1和50：1)的培养细胞的靶细胞凋亡和活力。靶细胞活力与效应物：靶细胞的比率的关系图可以指示重组细胞毒性B细胞的细胞毒性效应子功能。
实施例8
用重组B细胞受体构建细胞毒性B细胞并协调穿孔素表达。
表现出对前列腺癌肿瘤抗原有反应的细胞毒性的经修饰的B细胞用重组B细胞受体和用于穿孔素的诱导型基因改造，所述穿孔素促进靶细胞的细胞毒性。用细胞因子、白细胞介素-21(IL-21)和抗原刺激B细胞可导致会造成细胞死亡的细胞毒性分子(例如，颗粒酶B)的产生。然而，B细胞中可能缺乏穿孔素(一种重要的细胞毒性效应分子)的表达。因此，为了提供穿孔素的协调生产，将穿孔素的表达盒置于Ig重链可变区(VH)启动子/增强子序列的控制下。具有颗粒酶B和穿孔素的配位表达的工程化细胞毒性B细胞对靶细胞(即前列腺癌细胞)具有细胞毒性。
用单链抗体、膜免疫球蛋白(Ig)结构域和IL-21受体的细胞质结构域构建重组B细胞受体。单链抗体(单链可变片段(SCFv))对肿瘤相关抗原(前列腺癌脂质抗原(PCLA))具有特异性。SCFv连接至参与发送B细胞活化的信号的包括：铰链(H)、恒定区3(CH3)、跨膜(TM)和细胞质结构域的膜Ig重链结构域，并且最后，连接至发出信号以从B细胞中引发细胞毒性功能的IL-21受体细胞质结构域。参见图8A。重组B细胞受体表达载体的基因转移和表达(参见图8B)产生表达重组受体、对PCLA起反应以及产生细胞毒性效应分子(如颗粒酶B)的B细胞。重组B细胞受体的详细描述在上面的预示实施例1中给出。
此外，给出了用以获得表达重组B细胞受体的B细胞的表达载体和转染方法(参见预示实施例1)。重组B细胞通过经由重组BCR发送信号来响应抗原(即PCLA或在表面上携带PCLA的肿瘤细胞)以活化活性Ig H和L基因座的转录。例如，重组BCR通过与Igα和Igβ相互作用而传导信号可导致B细胞活化和分化，并且通过IL-21细胞质结构域的信号传导可导致颗粒酶B产生。另外，为了进一步促进重组B细胞的细胞毒性，在Ig VH启动子和Ig增强子元件的控制下，将人穿孔素基因引入活性功能性Ig H链基因座。
将细胞毒性B细胞改造以从活性功能性Ig重链基因座和Ig VH启动子序列并且在Ig增强子元件的控制下表达人穿孔素基因。编码人穿孔素的基因是公众可获得的。使用聚合酶链式反应(PCR)和寡核苷酸引物扩增编码人穿孔素的约1668个核苷酸的互补DNA(cDNA)，以添加与重组B细胞系中的活性重排的IgγH链基因的5'和3'侧翼序列同源的末端序列。参见图3A。例如，用5'引物和3'引物扩增穿孔素cDNA，所述5'引物含有与活性VH基因侧翼的上游序列同源的约30个核苷酸(参见例如图3A中的VH1D1J2)，而所述3'引物含有与活性恒定区基因(参见例如图3A中的CHγ)下游的序列同源的约30个核苷酸。通过同源重组整合扩增的穿孔素基因以取代γH链基因(参见图8C)，所述穿孔素基因具有与染色体14上的活性Ig H链基因同源的末端。描述了在分离的重组细胞系中的活性Ig重链基因座上的基因的工程和位点特异性整合[(参见例如，美国专利No.9,175,072，同上)]。转染的B细胞的穿孔素表达可以使用Elispot测定来确定，所述Elispot测定对在刺激细胞后体外产生细胞的穿孔素计数。用于人穿孔素Elispot测定的材料和方案可从Cell Sciences，Inc.，Canton，MA获得(参见可从www.cellsciences.com在线获得的Data sheet:Human PerforinElispot Kit,available online，其通过引用并入本文)。
为了确定表达穿孔素的重组细胞毒性B细胞杀死靶细胞，使用基于流式细胞术的测定法测定靶细胞的在暴露于重组细胞毒性B细胞后的凋亡的百分比。例如，将约250,000个重组细胞毒性B细胞加入10,000个前列腺癌细胞(例如表达PCLA的PC3细胞系)中。在共培养约3天后，通过用膜联蛋白V和碘化丙啶染色确定靶细胞(即PC3)的凋亡；通过流式细胞术确定凋亡细胞的百分比。将具有不表达PCLA的靶细胞系(例如HeLa)的匹配的阴性对照培养物与PC3培养物进行比较。此外，在细胞毒性测定中比较未用穿孔素基因转染的细胞毒性B细胞。分析了具有不同比例的效应细胞(重组细胞毒性B细胞)与靶细胞(PC3细胞)的培养物。例如，分析具有效应细胞和靶向细胞(效应细胞：靶向细胞的比例为5：1、10：1、25：1和50：1)的培养细胞的靶细胞凋亡和活力。靶细胞活力与效应物：靶细胞的比率的关系图可以指示重组细胞毒性B细胞的细胞毒性效应子功能。
实施例9
工程化B淋巴细胞表达对前列腺癌脂质抗原具有特异性的重组B细胞受体和对前列腺特异性干细胞具有特异性的分泌抗体。
分离的重组B淋巴细胞系(其表达对前列腺癌脂质抗原(PCLA)具有特异性的重组B细胞受体(BCR)并分泌识别前列腺干细胞抗原(PSCA)的抗体)构建用于治疗前列腺癌。将重组B淋巴细胞系输注于受试者中以提供B细胞，所述B细胞不仅对肿瘤细胞具有细胞毒性，而且还产生识别前列腺癌细胞的治疗性抗体。重组B淋巴细胞通过工程化重组BCR结合前列腺癌细胞上的PCLA，并被活化以产生细胞毒性效应物(例如，颗粒酶B)且分泌抗PSCA抗体。
重组B细胞提供靶向前列腺癌细胞的细胞和体液免疫。也可以通过用外源PCLA注射哺乳动物受试者(或体外细胞培养物)在体内或离体刺激重组B淋巴细胞系以引发细胞毒性效应物并产生分泌型抗PSCA抗体。可以基于哺乳动物受试者中前列腺癌细胞的检测来选择刺激针对哺乳动物受试者中的前列腺癌细胞的免疫反应性的时间的确定。
从前列腺癌患者中分离出表达膜IgG的B细胞受体(BCR)的多克隆记忆B细胞。通过以下方式从患者的外周血中分离多克隆记忆B细胞：1)使用Ficoll Hypaque密度梯度(可获自Sigma Aldrich，St.Louis，MO)分离外周血单核细胞；2)使用磁珠(可获自Stem CellTechnology，Vancouver，BC)对总B细胞进行阴性选择，和3)用识别膜IgG和CD27的荧光单克隆抗体、记忆B细胞标记物来标记细胞并执行荧光活化细胞分选。表达膜IgG的记忆B细胞在体外培养并进行基因工程改造以表达重组B细胞受体和分泌型抗PCSA抗体。
记忆B细胞经基因工程改造以表达对PCLA具有特异性的重组BCR和对前列腺干细胞抗原(PSCA)具有特异性的分泌型IgG抗体。构建分离的重组细胞系，其包括重组BCR。重组BCR结合前列腺癌细胞上的PCLA，并在细胞内向B细胞发送信号，以引发细胞毒性效应分子(如粒酶B)的表达和释放，如上文在预示实施例6中所述。可以使用药物选择(例如，G418)和流式细胞术来选择重组细胞系以鉴定表达重组BCR的克隆(参见例如上文的预测实施例6)。
编码抗PSCA抗体的免疫球蛋白基因(即Ig重链和轻链基因)分别整合在染色体14上的活性的、重排的Ig重链基因座(参见图3A)以及在染色体2上的活性的、重排的κ轻链基因座处。可获得用以获得抗PSCA抗体的方法和材料。例如，为了将抗PSCA抗体基因靶向整合到功能性γ1H链基因座中，将来自内含子的在JH外显子和γ恒定区基因(CHγ；参见图3A)之间的靶向序列置于抗-PSCAγ1-H链基因的5'端，并且将从γ1-H链细胞质外显子下游(3')选择的靶向序列置于γ1-H链基因的3'端(参见图3A)。类似的靶向序列(即，来自Jk-Ck内含子和Ck基因的3'端)用于将抗PSCA κL链基因靶向功能性Ck基因中。抗PSCA H和L链的靶向载体分别包括可选择的标记基因，例如潮霉素抗性和组氨醇脱氢酶。含有潮霉素和组氨醇的培养基用于选择表达编码分泌型IgG抗PSCA抗体的靶向载体的工程化记忆B细胞。
在转染和选择重组记忆B细胞后，使用标准免疫测定法鉴定产生对PSCA具有特异性的分泌型IgG抗体的那些细胞，以评估B细胞上清液。工程化记忆B细胞在体外培养并用PCLA刺激以活化细胞的细胞毒性并刺激抗PSCA IgG抗体的分泌。纯化PCLA(脂质抗原)的实验室方法可以适用于该实施方案。此外，表达重组B细胞受体和抗PSCA抗体的分离的重组细胞系在细胞毒性测定中用表达PCLA和PSCA的靶细胞进行测试。例如，携带PCLA的前列腺肿瘤细胞系PC3可以用编码PSCA的载体转导，并在体外用工程化细胞毒性B细胞系在细胞毒性测定中测试。描述了用于转导PC3细胞的方法和材料，并且上文描述了细胞毒性测定的细节。参见预示实施例6。
实施例10
用转录因子转染B细胞构建前列腺癌的细胞毒性B细胞。
通过改造记忆B细胞产生细胞毒性B细胞，所述记忆B细胞表达对前列腺癌脂质抗原(PCLA)具有特异性的B细胞受体(BCR)。用编码转录因子的病毒载体转染B细胞，所述转录因子控制包括颗粒酶B和穿孔素的细胞毒性效应分子的表达。识别并杀死前列腺癌细胞的工程化细胞毒性B细胞可用于前列腺癌患者的过继细胞治疗。
表达识别PCLA的B细胞受体的记忆B细胞由编码抗PCLA抗体的免疫球蛋白(Ig)基因构建。将工程化Ig基因插入人染色体14和2上的活性转录的重(H)和轻(L)链基因座上。从前列腺癌患者中分离表达膜IgG的B细胞受体(BCR)的多克隆记忆B细胞。通过以下方式从患者的外周血中分离多克隆记忆B细胞：1)使用Ficoll Hypaque密度梯度(可获自SigmaAldrich，St.Louis，MO)分离外周血单核细胞；2)使用磁珠(可获自Stem Cell Technology，Vancouver，BC)对总B细胞进行阴性选择，和3)用识别膜IgG和CD27的荧光单克隆抗体、记忆B细胞标记物来标记细胞并执行荧光活化细胞分选。表达膜IgG的记忆B细胞在体外培养并进行基因工程改造以表达对PCLA具有特异性的B细胞受体。
编码抗PCLA抗体的免疫球蛋白基因(即Ig重链和轻链基因)分别整合在染色体14上的活性的、重排的Ig重链基因座上(参见图3A)和染色体2上的活性的、重排的κ轻链基因座上。获得抗PCLA抗体，并在分离的重组细胞系中的活性Ig重链和轻链基因座处分离、改造和位点特异性整合相应的Ig基因。例如，将抗PCLA膜Ig H链基因靶向整合到功能性的重排的γ-H链基因座中：可变区外显子(VH1D1J2；参见图3A)上游(5')和γ-H链恒定区外显子(CHγ；参见图3A)下游(3')的靶向序列链基因分别位于工程化的膜γ-H链基因(参见图3B)的5'端和3'端处。类似的靶向序列(即，来自VkJk外显子的5'端和Ck基因的3'端)用于将抗PCLAκL链基因靶向染色体2上的功能性Ck基因。
将表达对PCLA具有特异性的膜IgG的工程化B细胞用编码对细胞毒性B细胞功能必需的三种转录因子的病毒载体转导。三种转录因子调节细胞毒性效应分子(如颗粒酶B)的表达。转录因子：T-bet，Runx3和Eomes对于细胞毒性T细胞分化中颗粒酶B和穿孔素的表达是必需的。使用转导人B细胞的仙台病毒载体构建编码T-bet、Runx3和Eomes的三顺反子载体。参见图8D。可以通过用对T-bet、Runx3和Eomes具有特异性的抗体-酶缀合物免疫染色来监测载体在工程化B细胞中的转染和表达(例如，抗Eomes、抗T-bet和抗Runx3抗体可以从Abcam，Cambridge，MA)，并且颗粒酶B和穿孔素的表达可以通过来自转染细胞的RNA的逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)来检测。
对表达对PCLA具有特异性的膜IgG的工程化细胞毒性B细胞进行细胞毒性效应功能与前列腺癌细胞系的比较测试。例如，携带PCLA的前列腺肿瘤细胞系PC3可用作流式细胞术测定中的靶细胞，流式细胞术测定检测在暴露于工程化细胞毒性B细胞后的凋亡细胞(参见上述预示实施例2)。
表达识别PCLA的膜IgG的工程化细胞毒性B细胞也可以在人前列腺癌的异种小鼠模型中体内测试。例如，将人前列腺肿瘤细胞PC3皮下植入免疫缺陷小鼠(例如可从JacksonLabs，Bar Harbor，ME获得的NSG小鼠)中，并用工程化的细胞毒性B细胞处理小鼠。评估该小鼠的肿瘤大小、体重和存活率。对照肿瘤细胞系可包括不表达PCLA的肿瘤。此外，评估并记录小鼠中细胞毒性B细胞在输注或注射到对照小鼠或携带PC3肿瘤的小鼠中后的存活或扩增。
每个列举的范围包括范围的所有组合和子组合，以及其中包含的特定数字。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请均不与本文的描述不一致的程度上并且出于所有目的通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被明确地和单独地指出通过引用并入以用于所有目的。
本领域普通技术人员应认识到，本技术领域的状态已发展到这样一种程度：系统的多个方面的硬件和软件实现方式之间几乎没有区别；硬件或软件的使用通常是(但不总是，因为在某些情境中，硬件和软件之间的选择会变得意义重大)代表成本与效益权衡的设计选择。本领域普通技术人员应当认识到，存在能够实现本文所公开的方法和/或系统和/或其他技术的多种载体(例如，硬件、软件和/或固件)，且优选的载体会根据部署所述方法和/或系统和/或其他技术的情境而变。例如，如果外科医师确定速度和准确性是最重要的，则外科医师可选择主要为硬件和/或固件的载体；替代地，如果灵活性是最重要的，则实施者可选择主要为软件的实现方式；或者，又替代地，实施者可选择硬件、软件和/或固件的一些组合。因此，存在能够实现本文所公开的方法和/或设备和/或其他技术的若干种可行载体，其中没有一种载体固有地优于其他载体，因为将被使用的任何载体是根据部署该载体的情境以及实施者的具体关注点(例如，速度、灵活性、或可预测性)而定的选择，而其中任何一者都可能发生变化。本领域普通技术人员会认识到，实现方式的光学方面会通常采用光学方面的硬件、软件和或固件。
在一般意义上，本文公开的可以通过各种硬件、软件、固件或其任何组合单独地和/或共同地实现的各个方面可以被视为由各种类型的“电路”组成。因此，如本文所用，“电路”包括但不限于具有至少一个分立电路的电路、具有至少一个集成电路的电路，具有至少一个专用集成电路的电路、形成由计算机程序配置的通用计算设备(例如，由至少部分地实现本文所公开的方法和/或设备的计算机程序配置的通用计算机、或由至少部分地实现本文所公开的方法和/或设备的计算机程序配置的微数字处理单元)的电路、形成存储设备(例如，各种形式的随机存取存储器和/或形成通信设备(例如，调制解调器、通信交换机、或光电设备)的电路。本文公开的主题可以以模拟或数字方式或其某种组合来实现。
这里描述的设备和/或工艺的至少一部分可以集成到数据处理系统中。数据处理系统一般包括下列项中的一或多项：系统单元壳体、视频显示设备、诸如易失性或非易失性存储器之类的存储器、诸如微处理器或数字信号处理器之类的处理器、诸如操作系统之类的计算实体、驱动器、图形用户界面、应用程序、一或多个交互设备(例如，触摸板、触摸屏、天线等)、和/或包括反馈回路和控制马达(例如，用于感测位置和/或速度的反馈、用于移动和/或调整部件和/或数量的控制马达)的控制系统。数据处理系统可利用诸如那些通常在数据计算/通信和/或网络计算/通信系统中找得到的合适的市售部件来实现。
前面的详细描述已通过方框图、流程图和/或实施例的使用阐述了设备和/或方法的各种实施方式。只要这些方框图、流程图和/或实施例包含一或多个功能和/或操作，本领域技术人员便应当理解，这样的方框图、流程图或实施例中的每个功能和/或操作可通过范围广泛的硬件、软件、固件或它们的几乎任意组合独自地和/或共同地实现。在一实施方式中，本文所描述的主题的若干部分可通过专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)、数字信号处理器(DSP)或其他集成形式实现。但本文所公开的实施方式的一些方面可整体地或部分地在集成电路中等效实施，作为在一或多台计算机上运行的一或多个计算机程序(例如，作为在一或多个计算机系统上运行的一或多个程序)、作为在一或多个处理器上运行的一或多个程序(例如，作为在一或多个微处理器上运行的一或多个程序)、作为固件或作为它们的几乎任意组合，并且鉴于本公开，设计电路和/或编写用于软件和或固件的代码会完全在本领域技术人员的能力范围内。此外，本文所描述的主题的机构能够被分发为各种形式的程序产品，并且适用本文所描述的主题的说明性实施方式与用于实际执行分发的信号承载介质的特定类型无关。信号承载介质的示例包括但不限于以下所列：可记录型介质，比如软盘、硬盘驱动器、光盘(CD)、数字视频光盘(DVD)、数字磁带、计算机存储器等；以及传输型介质，比如数字和/或模拟通信介质(例如光纤电缆、波导、有线通信链路、无线通信链路(例如发送器、接收器、发送逻辑、接收逻辑等)，等等)。
为了概念清楚起见，这里描述的组件(例如，步骤)、设备和对象以及伴随它们的描述被用作示例，并且使用本文提供的公开内容的各种配置修改在本领域技术人员的技能范围内。因此，如本文所使用的，所阐述的具体实施例和所附描述旨在代表它们更一般的类别。通常，本文中任何具体实施例的使用也意在代表其类别，并且本文中不包括这些特定组分(例如步骤)、装置和目的不应被视为表示需要限制。
对于本文的基本上任何复数或单数术语的使用，读者可根据上下文或应用将复数转换为单数或将单数转换为复数。为清楚起见，各种单数/复数置换在本文中没有明确阐述。
本文所描述的主题有时阐述了包含在不同的其他部件内的或者与不同的其他部件相连接的不同部件。应当理解，这样描绘的架构仅仅是示例，并且事实上可实施实现相同功能的许多其他架构。在概念性意义上，实现相同功能的任何部件设置都被有效地“关联”，使得希望的功能得以实现。因此，在本文中组合来实现特定功能的任意两个部件可被视为彼此“相关联”以使希望的功能得以实现，而不论架构或中间部件如何。同样，这样关联的任意两个部件也可被视为彼此“操作性地连接”或“操作性地耦合”以实现期望的功能，且能够这样关联的任意两个部件亦可被视为彼此“能够操作性地耦合”以实现期望的功能。能够操作性地耦合的具体示例包括但不限于能够物理配对的或物理交互的部件、或能够无线交互的或无线交互的部件、或逻辑交互的或能够逻辑交互的部件。
虽已示出并描述了本文所述的主题的特定方面，但可在不背离本文所描述的主题及其更宽泛的方面的情况下做出改变和修改，因此，所附的权利要求将所有这样的改变和修改包括在它们的范围内，视为在本文所描述的主题的真实精神和范围内。此外，应当理解本发明由所附的权利要求限定。
应理解，一般而言，本文尤其是在所附权利要求(例如，所附权利要求的主体)中所使用的术语通常意在作为“开放式”术语(例如，术语“包含”应当被解释为“包含但不限于”，术语“具有”应当被解释为“具有至少”，术语“包括”应当被解释为“包括但不限于”，等等)。应进一步理解，如果意在所引介权利要求表述对象的具体数量，则这种意图会被明确记载在该权利要求中，而如果不存在这样的记载，便不存在这样的意图。例如，作为对理解的辅助，下面所附的权利要求可包含引介短语“至少一个”和“一或多个”的使用以引介权利要求表述对象。但是，这类短语的使用不应当被解释为暗示通过不定冠词“一”或“一个”对权利要求表述对象的引介将含有这种所引介权利要求表述对象的任何特定权利要求限制为只包含一个这种表述对象的发明，即使在同一权利要求包括引介短语“一或多个”或“至少一个”以及诸如“一”或“一个”等不定冠词时亦如此；对于用于引介权利要求表述对象的定冠词的使用而言亦同样如此。此外，即使明确记载了所引介权利要求表述对象的具体数量，这种记载通常也应当被解释为是指至少是所记载的数量(例如，单单记载“两个表述对象”而没有其他修饰语，通常是指至少两个表述对象或者两或更多个表述对象)。此外，在使用与“A、B和C等中的至少一个”类似的惯用语的那些情况下，一般而言，这种结构意指本领域技术人员会理解的惯用意义(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”会包括但不限于只有A的系统、只有B的系统、只有C的系统、同时具有A和B的系统、同时具有A和C的系统、同时具有B和C的系统、或同时具有A、B和C的系统，等等)。在使用与“A、B或C等中的至少一个”类似的惯用语的那些情况下，一般而言，这种结构意指本领域技术人员会理解的惯用意义(例如，“具有A、B或C中的至少一个的系统”会包括但不限于只有A的系统、只有B的系统、只有C的系统、同时具有A和B的系统、同时具有A和C的系统、同时具有B和C的系统、和/或同时具有A、B和C的系统，等等)。实际上，提出两或更多可选择项的任何选言词和/或短语，无论是在说明书、权利要求书、还是在附图中，都应当被理解为预计包括其中一项、任一项、或两项的可能性。例如，短语“A或B”应被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
虽然本文已公开了多个方面和实施方式，但对本领域技术人员而言，其他方面和实施方式会是显而易见的。本文所公开的各个方面和实施方式是出于说明的目的且无意进行限制，真正的范围和精神由接下来的权利要求表明。

Claims (33)

1.一种分离的细胞系，其包含：
分离的B淋巴细胞系，其能够表达对第一抗原具有反应性的至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白或重组B细胞受体和对第二抗原具有反应性的至少一种内源性分泌型免疫球蛋白；
其中所述分离的B淋巴细胞系能够表达针对至少一种靶细胞的细胞毒性。
2.根据权利要求1所述的分离的细胞系，其进一步包含能够表达对所述第二抗原具有反应性的至少一种内源膜免疫球蛋白的所述分离的B淋巴细胞系。
3.根据权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白包含一种或多种外源掺入的膜免疫球蛋白多肽。
4.根据权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白包含编码所述至少一种膜免疫球蛋白的至少一种外源掺入的核酸，其中所述细胞系能够表达所述至少一种膜免疫球蛋白。
5.根据权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白包含编码所述至少一种膜免疫球蛋白的至少两种外源掺入的核酸。
6.根据权利要求5所述的分离的细胞系，其中所述至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白包含编码两种重链(H)免疫球蛋白和两种轻链(L)免疫球蛋白的核酸。
7.根据权利要求1所述的分离的细胞系，其中编码所述膜免疫球蛋白中的所述至少一种的所述至少两种外源掺入的核酸存在于所述分离的B淋巴细胞系中的Ig H链和Ig L链染色体基因座中。
8.根据权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白包含编码一种重链(H)免疫球蛋白和一种轻链(L)免疫球蛋白的核酸。
9.根据权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白包含编码一种单链Fv免疫球蛋白的核酸。
10.根据权利要求1所述的分离的细胞系，其中编码所述至少一种膜免疫球蛋白的所述外源掺入的核酸存在于所述分离的B淋巴细胞系中的一个或多个染色体基因座中。
11.根据权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述分离的B淋巴细胞系能够破坏对所述第二抗原具有反应性的所述内源膜免疫球蛋白的表达。
12.根据权利要求1所述的分离的细胞系，其中由所述第一抗原活化的所述至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白能够控制对所述第二抗原具有反应性的所述至少一种内源性分泌型免疫球蛋白的表达。
13.根据权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述分离的B淋巴细胞系包含幼稚B淋巴细胞、未成熟B淋巴细胞、过渡B淋巴细胞、成熟B淋巴细胞、滤泡B淋巴细胞、记忆B淋巴细胞、浆母细胞或血浆细胞中的至少一种。
14.根据权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述膜免疫球蛋白包含膜锚、细胞质结构域和细胞外配体结合结构域中的至少一种。
15.根据权利要求1所述的分离的细胞系，其中所述B淋巴细胞系携带能够转导用于诱导细胞毒性效应分子的表达的信号的至少一种嵌合B细胞受体。
16.根据权利要求15所述的分离的细胞系，其中所述嵌合B细胞受体源自所述常见的γ链受体、IL-21受体、Toll样受体或CD40中的至少一种。
17.根据权利要求15所述的分离的细胞系，其中所述细胞毒性效应分子包含穿孔素、颗粒酶B、Fas配体或肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)中的至少一种。
18.一种分离的重组细胞系，其包含：
分离的B淋巴细胞系，其能够表达对第一抗原具有反应性的至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白或重组B细胞受体和编码对第二抗原具有反应性的分泌型免疫球蛋白的至少一种外源掺入的核酸；
其中所述分离的B淋巴细胞系能够表达针对至少一种靶细胞的细胞毒性。
19.根据权利要求18所述的分离的细胞系，其还包含：
能够表达编码对所述第二抗原具有反应性的膜免疫球蛋白的至少一种外源掺入的核酸的所述分离的B淋巴细胞系。
20.根据权利要求18所述的分离的细胞系，其还包含：
能够表达编码对第三种抗原具有反应性的分泌型免疫球蛋白的至少一种外源掺入的核酸的所述分离的B淋巴细胞系。
21.根据权利要求20所述的分离的细胞系，其中所述第二抗原和所述第三抗原是单一抗原多肽的不同表位。
22.根据权利要求21所述的分离的细胞系，其中所述至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白包含至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白多肽。
23.根据权利要求21所述的分离的细胞系，其中所述至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白包含编码至少一种膜免疫球蛋白多肽的至少一种外源掺入的核酸，其中所述细胞系能够表达所述至少一种膜免疫球蛋白多肽。
24.根据权利要求23所述的分离的细胞系，其中编码所述至少一种膜免疫球蛋白的所述至少一种外源掺入的核酸存在于所述分离的B淋巴细胞系中的一个或多个染色体基因座中。
25.根据权利要求23所述的分离的细胞系，其中编码所述至少一种膜免疫球蛋白的至少一种外源掺入的核酸存在于所述分离的B淋巴细胞系中的Ig H链和Ig L链染色体基因座中。
26.根据权利要求23所述的分离的细胞系，其中编码所述至少一种膜免疫球蛋白的所述至少一种外源掺入的核酸存在于所述分离的B淋巴细胞系中的一个或多个非Ig L染色体基因座或非Ig H染色体基因座中。
27.根据权利要求23所述的分离的细胞系，其中编码所述至少一种膜免疫球蛋白的所述至少一种外源掺入的核酸存在于所述分离的B淋巴细胞系中的染色体外复制遗传元件中。
28.根据权利要求23所述的分离的细胞系，其中编码所述至少一种膜免疫球蛋白的所述核酸源自B淋巴细胞系。
29.根据权利要求23所述的分离的细胞系，其中由所述第一抗原活化的所述至少一种外源掺入的膜免疫球蛋白能够控制对所述第二抗原具有反应性的所述至少一种外源掺入的分泌型免疫球蛋白的表达。
30.根据权利要求23所述的分离的细胞系，其中所述分离的B淋巴细胞系包含幼稚B淋巴细胞、未成熟B淋巴细胞、过渡B淋巴细胞、成熟B淋巴细胞、滤泡B淋巴细胞、记忆B淋巴细胞、浆母细胞或血浆细胞中的至少一种。
31.根据权利要求30所述的分离的细胞系，其中所述分离的B淋巴细胞系包含B淋巴细胞的多克隆群。
32.根据权利要求30所述的分离的细胞系，其中所述分离的B淋巴细胞系包含B淋巴细胞的单克隆群。
33.根据权利要求23所述的分离的细胞系，其中所述膜免疫球蛋白包含膜锚、细胞质结构域和细胞外配体结合结构域中的至少一种。
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