KR20230110249A

KR20230110249A - IgE-매개 염증성 장애를 치료하기 위한 IgE 단편을 포함하는 면역원성 생성물

Info

Publication number: KR20230110249A
Application number: KR1020237012511A
Authority: KR
Inventors: 로랑 레버; 피에르 브룬스; 가르시아 에바 콩드; 마리자 바츠코빅; 뱅상 세라; 제랄딘느 그루아드-보겔; 로메인 버트랜드
Original assignee: 니오베크스; 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔); 앵스띠뛰 파스퇴르
Priority date: 2020-09-17
Filing date: 2021-09-17
Publication date: 2023-07-21
Also published as: WO2022058571A1; IL301402A; AU2021343290A1; EP4213874A1; JP2023542036A; CA3192500A1; US20230364232A1

Abstract

본 발명은 담체 단백질과 접합된 적어도 하나의 면역글로불린 또는 이의 단편을 포함하는 면역원성 생성물에 관한 것이고, 여기서 적어도 하나의 면역글로불린은 IgE이고, 바람직하게는 IgE 단편은 IgE Cε3 도메인을 포함하고, 담체 단백질은 바람직하게는 CRM₁₉₇이다. 본 발명은 추가로 염증성 장애 및 특히 알레르기 장애(allergic disorders)를 치료하기 위한 상기 면역원성 생성물의 용도에 관한 것이다.

Description

IgE-매개 염증성 장애를 치료하기 위한 IgE 단편을 포함하는 면역원성 생성물

본 발명은 비정상적 IgE 발현 또는 활성과 관련된 장애, 특히 음식 및 독(venom) 알레르기 및 아나필락시스 등의 IgE-매개 알레르기를 치료하기 위한 면역원성 생성물(immunogenic product) 및 이의 용도에 관한 것이다.

알레르기 질환의 유병률은 과거 수년 동안 극적으로 증가하고 있고, 특히 선진국에서는 어린이의 30% 이상이 알레르기를 앓고 있다. 알레르기의 가장 극적인 임상 증상은 급성 및 잠재적으로 치명적인 전신 반응인 아나필락시스이다. 면역글로불린 E(immunoglobulin E; IgE)는 알레르기 반응과 아나필락시스의 매개에서 중심적 역할을 한다. 알레르겐에 노출되면, 이러한 알레르겐은, 조직 비만 세포 및 혈액 호염기구의 표면에서 이들의 고친화성 수용체 FcεRI에 결합된 알레르겐-특이적 IgE에 의해 인식되고, 이는 이러한 세포의 탈과립화를 촉진하고, 히스타민을 포함하여 미리 형성된 매개체 및 새로 합성된 매개체 모두의 방출을 촉진한다. 이러한 이유로, 알레르기의 임상 진단은 주로 알레르겐-특이적 IgE의 측정에 기반한다.

알레르기에 대한 대부분의 치료는 증후성이다(대부분 항히스타민제 및 코르티코스테로이드). 그러나, 최근, 알레르기의 치료를 위해 몇몇 재조합 모노클로날 항체(mAb)가 개발되었다. 인간화된 항-IgE mAb인 오말리주맙은 알레르기성 천식 및 만성 자발성 두드러기의 치료에 임상적 이점을 나타낸다. 이용가능한 임상 데이터는, 이 mAb가 음식 알레르기를 포함하는 다른 유형의 알레르기의 치료에도 이익을 가질 수 있음을 시사한다. 그러나, 오말리주맙(또는 임의의 다른 mAb)의 사용은, 무엇보다도, 높은 비용과 반복 주사 수행의 필요성, 및 항-약물 항체(ADA)의 출현 또는 기타 부작용의 잠재적 위험에 의해 제한된다. 주요 의학적 제한은, 700IU/ml 초과의 IgE 수준을 갖는 환자이고, 이는 오말리주맙으로 치료하는 경우에 아나필락시스의 위험이 있을 수 있다. 오말리주맙보다 IgE에 대한 친화성이 유의하게 높고 잠재적으로 부작용이 감소된 차세대 항-IgE mAb인 리겔리주맙이 개발되었지만, 중증 천식 환자에서 오말리주맙보다 개선된 효능을 입증하지 못했다(NCT02075008). 오말리주맙과 리겔리주맙은, IgE에 결합하는 에피토프와, FcεRI-결합된 IgE 또는 IgE 생산을 방해하는 이들의 능력이 상이하다.

따라서, IgE는 알레르기 및 아나필락시스의 치료를 위한 유망한 치료 표적이지만, 장기적 치료 효과에 도달하기 위해, IgE를 차단하는 현재의 전략을 개선할 필요성이 분명히 있다.

키노이드(kinoids)라고 하는 치료 접합체 백신은 비정상적으로 고도로 생성된 표적에 대한 중화 항체를 유도하기 위한 활성 면역 전략에 사용되어, 표적 수준을 기준선 이하로 저하시킨다.

이러한 치료용 접합체에 기초한 몇몇 접근법은, 면역원성 담체에 연결된 IgE의 항원성 펩티드를 포함하는 면역원의 생성을 포함하여 IgE-관련 장애의 예방 및 치료를 위해 개발되었다(WO2011/154878, WO2010/067286, WO99/67293, Peng et al., 2007, Spiegelberg et al., 1987). 그러나, 지금까지, 이러한 접합체(IgE의 작은 펩티드만을 포함)는 치료학적으로 검증되지 않았다. 특히, 임상 1상 연구 중에 수득된 실험 결과는, IgE로부터 유래하고 담체에 결합된 펩티드가 대다수의 대상체(subject)에서 혈청 IgE의 유의한 저하를 유도하지 않았음을 나타냈다. 결과적으로, 이를 필요로 하는 환자에서 IgE에 대한 중화 항체를 유도하기에 효율적인 화합물이 여전히 필요하다.

본 발명에서, 출원인은 디프테리아 독소, CRM₁₉₇의 무독성 돌연변이체에 결합된 인간 IgE의 Cε3 도메인(domain)을 포함하는 항-인간 IgE 키노이드를 생성했다. 이 백신은 IgE 및 FcεRI 모두에 대해 인간화된 마우스(IgE/FcεRI 인간화된 마우스)에서 부작용 없이 장기간에 걸쳐 항-인간 IgE 중화 항체 반응을 유도했다. 항-IgE 백신접종은 혈액 호염기구 표면에서 순환하는 IgE 수준과 고친화성 수용체 FcεRI에 결합된 IgE 수준을 모두 감소시켰고, IgE/FcεRI 인간화된 마우스에서 IgE-매개된 아나필락시스로부터 완전히 보호했다.

요약

본 발명은 담체 단백질(carrier protein)과 접합된 적어도 하나의 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편(fragment)을 포함하는 면역원성 생성물에 관한 것으로, 여기서 적어도 하나의 면역글로불린은 IgE, 바람직하게는 인간 IgE이고, IgE 단편은 IgE Cε3 도메인을 포함하고, 담체 단백질은 바람직하게는 CRM₁₉₇이다.

일 실시형태에서, 면역글로불린 단편은 IgE Cε3 및 Cε4 도메인의 일부 또는 전부를 포함한다.

일 실시형태에서, 면역글로불린 단편은 IgE Cε2, Cε3 및 Cε4 도메인의 일부 또는 전부를 포함한다.

일 실시형태에서, IgE 또는 이의 단편은 G335C 돌연변이를 포함한다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 7을 포함하거나 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 적어도 하나의 글리코실화를 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 본원에 기재된 바와 같은 면역원성 생성물을 포함하는 조성물이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 본원에 기재된 바와 같은 면역원성 생성물 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제(excipient)를 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 본원에 기재된 바와 같은 면역원성 생성물 및 적어도 하나의 보조제(adjuvant)를 포함하는 백신 조성물이다.

일 실시형태에서, 상기 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 약제학적 조성물 또는 백신 조성물은 에멀젼(emulsion)이다.

본 발명은 또한 상기 본원에 기재된 바와 같은 면역원성 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은

a) 면역글로불린 또는 이의 단편을 NHS-에스테르, 바람직하게는 N-[γ-말레이미도부티릴옥시]-숙신이미드 에스테르(sGMBS)를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제(heterobifunctional crosslinker)와 접촉시킴으로써, NHS-에스테르를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제와 면역글로불린 또는 이의 단편 사이의 복합체(complex), 바람직하게는 sGMBS-면역글로불린 또는 이의 단편 복합체를 수득하는 단계;

b) 담체 단백질을, NHS-에스테르, 바람직하게는 N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트(SATA)를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제와 접촉시킴으로써, NHS-에스테르를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제와 담체 사이의 복합체, 바람직하게는 담체-SATA 복합체를 생성하는 단계;

c) NHS-에스테르를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제와 면역글로불린 또는 이의 단편 사이의 복합체, 바람직하게는 단계 (a)에서 수득된 sGMBS-면역글로불린 또는 이의 단편 복합체를, NHS-에스테르를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제와 담체 사이의 복합체, 바람직하게는 단계 (b)에서 수득된 담체-SATA 복합체와 접촉시키는 단계

를 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 의약(medicament)으로 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 면역원성 생성물이다.

본 발명은 또한, 염증성 장애(inflammatory disorder)를 치료하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 면역원성 생성물 또는 조성물, 약제학적 조성물 또는 백신 조성물에 관한 것이고, 바람직하게는, 염증성 장애는 비정상적 IgE 발현 또는 활성과 관련되어 있다.

일 실시형태에서, 염증성 장애는 천식(asthma), 알레르기성 병태(allergic conditions)(예를 들면, 음식 알레르기(food allergies), 독 알레르기(venom allergy), 동물에 대한 알레르기(allergy to animals), 약물 알레르기(drug allergy), 과민증 IgE 증후군(hyper IgE syndrome), 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 알레르기성 결막염(allergic conjunctivitis) 및 알레르기성 장위염(allergic enterogastritis)), 아나필락시스(anaphylaxis), 아토피성 장애(atopic disorders)(예를 들면, 두드러기(urticaria)(만성 특발성 두드러기(chronic idiopathic urticaria) 및 만성 자발성 두드러기(chronic spontaneous urticaria)를 포함), 습진(eczema)), 수포성 유천포창(bullous pemphigoid), 호흡기 장애(respiratory disorders)(예를 들면, 천식(asthma), 알레르기성 기관지폐 아스퍼길루스증(allergic bronchopulmonary aspergilosis), 알레르기성 기관지폐 진균증(allergic bronchopulmonary mycosis)), 비용종(nasal polyposis) 및 기도 염증을 수반하는 기타 병태(예를 들면, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 전신 경화증(systemic sclerosis; SSc)을 포함한 호산구(eosinophilia), 섬유증(fibrosis) 및 과도한 점액 생성(excess mucus)); 염증성 및/또는 자가면역 장애 또는 병태, 위장 장애 또는 병태(예를 들면, 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases; IBD) 및 호산구성 식도염(eosinophilic esophagitis; EE), 및 호산구성-매개된 위장병(eosinophilic-mediated gastrointestinal disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 크론병(Crohn's disease)); 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus); 비만 세포증(mastocytosis) 및 비만 세포 활성화 증후군(mast cell activation syndrome; MCAS)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일 실시형태에서, 염증성 장애는 알레르기, 아나필락시스, 알레르기성 천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 비용종으로부터 선택되고, 바람직하게는 염증성 장애는 음식 또는 독 알레르기이다.

본 발명은 또한, 특정 항원에 대한 알레르기가 있는 대상체의 탈감작(desensitization)을 유도하기 위한, 상기 본원에 기재된 바와 같은 면역원성 생성물 또는 조성물, 약제학적 조성물 또는 백신 조성물에 관한 것이고, 여기서 상기 면역원성 생성물 또는 조성물 및 상기 특정 항원은 알레르기성 대상체에게 투여되어야 한다.

정의

본 발명에서, 다음 용어는 하기 의미를 갖는다:

- 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은, 양, 시간적 기간 등과 같은 측정가능한 값을 지칭하는 경우, 이러한 변동이 개시된 방법을 수행하기에 적절하기 때문에, 명시된 값으로부터 ±20% 또는 일부 경우에 ±10% 또는 일부 경우에 ±5%, 또는 일부 경우에 ±1%, 또는 일부 경우에 ±0.1%의 변동을 포함하는 것으로 의도된다.

- 본원에서 사용된 바와 같이, "보조제"는 본 발명의 면역원성 생성물의 면역원성을 증강시키는 물질이다. 보조제는 종종 면역 반응을 강화하기 위해 제공되고, 숙련된 기술자에게 공지되어 있다.

- 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "담체 단백질 분자"는 적어도 15, 30 또는 50개 아미노산 길이의 단백질 또는 펩티드를 지칭하고, 이는, 대상체(예를 들면, 인간, 고양이, 개 또는 말)에 주사한 경우에 면역원성이고, 헤테로복합체를 형성하기 위해 적어도 하나의 IgE 또는 이의 단편(여기서, 바람직하게는 IgE 단편은 IgE Cε3 도메인을 포함함)에 부분적으로 공유 결합되는 경우, 적어도 하나의 IgE 또는 이의 단편의 다수의 항원이 B 림프구에 제시되도록 하고, 그 후의 IgE 또는 이의 단편에 대해 지시된 항체의 생성을 가능하게 한다.

- 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역 반응"은, 예를 들면, 림프구, 항원 제시 세포, 식세포 세포 및 상기 세포 또는 간에 의해 생성되는 거대분자(항체, 사이토카인 및 보체를 포함)의 작용을 지칭한다.

- 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역원성 생성물"은 담체 단백질에 결합된 적어도 하나의 IgE 또는 이의 단편을 지칭하고, 이는 상기 면역원성 생성물이 투여되는 대상체, 바람직하게는 포유동물에서 면역 반응을 유도하고, 이 면역 반응에는 체액성 면역 반응, 즉, 예를 들면, 내인성 IgE의 생물학적 활성 등의 특성을 중화시키는 항체의 생성이 포함된다.

- 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 부형제"는, 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여된 경우, 부작용, 알레르기 또는 기타 바람직하지 않은 반응을 생성하지 않는 부형제를 지칭한다. 여기에는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 따라서, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 무독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 임의 유형의 제형 보조제를 의미할 수 있다. 인간 투여를 위해, 제제는 FDA 또는 EMA와 같은 규제 기관에서 요구하는 멸균성, 발열성, 일반적 안전성 및 순도 기준을 충족해야 한다.

- 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 단백질"은, 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성되는 단백질(예를 들면, IgE 또는 이의 단편 또는 담체 단백질), 예를 들면, 원핵 세포(박테리오파지 또는 플라스미드 발현 시스템을 사용하여)에서 또는 진핵 세포(예를 들면, 효모, 곤충 또는 포유동물 발현 시스템)에서 발현되는 단백질(예를 들면, IgE 또는 이의 단편 또는 담체 단백질)을 지칭한다. 이 용어는 또한, 단백질(예를 들면, IgE 또는 이의 단편 또는 담체 단백질)을 코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되고 DNA 분자가 단백질(예를 들면, IgE 또는 이의 단편 또는 담체 단백질), 또는 단백질(예를 들면, IgE 또는 이의 단편 또는 담체 단백질)을 지정하는 아미노산 서열을 발현하는 단백질(예를 들면, IgE 또는 이의 단편 또는 담체 단백질)을 의미하는 것으로 해석되어야 하고, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 당해 기술분야에서 이용가능하고 공지되어 있는 재조합 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득되었다.

- 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 생물(예를 들면, 포유동물, 특히 인간, 영장류, 개, 고양이, 말, 양 등)를 포함하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다. 일 실시형태에서, 대상체는 "환자", 즉, 온혈 동물, 바람직하게는 인간일 수 있고, 이들은 의료 관리를 받을 예정이거나 의료 관리를 받고 있거나, 또는 의료 절차의 대상이었고/될 예정이거나, 예를 들면, 염증성 장애와 같은 표적화 질환 또는 병태의 발달에 대해 모니터링된다. 일 실시형태에서, 대상체는 성인(예를 들면, 18세 이상의 대상체)이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 어린이(예를 들면, 18세 미만의 대상체)이다. 일 실시형태에서, 대상체는 남성이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 여성이다. 일 실시형태에서, 대상체는 염증성 장애로 영향을 받고, 바람직하게는 진단된다. 일 실시형태에서, 대상체는 염증성 장애를 발증할 위험이 있다. 위험 요인의 예에는 염증성 장애의 유전적 소인, 또는 가족 병력이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.

- 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료학적 유효량"은 특정 생물학적 결과를 달성하는데 효과적인 본원에 기재된 면역원성 생성물의 양을 지칭한다. 따라서, 용어 "치료학적 유효량"은, 표적에 유의한 부정적 또는 불리한 부작용을 유발하지 않으면서, (1) 표적화된 질환 또는 병태의 발증을 지연 또는 예방하거나; (2) 표적화된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상의 진행, 악화 또는 열화를 감속 또는 중지시키거나; (3) 표적화된 질환 또는 병태의 증상을 개선시키거나; (4) 표적화된 질환 또는 병태의 중증도 또는 발병률을 감소시키거나; 또는 (5) 표적화된 질환 또는 병태를 치료하는 것을 목적으로 하는 면역원성 생성물의 수준 또는 양을 의미한다. 치료학적 유효량은 예방 또는 예방적 작용을 위해 표적화된 질환 또는 병태의 발증 전에 투여될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 치료학적 유효량은 치료 작용을 위해 표적화된 질환 또는 병태의 개시 후에 투여될 수 있다.

- 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 치료적 치료 및 예방적 또는 예방적 조치 모두를 의미하고; 여기서, 그 목적은 표적화된 질환 또는 병태를 예방 또는 감속(저하)하는 것이다. 치료를 필요로 하는 사람에는 이미 병태를 앓고 있는 사람뿐만 아니라, 병태에 걸리기 쉬운 사람 또는 병태가 예방되어야 하는 사람이 포함된다. 대상체는, 본원에 기재된 바와 같은 치료량의 면역원성 생성물을 제공받은 후, 대상체가 다음 중 하나 이상에서 관찰가능한 및/또는 측정가능한 개선을 나타내는 경우, 질환 또는 병태에 대해 성공적으로 "치료"된다: 병원성 세포의 수의 감소; 병원성인 총 세포의 백분율의 감소; 특정 병태와 관련된 하나 이상의 증상에 대한 어느 정도의 구제; 이환율 및 사망률의 감소 및/또는 생활의 질 문제의 개선. 병태의 성공적 치료 및 개선을 평가하기 위한 상기 파라미터는 의사에게 친숙한 일상적 수단에 의해 용이하게 측정가능하다.

상세한 설명

본 발명은, 적어도 하나의 담체 단백질과 접합된 적어도 하나의 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 포함하는 면역원성 생성물에 관한 것이고, 여기서 적어도 하나의 면역글로불린은 IgE이다.

본 출원인은, 본 발명의 면역원성 생성물의 투여가 동물 모델에서 항-IgE 중화 항체를 유도하고, 이에 의해 IgE-매개 염증성 장애를 치료하는 것을 입증했다.

어떠한 이론에도 구속됨이 없이, 본 출원인은, 본 발명의 면역원성 생성물이 당해 기술분야에 기재된 담체 단백질에 접합된 펩티드와 비교하여, 폴리클로날 항-IgE 중화 항체(즉, IgE 서열의 상이한 에피토프에 대해 지시되는 항체)를 유도하는 잇점을 나타내는 것을 시사한다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE Cε3 도메인을 포함하거나 이들로 구성된다.

담체 단백질의 예에는 CRM₁₉₇, KLH(키홀 림펫 헤모시아닌), 오브알부민, 소 혈청 알부민(BSA), 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 콜레라 톡소이드, 외막 소포 내의 수막염균 외막 단백질, 비-정형 헤모필루스 인플루엔자 외막 단백질, 슈도모나스 녹농균 독소 A 및 바이러스 유사 입자(VLP)가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.

일 실시형태에서, 담체 단백질은 CRM₁₉₇이다.

CRM₁₉₇은 단일 염기 치환(위치 52에서 글리신으로부터 글루타메이트로의 돌연변이)으로 인한 독성 활성 없이, 서열번호 1의 서열을 갖는 디프테리아 독소의 무독성 돌연변이체이다.

서열번호 1

GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS

일 실시형태에서, CRM₁₉₇은 2018년 힉케이(Hickey)(Hickey et al., 2018)에 의해 기재된 바와 같이 자가(씨. 디프테리아(C. diphtheriae)) 또는 이종 시스템(이. 콜라이(E. coli) 및 피. 플루오레센스(P. fluorescens))에서 당해 기술분야에 공지된 종래의 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 재조합 CRM₁₉₇은, CRM₁₉₇을 코딩하는 핵산 서열(예를 들면, 유전자)을 포함하는 발현 벡터를 함유하는 세포를 배양하고, 봉입체를 수확하고, CRM₁₉₇을 정제함으로써 수득할 수 있다. CRM₁₉₇은 또한 ATCC로부터 구입한 박테리아 균주(ATCC39255)로부터 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae)의 배양물로부터 추출할 수 있다. 일 실시형태에서, CRM₁₉₇은 상업적으로 이용가능하고, 예를 들면, 리젠트 프로테인스(Reagent Proteins)(San Diego, CA, US)로부터 구입할 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물은 CRM₁₉₇의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 서열번호 1과 적어도 약 70%, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 그 이상의 동일성을 나타낸다. 일 실시형태에서, CRM₁₉₇의 상기 변이체는 CRM₁₉₇의 위치 52에서 글리신으로부터 글루타메이트로의 돌연변이를 포함하고, 따라서 무독성이다.

용어 "동일성" 또는 "동일한"은, 2개 이상의 핵산 서열 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 서열 사이의 관계에서 사용되는 경우, 각각 2개 이상의 핵산 또는 아미노산 잔기의 스트링 사이의 정합 수에 의해 결정되는 바와 같이, 핵산 서열 또는 폴리펩티드 사이의 서열 관련성의 정도를 지칭한다. "동일성"은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")에 의해 해결된 갭 정렬(존재하는 경우)를 사용하여 2개 이상의 서열 중 작은 서열과의 동일한 정합의 백분율을 의미한다. 관련된 핵산 서열 또는 폴리펩티드의 동일성은 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 이러한 방법에는 문헌[참조: Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)]에 기재된 것들이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험된 서열 간에 최대의 정합을 제공하도록 설계된다. 동일성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에서 설명되어 있다. 2개의 서열 사이의 동일성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 ClustalO[참조: Sievers F., et al., 2011], GAP[참조: Devereux et al., Nucl. Acid. Res. ＼2, 387(1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.]을 포함하는 GCG 프로그램 패키지, BLASTP, BLASTN 및 FASTA[참조: Altschul et al., J. MoI. Biol. 215, 403-410(1990)]을 포함한다. BLASTX 프로그램은 국립 바이오테크놀로지 정보 센터(NCBI; National Center for Biotechnology Information) 및 기타 정보원(BLAST Manual, Altschul et al., NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra)으로부터 공개적으로 이용할 수 있다. 공지된 스미스 워터맨(Smith Waterman) 알고리즘을 사용하여 동일성을 결정할 수도 있다.

일 실시형태에서, CRM₁₉₇은 전장 CRM₁₉₇이다.

일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물은 CRM₁₉₇의 단편, 예를 들면, 서열번호 1로부터 적어도 약 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500개의 아미노산(바람직하게는 연속 아미노산)을 포함하는 단편을 포함한다.

IgE는 하나의 가변 도메인과 Cε1, Cε2, Cε3 및 Cε4로 명명된 4개의 불변 도메인을 포함하는 면역글로불린이다. IgE는 상이한 도메인 사이의 링커를 추가로 포함한다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 적어도 하나(예를 들면, 1, 2, 3 또는 4개)의 불변 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 가변 도메인을 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, IgE 또는 이의 단편은 전장 IgE를 포함하거나 이들로 구성되지 않는다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 전장 IgE 불변 영역이다(즉, Cε1, Cε2, Cε3 및 Cε4 도메인 및 모든 링커 영역을 포함함).

일 실시형태에서, IgE 단편은, 예를 들면, 이들이 유래하는 IgE의 적어도 약 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 또는 425개의 아미노산(바람직하게는 연속 아미노산)을 포함하는 IgE 불변 영역의 단편과 같은 IgE 불변 영역의 단편이다.

일 실시형태에서, 상기 단편은 IgE 불변 영역의 적어도 하나의 특정 에피토프를 포함한다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε3 도메인을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε3 도메인의 적어도 일부를 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, 상기 단편은 IgE Cε3 도메인의 적어도 하나의 특정 에피토프를 포함한다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε2 및 Cε3 도메인을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε2 및 Cε3 도메인의 적어도 일부를 포함하거나 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε2 및 Cε3 도메인 및 Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε2 및 Cε3 도메인의 적어도 일부 및 Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역을 포함하거나 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε2 및 Cε3 도메인, 및 Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역, Cε1과 Cε2 사이의 링커 영역 및 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역 중 적어도 하나를 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε2 및 Cε3 도메인, Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역, Cε1과 Cε2 사이의 링커 영역 및 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε2 및 Cε3 도메인의 적어도 일부, 및 Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역, Cε1과 Cε2 사이의 링커 영역 및 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역 중 적어도 하나를 포함하거나 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε3과 Cε4 도메인을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε3 및 Cε4 도메인의 적어도 일부를 포함하거나 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε3 및 Cε4 도메인, 및 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε3 및 Cε4 도메인의 적어도 일부, 및 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역을 포함하거나 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε3 및 Cε4 도메인, 및 Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역, Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역 및 Cε4 이후의 링커 영역 중 적어도 하나를 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε3 및 Cε4 도메인, Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역, Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역 및 Cε4 이후의 링커 영역을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε3 및 Cε4 도메인의 적어도 일부, 및 Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역, Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역 및 Cε4 이후의 링커 영역 중 적어도 하나를 포함하거나 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε2, Cε3 및 Cε4 도메인을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε2, Cε3 및 Cε4 도메인의 적어도 일부를 포함하거나 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε2, Cε3 및 Cε4 도메인, 및 Cε2와 Cε3 사이 및 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε2, Cε3 및 Cε4 도메인의 적어도 일부, 및 Cε2와 Cε3 사이 및 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역을 포함하거나 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε2, Cε3 및 Cε4 도메인, 및 Cε1과 Cε2 사이의 링커 영역, Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역, Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역 및 Cε4 이후의 링커 영역 중 적어도 하나를 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε2, Cε3 및 Cε4 도메인, Cε1과 Cε2 사이의 링커 영역, Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역, Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역 및 Cε4 이후의 링커 영역을 포함하거나 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 IgE의 Cε2, Cε3 및 Cε4 도메인의 적어도 일부, 및 Cε1과 Cε2 사이의 링커 영역, Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역, Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역 및 Cε4 이후의 링커 영역 중 적어도 하나를 포함하거나 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, IgE 또는 IgE 단편은 재조합된다. 재조합 IgE 또는 이의 단편은 IgE 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 서열을 사용하여 당해 기술분야에 공지된 종래의 방법에 의해 수득될 수 있다.

예를 들면, 재조합 IgE는 IgE를 코딩하는 핵산 서열(예를 들면, 유전자)을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 세포를 배양하고, 봉입체를 수확하고, IgE를 정제함으로써 수득할 수 있다. 따라서, 재조합 IgE 단편은 IgE 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 함유하는 세포를 배양하고, 봉입체를 수확하고, IgE 단편을 정제함으로써 수득할 수 있다.

일 실시형태에서, 재조합 IgE가 수득되고, 상기 재조합 IgE의 단편이, 예를 들면, 단백질분해에 의해 회수된다.

본 발명의 일 실시형태에서, IgE 또는 이의 단편은 포유동물로부터 유래한다.

일 실시형태에서, IgE 또는 이의 단편은 포유동물 IgE 또는 이의 단편의 변이체이고, 여기서 상기 변이체는, 이것이 유래하는 포유동물 IgE 또는 이의 단편과 적어도 약 70%, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 그 이상의 동일성을 나타낸다.

IgE는 글리코실화 부위를 포함하는 면역글로불린이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물에 포함된 IgE 또는 이의 단편은 글리코실화된다. 임의의 이론에 구속되지 않고, 본 출원인은, 글리코실화된 IgE(또는 이의 단편)를 포함하는 면역원성 생성물의 투여가 천연 면역글로불린에 상응하는 글리코실화된 형태의 IgE에 특이적인 항-IgE 항체의 생성을 유도할 수 있다는 것을 시사한다.

또한, IgE는 시알릴화될 수 있다. hIgE의 시알릴화는, 예를 들면, IgE 이펙터 기능에서 역할을 할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물에 포함된 IgE 또는 이의 단편은 적어도 하나의 시알산 잔기를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물에 포함된 IgE 또는 이의 단편은 어떠한 시알산 잔기도 포함하지 않는다.

일 실시형태에서, IgE는 인간 IgE, 바람직하게는 재조합 인간 IgE이다. 인간 IgE 불변 영역은 서열번호 2(UniProt ID: P01854)의 서열을 갖고, 여기서 위치 6-103, 112-210, 214-318 및 324-423의 아미노산은 각각 도메인 Cε1, Cε2, Cε3 및 Cε4에 상응한다. 위치 1-5, 104-111, 211-213, 319-323 및 424-428의 아미노산은 각각 Cε1 이전, Cε1과 Cε2 사이, Cε2와 Cε3 사이, Cε3과 Cε4 사이, 및 Cε4 이후의 링커 영역에 상응한다.

서열번호 2

ASTQSPSVFPLTRCCKNIPSNATSVTLGCLATGYFPEPVMVTWDTGSLNGTTMTLPATTLTLSGHYATISLLTVSGAWAKQMFTCRVAHTPSSTDWVDNKTFSVCSRDFTPPTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGK

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 2의 단편이고, 여기서 상기 단편은 서열번호 2의 적어도 약 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 또는 425개 아미노산(바람직하게는 연속 아미노산)을 포함한다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 2의 변이체이고, 여기서 상기 변이체는 서열번호 2와 적어도 약 70%, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 그 이상의 동일성을 나타낸다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE 불변 도메인, 바람직하게는 인간 IgE Cε3 도메인의 적어도 하나의 특정 에피토프를 포함한다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 전장 인간 IgE 불변 영역이다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε3 도메인을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε3 도메인의 적어도 일부를 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, 상기 단편은 인간 IgE Cε3 도메인의 적어도 하나의 특정 에피토프를 포함한다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε2 및 Cε3 도메인을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε2 및 Cε3 도메인의 적어도 일부를 포함하거나 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε2 및 Cε3 도메인 및 Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε2 및 Cε3 도메인의 적어도 일부 및 Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역을 포함하거나 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε2 및 Cε3 도메인, 및 Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역, Cε1과 Cε2 사이의 링커 영역 및 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역 중 적어도 하나를 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε2 및 Cε3 도메인, Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역, Cε1과 Cε2 사이의 링커 영역 및 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε2 및 Cε3 도메인의 적어도 일부, 및 Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역, Cε1과 Cε2 사이의 링커 영역 및 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역 중 적어도 하나를 포함하거나 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε3 및 Cε4 도메인을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε3 및 Cε4 도메인의 적어도 일부를 포함하거나 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε3 및 Cε4 도메인, 및 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε3 및 Cε4 도메인의 적어도 일부, 및 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역을 포함하거나 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε3 및 Cε4 도메인, 및 Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역, Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역 및 Cε4 이후의 링커 영역 중 적어도 하나를 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε3 및 Cε4 도메인, Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역, Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역 및 Cε4 이후의 링커 영역을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε3 및 Cε4 도메인의 적어도 일부, Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역, Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역 및 Cε4 이후의 링커 영역 중 적어도 하나를 포함하거나 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε2, Cε3 및 Cε4 도메인을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε2, Cε3 및 Cε4 도메인의 적어도 일부를 포함하거나 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε2, Cε3 및 Cε4 도메인, 및 Cε2와 Cε3 사이 및 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε2, Cε3 및 Cε4 도메인의 적어도 일부, 및 Cε2와 Cε3 사이 및 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역을 포함하거나 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε2, Cε3 및 Cε4 도메인, 및 Cε1과 Cε2 사이의 링커 영역, Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역, Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역 및 Cε4 이후의 링커 영역 중 적어도 하나를 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε2, Cε3 및 Cε4 도메인, Cε1과 Cε2 사이의 링커 영역, Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역, Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역 및 Cε4 이후의 링커 영역을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE의 Cε2, Cε3 및 Cε4 도메인의 적어도 일부, 및 Cε1과 Cε2 사이의 링커 영역, Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역, Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역 및 Cε4 이후의 링커 영역 중 적어도 하나를 포함하거나 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 3의 서열을 갖는 인간 IgE의 Cε3 불변 도메인을 포함하거나 이들로 구성된다.

서열번호 3

PRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTS

일 실시형태에서, IgE 단편은 인간 IgE Cε3 도메인의 단편, 예를 들면, 서열번호 3의 적어도 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개 아미노산(바람직하게는 연속 아미노산)을 포함하는 인간 IgE의 단편이다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 3의 변이체이고, 여기서 상기 변이체는 서열번호 3과 적어도 약 70%, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 그 이상의 동일성을 나타낸다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 3의 위치 3에서의 돌연변이(글리신 잔기가 시스테인 잔기로 치환됨)를 포함하는 인간 IgE의 Cε3 불변 도메인을 포함하거나 이들로 구성된다. 이 돌연변이는 돌연변이 G335C로 지칭될 수 있다[참조: Wurzburg et al., 2012]. 따라서, 일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 8을 포함하거나 이들로 구성된다.

서열번호 8

PRCVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTS

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 8의 단편, 예를 들면, 서열번호 8의 적어도 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개 아미노산(바람직하게는 연속 아미노산)을 포함하는 인간 IgE의 단편이다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 8의 변이체이고, 여기서 상기 변이체는 서열번호 8과 적어도 약 70%, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 그 이상의 동일성을 나타낸다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 Cε3 및 Cε4 불변 도메인, 및 임의로 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역을 포함하는 인간 IgE의 단편을 포함하거나 이들로 구성된다. Cε3 및 Cε4 불변 도메인, 및 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역을 포함하는 인간 IgE 단편의 예는 서열번호 4의 서열을 갖는다.

서열번호 4

PRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVS

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 4의 단편, 예를 들면, 서열번호 4의 적어도 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 또는 205개 아미노산(바람직하게는 연속 아미노산)을 포함하는 인간 IgE의 단편이다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 4의 변이체이고, 여기서 상기 변이체는 서열번호 4와 적어도 약 70%, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 그 이상의 동일성을 나타낸다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 Cε3 및 Cε4 불변 도메인, 및 임의로 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역을 포함하는 인간 IgE의 단편을 포함하거나 이들로 구성되고, 서열번호 4의 위치 3에서 돌연변이(글리신 잔기를 시스테인 잔기로 치환)를 추가로 포함한다. Cε3 및 Cε4 불변 도메인, 및 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역을 포함하는 이러한 IgE 단편의 예는 서열번호 9를 포함하거나 이들로 구성된 IgE 단편을 포함한다.

서열번호 9

PRCVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVS

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 9의 단편, 예를 들면, 서열번호 9의 적어도 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 또는 205개 아미노산(바람직하게는 연속 아미노산)을 포함하는 인간 IgE의 단편이다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 9의 변이체이고, 여기서 상기 변이체는 서열번호 9와 적어도 약 70%, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 그 이상의 동일성을 나타낸다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 Cε2 및 Cε3 불변 도메인, 및 임의로 Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역을 포함하는 인간 IgE의 단편을 포함하거나 이들로 구성된다. Cε2 및 Cε3 불변 도메인, 및 Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역을 포함하는 인간 IgE 단편의 예는 서열번호 5의 서열을 갖는다.

서열번호 5

PTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTS

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 5의 단편, 예를 들면, 서열번호 5의 적어도 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 또는 205개 아미노산(바람직하게는 연속 아미노산)을 포함하는 인간 IgE의 단편이다.

일 실시형태에서, 면역원성 생성물은 서열번호 5의 변이체이고, 여기서 상기 변이체는 서열번호 5와 적어도 약 70%, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 그 이상의 동일성을 나타낸다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 Cε2 및 Cε3 불변 도메인, 및 Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역을 포함하는 인간 IgE의 단편을 포함하거나 이들로 구성되고, 서열 번호 5의 위치 105에서 돌연변이(글리신 잔기를 시스테인 잔기로 치환)를 추가로 포함한다. Cε2 및 Cε3 불변 도메인, 및 Cε2와 Cε3 사이의 링커 영역을 포함하는 이러한 IgE 단편의 예는 서열번호 10을 포함하거나 이들로 구성된 IgE 단편을 포함한다.

서열번호 10

PTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRCVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTS

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 10의 단편, 예를 들면, 서열번호 10의 적어도 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 또는 205개 아미노산(바람직하게는 연속 아미노산)을 포함하는 인간 IgE의 단편이다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 10의 변이체이고, 여기서 상기 변이체는 서열번호 10과 적어도 약 70%, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 그 이상의 동일성을 나타낸다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 Cε2, Cε3 및 Cε4 불변 도메인, 및 임의로 Cε2와 Cε3 사이 및 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역을 포함하는 인간 IgE의 단편을 포함하거나 이들로 구성된다. Cε2, Cε3 및 Cε4 불변 도메인, 및 Cε2와 Cε3 사이 및 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역을 포함하는 인간 IgE 단편의 예는 서열번호 6의 서열을 갖는다.

서열번호 6

PTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVS

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 6의 단편, 예를 들면, 서열번호 6의 적어도 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305 또는 310개 아미노산(바람직하게는 연속 아미노산)을 포함하는 인간 IgE의 단편이다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 6의 변이체이고, 여기서 상기 변이체는 서열번호 6과 적어도 약 70%, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 그 이상의 동일성을 나타낸다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 Cε2, Cε3 및 Cε4 불변 도메인, 및 Cε2와 Cε3 사이 및 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역을 포함하는 인간 IgE의 단편을 포함하거나 이들로 구성되고, 서열번호 6에서 위치 105에서 돌연변이(글리신 잔기를 시스테인 잔기로 치환)를 추가로 포함한다. Cε2, Cε3 및 Cε4 불변 도메인, 및 Cε2와 Cε3 사이 및 Cε3과 Cε4 사이의 링커 영역을 포함하는 이러한 IgE 단편의 예는 서열번호 11을 포함하거나 이들로 구성된 단편을 포함한다.

서열번호 11

PTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRCVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVS

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 11의 단편, 예를 들면, 서열번호 11의 적어도 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305 또는 310개 아미노산(바람직하게는 연속 아미노산)을 포함하는 인간 IgE의 단편이다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 11의 변이체이고, 여기서 상기 변이체는 서열번호 11과 적어도 약 70%, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 그 이상의 동일성을 나타낸다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 12를 포함하거나 이들로 구성된다.

서열번호 12

ADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGK

일 실시형태에서, 면역원성 생성물은 서열번호 12의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 서열번호 12와 적어도 약 70%, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 그 이상의 동일성을 나타낸다.

서열번호 7

ADSNPRCVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGK

일 실시형태에서, 면역원성 생성물은 서열번호 7의 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 서열번호 7과 적어도 약 70%, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 그 이상의 동일성을 나타낸다.

인간 IgE는, Cε1 도메인의 3개 글리코실화 부위(N140, N168 및 N218), Cε2 도메인의 1개 글리코실화 부위(N265) 및 Cε3 도메인의 3개 글리코실화 부위(N371, N383 및 N394)를 포함하는 7개 글리코실화 부위를 포함하는 면역글로불린이다. 당해 기술분야에서, N394 잔기 상의 글리코실화는 단백질의 폴딩, FcεRI와의 안정한 IgE 상호작용 및 아나필락시스의 개시에 중요할 수 있음이 시사되었다.

일 실시형태에서, 글리코실화의 7개 부위는 각각 서열번호 2의 hIgE 불변 영역의 서열에서 잔기 N21, N49, N99(Cε1 도메인 내), N146(Cε2 도메인 내) 및 N252, N264, N275(Cε3 도메인 내)에 상응한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물에 포함된 hIgE 또는 이의 단편은 적어도 하나의 글리코실화를 포함한다. 임의의 이론에 구속되지 않고, 본 출원인은 이러한 면역원성 생성물의 투여가 천연 글리코실화된 hIgE에 대한 항-IgE 항체를 유도할 수 있음을 시사한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물에 포함된 hIgE 또는 이의 단편은 적어도 하나(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7)의 글리코실화를 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물에 포함된 hIgE 또는 이의 단편은 N394 글리코실화를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물에 포함된 hIgE 또는 이의 단편은 N275 글리코실화를 포함한다(아미노산이 서열번호 2와 같이 넘버링되는 경우).

또한, hIgE의 시알릴화는 IgE 이펙터 기능에서 역할을 할 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물에 포함된 hIgE 또는 이의 단편은 적어도 하나의 시알산 잔기를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물에 포함된 hIgE 또는 이의 단편은 임의의 시알산 잔기를 포함하지 않는다.

본 발명의 일 실시형태에서, IgE는 말과 IgE, 바람직하게는 재조합 말과 IgE이다. 말과 IgE 불변 영역은 서열번호 13의 서열을 갖고, 여기서 위치 1-93, 94-200, 201-307 및 308-419의 아미노산은 각각 도메인 Cε1, Cε2, Cε3 및 Cε4에 상응한다.

서열번호 13

VSKQAPLIFPLAACCKDTKTTNITLGCLVKGYFPGAWDAGPLNPSTMTFPAVFDQTSGLYTTISRVVASGKWAKQKFTCGVVHSQETFNKTFNACIVTFTPPTVKLFHSSCDPGGDSHTTIQLLCLISDYTPGDIDIVWLIEGQKVDEQFPTQASMKQEGSWPPTHSELNINQGQWASENTYTCQVTYKDMIFNQARKCTESDPPGVSVYLSPPSPLDLYVSKTPKITCLVVDLANVQGLSLNWSRESGEPLQKHTLATSEQFNKTFSVTSTLPVDTTDWIEGETYKCTVSHPDLPREVVRSIAKAPGKRLSPEVYVFLPPEEDQSSKDKVTLTCLIQNFFPADISVQWRRNNVLIQTDQQATTRPQKANGPDPAFFVFSRLEVSRAEWEQKNKFACKVVHEALSQRTLQKEVSKDPGK

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 13의 단편이고, 여기서 상기 단편은 서열번호 13의 적어도 약 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 또는 415개 아미노산(바람직하게는 연속 아미노산)을 포함한다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 13의 변이체이고, 여기서 상기 변이체는 서열번호 13과 적어도 약 70%, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 그 이상의 동일성을 나타낸다.

본 발명의 일 실시형태에서, IgE는 개과 IgE, 바람직하게는 재조합 개과 IgE이다. 개과 IgE 불변 영역은 서열번호 14의 서열을 갖는다.

서열번호 14

TSQDLSVFPLASCCKDNIASTSVTLGCLVTGYLPMSTTVTWDTGSLNKNVTTFPTTFHETYGLHSIVSQVTASGKWAKQRFTCSVAHAESTAINKTFSACALNFIPPTVKLFHSSCNPVGDTHTTIQLLCLISGYVPGDMEVIWLVDGQKATNIFPYTAPGTKEGNVTSTHSELNITQGEWVSQKTYTCQVTYQGFTFKDEARKCSESDPRGVTSYLSPPSPLDLYVHKAPKITCLVVDLATMEGMNLTWYRESKEPVNPGPLNKKDHFNGTITVTSTLPVNTNDWIEGETYYCRVTHPHLPKDIVRSIAKAPGKRAPPDVYLFLPPEEEQGTKDRVTLTCLIQNFFPADISVQWLRNDSPIQTDQYTTTGPHKVSGSRPAFFIFSRLEVSRVDWEQKNKFTCQVVHEALSGSRILQKWVSKTPGK

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 14의 단편이고, 여기서 상기 단편은 서열번호 14의 적어도 약 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 또는 425개 아미노산(바람직하게는 연속 아미노산)을 포함한다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 14의 변이체이고, 여기서 상기 변이체는 서열번호 14와 적어도 약 70%, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 그 이상의 동일성을 나타낸다.

본 발명의 일 실시형태에서, IgE는 고양이과 IgE, 바람직하게는 재조합 고양이과 IgE이다. 고양이과 IgE 불변 영역은 서열번호 15의 서열을 갖는다.

서열번호 15

AYISSGGNTDYADSVKGRFSISRDNAKNTLYLQMTSLKTEDTATYYCARGTGVIPDYWGQGALVTVSSTSIQAPLVFPLATCCKGTIATAPSVTLGCLVTGYFPMPVTVTWDARSLNKSVVTLPATLQENSGLYTTTSHVTVSGEWAKQKFTCSVAHAESPTINKTVSACTMNFIPPTVKLFHSSCNPLGDTGSTIQLLCLISGYVPGDMEVTWLVDGQKATNIFPYTAPGKQEGKVTSTHSELNITQGEWVSQKTYTCQVTYQGFTFEDHARKCTESDPRGVSTYLSPPSPLDLYVHKSPKITCLVVDLANTDGMILTWSRENGESVHPDPMVKKTQYNGTITVTSTLPVDATDWVEGETYQCKVTHPDLPKDIVRSIAKAPGRRFPPEVYVFLPPEGEPKTKDKVTLTCLIQNFFPPDISVQWLHNDSPVRTEQQATTWPHKATGPSPAFFVFSRLEVSRADWEQRDVFTCQVVHEALPGFRTLKKSVSKNPGK

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 15의 단편이고, 여기서 상기 단편은 서열번호 15의 적어도 약 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 또는 490개 아미노산(바람직하게는 연속 아미노산)을 포함한다.

일 실시형태에서, IgE 단편은 서열번호 15의 변이체이고, 여기서 상기 변이체는 서열번호 15와 적어도 약 70%, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 그 이상의 동일성을 나타낸다.

일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물은, 약 16:1 내지 약 1:4, 바람직하게는 약 8:1 내지 약 1:2, 보다 바람직하게는 약 1:1 범위의 IgE(또는 이의 단편):CRM₁₉₇ 몰비로 담체 단백질, 바람직하게는 CRM₁₉₇에 결합된 IgE 또는 이의 단편을 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물은 담체 단백질, 바람직하게는 CRM₁₉₇에 결합된 IgE 또는 IgE 단편을 포함하고, 항-IgE 항체에 의해 인식된다.

면역원성 생성물이 담체 단백질, 바람직하게는 CRM₁₉₇에 결합된 IgE 또는 IgE 단편을 포함하고 항-IgE 항체에 의해 인식된다는 사실은 당해 기술분야에 공지된 종래의 방법에 의해 검증될 수 있다. 이러한 방법의 예는, 예를 들면, 비오틴, 스트렙트아비딘 HRP 증폭 시스템 및 o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(OPD) 기질 용액으로 표지된 검출 항체를 사용하는 샌드위치 ELISA 항-IgE 또는 이의 단편/담체 단백질이다.

일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물은 담체 단백질, 바람직하게는 CRM₁₉₇에 결합된 IgE 또는 이의 단편을 포함하고, 면역원성이며, 이는 면역원성 생성물이 시험 A의 조건에서 생체내에서 항-IgE 항체를 유도할 수 있음을 의미한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물은, 예를 들면, 시험 A의 조건에서와 같이 생체내에서 폴리클로날 항-IgE 항체를 유도할 수 있다.

시험 A는 다음 방법에 따라 수행된다.

면역원성 생성물의 특정 양의 총 단백질(예를 들면, 브래드포드 단백질 검정에 의해 결정됨)을 마우스(3주령 이상)에 28일 동안 3회 주사한다. 일 실시형태에서, 시험 A는 약 10 내지 30㎍ 범위의 총 단백질 용량을 투여하는 것을 포함한다. 혈청 샘플은 면역화 전(면역전 혈청 샘플)과 면역화 후(시험 혈청 샘플)에서 수득된다. ELISA 항-IgE는 하기에 설명된 바와 같이 수행된다.

간단히 말하면, 인간 IgE 또는 CRM₁₉₇은 코팅 완충액(탄산염/중탄산염 완충액 pH 9.6)에서 각각 5 또는 1㎍/mL로 4℃에서 코팅하고, 밤새 인큐베이팅된다. 각 단계 후, 플레이트를 0.005%의 PBS 트윈 20으로 3회 세척한다. BSA 1% PBS로 차단한 후, 혈청 샘플을 첨가하고, 2000 dil^-1(PBS에서 희석, BSA 1%)에서 개시하여 2배 연속 희석을 수행했다. 37℃에서 90분간 인큐베이팅한 후, 결합된 항체를 1/10,000에서 HRP-접합된 염소 항-마우스 IgG(Bethyl Laboratories)로 검출하고, OPD 기질을 사용하여 플레이트를 명확하게 한다. 반응은 1M H₂SO₄로 중지하고, 흡광도를 490nm에서 연속적으로 기록한다. 샘플은 희석 2000 dil^-1에서 개시하여 최대 1,024,000 dil^- ¹까지 분석한다.

일 실시형태에서, 시험 혈청 샘플을 함유하는 웰의 광학 밀도(490nm)가 면역 전 혈청 샘플을 함유하는 웰의 광학 밀도보다 적어도 약 2배, 바람직하게는 적어도 약 5배 우수한 경우, 면역원성 생성물은 면역원성으로 간주되며, 이는 생체내에서 항-IgE 항체를 유도했음을 의미한다.

이 시험에서, 역가는 검정에서 상응하는 사전-면역 샘플의 ODmax - OD의 50%에 도달하는 혈청의 희석으로 정의될 수 있다. 이 계산 모드는 공지된 혈청전환 역가를 보는 것보다 훨씬 더 엄격할 수 있지만, 더 견고한 분석 및 더 적은 오인 양성을 제공할 수 있다. 역가는 혈청 희석 인자(dil^-1)로 표현될 수 있다.

일 실시형태에서, 시험 A에서, 역가 값 ≥ 1000 dil^- ¹, 바람직하게는 ≥ 2000 dil^-1은 본 발명의 면역원성 생성물이 IgE에 대한 결합 항체의 생성을 가능하게 한다는 것을 나타낸다.

일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물은 CRM₁₉₇에 결합된 IgE 또는 이의 단편을 포함하고, 이하 인용된 시험 B의 조건에서 IgE 활성을 중화시킬 수 있다. 본 발명에 따르면, 시험 B는 면역원성 생성물로 면역화된 마우스로부터 수득된 혈청의 중화능을 평가하기 위해 수행된다.

시험 B는 하기 방법에 따라 수행된다:

hFcεRI를 발현하는 골수-유래 배양 비만 세포(BMCMC)는 IgE/FcεRI 인간화된 마우스의 골수 세포를 IL-3(10ng/ml)가 함유된 배지에서 6주 동안 배양하여 수득하고, 이때 세포는 >95% c-Kit⁺hFcεRIα⁺이었다. 본 발명의 면역원성 생성물로 백신접종시 생성된 항-hIgE 항체의 중화능을 평가하기 위해, BMCMC를 본 발명의 면역원성 생성물 또는 CRM₁₉₇ 단독으로 백신접종한 마우스의 혈장 희석액과 함께 인큐베이팅한다. 이어서, FITC-표지된 hIgE를 첨가하고, BCMMC에서 hFcεRI에 대한 FITC-hIgE의 결합을 유세포 분석에 의해 평가한다.

결과는 IgE-FITC-양성 BMCMC의 백분율로 표시될 수 있다(hIgE 결합의 판독치로 사용됨). 가로 축에 IgE-FITC 결합의 50%를 초래하는 혈장 희석을 보간함으로써 NC₅₀을 이 시험에서 결정할 수 있다.

일 실시형태에서, 시험 B에서, NC₅₀ 값 ≥ 100 dil^- ¹, 바람직하게는 ≥ 200 dil^-1은 본 발명의 면역원성 생성물이 IgE에 대한 중화 항체의 생성을 가능하게 한다는 것을 나타낸다. 일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물의 투여에 의해 유도된 IgE에 대한 중화 항체는 폴리클로날 항체이다.

본 발명은 추가로 담체 단백질, 바람직하게는 CRM₁₉₇과 결합된 적어도 하나의 IgE 또는 이의 단편을 포함하는 면역원성 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이고, 여기서 바람직하게는 IgE 단편은 IgE Cε3 도메인을 포함하고, 상기 방법은

a) 면역글로불린 또는 이의 단편을 NHS-에스테르, 바람직하게는 N-[γ-말레이미도부티릴옥시]-숙신이미드 에스테르(sGMBS)를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제와 접촉시킴으로써, NHS-에스테르를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제와 면역글로불린 또는 이의 단편 사이의 복합체, 바람직하게는 sGMBS-면역글로불린 또는 이의 단편 복합체를 수득하는 단계;

c) NHS-에스테르를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제와 면역글로불린 또는 이의 단편 사이의 복합체, 바람직하게는 단계 (a)에서 수득된 sGMBS-면역글로불린 또는 이의 단편 복합체를, NHS-에스테르를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제와 담체 사이의 복합체, 바람직하게는 단계 (b)에서 수득된 담체-SATA 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다.

일 실시형태에서, 단계 a)에서, 반응 완충액은 액체, 바람직하게는 수성 용액이다.

일 실시형태에서, 단계 a)에서, 반응 완충액은 약 6 내지 약 8 범위의 pH, 바람직하게는 약 6.5 내지 약 7.5 범위, 보다 바람직하게는 약 pH 7.2이다.

일 실시형태에서, 단계 a)에서, IgE 또는 이의 단편은 약 0.1 내지 약 10mg/mL, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 5mg/ml, 보다 바람직하게는 약 1mg/mL 범위의 농도로 용액에 존재한다.

일 실시형태에서, 단계 a)에서, NHS-에스테르, 바람직하게는 sGMBS를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제는 반응 완충액에서 1mM 내지 100mM, 바람직하게는 5mM 내지 50mM, 보다 바람직하게는 10mM 범위의 농도로 제조된다.

일 실시형태에서, 단계 a)에서, IgE 또는 이의 단편, 및 NHS-에스테르, 바람직하게는 sGMBS를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제는 IgE(또는 이의 단편):NHS-에스테르, 바람직하게는 sGMBS를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제의 약 1:120 내지 약 1:1, 바람직하게는 약 1:50 내지 약 1:10, 보다 바람직하게는 약 1:40 내지 약 1:20 범위의 몰 비율로 혼합된다.

일 실시형태에서, 단계 a)에서, 적어도 하나의 IgE 또는 이의 단편은 약 30분 내지 약 120분, 바람직하게는 약 45분 내지 약 90분 범위, 보다 바람직하게는 적어도 60분 범위의 기간 동안 NHS-에스테르, 바람직하게는 sGMBS를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제와 함께 인큐베이팅된다.

일 실시형태에서, 단계 a)에서, 적어도 하나의 IgE 또는 이의 단편을 NHS-에스테르, 바람직하게는 sGMBS를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제와 접촉시키는 단계는 약 15℃ 내지 약 35℃, 바람직하게는 약 18℃ 내지 약 27℃ 범위의 온도에서 수행된다.

일 실시형태에서, 단계 a) 후에, 반응 혼합물에 존재하는 약 10kDa 미만, 약 5kDa 미만 또는 약 3kDa 미만의 분자량을 갖는 작은 화합물이 제거된다. 이러한 작은 화합물은 주로 NHS-에스테르(및 NHS-에스테르 가수분해-관련 부산물), 바람직하게는 sGMBS를 함유하는 과량의 헤테로이작용성 가교결합제, 및 반응하지 않은 과량의 분자를 포함한다. 이러한 제거는 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다(이러한 방법의 예에 대해서는 실시예 부분 참조).

일 실시형태에서, 단계 a)의 말단에서, 단백질 함량은 브래드포드 검정 또는 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정된다.

일 실시형태에서, 단계 b)에서, 반응 완충액은 액체, 바람직하게는 수성 용액이다.

일 실시형태에서, 단계 b)에서, 반응 완충액은 약 6 내지 약 8 범위, 바람직하게는 약 6.5 내지 약 7.5 범위의 pH, 보다 바람직하게는 약 pH 7.2이다.

일 실시형태에서, 단계 b)에서, 담체 단백질, 바람직하게는 CRM₁₉₇은 약 0.2 내지 약 20mg/mL, 바람직하게는 약 1 내지 약 10mg/ml, 더욱 바람직하게는 약 2mg/mL 범위의 농도로 용액에 존재한다.

일 실시형태에서, 단계 b)에서, NHS-에스테르, 바람직하게는 SATA를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제는 용액, 바람직하게는 DMSO에 20mM 내지 약 500mM, 바람직하게는 약 50mM 내지 약 200mM 및 보다 바람직하게는 약 100mM 범위의 농도로 존재한다.

일 실시형태에서, 단계 b)에서, 담체 단백질, 바람직하게는 CRM₁₉₇, 및 NHS-에스테르, 바람직하게는 SATA를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제는 담체:NHS-에스테르, 바람직하게는 SATA를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제가 약 1:320 내지 약 1:10, 바람직하게는 약 1:160 내지 약 1:40 범위의 몰 비로 혼합된다.

일 실시형태에서, 단계 b)에서, 담체 단백질, 바람직하게는 CRM₁₉₇은 NHS-에스테르, 바람직하게는 SATA를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제와 함께 약 10분 내지 약 60분, 바람직하게는 약 15분 내지 약 45분, 보다 바람직하게는 30분 동안 인큐베이팅된다.

일 실시형태에서, 접촉 단계 b)는 약 15℃ 내지 약 35℃, 바람직하게는 약 18℃ 내지 약 27℃ 범위의 온도에서 수행된다.

일 실시형태에서, 단계 b) 후에, 반응 혼합물에 존재하는 약 10kDa 미만, 약 5kDa 미만 또는 약 3kDa 미만의 분자량을 갖는 작은 화합물이 제거된다. 이들 작은 화합물은 주로 NHS-에스테르(및 NHS-에스테르 가수분해-관련 부산물), 바람직하게는 SATA를 함유하는 과량의 헤테로이작용성 가교결합제, DMSO 및 반응하지 않은 과량의 분자를 포함한다. 이러한 제거는 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.

일 실시형태에서, 단계 b) 후에, 담체 단백질, 바람직하게는 CRM₁₉₇과 NHS-에스테르, 바람직하게는 SATA를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제 사이의 복합체는 탈보호되어 보호 그룹(NHS-에스테르, 바람직하게는 SATA를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제)를 기능성 그룹으로 전환시킨다. 일 실시형태에서, 상기 탈보호 단계는 반응 혼합물에 존재하는 약 10kDa 미만, 약 5kDa 미만 또는 약 3kDa 미만의 분자량을 갖는 작은 화합물을 제거하는 단계 후에 수행된다.

분자를 탈보호하는 방법의 예는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 제한 없이, 하이드록실아민의 사용, 메톡실아민의 사용 또는 염기(예를 들면, NaOH, KOH, K₂CO₃, MeONa, 메탄올 중 NH₃)의 사용을 포함한다.

일 실시형태에서, 탈보호 단계는 바람직하게는 약 10mM 내지 약 500mM, 바람직하게는 약 20mM 내지 약 100mM, 더욱 바람직하게는 약 50mM 범위의 최종 농도로 하이드록실아민 용액을 반응 혼합물에 첨가하는 것을 포함한다.

일 실시형태에서, 하이드록실아민 용액은 약 60분 내지 약 180분, 바람직하게는 약 90분 내지 약 150분, 보다 바람직하게는 120분 범위의 기간 동안 반응 혼합물과 함께 인큐베이팅된다.

일 실시형태에서, 하이드록실아민 용액은 120분 동안 50mM에서 첨가된다.

일 실시형태에서, 하이드록실아민 용액과 반응 혼합물의 인큐베이팅은 약 15℃ 내지 약 35℃, 바람직하게는 약 18℃ 내지 약 27℃ 범위의 온도에서 수행된다.

일 실시형태에서, 탈보호 단계 후에, 반응 혼합물에 존재하는 약 10kDa, 5kDa 또는 3kDa 미만의 분자량을 갖는 작은 화합물이 제거된다. 이러한 작은 화합물은 주로 이전 단계로부터의 과량의 하이드록실아민 및 잠재적 잔류 SATA를 포함한다. 이러한 제거는 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.

일 실시형태에서, 단계 b)의 말단에서, 단백질 함량은 브래드포드 검정 또는 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정된다.

이어서, 본 발명의 방법의 단계 c)에서, 단계 a)의 최종 생성물을 단계 b)의 최종 생성물과 접촉시키고, 이에 의해 본 발명의 면역원성 생성물을 생성한다.

일 실시형태에서, 단계 c)에서, IgE 또는 IgE 단편을 포함하는 단계 a)의 최종 생성물 및 담체 단백질, 바람직하게는 CRM₁₉₇을 포함하는 단계 b)의 최종 생성물은, 약 8:1 내지 약 1:8, 바람직하게는 약 4:1 내지 약 1:4, 보다 바람직하게는 약 1:1 범위의 IgE 또는 이의 단편:담체 단백질, 바람직하게는 CRM₁₉₇의 몰비로 접촉된다.

일 실시형태에서, 단계 c)에서, IgE 또는 IgE 단편을 포함하는 단계 a)의 최종 생성물 및 담체 단백질, 바람직하게는 CRM₁₉₇을 포함하는 단계 b)의 최종 생성물은 약 0.01 내지 약 5mg/mL, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1mg/mL, 더 바람직하게는 약 0.4mg/mL 범위의 최종 단백질 농도에서 접촉된다.

일 실시형태에서, 단계 c)에서, 반응 완충액은 액체, 바람직하게는 수성 용액이다.

일 실시형태에서, 단계 c)에서, 반응 완충액은 약 6 내지 약 8 범위의 pH, 바람직하게는 약 6.5 내지 약 7.5 범위의 pH, 보다 바람직하게는 약 pH 7.2이다.

단계 c)의 일 실시형태에서, 접촉 단계는 약 2시간 내지 약 26시간, 바람직하게는 약 10 내지 18시간, 보다 바람직하게는 약 12 내지 약 18시간 범위의 기간 동안 수행된다.

일 실시형태에서, 인큐베이팅 단계 c)는 약 2℃ 내지 10℃, 바람직하게는 약 3℃ 내지 약 7℃, 보다 바람직하게는 약 4℃ 범위의 온도에서 수행된다.

일 실시형태에서, 단계 c) 이후, 반응 혼합물에 존재하는 약 100kDa 미만, 약 50kDa 미만, 약 25kDa 미만, 약 10kDa 미만, 약 5kDa 미만 또는 약 3kDa 미만의 분자량을 갖는 작은 화합물이 제거된다. 이러한 작은 화합물은 주로 반응하지 않은 과량의 분자를 포함한다. 이러한 제거는 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.

일 실시형태에서, 단계 c)에서 수득된 면역원성 생성물은 농축된다. 면역원성 생성물의 농축은 당해 기술분야에 공지된 임의의 기술, 예를 들면, 임의로 멸균 여과와 조합될 수 있는 원심 한외여과 방법에 의해 당업자에 의해 수행될 수 있다.

일 실시형태에서, 단계 c)에서 수득되고 임의로 농축된 면역원성 생성물은 동결건조된다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 면역원성 생성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 면역원성 생성물을 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성되거나, 이들로 구성되는 조성물에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 상기 조성물은 면역원성 조성물로 지칭될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 면역원성 생성물 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성되거나, 이들로 구성되는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 부형제는 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대, 인간 혈청 알부민, 완충 물질, 예컨대, 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스-기반 물질(예를 들면, 나트륨 카복시메틸셀룰로스), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 폴리머, 폴리에틸렌 글리콜 및 울 지방을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.

본 발명은 또한 상기 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 면역원성 생성물을 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성되거나, 이들로 구성되는 의약에 관한 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 조성물, 약제학적 조성물 또는 의약과 관련하여 용어 "본질적으로 이들로 구성되는"은 본 발명의 적어도 하나의 면역원성 생성물이 상기 조성물, 약제학적 조성물 또는 의약 내에서 생물학적 활성을 갖는 유일한 치료제 또는 약제인 것을 의미한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 조성물, 약제학적 조성물 또는 의약은 담체 단백질, 바람직하게는 CRM₁₉₇과 결합된 IgE 또는 IgE 단편을 포함하는 면역원성 생성물을 포함하거나 본질적으로 이들로 구성된다.

일 실시형태에서, 본 발명의 조성물, 약제학적 조성물 또는 의약은 백신 조성물이다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 백신 조성물은 하나 이상의 보조제를 포함한다.

본 발명은 추가로 본 발명의 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신의 제형에 관한 것이고, 상기 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신은 애주번트화된다.

일 실시형태에서, 본 발명의 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신은 따라서 하나 이상의 보조제를 포함한다.

본 발명에 사용될 수 있는 적합한 보조제는 다음을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다:

(1) 알루미늄 염(명반), 예를 들면, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄;

(2) 수중유 에멀젼 제형(다른 특정 면역자극제, 예를 들면, 무라밀 펩티드(하기에 정의됨) 또는 박테리아 세포벽 성분을 포함하거나 포함하지 않음), 예를 들면, 스쿠알렌계 에멀젼(예를 들면, 스쿠알렌계 수중유 에멀젼) 또는 스쿠알란계 에멀젼, 예를 들면,

(a) 모델 100Y 미세유동화기(Microfluidics, Newton, Mass.) 등의 미세유동화기를 사용하여 서브마이크론 입자로 제형화된 5% 스쿠알렌, 0.5% 트윈 80 및 0.5% 스팬 85(임의로 다양한 양의 MTP-PE(하기 참조, 필수는 아니지만)을 함유하는 MF59(PCT 공개번호 WO 90/14837에 기재된 스쿠알렌계 수중유 보조제),

(b) SWE01(수중유 스쿠알렌계 보조제),

(c) 서브마이크론 에멀젼으로 미세유동화되거나 와동되어 보다 큰 입자 크기 에멀젼을 생성하는, 10% 스쿠알렌, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉-차단된 폴리머 L121 및 thr-MDP(하기 참조)를 함유하는 SAF,

(d) 2% 스쿠알렌, 0.2% 트윈 80, 및 미국 특허 제4,912,094호(Corixa)에 기재된 3-O-데아밀화된 모노포스포릴리피드 A(MPL^TM), 트레할로스 디미콜레이트(TDM) 및 세포벽 골격(CWS), 바람직하게는 MPL+CWS(Detox^TM)로 이루어진 그룹으로부터 하나 이상의 박테리아 세포벽 성분을 함유하는 Ribi^TM 보조제 시스템(RAS), (Corixa, Hamilton, Mont.);

(e) 하기 조성을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 스쿠알란계 보조제: 스쿠알란 3.9%, w/v, 소르비탄 트리올레이트(0.47%, w/v), 및 시트레이트 완충액에 분산된 폴리옥시에틸렌(80) 소르비탄 모노올레이트(0.47%, w/v);

(3) 유중수 에멀젼 제형, 예를 들면, ISA-51 또는 스쿠알렌계 유중수 보조제(예를 들면, ISA-720); 유중수 에멀젼에 사용하기에 적합한 오일 보조제는 미네랄 오일 및/또는 대사가능한 오일을 포함할 수 있다. 미네랄 오일은 베이올(Bayol^®), 마르콜(Marcol^®) 및 드라케올(Drakeol^®) 6VR(SEPPIC, 프랑스)을 포함하는 드라케올(Drakeol^®)로부터 선택될 수 있다. 대사가능한 오일은 SP 오일(이하 기재됨), 에멀시겐(Emulsigen)(MPV Laboratories, Ralston, NZ), 몬타나이드(Montanide) 264,266,26(Seppic SA, Paris, France), 뿐만 아니라 식물성 오일, 동물성 오일, 예컨대, 어유 스쿠알란, 스쿠알렌, 토코페롤 및 이의 유도체로부터 선택될 수 있다;

(4) 사포닌 보조제, 예를 들면, 퀼(Quil) A 또는 스티물론(STIMULON^TM) QS-21(Antigenics, Framingham, Mass.)(미국 특허 제5,057,540호), 또는 ISCOM(면역자극 복합체) 등의 이로부터 생성된 입자가 사용될 수 있다;

(5) 박테리아 리포폴리사카라이드, 합성 lipidA 유사체, 예컨대, 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물(AGP), 또는 이의 유도체 또는 유사체(이는 코릭사(Corixa)로부터 입수할 수 있고, 미국 특허 제6,113,918호에 기재되어 있음); 이러한 AGP 중 하나는 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]에틸 2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3테트라데카노일옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]-b-D글루코피라노시드(이들은 또한 529(이전에 RC529로서 공지됨)로서 공지되고, 수성 형태 또는 안정한 에멀젼으로 제형화됨), 합성 폴리뉴클레오티드, 예컨대, CpG 모티프(들)를 함유하는 올리고뉴클레오티드(미국 특허 제6,207,646호);

(6) 사이토카인, 예컨대, 인터류킨(예를 들면, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 등), 인터페론(예를 들면, 감마 인터페론), 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 마크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF), 공자극 분자 B7-1 및 B7-2 등;

(7) 박테리아 ADP-리보실화 독소의 탈독소화된 돌연변이체, 예컨대, 야생형 또는 돌연변이 형태의 콜레라 독소(CT), 예를 들면, 아미노산 위치 29의 글루탐산이 공개된 국제 특허 출원 제WO 00/18434호(또한 WO 02/098368 및 WO 02/098369 참조)에 따라 또 다른 아미노산, 바람직하게는 히스티딘에 의해 치환된 돌연변이체, 백일해 독소(PT) 또는 이. 콜라이 열-불안정한 독소(LT), 특히 LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129(예를 들면, WO 93/13302 및 WO92/19265 참조); 및

(8) 조성물의 유효성을 증강시키기 위한 면역자극제로 작용하는 기타 물질. 무라밀 펩티드는 N-아세틸무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸노르무라밀-L-알라닌-2-(1'-2'디팔미토일-sn-글리세로-3하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(MTP-PE) 등이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.

사용되는 보조제는 부분적으로 수용체 생물에 따라 달라질 수 있다. 또한, 투여할 보조제의 양은 동물의 유형 및 크기에 따라 달라진다.

일 실시형태에서, 본 발명의 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신 조성물은 하나 이상의 계면활성제, 및 임의로 상기 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 보조제를 추가로 포함하는 에멀젼이다(또는 이를 포함한다). 일 실시형태에서, 에멀젼은 유중수 에멀젼 또는 수중유 에멀젼이다.

본 발명에서 사용될 수 있는 계면활성제의 예는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 아를라셀(Arlacel)(SEPPIC, France)에서 시판되는 몬타니드(Montanide^®) 80, 트윈 20, 트윈 80, 스판(span) 85, 트리톤 X-100 등의 만니드 모노올레이트를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다.

일 실시형태에서, 본 발명의 조성물, 약제학적 조성물, 의약, 백신 조성물은 치료학적 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 면역원성 생성물을 포함한다.

일 실시형태에서 및 저장 목적을 위해, 본 발명의 면역원성 생성물 또는 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신 조성물은 동결건조된다.

일 실시형태에서, 본 발명의 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신 조성물은 따라서 동결 건조된(동결건조된) 형태로 제공될 수 있다. 이 실시형태에 따르면, 본 발명의 면역원성 생성물은 하나 이상의 동결건조 보조 물질과 조합된다. 다양한 동결건조 보조 물질은 당업자에게 공지되어 있으며, 제한 없이, 락토스 및 만니톨 등의 당을 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신 조성물은, 예를 들면, 분해되기 쉬운 단백질이 분해되는 것을 보호하거나, 면역원성 생성물의 저장 수명을 증강시키거나, 동결-건조 효율을 개선하기 위해 안정화제와 혼합될 수 있다. 유용한 안정화제에는 SPGA, 탄수화물(예를 들면, 소르비톨, 만니톨, 트레할로스, 전분, 수크로스, 덱스트란 또는 글루코스), 단백질(예를 들면, 알부민 또는 카제인 또는 이들의 분해 생성물), 예를 들면, 라이신 또는 글리신과 같은 아미노산의 혼합물 및, 예를 들면, 알칼리 금속 인산염과 같은 완충제가 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.

일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물, 조성물, 약제학적 조성물 또는 백신 조성물은 주사에 의해, 국소적으로(예를 들면, 경피 전달에 의해), 직장으로, 비강으로 또는 질로 투여될 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물, 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신 조성물은 주사에 적합한 형태이다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물, 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신 조성물은 근육내, 복강내 또는 피하 주사에 의해 대상체에게 주사(또는 주사용)된다.

주사용에 적합한 형태의 예에는 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉시 제조를 위한 멸균 용액 또는 분산액 및 멸균 분말이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 미생물에 의한 오염 방지는, 예를 들면, 다양한 항균제 및 항진균제(예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등)와 같은 방부제를 조성물에 첨가함으로써 이루어질 수 있다. 일 실시형태에서, 주사 동안 통증을 감소시키기 위해, 등장화제, 예를 들면, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 일 실시형태에서, 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 주사가능한 조성물의 흡수를 연장시킬 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명의 동결건조된 백신 조성물은 주사용수에 용해되고 온화하게 혼합되며; 이어서 상기 본원에 기재된 바와 같은 면역보조제를 첨가하고; 혼합물을 온화하게 혼합하고 적절한 주사기에 충전한다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 백신 조성물로 충전되거나 사전 충전된 주사기를 포함하는 의료 기기에 관한 것이다.

일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물, 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신 조성물은 국소 투여용으로 적합한 형태이다. 국소 투여에 적합한 형태의 예에는 중합체 패치 또는 제어-방출 패치 등이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 생성물, 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신 조성물은 직장 투여에 적합한 형태이다. 직장 투여에 적합한 형태의 예에는 좌약, 미세 관장제, 관장제, 겔, 직장 발포제, 크림, 연고 등이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.

본 발명은 또한 본 발명의 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신 조성물로 충전되거나 사전 충전된 주사기인 의료 기기에 관한 것이다.

일 실시형태에서, 상기 주사기는 이중 챔버 주사기이며, 여기서 하나의 챔버는 본 발명의 면역원성 생성물을 갖는 용액을 포함하고, 다른 챔버는 보조제를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 면역원성 생성물 또는 본 발명의 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신 조성물로 사전 충전된 바이알을 포함하는 의료 기기에 관한 것이다.

본 발명은 또한 의약 또는 약물로서 사용하기 위한 본 발명의 면역원성 생성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 대상체의 염증성 장애를 치료하기 위한 본 발명의 면역원성 생성물, 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 대상체의 염증성 장애를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 면역원성 생성물의 용도에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 또한 대상체에게 본 발명의 면역원성 생성물, 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 염증성 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 면역원성 생성물, 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 IgE에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 면역원성 생성물, 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, IgE의 생물학적 활성을 억제하거나 생물학적 활성을 중화시키는 항체의 생산을 대상체에서 유도하는 방법에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 항체는 폴리클로날 항체이다.

일 실시형태에서, 대상체는 염증성 장애, 특히 비정상적 총 IgE 발현 또는 활성 및/또는 알레르겐-특이적 IgE의 발현과 관련된 염증성 장애로 영향을 받고, 바람직하게는 진단된다.

일 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 바람직하게는, 이 실시형태에 따르면, 본 발명의 면역원성 생성물에 포함된 적어도 하나의 IgE 또는 이의 단편은 인간으로부터 유래한다.

일 실시형태에서, 대상체는 비인간 포유동물(예를 들면, 애완동물)이다. 바람직하게는, 이 실시형태에 따르면, 본 발명의 면역원성 생성물에 포함된 적어도 하나의 IgE 또는 이의 단편은 상기 비-인간 포유동물로부터 유래한다.

일 실시형태에서, 대상체는 말, 개 또는 고양이이다. 바람직하게는, 이 실시형태에 따르면, 본 발명의 면역원성 생성물에 포함된 적어도 하나의 IgE 또는 이의 단편은 각각 말과, 개과 또는 고양이과이다.

일 실시형태에서, 염증성 장애는 비정상적 IgE 발현 또는 활성과 관련된 장애이다.

염증성 장애의 예로는 천식(asthma), 알레르기성 병태(allergic conditions)(예를 들면, 음식 알레르기(food allergies), 독 알레르기(venom allergy), 동물에 대한 알레르기(allergy to animals), 약물 알레르기(drug allergy), 과민증 IgE 증후군(hyper IgE syndrome), 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 알레르기성 결막염(allergic conjunctivitis) 및 알레르기성 장위염(allergic enterogastritis)), 아나필락시스(anaphylaxis), 아토피성 장애(atopic disorders)(예를 들면, 두드러기(urticaria)(만성 특발성 두드러기(chronic idiopathic urticaria) 및 만성 자발성 두드러기(chronic spontaneous urticaria)를 포함), 습진(eczema)), 수포성 유천포창(bullous pemphigoid), 호흡기 장애(respiratory disorders)(예를 들면, 천식(asthma), 알레르기성 기관지폐 아스퍼길루스증(allergic bronchopulmonary aspergilosis), 알레르기성 기관지폐 진균증(allergic bronchopulmonary mycosis)), 비용종(nasal polyposis) 및 기도 염증을 수반하는 기타 병태(예를 들면, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 전신 경화증(systemic sclerosis; SSc)을 포함한 호산구(eosinophilia), 섬유증(fibrosis) 및 과도한 점액 생성(excess mucus)); 염증성 및/또는 자가면역 장애 또는 병태, 위장 장애 또는 병태(예를 들면, 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases; IBD) 및 호산구성 식도염(eosinophilic esophagitis; EE), 및 호산구성-매개된 위장병(eosinophilic-mediated gastrointestinal disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 크론병(Crohn's disease)); 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus); 비만 세포증(mastocytosis) 및 비만 세포 활성화 증후군(mast cell activation syndrome; MCAS)이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.

일 실시형태에서, 염증성 장애는 천식(예를 들면, 알레르기성 천식), 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기(예를 들면, 음식 또는 독 알레르기), 아나필락시스 및 비용종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일 실시형태에서, 염증성 장애는 천식(예를 들면, 알레르기성 천식), 알레르기(예를 들면, 음식 또는 독 알레르기) 및 아나필락시스로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일 실시형태에서, 염증성 장애는 알레르기성 천식이다.

본 발명은 또한 특정 항원에 대해 알레르기가 있는 대상체의 탈감작을 유도하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 대상체에게 본 발명의 면역원성 생성물, 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신 조성물 및 상기 알레르겐을 투여하는 것을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 알레르겐 면역요법, 탈감작 또는 저-감작 또는 알레르기 백신접종으로도 공지된 용어 "탈감작"은 알레르기성 천식과 같은 환경적 알레르기에 대한 의학적 치료를 지칭한다. 이러한 치료에는 알레르겐의 존재하에 면역계의 반응을 감소시키기 위해 사람들을 점점 더 많은 양의 알레르겐에 노출시키는 것이 포함된다.

알레르겐의 예로는 흡입 알레르겐, 섭취 알레르겐 및 접촉 알레르겐이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.

흡입 알레르겐의 예는 아스티그마타(Astigmata)(예: Acarus siro(스토리지 진드기, Aca s 13), 블로미아 트로피칼리스(Blomia tropicalis)(진드기, Blo t), 더마토파고이데스 파리나에(Dermatophagoides farinae)(미국 집먼지 진드기, Der f), 더마토파고이데스 마이크로세라스(Dermatophagoides microceras)(집먼지 진드기, Der m), 더마토파고이데스 테로니씨누스(Dermatophagoides pteronyssinus)(유럽 집먼지 진드기, Der p), 유로글리푸스 마이네이(Euroglyphus maynei)(집먼지 진드기, Eur m), 글리시파구스 도메스티쿠스(Glycyphagus domesticus)(스토리지 진드기, Gly d 2), 레피도글리푸스 데스트럭터(Lepidoglyphus destructor)(스토리지 진드기, Lep d), 티로파구스 푸트레센티아에(Tyrophagus putrescentiae)(스토리지 진드기, Tyr p)); 블라타리아(Blattaria)(예를 들면, 블라텔라 게르마니카(Blattella germanica)(독일 바퀴벌레, Bla g), 페리플라네타 아메리카나(Periplaneta americana)(미국 바퀴벌레, Per a)); 콜레오프테라(Coleoptera)(예를 들면, 하르모니아 악시리디스(Harmonia axyridis)(아시아 무당벌레, Har a)), 디프테라(Diptera)(예를 들면, 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti)(황열병 모기, Aed a), 키로모무스 키이엔시스(Chironomus kiiensis)(깔따구(Midge), Chi k), 키로노무스 툼미 툼미(Chironomus thummi thummi)(깔따구, Chi t), 포르시포미이아 타이와나(Forcipomyia taiwana)(무는 깔따구, For t), 글로시나 모르시탄스(Glossina morsitans)(Savannah Tsetse 파리, Glo m), 헤미디프테라(Hemidipter): 트리아토마 프로트랙타(Triatoma protracta)(캘리포니아 키싱 벌레, Tria p)), 하이메노프테라(Hymenoptera)(예를 들면, 아피스 세라나(Apis cerana)(동부 하이브 꿀벌, Api c), 아피스 오르사타(Apis dorsata)(자이언트 꿀벌, Api d), 아피스 멜리페라(Apis mellifera)(꿀벌, Api m), 봄부스 펜실바니쿠스(Bombus pennsylvanicus)(범블 비, Bom p), 봄부스 테레스트리스(Bombus terrestris)(범블 비, Bom t), 돌리코베스풀라 아레나리아(Dolichovespula arearia)(황색 호넷, Dol a), 돌리코베스풀라 마쿨라타(Dolichovespula maculata)(흰색 얼굴 호넷, Dol m), 미르메시아 필로술라(Myrmecia pilosula)(호주 점퍼 개미, Myr p), 폴리스테스 안눌라리스(Polistes annularis)(말벌, Pol a), 폴리스테스 도미눌루스(Polistes dominulus)(지중해 종이 말벌, Pol d), 폴리스테스 엑스클라만스(Polistes exclamans)(말벌, Pol e), 폴리스테스 푸스카투스(Polistes fuscatus)(말벌, Pol f), 폴리스테스 갈리쿠스(Polistes gallicus)(말벌, Pol g), 폴리스테스 메트리쿠스(Polistes metricus)(말벌, Pol m), 폴리비아 폴리스타(Polybia paulista)(말벌, Pol p), 폴리비아 스쿠텔라리스(Polybia scutellaris)(말벌, Pol s), 솔레놉시스 게미나타(Solenopsis geminata)(열대 불개미, Sol g), 솔레놉시스 인빅타(Solenopsis invicta)(붉은 수입 불개미, Sol i), 솔레놉시스 리취테리(Solenopsis richteri)(검은 불개미, Sol r), 솔레놉시스 사에비씨마(Solenopsis saevissima)(브라질 불개미, Sol s), 베스파 크라브로(Vespa crabro)(유럽 호넷, Vesp c), 베스파 만다리니아(Vespa mandarinia)(자이언트 아시아 호넷, Vesp m), 베스풀라 피아보필로사(Vespula fiavopilosa)(옐로우 재킷, Vesp f), 베스풀라 게르마니카(Vespula germanica)(옐로우 재킷, Vesp g), 베스풀라 마쿨리프론스(Vespula maculifrons)(옐로우 재킷, Vesp m), 베스풀라 펜실바니카(Vespula pensylvanica)(옐로우 재킷, Vesp s), 바스풀라 스쿠아모사(Vespula squamosa)(옐로우 재킷, Vesp s), 베스풀라 비두아(Vespula vidua)(말벌, Vesp vi), 베스풀라 불가리스(Vespula vulgaris)(옐로우 재킷, Vesp v)), 익소디다(Ixodida)(예를 들면, 아르가스 레플렉수스(Argas reflexus)(비둘기 진드기, Arg r)), 레피도프테라(Lepidoptera)(예를 들면, 봄빅스 니오리(Bombyx niori)(실크 나방, Bomb n), 플로디아 인터펀크텔라(Plodia interpunctella)(인디안밀 나방, Plo i), 타우메토포에아 피티오캄파(Thaumetopoea pityocampa)(소나무 줄기나방, Tha p)), 티사누라(Thysanura)(예를 들면, 레피스마 사카리나(Lepisma saccharina)(실버피쉬(Silverfish), Lep s)), 시포나프테라(Siphonaptera)(예를 들면, 크테노세팔리데스 펠리스 펠리스(Ctenocephalides felis felis)(고양이 벼룩, Cte f)), 카르니보라(Carnivora)(예를 들면, 카니스 패밀리아리스(Canis familiaris)(개, Can f), 펠리스 도메스티쿠스(Felis domesticus)(고양이, Fel d)); 라고모르파(Lagomorpha)(예를 들면, 오릭톨라구스 쿠닐쿨루스(Oryctolagus cuniculus)(래빗, Ory c), 페리쏘닥트릴라(Perissodactlyla): 에쿠스 카발루스(Equus caballus)(가축 말, Equ c)), 플레우로넥티포르메스(Pleuronectiformes)(예를 들면, 레피도르홈부스 휘피아고니스(Lepidorhombus whiffiagonis)(Megrim, Whiff, Gallo, Lep w)), 로덴티아(Rodentia)(예를 들면, 카비아 포르셀루스(Cavia porcellus)(기니아 피그, Cav p), 무스 무스쿨루스(Mus musculus)(마우스, Mus m), 라투스 노르베기우스(Rattus norvegius)(랫트, Rat n)); 코니페랄레스(Coniferales): 샤마에시파리스 오브투사(Chamaecyparis obtusa)(일본 사이프레스, Cha o), 쿠프레쑤스 아리조니카(Cupressus arizonica)(사이프레스, Cup a), 크립토메리아 자포니카(Cryptomeria japonica)(삼나무, Cry j), 쿠프레쑤스 셈페르비렌스Cupressus sempervirens)(일반적 사이프레스, Cup s), 주니페루스 아쉐이(Juniperus ashei)(산 삼나무, Jun a), 주니페루스 옥시세드루스(Juniperus oxycedrus)(가시 주니퍼(Prickly juniper), Jun o), 주니페루스 사비노이데스(Juniperus sabinoides)(산 삼나무, Jun s), 주니페루스 비르기니아나(Juniperus virginiana)(동부 적색 삼나무, Jun v)); 겐티아날레스(Gentianales)(예를 들면, 카타란투스 로세우스(Catharanthus roseus)(로시 페리윙클(Rosy periwinkle), Cat r)); 포알레스(Poales)(예를 들면, 안톡산툼 오도라툼(Anthoxanthum odoratum)(스위트 베르날 잔디(Sweet vernal grass), Ant o 1), 사이노돈 닥틸론(Cynodon dactylon)(버뮤다 잔디, Cyn d 1, Cyn d 7, Cyn d 12, Cyn d 15, Cyn d 22w, Cyn d 23, Cyn d 24), 닥틸리스 글로메라타(Dactylis glomerata)(과수원 잔디, Dae g 1, Dae g 2, Dae g 3, Dae g 4, Dae g 5), 페스투카 프라텐시스(Festuca pratensis)(메도우 페스쿠에(Meadow fescue), Fes p 4)), 홀쿠스 란타누스(Holcus lanatus)(벨벳 잔디, Hol l 1, Hol l 5), 호르데움 불가레(Hordeum vulgare)(보리, Hor v 1, Hor v 5, Hor v 12, Hor v 15, Hor v 16, Hor v 17, Hor v 21), 로리움 페렌네(Lolium perenne)(호밀 잔디, Lol p 1, Lol p 2, Lol p 3, Lol p 4, Lol p 5, Lol p 11), 오리자 사티바(Oryza sativa)(벼, Ory s 1, Ory s 12), 파스팔룸 노타룸(Paspalum notarum)(바히아 잔디, Pas n 1), 팔라리스 아무아티카(Phalaris aquatica)(카나리아 잔디, Pha a 1, Pha a 5), 플레움 프라텐세(Phleum pratense)(티모티, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 7, Phl p 11, Phl p 12, Phl p 13), 포아 프라텐시스(Poa pratensis)(켄터키 블루 잔디, Poa p 1, Poa p 5), 세칼레 시리얼(Secale cereale)(호밀, Sec c 1, Sec c 20), 소굼 할레펜세(Sorghum halepense)(존슨 잔디, Sor h 1), 트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum)(밀, Tri a 12, Tri a 14, Tri a 185, Tri a 19, Tri a 25, Tri a 26, Tri a 27, Tri a 28, Tri a 29, Tri a 30), 제아 메이스(Zea mays)(옥수수, Zea m 1, Zea m 12, Zea m 14, Zea m 25), 파갈레스(Fagales): 알누스 글루티노사(Alnus glutinosa)(알더, Aln g 1, Aln g 4), 베툴라 베루코사(Betula verrucosa)(자작나무, Bet v 1, Bet v 2, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 5, Bet v 6, Bet v 7), 카르피누스 베툭스(Carpinus betuhxs)(호른빔(Hornbeam), Car b 1)); 라미알레스(Lamiales)(예를 들면, 프락시누스 엑스셀시오르(Fraxinus excelsior)(애쉬, Fra el), 리구스트룸 불가레(Ligustrum vulgare)(푸리베트(Privet), Lig v), 시린가 불가리스(Syringa vulgaris)(라일락, Syr v)); 말피기알레스(Malpighiales)(예를 들면, 헤베아 브라실리엔시스(Hevea brasiliensis)(파라 고무나무(라텍스), Hev b 1, Hev b 2, Hev b 3, Hev b 4, Hev b 5, Hev b 6, Hev b 7, Hev b 8, Hev b 9, Hev b 10, Hev b 11, Hev b 12, Hev b 13)); 프로테알레스(Proteales)(예를 들면, 플라타너스 아세리폴리아(Platanus acerifolia)(런던 플라타너스, Pla a 1, Pla a 2, Pla a 3), 플라타누스 오리엔탈리스(Platanus orientalis)(오리엔탈 플라타너스, Pla or 1, Pla or 2, Pla or 3))이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.

일 실시형태에서, 흡입된 알레르겐은 아카루스 시로(Acarus siro)(스토리지 진드기, Aca s 13), 더마토파고이데스 파리나에(Dermatophagoides farinae)(미국 집먼지 진드기, Der f), 더마토파고이데스 마이크로세라스(Dermatophagoides microceras)(집먼지 진드기, Der m), 더마토파고이데스 프테로니씨누스(Dermatophagoides pteronyssinus)(유럽 집먼지 진드기, Der p), 유로글리푸스 마이네이(Euroglyphus maynei)(집먼지 진드기, Eur m), 글리시파구스 도메스티쿠스(Glycyphagus domesticus)(스토리지 진드기, Gly d 2), 폴리스테스 안눌라리스(Polistes annularis)(말벌, Pol a), 폴리스테스 도미눌루스(Polistes dominulus)(지중해 종이 말벌, Pol d), 폴리스테스 엑클라만스(Polistes exclamans)(말벌, Pol e), 폴리스테스 푸스카투스(Polistes fuscatus)(말벌, Pol f), 폴리스테스 갈리쿠스(Polistes gallicus)(말벌, Pol g), 폴리스테스 메트리쿠스(Polistes metricus)(말벌, Pol m), 폴리비아 파울리스타(Polybia paulista)(말벌, Pol p), 폴리비아 스쿠텔라리스(Polybia scutellaris)(말벌, Pol s), 펠리스 도메스티쿠스(Felis domesticus)(고양이, Fel d), 포알레스(Poales) 및 베툴라 베루코세(Betula verrucose)(자작나무, Bet v 1, Bet v 2, Bet v 3, Bet v 4 , Bet v 5, Bet v 6, Bet v 7)를 포함하거나 이들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

섭취된 알레르겐의 예에는 진균 아스코마이코타(Fungi Ascomycota), 예를 들면, 도티데알레스(Dothideales)(예를 들면, 알테르나리아 알테르나타(Alternaria alternata)(알테르나리아 로트(Alternaria rot) 진균, Alt a), 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cladosporium cladosporioides)(Cla c), 클라도스포리움 헤르바룸(Cladosporium herbarum)(Cla h), 쿠르불라리아 루나타(Curvularia lunata) (Cur l), - 유로티알레스(Eurotiales): 아스퍼길루스 플라부스(Aspergillus flavus)(Asp fl), 아스퍼길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)(Asp f), 아스퍼길루스 니거(Aspergillus niger)(Asp n), 아스퍼길루스 오리자에(Aspergillus oryzae)(Asp o), 페니실리움 브레비콤팍툼(Penicillium brevicompactum)(Pen b), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum)(Pen ch), 페니실리움 시트리눔(Penicillium citrinum)(Pen c), 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum)(Pen o)), 하이포크레알레스(Hypocreales)(예를 들면, 푸사리움 쿨모룸(Fusarium culmorum)(Fus c)); 오니게날레스(Onygenales)(예를 들면, 트리코파이톤 루브룸(Trichophyton rubrum)(Tri r), 트리코피톤 톤수란스(Trichophyton tonsurans)(Tri t), 사카로마이세탈레스(Saccharomycetales): 칸디다 알비칸스(Candida albicans)(효모, Cand a), 칸디다 보이디니이(Candida boidinii)(효모, Cand b)); 투베르쿨라리알레스(Tuberculariales)(예를 들면, 에피코쿰 푸르푸라센스(Epicoccum purpurascens)(Epi p))로부터의 알레르겐, 진균 바시디오마이코타(Fungi Basidiomycota), 예를 들면, 하이메노마이세테스(Hymenomycetes)(예를 들면, 코프리누스 코마투스(Coprinus comatus)(샤기 마네(Shaggy mane), Cop c), 실로사이베 쿠벤시스(Psilocybe cubensis)(마법 버섯, Psi c), 우레이디니오마이세테스(Urediniomycetes)(예를 들면, 로도토룰라 무실라기노사(Rhodotorula mucilaginosa)(효모, Rho m))로부터의 알레르겐; 우스틸라기노마이세테스(Ustilaginomycetes)(예를 들면, 말라세지아 푸르푸르(Malassezia furfur)(피티리아시스 베르시콜라(Pityriasis versicolor) 감염제, Mala f), 말라세지아 심포디알리스(Malassezia sympodialis)(Mala s)); 항생물질(예를 들면, 페니실린, 세팔로스포린, 아미노사이드, 퀴놀론, 마크롤라이드, 테트라사이클린, 술파미드); 약물(예를 들면, 아세틸살리실산, 백신, 모르핀 및 유도체); 예를 들면, 비타민 K1과 같은 비타민; 및 식품 알레르겐(예를 들면, 우유, 계란, 땅콩, 견과류(호두, 캐슈 등), 생선, 조개류, 콩, 밀, 및 당근, 사과, 배, 아보카도, 살구, 복숭아로부터의 알레르겐 등)이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.

일 실시형태에서, 섭취된 알레르겐은 식품 알레르겐이다.

일 실시형태에서, 식품 알레르겐은 우유, 계란, 땅콩, 견과류(호두, 캐슈 등), 생선, 조개류, 콩, 밀 및 당근, 사과, 배, 아보카도, 살구, 복숭아로부터의 알레르겐을 포함하거나 이들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

접촉 알레르겐의 예에는 중금속(예: 니켈, 크롬, 금), 라텍스, 합텐(예: 할로탄, 하이드랄라진)이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.

일 실시형태에서, 알레르겐은 아카루스 시로(Acarus siro)(스토리지 진드기, Aca s 13), 더마토파고이데스 파리나에(Dermatophagoides farinae)(미국 집먼지 진드기, Der f), 더마토파고이데스 마이크로세라스(Dermatophagoides microceras)(집먼지 진드기, Der m), 더마토파고이데스 프테로니씨누스(Dermatophagoides pteronyssinus)(유럽 집먼지 진드기, Der p), 유로그릴푸스 마이네이(Euroglyphus maynei)(집먼지 진드기, Eur m), 글리시파구스 도메스티쿠스(Glycyphagus domesticus)(스토리지 진드기, Gly d 2), 폴리스테스 애눌라리스(Polistes annularis)(말벌, Pol a), 폴리스테스 도미눌루스(Polistes dominulus)(지중해 종이 말벌, Pol d), 폴리스테스 엑클라만스(Polistes exclamans)(말벌, Pol e), 폴리스테스 푸스카투스(Polistes fuscatus)(말벌, Pol f), 폴리스테스 갈리쿠스(Polistes gallicus)(말벌, Pol g), 폴리스테스 메트리쿠스(Polistes metricus)(말벌, Pol m), 폴리비아 파울리스타(Polybia paulista)(말벌, Pol p), 폴리비아 스쿠텔라리스(Polybia scutellaris)(말벌, Pol s), 펠리스 도메스티쿠스(Felis domesticus)(고양이, Fel d), 포알레스(Poales) 및 베툴라 베루코사(Betula verrucosa)(자작나무, Bet v 1, Bet v 2, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 5, Bet v 6, Bet v 7) 및 식품 알레르겐을 포함하거나 이들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명은 또한 특정 알레르겐에 대해 알레르기가 있는 대상체의 탈감작의 효능을 증가시키고/시키거나 탈감작 기간을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 대상체는 탈감작에 의해 치료되고, 본 발명의 면역원성 생성물, 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신 조성물로 추가 투여된다.

일 실시형태에서, 본 발명의 방법에서, 대상체에게 먼저 본 발명의 면역원성 생성물, 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신 조성물이 투여되고, 두 번째로 알레르겐이 투여된다.

일 실시형태에서, 본 발명의 방법에서, 대상체에게 먼저 알레르겐이 투여되고, 두 번째로 본 발명의 면역원성 생성물, 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신 조성물이 투여된다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에서, 대상체는 본 발명의 면역원성 생성물, 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신 조성물 및 알레르겐의 병용 투여를 제공받는다.

본 발명은 또한 상기 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신에 관한 것이며, 여기서 상기 조성물, 약제학적 조성물, 의약 또는 백신은 적어도 하나의 알레르겐을 추가로 포함한다.

일 실시형태에서, 치료 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 면역원성 생성물이 대상체에게 투여되거나 투여될 것이다. 일 실시형태에서, 치료 유효량은 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 브래드포드 단백질 검정을 사용하여 결정된 총 단백질의 양에 상응한다.

일 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 면역원성 생성물의 양은 유의한 부작용 없이 면역보호 반응을 유도한다.

일 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 면역원성 생성물의 양은 유의한 부작용 없이 알레르겐 탈감작을 유도한다.

본 발명의 면역원성 생성물에 대한 성분의 최적량은 대상체에서 적절한 면역 반응을 관찰하는 것을 수반하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신접종 후, 대상체는 적절한 간격을 두고 1회 또는 복수회의 부스터 면역화을 제공받을 수 있다.

일 실시형태에서, 치료는 일정 기간에 걸친 단일 용량 또는 복수의 용량으로 구성된다.

본 발명의 일 실시형태에서, 치료 대상체는 상기 본원에 기재된 바와 같이 치료 유효량의 면역원성 생성물을 1개월에 적어도 2회 투여한다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, 치료 대상체는 치료 유효량의 본 발명의 면역원성 생성물을 1개월에 2회 투여한다. 이 실시형태에서, 대상체는 0일차에 1회 및 7일차와 28일차 사이에 2회로 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 대상체는 0일차에 1회 및 28일차에 2회로 투여된다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, 치료 대상체는 치료 유효량의 본 발명의 면역원성 생성물을 1개월에 3회 투여한다. 이 실시형태에서, 치료 대상체는 0일차에 1회, 7일차와 14일차 사이에 2회, 및 21일차와 28일차 사이에 3회로 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 대상체는 0일차에 1회 투여되고, 7일차에 2회, 및 28일차에 3회 투여된다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, 치료 대상체는 치료학적 유효량의 본 발명의 면역원성 생성물을 3개월마다 1회 추가로 투여할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 치료 대상체는 상기 본원에 기재된 바와 같이 1개월에 3회 투여하고, 이어서 치료 유효량의 본 발명의 면역원성 생성물로 3개월마다 1회 추가로 투여된다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, 치료되는 대상체는, IgE에 대한 항체의 양이 대상체로부터 수득된 혈청 샘플에서 검출할 수 없는 경우, 상기 본원에 기재된 치료학적 유효량의 면역원성 생성물로 추가로 투여될 수 있다.

도 1은 hIgE 키노이드(Kinoid)(hIgE-K)의 생성을 나타낸다. (A) 티올-말레이미드 접합을 사용한 hIgE-K의 합성. (B) CRM₁₉₇에 대한 IgE Cε3-Cε4 단편의 접합시 고분자량 키노이드의 생성은 SDS-PAGE 및 (C) HPLC를 사용하여 확인되었다.
도 2는 hIgE-키노이드에 의한 항-hIgE 항체의 중화를 나타낸다. (A) 근육내 백신접종 프로토콜 개요. hIgE^KI 마우스(마우스 IgE 대신에 인간 IgE를 발현함)를 hIgE-K(또는 대조군으로서 CRM₁₉₇ 단독)로 백신접종하고, 보조제 수중 스쿠알렌 에멀젼(SWE)으로 유화시켰다. 키노이드의 1차 주사 후 5, 9, 21, 30 및 39주에 혈청 중의 (B) 항-hIgE 및 (C) 항-CRM₁₉₇ 항체 역가. 결과는 중앙값을 나타내는 막대를 갖는 개별 마우스의 값을 나타낸다. (D) 5주차에 수집된 혈청의 항-hIgE 중화 능력. hIgE 수용체 FcεRI를 발현하는 골수-유래 배양된 비만 세포(BMCMC)는 FcεRI를 위해 인간화된 마우스로부터 유래했다. BMCMC는 지시된 희석시에 hIgE-K(백신의 1차 주사 후 39일차에 수집됨)로 백신접종된 마우스의 혈청과 사전 인큐베이팅되었다. 그 직후, 형광-표지(FITC) hIgE를 30분 동안 첨가했다. 세포를 세척하고, BMCMC에 대한 FITC 형광의 수준을 유세포 분석에 의해 정량화했다. (E) 5주, 9주, 21주, 30주 및 39주에서 수집된 혈청 중의 총 hIgE의 수준. 결과는 평균 ± SEM을 나타내는 막대를 갖는 개별 마우스의 값을 나타낸다. (B-E) 데이터는 2개의 독립적 실험을 대표하는 그룹당 n=8 마우스를 사용한 단일 실험에서 수득한 것이다. ***, P < 0.001(만-휘트니(Mann-Whitney) U 시험).
도 3은 hIgE-K에 의한 백신접종이 IgE-매개 전신 아나필락시스를 예방하는 것을 나타낸다. (A) 프로토콜 개요. IgE/FcεRI 인간화 마우스(이는 인간 IgE 및 인간 IgE 수용체 FcεRI를 발현함)를 hIgE-K(또는 대조군으로서 CRM₁₉₇ 단독)로 백신접종하고(근육내, i.m.), 보조제 SWE로 유화시켰다. 9주차에, 마우스는 hIgE 항-니트로페닐(NP)로 감작시키고, 1일 후에 지시된 바와 같이 둘 다 정맥내 BSA에 결합된 NP(니트로페닐)로 챌린지했다. (B) 키노이드의 1차 주사 후 5주차에 혈청 중의 항체 역가. 결과는 중앙값 ± SEM을 나타내는 막대를 갖는 개별 마우스의 값을 나타낸다. (C) 마우스에게 IgE-K 또는 CRM₁₉₇ 주사 후 0주, 1주 및 3주차의 체온 변화(Δ°T, 평균 ± SEM). 데이터는 그룹당 총 n=7-9 마우스를 사용하여 2개 독립적 실험으로부터 풀링된다. (D) 10μg 항-NP hIgE의 정맥내 주사 후 체온의 변화(마우스에서 아나필락시스의 주요 판독치로서 사용됨)(Δ°T, 평균 ± SEM). 데이터는 그룹당 총 n=7-9 마우스를 사용하여 2개의 독립적 실험으로부터 풀링된다. (E) 500μg의 NP-BSA의 정맥내 주사 후 체온의 변화(Δ°T, 평균 ± SEM). 데이터는 그룹당 총 n=7-9 마우스를 사용하여 2개의 독립적 실험으로부터 풀링된다. *, ** 또는 ***, P < 0.05, 0.01 또는 0.001(만-휘트니 U 시험).
도 4는, 유전적 소인이 있는 알레르기 마우스 모델에서, hIgE-K를 사용한 백신접종이 IgE-매개된 전신 아나필락시스를 예방하는 것을 나타낸다. (A) 프로토콜 개요. F709 IL4Ra 돌연변이를 갖는 IgE/FcεRI 인간화 마우스(동등한 돌연변이는 인간의 아토피와 관련이 있고, 돌연변이는 마우스에서 IgE-매개 아나필락시스에 대한 감수성을 증가시키는 것으로 공지되어 있음)에게 hIgE-K(또는 대조군으로서 CRM₁₉₇ 단독)를 백신접종하고, 보조제 SWE로 유화시켰다. 6주차에, 마우스에게 250㎍의 항-hIgE를 iv 주사했다. (B) 250μg의 항-hIgE Ab의 정맥내 주사 후 체온의 변화(아나필락시스의 주요 판독치로서 사용됨)(Δ°T, 평균 ± SEM). (C) 250μg의 항-hIgE의 정맥내 주사 후 생존 곡선. 데이터는 그룹당 총 n=9 마우스를 사용한 2개의 독립적 실험으로부터 풀링되었다. ** 또는 ***, P < 0.01 또는 0.001(만-휘트니 U 시험).

실시예

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다.

본 발명은 CRM₁₉₇을 담체 단백질로 사용한 면역원성 생성물에 관한 것이다. 본 발명의 면역원성 생성물의 특성은 하기 실시예에 의해 설명된다.

CRM₁₉₇은 이의 독소 도메인에서 위치 52의 글리신으로부터 글루타메이트로의 단일 염기 치환으로 인해 독성 활성이 없는 무독성 형태의 디프테리아 독소이다[참조: Uchida et al., 1973 J Biol Chem].

티올-말레이미드 접합은 IgE 기반 면역원성 생성물의 제조에 사용된다. 설프하이드릴 모이어티는 SATA 및 후속 하이드록실아민 탈보호와 함께 담체 단백질 CRM₁₉₇에 도입되었고, IgE 또는 IgE의 단편은 말레이미드 함유제인 sGMBS에 의해 유도체화되었다. SATA와 sGMBS는 모두 1급 아민(예: 라이신 잔기의 ε-아미노 그룹 및 단백질 N-말단)과 반응하는 NHS-에스테르를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제이다.

실시예 1: 항-IgE 백신접종은 인간화 마우스에서 인간 IgE-매개 중증 알레르기 반응을 예방한다

재료 및 방법

마우스

마우스 염색체 12(Chr12:113,147,778)에 인간 IgE 서열(1080 염기쌍, 인간 염색체 14: 106,064,224-106,068,065에 위치)을 삽입하여 hIgE^KI 마우스를 수득했다. IgE/FcεRI 인간화 마우스는 hIgE^KI 및 mFcεRI^-/- hFcεRI^Tg 마우스의 상호교배에 의해 생성되었다[참조: Dombrowicz D et al., Anaphylaxis mediated through a humanized high affinity IgE receptor. Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 1996;157(4):1645-51]. F709 IL4Ra 돌연변이를 갖는 IgE/FcεRI 인간화 마우스는 IgE/FcεRI 인간화 마우스와 F709 IL4Ra 마우스를 상호교배하여 생성되었다[참조: Tachdjian R et al., In vivo regulation of the allergic response by the IL-4 receptor alpha chain immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. J Allergy Clin Immunol. 2010;125(5):1128-36.e8]. 마우스는 인스티튜트 파스퇴르(Institut Pasteur)의 특정 병원체-비함유 시설에서 유지되었다. 마우스는 인스티튜트 파스퇴르에서 사육되었고, 정상적 발달 및 번식 패턴을 입증했다. 모든 동물 관리 및 실험은 #170043에 등록된 동물 윤리 위원회 CETEA(프랑스 파리의 인스티튜트 파스퇴르)와 프랑스 연구부의 가이드라인 및 특정 승인에 따라 수행되었다.

IgE 단편 생산

재조합 hIgE Cε3-4 단편(G335C 돌연변이 함유, C-말단 스트렙 트윈(Strep Twin) 태그 포함, 서열번호 7의 아미노산 서열 보유)을 합성하고, 110rpm으로 회전하는 진탕기 플랫폼의 습윤 5% CO₂ 인큐베이터에서 37℃로 현탁액 중의 Expi293™ 발현 배지(Life Technologies)에서 배양한 기하급수적으로 성장하는 Expi-293 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 전에, 세포를 수확하여 Expi293™ 발현 배지에 2×10⁶ 세포/ml의 밀도로 재현탁하고, 상기에서 언급한 것과 동일한 조건에서 밤새 배양한다. 24시간 후, 500μg의 발현 플라스미드와 1350μL의 엑스피펙타민(Expifectamine)을 Opti-MEM(Life Technologies) 배지에서 5분 동안 사전 인큐베이팅하고, 함께 혼합했다. 인큐베이팅 20분 후, 혼합물을 Expi-293 세포에 2.9×10⁶ 세포/mL의 밀도로 첨가한다. 형질감염 20시간 후, 각각 25mL 및 2.5mL의 형질감염 인핸서 1 및 2(ThermoFisher)를 첨가했다. 세포를 형질감염 후 5일 동안 배양하고, 상청액을 수확하고, 4200rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 여과(0.2μm)했다. AKTA 순수 FPLC 기기(GE Healthcare) 및 스트렙-탁틴(Strep-Tactin^®) 컬럼(IBA Lifescience)을 사용하여 친화성 크로마토그래피로 단백질을 정제했다.

hIgE 키노이드 의 합성 및 특성화

hIgE Cε3-4는 1급 아민과 반응하는 말레이미드 함유제인 N-γ-말레이미도부티릴-옥시숙신이미드 에스테르(sGMBS; Thermo Fisher)로 변형되었다. hIgE Cε3-4의 완충액을 변형 완충액(70mM 인산염 완충액, 150mM NaCl, 5mM EDTA, pH=7,2)과 1mg/mL로 교환했다. 10mM sGMBS의 용액을 제조하고, hIgE Cε3-4에 1:30 비율로 첨가하고, 실온에서 60분 동안 인큐베이팅했다(광으로부터 보호됨). 과량의 sGMBS를 제거하고, Zeba 탈염 스핀 컬럼(Thermo Fisher)을 사용하여 변형 완충액에 대해 완충액을 교환했다. CRM₁₉₇은 Pfenex(미국)로부터 구입했다. 설프하이드릴 모이어티는 SATA(N-석신이미딜-S-아세틸티오아세테이트)와 함께 담체 단백질 CRM₁₉₇에 도입되었다. CRM₁₉₇을 변형 완충액에 2mg/mL로 희석하고, 새로 제조한 100mM SATA의 용액(DMSO에 용해)을 1:80 몰비로 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이팅했다(광으로부터 보호됨). 과량의 SATA를 제거하고, Zeba 탈염 스핀 컬럼을 사용하여 변형 완충액에 대해 완충액을 교환했다. SATA 변형된 CRM₁₉₇은 광으로부터 보호된 50mM 최종 농도의 하이드록실아민 용액과 함께 실온에서 120분 동안 인큐베이팅되었다. 과량의 하이드록실아민을 제거하고, Zeba 탈염 스핀 컬럼을 사용하여 변형 완충액에 대해 완충액을 교환했다. CRM₁₉₇ 및 hIgE Cε3-4 기능화 후, 제조업체의 지시에 따라 브래드포드(Bradford)(Thermo Fisher) 검정에 의해 각 제제의 단백질 함량을 측정했다.

기능화된 CRM₁₉₇을 기능화된 hIgE Cε3-4에 1:1의 몰 비율 및 0.4mg/mL의 최종 농도로 첨가했다. 혼합물을 4℃에서 16시간 동안 인큐베이팅하고, 광으로부터 보호하고, 이어서 Zeba 탈염 스핀 컬럼을 사용하여 변형 완충액에 대해 완충액을 교환했다. 단백질 함량은 브래드포드 검정에 의해 결정되었다. 이어서, 생성된 hIgE 키노이드(hIgE-K)를 0.22μm 멸균 여과하고, 4℃에서 보관했다.

hIgE-K는 상이한 시험관내 방법을 사용하여 특성화되었다. 수득된 키노이드의 프로파일을 분석하기 위해, hIgE Cε3-4 단편(Strep-TACTIN HRP 접합체(IBA Lifescience))에 대해 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 수행했다. Bio SEC-5 컬럼(2000Å, 5μm, 7.8*300mm, Agilent) 및 Bio SEC-3 컬럼(300Å, 3μm, 7.8*300mm, Agilent)을 사용한 크기 배제(SE)-HPLC도 또한 사용되었다. SE-HPLC 분석은 컬럼 온도 25℃에서 1mL/min의 등용매 모드에서 수행되었다. 여과(0.22μm 컷-오프) 후, 샘플을 100μL로 주입하고, 280nm에서 분석했다. 총 실행 시간은 35분이었다.

인간 IgE 항체의 생산

항-니트로페닐 hIgE는 이전에 기재된 바와 같이 생성되고 정제되었다[참조: Balbino B et al., The anti-IgE mAb omalizumab induces adverse reactions by engaging Fcgamma receptors. J Clin Invest. 2020]. JW8/5/13(ECACC 87080706) 세포는 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)로부터 구입했다. 이 세포주는 합텐 4-하이드록시-3-니트로페난아세틸(NP)에 대해 지시된 키메라 인간 IgE 항체를 생산하고, 인간 Fcε 쇄와 마우스 항-NP 가변 쇄로 구성된다. JW8/5/13 세포를 9×10⁵ 세포/ml에서 2mM 글루타민(Thermo Fisher Scientific) 및 10% 태소 혈청(FBS)(Thermo Fisher Scientific)을 함유하는 완전 둘베코-변형된 이글 배지(DMEM, Gibco)에서 배양했다. 15일 후, 상청액을 수확하고, 4200rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 여과(0.2μm)했다. 친화성 크로마토그래피에 의해 IgE 항체를 정제했다. 간략히 설명하면, CNBr-활성화된 세파로스 4 고속 유동 비드(GE Healthcare)는 비드 1g당 단백질 2.5mg의 비율을 사용하여 WT 항-IgE와 결합되었다. 비드를 칭량하고, 15용적의 차가운 1mM HCl로 세척하고, 2500rpm에서 5분 동안 원심분리했다. WT 항-IgE를 커플링 용액(0.5M NaCl을 함유하는 0.1M NaHCO₃ pH 8.3)에 재현탁시키고, 교반하에 4℃에서 밤새 비드와 혼합했다. 비드를 커플링 완충액으로 세척하고, 미반응 그룹을 0.1M 트리스-HCl 완충액(pH 8.0)으로 차단했다. 이어서, WT 항-IgE 결합 비드를 저(0.1M 아세테이트 완충액 pH 3) 및 고(0.1M 트리스-HCl pH 8) pH 용액을 번갈아 사용하여 세척하고, 붕산염 완충액(100mM 붕산염, 150mM NaCl pH 8.0)에서 4℃로 사용할 때까지 저장했다. IgE의 정제를 위해, WT 항-IgE-결합 세파로스 비드를 XK 16/20 컬럼(GE Healthcare)에 패킹하고, AKTA 순수 FPLC 기기(GE Healthcare)를 사용하여 친화성 크로마토그래피를 수행했다. 정제 후, IgE 항체는 HiTrap 탈염 컬럼(GE Healthcare)으로 탈염하고, 사용할 때까지 4℃에서 저장했다.

hIgE 키노이드 로의 백신접종

마우스에게 0일, 7일 및 28일차에 PBS 중 SWE, 수중 스쿠알렌 에멀젼 보조제(Vaccine Formulation Laboratory, University of Lausanne, Switzerland)와 1:1(v:v) 조합된 hIgE-K로 30μg의 초기 용량 및 이어서 10μg의 부스트 용량으로 근육내 면역화시켰다. 대조군으로서, 마우스의 그룹에게 SWE와 결합된 15㎍의 2회 초기 용량 및 5㎍의 부스트 용량(이 용량은 CRM₁₉₇의 중량비를 기준으로 정의됨)으로 CRM₁₉₇을 동일한 스케쥴에 따라 주사했다.

백신접종된 마우스의 혈청에서 인간 IgE 및 CRM ₁₉₇ 에 대한 IgG의 정량화

키노이드의 면역원성은 백신접종 후 상이한 시점에서 수집된 혈청에서 인간 IgE 및 CRM₁₉₇에 대한 항체를 평가함으로써 평가되었다. 인간 IgE 또는 CRM₁₉₇을 코팅 완충액(탄산염/중탄산염 완충액 pH 9.6)에서 각각 5 또는 1μg/mL로 4℃에서 코팅하고, 밤새 인큐베이팅했다. 각 단계 후, 플레이트를 0.005%의 PBS 트윈 20으로 3회 세척했다. BSA 1% PBS로 차단한 후, 혈청 샘플을 첨가하고, 2000 dil^-1(PBS, BSA 1%에 희석)에서 개시하여 2배 연속 희석을 수행했다. 37℃에서 90분 동안 인큐베이팅한 후, 결합된 항체를 HRP-접합된 염소 항 마우스 IgG(Bethyl Laboratories)로 1/10,000에서 검출하고, 플레이트는 OPD 기질을 사용하여 나타났다. 반응을 1M H₂SO₄로 중지시키고, 이어서 흡광도를 490nm에서 기록했다. 샘플은 희석 2000 dil^-1에서 개시하여 1,024,000 dil^- ¹까지 분석했다. 역가는 ODmax의 50%인 혈청의 희석으로 정의되었다. 역가는 혈청 희석 인자(dil^-1)로 표현되었다. 역가 정량화의 한계는 검정에서 시험된 최저 희석이다: 2000 dil^- ¹.

hIgE -K로 백신접종시 생성된 항- hIgE 항체의 중화능 평가

hFcεRI를 발현하는 골수-유래 배양 비만 세포(BMCMC)는 IgE/FcεRI 인간화 마우스의 골수 세포를 IL-3(10ng/ml)가 함유된 배지에서 6주 동안 배양하여 수득했고, 이때 세포는 >95% c-Kit⁺ hFcεRIα⁺였다(데이터는 제시되지 않음). hIgE-K로 백신접종시 생성된 항-hIgE 항체의 중화능을 평가하기 위해, hIgE-K 또는 CRM₁₉₇ 단독(대조군으로서)으로 백신접종한 마우스의 혈장 희석액과 함께 BMCMC를 인큐베이팅했다. 이어서, FITC 표지 hIgE(이전에 문헌[참조: Balbino B et al., The anti-IgE mAb omalizumab induces adverse reactions by engaging Fcgamma receptors. J Clin Invest. 2020]에 기재된 바와 같이 생성됨)을 첨가하고, BCMMC에서 hFcεRI에 대한 FITC-hIgE의 결합을 유세포 분석으로 평가한다.

호염기구 및 비만 세포의 표면에서 IgE 정량화

혈액은 헤파린으로 수집했다. 복막 세정액(PLF)의 경우, 복막의 외피를 온화하게 제거했다. 이어서, 27g 바늘을 사용하여 3mL의 차가운 PBS를 복강에 주사했다. 복막을 온화하게 마사지한 후, 복막 내피에서 절개를 수행하고, 집게로 피부를 유지하면서 PLF를 회수했다.

적혈구를 제거하기 위해 적혈구 용해를 시행했다.

혈액으로부터 유래하는 세포는 항 CD49b-BV421(클론 DX5, eBioscience), 항 CD131-PE(클론 REA193, Miltenyi) 및 항-인간 IgE-비오틴(클론 MHE-18, Biolegend) 및 항-비오틴-APC(클론 REA746, Miltenyi) 또는 항-인간 FcεRI-APC(클론 AER-37(CRA-1), BioLegend)로 염색했다. PLF로부터 유래하는 세포는 항 cKIT-APC(클론 2B8, eBioscience) 및 항-인간 IgE 비오틴(클론 MHE-18, BioLegend) 및 항-비오틴-APC(클론 REA746, Miltenyi) 또는 항-인간 FcεRI-APC(클론 AER-37(CRA-1), BioLegend)로 염색했다. 호염기구는 CD49b⁺ CD131⁺로 게이팅되었고, 비만 세포는 cKIT⁺ IgE⁺ 또는 FcεRI⁺로 게이팅되었다. 인간 FcεRI 및 IgE의 표면 발현을 평가하고, 평균 형광 강도(MFI)로 표현했다.

총 인간 및 마우스 IgE 정량화

총 인간 IgE 수준은 ELISA에 의해 정량화되었다. 항-Cε2 인간 IgE 항체(클론 8E/5D4, Aviva Systems Biology)를 코팅하고, 커플링 완충액(탄산염/중탄산염 완충액 pH=9,6)에서 5μg/mL로 4℃에서 밤새 인큐베이팅했다. 각 단계 후, 플레이트를 0.005%의 PBS 트윈 20으로 3회 세척했다. 실온에서 1시간 30분 동안 PBS 중의 BSA 1%로 차단한 후, 혈청 샘플을 1/10 최종 희석(PBS, BSA 1% 10% FBS에 희석됨)으로 첨가하고, 실온에서 90분 동안 인큐베이팅했다. 이어서, 항-인간 IgE 항체(A80-108P, Bethyl Laboratories)를 1:10,000으로 실온에서 90분 동안 첨가했다. 플레이트는 OPD 기질을 사용하여 나타났다. 2M H₂SO₄로 반응을 정지시키고, 이어서 흡광도를 490nm에서 기록했다. 총 마우스 IgE 수준은 제조업체의 지시에 따라 상업용 ELISA 키트(E90-115; Bethyl Laboratories)를 사용하여 ELISA에 의해 정량화되었다.

수동적 전신 아나필락시스

IgE/FcεRI 인간화 마우스에서, 정제된 마우스 IgE 항-NP 항체를 100μL의 PBS 중의 10μg의 용량으로 정맥내(iv) 투여했다. 24시간 후, PBS 중의 500㎍의 NP(21-31)-BSA(Santa Cruz Biotechnology)로 마우스를 iv 챌린지했다. 체온의 직장 측정은 챌린지 직전(시간 0)과 챌린지 후 최대 1시간 동안 상이한 시점에서 수행되었다. IgE/FcεRI 인간화된; F709 IL4Ra 마우스에서, 래빗 항-hIgE 항체(Bethyl Laboratories)를 250㎍의 용량으로 정맥내 투여했다. 체온의 직장 측정은 주사 직전(시간 0)과 주사 후 최대 1시간 동안 상이한 시점에서 수행되었다.

통계 분석

통계적 유의성은 쌍을 이루지 않은 스튜던트 t 시험(쌍을 이루지 않은 만 휘트니 시험)를 사용하여 결정되었다. P ≤ 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 프리즘(Prism) 7.0 소프트웨어 프로그램(GraphPad Software)을 사용하여 계산을 수행했다.

결과

hIgE 키노이드를 사용한 백신접종은 IgE 인간화된 마우스에서 강력한 항- IgE 중화 항체를 유도한다

IgE 키노이드(hIgE-K)는 티올-말레이미드 접합을 사용하여 인간 IgE Cε3-4 도메인을 디프테리아 "교차-반응 물질₁₉₇"(CRM₁₉₇, 다수의 승인된 접합 백신에서 담체 단백질로서 사용되는 디프테리아 독소의 무독성 돌연변이체)와 결합시킴으로써 생성했다(도 1A). 위치 335의 천연 글리신 잔기를 시스테인 잔기로 Cε3-4로 치환했다. 결과적으로, FcεRI가 아닌 오말리주맙에 대한 고친화성 결합을 보유하는 "폐쇄" 형태로 IgE 단편을 고정시키는 쇄간 디설파이드 결합이 형성된다. 본 발명자들은, 이 G335C 돌연변이를 함유하는 IgE 접합 백신이 FcεRI에 대한 잠재적으로 유해한 결합을 회피하면서 "오말리주맙-유사" 중화 항체의 생성을 조장할 것이라는 가설을 세웠다. SDS-PAGE 및 HPLC 분석은 CRM₁₉₇에 대한 hIgE Cε3-4 G335C의 접합시 고분자 종의 형성을 나타내고, hIgE-K의 효율적인 합성을 확인했다(도 1B 및 1C).

SWE, 스쿠알렌 수중유 에멀젼 보조제에서 hIgE-K에 의한 hIgE^KI 마우스(마우스 IgE 대신 인간 IgE를 발현함)의 면역화는 높은 항-hIgE 항체 역가를 유도했고, 1차 면역화 5주 후에 이미 검출할 수 있었고, 39주 후(지금까지 평가된 가장 최근 시점)에도 검출할 수 있었다(도 2A-B). 예상한 바와 같이, CRM₁₉₇ 단독 또는 hIgE-K에 노출된 모든 마우스는 항-CRM₁₉₇ 항체를 발증시켰다(도 2C). 중요하게도, 키노이드로 백신접종시 생성된 항-hIgE 항체는 1차 면역화 5주 후에 개시하여 모든 마우스에서 강력한 중화능을 나타냈다(도 2D). hIgE-K로 백신접종된 hIgE^KI 마우스가 아닌, CRM₁₉₇ - 면역화된 대조군 마우스의 혈액에서 hIgE를 검출할 수 있었다(도 2E). 전체적으로, 이들 데이터는 hIgE^KI 마우스에서 hIgE-K에 의한 백신접종을 통해 hIgE의 효율적 장기간 중화를 달성할 수 있음을 나타낸다.

hIgE- 매개 아나필락시스의 모델에서 항- hIgE 백신의 효능

인간 IgE 및 인간 FcεRI를 모두 발현하는 마우스(IgE/FcεRI 인간화 마우스)에서 hIgE-K의 주사 후 잠재적 부작용을 평가했다. IgE-K 백신(또는 대조군으로서 CRM₁₉₇ 단독)을 각각 주사한 후 마우스를 주의 깊게 모니터링하고(도 3A), IgE/FcεRI 인간화 마우스에서는 어떠한 검출가능한 부작용이 관찰되지 않았다: 저체온증(도 3C), 마우스에서 아나필락시스 충격을 수행하기 위해 사용된 파라미터도 없었고, IgE/FcεRI 인간화 마우스에서 각 백신 주사 후에 1시간에 걸쳐 설사, 고통 또는 활력의 결여도 없었다. 이러한 부작용의 부재는 백신이 비만 세포 및 호염기구의 표면에서 IgE 응집을 통해 FcεRI 활성화를 유발하지 않는다는 것을 시사한다. hIgE-K를 사용한 백신접종은 IgE/FcεRI 인간화 마우스에서 항-hIgE 항체의 높은 역가를 유도했고, 이는, hIgE^KI 마우스에서 이들의 출현과 유사하게(도 2E), 키노이드의 1차 주사 5주 후에 이미 검출가능했다(도 3B).

hIgE 백신의 안전성 및 효율을 추가로 평가하기 위해, 상기 기재된 동일한 면역화 스케쥴에 따라, hIgE-K 또는 대조군으로서 CRM₁₉₇ 단독으로 백신접종한 IgE/FcεRI 인간화 마우스에게 항-니트로페닐(NP) hIgE의 고용량(10μg)을 주사했다(도 3A). 또한, 본 발명자들은 항-NP-hIgE의 주사 후 1시간 동안 저체온증, 설사, 고통 또는 활력 부족을 관찰하지 않았고, 이는 매우 높은 수준의 순환 hIgE가 존재하는 경우에도 백신이 검출가능한 부작용을 유발하지 않음을 확인했다(도 3D). 중요하게도, hIgE-K로 백신접종된 마우스는 hIgE-매개된 아나필락시스로부터 보호된 반면, 항-NP hIgE를 주사하고 NP 항원으로 챌린지한 CRM₁₉₇-백신접종된 마우스는 중증 저체온증을 겪었고, 7마리 중 1마리가 사망했다(도 3E).

유전적 소인이 있는 알레르기 마우스 모델에서 항-hIgE 백신의 효능

IgE/FcεRI 인간화 마우스는 낮은 수준의 순환 hIgE를 입증한 반면, 알레르기 환자는 중등도에서 높은 수준의 순환 IgE를 나타내어, 마우스 모델을 항-IgE 백신접종 후에 IgE-유도 이벤트로부터 잠재적으로 더 쉽게 보호할 수 있게 한다. 이러한 모순을 해결하기 위해, IgE/FcεRI 인간화 마우스를, 인터류킨-4(IL-4) 및 IL-13 수용체 서브유닛, IL-4Ra를 코딩하는 유전자에서 기능-획득 Y709F 돌연변이를 보유하는 마우스와 교배하여, hIgE^KI; hFcεRI^Tg; F709 IL4Ra 마우스를 생성했다(도 4A). Y709F 돌연변이는 IL4Ra의 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프(ITIM)를 파괴하여, IL-4 및 IL-13에 반응하여 수용체 신호전달을 증강시키고, IgE 수준 및 IgE-매개 아나필락시스를 증폭시킨다. 아나필락시스가 내인성 hIgE에 의해 유발되는 모델에서 hIgE 백신의 효율을 평가하기 위해 hIgE^KI; hFcεRI^Tg; F709 IL4Ra 마우스를 사용했다. 이를 위해, hIgE^KI; hFcεRI^Tg; FcεRI 마우스에게 고용량의 폴리클로날 항-hIgE Ab를 주사하여 FcεRI-결합된 hIgE의 가교결합을 통해 비만 세포 활성화를 유발했다. 대조군으로 사용된 CRM₁₉₇-면역화된 마우스는 항-hIgE 주입 후 30분 이내에 100% 치사율(도 4C)과 함께 중증 저체온증(도 4B)을 발증했고, 이는 IgE/FcεRI 인간화된; F709 IL4Ra 마우스가 hFcεRI에 결합된 충분한 수준의 내인성 hIgE를 가져 hIgE-매개 아나필락시스를 유발하는 것을 확인한다. 대조적으로, 항-hIgE 주사 후, IgE-K 백신접종된 마우스는 일시적 경도의 저체온증만을 나타냈고, 사망하지 않았다(도 4B-C).

전체적으로, 본 발명자들의 결과는, 인간 IgE Cε3-4 도메인에 대한 백신이 표준 산업 방법을 사용하여 생산될 수 있고, 이 백신이 hIgE의 장기간 중화를 유도하여 순환 중의 검출불가능한 IgE 수준을 유도하고 감소된 FcεRI-결합된 hIgE를 유도할 수 있음을 나타낸다. hIgE-K 백신접종은, 반복 주사 후에도, IgE 및 FcεRI에 대해 인간화된 마우스에서 검출가능한 임의의 부작용을 유발하지 않는다. IgE-K 백신접종은 유전적 소인이 있는 알레르기 마우스 모델에서도 중증의 IgE-매개 알레르기 반응으로부터 보호를 유도한다. 이러한 결과는 hIgE-매개 알레르기 장애에 대한 효율적 장기간 백신의 임상 개발을 위한 길을 열어준다.

SEQUENCE LISTING <110> NEOVACS INSERM (Institut National de la Sant챕 et de la Recherche M챕dicale) INSTITUT PASTEUR Reber Laurent Bruhns Pierre Conde Garcia Eva Backovic Marija Serra Vincent G챕raldine GROUARD-VOGEL Romain BERTRAND <120> IMMUNOGENIC PRODUCT COMPRISING AN IgE FRAGMENT FOR TREATING IgE-MEDIATED INFLAMMATORY DISORDERS <130> IBIO-1656/PCT <150> EP20306047.0 <151> 2020-09-17 <150> US63/079686 <151> 2020-09-17 <160> 15 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 535 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM197 <400> 1 Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn 1 5 10 15 Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln 20 25 30 Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp 35 40 45 Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly 50 55 60 Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val 65 70 75 80 Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val 85 90 95 Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu 100 105 110 Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly 115 120 125 Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser 130 135 140 Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser 145 150 155 160 Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp 165 170 175 Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg 180 185 190 Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val 195 200 205 Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly 210 215 220 Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu 225 230 235 240 Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu 245 250 255 His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val 260 265 270 Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val 275 280 285 Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu 290 295 300 Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala 305 310 315 320 Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser 325 330 335 Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp 340 345 350 Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe 355 360 365 Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His 370 375 380 Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr 385 390 395 400 Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His 405 410 415 Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val 420 425 430 Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr 435 440 445 His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile 450 455 460 Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly 465 470 475 480 Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser 485 490 495 Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu 500 505 510 Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser 515 520 525 Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser 530 535 <210> 2 <211> 428 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgE constant region <400> 2 Ala Ser Thr Gln Ser Pro Ser Val Phe Pro Leu Thr Arg Cys Cys Lys 1 5 10 15 Asn Ile Pro Ser Asn Ala Thr Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Ala Thr 20 25 30 Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Met Val Thr Trp Asp Thr Gly Ser Leu 35 40 45 Asn Gly Thr Thr Met Thr Leu Pro Ala Thr Thr Leu Thr Leu Ser Gly 50 55 60 His Tyr Ala Thr Ile Ser Leu Leu Thr Val Ser Gly Ala Trp Ala Lys 65 70 75 80 Gln Met Phe Thr Cys Arg Val Ala His Thr Pro Ser Ser Thr Asp Trp 85 90 95 Val Asp Asn Lys Thr Phe Ser Val Cys Ser Arg Asp Phe Thr Pro Pro 100 105 110 Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser Ser Cys Asp Gly Gly Gly His Phe Pro 115 120 125 Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Val Ser Gly Tyr Thr Pro Gly Thr 130 135 140 Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp Leu 145 150 155 160 Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu Ala Ser Thr Gln Ser 165 170 175 Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr Thr 180 185 190 Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys 195 200 205 Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro 210 215 220 Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu 225 230 235 240 Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser 245 250 255 Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys 260 265 270 Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr 275 280 285 Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro 290 295 300 His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser Gly Pro 305 310 315 320 Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly 325 330 335 Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met Pro 340 345 350 Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp 355 360 365 Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe 370 375 380 Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu Gln Lys 385 390 395 400 Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Gln 405 410 415 Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys 420 425 <210> 3 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgE C琯3 <400> 3 Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu 1 5 10 15 Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Ala 20 25 30 Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys 35 40 45 Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys Gln Arg Asn Gly Thr 50 55 60 Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu 65 70 75 80 Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala 85 90 95 Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser 100 105 <210> 4 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgE C琯3 and C琯4 <400> 4 Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu 1 5 10 15 Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Ala 20 25 30 Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys 35 40 45 Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys Gln Arg Asn Gly Thr 50 55 60 Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu 65 70 75 80 Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala 85 90 95 Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu 100 105 110 Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg 115 120 125 Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met Pro Glu Asp Ile Ser Val 130 135 140 Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg His Ser Thr 145 150 155 160 Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg 165 170 175 Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu Gln Lys Asp Glu Phe Ile Cys 180 185 190 Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Gln Thr Val Gln Arg Ala 195 200 205 Val Ser 210 <210> 5 <211> 207 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgE C琯2 and C琯3 <400> 5 Pro Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser Ser Cys Asp Gly Gly Gly His Phe 1 5 10 15 Pro Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Val Ser Gly Tyr Thr Pro Gly 20 25 30 Thr Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp 35 40 45 Leu Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu Ala Ser Thr Gln 50 55 60 Ser Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr 65 70 75 80 Thr Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys 85 90 95 Lys Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg 100 105 110 Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys 115 120 125 Leu Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp 130 135 140 Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu 145 150 155 160 Lys Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly 165 170 175 Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His 180 185 190 Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser 195 200 205 <210> 6 <211> 312 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgE C琯2, C琯3 and C琯4 <400> 6 Pro Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser Ser Cys Asp Gly Gly Gly His Phe 1 5 10 15 Pro Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Val Ser Gly Tyr Thr Pro Gly 20 25 30 Thr Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp 35 40 45 Leu Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu Ala Ser Thr Gln 50 55 60 Ser Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr 65 70 75 80 Thr Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys 85 90 95 Lys Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg 100 105 110 Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys 115 120 125 Leu Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp 130 135 140 Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu 145 150 155 160 Lys Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly 165 170 175 Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His 180 185 190 Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser Gly 195 200 205 Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro 210 215 220 Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met 225 230 235 240 Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro 245 250 255 Asp Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly 260 265 270 Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu Gln 275 280 285 Lys Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser 290 295 300 Gln Thr Val Gln Arg Ala Val Ser 305 310 <210> 7 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide sequence + G335C <400> 7 Ala Asp Ser Asn Pro Arg Cys Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro Ser 1 5 10 15 Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu Val 20 25 30 Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg 35 40 45 Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys Gln 50 55 60 Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr Arg 65 70 75 80 Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro His 85 90 95 Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser Gly Pro Arg 100 105 110 Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser 115 120 125 Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met Pro Glu 130 135 140 Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala 145 150 155 160 Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe 165 170 175 Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu Gln Lys Asp 180 185 190 Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Gln Thr 195 200 205 Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys 210 215 <210> 8 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgE C琯3 + G335C <400> 8 Pro Arg Cys Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu 1 5 10 15 Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Ala 20 25 30 Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys 35 40 45 Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys Gln Arg Asn Gly Thr 50 55 60 Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu 65 70 75 80 Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala 85 90 95 Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser 100 105 <210> 9 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgE C琯3 and C琯4 + G335C <400> 9 Pro Arg Cys Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu 1 5 10 15 Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Ala 20 25 30 Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys 35 40 45 Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys Gln Arg Asn Gly Thr 50 55 60 Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu 65 70 75 80 Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala 85 90 95 Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu 100 105 110 Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg 115 120 125 Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met Pro Glu Asp Ile Ser Val 130 135 140 Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg His Ser Thr 145 150 155 160 Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg 165 170 175 Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu Gln Lys Asp Glu Phe Ile Cys 180 185 190 Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Gln Thr Val Gln Arg Ala 195 200 205 Val Ser 210 <210> 10 <211> 207 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgE C琯2 and C琯3 + G335C <400> 10 Pro Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser Ser Cys Asp Gly Gly Gly His Phe 1 5 10 15 Pro Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Val Ser Gly Tyr Thr Pro Gly 20 25 30 Thr Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp 35 40 45 Leu Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu Ala Ser Thr Gln 50 55 60 Ser Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr 65 70 75 80 Thr Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys 85 90 95 Lys Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Cys Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg 100 105 110 Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys 115 120 125 Leu Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp 130 135 140 Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu 145 150 155 160 Lys Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly 165 170 175 Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His 180 185 190 Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser 195 200 205 <210> 11 <211> 312 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgE C琯2, C琯3 and C琯4 + G335C <400> 11 Pro Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser Ser Cys Asp Gly Gly Gly His Phe 1 5 10 15 Pro Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Val Ser Gly Tyr Thr Pro Gly 20 25 30 Thr Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp 35 40 45 Leu Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu Ala Ser Thr Gln 50 55 60 Ser Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr 65 70 75 80 Thr Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys 85 90 95 Lys Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Cys Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg 100 105 110 Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys 115 120 125 Leu Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp 130 135 140 Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu 145 150 155 160 Lys Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly 165 170 175 Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His 180 185 190 Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser Gly 195 200 205 Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro 210 215 220 Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met 225 230 235 240 Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro 245 250 255 Asp Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly 260 265 270 Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu Gln 275 280 285 Lys Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser 290 295 300 Gln Thr Val Gln Arg Ala Val Ser 305 310 <210> 12 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide sequence <400> 12 Ala Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro Ser 1 5 10 15 Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu Val 20 25 30 Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg 35 40 45 Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys Gln 50 55 60 Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr Arg 65 70 75 80 Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro His 85 90 95 Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser Gly Pro Arg 100 105 110 Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser 115 120 125 Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met Pro Glu 130 135 140 Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala 145 150 155 160 Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe 165 170 175 Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu Gln Lys Asp 180 185 190 Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Gln Thr 195 200 205 Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys 210 215 <210> 13 <211> 419 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EIgE constant domain <400> 13 Val Ser Lys Gln Ala Pro Leu Ile Phe Pro Leu Ala Ala Cys Cys Lys 1 5 10 15 Asp Thr Lys Thr Thr Asn Ile Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Gly Ala Trp Asp Ala Gly Pro Leu Asn Pro Ser Thr Met Thr 35 40 45 Phe Pro Ala Val Phe Asp Gln Thr Ser Gly Leu Tyr Thr Thr Ile Ser 50 55 60 Arg Val Val Ala Ser Gly Lys Trp Ala Lys Gln Lys Phe Thr Cys Gly 65 70 75 80 Val Val His Ser Gln Glu Thr Phe Asn Lys Thr Phe Asn Ala Cys Ile 85 90 95 Val Thr Phe Thr Pro Pro Thr Val Lys Leu Phe His Ser Ser Cys Asp 100 105 110 Pro Gly Gly Asp Ser His Thr Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Ile Ser 115 120 125 Asp Tyr Thr Pro Gly Asp Ile Asp Ile Val Trp Leu Ile Glu Gly Gln 130 135 140 Lys Val Asp Glu Gln Phe Pro Thr Gln Ala Ser Met Lys Gln Glu Gly 145 150 155 160 Ser Trp Pro Pro Thr His Ser Glu Leu Asn Ile Asn Gln Gly Gln Trp 165 170 175 Ala Ser Glu Asn Thr Tyr Thr Cys Gln Val Thr Tyr Lys Asp Met Ile 180 185 190 Phe Asn Gln Ala Arg Lys Cys Thr Glu Ser Asp Pro Pro Gly Val Ser 195 200 205 Val Tyr Leu Ser Pro Pro Ser Pro Leu Asp Leu Tyr Val Ser Lys Thr 210 215 220 Pro Lys Ile Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Ala Asn Val Gln Gly Leu 225 230 235 240 Ser Leu Asn Trp Ser Arg Glu Ser Gly Glu Pro Leu Gln Lys His Thr 245 250 255 Leu Ala Thr Ser Glu Gln Phe Asn Lys Thr Phe Ser Val Thr Ser Thr 260 265 270 Leu Pro Val Asp Thr Thr Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Lys Cys 275 280 285 Thr Val Ser His Pro Asp Leu Pro Arg Glu Val Val Arg Ser Ile Ala 290 295 300 Lys Ala Pro Gly Lys Arg Leu Ser Pro Glu Val Tyr Val Phe Leu Pro 305 310 315 320 Pro Glu Glu Asp Gln Ser Ser Lys Asp Lys Val Thr Leu Thr Cys Leu 325 330 335 Ile Gln Asn Phe Phe Pro Ala Asp Ile Ser Val Gln Trp Arg Arg Asn 340 345 350 Asn Val Leu Ile Gln Thr Asp Gln Gln Ala Thr Thr Arg Pro Gln Lys 355 360 365 Ala Asn Gly Pro Asp Pro Ala Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val 370 375 380 Ser Arg Ala Glu Trp Glu Gln Lys Asn Lys Phe Ala Cys Lys Val Val 385 390 395 400 His Glu Ala Leu Ser Gln Arg Thr Leu Gln Lys Glu Val Ser Lys Asp 405 410 415 Pro Gly Lys <210> 14 <211> 426 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cIgE constant domain <400> 14 Thr Ser Gln Asp Leu Ser Val Phe Pro Leu Ala Ser Cys Cys Lys Asp 1 5 10 15 Asn Ile Ala Ser Thr Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Thr Gly Tyr 20 25 30 Leu Pro Met Ser Thr Thr Val Thr Trp Asp Thr Gly Ser Leu Asn Lys 35 40 45 Asn Val Thr Thr Phe Pro Thr Thr Phe His Glu Thr Tyr Gly Leu His 50 55 60 Ser Ile Val Ser Gln Val Thr Ala Ser Gly Lys Trp Ala Lys Gln Arg 65 70 75 80 Phe Thr Cys Ser Val Ala His Ala Glu Ser Thr Ala Ile Asn Lys Thr 85 90 95 Phe Ser Ala Cys Ala Leu Asn Phe Ile Pro Pro Thr Val Lys Leu Phe 100 105 110 His Ser Ser Cys Asn Pro Val Gly Asp Thr His Thr Thr Ile Gln Leu 115 120 125 Leu Cys Leu Ile Ser Gly Tyr Val Pro Gly Asp Met Glu Val Ile Trp 130 135 140 Leu Val Asp Gly Gln Lys Ala Thr Asn Ile Phe Pro Tyr Thr Ala Pro 145 150 155 160 Gly Thr Lys Glu Gly Asn Val Thr Ser Thr His Ser Glu Leu Asn Ile 165 170 175 Thr Gln Gly Glu Trp Val Ser Gln Lys Thr Tyr Thr Cys Gln Val Thr 180 185 190 Tyr Gln Gly Phe Thr Phe Lys Asp Glu Ala Arg Lys Cys Ser Glu Ser 195 200 205 Asp Pro Arg Gly Val Thr Ser Tyr Leu Ser Pro Pro Ser Pro Leu Asp 210 215 220 Leu Tyr Val His Lys Ala Pro Lys Ile Thr Cys Leu Val Val Asp Leu 225 230 235 240 Ala Thr Met Glu Gly Met Asn Leu Thr Trp Tyr Arg Glu Ser Lys Glu 245 250 255 Pro Val Asn Pro Gly Pro Leu Asn Lys Lys Asp His Phe Asn Gly Thr 260 265 270 Ile Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Asn Thr Asn Asp Trp Ile Glu 275 280 285 Gly Glu Thr Tyr Tyr Cys Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Lys Asp 290 295 300 Ile Val Arg Ser Ile Ala Lys Ala Pro Gly Lys Arg Ala Pro Pro Asp 305 310 315 320 Val Tyr Leu Phe Leu Pro Pro Glu Glu Glu Gln Gly Thr Lys Asp Arg 325 330 335 Val Thr Leu Thr Cys Leu Ile Gln Asn Phe Phe Pro Ala Asp Ile Ser 340 345 350 Val Gln Trp Leu Arg Asn Asp Ser Pro Ile Gln Thr Asp Gln Tyr Thr 355 360 365 Thr Thr Gly Pro His Lys Val Ser Gly Ser Arg Pro Ala Phe Phe Ile 370 375 380 Phe Ser Arg Leu Glu Val Ser Arg Val Asp Trp Glu Gln Lys Asn Lys 385 390 395 400 Phe Thr Cys Gln Val Val His Glu Ala Leu Ser Gly Ser Arg Ile Leu 405 410 415 Gln Lys Trp Val Ser Lys Thr Pro Gly Lys 420 425 <210> 15 <211> 496 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fIgE constant domain <400> 15 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 20 25 30 Gln Met Thr Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 35 40 45 Arg Gly Thr Gly Val Ile Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Leu Val 50 55 60 Thr Val Ser Ser Thr Ser Ile Gln Ala Pro Leu Val Phe Pro Leu Ala 65 70 75 80 Thr Cys Cys Lys Gly Thr Ile Ala Thr Ala Pro Ser Val Thr Leu Gly 85 90 95 Cys Leu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Met Pro Val Thr Val Thr Trp Asp 100 105 110 Ala Arg Ser Leu Asn Lys Ser Val Val Thr Leu Pro Ala Thr Leu Gln 115 120 125 Glu Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Thr Thr Ser His Val Thr Val Ser Gly 130 135 140 Glu Trp Ala Lys Gln Lys Phe Thr Cys Ser Val Ala His Ala Glu Ser 145 150 155 160 Pro Thr Ile Asn Lys Thr Val Ser Ala Cys Thr Met Asn Phe Ile Pro 165 170 175 Pro Thr Val Lys Leu Phe His Ser Ser Cys Asn Pro Leu Gly Asp Thr 180 185 190 Gly Ser Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Ile Ser Gly Tyr Val Pro Gly 195 200 205 Asp Met Glu Val Thr Trp Leu Val Asp Gly Gln Lys Ala Thr Asn Ile 210 215 220 Phe Pro Tyr Thr Ala Pro Gly Lys Gln Glu Gly Lys Val Thr Ser Thr 225 230 235 240 His Ser Glu Leu Asn Ile Thr Gln Gly Glu Trp Val Ser Gln Lys Thr 245 250 255 Tyr Thr Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly Phe Thr Phe Glu Asp His Ala 260 265 270 Arg Lys Cys Thr Glu Ser Asp Pro Arg Gly Val Ser Thr Tyr Leu Ser 275 280 285 Pro Pro Ser Pro Leu Asp Leu Tyr Val His Lys Ser Pro Lys Ile Thr 290 295 300 Cys Leu Val Val Asp Leu Ala Asn Thr Asp Gly Met Ile Leu Thr Trp 305 310 315 320 Ser Arg Glu Asn Gly Glu Ser Val His Pro Asp Pro Met Val Lys Lys 325 330 335 Thr Gln Tyr Asn Gly Thr Ile Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Asp 340 345 350 Ala Thr Asp Trp Val Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Lys Val Thr His 355 360 365 Pro Asp Leu Pro Lys Asp Ile Val Arg Ser Ile Ala Lys Ala Pro Gly 370 375 380 Arg Arg Phe Pro Pro Glu Val Tyr Val Phe Leu Pro Pro Glu Gly Glu 385 390 395 400 Pro Lys Thr Lys Asp Lys Val Thr Leu Thr Cys Leu Ile Gln Asn Phe 405 410 415 Phe Pro Pro Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Asp Ser Pro Val 420 425 430 Arg Thr Glu Gln Gln Ala Thr Thr Trp Pro His Lys Ala Thr Gly Pro 435 440 445 Ser Pro Ala Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Ser Arg Ala Asp 450 455 460 Trp Glu Gln Arg Asp Val Phe Thr Cys Gln Val Val His Glu Ala Leu 465 470 475 480 Pro Gly Phe Arg Thr Leu Lys Lys Ser Val Ser Lys Asn Pro Gly Lys 485 490 495

Claims

담체 단백질(carrier protein)과 접합된 적어도 하나의 면역글로불린(immunoglobulin) 또는 면역글로불린 단편(fragment)을 포함하는 면역원성 생성물(immunogenic product)로서,
적어도 하나의 면역글로불린이 IgE, 바람직하게는 인간 IgE이고, IgE 단편이 IgE Cε3 도메인(domain)을 포함하고, 담체 단백질이 바람직하게는 CRM₁₉₇인, 면역원성 생성물.
제1항에 있어서, 면역글로불린 단편이 IgE Cε3 및 Cε4 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는, 면역원성 생성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 면역글로불린 단편이 IgE Cε2, Cε3 및 Cε4 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는, 면역원성 생성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, IgE 또는 이의 단편이 G335C 돌연변이를 포함하는, 면역원성 생성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, IgE 단편이 서열번호 7을 포함하거나 이로 이루어지는, 면역원성 생성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, IgE 단편이 적어도 하나의 글리코실화를 포함하는, 면역원성 생성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 생성물을 포함하는 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 생성물 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제(excipient)를 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 생성물 및 적어도 하나의 보조제(adjuvant)를 포함하는 백신 조성물.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 에멀젼(emulsion)인, 조성물, 약제학적 조성물 또는 백신 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 생성물을 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
a) 면역글로불린 또는 이의 단편을 NHS-에스테르, 바람직하게는 N-[γ-말레이미도부티릴옥시]-숙신이미드 에스테르(sGMBS)를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제(heterobifunctional crosslinker)와 접촉시킴으로써, NHS-에스테르를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제와 면역글로불린 또는 이의 단편 사이의 복합체(complex), 바람직하게는 sGMBS-면역글로불린 또는 이의 단편 복합체를 수득하는 단계;
b) 담체 단백질(carrier protein)을, NHS-에스테르, 바람직하게는 N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트(SATA)를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제와 접촉시킴으로써, NHS-에스테르를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제와 담체 사이의 복합체, 바람직하게는 담체-SATA 복합체를 생성하는 단계;
c) NHS-에스테르를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제와 면역글로불린 또는 이의 단편 사이의 복합체, 바람직하게는 단계 (a)에서 수득된 sGMBS-면역글로불린 또는 이의 단편 복합체를, NHS-에스테르를 함유하는 헤테로이작용성 가교결합제와 담체 사이의 복합체, 바람직하게는 단계 (b)에서 수득된 담체-SATA 복합체와 접촉시키는 단계
를 포함하는, 방법.
의약(medicament)으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 생성물.
염증성 장애(inflammatory disorder)를 치료하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 생성물 또는 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 조성물, 약제학적 조성물 또는 백신 조성물로서, 바람직하게는 염증성 장애가 비정상적 IgE 발현 또는 활성과 연관되어 있는, 면역원성 생성물, 조성물, 약제학적 조성물 또는 백신 조성물.
제13항에 있어서, 염증성 장애가 천식(asthma), 알레르기성 병태(allergic conditions)(예를 들면, 음식 알레르기(food allergies), 독 알레르기(venom allergy), 동물에 대한 알레르기(allergy to animals), 약물 알레르기(drug allergy), 과민증 IgE 증후군(hyper IgE syndrome), 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 알레르기성 결막염(allergic conjunctivitis) 및 알레르기성 장위염(allergic enterogastritis)), 아나필락시스(anaphylaxis), 아토피성 장애(atopic disorders)(예를 들면, 두드러기(urticaria)(만성 특발성 두드러기(chronic idiopathic urticaria) 및 만성 자발성 두드러기(chronic spontaneous urticaria)를 포함), 습진(eczema)), 수포성 유천포창(bullous pemphigoid), 호흡기 장애(respiratory disorders)(예를 들면, 천식(asthma), 알레르기성 기관지폐 아스퍼길루스증(allergic bronchopulmonary aspergilosis), 알레르기성 기관지폐 진균증(allergic bronchopulmonary mycosis)), 비용종(nasal polyposis) 및 기도 염증을 수반하는 기타 병태(예를 들면, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 전신 경화증(systemic sclerosis; SSc)을 포함한 호산구(eosinophilia), 섬유증(fibrosis) 및 과도한 점액 생성(excess mucus)); 염증성 및/또는 자가면역 장애 또는 병태, 위장 장애 또는 병태(예를 들면, 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases; IBD) 및 호산구성 식도염(eosinophilic esophagitis; EE), 및 호산구성-매개된 위장병(eosinophilic-mediated gastrointestinal disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 크론병(Crohn's disease)); 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus); 비만 세포증(mastocytosis) 및 비만 세포 활성화 증후군(mast cell activation syndrome; MCAS)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 면역원성 생성물 또는 조성물.
제13항 또는 제14항에 있어서, 염증성 장애가 알레르기, 아나필락시스, 알레르기성 천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 및 비용종으로부터 선택되고, 바람직하게는 염증성 장애가 음식 또는 독(venom) 알레르기인, 면역원성 생성물 또는 조성물.
특정 항원에 대한 알레르기가 있는 대상체(subject)의 탈감작(desensitization)을 유도하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 생성물 또는 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 조성물, 약제학적 조성물 또는 백신 조성물로서, 상기 면역원성 생성물 또는 조성물 및 상기 항원이 알레르기 대상체에게 투여되어야 하는, 면역원성 생성물, 조성물, 약제학적 조성물 또는 백신 조성물.