JP2024050590A - 組換えタンパク質を製造する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】N-1大規模バイオリアクター細胞培養物の生細胞密度を増加させる新規な方法を提供する。【解決手段】方法は目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞を非灌流ベースの培養系で培養することを含み、ここで生細胞密度は少なくとも5×106細胞/mLまで増加する。ある実施形態では、本開示は目的の組換えポリペプチドの大規模産生のための新規な方法を提供し、該方法は以下の工程を含む:(1)目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞を非灌流ベースの培養系においてN-1段階で培養する、ここで生細胞密度は少なくとも5×106細胞/mLまで増加する;および(2)Nフェドバッチ産生細胞を少なくとも1.5×106細胞/mLの高播種密度を有する濃縮培地中で培養する、ここでNフェドバッチ産生細胞は非灌流ベースの培養系においてN-1段階から接種される。【選択図】なし
Description
本発明は一般に、細胞培養物製造のための高播種密度でのN産生バイオリアクターの接種のために非灌流戦略を用いてN-1培養段階において生細胞密度を増加させる方法に関する。
タンパク質およびポリペプチドは治療物質としてますます重要になってきている。ほとんどの場合、治療用タンパク質およびポリペプチドは、目的のポリペプチドを異常に高いレベルで産生するように設計および/または選択された細胞から細胞培養において産生される。細胞培養条件の制御および最適化は、タンパク質およびポリペプチドの商業的生産を成功させるために極めて重要である。
細胞培養において産生される多くのタンパク質またはポリペプチドは、細胞を一定期間培養した後、培養を終了し、産生されたタンパク質またはポリペプチドを単離するフェドバッチ法で製造される。産生されるタンパク質またはポリペプチドの最終的な量および質は、N-1播種培養およびN産生時の播種密度によって大きく影響され得る。フェドバッチ培養法におけるタンパク質またはポリペプチドの産生を改善するための努力がなされてきたが、さらなる改善の必要性がある。
灌流細胞培養は、従来のフェドバッチ細胞培養系よりもはるかに高い生細胞密度を達成できる。灌流細胞培養は老廃物を除去しながら培養系に新鮮な培地の継続的な供給を提供し、これは細胞が増殖するための豊かな環境を提供する。従来の低播種密度のフェドバッチ産生培養と比較して、N-1灌流播種を接種した高播種密度のフェドバッチ産生培養は短時間でより高い最終的な力価を達成できる。しかし、灌流細胞培養は、大規模な培養系(例えば200Lを超えるバイオリアクター)で使用する場合には、大量の細胞培地を消費するため高価となる。また、灌流細胞培養は、特に大規模な製造において細胞が細胞培養系から除去されるのを防ぐ細胞保持システムが複雑になり得る。
非灌流系を用いた高播種細胞密度での大規模細胞培養によってタンパク質およびポリペプチドを産生するための改良された系の開発が特に必要とされている。
本開示は、N-1大規模バイオリアクター細胞培養物の生細胞密度を増加させる方法に関し、該方法は目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞を非灌流ベースの培養系で培養することを含み、ここで生細胞密度は少なくとも5×106細胞/mLまで増加する。いくつかの実施形態では、非灌流ベースの培養系はバッチまたはフェドバッチバイオリアクターである。いくつかの実施形態では、N-1段階の生細胞密度は少なくとも5×106、少なくとも10×106、少なくとも15×106、少なくとも20×106、少なくとも25×106、または少なくとも30×106生細胞/mLである。いくつかの実施形態では、細胞生存率は、N-1段階の最終日において少なくとも80%、N-1段階の最終日において少なくとも85%、またはN-1段階の最終日において少なくとも90%である。
本発明のいくつかの実施形態では、宿主細胞はN-1バッチ培養のために濃縮培地中で培養される。いくつかの実施形態では、宿主細胞はN-1フェドバッチ培養のためにフィード培地を添加した播種培地中で培養される。
本発明のいくつかの実施形態では、培地はフィード培地によって非濃縮培地に対して少なくとも5%、非濃縮培地に対して少なくとも10%、非濃縮培地に対して少なくとも15%、または非濃縮培地に対して少なくとも20%濃縮されている。いくつかの実施形態では、濃縮培地またはフィード培地は増加した量の炭素源を含む。いくつかの実施形態では、炭素源はグルコースである。いくつかの実施形態では、濃縮培地またはフィード培地は増加した量の栄養素を含む。いくつかの実施形態では、栄養素は、アミノ酸、脂質、ビタミン、ミネラルおよびポリアミンから選択される。いくつかの実施形態では、濃縮培地は増加した量の炭素源および栄養素を含む。いくつかの実施形態では、炭素源はグルコースであり、栄養素はアミノ酸、脂質、ビタミン、ミネラルおよびポリアミンから選択される。
本発明のいくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、CHO、VERO、BHK、HEK、HeLa、COS、MDCKおよびハイブリドーマ細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、宿主細胞はCHO細胞である。
本発明のいくつかの実施形態では、目的のポリペプチドは治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドは抗体または抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIGIT、GITR、CXCR4、CD73 HER2、VEGF、CD20、CD40、CD11a、組織因子(TF)、PSCA、IL-8、EGFR、HER3およびHER4からなる群から選択される抗原に結合する。
本発明のいくつかの実施形態では、バイオリアクターは少なくとも50L、少なくとも500L、少なくとも1,000L、少なくとも5,000L、または少なくとも10,000Lである。
本発明のいくつかの実施形態では、本方法は、目的の組換えポリペプチドを産生させるためにN産生段階の接種に使用される濃縮されたバッチ培養またはフェドバッチ培養において、N-1段階に少なくとも5×106生細胞/mLを培養することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、目的のポリペプチドを産生培養系から単離する工程をさらに含む。
本開示はまた、以下を含む、目的の組換えポリペプチドの大規模産生のための方法に関する:(1)目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞をN-1段階において非灌流ベースの培養系で培養する、ここで生細胞密度は少なくとも5×106細胞/mLまで増加する;および(2)Nフェドバッチ産生細胞を少なくとも1.5×106細胞/mLの高播種密度で基本培地または濃縮基本培地中において培養する、ここでNフェドバッチ産生細胞はN-1段階から非灌流ベースの培養系において接種される。いくつかの実施形態では、N産生培養系はフェドバッチバイオリアクターである。
本発明のいくつかの実施形態では、濃縮基本培地はフィード培地によって非濃縮培地に対して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%濃縮されている。いくつかの実施形態では、濃縮培地は増加した量の炭素源を含む。いくつかの実施形態では、炭素源はグルコースである。いくつかの実施形態では、濃縮培地は増加した量の栄養素を含む。いくつかの実施形態では、栄養素は、アミノ酸、脂質、ビタミン、ミネラルおよびポリアミンから選択される。いくつかの実施形態では、濃縮培地は増加した量の炭素源および栄養素を含む。いくつかの実施形態では、炭素源はグルコースであり、栄養素はアミノ酸、脂質、ビタミン、ミネラルおよびポリアミンから選択される。
本発明のいくつかの実施形態では、バイオリアクターは少なくとも50L、少なくとも500L、少なくとも1,000L、少なくとも5,000L、少なくとも10,000L、少なくとも15,000L、または少なくとも20,000Lである。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はCHO細胞である。
本発明のいくつかの実施形態では、目的のポリペプチドの力価は少なくとも100mg/L、少なくとも1g/L、少なくとも3g/L、少なくとも5g/L、または少なくとも10g/Lである。
本発明のいくつかの実施形態では、宿主細胞はNフェドバッチ産生バイオリアクターのための基本培地または濃縮基本培地中で培養され、少なくとも1.5×106、少なくとも5×106、または少なくとも10×106生細胞/mLの生細胞密度が得られる。
本発明のいくつかの実施形態では、本方法は、目的のポリペプチドを単離する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドは治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドは抗体または抗原結合フラグメントである。
ある実施形態では、本開示はN-1大規模バイオリアクター細胞培養物の生細胞密度を増加させる新規な方法を提供し、該方法は目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞を非灌流ベースの培養系で培養することを含み、ここで生細胞密度は少なくとも5×106細胞/mLまで増加する。ある実施形態では、本開示は目的の組換えポリペプチドの大規模産生のための新規な方法を提供し、該方法は以下の工程を含む:(1)目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞を非灌流ベースの培養系においてN-1段階で培養する、ここで生細胞密度は少なくとも5×106細胞/mLまで増加する;および(2)N-1細胞培養物から非灌流ベースの培養系において接種された細胞をN産生段階において少なくとも1.5×106細胞/mLまでの高播種密度で濃縮培地中で培養する。
定義
不定冠詞「a」または「an」は、記載または列挙された任意の成分の「1つ以上」を指すと理解されるべきである。
不定冠詞「a」または「an」は、記載または列挙された任意の成分の「1つ以上」を指すと理解されるべきである。
本明細書における用語「約」は当業者によって決定される特定の値または組成の許容誤差範囲内にある値または組成を指し、これは値または組成がどのように測定または決定されるか(すなわち測定系の限界)に部分的に依存する。例えば「約」は、当分野の慣例により1標準偏差の範囲内または1を超える標準偏差の範囲内を意味し得る。あるいは、「約」は最大で20%の範囲を意味し得る。さらに、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、本用語は最大で一桁分または最大で5倍の値を意味し得る。特定の値または組成が本願および特許請求の範囲において提供される場合、別段の記載がない限り、「約」の意味はその特定の値または組成の許容誤差範囲内であると想定されるべきである。
本明細書における用語「および/または」は、2つの特定された特徴または成分のそれぞれの他方を伴うか、または伴わない具体的な開示として解釈されるべきである。したがって、本明細書における「Aおよび/またはB」などの語句において使用される用語「および/または」は、「AおよびB」、「AまたはB」、「A」(単独)、および「B」(単独)を含むことが意図される。同様に、「A、B、および/またはC」などの語句において使用される用語「および/または」は、以下の各態様を包含することが意図される:A、B、およびC;A、B、またはC;AまたはC;AまたはB;BまたはC;AおよびC;AおよびB;BおよびC;A(単独);B(単独);および、C(単独)。代替物(例えば「または」)の使用は、代替物のいずれか一方、両方、またはそれらの任意の組合せを意味することが理解されるべきである。
本明細書における用語「アミノ酸」は、その最も広い意味において、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る任意の化合物および/または物質を指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸は一般構造H2N--C(H)(R)--COOHを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は合成アミノ酸である;いくつかの実施形態では、アミノ酸はD-アミノ酸である;いくつかの実施形態では、アミノ酸はL-アミノ酸である。アミノ酸(ペプチド中のカルボキシ末端および/またはアミノ末端のアミノ酸を含む)は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基、および/またはペプチドの活性に不利な影響を与えることなくペプチドの循環半減期を変化させ得る他の化学基による置換によって修飾されてい得る。アミノ酸はジスルフィド結合に関与してい得る。アミノ酸は、1以上の翻訳後修飾(1以上の化学物質(例えば、メチル基、アセテート基、アセチル基、リン酸基、ホルミル成分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール成分、脂質成分、糖鎖、ビオチン成分など)との結合など)を含んでい得る。いくつかの実施形態では、本発明のアミノ酸は細胞培養用の培地中に提供され得、または該培地中に添加するために使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞培養培地中に提供されるか、または該培地に添加するために使用されるアミノ酸は、塩または水和物の形態で提供され得る。
本明細書における用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原認識部位を介して標的(タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、またはそれらの組合せなど)を認識して特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。本明細書において、本用語は、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、抗体フラグメント(Fab、Fab’、F(ab’)2およびFvフラグメントなど)、単鎖Fv(scFv)抗体、多特異性抗体(少なくとも2つの無傷な抗体から作製された二重特異性抗体など)、単一特異性抗体、一価抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、および抗体が所望の生物学的活性を示す限り抗原認識部位を含む他のあらゆる修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、それぞれ以下の5つの主要な免疫グロブリンのクラスのいずれかであり得る:IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgM、またはそれらのサブクラス(アイソタイプ)(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)。異なるクラスの免疫グロブリンは異なる周知のサブユニット構造および三次元構成を有する。抗体はネイキッド抗体であり得、または他の分子(限定されないが、毒素および放射性同位体を含む)と結合してい得る。
本明細書において、抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合フラグメント」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の1以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は完全長抗体のフラグメントによって果たされ得ることが示されている。
用語「抗原結合フラグメント」に包含される結合フラグメントの例としては、例えば(i)Fabフラグメント(パパイン切断からのフラグメント)またはVL、VH、LCおよびCH1ドメインからなる類似の一価のフラグメント;(ii)F(ab’)2フラグメント(ペプシン切断からのフラグメント)またはヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結されている2つのFabフラグメントを含む類似の二価のフラグメント;(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;(iv)抗体の単一のアームのVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント;(v)VHドメインからなるdAbフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546);(vi)単離された相補性決定領域(CDR);および(vii)合成リンカーによって任意に結合されてい得る2つ以上の単離されたCDRの組合せが挙げられる。さらに、Fvフラグメントの2つのドメインであるVLおよびVHは別々の遺伝子によってコードされているが、これらはこれらをVLおよびVH領域が対となって一価の分子を形成している単一のタンパク質鎖(単鎖Fv(scFv)として知られている;例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照)とすることができる合成リンカーによって組換え法を用いて連結され得る。このような単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは当業者に公知の従来の技術を用いて取得され、フラグメントは無傷の抗体と同様の方法で有用性のためにスクリーニングされる。抗原結合部分は組換えDNA技術によって、または無傷の免疫グロブリンの酵素的切断もしくは化学的切断によって作製され得る。
用語「抗原結合フラグメント」に包含される結合フラグメントの例としては、例えば(i)Fabフラグメント(パパイン切断からのフラグメント)またはVL、VH、LCおよびCH1ドメインからなる類似の一価のフラグメント;(ii)F(ab’)2フラグメント(ペプシン切断からのフラグメント)またはヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結されている2つのFabフラグメントを含む類似の二価のフラグメント;(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;(iv)抗体の単一のアームのVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント;(v)VHドメインからなるdAbフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546);(vi)単離された相補性決定領域(CDR);および(vii)合成リンカーによって任意に結合されてい得る2つ以上の単離されたCDRの組合せが挙げられる。さらに、Fvフラグメントの2つのドメインであるVLおよびVHは別々の遺伝子によってコードされているが、これらはこれらをVLおよびVH領域が対となって一価の分子を形成している単一のタンパク質鎖(単鎖Fv(scFv)として知られている;例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照)とすることができる合成リンカーによって組換え法を用いて連結され得る。このような単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは当業者に公知の従来の技術を用いて取得され、フラグメントは無傷の抗体と同様の方法で有用性のためにスクリーニングされる。抗原結合部分は組換えDNA技術によって、または無傷の免疫グロブリンの酵素的切断もしくは化学的切断によって作製され得る。
本明細書における用語「バッチ培養」は、細胞を培養するのに最終的に使用されるすべての成分(培地(下記の「培地」の定義を参照)および細胞自体を含む)が培養プロセスの最初に提供されている細胞の培養方法を指す。バッチ培養は典型的にはある時点で停止され、培地中の細胞および/または成分は回収され、任意で精製される。用語「フェドバッチ培養」は、細胞培養物から第1の液体培地を実質的または大幅に除去することなく、第2の液体培地を最初の細胞培養物に漸増的または連続的に添加することを意味する。いくつかの例では、第2の液体培地は第1の液体培地と同じである。他の例では、第2の液体培地は第1の液体培地の濃縮された形態であり、かつ/または乾燥粉末として添加される。
本明細書における用語「バイオリアクター」は、哺乳類細胞培養物の増殖に使用される任意の容器を指す。バイオリアクターは哺乳類細胞の培養に有用である限り任意のサイズであり得る。典型的には、バイオリアクターは少なくとも1リットルであり、10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,000、15,000、20,000リットルもしくはそれ以上、またはそれらの間の任意の容積であり得る。バイオリアクターの内部条件(限定されないが、pHおよび温度を含む)は典型的には培養期間中に制御される。バイオリアクターは、本発明の培養条件下で培地中に懸濁させた哺乳類細胞培養物を保持するのに適した任意の材料(ガラス、プラスチックまたは金属を含む)で構成され得る。本明細書における用語「産生バイオリアクター」は、目的のポリペプチドまたはタンパク質の産生に使用される最終的なバイオリアクターを指す。大規模な細胞培養産生バイオリアクターの容積は、典型的には少なくとも500リットルであり、1000、2500、5000、8000、10,000、12,000、15,000、20,000リットルもしくはそれ以上、またはそれらの間の任意の容積であり得る。当業者は本発明の実施において使用するのに適したバイオリアクターを認識し、選択できる。
本明細書における用語「生細胞密度」は、所定の体積の培地中に存在する生細胞(生きている細胞)の数を指す。用語「標的細胞密度」は、培養中に組換えタンパク質を産生するための培地の体積当たりの細胞の具体的な濃度を意味する。標的細胞密度は、培養される具体的な哺乳類細胞に応じて様々であり得る。
本明細書における用語「細胞生存率」は、培養中の細胞が所定の培養条件または実験的変動の状況の下で生存する能力を指す。本明細書で使用される本用語はまた、特定の時点での培養物における生細胞および死細胞の総数に関して、その時点で生きている細胞の割合を指す。
本明細書における用語「培養物」、「細胞培養物」および「哺乳類細胞培養物」は、細胞集団の生存および/または増殖に適した条件下で培地中に懸濁された哺乳類細胞集団を指す。当業者には明らかであるように、本明細書におけるこれらの用語は、哺乳類細胞集団およびその集団が懸濁されている培地を含む組合せを指し得る。
用語「培養する」または「細胞培養する」は、一連の制御された物理的条件下での液体培地中における哺乳類細胞の維持または増殖を意味する。
本明細書における用語「培地」、「細胞培養培地」、「培養培地」は、増殖する哺乳類細胞に栄養を与える栄養素を含む溶液を指す。典型的には、これらの溶液は、最小限の増殖および/または生存のために細胞が必要とする必須および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質ならびに微量元素を提供する。溶液はまた、最小限の割合を上回るように増殖および/または生存を増強する成分(ホルモンおよび増殖因子を含む)を含み得る。溶液は、好ましくは細胞の生存および増殖に最適なpHおよび塩濃度に処方される。培地はまた、「合成培地」、すなわち未知の組成のタンパク質、加水分解物または成分を含まない無血清培地であり得る。限定培地は動物由来の成分を含まず、すべての成分は既知の化学構造を有する。用語「濃縮培地」または「濃縮された合成培地」は、標準培養培地と比較して追加または増加した量の炭素源および/または栄養素を含む培養培地である。
本明細書における用語「N-1段階」は、産生接種の直前の最後の播種増殖段階を指す。N-1段階は、ポリペプチド産生のための産生バイオリアクターを播種する前の最後の細胞増殖段階である。本明細書における用語「N-2段階」および「N-3段階」は(典型的にはN産生段階の接種前の)細胞増殖期間を指す。N-3段階は、N-2段階において使用するために生細胞密度を増加させるために使用される細胞増殖段階である。N-2段階は、N-1段階において使用するために生細胞密度を増加させるために使用される細胞増殖段階である。
本明細書における用語「灌流」または「灌流プロセス」は、細胞をリアクター内に保持しながら等量の培地(栄養補助物質を含む)をバイオリアクターに同時に添加および除去する細胞培養方法を指す。補助培地に対応する量の細胞および培地は、典型的には連続的または半連続的に除去され、任意で精製される。典型的には、灌流プロセスを含む細胞培養プロセスは「灌流培養」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、新鮮な培地は、細胞培養プロセスにおいて使用される基本培地と同一または類似してい得る。いくつかの実施形態では、新鮮な培地は基本培地とは異なり、所望の栄養補助物質を含み得る。いくつかの実施形態では、新鮮な培地は合成培地である。
本明細書における用語「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は単数の核酸および複数の核酸を包含することが意図され、単離された核酸分子またはコンストラクト(例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)、相補的DNA(cDNA)またはプラスミドDNA(pDNA))を指す。ある態様において、ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または従来の結合ではない結合(例えば、ペプチド核酸(PNA)などにおいて見出されるアミド結合)を含む。
本明細書における用語「ポリペプチド」は、アミド結合(ペプチド結合としても知られる)によって直線的に連結されたモノマー(アミノ酸)で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は2以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特定の長さの産物を指すものではない。本明細書における用語「タンパク質」は、(いくつかの例においてアミド結合以外の結合によって結合され得る)1以上のポリペプチドで構成される分子を包含することが意図される。他方、タンパク質は単一のポリペプチド鎖であり得る。後者の例では、単一のポリペプチド鎖は、いくつかの例においてタンパク質を形成するために融合された2以上のポリペプチドサブユニットを含み得る。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」はまた、発現後修飾(限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含む)の産物を指す。ポリペプチドまたはタンパク質は天然の生物学的起源に由来し得、または組換え技術によって生成され得るが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されない。ポリペプチドまたはタンパク質は、化学合成を含む任意の方法で生成され得る。
本明細書における用語「目的のポリペプチド」は、精製が望まれる混合物中に存在する任意のタンパク質(天然または組換えのいずれか)を含むように最も広い意味で使用される。そのような目的のポリペプチドには、限定されないが、酵素、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、免疫グロブリン(例えば抗体)および/または任意の融合タンパク質が含まれる。
細胞培養の「産生段階」という用語は、細胞培養の最終段階を指す。産生段階では、細胞が最初に増殖し、次いでポリペプチドが産生される。産生段階は、一般的に「N」または細胞培養製造の最終段階と呼ばれる。
本明細書において互換的に使用される用語「精製する」、「分離する」、「単離する」または「回収する」は、細胞培地中に存在する1以上の他の成分(例えば、哺乳類細胞または培養培地タンパク質)、または哺乳類細胞溶解液中に存在する1以上の他の成分(例えば、DNA、RNAまたは他のタンパク質)から組換えタンパク質を少なくとも部分的に精製または単離(例えば、少なくともまたは約5%、例えば、少なくとももしくは約10%、15%、20%、25%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または少なくとももしくは約95%の重量による純度)することを指す。通常、目的のタンパク質の純度の程度は、組成物から少なくとも1つの不純物を(完全または部分的に)除去することによって増加する。
本明細書における用語「組換え発現されたポリペプチド」および「組換えポリペプチド」は、そのポリペプチドを発現するように遺伝子操作された哺乳類宿主細胞から発現されたポリペプチドを指す。組換え発現されたポリペプチドは、哺乳類宿主細胞において通常発現されるポリペプチドと同一または類似であり得る。組換え発現されたポリペプチドはまた、宿主細胞に対して外来性(すなわち、哺乳類宿主細胞において通常発現されるペプチドに対して異種性)であり得る。あるいは、組換え発現されたポリペプチドは、ポリペプチドの一部が哺乳類宿主細胞において通常発現されるポリペプチドと同一または類似のアミノ酸配列を含み、他の部分が宿主細胞に対して外来性であるという点でキメラであり得る。
本明細書における用語「播種する」は、細胞培養物をバイオリアクターまたは別の容器に提供するプロセスを指す。細胞は別のバイオリアクターまたは容器において以前に増殖されていてもよい。あるいは、細胞は、凍結およびバイオリアクターまたは容器に提供される直前に解凍され得る。本用語は、単一の細胞を含む任意の数の細胞を指す。
用語「振盪フラスコ」は、少なくとも1つのガス透過性表面を有する液体培養培地の体積を保持できる容器(例えば、無菌容器)を意味する。例えば、振盪フラスコは、T-フラスコ、三角フラスコまたは当分野で承認されているそれらの任意の改良版などの細胞培養フラスコであり得る。
本明細書における用語「力価」は、哺乳類細胞培養物によって産生された組換え発現ポリペプチドまたはタンパク質の総量を所定量の培地体積で割ったものを指す。力価は通常、培地1ミリリットル当たりのポリペプチドまたはタンパク質のミリグラムの単位で表現される。
本開示の様々な態様が、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に説明される。
本発明の方法
ある実施形態では、本開示は、N-1大規模バイオリアクター細胞培養物の生細胞密度を増加させる新規の方法であって、目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞を非灌流ベースの培養系で培養することを含み、生細胞密度が少なくとも5×106細胞/mLまで増加する、方法を提供する。
ある実施形態では、本開示は、N-1大規模バイオリアクター細胞培養物の生細胞密度を増加させる新規の方法であって、目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞を非灌流ベースの培養系で培養することを含み、生細胞密度が少なくとも5×106細胞/mLまで増加する、方法を提供する。
ある実施形態では、本開示は、以下を含む、目的の組換えポリペプチドの大規模産生のための新規の方法を提供する:(1)目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞をN-1段階において非灌流ベースの培養系で培養する、ここで生細胞密度は少なくとも5×106細胞/mLまで増加する;および(2)N-1細胞培養物から非灌流ベースの培養系において接種された細胞をN産生段階において少なくとも1.5×106細胞/mLまでの高播種密度で濃縮培地中で培養する。
宿主細胞
細胞培養およびポリペプチドの発現に感受性のある任意の哺乳類細胞または細胞型が、本発明に従って利用され得る。本発明に従って使用され得る哺乳類細胞の限定されない例としては、BALB/cマウス骨髄腫株(NSO/1、ECACC番号:85110503);ヒト網膜芽細胞(PER.C6(CruCell、Leiden、The Netherlands));SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7、ATCC CRL 1651);ヒト胚性腎臓株(浮遊培養での増殖のためにサブクローニングされた293または293細胞、Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977));ベビーハムスター腎臓細胞(BHK、ATCC CCL 10);チャイニーズハムスター卵巣細胞±DHFR(CHO、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスセルトリ細胞(TM4、Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL 70);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76、ATCC CRL-1 587);ヒト子宮頸がん細胞(HeLa、ATCC CCL 2);イヌ腎臓細胞(MDCK、ATCC CCL 34);buffaloラット肝細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75);ヒト肝細胞(Hep G2、HB 8065);マウス乳腺腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL5 1);TRI細胞(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982));MRC5細胞;FS4細胞;およびヒト肝細胞腫株(Hep G2)が含まれる。ある実施形態では、本発明はCHO細胞株の培養およびCHO細胞株からのポリペプチドおよびタンパク質の発現に使用される。
細胞培養およびポリペプチドの発現に感受性のある任意の哺乳類細胞または細胞型が、本発明に従って利用され得る。本発明に従って使用され得る哺乳類細胞の限定されない例としては、BALB/cマウス骨髄腫株(NSO/1、ECACC番号:85110503);ヒト網膜芽細胞(PER.C6(CruCell、Leiden、The Netherlands));SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7、ATCC CRL 1651);ヒト胚性腎臓株(浮遊培養での増殖のためにサブクローニングされた293または293細胞、Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977));ベビーハムスター腎臓細胞(BHK、ATCC CCL 10);チャイニーズハムスター卵巣細胞±DHFR(CHO、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスセルトリ細胞(TM4、Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL 70);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76、ATCC CRL-1 587);ヒト子宮頸がん細胞(HeLa、ATCC CCL 2);イヌ腎臓細胞(MDCK、ATCC CCL 34);buffaloラット肝細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75);ヒト肝細胞(Hep G2、HB 8065);マウス乳腺腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL5 1);TRI細胞(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982));MRC5細胞;FS4細胞;およびヒト肝細胞腫株(Hep G2)が含まれる。ある実施形態では、本発明はCHO細胞株の培養およびCHO細胞株からのポリペプチドおよびタンパク質の発現に使用される。
さらに、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する任意の数の市販および非市販のハイブリドーマ細胞株が本発明に従って利用され得る。当業者は、ハイブリドーマ細胞株が異なる栄養要求を有し得、かつ/または最適な増殖およびポリペプチドまたはタンパク質の発現のために異なる培養条件を必要とし得ることを理解しており、必要に応じて条件を改変できる。
上述したように、多くの例では、細胞は高レベルのタンパク質またはポリペプチドを産生するように選択または操作される。多くの場合、細胞は(例えば、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子の導入によって、かつ/または目的のポリペプチドをコードする(内因性か、または導入された)遺伝子の発現を調節する調節エレメントの導入によって)高レベルのタンパク質を産生するように遺伝子操作される。
特定のポリペプチドは、細胞増殖、細胞生存率、または目的のポリペプチドまたはタンパク質の産生を何らかの方法で最終的に制限する細胞の他の特徴に有害な影響を有し得る。特定のポリペプチドを発現するように操作されたある特定の種類の細胞集団の間でさえ、特定の個々の細胞がより増殖し、かつ/またはより多くの目的のポリペプチドを産生するような細胞集団内の変動性が存在する。本発明のある実施形態では、細胞株は、細胞を培養するために選択された特定の条件下での頑強な増殖のために実践者によって経験的に選択される。他の実施形態では、特定のポリペプチドを発現するように操作された個々の細胞が、細胞増殖、最終的な細胞密度、%細胞生存率、発現されたポリペプチドの力価、もしくはこれらの任意の組合せ、または実践者によって重要であるとみなされた任意の他の条件に基づいて大規模産生のために選択される。
フェドバッチ細胞培養産生
目的のポリペプチドを産生するための典型的な手法は、播種増殖のためのバッチ培養およびフェドバッチ培養産生段階を含む。バッチ播種培養プロセスは伝統的に、大規模産生培養物に特定の細胞密度の播種培養物を接種し、細胞を細胞増殖および生存率を助ける条件下で増殖させ、かつ細胞が特定の細胞密度に達したときに播種培養物を次の段階に移行させることを含む。フェドバッチ培養手法は、バッチ培養物に細胞増殖中に消費される栄養素および他の成分を補充するさらなる工程を含む。当業者は、本発明が細胞を培養する任意のシステム(限定されないが、バッチ、フェドバッチおよび灌流システムを含む)に利用され得ることを認識する。本発明の特定の好ましい実施形態では、細胞はバッチまたはフェドバッチシステムにおいて増殖される。
目的のポリペプチドを産生するための典型的な手法は、播種増殖のためのバッチ培養およびフェドバッチ培養産生段階を含む。バッチ播種培養プロセスは伝統的に、大規模産生培養物に特定の細胞密度の播種培養物を接種し、細胞を細胞増殖および生存率を助ける条件下で増殖させ、かつ細胞が特定の細胞密度に達したときに播種培養物を次の段階に移行させることを含む。フェドバッチ培養手法は、バッチ培養物に細胞増殖中に消費される栄養素および他の成分を補充するさらなる工程を含む。当業者は、本発明が細胞を培養する任意のシステム(限定されないが、バッチ、フェドバッチおよび灌流システムを含む)に利用され得ることを認識する。本発明の特定の好ましい実施形態では、細胞はバッチまたはフェドバッチシステムにおいて増殖される。
濃縮培地
本発明は、本明細書に記載の他の培養工程に従って使用した場合に、N-1培養において宿主細胞の生細胞密度を増加させ、かつ/または非濃縮培地で培養された宿主細胞と比較して高播種密度での産生培養においてより多くの栄養素を提供する濃縮された合成培地処方物を提供する。細胞増殖または目的のポリペプチドの産生に有益な効果を有することが示されている本発明の濃縮培地処方物は、i)増加した量の炭素源、および/またはii)標準培養培地と比較して増加した栄養素を含む。さらに、炭素源は以下であり得る:カゼイン、乳酸塩、ブドウ糖、フルクトース、フルクタン、グルコース、ショ糖、乳糖、マルトース、酢酸塩、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、アラビノース、大豆タンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプン、トリプトン、酵母エキス、およびそれらの組合せ。栄養素はアミノ酸であり得る。濃縮培地は、非濃縮培地と比較して炭素源および/または栄養素とともにフィード培地により5%、少なくとも10%、少なくとも15%または少なくとも20%濃縮されている。当業者は、本発明の培地処方物が限定培地および非限定培地の両方を包含することを理解する。
本発明は、本明細書に記載の他の培養工程に従って使用した場合に、N-1培養において宿主細胞の生細胞密度を増加させ、かつ/または非濃縮培地で培養された宿主細胞と比較して高播種密度での産生培養においてより多くの栄養素を提供する濃縮された合成培地処方物を提供する。細胞増殖または目的のポリペプチドの産生に有益な効果を有することが示されている本発明の濃縮培地処方物は、i)増加した量の炭素源、および/またはii)標準培養培地と比較して増加した栄養素を含む。さらに、炭素源は以下であり得る:カゼイン、乳酸塩、ブドウ糖、フルクトース、フルクタン、グルコース、ショ糖、乳糖、マルトース、酢酸塩、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、アラビノース、大豆タンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプン、トリプトン、酵母エキス、およびそれらの組合せ。栄養素はアミノ酸であり得る。濃縮培地は、非濃縮培地と比較して炭素源および/または栄養素とともにフィード培地により5%、少なくとも10%、少なくとも15%または少なくとも20%濃縮されている。当業者は、本発明の培地処方物が限定培地および非限定培地の両方を包含することを理解する。
実施例1~3に示される濃縮培地を用いた予期しない結果は、N-1培養段階において濃縮培地を用いたバッチ法で培養した宿主細胞が、非濃縮培地を用いたバッチ法で培養した宿主細胞と比較して増加した生細胞密度を示したことである。また、濃縮培地を用いたバッチ法で培養した宿主細胞は、濃縮培地を用いないフェドバッチ法で培養した宿主細胞に類似した生細胞密度および/または細胞生存率を示した。したがって、濃縮培地を用いたバッチ法で培養した宿主細胞は、非濃縮培地を用いた灌流システムまたはフェドバッチシステムで培養した宿主細胞に類似した結果を達成し得る。
実施例1~3に示される濃縮培地を用いた別の予期しない結果は、濃縮培地を用いたバッチ培養で増殖させた細胞から播種された産生培養物が、濃縮培地を用いない灌流法またはフェドバッチ法からの細胞を播種した産生培養物と類似した目的のポリペプチドについての力価を有していたことである。上記の条件は単独で使用してもよく、互いに様々な組合せで使用してもよい。
本発明で開示されるこれらの任意の培地処方物は、必要に応じてホルモンおよび/または他の増殖因子、特定のイオン(ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸など)、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素(非常に低い終濃度で通常存在する無機化合物)、アミノ酸、脂質、タンパク質加水分解物、もしくはグルコース、または他のエネルギー源を任意に補充され得る。本発明のある実施形態では、培地に化学誘導物質(chemical inductant)(ヘキサメチレンビス(アセトアミド)(「HMBA」)および酪酸ナトリウム(「NaB」)など)を補充することが有益であり得る。これらの任意のサプリメントは培養の開始時に添加され得、または枯渇した栄養素を補充するために、もしくは別の理由で後の時点で添加され得る。当業者は、開示された培地処方物に含まれ得る任意の望ましいまたは必要なサプリメントを認識する。
哺乳類細胞培養物の提供
目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞が同定されると、細胞は当業者に周知の様々な方法のいずれかによって培養物中で増殖される。目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞は通常、細胞の生存、増殖および生存率を助ける温度および培地中で増殖させることによって増殖する。最初の培養量は任意のサイズであり得るが、目的のポリペプチドまたはタンパク質の最終的な産生に使用される産生バイオリアクターの培養量よりも小さいことが多く、細胞は産生バイオリアクターに播種する前に体積を増加させたバイオリアクター内で数回継代されることが多い。細胞が特定の生細胞密度に達すると、細胞は生細胞の数をさらに増加させるためにバイオリアクター内で増殖される。これらのバイオリアクターは、N-1、N-2およびN-3などと呼ばれる。「N」は主要な産生培養のバイオリアクターを指し、「N-1」は主要な産生培養の前のバイオリアクターなどを意味する。
目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞が同定されると、細胞は当業者に周知の様々な方法のいずれかによって培養物中で増殖される。目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞は通常、細胞の生存、増殖および生存率を助ける温度および培地中で増殖させることによって増殖する。最初の培養量は任意のサイズであり得るが、目的のポリペプチドまたはタンパク質の最終的な産生に使用される産生バイオリアクターの培養量よりも小さいことが多く、細胞は産生バイオリアクターに播種する前に体積を増加させたバイオリアクター内で数回継代されることが多い。細胞が特定の生細胞密度に達すると、細胞は生細胞の数をさらに増加させるためにバイオリアクター内で増殖される。これらのバイオリアクターは、N-1、N-2およびN-3などと呼ばれる。「N」は主要な産生培養のバイオリアクターを指し、「N-1」は主要な産生培養の前のバイオリアクターなどを意味する。
細胞培養物は、培地の酸素供給および細胞への栄養素の分散を増加させるために撹拌または振盪され得る。代替的または追加的に、当分野で周知の特別な散布装置が培養物の酸素供給を増加および制御するために使用され得る。本発明に従って、当業者はバイオリアクターの特定の内部条件(限定されないが、pH、温度および酸素供給などを含む)を制御または調節することが有益であり得ることを理解する。
N-3バイオリアクターにおける開始細胞密度は当業者によって選択され得る。本発明に従って、産生バイオリアクターにおける開始細胞密度は、2×104生細胞/mLのように低くてもよい。本発明のある実施形態では、N-3バイオリアクターにおける開始細胞密度は、2x104、2x105、2x106、5x106、10x106生細胞/mLおよびそれ以上の範囲であり得る。N-3宿主細胞の濃縮培地を用いた培養は、少なくとも5x106生細胞/mLから5x106、10x106、15x106、20x106、25x106または30x106生細胞/mLまでの生細胞密度およびそれ以上をもたらし得る。
N-2バイオリアクターにおける開始細胞密度は当業者によって選択され得る。本発明に従って、産生バイオリアクターにおける開始細胞密度は、2×104生細胞/mLのように低くてもよい。本発明のある実施形態では、N-2バイオリアクターにおける開始細胞密度は、約2x104生細胞/mLから約2x105、2x106、5x106、10x106生細胞/mLおよびそれ以上の範囲であり得る。N-2宿主細胞の濃縮培地を用いた培養は、少なくとも5x106生細胞/mLから10x106、15x106、20x106、25x106または30x106生細胞/mLまでの生細胞密度およびそれ以上をもたらし得る。
N-1バイオリアクターにおける開始細胞密度は当業者によって選択され得る。本発明に従って、産生バイオリアクターにおける開始細胞密度は、培養量当たりの単一の細胞のように低くてもよい。本発明のある実施形態では、産生バイオリアクターにおける開始細胞密度は、約2x104生細胞/mLから約2x105、2x106、5x106、10x106生細胞/mLおよびそれ以上の範囲であり得る。N-1宿主細胞の濃縮培地を用いた培養は、少なくとも5x106生細胞/mLから約5x106、10x106、15x106、20x106、25x106または30x106生細胞/mLまでの生細胞密度およびそれ以上をもたらし得る。
N産生バイオリアクターにおける開始細胞密度は当業者によって選択され得る。本発明に従って、N産生バイオリアクターにおける開始細胞密度は、1×106生細胞/mLのように低くてもよい。本発明のある実施形態では、産生バイオリアクターにおける開始細胞密度は、約1x106生細胞/mLから約2x106、5x106、10x106生細胞/mLおよびそれ以上の範囲であり得る。宿主細胞の濃縮培地を用いた培養は、少なくとも1x106生細胞/mLから約2x106、5x106、10x106、15x106、20x106、25x106または30x106生細胞/mLまでの生細胞密度およびそれ以上をもたらし得る。
一般に、N-1の細胞培養物は、次の産生バイオリアクターに播種する前に所望の密度まで増殖され得る。全生存または全生存に近い生存率は必要とされないが、大部分の細胞が播種前に生存したままであることが好ましい。本発明のある実施形態では、細胞は(例えば低速遠心分離によって)上清から取り出され得る。また、任意の不要な代謝廃棄物または培地成分を除去するために、取り出された細胞を次のバイオリアクターに播種する前に培地で洗浄することが望ましい場合がある。培地は細胞を以前に増殖させた培地であり得、または本発明の実践者によって選択された異なる培地もしくは洗浄液であり得る。
次に、N-1の細胞は、産生バイオリアクターに播種するために適切な密度に希釈され得る。本発明のある実施形態では、細胞は、産生バイオリアクターで使用される培地と同じ培地で希釈される。あるいは、細胞は、本発明の実践者の必要性および要求に応じて、または細胞自体の特定の要件に適応させるために(例えば細胞を産生バイオリアクターに播種する前に短期間保存すべき場合に)、別の培地または溶液で希釈され得る。
本発明に従って、産生バイオリアクターは、ポリペプチドまたはタンパク質の大規模産生に適した任意の体積であり得る。ある実施形態では、産生バイオリアクターの体積は少なくとも500リットルである。他の実施形態では、産生バイオリアクターの体積は、1,000、2,500、5,000、8,000、10,000、15,000、20,000リットルもしくはそれ以上、またはそれらの間の任意の体積である。当業者は、本発明の実施における使用に適したバイオリアクターを認識し、選択できる。産生バイオリアクターは、産生されたポリペプチドまたはタンパク質の発現または安定性を阻害せず、細胞の増殖および生存率を助ける任意の物質で構成され得る。
本発明のある実施形態では、産生段階は、非濃縮培地と比較して濃縮された培地を含む。例えば、培地は、フィード培地によって非濃縮培地と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、または少なくとも20%濃縮されている。ある実施形態では、濃縮培地は増加した量の炭素源(例えばグルコース)を含む。ある実施形態では、濃縮培地は増加した量の栄養素(例えばアミノ酸)を含む。ある実施形態では、濃縮培地は増加した量の炭素源および栄養素を含む。
N-1段階または産生段階における細胞培養の温度は、細胞培養物が生存可能なままである温度範囲に主に基づいて選択される。一般に、ほとんどの哺乳類細胞は約25℃~42℃の範囲内で良好に増殖する。好ましくは、哺乳類細胞は約35℃~40℃の範囲内で良好に増殖する。当業者は、細胞の必要性および実践者の産生要件に応じて細胞を増殖させる適切な温度を選択できる。任意で、温度は単一の一定温度に維持される。任意で、温度はある温度範囲内に維持される。例えば、温度は定常的に上昇または低下し得る。あるいは、温度は様々な時間において離散的な量で上昇または低下し得る。当業者は、単一の温度を使用すべきか、または複数の温度を使用すべきか、および温度を定常的に調整すべきか、または離散的な量で調整すべきかを決定できる。
N-1段階または産生段階の細胞は、実践者の必要性および細胞自体の要件に応じてより多くの時間またはより少ない時間、増殖され得る。ある実施形態では、細胞は、細胞が乱されずに増殖できる場合に最終的に達する最大の生細胞密度の所定の割合である生細胞密度を達成するのに十分な期間、増殖される。細胞は規定された期間、増殖させることができる。例えば、細胞培養の開始濃度、細胞を増殖させる温度、および細胞の本質的な増殖速度に応じて、細胞は、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20日またはそれ以上増殖され得る。本発明の実践者は、ポリペプチド産生要件および細胞自体の必要性に応じて増殖期間を選択できる。
培養条件のモニタリング
本発明のある実施形態では、増殖している細胞培養物の特定の条件がモニタリングされる。細胞培養条件のモニタリングは、細胞培養物が組換えポリペプチドまたはタンパク質を準最適レベルで産生しているか否か、または培養物が準最適な産生段階に入ろうとしているか否かを決定することを可能にする。
本発明のある実施形態では、増殖している細胞培養物の特定の条件がモニタリングされる。細胞培養条件のモニタリングは、細胞培養物が組換えポリペプチドまたはタンパク質を準最適レベルで産生しているか否か、または培養物が準最適な産生段階に入ろうとしているか否かを決定することを可能にする。
非限定的な例として、温度、pH、細胞密度、細胞生存率、統合された生細胞密度、乳酸レベル、アンモニウムレベル、オスモル濃度、または発現ポリペプチドもしくはタンパク質の力価をモニタリングすることは有益または必要であり得る。当業者がこれらの条件を測定するのを可能にする多数の技術が当分野で周知である。例えば、細胞密度は、血球計、コールターカウンター(Vi-Cell)または細胞密度検査(CEDEX)を用いて測定され得る。生細胞密度は、培養試料をトリパンブルーで染色することによって決定され得る。トリパンブルーを取り込むのは死細胞のみであるため、生細胞密度は細胞の総数を計数し、色素を取り込む細胞の数を細胞の総数で割り、その逆数を取ることによって決定され得る。HPLCが、乳酸塩、アンモニウムまたは発現ポリペプチドもしくはタンパク質のレベルを決定するために使用され得る。あるいは、発現ポリペプチドまたはタンパク質のレベルは標準的な分子生物学的技術(SDS-PAGEゲルのクーマシー染色、ウエスタンブロッティング、ブラッドフォードアッセイ、ローリーアッセイ、ビウレットアッセイ、およびUV吸光度など)によって決定され得る。また、発現ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾(リン酸化およびグリコシル化を含む)をモニタリングすることが有益または必要であり得る。
発現ポリペプチドの単離
一般に、本発明に従って発現されたタンパク質またはポリペプチドを単離および/または精製することが典型的には望ましい。ある実施形態では、発現ポリペプチドまたはタンパク質は培地中に分泌され、したがって(例えば精製プロセスの最初の工程として)細胞および他の固形物が遠心分離または濾過などによって除去され得る。本明細書に記載された方法および組成物は細胞生存率の増加をもたらすため、本実施態様は本発明に従って使用される場合に特に有用である。結果として、培養プロセス中に死ぬ細胞は少なくなり、発現ポリペプチドまたはタンパク質の収量を潜在的に減少させ得るタンパク質分解酵素がより少ない量で培地中に放出される。
一般に、本発明に従って発現されたタンパク質またはポリペプチドを単離および/または精製することが典型的には望ましい。ある実施形態では、発現ポリペプチドまたはタンパク質は培地中に分泌され、したがって(例えば精製プロセスの最初の工程として)細胞および他の固形物が遠心分離または濾過などによって除去され得る。本明細書に記載された方法および組成物は細胞生存率の増加をもたらすため、本実施態様は本発明に従って使用される場合に特に有用である。結果として、培養プロセス中に死ぬ細胞は少なくなり、発現ポリペプチドまたはタンパク質の収量を潜在的に減少させ得るタンパク質分解酵素がより少ない量で培地中に放出される。
組換えポリペプチド
本発明の方法は、目的の任意の組換えポリペプチド(治療用抗体を含む)の大規模産生に使用され得る。本明細書において提供される方法によって産生され得る組換えポリペプチドの限定されない例としては、抗体(無傷の免疫グロブリンまたは抗体フラグメントを含む)、酵素(例えばガラクトシダーゼ)、タンパク質(例えば、ヒトエリスロポエチン、腫瘍壊死因子(TNF)またはインターフェロンアルファもしくはベータ)、細胞受容体(例えばEGFR)、または免疫原性もしくは抗原性タンパク質もしくはタンパク質フラグメント(例えば、ワクチンにおける使用のためのタンパク質)が挙げられる。本発明の範囲内の抗体には以下が含まれるが、これらに限定されない:トラスツズマブ(HERCEPTIN(登録商標))を含む抗HER2抗体(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992);抗HER3抗体;抗HER4抗体;米国特許第5,725,856号);米国特許第5,736,137号(RITUXAN(登録商標))に記載されているような抗CD20抗体(キメラ抗CD20「C2B8」など)、米国特許第5,721,108B1号に記載されているような2H7抗体のキメラまたはヒト化バリアント、またはTositumomab(BEXXAR(登録商標));抗IL-8(St John et al., Chest, 103:932 (1993)、および国際公開第WO 95/23865号);ヒト化抗VEGF抗体huA4.6.1 AVASTIN(登録商標)などのヒト化および/または親和性成熟抗VEGF抗体を含む抗VEGF抗体(Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992)、国際公開第WO 96/30046号、および1998年10月15日に公開された第WO 98/45331号);抗PSCA抗体(WO01/40309);S2C6およびそのヒト化バリアントを含む抗CD40抗体(WO00/75348);抗CD11a(米国特許第5,622,700号、WO 98/23761、Steppe et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991)、およびHourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994));抗IgE(Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993)、国際公開第WO 95/19181号);抗CD18(1997年4月22日に発行された米国特許第5,622,700号、または1997年7月31日に公開されたWO 97/26912のとおり);抗IgE(E25、E26およびE27を含む;1998年2月3日に発行された米国特許第5,714,338号、または1992年2月25日に発行された米国特許第5,091,313号、1993年3月4日に公開されたWO 93/04173、または1998年6月30日に出願された国際出願第PCT/US98/13410号、米国特許第5,714,338号);抗Apo-2受容体抗体(1998年11月19日に公開されたWO 98/51793);cA2(REMICADE(登録商標))、CDP571およびMAK-195を含む抗TNF-α抗体(1997年9月30日に発行された米国特許第5,672,347号、Lorenz et al., J. Immunol. 156(4):1646-1653 (1996)、およびDhainaut et al., Crit. Care Med. 23(9):1461-1469 (1995)参照);抗組織因子(TF)(1994年11月9日に付与された欧州特許第0 420 937 B1号);抗ヒトα4β7インテグリン(1998年2月19日に公開されたWO 98/06248);抗EGFR(1996年12月19日に公開されたWO 96/40210に記載されているようなキメラ化またはヒト化225抗体);OKT3などの抗CD3抗体(1985年5月7日に発行された米国特許第4,515,893号);CHI-621(SIMULECT(登録商標))および(ZENAPAX(登録商標))などの抗CD25抗体または抗tac抗体(1997年12月2日に発行された米国特許第5,693,762号参照);cM-7412抗体などの抗CD4抗体(Choy et al., Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996));CAMPATH-1Hなどの抗CD52抗体(Riechmann et al., Nature 332:323-337 (1988));Graziano et al., J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995)に記載されているようなFcγRIに対するM22抗体などの抗Fc受容体抗体;hMN-14などの抗がん胎児抗原(CEA)抗体(Sharkey et al., Cancer Res. 55(23 Suppl): 5935s-5945s (1995);huBrE-3、hu-Mc3およびCHL6を含む乳房上皮細胞に対する抗体(Ceriani et al., Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995);およびRichman et al., Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995));C242などの結腸がん細胞に結合する抗体(Litton et al., Eur J. Immunol. 26(1):1-9 (1996));抗CD38抗体、例えばAT13/5(Ellis et al., J. Immunol. 155(2):925-937 (1995));Hu M195(Jurcic et al., Cancer Res 55(23 Suppl): 5908s-5910s (1995))およびCMA-676またはCDP771などの抗CD33抗体;LL2またはLymphoCideなどの抗CD22抗体(Juweid et al., Cancer Res 55(23 Suppl): 5899s-5907s (1995));17-1A(PANOREX(登録商標))などの抗EpCAM抗体;アブシキシマブまたはc7E3 Fab(REOPRO(登録商標))などの抗GpIIb/IIIa抗体;MEDI-493(SYNAGIS(登録商標))などの抗RSV抗体;PROTOVIR(登録商標)などの抗CMV抗体;PRO542などの抗HIV抗体;抗Hep B抗体OSTAVIR(登録商標)などの抗肝炎抗体;抗CA125抗体OvaRex;抗イディオタイプGD3エピトープ抗体BEC2;抗αvβ3抗体VITAXIN(登録商標);ch-G250などの抗ヒト腎細胞がん抗体;ING-1;抗ヒト17-1A抗体(3622W94);抗ヒト大腸腫瘍抗体(A33);GD3ガングリオシドに対する抗ヒト黒色腫抗体R24;抗ヒト扁平上皮がん(SF-25);Smart ID10などの抗ヒト白血球抗原(HLA)抗体;抗PD-1抗体;抗PD-L1抗体;抗LAG-3抗体;抗GITR抗体;抗TIGIT抗体;抗CXCR4抗体;抗CD73抗体;および抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)。
本発明の方法は、目的の任意の組換えポリペプチド(治療用抗体を含む)の大規模産生に使用され得る。本明細書において提供される方法によって産生され得る組換えポリペプチドの限定されない例としては、抗体(無傷の免疫グロブリンまたは抗体フラグメントを含む)、酵素(例えばガラクトシダーゼ)、タンパク質(例えば、ヒトエリスロポエチン、腫瘍壊死因子(TNF)またはインターフェロンアルファもしくはベータ)、細胞受容体(例えばEGFR)、または免疫原性もしくは抗原性タンパク質もしくはタンパク質フラグメント(例えば、ワクチンにおける使用のためのタンパク質)が挙げられる。本発明の範囲内の抗体には以下が含まれるが、これらに限定されない:トラスツズマブ(HERCEPTIN(登録商標))を含む抗HER2抗体(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992);抗HER3抗体;抗HER4抗体;米国特許第5,725,856号);米国特許第5,736,137号(RITUXAN(登録商標))に記載されているような抗CD20抗体(キメラ抗CD20「C2B8」など)、米国特許第5,721,108B1号に記載されているような2H7抗体のキメラまたはヒト化バリアント、またはTositumomab(BEXXAR(登録商標));抗IL-8(St John et al., Chest, 103:932 (1993)、および国際公開第WO 95/23865号);ヒト化抗VEGF抗体huA4.6.1 AVASTIN(登録商標)などのヒト化および/または親和性成熟抗VEGF抗体を含む抗VEGF抗体(Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992)、国際公開第WO 96/30046号、および1998年10月15日に公開された第WO 98/45331号);抗PSCA抗体(WO01/40309);S2C6およびそのヒト化バリアントを含む抗CD40抗体(WO00/75348);抗CD11a(米国特許第5,622,700号、WO 98/23761、Steppe et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991)、およびHourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994));抗IgE(Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993)、国際公開第WO 95/19181号);抗CD18(1997年4月22日に発行された米国特許第5,622,700号、または1997年7月31日に公開されたWO 97/26912のとおり);抗IgE(E25、E26およびE27を含む;1998年2月3日に発行された米国特許第5,714,338号、または1992年2月25日に発行された米国特許第5,091,313号、1993年3月4日に公開されたWO 93/04173、または1998年6月30日に出願された国際出願第PCT/US98/13410号、米国特許第5,714,338号);抗Apo-2受容体抗体(1998年11月19日に公開されたWO 98/51793);cA2(REMICADE(登録商標))、CDP571およびMAK-195を含む抗TNF-α抗体(1997年9月30日に発行された米国特許第5,672,347号、Lorenz et al., J. Immunol. 156(4):1646-1653 (1996)、およびDhainaut et al., Crit. Care Med. 23(9):1461-1469 (1995)参照);抗組織因子(TF)(1994年11月9日に付与された欧州特許第0 420 937 B1号);抗ヒトα4β7インテグリン(1998年2月19日に公開されたWO 98/06248);抗EGFR(1996年12月19日に公開されたWO 96/40210に記載されているようなキメラ化またはヒト化225抗体);OKT3などの抗CD3抗体(1985年5月7日に発行された米国特許第4,515,893号);CHI-621(SIMULECT(登録商標))および(ZENAPAX(登録商標))などの抗CD25抗体または抗tac抗体(1997年12月2日に発行された米国特許第5,693,762号参照);cM-7412抗体などの抗CD4抗体(Choy et al., Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996));CAMPATH-1Hなどの抗CD52抗体(Riechmann et al., Nature 332:323-337 (1988));Graziano et al., J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995)に記載されているようなFcγRIに対するM22抗体などの抗Fc受容体抗体;hMN-14などの抗がん胎児抗原(CEA)抗体(Sharkey et al., Cancer Res. 55(23 Suppl): 5935s-5945s (1995);huBrE-3、hu-Mc3およびCHL6を含む乳房上皮細胞に対する抗体(Ceriani et al., Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995);およびRichman et al., Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995));C242などの結腸がん細胞に結合する抗体(Litton et al., Eur J. Immunol. 26(1):1-9 (1996));抗CD38抗体、例えばAT13/5(Ellis et al., J. Immunol. 155(2):925-937 (1995));Hu M195(Jurcic et al., Cancer Res 55(23 Suppl): 5908s-5910s (1995))およびCMA-676またはCDP771などの抗CD33抗体;LL2またはLymphoCideなどの抗CD22抗体(Juweid et al., Cancer Res 55(23 Suppl): 5899s-5907s (1995));17-1A(PANOREX(登録商標))などの抗EpCAM抗体;アブシキシマブまたはc7E3 Fab(REOPRO(登録商標))などの抗GpIIb/IIIa抗体;MEDI-493(SYNAGIS(登録商標))などの抗RSV抗体;PROTOVIR(登録商標)などの抗CMV抗体;PRO542などの抗HIV抗体;抗Hep B抗体OSTAVIR(登録商標)などの抗肝炎抗体;抗CA125抗体OvaRex;抗イディオタイプGD3エピトープ抗体BEC2;抗αvβ3抗体VITAXIN(登録商標);ch-G250などの抗ヒト腎細胞がん抗体;ING-1;抗ヒト17-1A抗体(3622W94);抗ヒト大腸腫瘍抗体(A33);GD3ガングリオシドに対する抗ヒト黒色腫抗体R24;抗ヒト扁平上皮がん(SF-25);Smart ID10などの抗ヒト白血球抗原(HLA)抗体;抗PD-1抗体;抗PD-L1抗体;抗LAG-3抗体;抗GITR抗体;抗TIGIT抗体;抗CXCR4抗体;抗CD73抗体;および抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)。
上述の説明は代表的なものとしてのみ理解されるべきであり、限定的であることを意図していない。本発明を実施するための代替的な方法および物質ならびに追加的な適用は当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
細胞株および培地
3つの異なるモノクローナル抗体またはポリペプチドを産生する3つの異なるCHO細胞株を、これらの実験で使用した。使用した播種培地、基本培地およびフィード培地は既知組成であった。
3つの異なるモノクローナル抗体またはポリペプチドを産生する3つの異なるCHO細胞株を、これらの実験で使用した。使用した播種培地、基本培地およびフィード培地は既知組成であった。
N-1播種培養
バッチおよびフェドバッチN-1培養のために、細胞を初期体積80~100mlを含む250ml振盪フラスコまたは初期容量1000mlを含む2L振盪フラスコのいずれかにおいて増殖させた。投入距離25mmのオービタルシェーカーにおいて150rpmの振盪速度を用いた。インキュベーターの設定は36.5℃の一定温度であり、CO2は5%に調節された。バッチN-1培養のために、播種培地は濃縮されていないか、またはグルコース濃縮されているか、またはグルコース濃縮および栄養素濃縮されているかのいずれかであった。バッチN-1培養物にはフィードを添加しなかった。フェドバッチN-1培養のために、播種培地を3日目から毎日与えた。
バッチおよびフェドバッチN-1培養のために、細胞を初期体積80~100mlを含む250ml振盪フラスコまたは初期容量1000mlを含む2L振盪フラスコのいずれかにおいて増殖させた。投入距離25mmのオービタルシェーカーにおいて150rpmの振盪速度を用いた。インキュベーターの設定は36.5℃の一定温度であり、CO2は5%に調節された。バッチN-1培養のために、播種培地は濃縮されていないか、またはグルコース濃縮されているか、またはグルコース濃縮および栄養素濃縮されているかのいずれかであった。バッチN-1培養物にはフィードを添加しなかった。フェドバッチN-1培養のために、播種培地を3日目から毎日与えた。
灌流N-1培養は、初期体積5Lを含む10Lの細胞バッグにおいて細胞を増殖させることを含んでいた。揺動速度を28rpmに調節し、揺動角度を7°に設定した。CO2を0~1日目において4%に調節し、その後オフにした。補助的なATF-2(Repligen)を細胞バッグに接続し、培養物を灌流させた。新鮮な培養培地(1×濃縮)を連続的に添加しながら、古い培養培地をスケジュールに従って同じ速度で連続的に除去する:0.5 VVD D2-4、1.0 VVD D4-5への増加、および2.0 VVD D5-6への最終的な増加。
産生培養
フェドバッチ産生バイオリアクターを、初期作業体積3.3Lを含む5L Sartoriusバイオリアクターにおいて実施した。
フェドバッチ産生バイオリアクターを、初期作業体積3.3Lを含む5L Sartoriusバイオリアクターにおいて実施した。
分析
生細胞密度(VCD)および細胞生存率を、Vi-Cell自動セルカウンター(Beckman Coulter)を用いてオフラインで測定した。また、グルコース、グルタミン、グルタミン酸、乳酸、およびアンモニウムをモニタリングするために、培養試料をCedex Bio HT(Roche)を用いてオフラインで分析した。バイオリアクター培養物のために、pH、pCO2、pO2をBioProfile pHOX(Nova Biomedical)を用いてオフラインで測定した。プロテインA UPLC法を用いてタンパク質力価を測定し、正規化した値として報告した。
生細胞密度(VCD)および細胞生存率を、Vi-Cell自動セルカウンター(Beckman Coulter)を用いてオフラインで測定した。また、グルコース、グルタミン、グルタミン酸、乳酸、およびアンモニウムをモニタリングするために、培養試料をCedex Bio HT(Roche)を用いてオフラインで分析した。バイオリアクター培養物のために、pH、pCO2、pO2をBioProfile pHOX(Nova Biomedical)を用いてオフラインで測定した。プロテインA UPLC法を用いてタンパク質力価を測定し、正規化した値として報告した。
高分子量(HMW)のサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を、温度制御されたオートサンプラーおよびWaters 2996 PDA検出器を備えたWaters Alliance HPLCシステム(Milford, MA)上で280nmにおいてモニタリングされる均一濃度勾配を伴うTosoh TSK G3000SWxlカラム、7.8x30cm、5umを用いて行った。
チャージバリアントを画像化キャピラリー等電点電気泳動(iCIEF)によってアッセイし、これはAlcott 720NVオートサンプラー(San Jose, CA)を有するProtein Simple iCE3装置上で実施された。試料を適切なpIマーカー、両性電解質および尿素と混合し、フルオロカーボンでコーティングされたキャピラリーカートリッジに注入した。高電圧を適用し、チャージバリアントはそれぞれのpIに移動した。UVカメラは280nMで画像を撮影した。主要なピークを同定し、酸性領域および塩基性領域に移動したピークを合計および定量化し、相対的なパーセント面積として報告した。
N-グリカンの分析を、Prozymeから市販されているキットであるGlykoPrep(登録商標)Rapid N-Glycan Preparation with 2-AB(Hayward, CA)を用いて行った。遊離オリゴ糖を、温度制御オートサンプラーおよび蛍光検出器を備えたWaters Acquity H-Classシステム(Milford, MA)上でAcquity UPLC Glycan BEH Amide、130Å、1.7μm、2.1x10mmカラム(Milford, MA)を用いてプロファイリングした。
実施例1
細胞株A:N-1播種培養
細胞株Aのために、N-1培養物を、バッチ、グルコース濃縮を伴うバッチ、グルコース濃縮および栄養素濃縮を伴うバッチ、フェドバッチまたは灌流の様式で増殖させた。バッチN-1培養はわずか15×106細胞/mLのピークVCDに達し、培養期間の終了近くにおいて高い細胞生存率を維持できなかった(図1A)。対照的に、グルコース濃縮を伴うバッチN-1培養は、17×106細胞/mLのVCDに達し、>99%の細胞生存率を維持した(図1A)。同様に、フェドバッチN-1ならびにグルコース濃縮および栄養素濃縮を伴うバッチN-1はともに、6日目において>20×106細胞/mLまで増殖し、生存率は>99%で維持された(図1Aおよび1B)。灌流N-1培養における細胞は、6日目において44×106細胞/mLまで増殖し、生存率は>99%であった(図1Aおよび1B)。
細胞株A:N-1播種培養
細胞株Aのために、N-1培養物を、バッチ、グルコース濃縮を伴うバッチ、グルコース濃縮および栄養素濃縮を伴うバッチ、フェドバッチまたは灌流の様式で増殖させた。バッチN-1培養はわずか15×106細胞/mLのピークVCDに達し、培養期間の終了近くにおいて高い細胞生存率を維持できなかった(図1A)。対照的に、グルコース濃縮を伴うバッチN-1培養は、17×106細胞/mLのVCDに達し、>99%の細胞生存率を維持した(図1A)。同様に、フェドバッチN-1ならびにグルコース濃縮および栄養素濃縮を伴うバッチN-1はともに、6日目において>20×106細胞/mLまで増殖し、生存率は>99%で維持された(図1Aおよび1B)。灌流N-1培養における細胞は、6日目において44×106細胞/mLまで増殖し、生存率は>99%であった(図1Aおよび1B)。
ポリペプチド-1の産生のための細胞株A:高密度フェドバッチ産生培養
細胞株Aのために、濃縮されたグルコースを伴うバッチ、濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ、フェドバッチまたは灌流培養において増殖させたシーズを用いて高密度フェドバッチ産生培養を開始した。
細胞株Aのために、濃縮されたグルコースを伴うバッチ、濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ、フェドバッチまたは灌流培養において増殖させたシーズを用いて高密度フェドバッチ産生培養を開始した。
N産生培養物を5×106細胞/mLの高播種密度で14日間接種した。毎日のフィードを培養体積の3.5%のフィード体積で2日目から開始した。溶存酸素(DO)を40%に維持し、pHを6.8~7.6に調節した。温度を最初に36.5℃に維持し、4日目に34℃に移行させた。
図2Aは、すべての産生培養物が全培養期間にわたって>90%の細胞生存率を維持したことを示している。フェドバッチ播種培養ならびに濃縮されたグルコースまたは濃縮されたグルコースおよび栄養素のいずれかを伴うバッチ播種培養の17×106細胞/mLと比較して、灌流播種培養は22×106細胞/mLの最大生細胞密度を有していた(図2A)。灌流播種培養からのポリペプチド-1の力価は約9.3g/Lであったが、フェドバッチ播種培養は約9g/Lの力価であった(図2B)。グルコースまたはグルコースおよび栄養素のいずれかが濃縮されたバッチ播種からの目的のポリペプチドの力価は、それぞれ約8.5g/Lおよび約9g/Lであった。図2Cは、品質特性(iCIEF、SECおよびN-グリカンなど)が種々のN-1播種にかかわらずすべてのN産生条件において類似していたことを示す。
実施例2
細胞株B:N-1播種培養
細胞株Bのために、N-1培養物を、バッチ、グルコース濃縮を伴うバッチ、グルコース濃縮および栄養素濃縮を伴うバッチ、フェドバッチまたは灌流の様式で増殖させた。バッチN-1培養はわずか24.5×106細胞/mLのピークVCDに達し、高い生存率を維持できなかった(図3Aおよび3B)。対照的に、グルコースのみが濃縮されたバッチN-1培養またはグルコースおよび栄養素がともに濃縮されたバッチN-1培養は、≧25.5×106生細胞/mLに達し、≧99%の細胞生存率を維持した(図3Aおよび3B)。同様に、フェドバッチN-1培養は5日目において≧30×106生細胞/mLまで増殖し、生存率は>99%で維持された(図3Aおよび3B)。灌流N-1培養における細胞は、5日目において41×106細胞/mLまで増殖し、生存率は≧99%であった(図3Aおよび3B)。
細胞株B:N-1播種培養
細胞株Bのために、N-1培養物を、バッチ、グルコース濃縮を伴うバッチ、グルコース濃縮および栄養素濃縮を伴うバッチ、フェドバッチまたは灌流の様式で増殖させた。バッチN-1培養はわずか24.5×106細胞/mLのピークVCDに達し、高い生存率を維持できなかった(図3Aおよび3B)。対照的に、グルコースのみが濃縮されたバッチN-1培養またはグルコースおよび栄養素がともに濃縮されたバッチN-1培養は、≧25.5×106生細胞/mLに達し、≧99%の細胞生存率を維持した(図3Aおよび3B)。同様に、フェドバッチN-1培養は5日目において≧30×106生細胞/mLまで増殖し、生存率は>99%で維持された(図3Aおよび3B)。灌流N-1培養における細胞は、5日目において41×106細胞/mLまで増殖し、生存率は≧99%であった(図3Aおよび3B)。
ポリペプチド-2の産生のための細胞株B:高密度フェドバッチ産生培養
細胞株Bのために、バッチ、濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ、フェドバッチまたは灌流培養において増殖させたシーズを用いて高密度フェドバッチ産生培養を開始した。
細胞株Bのために、バッチ、濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ、フェドバッチまたは灌流培養において増殖させたシーズを用いて高密度フェドバッチ産生培養を開始した。
産生培養物を3×106細胞/mLの高播種密度で14日間接種した。毎日のフィードを培養体積の3.1%のフィード体積で2日目から開始した。溶存酸素(DO)を40%に維持し、pHを6.7~7.6に調節した。温度を36.5℃に維持した。
図4Aは、すべての産生培養物が全培養期間にわたって>90%の細胞生存率を維持したことを示している。フェドバッチ播種培養ならびに濃縮されたグルコースまたは濃縮されたグルコースおよび栄養素のいずれかを伴うバッチ播種培養のわずか約24×106細胞/mLと比較して、灌流播種培養は約26×106細胞/mLの最大生細胞密度を有していた(図4A)。灌流および(濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴う)バッチ播種培養からの目的のポリペプチドの力価は約3.2g/Lであったが、バッチおよびフェドバッチ播種培養は約3g/Lの力価であった(図4B)。図4Cは、品質特性(iCIEF、SECおよびN-グリカンなど)が種々のN-1播種にかかわらずすべてのN産生条件において類似していたことを示す。
実施例3
細胞株C:N-1播種培養
細胞株Cのために、N-1培養物を、バッチ、グルコース濃縮を伴うバッチ、グルコース濃縮および栄養素濃縮を伴うバッチ、フェドバッチまたは灌流の様式で増殖させた。バッチN-1培養はわずか26×106細胞/mLのピークVCDに達し、高い生存率を維持できなかった(図5Aおよび5B)。対照的に、グルコースのみが濃縮されたバッチN-1培養またはグルコースおよび栄養素がともに濃縮されたバッチN-1培養は、≧30×106生細胞/mLに達し、≧99%の細胞生存率を維持した(図5Aおよび5B)。同様に、フェドバッチN-1培養は5日目において≧33×106生細胞/mLまで増殖し、生存率は≧99%で維持された(図5Aおよび5B)。灌流N-1培養における細胞は、5日目において62×106細胞/mLまで増殖し、生存率は≧99%であった(図5Aおよび5B)。
細胞株C:N-1播種培養
細胞株Cのために、N-1培養物を、バッチ、グルコース濃縮を伴うバッチ、グルコース濃縮および栄養素濃縮を伴うバッチ、フェドバッチまたは灌流の様式で増殖させた。バッチN-1培養はわずか26×106細胞/mLのピークVCDに達し、高い生存率を維持できなかった(図5Aおよび5B)。対照的に、グルコースのみが濃縮されたバッチN-1培養またはグルコースおよび栄養素がともに濃縮されたバッチN-1培養は、≧30×106生細胞/mLに達し、≧99%の細胞生存率を維持した(図5Aおよび5B)。同様に、フェドバッチN-1培養は5日目において≧33×106生細胞/mLまで増殖し、生存率は≧99%で維持された(図5Aおよび5B)。灌流N-1培養における細胞は、5日目において62×106細胞/mLまで増殖し、生存率は≧99%であった(図5Aおよび5B)。
ポリペプチド-3の産生のための細胞株C(実験1):フェドバッチまたは濃縮されたグルコースおよび栄養素シーズを伴うバッチを用いた高密度フェドバッチ産生培養
細胞株Cのために、フェドバッチまたは濃縮されたグルコースおよび栄養素培養物を伴うバッチにおいて増殖させたシーズを用いて高密度フェドバッチ産生培養を開始した。
細胞株Cのために、フェドバッチまたは濃縮されたグルコースおよび栄養素培養物を伴うバッチにおいて増殖させたシーズを用いて高密度フェドバッチ産生培養を開始した。
産生培養を6×106細胞/mLの高播種密度で14日間開始した。毎日のフィードを培養体積D2-10の5%およびその後の開始培養体積D11-13の3.3%のフィード体積で2日目から開始した。フィードを指定量の半分の量で1日に2回行った。溶存酸素(DO)を40%に維持し、pHを6.8~7.3に調節した。温度を最初に36.5℃に維持し、6日目に33℃に移行させた。
図6Aは、すべての産生培養物が全培養期間にわたって>80%の細胞生存率を維持したことを示している。フェドバッチ播種培養および(濃縮されたグルコースおよび栄養素伴う)バッチ播種培養は約27×106細胞/mLの最大生細胞密度を有していた(図6A)。フェドバッチおよび(濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴う)バッチ播種培養からの目的のポリペプチドの力価は約4.3g/Lであった(図6B)。図6Cは、品質特性(iCIEF、SECおよびN-グリカンなど)が種々のN-1播種にかかわらずすべてのN産生条件において類似していたことを示す。
ポリペプチド-3の産生のための細胞株C(実験2):フェドバッチまたは灌流播種を用いた高密度フェドバッチ産生培養
細胞株Cのために、フェドバッチまたは灌流培養において増殖させたシーズを用いて高密度フェドバッチ産生培養を開始した。
細胞株Cのために、フェドバッチまたは灌流培養において増殖させたシーズを用いて高密度フェドバッチ産生培養を開始した。
産生培養を6×106細胞/mLの高播種密度で14日間開始した。毎日のフィードを培養体積の3.7%のフィード体積で1日目から開始した。溶存酸素(DO)を40%に維持し、pHを6.8~7.3に調節した。温度を最初に36.5℃に維持し、6日目に33℃に移行させた。
図7Aは、すべての産生培養物が全培養期間にわたって>80%の細胞生存率を維持したことを示している。灌流播種培養は約33×106細胞/mLの最大生細胞密度を有しており、フェドバッチ播種培養は約30×106細胞/mLの最大生細胞密度を有していた(図7A)。灌流およびフェドバッチ播種培養からの目的のポリペプチドの力価は約7g/Lであった(図7B)。図7Cは、品質特性(iCIEF、SECおよびN-グリカンなど)が種々のN-1播種にかかわらずすべてのN産生条件において類似していたことを示す。
実施例4
3つの分子のための大規模製造プロセスを、1000Lスケール(細胞株Aの場合)のBristol-Myers SquibbのGMP施設または500Lスケール(細胞株BおよびCの場合)のスケールアップ施設のいずれかで行った。細胞株AおよびBのためのN-1播種培養はグルコースおよび栄養分を濃縮したバッチ培養を利用し、細胞株CのためのN-1播種はフェドバッチの様式で培養された。3つのプロセスはすべて頑強であり、1000Lまたは500Lまで拡張可能であることが示された。細胞密度、力価および産物の品質プロファイルは、実験室規模のバイオリアクターにおけるサテライト培養のものと一致している(図8~10)。細胞株Aについて、下流の精製能力を超える例外的に高い力価のために、産生培養物を10日目に回収した。細胞株Aの培養期間の短縮は、(2つの産生容器を用いて)新たな産生培養物を毎週接種することを可能とし、産生量を著しく増加させた。
3つの分子のための大規模製造プロセスを、1000Lスケール(細胞株Aの場合)のBristol-Myers SquibbのGMP施設または500Lスケール(細胞株BおよびCの場合)のスケールアップ施設のいずれかで行った。細胞株AおよびBのためのN-1播種培養はグルコースおよび栄養分を濃縮したバッチ培養を利用し、細胞株CのためのN-1播種はフェドバッチの様式で培養された。3つのプロセスはすべて頑強であり、1000Lまたは500Lまで拡張可能であることが示された。細胞密度、力価および産物の品質プロファイルは、実験室規模のバイオリアクターにおけるサテライト培養のものと一致している(図8~10)。細胞株Aについて、下流の精製能力を超える例外的に高い力価のために、産生培養物を10日目に回収した。細胞株Aの培養期間の短縮は、(2つの産生容器を用いて)新たな産生培養物を毎週接種することを可能とし、産生量を著しく増加させた。
Claims (39)
- N-1大規模バイオリアクター細胞培養物の生細胞密度を増加させる方法であって、目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞を非灌流ベースの培養系で培養することを含み、生細胞密度が少なくとも5×106細胞/mLまで増加する、方法。
- 非灌流ベースの培養系がバッチまたはフェドバッチバイオリアクターである、請求項1記載の方法。
- N-1段階の生細胞密度が、少なくとも5×106、少なくとも10×106、少なくとも15×106、少なくとも20×106、少なくとも25×106、または少なくとも30×106生細胞/mLである、請求項1または2に記載の方法。
- 細胞生存率が、N-1段階の最終日において少なくとも80%、N-1段階の最終日において少なくとも85%、またはN-1段階の最終日において少なくとも90%である、請求項3記載の方法。
- 宿主細胞がN-1バッチ培養のために濃縮培地中で培養される、請求項1または2に記載の方法。
- 宿主細胞がN-1フェドバッチ培養のためにフィード培地を添加した播種培地中で培養される、請求項1または2に記載の方法。
- 培地がフィード培地によって非濃縮培地に対して少なくとも5%、非濃縮培地に対して少なくとも10%、非濃縮培地に対して少なくとも15%、または非濃縮培地に対して少なくとも20%濃縮されている、請求項5または6に記載の方法。
- 濃縮培地またはフィード培地が増加した量の炭素源を含む、請求項5~7のいずれかに記載の方法。
- 炭素源がグルコースである、請求項8記載の方法。
- 濃縮培地またはフィード培地が増加した量の栄養素を含む、請求項5~7のいずれかに記載の方法。
- 栄養素が、アミノ酸、脂質、ビタミン、ミネラルおよびポリアミンから選択される、請求項10記載の方法。
- 濃縮培地が増加した量の炭素源および栄養素を含む、請求項5~11のいずれかに記載の方法。
- 炭素源がグルコースであり、栄養素がアミノ酸、脂質、ビタミン、ミネラルおよびポリアミンから選択される、請求項12記載の方法。
- 宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項1~13のいずれかに記載の方法。
- 哺乳類細胞が、CHO、VERO、BHK、HEK、HeLa、COS、MDCKおよびハイブリドーマ細胞からなる群から選択される、請求項14記載の方法。
- 宿主細胞がCHO細胞である、請求項14記載の方法。
- 目的のポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項1~16のいずれかに記載の方法。
- 目的のポリペプチドが抗体または抗原結合フラグメントである、請求項1~17のいずれかに記載の方法。
- 抗体または抗原結合フラグメントが、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIGIT、GITR、CXCR4、CD73 HER2、VEGF、CD20、CD40、CD11a、組織因子(TF)、PSCA、IL-8、EGFR、HER3およびHER4からなる群から選択される抗原に結合する、請求項18記載の方法。
- バイオリアクターが少なくとも50L、少なくとも500L、少なくとも1,000L、少なくとも5,000L、または少なくとも10,000Lである、請求項1~19のいずれかに記載の方法。
- 目的の組換えポリペプチドを産生させるためにN産生段階の接種に使用される濃縮されたバッチ培養またはフェドバッチ培養において、N-1段階に少なくとも5×106生細胞/mLを培養することをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 目的のポリペプチドを産生培養系から単離する工程をさらに含む、請求項21記載の方法。
- 以下を含む、目的の組換えポリペプチドの大規模産生のための方法:(1)目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞をN-1段階において非灌流ベースの培養系で培養する、ここで生細胞密度は少なくとも5×106細胞/mLまで増加する;および(2)Nフェドバッチ産生細胞を少なくとも1.5×106細胞/mLの高播種密度で基本培地または濃縮基本培地中において培養する、ここでNフェドバッチ産生細胞はN-1段階から非灌流ベースの培養系において接種される。
- N産生培養系がフェドバッチバイオリアクターである、請求項23記載の方法。
- 濃縮基本培地がフィード培地によって非濃縮培地に対して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%濃縮されている、請求項23~25のいずれかに記載の方法。
- 濃縮培地が増加した量の炭素源を含む、請求項23~26のいずれかに記載の方法。
- 炭素源がグルコースである、請求項27記載の方法。
- 濃縮培地が増加した量の栄養素を含む、請求項23~26のいずれかに記載の方法。
- 栄養素が、アミノ酸、脂質、ビタミン、ミネラルおよびポリアミンから選択される、請求項29記載の方法。
- 濃縮培地が増加した量の炭素源および栄養素を含む、請求項23~26のいずれかに記載の方法。
- 炭素源がグルコースであり、栄養素がアミノ酸、脂質、ビタミン、ミネラルおよびポリアミンから選択される、請求項31記載の方法。
- バイオリアクターが少なくとも50L、少なくとも500L、少なくとも1,000L、少なくとも5,000L、少なくとも10,000L、少なくとも15,000L、または少なくとも20,000Lである、請求項23記載の方法。
- 宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項23記載の方法。
- 宿主細胞がCHO細胞である、請求項34記載の方法。
- 目的のポリペプチドの力価が少なくとも100mg/L、少なくとも1g/L、少なくとも3g/L、少なくとも5g/L、または少なくとも10g/Lである、請求項23~35のいずれかに記載の方法。
- 宿主細胞がNフェドバッチ産生バイオリアクターのための基本培地または濃縮基本培地中で培養され、少なくとも1.5×106、少なくとも5×106、または少なくとも10×106生細胞/mLの生細胞密度が得られる、請求項23~35のいずれかに記載の方法。
- 目的のポリペプチドを単離する工程をさらに含む、請求項23記載の方法。
- 目的のポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項23~38のいずれかに記載の方法。
- 目的のポリペプチドが抗体または抗原結合フラグメントである、請求項23~38のいずれかに記載の方法。
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