CN1125479A - Flt3受体的配体 - Google Patents

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Abstract

揭示了flt3受体的配体能够传输更新信号来调节祖代细胞和干细胞的生长，增殖或分化。本发明涉及作为一分离蛋白质的flt3-L，编码flt3-L的DNA，用编码flt3-L的cDNA转染的宿主细胞，含有flt3-L的复方，使用flt3-L提高转送基因至哺乳动物的方法，以及通过使用flt3-L提高移植的方法。flt3-L可在治疗有贫血病，AIDS和其他不同的癌症病人中有用。

Description

FLT3受体的配体
发明领域
本发明涉及哺乳动物的flt3-配体、编码此类配体的核酸、生产重组flt3-配体的过程、含此类配体的药品以及它们在各种不同的疗法中的应用等。
发明背景
血细胞起源于造血干细胞，造血干细胞沿着确定的系谱即红血球、巨核细胞、粒性白细胞、单核白细胞和淋巴细胞进行分化。促进细胞前体增殖和成熟的细胞素被称为“集落刺激因子”(CSFs)。T-淋巴细胞可以产生几类CSFs，包括白细胞介素3(IL-3)、粒性白细胞-单核白细胞CSF(GM-CSF)、粒性白细胞CSF(G-CSF)和单核白细胞CSF(M-CSF)。这些CSFs既能够影响成熟细胞又能影响干细胞，但迄今尚未发现能够主要对干细胞产生影响的因子。
酪氨酸激酶受体(TKRs)是调节很多细胞增殖和分化的生长因子受体(Yarden，Y.和Ollrich，A.Annu.Rev.Biochem.，57，443—448，1988；以及Cadena DL和Gill GN，FASEB J.，6，2332—2337，1992)。在造血系统中某些TKRs在发挥功能。例如，通过集落刺激因子1型(CSF-1)发出信号，受体c-fms调节单核白细胞的存活、生长和分化(Stanley等，J.Cell Biochem.，21，151—159，1983)。“钢因子”(SF，也被认为是肥大细胞生长因子，干细胞因子或成套配体)，通过c-kit来进行作用，促进髓样区和淋巴样区细胞的增殖。
flt3(Ronsnet等，Oncogene，6，1641—1650，1991)和flk-2(Matthews等，Cell，65，1143—1152，1991)是与c-fms和c-kit的受体有关的TKR的不同形式，flk-2的基因产物被表达于造血细胞和祖代细胞，而flt3的基因产物分布于更加广泛的组织中。flt3和flk-2的受体蛋白在氨基酸顺序上相类似，但在细胞外区域中二者在两个氨基酸残基上具有差异，并且在近C-末端的一个具有31个氨基酸的片段上二者具有趋异性(Lyman等，Oncogere，8，815—822，1993)。
flt3-配体(flt3-L)还被发现可以调节祖代细胞和干细胞的生长和分化，似乎在治疗造血功能紊乱上具有临床应用的价值，尤其是治疗再生障碍性贫血和髓组织再生障碍性综合症。此外，对于受到细胞减少以及细胞扩展疗法的病人在进行同源的、异源的或自身骨髓移植时，flt3-L是有用的。同样，flt3-L在进行基因治疗以及祖代细胞和干细胞的动员系统中也上有用的。
癌症通常是采用电离辐射和化学毒素来杀死迅速分裂的细胞的细胞减少疗法来治疗的。由于对正常细胞的细胞毒性作用而带来了典型的副作用限制了细胞减少疗法的应用。常见的副作用是骨髓抑制，或者损害了产生红细胞、白细胞和血小板的骨髓细胞。而骨髓抑制的结果，将使病人产生血细胞减少症，或血细胞缺乏，这些将增加感染和出血紊乱的危险。
血细胞减少症会增加发病率及死亡率，并导致在癌症治疗中的低剂量服药。许多临床调查者已经使用按照计划来服药的细胞减少疗法来增加癌症治疗的服药量，同时又可以限制其对骨髓的损害。一种办法是进行骨髓或外缘的血细胞移植，其中骨髓或循环造血的祖代细胞或干细胞在进行细胞减少疗法之前被移去，然后在治疗之后被重新注入以恢复其造血机能。美国专利5,199,942号及其文献描述了一种方法，在自体的移植治疗方案中使用了GM-CSF，IL-3，SF，GM-CSF/IL-3融合蛋白，促红细胞生成素(“FPO”)及其组合。
高剂量服药的化学治疗在治疗上是有益的，因为与标准剂量治疗法相比较，它可以提高患转移癌症尤其是乳腺癌病人的目标应答频率。它可导致一些甚至预后不良病人的长期无病缓解。然而，高剂量服药的化学治疗具有毒性，很多会导致与感染、出血紊乱、其它与长期骨髓再生障碍相联系的影响等有关的临床并了症。
骨髓再生障碍性综合症是干细胞发生紊乱，其特征为细胞成熟受损，进行性的各类血细胞减少症和成熟细胞的功能失常。其特征还表现为不同程度的血细胞减少症，无效的红细胞生成和伴有正常或数量增加以及具有特殊形态的骨髓细胞的骨髓细胞生成。Bennett等(Br.J.Haematol.1982，51，189—199)将这些紊乱症状划分成5种亚型：顽固性贫血，具有环状成高铁红细胞的顽固性贫血，具有过量未成熟细胞的顽固性贫血，具有过量转型未成熟细胞的顽固性贫血和慢性骨髓单核细胞白血病。虽然这些病人中的大部分会发展成急性白血病，绝大多数死亡是缘于感染或出血的并发症。使用视黄酸、维他命D和阿糖胞苷治疗这些综合症并不成功。具有这些综合症的大多数病人年龄较大且不适于进行骨髓移植或具有损害的抗白血病的化学疗法。
再生障碍性贫血上另一种疾病，其特征表现为骨髓受损和严重的血细胞减少症。与骨髓的再生障碍性综合症不同，在这类疾病中骨髓是无细胞或细胞减少的。如今的治疗包括从一组织相容性供体进行骨髓移植或用抗胸腺细胞球蛋白(ATG)进行免疫抑制处理。与骨髓再生障碍性综合症相类似，具有这些综合症的大多数病人年龄较大且不适于进行骨髓移植或具有损害的抗白血病的化学治疗。由于感染或出血的并发症，这类病人的死亡率特别高。
在具有获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的病人中贫血是很常见的。在接受Zidovudine治疗的病人中贫血通常更严重。很多重要的还原病毒药物，抗感染药和抗肿瘤药抑制红细胞生成。重组EPO已显示能够使病人的血细胞比容和血红蛋白水平变正常，但无论如何，通常需要高剂量的服药。一种能够促进红血球谱系增殖的生长因子可以单独、或与EPO一起或与其它生长因子一起使用来治疗这类病人并降低所需的输血量。一种生长因子也可以提高T细胞的数量并在治疗AIDS病人上可能有特殊的用处。发明综述
本发明是关于分离的或均一的蛋白形式的具有生物活性的flt3-配体(flt3-L)。并且，本发明涉及编码flt3-L的DNA和包含编码flt3-L的cDNA的表达载体。已被包含编码flt3-L的cDNA表达载体转染或转化的宿主细胞，和将这种宿主细胞培养在导致flt3-L表达的条件下来生产flt3-L的方法也均在本发明的范围之内。
flt3-L可被用于制备药物用于同源、异源或自体的移植方法。药物可以包含单独的flt3-L或与其它生长因子合用，如白细胞介素、集落刺激因子、蛋白酪氨酸激酶和细胞素。
本发明包括使用flt3-L进行基因治疗和对其它一些病患者进行治疗的方法。这些病包括骨髓再生障碍性综合症，再生障碍性贫血、HZV感染(AIDS)和癌症如乳腺癌、淋巴瘤、小细胞肺癌、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、急性白血病、睾丸瘤和卵巢癌。
本发明也涉及抗体尤其是与flt3-L进行免疫反应的单克隆抗体。本发明还包括含有flt3-L的可溶部分及免疫球蛋白蛋白质的恒定区域的融合蛋白。
本发明也涉及在外缘血祖代细胞或干细胞的移植过程中使用flt3-L。典型地，将外缘血祖代细胞或干细胞在进行骨髓抑制的细胞减少治疗之前从病人身上移去，然后再与细胞减少治疗的同时或在其后重新输回，以反作用于这类治疗所引起的骨髓抑制作用。本发明按以下的至少一种方式提供了有效量flt3-L以供使用：(i)在收集祖代细胞或干细胞以增加或动员这类循环细胞的数目之前给病人服用flt3-L；(ii)在收集病人的祖代细胞或干细胞之后，在体外情况下使用flt3-L来扩展这类细胞；(iii)在奖所收集的祖代细胞或干细胞移植后，给病人服用flt3-L以促进植入。本发明的移植方法还进一步包括按顺序使用或与flt3-L同时使用有效量的细胞素。这类细胞素包括但并不局限于白细胞介素(IL)IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14或，IL-15，由一组包含G-CSF，GM-CSF，M-CSF或GM-CSF/IL-3的融合物，或其它生长因子如CSF-1，SF，EPO，白血病抑制因子(LIF)或成纤维细胞生长因子(FGF)中所筛选出的一种CSF。flt3-L以同样方式对于同源或异源移植也是有用的。
本发明还进一步包括一种祖代细胞或干细胞的扩展培养基，该培养基包括细胞生长培养基，自体的血清，单独使用或与以上所列的一种细胞素共同使用的flt3-L。
本发明还进一步包括通过使用flt3-L来扩展由脐带血液中所收集的祖代细胞和干细胞。其扩展可通过单独使用、顺序使用或与以上所列的一种细胞素共同使用flt3-L来实现。
本发明还进一步包括在基因疗法中flt3-L的应用。flt3-L能够使被外源DNA转染的用于基因治疗的早期造血祖代细胞或干细胞增殖和被培养。另一种种办法可将编码flt3-L的cDNA转染入细胞以便最终将其基因产物传送至靶细胞或组织。
并且，本发明还包括通过使用flt3-L促进体内红血球产生来治疗贫血病。这类应用包括在与细胞减少疗法连同在其后需要促进红血球生成时给病人服用flt3-L。这种治疗可包括与以上所列的细胞素中所选的一种生长因子共同服用。在这类治疗中优选的细胞素包括EPO，IL-3，G-CSF和GM-CSF。这类治疗对于AIDS病人，尤其是在接受AZT治疗的AIDS病人特别有用。
由于flt3-L促进干细胞的产生，其他带有flt3受体的非造血干细胞可被本发明的flt3-L所影响。flt3-L在体外受精过程中是有用的，并且可在体内用于对不育条件和处理。在消化道中，flt3-L可被用于对辐射和化学治疗所引起的肠损伤的治疗。flt3-L也可被用于对由人免疫缺陷病毒(HZV)感染的病人的处理。这类处理包括通过服用flt3-L来促进T细胞和红血球的体内产生及体外扩展。这类处理可阻止T细胞尤其是CD4阳性的T细胞的缺陷，并且可能增高病人对病毒的免疫反应，从而改善病人的生命质量。flt3-L可被用于促进干细胞来导致发囊的发育，从而促进毛发生长。
并且，flt3-L可被结合于一种固相基质上并用于通过亲和法来纯化或分离能够在细胞表面表达flt3的细胞。本发明包括由溶液中的细胞混合物分离在其表面具有flt3受体的细胞，包括使混合物中的细胞与上面有flt3-结合分子的接触表面接触，以及将接触表面和溶液分离。一旦被分离后，细胞可被用flt3-L体外扩展并被病人服用。
关于本发明的详细描述
已分离到一种编码小鼠的flt3-L的cDNA并揭示于序列SEQID NO：1。也已分离到一种编码人的flt3-L的cDNA并揭示于序列SEQ ZD NO：5。这些关于编码小鼠和人的flt3-L的cDNA的发现使得能够构建含有编码flt3-LcDNA的表达载体；用表达载体转染或转化的宿主细胞；以均一蛋白质形式存在的具有生物活性的小鼠和人的flt3-L；以及可与小鼠和人的flt3-L发生免疫反应的抗体。
flt3-L对于能够表达flt3受体的细胞(包括非造血细胞)的增强、促进、增殖或生长是有用的。由于flt3受体已被发现存在于脑、胎盘、神经组织、造血器官组织中，以及被发现分布于睾丸，卵巢，淋巴结，脾，胸腺和胎儿的肝脏中，与那里的组织损害相联系的各种条件的治疗是可能的。虽然不仅仅局限于此，以下将描述flt3-L的特殊应用。
此处所用的术语“flt3-L”是指在祖代细胞和干细胞中所发现的能够与flt3受体独立结合或复合的一类多肽。术语“flt3-L”包含具有氨基酸顺序SFQ ID NO：2的1至231或氨基酸顺序SEQ IDNO：6的1至235的蛋白质，以及与氨基酸顺序SEQ ID NO：2的1至231和氨基酸顺序SEQ ID NO：6的1至235具有高度相似性或高度同一性的蛋白质。并且，此术语指具有生物活性的序列SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：5的DNA基因产物。此术语更进一步包括膜结合蛋白质(包括其细胞内区域、膜区域和细胞外区域)，以及基本含有蛋白质的细胞外部分，保留有生物活性并能被分泌出去的可溶的或被截短的蛋白质。这类可溶蛋白质的特殊例子是具有氨基酸顺序SEQ ID NO：2的28至163和氨基酸顺序SEQ ID NO：6的28至160的蛋白质。
与flt3-L有关的术语“生物活性”是指flt3-L能够与flt3-L结合。或者说，“生物活性”指flt3-L能够通过膜结合的flt3-L白细胞传送促进信号。
“分离的”指flt3-L没有与其他蛋白质或多肽结合，例如，flt3-L可作为一种重组子宿主细胞培养的纯化产物或纯化的抽提物。
此处所指的“flt3-L变种”，指基本与天然的flt3-L同源但又由于一个或更多的氨基酸的缺失、插入或替换而具有与天然的flt3-L(来源于人、小鼠或其他哺乳动物)不同的氨基酸顺序的一类多肽。变种的氨基酸顺序一般至少在80％上与天然的flt3-L全同，更佳为至少90％相同。通过使用如 Devereux等(Nucl.Acids.Res 12：387，1984)所描述的GAP计算机程序6.0版来比较顺序资料可以确定其同源性的百分比，此程序可由威斯康辛大学遗传学计算机组(Uni-vesity of Wiscousin Genetics Computer Gronp(UWGCG))得到。GAP程序使用了被Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2：482，1981)修订过的Needleman和(J.Mol.Biol.48：443，1970)的排列方法。对于GAP程序较好的缺失参数包括：(1)对核苷酸的一元比较矩阵(包含数值1指同一和数值0指非同一)，以及如Schwartz和Daylofl所描述的(Atlas of Protein Sequence andStructure，Natioual Biomedical Research Foundation，PP.353—358，1989)Gribskov和Burgess的加权比较矩阵；(2)对每一个缺隙有3.0及对每一个缺隙中的每一个符号有附加的0.10的罚分；(3)对末端缺隙没有罚分。变种可以包含保守地替换顺序，这指一个氨基酸残基可以被一个具有相似和物理化学性质的氨基酸残基所替换。保守替换的例子包括将一个脂肪族氨基酸用另一个替换。例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或丙氨酸相互替换，或将一个极性氨基酸替换成另一个。如赖氨酸和精氨酸之间的替换，谷氨酸和天冬氨酸之间的替换以及谷氨酰胺和天冬酰胺之间的替换。其他这类保守性替换，例如，具有相似的疏水性的整个区域的替换，也是已知的。本发明也包括天然产生的flt3-L变种。这类变种的例子有由于交替的mRNA剪接作用造成的或由于flt3-L蛋白的蛋白酶解作用分解而得到的蛋白质，同时仍旧保留有flt3-L的结合性能。交替的mRNA剪接作用可以产生一个截短的但仍具有生物活性的flt3-L蛋白质，例如天然产生的可溶形式的蛋白质。变种可归因于蛋白水解作用，这包括在不同类型的宿主细胞中在表达上N-或C-末端的区别，以及由于蛋白酶解作用而除去了flt3-L蛋白质的一个或多个末端氨基酸(一般为1至5个末端氨基酸)。
术语“自体移植”见于美国专利第5,199,942号，此处以文献形式出现。简单地说，此术语是指进行自体造血的祖代细胞或干细胞移植的方法，包括：(1)在进行细胞减少疗法之前从病人处收集造血祖代细胞或干细胞；(2)用flt3-L在体外扩展造血祖代细胞或干细胞以提供含有数目增加了的造血祖代细胞或干细胞的细胞制备物；(3)与细胞减少疗法一起或随后给病人施用细胞制备物。祖代细胞和干细胞可由收集的外周血液或骨髓外植体获得。任选地，由以上所列的细胞素中选择一种或多种与flt3-L一起合用来增殖特定类型的造血细胞或影响增殖的造血细胞群的细胞动能。在前述中，SF，IL-1，IL-3，EPO，G-CSF，GM-CSF和GM-CSF/IL-3融合物是极好的，尤以G-CSF，GM-CSF和GM-CSF/IL-3为更佳。术语“异源移植”指从一种哺乳动物移得骨髓或外周血液祖代细胞或干细胞，注入同种的另一哺乳动物的方法。术语“同源移植”指在2个遗传学背景全同的哺乳动物之间进行骨髓移植。
本发明以上所描述的移植方法任选地包括一个体内的预备过程，该过程包括在收集造血细胞之前给病人单独服用flt3-L或与一种补充生长因子顺序地或同时合用以补充造血细胞至外围血液。合适的补充因子如上所列，较佳的补充因子为flt3-L，SF，IL-1和IL-3。
本发明以上所描述的方法任选地包括一个体内的后续过程，该过程包括在移植细胞制备物之后给病人单独服用flt3-L或与一种移入生长因子顺序地或同时地合用以利于从细胞制备物中移入和加强增殖移入的造血祖代细胞或干细胞。合适的移入因子如上所列，较佳的移入因子为GM-CSF，G-CSF，IL-3，IL-1，EPO和GM-CSF/IL-3融合物。
本发明进一步包括一种祖代细胞或干细胞扩展培养基，该培养基包括细胞生长培养基，自体血清，以及单独使用或与以上所列的一种细胞素生长因子一起使用的flt3-L。较佳的生长因子为SF，GM-CSF，IL-3，IL-1，EPO和GM-CSF/IL-3融合物。
特别地，flt3-L可被用于促进造血和非造血干细胞的增殖。当某些组织出现特定的组织损害时这类促进是有益的。flt3-L可被用于治疗神经损害并可作为神经细胞的一种生长因子。flt3-L也可能被用于体外受精过程和不育的体内治疗。flt3-L在对于由放射或化学治疗所引起的消化道损伤的治疗中可能是有用的。由于flt3受体分布于可导致发囊发育的干细胞，flt3-L或许可被用于促进毛发的生长。
由于flt3-L已表现出能够促进T细胞和红细胞的增殖(见下面的例子)，flt3-L可被用于对人免疫缺陷病毒(HZV)感染的病人的治疗。这类治疗包括施用flt3-L来促进T细胞的体内产生以及体外扩展。并且，flt3-L可以阻止CD4阳性T细胞的缺乏。这类治疗可以增强或维持病人对病毒的免疫反应，从而改善或维持病人的生命力。而且，这类体内处理可以促进红血球谱系的细胞，从而提高病人的血细胞比容和血红蛋白的水平。flt3-L可被单独给药或与以上所列的细胞素中所选择出的细胞素顺序地或一起服用。
由于flt3-L对祖代细胞和干细胞的专一性，它可被用于基因疗法。基因疗法包括给病人使用已被外源DNA转染的，可以被移入的细胞。见：Boggs，International J.Cell Cloning，8：80—96，(1990)；kohn等，Cancer Invest.，7(2)：179—192(1989)；Lehn，Bone Mar-row Transpl..，5：287—293(1990)；和Verma，Scientific American，PP.68—84(1990)。使用在专业领域中已知的基因疗法，将基因转移入哺乳动物的过程包括：(a)在培养基中培养早期造血细胞，其中含有单独的flt3-L或与从以上所列的细胞素中选出的细胞素顺序地或一起合用的flt3-L；(b)用外源DNA转染步骤(a)中的培养细胞；(c)给哺乳动物应用转染过的细胞。此方法是一个含有以上步骤(a)和(b)的用一个基因转染祖代细胞或干细胞的新方法。更进一步地，通过使用相同或类似的方法，可将编码flt3-L的cDNA转染入这类传送细胞以将flt3-L基因产物传送至靶组织。
实施例1描述了用于筛选flt3-L的一种新的flt3-L：Fc融合蛋白的构建。其他抗体Fc区域可用实施例1中所描述的人IgGlFc区域取代。其他合适的Fc区域有可被蛋白质A和蛋白质G以高度亲和性结合的人IgGl的Fc区域或人或小鼠的IgGlFc区域的片段，例如至少包含了绞链区域以使链间二硫键能够形成的区域。flt3：Fc融合蛋白有个优点即可被容易地纯化。而且，在2个分离的融合蛋白的Fc区域之间形成的二硫键可以产生二聚物。鉴于所寻找的配体有是多聚物的可能性，选择二聚的flt3：Fc受体是由于有高亲和结合flt3-L的潜在优点。
如上所述，本发明的一个方面是可溶性的flt3-L多肽。可溶性的flt3-L多肽包括天然的flt3-L的全部或部分的细胞外区域，但没有使多肽保持在细胞膜上的跨膜区域。可溶性的flt3-L多肽有个优点是包含天然的(或异源的)信号肽在初始合成时以促进分泌，但当flt3-L被从细胞分泌出后信号肽被切除。本发明的可溶性的flt3-L保留了结合flt3受体的能力。事实上，可溶性的flt3-L也可包含部分的跨膜区或部分的细胞质区或其他顺序，如果可溶性的flt3-L可被分泌的话。
可溶性的flt3-L可以通过从培养基中分离能够表达所期望的蛋白质的完整细胞来鉴定(并且与其非溶解性的膜结合的flt3-L区分开)，例如通过离心，检测培养基(上清液)中所期望的蛋白质的存在。培养基中flt3-L的存在表明了蛋白质已被从细胞中分泌出来因而是所期望蛋白质的溶解形式。
可溶性的flt3-L较之天然的结合的flt3-L蛋白质具有很多优点。由于可溶性蛋白质被从细胞中分泌出来，所以可以由重组宿主细胞中纯化此蛋白质。更进一步，可溶性蛋白质一般更适合于进行静脉注射。
可溶性的flt3-L多肽的例子包括那些含有天然flt3-L蛋白质的细胞外区域的基本部分的蛋白质。这类可溶性的哺乳动物flt3-L蛋白质包括氨基酸顺序SEQ ID No：2的28至188或氨基酸顺序SEQID No：6的28至182氨基酸。并且，本发明也包含少于完整细胞外区域的缩短的可溶性flt3-L蛋白质。这类缩短的可溶性蛋白质的代表是氨基酸顺序SEQ ID No：2的28至163和氨基酸顺序和SEQID No：6的28到160氨基酸。当在宿主细胞内最初表达时，可溶性的flt3-L蛋白质可能另外还含有一种如下所描述的异源的信号肽，它在所用的宿主细胞中具有功能。或者，蛋白质中可包含天然的信号肽，哺乳动物flt3-L包含氨基酸顺序的SEQ ID No：2的1到188和氨基酸顺序SEQ ID No：6的1到182的氨基酸。在本发明的一个具体例子中，可溶性的flt3-L被表达为一个融合蛋白质，它包括(从N-端到C-末端)：酵母α因子信号肽，一种如下所描述和在美国专利第5,011,092号的FLAG肽和包括氨基酸顺序SEQ ID No：2的28到188氨基酸的可溶性flt3-L。这种重组融合蛋白在酵母细胞内表达并被分泌出来。FLAG肽能够便于此蛋白质的纯化，并随后可用牛粘膜肠激酶将其从可溶性的flt3-L上切除。分离的编码可溶性flt3-L蛋白质的DAN序列也在本发明的范围之内。
包括可溶性多肽的缩短的flt3-L可通过任何一种传统方法而制备。一种所期望的DNA序列可通过已知的“本身”技术而化学合成。DNA片段也可通过对全长的克隆的DNA序列进行限制性内切酶消化而得到，然后通过琼脂糖凝胶电泳来分离。可以利用含有限制性内切酶酶切位点的连接头将所期望的DNA片段插入至表达载体，或者该片段可在天然存在的酶切位点上进行消化。众所周知的聚合酶链式反应(PCR)方法也可被用于扩增编码所期望的蛋白质片段的DNA序列。更进一步地，已知的诱变技术可在所期望的位点插入一个终止密码子，例如在细胞外区域的最后一个氨基酸的下游立刻插入一个终止密码子。
在另一个尝试中，酶切处理(如用Bal31核酸外切酶)可用于从具有特定的所期望末端的DNA片段中缺失末端的核苷酸。在所能得到的市售的连接头中有那些可被连接至由Bal31消化后所产生的平头末端上并含有限制性内切酶酶切位点的。或者那些用于改造DNA片段的N-末端或C-末端以达到所期望位点的寡聚核苷酸可被人工合成并连接至DNA片段上。所人工合成的寡聚核苷酸可在所期望的编码序列上游含有一个限制性内切酶酶切位点并在编码序列的N-末端设置一个起始密码子(ATG)。
如以上所述，本发明提供了分离的或均一的flt3-L多肽，二者均为重组体和非重组体。保存所希望的生物活性(如能够与flt3结合)的天然flt3-L的变种或衍生种类可以通过编码天然flt3-L多肽的核苷酸顺序的突变而获得。天然氨基酸顺序的变化可通过任何一种传统方法来实现。通过合成含有突变序列的寡聚核苷酸可将突变引入至特定的位点，通过二端邻接的限制酶切位点可以将这类寡聚核苷酸连接至天然序列的片段上。连接后，所得的改造了的顺序具有所期望的氨基酸插入，替换或缺失的类似序列。
另一种办法是，通过寡聚核苷酸定向及位点专一性突变方法可以提供变化了的基因，其预定的密码子可以通过替换、缺失或插入而发生改变。对以上进行突变的典型例子被揭示于Walder等，(Gene42：133，1986)；Bauer等，(Gene37：73，1985)；Graik(Bio Tech-niqus，January 1985，12—19)；Smith等(Gerefic Engineering；Principles and Methods，Planam Press，1981)；Kunkel(Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488，1985)；Kunkel等(Methods in Enzy-mol 154：367，1987)和美国专利第4,518,584号及4,737,462号。
flt3-L通过与其他化学部分形成共价的或聚集的接合物而被改造以产生flt3-L衍生物，这类化学部分如糖基团，脂类，磷酸基，乙酰基等等。flt3-L的共价衍生物可以通过将化学部分连接至flt3-L氨基酸侧链的功能团或flt3-L多肽的N-末端或C-末端以及flt3-L的细胞外区域来制备。在本发明的范围之内的flt3-L的其他衍生物包括flt3-L的共价的或聚集的接合物以及含有其他蛋白质或多肽的片段，例如在重组体培养中所合成的N-末端或C-末端融合蛋白。例如，聚合物可以包含一个信号多肽或前导多肽顺序(例如Saccha-romyces的α-因子前导顺序)，这些顺序位于flt3-L多肽的N-末端。信号肽和前导肽在共翻译过程中或翻译后引导聚合物从其合成位点转移至细胞膜或细胞壁的内部或外部。
flt3-L的融合多肽可以包含便于纯化和鉴定flt3-L的附加肽。这类肽包括，例如，聚组氨酸或由美国专利第5,011,912号及Hopp等(Biol Techuology 6：1204，1988)所描述的抗原鉴定肽。
本发明还进一步包括和或不和天然模式的糖基化联系的flt3-L多肽。根据选用的表达系统的不同，在酵母或哺乳动物表达系统例如COS—7细胞)中所表达的flt3-L与天然的flt3-L在分子量和糖基化模式方面可以相似或具有很大不同。
在细菌表达系统如E.coli(大肠杆菌)中所表达的flt3-L多肽是没有糖基化的分子。
本发明还进一步包括特多构建物，这类构建物编码氨基酸残基或顺序的各种不同的增加或替换，对其生物活性及结合不是必需的末端或内部残基或顺序的缺失。例如，flt3-L的细胞外区域N-端的糖基化位点可以通过修饰而阻止糖基化作用的进行，从而可在酵母或哺乳化动物表达系统中表达减少了碳水化合物的类似物。真核多肽的糖基化位点的特征为一个氨基酸三联体。天冬酰胺-X-Y，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸，Y是丝氨酸或苏氨酸。在小鼠和人的flt3-L蛋白质中，分别包含有两个这样的氨基酸三联体，分别在氨基酸顺序SEQ ID No：2的127到129和152到154以及氨基酸顺序SEQ ID No：2的126到128和150到152。对编码这些氨基酸三联体的核苷酸序列做适当的替换，增加或缺失可以导致阻止碳水化合和残基在天冬酰胺侧链上的附着。一个单独的核苷酸的变化，例如选择使天冬酰胺被另一个不同的氨基酸所取代，足够失活一个N-端糖基化位点。已知的失活蛋白质中N-端糖基化位点的方法包括那些美国专利第5,071,972号和EP第276,846号所描述的方法。
在另一个实施例中，对于生物活性不是最重要的编码半胱氨酸残基的序列可以改变使半胱氨酸残基缺失或被其他氨基酸所替代，以阻止复性过程中错误的分子内二硫键桥的开成。通过对邻近的二碱氨基酸残基的修饰制备其它相当的变化以增强有KEX2蛋白酶活性存在的酵母系统中的表达。EP第212,914号揭示了通过使用位点专一性突变来失活蛋白质中KEX2蛋白酶的加工位点。通过氨基酸残基的缺失，增加或替换以失活KEX2蛋白酶的加工位点。这些修饰改变了精氨酸-精氨酸、精氨酸-赖氨酸及赖氨酸-精氨酸对消除了这些相邻的碱性氨基酸的出现。赖氨酸-赖氨酸结成对被认为对KEX2裂解的敏感性变差，而且精氨酸-赖氨酸或赖氨酸-精氨酸转变成赖氨酸-赖氨酸代表了一个失活KEX2位点的保守的且较佳的方法。小鼠和人flt3-L分别含有两个KEX2蛋白酶加工位点，即氨基酸顺序SEQ ID No：2的216到217和217到218以及氨基酸顺序SEQ ID No：6的211到212和212到213。
在本发明范围之内的核苷酸顺序包括分离的DNA和RNA序列。这些序列在中等的和十分严格的条件下可与天然的flt3-L寡聚核苷酸序列杂交并编码具生物活性的flt3-L。其中等严格杂交条件如Sambrook等所定义(分子克隆实验手册(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，2ed.Vol.1.PP.101—104，Cold Spring Har-bor Laboratory Press，1989)，包括使用含5×SSC，0.5％SDS10mM EDTA(PH8.0)的预洗液，杂交条件为约55℃，5×SSC，过夜。十分严格的条件包括高温下的杂交和洗涤。专业技术人员将了解到温度和洗涤溶液的盐浓度按照如探针长度等因子的需要而发生改变。
由于已知的遗传密码子的简并性，超过一种密码子可以编码同一种氨基酸，与所示的序列SEQ ID No：1和SEQ ID No：5不同的DNA序列仍能编码具有与氨基酸顺序SEQ ID No：2和氨基酸顺序SEQ ID No：6的flt3-L蛋白质。这类变种DNA序列可能起因于不活动突变(如在PCR扩增过程中发生)或是天然序列的审慎地突变的产物。
本发明提供了编码具有生物活性的flt3-L的相当的分离的DNA序列，这些序列筛选自：(a)由天然哺乳动物的flt3-L基因的编码区域而得到的DNA；(b)包含如序列SEQ ID No：1和SEQ IDNo：5所示的核苷酸序列的cDNA；(c)在中等的严格条件下能够与(a)中的DNA杂交并编码具有生物活性的flt3-L的DNA；(d)由于遗传密码子简并如(a)(b)或(c)中所定义的DNA并编码具有生物活性的flt3-L的DNA。本发明也包括由这些相当的DNA序列所编码的flt3-L蛋白。
与DNA序列SEQ ID No：1或SEQ ID No：5相当的DNA，在中等严格的条件下能够与编码氨基酸顺序SEQ ID No：2的28到163和SEQ ID No：6的28到160的多肽的天然DNA序列杂交。由这类DNA所编码的flt3-L蛋白质的例子有(但并不局限于此)：flt3-L片段(可溶的或膜结合的)和包括如上所述的失活的N-端糖基化作用位点，失活的KEX2蛋白酶加工位点或保守的氨基酸替换的flt3-L蛋白质。由来自于其他哺乳动物种类的DNA所编码的flt3-L蛋白质，其中的DNA可以和序列SEQ ID No：1或SEQ IDNo：5的cDNA杂交，也属于此范围。
拥有结合flt3受体的必要能力的变种可以通过任何合适的检测方法来鉴定。flt3-L的生物活性可以通过，例如竞争性结合至flt3受体的配体结合区域(即竞争性结合检测)来确定。
一种类型用于flt3-L多肽的竞争性结合检测使用了一种放射标记的，可溶性的人flt3-L和表达细胞表面flt3受体的完整细胞。除了完整细胞以外，人们可以用融合蛋白的Fc区域替换可溶性的flt3受体(如flt3：Fc融合蛋白)，这些受体是通过蛋白质A，蛋白质G，或者flt3分子的或分子的Fc部分的抗体结合在固相载体上的。另一种类型的竞争性结合检测使用了放射性标记的可溶性flt3受体如flt3：Fc融合蛋白和表达flt3-L的完整细胞。或者是可溶性的flt3-L可被结合至固相上以便对表达flt3的细胞进行正筛选。
竞争性结合检测可以按照传统方法进行。例如，可用放射标记的flt3-L与假定的flt3-L同源物竞争以检测其与表面结合的flt3受体的结合活力。通过竞争性放射自显影板结合检测可得到定性的结果，或者也可以用Scatchart做图产生定量结果。
或者，flt3结合蛋白质，如flt3-L和抗flt3拉体，可被结合至固相载体如柱层析基质或适于进行鉴定分离或纯化细胞的相似底物，这类细胞在其表面表达flt3受体。flt3结合蛋白结合到固相载体的接触表面可以通过许多方法来进行，例如，通过构建flt3-L：Fc的融合蛋白并且通过蛋白质A或蛋白质G的相互作用将其结合至固相载体。各种其他的将蛋白质结合至固相载体的方法对本专业的技术人员是已知的并可用于本发明。例如，可用flt3结合蛋白包被磁性微球体，然后置于孵育容器中通过磁场。含有造血祖代细胞或干细胞的细胞混合物的悬浮液与具有flt3结合蛋白的固相载体相接触。在其表面具有flt3受体的细胞与固定的flt3结合蛋白结合，而未结合的细胞将被洗掉。这种亲和结合法对于从溶液中纯化、检测或分离这类表达flt3的细胞是有用的。从固相载体上释放正筛选细胞的方法对本专业的技术人员是已知的，并且也包含酶的使用。这类酶较好的为对细胞无毒、无害并且可以裂解细胞表面结合的配偶体，在flt3：flt3-L相互作用的情况下，酶最好能够裂解flt3受体，从而所得的细胞悬浮液不含“外源”flt3-L材料。然后纯化的细胞群体在对病人移植前可体外扩展，其数量足够重建病人的造血和免疫系统。
或者，被怀凝含有flt3的细胞混合物可以首先与生物素化的flt3结合蛋白质保温。典型的孵育时间至少为1小时以保证对flt3的足够结合。所得的混合物然后通过被抗生物素蛋白被覆的珠充满的柱。生物素对抗生物素蛋白的高亲和力使得细胞结合于珠上。对抗生物素被覆的珠的使用在专利领域中是已知的。见See Berenson等，J.Cell.Biochem.，10D：239(1986)。对非结合材料的洗脱以及结合细胞的释放可依照传统方法进行。
在以上所描述的方法中，合适的flt3结合蛋白是flt3-L，抗flt3抗体，和其他能够与flt3高度亲和的蛋白质。较佳的flt3结合蛋白是flt3-L。
如以上所描述的，本发明的flt3-L可以用来分离表达flt3受体的细胞。在另一方法中，flt3-L或细胞外区域或其一个片段可被共轭结合至可检测的部分如125I上以检测表达flt3的细胞。用125I做放射性标记可以采用几种标准的方法中的任一种获得具有高比活性标记的有功能的125I-flt3-L分子。或使用对flt3区域或分子的Fc区域的碘化的或结合了生物素的抗体。可以使用另一种可检测的部分例如可催化比色或荧光光度反应的酶，可使用生物素和抗生物素蛋白。对于欲检测其flt3受体表达的细胞可与标记的flt3-L接触，在保温之后，移去未结合的标记的flt3-L并用可检测的部分来测定结合。
在与以上所描述的相类似的竞争性检测方法中使用接合的可溶性的flt3受体(例如125I-flt3：Fc)也可以确定flt3-L(包括其变种)的结合特性。但在这种情况下，表达flt3受体的完整细胞或结合在固体底物上的可溶性的flt3受体，被用来测量含有假定的flt3-L变种的样品中与接合的可溶性的flt3竞争性结合到flt3-L上的程度。
其他用来检测flt3-L的方法包括抗flt3-L抗体的使用，为应答flt3-L而增殖的细胞系，或在flt3-L存在的情况下表达flt3受体并增殖的重组细胞系。例如，BAF/BO3细胞系缺乏flt3受体且为IL-3依赖型(见Hatakeyama等，Cell，59：837—845(1989))。当BAF/B03细胞系被含有flt3受体基因的表达载体转染后，对IL-3或flt3-L发生反应而增殖。一个转染flt3的合适表达载体的例子为pCAV/NOT质粒，见Mosley等，Cell，59：335—348(1989)。
flt3-L多肽可以寡聚体的形式存在，如共价连接或非共价连接的二聚体或三聚体。寡聚体可通过在不同的flt3-L多肽上的半胱氨酸残基间形成的二硫键来连接。在本发明的一个具体例子中，flt3-L二聚体是通过一种方式将flt3-L融合至一种抗体例如IgGl)的Fc区域产生的，该融合方式不影响flt3-L对flt3配体结合区域的结合。Fc多肽更佳的为融合至可溶性的flt3-L的C-末端(仅包含细胞外区域)。一般制备含有异源的与抗体衍生的多肽的不同部分融合的多肽的融合蛋白质的方法已的描述，例如Ashkenazi等(PNAS DSA88：10535，1991)和Byrn等(Nature 344：677，1990)及那里的引文。一种编码flt3-L：Fc融合蛋白质的基因融合被插入至一个适当的表达载体。flt3-L：Fc融合蛋白质的装配很像抗体分子，在Fc多肽间形成的链间的二硫键产生了二价的flt3-L。如果融合蛋白质由一种抗体的重链和轻链组成，就有可能形成带有多至4个flt3-L细胞外区域的flt3-L寡聚物。或者，人们可以用一个肽接头来连接两个可溶性的flt3-L区域。
可以通过已熟知的方法来制备含有编码flt3-L的DNA的重组表达载体。表达载体包括将flt3-L的DNA序列可操作地连接至合适的转录或翻译调节核苷酸序列，如那些由哺乳动物，微生物，病毒或昆虫基因衍生的序列。调节序列的例子包括转录启动子、操纵子、或增强子，一个mRNA的核糖体结合位点，和合适的控制转录和翻译起始和终止的序列。当调节序列与flt3-L DNA序列功能上相关连时，核苷酸序列是一种“可操作的连接”。例如，一个启动子核苷酸序列被可操作地连接至flt3-L的DNA序列如果这个启动子核苷酸序列能够控制flt3-L的DNA序列的转录。在所期望的宿主细胞内的复制能力通常由一个复制起始区所决定，用于鉴定转化子的筛选基因，可以共同插入至表达载体。
并且，编码适当的信号肽不是与flt3-L天然联系的基因可插入表达载体。例如，一个信号肽(分泌前导)的DNA序列，可以融合至flt3-L的序列的阅读框内，以便flt3-L被初始翻译为含有信号肽的融合蛋白形式。在预期的宿主细胞中具有功能的信号肽可以增强fIt3-L多肽的细胞外分泌。在flt3-L被从细胞中分泌出来后信号肽可被从flt3-L从肽上剪切去。
用于表达flt3-L多肽的合适的宿主细胞包括原核生物，酵母或高等真核细胞。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的合适的克隆和表达载体已被描述，例如，Pouwels等，Cloning Vectors：Al-aboratory Manual，Elsevier，New York(1985)。也可以使用本文所揭示的DNA构建物所衍生的RMA，和无细胞翻译系统来生产flt3-L多肽。
原核生物包括革兰氏阴性和革兰氏阳性有机体，例如，E.coli或Bacilli。用于转化的合适的原核生物宿主细胞包括，例如，E.coli，Bacillus subtilis，Salmonella typhimurium，和Pseuclomonas，Streptomyces和Staphylococcus属的各种其他种类。在原核宿主细胞中，例如E.coli，flt3-L多肽可以包括一个N-末端的甲硫氨酸残基以便于重组多肽在原核宿主细胞内的表达。N-末端的甲硫氨酸可从表达的重组flt3-L多肽上被剪切。
用于原核宿主细胞的表达载体一般含有一个或多个表型选择标记基因。一个表型选择标记基因可以是，例如，一个编码抗生素抗性蛋白或支持营养需求的基因。对于原核生物宿主细胞有用的表达载体的例子包括那些由如克隆载体pBR322(ATCC 37017)等市售质粒所衍生的载体。pBR322包含氨苄青霉素和四环素抗性基因以提供鉴定转化细胞的简单方法。用pBR322来构建一个表达载体，将一个合适的启动子和flt3-L DNA序列插入至pBR322载体上。其他的市售载体包括pKK233—3(pharmacia Fine chemicals，Uppsala，Sweden)和pGEMI(Promega Biotec，Madision，WI，USA)。
一般用于重组原核宿主细胞表达载体的启动子序列包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖启动子系统(Chang等，Nature 275：615，1978)；Goeddel等，Nature 281：544，1979)，色氨酸启动子系统(trp)(Goeddel等，Nucl.Acids.Res，8：405)，1980；EP-A-36776)和tac启动子系统(Maniatis，Molecular Cloning：A LaboratonyMauual，Cold Spring Harbor Laboratory，p.412，1982)。一个特别有用的原核生物宿主细胞表达系统使用一个噬菌体λPL启动子和cI857ts不耐热阻遇物序列。由American Type Culture Collection可得到的包括有λPL启动子衍生物的质粒载体包括质粒pHUB2(保存于E.coli菌株JMB9(ATCC37092))和pPLc28(保存E.coli RRI(ATCC 53082))。
flt3-L多肽同样可在酵母宿主细胞内表达，较好是Saccha-romyces属(如S.cerevisiae)。其他酵母的属，如Pichia，K.lactis或Kluyveromyces也可被使用。酵母载体经常包含一个来自2μ酵母质粒的复制序列的起始区，一个自主复制序列(ARS)，一个启动子区域，多聚腺苷酸化序列，转录终止序列和一个选择标记基因。对酵母载体的合适的启动子序列包括：金属硫蛋白的启动子，3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，J.Biol.Chem.255：2073，1980)或其他糖酵解酶(Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.7：149，1968；Holland等，Biochem，17：4900，1978)，例如磷酸丙酮酸水合酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸异构酶，磷酸葡萄糖异构酶，和葡糖激酶的启动子。其他的用于酵母表达的合适的载体和启动子被进一步描述于Hitzman，EPA—73,657或Fleer等，Gene，107：285—195(1991)；Vam den Berg等，Bis/Technology，8：135—139(1990)。另一个选择是如Russell等和Beier等所描述的葡萄糖可阻遏的ADH2启动子(J.Biol.Chem，258：2674，1982；和Nature 300：724，1982)。能够在酵母和E.coli中复制的穿梭载体可以通过将在大肠杆菌(Ecoli)中用于得筛选和复制(氨苄青酶素抗性基因和复制起始区)的pBR322的DNA序列插入至以上所描述的酵母载体中而构建。
酵母α因子的导序列可以利用来指导flt3-L多肽的分泌。α因子前导序列经常被插入至启动子序列和结构基因序列之间例如见Kurjan等，Cell 30：933，1982；Bitter等，Proc.Natl.Acad.SciUSA81：5330，1984；美国专利第4,546,082号和EP324,274号。其他的便于将重组的多肽从酵母宿主分泌出来的合适的前导序列对于本领域的专业人员是已知的。一个前导序列可以被改造成在其3’端附近含有一个或更多的限制性酶切位点。这将有利于将前导序列融合至结构基因上。
酵母转化方法对本专业的技术人员是已知的。其中一个是Hin-nem等所描述的方法(Proc.Matl Acad.Sci，USA 75：1929，1978)。Hinnen等的方法是在选择培养基上筛选色氨酸阳性的转化体，其中选择培养基由以下几部分组成：0.67％酵母氮源基质，0.5％酪蛋白水解物，2％葡萄糖，10μg/ml腺嘌呤和20μg/ml尿嘧啶。
被含有ADH2启动子序列的载体转化的酵母宿主细胞可在丰富培养基上生长以诱导表达。丰富培养基的一个例子由以下几部分组成：1％酵母浸出物，2％蛋白胨，和1％葡萄糖并附加80μg/ml腺嘌呤和80μg/ml尿嘧啶。ADH2启动子的除阻遏出现在当培养基中的葡萄糖被耗尽时。
哺乳动物和昆虫细胞培养系统也可用于表达重组的flt3-L多肽。Luckow和Summers综述了用杆状病毒系统在昆虫细胞中生产异种蛋白质(Bio/Technology 6：47(1988)。也可使用所建立的哺乳动物来源的细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的例子包括：猴肾细胞的COS—7系(ATCC CRL 1651)(Gluzman等，Cell23：175，1981)，L细胞，C127细胞，3T3细胞(ATCC CCL 163)，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，HeLa细胞，和BHK(ATCC CRL 10)细胞系，以及由McMahan等(EMBO J.10：2821，1991)所描述的非洲绿猿肾细胞系CVI(ATCC CCL 70)衍生的CV-1/EBNA-1细胞系。
哺乳动物宿主细胞表达载体的转录和翻译控制序列可由病毒基因组切得。通用的启动子序列和增强子序列来源于多瘤病毒，腺病毒2，猿猴病毒40(SV40)和人巨大细胞病毒。由SV40病毒基因组得到的DNA序列，例如SV40起始区，早期和晚期启动子，增强子，剪接和多聚腺苷酸化位点可用于提供其它的遗传元件以在哺乳动物宿主细胞中表达结构基因顺序。由于病毒的早期和晚期启动子可以容易地以一个片段从病毒基因组中获得所以特别有用。此片段也可以含有病毒的复制起始区(Fiers等，Nature 273：113，1978)。小些的或大些的SV40片段也可被使用，倘若位于SV40病毒复制起始区从HindIII位点至BglI位点的大约250bp的DNA序列被包括在内的话。
用于哺乳动物宿主细胞的示范性表达载体可以如Okayama和Berg(Mol.Cell.Biol.3：280，1983)所揭示的来构建。一个在C127小鼠乳皮细胞中稳定高表达哺乳动物cDNA的有用系统可以通过基本上如Cosman等(Mol.lmmunol.23：935，1986)所揭示的方法进行构建。一个有用的高表达载体，PMLSV N1/N4已如Cosman等(Nature 312：768，1984)所描述的被保存编号为ATCC 39890。另外的有用的哺乳动物表达载体在EPA-0367566和美国专利应用系列第07/701,405号，生效于1991年5月16日中有描述。载体可以由还原病毒得来。不用天然信号顺序，可以增加一种异源的信号顺序，例如在美国专利第4,965,195号所描述的IL-7用的信号顺序；如Cosman等(Nature 312：768，1984)所描述的IL-2受体用的信号序列；EP第367,566所描述的IL—4的信号肽；美国专利第4,968,607号所描述的I型IL-1受体信号和EP460,846号所描述的II型IL-1受体信号肽。
按照本发明做为分离的或均一的蛋白质的flt3-L可以用如上所描述的重组表达系统来生产或从天然存在的细胞中纯化。flt3-L可被纯化至基上均一，如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉(SDS-PAGE)分析中呈现单一的蛋白质条带所表明的。
生产flt3-L的一个过程包括培养一种被表达载体转化的宿主细胞，该载体含有在足以启动flt3-L表达的条件下的编码flt3-L的DNA序列。依据所使用的表达系统，flt3-L可由培养基或细胞抽提物中回收。正如对本专业的技术人员所了解的，纯化一个重组蛋白质的方法将根据所使用的宿主细胞的类型以及重组蛋白质是否被分泌至培养基而不同。
例如，当使用能分泌重组蛋白质的表达系统时，培养基首先可用市售的蛋白质浓缩滤器进行浓缩，例如，可用Amicon或MilliporePellicon超滤装置。在浓缩步骤之后，浓缩物可被加到如凝胶过滤介质等纯化基质上进行纯化。或者可使用阴离子交换树脂，例如，具有二乙胺乙基侧基的底物或基质。这些基质可以是丙烯酰胺，琼脂糖，葡聚糖，纤维素或其他广泛用于蛋白质纯化的类型。或者，可使用一阴离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括各种不同的不溶性的基质，这些基质含有硫代丙基或羧基甲基基团。硫代丙基基团是较好的。最后，一个或更多的反相高效液相色谱(RP-HPLC)(使用疏水性的RP-HPL介质例如具有甲基或其它脂肪族侧基基团的硅胶凝胶)步骤可用来进一步纯化flt3-L。上述的一些或所有纯化步骤以各种不同方式联合是人们熟知的并且可用来提供一种基本均一的重组体蛋白质。
有可能使用一种含有flt3受体的配体结合区域的亲和柱来亲和纯化所表达的flt3-L蛋白质。可以用传统的方法将flt3-L多肽从柱中移去，例如在一高盐洗脱缓冲液中然后透析至一低盐缓冲液以供使用或通过改变pH值或其它组分依据所使用的亲和基质来决定。或者，亲和柱可包含一种结合flt3-L的抗体。实施例6描述了一种使用本发明的flt3-L来产生flt3-L的单克隆抗体的方法。
细菌培养中所产生的重组蛋白质的分离通常通过起始的破碎宿主细胞、离心，从细胞沉淀物中(如果是一种不溶性的多肽)的抽提，或从上清液中抽提(如果是一种可溶性的多肽)，然后是一次或更多次的离心，盐析出，离子交换，亲和纯化或大小排阻色谱法。最后，可用RP-HPLC做最终的纯化步骤。可以通过任何方便的方法来破碎微生物细胞，如循环冻融法，超声处理，机械裂解或使用细胞袭解制剂。
转化的酵母宿主细胞可以较好的用来表达分冲多肽形式的flt3-L以简化纯化过程。从发酵的酵母宿主细胞分泌的重组多肽可采用如Urdal等(J。Chromatog 296：171，1984)所揭示的类似方法进行纯化。Urdal等描述了两个顺序的、反相HPLC步骤以从制备型HPLC柱中纯化重组的人IL-2。
按照本发明含有单链核酸顺序的(DNA或RNA)反义或正义寡聚核苷酸可与靶flt3-L mRNA序列结合形成一个二聚体，或与双链DNA螺旋的flt3-L序列结合形成三螺旋。按照本发明的反义或正义寡聚核苷酸，包含一个flt3-L的编码区cDNA的片段。这样的一个片段一般至少含有的14个核苷酸，较好的为14至30个核苷酸。根据一给定蛋白质的cDNA序列能够制成反应或正义寡聚核苷酸如Stein和Cohen，(Cancer Res.48：2659，1988)和Vam der Krol等(Bio Techniques 6：958，1988)所描述的。
反义或正义寡聚核苷酸与靶核酸序列的结合(通过几种方法的其中之一)导致了阻止转录(DNA)和翻译(RNA)的复合物的形成，这包括增强了双链分子的降解，转录或翻译的不到期终止或其它方法。反义寡聚核苷酸于是可用于阻止flt—3蛋白质的表达。反义或正义寡聚核苷酸更进一步包括具有被修饰了的糖-磷酸二酯骨架(或其它的糖连键，如WO91/06629所描述)的寡聚核苷酸，此类糖键能抵御内切核酸酶的作用。这类具有抗性糖连键的寡聚核苷酸在体内是稳定的(即能够抵御酶的降解)，但其保留与靶核苷酸序列结合的顺序特异性。正义或反义核苷酸的其它例子还包括那些与有机部分共价连接(如WO 90/10448中所描述的)的寡聚核苷酸，以及能提高寡聚核苷酸对靶核酸序列亲和力的其它部分，如聚-(L-赖氨酸)。更进一步地，嵌入试剂，如椭园霉素(ellipticine)和烷化剂或金属复合物可被吸附至正义或反义寡聚核苷酸上以修饰反义或正义寡聚核苷酸对靶核苷酸序列的结合专一性。
反义或正义寡聚核苷酸可以通过任何基因转移方法被引入含有靶核酸序列的细胞，这些方法包括，例如，磷酸钙(CaPO4)介导的基因转染，电激法或通过使用如Epstein—Barr病毒(非洲淋巴瘤病毒)的基因转移载体。通过将反义或正义寡聚核苷酸序列插入至一合适的还原病素载体，然后在体内或体外使细胞与含有插入序列的还原病素载体接触，可以较好地将反义或正义寡聚核苷酸序列引入含有靶核酸序列的细胞。合适的还原病毒载体包括，但并不局限于此，小鼠还原病毒M-MuLV，N2(由M-MuLV得来的一种还原病毒)，或双考贝载体DCT5A，DCT5B和DCT5C(见PCT应用美国US90/02656)。
如WO 91/04753所述，反义或正义寡聚核苷酸也可以通过与配体结合分子形式接合物而被引入含有靶核酸序列的细胞。合适的配体结合分子包括，但并不局限于此，细胞表面受体，生长因子，其他细胞素，或其他能够与细胞表面受体结合的配体。更佳地，配体结合分子的接合实质上不影响配体结合分子与其对应的分子或受体的结合能力，也不会阻止正义或反义寡聚核苷酸或其接合物进入细胞。
或者，如WO90/10448所描述的，一种正义或一种反义寡聚核苷酸可以通过形成寡聚核苷酸一脂质复合物而被引入含有靶核酸序列的细胞。正义或反义寡聚核苷酸复合物可以通过细胞内的内源脂酶而很好地解离。
本发明的flt3-L多肽可以按照已知的通常制备有用的药物复方的方法做成处方。flt3-L可被结合至混合物，以单独的活性材料或与其它已知的活性物质，与药用的合适稀释液如Tris—HCl，乙酸，磷酸)，防腐剂(例如乙基汞硫代水杨酸钠，苯甲醇，parabens)，乳代剂，溶解剂，辅剂和/或携带剂。适合的携带剂及其配方可见Remington’s制药科学，16th ed.1980，Mack出版社。并且，这类复方可包含与聚乙二醇(PEG)、金属离子构成复合物的flt3-L，或与聚乙酸、聚羟基乙酸、水凝胶等复合形成的聚合物，或复合形成脂质体，微乳胶微团，单片层或多片层的小泡，红细胞空壳或球状体，这些复方将影响flt3-L的物理状态、溶解度、稳定度、体内的释放速率和清除速率。flt3-L也可与抗组织专一性的受体、配体或抗原的抗体接合，或与组织专一的受体的配体偶联。在发现有flt3受体的肿瘤细胞中，可将flt3-L与一种毒素接合，用flt3-L把毒素运送至特定的位点，或用于致敏这些肿瘤细胞以利后来服用抗肿瘤药物。
flt3-L可被通过表面的、非肠胃道的或经吸入给药。“非肠胃道的”一词包括皮下注射，静脉内、肌肉内或脑池内注射，或灌输技术。这些复方将典型地包含有效量的flt3-L，单独或与有效量的其他活性物质合用。包含于复方中的这类药的剂量和浓度可依赖很多因子而发生变动，这些因子包括预计的用途、病人的体重和年龄以及给药途径。预示的剂量可以根据动物测试而确定，对于人服用的剂量范围可按照本专业领域一般所接受的实践来进行。记住以上的描述，典型的flt3-L的剂量范围约为每平方米10微克至1000微克。较好的剂量范围为每平方米100微克至300微克。
除了以上所述，下面给出实施例做具体说明，并且不限于本发明范围。
实施例1
Flt3-受体：Fc融合蛋白的制备
本实施例描述了小鼠flt3的cDNA的克隆，以及用于检测编码flt3-L的cDNA克隆的编码可溶性的鼠flt3-受体：Fc融合蛋白的表达载体的构建。通过使用寡聚核苷酸引物和Lyman等(Oncogene 8：815—822，1993)所描述的方法由小鼠的T细胞进行了flt3 cDNA的聚合酶链式反应(PCR)克。小鼠的flt3受体的cDNA序列和编码的氨基酸顺序由Rosnet等提出(Oncogene，6：1641—1650，1991)。小鼠的flt3蛋白质含有一个542个氨基酸的细胞外区域，一个21个氨基酸的跨膜区域和一个437个氨基酸的细胞质区域。
在将鼠的flt3的cDNA融合至编码人的IgG1分子的Fc部分的N-末端之前，扩增的鼠flt3 cDNA片段先插入至pCAV/NOT的Asp718-NotI位点(其描述见PCT应用WO 90/05183)。编码一条单链多肽(该多肽含有人的IgG1拉体的Fc区域)的DNA被克隆至pBLUESCRIPT SK载体的SpeI位点，该载体可购自Stratagene克隆系统，La Jolla，California。这个质粒载体可在大肠杆菌内复制并含有一个包括21个单一限制酶切位点的多聚合接头片段。一个单一的Bgl II位点被引入至所插入的Fc编码序列的5′端附近，从而使Bgl II位点包含了Fc多肽的氨基酸的密码3和4。
被编码的Fc多肽从N-未端绞链区域延伸至天然的C-末端，即是一个基本上全长抗体Fc区域。Fc区域的片段，例如那些C-末端缩短的片段，也可以被使用。这些片段最好含有多个半胱氨酸残基(至少半胱氨酸残基位于绞链反应中)以允许两个分离的flt3：Fc融合蛋白在两个Fc多肽部分之间形成链间的二硫键，形成如以上所讨论的二聚物。
一个Asp 718限制性内切酶酶切位点被引入flt3编码区域的上游。鼠flt3的cDNA的一个Asp718-NcotI片段(包括全部的细胞外区域，跨膜区域和胞浆区域的一小部分)被分离。以上所描述的Asp718-NcoI flt3的部分cDNA被克隆至含有Fc的cDNA的pBLUESCRIPT SK载体中，以使flt3的cDNA位于Fc的cDNA的上游。通过基因融合所得的单链DNA以Kunkel(Proc.Natl.A-cad.Sci.USA 82：488，1985)和Kunkel等(Methods in Enzymol.154：367，1987)所描述的方法进行突变，以更好地将flt3的全部细胞外区域融合至Fc序列。突变的DNA经测序后以证实适当的核苷酸已被移去(即跨膜区域和部分细胞质区域被缺失)，并且flt3和Fc序列在同一阅读框内。融合的cDNA然后被剪切并插入至哺乳动物表达载体sfHAV-EO409，此载体用SalI—NcoI消化，而且SalI和Asp718位点被填平。sfHAV-EO载体(也作pDC406)见于McMa-han等(EMBO J.，10；No.10：2821—2832，1991)的描述。
flt3：Fc融合蛋白最好在重组体哺乳动物细胞培养物中被合成。含有flt3：Fc融合的表达载体被转化入CV-1细胞(ATCC CCL70)和COS-7细胞(ATCC CRT 1651)，都来自于猴肾。flt3：Fc的表达水平在CV-1和COS-7细胞中较低。因此，对在293细胞(转化的初级人胚胎肾细胞，ATCC CRL 1573)中的表达也进行了尝试。
用sfHAV-EO/flt3：Fc载体转染的293细胞被培养于旋转瓶中以允许融合蛋白质的瞬间表达，它可通过flt3的信号肽而分泌入细胞培养基中。融合蛋白在蛋白质A琼脂糖柱上纯化，洗脱并且用于筛选具结合flt3：Fc能力的细胞如实施例2和3所述。
实施例2
筛选对flt3：Fc结合细胞
大约100种不同的初级细胞和细胞素归入以下的范畴：初级鼠胎脑细胞，鼠胎肝细胞系，大鼠的胎脑细胞系，人肺癌(成纤维细胞样的)细胞系，人和鼠骨髓和淋巴细胞系被用于fh3∶Fc结合的检测。细胞系与flt3∶Fc孵育，然后加以生物素化的抗人Fc抗体，然后再加入(Streptavidin)链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白(BectanDickinson)。生物素化的抗体购自Jackon lmmunoresearch实验室。链霉抗生物素蛋白结合至吸附有抗人Fc抗体的生物素分子，抗人Fc抗体再依次结合至flt3∶Fc融合蛋白的Fc部分。藻红蛋白是一种有荧光的藻胆蛋白，可作为检测的标记。通过使用一种FASScam流式细胞计来测定每种细胞类型的荧光信号水平。被认为是flt3∶Fc结合阳性的细胞被鉴定出来。
实施例3
flt3的cDNA从鼠T细胞cDNA库中分离和克隆
细胞系P7B-0.3A4的一种鼠T细胞cDNA文库被选作为flt3-L的cDNA的可能来源。P7B—0.3A4是一种鼠的T细胞克隆即胸腺嘧啶1.2阳性，CD4阴性，CD8阴性，TCRab阴性/阳性，CD44阳性。它起初在rHulL-7和固定化的抗CD3 MAb存在的条件下被以0.33细胞穴的密度克隆，并在超过1年的连续培养中生长，在含有15纳克/ml rHulL—7的培养基中每星期传代一次。亲本细胞来自用悬于不完全弗氏助剂中的50nmol PLP 139—151多肽和100微克肺结核分支杆菌H37Ra免疫的SJL/J小鼠的淋巴结细胞。PLP是中央神经系统的髓磷脂的脂蛋白的蛋白组分。以前所示的由139-151氨基酸组成的多肽是在实验的自动免疫脑脊髓炎(EAE的脑源多肽，一种在SJL/J小鼠中多发硬化症小鼠模型(Touhy，V.K.，Z.Lu，R.A.Sobel，R.A.Lauren和M.B.Lees；1989.SJL鼠髓磷脂脂蛋白蛋白的脑源决定子的鉴定J Immunol 142：1523)。在抗原存在的情况下经过起始培养之后，来自PLP7的亲本细胞系，在进行克隆前已经与rHulL—7(及不含抗原)进行了超过6个月的连续培养。
P7B—0.3A4的增殖只有在对很高浓度的PLP139-151多肽应答时(存在有照射过的同源的脾细胞)才发生，并且是脑源的或同种反应性的。此克隆在对固定化的抗CD3 MAb，IL-2和IL-7应答而增殖，但对IL-4不会因应答增殖。
flt3∶Fc的结合可在鼠的T细胞和人的T细胞中观察到，因而一种鼠的T细胞(0.3A4)因其易于生长而被选择。如McMaham等(EMBO J.，10：No.10：2821-2832，1991)所述的方法制备了在sfHAV-EO中的鼠的0.3A4的cDNA库。sfHAV-EO是一种也能在大肠杆菌中复制的哺乳动物表达载体。sfHAV-EO包含由SV40而来的复制起始区，非洲淋巴瘤病毒和pBR322，并且是如Dower等(J.Immunol.142：4314，1989)所述的HAV-EO的衍生物。sfHAV-EO与HAV-EO的区别在于HAV-EO中腺病毒2三部分的前导序列中的内含子缺失了。简短地说，通过使用与Haymerle等(Nucl.Acids Res.14：8615，1986)所述的相似的连接顺序的方法将T细胞cDNA克隆至sfHAV-EO的SalI位点，使用了以下的一对寡聚核苷酸连接顺序：
SEQ ID NO：35′TCGACTGGAACGAGACGACCTGCT3′
SEQ ID NO：43′GACCTTGCTCTGCTGGACGA5′
通过基本如Gubler和Hoffman(Gene，25：263-269，1983)的方法从0.3A4聚(A+)RNA制备了双链、平头末端、随机引物的cDNA，使用了Pharmacia DNA试剂盒。上述的连接顺序加入至cD-NA，上述的连接顺序加入至cDNA中如Haymerle等所述。通过在65℃过Sephacryl S—1000柱来移去低分子量物质，并且cDNA被连接至sfHAV-EO410，该载体已预先被SalI酶切并被连接至同样的寡聚核苷酸对上。此载体被标示为sfHAV-EO410。DNA被电激进入大肠杆菌DH10B(Dower等，Nucleic Acicls Res.，6127—6145，1988)，在37℃培养1小时后，转化细胞被冻存在含有20％甘油的1毫升SOC培养其中(Hanaham等，J.Mol.Biol，166：557—580，1983)。取一份用于测定氨苄青霉素抗性克隆的数目。所得的0.3A4库含有1.84百万个克隆。
用在sfHAV-EO中的cDNA库转化大肠杆菌DH10B菌株，每平板大约可得到1600克隆。从每个平板中挖下菌落，合并一起，并从每个合并的菌中制备质粒DNA。通过使用DEAE-葡聚糖，然后再以氯奎处理，大约1600合并的菌落的DNA被用来转染一个含有亚汇合的CV-1/EBNA-1细胞层。与Luthman等(Nucl.Acids.Res，11：1295，1983)和McCutchan等(J.Natl.Cancer Inst，41：351，1986)所描述的方法相类似。CV-1/EBNA-1细胞系(ATCC CRL10478)组成型地表达EBV核抗原由CMC的最早期增强子/启动子带动。如McMahan等所述(EMBOJ，10：2821，1991)，CV1-EB-VA-1来自于非洲绿猴肾细胞系CV-1(ATCC CCL70)。
为了用cDNA库转化CV-1/EBNA-1细胞，细胞被维持完全培养基(Dulbecco的改良的Eagle培养基DMEM)，含有10％(v/v)胎牛血清(FCS)，50单位/ml青霉素，50单位/ml链霉素，2mM L-谷氨酰胺)以大约2×105个细胞/穴的密库涂于单穴的有室载玻片上(Lab-Tek)。载片先用1ml溶于PBS中的10mg/ml的人粘连蛋白预处理30分钟，然后用PBS洗一次。培养基从粘附着的细胞层上移去后，用含有66.6μM硫酸氯奎的1.5ml完全培养基代替。然后将十分之二毫升的DNA溶液(2微克DNA，0.5毫克/毫升DEAE-葡聚糖于含有氯奎的完全培养基中)加于细胞中并孵育5小时。在孵育之后，移去培养基，并通过添加含有10％DMSO的完全培养基来休克细胞2.5至20分钟，然后再用新鲜的完全培养基来替换此溶液。培养细胞2—3天以使插入序列瞬间表达。
被转染的CV-1/EBNA-1的细胞单层通过基本如Gearing等(EMBO J8：3667，1989)所述的玻片放射自显影法来检测flt3-L的表达。被转染的CV-1/EBNA-1(粘附在有室的载玻片上)用含有脱脂奶粉(BM-NFDM)的结合培养基洗一次(RPM1培养基1640包含25mg/ml小牛血清白蛋白(BSA)，2mg/ml叠氮化钠，20mM HEP-ES，pH7.2和50毫克/毫升脱脂奶粉)。然后细胞与在BM-NFDM中的flt3∶Fc在室温下孵育1小时。在孵育后，在有室载玻片中的单层细胞用BM-NFDM洗涤三次以移去未结合的flt3∶Fc融合蛋白，然后与40ng/ml125I-鼠抗人Fc抗体(见以下描述)(1∶50稀释)在室温下孵育1小时。细胞用BM-NFDM洗涤三次，然后用磷酸-盐缓冲溶液洗涤2次来移去未结合的125I-鼠抗人Fc抗体。细胞通过与溶于PBS中的2.5％戊二酸pH7.3在室温下孵育30分钟而被固定，在PBS中洗2次，空气干燥。含有细胞的有室载玻片在磷影像仪(Molecular Dynamics)上暴露过夜，然后浸于Kodak GYNB-2照相乳胶液(在水中6倍稀释)并于暗盒中在4℃曝光3—5天。然后将载玻片在Kodak D19显影液中(40克/500毫升水)显影大约4分钟，用水漂洗后在Agfa G433C固定液中固定。用25—40倍放大倍数的显微镜单独镜检每个载玻片，通过在光背景下有放射自显影的银颗粒的存在来鉴定表达flt3-L的阳性细胞。
鼠抗人Fc抗体来自于Jackson实验室。这个抗体显示了对结合在Fcr受体上的Fc蛋白质的最小结合。此抗体用氯胺T方法来标记。简短地说，按照厂商说明来制备一个葡聚糖G-25柱。用含有1％牛血清白蛋白的10柱体积的PBS来预处理柱以减少抗体对柱和树脂的非专一性吸附。用不含牛血清白蛋白的5倍体积的PBS洗涤，以从柱中去作非结合牛血清白蛋白。在一试管中，分别加入10微克抗体(溶解于10微升PBS中)，50微升50mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)，和2.0mCi无携带剂的Na125I，将溶液混合均匀。然后加入15微升新制备的氯胺-T溶液(2mg/ml于磷酸钠缓冲液(pH)7.2)中)，将混合物在室温下孵育30分钟，再立刻将混合物加至葡聚糖G-25柱上。然后通过收集100—125微升一部分的洗脱液，放射性标记的抗体被从柱中洗脱下来。将牛血清白蛋白加至含有放射性标记抗体的洗脱物中，终浓度为1％。放射碘化作用产生的比活性在5—10×1015cpm/mmol蛋白质范围。
通过使用载玻片放射自显影法，大约1,600个cDNA库中的1,840,000个cDNA被检测，直到一个转染子库的检测清楚表明了对flt3∶Fc结合的明显阳性。这个库然后被分隔成500个库，再通过载玻片经过放射自显影检测，鉴定到一个阳性库。这个库再被分隔成100个库，并再次进行筛选。这个库中的100个单个群落被检测，直到鉴定出一个克隆(克隆#6C)，它指导带有flt3：Fc结合活力的表面蛋白的合成。分离出这个克隆，对其0.88kb的插入cDNA测了序。
克隆#6C的鼠flt3-配体cDNA的编码区域的核苷酸和编码的氨基酸顺序见SEQ ID NOs：1和2。插入cDNA的长度为0.88kb。在此序列内的开放阅读框架可编码一个231个氨基酸的蛋白质。231个氨基酸开放阅读框架的DNA和编码的氨基酸顺序见SEQ IDNOs：1和2。SEQ ID NO：2的蛋白质是I型跨膜蛋白，它带有一个N-末端的信号肽(1至27氨基酸)，一个细胞外区域(28至188氨基权)，一个跨膜区域(氨基酸189至211)和肥浆区域(212至231氨基酸)。紧接信号顺序裂解位点的天然蛋白质的预计分子量为23,164道尔顿。成熟蛋白质具有一个9.372的计算的pI。在编码区域两侧，有56碱基的5′非编码区和126碱基的3′非编码区，包括添加的cD-NA连接顺序。上述的克隆过程也产生了一个鼠flt3配体克隆#5H，它从SEQ ID NO：1中的核苷酸49至545(对应的氨基酸为163)与#6C克隆全同。从那个位点向上，#5H克隆完全不同，代表了另一个剪接结构。
在大肠杆菌中含有flt3-L的cDNA的sfHAV-EO410载体被于1993年3月20日保存于American Type Culture Collection，Rockville，MD，USA，并且接受号为ATCC 69286。保存物是按照布达配斯谈判的条款做的。
实施例4
编码人的flt3-L的cDNA的克隆
一个编码人flt3-L的cDNA被从人克隆22T细胞λgt10随机引物合成的cDNA库中克隆出，按Sim等(PNAS，86：8946—8950，1989)所描述的片断。cDNA库用与鼠flt3-L(SEQ ID NO：1的核苷酸103至516)的细胞外区域相对应的41 3碱基对的Ple I片段来筛选。片段是随机引物合成的，并在寡聚预杂交缓冲液中与cDNA库滤膜在55℃杂交过夜。此片段然后在2×SSC/0.1％SDS中于55℃洗涤1小时，然后于1×SSC/0.1％SDS中1小时及0.5×SSC/0.1％SSC中洗涤1小时。抽提阳性噬菌斑中的DNA，用对噬菌体臂专一的寡核苷酸通过PCR法来扩增插入的DNA。扩增的DNA被测序，克隆#9的序列见SEQ ID NO：5。通过如以上所描述的用含有与SEQ ID NO：1的核苷酸128至541基本对应的cDNA序列的鼠克隆#5H的cDNA的细胞外区域的一个片段来检测cDNA库，由相同的λgt10随机引物cDNA库分离了另外一个人flt3-L cDNA。
克隆#9 988碱基对的cDNA的测序表明一个705碱基对的开放阅读框架被一个29碱基对的5′非编码区和一个250碱基的3′非编码区包围。3′非编码区不含多聚A尾巴。在起始蛋氨酸的上游没有符合框的终止密码子。开放阅读框架编码一个如顺序SEQ IDNO：6中氨基酸1至235所示的235个氨基酸的I型跨膜蛋白。蛋白质含有一个26或27个氨基酸的信号肽。有个较大的可能性是N-末端信号肽在长度上是26个氨基酸而不是27个氨基酸。紧跟信号肽的是一个156或155个氨基酸的细胞外区域(分别对于26或27个氨基酸的信号肽来说)；一个23个氨基酸的跨膜区域和一个30个氨基酸的胞浆区域。人flt3-L与鼠flt3-L有72％的氨基酸同一性和78％的氨基酸相似性。包含克隆#9的人flt3-L的cDNA的载体pBLUESCRIPT SK(—)被于1993年8月6日保存至AmericanType Culture Collection，Rockville，Maryland，USA(ATCC)，并且接受号为ATCC 69382。保存物是按照布达配斯谈判条款制做的。
实施例5
flt3-L在酵母中的表达
为了在酵母中表达可溶性的flt3-L，人工合成的寡聚核苷酸引物被用于通过PCR(Mullis和Faloona，Meth.Enzymol.155：335—350，1987)来扩增信号肽末端和跨膜区域起始点之间的flt3-L的完整细胞外编码区域。5′引物(5′-AATTGGTACCTTTGGATAAAAGAGACTACAAGGACGACGATGACAAGACACCTGACTGTTACTTCAGCCAG-3′)SEQ ID NO：7编码了α因子先导顺序和一部分和一个抗原性八肽，以符号框方式与预计的成熟的flt3-L的N-末端融合的FLAG序列。3′寡聚核苷酸(5′-ATATGGATC-CCTACTGCCTGGGCCGAGGCTCTGGGAG-3′)SEQ ID NO：8产生了一个谷氨酰胺-189之后的终止密码子，正好位于推测的跨膜区域。PCR产生的DNA被连接至酵母表达载体(为了在K.lactis中表达)，该载体可指导将重组产物分泌至酵母培养基中(Fleer等，gene，107：285—195，1991；和Van der Berg等，Bio/Technology，8：135—139，1990)。用如前述的亲和层析法从酵母液体培养基中纯化出FLAG：flt3-L融合蛋白质(Hopp等，Bio/Technology，6：1204—1210，1988)
实施例6
flt3-L的单克隆抗体
本实施例说明制备flt3-L的单克隆抗体的方法。flt3-L在哺乳动物宿主细胞如COS-7或CV-1/EBNA-1细胞中表达并用flt3：Fc亲和层析法纯化。纯化的flt3-L，一个如细胞外区域的片段，人工合成的多肽或表达flt3-L的细胞可用于通过传统方法来产生对flt3-L的克隆抗体，例如于美国专利第4,411,993号所描述的技术。简短地说，鼠用flt3-L免疫，flt3-L于完全Freund辅剂中乳化用做免疫抗原存在，并以10—100微克的数量范围皮下或腹腔内注射。10—12天后，免疫过的鼠用另一份于完全Ferund辅剂中乳化的flt3-L强化。以后鼠周期性地按一周至二周的免疫程序加强。定期则眶后放血或尾尖切伤取出血清样品以检测flt3-L的抗体，检测方法可用斑点检测。ELISA(酶联免疫吸附剂检测)法或flt3结合的抑制法。
在测定了一个抗体的效价之后，用flt3-L的盐溶液最后一次静脉注射阳性动物。3至4天后，杀死动物，收集脾脏细胞。并且脾细胞被融合至一促鼠骨髓瘤细胞系，如NS1或更佳的为P3×63Ag8.653(ATCC CRL1580)。融合会产生杂交瘤细胞，将其置于含有HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺苷)筛选培养基的多个微效价平板上以抑制非融合细胞、骨髓瘤杂交细胞和脾细胞杂交细胞的增殖。
通过改进的Engvall等(Immunochem，8：871，1971和美国专利第4,703,004号)所揭示的技术，以测定对纯化的flt3-L的反应活力的ELISA法来检测杂交瘤细胞。一个较好的检测方法是如Beck-mam等(J.Immunol.144：4212，1990)所述的抗体捕捉技术。阳性杂交瘤细胞可被通过腹膜内注射进同源的BALB/C鼠，以产生含高浓度的抗flt3-L单克隆抗体的腹水。或者，杂交瘤细胞可在体外以各种不同的方法在三角瓶或旋转瓶中生长。在鼠腹水内产生的单克隆抗体可通过硫酸铵沉淀，然后再通过凝胶排阻层析来纯化。同样地，也可使用基于抗体与蛋白质A或蛋白质B结合的亲和层析，如同基于同flt3-L结合的亲和层析。
实施例7
flt3-L单独或与IL-7或IL-3联合使用
本实施例展示了通过含有flt3-L和IL-7的复方对AA4.1阳性胎儿肝细胞的促进和增殖；以及通过含有flt3-L和IL-3的复方对C-Kit阳性(C-Kit+)细胞的促进和增殖。
AA4.1-阳性(AA4.1+)表达细胞通过在Optilux100毫米塑料培养皿(Falcon NO.1001，Dxnard，CA)中的细胞平移，从14天C57BL/6鼠胎肝中被分离。平板在PBS中4℃被包被过夜，PBS中加有1％含有10微克/毫升AA4.1抗体(McKeran等，J.Im-munol.，132：332—339，1984)的胎儿牛血清(FBS)，然后在使用前用加有1％FBS的PBS洗涤干净。肝细胞的单细胞悬浮液以107细胞/皿的密度加入附加1％FBS的PBS中，然后在4℃使粘附到平板上2小时。然后仔细洗涤平板，通过刮取来收集粘附的细胞，以进行分析或在以下所描述的血细胞生成检测中进一步使用。通过使用AA4.1抗体的FACS分析证明了有一个大于95％AA4.1+的细胞群体。
C-kit+多能性干细胞被从成年鼠骨髓中纯化(de Vries等，J.Exp.Med.176：1503—1509，1992；和Visser和de Vries，Methdsin Cell Biol.，1993)。对外源凝集素小麦胚凝集素阳性和对被B220识别的抗原阴性的低密度细胞(≤1.078克/cm3)和15—1.4.1(Visser等，Meth，in Cell Biol.，33：451—468，1990)单克隆抗体，通过使用生物素化的Steer因子可被分成表达和不表达C-kit的细胞亚群。C-kit+部分已被证明含有多能性造血干细胞(de Vries等，Science 255：989—991，1992；Visser和de Vries，Metheds in CellBiol.，1993；和Ware等，1993已投稿)。
AA4.1+胎儿肝细胞被培养在重组的100纳克/毫升的IL-7(美国专利第4,965,195号)和培养在重组的250纳克/毫升的fh3-L中。在实验中flt3-L被以三个不同的形式使用：(1)以存在于固定的，flt3-L转染的CV1/EBNA细胞上的形式；(2)作为来自这些相同的flt3-L转染的CV1/EBNA细胞和浓缩的培养上清液；和(3)作为从如实施例5所描述的上清液中纯化和分离的多肽制剂。血细胞生成检测
C-kit+干细胞、胎儿肝AA4.1+细胞的增殖通过基本如de Vries等(J.Exp.Med.，173：1205－1211，1991)所述的[3H]-胸腺苷参入检测方法来进行检测。纯化的C-kit+干细胞在37℃，于一空气中含有6.5％二氧化碳和7％氧气的完全湿润环境中培养96小时。鼠的重组IL-3以100纳克/毫升的终浓度来使用。然后，细胞用每穴2μCi的[3H]-胸腺苷脉冲(81Ci/mmol；Amershan.Corp.，Arling-ton Heights，IL)标记并且再孵育24小时。AA4.1+细胞(大约20，000细胞/穴)在IL-7，flt3-L和flt3-L＋IL-7中孵育48小时。然后用[3H]-胸腺苷脉冲标记6小时。所得到的flt3-L和IL-7结果见表I，所得的flt3-L和IL-3结果见表II。
表I
flt3-L和IL-7对AA4.1+胎儿肝细胞增殖的影响
              对照   flt3-L   IL-7    flt3-L＋IL-7
[3H]-胸腺苷   100    1000    100    4200
参入(CPM)
flt3-L和IL-7合用产生的反应大约超过单独使用flt3-L时的四倍和超过单独使用IL-7时的大约40倍。
表II
flt3-L和IL-3对C-kit+细胞增殖的影响
                对照(单独载体)     flt3-L    IL-3    flt3-L＋IL-3[3H]-胸腺苷       1000                1800     3000     9100参入(CPM)
用flt3-L的cDNA转化的CV1/EBNA细胞的培养上清液较用单独表达载体转染的CV1/EBNA细胞的培养上清液在促进C-kit+的增殖上大约高出18倍。含有flt3-L的上清液中添加IL-3表现出了协同作用，所观察的增殖强度在约两倍于如果其作用是相加的结果。
实施例8
flt3-L∶Fc融合蛋白的构建
本实施例描述一种含有flt3-L的细胞外区域和人免疫球蛋白的Fc区域的融合蛋白的构建方法。其方法基本上类似于实施例1中所描述的flt3-L∶Fc融合蛋白的构建。
在将flt3-L的cDNA融合至编码人IgG1分子的Fc部分的cD-NA的N-末端前，flt3-L的cDNA片段被插入至pCAV/NOT的Asp718—NcotI位点，其描述见PCT应用WO 90/05183。编码含有人IgG1抗体的Fc区域的一条单链多肽的DNA被克隆至pBLUE-SCRIPT SK载体的SpeI位点，该载体可购自Stratagene克隆系统，La，Jolla，California。这个质粒载体可在大肠杆菌内复制并含有一个包括21个单一限制酶切位点的多接头片段。一个单一的Bgl II位点被引入至所插入的编码序列的5′端附近，从而使Bgl II位点包含了Fc多肽的第3和第4氨基酸的密码子。
被编码的Fc多肽从N-末端绞链区域延伸至天然的C-末端，即基本上是一个全长抗体Fc区域。Fc区域的片段，例如那些C-末端被缩短的片段，也可以被使用。这些片段最好含有多个半胱氨酸残基(至少半胱氨酸残基位于绞链反应中)以允许对于两个分离的flt3∶Fc融合蛋白在两个Fc多肽部分之间可形成链间的二硫键，从而形成二聚物。
一个pCAV/NOT中flt3-L的Asp718—StuI部分cDNA可被克隆至含有Fc的cDNA的pBLUESCR1PT SK载体的Asp710—SpeI位点，以使flt3-LDNA位于Fc cDNA的上游。由基因融合所得的单链DNA以Kunkel(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488，1985)和Kunkel(等Methods in Enzymol 154：367，1987)所描述的方法进行突变，以完善地将flt3的全部细胞外区域融合至Fc序列。突变的DNA经测序膈以证实适当的核苷酸已被移去(即跨膜区域和部分的胞浆区域被缺失)，并且flt3-L和Fc序列在同一阅读框内。融合的cDNA然后被剪切并通过传统方法插入至哺乳动物表达载体pCAV/NOT，此载体用Asp718/NOT消化。
flt3-L：Fc融合蛋白最好在重组体哺乳动物细胞培养物中被合成。含有flt3-L：Fc融合物的表达载体被转染入CV-1细胞(ATCCCCL70)或COS-7细胞(ATCC CRL 1651)。在293细胞(转化的初级人胚胎肾细胞，ATCC CRL1573)中表达也是可能的。
用pCAV/NOT/flt3-L：Fc载体转染的293细胞被培养在旋转的瓶中以允许融合蛋白的瞬间表达，它可通过flt3-L的信号肽而分泌入细胞培养基中，融合蛋白可在蛋白质A琼酯糖柱上纯化。
实施例9
过量表达flt3-L的转基因鼠的产生
本实施例描述一种用于产生过量表达flt3-L的转基因鼠的方法。研究过量表达flt3-L的鼠以确定过量表达的生物学影响。按照如Gordan等(science 214：1244—1246，1981)所描述的方法将flt3-L DNA微注射进鼠(B16/J)原核。一般地，具有可见的原核的鼠受精卵首先被放在注射室内并用一根小吸管固定，然后用注射吸管将编码flt3-L的基因少射入卵的原核。受精卵然后(i)被转移入一个假孕0.5天的母鼠的输卵管中或(ii)在体外培养至二细胞阶段(过夜)并被转移入一个假孕0.5天的母鼠的输卵管中或(iii)体外培养至胚泡阶段，再被转输入一个假孕2.5天的母鼠的子宫中。较佳地，前2个方法的任一个由于避免了长时间的体外培养而可使用，并且更佳地，应当转移大约20—30个微注射过的受精卵以避免产生小的同窝仔。
实施例10
flt3-L促进脾脏中红血细胞增殖
本实施例描述了在转基因鼠中flt3-L对脾脏红血细胞中产生的影响。轩基因鼠的产生按照实施例9中的方法。杀死鼠并将每一个完整的脾脏制成单细胞悬浮液。悬浮细胞被离心后再重悬于含有PBS和1％胎儿牛血清的10毫升培养基中。通过用血球计数板进行细胞计数。按照以下的公式，用台盼蓝染色法对每个样品进行细胞计数以获得每毫升培养基中的活细胞总数，公式为：(RBC＋WBC)/ml，其中RBC是红细胞的细胞数，WBC是白细胞的细胞数。然后用Turk染色对每个样品计数以获得每毫升培养基中白细胞总数。每个样品的每毫升培养基中红细胞总数的计算通过以每毫升的活细胞总数减去每毫升中白细胞的总数来进行。结果峥以下表III。
表III
在flt3-L过量表达的转基因鼠脾脏中血红细胞的增殖
鼠       活细胞总数         白细胞总数         红细胞总数
       (百万细胞/毫升)    (百万细胞/毫升)    (百万细胞/毫升)
对照1      29.7                  27                 2.7
对照2      31                    24.6               6.4
转基因1    44.7                  25.6               19.1
转基因2    37.3                  28.4               8.9
从表III中的数据可见，每毫升中白细胞数与对照鼠大体相同。但是，由2个转基因鼠脾脏得到的红细胞数大体为对照鼠中所观察到的2－3倍。flt3-L促进了红血球谱系细胞的增加，可能通过促进红血球祖代细胞，通过促进产生促红细胞生成蛋白的细胞，或阻断了限制红细胞中生成作用的机制。
实施例11
flt3-L促进T细胞和早期B细胞的增殖
从按照实施例10所获得的9周的转基因鼠所获得的骨髓用于筛选各种T细胞和B细胞表型标记的存在，其检测通过使用能与这些标记发生免疫反应的抗体。检测了以下标记：B220标记，它对B细胞谱系是专一的；对成熟B细胞专一的表面IgM标记(sIgM)；是一种早期B细胞标记的S7(CD43)标记；是活化的T细胞和B细胞的一种标记的干细胞抗原-1(SCA-1)标记；是辅助T细胞和某些干细胞的一种标记的CD4；对巨噬细胞专一的Mac-1标记，通过使用众所周知)的对这些标记的抗体进行筛选。下面的表IV显示了从骨髓筛选中所获得的数据。对由同一窝幼仔，得到的2只转基因鼠进行了分析以来自于同一窝的一正常鼠做对照(对照1)和另一无关的正常鼠做对照(对照2)。
表IV
转基因鼠中flt3-L过量表达的影响
标记    无关对照    同窝鼠    转基因#1     转基因#2
对照
B220     30.64       27.17      45.84       48.78
sIgM     3.54        2.41       1.94        1.14
S7(CD43) 54.43       45.44      46.11       50.59
SCA-1    10.92       11.74      19.45       27.37
CD4      6.94     8.72          12.21       14.05
Mac-1    36.80    27.15         21.39       18.63
上述数据表明鼠中flt3-L的过量表达导致了B细胞数目的增加，如B220+细胞和SCA-1+细胞的增加所示。B220+细胞的FACS分析表明proB细胞(HSA-，ST+)的增加。CD4+细胞的增加表明了T细胞和干细胞大约增加2倍。这些数据表明flt3-L增加了具有T细胞、干细胞或早期B细胞表型的细胞，但不促进成熟B细胞或巨噬细胞的增加。    实施例12
对过量表达flt3-L鼠胸腺的分析
本实施例描述了从按照实施例10所得的转基因鼠胸腺的分析。6个成年鼠，每个约有3个月年龄，被杀死后取出每只鼠的胸腺并制备单细胞悬浮液。
FACS分析表明在现有的细胞总数中没有变化并且通过使用一些标记证明，鼠胸腺细胞的成熟比例上没有改变，这些标记有：CD4vs.CD8；CD3vs.αβTCR(T细胞受体)；和CD3vs.γδTCR(细胞受体)。但是，在确定的细胞类型CD4-和CD8-分隔室中(即与发育有关的早期细胞；它们代表了全部胸腺细胞的2％—3％)中出现了变化。特别地，在胸腺发育三个阶段的CD4-和CD8-细胞。阶段1代表具有Pg-1++，HSA+和IL-2受体阴性(“IL-2R”)的细胞。在阶段1后，胸腺发育至含有具有Pgp-1+，HSA++，和IL-2R++标记的细胞的阶段2，然后为阶段3，其特征为细胞具有Pgp-1+/-，HSA++，和IL-2R-标记。转基因鼠中处于阶段2的胸腺细胞减少了50％，同时阶段3的细胞群都成正比地增加。这些数据表明flt3-L促进胸腺细胞从阶段2至阶段3的发育，表明flt3-L对早期细胞有活性。
实施例13
flt3-L在外周干细胞移植中的应用
本实施例描述了一种使用flt3-L在自体外周干细胞(PSC)或外周血祖代细胞(PBPC)移植的方法。典型地，PBPC和PSC移植对一些病人施用，这些病人的骨髓由于，例如，骨髓异常或恶性肿瘤而不适于收集。
在收集细胞前，可能希望动员或增加循环着的PBPC和PSC的数目。动员可提高PBPC和PSC收集，这可通过在收集这些细胞前给病人静脉的注射flt3-L达到。其他生长因子如CSF-1，GM-CSF，SF，G-CSF，EPO，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，GM-CSF/IL-3融合蛋白，LIF，FGF和这些因子的合用可以与flt3-L顺序使用或同时合用。通过使用本专业已知的apheresis方法来收集被动员的或非被动员的PBPC和PSC细胞。例如见：Bishop等，Blood，Vol.83，NO.2，PP.610一616，1994。简短地说，PBPC和PSC可通过传统设备来收集，例如一种Haemonetics型号V50 apheresis装置(Haemonet-ics，Braintree，MA)。典型的为每周至少5次的四小时收集直至收集到大约6.5×108单核细胞(MNC)/公斤病人。收集的PBPC和PSC取样用于检测粒性白细胞-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)的量，其检测通过用不含钙和镁的Hank平衡盐溶液(HBSS)来大体以1∶6稀释并且于淋巴瘤分离培养基(Organon Tekuika，Durham，North Carolina)上涂薄层而进行。离心后，收集界面上的MNC，用HBSS洗涤后重悬于HBSS中。1毫升一份溶液包含大体300，000MNC，改良的McCoy 5A培养基，0.3％琼脂，200单位/毫升重组人GM-CSF，200u/ml重组人IL-3，200u/ml重组人G-CSF，于37℃，5％CO2，完全湿润空气中培养14天。任选地，flt3-L或GM-CSF/IL-3融合分子(PIXY321)可加于培养物中。这些培养物通过赖氏染剂染色，并且，CFU-GM集落可通过解剖显微镜来记录(Ward等，Exp，Hematol.，16：358，1988)。或者，CFU-GM可通过使用CD34/CD33流式细胞光度方法来检测，峥siena等(Blood，Vol77，NO.2，PP400—409，1991)或本专业中其它的已知方法。
包含CFU-GM的培养物在一控制速度的冷冻器中冻牢(如CryoMed，Mt.Clemens，MI)，然后储存在于液氮的汽相中。10％的二甲基亚枫可用做低温保护剂。在从病人处的所有收集完成后，包含CFU-GM的培养物被解冻并合在一道。解冻的细胞收集物可以或是重新静脉输入病人或在重输入前进行体外扩展，合并的细胞和体外扩展可以在使用flt3-L作为生长因子(单独使用、顺序使用或与以上所列的细胞素结合使用)来完成。这类体外扩展法在本专业中是熟知的。扩展或未扩展的细胞被重新静脉输入回病人。为便于移植细胞移入，flt3-L在重输入时同时或稍后注入。flt3-L的注入在单独、顺序或与以上所列的细胞素结合使用的情况下进行。
实施例14
用flt3-L纯化造血祖代细胞和干细胞
本实施例描述从含有细胞混合物的悬浮液中纯化造血祖代细胞和干细胞的方法。通过常规方法收集骨髓和外周血液的细胞。将细胞悬浮于标准培养基并离心除去红细胞和中性白细胞。位于两相之间界面的细胞(在本专业中已知为淡黄色)被分离并重新悬浮。这些细胞主要是单核并且代表了绝大部分的早期造血祖代细胞和干细胞。所得的细胞悬浮液然后与生物素化的flt3-L孵育足够长的时间以允许flt3∶flt3-L的相互作用。典型地，至少1小时的孵育时间是足够的。孵育后，细胞悬浮液在重力条件下，经过用抗生物素蛋白包被的珠充塞的柱。这类柱在本专业中是熟知的，见Brernson等，J，CellBiochem.，10D：239，1986.用PBS洗涤柱以除去未结合的材料。可能用常规方法使靶细胞从珠及flt3-L上释放。
序列单(1)一般资料
(i)申请人Lymwm，Stewart D
Ncckmam，M.Patricia(ii)发明名称flt3受体的配体(iii)序列数目8(iv)通信地址
(A)地址：Stephen L.Malaska，Immunex Corporation
(B)街：51 University Street
(C)城市：Seattle
(D)州：Washington
(E)国家：美国
(F)邮编：98101(v)计算机可读形式
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：Apple Macintosh
(C)操作系统：Macintosh 7.0.1
(D)软件：Microsoft word.Version #5.1(vi)现在申请数据
(A)申请号：待定
(B)文件日期：1994年3月7日
(C)分类：(vii)以前申请数据
(A)申请号：08/162,407
(B)文件日期：1993年12月3日
(C)分类：(vii)以前申请数据
(A)申请号：08/111,758
(B)文件日期：1993年8月25日
(C)分类：(vii)以前申请数据
(A)申请号08/106,463
(B)文件日期：1993年8月12日
(C)分类：(vii)以前申请数据
(A)申请号08/068,394
(B)文件日期：1 993年5月24日
(C)分类：(viii)代理人资料
(A)姓名：Malaska，Stephen L.
(B)登记号：32,665
(C)编号：2813-D(iX)通讯资料
(A)电话：(206)587一0430
(B)传真：(206)233-0644
(C)电传：756822(2)SEQ ID NO：1的资料(i)序列特征
(A)长度：879碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑学：线状(ii)分子类型：cDNA至mRNA(iii)假设的：无(iv)反义：无(ix)性质
(A)名misc-feature
(B)位置1..25(ix)性质：
(A)名：misc-feature
(B)位置：855..879(ix)性质：
(A)名：CDS
(B)位置：57..752(xi)序列描述：SEQ ID NO：1GTCGACTGGA ACGAGACGAC CTGCTCTGTC ACAGGCATGA GGGGTCCCCG GCAGAG       56ATG ACA GTG CTG GCG CCA GCC TGG AGC CCA AAT TCC TCC CTG TTG CTG    104Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Asn Ser Ser Leu Leu Leu1               5                  10                  15CTG TTG CTG CTG CTG AGT CCT TGC CTG CGG GGG ACA CCT GAC TGT TAC    152Leu Leu Leu Leu Leu Ser Pro Cys Leu Arg Gly Thr Pro Asp Cys Tyr
        20                  25                  30TTC AGC CAC AGT CCC ATC TCC TCC AAC TTC AAA GTG AAG TTT AGA GAG    200Phe Ser His 5er Pro Ile Ser Ser Asn Phe Lys Val Lys Phe Arg Glu
    35                  40                  45TTG ACT GAC CAC CTG CTT AAA GAT TAC CCA GTC ACT GTG GCC GTC AAT    248Leu Thr Asp His Leu Leu Lys Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Val Asn
50                  55                  60CTT CAG GAC GAG AAG CAC TGC AAG GCC TTG TGG AGC CTC TTC CTA GCC    296Leu Gln Asp Glu Lys His Cys Lys Ala Leu Trp Ser Leu Phe Leu Ala65                  70                  75                  80CAG CGC TGG ATA GAG CAA CTG AAG ACT GTG GCA GGG TCT AAG ATG CAA    344Gln Arg Trp Ile Glu Gln Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln
            85                  90                  95ACG CTT CTG GAG GAC GTC AAC ACC GAG ATA CAT TTT GTC ACC TCA TGT    392Thr Leu Leu Glu Asp Val ASn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Ser Cys
        100                 105                 110ACC TTC CAG CCC CTA CCA GAA TGT CTG CGA TTC GTC CAG ACC AAC ATC               440Thr Phe Gln Pro Leu Pro Glu Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile
    115                 120                 125TCC CAC CTC CTG AAG GAC ACC TGC ACA CAG CTG CTT GCT CTG AAG CCC               488Ser His Leu Leu Lys Asp Thr Cys Thr Gln Leu Leu Ala Leu Lys Pro
130                 135                 140TGT ATC GGG AAG GCC TGC CAG AAT TTC TCT CGG TGC CTG GAG GTG CAG               536Cys Ile Gly Lys Ala Cys Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Val Gln145                 150                 155                 160TGC CAG CCG GAC TCC TCC ACC CTG CTG CCC CCA AGG AGT CCC ATA GCC               584Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Leu Pro Pro Arg Ser Pro Ile Ala
            165                 170                 175CTA GAA GCC ACG GAG CTC CCA GAG CCT CGG CCC AGG cAG CTG TTG CTC               632Leu Glu Ala Thr Glu Leu Pro Glu Pro Arg Pro Arg Gln Leu Leu Leu
        180                 185                 190CTG CTG CTG CTG CTG CCT CTC ACA CTG GTG CTG CTG GCA GCC GCC TGG               680Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Thr Leu Val Leu Leu Ala Ala Ala Trp
    195                 200                 205GGC CTT CGC TGG CAA AGG GCA AGA AGG AGG GGG GAG CTC CAC CCT GGG               728Gly Leu Arg Trp Gln Arg Ala Arg Arg Arg Gly Glu Leu His Pro Gly
210                 215                 220GTG CCC CTC CCC TCC CAT CCC TAGGATTCGA GCCTTGTGCA TCGTTGACTC                  779Val Pro Leu Pro Ser His Pro225                230AGCCAGGGTC   TTATCTCGGT   TACACCTGTA   ATCTCAGCCC   TTGGGAGCCC   AGAGCAGGAT   839TGCTGAATGG   TCTGGAGCAG   GTCGTCTCGT   TCCAGTCGAC                             879
(2)序列SEQ ID NO：2资料：(i)序列特征
(A)长度：231氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)拓朴学：线状(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Asn Ser Ser Leu Leu Leu1               5                   10                  15Leu Leu Leu Leu Leu Ser Pro Cys Leu Arg Gly Thr Pro Asp Cys Tyr
          20                  25                  30Phe Ser His Ser Pro Ile Ser Ser ASh Phe Lys Val Lys Phe Arg Glu
      35              40              45Leu Thr Asp His Leu Leu Lys Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Val Ash
  50                  55                  60Leu Gln Asp Glu Lys His Cys Lys Ala Leu Trp Ser Leu Phe Leu Ala65                   70                  75                  80Gln Arg Trp Ile Glu Gln Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln
              85                  90                  95Thr Leu Leu Glu Asp Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Ser Cys
         100                 105                 110Thr Phe Gln Pro Leu Pro Glu Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile
     115                 120                 125Ser His Leu Leu Ly5 Asp Thr Cys Thr Gln Leu Leu Ala Leu Lys Pro
 130                 135                 140Cys Ile Gly Lys Ala Cys Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Val Gln145                 150                 155                 160Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Leu Pro Pro Arg Ser Pro Ile Ala
             165                 170                 175Leu Glu Ala Thr Glu Leu Pro Glu Pro Arg Pro Arg Gln Leu Leu Leu
         180                 185                 190Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Thr Leu Val Leu Leu Ala Ala Ala Trp
     195                 200                 205Gly Leu Arg Trp Gln Arg Ala Arg Arg Arg Gly Glu Leu His Pro Gly
 210                 215                 220Val Pro Leu Pro Ser His Pro225                 230
(2)序列SEQ ID NO：3资料：(i)序列特征：
(A)长度：24碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓朴学：线状(iii)假设：无(iv)反义：无(xi)序列描述SEQ ID NO：3
TCGACTGGAA CGAGACGACC TGCT(2)序列SEQ ID NO：4资料：(i)序列特征：
(A)长度：20碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓朴学：线状(iii)假设：无(iv)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：4
AGCAGGTCGT CTCGTTCCAG(2)序列SEQ ID NO：5资料(i)序列特征
(A)长度：988碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓朴学：线状(ii)分子类型：cDNA至mRNA(iii)假设：无(iv)反义：无(ix)性质：
(A)名：CD3
(B)位置：30..734(xi)序列描述：SEQ ID NO：5CGGCCGGAAT TCCGCCGCCC CCGGCCGAA ATG ACA GTG CTG GCG CCA GCC TGG    53
                            Met Thr val Leu Ale Pro Alo Trp
                             1               5AGC CCA ACA ACC TAT CTC CTC CTG CTG CTG CTG CTG AGC TCG GGA CTC   101Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu
 10                  15                  20AGT GGG ACC CAG CAC TCC TCC TTC CAA CAC AGC CCC ATC TCC TCC GAC   149Ser Gly Thr Cln Asp Cya Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp25                  30                  35                  40TTC CCT GTC AAA ATC CGT GAG CTG TCT GAC TAC CTG CTT CAA GAT TAC   197Phe Ala Vel Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr
             45                  50                  55CCA GTC ACC GTG GCC TCC AAC CTG CAG GAG GAG GAG CTC TGC GGG GGC   245Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cye Gly Gly
 60                          65                  70CTC TGG CGG CTG GTC CTG GCA CAG CGC TGG ATG GAG CGG CTC AAG ACT   293Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr
     75                  80                  85GTC GCT GGG TCC AAG ATG CAA GCC TTG CTG GAG CGC GTG AAC ACG GAG   341Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu
 90                  95                 100ATA CAC TTT GTC ACC AAA TGT CCC TTT CAG CCC CCC CCC AGC TGT CTT   389Ile Mls Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu105                 110                 115                 120CGC TTC GTC CAG ACC AAC ATC TCC CGC CTC CTG CAG GAG ACC TCC GAG   437Arg Phe Val Gln Thr Arn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Clu Thr Ser Glu
            125                 136                 135CAG CTG GTG GCG CTG AAG CCC TGG ATC ACT CGC CAG AAC TTC TCC CGG    405Gln Leu Val Als Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Aen Phe ser Arg
        140                 145                 150TGC CTG GAG CTG CAG TGT CAG CCC GAC TCC TCA ACC CTG CCA CCC CCA    533Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Scr Thr Leu Pro Pro Pre
    155                 160                 165TGG AGT CCC CGG CCC CTG GAG GCC ACA GCC CCG ACA GCC CCG CAG CCC    583Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro
170                 175                 180CCT CTG CTC CTC CTA CTG CTG CrG CCC GTG GGC CTC CTG CTG CTG GCC    629Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Val Gly Leu Leu Leu Leu Ala185                 190                 195                 200GCT GCC TGG TGC CTG CAC TGG CAG AGG ACG CGG CGC ACC ACA CCC CGC    677Als Ala Trp Cys Leu His Trp Gln Arg Thr Arg Arg Arg Thr Pro Arg
            205                 210                 215CCT GGG GAG CAG GTG CCC CCC GTC CCC AGT CCC CAG GAC CTG CTG CTT    725Pro Gly Glu Gln Val Pro Pro Val Pro Ser Pro Gln Asp Leu Leu Leu
        220                 225                 230GTG GAG CAC TGACCTGGCC AAGGCCTCAT CCTGCCGACC CTTAAACAAC            774Val Glu His
    235GCAGTGAGAC AGACATCTAT CATCCCATTT TACAGGGGAG GATACTGAGG CACACAGAGG  834GGAGTCACCA GCCAGAGGAT GTATAGCCTG GACACAGAGG AACTTGGCTA GAGGCCGGTC  894CCTTCCTTGG GCCCCTCTCA TTCCCTCCCC AGAATGGAGG CAACGCCAGA ATCCAGCACC  954GGCCCCATTT ACCCAACTCT GAACAAAGCC CCCG                              988
(2)序列SEQ ID NO：6资料：(i)序列特征：
(A)长度：235氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)拓朴学：线状(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：6Met Thr Val Leu Ala Pro Ala TrP Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu1                       5          10                  15Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phs
          20                  25                  30Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu
      35                  40                  45Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu
  50                  55                  60Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln65                  70                  75                  80Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly
              85                  90                  95Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala
         100                 105                 110Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser
     115                 120                 125Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp
 130                 135                 140Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro145                 150                 155                 160Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala
             165                 170                 175Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
         180                 185                 190Pro Val Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Trp Cys Leu His Trp Gln
     195                 200                 205Arg Thr Arg Arg Arg Thr Pro Arg Pro Gly Glu Gln Val Pro Pro Val
 210                 215                 220Pro Ser Pro Gln Asp Leu Leu Leu Val Glu His225                     230             235
(2)序列SEQ ID NO：7资料：(i)序列特征：
(A)长度：71碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓朴学：线状(ii)分子类型：cDNA至mRNA(iii)假设：无(iv)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：7AATTGGTACC TTTGGATAAA AGAGACTACA AGGACGACGA TGACAAGACA CCTGACTGTT    60ACTTCAGCCA C                                                         71(2)序列SEQ ID NO：8资料：(i)序列特征：
(A)长度：37碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓朴学：线状(ii)分子类型：cDNA至mRNA(iii)假设：无(iv)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：8
ATATGGATCC CTACTGCCTG GGCCGAGGCT CTGGGAG

Claims (47)

1.一个多肽，其特征在于是一个分离的flt3-配体(flt3-L)多肽。
2.一个如权利要求1所述的多肽，其特征在于是小鼠的flt3-L。
3.一个如权利要求1所述的多肽，其特征在于是人的flt3-L。
4.一个如权利要求要求3所述的多肽，其特征在于包含SEQ10NO：6中的1-235氨基酸。
5.一个如权利要求1所述的多肽，其特征在于是可溶性的flt3-L。
6.一个如权利要求5所述的多肽，其特征在于包含SEQ10NO：6中的28～160或28～182氨基酸。
7.一个如权利要求3所述的多肽，其特征在于它由具有接受号码ATCC69382的大肠杆菌DH10B细胞中载体sfHAVEO410上的插入cDNA编码。
8.一个DNA序列，其特征在于是编码一种flt3-L多肽的分离的DNA序列。
9.一个如权利要求8所述的分离的DNA序列，其特征在于它编码一个小鼠flft3-L多肽。
10.一个如权利要求8所述的分离的DNA序列，其特征在于它编码一个人flt3-L多肽。
11.一个如权利要求8所述的分离的DNA序列，其特征在于它编码SEQ10NO：6的氨基酸顺序28～160或28～182。
12.一个如权利要求8所述的DNA，其特征在于它选自以下组：
(a)由一个flt3-L基团的编码区域衍生来的cDNA；
(b)由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5所选出的cDNA序列；
(c)于中等严格条件下可与(a)或(b)中的cDNA杂交的DNA序列，此DNA序列编码flt3-L；
(d)由于遗传密码的简并性，编码具有如(a)，(b)或(c)的DNA序列所编码的氨基酸顺序的flt3-L多肽的DNA序列。
13.包含如权利要求8的DNA序列的一个表达载体。
14.包含如权利要求9的DNA序列的一个表达载体。
15.包含如权利要求10的DNA序列的一个表达载体。
16.包含如权利要求11的DNA序列的一个表达载体。
17.包含如权利要求12的DNA序列的一个表达载体。
18.用如权利要求13的表达载体转染或转化的一种宿主细胞。
19.用如权利要求14的表达载体转染或转化的一种宿主细胞。
20.用如权利要求15的表达载体转染或转化的一种宿主细胞。
21.用如权利要求16的表达载体转染或转化的一种宿主细胞。
22.用如权利要求17的表达载体转染或转化的一种宿主细胞。
23.一种产生flt3-L多肽的方法，其特征在于包括在促进表达条件下培养如权利要求18的宿主细胞并从培养基中回收多肽。
24.一种产生flt3-L多肽的方法，其特征在于包括在促进表达条件下培养如权利要求19的宿主细胞并从培养基中回收多肽。
25.一种产生flt3-L多肽的方法，其特征在于包括在促进表达条件下培养如权项要求20的宿主细胞并从培养基中回收多肽。
26.一种产生flt3-L多肽的方法，其特征在于包括在促进表达条件下培养如权项要求21的宿主细胞并从培养基中回收多肽。
27.一种产生flt3-L多肽的方法，其特征在于包括在促进表达条件下培养如权项要求22的宿主细胞并从培养基中回收多肽。
28.与flt3-L多肽发生免疫反应的一种抗体。
29.如权利要求28所述的抗体，其特征在于是一种单克隆抗体。
30.一种复方药，其特征在于它含有有效量如权利要求1的flt3-L多肽以及一种可接受的药用携带剂、赋形剂和稀释剂。
31.一种复方药，其特征在于它包含有效量如权利要求3的flt3-L多肽以及一种可接受的药用携带剂、赋形剂或稀释剂。
32.一种对接受细胞减少疗法进行包体移植的方法，其特征在于包括：
(a)在进行细胞减少疗法前，从病人收集造血祖代细胞和干细胞；并且
(b)在以后的细胞减少疗法时给病人输入所收集的细胞；
本方法至少包括一个以下步骤：
(i)在收集细胞前给病人服用有效量的flt3-L以增加循环
着的祖代细胞或干细胞的数目；
(ii)通过与有效量的flt3-接触，体外扩展祖代细胞或干细
胞；并且
(iii)给病人服用有效量的flt3-以便于病人对移植祖代细胞
或干细胞的吸入。
34.如权利要求33的一种方法，其特征在于其中flt3-L与以下所列的细胞素中所选出的一种顺序或同时联合使用，细胞素包括：CSF-1，GM-CSF，SF，G-CSF，EPO，IL-，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，GM-CSF/IL-3融合蛋白，LIF和FGF。
35.如权利要求34的一种方法，其特征在于其中flt3-L与以下所列的细胞素中所选出的一种联合使用，细胞素包括：GM-CSF，SF，G-CSF，EPO，IL-3和GM-CSF/IL-3融合蛋白。
36.一种造血细胞糖展培养基，其特征在于包括细胞生长培养基，和有效量的如权项要求1的flt3-L多肽。
37.一种将外源基因转染入早期造血细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：
(a)在含有效量flt3-L多肽的培养基中培养早期造血细胞，并且
(b)用基因转染步骤(a)中的培养细胞。
38.一种将外的基因转染入哺乳动物的方法，其特征在于包括以下步骤：
(a)在含有效量flt3-L多肽的培养基中培养早期造血细胞；并且
(b)用基因转染(a)中的培养细胞；并且
(c)给哺乳动物注入转染的细胞。
39.一种促进哺乳动物T细胞增殖的方法，其特征在于包括给哺乳动物注入有效量如权项要求1的flt3-L多肽。
40.一种促进哺乳动物中脾脏红血球谱系的细胞增殖的方法，其特征在于包括给哺乳动物注入有效量如权利要求1的flt3-L多肽。
41.如权利要求40的一种方法，其特征在于更进一步包括注入一定有效量的EPO。
42.一种治疗具有骨髓形成综合症症状的病人的方法，其特征在于包括给病人注入一定有效量根据权利要求1的flt3-L多肽以及一个或更多由下列组中所选的生长因子：CSF-1，GM-CSF，SF，G-CSF，EPO，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，GM-CSF/IL-3融合蛋白，LIF和FGF。
43.一种治疗具有贫血症症状的病人的方法，其特征在于包括给病人注入一定有效量根据权利要求1的flt3-L多肽以及一个或更多由下列组中所选的生长因子：CSF-1，GM-CSF，SF，G-CSF，EPO，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，GM-CSF/IL-3融合蛋白，LIF和FGF。
44.一种治疗具有获得性免疫缺陷综合症症状的病人的方法，其特征在于包括给病人注入一定有效量根据权利要求1的flt3-L多肽以及一个或更多由下列组中所选的生长因子：CSF-1，GM-CSF，SF，G-CSF，EPO，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-1 3，IL-14，IL-15，GM-CSF/IL-3融合蛋白，LIF和FGF。
45.根据权利要求44的一种方法，其特征在于其中病人正接受AZT治疗。
46.一种转基因非人哺乳动物，其特征在于其所有的胚和体细胞包含有根据权利要求8的基因被转入所说的哺乳动物，或所说的哺乳动物的祖先，在胚阶段。
47.一种从悬浮细胞混合物中分离表面具有flt3受体的细胞的方法，其特征在于包括用具有flt3结合蛋白的接触表面来接触混合物中的细胞，然后分离接触表面和悬浮液。
48.根据权利要求47的一种方法，其特征在于其中的flt3结合蛋白是flt3-L。
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