CN1749276A

CN1749276A - 热休克蛋白65人上皮细胞生长因子受体2融合蛋白(hsp65－her2)

Info

Publication number: CN1749276A
Application number: CN 200410074742
Authority: CN
Inventors: 王丽颖; 向泽敏; 于永利
Original assignee: DIWEIHUAYU BIO-TECHNOLOGY Co Ltd BEIJING
Current assignee: DIWEIHUAYU BIO-TECHNOLOGY Co Ltd BEIJING
Priority date: 2004-09-14
Filing date: 2004-09-14
Publication date: 2006-03-22

Abstract

本发明提供了一种对表达人上皮细胞生长因子受体2(HER2)的肿瘤有预防和/或治疗作用的重组融合蛋白，该重组融合蛋白是将热休克蛋白65(heat shock protein 65，HSP65)的编码基因和人上皮细胞生长因子受体2(HER2)多表位抗原基因融合在一起，在大肠杆菌(E.coli)中表达的重组融合蛋白(HSP65－HER2)。该融合蛋白没有二硫键，不会以二聚体的形式表达而且MHC限制性范围扩大，覆盖的人群比例增加。本发明还提供了编码HSP65－HER2的碱基序列。

Description

热休克蛋白65-人上皮细胞生长因子受体2 融合蛋白(HSP65-HER2)

技术领域

本发明涉及一种重组融合蛋白，该重组融合蛋白是由热休克蛋白65(heat shock protein65，HSP65)和人上皮细胞生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor，HER2)多表位抗原多肽融合所构成(HSP65-HER2)，特别是涉及一种预防和或治疗人HER2阳性肿瘤的重组融合蛋白，该重组融合蛋白中不含有二硫键，所形成的融合蛋白以单体形式表达。本发明还涉及该重组融合蛋白的氨基酸序列及编码该重组融合蛋白的核苷酸序列。本发明还涉及含有上述基因的载体，含有上述基因和载体的宿主细胞、上述融合蛋白、基因、载体以及宿主细胞在制备用于治疗和/或预防人的HER2阳性肿瘤的药物和/或制剂中的应用、所述重组融合蛋白的生产方法。

背景技术

对于肿瘤的治疗，目前有手术疗法、化学疗法、放射疗法等。手术疗法对于多组织转移的患者来说，没有治疗意义。化学疗法由于化疗药物特异性较差而对正常细胞造成损害，放射疗法也存在同样的问题。为此，临床上需要一种特异性较强的药物，该药物能够区别肿瘤细胞和正常细胞，特异性地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞没有损害。免疫疗法治疗肿瘤就具有这样的特异性，免疫疗法治疗肿瘤的策略之一是通过激活体内针对肿瘤抗原的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)，被激活的CTL去杀伤表达此肿瘤抗原的肿瘤细胞。选择合适的肿瘤抗原是研制具有特异性CTL激活作用的生物制品的关键。

人上皮细胞生长因子受体2(HER2)是由定位于人的第17号染色体的q21的c-erbB-2基因所编码，是一种具有酪氨酸激酶的活性跨膜糖蛋白，和表皮生长因子受体有很高的同源性(Tadashi Yamamoto，et al.Similarity of protein encoded by the human c-erbB-2geneto epidermal growth factor receptor.Nature vol 31916 January 1986，230-234.)，因此也被称为human epidermal growth factor receptor 2，简称HER2。

约20％的卵巢癌患者的癌细胞高表达HER2。胃癌细胞、子宫内膜癌细胞、唾液腺癌细胞、腺癌细胞、前腺癌细胞、结肠和直肠癌细胞、非小细胞肺癌细胞也表达HER2。因此，针对HER2的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)都可能杀伤这些癌细胞，产生对上述肿瘤的治疗和或预防作用。

HER2的过度表达导致细胞侵袭性增加和对放疗的敏感性下降(Sartor CI，Biologicalmodifiers as potential radiosensitizers：targeting the epidermal growth factorreceptor family.Semin Oncol.2000 Dec，27(6 Suppl 11)：15-20；discussion 92-100.Review.)，这增加了手术后局部复发的可能性。在发生淋巴结转移和肿瘤细胞雌激素受体(ER)阴性的病人的肿瘤组织中更容易检出HER2的高表达的肿瘤细胞，且HER2高表达和ER的表达呈负相关关系。

HER2基因扩增已经成为肿瘤患者不良预后的判断指标。多种研究表明，HER2编码基因的扩增和过度表达可引起细胞的癌变。

以HER2为靶点可能研制出预防和治疗HER2阳性肿瘤的制剂。(HER2阳性肿瘤是指由表达HER2的肿瘤细胞形成的肿瘤)。

Wei WZ等证明，用突变的重组HER2蛋白免疫的小鼠可抑制表达HER2的小鼠乳腺癌细胞的生长( Wei WZ，Shi WP，Galy A，Lichlyter D，Hernandez S，Groner B，Heilbrun L，Jones RF.Protection against mammary tumor growth by vaccination with full-length，modifiedhuman ErbB-2 DNA.Int J Cancer.1999 May 31；81(5)：748-54.)。Dakappagari NK等证明，用含B细胞表位的HER2多肽免疫小鼠可抑制过度表达HER2的肿瘤细胞在其体内的生长(Dakappagari NK，Douglas DB，Triozzi PL，Stevens VC，Kaumaya PT Prevention of mammarytumors with a chimeric HER-2B-cell epitope peptide vaccine.Cancer Res.2000 Jul15；60(14)：3782-9.)。Foy TM等的研究表明用含有编码HER2全长或HER2亚单位的质粒以及蛋白免疫小鼠能使小鼠获得抵抗表达HER2肿瘤细胞攻击的能力(Foy TM，Bannink J，Sutherland RA，McNeill PD，Moulton GG，Smith J，Cheever MA，Grabstein K.Vaccinationwith Her-2/neu DNA or protein subunits protects against growth of aHer-2/neu-expressing murine tumor.Vaccine.2001Mar 21；19(17-19)：2598-606.)

用HER2蛋白抗原肽(VLRENTSPK)装载的树突状细胞体外免疫可诱导HER2蛋白特异性CTL，此CTL可杀伤表达HLA-A3和HER2的肿瘤细胞(Kawashima I，Tsai V，Southwood S，Takesako K，Sette A，Celis E.Identification of HLA-A3-restricted cytotoxic Tlymphocyte epitopes from carcinoembryonic antigen and HER-2/neu by primary in vitroimmunization with peptide-pulsed dendritic cells.Cancer Res.1999 Jan15；59(2)：431-5.)。HLA-A2限制性HER2蛋白抗原肽(IISAVVGIL)在结直肠癌患者也可诱生出HER2蛋白特异性的CTL(Scardino A，Gross DA，Alves P，Schultze JL，Graff-DuboisS，Faure O，Tourdot S，Chouaib S，Nadler LM，Lemonnier FA，Vonderheide RH，CardosoAA，Kosmatopoulos K.HER-2/neu and hTERT cryptic epitopes as novel targets for broadspeckrum tumor immunotherapy.J Immunol.2002 Jun 1；168(11)：5900-6.)。

STL是人体内杀伤肿瘤细胞最高效的免疫细胞。通常情况下，外源性的蛋白类肿瘤抗原在免疫人体后，主要进入MHC II类提呈途径，激发体液免疫反应(Heikema A，Agsteribbe E，Wilschut J，Huckriede A.Generation of heat shock protein-based vaccines byintracellular loading of gp96 with antigenic peptides.Immunol Lett.1997 Jun1；57(1-3)：69-74.)，但不能有效地激发肿瘤特异性的CTL的产生，因而不能产生有效的肿瘤预防和治疗作用。因此，赋予HER2多表位抗原激活特异性CTL的活性就成为研究以HER2多表位抗原为免疫原的具有预防和或治疗人HER2阳性肿瘤重组融合蛋白的关键。

热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是存在于多种生物体内的一个分子伴侣蛋白质家族，含有多种成员。在免疫应答的过程中，HSP可以协助外源性抗原物质进入包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞，并协助外源性抗原经过加工处理后进入MHC I类抗原提呈途径，进而激活抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)；同时热休克蛋白还能够刺激树突状细胞表面协同刺激分子的表达(如B7等)和细胞因子的分泌。

近年的研究表明，HSP可使与其结合的肿瘤抗原在抗原提呈细胞内和MHC I类分子结合并提呈在其表面，有效地激活肿瘤特异性CTL，激活的CTL去高效杀伤表达特异性肿瘤抗原的肿瘤细胞。注射从自体肿瘤提取的热休克蛋白-抗原肽复合物可抑制荷瘤小鼠原发肿瘤的生长、降低肿瘤的转移率，延长荷瘤小鼠的生存时间(Tamura Y，Peng P，Liu K，Daou M，Srivastava PK.Immunotherapy of tumors with autologous tumor-derived heat shockprotein preparations.Science.1997 Oct 3；278(5335)：117-20.Erratum in：Science 1999Feb 19；283(5405)：preceding 1119.)。

综上所述，将HSP65基因和HER2多表位抗原多肽基因融合后构成的融合基因所表达出的融合蛋白可在机体内特异性地激活针对表达HER2肿瘤抗原的肿瘤细胞的CTL，激活的CTL去杀伤表达HER2肿瘤抗原的肿瘤细胞，达到清除体内HER2阳性肿瘤细胞的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组融合蛋白，其包含热休克蛋白65(HSP65)和人HER2多表位抗原多肽。

本发明所述融合蛋白包括HSP65和HER2多表位抗原多肽，其中，HER2多表位抗原多肽包含具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列的肽段。其中HER2多表位抗原多肽基因由序列为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，和SEQ ID NO：4所示的多肽的编码基因以随机组合的方式融合而成；所谓的随机组合是指本发明中的HER2多表位抗原多肽的序列可以是单独的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列的肽段所组成，也可以是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4所示的序列的肽段相互连接所组成，具体的连接方式，如：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4，SEQ ID 1-SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：1-S SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：3-SEQ IDNO：2-SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3-SEQID NO：4-SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2。优选地，本发明提供的HER2多表位抗原多肽基因是由序列为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的多肽的编码基因按阿拉伯数字的顺序连接而形成的。上述序列中去除了半胱氨酸的密码子。

本发明的重组融合蛋白HSP65-HER2，其中，HSP65位于该融合蛋白的氨基端，HER2多表位抗原位于该融合蛋白的羧基端。优选地，本申请的HSP65具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选地，本发明的重组融合蛋白HSP65-HER2具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种编码重组融合蛋白(HSP65-HER2)的基因。优选地，该基因具有SEQID NO：5所示的核苷酸序列。

HER2多表位抗原多肽是由多个人HER2分子中的抗原表位相互连接形成的多肽，由HER2分子上的4个肽段组成，其中去除了半胱氨酸的密码子，序列可以如SEQ ID NO：8所示，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：20，为了在真核细胞中表达，以SEQ ID NO：20为模板，经PCR获得了另一个编码HER2多表位抗原的基因SEQ ID NO：25。

一个CTL表位可由8-9个氨基酸残基组成，因而SEQ ID NO：8所示的HER2蛋白多表位抗原可含有多个CTL表位。HER2多表位抗原SEQ ID NO：8包含HER2的4个肽段，它们的序列分别是：

SEQ ID NO.1：

氨基端Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu Gly Ile SerLeu Shr Glu Glu羧基端

SEQ ID NO.2：

氨基端Gln Glu Phe Ala Gly Ser Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe AspGly As Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile羧基端

SEQ ID NO.3：

氨基端Val Ala Ile Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu羧基端

SEQ ID NO.4：

氨基端Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly羧基端研究表明，在上述4个肽段中含有多个HLAI类分子限制性且能够被特异性CTL识别的表位(Elissa Keogh，John Fikes，Scott Southwood，et al.Identification of New Epitopesfrom Four Different Tumor-Associated Antigens：Recognition of Naturally ProcessedEpitcpes Correlates with HLA-Ap0201-Binding Affinity.The Journal of Immunology，2001，167：787-796；Ichiro Kawashima，Stephen J.Hudson，et al.The Multi-epitopeApprcach For Immunotherapy for Cancer：Identifyication of Several CTL Epitopes fromVar：ous Tumor-Associated Antigens Expressed on Solid Epithetlial Tumors.HumanImmuneology 1998，59：1-14；Ikuta Y，Okugawa T，et al.A HER2/NEU-derived peptide，aK(d)-restricted murine tumor rejection antigen，induces HER2-specificHLA-A2402-restricted CD8(+)cytotoxic T lymphocytes.Int J Cancer.2000Aug15；87(4)：553-8.)。上述的四个肽段以随机组合的方式相互连接在一起构成的任何一个HER2多表位抗原多肽被定义为一个拷贝的HER2多表位抗原多肽。我们将这四个肽段的编码基因以随机组合的方式相连接在一起所生成的任何一种新的基因，定义为HER2多表位抗原基因，该基因编码的多肽即为HER2多表位抗原多肽。HER2多表位抗原基因进行人工点突变或以插入、在两侧连接其它序列的方式进行改造所得的基因表达后形成的多肽也可能具有预防和或治疗HER2阳性肿瘤的作用。将HER2多表位抗原和热休克蛋白65融合形成的重组融合蛋白，在进入人体后可激活针对表达HER2的肿瘤细胞的CTL，因而对HER2阳性肿瘤有预防和或治疗的作用。该重组融合蛋白可用于治疗下列肿瘤，但并不局限于此：乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、腺癌、前腺癌、结肠和直肠癌、非小细胞肺癌、肺腺癌等。与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：8以及SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：25具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％同源性的核苷酸序列或氨基酸序列，或在核酸杂交条件下(J.Sambrook，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)与上述核苷酸序列或上述氨基酸序列的编码核苷酸序列杂交的核苷酸序列，或上述序列人工点突变或以插入、在两侧连接其它序列的方式进行改造所得的序列也可与上述序列起到等同的作用。

热休克蛋白65(HSP65)是一种来源于卡介苗的蛋白质，它在和HER2多表位抗原形成融合蛋白后，可以协助HER2多表位抗原进入包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞，并协助HER2多表位抗原进入MHCI类抗原加工提呈途径，进而激活HER2特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，对表达HER2的肿瘤细胞进行攻击和杀伤。此外，热休克蛋白65还可刺激包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞表达协同刺激分子(如B7等)和细胞因子的分泌，这些协同刺激分子(如B7等)和细胞因子可协助激活CTL。

本申请首先从卡介苗中用PCR方法获取了HSP65的编码基因，将该基因与pEPT28a载体连接构建了表达HSP65基因的表达载体pET28a-HSP65。根据HER2分子上的4个肽段SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的编码核苷酸序列设计引物，通过四轮PCR反应合成了HER2蛋白多表位抗原多肽基因(SEQ ID NO：20)。将HER2蛋白多表位抗原多肽基因(SEQ ID NO：20)经限制性内切酶消化后与pET28a-HSP65融合，形成pET28a-HSP65-HER2，在大肠杆菌中表达，并进一步纯化得到重组融合蛋白(HSP65-HER2)(SEQ ID NO：6，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：5)。HSP65-HER2在大肠杆菌中的表达量比HSP65-HER2-ME(申请号为01136347.9的中国专利申请文件中的SEQ ID NO：6)高，且HSP65-HER2蛋白中不含有二硫键，不会以二聚体形式表达，容易纯化；在HSP65-HER2中，增加了由MHC限制性的表位，因而增加了HSP65-HER2的适应人群。

为了获得稳定表达HER2多表位抗原基因的B16(C57BL/6小鼠黑色素瘤细胞系)细胞株，以序列为SEQ ID NO：20的DNA片段为模板进行PCR得到序列为SEQ ID NO：25的DNA片段，其经限制性内切酶消化后与真核表达载体pcDNA3连接，得到pcDNA3-HER2质粒，用上述质粒转染B16细胞株，即得到稳定表达HER2多表位抗原多肽基因的B16(C57BL/6小鼠黑色素瘤细胞系)细胞株。

用HSP65-HER2融合蛋白免疫小鼠，以PBS为对照，免疫后，分离小鼠的淋巴细胞，体外培养，并用HSP65-HER2融合蛋白刺激2-3次，分别以B16细胞、pcDNA3稳定转染的B16细胞、pcDNA3-HER2稳定转染的B16细胞为靶细胞与上述效应淋巴细胞共孵育，进行杀伤实验，结果表明，HSP65-HER2融合蛋白能够在小鼠中诱生HER2特异性的CTL而PBS不能，且这种诱生的CTL只能特异性地杀伤表达HER2多表位抗原多肽的肿瘤细胞而不能杀伤不表达HER2多表位抗原多肽的肿瘤细胞。

用HSP65-HER2融合蛋白免疫小鼠，以PBS为对照，免疫后分别给小鼠注射用pcDNA3-HER2稳定转染的B16细胞和pcDNA3稳定转染的B16细胞，结果表明，重组融合蛋白HSP65-HER2免疫的小鼠只能特异性地抑制其体内转染HER2多表位抗原多肽基因的肿瘤细胞的生长。

给小鼠分别注射用pcDNA3-HER2稳定转染的B16细胞和pcDNA3稳定转染的B16细胞，然后再注射PBS或HSP65-HER2融合蛋白，结果表明，注射转染HER2多表位抗原多肽基因肿瘤细胞的小鼠接受重组HSP65-HER2融合蛋白后其体内肿瘤细胞的生长受到特异性抑制。

分离人外周血单核细胞，诱导其形成未成熟的树突状细胞，用重组融合蛋白HSP65-HER2装载树突状细胞，自人的外周血分离CD8⁺T细胞，用装载HSP65-HER2的树突状细胞刺激CD8⁺细胞，收获HER2特异性的CD8⁺T细胞，该细胞能够杀伤表达HER2多表位抗原多肽的肿瘤细胞，而不能杀伤不含有该抗原的肿瘤细胞。即重组融合蛋白HSP65-HER2在体外能够诱生HER2多表位特异性的CTL。

进一步实验表明，重组融合蛋白HSP65-HER2在体外能够诱生HLA-A24限制性的CTL，而HEP65-HER2-ME则不能。

本发明的另一个目的是提供一种编码本发明重组融合蛋白的基因、含有上述基因的载体，含有上述基因和载体的宿主细胞。所述载体可以是pET28a、pcDNA3或其它可用于融合蛋白表达的真核或原核载体，所述宿主细胞可以是大肠杆菌(BL21DE3)、B16细胞，或其它可以表达融合蛋白的原核细胞、真核细胞，例如细菌、真菌或哺乳动物细胞。

本发明的另一个目的是提供上述融合蛋白、基因、载体以及宿主细胞在制备用于治疗和/或预防人的HER2阳性肿瘤的药物和/或试剂中的应用。

本发明的重组融合蛋白可通过已知的方法进行生产，例如，可以在合适条件下培养包含编码所述重组蛋白的基因的宿主细胞，并回收所需的重组融合蛋白。

附图说明

图1：热休克蛋白65(HSP65)编码基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图

泳道1：分子量标尺(Takara)2000bp；1000bp；750bp；500bp

泳道2：热休克蛋白65(HSP65)编码基因的PCR产物(1638bp)，如箭头所示

图2：HER2多表位抗原基因的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图

泳道1：分子量标尺(Takara)2000bp；1000bp；750bp；500bp；250bp；100bp。

泳道2：HER2多表位抗原基因的PCR产物(321bp)，如箭头所示

图3：重组质粒pET28a-HSP65-HER2用EcoR1和HindIII酶切后的琼脂糖凝胶电泳鉴定图

泳道1：经EcoR1和HindIII酶切后，得到的HER2多表位抗原基因片段(315bp)

泳道2：分子量标尺(Takara)2000bp；1000bp；750bp；500bp；250bp；100bp

图4：HSP65-HRE2重组融合蛋白的表达

泳道1：诱导前的HSP65-HER2-ME

泳道2：诱导后的HSP65-HER2-ME

泳道3：诱导前的HSP65-HER2

泳道4：诱导后的HSP65-HER2

泳道5：分子量标尺(Takara)97KD，66KD，45KD，30KD，20.1KD，14.4KD

图5：纯化后的HSP65-HER2-ME和HSP65-HER2的SDS-PAGE电泳图

泳道1：纯化后的HSP65-HER2-ME

泳道3：蛋白质分子量标尺97KD，66KD，45KD，30KD，20.1KD

泳道4：蛋白质分子量标尺97KD，66KD，45KD，30KD，20.1KD

泳道6：纯化后HSP65-HER2

图6：重组质粒pcDNA3-HER2用BamH1和Not1酶切鉴定图

泳道1：重组质粒pcDNA3-HER2用BamH1和Not1消化后释放出的333bp的HER2片段

图7：重组融合蛋白HSP65-HER2在小鼠HER2特异性杀伤性T淋巴细胞诱生

用5μg HSP65-HER2重组融合蛋白免疫小鼠，靶细胞为pcDNA3-HER2稳定转染的B16细胞

用5μg HSP65-HER2重组融合蛋白免疫小鼠，靶细胞为用pcDNA3稳定转染的B16细胞

用5μg HSP65-HER2重组融合蛋白免疫小鼠，靶细胞为B16细胞

注射PBS小鼠，靶细胞为pcDNA3-HER2稳定转染的B16细胞

注射PBS小鼠，靶细胞用pcDNA3稳定转染的B16细胞

注射PBS小鼠，靶细胞B16细胞

图8：重组融合蛋白HSP65-HER2在小鼠对HER2阳性肿瘤细胞的抑制作用

A HSP65-HER2免疫，肿瘤细胞为pcDNA3-HER2稳定转染的B16细胞组小鼠肿瘤大小及数量

B PBS注射，肿瘤细胞为pcDNA3-HER2稳定转染的B16细胞组小鼠肿瘤大小及数量

C HSP65-HER2免疫，肿瘤细胞为pcDNA3稳定转染的B16细胞小鼠的肿瘤大小及数量

图9：注射肿瘤细胞后重组融合蛋白HSP65-HER2对HER2阳性肿瘤细胞的抑制作用

A接种pcDNA3-HER2稳定转染的B16细胞后，HSP65-HER2免疫组小鼠肿瘤大小及数量

B接种pcDNA3-HER2稳定转染的B16细胞后，PBS注射组小鼠肿瘤大小及数量

C接种pcDNA3稳定转染的B16细胞后，HSP65-HER2免疫小鼠肿瘤大小及数量

图10：重组融合蛋白HSP65-HER2人体外HER2特异性CTL的诱生

图11：重组融合蛋白HSP65-HER2在体外HLA-A24限制性CTL的诱生

具体实施方式

本申请是通过下述方式实现的，但是具体的实施方式仅仅是对本发明的解释，而不应当理解为一种限制。

实施例1获取热休克蛋白65(HSP65)的编码基因

1.卡介苗：来源于长春生物制品研究所。采用苏通马铃薯培养基培养卡介苗，培养的温度为37-39℃，生长出的卡介苗呈现干皱浅黄色的菌膜。收集菌膜。

2.提取卡介苗基因组DNA：：方法参照Molecular Cloning一书(Joseph.Sambrook，David W.Russell.用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物细胞中分离高分子质量DNA。Molecularcloning：A Laboratory Manual，3^rd ed.463-470，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)，从上步收集的菌膜中提取卡介苗基因组DNA。

3.分离HSP65结构基因：采用PCR方法自卡介苗分离HSP65结构基因。采用的5’端引物序列为5’CCATG GCC AAG ACA ATT GCG3’(SEQ ID NO：21)；3’端引物序列为5’ACCGAA TTC GCT AGC CAT ATG GAA ATC CAT GCC ACC CAT 3’(SEQ ID NO：22)。

PCR操作程序

在500μl微量离心管中加入下列试剂：

模板cDNA(mmol/L) 5μl

10×PCR缓冲液(含氯化镁) 5μl

dNTPs(10mmol/L) 1μl

5’端和3’端引物(0.01mmol/L) 各0.5μl

Taq DNA聚合酶(5u/μl) 0.25μl

去离子水加至终体积为50μl

混合后加入矿物油 3滴

反应条件：94℃，30″；55℃，1’；72℃，2’，30个循环周期后，72℃延伸10min

4.克隆PCR产物：采用TA克隆方法。方法见TA连接试剂盒(Promega)按常规方法

(Joseph.Sambrook，David W.Russell.SDS碱裂解法制备质粒DNA，Molecularcloning：A Laboratory Manual，3^rd ed.27-30，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2001)提取质粒，采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行序列测定(ABIPrism310^TM，USA)。

获得的卡介苗(BCG)HSP65基因的序列为：

5’ATGGCCAAGA CAATTGCGTA CGACGAAGAG GCCCGTCGCG GCCTCGAGCG 50

GGGCTTGAAC GCCCTCGCCG ATGCGGTAAA GGTGACATTG GGCCCCAAGG 100

GGCGCAACGT CGTCCTGGAA AAGAAGTGGG GTGCCCCCAC GATCACCAAC 150

GATGGTGTGT CCATCGCCAA GGAGATCGAG CTGGAGGATC CGTACGAGAA 200

GATCGGCGCC GAGCTGGTCA AAGAGGTAGC CAAGAAGACC GATGACGTCG 250

CGGGTGACGG CACCACGACG GCCACCGTGC TGGCCCAGGC GTTGGTTCGC 300

GAGGGCCTGC GCAACGTCGC GGCCGGCGCC AACCCGCTCG GTCTCAAACG 350

CGGCATCGAA AAGGCCGTGG AGAAGGTCAC CGAGACCCTG CTCAAGGGCG 400

CCAAGGAGGT CGAGACCAAG GAGCAGATTG CGGCCACCGC AGCGATTTCG 450

GGGGGTGACC AGTCCATCGG TGACCTGATC GCCGAGGCGA TGGACAAGGT 500

GGGCAACGAG GGCGTCATCA CCGTCGAGGA GTCCAACACC TTTGGGCTGC 550

AGCTCGAGCT CACCGAGGGT ATGCGGTTCG ACAAGGGCTA CATCTCGGGG 600

TACTTCGTGA CCGACCCGGA GCGTCAGGAG GCGGTCCTGG AGGACCCCTA 650

CATCCTGCTG GTCAGCTCCA AGGTGTCCAC TGTCAAGGAT CTGCTGCCGC 700

TGCTCGAGAA GGTCATCGGA GCCGGTAAGC CGCTGCTGAT CATCGCCGAG 750

GACGTCGAGG GCGAGGCGCT GTCCACCCTG GTCGTCAACA AGATCCGCGG 800

CACCTTCAAG TCGGTGGCGG TCAAGGCTCC CGGCTTCGGC GACCGCCGCA 850

AGGCGATGCT GCAGGATATG GCCATTCTCA CCGGTGGTCA GGTGATCAGC 900

GAAGAGGTCG GCCTGACGCT GGAGAACGCC GACCTGTCGC TGCTAGGCAA 950

GGCCCGCAAG GTCGTGGTCA CCAAGGACGA GACCACCATC GTCGAGGGCG 1000

CCGGTGACAC CGACGCCATC GCCGGACGAG TGGCCCAGAT CCGCCAGGAG 1050

ATCGAGAACA GCGACTCCGA CTACGACCGT GAGAAGCTGC AGGAGCGGCT 1100

GGCCAAGCTG GCCGGTGGTG TCGCGGTCAT CAAGGCCGGT GCCGCCACCG 1150

ACGTCGAACT CAAGGAGCGC AAGCACCGCA TCGAGGATGC GGTTCGCAAT 1200

GCCAAGGCCG CCGTCGAGGA GGGCATCGTC GCCGGTGGGG GTGTGACGCT 1250

GTTGCAAGCG GCCCCGACCC TGGACGAGCT GAAGCTCGAA GGCGACGAGG 1300

CGACCGGCGC CAACATCGTG AAGGTGGCGC TGGAGGCCCC GCTGAAGCAG 1350

ATCGCCTTCA ACTCCGGGCT GGAGCCGGGC GTGGTGGCCG AGAAGGTGCG 1400

CAACCTGCCG GCTGGCCACG GACTGAACGC TCAGACCGGT GTCTACGAGG 1450

ATCTGCTCGC TGCCGGCGTT GCTGACCCGG TCAAGGTGAC CCGTTCGGCG 1500

CTGCAGAATG CGGCGTCCAT CGCGGGGCTG TTCCTGACCA CCGAGGCCGT 1550

CGTTGCCGAC AAGCCGGAAA AGGAGAAGGC TTCCGTTCCC GGTGGCGGCG 1600

ACATGGGTGG CATGGATTTC CATATGGCTA GCGAATTC 3’

用PCR得到的HSP65基因琼脂糖凝胶电泳见图1，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：7。

实施例2合成HER2蛋白多表位抗原基因

根据SEQ ID NO：1、2、3、4的氨基酸序列设计引物，用四轮PCR合成HER2蛋白多表位抗原基因

1.第一轮PCR：下列两条引物互为模板

引物1的序列为：

5’CTCTCGCATTCCTGCCAGAATCTTTTGACGGCGACCCGGCATCT AATACCGCACCGCTTCA 3’(SEQ IDNO：9)

引物1’的序列为：

5’CAACGATTTCTTCCAGAGTCTCAAATACTTGCAGTTGTTCCGGT TGAAGCGGTGCGGTATT 3’(SEQ IDNO：10)

第一轮PCR合成的产物的序列是：

5’CTCTCGCATTCCTGCCAGAATCTTTTGACGGCGACCCGGCATCTAATACCGCACCGCTTCAACCGGAACA

ACTGCAAGTATTTGAGACTCTGGAAGAAATCGTTG 3’(SEQ ID NO：11)

2.第二轮PCR：以第一轮PCR的产物为模板

引物2的序列是：

5’CTGACCGAGGAGCAGGAGTTCGCAGGTTCTAAAAAAATCTTCGGCT CTCTCGCATTCCTGC 3’(SEQ IDNO：12)

引物2’的序列是

5’CTTTGTTAGCTTTCGGGGAGGTGTTTTCACGCAGAACCTTGATAG CAACGATTTCTTCCA 3’(SEQ IDNO：13)

产物的序列是：

5’CTGACCGAGGAGCAGGAGTTCGCAGGTTCTAAAAAAATCTTCGGCTCTCTCGCATTCCTGCCAGAATCTTTT

GACGGCGACCCGGCATCTAATACCGCACCGCTTCAACCGGAACAACTGCAAGTATTTGAGACTCTGGAAGAA

ATCGTTGCTATCAAGGTTCTGCGTGAAAACACCTCCCCGAAAGCTAACAAAG3’(SEQ ID NO：14)

3.第三轮PCR：以第二轮PCR的产物为模板

引物3的序列是：

5’GGTGTTGGTTCCCCGTACGTTTCCCGTCTGCTGGGTATTTCC CTGACCGAGGAGCAG3’(SEQ ID NO：15)

引物3’的序列是：

5’AGTCAGAGAGTAAGCACCGTTGTGCAGAATACGACCACGTT CTTTGTTAGCTTTCG3’(SEQ ID NO：16)

产物的序列是：

5’GGTGTTGGTTCCCCGTACGTTTCCCGTCTGCTGGGTATTTCCCTGACCGAGGAGCAGGAGTTCGCAGGTTCT

AAAAAAATCTTCGGCTCTCTCGCATTCCTGCCAGAATCTTTTGACGGCGACCCGGCATCTAATACCGCACCG

CTTCAACCGGAACAACTGCAAGTATTTGAGACTCTGGAAGAAATCGTTGCTATCAAGGTTCTGCGTGAAAAC

ACCTCCCCGAAAGCTAACAAAGAACGTGGTCGTATTCTGCACAACGGTGCTTACTCTCTGACT3’(SEQ IDNO：17)

4.第四轮PCR：以第三轮PCR的产物为模板

引物4的序列是：

5’GAATTCGACGAAGCATACGTTATGGCT GGTGTTGGTTCCCCG 3’(SEQ ID NO：18)

引物4’的序列是

5’AAGCTTACCTTGCAG AGTCAGAGAGTAAGC3’(SEQ ID NO：19)

产物的序列是：

5’GAATTCGACGAAGCATACGTTATGGCTGGTGTTGGTTCCCCGTACGTTTCCCGTCTGCTGGGTATTTCCC

TGACCGAGGAGCAGGAGTTCGCAGGTTCTAAAAAAATCTTCGGCTCTCTCGCATTCCTGCCAGAATCTTT

TGACGGCGACCCGGCATCTAATACCGCACCGCTTCAACCGGAACAACTGCAAGTATTTGAGACTCTGGAA

GAAATCGTTGCTATCAAGGTTCTGCGTGAAAACACCTCCCCGAAAGCTAACAAAGAACGTGGTCGTATTC

TGCACAACGGTGCTTACTCTCTGACTCTGCAAGGTAAGCTT3’(SEQ ID NO：20)。

此序列代表的是HER2多表位抗原基因，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：8。

PCR的反应条件为：94℃，30″；55℃，1’；72℃，1’，30个循环周期后，72℃延伸10min。

用PCR获得的HER2多表位抗原基因的琼脂糖凝胶电泳见图2。

实施例3构建表达HSP65基因的表达载体(pET28a-HSP65)

将热休克蛋白65(HSP65)的编码基因和pET28a(Invitrogen)载体分别用NcoI、EcoRI消化，37℃，2h。采用琼脂糖凝胶电泳分离消化产物。电泳的条件是：1％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，150-200mA，电泳0.5-1h。

20×TAE缓冲液：0.8mol/L Tris base

0.4mol/L NaOAc

0.04mol/L Na2EDTA

用冰醋酸调pH 8.3。

在紫外灯下观察并分别切下琼脂糖凝胶上的1.6Kb和5.5KbDNA电泳带处的凝胶。将含DNA的琼脂糖凝胶，置-70℃冷冻15min，然后在65℃水浴中使胶融化；加入等倍体积TE-饱合酚，剧烈振荡30秒，然后-70℃冷冻15min；室温融化后，12,000r/min离心5min，将上层液相移至另一管中，用2-2.5倍乙醇沉淀、洗涤和干燥DNA。

将经NcoI、EcoRI消化的热休克蛋白65(HSP65)的编码基因和pET28a载体用连接酶连接。

连接反应：

HSP65基因(0.5μg/μl) 2μl

pET28a载体(50ng/μl) 2μl

10×连接缓冲液(Takara) 1μl

T4DNA连接酶 1μl

双蒸水加至体积为10μl

混合后置14-16℃水浴6-12h。

实施例4HSP65和HER2多表位抗原基因融合基因(pET28a-HSP65-HER2)的构建

1.在37℃，用EcoRI和HindIII分别消化HER2多表位抗原基因和插入了HSP65基因的pET 28a载体(pET28a-HSP65)两小时。消化产物经琼脂糖凝胶电泳分离。电泳的条件是：1％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，150-200mA，电泳0.5-1h。20×TAE缓冲液：0.8mol/L Trisbase 0.4mol/L NaOAc 0.04mol/L Na2EDTA用冰醋酸调pH 8.3。

在紫外灯下观察并切下琼脂糖凝胶上的315bp、7.1Kb大小DNA电泳带的凝胶。将含DNA区带的琼脂糖凝胶，置-70℃冷冻15min，然后在65℃水浴中使胶融化；加入等倍体积TE-饱合酚，剧烈振荡30sec，然后-70℃冷冻15min；室温融化后，1200r/min离心5min，将上层液相移至另一管中，用2-2.5倍乙醇沉淀、洗涤和干燥DNA。

2.连接反应：

质粒DNA(pET28a-HSP65)(0.5μg/μl) 2μl

HER2多表位抗原基因(300ng/μl) 5μl

10×连接缓冲液(Takara) 1μl

T4DNA连接酶 1μl

双蒸水调节体积至10μl

混合后置14-16℃水浴6-12h

3.将含HSP65-HER2融合基因的重组质粒pET28a(+)-HSP65-HER2转化E.colil).感受态细胞的制备：

a、将E.coli在LB琼脂培养基上划线，37℃培养12-16h；

b、次日从琼脂平板上取一单菌落于5ml LB培养基中，37℃以225rpm/min速度震荡培养12-16h；

c、取1ml上述培养物接种于100ml LB培养基中，37℃以225rpm/min的速度震荡培养直至OD值为0.5左右(大约3h)；

d、将菌液冰浴2h，然后2,500g，4℃离心20min收集菌体；

e、加入100ml冰冷的Trituration缓冲液(100mmol/LCaCl₂，70mmol/L MgCl₂，40mmol/L醋酸钠，pH5.5)，混匀，置冰上45min；

f、1,800g，4℃离心10min，弃上清，加入10ml冰冷的Trituration缓冲液悬浮细胞；

g、按每份200μl分装，4℃可保存1-2周。若需长期保存，可加甘油至终浓度为15％，置-70℃备用。

2).转化试验：

a、将200μl感受态细胞置冰上融化，然后加入3μl DMSO或β-巯基乙醇，混合后，加入3-5μl连接反应液(含重组质粒)，温和混匀，置冰上30min。

b、42℃45sec，然后迅速放回冰中1-2min。

c、加入2ml LB培养液，37℃以225rpm/min的速度摇荡培养1h。

d、4,000g离心10sec，弃上清，用200μl LB培养液重悬菌体。

e、将菌液铺于含有卡那霉素30-50μg的LB琼脂培养板上，涂匀，室温放置20-30min，倒置于37℃孵箱中培养12-16h。用限制性内切酶消化的方法鉴定重组克隆。

f、质粒和菌株的保存：质粒冰冻保存于-20℃。菌株在含20％-50％甘油培养液中保存于-20℃或-70℃。

4.HSP65和人HER2多表位抗原基因融合构成的融合基因的测序

按照常规提取质粒的方法(Joseph.Sambrook，David W.Russell.SDS碱裂解法制备质粒DNA，Molecular cloning：A Laboratory Manual，3^rd ed.27-30，Cold Spring HarborLaboratory Press，2001)，得到含有HSP65-HER2基因的质粒，用测序仪(ABIPrism310^TM，USA)测定HSP65-HER2的基因序列，结果表明，所得到的HSP65-HER2融合基因和本发明设计的HSP65-HER2基因序列完全一致。

pET28a-HSP65-HER2酶切鉴定结果见图3。

实施例5HSP65-HER2重组融合蛋白的表达

挑取含有重组质粒pET28a-HSP65-HER2的表达菌BL21DE3(Novagen，America)单菌落接种于含有50ml LB培养基的250ml三角烧瓶中，37℃水浴震荡培养至OD600值为0.6。加入IPTG使其终浓度为0.4mM，37℃水浴震荡培养2-3h。将含有表达菌的三角烧瓶置于冰上5min，4℃离心5min(5000xg)。吸弃上清，收集细菌，立即使用或冻存。

用同样方法诱导含有pET28a-HSP65-HER2-ME重组质粒的表达菌BL21 DE3(Novagen，America)进行表达。

分别取上述两种表达菌诱导前及诱导后的等量样品进行SDS-PAGE。

重组融合蛋白HSP65-HER2和HSP65-HER2-ME表达量比较的SDS-PAGE鉴定见图4。

实施例6重组融合蛋白HSP65-HER2的纯化

重组融合蛋白HSP65-HER2和HSP65-HER2-ME用同样的方法进行纯化。

1、裂菌

使用溶液A(50mM NaCl、20mM醋酸钠pH6.0)

重悬发酵菌体，超声波裂菌，离心收集上清。

2、离子交换层析

层析填料：Q Sepharose XL(Pharmingen，USA)

溶液A：50mM NaCl、20mM醋酸钠pH6.0

溶液B：20mM醋酸钠、1M NaCl pH6.0

样品：超声裂菌上清

步骤：使用溶液A平衡Q Sepharose XL介质，样品上样后，使用溶液B0-100％线性梯度洗脱收集目标蛋白所在洗脱峰作为下一步疏水层析样品。

三、疏水层析

层析填料：Phenyl Sepharose FF(Pharmingen)

溶液C：1.5M NaCl、20mMTris pH7.9

溶液D：20mM Tris pH7.9

样品：离子交换层析洗脱样品(经透析后更换缓冲液为溶液C)

步骤：用溶液C平衡疏水介质(Phenyl SFF)，样品上样，溶液D 35％-100％进行线性梯度洗脱，收集目标蛋白所在洗脱峰。

4、DEAE离子交换去除内毒素

层析填料：DEAE Sepharose FF(Pharmingen)

溶液E：100mM NaCl、20mM Tris、pH7.0

溶液F：1.5M NaCl、20mM Tris、pH7.0

样品：疏水层析洗脱样品

步骤：用溶液E平衡介质(DEAE SFF)，溶液F进行梯度洗脱，收集洗脱峰。洗脱样品使用G25除盐并更换缓冲液为PBS。

样品进行脱盐后即得到重组融合蛋白HSP65-HER2，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：5，氨基酸序列为SEQ ID NO：6。

重组融合蛋白HSP65-HER2和HSP65-HER2-ME纯化后的单体和二聚体SDS-PAGE见图5。

实施例7获得稳定表达HER2多表位抗原基因的B16(C57BL/6小鼠黑色素瘤细胞系)细胞株

1.用PCR方法获得多聚HER2多表位基因的序列

以SEQ ID NO：20的DNA片段为模板，进行PCR反应：

引物5的序列为：

5’CTGCAGGATCCATGGACGAAGCATACGTTATGGC3’(SEQ ID NO：23)

引物5’的序列为：

5’GCGGCCGCAAGCTTAAGATCTACCTTGCAGAGTCAGAGAGTAA 3’(SEQ ID NO：24)

得到产物DNA的序列为：

5’CTGCAGGATCCATGGACGAAGCATACGTTATGGCTGGTGTTGGTTCCCCGTACGTTTCCCGTCTGCTGGGT

ATTTCCCTGACCGAGGAGCAGGAGTTCGCAGGTTCTAAAAAAATCTTCGGCTCTCTCGCATTCCTGCCAGAATC

TTTTGACGGCGACCCGGCATCTAATACCGCACCGCTTCAACCGGAACAACTGCAAGTATTTGAGACTCTGGAAG

AAATCGTTGCTATCAAGGTTCTGCGTGAAAACACCTCCCCGAAAGCTAACAAAGAACGTGGTCGTATTCTGCAC

AACGGTGCTTACTCTCTGACTCTGCAAGGTAGATCTTAAGCTTGCGGCCGC 3’(SEQ ID NO：25)(含有PstI，BamHI，kozak序列，BglII，HindIII和NotI酶切位点)

2.将HER2多表位基因与真核表达载体pcDNA3连接

将HER2多表位抗原基因(SEQ ID NO：25)和真核表达质粒pcDNA3(Invitrogen)

分别用限制性内切酶BamHI和NotI酶切。酶切条件37℃2小时，采用琼脂糖凝胶电泳分离消化产物。

采用琼脂糖凝胶电泳分离消化产物。电泳的条件是：1％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，150-200mA，电泳0.5-1h。

20×TAE缓冲液：0.8mol/L Tris base

0.4mol/L NaOAc

0.04mol/L Na₂ EDTA

用冰醋酸调pH 8.3。

在紫外灯下观察并分别切下琼脂糖凝胶上的333bp和5.5Kb DNA电泳带。将含DNA区带的琼脂糖凝胶，置-70℃冷冻15min，然后在65℃水浴中使胶融化；加入等倍体积TE-饱合酰，剧烈振荡30秒，然后-70℃冷冻15min；室温融化后，12,000r/min离心5min，将上层液相移至另一管中，用2-2.5倍乙醇沉淀、洗涤和干燥DNA。

将经BamHI和NotI酶切消化的HER2和用同样酶处理的真核表达质粒pcDNA3用连接酶连接。

连接反应：

HER2基因 (5μg/μl) 2μl

真核表达质粒pcDNA3 (0.5μg/μl) 2μl

10×连接缓冲液(Takara) 1μl

T4DNA连接酶 1μl

双蒸水调节总体积至10μl

混合后置14-16℃水浴6-12h。

3.pcDNA3-HER2基因的测序(ABIPrism310^TM，USA)

结果表明：所得到的pcDNA3-HER2基因和本发明所设计的pcDNA3-HER2基因完全一致。

pcDNA3-HER2基因用BamHI和NotI的酶切鉴定见图6。

4.用pcDNA3-HER2质粒(pcDNA3-HER2)转染B16细胞系

取1-2μg pcDNA3-HER2质粒及15μl的Liposome(Invitrogen)加入到200μl无血清培养液中，混匀。室温(一般为20-25℃左右)孵育10-15min后，加入800μl无血清培养液，轻轻混匀待用。用PBS将欲转染的B16细胞洗一次，然后加入上述配好的转染试剂。37℃，5％CO2培养5小时。加入1000μl完全培养液，混匀，37℃，5％CO2培养过夜。次日，更换为含G418的新鲜完全培养液。待细胞稳定增长后，用有限稀释法筛选出表达HER2多表位基因的B16细胞单克隆株。用Western blot或ELISA法检测HER2多表位抗原的表达，选取阳性克隆用于下步实验。

实施例8重组融合蛋白HSP65-HER2可诱生小鼠HER2特异性的CTL

1.方法：

共设计6组，10只小鼠/组

对照组1	用PBS给C57BL/6小鼠注射三次(0d，14d，28d)；最后一次注射后3-7d处死小鼠，取脾和淋巴结，分离淋巴细胞，体外培养7d，其间用HSP65-HER2融合蛋白刺激2-3次，靶细胞采用B16细胞。
对照组1		对照组2	用PBS给C57BL/6小鼠注射三次(0d，14d，28d)；最后一次注射后3-7d处死小鼠，取脾和淋巴结，分离淋巴细胞，体外培养7d，其间用HSP65-HER2融合蛋白刺激2-3次，靶细胞采用pcDNA3稳定转染的B16细胞。

对照组3	用PBS给C57BL/6小鼠注射三次(0d，14d，28d)；最后一次注射后3-7d处死小鼠，取脾和淋巴结，分离淋巴细胞，体外培养7d，其间用HSP65-HER2融合蛋白刺激2-3次，靶细胞采用pcDNA3-HER2稳定转染的B16细胞。
对照组3		实验组1	用5μgHSP65-HER2融合蛋白免疫C57BL/6小鼠三次(0d，14d，28d)；最后一次免疫后3-7d处死小鼠，取脾和淋巴结，分离淋巴细胞，体外培养7d，其间用HSP65-HER2融合蛋白刺激2-3次，靶细胞采用B16细胞。
实验组2	用5μg HSP65-HER2融合蛋白免疫C57BL/6小鼠三次(0d，14d，28d)；最后一次免疫后3-7d处死小鼠，取脾和淋巴结，分离淋巴细胞，体外培养7d，其间用HSP65-HER2融合蛋白刺激2-3次，靶细胞采用pcDNA3稳定转染的B16细胞。	实验组1
实验组2		实验组3	用5μg HSP65-HER2融合蛋白免疫C57BL/6小鼠三次(0d，14d，28d)；最后一次免疫后3-7d处死小鼠，取脾和淋巴结，分离淋巴细胞，体外培养7d，其间用HSP65-HER2融合蛋白刺激2-3次，靶细胞采用pcDNA3-HER2稳定转染的B16细胞。

上述小鼠的注射和免疫部位是小鼠四肢皮下向心端。

各种靶细胞用⁵¹Cr标记1h。采用常规细胞毒实验，效应细胞和靶细胞共孵育4h后离心收集上清。使用放射性测定仪测定上清中的放射性含量(cpm)。

特异性杀伤％＝实验孔(cpm)-自发释放孔(cpm)/最大释放孔(cpm)-自发释放孔(cpm)％。

2.结果：HSP65-HER2融合蛋白能够在小鼠中诱生HER2特异性的CTL而PBS不能，且这种诱生的CTL只能特异性地杀伤表达HER2多表位抗原的肿瘤细胞而不能杀伤不表达HER2多表位抗原的肿瘤细胞。各组间所诱生的CTL的比较见图7。

3.结论：HSP65-HER2融合蛋白能够在小鼠中诱生HER2特异性的CTL，且此CTL在体外只能杀伤表达HER2多表位抗原的肿瘤细胞。

实施例9重组融合蛋白HSP65-HER2免疫的小鼠其体内转染HER2多表位抗原基因的肿瘤细胞的生长受到特异性地抑制

1方法及免疫程序

共设计3组，10只小鼠/组

对照组1	用200μlPBS在第0，14，28天分别注射C57BL/6小鼠三次，注射部位是小鼠四肢皮下向心端，最后一次注射后3-7d给小鼠右侧后肢注射用pcDNA3-HER2质粒稳定转染的B16细胞(1.2×10⁵个细胞/小鼠)。
对照组1		对照组2	用5μg HSP65-HER2融合蛋白在第0，14，28天分别免疫C57BL/6小鼠

	三次，免疫部位是小鼠四肢皮下向心端，最后一次免疫后3-7d给小鼠右侧后肢注射用pcDNA3质粒稳定转染的B16细胞(1.2×10⁵个细胞/小鼠)。
		实验组	用5μg HSP65-HER2融合蛋白在第0，14，28天分别免疫C57BL/6小鼠三次，免疫部位是小鼠四肢皮下向心端，最后一次免疫后3-7d给小鼠右侧后肢注射用pcDNA3-HER2质粒稳定转染的B16细胞(1.2×10⁵个细胞/小鼠)。

在接种肿瘤细胞25天后处死上述各组小鼠，分离肿瘤，称量各组小鼠瘤重。

2.结果：实验组小鼠肿瘤重量显著小于对照组1小鼠的肿瘤重量，实验组小鼠的肿瘤重量显著小于对照组2小鼠的肿瘤重量(P＜0.05)。各组小鼠肿瘤大小的比较见图8。

3.结论：重组融合蛋白HSP65-HER2免疫的小鼠只能特异性地抑制其体内转染HER2多表位抗原基因的肿瘤细胞的生长。

实施例10注射转染HER2多表位抗原基因肿瘤细胞的小鼠接受重组HSP65-HER2融合蛋白后其体内肿瘤细胞的生长受到特异性抑制

1.方法及免疫程序

共设计3组，10只小鼠/组

对照组1	在第0天给小鼠右侧后肢注射用pcDNA3-HER2质粒稳定转染的B16细胞(1.2×10⁵个细胞/小鼠)，第2天和第16天给小鼠注射PBS，注射部位是小鼠四肢皮下向心端。
对照组1		对照组2	在第0天给小鼠右侧后肢注射用空pcDNA3质粒稳定转染的B16细胞(1.2×10⁵个细胞/小鼠)，第2天和第16天给小鼠注射100μgHSP65-HER2融合蛋白，注射部位是小鼠四肢皮下向心端。
实验组	在第0天给小鼠右侧后肢注射用pcDNA3-HER2质粒稳定转染的B16细胞(1.2×10⁵个细胞/小鼠)，第2天和第16天给小鼠注射100μgHSP65-HER2融合蛋白，注射部位是小鼠四肢皮下向心端。	对照组2

在接种肿瘤后25天后处死上述各组小鼠，分离肿瘤，称量各组小鼠瘤重。

2.结果：实验组小鼠的肿瘤重量显著小于对照组1小鼠的肿瘤重量，实验组小鼠的肿瘤重量显著小于对照组2小鼠的肿瘤重量(P＜0.05)。各组小鼠肿瘤大小的比较见图9。

3.结论：注射转染HER2多表位抗原基因肿瘤细胞的小鼠接受重组HSP65-HER2融合蛋白后其体内肿瘤细胞的生长受到特异性抑制。

实施例11重组融合蛋白HSP65-HER2在体外诱生HER2多表位抗原特异性的CTL

1.分离人外周血单核细胞

1)将12.5ml泛影葡胺分别加入于几支50ml离心管中

2)汲取50ml PBS/EDTA缓冲液移入一烧瓶中。

3)血袋经70％己醇洗后，将其中的血移入于含与血样等体积的PBS/EDTA(PBS：NaCL 8.0克，KCL 0.2克，Na₂PO₄ 3.58克，KH₂PO₄ 0.24克，将上述试剂溶于800毫升蒸馏水中，最后定容至1000毫升，高压灭菌后使用。1000毫升的PBS中加入10毫升浓度为200mM的EDTA)溶液的烧瓶中，混匀。

4)从烧瓶中汲取稀释后的血液25ml移入于含12.5ml泛影葡胺的50ml试管中。

5)将上述试管，室温下以3000r/min转速(不使用刹车)离心20-25min。

6)离心后，去上清，汲取界面层，移入一新离心管中。

7)向此含有分层细胞的离心管中加入PBS/EDTA缓冲液至45ml后，1800r/min，4℃，离心10min。此为第一次冲洗；第二次冲洗时为1200r/min，4℃，离心7min。

8)收取试管底部的细胞团，加入PBS/EDTA/人血清缓冲液重悬细胞。所用体积视细胞数而定。

9)将上述含有细胞的试管离心，1200r/min，4℃离心7min(不用刹车)。

10)以6ml冷的PBS/EDTA/人血清缓冲液重悬细胞，取2只试管，各加6ml 52％冷的Percol。

11)汲取3ml细胞悬液缓慢移入(勿搅动Percol)含6ml冷的52％Percol试管中，在无刹车条件下离心，2000r/min，4℃离心20min。

12)汲取界面层细胞，移入一新管中；将其他细胞移入另一管中进行HLA分型。

13)以冷的PBS/EDTA/人血清缓冲液洗涤分层细胞，4℃，1300r/inm，无刹车离心10min。

14)以尼龙网滤过因死亡而成团的分层细胞。

15)计数单核细胞数。

2.诱导未成熟的树突状细胞

1)以IMDM稀释单核细胞，调整细胞数达2×10⁶/ml。

2)向12孔板中每一个孔加入1ml细胞悬液，再加入1ml IMDM，将含有细胞的12孔板于37℃，5％CO₂孵箱内培养2h。

3)2h后，用IMDM冲洗含有细胞的12孔板去掉每孔中未黏附的细胞。

4)以IMDM洗一次，用手轻轻摇动12孔板。

5)每孔中加入2ml含100ng(200U)/ml GM-CSF和200U/ml IL-4的IMDM。

6)于37℃，5％CO₂孵箱中培养5d，每2-3d换一次培养液。

3.用重组融合蛋白HSP65-HER2装载树突状细胞

1)于第5天将重组融合蛋白HSP65-HER2直接加于未成熟的树突状细胞(DC)中使其终浓度达100μg/ml，继续培养2d。

2)于第7d收获成熟的DC。

4.自人的外周血分离CD8⁺T淋巴细胞

1)从人血浆白细胞层分离外周血单个核细胞(PBMC)。

2)以PBS/EDTA/人血清缓冲液洗涤分离出的单个核细胞并计数。

3)根据得到的细胞数量准备抗体溶液：抗体溶液是用PBS/EDTA/人血清缓冲液将抗体制备成1∶1000稀释液，所含抗体为小鼠抗人anti-CD4，anti-CD14，anti-CD56，anti-CD19，anti-CD45RO，HLA-DR，γδ-TCR。每20×106个细胞需要1ml抗体溶液。

4)用抗体溶液重悬细胞。

5)将细胞与抗体混悬液置冷室内或冰上震荡培养30min。

6)离心收获细胞，将与抗体结合的细胞重悬于25ml PBS/EDTA/人血清缓冲液中。

7)制备抗小鼠IgG磁珠，以PBS(pH7.4)将磁珠洗三次。

8)按照细胞/磁珠＝1/4的比例将细胞重悬于含磁珠的试管内，置冰上，然后于双向摇床上培养20min。

9)离心收获上清，上清中即含有所需要的CD8⁺T淋巴细胞，细胞计数。

10)于96孔U型板中加入2×10⁵T细胞/孔。

5.用装载重组融合蛋白HSP65-HER2的树突状细胞刺激CD8⁺T淋巴细胞

1)按照1∶1，1∶2，1∶5和1∶10等几种不同浓度将CD8⁺T淋巴细胞和装载了重组融合蛋白HSP65-HER2的树突状细胞(DCs)混合在一起，培养6d-7d。

2)按照上述方法重复刺激CD8⁺T淋巴细胞两次，每次培养6d-7d。

3)3周以后，收获HER2特异性的CD8⁺T细胞。

6.T2细胞标记和HER2特异性抗原肽的加载

1.含有T2细胞的培养瓶中，加入⁵¹Cr使其终浓度达到1μCi/ml，将含有T2细胞和⁵¹Cr的培养瓶于37℃，5％CO₂培养1-2小时。期间偶而摇动混合几次，然后以IMDM培养液洗细胞3次。

2.向含有已标记⁵¹Cr的T2细胞培养中，分别加入10-100μgHER2特异性抗原肽，37℃，5％CO₂培养1-2小时。同时用无关肽作阴性对照。

7.CTL分析

1.向96孔板中以不同的效靶比加入效应细胞和靶细胞。

2.设立对照组：

自然释放对照靶细胞50μl+培养基 100μl

最大释放对照靶细胞50μl+10％Triton X-100 100μl

3.将已加入效应细胞和靶细胞的96孔板离心，1500rpm/min，5min。

4.将96孔板置37℃，5％CO₂条件下培养4-6h。

5.培养后使用Skkatron滤过系统收获细胞悬液，每个样品于γ-计数器上计数1min。

6.按以下公式计算释放率(％)：

8.CTL结果

成熟的树突状细胞能够将HER2特异性的T细胞表位呈递给自体来源的CD8⁺T淋巴细胞。用这种成熟的树突状细胞刺激CD8⁺T淋巴细胞3次，每次6-7天，获得的杀伤性T淋巴细胞能够杀伤表达HER2多表位抗原的肿瘤细胞，而不能杀伤不含有该抗原的肿瘤细胞。见图10。

9.结论

重组融合蛋白HSP65-HER2在体外能够诱生HER2多表位抗原特异性的CTL。

实施例12重组融合蛋白HSP65-HER2在体外可诱导HLA-A24限制性的CTL

1.步骤同实施例11，分离HLA-A24限制性的的健康人外周血单核细胞，其中一部分细胞诱导为不成熟的树突状细胞，另一种细胞用于分离CD8⁺T淋巴细胞。不成熟的树突状细胞分别加载HSP65-HER2-ME和HSP65-HER2进行培养。在HSP65-HER2和HSP65-HER2-ME诱导下转变为成熟状态的树突状细胞刺激自体来源的CD8⁺T淋巴细胞。共刺激三次，每次培养6-7d，3周以后，分别收获HSP65-HER2及HSP65-HER2-ME特异性的CD8⁺T淋巴细胞。

2.T2/A24细胞的标记(T2/A24细胞为T2细胞用HLA-A2402cDNA转染而成)和HER2特异性抗原肽(PYVSRLLGI)加载同实施例11中的6.T2细胞标记和HER2特异性抗原肽的加载。

分别用收获的HSP65-HER2及HSP65-HER2-ME特异的CD8⁺T淋巴细胞作为效应细胞，加载了抗原肽(PYVSRLLGI)的T2/A24细胞作为靶细胞，进行标准的杀伤实验。

结果表明：重组融合蛋白HSP65-HER2在体外可诱生HLA-A24限制性的CTL而HSP65-HER2-ME不能。见图11。

结论：重组融合蛋白HSP65-HER2在体外可诱生HLA-A24限制性的CTL而HSP65-HER2-ME不能。

序列表

<110>北京迪威华宇生物技术有限公司

<120>热休克蛋白65-人上皮细胞生长因子受体2融合蛋白(HSP65-HER2)

<160>25

<210>1

<211>25

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser

1 5 10 15

Arg Leu Leu Gly Ile Ser Leu Thr Glu Glu

20 25

<210>2

<211>45

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

Gln Glu Phe Ala Gly Ser Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe

1 5 10 15

Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro

20 25 30

Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile

35 40 45

<210>3

<211>17

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>3

Val Ala Ile Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn

1 5 10 15

Lys Glu

<210>4

<211>16

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>4

Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln

1 5 10 15

Gly

<210>5

<211>1989

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg 50

gggcttgaac gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg 100

gccgcaacgt cgtcctggaa aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac 150

gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag ctggaggatc cgtacgagaa 200

gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc gatgacgtcg 250

ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc 300

gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg 350

cggcatcgaa aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg 400

ccaaggaggt cgagaccaag gagcagattg cggccaccgc agcgatttcg 450

gcgggtgacc agtccatcgg tgacctgatc gccgaggcga tggacaaggt 500

gggcaacgag ggcgtcatca ccgtcgagga gtccaacacc tttgggctgc 550

agctcgagct caccgagggt atgcggttcg acaagggcta catctcgggg 600

tacttcgtga ccgacccgga gcgtcaggag gcggtcctgg aggaccccta 650

catcctgctg gtcagctcca aggtgtccac tgtcaaggat ctgctgccgc 700

tgctcgagaa ggtcatcgga gccggtaagc cgctgctgat catcgccgag 750

gacgtcgagg gcgaggcgct gtccaccctg gtcgtcaaca agatccgcgg 800

caccttcaag tcggtggcgg tcaaggctcc cggcttcggc gaccgccgca 850

aggcgatgct gcaggatatg gccattctca ccggtggtca ggtgatcagc 900

gaagaggtcg gcctgacgct ggagaacgcc gacctgtcgc tgctaggcaa 950

ggcccgcaag gtcgtggtca ccaaggacga gaccaccatc gtcgagggcg 1000

ccggtgacac cgacgccatc gccggacgag tggcccagat ccgccaggag 1050

atcgagaaca gcgactccga ctacgaccgt gagaagctgc aggagcggct 1100

ggccaagctg gccggtggtg tcgcggtcat caaggccggt gccgccaccg 1150

acgtcgaact caaggagcgc aagcaccgca tcgaggatgc ggttcgcaat 1200

gccaaggccg ccgtcgagga gggcatcgtc gccggtgggg gtgtgacgct 1250

gttgcaagcg gccccgaccc tggacgagct gaagctcgaa ggcgacgagg 1300

cgaccggcgc caacatcgtg aaggtggcgc tggaggcccc gctgaagcag 1350

atcgccttca actccgggct ggagccgggc gtggtggccg agaaggtgcg 1400

caacctgccg gctggccacg gactgaacgc tcagaccggt gtctacgagg 1450

atctgctcgc tgccggcgtt gctgacccgg tcaaggtgac ccgttcggcg 1500

ctgcagaatg cggcgtccat cgcggggctg ttcctgacca ccgaggccgt 1550

cgttgccgac aagccggaaa aggagaaggc ttccgttccc ggtggcggcg 1600

acatgggtgg catggatttc catatggcta gcgaattcga cgaagcatac 1650

gttatggctg gtgttggttc cccgtacgtt tcccgtctgc tgggtatttc 1700

cctgaccgag gagcaggagt tcgcaggttc taaaaaaatc ttcggctctc 1750

tcgcattcct gccagaatct tttgacggcg acccggcatc taataccgca 1800

ccgcttcaac cggaacaact gcaagtattt gagactctgg aagaaatcgt 1850

tgctatcaag gttctgcgtg aaaacacctc cccgaaagct aacaaagaac 1900

gtggtcgtat tctgcacaac ggtgcttact ctctgactct gcaaggtaag 1950

cttgcggccg cactcgagca ccaccaccac caccactga 1989

<210>6

<211>663

<212>PRT

<213>人工合成

<400>6

Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu

1 5 10 15

Glu Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu

20 25 30

Gly Pro Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala

35 40 45

Pro Thr Ile Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu

50 55 60

Leu Glu Asp Pro Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu

65 70 75

Val Ala Lys Lys Thr Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr

80 85 90

Ala Thr Val Leu Ala Gln Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn

95 100 105

Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu

110 115 120

Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys

125 130 135

Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ala Ala Thr Ala Ala Ile Ser

140 145 150

Ala Gly Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile Ala Glu Ala Met Asp

155 160 165

Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu Glu Ser Asn Thr

170 175 180

Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg Phe Asp Lys

185 190 195

Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg Gln Glu

200 205 210

Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys Val

215 220 225

Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly

230 235 240

Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu

245 250 255

Ala Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys

260 265 270

Ser Val Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala

275 280 285

Met Leu Gln Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser

290 295 300

Glu Glu Val Gly Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu

305 310 315

Gly Lys Ala Arg Lys Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile

320 325 330

Val Glu Gly Ala Gly Asp Thr Asp Ala Ile Ala Gly Arg Val Ala

335 340 345

Gln Ile Arg Gln Glu Ile Glu Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg

350 355 360

Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala

365 370 375

Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Asp Val Glu Leu Lys Glu Arg

380 385 390

Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn Ala Lys Ala Ala Val

395 400 405

Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr Leu Leu Gln Ala

410 415 420

Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp Glu Ala Thr

425 430 435

Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu Lys Gln

440 445 450

Ile Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu Lys

455 460 465

Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly

470 475 480

Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys

485 490 495

Val Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu

500 505 510

Phe Leu Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu

515 520 525

Lys Ala Ser Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe

530 535 540

His Met Ala Ser Glu Phe Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val

545 550 555

Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu Gly Ile Ser Leu Thr Glu

560 565 570

Glu Gln Glu Phe Ala Gly Ser Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala

575 580 585

Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala

590 595 600

Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu

605 610 615

Ile Val Ala Ile Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala

620 625 630

Asn Lys Glu Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu

635 640 645

Thr Leu Gln Gly Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His

650 655 660

His His ter

663

<210>7

<211>544

<212>PRT

<213>BCG HSP65

<400>7

Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu

1 5 10 15

Glu Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu

20 25 30

Gly Pro Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala

35 40 45

Pro Thr Ile Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu

50 55 60

Leu Glu Asp Pro Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu

65 70 75

Val Ala Lys Lys Thr Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr

80 85 90

Ala Thr Val Leu Ala Gln Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn

95 100 105

Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu

110 115 120

Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys

125 130 135

Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ala Ala Thr Ala Ala Ile Ser

140 145 150

Ala Gly Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile Ala Glu Ala Met Asp

155 160 165

Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu Glu Ser Asn Thr

170 175 180

Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg Phe Asp Lys

185 190 295

Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg Gln Glu

200 205 210

Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys Val

215 220 225

Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly

230 235 240

Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu

245 250 255

Ala Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys

260 265 270

Ser Val Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala

275 280 285

Met Leu Gln Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser

290 295 300

Glu Glu Val Gly Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu

305 310 315

Gly Lys Ala Arg Lys Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile

320 325 330

Val Glu Gly Ala Gly Asp Thr Asp Ala Ile Ala Gly Arg Val Ala

335 340 345

Gln Ile Arg Gln Glu Ile Glu Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg

350 355 360

Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala

365 370 375

Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Asp Val Glu Leu Lys Glu Arg

380 385 390

Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn Ala Lys Ala Ala Val

395 400 405

Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr Leu Leu Gln Ala

410 415 420

Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp Glu Ala Thr

425 430 435

Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu Lys Gln

440 445 450

Ile Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu Lys

455 460 465

Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly

470 475 480

Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys

485 490 495

Val Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu

500 505 510

Phe Leu Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu

515 520 525

Lys Ala Ser Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe

530 535 540

His Met Ala Ser

544

<210>8

<211>107

<212>PRT

<213>人工合成

<400>8：

Glu Phe Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr

1 5 10 15

Val Ser Arg Leu Leu Gly Ile Ser Leu Thr Glu Glu Gln Glu Phe

20 25 30

Ala Gly Ser Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu

35 40 45

Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro

50 55 60

Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile Val Ala Ile

65 70 75

Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Arg

80 85 90

Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly

95 100 105

Lys Leu

107

<210>9

<211>61

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

ctctcgcatt cctgccagaa tcttttgacg gcgacccggc atctaatacc 50

gcaccgcttc a 61

<210>10

<211>61

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

caacgatttc ttccagagtc tcaaatactt gcagttgttc cggttgaagc 50

ggtgcggtat t 61

<210>11

<211>105

<212>DNA

<213>人工合成

<400>11

ctctcgcatt cctgccagaa tcttttgacg gcgacccggc atctaatacc 50

gcaccgcttc aaccggaaca actgcaagta tttgagactc tggaagaaat 100

cgttg 105

<210>12

<211>61

<212>DNA

<213>人工合成

<400>12

ctgaccgagg agcaggagtt cgcaggttct aaaaaaatct tcggctctct 50

cgcattcctg c 61

<210>13

<211>60

<212>DNA

<213>人工合成

<400>13

ctttgttagc tttcggggag gtgttttcac gcagaacctt gatagcaacg 50

atttcttcca 60

<210>14

<211>196

<212>DNA

<213>人工合成

<400>14

ctgaccgagg agcaggagtt cgcaggttct aaaaaaatct tcggctctct 50

cgcattcctg ccagaatctt ttgacggcga cccggcatct aataccgcac 100

cgcttcaacc ggaacaactg caagtatttg agactctgga agaaatcgtt 150

gctatcaagg ttctgcgtga aaacacctcc ccgaaagcta acaaag 196

<210>15

<211>57

<212>DNA

<213>人工合成

<400>15

ggtgttggtt ccccgtacgt ttcccgtctg ctgggtattt ccctgaccga 50

ggagcag 57

<210>16

<211>56

<212>DNA

<21>人工合成

<400>16

agtcagagag taagcaccgt tgtgcagaat acgaccacgt tctttgttag 50

ctttcg 56

<210>17

<211>279

<212>DNA

<213>人工合成

<400>17

ggtgttggtt ccccgtacgt ttcccgtctg ctgggtattt ccctgaccga 50

ggagcaggag ttcgcaggtt ctaaaaaaat cttcggctct ctcgcattcc 100

tgccagaatc ttttgacggc gacccggcat ctaataccgc accgcttcaa 150

ccggaacaac tgcaagtatt tgagactctg gaagaaatcg ttgctatcaa 200

ggttctgcgt gaaaacacct ccccgaaagc taacaaagaa cgtggtcgta 250

ttctgcacaa cggtgcttac tctctgact 279

<210>18

<211>42

<212>DNA

<213>人工合成

<400>18

gaattcgacg aagcatacgt tatggctggt gttggttccc cg 42

<210>19

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>19

aagcttacct tgcagagtca gagagtaagc 30

<210>20

<211>321

<212>DNA

<213>人工合成

<400>20

gaattcgacg aagcatacgt tatggctggt gttggttccc cgtacgtttc 50

ccgtctgctg ggtatttccc tgaccgagga gcaggagttc gcaggttcta 100

aaaaaatctt cggctctctc gcattcctgc cagaatcttt tgacggcgac 150

ccggcatcta ataccgcacc gcttcaaccg gaacaactgc aagtatttga 200

gactctggaa gaaatcgttg ctatcaaggt tctgcgtgaa aacacctccc 250

cgaaagctaa caaagaacgt ggtcgtattc tgcacaacgg tgcttactct 300

ctgactctgc aaggtaagct t 321

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>21

ccatggccaa gacaattgcg 20

<210>22

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

<400>22

accgaattcg ctagccatat ggaaatccat gccacccat 39

<210>23

<211>34

<212>DNA

<213>人工合成

<400>23

ctgcaggatc catggacgaa gcatacgtta tggc 34

<210>24

<211>43

<212>DNA

<213>人工合成

<400>24

gcggccgcaa gcttaagatc taccttgcag agtcagagag taa 43

<210>25

<211>344

<212>DNA

<213>人工合成

<400>25

ctgcaggatc catggacgaa gcatacgtta tggctggtgt tggttccccg 50

tacgtttccc gtctgctggg tatttccctg accgaggagc aggagttcgc 100

aggttctaaa aaaatcttcg gctctctcgc attcctgcca gaatcttttg 150

acggcgaccc ggcatctaat accgcaccgc ttcaaccgga acaactgcaa 200

gtatttgaga ctctggaaga aatcgttgct atcaaggttc tgcgtgaaaa 250

cacctccccg aaagctaaca aagaacgtgg tcgtattctg cacaacggtg 300

cttactctct gactctgcaa ggtagatctt aagcttgcgg ccgc 344

Claims

1、一种重组融合蛋白，其特征在于它包括热休克蛋白65(HSP65)和人上皮细胞生长因子受体2(HER2)多表位抗原多肽，其中，HER2多表位抗原多肽包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列。

2、权利要求1所述的重组融合蛋白，其中HER2多表位抗原多肽可以为1-5个拷贝。

3、权利要求1所述的重组融合蛋白，其对人的HER2阳性肿瘤有预防和/或治疗作用。

4、权利要求3所述的重组融合蛋白，其中HER2多表位抗原多肽

(1)包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；或

(2)其氨基酸序列与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的同源性大于80％；或

(3)其核苷酸编码序列能够在核酸杂交条件下与编码SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列杂交；或

(4)包括那些对SEQ ID NO：8所示的序列进行人工点突变或插入其它序列、或以两侧连接其它序列的方式进行改造后所得到的序列。

5、权利要求3所述的重组融合蛋白，其中HER2多表位抗原多肽是由

a)与SEQ ID NO：20的核苷酸序列具有简并性的核苷酸序列编码的；或

b)与SEQ ID NO：20的核苷酸序列具有70％以上同源性的核苷酸序列编码的；

或

c)与SEQ ID NO：20的核苷酸序列能够在核酸杂交条件下杂交的核苷酸序列编码的；或

d)SEQ ID NO：20的核苷酸序列编码的；或

e)包括那些对SEQ ID NO：20所示的序列进行人工点突变或插入其它序列、或以两侧连接其它序列的方式进行改造后所得到的序列编码的。

6、权利要求3所述的重组融合蛋白，其中HER2多表位抗原多肽是由

(1)与SEQ ID NO：25的核苷酸序列具有简并性的核苷酸序列编码的；或

(2)与SEQ ID NO：25的核苷酸序列具有70％以上同源性的核苷酸序列编码的；或

(3)与SEQ ID NO：25的核苷酸序列能够在核酸杂交条件下杂交的核苷酸序列编码的；或

(5)SEQ ID NO：25的核苷酸序列编码的；或

(6)包括那些对SEQ ID NO：25所示的序列进行人工点突变或插入其它序列、或以两侧连接其它序列的方式进行改造后所得到的序列编码的。

7、权利要求3所述的重组融合蛋白，其中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4按随机组合方式相互连接构成一个拷贝。

8、权利要求3所述的重组融合蛋白，其中，HER2多表位抗原基因包括那些对SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，和SEQ ID NO：4所示的序列进行人工点突变或插入其它序列、或以两侧连接其它序列的方式进行改造后所得到的序列。

9、权利要求1-8中任意一项的重组融合蛋白，其中HSP65

(1)包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；或

(2)其氨基酸序列与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的同源性大于80％；或

(3)其核苷酸编码序列能够在核酸杂交条件下与编码SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列杂交；或

(4)包括那些对SEQ ID NO：7所示的序列进行人工点突变或插入其它序列、或以两侧连接其它序列的方式进行改造后所得到的序列。

10、权利要求1-3中任意一项的重组融合蛋白，

(1)其具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；或

(2)其氨基酸序列与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的同源性大于80％；或

(3)其核苷酸编码序列能够在核酸杂交条件下与编码SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列杂交；或

(4)包括那些对SEQ ID NO：6所示的序列进行人工点突变或插入其它序列、或以两侧连接其它序列的方式进行改造后所得到的序列。

11、权利要求1-3中任意一项的重组融合蛋白，其是由

(1)与SEQ ID NO：5的核苷酸序列具有简并性的核苷酸序列编码的；或

(2)与SEQ ID NO：5的核苷酸序列具有70％以上同源性的核苷酸序列编码的；或

(3)与SEQ ID NO：5的核苷酸序列能够在核酸杂交条件下杂交的核苷酸序列编码的；

或

(4)SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码的；或

(5)包括那些对SEQ ID NO：5所示的序列进行人工点突变或插入其它序列、或以两侧连接其它序列的方式进行改造后所得到的序列编码的。

12、权利要求1-3中任意一项所述的重组融合蛋白，其中，HSP65位于该重组融合蛋白的氨基端，HER2多表位抗原位于该重组融合蛋白的羧基端。

13、权利要求9所述的重组融合蛋白，其中，HSP65位于该重组融合蛋白的氨基端，HER2多表位抗原位于该重组融合蛋白的羧基端。

14、权利要求1-3中任意一项所述的重组融合蛋白，其中没有二硫键。

15、权利要求9所述的重组融合蛋白，其中没有二硫键。

16、编码权利要求1-15中任意一项的重组融合蛋白的核苷酸序列。

17、含有权利要求16的核苷酸的载体。

18、权利要求17的载体，其是质粒载体。

19、权利要求18的载体，其中用于连接权利要求16的核苷酸的原始载体是pET28a。

20、权利要求18的载体，其中用于连接权利要求16的核苷酸的原始载体是pcDNA3。

21、含有权利要求16所述的核苷酸序列或权利要求17-20中任意一项所述载体的宿主细胞。

22、权利要求21的宿主细胞，其是原核细胞。

23、权利要求22的宿主细胞，其中所述原核细胞是大肠杆菌。

24、权利要求21的宿主细胞，其是真核细胞。

25、权利要求24的宿主细胞，其中所述真核细胞是B16细胞。

26、生产权利要求1-15中任意一项重组融合蛋白的方法，包括在合适条件下培养权利要求21-25中任意一项的宿主细胞，并回收所需的重组融合蛋白。

27、权利要求1-15中任意一项的重组融合蛋白、权利要求16的核苷酸序列、权利要求17-20中任意一项的载体和/或权利要求21-25中任意一项的细胞在制备用于治疗和/或预防人的HER2阳性肿瘤的药物和/或试剂中的应用。