HUT74831A - Ligands of flt3 - Google Patents

Ligands of flt3 Download PDF

Info

Publication number
HUT74831A
HUT74831A HU9503341A HU9503341A HUT74831A HU T74831 A HUT74831 A HU T74831A HU 9503341 A HU9503341 A HU 9503341A HU 9503341 A HU9503341 A HU 9503341A HU T74831 A HUT74831 A HU T74831A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
flt3
cells
polypeptide
cell
csf
Prior art date
Application number
HU9503341A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9503341D0 (en
Inventor
M Patricia Beckmann
Stewart D Lyman
Original Assignee
Immunex Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immunex Corp filed Critical Immunex Corp
Publication of HU9503341D0 publication Critical patent/HU9503341D0/hu
Publication of HUT74831A publication Critical patent/HUT74831A/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/30—Animal model comprising expression system for selective cell killing, e.g. toxins, enzyme dependent prodrug therapy using ganciclovir
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0381—Animal model for diseases of the hematopoietic system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)

Description

A találmány tárgyát emlős flt3-ligandumok (az flt3-jelű tirozin kináz receptorok ligandumai) képezik, továbbá ilyen ligandumokat kódoló nukleinsavak, eljárások rekombináns flt3-ligandumok előállítására, ilyen ligandumokat tartalmazó gyógyászati készítmények, valamint azok alkalmazása különböző terápiás eljárásokban.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható transzplantációs eljárásokban használható gyógyászati készítmények előállítására és különböző immunrendszeri és vérrendszeri rendellenességek génterápiás kezelésére.
A vér sejtjei hematopoetikus törzssejtektől származnak, amelyek elkötelezettekké válnak bizonyos sejtvonalakká történő differenciálódás irányában, azaz eritroid, megakariocita, granulocita, monocita és limfocita sejtekké történő differenciálódás irányában. A sejt-prekurzorok proliferációját és érését stimuláló citokineket kolóniastimuláló faktoroknak ( CSF-eknek) nevezzük. Több CSF-et T-limfociták termelnek, ilyen faktorok például az interleukin-3, a granulocita-monocita CSF (GM-CSF), a granulocita-CSF (G-CSF) és a monocita-CSF (M-CSF). Ezek a
Aktaszámunk: 82830-8771/PÁ
CFS-ek mind érett, mind törzssejtekre kifejtik hatásukat. Mindeddig nem ismert olyan faktor, amely képes lenne elsősorban a törzssejtekre hatni.
A tirozin kináz receptorok (TKR-ek) olyan növekedési faktor receptorok, amelyek számos sejt proliferációját és differenciálódását szabályozzák [Yardén Y. és Ullrich A.: Annu. Rév. Biochem. 57, 443 (1988); Cadena D.L. és Gill G.N.: FASEB J. 6, 2332 (1992)] . Egyes TKR-ek a hematopoetikus rendszeren belül működnek. Például a c-fmsreceptor az 1-es típusú kolónia-stimuláló faktoron (CSFl-en) keresztül jelet közvetítve szabályozza a monociták túlélését, növekedését és differenciálódását [ Stanley és mtsai.: J. Cell Biochem. 21, 151 (1983)] . A hatását ckit-en keresztül kifejtő Steel-f aktor (SF, amely masztocita növekedési-faktorként, törzssejt-faktorként vagy kit-ligandumként is ismert) mind a mieloid-, mind a limfoid-terekhez tartozó sejtek proliferációját stimulálja.
Az Ftl3 [ Rosnet és mtsai.: Oncogene 6, 1641 (1991)] és az Flk-2 [ Matthews és mtsai.: Cell 65, 1143 (1991)] a c-fms és c-kit receptorokhoz hasonló TKR-variánsok. Az flk-2géntermék hematopoetikus sejtekben és őssejtekben fejeződik ki, míg az f1t3-génterméket sokkal általánosabb szöveti megoszlás jellemzi. Az flt3 és flk-2 receptorproteinek hasonló aminosav-szekvenciával rendelkeznek, az extracelluláris doménban két aminosav-eltérést tartalmaznak, a Cterminushoz közel pedig egy 31 aminosavból álló szegmensben különböznek egymástól [ Lyman és mtsai.: Oncogene 8^, 815 (1993)] .
• * · · · · · • ··· «····· • · · · · ······· · · · ·
Az Fit3-ligandumokról (flt3-L) kimutatták, hogy ősés törzssejtek növekedésére és differenciálódására fejtik ki hatásukat, és felmerült azok klinikai alkalmazásának lehetősége vérképzőrendszeri rendellenességek, közelebbről aplasztikus anémia és mielodiszpláziás szindrómák kezelésében. Az flt3-L-ok alkalmazhatók lehetnek ezenkívül allogén, szingén vagy autológ csontvelőátültetéseknél sejtszámcsökkenést eredményező kezelésekben részesített betegekben, valamint azt követően a sejtek felszaporítására. Az flt-3 alkalmazható lehet továbbá génterápiában, valamint ős- és törzssejtek mobilizálására irányuló rendszerekben.
A rákokat a sejtszám-csökkenését eredményező kezelésben részesítik, ezekben ionizáló sugárzást vagy kémiai toxinokat alkalmazunk, amely elöli a gyorsan osztódó sejteket. A mellékhatások tipikusan a normális sejtekre kifejtett citotoxikus hatásból származnak, és azok korlátozhatják a sejtszám-csökkenést létrehozó terápiák alkalmazhatóságát. Gyakori mellékhatás a mieloid rendszer szuppressziója vagy azoknak a csontvelősejteknek károsodása, amelyekből fehér-, vörösvérsejtek és vérlemezkék keletkeznek. A mieloid rendszer szuppressziójának következtében a betegekben citopénia jön létre vagy csökken a vérsejtek száma, ami növeli a fertőzések és vérzési rendellenességek kialakulásának veszélyét .
A citopénia növeli a morbiditást, a mortalitást, és a rákellenes terápiában aluldozírozáshoz vezet. Számos klinikai kutató módosította a se j szám-csökker.ést eredményező terápia hatóanyagbeadási rendjét és ütemezését abból a cél4 - · * · * · • · ··· «····· « · · ♦ · · *· ··»···· · *· ·
- 4 ból, hogy növelje a rák-ellenes terápia hatóanyag-dózisát, és egyidejűleg korlátozza a csontvelő károsodását. Az egyik eljárásban csontvelő- vagy perifériás vérsejteket transzplantálnak, eszerint a sejszám-csökkenést okozó terápiát megelőzően csontvelői vagy a keringésben található hematopoetikus ős- vagy törzssejeteket távolítanak el, majd azokat a hematopoetikus funkciók helyreállítása céljából a terápiát követően visszainfundálják. Az USSN 5/199 942 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, mely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi, GM-CSF, IL3, SF, GM-CSF/IL-3 fúziós proteinek, eritropoetin (EPO) és azok kombinációjának alkalmazására szolgáló eljárást ismertet autológ transzplantációs programokban.
A nagy dózisú kemoterápiának jótékony hatása van, mivel áttétekkel rendelkező rákokban, különösen mellrákokban szenvedő betegek esetében, a szokásos dózisú terápiához képest növelheti az objektív válaszreakció gyakoriságát. Ez még egyes rossz prognózissal rendelkező betegek esetében is növelheti a tünetmentes remissziók időtartamát. A nagy dózisú kemoterápia azonban toxikus, és számos, fertőzésben, vérzési rendellenességben és más mellékhatásokban megnyilvánuló klinikai komplikáció a mieloid rendszer hosszú ideig tartó szuppressziójával függ össze.
A mielodiszpláziás szindrómák törzssejteket érintő rendellenességek, amelyek elégtelen sejtéréssel, progreszsziv páncitopéniával és az érett sejtek funkcionális rendellenességeivel jellemezhetők. Ezenkívül jellemző rájuk a különböző fokú citopénia, az elégtelen eritropoezis és • · · · · · · , · ··· ······ ♦ · · ·· ······· · ···
- 5 mileopoezis, emellett a csontvelősejtek száma normális vagy fokozott, és azok rendellenes morfológiával rendelkeznek. Bennett és mtsai. [Br. J. Haematol. 51, 189 (1982)] ezeket a rendellenességeket öt altípusra osztották, melyek a következők: refraktorikus anémia gyűrűs szideroblasztokkal, refraktorikus anémia fokozott blasztsejtszámmal, refraktorikus anémia fokozott, transzformáción átmenő blasztsejtszámmal, és krónikus mielomonocitás leukémia. Bár a fenti betegek jelentős százalékában akut leukémia fejlődik ki, a legtöbb beteg fertőzéssel vagy vérzéssel járó komplikációk következtében hal meg. A fenti tünetcsoportok kezelése retinoidokkal, D-vitaminnal és cytarabinnal nem bizonyult sikeresnek. A fenti szindrómában szenvedő betegek többsége idős korú, és nem alkalmas jelölt csontvelőtranszplantációra vagy agresszív antileukémiás kemoterápiára.
Az aplasztikus anémia egy másik olyan betegségtípus, melyet csontvelő-elégtelenség és súlyos páncitopénia jellemez. A mielodiszpláziás szindrómával ellentétben ennél a betegségnél a csontvelőben hiányoznak a sejtek vagy kevés sejt van. Jelenleg kezelésként hisztokompatibilis donorból származó csontvelőtranszplantációt vagy antithymocytaglobulinnal (ATG-vel) immunszuppresszív terápiát alkalmaznak. A mielodiszpláziás szindrómához hasonlóan, a legtöbb fenti szindrómában szenvedő beteg idős, és nem alkalmas csontvelőtranszplantációra vagy agresszív antileukémiás kemoterápiára . Ezekben a betegekben a fertőzéses vagy vérzési komplikációk következtében fellépő mortalitás rendkívül ma gas .
• ·
Az anémia előfordulása gyakori szerzett immunhiányos szindrómában (AIDS-ben) szenvedő betegekben. Az anémia rendszerint sokkal súlyosabb zidovudinnal kezelt betegekben. Számos jelentős retrovírus, antiinfektív és antineopláziás szer szuppresszálja az eritropoezist. Az EPO-ról kimutatták, hogy normalizálja a betegek hematokritját és hemoglobin-szintjét, bár ehhez rendszerint igen nagy dózisokra van szükség. Egy, az eritroid-vonal proliferációját stimuláló növekedési faktor egymagában vagy EPO-val vagy más növekedési faktorral kombinálva alkalmazható lenne ilyen betegek kezelésére és a szükséges transzfúziók számának csökkentésére. AIDS-betegek kezelésében különösen előnyös lenne egy olyan növekedési faktor alkalmazása, amely képes lenne a T-sejtek számának növelésére is.
Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást .
A találmány tárgyát képezik biológiailag aktív flt3ligandumok (flt3-L-ek), izolált vagy homogén proteinként. A találmány tárgyát képezik továbbá, flt3-L-ot kódoló izolált DNS-ek, valamint flt3-L-ot kódoló cDNS-t tartalmazó expressziós vektorok. A találmány tárgyához tartoznak flt3L-ot kódoló cDNS-t tartalmazó expressziós vektorral transzfektált vagy transzformált gazdasejtek, valamint eljárások flt3-L előállítására, melyek szerint megfelelő gazdasejteket flt3-L expresszálódása szempontjából kedvező körülmények között tenyésztünk.
Az flt3-L felhasználható allogén, szingén vagy autológ transzplantációs eljárások során alkalmazható gyógyászati • · · · · · · • · ··· ······ ♦ ♦ · · · · • · ····«·· « «··
- 7 készítmények előállítására. A gyógyászati készítmények tartalmazhatnak flt3-L-t egymagában, vagy tartalmazhatnak azon kívül egyéb növekedési faktorokat is, például interleukineket, kolónia-stimuláló faktorokat, protein tirozin kinázokat és citokineket.
A találmány tárgyát képezik eljárások flt3-L tartalmú készítmények alkalmazására génterápiában és meilodiszpláziás szindrómában, aplasztikus anémiában, HIV-fertőzében (AIDS) és rákokban, például mellrákban, limfómákban, kissejtes tüdőkarcinómában, áttétes mielómában, neuroblasztómában, akut leukémiában, heretumorokban és petefészekkarcinómában szenvedő betegek kezelésében.
A találmány tárgyát képezik továbbá flt3-L-mal immunreakcióba lépő ellenanyagok, közelebbről monoklonális ellenanyagok. A találmány tárgyát képezik ezenkívül olyan fúziós proteinek, amelyek tartalmazzák az flt3-L szolúbilis részét és egy immunglobulin-protein konstans dóménját.
A találmány tárgyához tartozik ezen felül flt3-L alkalmazása perifériás vér eredetű ős- vagy törzssejtek transzplantációjával járó eljárásokban. Tipikusan, a sejtszámcsökkenést okozó mieloszuppresszív terápiát megelőzően a betegből perifériás vér eredetű ős- vagy törzssejteket távolítunk el, majd azokat a kezelés mileoszuppresszív hatásainak ellensúlyozása céljából a sejtszámcsökkenést okozó terápiával egyidőben vagy azt követően a betegnek visszaadjuk. A találmány tárgyát képezi flt3-L hatékony mennyiségének alkalmazása az alábbi módok legalább egyike szerint: (i) az flt3-L-t az ős- vagy törzssejtek vételét megelőzően « · · · ·
- 8 adjuk a betegnek abból a célból, hogy a keringésben az ilyen sejtek számát növeljük vagy azokat mobilizáljuk; (ii) miután a betegből az ős- vagy törzssejteket összegyűjtöttük, azokhoz flt3-L-t adunk a fenti sejtek ex vivő felszaporitása céljából; (iii) az flt3-L-t az összegyűjtött ősvagy törzssejtek transzplantációját követően adjuk be a betegnek, hogy azok megtapadását elősegítsük, k találmány szerinti transzplantációs eljárásban alkalmazhatjuk továbbá egy citokin hatékony mennyiségét az flt3-L-kezelést követően vagy azzal egyidőben, az előbbivel kombinálva. Anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, alkalmazhatók a következő citokinek: IL-1-, IL-2-, IL-3-, IL-4-, IL-5-, IL-
6-, IL-7-, IL-8-, IL-9-, IL-10-, IL-11-, IL-12-, IL-13-, IL-14- vagy IL-15-interleukinek (IL-ek), a G-CSF, GM-CSF, M-CSF vagy GM-CSF/IL3-fúziót tartalmazó CSF-ek, alkalmazhatók egyéb növekedési faktorok, például CSF-1, SF, EPO, a leukémia inhibitoros faktor (LIF) vagy a fibroblaszt növekedési faktor (FGF). Az flt3-L a fentivel megegyező módon alkalmazható szingén vagy allogén transzplantációk esetében is .
A találmány tárgyához tartozik továbbá, ős- vagy törzssejtek tenyésztésére szolgáló felszaporító-tápfolyadék, amely sejttenyésztő tápfolyadékot, autológ szérumot, és egymagában vagy a fenti citokinek valamelyikével kombinálva flt3-L-t tartalmaz.
A találmány tárgyához tartozik ezen felül flt3~L alkalmazása köldökzsinórvérből származó ős- vagy törzssejtek felszaporítására. A sejtek felszaporítását végezhetjük csu• · ·
- 9 pán flt3-L alkalmazásával, vagy az flt3-L-kezelést követően vagy azzal egyidejűleg a fenti citokinek valamelyikével kombinálva.
A találmány tárgyát képezi továbbá flt3-L alkalmazása génterápiában. Az flt3-L elősegíti a korai hematopoetikus ős- vagy törzssejtek proliierációját és tenyésztését, melyeket a későbbiekben exogén DNS-sel transzformálunk, majd génterápiában alkalmazunk. Más eljárás szerint, a fenti sejteket flt3-L-t kódoló cDNS-sel transzfektálhatjuk, hogy annak géntermékét végül a célzott sejtekbe vagy szövetbe juttassuk.
A találmány tárgyához tartozik ezen felül flt3-L alkalmazása anémia kezelésében eritroid sejtek termelődésének in vivő stimulálására. A fenti alkalmazási mód szerint a betegnek, amelyben az eritroid sejtek termelődését stimulálni kívánjuk, a sejtszámcsökkenést okozó terápiával egyidőben vagy azt követően flt3-L-t adunk be. A kezelés során, azzal együtt alkalmazhatunk egyéb, a fent felsorolt citokinek közé tartozó növekedési faktorokat is. A találmány szerinti kezelésben alkalmazható előnyös citokinek a következők: EPO, IL-3, G-CSF és GM-CSF. Az ilyen kezelés különösen jól alkalmazható AIDS-betegekben, előnyösen AZT-kezelésben részesülő AIDS-betegekben.
Mivel az flt3-L stimulálja a törzssejtek termelődését, a találmány szerinti flt3-L alkalmazásával flt3-receptort hordozó egyéb, nem-hematopoetikus törzssejtekre is kifejthetünk hatást. Az flt3-L alkalmazható in vitro fertilizációs eljárásokban, és in vivő, infertilitással jáΛ · · · · ······ • · · · · · · ······· · ···
- 10 ró állapotok kezelésében. A bélben az f lt3-ligandum felhasználható besugárzás vagy kemoterápia okozta bélkárosodás kezelésére. Az flt3-L alkalmazható továbbá humán immundeficiencia vírussal (HÍV) fertőzött betegek kezelésére. Az ilyen kezelés szerint, flt3-L-t adagolunk T-sejtek és eritroid sejtek in vivő termelődésének, valamint ex vivő felszaporításának stimulálása céljából. A fenti kezelés képes megakadályozni a T-sejt-deficienciát, elsősorban a CD4pozitív T-sejtekét, és erősítheti a beteg immunválaszát a vírussal szemben, ezáltal javítja a beteg életminőségét. Az flt3-L alkalmazható hajhagymák fejlődéséhez szükséges törzssejtek stimulálására, ezáltal a hajnövekedés fokozására .
Ezenkívül az flt3-L szilárd fázisú mátrixhoz köthető, és felhasználható a sejtfelszínen flt3-t expresszáló sejtek affinitásos módszerrel történő tisztítására vagy különválasztására. A találmány tárgyát képezi tehát oldatban található sejtek elegyéből felszínükön flt3-t hordozó sejtek elválasztására szolgáló eljárás, mely eljárás szerint, az elegyben található sejteket flt3-kötő molekulákat egy flt3kötő molekulákat hordozó kontaktfelszínnel érintkeztetjük, majd a kontaktfelszínt és az oldatot egymástól elválasztjuk. Az elválasztást követően a sejteket flt3-L alkalmazásával ex vivő felszaporíthatjuk, és betegnek beadhatjuk.
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.
Egér-f1t3-L-t kódoló cDNS-t izoláltunk, amelynek szek venciáját az 1. azonosítószámú szekvencia ismerteti. Ezen * » · * ···· ··· · · · · felül humán flt3-L-t kódoló cDNS-t is izoláltunk, ennek szekvenciáját az 5. azonosítószámú szekvencia ismerteti. Az egér- és humán flt3-L-t kódoló cDNS-ek izolálása lehetővé teszi flt3-L-t kódoló cDNS-t tartalmazó expressziós vektorok; ilyen expressziós vektorokkal transzfektált vagy transzformált gazdasejtek; homogén, biológiailag aktív egér- és humán-flt3-L-proteinek; valamint az egér- és a humán-flt3-L-mal immunológiai reakcióba lépő ellenanyagok előállítását.
Az flt3-L alkalmazható az flt3-receptort expresszáló sejtek, ezen belül nem-hematopoetikus sejtek proliferációjának vagy növekedésének fokozására és stimulálására. Mivel az flt3-receptor megtalálható az agyban, méhlepényben, idegi- és hematopoetikus eredetű szövetekben, valamint előfordul a herében, petefészkekben, nyirokcsomókban, lépben, csecsemőmirigyben, és fötális májban, az flt3-L alkalmazásával a fenti szövetek károsodásával kapcsolatos számos különböző állapot kezelése lehetséges. Anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, az alábbiakban ismertetjük az flt3-L néhány közelebbi alkalmazási lehetőségét.
A leírásban flt3-L alatt polipeptidek olyan csoportját értjük, amelyek önállóan képesek ős- és törzssejteken található f1t3-receptorokhoz kötődni és azokkal komplexet képezni. Az flt3-L-megjelölés vonatkozik a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-231. aminosav-szekvenciával rendelkező vagy a 6. azonosítószámú szekvencia szerinti 1235. aminosav-szekvenciával rendelkező proteinekre, valamint olyan proteinekre, amelyek a 2. azonosítószámú szék• · • · · • · « · ·· ·· · · ···
- 12 vencia szerinti 1-231. aminosav-szekvenciával vagy a 6. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-235. aminosavszekvenciával nagy fokú hasonlóságot vagy nagy fokú azonosságot mutatnaK, ezenxivui Dioiogiai aKtivitassai renaeiKeznek és képesek flt3-receptorhoz kötődni. A kifejezés vonatkozik továbbá az 1. vagy az 5. azonosítószámú szekvencia szerinti DNS biológiailag aktív géntermékeire. Az flt3-L kifejezés ezen felül vonatkozik a membránhoz kötött proteinekre (amelyek intracelluláris régióból, membrán-régióból és extracelluláris régióból állnak), valamint olyan oldható vagy csonka proteinekre, amelyek elsősorban a protein extracelluláris doménjét tartalmazzák, megtartották, a protein biológiai aktivitását és képesek szekretálódni. Ilyen oldható proteinek például a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti 28-163., valamint a 6. azonosítószámú szekvencia szerinti 28-160. aminosav-szekvenciát tartalmazó proteinek.
Az flt3-L vonatkozásában biológiai aktív kifejezésen azt értjük, hogy az flt3-L képes flt3-hoz kötődni. Más értelmezés szerint, a biológiai aktív kifejezés arra vonatkozik, hogy az flt3-L képes a membránhoz kötött flt3-on keresztül stimuláló hatású szignál átvitelére (transzdukciójára) a sejtre.
Azt mondjuk, hogy az flt3-L izolált, amennyiben az flt3-L egyéb proteinektől vagy polipeptidektől mentes, például rekombináns gazdasejt tenyészetének tisztított terméke vagy tisztított extraktum.
A leírásban flt3-L-variánsoknak olyan polipeptideket nevezünk, amelyek lényegében homológok a natív flt3-L-lal, • · · de attól (a humán, egér vagy más emlős fajból származó flt3-L szekvenciájától) eltérő aminosav-szekvenciával rendelkeznek, mivel bennük egy vagy több deléció, inszerció vagy szubsztitúció található. A variáns aminosavszekvenciája előnyösen legalább 80 %-ban, és legelőnyösebben legalább 90 %-ban megegyezik a natív flt3-L szekvenciájával. Az százalékban kifejezett azonosságot például a GAPszámítógép-programban található szekvencia-információ felhasználásával történő összehasonlítással állapíthatjuk meg (6.0 változat) [ Devereux és mtsai.: Nucl. Acids Rés. 12, 387 (1984)], amely hozzáférhető az University of Wisconsin Genetics Computer Group-tói (UWGCG). A GAP-program Needleman és Wunsch összevetési módszerének [ J. Mól. Bioi.
48, 443 (1970)] Smith és Waterman által módosított változatát hasznosítja [ Adv. Appl. Math. 2_, 482 (1981)] . A GAPprogramban alkalmazott előnyös alapbeállítási paraméterek a következők: (1) egy egyalkotós összehasonlító mátrix a nukleotidokra, (amelyben az azonosságnak 1-es érték, az eltérésnek 0 felel meg), valamint a Gribskov és Burgess szerinti súlyozott összehasonltó mátrix [Nucl. Acids Rés. 14, 6745 (1986)], amelyet Schwartz és Dayhoff írtak le (szerk.) [ Atlas of Proteins Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation 353 (1979)] ; (2) valamennyi hézag (gap) esetében 3, 0-as büntetéspont járt (penalty érték), és további 0,10-es büntetéspont járt az egyes hézagokban található valamennyi szimbólum esetében; (3) nem járt büntetéspont a végeken található hézagokra. A variánsok tartalmazhatnak a szekvenciában konzervatív szubsztitú• · alifás ciókat, ami azt jelenti, hogy aminosav helyettesíti, ami fizikokémiai tulajdonságokkal szubsztitúció például egy egy másik alifás aminosavval, vagy Ala-aminosavak egymással konzervatív szubsztitúció egy sav helyettesítése egy másik az adott aminosavat olyan az előbbihez hasonló rendelkezik. Konzervatív aminosav helyettesítése például az Ile-, Val-, Leu-, történő helyettesítése, vagy több-pólusú (poláris) aminoilyen aminosavval, például
Lys- és Arg-, Glu- és Asp- vagy Gin- és Asn-aminosavak helyettesítése egymással. További konzervatív szubsztitúciók, mint például hasonló hidrofób sajátságokkal rendelkező tel jes régiók egymással történő helyettesítése, jól ismertek.
A találmány tárgyához tartoznak tehát a természetben elő forduló flt3-L-variánsok is. Ilyen variánsok például eltérő mRNS-összekapcsolódási (splicing) folyamatok révén keletkező, vagy az flt3-L-protein proteolitikus hasításának következében létrejövő proteinek, amennyiben azok flt3-L-ra jellemző kötődési tulajdonsága megmaradt. Az mRNS eltérő összekapcsolódásának következtében csonka, de biológiailag aktív flt3-L-proteinek jöhetnek létre, mint például a protein természetben előforduló oldható formája. Proteolízis révén keletkező variációk például az N- vagy C-terminális eltérések, amelyek különböző típusú gazdasejtben történő expresszálódás során, az flt3-L-proteinről egy vagy több terminális aminosav (általában 1-5 terminális aminosav) proteolitikus eltávolításának következtében jönnek létre.
Az autológ transzplantáció fogalmát az USSN 5 199 942 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás is• · • · · · ·
- 15 merteti, amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi. Röviden, a fogalom autológ hematopoetikus ős- vagy törzssejtek transzplantációját magába foglaló eljárásra vonatkozik, mely szerint (1) a betegből a sejtszámcsökkenést eredményező terápiát megelőzően hematopoetikus őssejteket vagy törzssejteket gyűjtünk; (2) a hematopoetikus ős- vagy törzssejteket flt3-L alkalmazásával ex vivő felszaporitjuk, hogy megnövelt sejtszámú hematopoetikus ős- vagy törzssejteket tartalmazó sejtkészitményt kapjunk; (3) a sejtkészítményt a sejtszámcsökkenést okozó terápiával egyidőben vagy azt követően a betegnek beadjuk. Ős- vagy törzssejteket nyerhetünk gyűjtött perifériás vérből vagy csontvelő explantátumokból. Kívánság szerint, a fent felsoroltak közül egy vagy több citokint kombinálhatunk az flt3-L-lel, hogy meghatározott hematopoetikus sejttípusok proliferációját segítsük elő, vagy a kapott proliferált hematopoetikus sejtpopuláció sejtfunkcióit befolyásoljuk. Az említettek közül előnyösek az SF, IL-1, IL-3, EPO, G-CSF, GMCSF, valamint a GM-CSF/IL-3 fúziók, legelőnyösebbek a GCSF, GM-CSF, valamint a GM-CSF/IL-3 fúziók. Allogén transzplantációnak olyan eljárást nevezünk, melyben csontvelőből vagy perifériás vérből származó ős- vagy törzssejteket távolítunk el emlősből, és azokat azonos fajhoz tartozó másik emlősnek adjuk be. Szingén transzplantációnak nevezzük azt, amikor a csontvelő-transzplantáció genetikailag azonos emlősök között történik.
A találmány szerinti transzplantációs eljárás kívánság szerint tartalmaz egy előzetes in vivő kezelést, mely során • · • · · · · · ·· ··«···· * ···
- 16 a betegnek flt3-L-t adunk be egymagában vagy egy toborzó növekedési faktorral kombinálva, azzal együtt vagy egymást követően, hogy a sejtek összegyűjtését megelőzően fokozott számban jussanak a perifériás vérbe hematopoetikus sejtek. Alkalmas toborzó-faktorokat tartalmaz a fenti felsorolás, előnyös toborzó-faktorok az flt3-L, az SF, az IL-1 és az IL-3 .
A találmány szerinti eljárás kívánság szerint tartalmaz egy utólagos in vivő beavatkozást, melyben a sejtkészítmény transzplantációját követően a betegnek flt3-L-t adunk be egymagában vagy egy megtapadást elősegítő növekedési faktorral kombinálva egymást követően vagy azzal egyidőben, hogy a sejtkészítményből származó beültetett hematopoetikus ős- vagy törzssejtek megtapadását elősegítsük és proliferációjukat fokozzuk. Alkalmazható, magtapadást elősegítő faktorok például a fent felsoroltak, és előnyös faktorok a GM-CSF, G-CSF, IL-3, EPO, valamint a GM-CSF/IL-3 fúziók.
A találmány tárgyához tartozik ezen felül ős- vagy törzssejtek felszaporitására alkalmas tápfolyadék, amely sejttenyésztő tápfolyadékot, autológ szérumot tartalmaz, valamint flt3-L-t tartalmaz egymagában vagy a fent felsorolt citokinek valamelyikével kombinálva. Előnyös növekedési faktorok a következők: SF, GM-CSF, IL-3, IL-1, G-CSF, EPO, valamint a GM-CSF/IL-3 fúziók.
Közelebbről, az flt3-L alkalmazható hematopoetikus és nem-hematopoetikus törzssejtek prolferációjának stimulálására. Az ilyen stimulálásnak előnyös hatása van, amikor a fenti szövetekben meghatározott szövetkárosodás jött létre.
Ilyen vonatkozásban az flt3-L felhasználható neurológiai károsodások kezelésében, és növekedési faktorként szolgálhat az idegsejtek számára. Az flt3-L feltehetően alkalmazható lesz in vitro fertilizációs eljárásokban, és valószínűleg felhasználható in vivő, infertilitással járó állapotok kezelésében. Felmerül az flt3-L alkalmazási lehetősége besugárzás vagy kemoterápia okozta bélkárosodásokban. Mivel az flt3-receptor megtalálható a hajhagymák kifejlődéséhez szükséges törzssejtekben, az flt3-L alkalmazható lehet hajnövekedés serkentésére is.
Mivel az flt3-L-ról kimutatták, hogy stimulálja mind a T-sejtek, mind az eritrociták proliierációját (lásd az alábbi példákat), az flt3-L alkalmazható lehet humán immundeficiencia vírussal (HÍV) fertőzött betegek kezelésére. Az ilyen kezelés szerint, flt3-L-t adagolunk T-sejtek és eritroid sejtek in vivő termelődésének, valamint ex vivő felszaporításának stimulálása céljából. A fenti kezelés képes továbbá megakadályozni a CD4-pozitív T-sejtek deficienciáját. Az említett kezelés erősítheti vagy fenntarthatja a beteg immunválaszát a vírussal szemben, ezáltal javítja vagy szinten tartja a beteg életminőségét. Ezen felül az ilyen in vivő kezelés képes stimulálni az eritroid vonalhoz tartozó sejteket, ezáltal növeli a beteg hematokrit- és hemoglobin-szintjét. A fenti alkalmazási módban az flt3-L alkalmazható egymagában vagy a fent felsorolt citokinekkel kombinálva, egymást követően vagy azokkal egyidőben .
- 18 Az ős- vagy törzssejtekre kifejtett specifikus hatása következtében az flt3-L felhasználható génterápiában. A génterápiában exogén DNS-sel transzfektált sejteket juttatunk transzplantációra alkalmas gazdaszervezetbe [ Lásd, Boggs: International J. Cell Cloning £, 80 (1990); Kohn és mtsai.: Cancer Invest. 7 (2), 179 (1989); Lehn: Boné Marrow Transpl. 5, 287 (1990); valamint Verma: Scientific American 68. oldal (1990)] . A technika állása szerint ismert génterápiás módszerek szerint egy génnek emlősbe történő juttatása az alábbi lépéseket tartalmazza: (a) korai hematopoetikus sejteket tenyésztünk olyan tápfolyadékban, amely flt3-L-t tartalmaz egymagában vagy a fent felsorolt citokinek valamelyikével kombinálva, egymást követően vagy együttesen; (b) az (a)-lépésből származó tenyésztett sejteket az exogén génnel transzfektáljuk; (c) a transzfektált sejteket az emlősnek beadjuk. A fenti módszeren belül új, hogy a fenti (a)- és (b)-lépések szerint ős- vagy törzssejteket transzfektálunk egy génnel. Ezen felül, a fentivel megegyező vagy ahhoz hasonló módszereket alkalmazva az flt3-L-t kódoló cDNS ilyen szállító-sejtekbe transzfektálható, hogy az flt3-L génterméket a célzott szövetbe juttassuk.
Az 1. példa egy új flt3:Fc fúziós protein előállítását ismerheti, melyet flt3-L-re történő szűrésben használtunk fel. Az 1. példában leírt humán IgGl Fc-régiót más ellenanyag Fc-régiók is helyettesíthetik. További alkalmas Fcrégick azok, amelyek nagy affinitással képesek kötődni protein-A-hoz vagy protein-G-hez, és tartalmazzák a humán IgGl • · · · · · · • · ··· ······ • · · · · * ·· ···· ··· · ···
Fc-régióját, vagy a humán- vagy egér-IgGl Fc-régiójának egy fragmentumát, például egy olyan fragmentumot, amely legalább tartalmazza a csukló-régiót (hinge-régiót), úgy, hogy a láncok közti diszulfid-kötések létre tudjanak jönni. Az flt3:Fc fúziós protein azzal az előnnyel rendelkezik, hogy könnyű tisztítani. Ezen felül két különálló fúziós proteinlánc Fc-régiói között diszulfid-kötések alakulnak ki, miáltal dimerek jönnek létre. A dimerizálódott flt3:Fcreceptort azért választottuk, mivel azzal a potenciális előnnyel rendelkezik, hogy nagyobb affinitással kötődik flt3-L-hoz, tekintettel arra a lehetőségre, hogy a keresett ligandum multimer lesz.
Amint azt a fentiekben említettük, a találmány tárgyához tartoznak oldható flt3-L-polipeptidek. Az oldható flt3L-polipeptidek a natív flt3-L extracelluláris doménjének egészét vagy annak egy részét tartalmazzák, de hiányzik belőlük a transzmembrán-régió, amely a polipeptid sejtmembránon történő retencióját okozná. Az oldható flt3-Lpolipeptidek szintetizálódásukat követően kezdetben előnyösen tartalmazzák a natív (vagy egy heterológ) szignálpeptidet, amely elősegíti szekréciójukat, de a szignálpeptid az flt3-L-nak sejtből történő szekréciója során lehasítódik. A találmány szerinti oldható flt3-L-polipeptidek megtartják azon képességüket, hogy az flt3-receptorhoz kötődnek. Valójában, az oldható flt3-L tartalmazhatja a transzmembrán-régió egy részét vagy a citoplazma-domén egy részét vagy más szekvenciákat is, amennyiben az oldható f1t3-L-protein képes szekretálódni.
«·· ·
Az oldható flt3-L úgy azonosítható (és különíthető el annak nem-oldható, membránhoz kötött megfelelőjétől), hogy a kívánt proteint expresszáló intakt sejteket - például centrifugálással - elkülönítjük a tenyésztő folyadéktól, majd a tápfolyadékot (felülúszót) a kívánt protein jelenlétére analizáljuk. A tápfolyadékban a flt3-L jelenléte azt jelenti, hogy a protein szekretálódott a sejtekből, tehát az a kívánt protein oldható formájának felel meg.
Az flt3-L oldható formái számos előnnyel rendelkeznek a natív, kötött flt3-L-proteinhez képest. A proteinek tisztítása a rekombináns gazdasejtekből könnyebb, mivel az oldható proteinek szekretálódnak a sejtekből. Ezen felül, az oldható proteinek általában alkalmasabbak intravénás adagolásra .
Oldható flt3-L-proteinek például azok, amelyek a natív flt3-L-protein extracelluláris doménjének jelentős részét tartalmazzák. Az ilyen oldható, emlős-flt3-L-proteinek tartalmazzák a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti 28-188. aminosavakat vagy a 6. azonosítószámú szekvencia szerinti 28-182. aminosavakat. A találmány tárgyához tartoznak ezen felül csonka oldható flt3-L-proteinek, amelyek a teljes extracelluláris doménnál kevesebbet tartalmaznak. Ilyen csonka oldható flt3-L-proteinek például a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti 28-163. aminosavakat vagy a 6. azonosítószámú szekvencia szerinti 28-160. aminosavakat tartalmazó proteinek. A gazdasejtben expresszálódva az oldható flt3-L kezdetben tartalmazhat egy, az alábbiakban ismertetett heterológ szignálpeptidet, amely az alkalmazott gazdasejt• · · • · ··· ····· » · · · ♦ ·
.............
ben funkcióképes. Más esetben, a protein tartalmazhatja a natív szignálpeptidet, mint például az az emlős flt3-L, amely tartalmazza a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-188. aminosavakat vagy a 6. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-182. aminosavakat. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az oldható flt3-L fúziós proteinként expresszálódott, amely tartalmazta az élesztő a-faktor szignálpeptidjét (az N-terminális végtől a C-terminális végig) , egy FLAG®-peptidet, melyet az alábbiakban ismertetünk, és melyet az 5 011 912 számú amerikai egyesült államokbeli közzétételi irat tár fel, valamint tartalmaz egy oldható f1t3-L-peptidet, amely a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti 28-188. aminosavakból áll. Ez a rekombináns fúziós protein élesztősejtekben expresszálódik és azokból szekretálódik. A FLAG®-peptid megkönnyíti a protein tisztítását, és az szarvasmarha nyálkahártya eredetű enterokinázzal az oldható flt3-L-peptidről utólag lehasítható. A találmány tárgyát képezik továbbá, oldható flt3-Lproteineket kódoló izolált DNS-szekvenciák.
Csonka f1t3-L-peptidek, ezen belül oldható polipeptidek, bármely a technika állása szerint ismert eljárással előállíthatok. Egy kívánt DNS-szekvenciát előállíthatunk kémiai szintézissel, szakember számára ismert technikák alkalmazásával. DNS-fragmentumok ugyancsak előállíthatok a teljes hosszúságú, klónozott DNS-szekvencia restrikciós endonukleázokkal végzett emésztésével, és azok agaróz-gélen elektroforézissel izolálhatok. Alkalmazhatunk restrikciós endonukleáz számára hasítási helyet (helyeket) • ·
- 22 tartalmazó linkereket, hogy a kívánt DNS-fragmentum expressziós vektorba történő inszertálását megkönnyítsük, vagy a fragmentumot emészthetjük az abban természetesen megtalálható hasítási helyeken. Egy kívánt proteinfragmentumot kódoló DNS-szekvencia amplifikálására felhasználhatjuk a jól ismert polimeráz-láncreakciós eljárást is. További lehetőség szerint, alkalmazhatunk ismert mutagenezises technikákat, hogy egy kívánt ponton, például az extracelluláris dómén utolsó aminosavának megfelelő kódontól közvetlenül 3' -irányban stop-kódont inszertáljunk a szekvenciába.
Egy további megközelítési módban, egy DNS-fragmentumról enzimatikus kezeléssel (például Bal31-exonukleázzal végzett kezeléssel) eltávolíthatjuk a terminális nukleotidokat, hogy meghatározott véggel rendelkező fragmentumot kapjunk. A kereskedelemben hozzáférhető linkerek között vannak olyanok, amelyek a Bal31-emésztés által eredményezett tompa végekkel ligálhatók, és amelyek restrikciós hasítási helyet (helyeket) tartalmaznak. Eljárhatunk úgy is, hogy olyan oligonukleotidokat szintetizálunk, amelyek egy kívánt pontig helyreállítják egy DNS-fragmentum N- vagy C-terminális végét, és azokat a DNS-fragmentummal ligáljuk. A szintetizált oligonukleotidok a kívánt kódoló szekvenciától 5' irányban tartalmazhatnak egy restrikciós hasítási helyet, és az N-terminuson egy iniciációs-kódont (ATG) illeszthetnek a kódoló szekvenciába.
Az elmondottak alapján, a találmány tárgyához tartoznak izolált vagy homogén, rekombináns és nem-rekombináns flt3f · • ··· • · · · ·· ···· ··· *·« ··· t ··«
L-polipeptidek. Előállíthatjuk a natív flt3-L-proteinek olyan variánsait és származékait, amelyek a kívánt biológiai aktivitást megtartották (például képesek flt3-hez kötődni) , úgy, hogy a natív f1t3-L-polipeptideket kódoló nukleotid-szekvenciában mutációt hozunk létre. A natív ami nosav-szekvenciát bármely, a technika állása szerint ismert módszerrel megváltoztathatjuk. Mutációkat hozhatunk létre meghatározott helyen oly módon, hogy mutációt hordozó szekvenciát tartalmazó oligonukleotidokat szintetizálunk, melyeket a natív szekvenciához történő ligálást lehetővé tevő restrikciós hasítási helyek határolnak. A ligálást követően a kapott helyreállított szekvencia olyan analógot fog kódolni, amely a kívánt aminosav-inszerciót, -szubsztitúciót vagy -deléciót tartalmazza.
Alkalmazhatunk ezen felül oligonukleotid-irányítóttá helyspecifikus mutagenezises eljárásokat is, hogy olyan módosított gént kapjunk, amelyben meghatározott kódonokat szubsztitúcióval, delécióval vagy inszercióval megváltoztattunk. A fentiekben felsorolt módosítások például a következő eljárásokkal végezhetők: Walder és mtsai.: Gene 42,
133 (1986); Bauer és mtsai.: Gene 37, (1985); Craik:
BioTechniques 12.
oldal (1985, január) ; Smith és mtsai.:
Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82, 488 (1985);
Kunkel és mtsai.: Methods in Enzymol. 154, 367 (1987);
valamint a
518 584 számú és 4 737 462 számú államokbeli közzétételi iratok, amelyek amerikai egyesült teljes terjedelmében a kitanitás részét képezik.
• · • · · · · ·
- 24 • · · • · · · · • · · · • · ···· ···
Az flt3-L más kémiai-csoportokkal, például glikozilcsoportokkal, lipidekkel, foszfátokkal, acetil-csoportokkal és hasonlókkal módosítható úgy is, hogy kovalens- vagy aggregációs-konjugátumokat képző flt3-L-származékok jöjjenek létre. Az flt3-L kovalens származékai előállíthatok úgy, hogy a kémiai-csoportokat az flt3-L aminosavoldalláncain található funkcionális csoportokhoz kapcsoljuk, vagy az flt3-L-polipeptid vagy annak extracelluláris doménja N- vagy C-terminális végéhez kapcsoljuk. A találmány tárgyához tartoznak ezen felül olyan flt3-Lszármazékok, amelyekben az flt3-L vagy annak fragmentumai más proteinekkel vagy polipeptidekkel képeznek kovalensvagy aggregációs-konjugátumokat, például rekombináns tenyészetekben N-terminális vagy C-terminális fúziós proteinekként szintetizálódva. A konjugátum az f1t3-L-polipeptid Νterminális végén tartalmazhat például szignál- vagy vezetőpolipeptid-szekvenciát (például a Saccharomyces a-faktor vezető-szekvenciát). A szignál- vagy vezető-peptid a transzlációval egyidejűleg vagy azt követően irányítja a konjugátumnak a szintézis helyéről a sejtmembránon vagy sejtfalon belülre vagy azon kívülre történő szállítását.
Az flt3-L fúziós-polipeptidek tartalmazhatnak olyan peptideket, amelyeket az flt3-L tisztításának és azonosításának megkönnyítése céljából adtunk a polipeptidhez. Ilyen peptidek például a poly-His vagy az 5 011 912 számú amerikai egyesült államokbeli közzétételi irat által feltárt, valamint Hopp és munkatársai által ismertetett antigénhatású azonosító peptidek [ Bio/Technology 6, 1204 (1988)] .
• · · · · ·
A találmány tárgyát képezik továbbá a natív mintának megfelelő glikozilezéssel rendelkező vagy azzal nem rendelkező flt3-L-polipeptidek. Az élesztő- vagy emlősrendszerekben (például C0S-7-sejtekben) expresszálódott flt3-L molekulatömegét és glikozilezési mintáját tekintve lehet hasonló a natív f1t3-L-polipeptidhez, de lehet attól lényegesen eltérő is, a választott expressziós-rendszertől függően. Az flt3-L-polipeptidnek bakteriális expressziós rendszrekben, például E. coliban történő expressziója glikozilezéstől mentes molekulákat eredményez.
A találmány tárgyához tartoznak ezen felül olyan egyenértékű DNS-konstrukciók, amelyek különböző, a biológiai aktivitás vagy kötődés szempontjából nem szükséges, aminosavvagy aminosav-szekvencia-addíciókat, aminosav- vagy aminosav-szekvencia-szubsztitúciókat vagy terminális vagy belső aminosav- vagy aminosavszekvencia-deléciókat tartalmaznak. Például az flt3-L extracelluláris doménjában található Nglikozilezési helyek úgy módosíthatók, hogy elkerüljék a glikozileződést, így emlős vagy élesztő expressziósrendszerekben csökkent szénhidrát-tartalmú analóg fog expresszálódni. Eukariota polipeptidekben az Nglikozilezési helyeket az Asn-X-Y aminosav-triplet jellemzi, ahol X prolint kivéve bármely aminosav lehet, és Y Servagy Thr-aminosavaknak felel meg. Mind az egér, mind a humán flt3-L-protein két ilyen tripletet tartalmaz, ezek a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti 127-129. és a 152-154. pozíciókban, valamint a 6. azonosítószámú szekvencia szerinti 126-128. és 150-152. pozíciókban találhatók. A fenti • · • · · « · · • · ······· · ·· tripleteket kódoló nukleotid-szekvenciában létrehozoztt megfelelő szubsztitúciók, addiciók vagy deléciók meggátolják a szénhidrát-csoportok kapcsolódását az Asn oldalláncához. Egyetlen nukleotid megváltoztatása úgy, hogy az Asn-t más aminosav helyettesítse, elegendő például egy Nglikozilezési hely inaktiválásához. Proteinekben található N-glikozilezési helyek inaktiválására szolgáló ismert eljárások például, az 5 071 972 számú amerikai egyesült államokbeli közzétételi iratban feltárt, valamint a 276 846 számú európai közzétételi iratban ismertetett eljárások, amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik.
Más eljárás szerint, a biológiai aktivitás szempontjából nem feltétlenül szükséges Cys-aminosavakat kódoló szekvenciákat úgy módosíthatjuk, hogy a Cys-aminosavak deletálását vagy más aminosavakkal történő helyettesítését idézzük elő, ami meggátolja a renaturálódás során a hibás intramolekuláris diszulfid-hidak kialakulását. További egyenértékű konstrukciók állíthatók elő szomszédos kétbázisos aminosavak módosításával, hogy olyan élesztőrendszerekben, amelyekben KEX2-proteáz aktivitás van jelen, az expressziót fokozzuk. A 212 914 számú európai közzétételi irat helyspecifikus mutagenezis alkalmazását ismerteti egy protein KEX2-proteáz hasítóhelyeinek inaktiválására. A KEX2-proteáz hasítóhelyei inaktiválhatók aminosavak olyan deléciójával, addíciójával vagy szubsztitúciójával, hogy az az Arg-Arg-, Arg-Lys- és Lys-Arg-párok módosítását eredményezze, ezáltal a fenti szomszédos bázikus aminosavak előfordulását kiküszöbölje. A Lys-Lys-párosítás lényegesen ke• · · · · • · · · · • · · · · · • · * · · · 9 · ····«·· · ··*
- 27 vésbé érzékeny a KEX2-hasításra, ezen kívül az Arg-Lysvagy a Lys-Arg-párok módosítása Lys-Lys-párra konzervatív változtatásnak minősül, és előnyös megközelítési mód a KEX2-helyek inaktiválására. Mind az egér-, mind a humánflt3-L két KEX2-proteáz támadási-helyet tartalmaz, ezek a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti 216-217. és a 217218. pozíciókban, valamint a 6. azonosítószámú szekvencia szerinti 211-212. és 212-213. pozíciókban találhatók.
A találmány tárgyát képező nukleinsav-szekvenciák közé tartoznak a találmány szerinti natív flt3-L-nukleotidszekvenciával mérsékelten vagy erősen sztringens körülmények között hibridizálódó, és biológiailag aktív flt3-L-t kódoló izolált DNS- és RNS-szekvenciák. Mérsékelten sztringens feltételek alkalmazása esetén Sambrook és mtsai. szerint [ Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, 1. kötet, 1.101-1.104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] előmosó oldatot használunk, amelynek összetétele a következő: 5xSSC, 0,5 % SDS, 1,0 mmól/1 EDTA (pH=8,0), majd körülbelül 55 'C-on, 5xSSC-pufferben, egy éjszakán át hibridizáltatunk. Erősen sztringens körülmények között a hibridizálásnál és mosásnál magasabb hőmérsékletet alkalmazunk. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a hőmérséklet és a mosófolyadék sókoncentrációja szükség szerint módosítható olyan faktoroknak megfelelően, mint például a hibridizációspróba hossza.
A genetikai kódon ismert degeneráltságának következtében, amely szerint ugyanazt az aminosavat egynél több kódon kódolhatja, egy DNS-szekvencia eltérhet az 1. és 5. azono28 sítószámú szekvenciákon bemutatott szekvenciáktól, ugyanakkor a 2. és 6. azonosítószámú szekvencia szerinti flt3-L~ proteint kódolhatja. Ilyen DNS-szekvencia-variánsokat eredményezhetnek csendes-mutációk (például PCR-amplifikáció során keletkező mutációk), vagy következményei lehetnek a natív szekvenciában létrehozott szándékos mutagenezisnek.
A találmány tárgyát képezik tehát biológiailag aktív flt3-L-t kódoló, egyenértékű izolált DNS-szekvenciák, melyek a következők lehetnek: (a) egy natív, emlős flt3-L-gén kódoló-régiójából származó DNS; (b) az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti vagy az 5. azonosítószámú szekvencia szerinti nukleotid-szekvenciát tartalmazó cDNS; (c) az (a)pont szerinti DNS-sel mérsékelten sztringes körülmények között hibridizálódni képes DNS, amennyiben biológiailag aktív flt3-L-t kódol; valamint (d) az (a)- (b) - és (c)-pontok szerinti DNS-ekből levezethető, csak a genetikai kód degeneráltsága folytán különböző DNS-ek, amennyiben biológiailag aktív flt3-L-t kódolnak. A találmány tárgyát képezik az ilyen egyenértékű DNS-ek által kódolt flt3-L-proteinek is.
Az 1. és 5. azonosítószámú szekvencia szerinti DNSszekvenciákkal egyenértékű DNS mérsékelten sztringens körülmények között hibridizálódni képes a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti 28-163. vagy a 6. azonosítószámú szekvencia szerinti 28-160. aminosavakat tartalmazó polipeptideket kódoló natív DNS-szekvenciával. Ilyen DNS-ek által kódolt flt3-L-proteinek anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk a következők: a fent ismertetett inaktivált N-glikozilezési-helyet (-helyeket), inaktivált • · • · · ·
KEX2-proteáz támadási-helyet (-helyeket) vagy konzervatív aminosav-szubsztitúciót (-szubsztitúciókat) tartalmazó f1t3-L-fragmentumok (oldható vagy membránhoz kötött) és f1t3-L-proteinek. A találmány tárgyát képezik ezen felül más emlős-fajokból származó DNS-ek által kódolt flt3-Lproteinek, amennyiben a DNS képes az 1. vagy az 5. azonosítószámú szekvencia szerinti cDNS-sel hibridizálódni.
Az flt3-receptorhoz történő kötődés előírt képességével rendelkező variánsok bármely alkalmas vizsgálati-eljárással azonosíthatók. Az flt3-L biológiai aktivitását meghatározhatjuk például az flt3-receptor ligandum-kötő doménjhoz történő kötődésért való kompetíció vizsgálata alapján (azaz, kompetitív kötődési vizsgálati-eljárással).
Az flt3-L-polipeptidek esetében alkalmazható kompetitív kötődési vizsgálati-eljárások egy típusában radioaktívan jelölt, humán flt3-L-t és sejtfelszíni flt3-receptorokat expresszáló intakt sejteket használunk. Intakt sejtek helyett alkalmazhatunk oldható flt3-receptorokat - (például flt3:Fc fúziós proteineket) - Protein-A-val, Protein-G-vel vagy a molekula flt3- vagy Fc-régiójára specifikus ellenanyaggal létrejövő kölcsönhatáson keresztül, a fúziós protein Fc-régiója által egy szilárd fázishoz kötve. Egy más típusú kompetitív kötődési vizsgálati-eljárás szerint, radioaktívan jelölt oldható flt3-receptorokat, például flt3:Fc fúziós proteineket és flt3-L-t expresszáló intakt sejteket alkalmazunk. Eljárhatunk úgy is, hogy az oldható flt3-L-t szilárd fázishoz kötjük, hogy flt3-expresszáló sejtekre pozitív módon tudjunk szelektálni.
Kompetitív kötődési vizsgálati-eljárásokat végezhetünk szokásos eljárásokkal is. Alkalmazhatunk például radioaktivan jelölt flt3-L-t egy feltételezett f1t3-L-homológgal történő kompetició vizsgálatára, hogy a homológnak felszínhez kötött flt3-receptorokkal szemben mutatott kötődési aktivitását meghatározzuk. Kvalitatív eredményeket kaphatunk kompetitív autoradiográfiás lemez-kötődési vizsgálati eljárásokkal, vagy készíthetünk Scatchard-plot-ot kvantitavív eredmények meghatározására.
Más eljárás szerint, flt3-kötő proteineket, például flt3-L-t és anti-flt3-ellenanyagokat szilárd fázishoz, például oszlopkromatográfiás töltethez vagy az identifikálásra megfelelő egyéb hasonló szubsztráthoz köthetünk, ennek alkalmazásával felszínükön az flt3-receptort expresszáló sejtek elkülöníthetők vagy tisztíthatok. Az flt3-kötő proteineknek szilárd fázisú kontaktfelszínhez történő kötését bármely eljárással elvégezhetjük, például flt3-L:Fc fúziós proteineket állíthatunk elő, és azokat Protein-A-val vagy Protein-G-vel létrejövő kölcsönhatáson keresztül a szilárd fázishoz köthetjük. A technika állása szerint proteinek szilárd fázishoz történő rögzítésére szolgáló eljárások jól ismertek, és azok bármelyike alkalmazható a találmány szerinti megoldásban. Például mágneses mikrogömböket flt3-kötő proteinekkel fedhetünk, és mágneses térbe helyezett inkubációs tartályban tarthatunk. Hematopoetikus ős- vagy törzssejtek elegyét tartalmazó sejtszuszpenziót érintkeztetünk a szilárd fázissal, amelynek felszínén flt3-kötő proteinek találhatók. Felszínükön az f1t3-receptort hordozó sejtek kötődni fognak a rögzített flt3-kötő proteinekhez, ezt követően a nem-kötődött sejtek kimoshatok. Ez az affinitásos kötődési-eljárás alkalmazható flt3-expresszáló sejtek oldatból történő tisztítására, azokra történő szűrésre vagy azok elválasztására. A szilárd fázisról a pozitív szelekcióval kiválasztott sejtek a technika állása szerint ismert módszerekkel, például enzimek alkalmazásával felszabadíthatok. Ezek az enzimek előnyösen nem toxikusak a sejtekre, nem károsítják a sejteket, és előnyösen úgy hatnak, hogy a sejtfelszínhez kötött partnert hasítják. Az flt3:flt3-Lkölcsönhatás esetében az enzim előnyösen az flt3-receptort hasítja, ezáltal a kapott sejtszuszpenziót az idegen flt3-L-től megszabadítja. A tisztított sejtpopulációt ezt követően a betegnek történő transzplantációt megelőzően ex vivő olyan mennyiségben felszaporíthatjuk, hogy az elegendő legyen a beteg hematopoetikus- és immunrendszerének helyreállítására .
A találmány egy további megvalósítási módja szerint, feltételezetten f lt3+-sejteket tartalmazó sejtelegyet először biotínezett flt3-kötő proteinnel inkubálunk. Az inkubációs idő tipikusan legalább egy óráig tart, hogy az flt3hez történő megfelelő kötődés létrejöjjön. A kapott elegyet avidinnal fedett gyönyökkel feltöltött oszlopon engedjük át, miáltal a biotin nagy affinitása az avidinhoz lehetővé teszi a sejtek kötődését a gyöngyökhöz. Avidinnel fedett gyöngyök alkalmazása a technika állása szerint ismert [ lásd, Berenson és mtsai.: J. Cell. Biochem. 10D:239, • · · · · ·
- 32 (1986)] . A nem-kötődött anyag kimosását és a kötődött sejtek felszabadítását szokásos módszerekkel végezhetjük.
A fent ismertetett eljárásokban alkalmazható flt3-kötő proteinek az flt3-L, anti-flt3-ellenanyagok, és egyéb olyan proteinek, amelyek nagy affinitással képesek flt3-hoz kötődni. Előnyös flt3-kötő protein az flt3-L.
Az elmondottak alapján, a találmány szerinti flt3-L felhasználható flt3-receptorokat expresszáló sejtek különválasztására. Egy további eljárás szerint, flt3-L-t vagy annak egy extracelluláris doménját vagy fragmentumát konjugálhatjuk egy detektálható csoporttal, például I-tel, hogy az flt3-expresszáló sejteket kimutathassuk. A I-tel történő radioaktív jelölést bármely olyan ismert eljárással végezhetjük, amely magas specifikus aktivitással jelölt,
125 funkcionális I-flt3-L-molekulákat eredményez. Alkalmazhatunk továbbá a molekula flt3-régiójával vagy Fc-régiójával szemben irányuló, jódozott vagy biotinezett ellenanyagokat. Használhatunk más detektálható csoportot, például egy kolorimetriás vagy fluorometriás reakciót katalizálni képes enzimet, biotint vagy avidint. Az flt3-receptor expressziójára nézve vizsgálandó sejtek jelölt flt3-L-lel érintkeztethetők. Inkubációt követően a nem kötődött flt3-L eltávolítható, és a kötődés a detektálható csoport felhasználásával meghatározható.
Az flt3-L (valamint annak variánsai) kötődési tulajdonságait a fent ismertetett kompetíciós vizsgálati-eljárásokhoz hasonló eljárással meghatározhatjuk a konjugált, oldható flt3-receptorok (például *25
I-flt3:Fc) alkalmazásé33 val is. Ebben az esetben azonban, flt3-receptort expresszáló intakt sejteket vagy szilárd hordozóhoz kötött oldható flt3-receptorokat alkalmazunk annak meghatározására, hogy milyen mértékben képes a feltételezett flt3-Lvariánst tartalmazó minta kompetícióba lépni az flt3-L-lel a konjugált, oldható flt3-hez történő kötődésért.
Az flt3-L vizsgálatára feléhasználható további eljárások anti-flt3-L-ellenanyagok, flt3-L hatására proliferálódó sejtvonalak vagy flt3-receptort expresszáló és flt3-L jelenlétében proliferálódó rekombináns sejtvonalak alkalmazásán alapulnak. Például a
BAF/B03-sejtvonalból hiányoznak az flt3-receptorok, és a sejtvonal IL-3-dependens [lásd,
Hatakeyama és mtsai.:
receptorgént tartalmazó expressziós vektorral transzfektált
BAF/B03-sej tek
IL-3 vagy flt3-L hatására proliferálódni kezdenek. Flt3 transzfekciójára felhasználható expressziós vektor például a pCAV/NOT-plazmid [ Mosley és mtsai.: Cell
59, 335 [ 1989)] .
Az f1t3-L-polipeptidek lehetnek oligomerek, mint például kovalensen kötött vagy nem-kovalensen kötött dimerek vagy trimerek. Az oligomerek kapcsolódhatnak különböző flt3-L-polipeptideken található ciszteinek közt létrejövő diszulfid-hidakon keresztül. A találmány egy megvalósítási módja szerint, flt3-L-dimereket úgy állítunk elő, hogy az flt3-L-t egy ellenanyag (például
IgGl) Fc-régiójával fuzionáltatjuk oly módon, hogy az az flt3-L kötődését az flt3ligandumkötő doménhoz ne gátolja. Az Fc-polipeptidet előnyösen egy oldható (csak az extracelluláris domént tártál··· · · · • · · · « · · ♦ · mazó) flt3-L C-terminális végével fuzionáltatjuk. Ellenanyag eredetű polipeptidek különböző részeivel (például az Fc-doménnal) fuzionáltatott heterológ polipeptideket tartalmazó fúziós proteinek előállítására alkalmazható általános eljárásokat ismertetnek például az alábbi szakirodalmi helyek: Ashkenazi és mtsai.: PNAS USA 88, 10535 (1991); valamint Byrn és mtsai.: Natúré 344, 677 (1990)] , melyek amely teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik. Az flt3-L: Fc fúziós proteint kódoló génfúziót megfelelő expressziós vektorba inszertáljuk. Az flt3-L:Fc fúziós proteinek az ellenanyag-molekulákhoz igen hasonló módon épülnek össze, miközben az Fc-polipeptidek között láncok közti diszulfid-kötések képződnek, divalens flt3-molekulákat eredményezve. Amennyiben a fúziós proteinek előállítása úgy történik, hogy ellenanyagnak mind a nehéz, mind a könnyű láncát felhasználjuk, olyan flt3-L-oligomert kaphatunk, amely négy flt3-L extracelluláris régióval rendelkezik. Egy másik lehetőség szerint, két oldható flt3-L-domént egy kapcsolópeptid alkalmazásával kapcsolhatunk össze.
Flt3-L-t kódoló DNS-t tartalmazó rekombináns expressziós vektorok előállíthatok a technika állása szerint jól ismert eljárásokkal. Az expressziós vektorok tartalmazzák az flt3-L DNS-szekvenciát funkcionálisan kapcsolva megfelelő transzkripciós vagy transzlációs szabályozó nukleotid-szekvenciákkal, például emlős-, mikrobiális-, vírus- vagy rovargén eredetű szekvenciákkal. Szabályozó szekvenciák például a következők: transzkripciós promóterek, operátorok, vagy enhanszerek, egy mRNS riboszómális kötő35 • · · hely, valamint megfelelő transzkripciós- és transzlációs-, iniciációs és terminációs szabályozó szekvenciák. Akkor mondjuk, hogy nukleotid-szekvenciák funkcionálisan kapcsoltak, ha a szabályozó szekvencia működése kihat az flt3-L DNS-szekvenciára. Egy promóter-szekvencia tehát funkcionálisan kapcsolt egy flt3-L DNS-szekvenciával, ha a promóter-nukleotidszekvencia szabályozza az flt3-L-t kódoló DNS-szekvencia transzkripcióját. A kívánt gazdasejtben történő replikáció képességét rendszerint egy replikációsorigó hordozza, az expressziós vektor tartalmazhat ezen kívül a transzformánsok azonosítását lehetővé tevő szelekciós-gént is.
Az expressziós vektorba beépíthetünk továbbá megfelelő szignálpeptideket kódoló szekvenciákat is, amelyek a természetben nem kapcsolódnak az flt3-L-lel. Például, szignálpeptidet (szekretoros vezető-szekvenciát) kódoló DNS-szekvenciák a leolvasási fázissal azonos fázisban fuzionáltathatók az flt3-L-szekvenciával úgy, hogy az flt3-L először a szignálpeptidet tartalmazó fúziós proteinként transzlálódjék. Az alkalmazott sejtben funkcionális szignálpeptid fokozza az flt3-L-polipeptid extracelluláris szekrécióját. A szignálpeptid az flt3-L-polipeptidről az flt3-L sejtből történő szekréciója során lehasítódhat.
Az flt3-L-polipeptidek expressziójára alkalmas gazdasejtek lehetnek prokarióta-, élesztő- vagy magasabb rendű eukariota-sejtek. Bakteriális-, gomba-, élesztő- és emlősgazdasejtekben alkalmazható klónozó- és expressziós vektorokat ismertetnek például Pouwels és mtsai.: Cloning • · • * ··· ······ • · · · · • · ···· ··· · ···
- 36 Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985). Flt3-L-polipeptidek előállítására felhasználhatók sejtmentes transzlációs rendszerek is, a találmány szerinti DNSkonstrukciókból származó RNS-ek alkalmazásával.
Prokarióták lehetnek gram-negatív vagy gram-pozitív organizmusok, például E. coli, vagy Bacillusok. Transzformációra alkalmazható prokarióta gazdasejtek például a következők: E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typimurium, valamint más különböző, Pseudomonas-, Streptomyces- és Staphylococcus-nemzetségekhez tartozó fajok. Prokarióta gazdasejtekben, például E. coliban, az flt3-L-polipeptid tartalmazhat egy, a rekombináns polipeptidnek prokarióta gazdasejtben történő expresszálódását megkönnyítő Nterminális metionint. Az N-terminális metionin az expresszálódott rekombináns f1t3-L-polipeptidről lehasadhat .
Prokarióta gazdasejtekben alkalmazható expressziós vektorok általában tartalmaznak egy vagy több, fenotípus alapján történő szelekciót lehetővé tevő szelekciós markergént. Ilyen fenotípus alapján történő szelekciót lehetővé tevő szelekciós markergén például egy antibiotikum-rezisztenciát létrehozó proteint kódoló gén vagy egy autotróf igényt kielégítő gén. Prokarióta gazdasejtekben alkalmazható expressziós vektorok lehetnek például a kereskedelemben hozzáférhető plazmidokból származó vektorok, például a pBR322 klónozó vektor (ATCC 37017) . A pBR322 ampicillin- és tetraciklin-rezisztenciáért felelős géneket tartalmaz, és alkalmazásával egyszerű a transzformált sejtek azonosítása.
• · ·
Hogy a pBR322 felhasználásával expressziós vektort állítsunk elő, egy megfelelő promótert és flt3-L DNS-szekvenciát inszertáltünk a pBR322-vektorba. A kereskedelemben hozzáférhető további vektorok például a pKK223-3-plazmid (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Svédország), valamint a pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA) .
Rekombináns prokarióta gazdasejtekben alkalmazott expressziós vektorokban gyakran felhasznált promóterszekvenciák a következők: b-laktamáz (penicillináz), laktóz promóter-rendszer [ Chang és mtsai.: Natúré 275, 615 (1978); és Goeddel és mtsai.: Natúré 281, 544 (1979)] , a triptofán (trp) promóter-rendszer [ Goeddel és mtsai.: Nucl. Acids Rés. % 4057 (1980); valamint a 36776 számú európai szabadalmi bejelentés] és a tac-promóter [Maniatis: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 412. oldal (1982)] . Egy különösen előnyös prokarióta-gazdasejt expressziós-rendszerben 1-fág PLpromótert és egy cI857ts termolabilis represszorszekvenciát alkalmaztak. Az American Type Culture Collection-tói hozzáférhető, a lPL-promótert tartalmazó plazmidvektorok például a pHUB2-plazmid, (amely az E. coli JMB9-törzsben található) (ATCC 37092), valamint a pPLc28plazmid, (amely az E. coli RRl-törzsben található) (ATCC 53082) .
Flt3-L-polipeptidek expresszálhatók továbbá élesztőgazdasejtekben, előnyösen a Saccharomyces nemzetségbe tartozó élesztősejtekben (például a S. cerevisiaeben) . Alkalmazhatók ezen kívül egyéb élesztő-nemzetségek, például
- 38 • · · · · · · ♦ ♦ ··· ······ • · · · · ·· ···· ··· « ···
Pichia, K. lactis vagy Kluyveromyces. Élesztővektorok általában tartalmaznak egy 2m-élesztőplazmidból származó replikációs-origó-szekvenciát, egy autonóm replikálódó szekvenciát (ARS), promóter régiót, poliadenilezési-szekvenciákat, transzkripciós terminációs szekvenciákat, valamint egy szelekciót lehetővé tevő markergént. Élesztővektorokban alkalmazható promóter-szekvenciák többek között a következők: a methallothionein promótere, a 3-foszfoglicerát kináz promótere [ Hitzeman és mtsai.: J. Bioi. Chem. 255, 2073 (1980)] vagy más glikolitikus enzimek promóterei [ Hess és mtsai. : J. Adv. Enzyme Reg. J_, 149 (1968); valamint Holland és mtsai.: Biochem. 17, 4900 (1978)], például az enoláz, glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz, hexokináz, piruvát dekarboxiláz, foszfofruktokináz, glükóz-6-foszfát izomeráz, 3-foszfoglicerát mutáz, piruvát kináz, triózfoszfát izomeráz, foszfoglükóz izomeráz és glükokináz promóterei. Élesztő expressziósrendszerekben alkalmazható további vektorokat és promótereket ismertetnek az alábbi szakirodalmi helyeken: Hitzeman, EPA-73 657, vagy Fleer és mtsai.: Gene 107, 285 (1991); van den Berg és mtsai.: Bio/Technology 8_, 135 (1990)] . Felhasználható ezen felül a glükóz által represszálható ADH2-promóter, amelyet Russel és munkatársai [ J. Bioi. Chem. 258, 2674 (1982)] , valamint Beier és munkatársai írtak le [Natúré 300, 724 (1982)] . Előállíthatunk mind E. coliban, mind élesztőben replikálódni képes ingázóvektorokat úgy, hogy pBR322-plazmidból az E. coliban történő szelekcióért és replikációért felelős DNS-szekvenciákat (az AmpR-gént és a replikációs-origót) a fenti élesztővektorok egyikébe inszertáljuk.
Az flt3-L-polipeptid szekréciójának irányítására felhasználhatjuk az élesztő eredetű a-faktor vezetőszekvenciát. Az a-faktor vezető-szekvenciát gyakran a promóter-szekvencia és a strukturális génszekvencia közé inszertálják [ lásd, Kurjan és mtsai.: Cell 30, 933 (1982); Bittér és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5330 (1984); 4 546 082 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, valamint a 324 274 számú európai közzétételi irat] . Szakember számára jól ismertek rekombináns polipeptidek élesztő-gazdasejtekből történő szekrécióját elősegítő további vezető-szekvenciák. A vezető-szekvencia, annak 3' -vége közelében módosítható úgy, hogy az egy vagy több restrikciós helyet tartalmazzon. Ez megkönnyíti a vezető-szekvenciának a struktúrális génnel történő fúzióját.
Élesztők transzformációjára alkalmazható eljárások szakember számára ismertek. Egy ilyen eljárást ismertetnek Hinnen és munkatársai [ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)] . A Hinnen-féle eljárás szerint, egy szelektív táptalajban Trp+-transzformánsokra szelektálunk, ahol a szelektív táptalaj összetétele a következő: 0,67 % élesztőnitrogénbázis, 0,5 % kazaminosavak, 2 % glükóz, 10 pg/ml adenin és 20 pg/ml uracil.
ADH2-promóterszekvenciát tartalmazó vektorokkal transzformált élesztő-gazdasejtek az ezpresszió indukálása céljából dúsított táptalajban tenyészthetők. Ilyen dúsított táptalaj például az alábbi összetételű táptalaj: 1 % élesz• · tőkivonat, 2 % pepton, 1 % glükóz, mely táptalajt 80 pg/ml adeninnel és 80 pg/ml uracillal egészítünk ki. Az ADH2promóter akkor derepresszálódik, amikor a glükóz elfogy a táptalajból.
Rekombináns flt3-L-polipeptidek expressziójára emlősvagy rovar-eredetű gazdasejt-tenyészetekből álló rendszereket is alkalmazhatunk. Baculovírus-rendszerek heterológ proteinek rovarsejtekben való előállítására történő alkalmazásáról közöl összefoglalót Luckow és Summers [ Bio/Technology 6, 47 (1988)] . Alkalmazhatók továbbá emlőseredetű folyamatos sejtvonalak is. Alkalmas emlősgazdasejtvonalak például a következők: majomvese-sejtekből származó COS-7-sejtvonal (ATCC CRL 1651) [ Gluzman és mtsai.: Cell 23, 175 (1981)] , L-sejtek, C127-sejtek, 3T3sejtek (ATCC CCL 163), kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek, HeLa-sejtek, BHK-sejtvonalak (ATCC CRL 10), valamint a CV-l/EBNA-l-sejtvonal, amely a McMahan és munkatársai által leírt [ EMBO J. 10, 2821 (1991)] CVI-jelű afrikai zöldmajomvesesejtvonalból (ATCC CCL 70) származik.
Emlős-gazdasejtekben alkalmazható expressziós vektorok számára transzkripciós és transzlációs szabályozószekvenciákat kivághatunk virusgenomokból. Gyakran használt promóter- és enhanszer-szekvenciák származnak a következő vírusokból: Polyoma-virusból, Adenovírus-2-ből, Simian Vírus-40-ből (SV40-vírusból), és humán citomegalovirusból. Az
SV40-vírusgenomból származó egyéb DNS-szekvenciák, például az SV40 replikációs-origója, a korai és késői promóter, enhanszer, splice-szekvenciák és poliadenilezési*·· ·· · helyek, további genetikai elemeket szolgáltathatnak egy struktúrális-génszekvencia emlős-gazdasejtben történő expressziója számára. Különösen előnyös vírus eredetű korai és késői promóterek alkalmazása, mivel vírusgenomból mindkettő könnyen előállítható olyan fragmentumként, amely egyúttal vírus eredetű replikációs-origót is tartalmazhat [ Fiers és mtsai.: Natúré 273, 113 (1978)] . Alkalmazhatók továbbá kisebb és nagyobb méretű SV40-fragmentumok, amenynyiben az SV40-vírus replikációs-origójából a HindlIIhelytől a BglI-helyig terjedő, körülbelül 250 bázispár hosszúságú szekvenciát tartalmazzák.
Emlős-gazdasejtekben alkalmazható expressziós vektorokat előállíthatunk például Okayama és Berg eljárása szerint [Mól. Cell Bioi. 3, 280 (1983)] . Emlős cDNS-ek C127-jelű egéremlő epithel-sejtekben történő stabil, magas szintű expresszióját eredményezőrendszer előállítható lényegében Cosman és munkatársai eljárása szerint [Mól. Immunoi. 23, 935 (1986)] . Egy jól alkalmazható, magas szintű expressziót eredményező, PMLSV-Nl/N4-jelű expressziós vektort írtak le Cosman és munkatársai [Natúré 312, 768 [ 1984)] , amelyet ATCC 39890 nyilvántartási szám alatt helyeztek letétbe. További jól felhasználható emlős expressziós vektorokat tárnak fel az EP-A-0367566 számú európai szabadalmi bejelentésben, valamint az USN 07/701 415 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben, (melyet 1991 május
16.-án nyújtottak be), és amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik. A vektorok származhatnak retrovírusokból is. A natív szignál-szekvenciát helyette- síthetjuk egy heterológ szignál-szekvenciával, például az IL-7 szignál-szekvenciájával (lásd, az USN 4 965 195 számú amerikai egyesült államokbeli közzétételi iratot), az IL-2receptor szignál-szekvenciájával [ Cosman és mtsai.: Natúré 312, 768 (1984)] , az IL-4 szignálpeptidjével (EP 367 566 számú európai szabadalmi leírás), az I-es típusú IL-1receptor szignálpeptidjével (USN 4 968 607 számú amerikai egyesült államokbeli közzétételi irat), valamint az Il-es típusú IL-l-receptor szignálpeptidjével (EP 460 846 számú európai szabadalmi leírás) .
A találmány szerinti izolált vagy homogén flt3-Lprotein előállítható a fent ismertetettek szerint rekombináns expressziós rendszerekben, vagy tisztítható természetben előforduló sejtekből. Az flt3-L tisztításával nagyfokú homogenitás érhető el, amint azt az SDSpoliakrilamid-gélelektroforézissel (SDS-PAGE) végzett analízisen látható egyetlen proteincsík bizonyítja.
Flt3-L-t előállíthatunk úgy, hogy flt3-L-t kódoló DNSszekvenciát tartalmazó expressziós vektorral transzformált gazdasejtet flt3-L expresszálódását elősegítő körülmények között tenyésztünk. Az flt3-L-t ezután, az alkalmazott expressziós-rendszertől függően, a tenyésztő-folyadékból vagy sejtextraktumból kinyerjük. Szakember számára ismert, hogy rekombináns proteinek tisztítására alkalmazott eljárásokat befolyásolják olyan faktorok, mint az alkalmazott gazdasejt típusa, valamint az, hogy rekombináns protein szekretálódik-e a tápfolyadékba vagy nem.
« • · · «· • · · · · _ 43 — ** *··· ··· ·
Amennyiben például a rekombináns proteint szekretáló expresszios rendszereset aisaimazunK, a tenyeszto-roiyadékot először a kereskedelemben hozzáférhető proteinkoncentrációs filter, például Amicon vagy Millipore Pellicon ultrafiitrációs-egység segítségével koncentrálhatjuk. A koncentrációs lépést követően a koncentrátumot egy ti szító mátrixra, például gélfiltrációs töltetre vihetjük fel. Alkalmazhatunk ezen felül anioncserélő töltetet, például hozzákapcsolt dietilaminoetil- (DEAE-) csoportokat tartalmazó mátrixot vagy szubsztrátot. A hordozó lehet akrilamid, agaróz, dextrán, cellulóz vagy lehet egyéb, a protein-tisztítási eljárásokban általánosan használt típus. Alkalmazhatunk továbbá kationcserélő lépést is. Alkalmas kátioncsrélők például különböző, szulfopropil- vagy karboximetil-csoportokat tartalmazó oldhatatlan hordozók. Előnyösek a szulfopropil-csoportok. Végül, az flt3-L további tisztítására alkalmazhatunk egy vagy több, reverz-fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás lépést (RP-HPLCt) , hidrofób RP-HPLC-töltet (például hozzákapcsolt metilcsoportokat vagy más alifás csoportokat tartalmazó szilikagél) felhasználásával. A felsorolt tisztítási lépesek többsége vagy mindegyike különböző kombinációkban jól ismert, és azok alkalmazásával lényegében homogén rekombináns proteint állíthatunk elő.
Alkalmazhatunk az flt3-receptor ligandum-kötő doménjét hordozó affinitásos oszlopot is az expresszálódott flt3-Lpolipeptidek affinitásos alapon történő tisztítására. Az flt3-L-polipeptidek szokásos technikákkal, például magas ·«· *44 * · • ··· ··· ··· • · · · ·· ···· ··· · ··· sókoncentrációjú elúciós-pufferrel az affinitásos-oszlopról eltávolíthatók, majd a felhasználás céljára alacsonyabb sókoncentrációjú pufferbe dializálhatók, vagy az alkalmazott affinitásos-töltettől függően a dialízis során a pH vagy más összetevők módosíthatók. Az affinitásos-oszlop flt3-L-hez kötődni képes ellenanyagot is tartalmazhat. A 6. példában a találmány szerinti flt3-L alkalmazására szolgáló eljárást ismertetünk flt3-L-lel reagáló monoklonális ellenanyagok előállítására.
Baktériumtenyészetekben előállított rekombináns proteineket általánosságban úgy izolálunk, hogy először a gazdasejteket roncsoljuk, centrifugáljuk, oldhatatlan polipeptid esetében a sejtek üledékéből, oldható polipeptidek esetében a felülúszóból extraktumot készítünk, majd egy vagy több olyan lépés következik, amely koncentrálást, kisózást, ioncserét, affinitásos alapon történő tisztítást vagy molekulaszűrő-kromatográfiát tartalmaz. Végül, a végső tisztítási lépésben RP-HPLC-t alkalmazhatunk. Mikrobiális sejtek bármely ismert módszerrel roncsolhatok, például fagyasztásolvasztás ciklusos alkalmazásával, mechanikai roncsolással vagy sejtek lizálódását eredményező szerekkel.
Tanszformált élesztő-gazdasejteket előnyösen flt3-L szekretált polipeptidként történő expresszálására alkalmazunk, hogy a tisztítást megkönnyítsük. Élesztő-gazdasejtek fermentációjából származó szekretálódott rekombináns polipeptidek Urdal és munkatársai által közölt eljárással megegyező módon tisztíthatok [ J. Chromatog. 296, 171 (1984)] . Urdal és munkatársai két egymást követő reverz- 45 4 / fázisú HPLC-lépést írnak le preparatív HPLC-oszlopon rekombináns, humán IL-2 tisztítására.
A találmány szerint előállíthatok egy célzott flt3-LmRNS-szekvenciához kötődni (és azzal duplexet képezni) vagy a kétszálú DNS-hélixen belül az flt3-L-szekvenciához egy kötődni (és azzal hármas hélixet képezni) képes egyszálú nukleinsav-szekvenciát (RNS-t vagy DNS-t) tartalmazó antiszensz vagy szensz oligonukleotidok. Az antiszensz vagy szensz oligonukleotidok a találmány szerint tartalmazzák az flt3-L-cDNS kódoló-régiójának egy fragmentumát. Ilyen fragmentumok általában legalább körülbelül 14 nukleotidot, előnyösen körülbelül 14-30 nukleotidot tartalmaznak. Adott protein esetében egy cDNS-szekvencia alapján antiszensz vagy szensz oligonukleotidok előállításának lehetőségét ismertetik például Stein és Cohen [ Cancer Rés. 4 8, 2659 (1988)] , valamint van dér Krol és munkatársai [ Bio/Techniques 6, 958 (1988)] .
Antiszensz vagy szensz oligonukleotidok kötődése cél zott nukleotid-szekvenciákhoz olyan komplexek kialakulásához vezet, amelyek gátolják a transzlációt (RNS-szinten) vagy transzkripciót (DNS-szinten), a gátlás több lehetőség valamelyike szerint jöhet létre, például a duplexek fokozott degradációja révén, a transzkripció vagy transzláció korai terminációja révén, vagy más módon. Az antiszensz oligonukleotidokat alkalmazhatjuk tehát az flt3-L-proteinek expressziójának gátlására. Antiszensz vagy szensz oligonukleotidok ezen felül módosított cukor-foszfodiészter vázzal rendelkező oligonukleotidokat (vagy más cukor• · · · · · · • · ··· ······ • · · · · · ·· ······· · ···
- 46 kötéseket, például a WO91/06629 számú nemzetközi közzétételi iratban feltártakat) tartalmaznak, amelyekben a cukorendogén cukor-kötésekkel kötések rezisztensek ilyen, rezisztens leotidok in vivő stabilak degradációnak ellenállni) , specifitást, amely képessé szekvenciákhoz történő nukleázokkal szemben. Az rendelkező oligonuk(azaz, képesek az enzimatikus de megtartják a szekvenciateszi őket célzott nukleotidAntiszensz vagy szensz kötődésre.
oligonukleotidok további példái azok az oligonukleotidok, melyek kovalensen kötődnek szerves csoportokhoz (lásd például a WO 90/104448 számú nemzetközi közzétételi iratban leírtakat), vagy egyéb, az oligonukleotid affinitását a célzott nukleotid-szekvencia vonatkozásában fokozó csoportokhoz, például poli-(L-lizinhez) . Ezen kívül szensz vagy antiszensz oligonukleotidokhoz kapcsolhatók közbeiktatott interkaláló ágensek, például ellipticin, valamint alkiláló szerek vagy fémkomplexek, hogy az antiszensz vagy szensz oligonukleotidok kötődési specifitását a célzott nukleotidszekvencia vonatkozásában módosítsuk.
Antiszensz vagy szensz oligonukleotidokat gének bejut tatására alkalmas bármely eljárással bejuttathatunk a célzott nukleinsav-szekvenciát tartalmazó sejtbe, például
CaPO4 által közvetített DNS-transzfekcióval, elektroporációval, vagy géntranszfer-vektorok, például
EpsteinBarr vírus alkalmazásával. Antiszensz vagy szensz oligonukleotidokat előnyösen úgy juttatunk a insav-szekvenciát tartalmazó sejtbe, hogy célzott nukleaz antiszensz vagy szensz oligonukleotidot egy alkalmas retrovísus• · ··· ··· ··· • * • · · · · · ·
- 47 vektorba inszertáljuk, majd a sejtet in vivő vagy ex vivő az inszertált szekvenciát tartalmazó retrovírus-vektorral érintkeztetjük. Alkalmazható retrovírus-vektorok, anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk a következők: MMuLV- és N2- (amely a M-MuLV retrovírus-származéka) egérretrovírusok, vagy a DCT5A-, DCT5B- és DCT5C-jelű kettős kópiaszámú vektorok (lásd, az USN 90/02656 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentést).
Antiszensz vagy szensz oligonukleotidokat bejuttathatunk a célzott nukleotid-szekvenciát tartalmazó sejtbe úgy is, hogy a WO 91/04753 számú nemzetközi közzétételi iratban feltártak szerint, konjugátumot hozunk létre egy ligandumkötő molekulával. Alkalmazható ligandum-kötő molekulák, anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, a következők: sejtfelszíni receptorok, növekedési faktorok, egyéb citokinek vagy egyéb, sejtfelszíni receptorokhoz kötődő ligandumok. A ligandum-kötő molekula konjugációja előnyösen nem gátolja jelentős mértékben a ligandum-kötő molekulának a megfelelő molekulához vagy receptorhoz történő kötődését, és nem gátolja az antiszensz vagy szensz oligonukleotidoknak vagy azok konjugált változatának bejutását a sejtbe.
Másképp eljárva, antiszensz vagy szensz oligonukleotidokat bejuttathatunk a célzott nukleinsav-szekvenciát tartalmazó sejtbe úgy is, hogy a WO 90/10 448 számú nemzetközi közzétételi irat szerint oligonukleotid-lipidkomplexet képzünk. A szensz vagy antiszensz oligonuk1 • · · · « · • · ······· · ···
- 48 leotid-lipid-komplex előnyösen a sejten belül egy endogén lipáz hatása által disszociálódik.
A találmány szerinti f1t3-L-polipeptidek ismert eljárások szerint gyógyászatilag alkalmazható készítményekké alakíthatók. Az flt3-L egyedüli aktív összetevőként vagy más ismert aktív összetevőkkel együtt, elegyben kombinálható gyógyászatilag elfogadható hígítóanyagokkal (például TrisHC1-, acetát-, foszfát-pufferekkel) , tartósítószerekkel, (például Thiomersallal, benzil-alkohollal, parabenekkel), emulgeátorokkal, szolubilizálókkal, adjuvánsokkal és/vagy hordozóanyagokkal. Alkalmazható hordozóanyagok és azok formulázásának ismertetése megtalálható az alábbi szakirodalmi helyen: Remington Pharmaceutical Sciences, 16. kiadás, (1980) Mack Publishing CO. Az említett készítmények tartalmazhatnak továbbá polietilén-glikollal (PEG-gel) vagy fémionokkal komplexet képző flt3-L-t, vagy az beépíthető polimer-vegyületekbe, például poliecetsavba, poliglikolsavba, hidrogélekbe, stb., vagy beépíthető liposzómákba, mikroemulziókba, micellákba, egyrétegű vagy többrétegű fallal rendelkező vezikulumokba, eritrocita-szellemalakokba (lizálódott vörösvértestekbe) vagy szferoblasztokba. A fenti készítmények befolyásolják az flt3-L fizikai állapotát, oldhatóságát, stabilitását, in vivő felszabadulásának és in vivő kiürülésének sebességét. Az flt3-L konjugálható továbbá szövetspecifikus receptorok, ligandumok vagy antigének ellen irányuló ellenanyagokkal, vagy összekapcsolható szövetspecifikus receptorok ligandumaival. Amennyiben az flt3receptor tumoros sejtek felszínén található, az flt3-L to• · · xinnal konjugálható, amelyben az flt3-L alkalmazásának célja a toxin specifikus helyre történő juttatása, vagy az említett tumoros sejtek érzékenységének fokozása az azt követően alkalmazott tumorellenes szerekkel szemben.
Flt3-L alkalmazható helyileg, parenterálisan vagy inhalációval. Parenterális kifejezés alatt szubkután (bőr alá) , intravénás, intramuszkuláris (izomba), intraciszternális injektálást vagy infúziós technikákat értünk. Ezek a készítmények tipikusan az flt3-L hatékony mennyiségét tartalmazzák egyedül, vagy bármely más aktív összetevő hatékony mennyiségével kombinálva. A dózisok és a gyógyászati készítményekben található előnyös gyógyszerkoncentrációk több faktortól függően változhatnak, így például az alkalmazás céljától, a beteg testtömegétől, korától és a beadás módjától. Hozzávetőleges dózisok meghatározhatók állatokban végzett tesztekkel; emberi adagolásra alkalmas dózisok meghatározása a technika állása szerint elfogadott eljárásokkal történhet. A fentiek figyelembe vételével, az flt3-L tipikus dózisa körülbelül 10-1000 pg/m2. Az előnyös dózistartomány körülbelül 100-300 pg/mz' .
A találmány szerinti megoldást a pontosabb értelmezhetőség céljából a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.
. példa
Flt3-receptor:Fc fúziós protein előállítása
Ebben a példában egér-flt3-cDNS klónozását, és egéreredetú oldható flt3-receptor:Fc fúziós proteint kódoló expressziós vektor előállítását ismertetjük flt3-L-t kódoló cDNS-klónok kimutatása céljára. Az flt3-cDNS-t polimeráz láncreakcióval klónoztuk egér-T-sejtekből a Lyman és munkatársai által leírt láncindító oligonukleotidok és az általuk ismertetett eljárás alkalmazásával [ Oncogene £3, 815 (1993)] , amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi. Az egér-flt3-receptor cDNS-szekvenciáját és az általa kódolt aminosav-szekvenciát Rosnet és munkatársai közölték [Oncogene 6, 1641 (1991)], amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi. Az egér-flt3-protein 542 aminosavból álló extracelluláris doménnal, 21 aminosavból álló transzmembrán-doménnal, és 437 aminosavból álló citoplazmikus doménnal rendelkezik.
Mielőtt az egér-flt3-cDNS-t a humán IgGl-molekula Főrészét kódoló cDNS N-terminális végével fuzionáltattuk, az amplifikált egér-flt3-cDNS-fragmentumot a pCAV/NOT-plazmid Asp718-NotI-helyére inszertáltuk, mely plazmidot a WO 90/05183 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés ismerteti. A humán IgGl-ellenanyag Fc-régióját tartalmazó egyszálú polipeptidet kódoló DNS-t pBLUESCRIPT-SK®-vektor Spel hasítási helyére inszertáltuk, amely vektor a kereskedelemben hozzáférhető a Stratagene Cloning Systems-től (La Jolla, Kalifornia) . Ez a plazmidvektor képes E. coliban replikálódni, és 21 egyedi restrikciós helyet tartalmazó • · · · · · · • · ·* *··. **ζ ···.
• · ······· . ®··
- 51 többszörös klónozási szegmenst hordoz. Az inszertált Fckódolószekvencia 5' -végéhez közel egy egyedi BglII hasítási helyet hoztunk létre úgy, hogy a BglII hasítási hely magába foglalja az Fc-polipeptidben a 3. és 4. aminosavakat kódoló kódont.
A kódolt Fc-polipeptid az N-terminális kapocsrégiótól a natív C-terminális végig terjed, azaz, lényegében teljes hosszúságú ellenanyag-Fc-régiót tartalmazza. Alkalmazhatók ezen kívül az Fc-régó fragmentumai is, például a Cterminális végen csonka fragmentumok. A fragmentumok előnyösen több cisztein-aminosavat tartalmaznak, (legalább a kapocsrégíóban található ciszteineket tartalmazzák), hogy két különálló flt3:Fc fúziós protein Fc-polipeptid-részei között a láncok közti diszulfidhidak létrejötte lehetségessé váljon, és ezáltal, a fent említettek szerint dimerek képződjenek.
Az flt3-kódolórégiótól 5' -irányban egy Asp718 restrikciós endonukleáz hasítási helyet építettünk be. Izoláltuk az egér-flt3-cDNS Asp718-NotI-fragmentumát, (amely a teljes extracelluláris domént, a transzmembrán-régiót és a citoplazmikus dómén egy kis részét tartalmazta). A fent leírt Asp718~NotI flt3-cDNS-részletet az Fc-cDNS-t tartalmazó pBluescript-SK®-vektorba klónoztuk úgy, hogy az flt3-cDNS az Fc-cDNS-től 5' -irányban helyezkedjen el. A kapott génfúzióból származó egyszálú DNS-t Kunkel [ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488 (1985)] , valamint Kunkel és munkatársai [ Methods in Enzymol. 154, 367 (1987)] eljárása szerint mutagenizáltűk, hogy az flt3 teljes extracelluláris
- 52 doménját tökéletesen fuzionáltassuk az Fc-szekvenciával. A mutagenizált DNS-t szekvenáltuk annak igazolása céljából, hogy a megfelelő nukleotidokat távolítottuk el, (azaz, a transzmembrán-régiót és a részleges citoplazmikus domént alkotó DNS-szekvenciákat deletáltuk), valamint hogy az flt3- és az Fc-szekvenciák azonos leolvasási fázisba esnek. Ezt követően a fúziós cDNS-t kivágtuk és az sfHAV-EO-409elnevezésű emlős expressziós vektorba inszertáltuk, amelyet Sall-Notl-enzimekkel hasítottunk, és amelyben a Sáli- és Asp718-végeket tompa végűvé alakítottuk. Az sfHAV-EOvektort (amely pDC406-néven is ismert), McMahan és munkatársai írták le [ EMBO J. l_0, 2821 (1991)] .
Az flt3:Fc fúziós proteineket előnyösen rekombináns emlős sejttenyészetben állítjuk elő. Az flt3:Fc-fúziót tartalmazó expressziós vektort CV-1-sejtekbe (ATCC CCL 70) és COS-7-sejtekbe (ATCC CRL 1651) juttattuk, mindkettő majomveséből származó sejtvonal. Az flt3:Fc expressziójának szintje mind CV-l-sejtekben, mind COS-7-sejtekben viszonylag alacsony volt. Ezért megkíséreltük az expresszálást 239-sejtekben is (transzformált elsődleges, humán embrionális vesesejtekben, ATCC CRL 1573) .
Az sfHAV-EO/flt3:Fc-vektorral transzfektált 239sejteket görgő-palackokban tenyésztettük, hogy a fúziós protein tranziens expresszióját lehetővé tegyük, amely az f1t3-szignálpeptid révén a tenyésztő tápfolyadékba szekretálódott. A fúziós proteint protein-A-Sepharoseoszlopon tisztítottuk, eluáltuk, majd a 2. és a 3. példák• · •·· ·99
- 53 bán leírtak szerint, sejtek flt3:Fc-kötő képességének vizsgálatára használtuk.
2. példa
Sejtek flt3:Fc-kötő képességének vizsgálata
Körülbelül 100 különböző elsődleges sejtet és sejtvonalat vizsgáltunk flt3:Fc-kötő képességre nézve, melyek a következő kategóriákba estek: elsődleges fötális egér agysejtek, fötális egér májsejtvonalak, fötális patkány agysejtek, humán tüdőkarcinóma (fibroblasztoid) sejtvonalak, humán és egér limfoid- és mieloid-sejtvonalak. A sejtvonalakat flt3:Fc, majd biotinezett anti-humán Fc-ellenanyag, végül streptavidin-fikoeritrin (Becton-Dickinson) jelenlétében inkubáltuk. A biotinezett ellenanyagot a Jackson Immunoresearch Laboratories-től szereztük be. A streptavidin az anti-humán Fc-ellenanyaghoz kapcsolt biotin-molekulához, az pedig az flt3:Fc fúziós protein Fcrégiójához kötődik. A fikoeritrin egy fluoreszcens fikobiliprotein, amely detektálható jelölőanyagként szolgál. A fluoreszcens jel intenzitását valamennyi sejttípus esetében FACScan áramlási citométerrel mértük (Becton Dickinson) . Az flt3:Fc-kötődésre nézve pozitívnak ítélt sejttípusokat azonosítottuk.
···· ♦ *
» · · · • · · · * • · · · ·· *··· ··· ·· ·
3. példa
Flt3-L-cDNS izolálása és klónozása egéreredetű T-sejtes cDNS-génkönyvtárból·
Az flt3-L-cDNS lehetséges forrásaként egy P7B-0,3A4jelű sejtvonalból származó, egér T-sejtes cDNSgénkönyvtárat választottunk. A P7B-0,3A4-sejtvonal egy egér T-sejtes klón, amely Thyl,2 + , CD4 , CD8 , TCRab+ és CD44+. Ezt a sejtvonalat eredetileg 0,33 sejt / mélyület sűrűségben, rHuIL-7 (rekombináns humán IL-7) , valamint immobilizált ar.ti-CD3-MAb (monoklonális-ellenanyag) jelenlétében klónoztuk, majd több, mint egy évig, hetenként végzett passzálásckkal 15 ng/ml rHuIL-7-tartalmú tápfolyadékban folyamatos tenyészetben tenyésztettük. A szülői sejtvonal inkomplett Freund-féle adjuvánsban elegyített 50 nmól PLP139_151-peptiddel és 100 pg Mycobacterium tuberculosis H37Ra-törzzsel immunizált SJL/J-egerekből nyert nyirokcsomó-sejtekből származott. A PLP a központi idegrendszer mielinhüvelyeir.ek proteolipid-protein összetevője. A peptidről, amely 139-151 aminosavból áll, korábban kimutatták, hogy experimentális autoimmun enkefalomielitiszben (agyvelőgyulladásban, EAE) - egy, SJL/J-egerekben a szklerózis multiplex modelljeként alkalmazott egér-modellben enkefalogén peptid [ Touhy V.K., Z. Lu, R.A. Sobel, R.A. Laursen és M.B. Lees: Identification of an encephalitogenic determinant of myelin proteolipid protein fór SJL mice, J. Immunoi. 142, 1523 (1989)] . Antigén jelenlétben végzett első tenyésztést követően a PLP7elnevezésű szülői sejtvonalat a klónozást megelőzően rHuIL55 • · · · · • · · · · • · · · · · ·· ······· · · · · hozzáadása mellett (és antigén nélkül) több, mint hat hónapig folyamatos sejtvonalként tartottuk fenn.
A P7B-0,3A4 csak igen magas PLP139_151-peptidkoncentráció hatására, besugárzott szingén lépsejtek jelenlétében proliferálódik, és nincs enkefalogén vagy alloreszponziv hatása (azonos faj másik egyedében nem vált ki reakciót). Ez a klón immobilizált anti-CD3-MAb, IL-2 és IL-7 hatására proliferálódik de IL-4 hatására nem.
AZ flt3:Fc-kötődés egér T-sejteken és humán T-sejteken egyaránt megfigyelhető volt; a tenyésztés egyszerűsége miatt további vizsgálatainkhoz egér T-sejtes sejtvonalat választottunk (0,3A4-sejtvonalat) . sfHAV-EO-vektorban egéreredetű 0, 3A4-sejtből származó cDNS-génkönyvtárat állítottunk elő McMahan és munkatársai eljárása szerint [ EMBO J. 10, No:10, 2821 (1991)] . Az sfHAV-EO egy emlős expressziós vektor, amely E. coliban is képes replikálódni. Az sfHAVEO-vektor SV40-, Epstein-Barr-vírus- és pBR322-eredetű replikációs origókat tartalmaz, és a HAV-EO származéka, amelyet Dower és munkatársai írtak le [ J. Immunoi. 142, 4314 (1989)] . Az sfHAV-EO-vektor abban tér el a HAV-EOvektortól, hogy az előbbiben a EAV-EO-vektor által hordozott három részből álló, adenovírus-2 vezető-szekvenciában található intron deletálódott. Röviden, egér T-sejtes cDNSt Haymerle és munkatársai által leírt adapter-eljáráshoz hasonló eljárással [Nucl. Acids Rés. 14, 8615 (1986)] sfHAV-EO-vektor Sall-helyére klónoztunk; a következő oligonukleotid-adapterpárt alkalmaztuk:
♦ · · · · • · · · ·
4· ···»··· · ·»·
5' -TCGACTGGAACGAGACGACCTGCT-3' (3. azonosítószámú szekvencia) ,
3' -GACCTTGCTCTGCTGGAGGA-5 (4. azonosítószámú szekvencia).
0,3A4-eredetű poli(A)+RNS alapján kétszálú, tompa végű, véletlenszerű láncindítással szintetizált ( random-primed ) cDNS-t állítottunk elő lényegében Gubler és Hoffman eljárása szerint [ Gene 25, 263 (1983)], egy Pharmacia DNSreagenskészlet felhasználásával. A cDNS-hez Haymerle és munkatársai utasítási szerint, hozzáadtuk a fenti adaptereket. Az alacsony molekulatömegű nukleinsavakat SephacrylS-1000-oszlopon, 65 °C-on végzett passzálással távolítottuk el, majd a cDNS-t sfHAV-EO410-vektorral ligáltuk, amelyet előzőleg Sall-enzimmel hasítottunk, és a fentivel megegyező oligonukleotidpárral ligáltunk. Ezt a vektort sfHAVEO410-vektornak neveztük. A DNS-t elektroporációs eljárással [ Dower és mtsai.: Nucleic Acids Rés. 16, 6127 (1988)] E. coli DHlOB-törzsbe juttattuk, és egy órán át, 37 °C-on végzett tenyésztést követően a transzformánsokat 1 ml-es térfogatú mintákra szétosztva, 20 % glicerint tartalmazó SOC-táptalajban lefagyasztottuk [Hanahan és mtsai.: J. Mól. Bioi. 166, 557 (1983)] . Egy mintát az ampicillin-rezisztens kolóniák számának meghatározása céljából megtitráltunk. Eszerint, a kapott 0, 3A4-génkönyvtár 1,84 millió kiónt tartalmazott .
Az sfHAV-EO410-vektroban található cDNS-génkönyvtárral transzfektált E. coli DHlOB-sejteket kioltottuk, így lemezenként körülbelül 1600 telepet kaptunk. A telepeket mindegyik lemezről lekapartuk, összegyűjtöttük, és az egyes • · · • · · · • · · · · összegyűjtött mintákból plazmid-DNS-t állítottunk elő. Ezt követően a DNS-eleggyel, amely körülbelül 1600 telepből származó DNS-t képviselt, még nem összefüggő rétegben növő CV-1/EBNA-l-sejteket transzfektáltünk kloroquine-kezelést követően DEAE-dextrán alkalmazásával, a Luthman és munkatársai [ Nucl. Acids Rés. 11, 1295 (1983)] , valamint
McCutchan és munkatársai [ J. Natl. Cancer Inst. 41, 351 (1986)] által leírtakhoz hasonló eljárással. A CV-l/EBNA-1sejtvonal (ATCC CRL 10478) folyamatosan expresszál EBVnukleáris-antigén-l-et, melynek expresszálódását a CMV közvetlen-korai enhanszer/promóter-szekvenciája irányítja. A CV-1/EBNA-1-sejtvonal a CVl-jelű, afrikai zöldmajom vesesejtvonalból (ATCC CCL 70) származik, és azt McMahan és munkatársai írták le [ EMBO J. 10, 2821 (1991)] .
A CV-1/EBNA-sejtek cDNS-génkönyvtárral történő transzfektálása céljából a sejteket komplett tápfolyadékban tartottuk fenn [10 térf-% fötális borjúszérumot (FCS-t), 50 egység/ml penicillint, 50 egység/ml streptomycint és 2 mmól/1 L-glutamint tartalmazó Dulbecco-féle módosított Eagle-tápfolyadékban (DMEM)] , majd azokat egy-mélyületű kamrás lemezekre (Lab-Tek), körülbelül 2xl05 /mélyület sűrűségben kioltottuk. A lemezeket előzőleg 30 percig, 1 ml humán-fibronektinnel kezeltük (PBS-ben, 10 pg/ml), majd PBS-sel egyszer mostuk. A letapadt sejtrétegről a tápfolyadékot eltávolítottuk, és azt 1,5 ml, 66,6 pmól/l kloroquine-szulfátot tartalmazó komplett tápfolyadékkal helyettesítettük. A sejtekhez ezután 0,2 ml DNS-oldatot adtunk (2 pg DNS és 0,5 mg/ml DEAE-dextrán kloroquin-tartalmú komplett tápfolyadékban), majd a sejteket 5 óráig inkubáltuk. Az inkubációt követően a tápfolyadékot eltávolitottuk, és a sejteket 2,5-20 percig, 10 % DMSO-tartalmú komplett tápfolyadék hozáadásával sokkoltuk, majd az oldatot friss komplett tápfolyadékra cseréltük. A sejteket 2-3 napig tenyésztettük, hogy az inszertálódott szekvencia tranziens expresszálódását lehetővé tegyük.
CV-l/EBNA-l-sejtekből álló transzfektált egyrétegű tenyészeteket vizsgáltunk lemez-autoradiográfiás eljárással flt3-L expresszióra nézve, lényegében a Gearung és munkatársai által leírt eljárás alkalmazásával [ EMBO J. 8^, 3667 (1989)] . Transzfektált CV-l/EBNA-l-sejteket (a vájatot tartalmazó lemezekhez tapadt sejteket) zsírtalan szárított tejporral kiegészített, kötődést elősegítő tápfolyadékkal [ BM-NFDM: 25 mg/ml szarvasmarha szérumalbumint (BSA-t) , 2 mg/ml nátrium-azidot, 20 mmól/l HEPES-puffért (pH=7,2) és 50 mg/ml zsírtalan szárított tejport tartalmazó RPMI-1640 tápfolyadékkal) egyszer mostunk. Ezt követően a sejteket 1 órán át, szobahőmérsékleten, BM-NFDM-tápfolyadékban, flt3:Fc fúziós protein jelenlétében (1 pg/ml) inkubáltuk. Az inkubációt követően a nem kötődött flt3:Fc fúziós protein eltávolítása céljából az egyrétegű sejttenyészetet BMNFDM- tápfolyadékkal háromszor mostuk, majd 1 órán át, szobahőmérsékleten, 40 ng/ml (1:50 arányban hígított) 12’Ijelölt, egérben termelt anci-humán Fc-ellenanyaggal inkubáltuk (lásd az alábbiakban). A sejteket BM-NFDMtápf olyadékkal háromszor, majd foszfát-pufferes fiziológiás sóoldattal (PBS-sel) kétszer mostuk, hogy a nem-kötődött 125I-jelölt, egérben termelt anti-humán Fc-ellenanyagot eltávolítsuk. A sejteket 30 percig, szobahőmérsékleten, PBSben (pH=7,3) oldott 2,5 % glutáraldehidben végzett inkubálással fixáltuk, PBS-sel kétszer mostuk, és levegőn szárítottuk. A sejteket tartalmazó, vájatot tartalmazó lemezeket egy éjszakán át Phosphorimager-en tartottuk (Molecular Dinamics), majd Kodak-GTNB-2-fotoemulzióba mártottuk (6-szoros hígítás vízben), végül 3-5 napig, 4 °Con, a fényt teljesen kizáró dobozban sötétben exponáltuk. Ezután a lemezeket körülbelül 4 percig Kodak-D19előhívóban (40 g/500 ml víz) előhívtuk, vízben öblítettük, majd Agfa-G433C-fixálóval fixáltuk. A lemezeket 25-40szeres nagyítás alkalmazásával mikroszkóppal egyenként megvizsgáltuk, az flt3-L-t expresszáló pozitív sejteket a világos háttérrel szemben megfigyelhető autoradiográfiás ezüstszemcsék jelenléte alapján azonosítottuk.
Az egér-eredetű anti-humán Fc-ellenanyagot Jackson Laboratoriestől szereztük be. Ez az ellenanyag minimális mértékben kötődött az Fcg-receptorhoz kötődő Fcproteinekhez. Az ellenanyagot Chloramine-T-eljárással jelöltük. Röviden, Sephadex-G-25-oszlopot készítettünk a gyártó utasításai szerint. Az oszlopot 10-szeres térfogatú, 1 % szarvasmarha-szérumalbumint tartalmazó PBS-sel előkezeltük, hogy az ellenanyag nem-specifikus adszorbcióját az oszlophoz és töltethez csökkentsük. A nem-kötődött szarvasmarha-szérumalbumint ezt követően 5-szörös térfogatú, szarvasmarha-szérumalbumint nem tartalmazó PBS-sel az oszlopról kimostuk. Egy mikrocentrifugacsőben 50 pl, 50 mmól/1 kon- 60 centrációjú nátrium-foszfát pufferhez (pH=7,2) 10 pg ellenanyagot adtunk (10 pl PBS-ben oldva), ehhez 2,0 mCi hordozó-mentes Na125I-ot adtunk, majd az oldatot jól összekevertük. Ehhez 15 pl frissen készített kloramin-T-oldatot adunk (2 mg/ml kloramin-T 0,1 mól/1 nátrium-foszfát pufferben, pH=7,2), és az elegyet 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd azonnal Sephadex-G-25-oszlopra vittük fel. Ezt követően a radioaktívan jelölt ellenanyagot az oszlopról eluáltuk, az eluátumból 100-150 pl térfogatú frakciókat gyűjtöttünk. A radioaktívan jelölt ellenanyagot tartalmazó eluált frakciókhoz 1 % végkoncentrációban szarvasmarha-szérumalbumint adtunk. A radioaktív jóddal történő jelölés 5-10xl015 cpm/nmól protein specifikus-aktivitást eredményezett.
A lemez-autoradiográfiás eljárás alkalmazásával körülbelül 1 840 000 cDNS-t vizsgáltunk át körülbelül 1 600 cDNS-t tartalmazó csoportokban, míg az egyik transzfektáns csoport vizsgálata több, flt3:Fc-kötődésre nézve egyértelműen pozitív sejt jelenlétét igazolta. Ezt a csoportot ezután 500 cDNS-t tartalmazó csoportokra osztottuk, és ismételten lemez-autoradiográfiás eljárás alkalmazásával átvizsgáltuk - a vizsgálattal egy pozitív csoportot azonosítottunk. Ezt a csoportot 100-as csoportokra osztottuk, és újból átvizsgáltuk. Az előbbi, 100 cDNS-t tartalmazó csoportból származó egyes kolóniákat addig vizsgáltuk, amíg olyan kiónt azonosítottunk (a #6C kiónt), amelyben detektálható flt3:Fc-kötő aktivitással rendelkező felszíni61 protein szintetizálódott. Ezt a kiónt izoláltuk, és az abban található 0,88 kb-os inszertet szekvenáltűk.
A #6C-klónban található egér-flt3-ligandum-cDNS kódolószekvenciájának nukleotid-szekvenciáját és az általa kódolt aminosav-szekvenciát az 1. és 2. azonosítószámú szekvenciák mutatják. A cDNS-inszert 0,88 kb hosszúságú. A fenti szekvenciában található nyitott olvasási fázis 231 aminosavból álló proteint képes kódolni. A 231 aminosavból álló nyitott olvasási fázis DNS-szekvenciáját és az általa kódolt aminosav-szekvenciát tehát az 1. és 2. azonosítószámú szekvenciák tartalmazzák. A 2. azonosítószámú szekvencia szerinti protein egy I. típusú transzmembránprotein, amely tartalmaz egy N-terminális szignálpeptidet (1-27. aminosavak), egy extracelluláris domént (28-188. aminosavak), egy transzmembrán-domént (189-211. aminosavak) és egy citoplazmikus domént (212-231. aminosavak). A natív protein számított molekulatömege a szignálszekvencia lehasítását követően 23 164 dalton. Az érett protein becsült pl-értéke 9,372. A kódoló régiót 56 bázispárból álló 5' -végi nem-kódoló szekvencia, és 126 bázispárból álló 3' -végi nem-kódoló szekvencia határolja, amelyben benne foglaltatnak a hozzákapcsolt cDNS-adapterek is. A fent ismertetett klónozási eljárás során kaptunk egy másik egér-flt3-ligandumot kódoló kiónt is, az #5H-klónt, amely az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti 49. nukleotiddal kezdődően és az 545. nukleotidig terjedően (amely megfelel a 163. aminosavnak) megegyezik a #6Cklónnal . Ettől a ponttól kezdve az #5H-klón teljesen külön• · « · · · · · ·· ··«··»· r ··· bözik az előzőtől, és egy eltérő összekapcsolódási ( spl icing-) konstrukciót képvisel.
Az flt3-L-cDNS-t E. coli DHlOB-sejtekben tartalmazó sfHAV-EO410-vektort 1993 április 20.-án helyeztük letétbe az American Type Culture Collection (ATCC) intézetében (Rockville, MD, USA), ahol az az ATCC 69286 nyilvántartási számon szerepel. A letétbe helyezés a Budapesti Szerződéssel összhangban történt.
4. példa
Humán flt3-L-t kódoló cDNS klónozása
Humán flt3-L-t kódoló cDNS-t humán 22T-sejtes kiónból származó, véletlenszerű láncindítással ( random-priming eljárással) lgtlO-ben előállított cDNS-génkönyvtárból klónoztunk Sims és munkatársai eljárása szerint [ PNAS 86, 8946 (1989)] . A génkönyvtárat egy 413 bázispárból álló, az egér-flt3-L extracelluláris doménjának, (az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti 103-516. nukleotidoknak) megfelelő Plel-fragmentummal átvizsgáltuk. A fragmentumot véletlenszerű láncindításos technikával jelöltük, majd egy éjszakán át, 55 °C-on a génkönyvtárat tartalmazó filterekkel oligonukleotid-előhibridizációs pufferben hibridizáltattuk.
A fragmentumokat ezután 55 °C-on, 1 órán át,
2xSSC/ 0,1 % SDS tartalmú pufferben, majd 1 órán át
lxSSC/ 0,1 % SDS tartalmú pufferben, végül 1 órán át
0,5xSSC/ 0,1 % SDS tartalmú pufferben mostuk. A pozitív
fágplakkokból DNS-t extraháltunk, és az inszertált DNS-eket
PCR-eljárással, a fágkarokra specifikus oligonukleotidok • · · · · • · · ·« • ······ · · ♦ · alkalmazásával amplifikáltuk. Ezt követően a DNS-eket szekvenáltuk - a #9-számú klón szekvenciáját az 5. azonosítószámú szekvencia mutatja. Ugyanabból a fent ismertetett, véletlenszerű láncindítással (random priming eljárással) lgtlO-ben előállított cDNS-génkönyvtárból további humán flt3-L-cDNS-t izoláltunk úgy, hogy a génkönyvtárat az #5H-jelű egér-klónban található cDNS extracelluláris doménjának egy fragmentumával vizsgáltuk át, amely fragmentum lényegében megfelelt az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti 128-541. nukleotidoknak.
A #9-számú kiónban található, 988 bázispárból álló cDNS szekvenálása 705 bázispárból álló nyitott olvasási fázist tárt fel, amelyet 29 bázispárból álló 5' -végi nem-kódoló szekvencia és 250 bázispárból álló 3' -végi nem-kódoló szekvencia határolt. A 3' -végi nem-kódoló régió nem tartalmazott poli-A-végződést. A kezdő metionin-kódontól 5' irányban nem voltak a leolvasási fázisba eső stop-kódonok. A nyitott olvasási fázis egy I-es típusú, 235 aminosavból álló transzmembrán-proteint kódol, amelyet a 6. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-235. aminosavak szemléltetnek. A protein 26-27 aminosavból álló N-terminális szignálpeptiddel rendelkezik. Kissé nagyobb a valószínűsége annak, hogy az N-termináis szignálpeptid 26 aminosavból épül fel, mint annak, hogy 27 aminosavból épül fel. A szignálpeptidet követi a 156 vagy 155 aminosavból álló extracelluláris dómén (a 26 és 27 aminosavat tartalmazó szignálpeptideknek megfelelően); egy 23 aminosavból álló transzmebrán-domén, és egy 30 aminosavból álló citoplaz• · · · · » mikus dómén. A humán flt3-L összességében 72 %-os aminosavegyezést és 78 %-os aminosav-hasonlóságot mutat az egér flt3-L-proteinnel. A #9-számú kiónból származó humán flt3L-cDNS-t tartalmazó pBLUESCRIPT-SK(-) -vektort 1993 augusztus 6.-án helyeztük letétbe az American Type Culture Collection (ATCC) intézetében (Rockville, Maryland, USA) , ahol az az ATCC 69382 nyilvántartási számon szerepel. A letétbe helyezés a Budapesti Szerződéssel összhangban történt .
5. példa
Flt3-L expressziója élesztőben
Oldható flt3-L expressziója élesztőben úgy történt, hogy szintetikus láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, PCR-eljárással [ Methods in Enzymol. 155, 335 (1987)] a szignálpeptid vége és a transzmembrán-szegmens eleje közti teljes extracelluláris flt3-L-kódoló-domént amplifikáltuk. Az 5' -végi láncindító oligonukleotid (5' -AATTGGTACCTTTGGATAAAAGAGACTACAAGGACGACGATGACAAGACACCTGACTGTTACTTCAGCCAC3' ; 7. azonosítószámú szekvencia) az alfa-faktor vezetőszekvenciáját és egy antigén-hatású oktapeptidet, a FLAGszekvenciát kódolta a nyitott olvasási fázisba illeszkedve az flt3-L előre megjósolt érett N-terminális végével fuzionáltatva. A 3' -végi láncindító oligonukleotid (5' -ATATGGATCCCTACTGCCTGGGCCGAGGCTCTGGGAG-3' ; 8. azonosítószámú szekvencia) a Gln-189-et követően, közvetlenül a feltételezett transzmembrán-régiónál egy terminációs kódont hozott létre. A PCR-eljárással előállított DNS-fragmenst (K.
lactisban' történő expresszió céljából) egy olyan élesztő expressziós vektorba ligáltuk, amely a rekombináns terméknek élesztő-tápfolyadékba való szekretálódását irányítja (Fleer és mtsai.: Gene 107, 285 (1991); valamint van dér Berg és mtsai.: Bio/Technology 8_, 135 (1990)] . A FLAG:flt3L fúziós proteint az élesztő-tenyésztőfolyadékból affinitásos-kromatográfiás eljárással, a korábbiakban leírtak szerint tisztítottuk [Hopp és mtsai.: Biotechnology 6, 1204 (1988)] .
6. példa
Flt3-L-polipeptiddel szemben előállított monoklonális ellenanyagok
Ebben a példában flt3-L-polipeptiddel reagáló monoklonális ellenanyagok előállítására szolgáló eljárást ismertetünk. Flt3-L-t emlős gazdasejtben, például COS-7vagy CV-1/EBNA-l-sejtekben expresszáltattunk, és flt3:Fc affinitásos-kromatográfiával tisztítottunk. Flt3-Lpolipeptiddel reagáló monoklonális ellenanyagok ismert technikákkal történő előállítására alkalmazható tisztított flt3-L, annak fragmentuma, szintetikus peptidek vagy flt3L-t expresszáló sejtek (lásd például az USSN 4 411 993 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett technikákat). Röviden, egereket immunizáltunk immunogénként Flt3-L alkalmazásával, amelyet komplett Freund-féle adjuvánsban emulgeáltunk, és 10-100 pg mennyiségekben szubkután (bőr alá) vagy intraperitoneálisan (hasüregbe) injektáltunk. 10-20 nappal később az immunizált
állatokat inkomplett Freund-féle adjuvánsban emulgeált további flt3-L beadásával emlékeztető oltásban részesítettük. Ezt követően az egereket hetes - két hetes időszakonként emlékeztető oltásban részesítettük. Retroorbitális (szemüreg mögötti vénákból történő) vérvétellel vagy farokvég bemetszésével időről időre szérummintákat vettünk, és azokat dot-blot vizsgálati-eljárással, ELISAeljárással (enzimhez kötött immunszorbens vizsgálatieljárással) vagy flt3-kötődésgátlási vizsgálati-eljárással flt3-L-ellenanyagokra nézve teszteltük.
Megfelelő ellenanyag-titer kimutatását követően a pozitívnak ítélt állatokat egy utolsó intravénás flt3-Linjektálásban részesítettük, fiziológiás sóoldatban. Háromnégy nappal később az állatokat leöltük, lépsejteket gyűjtöttünk, és a lépsejteket egérmileóma-sejtvonallal, például NS1- vagy előnyösen P3x63Ag8.653-sejtvonallal (ATCC CRL 1580) fuzionáltattuk. A fúzió eredményeképp hibridómasejtek jöttek létre, amelyeket több mikrotitráló lemezre, HAT (Hipoxantin, aminopterin és timidin tartalmú) szelektív táptalajba oltottunk, hogy a nem-fuzionált sejtek, mielóma-hibridek és lépsejt-hibridek proliierációját meggátoljuk.
A hibridómasejteket Engvall és munkatársai által leírt technikák alkalmazásával [ Immunochem. 8, 871 (1971); valamint USSN 4 703 004 szabadalmi leírás] , flt3-L-polipeptiddel számú amerikai
ÉLISA-eljárással szemben mutatott egyesült államokbeli szűrtük tisztított reaktivitásra. Egy előnyös szűrési technika az ellenanyag-befogó (antibody • · · · · · · • « ··« ····· • · · · • ······· · · · capture) technika, amleyet Beckman és munkatársai közöltek [ J. Immunoi. 144, 4212 (1990)] . Pozitív hibridómasejteket injektálhatunk intraperitoneálisan szingén (genetikailag azonos egyedektől származó)
BALB/c-egerekbe, hogy magas koncentrációban anti-flt3-L monoklonális ellenanyagokat (aszciteszt) kapjunk. Más eljárás szerint, hibridómasejteket tenyészthetünk különböző technikákkal in vitro, palackokban vagy görgő palackokban.
Egér-aszciteszben előállított monoklonális ellenanyagok tisztíthatók ammónium-szulfát-precipitációs eljárással, majd molekulaszűrő kromatográfiával. Alkalmazhatunk továbbá az ellenanyagoknak protein-A-hoz vagy protein-G-hez történő kötődésén alapuló affinitásos-kromatográfiát, valamint flt3-L-hez történő kötődésén alapuló kromatográfiát is.
7. példa
Flt3~L alkalmazása önmagában vagy IL-7-tel vagy IL-3-mal történő kombinációban
Ebben a példában AA4.1+ fötális májsejtek stimulálását és proliierációját ismertetjük olyan készítmények alkalmazásával, amelyek flt3-L-t , valamint IL-7-et tartalmaznak; ezen felül c-kit-pozitív-sejtek (c-ki t+-se j tek) stimulálását és proliierációját ismertetjük flt3-L-t és IL-3-at tartalmazó készítmények alkalmazásával.
AA4.1-pozitív (AA4.1+), AA4.1-ellenanyagot expresszáló sejteket izoláltunk 14 napos fötális C57BL/6-egerek májából úgy, hogy a sejteket 100 mm-es Optilux műanyag Petricsészékben (Falcon, No. 1001, Oxnard, CA) kimostuk (panning ) . Szövettenyésztő lemezeket fedtük egy éjszakán át, 4 °C-on, 10 pg/ml AA4.1-ellenanyagot tartalmazó, 0,1 % fötális borjúszérummal· (FBS-sel) kiegészített PBS-sel [ McKearn és mtsai. : J. Immunoi. 132, 332 (1984)] , majd a lemezeket a felhasználás előtt 1 % FBS-t tartalmazó PBS-sel alaposan mostuk. A lemezek mélyúleteihez különálló májsejteket tartalmazó szuszpenziót adtunk 107 sejt/mélyület sűrűségben, 1 % FBS-sel kiegészített PBS-ben., majd a sejteket 2 órán át, 4 °C-on hagytuk a lemezekhez kitapadni. Ezt követően a lemezeket alaposan mostuk, és a letapadt sejteket az alábbiakban ismertetett hematopoezis vizsgálati-eljárásokban történő analízis vagy további felhasználás céljára lekaparással összegyűjtöttük. AA4.1-ellenanyagokkal végzett FACS-vizsgálati-eljárás szerint az AA4.1 sejtpopuláció aránya több volt, mint 95 %.
C-kit+ pluripotens törzssejteket tisztítottunk felnőtt egerek csontvelejéből [de Vries és mtsai.: J. Exp. Med. 176, 1503 (1992); valamint Visser és de Vries: Methods in Cell Bioi. (1993) (benyújtva)] . A búzacsiraagglutininlektinre pozitív és a B220-, valamint 15-1.4.1-jelű monoklonális ellenanyagok [Visser és mtsai.: Meth. in Cell Bioi. 3_3, 451 (1990)] által felismert antigénekre negatív alacsony denzitású (<=1,078 g/cm ) sejtek biotinezett Steel-faktor alkalmazásával c-kit-et expresszáló vagy nem expresszáló alpopulációkra voltak oszthatók. A c-kit+frakcióról kimutatták, hogy az pluripotens hematopoetikus törzssejteket tartalmaz [de Vries és mtsai.: Science 255,
9β9 (1992); de vnes: Metnods in cell Blol. (1993) (benyújtva); valamint Ware és mtsai.: (1993) (benyújtva)] .
AA4 . V fötális májsejteket 100 ng/ml rekombináns IL-7 jelenlétében (USSN 4 965 195 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) és 250 ng/ml rekombináns flt3-L jelenlétében tenyésztettünk. Az flt3-L-t három különböző formában alkalmaztuk a kísérletekben, melyek a következő voltak: (1) abban a formában, ahogy azok fixált, flt3-L-transzfektált CV1/EBNA-sejteken jelen vannak; (2) az előbbi, flt3-L-transzfektált CV1/EBNA-sejtek tenyésztőfolyadékának koncentrált felülúszójában található formában; (c) az 5. példában leírtak szerint élesztő-felülúszóból előállított tisztított és izolált polipeptidkészítményként.
Hematopoezis-vizsgálati-elj árások
C-ki t+-törzssejtek és AA4.1+ fötális májsejtek proliferációját vizsgáltuk [ 3H] -timidin-beépülési vizsgálati-eljárással, lényegében de Vries és munkatársai által közölt eljárás szerint [de Vries és mtsai.: J. Exp. Med. 173, 1205 (1991)] . Tisztított c-ki t+-törzssejteket tenyésztettünk 96 órán át, 37 °C-on, levegőben 6,5% CO2-t és 7 % O2-t tartalmazó, párával telített légtérben. Rekombináns egérIL-3-at alkalmaztunk 100 ng/ml végkoncentrációban. Ezt követően a sejteket lökésszerűen 2 pCi [ 3H] -timidinnel kezeltük (81 Ci/mmól; Amersham Corp., Arlington Heights, IL) és további 24 órán át inkubáltuk. AA4.l'-sejteket (körülbelül 20 000 sejt/mélyület koncentrációban) IL-7, flt3-L, valamint flt3-L és IL-7 jelenlétében inkubáltunk 48 órán át, • · · · · · « · · · · · ·· ······· · ··· majd a sejteket 6 órán keresztül lökésszerűen [ 3H] timidinnel kezeltük. Az flt3-L és IL-7 alkalmazásával kapott eredményeket az 1. táblázat, az flt3-L és IL-3 alkalmazásával kapott eredményeket a 2. táblázat szemlélteti.
1. táblázat
Flt3-L és IL-7 alkalmazásának hatása AA4.1+ fötális májsej-
tek proliferációjára
Kontroll Faktor flt3-L+IL- 7
Flt3-L IL-7
[ 3H] - 100 timidin- beépülés (cpm) 1000 100 4200
Az flt3-L és IL-7 kombinációj ával kapott válaszreakció
a csak flt3-L alkalmazásával kapott válaszreakciónál körülbelül négyszer, a csak IL-7 alkalmazásával kapott értéknél körülbelül 40-szer magasabb volt.
• «
2. táblázat
Flt3-L és IL-3 alkalmazásának hatása C-kit -sejtek proliferációjára
Faktor
Kontroll
Flt3-L (csak vektor) [ 3H] - 100 1800 timidinbeépülés (cpm)
IL-3 flt3-L+IL3
3000 9100
Az flt3-L-cDNS-sel transzfektált CVl/EBNA-sejtek tenyésztőfolyadékának felülúszója a c-kít+-törzssejtek proliierációját körülbelül 18-szor nagyobb mértékben stimulálta, mint a csupán expressziós vektorral transzfektált CV1/EBNA-sejtek tenyésztőfolyadékának felülúszója. Az IL-3 tartalmú felülúszó hozzáadása flt3-L-hez szinergista hatásra utalt, mivel a proliferációra kifejtett hatás körülbelül kétszer nagyobb volt, mint az additív hatás esetében várható lett volna.
8. példa
Flt3-L:Fc fúziós protein előállítása
Ebben a példában az flt3-L extracelluláris régióját, valamint humán immunglobulin Fc-doménjét tartalmazó fúziós protein előállítását ismertetjük. Az eljárások lényegében • · 4 • 4 4 · · 4 megegyeznek, az 1. példában, az flt3:Fc fúziós protein előállításánál leírtakkal.
Mielőtt az flt3-L-cDNS-t humán-IgGl-molekula Fcrégióját kódoló cDNS N-terminálist kódoló végével fuzionáltattuk, az f1t3-L-cDNS-fragmentumot pCAV/NOT-vektor Asp718Notl-helyére inszertáltuk a WO 90/05183 számú szabadalmi bejelentésben leírtak szerint. Az egyláncú, humán-IgGlellenanyag Fc-régióját tartalmazó polipeptidet kódoló DNS-t pBLUESCRIPT-SK®-vektor Spel hasítási helyére klónoztuk, amely vektor a kereskedelemben hozzáférhető (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Kalifornia). Ez a plazmidvektor képes E. coliban replikálódni, és 21 egyedi restrikciós helyet tartalmazó többszörös klónozási szegmenst hordoz. Az inszertált Fc-kódolószekvencia 5'-végéhez közel egy egyedi BglII hasítási helyet hoztunk létre úgy, hogy a BglII hasítási hely magában foglalja az Fc-polipeptidben a 3. és 4. aminosavakat kódoló kódont.
A kódolt Fc-polipeptid az N-terminális kapocsrégiótól a natív C-terminális végig terjed, azaz, lényegében teljes hosszúságú ellenanyag-Fc-régió. Alkalmazhatók ezen kívül az Fc-régó fragmentumai is, például a C-terminális végen csonka fragmentumok. A fragmentumok előnyösen több ciszteinaminosavat tartalmaznak, (legalább a kapocsrégióban található ciszteineket tartalmazzák), hogy két különálló f lt3L:Fc fúziós protein Fc-polipeptid-részei között láncok közti diszulfidhidak jöhessenek létre, ezáltal dimerek képződj enek.
• · • ···
A pCAV/NOT-plazmidban található flt3-L-cDNS Asp718-Stul része az Fc-cDNS-t tartalmazó pBLUESCRIPT-SK^-vektor Asp78/Spel helyére klónozható úgy, hogy az flt3-L-cDNS az Fc-cDNS-től 5' -irányban helyezkedjen el. A kapott génfúzióból származó egyszálú DNS szekvenciája Kunkel [ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488 (1985)] , valamint Kunkel és munkatársai [ Methods in Enzymol. 154, 367 (1987)] által leírt eljárás szerint templát-specif ikus mutagenezissel módosítható úgy, hogy az flt3-L teljes extracelluláris doménját tökéletesen fuzionáltathassuk az Fc-szekvenciával. A mutagenizált DNS-t ezután szekvenálhatjuk annak igazolása céljából, hogy a megfelelő nukleotidokat távolítottuk el, (azaz, a transzmembrán-régiót és a részleges citoplazmikus domént kódoló DNS-szekvenciákat deletáltuk), valamint hogy az flt3-L- és az Fc-szekvenciák azonos leolvasási fázisba esnek. Ezt követően a fúziós cDNS-t kivágjuk és ismert eljárások alkalmazásával az pCAV/NOT emlős expressziós vektorba inszertáljuk, amelyet előzőleg Asp718-NotI-enzimmel hasítottunk.
Az flt3-L:Fc fúziós proteineket előnyösen rekombináns emlős sejttenyészetben állítjuk elő. Az fIt3-L:Fc-fúziót tartalmazó expressziós vektort ezután CV-1-sejtekbe (ATCC CCL 70) vagy COS-7-sejtekbe (ATCC CRL 1651) juttattuk. Lehetséges az expresszálás 239-sejtekben is (transzformált elsődleges, humán embrionális vesesejtekben, ATCC CRL 1573) .
Az pCAV/NOT/fIt3-L:Fc-vektorral transzfektált 239sejteket görgő-palackokban tenyésztettük, hogy a fúziós • * ··« • · * · ···· ··· • ·· * ·· « · • · ·· protein tranziens expresszióját lehetővé tegyük, amely az flt3-L-szignálpeptid révén a tenyésztő tápfolyadékba szekretálódik. A fúziós protein protein-A-Sepharoseoszlopon tisztítható.
9. példa
Flt3-L~t nagy mennyiségben expresszáló transzgenikus egerek előállítása
Ebben a példában flt3-L-t nagy mennyiségben expresszáló transzgenikus egerek előállítását ismertetjük. Flt3-L-t nagy mennyiségben expresszáló transzgenikus egereket tanulmányoztunk a nagy mennyiségű expresszió biológiai hatásainak meghatározása céljából. Egerek (B16/J) pronukleuszait flt3-L-DNS-sel mikroinjektáltuk Gordon és munkatársai eljárása szerint [ Science 214, 1244 (1981)] . Általánosságban, látható pronukleuszt tartalmazó megtermékenyített egérpetesejteket injekciós kamrára helyeztünk, és egy kis méretű pipettával helyben tartottunk. Az flt3-L-t kódoló gén (#6-klón) injektálása a pronukleuszt tartalmazó petesejtbe injekciós-pipepttával történt. Ezt követően, az injektált petesejteket (i) előzőleg, 0,5 nappal azelőtt p.c. álterhessé tett nőstény egerek petevezetőjébe juttattuk; (ii) két-sejtes állapotig in vitro tenyésztettük (egy éjszakán át), majd 0,5 nappal azelőtt p.c. álterhessé tett nőstény egerek petevezetőjébe juttattuk; (iii) blasztociszta állapotig in vitro tenyésztettük, majd 2,5 nappal azelőtt p.c. álterhessé tett nőstény egerek petevezetőjébe juttattuk. Előnyösen az első két lehetőség valamelyike alkalmazható, • · · · · · · • * ···· Φ·« ne ······ ~ / 3 — ·#· ··«· ··· *···· mivel nem tartalmaznak hosszú ideig tartó in vitro tenyésztést, és a kis számú almok elkerülés érdekében előnyösen körülbelül 20-30 mikroinjektált petesejtet kell bejuttatnunk.
példa
Az flt3-L stimulálja az eritroid-sejtek proliferációját a lépben
Ebben a példában flt3-L hatását ismertetjük eritroidsejtek proliferációjára transzgenikus egerek lépében. Transzgenikus egereket a 10. példában leirt eljárások szerint állítottunk elő. Az egereket leöltük, és valamennyi intakt lépből különálló sejteket tartalmazó szuszpenziót készítettünk. A szuszpendált sejteket centrifugáltuk, majd 10 ml olyan oldatban szuszpendáltuk, amely 1 % borjúszérummal kiegészített PBS-t tartalmazott. Ebből hemocitométer alkalmazásával meghatároztuk a sejtszámot. Valamennyi sejtmintát tripánkék-festés mellett számoltunk meg, hogy az alábbi képlet szerint meghatározzuk az 1 ml tápfolyadékban található összes élő sejt számát: (RBC+WBC)/ml, ahol RBC (red blood cell count) a vörösvértestek száma, WBC (white blood cell count) a fehérvérsejtszám. Ezt követően valamennyi mintát Turk-féle festés mellett is megszámoltunk, hogy meghatározzuk az 1 ml tápfolyadékban található össz-fehérvérsejtszámot. Az össz-vörösvértestszámot valamennyi minta esetében úgy kaptuk meg, hogy az 1 ml folyadékban található össz-fehérvérsejtszámot kivontuk az 1 ml • · · • · · · · ·· ······· · »·) folyadékban található teljes élő sejtszámból. Az eredményeket a 3. táblázatban összegeztük.
3. táblázat
Eritroid-sejtek proliferációja flt3-L-t nagy mennyiségben
expresszáló transzgenikus egerek lépében
Egér teljes élő ossz - ossz-
sej tszám fehérvérsejt- vörösvértest-
(millió szám(millió szám (millió
sej t/ml) sej t/ml) sej t/ml)
1. kontroll 29, 7 27 2,7
2. kontroll 31 24, 6 6,4
1. transzgeniku s 44,7 25, 6 19, 1
2. transzgeniku 3 37, 3 28, 4 8, 9
A 3. táblázatban szereplő adatok szerint, az 1 ml térfogatban található össz-fehérvérsejtszám körülbelül ugyanakkora volt, mint a kontroli-egerekben meghatározott érték. A két transzgenikus egér lépéből származó vörösvértestszám azonban, körülbelül két-háromszor nagyobb volt, mint a kontroli-egerekben megfigyelhető érték. Az flt3-L fokozza az eritroid-sejtvonalhoz tartozó sejtek számát, feltehetőleg az eritroid-őssejtek stiumulálásán, éritropoetint termelő sejtek stimulálásán vagy egy, az eritropoezist gátló mechanizmus blokkolásán keresztül.
• · · • · · · · · » ·
11. példa
Az flt3-L stimulálja T-sejtek és korai B-sejtek proliiérációját
A 10. példában ismertetettek szerint előállított, 9 hetes korú transzgenikus egerekből származó csontvelőt különböző T- és B-sejtes fenotípusos markerek jelenlétére vizsgáltunk át az említett markerekre specifikus immunreaktív ellenanyagok alkalmazásával. A következő markereket vizsgáltuk: a B220-markert, amely a B-sejtes vonalra specifikus; felszíni IgM-markert (slgM), amely érett B-sejtekre specifikus; az S7- (CD43-) markert, amely egy korai Bsejtes marker; a Stem Cell Antigen-1- (ősséjtes-antigén1-, SCA-1-) markert, amely aktivált T- és B-sejtek markere; a CD4-markert, amely helper-T-sejtek és egyes törzssejtek markere; valamint a Mac-l-markert, amely makrofágokra specifikus; a fenti markerek jelenlétét az említett markerek ellen termelt jól ismert ellenanyagok alkalmazásával vizsgáltuk. Az alábbi 4. táblázatban összegeztük a csontvelő szűrésével kapott eredményeket. Ugyanabból az alomból származó két transzgenikus egeret analizáltunk egy azonos alomból származó normális egérrel, és egy másik alomból származó normális egérrel szemben (kontroll) .
- 78 4 . táblázat
Flt3-L nagy mennyiségben történő expressziójának hatása transzgenikus egerekben
Pozitív sejtek százalékos aránya
Marker Másik Azonos transzge- trans zge-
alomból alomból nikus #1 nikus #2
származó származó
kontroll kontroll
B220 30, 64 27,17 45, 84 48,78
slgM 3, 54 2,41 1,94 1,14
S7 (CD43) 54,43 45,44 46, 11 50, 59
SCA-1 10, 92 11,74 19, 45 27, 37
CD4 6, 94 8,72 12,21 14,05
Mac-1 36, 80 27,15 21,39 18, 63
A fenti adatok szerint, az flt3-L nagy mennyiségben
történő expressziója egerekben a B-sejtek számának növekedéséhez vezet, amit a B220+-sejtek és az SCA-l+-sejtek számának növekedése jelez. A B220+-sejtek analízise FACSeljárással a proB-sejtek (HSA , S7+-sejtek) számának emelkedésére utalt. A CD4+-sejtek számának növekedése a Tsejtek és törzssejtek számának körülbelül kétszeres emelkedését jelentette. Az slgM-markerrel rendelkező sejtek számának csökkenése arra utal, hogy az flt3-L nem stimulálja érett B-sejtek proliferációját. A fenti adatok szerint, az flt3-L növelte a törzssejtes, T-sejtes vagy korai B-sejtes fenotípussal rendelkező sejtek számát, de nem stimulálta az érett B-sejtek vagy makrofágok proliferációját.
• · • · • · · · · ·
- 79 12. példa
Flt3-L-t nagy mennyiségben expresszáló egerek timuszának analízise
Ebben a példában a 10. példában ismertetettek szerint előállított transzgenikus egerekből származó timuszok (csecsemőmirigyek) analízisét ismertetjük. Hat, körülbelül három hónapos korú felnőtt egeret leöltünk. Valamennyi egérből eltávolítottuk a timuszt, és abból különálló sejteket tartalmazó szuszpenziót készítettünk.
FACS-analízissel kimutattuk, hogy az össz-sejtszám vonatkozásában nem történt változás, és az egerekben nem volt kimutatható az érési folyamaton keresztülmenő timociták arányának megváltozása a következő markerek vizsgálata alapján: CD4 versus CD8; CD3 versus abTCR (T-sejtreceptor); valamint CD3 versus gdTCR (T-sejtreceptor) . Megváltozott azonban a CD4 - és CD8 -típusba tartozó egyes sejttípusok aránya (azaz, a fejlődés vonatkozásában a legkorábbi sejteké; amelyek az össz-timuszsejtek körülbelül 2-3 %-át képviselik) . Közelebbről, a CD4 - és CD8*-sejtek fejlődése a timuszban három lépésben történik. Az 1. lépcsőben a sejtek Pgp-1++-, HSA+-markerekkel és IL-2-receptor-negatív ( IL-2 ) markerekkel jellemezhetők. Az 1. lépcsőt követően a timuszsejtek elérik a 2. fejlődési fokot, amelyben a sejtek Pgp-1+-, HSA++- és IL-2R++-markerekkel rendelkeznek, majd a harmadik fejlődési lépcsőt, amelyben a sejtek Pgp-1*' HSA’*- és IL-2R -markerekkel jellemezhetők. A transzgenikus egerek esetében a 2. fejlődési lépcsőbe tartozó timuszsejtek száma körülbelül 50 %-kal csökkent, míg a 3.
• · • · · • · ··· ··· *·«···· * * fejlődési lépcsőbe tartozó sejtpopuláció száma arányosan nőtt. A fenti adatok azt jelentik, hogy az flt3-L a timuszsejtek 2. fejlődési lépcsőből 3. fejlődési lépcsőbe történő átalakulását irányítja, tehát az flt3-L kifejti hatását korai T-sejtekre.
13. példa
Flt3-L alkalmazása perifériás törzssejt-transzplantációban
Ebben a példában flt3-L alkalmazását ismertetjük autológ perifériás törzssejtek (PSC) vagy perifériás vérből származó őssejtek (PBPC) transzplantációjára. A PBPC- vagy PSC-transzplantációt tipikusan olyan betegekben alkalmazzuk, amelyek csontveleje nem alkalmas sejtgyűjtésre, például csontvelő-abnormalitás vagy malignus átalakulás következtében .
A sejtgyűjtést megelőzően előnyös lehet a keringő PBPCés PSC-sejtek mobilizálása vagy a sejtek számának növelése. A mobilizálás javíthatja a PBPC- és PSC-gyűjtés hatásfokát, és megvalósítható úgy, hogy a betegnek az említett sejtek gyűjtését megelőzően intravénásán flt3-L-t adunk be. Az flt3-L-adagolással eltérő időben vagy azzal egyidejűleg további növekedési faktorokat is beadhatunk, melyek a következők lehetnek: CSF-1, GM-CSF, SF, G-CSF, EPO, IL-1-, IL-2-, IL-3-, IL-4-, IL-5-, IL-6-, IL-7-, IL-8-, IL-9-, IL10-, IL-11-, IL-12-, IL-13-, IL-14-, IL-15-interleukinek, GM-CSF/IL3 fúziós proteinek, LIF, FGF és az előbbiek kombinációi. A technika állása szerint ismert afereziseljárásokkal mobilizált vagy nem-mobilizált PBPC-t és PSC-t
9 gyűjtünk [ lásd például: Bishop és mtsai.: Blood 83, No2, 610 (1994)] . Röviden, PBPC-t és PSC-t gyűjtünk szokásos eszközökkel, például Haemonetics Model V50 afereziskészülékkel (Haemonetics, Braintree, MA). Négy órás gyűjté seket végzünk, tipikusan nem többször, mint hetente öt alkalommal, míg a betegből körülbelül 6,5xl08/ testtömeg-kg mononukleáris (MNC) sejtet nyerünk. A gyűjtött PBPC- és PSC-sejtekből vett mintákat granulocita-makrofág kolóniaképző-egység- (CFU-GM-) tartalomra vizsgáljuk úgy, hogy kálciumot és magnéziumot nem tartalmazó Hanks-féle kiegyensúlyozott sóoldattal (HBSS-oldattal körülbelül 1 : 6 arányú hígítást készítünk, és az elegyet limfocita-szeparációs táptalajra (Organon Teknika
Durham, Észak-Karolina rétegezzük. Centrifugálást követően a réteghatáron látható MNC t összegyűjtjük, mossuk és HBSS-ben szuszpendáljuk. Egy ml térfogatú mintákat, amely körülbelül 300 000 MNC-t, módosított McCoy-féle 5A-tápfolyadékot, 0,3 % agart, 200 egység/ml rekombináns humán GM-CSF-t, 200 egység/ml rekombináns humán IL-3-t, és 200 egység/ml rekombináns humán G-CSF-t tartalmaz, 14 napig, 37 °C-on, 5 % CO2-t tar talmazó párával telített levegőben tenyésztünk. A tenyészethez kívánság szerint flt3-L-t vagy GM-CSF/IL-3 fúziós molekulákat (PIXY 321) adhatunk. A fenti tenyészeteket Wright-féle festéssel festjük, és a CFU-GM-kolóniákat preparáló mikroszkóp alkalmazásával megszámoljuk (Ward és mtsai.: Exp. Hematol. 1 6, 358 (1988)] . A CFU-GM-kolóniákat vizsgálhatjuk ezen felül a CD34/CD33 flow-citometriás- 82
eljárással [Siena és mtsai.: Blood 77, No2, 400 (1991)] vagy a technika állása szerint ismert bármely eljárással.
A CFU-GM-tartalmú kolóniákat szabályozható hőmérsékletcsökkenésű fagyasztóban (például Cryo-Med-fagyasztóban, Mt. Clemens, MI) lefagyasztjuk, majd folyékony nitrogén párolgó gáz-fázisában tároljuk. Krioprotektorként tíz % dimetil-szulfoxidot alkalmazhatunk. Miután a betegből történő sejtgyűjtés befejeződött, a CFU-GM-tartalmú tenyészeteket felolvasztjuk és összekeverjük. A felolvasztott gyűjtött sejtelegyet intravénásán visszainfundáljuk a betegnek, vagy a visszainfundálás előtt azokat ex vivő felszaporitjuk. Az sejtelegy ex vivő felszaporítását végezhetjük növekedési faktorként flt3-L alkalmazásával egymagában, vagy egymást követően vagy egyidőben a fenti citokinek valamelyikével történő kombinációban. Az ilyen ex vivő felszaporításra alkalmazható eljárások a technika állása szerint ismertek. A felszaporított vagy fel nem szaporított sejteket intravénásán visszainfundáljuk a betegnek. A transzplantált sejtek megtapadásának elősegítésére a reinfúzióval egyidőben vagy azt követően flt3-L-t adagolunk. Az flt3-L-t ekkor alkalmazhatjuk önmagában, vagy egymást követően vagy egyidőben a fenti citokinek valamelyikéval történő kombiná cióban .
• · ·
14. példa
Hematopoetikus ős- vagy törzssejtek tisztítása flt3-L alkalmazásával
Ebben a példában hematopoetikus ős- és törzssejteknek sejtek elegyét tartalmazó szuszpenzióból történő tisztítására szolgáló eljárást ismertetünk. Csontvelőből és perifériás vérből sejteket gyűjtünk ismert eljárásokkal. A sejteket standard tápfolyadékban szuszpendáljuk, majd a neutrofil-sejtek és vörösvérsejtek eltávolítása céljából centrifugáljuk. A két fázis közti határfelületen elhelyezkedő sejteket, (melyet a technika állása szerint buffy coat-nak is neveznek) összegyűjtjük és szuszpendáljuk. Ezek a sejtek elsősorban mononukleáris sejtek, és a korai hematopoetikus ős- vagy törzssejtek populációjának jelentős részét képviselik. A kapott sejtszuszpenziót ezután biotinezett flt3-L-lel inkubáljuk elegendő ideig ahhoz, hogy megfelelő flt3:flt3-L-kölcsönhatás jöjjön létre. Tipikusan, legalább egy órás inkubációs időre van szükség. Az inkubálást követően a sejtszuszpenziót gravitációs erő által működtetett, avidinnal fedett gyöngyökkel töltött oszlopon engedjük át. Ilyen oszlopok a technika állása szerint jól ismertek [lásd, Berenson és mtsai.: J. Cell Biochem. 1OD, 239 (1986)] . Az oszlopot a nem-kötődött anyag eltávolítása céljából PBS-oldattal mossuk. A célzott sejtek a gyöngyökről és az flt3-L-ről ismert eljárásokkal felszaba díthatok.
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 879 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: mRNS-ből előálltott cDNS
HIPOTETIKUS: nem
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature
ELHELYEZKEDÉS: 1-25
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature
ELHELYEZKEDÉS: 855-879
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS
ELHELYEZKEDÉS: 57-752
- 85 AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTCGACTGGA ACGAGACGAC CTGCTCTGTC ACAGGCATGA GGGGTCCCCG GCAGAG 56
ATG Met 1 ACA GTG Thr Val CTG GCG Leu Alá 5 CCA Pro GCC Alá TGG AGC Trp Ser CCA Pro ’ 10 AAT Asn TCC Ser TCC Ser CTG Leu TTG Leu 15 CTG Leu 104
CTG TTG CTG CTG CTG AGT CCT TGC CTG CGG GGG ACA CCT GAC TGT TAC 152
Leu Leu Leu Leu Leu Ser Pro Cys Leu Arg Gly Thr Pro Asp Cys Tyr
20 25 30
TTC AGC CAC AGT CCC ATC TCC TCC AAC TTC AAA GTG AAG TTT AGA GAG 200
Phe Ser His Ser Pro Ile Ser Ser Asn Phe Lys Val Lys Phe Arg Glu
35 40 45
TTG ACT GAC CAC CTG CTT AAA GAT TAC CCA GTC ACT GTG GCC GTC AAT 248
Leu Thr Asp His Leu Leu Lys Asp Tyr Pro Val Thr Val Alá Val Asn
50 55 60
CTT CAG GAC GAG AAG CAC TGC AAG GCC TTG TGG AGC CTC TTC CTA GCC 296
Leu Gin Asp Glu Lys His Cys Lys Alá Leu Trp Ser Leu Phe Leu Alá
65 70 7 5* 80
CAG CGC TGG ATA GAG CAA CTG AAG ACT GTG GCA GGG TCT AAG ATG CAA 344
Gin Arg Trp Ile Glu Gin Leu Lys Thr Val Alá Gly Ser Lys Met Gin
85 90 95
ACG CTT CTG GAG GAC GTC AAC ACC GAG ATA CAT TTT GTC ACC TCA TGT 392
Thr Leu Leu Glu Asp Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Ser Cys
100 105 110
ACC TTC CAG CCC CTA CCA GAA TGT CTG CGA TTC GTC CAG . ACC AAC . ATC 4 40
Thr Phe Gin Pro Leu Pro Glu Cys Leu Arg Phe Val Gin ' Thr Asn Ile
115 120 125
TCC CAC CTC CTG AAG GAC ACC TGC ACA CAG CTG CTT GCT CTG . AAG CCC 488
Ser His Leu Leu Lys Asp Thr Cys Thr Gin Leu Leu Alá Leu : Lys Pro
130 135 140
TGT ATC GGG AAG GCC TGC CAG AAT TTC TCT CGG TGC CTG GAG 1 GTG CAG 536
Cys Ile Gly Lys Alá Cys Gin Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu ' Val Gin
145 150 155 160
TGC CAG CCG GAC TCC TCC ACC CTG CTG CCC CCA AGG AGT CCC . ATA GCC 584
Cys Gin Pro Asp Ser Ser Thr Leu Leu Pro Pro Arg Ser Pro Ile Alá
165 170 175
CTA GAA GCC ACG GAG CTC CCA GAG CCT CGG CCC AGG CAG CTG TTG CTC 632
Leu Glu Alá Thr Glu Leu Pro Glu Pro Arg Pro Arg Gin Leu Leu Leu
180 185 190
CTG CTG CTG CTG CTG CCT CTC ACA CTG GTG CTG CTG GCA GCC GCC TGG 680
Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Thr Leu Val Leu Leu Alá Alá . Alá Trp
195 200 205
GGC CTT CGC TGG CAA AGG GCA AGA AGG AGG GGG GAG CTC CAC CCT GGG 728
Gly Leu Arg Trp Gin Arg Alá Arg Arg Arg Gly Glu Leu His Pro Gly
210 215 220
GTG CCC CTC CCC TCC CAT CCC TAGGATTCGA GCCTI ’GTGCA TCGTTGACTC 779
Val Pro Leu Pro Ser His Pro
225 230
AGCCAGGGTC TTATCTCGGT TACACCTGTA ATCTCAGCCC TTGGGAGCCC AGAGCAGGAT 339
TGCTGAATGG TCTGGAGCAG GTCGTCTCGT TCCAGTCGAC
879
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 231 aminosav
TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: fehérje
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Met 1 Thr Val Leu Alá 5 Pro Alá Trp Ser Pro 10 Asn Ser Ser Leu Leu 15 Leu
Leu Leu Leu Leu Leu Ser Pro Cys Leu Arg Gly Thr Pro Asp Cys Tyr
20 25 30
Phe Ser His Ser Pro Ile Ser Ser Asn Phe Lys Val Lys Phe Arg Glu
35 40 45
Leu Thr Asp His Leu Leu Lys Asp Tyr Pro Val Thr Val Alá Val Asn
50 55 60
Leu Gin Asp Glu Lys His Cys Lys Alá Leu Trp Ser Leu Phe Leu Alá
65 70 75 80
Gin Arg Trp Ile Glu Gin Leu Lys Thr Val Alá Gly Ser Lys Met Gin
85 90 95
Thr Leu Leu Glu Asp Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Ser Cys
100 105 110
Thr Phe Gin Pro Leu Pro Glu Cys Leu Arg Phe Val Gin Thr Asn Ile
115 120 125
Ser His Leu Leu Lys Asp Thr Cys Thr Gin Leu Leu Alá Leu Lys Pro
130 135 140
Cys Ile Gly Lys Alá Cys Gin Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Val Gin
145 150 155 160
Cys Gin Pro Asp Ser Ser Thr Leu Leu Pro Pro Arg Ser Pro Ile Alá
165 170 175
Leu Glu Alá Thr Glu Leu Pro Glu Pro Arg Pro Arg Gin Leu Leu Leu
180 185 190
Leu Leu Leu Leu Leu P ro Leu Thr Leu Val Leu Leu Alá Alá Alá Trp
195 200 205
Gly Leu Arg Trp Gin Arg Alá Arg Arg Arg Gly Glu Leu His Pro Gly
210 215 220
Val Pro Leu Pro Ser His Pro
225 230
9
999 999
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 24 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: NEM
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCGACTGGAA CGAGACGACC TGCT 2 4
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGCAGGTCGT CTCGTTCCAG 20
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 988 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris • · ··
MOLEKULATÍPUS: mRNS-ből előálltott cDNS
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS
ELHELYEZKEDÉS: 30-734
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGGCCGGAAT TCCGGGGCCC CCGGCCGAA ATG ACA GTG CTG GCG CCA GCC TGG 53
Met 1 Thr Val Leu Alá 5 Pro Alá Trp
AGC CCA ACA ACC TAT CTC CTC CTG CTG CTG CTG CTG AGC TCG GGA CTC 101
Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu
10 15 - 20
AGT GGG ACC CAG GAC TGC TCC TTC CAA CAC AGC CCC ATC TCC TCC GAC 149
Ser Gly Thr Gin Asp Cys Ser Phe Gin His Ser Pro Ile Ser Ser Asp
25 30 35 40
TTC GCT GTC AAA ATC CGT GAG CTG TCT GAC TAC CTG CTT CAA GAT TAC 197
Phe Alá Val Lys He Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gin Asp Tyr
45 50 55
CCA GTC ACC GTG GCC TCC AAC CTG CAG GAC GAG GAG CTC TGC GGG GGC 245
Pro Val Thr Val Alá Ser Asn Leu Gin Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly
60 65 70
CTC TGG CGG CTG GTC CTG GCA CAG CGC TGG ATG GAG CGG CTC AAG ACT 293
Leu Trp Arg Leu Val Leu Alá Gin Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr
75 Θ0 85
GTC GCT GGG TCC AAG ATG CAA GGC TTG CTG GAG CGC GTG AAC ACG GAG 341
Val Alá Gly Ser Lys Met Gin Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu
90 95 100
ATA CAC TTT GTC ACC AAA TGT GCC TTT CAG CCC CCC CCC AGC TGT CTT 389
He His Phe Val Thr Lys Cys Alá Phe Gin Pro Pro Pro Ser Cys Leu
105 110 115 120
• · • ·· ·· · • · r · · · ·
CGC Arg TTC Phe GTC Val CAG Gin ACC Thr 125 AAC Asn ATC Ile TCC Ser CGC Arg CTC Leu 130 CTG Leu CAG Gin GAG Glu ACC Thr TCC Ser 135 GAG Glu 4 37
CAG CTG GTG GCG CTG AAG CCC TGG ATC ACT CGC CAG AAC TTC TCC CGG 485
Gin Leu Val Alá Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gin Asn Phe Ser Arg
140 145 150
TGC CTG GAG CTG CAG TGT CAG CCC GAC TCC TCA ACC CTG CCA CCC CCA 533
Cys Leu Glu Leu Gin Cys Gin Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro
155 160 165
TGG AGT CCC CGG CCC CTG GAG GCC ACA GCC CCG ACA GCC CCG CAG CCC 581
Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Alá Thr Alá Pro Thr Alá Pro Gin Pro
170 175 180
CCT CTG CTC CTC CTA CTG CTG CTG CCC GTG GGC CTC CTG CTG CTG GCC 629
Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Val Gly Leu Leu Leu Leu Alá
185 190 195 200
GCT GCC TGG TGC CTG CAC TGG CAG AGG ACG CGG CGG AGG ACA CCC CGC 677
Alá Alá Trp Cys Leu His Trp Gin Arg Thr Arg Arg Arg Thr Pro Arg
205 210 215
CCT GGG GAG CAG GTG CCC CCC GTC CCC AGT CCC CAG GAC CTG CTG CTT 725
P ro Gly Glu Gin Val Pro P ro Val Pro Ser Pro Gin Asp Leu Leu Leu
220 225 230
GTG GAG CAC TGACCTGGCC AAGGCCTCAT CCTGCGGAGC CTTAAACAAC 774
Val Glu His
235
GCAGTGAGAC AGACATCTAT CATCCCATTT TACAGGGGAG GATACTGAGG CACACAGAGG 834
GGAGTCACCA GCCAGAGGAT GTATAGCCTG GACACAGAGG AAGTTGGCTA GAGGCCGGTC 894
CCTTCCTTGG GCCCCTCTCA TTCCCTCCCC AGAATGGAGG CAACGCCAGA ATCCAGCACC 954
GGCCCCATTT ACCCAACTCT GAACAAAGCC CCCG 988
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 235 bázispár
TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: fehérje
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Met 1 Thr Val Leu Alá 5 Pro Alá Trp Ser Pro 10 Thr Thr Tyr Leu Leu 15 Leu
Leu Leu Leu Leu 20 Ser Ser Gly Leu Ser 25 Gly Thr Gin Asp Cys 30 Ser Phe
Gin His Ser 35 Pro Ile Ser Ser Asp 40 Phe Alá Val Lys Ile 45 Arg Glu Leu
Ser Asp 50 Ty r Leu Leu Gin Asp 55 Tyr Pro Val Thr Val 60 Alá Ser Asn Leu
Gin Asp Glu Glu Leu Cvs Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Alá Gin
65 70 75 80
Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Alá Gly Ser Lys Met Gin Gly
85 90 95
Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Alá
100 105 lí 0
Phe Gin Pro Prp Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gin Thr Asn Ile Ser
115 120 125
Arg Leu Leu Gin Glu Thr Ser Glu Gin Leu Val Alá Leu Lys Pro Trp
130 135 140
Ile Thr Arg Gin Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gin Cys Gin Pro
145 150 155 160
Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Alá
165 170 175
Thr Alá Pro Thr Alá Pro Gin Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
180 185 190
Pro Val Gly Leu Leu Leu Leu Alá Alá Alá Trp Cys Leu His Trp Gin
195 200 205
Arg Thr Arg Arg Arg Thr Pro Arg Pro Gly Glu Gin Val Pro Pro Val
210 215 220
Pro Ser Pro Gin Asp Leu Leu Leu Val Glu His
225 230 235
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 71 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: mRNS-ből előálltott cDNS
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem • · • ··· ··· ··· • · · · ······· * ···
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AATTGGTACC TTTGGATAAA AGAGACTACA AGGACGACGA TGCCAAGACA
CCTGACTGTT 60
ACTTCAGCCA C 71
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 37 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: mRNS-ből előálltott cDNS
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATATGGATCC CTACTGCCTG GGCCGAGGCT CTGGGAG

Claims (1)

1. Izolált flt3-ligandum (flt3-L) polipeptid.
2 . Az 1. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemez- ve, hogy egér-fIt3-L. 3 . Az 1. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemez- ve, hogy humán flt3-L. 4 . A 3. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemez- ve. hogy a 6. azonosítószámú szekvencia szerin ti 1-235. aminosava kát tartalmazza. 5 . Az 1. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemez- ve, hogy oldható flt3-L. 6 . Az 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemez- ve, hogy a 6. azonosítószámú szekvencia szerint i 28-160.
vagy 28-182. aminosavakat tartalmazza.
7. A 3. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy E. coli DHlOB-sejtekben található sfHAVEO410vektor által hordozott cDNS-inszert által kódolt, mely sejtek nyilvántartási száma: ATCC 69382.
8. Izolált DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy Flt3L-polipeptidet kódol.
9. A 8. igénypont szerinti izolált DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy egér flt3-L-polipeptidet kódol.
10. A 8. igénypont szerinti izolált DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy humán flt3-L-polipeptidet kódol.
11. A 8. igénypont szerinti izolált DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy a 6. azonosítószámú szekvencia szerinti 28-160. vagy 28-182. aminosavakat kódolja.
• ·
12. A 8. igénypont szerinti izolált DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy a következők valamelyike:
(a) egy flt3-L-gén kódoló-régiójából származó cDNS;
(b) az 1. azonosítószámú szekvencia és az 5. azonosítószámú szekvencia szerinti cDNS-szekvenciák valamelyike;
(c) mérsékelten sztringens körülmények között az (a)- vagy (b)-pontok szerinti cDNS-szekvenciákkal hibridizálódni képes DNS-szekvenciák, azzal jellemezve, hogy az említett DNS-szekvenciák flt3-L-t kódolnak;
(d) DNS-szekvenciák, amelyek - a genetikai kód degeneráltsága folytán - az (a)- (b)- és (c)-pontok szerinti DNS-ek által kódolt polipeptidek aminosav-szekvenciájával megegyező szekvenciájú flt3-L-polipeptideket kódolnak.
13. Expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy igénypont szerinti DNS-t tartalmaz.
14. Expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy igénypont szerinti DNS-t tartalmaz.
15. Expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy igénypont szerinti DNS-t tartalmaz.
16. Expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy
11 .
igénypont szerinti DNS-t tartalmaz.
17. Expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy igénypont szerinti DNS-t tartalmaz.
18. Gazdasejt, azzal jellemezve, hogy 13.
igénypont szerinti expressziós vektorral van transzfektálva vagy transzformálva.
19. Gazdasejt, azzal jellemezve, szerinti expressziós vektorral van transzformálva .
20. Gazdasejt, azzal jellemezve, szerinti expressziós vektorral van transzformálva.
21. Gazdasejt, azzal jellemezve, szerinti expressziós vektorral van transzformálva.
22. Gazdasejt, azzal jellemezve, szerinti expressziós vektorral van hogy 14. igénypont transzfektálva vagy hogy 15. igénypont transzfektálva vagy hogy 16. igénypont transzfektálva vagy hogy 17. igénypont transzfektálva vagy transzformálva.
23. Eljárás flt3-L-polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a 18. igénypont szerinti gazdasejteket az expressziót elősegítő körülmények között tenyésztünk, majd a polipeptidet a tenyésztő tápfolyadékból kinyerjük.
24. Eljárás flt3-L-polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a 19. igénypont szerinti gazdasejteket az expressziót elősegítő körülmények között tenyésztünk, majd a polipeptidet a tenyésztő tápfolyadékból kinyerjük.
25. Eljárás flt3-L-polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a 20. igénypont szerinti gazdasejteket az expressziót elősegítő körülmények között tenyésztünk, majd a polipeptidet a tenyésztő tápfolyadékból kinyerjük.
26. Eljárás flt3-L-polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a 21. igénypont szerinti gazdasejteket az expressziót elősegítő körülmények között tenyésztünk, majd a polipeptidet a tenyésztő tápfolyadékból kinyerjük.
• ·
27. Eljárás flt3-L-polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a 22. igénypont szerinti gazdasejteket az expressziót elősegítő körülmények között tenyésztünk, majd a polipeptidet a tenyésztő tápfolyadékból kinyerjük.
28. Ellenanyag, azzal jellemezve, hogy képes flt3-Lpolipeptiddel immunológiai reakcióba lépni.
29. A 28. igénypont szerinti ellenanyag, azzal jellemezve, hogy monoklonális ellenanyag.
30. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti flt3-L-polipeptid hatékony mennyiségét, valamint gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot, kötőanyagot vagy hígítóanyagot tartalmaz.
31. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy az 3. igénypont szerinti flt3-L-polipeptid hatékony mennyiségét, valamint gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot, kötőanyagot vagy hígítóanyagot tartalmaz.
32. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy az 5. igénypont szerinti flt3-L-polipeptid hatékony mennyiségét, valamint gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot, kötőanyagot vagy hígítóanyagot tartalmaz.
33. Eljárás autológ transzplantáció végrehajtására sejtszámcsökkenést eredményező terápiás kezelés alatt álló páciens esetén, azzal jellemezve, hogy:
(i) a sejtszámcsökkenést eredményező terápiát megelőzően a pácienstől hematopoetikus ős- vagy törzssejteket gyűjtünk; és (ii) a sejtszámcsökkenést eredményező terápiát követően a gyűjtött sejteket a páciensnek visszaadjuk;
• · továbbá azzal jellemezve, hogy az eljárás az alábbi lépések legalább egyikét tartalmazza:
(a) a páciensnek a sejtgyűjtést megelőzően flt3-L hatékony mennyiségét adjuk be a keringő ős- vagy törzssejtek számának növelése céljából;
(b) az ős- vagy törzssejteket ex vivő felszaporítjuk úgy, hogy azokat flt3-L hatékony mennyiségével érintkeztetjük; és (c) a páciensnek flt3-L hatékony mennyiségét adjuk be, miáltal a páciensben a transzplantált ős- vagy törzssejtek megtapadását elősegítsük.
34. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az flt3-L-t a következő citokinekkel kombinálva alkalmazzuk: CSF-1, GM-CSF, SF, G-CSF, EPO, IL-1-, IL-2-, IL-3-, IL-4-, IL-5-, IL-6-, IL-7-, IL-8-, IL-9-, IL-10-, IL-11-, IL-12-, IL-13-, IL-14-, IL-15-interleukinek, GM-CSF/IL3 fúziós proteinek, LIF, FGF, valamint az előbbiek egyidejűleg vagy egymást követően alkalmazott kombinációi.
35. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a flt3-L-t a következő citokinekkel kombinálva alkalmazzuk: GM-CSF, SF, G-CSF, EPO, IL-3, és GM-CSF/IL3 fúziós proteinek.
36. Tápfolyadék hematopoetikus sejtek felszaporítására, azzal jellemezve, hogy sejttenyésztő tápfolyadékot és az 1. igénypont szerinti flt3-L-polipeptid hatékony mennyiségét tartalmazza.
···>
···· ·· ···· • · · · ··· ··· ··· • · · ··♦ 4 «44
37. Eljárás exogén gének, korai hematopoetikus sejtekbe történő bejuttatására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépeseket tartalmazza:
(i) a korai hematopoetikus sejteket f1t3-L-polipeptid hatékony mennyiségét tartalmazó tápfolyadékban tenyésztünk;
(ii) az (i)-lépés szerinti tenyésztett sejteket a génnel transzfektáljuk.
38. Eljárás exogén gének emlősbe történő bejuttatására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépeseket tartalmazza:
(i) a korai hematopoetikus sejteket flt3-L-polipeptid hatékony mennyiségét tartalmazó tápfolyadékban tenyésztünk;
(ii) az (i)-lépés szerinti tenyésztett sejteket a génnel transzfektáljuk;
(iii) a transzfektált sejteket az emlősnek beadjuk.
39. Eljárás T-sejtek proliferációjának stimulálására emlősben, azzal jellemezve, hogy az emlősnek az 1. igénypont szerinti flt3-L-polipeptid hatékony mennyiségét beadjuk .
40. Eljárás eritroid-sejtvonalhoz tartozó sejtek proliferációjának stimulálására emlős lépében, azzal jellemezve, hogy az emlősnek az 1. igénypont szerinti flt3-Lpolipeptid hatékony mennyiségét beadjuk.
41. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy EPO hatékony mennyiségét is beadjuk.
42. Eljárás mielodiszpláziás tünetegyüttesben szenvedő beteg kezelésére, azzal jellemezve, hogy a betegnek az 1 . igénypont szerinti flt3-L-polipeptid hatékony mennyiségét, valamint - adott esetben - a következő növekedési faktorok
- 98 ···· ·· < · · »· <··· ···· • ·· ·* • < · · · · • · « ··· egyikének vagy azok közül többnek a hatékony mennyiségét beadjuk: CSF-1, GM-CSF, SF, G-CSF, EPO, IL-1-, IL-2-, IL-3-, IL-4-, IL-5-, IL-6-, IL-7-, IL-8-, IL-9-, IL-10-, IL-11-, IL-12-, IL-13-, IL-14-, IL-15-interleukinek, GMCSF/IL3 fúziós proteinek, LIF, valamint FGF.
43. Eljárás anémiában szenvedő beteg kezelésére, azzal jellemezve, hogy a betegnek az 1. igénypont szerinti flt3L-polipeptid hatékony mennyiségét, valamint - adott esetben - a következő növekedési faktorok egyikének vagy azok közül többnek, a hatékony mennyiségét beadjuk: CSF-1, GMCSF, SF, G-CSF, EPO, IL-1-, IL-2-, IL-3-, IL-4-, IL-5-, IL-6-, IL-7-, IL-8-, IL-9-, IL-10-, IL-11-, IL-12-, IL-13-, IL-14-, IL-15-interleukinek, GM-CSF/IL3 fúziós proteinek, LIF, valamint FGF.
44. Eljárás szerzett immunhiányos tünetegyüttesben szenvedő beteg kezelésére, azzal jellemezve, hogy a betegnek az 1 . igénypont szerinti flt3-L-polipeptid hatékony mennyiségét, valamint - adott esetben - a következő növekedési faktorok egyikének vagy azok közül többnek a hatékony mennyiségét beadjuk: CSF-1, GM-CSF, SF, G-CSF, EPO, IL-1-, IL-2-, IL-3-, IL-4-, IL-5-, IL-6-, IL-7-, IL-8-, IL-9-, IL10-, IL-11-, IL-12-, IL-13-, IL-14-, IL-15-interleukinek, GM-CSF/IL3 fúziós proteinek, LIF, valamint FGF.
45. A 44. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a beteg AZT-kezelésben részesül.
46. Transzgenikus nem-humán emlős, azzal jellemezve, hogy ivarsejtjei és szomatikus sejtjei tartalmazzák a 8. igénypont szerinti DNS-szekvenciát, amely DNS-szekvencia
- 99 embrionális állapotban az említett emlősbe vagy az emlős elődjébe lett bejuttatva.
47. Eljárás felszínükön flt3-receptort hordozó sejtek különválasztására sejtek elegyét tartalmazó szuszpenzióból, azzal jellemezve, hogy az elegyben található sejteket egy flt3-kötőproteineket hordozó kontaktfelszínnel érintkeztetjük, majd a kontaktfelszint és a szuszpenziót szétválasztjuk .
48. A 47. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy f1t3-kötőproteinként flt3-L-t alkalmazunk.
HU9503341A 1993-05-24 1994-05-12 Ligands of flt3 HUT74831A (en)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6839493A 1993-05-24 1993-05-24
US10646393A 1993-08-12 1993-08-12
US11175893A 1993-08-25 1993-08-25
US16240793A 1993-12-03 1993-12-03
US20950294A 1994-03-07 1994-03-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9503341D0 HU9503341D0 (en) 1996-01-29
HUT74831A true HUT74831A (en) 1997-02-28

Family

ID=27535798

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9503341A HUT74831A (en) 1993-05-24 1994-05-12 Ligands of flt3

Country Status (16)

Country Link
US (3) US5554512A (hu)
JP (1) JP4028594B2 (hu)
KR (1) KR100319359B1 (hu)
CN (1) CN1123574C (hu)
AU (1) AU683472B2 (hu)
BR (1) BR9407073A (hu)
CA (1) CA2162397C (hu)
FI (1) FI955646A (hu)
HU (1) HUT74831A (hu)
MY (1) MY148148A (hu)
NO (1) NO322373B1 (hu)
NZ (1) NZ267541A (hu)
OA (1) OA10716A (hu)
PL (1) PL311756A1 (hu)
UA (1) UA42726C2 (hu)
WO (1) WO1994028391A1 (hu)

Families Citing this family (116)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7017494A (en) * 1993-05-19 1994-12-12 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Purified mammalian flt3 ligands and agonists and antagonists thereof
US7534867B1 (en) * 1993-05-19 2009-05-19 Schering Corporation Purified mammalian Flt3 ligands; agonists; antagonists
US5554512A (en) * 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
NZ314644A (en) * 1993-05-24 2000-11-24 Immunex Corp Use of flt3-ligands as a growth stimulator of stem cells in the transplantation of tissue
US7294331B2 (en) * 1994-03-07 2007-11-13 Immunex Corporation Methods of using flt3-ligand in hematopoietic cell transplantation
US5525708A (en) * 1994-03-28 1996-06-11 Cytomed, Inc. Covalent dimer of kit ligand
US5789655A (en) 1994-05-13 1998-08-04 The Regents Of The University Of California Transgenic animals expressing artificial epitope-tagged proteins
WO1997003684A1 (en) * 1995-07-21 1997-02-06 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES, represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Method of decreasing radiation or radio-mimetic chemotherapy for hematopoietic pluripotent cell engraftment
US6117850A (en) * 1995-08-28 2000-09-12 The Collaborative Group, Ltd. Mobilization of peripheral blood precursor cells by β(1,3)-glucan
GB9519776D0 (en) * 1995-09-28 1995-11-29 Casimir Colin Materials and methods relating to the transfer of nucleic acid into stem cells
US7150992B1 (en) 1995-10-04 2006-12-19 Innunex Corporation Methods of preparing dendritic cells with flt3-ligand and antigen
US7361330B2 (en) * 1995-10-04 2008-04-22 Immunex Corporation Methods of using flt3-ligand in the treatment of fibrosarcoma
AU697539B2 (en) 1995-10-04 1998-10-08 Immunex Corporation Dendritic cell stimulatory factor
US20030103988A1 (en) * 1995-10-26 2003-06-05 Leonard Chess Regulation of activated t cells by recognition of t cell receptor beta chains and major histocompatibility complex class ib molecules
US5849999A (en) * 1996-10-16 1998-12-15 The Mclean Hospital Corporation Transgenic non-human mice expressing Flag-APP-C100 protein develop alzheimer's disease brain morphology and behavior
US6660257B1 (en) 1996-10-25 2003-12-09 Pharmacia Corporation Circular permuteins of flt3 ligand
US6967092B1 (en) 1996-10-25 2005-11-22 Mc Kearn John P Multi-functional chimeric hematopoietic receptor agonists
AU7835898A (en) * 1997-06-17 1999-01-04 Immunex Corporation A method of enhancing antigen-specific peripheral immune tolerance
WO1999026639A1 (en) * 1997-11-26 1999-06-03 Allegheny University Of The Health Sciences Methods for mobilizing hematopoietic facilitating cells and hematopoietic stem cells into the peripheral blood
DE69824039T2 (de) 1997-12-08 2005-08-18 Lexigen Pharmaceuticals Corp., Lexington Heterodimäre fusionsproteine zur verwendung für gezielte immuntherapie und allgemeine immunerregung
CA2316755C (en) * 1998-01-23 2006-04-04 Prolifaron, Inc. Methods and compositions for the identification of growth factor mimetics, growth factors and inhibitors
US6291661B1 (en) * 1998-07-02 2001-09-18 Immunex Corporation flt3-L mutants and method of use
US6376067B1 (en) * 1998-12-21 2002-04-23 Mitsubishi Polyester Film, Llc Silicone coated film with back side slip control coating and method of controlling slip of such film
US7112409B2 (en) * 1999-01-29 2006-09-26 Center For Molecular Medicine And Immunology Method of determining cytokine dosage for myelosuppressive state
US6649352B1 (en) * 1999-01-29 2003-11-18 Center For Molecular Medicine And Immunology Method of evaluating myelosuppressive state
JP2003530070A (ja) * 1999-05-19 2003-10-14 レキシジェン ファーマシューティカルズ コーポレイション Ｆｃ融合タンパク質としてのインターフェロン−αタンパク質の発現および搬出
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US6617135B1 (en) 1999-08-09 2003-09-09 Emd Lexigen Research Center Corp. Multiple cytokine protein complexes
GB9924981D0 (en) * 1999-10-21 1999-12-22 Univ Manchester Gene therapy
AU2154401A (en) 1999-11-12 2001-05-30 Merck Patent Gmbh Erythropoietin forms with improved properties
EP2298334A3 (en) 1999-12-20 2012-04-04 Immunex Corporation Tweak receptor
WO2001058957A2 (en) 2000-02-11 2001-08-16 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US7541184B2 (en) 2000-02-24 2009-06-02 Invitrogen Corporation Activation and expansion of cells
MXPA02012734A (es) 2000-06-29 2003-04-25 Merck Patent Gmbh Mejoramiento de las respuestas inmunes mediadas por la proteina de fusion anticuerpo-citocina, mediante tratamiento combinado con agentes mejoradores de la captacion de inmunocitocina.
US20020150552A1 (en) * 2000-09-12 2002-10-17 Lau Allan S. Compositions comprising mixtures of therapeutic proteins and methods of producing the same
US20030129162A1 (en) * 2000-09-12 2003-07-10 Lau Allan S. Compositions comprising mixtures of therapeutic proteins and methods of producing the same
US20020150541A1 (en) * 2000-09-12 2002-10-17 Gene Trol Biotherapeutics, Inc. Compositions comprising mixtures of therapeutic proteins and methods of producing the same
WO2002067760A2 (en) 2001-01-09 2002-09-06 Baylor Research Institute Methods for treating autoimmune diseases in a subject and in vitro diagnostic assays
MXPA03008031A (es) 2001-03-07 2003-12-04 Merck Patent Gmbh Tecnologia de expresion para proteinas que contienen porcion de anticuerpo isotipo hibrida.
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
EP1390076A4 (en) * 2001-04-27 2004-12-15 Xcyte Therapies Inc Maturation of antigen-presenting cells with activated cells
CN100503639C (zh) 2001-05-03 2009-06-24 默克专利有限公司 重组肿瘤特异性抗体及其应用
US20030017529A1 (en) * 2001-06-27 2003-01-23 Applera Corporation Isolated human secreted proteins, nucleic acid molecules encoding human secreted proteins, and uses thereof
US7070996B2 (en) * 2001-08-31 2006-07-04 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Production of cultured human mast cells and basophils for high throughput small molecule drug discovery
AU2002363322A1 (en) * 2001-10-26 2003-05-19 Large Scale Biology Corporation Endothelial cell derived hemotopoietic growth factor
WO2003048334A2 (en) 2001-12-04 2003-06-12 Merck Patent Gmbh Immunocytokines with modulated selectivity
EP1487477A4 (en) * 2002-03-26 2006-07-19 Immunex Corp METHOD OF USE OF FLT3 LIGAND IN IMMUNIZATION PROTOCOLS
ES2557741T3 (es) 2002-03-27 2016-01-28 Immunex Corporation Procedimientos para incrementar la producción de polipéptidos
US20050058622A1 (en) * 2002-12-06 2005-03-17 Lyman Stewart D. Methods of using Flt3-Ligand in hematopoietic cell transplantation procedures incorporating nonmyeloablative conditioning regimens
ATE471946T1 (de) 2002-12-17 2010-07-15 Merck Patent Gmbh Humanisierter antikörper (h14.18) des maus antikörpers 14.18, der gd2 bindet und seine fusion mit il-2
US20050232926A1 (en) * 2003-06-06 2005-10-20 Oncomax Acquisition Corp. Antibodies specific for cancer associated antigen SM5-1 and uses thereof
US20040254108A1 (en) * 2003-06-13 2004-12-16 Jing Ma Preparation and application of anti-tumor bifunctional fusion proteins
US20050232931A1 (en) * 2003-06-13 2005-10-20 Oncomax Acquisition Corp. Preparation and application of anti-tumor bifunctional fusion proteins
CA2528595A1 (en) * 2003-06-13 2005-01-06 Oncomax Acquisition Corp. Preparation and application of anti-tumor bifunctional fusion proteins
EP1691852A2 (en) * 2003-11-10 2006-08-23 Angiotech International AG Medical implants and fibrosis-inducing agents
ES2616337T3 (es) 2003-12-12 2017-06-12 Government Of The United States Of America, As Repr. By The Secr. Of The Dept. Of Health And Human Services And His Successors Un epítopo de linfocito T citotóxico humano y su epítopo agonista del número no variable de secuencias de repetición en tándem de MUC-1
CA2551189A1 (en) * 2003-12-24 2005-07-07 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Therapeutic agents and uses therefor
JP2008502317A (ja) 2003-12-30 2008-01-31 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング Ｉｌ−７融合タンパク質
WO2005063808A1 (en) 2003-12-31 2005-07-14 Merck Patent Gmbh Fc-ERYTHROPOIETIN FUSION PROTEIN WITH IMPROVED PHARMACOKINETICS
AU2005206277B2 (en) * 2004-01-22 2011-06-23 Merck Patent Gmbh Anti-cancer antibodies with reduced complement fixation
CN100404683C (zh) * 2004-05-27 2008-07-23 中国医学科学院基础医学研究所 一种人fl多核苷酸及其与人gm-csf联合基因治疗恶性肿瘤的用途
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
CN1993460A (zh) * 2004-07-12 2007-07-04 索林集团意大利有限公司 用于培养人细胞的装置和方法
EP1786474B1 (en) * 2004-08-12 2011-06-01 Cedars-Sinai Medical Center Combined gene therapy for the treatment of macroscopic gliomas
ES2342964T3 (es) * 2004-12-09 2010-07-20 Merck Patent Gmbh Variantes de la interleucina-7 con inmunogenicidad reducida.
WO2006090882A1 (ja) * 2005-02-23 2006-08-31 Foundation For Biomedical Research And Innovation 血管内皮前駆細胞の生体外増幅方法
US20090050204A1 (en) * 2007-08-03 2009-02-26 Illuminex Corporation. Photovoltaic device using nanostructured material
US20070048254A1 (en) * 2005-08-24 2007-03-01 Mirus Bio Corporation Generation of dendritic cells
US7482165B2 (en) * 2005-08-24 2009-01-27 Beckman Coulter, Inc. Method of preventing white blood cell interferences to red blood cell measurements of a blood sample
ATE509954T1 (de) 2005-12-30 2011-06-15 Merck Patent Gmbh Anti-cd19-antikörper mit reduzierter immunogenität
ATE555125T1 (de) 2005-12-30 2012-05-15 Merck Patent Gmbh Interleukin-12p40-varianten mit verbesserter stabilität
MX2008011525A (es) * 2006-03-09 2008-09-18 Pharmacopeia Inc Inhibidores de mnk2 de 8-heteroarilpurina para el tratamiento de trastornos metabolicos.
US8921050B2 (en) 2006-03-17 2014-12-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of diagnosing renal cell carcinoma
WO2008095027A2 (en) * 2007-01-30 2008-08-07 Cedars-Sinai Medical Center Adenoviral vector comprising herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and a transgene for increasing the expression of the transgene
AR071891A1 (es) 2008-05-30 2010-07-21 Imclone Llc Anticuerpos humanos anti-flt3 (receptor tirosina cinasa 3 tipo fms humano)
US8834409B2 (en) 2008-07-29 2014-09-16 Covidien Lp Method for ablation volume determination and geometric reconstruction
WO2010047928A2 (en) * 2008-10-24 2010-04-29 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Methods and compositions for treatment of fibrosis
DE102008061522A1 (de) 2008-12-10 2010-06-17 Biontech Ag Verwendung von Flt3-Ligand zur Verstärkung von Immunreaktionen bei RNA-Immunisierung
KR101781966B1 (ko) 2009-04-17 2017-09-27 글로브이뮨 암에 대한 병용 면역요법 조성물 및 방법
EP2421896A1 (en) 2009-04-22 2012-02-29 Merck Patent GmbH Antibody fusion proteins with modified fcrn binding sites
JP6073135B2 (ja) * 2009-10-19 2017-02-01 トライステム・トレイディング・（キプロス）・リミテッドＴｒｉＳｔｅｍ Ｔｒａｄｉｎｇ （Ｃｙｐｒｕｓ） Ｌｉｍｉｔｅｄ 再プログラム化成熟成体細胞を用いる治療
DK2513311T4 (da) 2009-12-18 2021-06-14 Bavarian Nordic As Produktion af ifn-lambda ved hjælp af traditionelle dendritceller og anvendelser deraf
EP2601287B1 (en) 2010-08-05 2015-01-07 Amgen Inc. Dipeptides to enhance yield and viability from cell cultures
WO2012065755A1 (en) 2010-11-19 2012-05-24 Bavarian Nordic A/S Production of ifn-lambda by b cells
US9133493B2 (en) 2011-04-21 2015-09-15 Amgen Inc. Method for culturing mammalian cells to improve recombinant protein production
LT2837680T (lt) 2011-07-01 2020-07-10 Amgen Inc. Žinduolių ląstelių kultūra
BR112014004591A2 (pt) 2011-09-02 2017-03-28 Amgen Inc produto farmacêutico de análise da exposição à luz de um produto farmacêutico
AR089231A1 (es) 2011-12-15 2014-08-06 Amgen Inc Metodo de floculacion
EP2832851B1 (en) * 2012-03-28 2019-04-17 Quarrymen & Co. Inc. Immortalized stem cells and medicinal composition and medicinal preparation comprising product thereof as active ingredient
WO2014109858A1 (en) 2013-01-14 2014-07-17 Amgen Inc. Methods of using cell-cycle inhibitors to modulate one or more properties of a cell culture
US10023608B1 (en) 2013-03-13 2018-07-17 Amgen Inc. Protein purification methods to remove impurities
TWI625390B (zh) 2013-03-14 2018-06-01 安美基公司 用於增加重組蛋白質之甘露糖含量之方法
JP6457479B2 (ja) 2013-03-14 2019-01-23 アムジエン・インコーポレーテツド 漏出したアフィニティ精製リガンドの除去
US9481901B2 (en) 2013-05-30 2016-11-01 Amgen Inc. Methods for increasing mannose content of recombinant proteins
MX2016005572A (es) 2013-10-31 2016-12-09 Amgen Inc Uso de monensina para regular la glicosilacion de proteinas recombinantes.
BR122020004385B1 (pt) 2014-01-13 2022-10-04 Amgen Inc Método para aumentar o teor de glicoforma de alta manose de uma glicoproteína recombinante e método de produção de uma glicoproteína recombinante
US11384378B2 (en) 2014-06-04 2022-07-12 Amgen Inc. Methods for harvesting mammalian cell cultures
US11275090B2 (en) 2014-11-19 2022-03-15 Amgen Inc. Quantitation of glycan moiety in recombinant glycoproteins
SG11201704351WA (en) 2014-12-01 2017-06-29 Amgen Inc Process for manipulating the level of glycan content of a glycoprotein
WO2017218638A1 (en) * 2016-06-14 2017-12-21 Jianjun Chen Methods for treating subjects suffering from acute myeloid leukemia with flt3 ligand-targeted mir-150 nanoparticles
JP7146732B2 (ja) 2016-07-13 2022-10-04 オハイオ ステート イノベーション ファウンデーション 宿主抗原提示並びに宿主抗腫瘍及び抗病原体免疫を最適化するためのプラットフォーム及び方法
SG10202111394XA (en) 2017-04-13 2021-12-30 Senti Biosciences Inc Combinatorial cancer immunotherapy
CN112218651A (zh) 2018-01-08 2021-01-12 诺华公司 用于与嵌合抗原受体疗法组合的免疫增强rna
EP3743095A1 (en) 2018-01-26 2020-12-02 Celldex Therapeutics, Inc. Methods of treating cancer with dendritic cell mobilizing agents
SG11202007702UA (en) * 2018-02-14 2020-09-29 Viela Bio Inc Antibodies to feline mcdonough sarcoma (fms)-like tyrosine kinase 3 receptor ligand (flt3l) and uses thereof for treating autoimmune and inflammatory diseases
MX2020011614A (es) 2018-05-01 2020-12-09 Amgen Inc Anticuerpos con perfiles de glicanos modulados.
KR20210094534A (ko) 2018-10-17 2021-07-29 센티 바이오사이언시스, 인코포레이티드 병용 암 면역 요법
US11419898B2 (en) 2018-10-17 2022-08-23 Senti Biosciences, Inc. Combinatorial cancer immunotherapy
US20220177550A1 (en) * 2019-03-28 2022-06-09 Orionis Biosciences, Inc. Chimeric proteins and chimeric protein complexes directed to fms-like tyrosine kinase 3 (flt3)
CA3136626A1 (en) * 2019-04-12 2020-10-15 Emory University Compositions and methods for promoting hematopoietic cell cytotoxicity
CA3142513A1 (en) 2019-06-25 2020-12-30 Gilead Sciences, Inc. Flt3l-fc fusion proteins and methods of use
KR20230098201A (ko) * 2020-10-26 2023-07-03 네오이뮨텍, 인코퍼레이티드 줄기 세포 동원의 유도 방법
TW202313094A (zh) 2021-05-18 2023-04-01 美商基利科學股份有限公司 使用ＦＬＴ３Ｌ—Ｆｃ融合蛋白之方法
WO2023129974A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Generation of landing pad cell lines

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4745099A (en) * 1985-02-06 1988-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for the treatment of the anemia of malignant tumors
US5013824A (en) * 1985-11-19 1991-05-07 Schering Corporation Human interleukin-4 peptides and conjugates thereof
US5057420A (en) * 1987-06-05 1991-10-15 Granada Biosciences, Inc. Bovine nuclear transplantation
US5192553A (en) * 1987-11-12 1993-03-09 Biocyte Corporation Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use
JPH0611705B2 (ja) * 1988-02-10 1994-02-16 新技術事業団 血小板減少症治療剤
US5437994A (en) * 1989-06-15 1995-08-01 Regents Of The University Of Michigan Method for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells
US5635386A (en) * 1989-06-15 1997-06-03 The Regents Of The University Of Michigan Methods for regulating the specific lineages of cells produced in a human hematopoietic cell culture
US5399493A (en) * 1989-06-15 1995-03-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the optimization of human hematopoietic progenitor cell cultures
US5763266A (en) * 1989-06-15 1998-06-09 The Regents Of The University Of Michigan Methods, compositions and devices for maintaining and growing human stem and/or hematopoietics cells
US5326558A (en) * 1989-08-08 1994-07-05 Genetics Institute, Inc. Megakaryocytopoietic factor
US5061620A (en) * 1990-03-30 1991-10-29 Systemix, Inc. Human hematopoietic stem cell
US5185438A (en) * 1991-04-02 1993-02-09 The Trustees Of Princeton University Nucleic acids encoding hencatoporetic stem cell receptor flk-2
US5270458A (en) * 1991-04-02 1993-12-14 The Trustees Of Princeton University Nucleic acids encoding fragments of hematopoietic stem cell receptor flk-2
US5367057A (en) * 1991-04-02 1994-11-22 The Trustees Of Princeton University Tyrosine kinase receptor flk-2 and fragments thereof
CA2107897A1 (en) * 1991-04-09 1992-10-10 Ronald Hoffman System and process for supporting hematopoietic cells
US5199942A (en) * 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
DK0614485T3 (da) * 1991-10-23 2002-10-28 Nexell Therapeutics Inc Fremgangsmåde til selektiv formering af CD34 positive celler
CA2123094C (en) * 1991-11-06 1999-08-10 Paulo N. Correa Cell culture medium
US5453357A (en) * 1992-10-08 1995-09-26 Vanderbilt University Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same
NZ314644A (en) * 1993-05-24 2000-11-24 Immunex Corp Use of flt3-ligands as a growth stimulator of stem cells in the transplantation of tissue
US5554512A (en) * 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
US5525708A (en) * 1994-03-28 1996-06-11 Cytomed, Inc. Covalent dimer of kit ligand

Also Published As

Publication number Publication date
CA2162397A1 (en) 1994-12-08
KR100319359B1 (ko) 2002-07-31
JP4028594B2 (ja) 2007-12-26
JPH08511251A (ja) 1996-11-26
CN1123574C (zh) 2003-10-08
NO322373B1 (no) 2006-09-25
UA42726C2 (uk) 2001-11-15
WO1994028391A1 (en) 1994-12-08
NO954735D0 (no) 1995-11-23
NZ267541A (en) 1997-06-24
US5843423A (en) 1998-12-01
PL311756A1 (en) 1996-03-18
MY148148A (en) 2013-03-15
US5554512A (en) 1996-09-10
CA2162397C (en) 2007-04-03
FI955646A (fi) 1996-01-23
OA10716A (en) 2002-12-09
BR9407073A (pt) 1996-08-27
FI955646A0 (fi) 1995-11-23
CN1125479A (zh) 1996-06-26
AU683472B2 (en) 1997-11-13
US6919206B2 (en) 2005-07-19
AU6987794A (en) 1994-12-20
NO954735L (no) 1996-01-23
HU9503341D0 (en) 1996-01-29
US20030148516A1 (en) 2003-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT74831A (en) Ligands of flt3
US7041282B2 (en) Ligands for flt3 receptors
US20110053863A1 (en) Methods of using flt3-ligand in the treatment of cancer
US7374934B2 (en) Cell populations and methods of production thereof
US6190655B1 (en) Methods of using Flt-3 ligand for exogenous gene transfer
WO1997021802A9 (en) Novel embryonic cell populations and methods to isolate such populations
US7045128B2 (en) Antibodies against flt3-ligand
US6630143B1 (en) Antibodies against flt3 ligand
JP4251983B2 (ja) 造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持し得るポリペプチドおよびそれをコードするｄｎａ
Wermann et al. Human-mouse xenografts in stem cell research
RU2220979C2 (ru) ПОЛИПЕПТИД ЛИГАНДА flt3 (ВАРИАНТЫ), ПОЛИНУКЛЕОТИД(ВАРИАНТЫ), ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ ВЕКТОР(ВАРИАНТЫ), ЛИНИЯ КЛЕТОК СНО (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ПОЛИПЕПТИДА ЛИГАНДА flt3 (ВАРИАНТЫ), ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ (ВАРИАНТЫ)
MXPA94003806A (en) Ligands for receivers f
JPH08501451A (ja) 異種移植臓器移植片の事前適応化、その他を目的とする膜間転移によるタンパク質の供給法
Friend Identification of a novel growth factor and the role of thymic stroma in hematopoiesis

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary prot. cancelled due to non-payment of fee