CN100404683C - 一种人fl多核苷酸及其与人gm-csf联合基因治疗恶性肿瘤的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域。具体而言，本发明涉及编码受体蛋白flt3的配体(FL)的多核苷酸、其编码的蛋白、其生产方法及其用途。本发明还涉及人FL与人GM-CSF联合基因的联合表达及二者联合表达用于制备治疗恶性肿瘤的药物中的用途。

Description

一种人FL多核苷酸及其与人GM-CSF联合基因治疗恶性肿瘤的用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域。具体而言，本发明涉及编码受体蛋白flt3的配体的多核苷酸、其编码的蛋白、其生产方法及其用途。本发明还涉及人FL与人GM-CSF联合基因的联合表达及二者联合表达用于制备治疗恶性肿瘤的药物中的用途。

背景技术

人FL是受体蛋白flt3的配体(flt3-ligand)，简称hFL，是新近发现的一种造血细胞生长因子。成熟型hFL由156个氨基酸组成，分子量约17kD。它的主要功能与人干细胞因子(SCF)相似，主要作用于早期原始的干/祖细胞，促进其增殖和分化，以促使所有血细胞发生。它在造血系统原发性疾病和继发性损伤疾病治疗中具有重要作用。但FL又不同于SCF，它的生物学作用没有种属特异性，对肥大细胞无作用。动物实验和临床试用结果表明FL的毒副作用比SCF小。尤为值得注意的是，FL除了对造血干细胞具有重要作用外，它还能显著地促进细胞毒T淋巴细胞、NK细胞增殖，特别是能大量扩增树突状细胞(DCs)。而且，与其它促DC生长的细胞因子GM-CSF、IL-4或G-CSF相比，FL是最主要和最强有力的DCs生长因子。

DC是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，也是唯一能够刺激初始T细胞增殖的抗原提呈细胞，在抗肿瘤免疫等免疫应答的诱导中具有独特的地位：外周组织中未成熟的DC摄取、处理肿瘤抗原，迁移至淋巴器官并逐渐成熟，然后将肿瘤抗原肽提呈给初始T细胞，刺激其活化增殖，启动抗肿瘤免疫应答。恶性肿瘤逃脱免疫监视的原因之一在于，肿瘤细胞通过分泌IL-10、TGF-β和VEGF等抑制DC前体细胞向成熟DC分化，并抑制DC(尤其肿瘤浸润部位DC)表达MHC II类分子和B7，使DC不能有效提呈肿瘤抗原。近年来，大量以DC为基础的抗肿瘤免疫研究和肿瘤治疗取得了令人鼓舞的成果。

上述功能使FL在肿瘤免疫治疗、造血干细胞移植及制备免疫疫苗等方面有重要潜在应用价值。在抗肿瘤方面，动物实验已证实，FL对恶性黑色素瘤、淋巴瘤、纤维肉瘤、肝脏肿瘤及卵巢癌等实体肿瘤或白血病均能部分延缓肿瘤生长，并且可能激发特异性免疫保护反应。

1993年，Immunex公司克隆了hFL基因(Lyman SD，James L，Vanden BT，etal.Molecular cloning of a ligand for the flt3/flk-2tyrosine kinase receptor：aproliferative factor for primitive hematopoietic cells.Cell，1993，75(6)：1157-67)，并在真核细胞中获得表达，其主要用于黑色素瘤、肾细胞癌、前列腺癌、以及放化疗后肿瘤患者的干细胞移植。但其产量较低，不能满足大规模应用的需要。

Graddis TJ等应用双膜快速筛选法，筛选到酵母表达的hFL中两个氨基酸改变(K84E/Q122R)的突变体。该突变体比正常hFL对BAF/hFIt3R细胞的增殖活性增高约3倍。他们将该突变体酵母转化子的培养上清，经过过滤→FractogelEMD SO3-650分离→抗hFL单克隆抗体亲和层析柱分离→浓缩→Superdex 200分离→再浓缩，最后获得重组hFL纯品。这种工艺较复杂，成本高(Graddis TJ，Brasel K，Friend D et al.Structure-function analysis of FLT3 ligand-FLT3 receptorinteractions using a rapid functional screen.J Biol Chem 1998，273(28)：17626-33)。因此存在着简化hFL制备工艺方法的需要。

另外，目前国内外在肿瘤的免疫基因治疗方面有很多突破。用腺病毒介导细胞因子进行免疫调节，提高机体的抗肿瘤免疫，治疗肿瘤已取得众多成就。选择相互间有协同免疫调节作用和抗肿瘤作用的细胞因子，进行联合基因治疗，是肿瘤免疫基因治疗的一大发展方向。关于多种细胞因子联合治疗恶性肿瘤的研究有很多，但迄今为止却没有关于在一个载体中联合表达hFL和hGM-CSF治疗恶性肿瘤的报道。

发明内容

因此，基于上述需要，本发明提供了编码人hFL的核酸序列以及使用该序列表达人hFL的方法以及联合表达hFL和hGM-CSF的方法及二者联合表达用于治疗恶性肿瘤的用途。

本发明涉及如SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列。

本发明还涉及含有所述的多核苷酸序列的载体，优选甲醇酵母穿梭载体。

本发明还涉及含有所述的载体的甲醇酵母阳性重组子。

本发明进一步涉及由所述的甲醇酵母阳性重组子表达的hFL，即SEQ IDNO.2的氨基酸序列。

本发明进一步涉及一种生产hFL的方法，其包括以下步骤；

1)将编码hFL的多核苷酸序列亚克隆到穿梭载体上，筛选含有阳性穿梭质粒的克隆；

2)将所述的阳性穿梭质粒转入甲醇酵母中，诱导表达以分泌形式表达的hFL；

3)将所述的分泌蛋白进行分离纯化；

其特征在于所述的编码hFL的多核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列。

本发明进一步涉及所述的hFL用于制备刺激造血干细胞增殖的药物中的用途

本发明还涉及所述的hFL用于制备抗恶性肿瘤的药物中的用途。

本发明进一步涉及如SEQ ID NO.3所示编码hFL的多核苷酸序列。

本发明进一步涉及含有所述的多核苷酸序列及编码hGM-CSF的多核苷酸序列的双基因的改造腺病毒穿梭质粒。

本发明进一步涉及含有所述的载体的重组腺病毒。

本发明进一步涉及所述的hFL和hGM-CSF联合表达用于制备抗恶性肿瘤的药物的用途。

本发明进一步涉及一种生产重组腺病毒的方法，其包括以下步骤：

1)将编码hFL以及hGM-CSF的多核苷酸序列亚克隆到改造的腺病毒穿梭载体上，筛选含有阳性穿梭质粒的克隆；

2)将所述的阳性穿梭质粒与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化感受态细菌BJ5183，在细菌内同源重组，产生重组腺病毒质粒

3)用脂质体转染技术将重组腺病毒质粒转入293细胞，7天后收集细胞，反复冻融释放第1代重组腺病毒

4)大量培养293细胞，用高效表达的重组腺病毒感染293细胞，3天后收集细胞，反复冻融后释放高滴度的重组腺病毒。应用GFP分析或MOI方法测定重组腺病毒滴度。

在本发明中可以使用的细胞培养系统有很多，例如原核细胞、哺乳动物和昆虫细胞培养系统，它们都可以被用来表达SEQ ID NO.2所示编码hFL的多核苷酸序列。

本发明所表达的hFL的活性较高，与mGM-CSF联用可以协同增强刺激小鼠骨髓GM-CFU集落形成。

本发明人利用甲醇酵母表达体系表达了分泌性hFL，并取得了期望的效果，其可以在甲醇酵母中取得高效表达，并采用Q-FF分离→浓缩→SephacrylS-200分离纯化，步骤简单有效。hFL生物学活性实验测定，单独应用hFL可以刺激小鼠骨髓有核细胞扩增，与mGM-CSF联用可以协同增强刺激小鼠骨髓GM-CFU集落形成。在鼠皮下移植EL4淋巴瘤模型的治疗实验中，实验组连续注射hFL 14天后，肿瘤比对照组减小，抑瘤率为24.9％，P值小于0.001，差别具有显著统计学意义。

FL与造血细胞因子GM-CSF之间存在有明显协同作用，两者联合注射小鼠，导致脾DC的数量明显高于两者单用，是对照组的75～100倍。所以，如果使用携带人FL和人GM-CSF两个基因的重组腺病毒，在体内同时表达FL和GM-CSF，可能会取得更佳的抗肿瘤效果。本发明人将编码人FL和人GM-CSF的多核苷酸序列重组到经本发明人改造过的腺病毒穿梭质粒上，得到含有双基因的重组腺病毒，并且，在小鼠抗肿瘤实验中取得30％的抑瘤效率。联合应用腺病毒介导的人FL和人GM-CSF，在体内增加树突状细胞的数量以抑制肿瘤，这一点在现有技术中没有报告。并且，令人意想不到的是，经本发明人改造过的腺病毒穿梭质粒使两个目的基因均获得高效表达。

附图说明

图1描述hFL基因片段的合成的示意图。

图2描述PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定。

图3描述重组质粒pPIC9K-hFL的构建过程。

图4描述阳性克隆pPIC9K-hFL酶切鉴定图谱：M：λDNA/Hind IIImarker；1：pPIC9K-hFL/Xho I+EcoR I；2：pPIC9K/Xho I+EcoR I；3：pPIC9K-hFL。

图5描述双膜原位杂交筛选高表达转化子中，不同酵母转化子hFL表达水平不同，导致免疫显色的强弱不同，箭头所示为一强染色克隆，代表其表达水平高。

图6描述Q-FF纯化酵母表达上清中的hFL。

图7描述反相高效液相层析纯化hFL。

图8描述hFL纯化的SDS-PAGE分析(考马斯亮蓝染色)M：marker；1.培养上清；2：Q-FF洗脱峰；3：S-200洗脱峰；4：RP-HPLC洗脱峰(含DTT)；5：RP-HPLC洗脱峰(不含DTT)。

图9描述纯化的hFL及部分去糖基化hFL的Western blotting分析1：纯化hFL(p.pastoris)；2：由EndoH部分去糖基化后的hFL(p.pastoris)；3：纯化hFL(E.coli)；4：阴性对照。

图10描述hFL对骨髓有核细胞增殖作用的生长曲线。

图11描述骨髓细胞集落形成曲线。

图12描述EL4淋巴瘤面积随时间变化曲线。

图13描述T载体-hFL和T载体-hGM-CSF的酶切图谱。M：λDNA/Hind IIImarker；1：T载体-hFL/Sal I+Xba I；2：T载体-hGM-CSF/AgeI+AleI。

图14描述pAdTrack-CMV-hFL、pAdTrack-CMV-hFL-hGM-CSF的酶切图谱。M：λDNA/Hind III marker；1：pAdTrack-CMV-hFL/Sal I+Xba I；

2：pAdTrack-CMV-hFL-hGM-CSF/Age I+Ale I。

图15描述穿梭质粒pAdTrack-CMV-hF-hGM-CSF的构建。

图16描述pAd-hFL-hGM-CSF PacI酶切图谱。M：λDNA/Hind III marker；1：pAd-hFL-hGM-CSF/PacI；2：pAd-hFL-hGM-CSF。

图17描述Ad-hFL-hGM-CSF感毒上清Western blotting分析。A：羊抗hFL一抗；B：兔抗hGM-CSF一抗。1：Ad-hFL-hGM-CSF感毒上清2：Ad-GFP感毒上清。

图18描述腺病毒体内表达的hFL浓度。

图19描述腺病毒体内表达的hGM-CSF浓度。

图20描述Ad-hFL-hGM-CSF感毒上清对骨髓有核细胞的增殖作用。

图21描述hGM-CSF对照品对TF1的增殖作用。

图22描述Ad-hFL-hGM-CSF感毒上清对TF1细胞的增殖作用。

图23描述脾脏中CD11c⁺细胞占脾脏核细胞的百分数。

图24描述脾脏细胞流式分析图。

图25描述EL4淋巴瘤面积随时间变化曲线。

优选实施方式

以下的参考实施例和试验实施例详细描述了本发明多核苷酸和本发明的所述的制备hFL的方法，其目的是进一步例示本发明，而不是限定其范围，本领域普通技术人员可以理解的是，在不背离本发明的发明要点的情况下，可以对本发明进行多种修改，而这些修改都在本发明的保护范围之内，因此，本发明权利要求的范围由所附的权利要求所决定。

1人FL在甲醇酵母中表达、纯化、体外活性测定及小鼠抗肿瘤实验

1.1人FL基因的获得

1.1.1人FL的核苷酸序列

SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列，是在编码人FL基因的156个密码子中，共有6个N端密码子替换为甲醇酵母偏爱密码子获得的，它们是第1、2、4、9、10、12位密码子。其具体替换见表1。并且将FL第84位赖氨酸的密码子AAA改变为谷氨酸的密码子GAG；第122位谷氨酰胺的密码子CAG改变为精氨酸的密码子AGA，以提高hFL生物学活性。

表1甲醇酵母偏爱密码子修改表

根据SEQ ID NO.1，设计并合成6对引物(P1-P2，P3-P4，P5-P6，P7-P8，P9-P10，P11-P12)(图1)。引物P1含XhoI酶切位点，P12含EcoR I酶切位点，相邻两个片段之间重叠15～17bp。以下是所述的PCR引物：

P1(60mers)：CCGCTCGAGA AGAGAACTCA AGACTGTTCC TTCCAACACT CTCCAATCTC TTCCGACTTC

P3(55mers)：ACCTGCTTCA AGATTACCCA GTCACCGTGG CCTCCAACCT GCAGGACGAG GAGCT

P5(53mers)：GTCCTGGCAC AGCGCTGGAT GGAGCGGCTC AAGACTGTCG CTGGGTCCAA GAT

P7(56mers)：AACACGGAGA TACACTTTGT CACCGAGTGT GCCTTTCAGC CCCCCCCCAG CTGTCT

P9(55mers)：CCGCCTCCTG CAGGAGACCT CCGAGCAGCT GGTGGCGCTG AAGCCCTGGA TCACT

P11(54mers)：GAGCTGCAGT GTCAGCCCGA CTCCTCAACC CTGCCACCCC CATGGAGTCC CCGG

P2(59mers)：AATCTTGAAG CAGGTAGTCA GACAGCTCAC GGATTTTGAC AGCGAAGTCG GAAGAGATT

P4(55mers)：AGCGCTGTGC CAGGACCAGC CGCCAGAGGC CCCCGCAGAG CTCCTCGTCC TGCAG

P6(55mers)：AGTGTATCTC CGTGTTCACG CGCTCCAGCA AGCCTTGCAT CTTGGACCCA GCGAC

P8(56mers)：CTCCTGCAGG AGGCGGGAGA TGTTGGTCTG GACGAAGCGA AGACAGCTGG GGGGGG

P10(56mers)：GCTGACACTG CAGCTCCAGG CACCGGGAGA AGTTTCTGCG AGTGATCCAG GGCTTC

P12(56mers)：GGAATTCTTA CGGGGCTGTC GGGGCTGTGG CCTCCAGGGG CCGGGGACTC CATGGG

将P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12配成50μmol/L浓度。第一轮进行两个片段拼接(依次P1与P2、P3与P4、P5与P6、拼接)。将P1与P2(P1、P2既是模板，又是引物)各取1μl，加入50μl的反应体系中(内含2.5mmol/L dNTP(Promega公司产品)8μl，10x buffer 5μl，Taq酶1-2U，必要时可加入适量的镁离子，以消毒的重蒸水补足体积)，表面加一层矿物油，放入PCR仪中。P3与P4、P5与P6、P7与P8、P9与P10、P11与P12也如此处理，根据模板和引物的情况设定反应程序，所述的反应程序为本领域普通技术人员已知的技术，分别扩增出P1-2、P3-4、P5-6、P7-8、P9-10、P11-12。将P1-2与P3-4各取1μl为模板，再分别加入P1、P4各50pmol进行第二轮PCR扩增4片段拼接产物P1-4。P5-8、P9-12也如此得到。将P1-4、P5-8PCR产物各取1μl为模板，分别加入P1、P8各50pmol进行第三轮PCR扩增8片段拼接产物为P1-8。P5-12类同。将P1-8、P5-12PCR产物各取1μl为模板，分别加入P1、P12各50pmol进行第四轮PCR扩增hFL基因全长。四轮PCR产物经2％ agarose电泳结果如图2。

1.2重组表达质粒pPIC9K-hFL的构建

将回收的PCR产物和表达质粒pPIC9K(购自Invitrogen，美国)分别用Xho I和EcoR I双酶切，然后用T4DNA连接酶连接，连接产物转化宿主菌DH5α。由于pPIC9K的卡那霉素基因中含有XhoI酶切位点，pPIC9K用Xho I和EcoR I双酶切后质粒骨架在卡那霉素基因处断为两个大片段。为保证正确连接，用Kana抗性筛选连接重组子(图3)。疑似阳性克隆用Xho I和EcoR I双酶切，得到一条501bp区带(图4)。利用invitrogen pPIC9KAOX-5’引物及3’引物对阳性克隆进行双向序列测定，结果与设计序列一致。

1.3重组蛋白在Pichia pastoris中的表达及纯化

1.3.1质粒转化酵母宿主菌：

重组表达质粒pPIC9K-hFL经SalI线性化后，取5～10μg与KM71感受态酵母菌80μl混合，转入0.2cm电转杯，冰浴5min后，利用BioRad电转仪(1500V，25μF，200Ω)进行电转，然后将菌液涂布于MD/-His选择平板上，30℃孵育2～3天，观察转化子生长。

1.3.2双膜原位杂交筛选高表达hFL转化子

将醋酸纤维素薄膜置于MD/-His平板的His⁺转化子菌落上，用涂布棒轻压使醋酸纤维素薄膜完全湿润并赶尽气泡，使所有菌落转移到醋酸纤维素薄膜上。在BMMY板上置一同样大小的硝酸纤维素薄膜，并将醋酸纤维素薄膜菌落向上置于硝酸纤维素薄膜上。30℃孵育18h后，将醋酸纤维素薄膜移至MD/-His平板上，4℃保存。将硝酸纤维素薄膜取下，6％小牛血清37℃封闭2h，TBS-T洗3次(每次10min)。兔抗hFL多克隆抗体(0.1μg/ml)室温孵育2h，TBS-T洗膜3次。然后羊抗兔IgG-AP(2u/ml)室温孵育2h，TBS-T洗膜3次。在15ml BCIP/NBT底物缓冲液中加入50μl BCIP和99μl NBT，室温反应5min后，用含5mmol/L EDTA的PBS终止反应。

电转时用不同的细胞浓度铺MD/-His板，每板得到100～1000个转化子。硝酸纤维素薄膜将透过醋酸纤维素薄膜的酵母外泌hFL捕获，根据免疫显色的强弱鉴定转化子表达水平的高低，各染色点对应于醋酸纤维素薄膜的相应菌落，不同菌落的显色强度有明显差异(图5)。

1.3.3高表达转化子的大量表达及纯化

由KM71得到的转化子全部为Mut^s型。将筛选到的高表达转化子接种到5mlBMG培养基中，30℃振荡培养16～18h，1∶500接种入400ml BMG培养基中，30℃振荡培养过夜至OD₆₀₀为2～6，离心收集菌体，用100ml BMM浓缩至OD₆₀₀为10～20后诱导表达，每隔24h补加甲醇至终浓度为2％，共诱导96h，离心收集酵母培养上清。

将培养上清用20mmol/L Tris-Cl(pH8.0)透析并经0.45-μm滤膜过滤后，上样于阴离子交换柱Q-FF，20mmol/L Tris-Cl(pH8.0)洗脱未结合蛋白，结合蛋白用线性盐梯度(0～0.8mol/L NaCl，20mmol/L Tris-Cl，pH8.0)洗脱，收集目的蛋白溶液经浓缩，再上样于用20mmol/L磷酸缓冲液(0.15mol/LNaCl，pH7.0)平衡的S-200，用同一缓冲液洗脱目的蛋白。以上操作皆在4℃进行。目的蛋白经反相高效液相层析(RP-HPLC)进一步纯化及鉴定。RP-HPLC柱用溶液A(2％乙腈，0.1％三氟醋酸TFA)平衡，以溶液A和溶液B(90％乙腈，0.1％TFA)的线性梯度洗脱。用15％SDS-PAGE检测各步纯化效果，凝胶考马斯亮蓝染色。

表达产物经阴离子交换柱Q-FF梯度洗脱时，在0.2mol/L和0.5mol/L NaCl梯度处分别有一个洗脱峰，前者为目的蛋白峰(图6)。收集该峰，浓缩后再经分子筛S-200纯化，RP-HPLC纯化及鉴定，得到一对称的目的蛋白峰，纯度达98％以上(图7)。各步纯化样品的SDS-PAGE图谱如图8，hFL在不含DTT的非还原性系统中的泳动速度比含有DTT的还原性缓冲液中稍快，其原因可能是蛋白质分子在二硫键存在时比全部打开的空间结构更紧密。hFL的主条带在22kD处，另有一小部分hFL由于糖基化程度不同，分子量较大，位于34kD处。

1.3.4酵母表达hFL的Western blotting鉴定

应用兔抗hFL一抗进行Western blotting鉴定。纯化的hFL Western blotting结果为阳性，说明酵母表达产物能与兔抗hFL多克隆抗体结合，对照组杂交呈阴性(图9)。最初认为SDS-PAGE图谱(图8)中34kD处的条带是杂蛋白，后来发现在各步纯化过程中34kD和22kD的蛋白总是基本同时洗脱下来，在Westernblotting中该条带同样显色，这可能是不同糖基化形式的hFL。经EndoH去除hFL的N-糖链后，Western blotting显示34kD区带消失，而且hFL主条带分子量变小，但仍高于大肠杆菌中表达的无糖基hFL(图9)，提示甲醇酵母表达的hFL中不仅存在N-糖基化，还可能有其他形式的糖基化。

1.4重组蛋白理化性质测定

将依次经Q-FF、S-200和RP-HPLC纯化的hFL进行理化性质测定。

1.4.1hFLN端氨基酸序列分析

酵母表达的hFL N端前10个氨基酸为TQDCSFQHSP，测序结果与设计一致。

1.4.2分子量测定

经Maldi-Tof-MS质谱法(Voyager-DE PRO)测定分子量，结果显示，重组蛋白分子量在20～22kD之间，显示具一定程度的糖基化。

1.4.3毛细管法测等电点

基础所中心实验室用Beckman毛细管电泳仪(P/ACE System 5500)测定hFL等电点为3.12～4.72，其呈不均一，可能是糖基化程度不同所致。

1.5重组蛋白体外活性测定：

1.5.1hFL对骨髓有核细胞的增殖作用：

1)颈部脱臼法处死小鼠，75％酒精浸泡1分钟消毒，解剖取股骨，剔除肌肉组织。

2)剪去股骨两端骨骺，用1ml注射器取生理盐水，将骨髓全部吹出，反复吹吸成单个细胞悬液。1000rpm×5’，弃上清。加入红细胞裂解液，1000rpm×5’，弃上清。

3)20％马血清的RPMI 1640重悬细胞，计数，稀释细胞至浓度2×10⁵/ml。

4)96孔板中，每孔加入80μl hFL，再加入80μl细胞悬液。hFL终浓度依次为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、100pg/ml、10pg/ml、0pg/ml。每浓度做4个复孔。37℃、5％CO₂培养9天。其间每天观察细胞增殖情况。

5)每孔加入20μl 5mg/ml MTT，37℃、5％CO₂孵育4hr后加入10％的酸化SDS(含有10mM HCl)，溶解结晶，37℃，5％CO2孵育过夜，测OD630值。

小鼠骨髓有核细胞体外培养3～4天时，观测到添加hFL的细胞数开始明显增多，而不含hFL组，细胞大部分开始死亡，大部分细胞在72小时内死亡。9天时，应用MTT法，绘制hFL对骨髓有核细胞的增殖作用的生长曲线(图10)。

1.5.2骨髓细胞集落形成试验

1)颈部脱臼法处死小鼠，75％酒精浸泡1分钟消毒，解剖取股骨，剔除肌肉组织。

2)剪去股骨两端骨骺，用1ml注射器取生理盐水，将骨髓全部吹出，反复吹吸成单个细胞悬液。1000rpm×5’，弃上清。加入红细胞裂解液，1000rpm×5’，弃上清。

3)1×1MDM重悬细胞，计数，稀释细胞至浓度2×10⁵/ml。

4)在1ml EP管中依次加入400μl1×IMDM，细胞因子，100μl细胞悬液。单独应用hFL组，加入hFL的终浓度依次为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、100pg/ml、10pg/ml，鼠GM-CSF(mGM-CSF)与hFL联合应用组，加入100ng/ml mGM-CSF，再加入hFL达终浓度100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、100pg/ml、10pg/ml、0pg/ml。

5)在每个1ml EP管中加入500μl含有20％胎牛血清、2％甲基纤维素的1×IMDM，颠倒混匀，加入六孔板中。

6)37℃、5％CO₂培养9天。计数超过50个细胞的克隆数。

单加入hFL的孔中无克隆形成。hFL+mGM-CSF组，随hFL浓度增加，克隆数目增加，且克隆大小，细胞数目也随hFL浓度而增加。培养第8天和第10天，在100×显微镜下，分别计数超过50个细胞小于100个细胞，及大于100个细胞的克隆数。见表2，表3，图11。

与现有技术相比，本发明所表达的hFL与mGM-CSF的协同作用明显增加，例如，在第8天，100pg/ml hFL与mGM-CSF联用组，每10⁵骨髓有核细胞形成90个克隆，比单独应用mGM-CSF组的克隆数增加9倍；100ng/ml hFL与mGM-CSF联用组，每10⁵骨髓有核细胞形成210个克隆，比单独应用mGM-CSF的克隆数增加21倍。Broxmeyer HE等应用200ng/ml hFL与mGM-CSF联用，每10⁵骨髓有核细胞形成82个克隆，比单独应用mGM-CSF的克隆数仅增加1倍左右，见：Broxmeyer HE，Lu L，Cooper S，et al.Flt3 ligand stimulates/costimulatesthe growth of myeloid stem/progenitor cells Experimental hematology，1995，23：1121-1129。

表2hFL+mGM-CSF组培养第8天克隆数

表3hFL+mGM-CSF组培养第10天克隆数

1.6重组蛋白体内抗肿瘤活性

鼠皮下移植EL4淋巴瘤模型的治疗实验：20～22克的雄性C57BL/6J小鼠12只，按照体重分笼，分为两组，使每组6只小鼠体重均匀。收集处于对数生长期的EL4淋巴瘤细胞，用PBS洗一次后，细胞计数，调整浓度至2×10⁶/ml。在每只小鼠右肋皮下注射100μl充分混匀的上述细胞悬液，眼科镊夹住10秒钟，防止回漏。治疗组自第三天开始，每天皮下注射hFL蛋白30μg，连续14天。对照组每天注射100μl PBS。

小鼠右肋皮下注射2×10⁵EL4细胞后，第九天可摸到包块，隔天测量肿瘤最长径a与最短径b(mm)，绘制肿瘤面积S＝ab(mm²)增长曲线(图12)。待肿瘤长至22天，处死小鼠，解剖取肿瘤组织，称重(表4)，计算肿瘤抑制率：

表4小鼠接种肿瘤22天后瘤重

hFL组与PBS组相比，肿瘤大小有显著差异，肿瘤抑制率为24.9％，经t检验，该差异具有显著统计学意义(P＜0.001)。

2重组腺病毒介导的hFL和hGM-CSF抗恶性肿瘤治疗

2.1细菌内同源重组法制备出高滴度重组腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF和Ad-GFP

2.1.1编码hFL和hGM-CSF DNA片段两端引物的设计及DNA片段获得

以重组酵母质粒pPIC9K-hFL作为模板，共设计五条5’端引物和一条3’引物。

第一条5’端引物采用Sal I酶切位点GTCGAC，这样使得hFL mRNA的5’UTR长度为37bp，适于核糖体的结合以高效表达。加入KOZAK序列(gcc gcc accATGg)，+4位由A改为G，由此，第二个氨基酸由ACA(Thr)改变为GGA(gly)。第二、三条5’端引物设计hFL自身的信号肽26个氨基酸：MGVLAPAWSPTTYLLLLLLLSSGLSG的编码序列，并将第五个氨基酸ALA的密码子由GCG改为GCC，这样可减少引物自身形成的茎环结构中的一个配对，并且是高表达密码子，以增加mRNA的翻译效率；第四、五条5’端引物将酵母嗜好密码子改为hFL原来真核表达的密码子。

3’引物含有XbaI酶切位点TCTAGA，设计两个不同的终止密码子，并在其后加入嘌呤A(TAA TGA A)，以确保终止表达。C端第一和第四个氨基酸Pro的密码子由CCG改为CCC，C端第三个氨基酸Thr的密码子由ACA改为ACC，均为真核偏好密码子。

编码hFL的核苷酸序列为SEQ ID NO.3的序列。

以本室保存的含有hGM-CSF cDNA序列的重组质粒HTB194作为模板，设计一条5’端引物和一条3’引物。5’引物含有AgeI酶切位点ACCGGT，KOZAK序列(ggAG GATG)。3’引物含有AleI酶切位点CACCAGGGTG，设计两个不同的终止密码子，并在其后加入嘌呤A(TAA TGAA)，以确保终止表达。

编码hGM-CSF的核苷酸序列为

ACCGGTggAG GATGTGGCTG CAGAGCCTGC TGCTCTTGGG CACTGTGGCC TGCAGCATCT

CTGCACCCGC CCGCTCGCCC AGCCCCAGCA CGCAGCCCTG GGAGCATGTG AATGCCATCC

AGGAGGCCCG GCGTCTCCTG AACCTGAGTA GAGACACTGC TGCTGAGATG AATGAAACAG

TAGAAGTCAT CTCAGAAATG TTTGACCTCC AGGAGCCGAC CTGCCTACAG ACCCGCCTGG

AGCTGTACAA GCAGGGCCTG CGGGGCAGCC TCACCAAGCT CAAGGGCCCC TTGACCATGA

TGGCCAGCCA CTACAAGCAG CACTGCCCTC CAACCCCGGA AACTTCCTGT GCAACCCAGA

TTATCACCTT TGAAAGTTTC AAAGAGAACC TGAAGGACTT TCTGCTTGTC ATCCCCTTTG

ACTGCTGGGA GCCAGTCCAG GAGTGATAAG CACCCTGGTG

以下是所述的PCR引物：

hFL的5’引物

P1(25mers)：GGTCGACGCC GCCACCATGG GAGTG

P2(59mers)：GAAGATCTAT GACAGTGCTG GCGCCAGCCT GGAGCCCAAC AACCTATCTC CTCCTGCTG

P3(59mers)：CCTATCTCCT CCTGCTGCTG CTGCTGAGCT CGGGACTCAG TGGGACCCAG GACTGCTCC

P4(35mers)：CGGGATCCCT TGTTCCAAGG ACCCAGGACT GCTCC

P5(56mers)：ATTTTGACAG CGAAGTCGGA GGAGATGGGGCTGTGTTGGA AGGAGCAGTC CTGGGT

hFL的3’引物

P6(33mers)：GCTCTAGATT CATTAGGGGG CGGTGGGGGC TGT

hGM-CSF的5’引物及3’引物

P5(24mers)：GCGACCGGT GGAG GATGTGGCTG C

P6(31mers)：GCACCAGGGTG CTTATCACTC CTGGACTGGC

从酵母表达质粒pPIC9K-hFL上PCR出含自身信号肽的基因hFL，连接到T载体，疑似阳性克隆用Sal I和Xba I双酶切，得到一条574bp区带(图13)，由TaKaRa公司测序正确。

从重组质粒HTB194上PCR出含信号肽的基因hGM-CSF，连接到T载体，疑似阳性克隆用AgeI和AleI双酶切，得到一条460bp区带(图13)，由TaKaRa公司测序正确。

2.1.2穿梭质粒pAdTrack-CMV-hFL和pAdTrack-CMV-hFL-hGM-CSF的构建

穿梭质粒pAdTrack-CMV用Sal I和Xba I双酶切，0.8％凝胶电泳，回收大片段。将T载体-hFL同样用SalI和Xba I双酶切，1.5％凝胶电泳，回收hFL DNA片段。两者的回收产物用T4DNA连接酶连接，于13℃保温过夜，使hFL基因定向克隆至pAdTrack-CMV。将连接产物转化感受态DH5α，筛选插入hFL DNA的阳性克隆，小量提取质粒经SalI和XbaI酶切鉴定(图14)。

为了得到含有双基因的穿梭质粒pAdTrack-CMV-hFL-hGM-CSF，将鉴定正确的pAdTrack-CMV-hFL用AgeI和AleI双酶切，0.8％凝胶电泳，回收大片段。将T载体-hGM-CSF同样用AgeI和AleI双酶切，1.5％凝胶电泳，回收hGM-CSF DNA。两者的回收产物用T4DNA连接酶连接，13℃保温过夜，使hGM-CSF基因定向克隆至pAdTrack-CMV-hFL(图15)。将连接产物转化感受态DH5α，筛选插入hGM-CSF DNA的阳性克隆，小量提取质粒经AgeI和AleI双酶切鉴定(图14)。

2.1.3细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAd-hFL-hGM-CSF和pAd-GFP

取0.5μg穿梭质粒pAdTrack-CMV-hFL-hGM-CSF和pAdTrack-CMV，分别用Pme I酶切，使之线性化，然后电泳回收，分别溶于6μl H₂O。分别加1μl pAdEasy-1(约0.1μg)，混匀，然后加40μl电感受态BJ5183菌，混匀，转移至冰浴的电转杯，在2.5kv/200Ω/25μF条件下进行电转化，立即加入500μl LB培养基，混匀，转移到1.5ml Ep管，于37℃保温15～20分钟，取50～200μl涂于LB/Kan(50μg/mL)平板，37℃孵箱过夜(16～20hrs)。挑取10～20个最小的菌落接种于3mL含kan50μg/ml的LB中，37℃摇床培养12～15hrs。按碱裂法小量提取质粒，先取少量质粒电泳，可疑阳性质粒用PacI酶切，正确重组的质粒可出现一条大的片段(约35kb)和一条小的片段(3.0kb或4.5kb)(图16)。取鉴定正确的pAd-hFL-hGM-CSF和pAd-GFP质粒各1～2μl于DH10B中进行电转化，然后进行质粒大量扩增，用EndoFree^TM Plasmid Maxi Kit纯化质粒备用。

2.1.4重组体腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF和Ad-GFP的包装

转染前1天，在T-25培养瓶中接种2×10⁶293细胞，至转染时细胞约为50％～70％汇合度。取质粒pAd-hFL-hGM-CSF和pAd-GFP各4μg分别用Pac I酶切，酚、酚/氯仿、氯仿各抽提1次，乙醇沉淀，70％乙醇洗涤两次，超净台室温吹干，溶于20μl ddH₂O，再加20μl Lipofectamine2000一起混合于500μl

I，室温孵育10～30分钟。在等待时，将T-25培养瓶中293细胞培养基倒去，用4ml

I洗1次，再加2.5ml

I，重新置于37℃CO₂孵箱约10分钟。将上述Lipofectamine2000-DNA混合物加入培养瓶，放回37℃ CO₂孵箱孵育4hrs。弃去含Lipofectamine2000-DNA混合物的培养液上清，加6mlDMEM 5％，继续培养7～10天，转染后5天内每2～3天换6mL DMEM 5％1次，5天以后不再换培养基。转染后1～2天pAd-GFP在荧光显微镜下可看见细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达，以后逐渐增多，7～10天达高峰，8天左右细胞部分脱落；转染后7～10天后离心收集细胞，弃上清，细胞沉淀悬浮于2ml DPBS，37℃/-70℃反复冻融4次，简单离心，留上清，保存于-70℃，是为第1代腺病毒液，滴度可达10⁷pfu/ml。取1.0ml上清转染2瓶T-2550％～70％汇合的293细胞，约2～3天后即可见到CPE，在荧光显微镜下观察，可见到细胞内大量GFP表达，转染后3～5天，当大约1/3～1/2的293细胞脱落时，离心收集细胞，按上述方法收集病毒，是为第2代腺病毒，滴度可达10⁹pfu/ml以上。

pAd-hFL-hGM-CSF中由于不含GFP基因，所以在荧光显微镜下看不到绿色荧光，但是可观察到CPE，细胞病变，胀大变圆，成团飘浮。其余步骤同上。

2.1.5重组体腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF和Ad-GFP的鉴定

Ad-GFP重组腺病毒不需进一步鉴定，只要在第1代腺病毒转染的293细胞中能看见荧光物质即可。Ad-hFL-hGM-CSF的鉴定采用Western blotting法。

pAd-GFP第3代腺病毒感染293细胞的培养上清作为阴性对照，pAd-hFL-hGM-CSF第4代腺病毒感染293细胞的培养上清为待测标本。

分别应用羊抗hFL一抗，兔抗hGM-CSF一抗，做pAd-hFL-hGM-CSF感毒上清的Westernblotting，结果均为阳性，且分子量高于原核表达蛋白的分子量，说明培养上清中的hFL和hGM-CSF均有一定程度糖基化。对照组杂交呈阴性(图17)。

2.1.6腺病毒pAd-hFL-hGM-CSF和pAd-GFP的大量扩增、保存

鉴定为阳性的重组体腺病毒，在293细胞中进行繁殖。以MOI＝10～20感染48小时后，细胞出现完全病变时，收集细胞，离心弃去培养基，用少量DPBS重悬细胞。经冻融三次，3000rpm离心10min，吸取上清加10％甘油，然后用0.2μm的滤膜过滤除菌，分装后于-70℃保存。

2.1.7滴度测定

1)绿色荧光蛋白计数法：

测定前1天，取数个Ф60mm培养皿，每皿接种2×10⁶个293细胞，至第2天约为70％～90％汇合。按有限稀释法，取不同稀释度的病毒上清1ml感染293细胞，37℃ CO₂孵箱孵育90分钟，再加DMEM5％4ml，于转染后18小时，在荧光显微镜下计数表达GFP的细胞数，按公式：病毒滴度＝病毒稀释倍数×GFP阳性细胞数(pfu/ml)。用该方法测出的病毒滴度为具有转染能力的完整腺病毒滴度(pfu-plaque forming unit，空斑形成单位)。

2)MOI法

用12个35mm平皿(或2个6孔板)，按8×10⁵细胞/平皿(孔)量接种293细胞，培养过夜。取待测病毒液0.15ml加入装有1.35ml PBS的Eppendorf管中，混匀后依次作10×倍比稀释至第5管，取每一稀释度的病毒液按0.5ml/平皿(孔)量感染293细胞，培养36～48小时后，观察细胞病变，用近100％细胞出现病变的病毒稀释度，代入下列公式计算病毒滴度，公式中假定每个细胞感染10个病毒，在36～48小时内能导致细胞病变。

按常规方法大量制备腺病毒Ad-GFP和Ad-hFL-hGM-CSF，浓缩后测定其滴度为5×10¹⁰pfu/ml。

2.2体内外表达量测定

2.2.1体外表达量测定

将1×10⁶个293细胞接种在6孔板内，37℃、5％CO₂孵育4hr使细胞贴壁。按照MOI＝30，用腺病毒Ad-GFP、Ad-hFL-hGM-CSF分别感染293细胞。收集24hr上清。以一定倍数进行稀释，应用R&D hFL和hGM-CSF免疫检测试剂盒，测定hFL和hGM-CSF含量。如表5，表6。

表5腺病毒体外表达的hFL浓度

	293
		Ad-GFP	低于15.6pg/ml<sup>*</sup>
Ad-hFL-hGM-CSF	96ng/ml

15.6pg/ml^*为该试剂盒的检测最低值

表6腺病毒体外表达的hGM-CSF浓度

	293
		Ad-GFP	低于7.8pg/ml<sup>*</sup>
Ad-hFL-hGM-CSF	306ng/ml

7.8pg/ml^*为该试剂盒的检测最低值

2.2.2体内表达量测定

小鼠分别皮下注射腺病毒Ad-GFP、Ad-hFL-hGM-CSF 5×10⁹pfu，取4hr、8hr、24hr、48hr、96hr、8天、11天的小鼠尾血50μl，室温放置1hr，3000rpm×15’离心，取血清，以一定倍数进行稀释，应用R&D hFL和hGM-CSF免疫检测试剂盒，测定hFL和hGM-CSF含量。

注射Ad-hFL-hGM-CSF组，血清中hFL在24小时达到最高峰25ng/ml，hGM-CSF在8小时达到最高峰3.3ng/ml，并持续8～11天，仍能检测到表达(图18，图19)。注射Ad-GFP组，血清中始终未检测到hFL和hGM-CSF的表达。

2.3体外活性测定

2.3.1重组腺病毒感染293表达的hFL对骨髓有核细胞的增殖作用

将1×10⁶个293细胞接种在6孔板内，37℃、5％CO₂孵育4hr使细胞贴壁。按照MOI＝30，用腺病毒Ad-GFP、Ad-hFL-hGM-CSF感染293细胞。收集24hr上清，-20℃冻存备用。

1)颈部脱臼法处死小鼠，75％酒精浸泡1分钟消毒，解剖取股骨，剔除肌肉组织。

2)剪去股骨两端骨骺，用1ml注射器取生理盐水，将骨髓全部吹出，反复吹吸成单个细胞悬液。1000rpm×5’，弃上清。加入红细胞裂解液，1000rpm×5’，弃上清。

3)20％马血清的RPMI 1640重悬细胞，计数，稀释细胞至浓度2×10⁵/ml。

4)96孔板中，每孔20μl的Ad-GFP、Ad-hFL-hGM-CSF感毒上清，加入20％马血清的RPMI 1640 20μl，每个样品设4个平行孔。再加入80μl的细胞悬液。37℃、5％CO₂培养9天。其间每天观察细胞增殖情况。

5)每孔加入20μl 5mg/ml MTT，37℃、5％CO₂孵育4hr后加入10％的酸化SDS(含有10mM HCl)，溶解结晶，37℃，5％CO2孵育过夜，测OD630值。

小鼠骨髓有核细胞在体外培养，3～4天时，观测到添加Ad-hFL-hGM-CSF感毒上清组细胞数开始明显增多，而添加Ad-GFP感毒上清组及空白对照组，细胞大部分开始死亡，细胞数减少，大部分细胞在72小时内死亡。9天时，应用MTT法测定细胞增殖作用(图20)。

2.3.2Ad-hFL-hGM-CSF感染293表达的hGM-CSF刺激TF1细胞增殖的作用

将1×10⁶个293细胞接种在6孔板内，37℃、5％CO₂孵育4hr使细胞贴壁。按照MOI＝30，用腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF感染293细胞。收集24hr上清，-20℃冻存备用。

将处在对数生长期内的TF1细胞用不含因子的RPMI 1640培基洗两次后，用不含因子的培养基将细胞悬液的浓度调整为2×10⁶/ml。在96孔板中，每孔加入100μl四倍梯度稀释的感毒上清，再接种100μl TF1细胞悬液，hGM-CSF终浓度依次为0.009ng/ml、0.037ng/ml、0.15ng/ml、0.59ng/ml、2.34ng/ml、9.38ng/ml。阳性对照每孔加入100μl四倍梯度稀释的hGM-CSF标准品，再接种100μl TF1细胞悬液，hGM-CSF终浓度依次为0.024ng/ml、0.097ng/ml、0.39ng/ml、1.5625ng/ml、6.25ng/ml、25ng/ml。每浓度做3个复孔。37℃、5％CO₂培养4天。其间每天观察细胞增殖情况。每孔加入20μl 5mg/ml MTT，37℃、5％CO₂孵育4hr后加入10％的酸化SDS(含有10mM HCl)，溶解结晶，37℃，5％CO2孵育过夜，测OD630值。

TF1细胞在不含有hGM-CSF的培养基中，自第二天开始逐渐死亡。添加Ad-hFL-hGM-CSF感毒上清组细胞数明显增多，4天后，应用MTT法，绘制hGM-CSF对TF1细胞增殖作用曲线，与hGM-CSF对照品基本吻合(图21，图22)。

2.4腺病毒介导人hFL和hGM-CSF联合基因扩增小鼠体内DC

1)C57BL/6J小鼠分别皮下注射5×10⁹pfu Ad-GFP、Ad-hFL-hGM-CSF。

2)第8天，颈部脱臼法处死小鼠，解剖取脾称重。用玻璃注射器芯在100目筛网上研磨脾脏，用PBS’(PBS’配制：PBS+1～2％灭活FCS+0.09％叠氮钠)制备单细胞悬液，离心1000rpm×5’，弃上清。加入红细胞裂解液，1000rpm×5’，弃上清。

3)PBS’重悬细胞，计数，调整细胞浓度为10⁷/ml。

4)取100μl细胞于管中，加入PE标记的抗小鼠CD11c抗体5μl和FITC标记的抗小鼠CD11b抗体0.5μl，混匀避光，冰浴30～45min。

5)加入100～200μl冷PBS’，250g/1500rpm×5’，2ml PBS’再洗一次。0.5ml冷PBS’重悬，流式细胞仪检测。

注射Ad-hFL-hGM-CSF的小鼠脾脏显著增大，总的脾脏细胞数增加到正常值的～2倍，而注射Ad-GFP的小鼠脾脏则无明显变化。Ad-hFL-hGM-CSF组，脾脏中CD11c⁺细胞(与DC的表面标志一致)百分数平均达14.4％，而正常小鼠的脾脏DC不足0.5％，CD11c⁺DC数目显著增加至正常值的～50倍(图23，图24)。

2.5腺病毒介导人FL和人GM-CSF联合基因治疗小鼠恶性肿瘤

20～22克的雄性C57BL/6J小鼠18只，按照体重分笼，使每组6只小鼠体重均匀。收集处于对数生长期的EL4淋巴瘤细胞，用PBS洗一次后，细胞计数，调整浓度至2×10⁶/ml。在每只小鼠右肋皮下注射100μl充分混匀的上述细胞悬液，眼科镊夹住10秒钟，防止回漏。在注射肿瘤前三天，隔天皮下注射Ad-GFP、Ad-hFL-hGM-CSF 5×10⁹pfu，共注射四次。对照组每天注射100μl PBS。待肿瘤长出后，隔天用卡尺测量肿瘤最长径a与最短径b(mm)，计算肿瘤面积S＝ab(mm²)，绘制肿瘤面积增长曲线(图25)。待肿瘤长至21天，处死小鼠，解剖取肿瘤组织，称重(表7)，计算肿瘤抑制率。

表7小鼠接种肿瘤21天后瘤重

^*实验第5天意外死亡，与样品无关。

Ad-hFL-hGM-CSF组与PBS组、GFP相比，肿瘤大小有明显差异，肿瘤抑制率为30％，经t检验，该差异具有统计学意义(P＜0.05)。

序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所

<120>一种人FL多核苷酸及其与人GM-CSF联合基因治疗恶性肿瘤的用途

<130>CGCNC41289

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>468

<212>DNA

<213>酵母

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(468)

<223>

<400>1

act caa gac tgt tcc ttc caa cac tct cca atc tct tcc gac ttc gct     48

Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala

1               5                   10                  15

gtc aaa atc cgt gag ctg tct gac tac ctg ctt caa gat tac cca gtc     96

Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val

            20                  25                  30

acc gtg gcc tcc aac ctg cag gac gag gag ctc tgc ggg ggc ctc tgg    144

Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp

        35                  40                  45

cgg ctg gtc ctg gca cag cgc tgg atg gag cgg ctc aag act gtc gct    192

Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala

    50                  55                  60

ggg tcc aag atg caa ggc ttg ctg gag cgc gtg aac acg gag ata cac    240

Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His

65                  70                  75                  80

ttt gtc acc gag tgt gcc ttt cag ccc ccc ccc agc tgt ctt cgc ttc    288

Phe Val Thr Glu Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe

                85                  90                  95

gtc cag acc aac atc tcc cgc ctc ctg cag gag acc tcc gag cag ctg    336

Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu

            100                 105                 110

gtg gcg ctg aag ccc tgg atc act cgc aga aac ttc tcc cgg tgc ctg    384

Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Arg Asn Phe Ser Arg Cys Leu

        115                 120                 125

gag ctg cag tgt cag ccc gac tcc tca acc ctg cca ccc cca tgg agt    432

Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser

    130                 135                 140

ccc cgg ccc ctg gag gcc aca gcc ccg aca gcc ccg                    468

Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro

145                 150                 155

<210>2

<211>156

<212>PRT

<213>酵母

<400>2

Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala

1               5                   10                  15

Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val

            20                  25                  30

Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp

        35                  40                  45

Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala

    50                  55                  60

Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His

65                  70                  75                  80

Phe Val Thr Glu Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe

                85                  90                  95

Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu

            100                 105                 110

Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Arg Asn Phe Ser Arg Cys Leu

        115                 120                 125

Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser

    130                 135                 140

ProArg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro

145                 150                 155

<210>3

<211>574

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(16)..(561)

<223>

<400>3

gtcgacgccg ccacc atg gga gtg ctg gcc cca gcc tgg agc cca aca acc   51

                 Met Gly Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Thr Thr

                 1               5                   10

tat ctc ctc ctg ctg ctg ctg ctg agc tcg gga ctc agt ggg acc cag    99

Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln

        15                  20                  25

gac tgc tcc ttc caa cac agc ccc atc tcc tcc gac ttc gct gtc aaa    147

Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys

    30                  35                  40

atc cgt gag ctg tct gac tac ctg ctt caa gat tac cca gtc acc gtg    195

Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val

45                  50                  55                  60

gcc tcc aac ctg cag gac gag gag ctc tgc ggg ggc ctc tgg cgg ctg    243

Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu

                65                  70                  75

gtc ctg gca cag cgc tgg atg gag cgg ctc aag act gtc gct ggg tcc    291

Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser

            80                  85                  90

aag atg caa ggc ttg ctg gag cgc gtg aac acg gag ata cac ttt gtc    339

Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val

        95                  100                 105

acc gag tgt gcc ttt cag ccc ccc ccc agc tgt ctt cgc ttc gtc cag    387

Thr Glu Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln

    110                 115                 120

acc aac atc tcc cgc ctc ctg cag gag acc tcc gag cag ctg gtg gcg    435

Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala

125                 130                 135                 140

ctg aag ccc tgg atc act cgc aga aac ttc tcc cgg tgc ctg gag ctg    483

Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Arg Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu

                145                 150                 155

cag tgt cag ccc gac tcc tca acc ctg cca ccc cca tgg agt ccc cgg    531

Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg

            160                 165                 170

ccc ctg gag gcc aca gcc ccc acc gcc ccc taatgaatct aga             574

Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro

        175                 180

<210>4

<211>182

<212>PRT

<213>人

<400>4

Met Gly Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu

1               5                   10                  15

Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phe

            20                  25                  30

Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu

        35                  40                  45

Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu

    50                  55                  60

Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln

65                  70                  75                  80

Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly

                85                  90                  95

Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Glu Cys Ala

            100                 105                 110

Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser

        115                 120                 125

Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp

    130                 135                 140

Ile Thr Arg Arg Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro

145                 150                 155                 160

Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala

                165                 170                 175

Thr Ala Pro Thr Ala Pro

            180

<210>5

<211>460

<212>DNA

<213>人

<400>5

accggtggag gatgtggctg cagagcctgc tgctcttggg cactgtggcc tgcagcatct    60

ctgcacccgc ccgctcgccc agccccagca cgcagccctg ggagcatgtg aatgccatcc   120

aggaggcccg gcgtctcctg aacctgagta gagacactgc tgctgagatg aatgaaacag   180

tagaagtcat ctcagaaatg tttgacctcc aggagccgac ctgcctacag acccgcctgg   240

agctgtacaa gcagggcctg cggggcagcc tcaccaagct caagggcccc ttgaccatga   300

tggccagcca ctacaagcag cactgccctc caaccccgga aacttcctgt gcaacccaga   360

ttatcacctt tgaaagtttc aaagagaacc tgaaggactt tctgcttgtc atcccctttg   420

actgctggga gccagtccag gagtgataag caccctggtg                         460

Claims (11)

1.一种多核苷酸序列，选自SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的多核苷酸序列。

2.含有权利要求1所述的多核苷酸序列的穿梭载体。

3.根据权利要求2所述的穿梭载体为甲醇酵母载体。

4.含有权利要求2所述的穿梭载体的甲醇酵母阳性重组子。

5.如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

6.一种生产人FL的方法，其包括以下步骤：

1)将编码hFL的多核苷酸序列亚克隆到穿梭载体上，筛选含有阳性穿梭质粒的克隆；

2)将所述的阳性穿梭质粒转入甲醇酵母中，诱导表达以分泌形式表达的hFL；

3)将所述的分泌蛋白进行分离纯化；

其特征在于所述的编码hFL的多核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列。

7.根据权利要求5所述的氨基酸序列用于制备刺激造血干祖细胞增殖的药物或抗恶性肿瘤药物中的用途。

8.含有权利要求1所述的多核苷酸序列及编码hGM-CSF的多核苷酸的改造腺病毒穿梭质粒。

9.含有权利要求8所述的质粒的重组腺病毒。

10.如权利要求6所述的hFL和hGM-CSF联合表达用于制备抗恶性肿瘤药物中的用途。

11.一种生产联合表达如权利要求6所述的hFL以及hGM-CSF的重组腺病毒的方法，其包括以下步骤：

1)将编码hFL以及hGM-CSF的多核苷酸序列亚克隆到改造的腺病毒穿梭载体上，筛选含有hFL和hGM-CSF基因的阳性穿梭质粒的克隆；

2)将所述的阳性穿梭质粒与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化感受态细菌BJ5183，在细菌内同源重组，产生重组腺病毒质粒；

3)用脂质体转染技术将重组腺病毒质粒转入293细胞，7天后收集细胞，反复冻融释放第1代重组腺病毒；

4)大量培养293细胞，用高效表达的重组腺病毒感染293细胞，3天后收集细胞，反复冻融后释放高滴度的重组腺病毒，测定重组腺病毒滴度。

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