KR20210027427A - 재조합 단백질 생산 방법 - Google Patents

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KR20210027427A
KR20210027427A KR1020217003056A KR20217003056A KR20210027427A KR 20210027427 A KR20210027427 A KR 20210027427A KR 1020217003056 A KR1020217003056 A KR 1020217003056A KR 20217003056 A KR20217003056 A KR 20217003056A KR 20210027427 A KR20210027427 A KR 20210027427A
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앤드류 용키
준 티안
마이클 씨. 보리스
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Abstract

특정 실시양태에서, 본 개시내용은 비-관류-기반 배양 시스템에서 관심 재조합 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 생존 세포 밀도는 적어도 5 x 106개의 세포/mL로 증가되는 것인, N-1 대규모 생물반응기 세포 배양물의 생존 세포 밀도를 증가시키는 신규한 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 (1) 비-관류-기반 배양 시스템 중 N-1 단계에서 관심 재조합 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 생존 세포 밀도는 적어도 5 x 106개의 세포/mL로 증가하는 것인 단계; 및 (2) N 유가식 생산 세포를 적어도 1.5 x 106개의 세포/mL의 높은 시드 밀도로 농축된 배지 중에서 배양하는 단계이며, 여기서 N 유가식 생산 세포는 비-관류-기반 배양 시스템 중 N-1 단계로부터 접종된 것인 단계를 포함하는, 관심 재조합 폴리펩티드를 대규모로 생산하는 신규한 방법을 제공한다.

Description

재조합 단백질 생산 방법
본 발명은 일반적으로 세포 배양물 제조에서 높은 시드 밀도에서의 N 생산 생물반응기의 접종을 위해 비-관류 전략법을 사용하여 N-1 배양 단계 동안 생존 세포 밀도를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
단백질 및 폴리펩티드는 치료제로서 점점 더 중요시되고 있다. 대개의 경우, 치료 단백질 및 폴리펩티드는, 관심 폴리펩티드를 유달리 높은 수준으로 생산하도록 조작 및/또는 선택된 세포로부터의 세포 배양으로 생산된다. 세포 배양 조건의 제어 및 최적화는 단백질 및 폴리펩티드의 성공적인 상업적 생산을 위해 매우 중요하다.
세포 배양으로 생산된 다수의 단백질 및 폴리펩티드는 유가식 공정으로 생산되며, 여기서 세포는 일정 기간 동안 배양된 후, 배양은 종결되고, 생산된 단백질 또는 폴리펩티드는 단리된다. 생산된 단백질 또는 폴리펩티드의 최종 양과 품질은 N-1 시드 배양물 및 N 생산에서의 시드-밀도에 의해 현저한 영향을 받을 수 있다. 유가식 배양 공정에서 단백질 및 폴리펩티드의 생산을 개선시키기 위한 노력이 기울여져 왔지만, 여전히 추가 개선이 요구되고 있다.
관류 세포 배양이 종래 유가식 세포 배양 시스템보다 훨씬 더 높은 생존 세포 밀도를 달성할 수 있다. 관류 세포 배양은 폐기물은 제거하면서, 배양 시스템에 신선한 배지를 계속해서 공급하는데, 이는 세포 성장에 풍부한 환경을 제공한다. 낮은 시드 밀도를 이용하는 종래 유가식 생산 배양과 비교하면, N-1 관류 시드가 접종된 높은 시드 밀도 유가식 생산 배양을 통해 단기간 내에 더 높은 최종 역가를 달성할 수 있다. 그러나, 관류 세포 배양은 대규모 배양 시스템 (예컨대, 200 L 초과의 생물반응기)에서 사용될 때에는 다량의 세포 배양 배지가 소비되기 때문에 비용은 더 비싸진다. 또한, 관류 세포 배양은 특히 대규모 제조인 경우, 세포가 세포 배양 시스템으로부터 제거되지 못하도록 이를 막은 세포 체류 시스템으로부터 야기되는 문제들이 있을 수 있다.
비-관류 시스템을 이용하여 높은 시드 세포 밀도로 대규모 세포 배양에 의해 단백질 및 폴리펩티드를 생산하기 위한 개선된 시스템 개발이 특히 요구되고 있다.
본 개시내용은 비-관류-기반 배양 시스템에서 관심 재조합 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, N-1 대규모 생물반응기 세포 배양물의 생존 세포 밀도를 증가시키는 방법이며, 여기서 생존 세포 밀도는 적어도 5 x 106개의 세포/mL로 증가되는 것인 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 비-관류-기반 배양 시스템은 회분식 또는 유가식 생물반응기이다. 일부 실시양태에서, N-1 단계에서의 생존 세포 밀도는 적어도 5 x 106, 적어도 10 x 106, 적어도 15 x 106, 적어도 20 x 106, 적어도 25 x 106, 또는 적어도 30 x 106개의 생존 세포/mL이다. 일부 실시양태에서, 세포 생존율은 N-1 단계 마지막 날 적어도 80%, N-1 단계 마지막 날 적어도 85%, 또는 N-1 단계 마지막 날 적어도 90%이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 N-1 회분식 배양을 위해 농축된 배지 중에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 N-1 유가식 배양을 위해 피드 배지 첨가하에 시드 배지 중에서 배양된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 배지는 피드 배지에 의해 비-농축된 배지 대비 적어도 5%, 비-농축된 배지 대비 적어도 10%, 비-농축된 배지 대비 적어도 15%, 또는 비-농축된 배지 대비 적어도 20% 농축된다. 일부 실시양태에서, 농축된 배지 또는 피드 배지는 증가된 양의 탄소원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 탄소원은 글루코스이다. 일부 실시양태에서, 농축된 배지 또는 피드 배지는 증가된 양의 영양소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 영양소는 아미노산, 지질, 비타민, 미네랄, 및 폴리아민으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 농축된 배지는 증가된 양의 탄소원 및 영양소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 탄소원은 글루코스이고, 영양소는 아미노산, 지질, 비타민, 미네랄, 및 폴리아민으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 CHO, VERO, BHK, HEK, HeLa, COS, MDCK 및 하이브리도마 세포로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드는 치료 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드는 항체, 또는 항원 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체, 또는 항원 결합 단편은 PD-1, PD-L1, LAG-3, TIGIT, GITR, CXCR4, CD73 HER2, VEGF, CD20, CD40, CD11a, 조직 인자 (TF), PSCA, IL-8, EGFR, HER3, 및 HER4로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 결합한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 생물반응기는 적어도 50 L, 적어도 500 L, 적어도 1,000 L, 적어도 5,000 L, 또는 적어도 10,000 L이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 방법은 농축된 회분식 배양물 또는 유가식 배양물 중에서 N-1 단계에서의 적어도 5 x 106개의 생존 세포/mL를 배양하는 단계를 추가로 포함하고, 이는 관심 재조합 폴리펩티드를 생산하는 N 생산 단계의 접종을 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 관심 폴리펩티드를 생산 배양 시스템으로부터 단리시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시내용은 또한 (1) 비-관류-기반 배양 시스템 중 N-1 단계에서 관심 재조합 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 생존 세포 밀도는 적어도 5 x 106개의 세포/mL로 증가되는 것인 단계; 및 (2) N 유가식 생산 세포를 기초 배지 또는 농축된 기초 배지 중에서 적어도 1.5 x 106개의 세포/mL의 높은 시드 밀도로 배양하는 단계이며, 여기서 N 유가식 생산 세포는 비-관류-기반 배양 시스템 중 N-1 단계로부터 접종된 것인 단계를 포함하는, 관심 재조합 폴리펩티드의 대규모 생산 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, N 생산 배양 시스템은 유가식 생물반응기이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 농축된 기초 배지는 피드 배지에 의해 비-농축된 배지 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20% 농축된다. 일부 실시양태에서, 농축된 배지는 증가된 양의 탄소원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 탄소원은 글루코스이다. 일부 실시양태에서, 농축된 배지는 증가된 양의 영양소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 영양소는 아미노산, 지질, 비타민, 미네랄, 및 폴리아민으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 농축된 배지는 증가된 양의 탄소원 및 영양소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 탄소원은 글루코스이고, 영양소는 아미노산, 지질, 비타민, 미네랄, 및 폴리아민으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 생물반응기는 적어도 50 L, 적어도 500 L, 적어도 1,000 L, 적어도 5,000 L, 적어도 10,000 L, 적어도 15,000 L, 또는 적어도 20,000 L이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드의 역가는 적어도 100 mg/L, 적어도 1 g/L, 적어도 3 g/L, 적어도 5 g/L 또는 적어도 10 g/L이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 적어도 1.5 x 106, 적어도 5 x 106, 또는 적어도 10 x 106개의 생존 세포/mL의 생존 세포 밀도를 수득하기 위해 N 유가식 생산 생물반응기에서 기초 배지 또는 농축된 기초 배지 중에서 배양된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 방법은 관심 폴리펩티드를 단리시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드는 치료 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드는 항체, 또는 항원 결합 단편이다.
도 1a 및 1b. 도 1a는 CHO 세포주 A에 대한 하기의 세포 배양 시스템에서 성장된 N-1 세포 배양물의 생존 세포 밀도 ("VCD")를 보여준다: 관류, 유가식, 회분식, 글루코스가 농축된 회분식, 및 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식 세포 배양 시스템. 도 1b는 세포주 A에 대한 하기의 세포 배양 시스템에서 성장된 N-1 세포 배양물의 세포 생존율(%)을 보여준다: 관류, 유가식, 회분식, 글루코스가 농축된 회분식, 및 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식.
도 2a-2c. 도 2a는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 세포주 A에 의한 폴리펩티드-1에 대한 N 생산 배양물의 생존 세포 밀도를 보여준다: 관류, 유가식, 글루코스가 농축된 회분식, 및 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식. 도 2b는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 생산 배양물 중에서 성장된 관심 폴리펩티드의 역가를 보여준다: 관류, 유가식, 글루코스가 농축된 회분식, 및 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식. 도 2c는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 CHO 세포주 A에 의한 폴리펩티드-1에 대한 생산 배양물 중에서 성장된 관심 폴리펩티드에 대한 영상화 모세관 등전 집중법(imaged capillary isoelectric focusing: "iCIEF"), 크기 배제 크로마토그래피 ("SEC"), 및 N-글리칸 분석을 보여준다: 관류, 유가식, 글루코스가 농축된 회분식, 및 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식.
도 3a 및 3b. 도 3a는 CHO 세포주 B에 대한 하기의 세포 배양 시스템에서 성장된 N-1 세포 배양물의 VCD를 보여준다: 관류, 유가식, 회분식, 글루코스가 농축된 회분식, 및 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식 세포 배양 시스템. 도 3b는 CHO 세포주 B에 대한 하기의 세포 배양 시스템에서 성장된 N-1 세포 배양물의 세포 생존율(%)을 보여준다: 관류, 유가식, 회분식, 글루코스가 농축된 회분식, 및 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식.
도 4a-4c. 도 4a는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 CHO 세포주 B에 의한 폴리펩티드-2에 대한 N 생산 배양물의 생존 세포 밀도를 보여준다: 관류, 유가식, 글루코스가 농축된 회분식, 및 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식. 도 4b는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 CHO 세포주 B에 의한 폴리펩티드-2에 대한 N 생산 배양물 중에서 성장된 관심 폴리펩티드의 역가를 보여준다: 관류, 유가식, 글루코스가 농축된 회분식, 및 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식. 도 4c는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 CHO 세포주 B에 의한 폴리펩티드-2에 대한 N 생산 배양물 중에서 성장된 관심 폴리펩티드에 대한 iCIEF, SEC, 및 N-글리칸 분석을 보여준다: 관류, 유가식, 글루코스가 농축된 회분식, 및 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식.
도 5a 및 5b. 도 5a는 CHO 세포주 C에 대한 하기의 세포 배양 시스템에서 성장된 N-1 세포 배양물의 VCD를 보여준다: 관류, 유가식, 회분식, 글루코스가 농축된 회분식, 및 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식 세포 배양 시스템. 도 5b는 하기의 세포 배양 시스템에서 성장된 N-1 세포 배양물의 세포 생존율(%)을 보여준다: 관류, 유가식, 회분식, 글루코스가 농축된 회분식, 및 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식.
도 6a-6c. 도 6a는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 CHO 세포주 C에 의한 폴리펩티드-3에 대한 N 생산 배양물의 생존 세포 밀도를 보여준다: 관류, 유가식, 글루코스가 농축된 회분식, 및 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식. 도 6b는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 CHO 세포주 C에 의한 폴리펩티드-3에 대한 생산 배양물 중에서 성장된 관심 폴리펩티드의 역가를 보여준다: 유가식 및 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식. 도 6c는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 CHO 세포주 C에 의한 폴리펩티드-3에 대한 N 생산 배양물 중에서 성장된 관심 폴리펩티드에 대한 iCIEF, SEC, 및 N-글리칸 분석을 보여준다: 유가식 및 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식.
도 7a-7c. 도 7a는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 CHO 세포주 C에 의한 폴리펩티드-3에 대한 N 생산 배양물의 생존 세포 밀도를 보여준다: 관류 및 유가식. 도 7b는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 CHO 세포주 C에 의한 폴리펩티드-3에 대한 생산 배양물 중에서 성장된 관심 폴리펩티드에 역가를 보여준다: 관류 및 유가식. 도 7c는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 CHO 세포주 C에 의한 폴리펩티드-3에 대한 N 생산 배양물 중에서 성장된 관심 폴리펩티드에 iCIEF, SEC, 및 N-글리칸 분석를 보여준다: 관류 및 유가식.
도 8a-8c. 도 8a는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 CHO 세포주 A에 의한 폴리펩티드-1에 대한 1,000 L 규모 (n=3) 및 5 L 위성체 (n=2)의 N 생산 배양물의 생존 세포 밀도를 보여준다: 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식. 도 8b는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 CHO 세포주 A에 의한 폴리펩티드-1에 대한 1,000 L 규모 (n=3) 및 5 L 위성체 (n=2)의 생산 배양물 중에서 성장된 관심 폴리펩티드의 역가를 보여준다: 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식. 도 8c는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 CHO 세포주 A에 의한 폴리펩티드-1에 대한 1,000 L 규모 (n=3) 및 5 L 위성체 (n=2)의 N 생산 배양물 중에서 성장된 관심 폴리펩티드에 대한 iCIEF, SEC, 및 N-글리칸 분석을 보여준다: 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식.
도 9a-9c. 도 9a는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 CHO 세포주 B에 의한 폴리펩티드-2에 대한 500 L 규모 (n=1) 및 5 L 위성체 (n=2)의 N 생산 배양물의 생존 세포 밀도를 보여준다: 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식. 도 9b는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 CHO 세포주 B에 의한 폴리펩티드-2에 대한 500 L 규모 (n=1) 및 5 L 위성체 (n=2)의 생산 배양물 중에서 성장된 관심 폴리펩티드의 역가를 보여준다: 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식. 도 9c는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 CHO 세포주 B에 의한 폴리펩티드-2에 대한 500 L 규모 (n=1) 및 5 L 위성체 (n=2)의 N 생산 배양물 중에서 성장된 관심 폴리펩티드에 대한 iCIEF, SEC, 및 N-글리칸 분석을 보여준다: 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식.
도 10a-10c. 도 10a는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 CHO 세포주 C에 의한 폴리펩티드-3에 대한 500 L 규모 (n=1) 및 5 L 위성체 (n=2)의 N 생산 배양물의 생존 세포 밀도를 보여준다: 유가식. 도 10b는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 CHO 세포주 C에 의한 폴리펩티드-3에 대한 500 L 규모 (n=1) 및 5 L 위성체 (n=2)의 생산 배양물 중에서 성장된 관심 폴리펩티드의 역가를 보여준다: 유가식. 도 10c는 하기 N-1 세포 배양 시스템으로부터의 시드 배양물을 이용한 CHO 세포주 C에 의한 폴리펩티드-3에 대한 500 L 규모 (n=1) 및 5 L 위성체 (n=2)의 N 생산 배양물 중에서 성장된 관심 폴리펩티드에 대한 iCIEF, SEC, 및 N-글리칸 분석을 보여준다: 유가식.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 비-관류-기반 배양 시스템에서 관심 재조합 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, N-1 대규모 생물반응기 세포 배양물의 생존 세포 밀도를 증가시키는 신규한 방법이며, 여기서 생존 세포 밀도는 적어도 5 x 106개의 세포/mL로 증가되는 것인 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 (1) 비-관류-기반 배양 시스템 중 N-1 단계에서 관심 재조합 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 생존 세포 밀도는 적어도 5 x 106개의 세포/mL로 증가되는 것인 단계; 및 (2) 비-관류-기반 시스템에서 N-1 세포 배양물로부터 접종된 것인 N 생산 단계에서의 세포를 적어도 1.5 x 106개의 세포/mL의 높은 시드 밀도로 농축된 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 관심 재조합 폴리펩티드를 대규모로 생산하는 신규한 방법을 제공한다.
정의
"하나"라는 단수 형태는 임의의 언급되거나, 열거된 성분들 중 "하나 이상의 것"을 지칭한다는 것을 이해하여야 한다.
본원에서 사용되는 바, "약"이라는 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정한 값 또는 조성에 대한 허용 오차 범위 내의 값 또는 조성을 지칭하며, 이는 부분적으로 값 또는 조성이 측정 또는 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 한계에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, "약"은 관련 기술분야에서의 실시에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 내에 있음을 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 최대 20%의 범위를 의미할 수 있다. 추가로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 본 용어는 값의 최대 10배 또는 최대 5배를 의미할 수 있다. 특정한 값 또는 조성이 본 출원 및 청구범위에서 제공되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, "약"의 의미는 상기 특정한 값 또는 조성에 대한 허용 오차 범위 내에 있는 것으로 가정되어야 한다.
본원에 사용된 "및/또는"이라는 용어는 2개의 명시된 특징 또는 성분 각각을 함께 또는 따로따로 구체적으로 개시하는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 본원에서 예컨대, "A 및/또는 B"와 같은 어구에 사용된 "및/또는"이라는 용어는 "A 및 B," "A 또는 B," "A" (단독), 및 "B" (단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 유사하게, 예컨대, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에 사용된 "및/또는"이라는 용어는 각각의 하기 측면: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독)를 포괄하는 것으로 의도된다. 양자택일 (예컨대, "또는") 사용은 양자택일의 것 중 어느 하나, 그 둘 모두, 또는 그의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해하여야 한다.
본원에서 사용되는 바, 가장 광범위한 의미에서 "아미노산"이라는 용어는 폴리펩티드 쇄로 도입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 일반 구조식 H2N--C(H)(R)--COOH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 자연적으로 발생된 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 합성 아미노산이고; 일부 실시양태에서, 아미노산은 D-아미노산이고; 일부 실시양태에서, 아미노산은 L-아미노산이다. 펩티드에서 카르복시- 및/또는 아미노-말단 아미노산을 비롯한, 아미노산은 그의 활성에 불리한 영향을 주지 않으면서, 메틸화, 아미드화, 아세틸화, 보호기, 및/또는 펩티드의 순환 반감기를 변화시킬 수 있는 다른 화학기로의 치환에 의해 변형될 수 있다. 아미노산은 이황화 결합에 참여할 수 있다. 아미노산은 번역 후 변형 또는 번역 후 변형들, 예컨대, 하나 이상의 엔티티 (예컨대, 메틸 기, 아세테이트 기, 아세틸 기, 포스페이트 기, 포르밀 모이어티, 이소프레노이드 기, 술페이트 기, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 지질 모이어티, 탄수화물 모이어티, 비오틴 모이어티 등)와의 회합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 아미노산은 세포 배양 배지에 제공되거나, 또는 그를 보충하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지에 제공되거나, 또는 그를 보충하는 데 사용되는 아미노산은 염으로서 또는 수화물 형태로 제공될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "항체"라는 용어는 면역글로불린 분자의 가변 영역 내의 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 또는 상기의 조합을 인식하고, 그에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, 항체가 원하는 생물학적 활성을 보이는 한, 본 용어는 무손상 폴리클로날 항체, 무손상 모노클로날 항체, 항체 단편 (예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편), 단일 쇄 Fv (scFv) 항체, 다중특이적 항체, 예컨대, 적어도 2개의 무손상 항체로부터 생성된 이중특이적 항체, 단일특이적 항체, 1가 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체의 항원 결정부를 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 뮤로 지칭되는, 그의 중쇄 불변 도메인의 아이덴티티에 기초하여, 5가지 주요 부류의 면역글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 그의 하위부류 (이소타입) (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 중 임의의 것일 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린은 상이하고, 널리 공지된 서브유닛 구조 및 3차원 입체형태를 갖는다. 항체는 네이키드이거나, 또는 독소 및 방사성 동위원소를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다른 분자에 접합될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 항체의 "항원 결합부" 또는 "항원 결합 단편"이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. "항원 결합 단편"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예, 예컨대, (i) Fab 단편 (파파인 절단으로부터의 단편) 또는 VL, VH, LC 및 CH1 도메인으로 이루어진 유사한 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편 (펩신 절단으로부터의 단편) 또는 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 유사한 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 및 (vii) 임의적으로 합성 링커에 의해 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다. 추가로, 비록 Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, VL 및 VH 영역이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하는 단일 단백질로서 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다 (상기 1가 분자는 단일 쇄 Fv (scFv)로 공지; 예컨대, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426]; 및 [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). 상기 단일 쇄 항체는 또한 항체의 "항원 결합부"라는 용어 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상의 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원 결합부는 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "회분식 배양"이라는 용어는 배지 (하기 "배지" 정의 참조)를 비롯한, 궁극적으로 세포 배양에 사용되는 모든 성분 뿐만 아니라, 세포 그 자체가 배양 공정 시작 시점에 제공되는 것인, 세포를 배양하는 방법을 지칭한다. 회분식 배양은 전형적으로 일부 시점에서 중단되고, 배지 중의 세포 및/또는 성분이 수거되고, 임의적으로 정제된다. "유가식 배양"이라는 용어는 세포 배양물로부터 제1 액체 배양 배지를 실질적으로 또는 상당부 제거하지 않고, 초기 세포 배양물에 제2 액체 배양 배지를 증분식으로 또는 연속적으로 첨가하는 것을 의미한다. 일부 경우에, 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지와 동일한 것이다. 다른 경우에, 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지의 농축된 형태이고/거나, 건조 분말로서 첨가된다.
본원에서 사용되는 바, "생물반응기"라는 용어는 포유동물 세포 배양물의 성장을 위해 사용되는 임의의 베쓸을 지칭한다. 생물반응기는 포유동물 세포를 배양하는 데 유용하다면, 임의의 크기일 수 있다. 전형적으로, 생물반응기는 적어도 1 L가 될 것이며, 이는 10, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 8,000, 10,000, 12,000, 15,000, 20,000 L 또는 그 초과, 또는 그 사이의 임의의 부피일 수 있다. pH 및 온도를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 생물반응기의 내부 조건은 전형적으로 배양 기간 동안 제어된다. 생물반응기는 유리, 플라스틱 또는 금속을 비롯한, 본 발명의 배양 조건하에 배지 중에 현탁된 포유동물 세포 배양물을 수용하는 데 적합한 임의의 물질로 구성될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "생산 생물반응기"라는 용어는 관심 폴리펩티드 또는 단백질 생산에 사용되는 최종 생물반응기를 지칭한다. 대규모 세포 배양 생산 생물반응기의 부피는 전형적으로 적어도 500 L이고, 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000, 12,000, 15,000, 20,000 L 또는 그 초과, 또는 그 사이의 임의의 부피일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 실시에 사용하는 데 적합한 생물반응기에 대해 알고 있을 것이며, 그를 선택할 수 있을 것이다.
본원에서 사용되는 바, "생존 세포 밀도"라는 용어는 주어진 부피의 배지 중에 존재하는 생존 (살아있는) 세포의 개수를 지칭한다. "표적 세포 밀도"라는 용어는 배양물 중 재조합 단백질을 생산하기 위한 배양 배지 부피당 특정 세포 농도를 의미한다. 표적 세포 밀도는 배양된 특정 포유동물 세포에 따라 달라질 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "세포 생존율"이라는 용어는 주어진 배양 조건 또는 실험상 변화 세트하에서 생존할 수 있는 배양물 중 세포의 능력을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, 상기 용어는 또한 특정 시점에 배양물 중의, 살아있는 세포 및 죽은 세포인 세포의 총 개수 대비의 상기 시점에 살아있는 세포의 부분을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "배양물," "세포 배양물" 및 "포유동물 세포 배양물"이라는 용어는 세포 집단의 생존 및/또는 성장에 적합한 조건하에 배지에 현탁되어 있는 포유동물 세포 집단을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명한 바와 같이, 본원에서 사용되는 바, 상기 용어는 포유동물 세포 집단, 및 그 집단이 현탁되어 있는 배지를 포함하는 조합을 지칭할 수 있다.
"배양" 또는 "세포 배양"이라는 용어는 제어된 물리적 조건 세트하에서의 액체 배양 배지 중 포유동물 세포의 유지 또는 성장을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "배지," "세포 배양 배지," "배양 배지"라는 용어는 성장하는 포유동물 세포에 영양분을 공급하는 영양소를 함유하는 용액을 지칭한다. 전형적으로, 상기 용액은 최소 성장 및/또는 생존을 위해 세포가 요구하는 필수 및 비-필수 아미노산, 비타민, 에너지원, 지질, 및 미량 원소를 제공한다. 상기 용액은 또한 호르몬 및 성장 인자를 비롯한, 성장 및/또는 생존을 최소율 초과로 증진시키는 성분을 함유할 수 있다. 상기 용액은 바람직하게 세포 생존 및 증식에 최적인 pH 및 염 농도로 제제화된다. 배지는 또한 "화학적으로 정의된 배지" - 조성이 비공지된 단백질, 가수분해물 또는 성분은 함유하지 않는 무혈청 배지일 수 있다. 정의된 배지는 동물 유래 성분을 함유하지 않고, 모든 성분은 공지된 화학 구조를 갖는다. "농축된 배지," "농축된 배지들," 또는 "농축된 화학적으로 정의된 배지"라는 용어는 표준 배양 배지 대비 추가의 또는 증가된 양의 탄소원 및/또는 영양소를 포함하는 배양 배지이다.
본원에서 사용되는 바, "N-1 단계"라는 용어는 생산 접종 직전의 마지막 시드 확장 단계를 지칭한다. N-1 단계는 폴리펩티드 생산을 위한 생산 생물반응기에 시딩하기 전의 최종 세포 성장 단계이다. 본원에서 사용되는 바, "N-2 단계" 및 "N-3 단계"라는 용어는 세포 성장 및 확장 동안, 및 전형적으로, N 생산 단계 중 접종 전의 일정 기간을 지칭한다. N-3 단계는 N-2 단계에서 사용되는 생존 세포 밀도를 증가시키기 위해 사용되는 세포 성장 단계이다. N-2 단계는 N-1 단계에서 사용되는 생존 세포 밀도를 증가시키기 위해 사용되는 세포 성장 단계이다.
본원에서 사용되는 바, "관류" 또는 "관류 공정"이라는 용어는 세포는 생물반응기에 그대로 유지되면서, (영양 보충제 함유하는) 등가 부피의 배지를 동시에 생물반응기에 첨가하고, 그로부터 제거하는 세포 배양 방법을 지칭한다. 보충 배지에 상응하는 부피의 세포 및 배지를 전형적으로 연속 또는 반-연속적인 방식으로 제거하고, 임의적으로, 정제한다. 전형적으로, 관류 공정을 포함하는 세포 배양 공정은 "관류 배양"으로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 신선한 배지는 세포 배양 공정에서 사용된 기초 배지와 동일하거나, 또는 유사한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 신선한 배지는 기초 배지와 상이하지만, 원하는 영양 보충제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신선한 배지는 화학적으로 정의된 배지이다.
본원에서 사용되는 바, "폴리뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"라는 용어는 단수의 핵산 뿐만 아니라, 복수의 핵산을 포함하는 것으로 의도되며, 이는 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예컨대, 메신저 RNA (mRNA), 상보적 DNA (cDNA), 또는 플라스미드 DNA (pDNA)를 지칭한다. 특정 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 통상의 포스포디에스테르 결합 또는 비-통상의 결합 (예컨대, 예를 들자면, 펩티드 핵산 (PNA)에서 발견되는 아미드 결합)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "폴리펩티드"라는 용어는 아미드 결합 (펩티드 결합으로도 공지)에 의해 선형으로 연결된 단량체 (아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. "폴리펩티드"라는 용어는 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 임의의 쇄 또는 쇄들을 지칭하고, 특정 길이의 생성물을 지칭하는 것은 아니다. 본원에서 사용되는 바, "단백질"이라는 용어는, 일부 경우에는 아미드 결합 이외의 결합에 의해 회합될 수 있는, 하나 이상의 폴리펩티드로 구성된 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 한편, 단백질은 또한 단일 폴리펩티드 쇄일 수 있다. 상기 후자의 경우, 단일 폴리펩티드 쇄는 일부 경우에서, 함께 융합되어 단백질을 형성하는 2개 이상의 폴리펩티드 서브유닛을 포함할 수 있다. "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 또한 제한 없이, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 또는 비-자연적으로 발생된 아미노산에 의한 변형을 비롯한, 발현 후 변형의 생성물을 지칭한다. 폴리펩티드 또는 단백질은 천연의 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 또는 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 이는 화학적 합성을 비롯한, 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "관심 폴리펩티드"라는 용어는 그의 가장 광범위한 의미에서, 그를 위해서는 정제가 요구되는 것인, 혼합물 중에 존재하는 (천연 또는 재조합) 임의의 단백질을 포함하는 것으로 사용된다. 상기 관심 폴리펩티드는 제한 없이, 효소, 호르몬, 성장 인자, 시토카인, 면역글로불린 (예컨대, 항체), 및/또는 임의의 융합 단백질을 포함한다.
세포 배양의 "생산 단계"라는 용어는 세포 배양의 마지막 단계를 지칭한다. 생산 단계 동안, 세포는 먼저 성장한 후, 이어서, 폴리펩티드를 생산하게 될 것이다. 생산 단계는 보편적으로 세포 배양물 제조의 "N" 또는 마지막 단계를 지칭한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 바, "정제하는," "분리시키는," "단리시키는," 또는 "회수하는"이라는 용어는 세포 배양 배지 중에 존재하는 하나 이상의 다른 성분들 (예컨대, 포유동물 세포 또는 배양 배지 단백질), 또는 포유동물 세포 용해물 중에 존재하는 하나 이상의 다른 성분들 (예컨대, DNA, RNA, 또는 다른 단백질)로부터 재조합 단백질을 적어도 부분적으로 (예컨대, 적어도 또는 약 5중량%, 예컨대, 적어도 또는 약 10중량%, 15중량%, 20중량%, 25중량%, 30중량%, 40중량%, 45중량%, 50중량%, 55중량%, 60중량%, 65중량%, 70중량%, 75중량%, 80중량%, 85중량%, 90중량%, 또는 적어도 또는 약 95중량% 순도로) 정제 또는 단리시키는 것을 지칭한다. 전형적으로, 관심 단백질 순도 정도는 조성물로부터 적어도 하나의 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 증가된다.
본원에서 사용되는 바, "재조합적으로 발현된 폴리펩티드" 및 "재조합 폴리펩티드"라는 용어는 폴리펩티드를 발현하도록 유전자 조작된 포유동물 숙주 세포로부터 발현된 폴리펩티드를 지칭한다. 재조합적으로 발현된 폴리펩티드는 보통 포유동물 숙주 세포에서 발현되는 폴리펩티드와 동일하거나, 또는 유사한 것일 수 있다. 재조합적으로 발현된 폴리펩티드는 또한 숙주 세포에 대해 외래인 것, 즉, 보통 포유동물 숙주 세포에서 발현되는 폴리펩티드와 이종성인 것일 수 있다. 대안적으로, 재조합적으로 발현된 폴리펩티드는, 폴리펩티드 중 일부는 보통 포유동물 숙주 세포에서 발현되는 폴리펩티드와 동일하거나, 또는 유사한 아미노산 서열을 함유하는 반면, 나머지 부분은 숙주 세포에 대해 외래인 것인, 키메라 폴리펩티드일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "시딩하는"이라는 용어는 세포 배양물을 생물반응기 또는 또 다른 베쓸에 제공하는 공정을 지칭한다. 세포는 이전에 또 다른 생물반응기 또는 베쓸에서 증식된 것일 수 있다. 대안적으로, 세포는 냉동되고, 그를 생물반응기 또는 베쓸에 제공하기 직전에 해동된 것일 수 있다. 상기 용어는 단일 세포를 비롯한, 임의의 개수의 세포를 지칭한다.
"진탕 플라스크"라는 용어는 적어도 하나의 가스 투과성 표면을 갖는, 적어도 하나의 일정 부피의 액체 배양 배지를 수용할 수 있는 베쓸 (예컨대, 멸균 베쓸)을 의미한다. 예를 들어, 진탕 플라스크는 세포 배양 플라스크, 예컨대, T-플라스크, 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크, 또는 관련 기술분야에서 인정받은, 그의 임의의 변형된 버전일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "역가"라는 용어는 포유동물 세포 배양물에 의해 생산된 재조합적으로 발현된 폴리펩티드 또는 단백질의 총량을 주어진 양의 배지 부피로 나눈 값을 지칭한다. 역가는 전형적으로 배지 1 mL당 폴리펩티드 또는 단백질의 mg인 단위로 표시된다.
본 개시내용의 다양한 측면은 하기 서브섹션에서 추가로 상세하게 기술된다.
본 발명의 방법
본 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 비-관류-기반 배양 시스템에서 관심 재조합 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, N-1 대규모 생물반응기 세포 배양물의 생존 세포 밀도를 증가시키는 신규한 방법이며, 여기서 생존 세포 밀도는 적어도 5 x 106개의 세포/mL로 증가되는 것인 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 (1) 비-관류-기반 배양 시스템 중 N-1 단계에서 관심 재조합 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 생존 세포 밀도는 적어도 5 x 106개의 세포/mL로 증가되는 것인 단계; 및 (2) 비-관류 배양 시스템에서 N-1 세포 배양물로부터 접종된 것인 N 생산 단계에서의 세포를 적어도 1.5 x 106개의 세포/mL의 높은 시드 밀도로 농축된 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 관심 재조합 폴리펩티드를 대규모로 생산하는 신규한 방법을 제공한다.
숙주 세포
세포 배양에, 및 폴리펩티드 발현에 감수성인 임의의 포유동물 세포 또는 세포 유형이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 포유동물 세포의 비제한적인 예로는 BALB/c 마우스 골수종 세포주 (NSO/1, ECACC 번호: 85110503); 인간 망막모세포 (PER.C6 (크루셀(CruCell: 네덜란드 라이덴))); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 또는 현탁 배양물 중에서의 성장을 위해 계대배양된 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포 ±DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1 587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL5 1); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암종 세포주 (Hep G2)를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 CHO 세포주로부터 폴리펩티드 및 단백질을 배양 및 발현하는 데 사용된다.
추가로, 폴리펩티드 또는 단백질을 발현하는 임의의 개수의 상업적으로 및 비-상업적으로 이용가능한 하이브리도마 세포주가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자라면 하이브리도마 세포주가 상이한 영양 요건을 가질 수 있고/거나, 최적의 성장 및 폴리펩티드 또는 단백질 발현을 위해 상이한 배양 조건을 요구할 수 있다는 것을 이해할 것이며, 필요에 따라 조건을 수정할 수 있을 것이다.
상기 언급한 바와 같이, 다수의 경우에서, 세포는 고수준의 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하도록 선택 또는 조작될 것이다. 대개, 세포는 예를 들어, 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 도입에 의해 및/또는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 (내인성이든 또는 도입되었건 간에) 유전자의 발현을 조절하는 제어 요소의 도입에 의해 고수준의 단백질을 생산하도록 유전자 조작된다.
특정 폴리펩티드는 궁극적으로는 어떤 방식으로든 관심 폴리펩티드 또는 단백질의 생산을 제한하는 세포의 세포 성장, 세포 생존율 또는 일부 다른 특징에 유해한 영향을 미칠 수 있다. 심지어 특정 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 한 특정 유형의 세포 집단 중에서도 세포 집단 내에 변동성은 존재하고, 이에 의해 특정 개별 세포가 더욱 잘 성장하고/거나, 관심 폴리펩티드를 더 많이 생산하게 될 것이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 세포주는 세포를 배양하기 위해 선택된 특정 조건하에서의 강건한 성장을 위해 실무자에 의해 경험적으로 선택된다. 다른 실시양태에서, 특정 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 개별 세포는 세포 성장, 최종 세포 밀도, 세포 생존율(%), 발현된 폴리펩티드의 역가, 또는 상기 조건 또는 실무자에 의해 중요한 것으로 간주되는 임의의 다른 조건의 임의의 조합에 기초하여 대규모 생산을 위해 선택된다.
유가식 세포 배양 생산
관심 폴리펩티드를 생산하는 전형적인 방법은 시드 확장을 위한 회분식 배양 및 유가식 배양 생산 단계를 포함한다. 회분식 시드 배양 공정은 전통적으로 대규모 생산 배양물에 특정 세포 밀도의 시드 배양물을 접종하고, 세포 성장 및 생존율에 도움이 되는 조건하에서 세포를 성장시키고, 세포가 언급된 세포 밀도에 도달하였을 때, 시드 배양물을 다음 단계로 전달하는 것을 포함한다. 유가식 배양 방법은 회분식 배양을, 영양소 및 세포 성장 동안 소비되는 다른 성분으로 보충하는 추가 단계 또는 단계들을 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 회분식, 유가식 및 관류 시스템을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 세포가 배양되는 임의의 시스템에서 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본 발명의 특정의 바람직한 실시양태에서, 세포는 회분식 또는 유가식 시스템에서 성장된다.
농축된 배지
본 발명은 본원에 기술된 다른 배양 단계에 따라 사용될 때, N-1 배양물 중 숙주 세포의 생존 세포 밀도를 증가시키고/거나, 비-농축된 배지에서 배양된 숙주 세포와 비교하였을 때, 높은 시드 밀도에서의 생산 배양물 중에 더 많은 영양소를 제공하는 농축된, 화학적으로 정의된 배지 제제를 제공한다. 세포 성장에 또는 관심 폴리펩티드의 생산에 유익한 영향을 주는 것으로 밝혀진 본 발명의 농축된 배지 제제는 표준 배양 배지 대비 i) 증가된 양의 탄소원 및/또는 ii) 증가된 영양소를 포함한다. 추가로, 탄소원은 카세인, 락테이트, 덱스트로스, 프럭토스, 프럭탄, 글루코스, 수크로스, 락토스, 말토스, 아세테이트, 글리세롤, 소르비톨, 만닛톨, 사카로스, 크실로스, 당밀, 푸코스, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 아세트산나트륨, 아라비노스, 대두 단백질, 가용성 단백질, 라피노스, 아밀로스, 전분, 트립톤, 효모 추출물 및 그의 조합일 수 있고, 영양소는 아미노산일 수 있다. 농축된 배지는 피드 배지를 이용하여 탄소원 및/또는 영양소가 비-농축된 배지 대비 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 또는 적어도 20% 농축된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자라면 본 발명의 배지 제제는 정의된 배지 및 비-정의된 배지, 둘 모두를 포함한다는 것을 이해할 것이다.
실시예 1-3에 제시된, 농축된 배지를 사용하였을 때의 예상 밖의 결과는, N-1 배양 단계 동안 농축된 배지를 이용하여 회분식 방법으로 배양된 숙주 세포는 비-농축된 배지를 이용하여 회분식 방법으로 배양된 숙주 세포보다 증가된 생존 세포 밀도를 보인다는 것이다. 또한, 농축된 배지를 이용하여 회분식 방법으로 배양된 숙주 세포는 농축된 배지 없이 유가식 방법으로 배양된 숙주 세포와 유사한 생존 세포 밀도 및/또는 세포 생존율을 보였다. 따라서, 농축된 배지를 이용하여 회분식 방법으로 배양된 숙주 세포는 비-농축된 배지를 이용하여 관류 또는 유가식 시스템에서 배양된 숙주 세포와 유사한 결과를 달성할 수 있다.
실시예 1-3에 제시된, 농축된 배지를 사용하였을 때의 예상 밖의 또 다른 결과는, 농축된 배지를 이용하여 회분식 배양으로 성장된 세포로부터 시딩된 생산 배양물은 관심 폴리펩티드에 대하여, 농축된 배지 없이 관류 또는 유가식 방법으로부터의 세포가 시딩된 생산 배양물과 유사한 역가를 가졌다는 것이다. 상기 열거된 조건은 개별적으로, 또는 서로 다양한 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 개시된 상기 배지 제제 중 임의의 것은 임의적으로 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자, 특정 이온 (예컨대, 나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘, 포스페이트), 완충제, 비타민, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 미량 원소 (보통 극도로 낮은 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 아미노산, 지질, 단백질 가수분해물, 또는 글루코스 또는 다른 에너지원으로 보충될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 배지를 화학적 인덕턴트(inductant), 예컨대, 헥사메틸렌-비스(아세트아미드) ("HMBA") 및 소듐 부티레이트 ("NaB")로 보충하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 임의적 보충제는 배양 시작시 첨가될 수 있거나, 또는 고갈된 영양소 보충을 위해 또는 또 다른 이유에서 나중 시점에 첨가될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 개시된 배지 제제 중에 포함될 수 있는 임의의 바람직하거나, 필요한 보충제에 대해 알 것이다.
포유동물 세포 배양물 제공
일단 관심 폴리펩티드 또는 단백질을 발현하는 세포를 확인하고 나면, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다양한 방법들 중 임의의 것에 의해 배양물 중에서 증식시킨다. 관심 폴리펩티드 또는 단백질을 발현하는 세포는 전형적으로 세포의 생존, 성장 및 생존율에 도움이 되는 온도하에서 및 배지 중에서 그를 성장시킴으로써 증식된다. 초기의 배양물 부피는 임의의 크기일 수 있지만, 대개는 관심 폴리펩티드 또는 단백질의 최종 생산에서 사용되는 생산 생물반응기의 배양물 부피보다는 작고, 빈번하게 세포는 생산 생물반응기에 시딩하기 전에 증가된 부피의 생물반응기에서 수회에 걸쳐 계대접종된다. 일단 세포가 특정 생존 세포 밀도에 도달하고 나면, 세포를 생물반응기에서 성장시켜 생존 세포의 개수를 추가로 증가시킨다. 이들 생물반응기는 N-1, N-2, N-3 등으로 지칭된다. "N"은 주요 생산 배양 생물반응기를 지칭하고, 동시에 "N-1"은 주요 생산 배양 이전의 생물반응기를 의미하며, 기타 이런 방식의 의미를 갖는다.
세포 배양물은 배지의 산화 및 영양소의 세포로의 분산을 증가시키기 위해 교반 또는 진탕될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 관련 기술분야에 널리 공지된 특수 주입 장치를 사용하여 배양물의 산화를 증가 및 제어할 수 있다. 본 발명에 따라, 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, pH, 온도, 산화 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 생물반응기의 특정 내부 조건을 제어 또는 조절하는 것이 유익할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
N-3 생물반응기에서의 출발 세포 밀도는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 본 발명에 따라, 생산 생물반응기에서의 출발 세포 밀도는 2x104개의 생존 세포/mL 정도로 낮을 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, N-3 생물반응기에서의 출발 세포 밀도는 2x104, 2x105, 2x106, 5x106, 10x106개의 생존 세포/mL 및 그 초과 범위일 수 있다. 농축된 배지를 이용하여 N-3 숙주 세포를 배양하면, 생존 세포 밀도는 적어도 5x106개의 생존 세포/mL 내지 5x106, 10x106, 15x106, 20x106, 25x106 또는 30x106개의 생존 세포/mL 및 그 초과인 세포 밀도가 될 수 있다.
N-2 생물반응기에서의 출발 세포 밀도는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 본 발명에 따라, 생산 생물반응기에서의 출발 세포 밀도는 2x104개의 생존 세포/mL 정도로 낮을 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, N-2 생물반응기에서의 출발 세포 밀도는 약 2x104개의 생존 세포/mL 내지 약 2x105, 2x106, 5x106, 10x106개의 생존 세포/mL 및 그 초과 범위일 수 있다. 농축된 배지를 이용하여 N-2 숙주 세포를 배양하면, 생존 세포 밀도는 적어도 5x106개의 생존 세포/mL 내지 10x106, 15x106, 20x106, 25x106 또는 30x106개의 생존 세포/mL 및 그 초과인 세포 밀도가 될 수 있다.
N-1 생물반응기에서의 출발 세포 밀도는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 본 발명에 따라, 생산 생물반응기에서의 출발 세포 밀도는 배양물 부피당 하나의 단일 세포 정도로 낮을 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 생산 생물반응기에서의 출발 세포 밀도는 약 2x104개의 생존 세포/mL 내지 약 2x105, 2x106, 5x106, 10x106개의 생존 세포/mL 및 그 초과 범위일 수 있다. 농축된 배지를 이용하여 N-1 숙주 세포를 배양하면, 생존 세포 밀도는 적어도 5x106개의 생존 세포/mL 내지 약 5x106, 10x106, 15x106, 20x106, 25x106 또는 30x106개의 생존 세포/mL 및 그 초과인 세포 밀도가 될 수 있다.
N 생산 생물반응기에서의 출발 세포 밀도는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 본 발명에 따라, N 생산 생물반응기에서의 출발 세포 밀도는 1 x 106개의 세포/mL 정도로 낮을 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 생산 생물반응기에서의 출발 세포 밀도는 약 1x106개의 생존 세포/mL 내지 약 2x106, 5x106, 10x106개의 생존 세포/mL 및 그 초과 범위일 수 있다. 농축된 배지를 이용하여 숙주 세포를 배양하면, 생존 세포 밀도는 적어도 1x106개의 생존 세포/mL 내지 약 2x106, 5x106, 10x106, 15x106, 20x106, 25x106 또는 30x106개의 생존 세포/mL 및 그 초과인 세포 밀도가 될 수 있다.
일반적으로, N-1의 세포 배양물은 다음 생산 생물반응기 시딩 이전에 원하는 밀도로 성장시킬 수 있다. 비록 전체적인 또는 거의 전체에 가까운 생존율이 요구되는 것은 아니지만, 시딩 이전에 대부분의 세포가 살아있는 상태 그대로 유지되는 것이 바람직하다. 본 발명의 한 실시양태에서, 세포는 예를 들어, 저속 원심분리에 의해 상청액으로부터 제거될 수 있다. 임의의 원치않는 대사 폐기물 또는 배지 성분을 제거하기 위해 다음 생물반응기에 시딩하기 전에, 제거된 세포를 배지로 세척하는 것 또한 바람직할 수 있다. 배지는 이전 세포 성장이 이루어졌던 배지일 수 있거나, 또는 본 발명의 실무자에 의해 선택된 상이한 배지 또는 세척액일 수 있다.
이어서, N-1의 세포를 생산 생물반응기 시딩에 적절한 밀도로 희석시킬 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 세포는 생산 생물반응기에서 사용되는 것과 동일한 배지로 희석된다. 대안적으로, 세포는 본 발명의 실무자의 필요 및 요구에 따라 또는 세포 그 자체의 특정 요건을 수용하기 위해, 예를 들어, 생산 생물반응기 시딩 이전에 짧은 기간 동안 보관되어야 한다면, 또 다른 배지 또는 용액으로 희석된다.
본 발명에 따라, 생산 생물반응기는 폴리펩티드 또는 단백질의 대규모 생산에 적절한 임의의 부피일 수 있다. 특정 실시양태에서, 생산 생물반응기의 부피는 적어도 500 L이다. 다른 실시양태에서, 생산 생물반응기의 부피는 1,000, 2,500, 5,000, 8,000, 10,000, 15,000, 또는 20,000 L 또는 그 초과, 또는 그 사이의 임의의 부피이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 실시에 사용하는 데 적합한 생물반응기에 대해 알고 있을 것이며, 그를 선택할 수 있을 것이다. 생산 생물반응기는 생산되는 폴리펩티드 또는 단백질의 발현 또는 안정성을 방해하지 않는, 세포 성장 및 생존율에 도움이 되는 임의의 물질로 구축될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 생산 단계는 비-농축된 배지 대비 농축된 배지를 포함한다. 예를 들어, 배지는 피드 배지에 의해 비-농축된 배지 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 또는 적어도 20% 농축된다. 특정 실시양태에서, 농축된 배지는 증가된 양의 탄소원 (예컨대, 글루코스)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 농축된 배지는 증가된 양의 영양소 (예컨대, 아미노산)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 농축된 배지는 증가된 양의 탄소원 및 영양소를 포함한다.
N-1 단계 또는 생산 단계에서 세포 배양 온도는 주로 세포 배양물이 생존 상태 그대로 유지되는 온도 범위에 기초하여 선택될 것이다. 일반적으로, 대부분의 포유동물 세포는 약 25℃ 내지 42℃ 범위 내에서 잘 성장한다. 바람직하게, 포유동물 세포는 약 35℃ 내지 40℃ 범위 내에서 잘 성장한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 세포의 요구 및 실무자의 생산 요건에 의존하여 세포를 성장시키는 적절한 온도 또는 온도들을 선택할 수 있을 것이다. 임의적으로, 온도는 단일의 일정한 온도로 유지된다. 임의적으로, 온도는 온도 범위 내에서 유지된다. 예를 들어, 온도는 꾸준히 증가 또는 감소될 수 있다. 대안적으로, 온도는 다양한 시점에 별개의 양만큼 증가 또는 감소될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 단일 또는 다중 온도가 사용되어야 하는지 여부, 및 온도가 꾸준히 또는 별개의 양만큼 조정되어야 하는지 여부를 결정할 수 있을 것이다.
N-1 단계 또는 생산 단계의 세포는 실무자의 필요 및 세포 자체의 요건에 의존하여 더욱 많은 또는 더욱 적은 시간량 동안 성장될 수 있다. 한 실시양태에서, 세포는, 세포가 어떤 방해도 받지 않고 성장할 수 있도록 허용된다면, 이때, 최종적으로 도달하게 되는 최대 생존 세포 밀도 대비의 주어진 비율인 생존 세포 밀도를 달성하는 데 충분한 기간 동안 성장된다. 세포는 정의된 기간 동안 성장할 수 있도록 허용된다. 예를 들어, 세포 배양물의 출발 농도, 세포의 성장이 이루어지는 온도, 및 세포의 고유한 성장률에 의존하여, 세포는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일, 또는 그 초과의 기간 동안 성장될 수 있다. 본 발명의 실무자는 폴리펩티드 생산 요건 및 세포 그 자체의 요구에 의존하여 성장 지속 기간을 선택할 수 있을 것이다.
배양 조건 모니터링
본 발명의 특정 실시양태에서, 특정의 성장 세포 배양 조건이 모니터링된다. 세포 배양 조건을 모니터링함으로써 세포 배양물이 재조합 폴리펩티드 또는 단백질을 차선 수준으로 생산하는지 여부, 또는 배양물이 차선의 생산 단계에 접어들게 되는지 여부를 결정할 수 있다.
비제한적인 예로서, 온도, pH, 세포 밀도, 세포 생존율, 통합된 생존 세포 밀도, 락테이트 수준, 암모늄 수준, 오스몰농도, 또는 발현된 폴리펩티드 또는 단백질의 역가를 모니터링하는 것이 유익하거나, 또는 필요할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 상기 조건들을 측정할 수 있도록 허용하는 다수의 기술이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 세포 밀도는 혈구계수기, 쿨터(Coulter) 계수기 (비-셀(Vi-Cell)), 또는 세포 밀도 검사 (CEDEX)를 이용하여 측정될 수 있다. 생존 세포 밀도는 배양물 샘플을 트리판 블루(Trypan blue)로 염색함으로써 결정될 수 있다. 오직 죽은 세포만이 트리판 블루를 흡수하기 때문에, 생존 세포 밀도는 세포의 총 개수를 계수하고, 염료를 흡수한 세포의 개수를 상기 세포의 총 개수로 나누고, 역수를 구함으로써 결정될 수 있다. HPLC는 락테이트, 암모늄 또는 발현된 폴리펩티드 또는 단백질 수준을 결정하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 발현된 폴리펩티드 또는 단백질 수준은 표준 분자 생물학 기술, 예컨대, SDS-PAGE 겔의 쿠마시(coomassie) 염색, 웨스턴 블롯팅, 브래드퍼드(Bradford) 검정법, 로우리(Lowry) 검정법, 뷰렛(Biuret) 검정법, 및 UV 흡광도에 의해 결정될 수 있다. 인산화 및 글리코실화를 비롯한, 발현된 폴리펩티드 또는 단백질의 번역 후 변형을 모니터링하는 것 또한 유익하거나, 또는 필요할 수 있다.
발현된 폴리펩티드의 단리
일반적으로, 본 발명에 따라 발현된 단백질 또는 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 것이 바람직할 것이다. 한 실시양태에서, 발현된 폴리펩티드 또는 단백질은 배지로 분비되고, 따라서, 예를 들어, 정제 공정에서 제1 단계로서 원심분리 또는 여과에 의해 세포 및 다른 고체를 제거할 수 있다. 본원에 기술된 방법 및 조성물을 통해 그 결과로 세포 생존율이 증가하기 때문에, 본 실시양태는 본 발명에 따라 사용될 때에 특히 유용하다. 결과로서, 배양 공정 동안 더 적은 세포가 사멸하고, 잠재적으로는 발현된 폴리펩티드 또는 단백질의 수율을 감소시킬 수 있는 단백질분해 효소는 더 적은 양이 배지로 방출된다.
재조합 폴리펩티드
본 발명의 방법은 치료 항체를 비롯한, 관심의 대상인 임의의 재조합 폴리펩티드의 대규모 생산을 위해 사용될 수 있다. 본원에 제공된 방법에 의해 생산될 수 있는 재조합 폴리펩티드의 비제한적인 예로는 항체 (무손상 면역글로불린 또는 항체 단편 포함), 효소 (예컨대, 갈락토시다제), 단백질 (예컨대, 인간 에리트로포이에틴, 종양 괴사 인자 (TNF), 또는 인터페론 알파 또는 베타), 세포 수용체 (예컨대, EGFR) 또는 면역원성 또는 항원성 단백질 또는 단백질 단편 (예컨대, 백신용 단백질)을 포함한다. 본 발명의 범주 내의 항체로는 트라스투주맙(Trastuzumab) (허셉틴(HERCEPTIN)®)을 비롯한 항-HER2 항체 (Carter et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:4285-4289 (1992)); 항-HER3 항체; 항-HER4 항체; 미국 특허 번호 5,725,856); 항-CD20 항체, 예컨대, 미국 특허 번호 5,736,137에서의 것과 같은 키메라 항-CD20 "C2B8" (리툭산(RITUXAN)®), 미국 특허 번호 5,721,108B1에서의 것과 같은 2H7 항체의 키메라 또는 인간화 변이체, 또는 토시투모맙(Tositumomab) (벡사(BEXXAR)®); 항-IL-8 (문헌 [St John et al., Chest, 103:932 (1993)], 및 국제 공개 번호 WO 95/23865); 인간화 및/또는 친화도 성숙화된 항-VEGF 항체를 비롯한, 항-VEGF 항체, 예컨대, 인간화 항-VEGF 항체 huA4.6.1 아바스틴(AVASTIN)® (문헌 [Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992)], 국제 공개 번호 WO 96/30046, 및 WO 98/45331 (1998년 10월 15일 공개); 항-PSCA 항체 (WO01/40309); S2C6 및 그의 인간화 변이체 (WO00/75348)를 비롯한, 항-CD40 항체; 항-CD11a (미국 특허 번호 5,622,700, WO 98/23761, 문헌 [Steppe et al., Transplant Intl . 4:3-7 (1991)], 및 [Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)]); 항-IgE (문헌 [Presta et al., J. Immunol . 151:2623-2632 (1993)], 및 국제 공개 번호 WO 95/19181); 항-CD18 (미국 특허 번호 5,622,700 (1997년 4월 22일 등록), 또는 WO 97/26912 (1997년 7월 31일 공개)에서의 것과 같은 것); 항-IgE (E25, E26 및 E27 포함; 미국 특허 번호 5,714,338 (1998년 2월 3일 등록) 또는 미국 특허 번호 5,091,313 (1992년 2월 25일 등록), WO 93/04173 (1993년 3월 4일 공개), 또는 국제 출원 번호 PCT/US98/13410 (1998년 6월 30일 출원), 미국 특허 번호 5,714,338); 항-Apo-2 수용체 항체 (WO 98/51793 (1998년 11월 19일 공개)); 항-TNF-α 항체 (cA2 (레미캐이드(REMICADE)®), CDP571 및 MAK-195 포함) (미국 특허 번호 5,672,347 (1997년 9월 30일 등록), 문헌 [Lorenz et al., J. Immunol . 156(4):1646-1653 (1996)], 및 [Dhainaut et al., Crit . Care Med . 23(9):1461-1469 (1995)] 참조); 항-조직 인자 (TF) (유럽 특허 번호 0 420 937 B1 (1994년 11월 9일 등록)); 항-인간 α4β7 인테그린 (WO 98/06248 (1998년 2월 19일 공개); 항-EGFR (WO 96/40210 (1996년 12월 19일 공개)에서의 것과 같은 키메라화 또는 인간화 225 항체); 항-CD3 항체, 예컨대, OKT3 (미국 특허 번호 4,515,893 (1985년 3월 7일 등록)); 항-CD25 또는 항-tac 항체, 예컨대, CHI-621 (씨뮬렉트(SIMULECT)®) 및 (제나팍스(ZENAPAX)®) (미국 특허 번호 5,693,762 (1997년 12월 2일 등록) 참조); 항-CD4 항체, 예컨대, cM-7412 항체 (Choy et al., Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996)); 항-CD52 항체, 예컨대, 캄패스-1H(CAMPATH-1H) (Riechmann et al., Nature 332:323-337 (1988)); 항-Fc 수용체 항체, 예컨대, 문헌 [Graziano et al., J. Immunol . 155(10):4996-5002 (1995)]에서의 것과 같은, FcγRI에 대한 M22 항체; 항-암배아 항원 (CEA) 항체, 예컨대, hMN-14 (Sharkey et al., Cancer Res. 55(23 Suppl): 5935s-5945s (1995)); 유방 상피 세포에 대한 항체 (huBrE-3, hu-Mc 3 및 CHL6 포함) (문헌 [Ceriani et al., Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995)]; 및 [Richman et al., Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995)]); 결장 암종 세포에 결합하는 항체, 예컨대, C242 (Litton et al., Eur J. Immunol . 26(1):1-9 (1996)); 항-CD38 항체, 예컨대 AT 13/5 (Ellis et al., J. Immunol . 155(2):925-937 (1995)); 항-CD33 항체, 예컨대, Hu M195 (Jurcic et al., Cancer Res 55(23 Suppl): 5908s-5910s (1995)) 및 CMA-676 또는 CDP771; 항-CD22 항체, 예컨대, LL2 또는 림포시드(LymphoCide) (Juweid et al., Cancer Res 55(23 Suppl): 5899s-5907s (1995)); 항-EpCAM 항체, 예컨대, 17-1A (파노렉스(PANOREX)®); 항-GpIIb/IIIa 항체, 예컨대, 압식시맙 또는 c7E3 Fab (레오프로(REOPRO)®); 항-RSV 항체, 예컨대, MEDI-493 (시나기스(SYNAGIS)®); 항-CMV 항체, 예컨대, 프로토비르(PROTOVIR)®; 항-HIV 항체, 예컨대, PRO542; 항-간염 항체, 예컨대, 항-Hep B 항체 오스타비르(OSTAVIR)®; 항-CA 125 항체 오라렉스(OvaRex); 항-이디오타입 GD3 에피토프 항체 BEC2; 항-αvβ3 항체 비탁신(VITAXIN)®; 항-인간 신장 세포 암종 항체, 예컨대, ch-G250; ING-1; 항-인간 17-1A 항체 (3622W94); 항-인간 결장직장 종양 항체 (A33); GD3 강글리오시드에 대한 항-인간 흑색종 항체 R24; 항-인간 편평 세포 암종 (SF-25); 항-인간 백혈구 항원 (HLA) 항체, 예컨대, 스마트(Smart) ID10; 항-PD-1 항체; 항-PD-L1 항체; 항-LAG-3 항체; 항-GITR 항체; 항-TIGIT 항체; 항-CXCR4 항체; 항-CD73 항체; 및 항-HLA DR 항체 온코림(Oncolym) (림-1(Lym-1))을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 기술내용은 단지 대표적인 것으로서 이해되어야 하며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명 및 또한 추가 적용을 실행하기 위한 대안적 방법 및 물질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이고, 첨부된 청구범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
실시예
세포주 및 배지
3개의 상이한 모노클로날 항체 또는 폴리펩티드를 생산하는 3개의 상이한 CHO 세포주를 본 실험에서 사용하였다. 사용된 시드, 기초 및 피드 배지는 화학적으로 정의된 것이었다.
N-1 시드 배양물
회분식 및 유가식 N-1 배양물의 경우, 세포를 초기 부피 80-100 ml로 250 ml 진탕 플라스크 중에서, 또는 초기 부피 1,000 ml로 2 L 진탕 플라스크 중에서 성장시켰다. 25 mm 투사 거리하의 회전 진탕기 상에서 150 rpm의 진탕 속도를 사용하였다. 인큐베이터 환경은 36.5℃의 일정한 온도였고, CO2는 5%로 제어되었다. 회분식 N-1 배양물의 경우, 시드 배지를 농축시키지 않거나, 또는 글루코스를 농축시키거나, 또는 글루코스 및 영양소를 농축시켰다. 회분식 N-1 배양물에 어떤 피드도 첨가하지 않았다. 유가식 N-1 배양물의 경우, 시드 배지를 3일째부터 매일 공급하였다.
관류 N-1 배양물은 10 L 세포 백 중에 성장 세포를 초기 부피 5 L로 포함하였다. 진동 속도는 28 rpm으로 제어되었고, 진동각은 7°로 설정하였다. CO2는 0일째 내지 1일째 사이에는 4%로 제어하였고, 그 이후에는 제어하지 않았다. 보조 ATF-2 (레플리겐(Repligen))를 세포 백에 연결하여 배양물을 관류시켰다. 하기 스케줄에 따라 기존에 있던 배양 배지는 동일한 비율로 계속해서 제거하면서, 신선한 배양 배지 (1x 농축)를 계속해서 첨가한다: D2-4에서 0.5 VVD, D4-5에서 1.0 VVD로 증가, 및 D5-6에서 최종적으로 2.0 VVD로 증가.
생산 배양물
유가식 생산 생물반응기는 3.3 L 초기 작업 부피로 5 L 사르토리우스(Sartorius) 생물반응기로 수행하였다.
분석
비-셀 자동화 세포 계수기 (벡크만쿨터(Beckman Coulter))를 이용하여 오프라인으로 생존 세포 밀도 (VCD) 및 세포 생존율을 측정하였다. 세덱스 바이오 HT(Cedex Bio HT) (로슈(Roche))를 이용하여 오프라인으로 배양물 샘플을 분석하여 글루코스, 글루타민, 글루타메이트, 락테이트, 및 암모늄을 모니터링하였다. 생물반응기 배양물의 경우, 바이오프로파일 pHOX(BioProfile pHOX) (노바 바이오메디컬(Nova Biomedical))를 이용하여 오프라인으로 pH, pCO2, pO2 또한 측정하였다. 프로테인 A(Protein A) UPLC 방법을 이용하여 단백질 역가를 측정하였고, 이는 정규화된 값으로 기록하였다.
온도 제어식 자동샘플러 및 워터스(Waters) 2996 PDA 검출기가 장착된 워터스 알리안스(Waters Alliance) HPLC 시스템 (미국 매사추세츠주 밀포드) 상에서 280 nm에서의 등용매 구배 모니터링하에 토소(Tosoh) TSK G3000SWxl 칼럼, 7.8 x 30 cm, 5 um를 이용하여 고분자량 (HMW)에 대한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 수행하였다.
영상화 모세관 등전 집중법 (iCIEF)에 의해 전하 변형체를 검정하였고, 이는 월콧(Alcott) 720NV 자동샘플러 (미국 캘리포니아주 산호세)가 장착된 프로테인 심플 iCE3(Protein Simple iCE3) 장치에서 수행되었다. 샘플을 적절한 pI 마커, 양쪽성 물질, 및 우레아와 함께 혼합하고, 플루오르화탄소 코팅된 모세관 카트리지 내로 주입하였다. 고전압을 인가하였고, 전하 변형체는 그의 각 pI로 이동하였다. UV 카메라는 280 nM에서 영상을 포착하였다. 주요 피크를 확인하였고, 산성 범위 및 염기성 범위로 이동한 피크를 합산하고, 정량화하고, 상대 면적률(%)로 기록하였다.
프로자임(Prozyme)으로부터 입수한 상업적으로 이용가능한 키트인, 2-AB를 포함하는 글리코프렙® 라피드 N-글리칸 프리퍼레이션(GlykoPrep® Rapid N-Glycan Preparation with 2-AB) (미국 캘리포니아주 헤이워드)을 이용하여 N-글리칸 분석을 수행하였다. 온도 제어식 자동샘플러 및 형광 검출기가 장착된 워터스 액쿼티 H-클래스 시스템(Waters Acquity H-Class system) (미국 매사추세츠주 밀포드) 상에서 액쿼티 UPLC 글리칸 BEH 아미드(Acquity UPLC Glycan BEH Amide), 130 Å, 1.7 ㎛, 2.1x10 mm 칼럼 (미국 매사추세츠주 밀포드)을 이용하여 유리 올리고당을 프로파일링하였다.
실시예 1
세포주 A: N-1 시드 배양물
세포주 A의 경우, N-1 배양물을 회분식 모드, 글루코스가 농축된 회분식 모드, 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식 모드, 유가식 또는 관류 모드로 성장시켰다. 회분식 N-1 배양물은 오직 15x106개의 세포/mL의 피크 VCD에만 도달하였고, 배양 기간 종료에 가까운 시점까지 높은 세포 생존율을 유지시키는 데에는 실패하였다 (도 1a). 그에 반해, 글루코스가 농축된 회분식 N-1 배양물은 17x106개의 세포/mL의 VCD에 도달하였고, >99% 세포 생존율을 유지하였다 (도 1a). 유사하게, 유가식 N-1 및 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식 N-1, 둘 모두 6일째 >20x106개의 세포/mL까지 성장하였고, 생존율은 >99%로 유지되었다 (도 1a 및 1b). 관류 N-1 배양물 중의 세포는 6일째 44x106개의 세포/mL까지 성장하였고, 생존율은 >99%로 유지되었다 (도 1a 및 1b).
폴리펩티드-1 생산을 위한 세포주 A: 고밀도 유가식 생산 배양
세포주 A의 경우, 글루코스가 농축된 회분식 배양물, 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식 배양물, 유가식 또는 관류 배양물 중에서 성장된 시드를 사용하여 고밀도 유가식 생산 배양을 개시하였다.
N 생산 배양물을 14일 동안 5x106개의 세포/mL의 높은 시드 밀도로 접종하였다. 매일의 피드는 배양물 부피의 3.5%인 피딩 부피로 2일째에 시작하였다. 용존 산소량 (DO)을 40%로 유지시키고, pH는 6.8 내지 7.6으로 제어하였다. 온도는 초기에는 36.5℃로 유지시켰고, 4일째 34℃로 이동시켰다.
도 2a는 모든 생산 배양물이 전체 배양 기간 동안에 걸쳐 >90% 세포 생존율을 유지하였다는 것을 입증한다. 유가식 시드 배양물 및 글루코스 농축, 또는 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식 시드 배양물의 경우, 17x106개의 세포/mL인 것과 비교하여, 관류 시드 배양물은 22x106개의 세포/mL의 최대 생존 세포 밀도를 가졌다 (도 2a). 관류 시드 배양물로부터의 폴리펩티드-1에 대한 역가는 대략 9.3 g/L인 반면, 유가식 시드 배양물은 대략 9 g/L의 역가를 가졌다 (도 2b). 글루코스, 또는 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식 시드로부터의 관심 폴리펩티드의 역가는 각각 대략 8.5 g/L 및 9 g/L였다. 도 2c는 예컨대, iCIEF, SEC, 및 N-글리칸과 같은 품질 속성이 상이한 N-1 시드와 상관없이 모든 N 생산 조건에 대해 유사하였다는 것을 보여준다.
실시예 2
세포주 B: N-1 시드 배양물
세포주 B의 경우, N-1 배양물을 회분식 모드, 글루코스가 농축된 회분식 모드, 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식 모드, 유가식 또는 관류 모드로 성장시켰다. 회분식 N-1 배양물은 오직 24.5x106개의 세포/mL의 피크 VCD에만 도달하였고, 높은 세포 생존율을 유지시키는 데에는 실패하였다 (도 3a 및 3b). 그에 반해, 글루코스만 단독으로 농축, 또는 글루코스 및 영양소가 둘 모두 농축된 회분식 N-1 배양물은 ≥25.5x106개의 생존 세포/mL에 도달하였고, ≥99% 세포 생존율을 유지하였다 (도 3a 및 3b). 유사하게, 유가식 N-1 배양물은 5일째 ≥30x106개의 생존 세포/mL까지 성장하였고, 생존율은 ≥99%로 유지되었다 (도 3a 및 3b). 관류 N-1 배양물 중의 세포는 5일째 41x106개의 세포/mL까지 성장하였고, 생존율은 ≥99%로 유지되었다 (도 3a 및 3b).
폴리펩티드-2 생산을 위한 세포주 B: 고밀도 유가식 생산 배양
세포주 B의 경우, 회분식 배양물, 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식 배양물, 유가식 또는 관류 배양물 중에서 성장된 시드를 사용하여 고밀도 유가식 생산 배양을 개시하였다.
생산 배양물을 14일 동안 3x106개의 세포/mL의 높은 시드 밀도로 접종하였다. 매일의 피드는 배양물 부피의 3.1%인 피딩 부피로 2일째에 시작하였다. 용존 산소량 (DO)을 40%로 유지시키고, pH는 6.7 내지 7.6으로 제어하였다. 온도는 초기에는 36.5℃로 유지시켰다.
도 4a는 모든 생산 배양물이 전체 배양 기간 동안에 걸쳐 >90% 세포 생존율을 유지하였다는 것을 입증한다. 유가식 시드 배양물 및 글루코스 농축, 또는 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식 시드 배양물의 경우, 단지 대략 24x106개의 세포/mL인 것과 비교하여, 관류 시드 배양물은 대략 26x106개의 세포/mL의 최대 생존 세포 밀도를 가졌다 (도 4a). 관류 시드 배양물 및 (글루코스 및 영양소가 농축된) 회분식 시드 배양물로부터의 관심 폴리펩티드에 대한 역가는 대략 3.2 g/L인 반면, 회분식 시드 배양물 및 유가식 시드 배양물은 대략 3 g/L의 역가를 가졌다 (도 4b). 도 4c는 예컨대, iCIEF, SEC, 및 N-글리칸과 같은 품질 속성이 상이한 N-1 시드와 상관없이 모든 N 생산 조건에 대해 유사하였다는 것을 보여준다.
실시예 3
세포주 C: N-1 시드 배양물
세포주 C의 경우, N-1 배양물을 회분식 모드, 글루코스가 농축된 회분식 모드, 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식 모드, 유가식 또는 관류 모드로 성장시켰다. 회분식 N-1 배양물은 오직 26x106개의 세포/mL의 피크 VCD에만 도달하였고, 높은 생존율을 유지시키는 데에는 실패하였다 (도 5a 및 5b). 그에 반해, 글루코스 단독으로 농축, 또는 글루코스 및 영양소가 둘 모두 농축된 회분식 N-1 배양물은 ≥30x106개의 생존 세포/mL에 도달하였고, ≥99% 세포 생존율을 유지하였다 (도 5a 및 5b). 유사하게, 유가식 N-1 배양물은 5일째 ≥33x106개의 생존 세포/mL까지 성장하였고, 생존율은 ≥99%로 유지되었다 (도 5a 및 5b). 관류 N-1 배양물 중의 세포는 5일째 62x106개의 세포/mL까지 성장하였고, 생존율은 ≥99%로 유지되었다 (도 5a 및 5b).
폴리펩티드-3 생산을 위한 세포주 C (실험 1): 유가식 시드 및, 또는 글루코 스 및 영양소가 농축된 회분식 시드를 이용한 고밀도 유가식 생산 배양
세포주 C의 경우, 유가식 배양물, 또는 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식 배양물 중에서 성장된 시드를 사용하여 고밀도 유가식 생산 배양을 개시하였다.
생산 배양을 14일 동안 6x106개의 세포/mL의 높은 시드 밀도로 개시하였다. 매일의 피드는 D2-10에는 배양물 부피의 5%인 피딩 부피로 2일째에 시작하고, D11-13에는 배양물 부피의 3.3%로 하였다. 피딩은 명시된 양의 절반인 양으로 1일 2회 수행하였다. 용존 산소량 (DO)을 40%로 유지시키고, pH는 6.8 내지 7.3으로 제어하였다. 온도는 초기에는 36.5℃로 유지시키고, 6일째 33℃로 이동시켰다.
도 6a는 모든 생산 배양물이 전체 배양 기간 동안에 걸쳐 >80% 세포 생존율을 유지하였다는 것을 입증한다. 유가식 시드 배양물 및 (글루코스 및 영양소가 농축된) 회분식 시드 배양물은 대략 27x106개의 세포/mL의 최대 생존 세포 밀도를 가졌다 (도 6a). 유가식 시드 배양물 및 (글루코스 및 영양소가 농축된) 회분식 시드 배양물로부터의 관심 폴리펩티드에 대한 역가는 대략 4.3 g/L였다 (도 6b). 도 6c는 예컨대, iCIEF, SEC, 및 N-글리칸과 같은 품질 속성이 상이한 N-1 시드와 상관없이 모든 N 생산 조건에 대해 유사하였다는 것을 보여준다.
폴리펩티드-3 생산을 위한 세포주 C (실험 2): 유가식 시드 및, 또는 관류 시드를 이용한 고밀도 유가식 생산 배양
세포주 C의 경우, 유가식 배양물, 또는 관류 배양물 중에서 성장된 시드를 사용하여 고밀도 유가식 생산 배양을 개시하였다.
생산 배양을 14일 동안 6x106개의 세포/mL의 높은 시드 밀도로 개시하였다. 매일의 피드는 배양물 부피의 3.7%인 피딩 부피로 1일째에 시작하였다. 용존 산소량 (DO)을 40%로 유지시키고, pH는 6.8 내지 7.3으로 제어하였다. 온도는 초기에는 36.5℃로 유지시켰고, 6일째 33℃로 이동시켰다.
도 7a는 모든 생산 배양물이 전체 배양 기간 동안에 걸쳐 >80% 세포 생존율을 유지하였다는 것을 입증한다. 관류 시드 배양물은 대략 33x106개의 세포/mL의 최대 생존 세포 밀도를 가진 반면, 유가식 시드 배양물은 대략 30x106개의 세포/mL의 최대 생존 세포 밀도를 가졌다 (도 7a). 관류 시드 배양물 및 유가식 시드 배양물로부터의 관심 폴리펩티드에 대한 역가는 대략 7 g/L였다 (도 7b). 도 7c는 예컨대, iCIEF, SEC, 및 N-글리칸과 같은 품질 속성이 상이한 N-1 시드와 상관없이 모든 N 생산 조건에 대해 유사하였다는 것을 보여준다.
실시예 4
(세포주 A의 경우) 1,000 L 규모의 브리스톨-마이어스 스큅의 GMP(Bristol-Myers Squibb's GMP) 설비에서, 또는 (세포주 B 및 C)의 경우, 500 L 규모의 규모 확장 설비에서 3가지 분자에 대한 대규모 제조 공정을 수행하였다. 세포주 A 및 세포주 B에 대한 N-1 시드 배양물은 글루코스 및 영양소가 농축된 회분식 배양을 이용한 반면, 세포주 C에 대한 N-1 시드는 유가식 모드로 배양하였다. 3가지 공정 모두 강건하고, 1,000 L 또는 500 L로의 규모 확장이 가능한 것으로 나타났다. 세포 밀도, 역가 및 생성물 품질 프로파일은 랩-규모의 생물반응기에서의 위성체 배양의 것과 일관된다 (도 8-10). 세포주 A의 경우, 하류 정제에 대한 능력을 초과할 정도로 특별히 높은 역가에 기인하여 생산 배양물을 10일째에 수거하였다. 세포주 A의 경우, 단축된 배양 지속 기간을 통해 새로운 생산 배양물을 매주 접종할 수 있게 되었고 (2개의 생산 베쓸 이용), 이에 의해 생산량은 유의적으로 증가되었다.

Claims (39)

  1. 비-관류-기반 배양 시스템에서 관심 재조합 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, N-1 대규모 생물반응기 세포 배양물의 생존 세포 밀도를 증가시키는 방법이며, 여기서 생존 세포 밀도는 적어도 5 x 106개의 세포/mL로 증가되는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 비-관류-기반 배양 시스템이 회분식 또는 유가식 생물반응기인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, N-1 단계에서의 생존 세포 밀도가 적어도 5 x 106, 적어도 10 x 106, 적어도 15 x 106, 적어도 20 x 106, 적어도 25 x 106, 또는 적어도 30 x 106개의 생존 세포/mL인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 세포 생존율이 N-1 단계 마지막 날 적어도 80%, N-1 단계 마지막 날 적어도 85%, 또는 N-1 단계 마지막 날 적어도 90%인 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 숙주 세포가 N-1 회분식 배양을 위해 농축된 배지 중에서 배양되는 것인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 숙주 세포가 N-1 유가식 배양을 위해 피드 배지 첨가하에 시드 배지 중에서 배양되는 것인 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 배지가 피드 배지에 의해 비-농축된 배지 대비 적어도 5%, 비-농축된 배지 대비 적어도 10%, 비-농축된 배지 대비 적어도 15%, 또는 비-농축된 배지 대비 적어도 20% 농축되는 것인 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 농축된 배지 또는 피드 배지가 증가된 양의 탄소원을 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항 있어서, 탄소원이 글루코스인 방법.
  10. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 농축된 배지 또는 피드 배지가 증가된 양의 영양소를 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항 있어서, 영양소가 아미노산, 지질, 비타민, 미네랄, 및 폴리아민으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 농축된 배지가 증가된 양의 탄소원 및 영양소를 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항 있어서, 탄소원이 글루코스이고, 영양소가 아미노산, 지질, 비타민, 미네랄, 및 폴리아민으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 세포인 방법.
  15. 제14항 있어서, 포유동물 세포가 CHO, VERO, BHK, HEK, HeLa, COS, MDCK 및 하이브리도마 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 제14항 있어서, 숙주 세포가 CHO 세포인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 폴리펩티드가 치료 폴리펩티드인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 폴리펩티드가 항체, 또는 항원 결합 단편인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 항체, 또는 항원 결합 단편이 PD-1, PD-L1, LAG-3, TIGIT, GITR, CXCR4, CD73 HER2, VEGF, CD20, CD40, CD11a, 조직 인자 (TF), PSCA, IL-8, EGFR, HER3, 및 HER4로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 결합하는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 생물반응기가 적어도 50 L, 적어도 500 L, 적어도 1,000 L, 적어도 5,000 L, 또는 적어도 10,000 L인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 농축된 회분식 배양물 또는 유가식 배양물 중에서 N-1 단계에서의 적어도 5 x 106개의 생존 세포/mL를 배양하는 단계를 추가로 포함하고, 이는 관심 재조합 폴리펩티드를 생산하는 N 생산 단계의 접종을 위해 사용되는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 관심 폴리펩티드를 생산 배양 시스템으로부터 단리시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. (1) 비-관류-기반 배양 시스템 중 N-1 단계에서 관심 재조합 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 생존 세포 밀도는 적어도 5 x 106개의 세포/mL로 증가되는 것인 단계; 및 (2) N 유가식 생산 세포를 기초 배지 또는 농축된 기초 배지 중에서 적어도 1.5 x 106개의 세포/mL의 높은 시드 밀도로 배양하는 단계이며, 여기서 N 유가식 생산 세포는 비-관류-기반 배양 시스템 중 N-1 단계로부터 접종된 것인 단계를 포함하는, 관심 재조합 폴리펩티드의 대규모 생산 방법.
  24. 제23항에 있어서, N 생산 배양 시스템이 유가식 생물반응기인 방법.
  25. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 농축된 기초 배지가 피드 배지에 의해 비-농축된 배지 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20% 농축된 것인 방법.
  26. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 농축된 배지가 증가된 양의 탄소원을 포함하는 것인 방법.
  27. 제27항 있어서, 탄소원이 글루코스인 방법.
  28. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 농축된 배지가 증가된 양의 영양소를 포함하는 것인 방법.
  29. 제29항 있어서, 영양소가 아미노산, 지질, 비타민, 미네랄, 및 폴리아민으로부터 선택되는 것인 방법.
  30. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 농축된 배지가 증가된 양의 탄소원 및 영양소를 포함하는 것인 방법.
  31. 제31항 있어서, 탄소원이 글루코스이고, 영양소가 아미노산, 지질, 비타민, 미네랄, 및 폴리아민으로부터 선택되는 것인 방법.
  32. 제23항 있어서, 생물반응기가 적어도 50 L, 적어도 500 L, 적어도 1,000 L, 적어도 5,000 L, 적어도 10,000 L, 적어도 15,000 L, 또는 적어도 20,000 L인 방법.
  33. 제23항 있어서, 숙주 세포가 포유동물 세포인 방법.
  34. 제34항 있어서, 숙주 세포가 CHO 세포인 방법.
  35. 제23항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 폴리펩티드의 역가가 적어도 100 mg/L, 적어도 1 g/L, 적어도 3 g/L, 적어도 5 g/L 또는 적어도 10 g/L인 방법.
  36. 제23항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 적어도 1.5 x 106, 적어도 5 x 106, 또는 적어도 10 x 106개의 생존 세포/mL의 생존 세포 밀도를 수득하기 위해 N 유가식 생산 생물반응기에서 기초 배지 또는 농축된 기초 배지 중에서 배양되는 것인 방법.
  37. 제23항 있어서, 관심 폴리펩티드를 단리시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  38. 제23항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 폴리펩티드가 치료 폴리펩티드인 방법.
  39. 제23항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 폴리펩티드가 항체, 또는 항원 결합 단편인 방법.
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