RU2648999C2 - Способы повышения эффективности этапов очистки белка, находящихся ниже по потоку, с использованием мембранной ионообменной хроматографии - Google Patents
Способы повышения эффективности этапов очистки белка, находящихся ниже по потоку, с использованием мембранной ионообменной хроматографии Download PDFInfo
- Publication number
- RU2648999C2 RU2648999C2 RU2014130017A RU2014130017A RU2648999C2 RU 2648999 C2 RU2648999 C2 RU 2648999C2 RU 2014130017 A RU2014130017 A RU 2014130017A RU 2014130017 A RU2014130017 A RU 2014130017A RU 2648999 C2 RU2648999 C2 RU 2648999C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- membrane
- antibodies
- interest
- eluate
- Prior art date
Links
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title claims abstract description 197
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 94
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 114
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 109
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims abstract description 65
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 49
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 41
- 239000003014 ion exchange membrane Substances 0.000 claims abstract description 30
- 229920000831 ionic polymer Polymers 0.000 claims abstract description 19
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims abstract 4
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 42
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims description 41
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 17
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 13
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 10
- 239000003011 anion exchange membrane Substances 0.000 claims description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 6
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 62
- 238000011068 loading method Methods 0.000 abstract description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 148
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 147
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 146
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 107
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 78
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 76
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 76
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 73
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 70
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 32
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 32
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 32
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 32
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 32
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 32
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 241000270276 Natrix Species 0.000 description 26
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 26
- NDDAHWYSQHTHNT-UHFFFAOYSA-N indapamide Chemical compound CC1CC2=CC=CC=C2N1NC(=O)C1=CC=C(Cl)C(S(N)(=O)=O)=C1 NDDAHWYSQHTHNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 22
- 239000000463 material Substances 0.000 description 21
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 241000894007 species Species 0.000 description 16
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 15
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 15
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 15
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 14
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 14
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 14
- -1 antibody molecules Proteins 0.000 description 14
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 14
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 13
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 11
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 10
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 10
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 10
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 10
- 239000012561 harvest cell culture fluid Substances 0.000 description 10
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 9
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 9
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 9
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 9
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 8
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000011140 membrane chromatography Methods 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 8
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 7
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 7
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 6
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 6
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 6
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 6
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 6
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 6
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 6
- 239000002647 aminoglycoside antibiotic agent Substances 0.000 description 6
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 6
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000002494 anti-cea effect Effects 0.000 description 5
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 5
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 5
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 5
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 4
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 4
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 238000012799 strong cation exchange Methods 0.000 description 4
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 3
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 3
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 3
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 3
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 3
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 229940126574 aminoglycoside antibiotic Drugs 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000013628 high molecular weight specie Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 3
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 229960005267 tositumomab Drugs 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 2
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTQWWZBSTRGEAV-PKHIMPSTSA-N 2-[[(2s)-2-[bis(carboxymethyl)amino]-3-[4-(methylcarbamoylamino)phenyl]propyl]-[2-[bis(carboxymethyl)amino]propyl]amino]acetic acid Chemical compound CNC(=O)NC1=CC=C(C[C@@H](CN(CC(C)N(CC(O)=O)CC(O)=O)CC(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)C=C1 RTQWWZBSTRGEAV-PKHIMPSTSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 2
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 2
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 2
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 2
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 2
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 2
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 102100021852 Neuronal cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 2
- 101710130688 Neuronal cell adhesion molecule Proteins 0.000 description 2
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Natural products OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101001039269 Rattus norvegicus Glycine N-methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 2
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 2
- 102100029981 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Human genes 0.000 description 2
- 101710100963 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Proteins 0.000 description 2
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 2
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 2
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 229950009760 epratuzumab Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 2
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 229960001001 ibritumomab tiuxetan Drugs 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- RGLRXNKKBLIBQS-XNHQSDQCSA-N leuprolide acetate Chemical compound CC(O)=O.CCNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 RGLRXNKKBLIBQS-XNHQSDQCSA-N 0.000 description 2
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 2
- AQIXEPGDORPWBJ-UHFFFAOYSA-N pentan-3-ol Chemical compound CCC(O)CC AQIXEPGDORPWBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 2
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 2
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 2
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOWDZACBATWTAU-FEFUEGSOSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-(dimethylamino)-3-methylbutanoyl]amino]-n-[(3r,4s,5s)-1-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1s,2r)-1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl]amino]-1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl]pyrrolidin-1-yl]-3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl]-n,3-dimethylbutanamide Chemical compound CC(C)[C@H](N(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N(C)[C@@H]([C@@H](C)CC)[C@H](OC)CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)C1=CC=CC=C1 WOWDZACBATWTAU-FEFUEGSOSA-N 0.000 description 1
- XMQUEQJCYRFIQS-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-amino-5-ethoxy-5-oxopentanoic acid Chemical compound CCOC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O XMQUEQJCYRFIQS-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- SPSSULHKWOKEEL-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrotoluene Chemical compound CC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O SPSSULHKWOKEEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IRLPACMLTUPBCL-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylyl sulfate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OS(O)(=O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O IRLPACMLTUPBCL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 1
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 1
- 241000256173 Aedes albopictus Species 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 101100107610 Arabidopsis thaliana ABCF4 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 description 1
- 102400001282 Atrial natriuretic peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 102000007536 B-Cell Activation Factor Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010046304 B-Cell Activation Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000013585 Bombesin Human genes 0.000 description 1
- 108010051479 Bombesin Proteins 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 241000409811 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100031151 C-C chemokine receptor type 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710149815 C-C chemokine receptor type 2 Proteins 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102400000113 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- BYMMIQCVDHHYGG-UHFFFAOYSA-N Cl.OP(O)(O)=O Chemical compound Cl.OP(O)(O)=O BYMMIQCVDHHYGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000759568 Corixa Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 1
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 241000272190 Falco peregrinus Species 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 101001070329 Geobacillus stearothermophilus 50S ribosomal protein L18 Proteins 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100031547 HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000866278 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000777628 Homo sapiens Leukocyte antigen CD37 Proteins 0.000 description 1
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 1
- 101001136592 Homo sapiens Prostate stem cell antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000801228 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 235000003325 Ilex Nutrition 0.000 description 1
- 241000209035 Ilex Species 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000003781 Inhibitor of growth protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000191 Inhibitor of growth protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 1
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 238000012695 Interfacial polymerization Methods 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 102000010781 Interleukin-6 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000235651 Lachancea waltii Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031586 Leukocyte antigen CD37 Human genes 0.000 description 1
- 108010000817 Leuprolide Proteins 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- 239000004907 Macro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710151805 Mitochondrial intermediate peptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- 229930182474 N-glycoside Natural products 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 description 1
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 1
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 229920012266 Poly(ether sulfone) PES Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102100025067 Potassium voltage-gated channel subfamily H member 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710163352 Potassium voltage-gated channel subfamily H member 4 Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 102100036735 Prostate stem cell antigen Human genes 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 102400000834 Relaxin A chain Human genes 0.000 description 1
- 101800000074 Relaxin A chain Proteins 0.000 description 1
- 102400000610 Relaxin B chain Human genes 0.000 description 1
- 101710109558 Relaxin B chain Proteins 0.000 description 1
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 1
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 1
- 101100068078 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GCN4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 241000311088 Schwanniomyces Species 0.000 description 1
- 241001123650 Schwanniomyces occidentalis Species 0.000 description 1
- 241000287219 Serinus canaria Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 1
- 241001149964 Tolypocladium Species 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 1
- 102000011117 Transforming Growth Factor beta2 Human genes 0.000 description 1
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 description 1
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 1
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 101800000304 Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000097 Transforming growth factor beta-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000056172 Transforming growth factor beta-3 Human genes 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 102100036922 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B Human genes 0.000 description 1
- 101710181056 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B Proteins 0.000 description 1
- 102100029690 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13C Human genes 0.000 description 1
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Natural products NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 229940122803 Vinca alkaloid Drugs 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 229960000446 abciximab Drugs 0.000 description 1
- MNOGBRROKHFONU-CJUKMMNNSA-N ac1l2wzw Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(NCCOP(O)(O)=O)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 MNOGBRROKHFONU-CJUKMMNNSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940119059 actemra Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 1
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000002391 anti-complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000003388 anti-hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 108010008730 anticomplement Proteins 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229940120638 avastin Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229960003270 belimumab Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001950 benzethonium chloride Drugs 0.000 description 1
- UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M benzethonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(C(C)(C)CC(C)(C)C)=CC=C1OCCOCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000005460 biophysical method Methods 0.000 description 1
- HUTDDBSSHVOYJR-UHFFFAOYSA-H bis[(2-oxo-1,3,2$l^{5},4$l^{2}-dioxaphosphaplumbetan-2-yl)oxy]lead Chemical compound [Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O HUTDDBSSHVOYJR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000003130 blood coagulation factor inhibitor Substances 0.000 description 1
- DNDCVAGJPBKION-DOPDSADYSA-N bombesin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1NC2=CC=CC=C2C=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C(C)C)C1=CN=CN1 DNDCVAGJPBKION-DOPDSADYSA-N 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000069 breast epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N butyl alcohol Substances CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229960003115 certolizumab pegol Drugs 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005354 coacervation Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 229920006037 cross link polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N cyclohexanol Chemical compound OC1CCCCC1 HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 108700001680 des-(1-3)- insulin-like growth factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 229960002224 eculizumab Drugs 0.000 description 1
- 229960000284 efalizumab Drugs 0.000 description 1
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000004794 expanded polystyrene Substances 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 229940048921 humira Drugs 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229950004101 inotuzumab ozogamicin Drugs 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 102000028416 insulin-like growth factor binding Human genes 0.000 description 1
- 108091022911 insulin-like growth factor binding Proteins 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229960004338 leuprorelin Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 229940076783 lucentis Drugs 0.000 description 1
- 229940066294 lung surfactant Drugs 0.000 description 1
- 239000003580 lung surfactant Substances 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Chemical class 0.000 description 1
- TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N methamphetamine hydrochloride Chemical compound Cl.CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 229950003063 mitumomab Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000007514 neuronal growth Effects 0.000 description 1
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 229960002450 ofatumumab Drugs 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 229960000470 omalizumab Drugs 0.000 description 1
- 229950007283 oregovomab Drugs 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002138 osteoinductive effect Effects 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N p-hydroxybenzoic acid methyl ester Natural products COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- FWZLYKYJQSQEPN-SKLAJPBESA-N peregrine Chemical compound OC1[C@H]2[C@@H]3C4([C@@H]5C6OC(C)=O)C(OC)CC[C@@]5(C)CN(CC)[C@H]4C6[C@@]2(OC)C[C@H](OC)[C@H]1C3 FWZLYKYJQSQEPN-SKLAJPBESA-N 0.000 description 1
- FWZLYKYJQSQEPN-UHFFFAOYSA-N peregrine Natural products OC1C2C3C4(C5C6OC(C)=O)C(OC)CCC5(C)CN(CC)C4C6C2(OC)CC(OC)C1C3 FWZLYKYJQSQEPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960002087 pertuzumab Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920001601 polyetherimide Polymers 0.000 description 1
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000307 polymer substrate Polymers 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 108010005636 polypeptide C Proteins 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920003053 polystyrene-divinylbenzene Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000079 presaturation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 108010087851 prorelaxin Proteins 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000010966 qNMR Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 229960003876 ranibizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940116176 remicade Drugs 0.000 description 1
- 229940107685 reopro Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000013017 sartobind Substances 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N silicic acid Chemical compound O[Si](O)(O)O RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 229940115586 simulect Drugs 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- VIDRYROWYFWGSY-UHFFFAOYSA-N sotalol hydrochloride Chemical compound Cl.CC(C)NCC(O)C1=CC=C(NS(C)(=O)=O)C=C1 VIDRYROWYFWGSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- SFVFIFLLYFPGHH-UHFFFAOYSA-M stearalkonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 SFVFIFLLYFPGHH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000012607 strong cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 229940036185 synagis Drugs 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229950000301 teneliximab Drugs 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000001302 tertiary amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- YMBCJWGVCUEGHA-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CC[N+](CC)(CC)CC YMBCJWGVCUEGHA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 229960003989 tocilizumab Drugs 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 108010042974 transforming growth factor beta4 Proteins 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical group CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000015 trinitrotoluene Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- 229940099073 xolair Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/165—Extraction; Separation; Purification by chromatography mixed-mode chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Manufacture Of Macromolecular Shaped Articles (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу усиления эффективности этапов хроматографии для очистки антител ниже по потоку, включающему: а) пропускание композиции, содержащей представляющее интерес антитело и загрязняющий ионный полимер сквозь ионообменную мембрану, отличающееся тем, что антитело и мембрана имеют противоположный заряд, при рабочих условиях, которые состоят из буфера, имеющего рН, достаточно отличающийся от pI антитела с целью повышения заряда антитела, и низкой ионной силы, эффективной для предотвращения экранирования зарядов буферных ионов, которые приводят к тому, что мембрана связывает антитело и по крайней мере один загрязняющий ионный полимер; b) перегрузку ионообменной мембраны до плотности нагрузки 1000-5000 г/л таким образом, что по меньшей мере один указанный загрязняющий ионный полимер остается связанным с мембраной, тогда как представляющее интерес антитело находится, главным образом, в элюате; c) улавливание элюата из ионообменной мембраны, который содержит представляющее интерес антитело; d) этап ионообменной хроматографии, которая имеет аналогичный предыдущей мембране заряд, которому подвергают элюат мембраны, содержащий представляющее интерес антитело, и e) извлечение очищенного антитела из элюата этапа ионообменной хроматографии. Способ позволяет улучшить очистку белков и удалять примеси ионного полимера, например, такого как полиэтиленимин. 3 н. и 24 з.п. ф-лы, 16 ил., 2 табл., 1 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение в целом относится к очистке белка. В частности, настоящее изобретение относится к способам повышения эффективности находящихся ниже по потоку этапов очистки с целью удаления примесей посредством использования находящейся выше по потоку мембранной ионообменной хроматографии.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Масштабная, экономичная очистка белков становится все более важной проблемой для биотехнологической промышленности. Как правило, белки получают путем культивирования клеток, с использованием либо эукариотических или прокариотических клеточных линий разработанных для получения интересующего белка путем введения рекомбинантной плазмиды, содержащей ген этого белка. Эти клетки должны подаваться со сложной средой роста, содержащей сахара, аминокислоты и факторы роста, обычно поставляемые из препаратов сыворотки животных. Разделение желаемого белка в смеси соединений, подаваемых к клеткам, и побочных продуктов самих клеток с чистотой, достаточной для использования в качестве терапевтических доз для человека, представляет собой сложную задачу.
Методики очистки белков от остатков клеток изначально зависят от механизма экспрессии данного белка. Некоторые белки могут быть секретированы непосредственно из клетки в окружающую питательную среду; другие созданы внутри клетки. Для последних белков, первый этап способа очистки содержит лизис клетки, что может осуществляться различными способами, в том числе механического разрезания, осмотического удара или ферментативных способов обработки. Такое разрушение высвобождает все содержимое ячейки в гомогенат, и, кроме того, производит субклеточные фрагменты, которые трудно удалить из-за их небольшого размера. Как правило, их удаляют дифференциальным центрифугированием или фильтрацией. Та же проблема возникает, хотя и в меньшем масштабе, с непосредственно секретируемыми белками за счет естественной смерти клеток и высвобождения внутриклеточных белков клетки-хозяина в ходе получения белка.
После того, как был получен представляющий интерес осветленный раствор, содержащий белок, без больших компонентов дебриса, его отделение от остальных других белков, продуцируемых клеткой, как правило, осуществляют с использованием комбинации различных способов хроматографии. Эти способы разделяют смеси белков и других примесей на основе их заряда, степени гидрофобности или размера. Для каждого из этих способов доступны несколько различных хроматографических смол, что позволяет осуществить правильную адаптацию схемы очистки вовлеченного, в частности, белка. Сущностью каждого из этих способов разделения является то, что белки подвергают либо движению с разной скоростью по длинной колонке, достигая физического разделения, которое увеличивается, когда они проходят далее вниз по колонке, или селективному присоединению к разделяющей среды, будучи затем дифференциально элюированными или перемещенными с помощью различных растворителей или заместителей. В некоторых случаях желаемый белок отделяют от примесей, причем примеси специфически прилипают к колонке, а представляющий интерес белок нет, то есть интересующий белок присутствует в "элюате". Публикации, касающиеся очистка белка, включают Fahrner и соавт., Biotechnol Genet Eng Rev. 2001; 18:301-27.
Типичный масштабный процесс очистки антител часто построен вокруг применения иммобилизованного протеина А в качестве основного этапа захвата и очистки, в сочетании с другими операциями в колонке. Протеин А представляет собой белок клеточной стенки Staphylococcus aureas со сродством к области Fc IgG. По этой причине он широко используется для очистки IgG. Операции с протеином А в колонке в целом предоставляют чистоту продукта более 98%, с большинством технологических примесей, вымываемых фракцией элюата. Тем не менее, существуют многочисленные недостатки использования хроматографии с протеином А. Во-первых, связывание обычно осуществляют при рН от нейтрального до слабощелочного и, как правило, элюирование обычно осуществляют при кислом значении рН. Одной из потенциальных проблем является то, что низкий рН может денатурировать или частично денатурировать IgG. Из-за этого и высокой чистоты продукта, необходимой для клинического применения, для разделения изомеров, связанных с продуктами, являются необходимыми дополнительные этапы концентрации, очистки и удаления оставшихся количеств белков/ДНК клетки-хозяина, культивирования клеток примесей, выщелоченного протеина А и вирусов. Усугубляется проблема тем, что многие из этих примесей могут помешать эффективности функциональных блоков технологического способа выделения очищенных антител ниже по потоку. Другой основной проблемой является цена - колонки с протеином А являются более дорогими, чем обычные ионообменные колонки. Наконец, существуют многочисленные сценарии, в которых хроматография с протеином А или не является подходящей, или стоимость является слишком высокой, например, с очисткой полипептидов, подобных антителам молекул, фрагментов антител и/или всех антител, выделенных из определенных клеточных систем.
Природа настоящего изобретения решает вышеобозначенные проблемы, и в вариантах его осуществления демонстрируют способ очистки, альтернативный доступным в настоящее время в данной области с использованием этапа очистки с протеином А антитела, фрагмента антитела и полипептида.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способам повышения эффективности последующих этапов хроматографии для очистки белков, которые содержат (а) пропускание композиции, содержащей представляющий интерес полипептид и различные загрязняющие вещества сквозь ионообменную мембрану, отличающуюся тем, что полипептид и мембрана имеют противоположный заряд, при рабочих условиях, состоящих из буфера, имеющего рН, достаточно отличающийся от pi полипептида для повышения заряда полипептида, и низкой ионной силы, эффективно предотвращающей экранирование зарядов буферными ионами, которое приводит к связыванию с мембраной молекул полипептида и по меньшей мере одного загрязняющего вещества, (b) улавливание фракции из ионообменной мембране, содержащей представляющий интерес полипептид; (с) дополнительный один или более этап(ы) очистки, которому подвергают композицию, содержащую полипептид, и (d) извлечение очищенного полипептида из элюата.
В одном альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу повышения эффективности последующих этапов хроматографии для очистки белков, содержащих (а) пропускание композиции, содержащей представляющий интерес полипептид, и различных загрязняющих веществ через катионообменную мембрану, где этот полипептид и мембрана имеют противоположный заряд, при рабочих условиях, состоящих из буфера с рН от около 1 до около 5 единиц рН ниже pI полипептида и проводимости ≤ около 40 мСм/см, которая приводит к связыванию с мембраной полипептид и по меньшей мере одно загрязняющее вещество, и (b) выделение фракции на ионообменной мембране, содержащей представляющий интерес полипептид; (с) дополнительный один или более этап(ы) очистки, которому подвергают композицию, содержащую полипептид, и (d) извлечение очищенного полипептида из элюата.
В одном альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу повышения эффективности последующих этапов хроматографии для очистки белков, содержащих (а) пропускание композиции, содержащей представляющий интерес полипептид, и различных загрязняющих веществ через анионообменную мембрану, где этот полипептид и мембрана имеют противоположный заряд, при рабочих условиях, состоящих из буфера с рН от около 1 до около 5 единиц рН выше pI полипептида и проводимости ≤ около 40 мСм/см, которая приводит к связыванию с мембраной полипептид и по меньшей мере одно загрязняющее веществе, и (b) выделение фракции на ионообменной мембране, содержащей представляющий интерес полипептид; (с) дополнительный один или более этап(ы) очистки, которому подвергают композицию, содержащую полипептид, и (d) выделение очищенного полипептида из элюата.
В одном аспекте загрязняющее вещество представляет собой белок яичника китайского хомячка (CHOP). В другом аспекте загрязняющее вещество представляет собой белок Е. coli (ЕСР). В другом аспекте загрязняющее вещество представляет собой гентамицин. В еще одном аспекте загрязняющее вещество представляет собой полиэтиленимин (PEI).
В отдельном аспекте полипептид содержит область СН2/СН3. В другом аспекте полипептид представляет собой антитело. В еще одном дополнительном аспекте антитело представляет собой моноклональное антитело.
В других аспектах способы дополнительно включают воздействие на композицию, содержащую полипептид, на дальнейшем одном или более этапе(ах) очистки до, во время или после стадии а на протяжении стадии b, описанной выше, стадия очистки в одном альтернативном варианте осуществления представляет собой Fc-связывающую аффинную хроматографию (напр., хроматографию с протеином А) и, в другом альтернативном варианте осуществления, ионообменную хроматографию, которая использует колонку или мембрану, действующую в режиме связывания/вымывания, промывания или перемещения. В еще одном аспекте ионообменную мембрану заменяют на монолит или объемный фильтр.
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает получение фармацевтической композиции путем объединения очищенного полипептида с фармацевтически приемлемым носителем.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фигура 1. Схема очистки антител с использованием мембраны СЕХ для защиты колонки СЕХ с, или без, исходной колонки с протеином А.
Фигура 2. Схема очистки не-антител с использованием мембраны СЕХ для защиты колонки СЕХ в качестве начального этапа.
Фигура 3. Выход в случае анионообменной емкости mAb 1 при рН 5,5 и 6,4 мСм/см и при рН 8,0 и 5,0 мСм/см, Mustang™ S (малогабаритная, минутный объем 0,18 мл, 667 MV/час).
Фигура 4. Выход в случае анионообменной емкости mAb 2 при рН рН 8,0, Mustang™ Q (малогабаритная, минутный объем 0,35 мл, 600 MV/час).
Фигура 5. Клиренс CHOP в случае емкости с протеином A mAb 3 при рН 5,5, 3,2 мСм/см, Mustang™ S (малогабаритная, минутный объем 0,18 мл, 1333 MV/час).
Фигура 6. Клиренс примесей после перегрузки с мембранами СЕХ.
Фигура 7. Сила связывания Mustang S различных видов, которая определяется градиентом элюирования, и нормализация высокой концентрации видов в каждой фракции.
Фигура 8. Общую связанную массу различных видов на Mustang S рассчитывают с помощью суммирования всех масс фракций градиентного элюирования и при сравнении с разными плотностями нагрузки мембран и нормализацией к максимальной массе.
Фигура 9. Мембрану Mustang S загружают белком, промывают 20 мМ ацетатного буфера, пока УФ-поглощение не достигнет исходного уровня, а затем элюируют 20 мМ ацетат/гентамициновым буфером, чтобы продемонстрировать перемещение антитела относительно гентамицина.
Фигура 10. Схема, изображающая протокол для определения способности к динамическому связыванию (DBC) антител на колонке СЕХ (Fractogel SE Hicap) с, или без, использованием мембраны СЕХ на различных концентрациях гентамицина.
Фигура 11. Влияние концентрации гентамицина на DBC антитела Fractogel SE
Hicap.
Фигура 12. Сравнение DBC гентамицина на двух мембранах СЕХ (Mustang S и Natrix S).
Фигура 13. DBC антитела Fractogel SE Hicap с перегруженной Natrix S емкостью, которая демонстрирует 30% повышение DBC.
Фигура 14. Влияние % PEI, используемое в способе экстракции на SP Sepharose Fast Flow (SPSFF), на DBC белка демонстрирует повышение на от 36 до 51 г/л, при том, что используют меньше PEL
Фигура 15. Влияние % PEI, используемое в способе экстракции, на SPSFF, демонстрирует сниженный выход на этапе и повышенные примеси в емкости, при том, что используют больше PEI.
Фигура 16. DBC протеина на Natrix S, ЕСР и PEI демонстрируют прорыв PEI при 330 мг/мл мембраны, по сравнению с прорывом белка и ЕСР при 123 мг/мл мембраны.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА РЕАЛИЗАЦИИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения:
В данном документе численные диапазоны или количества, которым предшествует термином "около", полностью содержит точный диапазон или точное численное количество.
"Композиция", которая должна быть очищена по данному документу, содержит представляющий интерес полипептид и одно или более загрязняющее вещество. Композиция может быть "частично очищенный" (напр., такой, которая была подвергнута одному или нескольким этапам очистки, таким как хроматография с протеином А) или может быть получена непосредственно из клетки-хозяина или организма, продуцирующего полипептид (напр., композиция может содержать собранную культуральную жидкость).
Как используется в данном документе, "полипептид" в целом относится к пептидам и белкам, имеющим более чем около десяти аминокислот. Предпочтительно полипептид представляет собой белок млекопитающего, примеры которого содержат: ренин; гормон роста, в том числе гормона роста человека и бычий гормон роста; фактор высвобождения гормона роста; паратгормон; тиреотропный гормон; липопротеины; альфа-1-антитрипсин; А-цепь инсулина; В-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания, такие как фактор VIIIC, фактор IX, тканевой фактор, и фактор фон Виллебранда; противосвертывающие факторы, такие как протеин С; предсердный натрийуретический фактор; сурфактант легких; активатор плазминогена, такой как урокиназа или моча человека, или тканевой активатор плазминогена (t-PA); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; альфа и -бета фактор некроза опухолей; энкефалиназа; RANTES (регулируют обычно по активации экспрессированных и секретированных Т-клеток); макрофагальный белок воспаления человека (MIP-1 -альфа); сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; мюллерова ингибирующая субстанция; А-цепь релаксина; В-цепь релаксина; прорелаксин; гонадотропин-ассоциированный пептид мыши; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; IgE; антиген цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA), таких как CTLA-4; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); рецепторы гормонов или факторов роста; протеин А или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как костный нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5, -6 (или NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6) или фактор роста нервной ткани, такой как NGF-β; тромбоцитарный фактор роста (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-альфа и TGF-бета, в том числе TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, или TGF-β5; инсулиноподобный фактор роста-I и II (IGF-I и IGF-II); дез(1-3)-IGF-1 (IGF-I мозга), белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста (IGFBP); белки CD, такие как CD3, CD4, CD8, CD 19 и CD20; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (BMP); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (CSF), напр., M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (ILS), напр., от IL-1 до IL-10; супероксиддисмутазы; Т-клеточные рецепторы; белки поверхности мембраны; стимулятор гемолиза; вирусный антиген, такой как, например, часть оболочки СПИДа; транспортные белки; "хоуминг"-рецептор; аддрессины; регуляторные белки; интегрины, такие как CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 и VCAM; опухолеспецифический антиген, такой как рецептора HER2, HER3 или HER4; и фрагменты и/или варианты любого из вышеперечисленных полипептидов, а также антител, в том числе фрагменты антител, связывающихся с любым из вышеперечисленных полипептидов.
"Загрязняющее вещество" представляет собой материал, который отличается от желаемого полипептидного продукта. Загрязняющее вещество содержит, без ограничения ими, материалы клетки-хозяина, такие как белки яичника китайского хомячка (CHOP) или белки Е. coli (ЕСР); выщелоченный белок А; нуклеиновую кислоту; вариант, фрагмент, агрегат, изомер или производное желаемого полипептида; другой полипептид; эндотоксин; вирусное загрязняющее вещество; компоненты аминогликозидньгх антибиотиков (напр., гентамицин, стрептомицин, неомицин, канамицин); или ионный полимер, добавленный в процессе очистки (напр., полиэтиленимин (PEI), поливиниламин, полиаргинин, поливинилсульфоновая кислота, полиакриловая кислота) и т.д.
Используемый в данном документе термин "область CH2/CH3" относится к аминокислотным остаткам в области Fc молекулы иммуноглобулина. В предпочтительных вариантах область область CH2/CH3 содержит в себе неповрежденную область CH2 после интактной области CH3, и наиболее предпочтительно Fc-область иммуноглобулина. Примеры полипептидов, содержащих область CH2/CH3, содержат антитела, иммуноадгезины и слитые белки, содержащие представляющий интерес полипептид, слитый с, или сопряженный с, областью CH2/CH3.
В предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения антитело, которое очищают по данному документу, представляет собой рекомбинантное антитело. "Рекомбинантное антитело" представляет собой таковое, полученное в клетке-хозяине, которая была трансформирована или, трансфицирована с, кодирующей антитело нуклеиновой кислотой, или получает антитело в результате гомологичной рекомбинации. "Трансформацию" и "трансфекцию" используют взаимозаменяемо для обозначения процесса введения нуклеиновой кислоты в клетку. После трансформации или трансфекции нуклеиновая кислота может интегрироваться в геном клетки-хозяина или может существовать как внехромосомный элемент."Клетка-хозяин" содержит в себе клетку в клеточной культуре in vitro, а также в клетке животного-хозяина. Например, способы рекомбинантного получения полипептидов, описанные в патенте США №5534615, специально содержатся в данном документе в виде ссылки.
Термин "антитело" используется в широком смысле и конкретно охватывает моноклональные антитела (в том числе непроцессированный моноклональные антитела), поликлональные антитела, мульти специфические антитела (напр., биспецифичные антитела) и фрагменты антител, пока они сохраняют, или изменены, чтобы содержать, область CH2/CH3 так, как они определены в данном документе.
Антитело по настоящему изобретению направлено против "антигена", представляющего интерес. Предпочтительно антиген представляет собой биологически важный полипептид и введение антитела млекопитающему, страдающему от заболевания или расстройства, которое может привести к терапевтическому действию для этого млекопитающего. Тем не менее, также рассматриваются антитела, направленные против не-полипептидных антигенов (таких, как ассоциированные с опухолью гликолипидные антигены, смотри патент США 5091178). Если антиген представляет собой полипептид, то он может быть трансмембранной молекулой (напр., рецептором) или лигандом, таким как фактор роста. Примерные антигены содержат полипептиды, описанные выше. Предпочтительные молекулярные мишени для антител, охватываемых настоящим изобретением, содержат CD полипептиды, такие как CD3, CD4, CD8, CD 19, CD20 и CD34; члены семейства рецепторов HER, такие как рецептор EGF (HER1), HER2, HER3 или рецептор HER4; молекулы клеточной адгезии, такие как LFA-1, Mac1, р150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM и интегрин av/b3, которые содержат их субъединицы А или В (напр., антитела анти-CD11a, анти-CD18 или анти-CD11b); факторы роста, такие как VEGF; IgE; антигены группы крови; рецептор flk2/flt3; рецептор ожирения (ОВ); рецептор mpI; CTLA-4; полипептид С и т.д. Растворимые антигены или их фрагменты, необязательно конъюгированные с другими молекулами, могут быть использованы в качестве иммуногенов для получения антител. Для трансмембранных молекул, таких как рецепторы, в качестве иммуногена могут быть использованы их фрагменты (напр., внеклеточный домен рецептора). С другой стороны, в качестве иммуногена могут быть использованы клетки, экспрессирующие трансмембранную молекулу. Такие клетки могут быть получены из природного источника (напр., линии раковых клеток) или могут быть клетками, которые были трансформированы рекомбинантными способами для экспрессирования трансмембранной молекулы.
Примеры антител, которые должны быть очищены по данному документу, содержат, но без ограничения ими: антитела HER2, содержащие трастузумаб (в том числе HERCEPTIN®) (Carter и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992), патент США №5725856) и пертузумаб (OMNITARG™) (SEQ CHAPTER \h \r 1WO01/00245); антитела CD20 (см. ниже); антитела IL-8 (St John и соавт., Chest, 103:932 (1993), и международная заявка WO 95/23865); антитела рецептора VEGF или VEGF, в том числе гуманизированные антитело и/или антитело VEGF с созревшей аффинностью, такие как гуманизированное антитело VEGF huA4.6.1 бевацизумаба (AVASTIN®) и ранибизумаба (Lucentis®) (Ким и соавт., Growth Factors, 7:53-64 (1992), международные заявки WO 96/30046 и WO 98/45331, опубликованные 15 октября 1998); антитела PSCA (WO 01/40309); антитела CD11а, которые содержат эфализумаб (RAPTIVA®) (патент США №5622700, WO 98/23761, Steppe и соавт., Transplant Intl. 4:3-7 (1991), и Hourmant и соавт, Transplantation 58:377-380 (1994)).; антитела, которые связывают IgE, в том числе омализумаб (XOLAIR®) (Presta и соавт., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993), и международная заявка WO 95/19181; патент США №5714338, выданный 3 февраля 1998 или патент США №5091313, выданный 25 февраля 1992, WO 93/04173, опубликованный 4 марта 1993, или международная заявка PCT/US98/13410, поданная 30 июня 1998, патент США №5714338); антитела CD18 (патент США №5622700, выданный 22 апреля 1997, или как в WO 97/26912, опубликованной 31 июля 1997); антитела рецептора антитела Аро-2 (WO 98/51793, опубликованный 19 ноября 1998); антитела тканевого фактора (TF) (Европейский патент №0 420 937 В1, выданный 9 ноября 1994); α4-α7 интегриновые или антитела (WO 98/06248, опубликованный 19 февраля 1998); антитела EGFR (напр., химерное или гуманизированными антитела 225, цетуксимаб, ERBUTIX®, как в WO 96/40210, опубликованном 19 Декабрь 1996); антитела CD3, такие как ОКТЗ (патент США №4515893, выданный 7 мая 1985); антитела CD25 или Тас, такие как CHI-621 (SIMULECT®) и ZENAPAX® (смотри патент США №5693762, выданный 2 декабря 1997); антитела CD4, такие как антитела сМ-7412 (Choy и соавт., Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996)); антитела CD52, такие как САМРАТН-1Н (ILEX/Berlex) (Riechmann и соавт., Nature 332:323-337 (1988)); антитела рецепторов Fc, такие как антитела М22, направленные против Fc(RI, такие как в Graziano и соавт., J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995)); антитела карциноэмбрионального антигена (СБА), такие как hMN-14 (Sharkey и соавт., Cancer Res. 55(23 Suppl): 5935s-5945s (1995)); антитела, направленные против эпителиальных клеток молочной железы, в том числе huBrE-3, hu-Mc 3 и CHL6 (Ceriani и соавт., Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995); и Richman и соавт., Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995)); антитела, которые связываются с клетками карциномы толстой кишки, такие как С242 (Litton и соавт., EurJ. Immunol. 26(1): 1-9 (1996)); антитела CD38, напр., AT 13/5 (Ellis и соавт., J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)); антитела CD33, такие как Ни Ml95 (Jurcic и соавт., Cancer Res 55(23 Suppl): 5908s-5910s (1995)) и СМА-676 или CDP771; антитела ЕрСАМ, такие как 17-1A (PANOREX®); антитела GpIIb/IIIa, такие как абциксимаб или с7Е3 Fab (REOPRO®); антитела RSV, такие как MEDI-493 (SYNAGIS®); антитела CMV, такие как PROTOVIR®; антитела HIV, такие как PR0542; антитела к гепатиту, такие как антитело к Hep В OSTAVIR®; антитело СА 125 OvaRex; идиотипическое антитело ВЕС2 к антигену GD3; антитело αvβ3 (напр., VITAXIN®; Medimmune); антитело к почечно-клеточному раку человека, такое как ch-G250; ING-1; антитело к клеткам человека 17-1 An (3622W94); колоректальное опухолевое антитело к клеткам человека (А33); антитело к клеткам меланомы человека R24, направленное против ганглиозида GD3; плоскоклеточный рак к клеткам человека (SF-25); антитело лейкоцитарного антигена человека (HLA), такое как Smart ID 10 и анти-HLA натитело DR Oncolym (Lym-1); антитело CD37, такое как TRU 016 (Trubion); антитело IL-21 (Zymogenetics/Novo Nordisk); антитела против В-клетки (Impheron); В-клетка, специфическая к MAb (Immunogen/Aventis); 1D09C3 (Morphosys/GPC); LymphoRad 131 (HGS); антитело Lym-1, такое как Lym-1 Y-90 (USC) или анти-Lym-l Oncolym (USC/Peregrine); LIF 226 (Enhanced Lifesci.); антитело BAFF (напр., WO 03/33658); антитело к рецептору BAFF (смотри, напр., WO 02/24909); BR3 антитело; антитело Blys, такое как белимумаб; LYMPHOSTAT -В™; ISF 154 (UCSD/Roche/Tragen); гомиликсима (Idee 152; Biogen Idee); антитело к рецептору IL-6, такое как атлизумаб (ACTEMRA™; Chugai/Roche); антитело IL-15, такое как HuMax-Il-15 (Genmab/Amgen); антитело к хемокиновому рецептору, такое как антитело CCR2 (напр., MLN1202; Millieneum); антикомплементное антитело, такое как антитело С5 (напр., экулизумаб, 5G1.1; Alexion); пероральный состав иммуноглобулина человека (напр., IgPO; Protein Therapeutics); антитело, IL-12, такое как АВТ-874 (CAT/Abbott); Teneliximab (BMS-224818; BMS); антитела CD40, которые содержат S2C6 и их гуманизированные варианты (WO 00/75348) и TNX 100 (Chiron/Tanox); антитела TNF-α, которые содержат сА2 или инфликсимаб (REMICADE®), CDP571, МАК-195, адалимумаб (HUMIRA™), фрагмент пегилированного антитела TNF-α, такого как CDP-870 (Celltech), D2E7 (Knoll), анти-TNF-α поликлональное антитело (напр., PassTNF; Verigen); антитела CD22, такие как LL2 или эпратузумаб (LYMPHOCIDE®; Immunomedics), которые содержат эпратузумаб Y-90 и эпратзумаб 1-131, антитело CD22 от Abiogen (Abiogen, Italy), CMC 544 (Wyeth/Celltech), комботокс (UT Soutwestern), BL22 (NIH) и LympoScan Tc99 (Immunomedics).
Примеры антител CD20 содержат: "C2B8", который теперь называется "ритуксимаб" ("RITUXAN®") (патент США №5736137); мышиное антитело 2 В8, помеченное иттрий-[90], обозначаемое "Y2B8" или "Ibritumomab Tiuxetan" (ZEVALIN®), коммерчески доступное от IDEC Pharmaceuticals, Inc. (патент США №5736137;. 2В8 хранят с АТСС под добавлении № НВ11388, 22 июня 1993); мышиный IgG2a "В1," также называемый "Tositumomab", необязательно помеченный 131I, для получения "131I-B1" или антитела "йод 1131 тозитумомаб" (Bexxar™), коммерчески доступного от Corixa (см. также патент США №5595721); мышиное моноклональное антитело "1F5" (Press и соавт., Blood 69(2):584-591 (1987)) и их варианты, которые содержат "измененный каркас" или гуманизированный 1F5 (WO 2003/002607, Leung, S.; АТСС комплекс НВ-96450); мышиное антитело 2Н7 и химерное антитело 2Н7 (патент США №5677180); гуманизированное 2Н7 (WO 2004/056312, Lowman и соавт.,); 2F2 (HuMax-CD20), полностью человеческое высокоаффинное антитело, направленное на молекулу CD20 в клеточной мембране В-клеток (Genmab, Дания; смотри, например, Glennie и van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) и Cragg и соавт., Blood 101: 1045-1052 (2003); WO 2004/035607; US 2004/0167319); человеческие моноклональные антитела, описанные в WO 2004/035607 и US 2004/0167319 (Teeling и соавт.,); антитела, имеющие сложные N-гликозид-связанные сахарные цепи, присоединенные к области Fc, описанные в US 2004/0093621 (Shitara и соавт.); моноклональные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, связанные с CD20 (WO 2005/000901, Tedder и соавт.,), такие как НВ20-3, НВ20-4, НВ20-25 и МВ20-11; молекулы, связывающие CD20, такие как серии антител АМЕ, напр., антитела АМЕ 33, как описано в WO 2004/103404 и US 2005/0025764 (Watkins и соавт., Eli Lilly/Applied Molecular Evolution, АМЕ); молекулы, связывающие CD20, такие как описаны в US 2005/0025764 (Watkins и соавт.); А20 антитело или его варианты, такое как химерное или гуманизированное антитело А20 (сА20, hA20, соответственно) или IMMU-106 (US 2003/0219433, Immunomedics); антитела, связывающие CD20, в том числе бес-антигенные Leu-16, 1Н4 или 2 В8, необязательно сопряженные с IL-2, как в US 2005/0069545А1 и WO 2005/16969 (Carr и соавт.,); биспецифическое антитело, которое связывает CD22 и CD20, например, hLL2×hA20 (WO 2005/14618, Chang и соавт.,); моноклональные антитела L27, G28-2, 93-1В3, В-С1 или NU-B2, доступные от International Leukocyte Typing Workshop (Valentine и соавт., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p.440, Oxford University Press (1987)); 1H4 (Haisma и соавт., Blood 92:184 (1998)); анти-СD20 конъюгат ауристатина Е (Seattle Genetics); анти-CD20-IL2 (EMD/Biovation/City of Hope); анти-CD20 терапия MAb (EpiCyte); анти-СD20 антитело TRU015 (Trubion).
Термин "моноклональное антитело", используемый в данном документе, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, напр., индивидуальные антитела, содержащие популяцию, являются идентичными за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высоко специфичными, направленными против одного иммунодоминантного сайта. Кроме того, в отличие от обычных (поликлональных) препаратов антител, которые обычно содержат различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты антигена. Определение "моноклональное" указывает на характер антитела, полученного из, по существу, гомогенной популяции антител, и не должно быть истолковано как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, которые будут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, могут быть изготовлены гибридомным способом, впервые описанным Kohler и соавт., Nature 256:495 (1975), или могут быть получены способами рекомбинантных ДНК (см., напр., патент США №4816567). В дополнительном варианте, "моноклональные антитела" могут быть выделены из фаговых библиотек антител, полученных с использованием способов, описанных в McCafferty и соавт., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson и соавт., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks и соавт., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991) описывают выделение мышиных и человеческих антител, соответственно, с использованием фаговых библиотек. В последующих публикациях описано производство с высоким сродством (диапазон нМ) человеческого антитела по перестановки цепей (Marks и соавт., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), а также комбинаторной инфекции и in vivo рекомбинации в качестве стратегии конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse и соавт., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Таким образом, эти способы являются приемлемой альтернативой традиционным гибридомным способам для выделения моноклональных антител. Кроме того, в настоящее время возможно получать трансгенных животных (напр., мыши), которые способны после иммунизации продуцировать полный репертуар антител человека при отсутствии продуцирования эндогенных иммуноглобулинов. Например, было описано, что гомозиготная делеция тяжелой цепи антитела области присоединения (JH) гена у химерных и мутантных по зародышевой линии мышей приводит к полному ингибированию продуцирования эндогенного антитела. Передача ряда генов иммуноглобулина зародышевой линии человека зародышевой линии таких мутантных мышей приведет к производству человеческого антитела при антигенной стимуляции. Смотри, напр., Jakobovits и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits и соавт., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann и соавт., Year in Immuno., 7:33 (1993); и Duchosal и соавт., Nature 355:258 (1992).
Моноклональные антитела в данном документе специально содержат "химерные" антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из отдельных видов или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность (патент США №4816567; и Morrison и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).
Термин "гипервариабельная область" при использовании в данном документе относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из "области, определяющей комплементарность" или "CDR" (напр., остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в тяжелой цепи вариабельного домена; Kabat и соавт., Sequences of Polypeptides of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или остатки из "гипервариабельной петли" (напр., остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в легкой цепи вариабельного домена и 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в тяжелой цепи вариабельного домена; Chothia и Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). "Каркас" или остатки "FR", как определено здесь, представляют собой остатки гипервариабельной области, отличные от остатков вариабельного домена.
"Гуманизированные" формы не принадлежащих к человеческому роду (напр., мышиные) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, не принадлежащего к человеческому роду. По большей части, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитело реципиента), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента заменены остатками из гипервариабельной области, не относящихся к человеку видов (антитело донора), таких как мышь, крыса, кролик или примат, имеющих желаемую специфичность, аффинность и способность. В некоторых случаях остатки области каркаса Fv (FR) иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками, не принадлежащими к человеческому роду. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не встречаются в антителе реципиента или в антителе донора. Эти изменения сделаны для улучшения производительности антител в дальнейшем. В общем, гуманизированное антитело содержит по существу все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все, или по существу все, гипервариабельные петли соответствуют таковым из иммуноглобулина, не принадлежащего к человеческому роду, и всем, или по существу всем, областям FR из последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно также содержит, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно, человеческого иммуноглобулина.
Выбор вариабельных доменов человека как легкого, так и тяжелого, которые используют для получения гуманизированных антител, очень важен для снижения антигенности. В соответствии со способом так называемого "максимального соответствия", осуществляют скрининг последовательности вариабельного домена антитела грызуна по всей библиотеке известных последовательностей вариабельных доменов человека. Последовательность человека, которая является наиболее близкой последовательности грызуна, в случае гуманизированного антитела затем, принимается как человеческий каркас (FR) (Sims и соавт., J. Immunol, 151:2296 (1993); Chothia и соавт., J. Mol Biol, 196:901 (1987)).
Другой способ использует определенный каркас, полученный из консенсусной последовательности всех антител человека конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. И тот же каркас можно использовать для нескольких различных гуманизированных антител (Carter и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta и соавт., J. Immnol, 151:2623 (1993)).
Кроме того, важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой аффинности по отношению к антигену и другим благоприятным биологическим свойствам. Для достижения этой цели, в соответствии с предпочтительным способом, гуманизированные антитела получают с помощью процесса анализа исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов являются доступными и известны специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных потенциальных последовательностей иммуноглобулина. Исследование этих изображений позволяет проанализировать вероятную роль остатков в функционировании потенциальных последовательностей иммуноглобулина, напр., анализ остатков, которые влияют на способность потенциального иммуноглобулина связываться с его антигеном. Таким образом, остатки FR могут быть выбраны и объединены с реципиентом и вводимыми последовательностями таким образом, чтобы достигнуть требуемую характеристику антитела, такую как повышенная аффинность по отношению к антигену-мишени(ям). В общем, на связывание антигена остатки CDR влияют непосредственно и в наибольшей степени.
"Фрагменты антитела" содержат часть полноразмерного антитела, как правило, их область связывания антигена или вариабельную область. Примеры фрагментов антител содержат фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Для получения фрагментов антител были разработаны различные способы. Традиционно эти фрагменты получали путем протеолитического расщепления интактных антител (смотри, напр., Morimoto и соавт., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) и Brennan и соавт., Science, 229:81 (1985)). Однако эти фрагменты могут быть получены непосредственно с помощью рекомбинантных клеток-хозяев. Например, фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, обсуждаемых выше. Альтернативно, фрагменты Fab'-SH могут быть выделены непосредственно из Е. coli и химически связаны с образованием фрагментов F(ab')2 (Carter и соавт., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). В другом варианте реализации настоящего изобретения F(ab')2 формируется с помощью лейциновой застежки GCN4 для содействия сборке молекулы F(ab')2. Согласно другому подходу, фрагменты F(ab')2 могут быть выделены непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Специалисту в данной области будут очевидны другие способы получения фрагментов антител.
В других вариантах реализации настоящего изобретения антитело представляет собой одноцепочечный фрагмент Fv (scFv). Смотри WO 93/16185. "Одноцепочечные Fv" или фрагменты антител "sFv" составляют домены антитела VH и VL, причем эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет sFv образовать желаемую структуру для связывания антигена. Для ознакомления с sFv смотри Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
Термин "диатела" относится к малым фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, фрагменты которых содержат вариабельный домен (VH) тяжелой цепи, связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в той же полипептидной цепи (VH-VL). При использовании линкера, являющегося слишком коротким, чтобы позволить объединение двух доменов на той же цепи, домены вынуждены объединяться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих участка. Диатела более подробно описаны в, например, ЕР 404,097; WO 93/11161; и Hollinger и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993).
Выражение "линейные антитела", используемое в данной заявке, относится к антителам, описанным у Zapata и соавт., Polypeptide Eng. 8(10): 1057-1062 (1995). Вкратце, эти антитела содержат пару тандемных сегментов Fd (VH-CH1-VH-CH1), которые образуют пару антигенсвязывающих областей. Линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими.
"Мультиспецифические антитела" обладают специфичностью связывания с по меньшей мере двумя различными эпитопами, причем эпитопами, как правило, различных антигенов. В то время как такие молекулы обычно связывают только два антигена (напр., биспецифические антитела, BsAb), этим выражением охватываются антитела с дополнительными особенностями, такими как триспецифичные антитела, при использовании в данном документе. Примеры BsAb, содержат те, которые, с одной стороны, направлены против антигена опухолевых клеток, а с другой стороны, направлены против молекулы цитотоксического триггера, такой как анти-FcγRI/анти-CD15, анти- p185HER2/FcγRIII (CD 16), анти-CD3/направленная против злокачественной В-клетка (1D10), анти-CD3/анти-p185HER2, анти-CD3/анти-р97, анти-CD3/направленная против почечноклеточного рака, анти-CD3/анти-OVCAR-3, анти-CD3/L-D1 (направленная против антигена рака толстой кишки), анти-CD3/направленная против аналога меланоцитостимулирующего гормона, направленная против рецептора EGF/анти-CD3, анти-CD3/анти-САМА1, анти-CD3/анти-CD19, анти-CD3/MoV18, направленная против нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM)/анти-CD3, направленная против фолат связывающего белка (FBP)/анти-CD3, направленная против пан-карциномного антигена (АМОС-31)/анти-CD3; BsAbs с одной стороны специфически связывается с опухолевым антигеном, а с другой стороны связывается с токсином, таким как антисапориновый/анти-Id-1, анти-CD22/антисапориновый, анти-CD7/антисапориновый, анти-CD38/антисапориновый, анти-СЕА/направленный против А цепи рицина, идиотип, направленный против интерферонаа(IFN-α)/гибридомы, анти-СЕА/направленный против алкалоида барвинка; BsAbs для преобразования активируемых ферментами пролекарств, таких как анти-CD30/направленная против щелочной фосфатазы (который катализирует превращение пролекарства фосфата митомицина в митомициновый спирт); BsAbs, который могут быть использован в качестве фибринолитического средства, такого как анти-фибрин/направленный против тканевого активатора плазминогена (tPA), антифибриновый/направленный против активатор плазминогена урокиназного типа (uPA); BsAbs для таргетирования иммунных комплексов на рецепторы клеточной поверхности, такие как направленные против липопротеина низкой плотности (LDL)/направленные против рецептора Fc (напр., FcγRI или FcγRIII); BsAbs для использования в терапии инфекционных заболеваний, таких как анти-CD3/направленный против вируса простого герпеса (HSV), направленный против рецептора Т-клеток: комплекс CD3/антипротивогриппозный, анти-FcγR/анти-HIV; BsAbs для обнаружения опухоли in vitro или in vivo, такой как анти-СЕА/анти-EOTUBE, анти-СЕА/анти-DPTA, анти-p185HER2/антигаптеновый; BsAbs в качестве адъювантов вакцин; и BsAbs в качестве диагностических инструментов, таких как направленные против кроличего IgG/анти-ферритин, направленный против пероксидазы хрена (НКР)/антигормональный, направленный против соматостатина/направленный против вещества Р, анти-HRP/анти-FITC, анти-СЕА/антиβгалактозидазный. Примеры триспецифичных антител содержат анти-CD3/анти-CD4/анти-CD37, анти-CD3/анти-CD5/анти-CD37 и анти-CD3/анти-CD8/анти-CD37. Биспецифические антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (напр., биспецифические антитела F(ab')2).
Рассматривают антитела с более чем двумя валентностями. Например, могут быть получены триспецифические антитела. Tutt и соавт., J. Immunol. 147: 60 (1991).
"Изолированное антитело", в терминах настоящего изобретения, представляет собой антитело, которое не конъюгировано с цитотоксическим фрагментом или радиоактивной меткой.
"Интактное антитело" в данном документе представляет собой такое, которое содержит в себя две области, связывающие антиген, а также область Fc. Предпочтительно, чтобы интактное антитело имело функциональную область Fc.
"Лечение" относится как к терапевтическому лечению, так и профилактическим или превентивным мерам. Те, кто нуждается в лечении, содержат такие, которые уже имеют заболевание, а также тех, у которых заболевание может быть предотвращено.
"Заболевание" означает любое состояние, должное получить пользу от лечения очищенным антителом, как описано в данном документе. Это содержит в себе как хронические и острые заболевания и расстройства, так и такие патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее к рассматриваемому заболеванию.
Фраза "ионообменная хроматография" относится к способу сепарации, в котором соединения разделяют на основе их суммарного заряда. Молекулы классифицируют как анионы (имеющие отрицательный заряд) или катионы (имеющие положительный заряд). Некоторые молекулы (напр., полипептиды) могут иметь как анионные, так и катионные группы.
Ионообменная смола или ионообменный полимер представляет собой нерастворимую матрицу (или опорную конструкцию), обычно в виде мелких (диаметр 1-2 мм) шариков, изготовленных из субстрата на основе органического полимера. Horie и соавт. Pure Appl. Chem. (2004) Vol. 76, No. 4, pp. 889-906. Материал имеет высокоразвитую структуру пор, на поверхности которых находятся сайты с легко захватываемыми и освобождаемыми ионами. Захват ионов происходит только при одновременном высвобождении других ионов; таким образом, этот процесс называется ионным обменом. Есть несколько различных типов ионообменной смолы, которые изготавливаются избирательного предпочтения одного или нескольких различных типов ионов.
Наиболее типичные ионообменные смолы основаны на сшитом полистироле. Требуемые активные группы могут быть введены после полимеризации или могут быть использованы замещенные мономеры. Например, сшивание часто достигается в процессе полимеризации путем добавления в стирол 0,5-25% дивинилбензола. Несшитые полимеры используют редко, потому что они менее стабильны. Сшивание уменьшает способность смолы к ионному обмену и продлевает время, необходимое для достижения ионообменных процессов. Размер частиц также влияет на параметры смолы; мелкие частицы имеют большую внешнюю поверхность, но вызывают большие потери напора в ходе процессов в колонках.
Есть четыре основных типа ионообменных смол, отличающихся их функциональными группами: сильно кислые (обычно с сульфокислыми группами, например, натрийсульфонат пенополистирола или поли-AMPS); сильно основные (четвертичные аминогруппы, например, триметиламмониевые группы, например поли-АРТАС); слабокислые (в основном, карбоксильные группы); слабоосновные (первичные, вторичные и/или третичные аминогруппы, например полиэтиленамин). Есть также специализированные типы: хелатобразующие смолы (иминодиуксусная кислота, тиомочевина и многие другие).
При ионообменной хроматографии мембрана связывает соединения с общим положительным или отрицательным зарядом. Связывающие участки расположены вдоль пор адсорбера. Соединение транспортируется к сайту связывания за счет конвекции. Положительно заряженная мембрана (анионообменная смола) связывает соединение с общим отрицательным зарядом. И наоборот, отрицательно заряженная мембрана (катионообменная смола) связывает соединение с общим положительным зарядом.
Ионообменные мембраны могут быть дополнительно классифицированы либо как сильные, либо как слабые. Сильные ионообменные мембраны заряжены (ионизированы) в широком диапазоне уровней рН. Слабые ионообменные мембраны ионизированы в узком диапазоне значений рН. Четыре наиболее распространенные ионообменные составы представляют собой:
В общем, ионообменные мембраны имеют размеры пор от 0,1 до 100 мкм. В качестве справки, Sartoblnd Q (Sartorius AG) представляет собой сильную анионообменную мембрану с номинальным размером пор от 3 до 5 мкм и коммерчески доступен в виде однослойной или многослойной пленки, a Mustang Q (Pall Corporation) представляет собой сильную анионообменную мембрану с номинальным размером пор 0,8 мкм и также коммерчески доступен в виде однослойной или многослойной пленки. В качестве еще одной справки, Sartobind S (Sartorius AG) представляет собой сильную катионообменную мембрану с номинальным размером пор 3-5 мкм и коммерчески доступен в виде однослойной или многослойной пленки, a Mustang S (Pall Corporation) представляет собой сильную катионообменную мембрану с номинальным размером пор 0,8 мкм и также коммерчески доступен в виде однослойной или многослойной пленки. В качестве еще одной справки, Natrix S (Natrix Separations, Inc) представляет собой сильную катионообменную мембрану, которая состоит из нетканого высоковолокнистого прочного полимерного субстрата, заключенного в макропористый гидрогель с большой площадью поверхности.
"Номинальное" отношение размера пор характеризует способность мембраны сохранить большинство частиц при размере пор 60 до 98% от номинального.
"рН" раствора определяет кислотность или щелочность по отношению к ионизации пробы воды. Значение рН воды является нейтральным, напр., 7. Большинство значений рН находятся в диапазоне от 0 до 14. Растворы с более высоким, чем в случае воды (рН менее 7), значением [Н+] являются кислыми; растворы с более низким, чем в случае воды (рН больше 7), значением [Н+] являются основными или щелочными. рН может быть измерено с помощью рН-метра. Устанавливаемое значение рН может быть отрегулировано с использованием кислоты или основания, таких как HCl или NaOH.
"pI" или "изоэлектрическая точка" молекулы, такой как полипептид, обозначает рН, при котором полипептид содержит равное количество положительных и отрицательных зарядов. Значение pI может быть рассчитано, исходя из суммарного заряда аминокислотных остатков полипептида, или может быть определено с помощью изоэлектрического фокусирования. Амфотерный характер полипептидов может быть изменен для того, чтобы получить как анионные, так и катионные группы. Значение рН полипептида может быть снижено до точки, в которой желаемый полипептид ведет себя как катион (имеющий положительный заряд). Кроме того, значение рН полипептида может быть увеличено до точки, в которой желаемый полипептид ведет себя как анион (имеющий отрицательный заряд).
Термин "проводимость" соответствует способности раствора проводить электрический ток между двумя электродами. Основной единицей проводимости является сименс (S), которая ранее называлась мо. Проводимость обычно выражается в единицах мСм/см. Поскольку проводимость электрического тока обеспечивается зарядом ионов в растворе, электропроводность раствора пропорциональна концентрации ионов в растворе. Оба эти параметра хорошо коррелируются с ионной силой. Ионная сила тесно связана с концентрацией электролитов и указывает, насколько эффективно заряд конкретного иона в электролите экранирован или стабилизирован другими ионами. Основное различие между ионной силой и концентрацией электролита заключается в том, что ионная сила является более высокой, если некоторые из ионов являются более высокозаряженными. Еще одно различие между ними состоит в том, что ионная сила отражает концентрацию свободных ионов, а не только то, сколько соли добавляют к раствору. Проводимость может быть измерена с помощью электрокондуктометра, например, различных моделей электрокондуктометров Orion. Проводимость раствора может быть изменена путем изменения концентрации ионов в ней. Например, концентрация буферного агента и/или концентрация соли (напр., хлорида натрия, ацетата натрия или хлорида калия) в растворе могут быть изменены для того, чтобы достичь желаемой проводимости. Предпочтительно для того, чтобы достичь желаемой проводимости изменяют концентрацию соли различных буферов.
В случае мембранной хроматографии, "скорость потока" обычно описывается как объемы мембраны в час (MV/ч).
В случае мембранной хроматографии, "плотность нагрузки" часто выражается в граммах состава, обрабатываемых на литр мембраны.
"Буфер" представляет собой раствор, которое препятствует изменению рН при действии на него кислотно-основных компонентов конъюгата. Различные буферы, которые могут быть использованы в зависимости, например, от желаемого рН буфера, описаны в Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., Ed. Calbiochem Corporation (1975).
Под "очисткой" полипептида из композиции, содержащей полипептид и одно или более загрязняющее вещество, подразумевается увеличение степени чистоты полипептида в композиции путем удаления из композиции (полностью или частично) по меньшей мере одного загрязняющего вещества. "Этап очистки" может быть частью общего процесса очистки, что приводит к "гомогенной" композиции. Термин "гомогенная" в данном документе используют для обозначения композиции, которая в пересчете на общую массу композиции содержит по меньшей мере около 70% массы представляющего интерес антитела, предпочтительно по меньшей мере около 80% массы, более предпочтительно по меньшей мере около 90% массы, еще более предпочтительно по меньшей мере около 95% массы.
"Связывание" молекулы с ионообменной мембраной означает то, что молекула при соответствующих условиях (рН и/или проводимости) подвергается воздействию ионообменной мембраны таким образом, что молекула является обратимо иммобилизованной в, или на, ионообменной мембране в силу электростатических взаимодействий между молекулой и заряженной группой или заряженными группами ионообменной мембраны.
Под "промыванием" ионообменной мембраны подразумевают прохождение соответствующего буфера через, или сквозь, ионообменную мембрану.
"Элюирование" молекулы (напр., антитела или загрязняющего вещества) с ионообменной мембраной означает удаление молекулы оттуда.
В случае мембранной хроматографии "элюат" соответствует связыванию примесей с мембраной, в то время как соединение является неудерживаемым.
В случае мембранной хроматографии "конкурирующая адсорбция" означает более чем один компонент, связывающийся с мембраной при данном состоянии.
В случае мембранной хроматографии "хроматография с перегрузкой" относится к обеспечению конкурентной адсорбции к мембране и соединения, представляющего интерес, и примеси. Мембрану загружают сверх связывающей способности соединения. Воспользовавшись дифференциальной прочностью связывания соединения и примеси, при том, что примесь связывается намного сильнее, соединение вытесняется примесями, десорбируется из мембраны и поступает в элюат мембраны.
"Вытеснительная хроматография" относится к способу хроматографии, в котором образец помещают в колонку или мембрану, а затем вытесняют его с помощью растворенного вещества, которое адсорбируется сильнее, чем компоненты исходной смеси. В результате, компоненты растворяют в последовательных "прямоугольных" зонах высококонцентрированных чистых веществ, а не "пиках", разделенных растворителем. Tugcu (1994) Methods in Molecular Biology: Vol 421 Affinity Chromatography: Methods and Protocols pp 71-89. По сравнению с другими видами хроматографии, могут быть достигнуты более высокая концентрация продукта, более высокая чистота и увеличение пропускной способности. Вытеснительная хроматография является эффективным способом для очистки белков из сложных смесей при высоких загрузках колонок в различных применениях. Вытеснительная хроматография хорошо подходит для получения мг количества очищенных белков из сложных смесей с использованием стандартной хроматографической аналитической лабораторной колонки. Она помимо этого особенно хорошо подходит для обогащения сырье микрокомпонентами. Вытеснительную хроматографию возможно с легкостью осуществить с использованием различных систем смол, в том числе, ионобменной, HIC и RPLC. Freitag and Breier. (1995) J. Chromatogr. A 691, 101-112.
Фраза "смешанный режим" относится к сорбенту, который имеет возможность отделить соединений на основе двух различных механизмов, напр., разделения на основе различий в гидрофильности/гидрофобности между полипептидами, наложенных на разделение на основе суммарного заряда. Это часто осуществляется с помощью мультимодального лиганда, который может взаимодействовать с молекулой-мишенью несколькими различными способами, которые содержат ионное взаимодействие и связывание водорода или гидрофобное взаимодействие. Сорбенты, такие как GE Healthcare Capto™ ММС и Capto™ Adhere являются примерами хроматографических смол "смешанного типа".
"Объемный фильтр" представляет собой разновидность фильтра, который использует пористую фильтрующую среду, чтобы удерживать частицы во всей среде, а не только на поверхности среды. Эти фильтры обычно используют, если жидкость, которая подлежит фильтрации, содержит высокую нагрузку частиц, так как, по сравнению с другими типами фильтров, они могут удерживать большую массу частиц до того, как наступит засорение.
"Монолит" относят к хроматографической среде, которая состоит из пористой подложки, химически измененной для конкретного применения. Ионообменные монолиты, которые были разработаны в качестве альтернативы хроматографическим смолам, как правило, демонстрируют высокую проницаемость и небольшие расстояния диффузии, что выражается в лучшей массопередаче и более низком давлении, что позволяет использовать их при более высоких скоростях потока и/или более коротком времени пребывания.
Способы реализации настоящего изобретения
Настоящее изобретение по данному документу обеспечивает способы очистки полипептида из композиции (напр., водного раствора), содержащей полипептид и одно или более загрязняющее вещество. Композицию, как правило, получают в результате рекомбинантного получения полипептида, но, возможно, что в результате получения полипептида по пептидному синтезу, (или другим синтетическим способам) или полипептида, который может быть очищен из естественного источника полипептида. Предпочтительно полипептид представляет собой полипептид, который содержит область CH2/CH3. В предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения полипептид, который содержит область Сн2/Сн3 представляет собой антитело.
Рекомбинантное получение антител
В случае рекомбинантного получения полипептида, для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии в реплицируемый вектор выделяют и встраивают нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептидную последовательность. ДНК, кодирующую полипептид, легко выделяют и секвенируют, используя общепринятые способы (напр., с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела). Пригодными являются многие векторы. Компоненты вектора обычно содержат, но без ограничения ими, один или более из следующих компонентов: сигнальную последовательность, точку начала репликации, один или несколько маркерных генов, элемент-энхансер, промотор и последовательность завершения транскрипции (напр.,, как описано в патенте США 5534615, который специально содержится в данный документе в виде ссылки).
Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии ДНК в векторах в данном документе представляют собой прокариотические, дрожжевые или высшие эукариотические клетки. Подходящие прокариоты для этой цели содержат эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы, например, Enterobacteriaceae, такие как Escherichia, напр., Е. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, напр., Salmonella typhimurium, Serratia, напр., Serratia marcescans, и Shigella, также как Bacilli, такие как В. subtilis и В. licheniformis (напр., В. licheniformis 41P, описанные в DD 266710, опубликованном 12 апреля 1989), Pseudomonas, такие как Р. aeruginosa и Streptomyces. Одним предпочтительным носителем для клонирования Е. coli является Е. coli 294 (АТСС 31446), хотя другие штаммы, такие как Е. coli В, Е. coli X1776 (АТСС 31537) и Е. coli W3110 (АТСС 27325) также являются подходящими. Эти примеры являются иллюстративными, а не ограничивающими.
Кроме прокариотов, подходящими клонирующими или экспрессирующими хозяевами для векторов, кодирующих антитело, являются эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи. Среди низших эукариотических микроорганизмов-хозяев наиболее часто используют Saccharomyces cerevisiae или обычные пекарские дрожжи. Тем не менее, некоторое количество или родов, видов и штаммов являются общедоступными и применимы в данном документе, например, Schizosaccharomyces pombe; носители Kluyveromyces, такие как, напр., K. lactis, K. fragilis (АТСС 12424), K. bulgaricus (АТСС 16045), K. wickeramii (АТСС 24178), K. waltii (АТСС 56500), K. drosophilarum (АТСС 36906), K. rmotolerans и K. marxianus; yarrowia (ЕР 402226); Pichia pastoris (ЕР 183070); Candida; Trichoderma reesia (ЕР 244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, такие как Schwanniomyces occidentalis; и filamentous fungi, такие как, напр., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium и носители Aspergillus, такие как A. nidulans и A. niger.
Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного полипептида получают из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных содержат клетки растений и насекомых. Были определены многочисленные бакуловирусные штаммы, варианты и соответствующие пермиссивные инсектиционные клетки-хозяева таких носителей, как Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedes aegypti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (плодовая мушка) и Bombyx mori. Разнообразие вирусных штаммов для трансфекции являются общедоступными, напр., вариант L-1 Autographa californica, штамм Bm-5 Bombyx mori NPV, и такие вирусы, в соответствии с настоящим изобретением, согласно данному документу могут быть использованы в качестве вируса, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. Помимо этого в качестве носителей можно использовать культуры растительных клеток хлопка, кукурузы, картофеля, сои, петунии, помидора и табака.
Тем не менее, больше интерес проявляют клетки позвоночных, а размножение клеток позвоночных в культуре (культуре ткани) стало рутинной методикой. Примеры полезных млекопитающих линий клеток-хозяев содержат, но не ограничиваются ими, клетки CV1 почек обезьяны, трансформированные с помощью SV40 (COS-7, АТСС CRL 1651); эмбриональные клетки почки человека (293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture, Graham и соавт., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); клетки почки новорожденного хомяка (ВНК, АТСС CCL 10); клетки яичника китайского хомячка/-DHFR (СНО, Urlaub и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); фолликулярные клетки яичка мыши (ТМ4, Mar, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почек обезьян (CV1 АТСС CCL 70); клетки почек африканских зеленых мартышек (VERO-76, АТСС CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, АТСС CCL 2); клетки почек собаки (MDCK, АТСС CCL 34); клетки почек крысы линии Buffalo (BRL 3A, АТСС CRL 1442); альвеолярные клетки человека (W138, АТСС CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, НВ 8065); опухоль молочной железы мышей (ММТ 060562, АТСС CCL51); клетки TRI (Маг и соавт., Annals NY. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4; и клетки гепатомы человека (Hep G2). Зачастую, клетки СНО являются предпочтительными для экспрессии антител и могут быть преимущественно использованы для получения антител, очищенных в соответствии с настоящим изобретением.
Клетки-хозяева трансформируют описанными выше экспрессирующими или клонирующими векторами для получения полипептида и культивируют в обычных питательных средах, модифицированных соответствующим образом для индукции промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих нужные последовательности.
Клетки-хозяева, используемые для получения полипептида согласно настоящему изобретению, можно культивировать в различных средах. Для культивирования клеток-хозяев подходят такие коммерчески доступные среды, как Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma). Кроме того, любой из сред описана в Ham и соавт., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes и соавт., Anal. Biochem. 102:255 (1980), патенты США №4767704; 4657866; 4927762; 4560655; или 5122469; WO 90/03430; WO 87/00195; или в качестве культуральной среды для клеток-хозяев используют патент США Re. 30985. Любой из этих сред могут быть дополнены, при необходимости, гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлорид натрия, кальция, магния и фосфат), буферами (такими как HEPES), нуклеотидами (такими как аденозин и тимидин), аминогликозидными антибиотиками (такими как гентамицин), микроэлементами (определяемыми как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях в микромольном диапазоне), глюкозой или эквивалентным источником энергии. В соответствующих концентрациях также могут содержаться любые другие необходимые добавки, которые известны специалистам в данной области техники. Условия культивирования, такие как температура, рН, и т.п., соответствуют тем, которые использовались по отношению к клетке-хозяину, ранее выбранной для экспрессии, и будут очевидны специалисту в данной области.
При использовании рекомбинантных способов, полипептид может быть получен внутриклеточно, в периплазматическом пространстве или непосредственно секретируется в среду. Если полипептид получают внутриклеточно, в качестве первого этапа, удаляют нерастворимый дебрис, либо клеток-хозяев, либо лизированных клеток (напр., в результате гомогенизации), например, центрифугированием или ультрафильтрацией. Если полипептид секретируется в среду, супернатанты из таких систем экспрессии могут быть сконцентрированы с использованием коммерчески доступного фильтра для концентрирования белков, например, устройство ультрафильтрации Amicon или Millipore Pellicon.
В одном из аспектов настоящего изобретения предполагают воздействие гентамицина на колонки СЕХ. Гентамицин и другие аминогликозидные антибиотики могут использовать в качестве бактерицидной добавки при применениях клеточной культуры для предотвращения появления неустойчивых примесей. При добавлении к культуре клеток она должна быть удалена как производственная примесь. Типичное удаление осуществляется с помощью этапа аффинной хроматографии, однако, в некоторых способах этап аффинности может не быть первым этапом очистки.
Как катионный аминогликозидный антибиотик, гентамицин является положительно заряженным на уровне нейтрального значения рН или ниже. Если колонка СЕХ является первым этапом хроматографии, то с целью связывания представляющего интерес полипептида при уровне нейтрального рН или ниже, гентамицин будет конкурировать при связывании сайтов на колонке. Предыдущие исследования показали, что гентамицин связывается с мембраной СЕХ или смолой сильнее, чем антитело, влияние на колонку СЕХ представляет собой очевидное уменьшение способности к связыванию антитела.
По еще одному аспекту настоящего изобретения предполагается воздействие полиэтиленимина (PEI) или других катионньгх полимеров на колонки СЕХ. PEI может быть использован в качестве флокулирующего средства перед сбором клеток в способах очистки полипептида E. coli. Если PEI добавляют после этапа гомогенизации клеток, он действует в качестве связующего вещества загрязнения и делает и центрифугирование, и фильтрацию, более устойчивыми способами. Проблемы в связи с тем, что содержится этот этап, являются следствием каких-либо дополнительных PEI, которые не используют для флокуляции примесей, потому что тогда они остаются в очистных емкостях, которые, в конечном итоге, вступают в контакт с колонками СЕХ.
Существует много различных форм PEI, изменяющиеся в диапазоне от линейных до разветвленных полимеров, и они могут содержать первичные, вторичные или третичные амины. Форма PEI является не настолько важной, как то, что она является положительно заряженной при большинстве условий обработки. Поэтому с колонкой СЕХ он будет связываться очень сильно. Кроме того, первым этапом хроматографии для большинства белков E. coli может быть колонка СЕХ, ввиду ее относительно высокой связывающей способности. Кроме того, из-за сильного связывания колонки СЕХ с PEI, иногда требуется использование более слабой колонки СЕХ, для того, чтобы элюировать PEI с колонки после каждого запуска.
Предыдущие исследования показали, что если для флокуляции используют различные уровни PEI, связывающая способность колонки СЕХ будет увеличиваться по мере использования более низких уровней PEL Также было отмечено, что выход на этапе хроматографии СЕХ будет увеличиваться при более низком уровне PEI при нагрузке.
Использование одинаково заряженных ионообменной мембраны перед ионообменной колонкой для уменьшения примесей может привести к увеличению связывающей способности, выхода, клиренса загрязнения, которые могут обеспечить большую эффективность способа и снижение эксплуатационных затрат.
Способ ионообменной мембранной хроматографии по настоящему изобретению
В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения композиция, которую подвергают способу очистки по данному документу, представляет собой рекомбинантно полученный полипептид, предпочтительно интактное антитело, экспрессированное рекомбинантной культурой клеток-хозяев яичника китайского хомячка (СНО) или E. coli. Необязательно, перед мембранной ионообменной хроматографией композицию подвергают по меньшей мере одному этапу очистки. Композиция содержит представляющий интерес полипептид и одно или более загрязняющее вещество, такое как клетки яичника китайского хомячка (CHOP); белки E. coli (ЕСР); выщелоченный протеин А; нуклеиновая кислота; вариант, фрагмент, агрегат или производное желаемого антитела; другой полипептид; эндотоксин; вирусное загрязняющее вещество; аминогликозидные компоненты антибиотиков (напр., гентамицин); или ионный полимер, добавленный в процессе очистки (напр., полиэтиленимин (PEI), поливиниламин, полиаргинин, поливинилсульфоновая кислота, полиакриловая кислота) и т.д.
Примеры дополнительных методик очистки, которые могут выполнять до, во время или после способа мембранной ионообменной хроматографии, содержат фракционирование с помощью гидрофобной хроматографии (напр., на PHENYL-SEPHAROSE™), осаждение этанолом, термическое осаждение, осаждение полиэтиленгликолем (ПЭГ), изоэлектрофокусирование, ВЭЖХ с обращенной фазой, хроматография на силикагеле, хроматография на HEPARIN SEPHAROSE™, анионообменная хроматография, катионообменная хроматография, ионный обмен смешанного типа, хроматофокусирование, SDS-PAGE, осаждение сульфатом аммония, хроматография на гидроксиапатите, гель-электрофорез, диализ, хроматография на основе индукции заряд гидрофила, высокоэффективная ангенциальная поточная фильтрация (HPTFF) и аффинная хроматография (напр., с использованием протеина А, протеина G, антитела или определенного субстрата, лиганда или его антигена в качестве захватывающего реагента).
При использовании рекомбинантных способов, полипептид может быть получен внутриклеточно, в периплазматическом пространстве или непосредственно секретируется в среду. Если полипептид получают внутриклеточно, в качестве первого этапа, нерастворимый дебрис, либо клеток-хозяев, либо лизированных клеток, удаляют, например, центрифугированием или ультрафильтрацией. Если полипептид секретируется в среду, рекомбинантные клетки-хозяева могут быть отделены от клеточной культуральной среды, например, центрифугированием или фильтрацией.
В случае выделения антител, основная очистка происходит во время аффинной хроматографии протеина А, если его применяют в качестве первого этапа. Протеин А представляет собой бактериальный белок клеточной стенки, который специфически связывается с областью Fc антитела. Когда происходит иммобилизация в хроматографической среде, протеин А обеспечивает способ очистки рекомбинантных антител, поскольку он может избирательно связывать антитела в комплексные электролиты, позволяя примесям проходить сквозь.
Основная схема действий аффинной колонки с протеином А проста: связывает около нейтрального рН и вымывает в кислой среде. Белок, иммобилизованный на твердой фазе, используют для очищения полипептида, содержащего область CH2/CH3. Твердая фаза предпочтительно представляет собой колонку, которая содержит стекло, кремнезем, агарозу или полистиролдивинилбензольную поверхность для иммобилизации протеина А. Предпочтительно твердая фаза представляет собой стекляннуя колонку с контролируемым размером пор, колонку с кремневой кислотой или высокосшитую агарозную колонку. Колонка Mabselect SuRe™, коммерчески доступная от GE Healthcare, является примером высокосшитой агарозной колонки протеина А, эффективной при очистки антител. Иногда, колонку, в попытке предотвратить неспецифическое присоединение к колонке, покрывают реагентом, таким как глицерин. Колонка PROSEP А™, коммерчески доступная от Millipore Corporation, является примером стеклянной колонки с протеином А с контролируемым размером пор, покрытой глицерином. Твердую фазу в хроматографии с протеином А уравновешивают подходящим буфером.
Загрязненный препарат получают из рекомбинантных клеток-хозяев, загруженных на твердую фазу, уравновешенную с помощью загрузочного буфера, который может быть таким же, как уравновешивающий буфер. Также как загрязненный препарат проходит через твердую фазу, полипептид адсорбируется с иммобилизованным протеином А, а другие загрязняющие вещества (например, белки клеток яичника китайского хомячка, CHOP, при чем полипептид получают в клетке СНО, гентамицин и полиэтиленимин (PEI)) неспецифически связываются с твердой фазой.
Следующий этап выполняют последовательно, что влечет за собой удаление загрязняющих веществ, связанных с твердой фазой промывкой твердой фазы раствором, содержащим на промежуточном этапе промывки соль, аминокислоту и/или гидрофобный раствор электролита. В предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения соль в этом промывании представляет собой фосфат калия, аминокислота представляет собой аргинин, а гидрофобный электролит представляет собой ТЕМАС и/или ТЕАС. Хоть в промывании может принимать участие одно растворенное вещество, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения могут использовать два или более подобные растворенные вещества. Растворенное вещество(а) предпочтительно добавляют в рН буферный раствор, который имеет рН около нейтрального.
После промежуточного этапа промывания, соответствующего предыдущему пункту, из колонки извлекают представляющий интерес полипептид. Обычно это осуществляют с помощью подходящего элюирующего буфера. Полипептид могут, например, элюировать из колонки с использованием элюирующего буфера, имеющего низкий рН, напр., в диапазоне от около 2 до около 5 и предпочтительно в диапазоне от около 2,5 до около 3,5. Примеры элюирующих буферов для этой цели, содержат цитратные или ацетатные буферы.
Мембранную ионообменную хроматографию осуществляют таким образом, как заявлено в данном документе. Первым выбором, который должен быть сделан, является либо анионобменная, либо катионообменная мембрана, которую будут использовать. Хоть изоэлектрическая точка (pI) некоторых антител лежит в диапазоне от приблизительно 6,7 до 9,4, pI многих антител является высоким (часто >8, а иногда и >9). В общем, катионообменную мембрану могут использовать для антител с pI более около 8, и могут использовать анионообменную мембрану в случае антител с pI менее около 8.
Для работы мембранной катионообменной хроматографии в режиме перегрузки, рН материала нагрузки доводят до от около 1 до около 5 единиц рН ниже pI антитела, проводимость материала нагрузки доводят до ≤ около 40 мСм/см, в зависимости от рН и, затем закачивают антитела сквозь мембрану. В некоторых вариантах реализации значение рН материала нагрузки доводят на от около 1 до около 4 единиц рН, на от около 1 до около 3 единиц рН, на от около 1 до около 2 единиц рН или на около 1 единицу рН ниже pI антитела. В других вариантах реализации настоящего изобретения проводимость материала нагрузки доводят до ≤ около 20 мСм/см или ≤ около 10 мСм / см, в зависимости от рН. Поскольку рН нагрузки меньше pi антитела, антитело (которое стало положительно заряженным) НЕ будет возвращаться в первоначальное состояние. Скорее, антитело будет электростатически связанным с отрицательно заряженными функциональными группами катионообменной смолы. Это потому, что антитело (положительный) и мембрана (отрицательный) имеют противоположный заряд. Так как pI многих загрязняющих веществ, напр., белки клетки-хозяина, такие как CHOP или ЕСР, аминогликозидов, таких как гентамицин и ионные полимерные добавки, такие как полиэтиленимин (PEI), которые вымываются с антителом во время аффинной хроматографии с протеином А, лишь немного отличается от pI антитела, то pI могут отличаться только на от около 0,05 до около 0,2 единиц pI, такие загрязняющие вещества, как "основные" антитела, также связываются с мембраной. В схемах очистки, где не используется хроматография с протеином А, гентамицин, PEI, или другие примеси остаются в достаточно высокой концентрации, чтобы нарушить работу колонки IEX, если не используют мембрану. Без связи с теорией, представляется, что в случае мембранной катионообменной хроматографии, которая работает в режиме перегрузки, при условиях рН и проводимости, которые индуцируют заряд с минимальным ионным экранированием, происходит конкурентоспособная адсорбция и загрязняющие вещества преимущественно связываются с мембраной или иным образом эффективно "вытесняют" антитело из мембраны (RR Drager, FE Regnier, J Chromatogr. 359:147-55 (1986)), позволяя антителу "вымываться" из матрицы или потока после связывания и восстанавливаться в элюате.
Для работы мембранной анионообменной хроматографии в режиме перегрузки, рН материала нагрузки доводят до от около 1 до около 5 единиц рН выше pI антитела, проводимость материала нагрузки доводят до ≤ около 40 мСм/см, в зависимости от рН и затем закачивают антитела сквозь мембрану. В некоторых вариантах реализации значение рН материала нагрузки доводят на от около 1 до около 4 единиц рН, от около 1 до около 3 единиц рН, от около 1 до около 2 единиц рН или на около 1 единицу рН выше pI антитела. В других вариантах реализации настоящего изобретения проводимость материала нагрузки доводят до ≤ около 20 мСм/см или ≤ около 10 мСм / см, в зависимости от рН. Поскольку рН нагрузки больше pI антитела, антитело (которое стало отрицательно заряженным) не будет возвращаться в первоначальное состояние. Скорее, антитело будет электростатически связанным с положительно заряженными функциональными группами катионообменной смолы. Это потому, что антитело (отрицательный) и мембрана (положительный) имеют противоположный заряд. Так как pI многих загрязняющих веществ, напр., белков клетки-хозяина, таких как CHOP, которые вымываются с антителом во время аффинной хроматографии с протеином А, лишь немного отличается от pI антитела, то pI могут отличаться только на от около 0,05 до около 0,2 единиц pi, такие загрязняющие вещества, как "кислые" антитела, также связываются с мембраной. Без связи с теорией, представляется, что в случае мембранной анионообменной хроматографии, которая работает в режиме перегрузки, при условиях рН и проводимости, которые индуцируют заряд с минимальным ионным экранированием, происходит конкурентоспособная адсорбция и загрязняющие вещества преимущественно связываются с мембраной или иным образом эффективно "вытесняет" антитело из мембраны (RR Drager, FE Regnier, J Chromatogr. 359:147-55 (1986)), позволяя антителу "вымываться" из матрицы или потока после связывания и восстанавливаться в элюате.
В одном примере мембранную хроматографию осуществляют как на стандартной хроматографической системе, так и в оригинальной хроматографической системе, такой как АКТА™ Explorer (GE Healthcare), снабженной манометрами, датчиками и насосами с контроллерами насосов. В этом примере мембранное устройство устанавливают ниже по потоку относительно манометра. В указанном примере детекторы рН и проводимости устанавливают ниже по потоку от мембранного устройства. В продолжение этого примера, систему тщательно промывают водой, а затем уравновешивают буфером перед установкой мембраны. В дальнейшем в этом примере, систему с мембраной промывают уравновешивающим буфером до тех пор, пока рН раствора и проводимость на выходе не соответствуют спецификации уравновешивающего буфера (около пяти объемов мембраны) и не наблюдается стабильный исходный уровень. Продолжая далее в этом примере, исходный материал загружают с помощью насоса на 333-2667 MV/час, рН 5,5 (для очистки гипотетического "основного" антитела) или рН 8,0 (для очистки гипотетического "кислого" антитела) и проводимость приблизительно 4 мСм/см. Продолжая еще дальше в этом примере, записывают изменения в процессе эксплуатации операционного обратного фильтрационного давления, рН и проводимости. Наконец, в этом примере полипептид в мембранном элюате собирают сразу же после того, как след ультрафиолетового (УФ) поглощения при 280 нм составляет 0,2 единицы оптической плотности выше исходного уровня. После загрузки исходного материала, мембрану промывают соответствующим промывочным буфером, и сбор в емкость останавливают после того, как УФ след при 280 нм не превышает 0,2 единицы оптической плотности, а в образцах из емкости во фракции элюата мембраны анализируют концентрацию полипептида, уровень димеров/агрегации, белки клетки-хозяина, ДНК и выщелоченный протеин А. Этап восстановления, как правило, рассчитывают с использованием загруженного полипептида и полипептида в элюате мембраны. Обычно используют только одноразовую мембрану. Что касается химико-аналитических анализов, содержание полипептида (концентрация полипептид) может быть определено по поглощению при 280 нм с использованием спектрофотометра Beckman. Агрегация полипептида может быть определена с помощью гель-хроматографии. Уровни белка клетки-хозяина, напр., CHOP или ЕСР, могут быть проанализированы с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). ДНК клетки-хозяина может быть количественно определено с помощью использования TaqMan PCR (полимеразной цепной реакции). Выщелоченный белок может быть получен с использованием иммунохимического способа на основе ELISA, рекомендованного поставщиком смолы с протеином А. Гентамицин возможно анализировать с помощью ELISA и полиэтиленимина (PEL), их уровни оценивают количественно с помощью хроматографии с помощью Q Sepharose Fast Flow или ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
Следующие буферы гипотетически разработаны и испытаны для использования с мембраной S: (1) 89 мМ уксусная кислота, 127 мМ трис-основание, 21 мМ лимонная кислота, рН 5,5, 6,0 мСм/см, (2) 28 мМ MES, 95 мМ NaCl, рН 6,0, 11 мСм/см, (3) 200 мМ NaOAc, рН 5,5, 12 мСм/см, (4) 100 мМ NaOAc, рН 5,5, 6,4 мСм/см, (5) 96 мМ уксусная кислота, 65 мМ TRIS, рН 5,0, 3,6 мСм/см, (6) 25 мМ MOPS, рН 7,1, 0,8 мСм/см, (7) 50 мМ HEPES, 90 мМ NaCl, рН 7,0, 10 мСм/см, (8) 0,5х фосфатно-солевой буфер (PBS), 4,5 мМ уксусная кислота, рН 5,0, 8,0 мСм/см, 25 мМ NaOAc, рН 5,0, 6,0 мСм/см.
Следующие буферы гипотетически разработаны и испытаны для использования с мембраной Q: (1) 50 TRIS, 15 мМ NaCl, рН 8,0, 4,3 мСм/см, (2) 25 мМ TRIS, рН 8,0, 1,3 мСм/см, (3) 60 мМ TRIS, 118 мМ NaCl, рН 8,0, 15,7 мСм/см, (4) 50 мМ TRIS, 50 мМ NaOAc, рН 8,0, 7,0 мСм/см, (5) 25 мМ HEPES, 85 мМ NaOAc, рН 7,0, 6,5 мСм/см, и (6) 91 мМ уксусная кислота, 130 мМ TRIS, рН 8,0, 5,0 мСм/см, (7) 75 мМ глицин, 9 мМ фосфорная кислота, 115 мМ Трис, рН 8,9, 0,8 мСм/см (8) 25 мМ TRIS, 5 мМ NaCl, рН 8,9, 1,0 мСм/см. (9) 25 мМ TRIS, 10 мМ NaCl, рН 9,0, 1,5 мСм/см, (10) 1х фосфатно-солевой буфер (PBS), рН 7,3, 15,2 мСм/см.
Кроме того, любая буферная система может увеличивать или уменьшать рН при добавлении уксусной кислоты, лимонной кислоты, HEPES, соляной кислоты, фосфорной кислоты, гидроксида натрия, TRIS или других подобных кислотных и основных буферов, для того, чтобы достичь подходящее значение рН. Любая буферная система также может увеличивать или уменьшать проводимость с использованием очищенной воды, воды для инъекций (WFI), ацетата натрия, хлорида натрия, фосфата калия или другого подобного буфера с низким и высоким содержанием соли, для того, чтобы достичь подходящую проводимость.
Развитие конкурентного этапа адсорбции мембранной хроматографии содержит пропускание материал нагрузки сквозь мембрану при различных уровнях рН и проводимости. Сохранение полипептида, либо представляющего интерес полипептида или примеси, может быть повышена, если молекула имеет большое электростатическое взаимодействие. Электростатические взаимодействия могут быть повышены при работе в условиях, если полипептиды являются высокозаряженными, напр., если используют буфер с рН, который достаточно отличается от pI полипептида, повышение заряда полипептида и низкую ионную силу для того, чтобы предотвратить экранирование зарядов буферными ионами. В отличие от этого, электростатические взаимодействия могут быть уменьшены при работе в условиях, если полипептиды являются слабозаряженными, напр., если используют буфер с рН, который достаточно близок к pI полипептида, уменьшения заряда полипептида и высокой ионную силу для того, чтобы обеспечить экранирование зарядов буферными ионами. В результате, полипептиды, которые имеют различные физико-химические свойства, могут быть разделены с помощью адсорбции на мембране за счет оптимизации буферного раствора. Некоторые молекулы могут удерживаться на данной мембране, в то время как остальные проходят сквозь, что основано на соответствующем выборе рН и ионной силы буфера.
Получение полипептида, осуществленное в соответствии со способом мембранной ионообменной хроматографии по данному документу, при необходимости подвергают дополнительным этапам очистки. Иллюстративные дополнительные этапы очистки были рассмотрены выше.
Как показано на Фигуре 1, отдельный пример успешной схемы очистки антитела представляет собой способ восстановления, который влечет за собой этап начального захвата аффинной хроматографии с протеином А, после чего используют катионообменную колонку в режиме связывания и элюции с последующим конечным этапом или этапами финишной обработки.
Как показано на Фигуре1, отдельный пример усовершенствованной схемы очистки антитела представляет собой способ восстановления, который влечет за собой этап начального захвата аффинной хроматографии с протеином А, с последующей работой катионообменной мембраны в режиме перегрузки, защищающем катионообменную колонку в режиме связывания и элюции, с последующим конечным этапом или этапами финишной обработки.
Как показано на Фигуре 1, еще один пример усовершенствованной схемы очистки представляет собой способ восстановления, который влечет за собой предварительную работу катионообменной мембраны в режиме перегрузки, защищающем катионообменную колонку в режиме связывания и элюции, с последующим конечным этапом или этапами финишной обработки.
Как показано на Фигуре 2, еще один пример эффективной схемы очистки в случае не антитела представляет собой способ восстановления, который влечет за собой этап начального захвата катионобменной хроматографии, с последующим этапом или этапами финишной обработки.
Как показано на Фигуре 2, еще один пример усовершенствованной схемы очистки представляет собой способ восстановления, который влечет за собой предварительную работу катионообменной мембраны в режиме перегрузки, защищающем катионообменную колонку в режиме связывания и элюции, с последующим конечным этапом или этапами финишной обработки.
В отличие от применений, в которых в первую очередь применяют мембраны IEX, в качестве единственного этапа очистка или этапа финишной обработки, мембраны по настоящему способу очистки в настоящее время используют для защиты одноименно заряженной ионообменной мембраны (напр., катионообменную мембрану размещают непосредственно перед катионообменной смолой). Это является выгодным, потому что мембраны являются более селективными по отношению к примесям, чем полипептиды/антитела, таким образом они снижают количество, или устраняют, примесей, которые идут на колонку. Примеси могут также смещать полипептид/антитело так, что он, в конечном счете, совершает свой путь на колонку. С вышеупомянутой колонкой мембраны могут использовать либо постоянно, либо с перерывами.
Использование мембран перед одинаково заряженной ионообменной колонкой в настоящем способе очистки может быть выгодно, при условии, что примеси в нагрузке снижают производительность катионообменной колонки. При удалении этих примесей с мембраной, она может позволить катионообменной колонки быть загруженной до более высокой связывающей способности, что приводит к уменьшению размера колонки или, в перспективе, к уменьшению количества циклов. Кроме того, с помощью удаления этих примесей с мембраной, это может позволить катионообменной колонке иметь увеличение выхода этапа, или иметь более длительный срок службы смолы, прежде чем утилизировать, или привести к снижению уровней загрязнения в катионообменной емкости, или уменьшить количество этапов финишной обработки ниже по потоку. Он также может позволить катионообменной колонке заменить аффинную колонку с протеином А, которая может быть выгодной, если является необходимым более дешевая альтернатива аффинной смоле с протеином А, или если представляющий интерес полипептид не будет связываться с аффинной смолой с протеином А. Использование катионообменной мембраны и катионообменной колонки в непрерывном режиме может быть выгодно ввиду уменьшения общего времени обработки, буферов или оборудования, такого как емкости или хроматографические системы.
Необязательно, полипептид по желанию конъюгирован с одной или более гетерологичной молекулой. Гетерологичная молекула может быть, например, такой, которая увеличивает время полураспада полипептида в сыворотке (напр., полиэтиленгликоль, PEG), или она может быть меткой (напр., ферментом, флуоресцентной меткой и/или радионуклидом) или цитотоксической молекулой (напр., токсином, химиотерапевтическим лекарственным средством или радиоактивным изотопом и т.д.).
Терапевтический состав, содержащий полипептид, необязательно конъюгированный с гетерологичной молекулой, может быть получен путем смешивания полипептида, имеющего требуемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизирующими средствами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в виде лиофилизированных композиций или водных растворов, "фармацевтически приемлемый" носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы в используемых дозах и концентрациях являются нетоксичными для реципиентов и содержат буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, которые содержат аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярный (менее чем около 10 остатков) полипептид; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, которые содержат глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (напр., Zn-белковые комплексы); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG).
Активные ингредиенты могут также заключать в микрокапсулы, получаемые, например, способами коацервации или путем межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозная или желатиновая микрокапсула и микрокапсула на основе поли(метилметакрилата), соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие способы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Состав, который будет использоваться для введения in vivo, должен быть стерильным. Это легко достигается путем фильтрации сквозь стерильные фильтрационные мембраны.
Могут быть получены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением содержат полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие полипептид, где матрицы находятся в виде формованных изделий, напр., пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением содержат сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γэтил-L-глутамат, недеградируемый этиленвинилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и ацетата лейпролида) и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота.
Полипептид очищают, как описано в данном документе, или композицию, которая содержит полипептид и фармацевтически приемлемый носитель, затем используют для различных диагностических, терапевтических или других целей, известных для таких полипептидов и композиций. Например, полипептид может быть использован для лечения заболевания млекопитающего путем введения млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида.
Следующий пример(ы) предложены в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения. Раскрытия всех цитирований в описании специально содержатся в данном документе в виде ссылок.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Внедрение
Это исследование фокусируется на очистки моноклональных антител с использованием ионообменных мембран в режиме конкурентной адсорбции для повышения эффективности колонок ниже по потоку. Поскольку мембраны, работающие в режиме конкурентной адсорбции, связывают многие примеси сильнее, чем моноклональные антитела или другие полипептиды, представляющие интерес, мембрана эффективно удаляет примеси, которые могут оказывать вредное воздействие на одинаково заряженную колонку ниже по потоку.
Этот подход является нелогичным для многих способов очистки, которые пытаются избавляться от избыточных этапов катионобменной или анионобменной очистки. В этом применении избыточная мембрана перед колонкой ниже по потоку может повысить производительность колонки так, что способ станет в общем более эффективным.
Для анализа, основанного на их молекулярном разнообразии, отбирают одну рекомбинантную ДНК, которая производит МКА, одну рекомбинантную ДНК, которая производит неполное антитело, и одну рекомбинантную ДНК, которая производит полипептид. mAb получают в клеточных культурах СНО и различают по степеням очистки, начиная с отсутствия хроматографической очистки, до трех хроматографических этапов на колонке (с протеином А, анионообменный и катионообменный). Неполное антитело получают в клеточных культурах E. coli и очищают на этапе хроматографии с протеином А. Полипептид получают в клеточных культурах E. coli и без предварительной хроматографической очистки. Потоки исходных материалов выбирают на основе остаточных уровней примесей, которые могут отрицательно влиять на хроматографическую колонку.
Это исследование изучает способность примесей, таких как гентамицин и полиэтиленимином (PEI), негативно влиять на ионообменные колонки и способность ионообменных мембран, таких как Mustang™ S и Natrix S, для того чтобы очистить эти примеси, что приведет к повышению производительности колонки.
Материалы и способы
Поток исходных материалов
Потоки исходных материалов берут из промышленных, опытных или малогабаритных партий клеточных культур (Genentech Inc., Южный Сан-Франциско, Калифорния), первоначально созданных для коммерческих или исследовательских целей. Потоки исходных материалов имеют различные степени очистки, то есть клетки разделяют и очищенную жидкость очищают или не очищают на по меньшей мере одном этапе хроматографии на колонке. Каждый поток исходных материалов содержит требуемый терапевтический полипептид и определяемый количественно уровень примесей. Состав каждого исходного потока изменяют в зависимости от конкретного способа и уровня очистки полипептида. Таблица 1 демонстрирует характеристики потока исходных материалов каждого из антител, полипептидов, или одновалентных антител, используемых в настоящем исследовании.
Определение количества полипептида
Концентрацию полипептида определяют с использованием трех способов. Если уровни примесей являются слишком низкими, чтобы иметь заметное влияние на УФ-поглощение, используют УФ-спектрофотометрическое сканирование при 280 и 320 нм. Если уровень примесей или цвет имеют заметное влияние на УФ-поглощение, для количественного определения концентраций антител или полипептидов используют, соответственно, аналитическую аффинную колонку или ионообменную колонку.
В случае образцов, испытанных с помощью УФ-спектрофотометрического сканирования, образцы, содержащие полипептид, разбавляют соответствующим неинтерферирующим разбавляющим веществом в диапазоне от 0,1 до 1,0 ЕОП. Пробоподготовку и спецификацию показаний сканирования проводят дважды и фиксируют среднее значение. Коэффициент поглощения протестированных полипептидов составляет от 1,45 до 1,70 (мг/мл)-1см-1. Для расчета концентрации mAb с использованием уравнения, известного как закон Бэра-Ламберта используют оптическую плотность при 280 и 320 нм, коэффициент разбавления, длину пути (1 см) и коэффициент ослабления абсорбции.
Для образцов, испытанных на аналитических аффинных колонках, образцы, содержащие антитело, в случае необходимости разбавляют соответствующим неинтерферирующим разбавителем в диапазоне от 0,025 до 4,0 мг/мл. С другой стороны, объем инъекции может быть в два раза больше или в два раза меньше наиболее низких или наиболее высоких образцов концентраций, соответственно. Подготовка образцов и исследование HPLC выполняют дважды и записывают среднее значение. Так же, как в случае HPLC анализа генерического антитела, результаты концентрации образца для специфических антител корректируют с помощью соответствующего коэффициент ослабления абсорбции против коэффициента ослабления абсорбции соответствующих материалов антитела.
В случае образцов, испытанных на аналитической ионообменной колонке, образцы, содержащие полипептид, в случае необходимости разводят соответствующим неинтерферирующим разбавителем в интервале от 0,1 до 0,8 мг/мл. Подготовка образцов и исследование HPLC выполняют дважды и записывают среднее значение. Результаты концентрации образца определяют интегрированием площади под пиком инъекции и коррелированием со стандартной кривой с использованием справочного материала.
Определение количества белков клетки-хозяина СНО (CHOP)
Для количественной оценки уровней CHOP используют твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Аффинно очищенные анти-СНОР антитела козы иммобилизируют в лунках микротитрационного планшета. Растворы образцов, содержащих СНО, стандарты и контроли, инкубируют в лунках, с последующей инкубацией с анти-СНОР антителами козы, конъюгированными с пероксидазой из хрена. Ферментативную активность пероксидазы из хрена определяют с помощью дигидрохлорида о-фенилендиамина. CHOP определяют количественно путем считывания оптической плотности при 492 нм в спектрофотометре для прочтения микротитрационных планшетов. Для создания стандартной кривой и автоматического расчета концентрации образца используют компьютерную программу построения кривой. Диапазон результатов количественного анализа в случае ELISA обычно составляет от 5 нг/мл до 320 нг/мл. Для каждого образца анализируют 2-4 разведения и усредняют значения. Количества CHOP делят на концентрацию белка, и результаты представляют в миллионных долях (нг СНОР/мг белка).
Определение количества белков Е. Coli (ЕСР)
Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) для количественной оценки уровней ЕСР используют таким же образом, как и для количественного определения CHOP.
Определение количества гентамицина
Для количественной оценки уровней гентамицина используют твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Поликлональные антитела козы к гентамицину-BSA иммобилизуют в лунках микротитрационного планшета. При связывании с антителом, гентамицин конкурирует с биотин-гентамицином. Количество связанного биотин-гентамицина измеряют пероксидазой хрена-стрептавидином, ферментативная активность которой обнаружена по отношению к тетраметилбензидину (ТМВ). Образцы разводят в разбавляющем веществе для анализа ELISA в соответствии с приемлемым разбавлением образца, установленном при определении образца. Гентамицин определяют количественно путем считывания оптической плотности при 450 нм в спектрофотометре для прочтения микротитрационных планшетов. Для создания стандартной кривой и автоматического рассчета концентрации образца используют компьютерную программу построения кривой с минимум 4 параметрами. Как правило, диапазон результатов в случае стандартной кривой в анализе гентамицина составляет от 0,58 нг/мл до 90 нг/мл. Для каждого образца анализируют 2-4 разведения и усредняют значения. Количества гентамицина разделяют на концентрацию белка и результаты представляют в единицах частей на миллион (нг гентамицина/мг белка).
Определение количества полиэтиленимина
Все данные записаны на спектрометре Bruker 600 MHz, снабженном криозондом TCI, оборудованным градиентом в 5 мм, и автоматическим пробоотборником. Данные получают с помощью последовательности импульсов спинового эха, предназначенной для сведения к минимуму резонансных сигналов от белка в растворе. Возбуждение, определяющее последовательность импульсов, в сочетании с последовательностью импульсов предварительного насыщения получают для того, чтобы минимизировать резонансный сигнал воды в растворе. До измерений по способу ЯМР, ко всем образцам добавляют D2O до конечной концентрации 10% (630 мл пробы +70 мл D2O).
Количественный анализ NMR представляет собой общий аналитический способ и может быть применен к исключительно большому числу органических молекул. Как правило, каждая молекула имеет уникальный набор сигналов NMR с характерными резонансными частотами, относительными пиковыми интенсивностями, ширинами линий и взаимосвязанными паттернами. Единственным критерием пригодности анализа NMR для определения концентрации небольших молекул, содержащих протон, состоит в том, что сигнал NMR анализируемого вещества и компонентов буфера не перекрываются. Анализ NMR является точным и обладает высокой точностью в широком диапазоне концентраций анализируемого вещества (например, от 1 мкг/мл до 154500 мкг/мл в случае пропиленгликоля).
Хроматографические мембраны
Испытываемыми мембранами являются Mustang™ S (Pall Corporation, East Hills, Нью Йорк) и Natrix S (Natrix Separations, Burlington, Канада). Mustang™ S и Natrix S представляют собой сильные катионообменные мембраны, которые эффективно связывают положительно заряженные белки и вирусные частицы. Mustang™ S изготовлена из полиэфирсульфона (PES) с 0,8 мкм порами и модифицирована образованием сульфоновой кислоты. Мембрана Natrix S состоит из полимерного гидрогеля, образованного внутри гибкой пористой матрицы носителя. Матрица носителя обеспечивает механическую прочность, тогда как свойства гидрогеля определяют химический состав для разделения продукта. Для увеличения связывающей способности производитель может объединить несколько слоев мембраны в каждом устройстве. Общее количество слоев и толщина варьируются в зависимости от производителя и размера устройства, которое изготавливают.Объем мембраны (MV) представляет собой физический объем мембраны (твердых и пустых) и измеряется в единицах мл. В данном исследовании используют множество мембранных устройств, представляющих различные масштабы. В Таблице 2 приведены соответствующие спецификации для каждой испытанной мембраны.
Хроматографические смолы
Испытываемые смолы представляют собой Fractogel SE Hicap (EMD Chemicals Inc., Gibbstown, Нью джерси) и SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, Нью джерси). Смолы Fractogel SE Hicap и SP Sepharose Fast Flow являются сильными катионообменныеми смолами. Смола Fractogel SE Hicap состоит из сшитых полиметакрилатных частиц диаметром 40-90 мкм с размером пор около 800 А. Функциональный лиганд ковалентно связан частицой длинной линейной полимерной цепью. Смола SP Sepharose Fast Flow изготовлена из высокосшитую агарозных частиц диаметром 45-165 мкм с эксклюзионным пределом ~4000000 Да. Sepharose Fast Flow представляет собой сшитое производное Sepharose с сульфопропильным лигандом в качестве функциональной группы. Способ сшивания является собственностью производителя.
Системы очистки мембраны и смолы
Малогабаритные тесты проводят с АКТА Explorer™ 100 (GE Healthcare, Fairfield, Коннектикут), которая представляет собой систему очистки программируемого способа, которая содержит интегрированный насос-дозатор, датчик давления и встраиваемые рН-, проводимости и УФ-датчики. Система Explorer была запрограммирована и контролируется с помощью программного обеспечения UNICORN™ v5.10, работающего на компьютере (GE Healthcare, Fairfield, Коннектикут). Малогабаритные тесты выполняют также с помощью неавтоматизированной системы, которая содержит шланговый насос с цифровым режимом экономии Masterflex® L/S® (Cole Parmer, Vernon Hills, Иллинойс), встраиваемый датчик давления DTX™ Plus TNF-R (Becton Dickinson, Franklin Lakes, Нью-Джерси), и весы AND EK-1200i (A&D Company, Ltd., Tokyo, Япония). Весы используют для физического мониторинга скорости потока насоса путем измерения накопления массы. Массу преобразуют в объем при условии, что плотность потока исходных материалов составляет 1,0 г/мл. Давление со стороны встраиваемых преобразователей и массы на весах непрерывно контролируют с помощью системы сбора данных сети NetDAQ™ 2640А/41А (Fluke, Everett, Вашингтон), который связан с компьютером под управлением Trendlink™ в версии 3.1.1 (Canary Labs Inc., Martinsburg, Пенсильвания) и программного обеспечения RsCom в версии 2.40 (A&D Company, Ltd., Tokyo, Япония) для давления и сбора массы соответственно.
Способ сбора образцов, проходящих сквозь мембрану
Проточные образцы собирают тремя различными способами. Случайные образцы и фракции являются наиболее распространенными. Случайный образец представляет собой небольшую мгновенную аликвоту потока, взятую при конкретной пропускной способности. Фракции крупнее проточных образцов, и определяются с помощью диапазонов пропускной способности. Проточную пробу также собирают в виде одной большой емкости. Анализ емкости является эффективным, но случайные образцы и фракции, как правило, являются более полезными для мониторинга уровней mAb и примесей, потому что последовательные пробы могут быть объединены для демонстрации трендов.
Способы способностей к динамическому связыванию (DBC)
Способности к динамическому связыванию (DBC) мембран и смол определяют путем загрузки потока исходных материалов в среду при обычной скорости технологического процесса. Это предпочтительнее, чем позволить среде впитаться в поток исходных материалов нагрузки, что обычно делают для определения статической связывающей способности. В случае данного применения DBC является более подходящим показателем производительности сред. DBC определяют, учитывая случайные проточные образцы или фракции во время фазы нагрузки. Использование конкретной пропускной способности в случае случайных образцов или объема всех фракций и концентрации полипептида или примеси для всех случайных образцов или фракций позволяет создать диаграмму DBC. Кроме того, если известны концентрации полипептида или примесей в материале нагрузки, график может быть получен для сравнения концентрации фильтрата (С) с концентрацией нагрузки (С0). В этом случае значение С/С0 равное 0 указывает на то, что концентрация фильтрата значительно ниже, чем концентрация нагрузки, а значение С/С0 равное 1 указывает на то, что концентрация фильтрата совпадает с концентрацией нагрузки.
Экспериментальная часть
Сырье удаляют из холодильного оборудования (2-8°С или ≤70°С) и оставляют для уравновешивания до комнатной температуры. Затем необязательно, регулируют рН и/или проводимость при условиях, приведенных в Таблице 1, с использованием соответствующего средства для титрования (напр., 1,5 М Трис-основания или 1 М лимонной кислоты) или разбавителя (очищенная вода или 5 М хлорид натрия). После чего фильтруют в автономном режиме с использованием AcroPak™ 20 (Pall Corporation, East Hills, Нью-Йорк), AcroPak™ 1000 (Pall Corporation, East Hills, Нью Йорк) или 1000 мл вакуум-фильтра (Thermo Fisher Scientific, Rochester, Нью Йорк), чтобы удалить любые осадки, которые могли образоваться во время холодного хранения или регулирования температуры.
Система очистки получают с помощью промывания нагрузки и проточной линии с использованием очищенной воды или соответствующего буфера. Мембрану помещают в линию ниже по потоку от насоса подачи и датчика давления, а затем его промывают 50-500 MV очищенной воды или уравновешивающего буфера. После промывки, сырьевой поток наносят на мембрану и нагружают различные количества при постоянной скорости потока 333-2667 MV/час. Во время фазы нагрузки по мере необходимости из потока отбирают образцы. Затем, необязательно, мембрану очищают буфером для того, чтобы собрать остаточный продукт. Для поддержания удержания примесей на мембране очищающий (другими словами промывочный буфер) буфер по сравнению с сырьем в целом имеет аналогичное значение рН и имеет равную или меньшую проводимость.
Полученные случайные образцы мембраны, фракций или емкостей затем проанализируют для определения концентраций полипептида и/или примесей.
В некоторых случаях полученные мембранные емкости затем наносят на смолу. Хроматографию смолы выполняют только с использованием Äkta Explorer, чтобы УФ, рН и проводимость изменялась в режиме реального времени и накопление материала могло бы быть облегчено с помощью встраиваемого УФ-датчика. Во время фазы нагрузки по мере необходимости из потока отбирают образцы.
В некоторых случаях мембрану элюируют. Элюирование мембраны выполняют только с использованием Äkta Explorer, чтобы накопление материала могло быть облегчено с помощью встраиваемого УФ-датчика. Мембрану элюируют с использованием сильно минерализованный буфер (20 мМ ацетата натрия и 350 мМ хлорида натрия, рН 5,5). Кроме того, в некоторых случаях мембрану элюируют с градиентом двух буферов, (20 мМ ацетат натрия, 0 мМ хлорида натрия, рН 5,5 и 20 мМ ацетат натрия, 2000 мМ хлорида натрий, рН 5,5) от 0 до 100% за 20 мл.
В некоторых случаях смолу элюируют.Элюирование смолы выполняют только с использованием Äkta Explorer, чтобы накопление материала могло бы быть облегчено с помощью встраиваемого УФ-датчика. Смолы элюируют с использованием сильно минерализованного буферного градиента (от 50 до 500 мМ ацетата натрия, рН 5,5) или сильно минерализованного этап (50 мМ HEPES, 200 мМ хлорида натрия, 0,05% тринитротолуола, 1 мМ DTT, рН 7,5) при постоянной скорости потока 200 см/ч и собирают от 0,5-1,0 OD или 1,25-1,25 OD в случае Fractogel SE Hicap и SP Sepharose Fast Flow соответственно.
Результаты
Выход малогабаритной катионобменной мембраны
Анионообменная емкость MAb 1 при рН 8,0 и 5,0 мСм/см и анионообменная емкость mAb 1, которую доводили до рН 5,5 и 6,4 мСм/см с использованием 1М лимонной кислоты, обрабатывают мембраной Mustang™ S при 667 MV/час. Мембрана Mustang™ S использует 0,18 мл устройство Acrodisc®. Потоки исходных материалов mAb 1 при рН 5,5 и рН 8,0 оба ниже pi антитела, и, следовательно, являются положительно заряженными. Сырье и проточные случайные образцы анализируют на концентрацию антител. Хоть исходные образцы демонстрируют некоторое количество антител, связывающихся с мембраной, на Фигуре 3 продемонстрирован выход, который является аналогичным при обоих условиях рН, быстро возрастает при плотности нагрузки 1000 г/л, и ≥96% достижимо после плотности нагрузки приблизительно 5000 г/л.
Выход малогабаритной анионобменной мембраны
С целью сравнения для испытаний выбирают mAb 2 с использованием анионообменной мембраны выше изоэлектрической точки 7,7. Белки являются склонными к дезамидированию и агрегации при высокой рН, поэтому подобные тесты на mAb 1 не проводят.Катионообменную емкость при рН 5,5 и 9 мСм/см доводят до рН 8,0 с помощью 1,5 М трис-основания. Исходное сырье затем разделяют на три отдельные емкости и корректируют проводимость с использованием очищенной воды. Первая емкость имеет 10 мСм/см, вторую и третью емкость доводят до 7 мСм/см и 4 мСм/см, соответственно. Все три емкости поддерживают при рН 8,0. Каждый поток исходных материалов затем обрабатывают малогабаритной 0,35 мл Mustang™ Q при постоянной скорости потока 600 MV/час.mAb 3 при рН 8,0 на 0,3 единицы рН выше pI и поэтому антитела являются отрицательно заряженными. Нагрузку и проточные емкости анализируют на концентрацию антител. Фигура 4 иллюстрирует то, что выход является аналогичным при всех трех условиях рН, первоначально быстро растет при плотностью нагрузки 200 г/л, и составляет ≥96% при плотности нагрузки приблизительно 1000 г/л.
Клиренс загрязнения малогабаритной катионобменной мембраны
Для оценки клиренса загрязнения катионобменной мембраны, емкость mAb 3 с протеином А при рН 5,5 и 3,2 мСм/см обрабатывают сквозь более малогабаритную мембрану 0,18 мл Mustang™ S при постоянной скорости потока 1333 MV/час. Нагрузка mAb 3 составляет на 3,4 единицы ниже рассчитанной pI и поэтому антитела являются положительно заряженными. Нагрузка, проточные фракции и элюирующие образцы анализируют и результаты в случае CHOP проиллюстрированы на Фигуре 5. Данные показывают, что Mustang™ S изначально снижает CHOP от 438 до 109 частей на миллион. CHOP увеличивается до 318 частей на миллион, когда плотность нагрузки приближается к 55300 г/л. Мембрану элюируют с использованием раствора, имеющего высокое содержание солей. Ионы соли используют для защиты зарядов, тем самым разрушая электростатические взаимодействия, и это является причиной того, что белки десорбируются с поверхности мембраны и свободно перемещаются в подвижной фазе. Анализ емкости для элюирования демонстрирует обогащение примесями, подтверждающее то, что CHOP связывается с мембраной за счет электростатических сил.
Для дальнейшей оценки производительности адсорбера, анионообменную емкость mAb 3, при рН 5,5 и 6,0 мСм/см, обрабатывают мелкомасштабной мембраной 0,18 мл Mustang™ S при постоянной скорости потока 667 МВ/ч. рН mAb 3 составляет на 3,4 единицы ниже pi и поэтому антитело является положительно заряженным. Сырье и проточные случайные образцы анализируют на концентрации mAb, CHOP и гентамицина. Для сравнения концентраций сырья и случайного образца, получают диаграмму С/С0 (случайный образец/нагрузка) как функцию плотности нагрузки мембраны. Как проиллюстрировано на Фигуре 6, величины С/С0 mAb находятся вблизи 1,0 при плотностях нагрузки от 2 до 16 кг/л, предполагая, что концентрации случайного образца почти идентичны концентрации нагрузки, и, в очередной раз, выход будет очень высоким. С другой стороны, величины С/Со в случае CHOP и гентамицина являются низкими, на уровне ≤0,2 при плотности нагрузки от 2 до 16 кг/л, предполагая, что концентрации случайного образца значительно ниже, чем концентрация нагрузки, а Mustang™ S удаляет основную массу этих примесей, несмотря на перегруженность mAb.
Селективность связывания малогабаритной катионобменной мембраны
Чтобы оценить, насколько катионообменные мембраны являются селективными для связывания определенных примесей по сравнению с МКА, была разработана и выполнена серия экспериментов с использованием емкости mAb 3 с протеином А. Эту емкость выбирают из-за ее более высокого уровня примесей, в том числе высокомолекулярных частиц (HMWS), димера, низкомолекулярных соединений (LMWS), гентамицина и CHOP. Емкость с протеином А доводят до рН 5,5 и 4,4 мСм/см. Перед нагрузкой, каждую мембрану Mustang™ S уравновешивают 20 мМ ацетата натрия, рН 5,5 и 1,3 мСм/см буфера. Проводят четыре эксперимента, при каждой нагрузке мембраны 0,18 мл Mustang™ S с 1333 MV/ч до плотностей нагрузки 1000, 5000, 10000 или 15000 г/л. После загрузки, мембраны промывают 20 мМ ацетата натрия, рН 5,5 и 1,3 мСм/см буфера. После промывания для элюирования мембраны используют градиентное элюирование с использованием промывочного буфера и 20 мМ ацетата натрия, 2 М хлорида натрия, рН 5,1 и ~500 мСм/см. Градиент формируют за 20 мл, а для проведения анализа элюирующие фракции берут каждые 2 мл. Для четырех экспериментов, элюирующие фракции анализируют на все примеси и концентрации mAb. В любом данном эксперимента с плотностью нагрузки можно сравнивать фракции для того, чтобы определить, когда загрязнение или mAb элюируют из мембраны с позднее элюирующими видами, связанными более плотно, чем рано элюирующие виды. На Фигуре 7 проиллюстрирована доля нормированных концентраций различных видов, проанализированных через 10 фракций элюции для эксперимента с плотностью нагрузки 5000. Положение каждого пика предполагает, что мономер mAb связывается с мембраной наиболее слабо, так как быстро элюируется. В порядке возрастания связывания силы, за мономером следуют HMWS, димер, CHOP, LMWS и гентамицин. Хотя многие виды элюируются в градиенте на аналогичной позиции, эта диаграмма ясно показывает, что гентамицин связывается гораздо сильнее, чем конкурирующие виды.
Кроме того, для каждой плотности нагрузки рассчитывают общую массу каждой примеси или mAb, связанного с колонкой, и сравнивают между различными экспериментами с плотностью нагрузки. На рисунке 8 проиллюстрирована доля нормализованной массы каждого вида в зависимости от увеличения плотности нагрузки мембраны. Направление линий указывает, увеличивается или уменьшается масса вида. Мономер mAb, который, как было показано ранее, связывается наиболее слабо, имеет снижение уровня массы при увеличении плотности нагрузки. И наоборот, димер, HMWS, CHOP, гентамицин, и LMWS по увеличению массы при увеличении плотности нагрузки. Это подтверждает предыдущие результаты относительно прочности связывания и предполагает, что количество мономера mAb уменьшается, тогда как другие виды непрерывно связываются с мембраной.
Перемещение малогабаритной катионобменной мембраны
Чтобы определить, моет ли мономер mAb элюировать сильносвязывающие виды, такие как гентамицин, в качестве гипотезы для объяснения результатов селективности связывания, был проведен эксперимент с использованием емкости mAb 3 с протеином А. Емкость с протеином А доводят до рН 5,5 и 4,2 мСм/см. Эксперимент проводят с помощью уравновешивания мембраны 0,18 мл Mustang™ S с 20 мМ ацетата натрия, рН 5,4. Емкости mAb 1 с протеином А нагружают до тех пор, пока тренд УФ ясно не покажет прорыв mAb. Затем мембрану промывают уравновешивающим буфером перед тем, как для элюирования мембраны используют элюирующий буфер, состоящий из уравновешивающего буфера и 2 г/л гентамицина. Следует отметить, что уравновешивающий буфер и элюирующий буфера имеют одинаковый рН и проводимость, для того, чтобы предотвратить любые влияния на связывание mAb с мембраной. На Фигуре 9 проиллюстрирована хроматограмма, в том числе тренды УФ, рН и проводимости, во время этапов нагрузки, промывания и элюирования. Хроматограмма демонстрирует, что этапа промывания было достаточно для возвращения тренда УФ к базовому уровню, после инициирования этапа элюирования. Это также показывает, что в течение фазы элюирования, большой УФ пик наблюдается без каких-либо существенных изменений в трендах рН или проводимости. Это показывает, что гентамицин может эффективно смещать связанный мономер mAb с катионообменной мембраны.
Сравнение связывания гентамицина с СЕХ мембранами
Для определения связывающей способности гентамицина с СЕХ мембранами проводят эксперименты исследования мембраны 0,18 мл Mustang™ S и 0,23 мл Natrix S. Буфер PBS при рН 7,2 доводят 2,0 М уксусной кислоты и PW до конечного рН 5,00 и проводимости 8,10 мСм/см. Доведенный буфер затем метят емкостью UF/DF mAb 3 и гентамицином до конечных концентраций приблизительно 1,0 мг/мл и 40000 нг/мл. Полученный меченый раствор используют в качестве потока исходных материалов для нагрузки.
Для выполнения экспериментов, обе мембраны промывают очищенной водой, уравновешивают доведенным буфером, нагружают меченым раствором и промывают доведенным буфером. Во время этапа нагрузки, в случае Mustang™ S при 20, 40, 60, и 80 мл собирают 4 мл проточные случайные образцы. В случае Natrix S, 4 мл проточного случайного образца собирают при 10 мл, а затем каждые 60 мл, для получения в общей сложности 19 образцов. Все образцы затем анализируют на концентрации mAb и гентамицина и сравнивают с концентрациями нагрузки для создания диаграммы С/С0 по сравнению с плотностью нагрузки мембраны, как показано на Фигуре 10.
Хотя это и не отображено на рисунке, концентрация mAb достигает значения С/С0 1,0, предполагая, что этап будет иметь высокий выход антител в элюате. Значения С/С0 для гентамицина, наоборот, достигают 1,0 гораздо позже, предполагая, что обе мембраны связывают значительные уровни. Mustang™ S имеет способность связывать гентамицин между 4,4 и 8,9 г/лм в то время как Natrix S имеет более высокую способность связывать гентамицин и продемонстрировал более медленный прорыв. При 50 г/л, величина С/С0 составляет 0,3 и кривая прорыва является в какой-то степени линейной примерно до 125 г/лм и величиной С/С0 около 0,8. После 125 г/л м кривая прорыва выравнивается, предполагая, что мембрана может все еще связывать гентамицин, одновременно с чем, возможно, вытесняя небольшие уровни mAb.
Эти результаты показывают, что различные мембраны СЕХ имеют разные способности связывать гентамицин и кривые прорыва. Natrix S, с ее более высокой связывающей способности и постепенным прорывом, делает ее более эффективной мембраной для удаления гентамицина. Кроме того, от связывания более высоких уровней гентамицина можно было бы ожидать, что смещается большее количество mAb, что приводит к более высокому выходу.
СЕХ смолы и влияния сильно связывающих аминогликозидных антибиотиков
Чтобы определить, что вызывает более сильное связывание примесей, таких как гентамицин, на упакованную колонку смолы СЕХ, разрабатывают серию экспериментов, чтобы проверить и модельные потоки исходных материалов и фактические потоки исходных материалов с или без мембраны СЕХ, защищающей колонку. Фигура 11 иллюстрирует различные эксперименты, концентрации антител и примесей, а также этапы, необходимые для выполнения этих экспериментов.
Во-первых, с помощью модельного потока исходных материалов PBS, помеченного с помощью емкости UF/DF mAb 3 и изменения уровней гентамицина, смолы Fractogel SE Hicap испытывают на способности связывать антитела путем создания кривых прорыва. PBS сначала доводят 1,0 М уксусной кислотой до рН 5,0, затем помощью очищенной воды доводят до проводимости 8,0 мСм/см. Емкость UF/DF метят в доведенный буфер до концентрации mAb примерно 1,6 мг/мл.
Для каждого выполненного хроматографического эксперимента, Fractogel SE Hicap сначала уравновешивают 25 мМ ацетата натрия при рН 5 перед нагрузкой желаемым потоком исходных материалов. После загрузки колонку промывают 50 мМ ацетата натрия при рН 5,5, промывают 25 мМ HEPES при рН 7,7, промывают 50 мМ ацетата натрия при рН 5,5, элюируют с использованием 350 мМ ацетата натрия при рН 5,5, восстанавливают с использованием 1 М NaCl и 0,5 н NaOH, а затем хранят в 0,1 н NaOH до следующего использования колонки.
Первый эксперимент проводят без помеченного гентамицина и демонстрируют DBC антитела 108 г/л. Далее, указанное изменение и добавление метки выполняют с помощью добавления гентамицина до конечной концентрации 24100 мг/мл. Этот эксперимент показал уменьшенную DBC антитела 89 г/л. Это условие повторяют с концентрацией гентамицина 30500, и рассчитывают DBC антитела 88 г/л. Эти данные показывают, что с использованием модельной системы PBS, очищенного антитела, а также различных уровней гентамицина, присутствие антител уменьшает DBC гентамицина на смоле Fractogel SE Hicap с 108 мг/мл до примерно 88 г/л.
Далее, выполняют два эксперимента с использованием собранной клеточной культуральной жидкости (HCCF), содержащий приблизительно 0,9 мг/мл mAb 3, от 24100 до 30000 нг/мл гентамицина и 408000 нг/мл CHOP. Использование HCCF на уровнях гентамицина согласуется с модельным потоком исходных материалов, DBC антител 68 и 71 г/л. Возможным объяснением разницы между модельным DBC потока исходных материалов 88 и 89 г/л и DBC 68 и 71 г/л, с использованием HCCF, является наличие высоких уровней CHOP в потоке исходных материалов.
Фигура 12 иллюстрирует кривые прорыва всех антител из указанных выше экспериментов, а также уровни загрязнения в потоке исходных материалов, и округленное DBC. Опыты также осуществляют в случайном порядке, чтобы избежать возможное ухудшение колонки или остатка гентамицина от опыта к опыту. Порядок экспериментов приведен в Таблице с прилагаемой Фигурой 12. Между порядком экспериментов и DBC антитела нет никакой корреляции, поэтому маловероятно, что колонка деградирует или что остаток гентамицина влияет на последующие опыты.
Наконец, зная, что наличие гентамицин в потоке исходных материалов демонстрирует значительное снижение в колонке DBCS и что мембраны СЕХ способны связывать гентамицин без привязки значительных уровней антител, для проверки, может ли мембрана СЕХ защитить и повысить производительность на смоле СЕХ, проводят два эксперимента. Поскольку Natrix S демонстрирует улучшенную способность связывания гентамицина на Mustang™ S, ее используют для защиты Fractogel SE Hicap. Размораживают 2 л HCCF, рН доводят до 5 с 2 М уксусной кислоты, доводят до 8 мСм/см с очищенной водой и стерильно фильтруют вне линии, чтобы удалить любые эффекты промерзания и оттаивания потока исходных материалов. Из этого доведенного и фильтрованного потока исходных материалов, нагрузку разделяют с тем, что одну часть загружают в колонку, в то время как другую часть пропускают сквозь 0,75 мл Natrix S, а затем нагружают в Fractogel SE Hicap. Для обоих этапов нагрузки колонки, отбирают 15 мл фракции, по около 60 образцов каждой. Доведенный HCCF, элюат Natrix и фракции Fractogel SE Hicap проанализируют на концентрации антител и гентамицина. Полученный HCCF, антитело потока исходных материалов элюата Natrix и концентрации загрязнения, а также полученные кривые прорыва Fractogel SE Hicap проиллюстрированы на Фигуре 13. Полученные данные демонстрируют, что Natrix продуктивно сокращает уровни гентамицина в доводенном HCCF от 24100 нг/мл до 870 нг/мл. Уровни CHOP несколько снижаются с 408000 нг/мл до 328000 нг/мл. Концентрация антител несколько ниже 0,83 мг/мл по сравнению с доведенной концентрацией HCCF 0,88 мг/мл, представляющей выход около 94%. Наконец, полученные кривые прорыва колонки СЕХ имеют DBC антитела 72 г/л, с использованием доведенной HCCF и DBC антитела 94 г/л с помощью элюата Natrix. Это представляет собой увеличение DBC приблизительно на 30% с помощью пропускания перед загрузкой на колонку СЕХ гентамицина, содержащего поток исходных материалов, через мембрану СЕХ.
Прорыв мембраны СЕХ, ЕСР и PEI
Чтобы проверить, может ли наблюдаться аналогичная производительность при использовании мембраны СЕХ с другими примесями, такими как ЕСР или PEI, проводят эксперимент с использованием емкости моновалентного антитела 1 с протеином А и 0,23 мл мембраной Natrix S. Емкость с протеином А предварительно доводят до рН 6,7 с помощью 1,5 М трис-основания, и разбавляют до проводимости 2,5 мСм/см с помощью очищенной воды. Нагрузка, которая характеризуется концентрацией антитела 4,7 г/л, 130 мкг/мл PEI и 8870 нг/мл ЕСР, загружают в уравновешенную Natrix S и отбирают 10 образцов фракций элюата по 2 мл и, после этого, 12 образцов фракции по 5 мл. Фракции элюата затем анализируют на концентрациию антител, PEI и ЕСР, которые затем используют для генерирования С/С0 в зависимости от плотности нагрузки антител мембран. Фигура 14 иллюстрирует то, что прорыв и антитела и ЕСР сквозь мембрану СЕХ при приблизительно 123 мг/мл. Так как количественный уровень PEI составляет 30 мкг/мл, первые несколько образцов находятся на этом уровне или ниже этого уровня, а Фигура 14 иллюстрирует значение С/С0 0,23, так как неизвестно, какая существует концентрация PEI в тех образцах. Игнорируя уровни PEI 0,23, PEI демонстрирует прорыв при 330 мг/мл значительно позже, чем в случае антитела и ЕСР. Эти результаты показывают, что мембраны СЕХ также являются эффективными в удалении ионных полимеров без отрицательного влияния на выход антител.
Смолы СЕХ и влияния сильно связывающих ионных полимеров
Чтобы определить, какой эффект сильно связывающаяся примесь, такая как PEI, может иметь на наполненную колонку смолы СЕХ, выполняют серию экспериментов по оценку уровней PEI, используемых во время экстракция полипептида 1 и их влияние на колонку с SP Sepharose Fast Flow. Поскольку поток исходных материалов в случае данного продукта больше загрязнен, не удалось оценить количественно уровни PEI, которые идут на колонку, отмечают вместо уровней PEI, используемых при экстракции.
В этих экспериментах, извлеченный продукт обуславливают различные уровни PEI в пределах от 0,75 до 1,05%, разбавленный очищенной водой и центрифугированный для получения 4 образцов фильтрата. Каждый образец центрата, примерно при рН 7,0 и 8,0 мСм/см затем наносят на колонку SP Sepharose Fast Flow с образцами элюата, собирают и анализируют на концентрацию полипептида. Полученные данные используют для получения диаграммы С/С0 как функции плотности нагрузки полипептида в смолу. На Фигуре 15 проиллюстрированы кривые прорыва и соответствующий DBC колонки для каждого испытания центрата. Как показано в таблице, одновременно с тем как растет % PEI в течение процесса экстракции, уменьшается DBC колонки.
Кроме того, на второй серии экспериментов с использованием полипептида 1, в колонку SP Sepharose Fast Flow загружают фильтраты с различными % PEI, с тем, что колонку последовательно промывают и элюируют для каждого эксперимента. Полученные емкости каждого эксперимента затем анализируют на концентрацию полипептида, ЕСР и размер продукта с помощью эксклюзионной хроматографии. Фигура 16 иллюстрирует что емкости генерируют с использованием повышения уровня % PEI в то время как экстракция приводит к уменьшении выхода этапа и емкость увеличивает уровни загрязнения, такого как ЕСР, агрегатов продуктов или димеров.
Хотя эксперименты с использованием мембраны СЕХ до этой колонке СЕХ не проводили, зная, что PEI может быть связано с Natrix S из предыдущих экспериментов и, наблюдая сниженную производительность колонки СЕХ как функцию % PEI, можно выдвинуть гипотезу, что использование мембраны СЕХ в этом потоке исходных материалов позволяет улучшить не только способность к связыванию колонки, но и полученную емкость.
Заключение
Ионообменные мембраны показали свою эффективность при удалении примесей при таком состоянии рН и проводимости, которое вызывает связывание белка. Действуя посредством хроматографии с перегрузкой и содействуя конкурентной адсорбции между примесями и представляющим интерес белком, показанные выходы составляют ≥96% после достижения плотностей нагрузки 1000-5000 г/л м. Показано, что катионообменные мембраны в проточных фракциях на мембране связывают и значительно сокращают такие примеси, как CHOP и гентамицин, со значениями С/С0<0,2 при плотности нагрузки 16000 г/лм. Также показано, что катионообменные мембраны обладают селективностью по отношению к связывания некоторых примесей в отличие от антител с использованием менее очищенных потоков исходных материалов, содержащих высокомолекулярные частицы, димер, низкомолекулярные частицы, гентамицин и CHOP. В этих исследованиях было показано, что данные примеси связываются с различной силой, повышение плотности нагрузки мембраны демонстрирует продолжающееся связывание примесей, в то время как связь антитела с мембраной уменьшается, и низкомолекулярные высокозаряженные частицы, такие как гентамицин, связываются гораздо сильнее, чем конкурирующие виды. Кроме того, конкурентная адсорбция и вытеснительная хроматография подтверждают то, что наблюдается при элюировании антитела из катионообменной мембраны с использованием буфера, содержащего гентамицин. Было показано, что две катионообменные мембраны, Mustang™ S и Natrix S, имеют возможности для динамического связывания 4,4-8,9 г/л м и 50 г/лм гентамицина, соответственно. Также было показано, что кривая прорыва в случае Natrix S более пологая, чем в случае Mustang™ S. Natrix S создана для более высоких способностей к связывания, чем традиционные мембран, и это свойство, вместе с постепенным прорывом, делает ее хорошо подходящей для очистки от примесей.
Было показано, что катионообменные смолы обладают различными способностями к динамическому связыванию в присутствии гентамицина, с уменьшением DBC в качестве концентрации гентамицина при увеличении потока исходных материалов. DBC колонки Fractogel SE Hicap снижается от 108 до 88 г/л при использовании модельного потока исходных материалов, содержащего от 0 до 30 500 нг/мг гентамицина. С использованием репрезентативного потока исходных материалов, Fractogel SE Hicap показал DBC 68-71 г/л. Применимость катионообменной мембраны проверяют, когда она в состоянии снизить концентрации гентамицина в данном потоке сырья от 24100 нг/мг до 870 нг/мг гентамицина с выходом 94%. Поток исходных материалов со сниженной концентрацией гентамицина позволяет Fractogel SE Hicap иметь DBC 94 г/л по сравнению с 72 г/л, при прямом сравнении. Так же, как гентамицин, катионообменные мембраны были показаны для связывания высоко заряженных ионных полимеров, таких как PEI, в присутствии моновалентного антитела и ЕСР. Наконец, было показано, что катионообменные смолы негативно влияют на изменение концентраций PEI в потоке исходных материалов, что приводит к снижению способности динамического связывания и увеличенным примесям в емкости при увеличенных концентрациях PEI. Было показано, что колонка SP Sepharose Fast Flow уменьшается от 51 г/л до 36 г/л, тогда как PEI выше по потоку возрастает от 0,75% до 1,05%. В отдельном исследовании, выход этапа снижается с 96% до 70%, ЕСР увеличивается с 155 нг/мг до 904 нг/мг, содержание агрегатов увеличивается с 2,5% до 17,3%, содержание димера увеличивается с 3,7% до 5,9%, а концентрация PEI выше по потоку увеличивается с 0,6% до 1,1%. Использование катионообменной мембраны перед колонкой SP Sepharose Fast Flow не было проверено, нопоскольку известно, что колонка подвержена отрицательному влиянию PEI и мембрана является эффективной в связывании PEI, правильно подобранная мембрана должна уменьшить % PEI, что ведет к тому, что колонка служит причиной более высоких способностей к связывания и выхода, а также снижения концентраций примесей в емкости.
Постоянно появляются более совершенные технологии очистки. По мере разработки ионообменных смол с более высокой связывающей способностью, их использование в качестве аффинной смолы с протеином А является, по-видимому, подходящим, ввиду снижения эксплуатационных расходов. Тем не менее при воздействии на поток исходных материалов с повышенными уровнями загрязнения или примесей, таких как гентамицин или PEI, обычно не наблюдающихся в использовании ниже по потоку, их истинная эффективность может быть снижена. Использование ионообменной мембраны перед такой ионообменной смолой может защитить колонку за счет уменьшения примесей, которые нагружают на колонку. Это может привести к ряду улучшений в случае колонки, например, более высоким способностям динамического связывания, увеличенным выходам этапа или сниженным концентрациям загрязнения в емкости. С помощью выбора соответствующей мембраны с достаточными способностью к связыванию загрязнения, объемом и проницаемостью, два этапа могут функционировать непрерывно, дополнительно сокращается время работы и, в конечном счете, затраты на способ очистки.
Вышеизложенную спецификацию считают достаточной для того, чтобы позволить специалисту в данной области осуществить настоящее изобретение. Настоящее изобретение не должно быть ограничено в объеме зарегистрированной концепции, так как зарегистрированный вариант реализации настоящего изобретения предполагается в качестве отдельной иллюстрации некоторых аспектов настоящего изобретения, и любые концепции, которые являются функционально эквивалентными, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Депонирование материала в данном документе не является признанием того, что приведенное в данном документе описание является недостаточным для того, чтобы содержаться в практике любого аспекта изобретения, в том числе, в его оптимальный режим, и это не должны быть истолковано как ограничивающее объем формулы изобретения до конкретных иллюстраций, которые он представляет. Действительно, различные модификации изобретения в дополнение к показанным и описанным здесь будут очевидны специалистам в данной области из предшествующего описания, и попадают в объем прилагаемой формулы изобретения.
Claims (42)
1. Способ усиления эффективности этапов хроматографии для очистки антител ниже по потоку, включающий:
а) пропускание композиции, содержащей представляющее интерес антитело и загрязняющий ионный полимер сквозь ионообменную мембрану, отличающееся тем, что антитело и мембрана имеют противоположный заряд, при рабочих условиях, которые состоят из буфера, имеющего рН, достаточно отличающийся от pI антитела с целью повышения заряда антитела, и низкой ионной силы, эффективной для предотвращения экранирования зарядов буферных ионов, которые приводят к тому, что мембрана связывает антитело и по крайней мере один загрязняющий ионный полимер;
b) перегрузку ионообменной мембраны до плотности нагрузки 1000-5000 г/л таким образом, что по меньшей мере один указанный загрязняющий ионный полимер остается связанным с мембраной, тогда как представляющее интерес антитело находится, главным образом, в элюате;
c) улавливание элюата из ионообменной мембраны, который содержит представляющее интерес антитело;
d) этап ионообменной хроматографии, которая имеет аналогичный предыдущей мембране заряд, которому подвергают элюат мембраны, содержащий представляющее интерес антитело, и
e) извлечение очищенного антитела из элюата этапа ионообменной хроматографии.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ионообменная мембрана имеет размер пор от 0,1 до 100 нм.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что ионообменную мембрану заменяют на монолит или объемный фильтр.
4. Способ усиления эффективности этапов хроматографии для очистки антител ниже по потоку, включающий:
а) пропускание композиции, содержащей представляющее интерес антитело и загрязняющий ионный полимер, сквозь катионообменную мембрану, отличающееся тем, что антитело и мембрана имеют противоположный заряд, при рабочих условиях, состоящих из буфера, имеющего рН на от около 1 до около 5 единиц ниже pI антитела, и проводимости < около 40 мСм/см, которые приводят к тому, что мембрана связывает антитело и по крайней мере один указанный загрязняющий ионный полимер;
b) перегрузку катионообменной мембраны до плотности нагрузки 1000-5000 г/л таким образом, что по меньшей мере один загрязняющий ионный полимер остается связанным с мембраной, тогда как представляющее интерес антитело находится, главным образом, в элюате;
c) улавливание элюата катионообменной мембраны, который содержит представляющее интерес антитело;
d) этап очистки с помощью катионообменной хроматографии, которому подвергают элюат мембраны, содержащий интересующее антитело, и
e) извлечение очищенного антитела из элюата этапа катионообменной хроматографии.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что рН на от около 1 до около 4 единиц рН ниже pI антитела.
6. Способ по п.4, отличающийся тем, что pH на от около 1 до около 3 единиц рН ниже pI антитела.
7. Способ по п.4, отличающийся тем, что pH на от около 1 до около 2 единиц рН ниже pI антитела.
8. Способ по п.4, отличающийся тем, что pH на около 1 единицу рН ниже pI антитела.
9. Способ по п.4, отличающийся тем, что проводимость составляет < около 20 мСм/см.
10. Способ по п.4, отличающийся тем, что проводимость составляет < около 10 мСм/см.
11. Способ по п.4, отличающийся тем, что катионобменная мембрана представляет собой катионобменный монолит или объемный фильтр.
12. Способ усиления эффективности этапов хроматографии для очистки антител ниже по потоку, включающий:
а) пропускание композиции, содержащей представляющее интерес антитело и загрязняющий ионный полимер, сквозь анионообменную мембрану, отличающееся тем, что антитело и мембрана имеют противоположный заряд, при рабочих условиях, состоящих из буфера, имеющего рН на от около 1 до около 5 единиц выше pI антитела, и проводимости < около 40 мСм/см, которые приводят к тому, что мембрана связывает антитело и по крайней мере один указанный загрязняющий ионный полимер;
b) перегрузку анионообменной мембраны до плотности нагрузки 1000-5000 г/л таким образом, что по меньшей мере один загрязняющий ионный полимер остается связанным с мембраной, тогда как представляющее интерес антитело находится, главным образом, в элюате;
c) улавливание элюата анионообменной мембраны, который содержит представляющее интерес антитело;
d) этап очистки с помощью анионообменной хроматографии, которому подвергают элюат мембраны, содержащий интересующее антитело, и
e) извлечение очищенного антитела из элюата этапа анионообменной хроматографии.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что рН на от около 1 до около 4 единиц рН выше pI антитела.
14. Способ по п.12, отличающийся тем, что рН на от около 1 до около 3 единиц рН выше pI антитела.
15. Способ по п.12, отличающийся тем, что рН на от около 1 до около 2 единиц рН выше pI антитела.
16. Способ по п.12, отличающийся тем, что pH на около 1 единицу рН выше pI антитела.
17. Способ по п.12, отличающийся тем, что проводимость составляет < около 20 мСм/см.
18. Способ по п.12, отличающийся тем, что проводимость составляет < около 10 мСм/см.
19. Способ по п.12, отличающийся тем, что анионообменную мембрану заменяют анионообменным монолитом или объемным фильтром.
20. Способ по любому из пп.1-19, отличающийся тем, что мембрана представляет собой адсорбер смешанного типа.
21. Способ по пп.1-20, отличающийся тем, что ионный полимер представляет собой полиэтиленимин (PEI).
22. Способ по пп.1-21, отличающийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.
23. Способ по любому из пп.1-22, отличающийся тем, что дополнительный этап(ы) очистки содержит ионообменную хроматографию.
24. Способ по любому из пп.1-23, отличающийся тем, что дополнительный этап(ы) очистки непрерывно осуществляют во время этапов от a до e, а указанным этапом очистки является ионообменная хроматография.
25. Способ по любому из пп.23 или 24, отличающийся тем, что ионообменная хроматография содержит катионообменную колонку.
26. Способ по любому из пп.23 или 24, отличающийся тем, что ионообменная хроматография содержит анионообменную колонку.
27. Способ по любому из пп.1-26, который дополнительно включает получение фармацевтической композиции путем объединения очищенного антитела с фармацевтически приемлемым носителем.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161579285P | 2011-12-22 | 2011-12-22 | |
US61/579,285 | 2011-12-22 | ||
PCT/US2012/070373 WO2013096322A1 (en) | 2011-12-22 | 2012-12-18 | Ion exchange membrane chromatography |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2014130017A RU2014130017A (ru) | 2016-02-10 |
RU2648999C2 true RU2648999C2 (ru) | 2018-03-29 |
Family
ID=47430154
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014130017A RU2648999C2 (ru) | 2011-12-22 | 2012-12-18 | Способы повышения эффективности этапов очистки белка, находящихся ниже по потоку, с использованием мембранной ионообменной хроматографии |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10364268B2 (ru) |
EP (2) | EP2794635B8 (ru) |
JP (5) | JP6605202B2 (ru) |
KR (3) | KR20210025692A (ru) |
CN (2) | CN104125963B (ru) |
AR (1) | AR089362A1 (ru) |
AU (3) | AU2012355356B2 (ru) |
BR (1) | BR112014015101A8 (ru) |
CA (1) | CA2859376C (ru) |
ES (1) | ES2697676T3 (ru) |
HK (1) | HK1203526A1 (ru) |
HR (1) | HRP20181846T1 (ru) |
IL (2) | IL267585B (ru) |
MX (2) | MX360453B (ru) |
MY (1) | MY172426A (ru) |
PL (1) | PL2794635T3 (ru) |
RU (1) | RU2648999C2 (ru) |
SG (1) | SG11201403437TA (ru) |
SI (1) | SI2794635T1 (ru) |
TR (1) | TR201815709T4 (ru) |
WO (1) | WO2013096322A1 (ru) |
ZA (2) | ZA201404593B (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2782457C2 (ru) * | 2018-07-06 | 2022-10-27 | Бэджер Лайсенсинг Ллс | Обработка остаточных потоков от производства бисфенолов |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2794635B8 (en) * | 2011-12-22 | 2018-11-14 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Ion exchange membrane chromatography |
KR101891522B1 (ko) | 2013-12-12 | 2018-08-24 | 이엠디 밀리포어 코포레이션 | 아크릴아미드 함유 필터를 사용한 단백질 분리 |
CA2935143C (en) * | 2013-12-27 | 2024-05-07 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for purifying antibody having low isoelectric point |
CN104693303B (zh) * | 2015-02-28 | 2018-03-13 | 苏州金盟生物技术有限公司 | 一种蛋白制品中的核酸去除方法 |
SI3334747T1 (sl) | 2015-08-13 | 2024-02-29 | Amgen Inc. | Globinsko nabito filtriranje proteinov, ki vežejo antigen |
GB201711481D0 (en) | 2017-07-17 | 2017-08-30 | Ucb Biopharma Sprl | Protein purification |
EP3546475A1 (en) * | 2018-03-27 | 2019-10-02 | Sanofi | Full flow-through process for purifying recombinant proteins |
US10792618B2 (en) | 2018-06-19 | 2020-10-06 | Sartorius Stedim Biotech Gmbh | Particle separation and/or purification of a fluid |
GB201815405D0 (en) * | 2018-09-21 | 2018-11-07 | Fujifilm Mfg Europe Bv | Membranes suitable for detecting, filtering and/or purifying biomolecules |
EP3899526B1 (en) * | 2018-12-21 | 2024-05-01 | Solventum Intellectual Properties Company | Method for testing a chromatography device used for ion exchange |
AR119264A1 (es) * | 2019-06-05 | 2021-12-09 | Genentech Inc | Método para reutilización de cromatografía |
US11416468B2 (en) * | 2020-07-21 | 2022-08-16 | International Business Machines Corporation | Active-active system index management |
CN116371011B (zh) * | 2023-05-26 | 2023-08-18 | 湖南杰萃生物技术有限公司 | 一种从桑叶中提取黄酮和生物碱的方法 |
CN117866038B (zh) * | 2024-03-11 | 2024-05-28 | 北京百力格生物科技有限公司 | 纯化含有宿主核酸的带亲和标签的酸性蛋白的方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2145873C1 (ru) * | 1993-09-21 | 2000-02-27 | Хемосол Инк. | Способ очистки гемоглобина в коммерческом масштабе |
WO2009135656A1 (en) * | 2008-05-06 | 2009-11-12 | Lonza Biologics Plc. | A method for the purification of antibodies using displacement chromatography |
WO2010019148A1 (en) * | 2008-08-14 | 2010-02-18 | Genentech, Inc. | Methods for removing a contaminant using indigenous protein displacement ion exchange membrane chromatography |
Family Cites Families (76)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE266710C (ru) | ||||
US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
USRE30985E (en) | 1978-01-01 | 1982-06-29 | Serum-free cell culture media | |
US4515893A (en) | 1979-04-26 | 1985-05-07 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Hybrid cell line for producing complement-fixing monoclonal antibody to human T cells |
US4560655A (en) | 1982-12-16 | 1985-12-24 | Immunex Corporation | Serum-free cell culture medium and process for making same |
US4657866A (en) | 1982-12-21 | 1987-04-14 | Sudhir Kumar | Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
DD266710A3 (de) | 1983-06-06 | 1989-04-12 | Ve Forschungszentrum Biotechnologie | Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase |
US4767704A (en) | 1983-10-07 | 1988-08-30 | Columbia University In The City Of New York | Protein-free culture medium |
JPS6150925A (ja) | 1984-08-17 | 1986-03-13 | Toray Ind Inc | 抗原または抗体の精製方法 |
US4879231A (en) | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
GB8516415D0 (en) | 1985-06-28 | 1985-07-31 | Celltech Ltd | Culture of animal cells |
US5091178A (en) | 1986-02-21 | 1992-02-25 | Oncogen | Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies |
US4927762A (en) | 1986-04-01 | 1990-05-22 | Cell Enterprises, Inc. | Cell culture medium with antioxidant |
GB8610600D0 (en) | 1986-04-30 | 1986-06-04 | Novo Industri As | Transformation of trichoderma |
IL85035A0 (en) | 1987-01-08 | 1988-06-30 | Int Genetic Eng | Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same |
EP0391934A1 (en) * | 1987-10-23 | 1990-10-17 | Schering Corporation | Method of purifying protein |
US5091313A (en) | 1988-08-05 | 1992-02-25 | Tanox Biosystems, Inc. | Antigenic epitopes of IgE present on B cell but not basophil surface |
US5720937A (en) | 1988-01-12 | 1998-02-24 | Genentech, Inc. | In vivo tumor detection assay |
WO1989012463A1 (en) | 1988-06-21 | 1989-12-28 | Genentech, Inc. | Method and therapeutic compositions for the treatment of myocardial infarction |
DE68925971T2 (de) | 1988-09-23 | 1996-09-05 | Cetus Oncology Corp | Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
JP2844346B2 (ja) | 1989-05-31 | 1999-01-06 | 昭 梶 | 新規ペプチドならびに新規dna |
EP0402226A1 (en) | 1989-06-06 | 1990-12-12 | Institut National De La Recherche Agronomique | Transformation vectors for yeast yarrowia |
DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
US5122469A (en) | 1990-10-03 | 1992-06-16 | Genentech, Inc. | Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins |
ATE233813T1 (de) | 1991-08-14 | 2003-03-15 | Genentech Inc | Veränderte immunglobuline für spezifische fc- epsilon rezeptoren |
EP0617706B1 (en) | 1991-11-25 | 2001-10-17 | Enzon, Inc. | Multivalent antigen-binding proteins |
DE69334255D1 (de) | 1992-02-06 | 2009-02-12 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür |
CA2140933A1 (en) | 1992-08-21 | 1994-02-22 | Paula M. Jardieu | Method for treating an lfa-1 mediated disorder |
US5736137A (en) | 1992-11-13 | 1998-04-07 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma |
US5595721A (en) | 1993-09-16 | 1997-01-21 | Coulter Pharmaceutical, Inc. | Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20 |
ES2108566T3 (es) | 1993-12-10 | 1997-12-16 | Genentech Inc | Procedimientos para diagnosticar alergias y para seleccionar agentes terapeuticos antialergicos. |
EP0739214B1 (en) | 1994-01-18 | 1998-03-18 | Genentech, Inc. | A METHOD OF TREATMENT OF PARASITIC INFECTION USING IgE ANTAGONISTS |
CA2181787A1 (en) | 1994-03-03 | 1995-09-08 | Claire M. Doerschuk | Anti-il-8 monoclonal antibodies for treatment of inflammatory disorders |
US5534615A (en) | 1994-04-25 | 1996-07-09 | Genentech, Inc. | Cardiac hypertrophy factor and uses therefor |
IL117645A (en) | 1995-03-30 | 2005-08-31 | Genentech Inc | Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration |
US5641870A (en) | 1995-04-20 | 1997-06-24 | Genentech, Inc. | Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification |
CA2222231A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Imclone Systems Incorporated | Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors |
ATE222774T1 (de) | 1996-01-23 | 2002-09-15 | Genentech Inc | Antikörper gegen cd 18 zur verwendung gegen gehirnschlag |
CA2242931A1 (en) | 1996-01-31 | 1997-08-07 | David Francis Elgar | Production of an immunoglobulin enriched fraction from whey protein solutions |
US7147851B1 (en) | 1996-08-15 | 2006-12-12 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin |
AU731817C (en) | 1996-11-27 | 2001-11-01 | Genentech Inc. | Humanized anti-CD11a antibodies |
SI1325932T1 (ru) | 1997-04-07 | 2005-08-31 | Genentech Inc | |
EP1860187B1 (en) | 1997-05-15 | 2011-07-13 | Genentech, Inc. | Apo-2 receptor |
US6054293A (en) | 1997-07-08 | 2000-04-25 | The Regents Of The University Of California | Semaphorin receptors |
US6946129B1 (en) | 1999-06-08 | 2005-09-20 | Seattle Genetics, Inc. | Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof |
EP2112167A3 (en) | 1999-06-25 | 2010-12-22 | Genentech, Inc. | Humanized ANTI-ERBB2 antibodies and treatment with ANTI-ERBB2 antibodies |
ES2309012T3 (es) | 1999-10-29 | 2008-12-16 | Genentech, Inc. | Composiciones del anticuerpo anti-psca y a sus procedimientos contra celulas cancerigenas que expresen psca. |
AU2001273432A1 (en) | 2000-07-13 | 2002-01-30 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for rapid protein and peptide extraction and isolation using a lysis matrix |
UA83458C2 (ru) | 2000-09-18 | 2008-07-25 | Байоджен Айдек Ма Інк. | Выделенный полипептид baff-r (рецептор фактора активации в-клеток семейства tnf) |
US7321026B2 (en) | 2001-06-27 | 2008-01-22 | Skytech Technology Limited | Framework-patched immunoglobulins |
WO2003025156A2 (en) | 2001-09-18 | 2003-03-27 | Affinium Pharmaceuticals, Inc. | Methods and apparatuses for purification |
WO2003033656A2 (en) | 2001-10-16 | 2003-04-24 | Exelixis, Inc. | MSREBPs AS MODIFIERS OF THE SREBP PATHWAY AND METHODS OF USE |
WO2003033658A2 (en) | 2001-10-17 | 2003-04-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant |
US20040093621A1 (en) | 2001-12-25 | 2004-05-13 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd | Antibody composition which specifically binds to CD20 |
CN101914158A (zh) | 2002-02-14 | 2010-12-15 | 免疫医疗公司 | 抗cd 20抗体及其融合蛋白和使用方法 |
KR20090088973A (ko) | 2002-10-17 | 2009-08-20 | 젠맵 에이/에스 | Cd20에 대한 인간 모노클로날 항체 |
SI2289936T1 (sl) | 2002-12-16 | 2017-10-30 | Genentech, Inc. | Imunoglobulinske variante in njihove uporabe |
CN1206240C (zh) * | 2003-04-07 | 2005-06-15 | 中国科学院生态环境研究中心 | 高效离子交换膜色谱纯化卵黄蛋白原技术 |
CA2897608C (en) | 2003-05-09 | 2018-07-31 | Duke University | Cd20-specific antibodies and methods employing same |
AR044388A1 (es) | 2003-05-20 | 2005-09-07 | Applied Molecular Evolution | Moleculas de union a cd20 |
WO2005014618A2 (en) | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Immunomedics, Inc. | Bispecific antibodies for inducing apoptosis of tumor and diseased cells |
US8147832B2 (en) | 2003-08-14 | 2012-04-03 | Merck Patent Gmbh | CD20-binding polypeptide compositions and methods |
US20080274501A1 (en) * | 2007-05-02 | 2008-11-06 | Chenming Zhang | Method of purifying acidic proteins expressed in plants |
US9433922B2 (en) | 2007-08-14 | 2016-09-06 | Emd Millipore Corporation | Media for membrane ion exchange chromatography based on polymeric primary amines, sorption device containing that media, and chromatography scheme and purification method using the same |
JP5778389B2 (ja) | 2007-10-26 | 2015-09-16 | 旭化成ケミカルズ株式会社 | たんぱく質の精製方法 |
ES2666170T3 (es) | 2007-10-30 | 2018-05-03 | Genentech, Inc. | Purificación de anticuerpos mediante cromatografía de intercambio catiónico |
GB0816242D0 (en) | 2008-09-05 | 2008-10-15 | Immunobiology Ltd | Method of purifying protien complexes |
KR20190018041A (ko) | 2009-08-06 | 2019-02-20 | 제넨테크, 인크. | 단백질 정제 시의 바이러스 제거의 개선방법 |
WO2011028753A1 (en) * | 2009-09-01 | 2011-03-10 | Genentech, Inc. | Enhanced protein purification through a modified protein a elution |
RU2624027C2 (ru) * | 2010-04-23 | 2017-06-30 | Дженентек, Инк. | Получение гетеромультимерных белков |
CN102905718A (zh) | 2010-05-25 | 2013-01-30 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 纯化多肽的方法 |
US20140296485A1 (en) * | 2011-10-03 | 2014-10-02 | Sachem, Inc. | Anionic displacer molecules for hydrophobic displacement chromatography |
EP2794635B8 (en) * | 2011-12-22 | 2018-11-14 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Ion exchange membrane chromatography |
US9813410B2 (en) | 2014-06-26 | 2017-11-07 | Rakuten, Inc. | Information processing apparatus, information processing method, and information processing program |
-
2012
- 2012-12-18 EP EP12806322.9A patent/EP2794635B8/en active Active
- 2012-12-18 TR TR2018/15709T patent/TR201815709T4/tr unknown
- 2012-12-18 KR KR1020217005616A patent/KR20210025692A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-12-18 ES ES12806322T patent/ES2697676T3/es active Active
- 2012-12-18 AU AU2012355356A patent/AU2012355356B2/en active Active
- 2012-12-18 CN CN201280070369.9A patent/CN104125963B/zh active Active
- 2012-12-18 EP EP18193475.3A patent/EP3492486A1/en active Pending
- 2012-12-18 MX MX2014007622A patent/MX360453B/es active IP Right Grant
- 2012-12-18 JP JP2014549204A patent/JP6605202B2/ja active Active
- 2012-12-18 CA CA2859376A patent/CA2859376C/en active Active
- 2012-12-18 PL PL12806322T patent/PL2794635T3/pl unknown
- 2012-12-18 MY MYPI2014701665A patent/MY172426A/en unknown
- 2012-12-18 SG SG11201403437TA patent/SG11201403437TA/en unknown
- 2012-12-18 KR KR1020147019968A patent/KR102067075B1/ko active IP Right Grant
- 2012-12-18 SI SI201231443T patent/SI2794635T1/sl unknown
- 2012-12-18 BR BR112014015101A patent/BR112014015101A8/pt not_active Application Discontinuation
- 2012-12-18 IL IL267585A patent/IL267585B/en unknown
- 2012-12-18 RU RU2014130017A patent/RU2648999C2/ru active
- 2012-12-18 KR KR1020207000846A patent/KR20200008022A/ko not_active IP Right Cessation
- 2012-12-18 CN CN201810818291.3A patent/CN108892706A/zh active Pending
- 2012-12-18 US US14/365,449 patent/US10364268B2/en active Active
- 2012-12-18 WO PCT/US2012/070373 patent/WO2013096322A1/en active Application Filing
- 2012-12-20 AR ARP120104862A patent/AR089362A1/es not_active Application Discontinuation
-
2014
- 2014-06-16 IL IL233158A patent/IL233158B/en active IP Right Grant
- 2014-06-20 MX MX2018013356A patent/MX2018013356A/es unknown
- 2014-06-23 ZA ZA2014/04593A patent/ZA201404593B/en unknown
-
2015
- 2015-04-27 HK HK15104046.9A patent/HK1203526A1/xx unknown
-
2018
- 2018-01-10 AU AU2018200194A patent/AU2018200194B2/en active Active
- 2018-02-13 JP JP2018023128A patent/JP2018109024A/ja not_active Withdrawn
- 2018-11-05 HR HRP20181846TT patent/HRP20181846T1/hr unknown
-
2019
- 2019-06-06 US US16/433,763 patent/US11945837B2/en active Active
- 2019-06-20 ZA ZA2019/03994A patent/ZA201903994B/en unknown
- 2019-10-24 JP JP2019193276A patent/JP7402011B2/ja active Active
-
2020
- 2020-02-14 AU AU2020201070A patent/AU2020201070A1/en not_active Abandoned
-
2021
- 2021-06-22 JP JP2021102974A patent/JP7359807B2/ja active Active
-
2022
- 2022-03-25 JP JP2022050501A patent/JP2022101557A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2145873C1 (ru) * | 1993-09-21 | 2000-02-27 | Хемосол Инк. | Способ очистки гемоглобина в коммерческом масштабе |
WO2009135656A1 (en) * | 2008-05-06 | 2009-11-12 | Lonza Biologics Plc. | A method for the purification of antibodies using displacement chromatography |
WO2010019148A1 (en) * | 2008-08-14 | 2010-02-18 | Genentech, Inc. | Methods for removing a contaminant using indigenous protein displacement ion exchange membrane chromatography |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2782457C2 (ru) * | 2018-07-06 | 2022-10-27 | Бэджер Лайсенсинг Ллс | Обработка остаточных потоков от производства бисфенолов |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20210284685A1 (en) | Methods for removing a contaminant using indigenous protein displacement ion exchange membrane chromatography | |
JP7359807B2 (ja) | イオン交換膜クロマトグラフィー | |
NZ626949B2 (en) | Ion exchange membrane chromatography |