JP2023110045A - 異常なｉｌ－４および／またはｉｌ－１３の発現または活性に関連する疾患を治療するためのｉｌ－４および／またはｉｌ－１３を含む免疫原性産物 - Google Patents

異常なｉｌ－４および／またはｉｌ－１３の発現または活性に関連する疾患を治療するためのｉｌ－４および／またはｉｌ－１３を含む免疫原性産物 Download PDF

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Abstract

【課題】免疫原性産物と、異常なＩＬ－４および／またはＩＬ－１３の発現または活性に関連する疾患（特に喘息、アトピー性皮膚炎およびアレルギー性疾患）を治療するためのその使用とを提供する。【解決手段】担体タンパク質に結合されたサイトカインを含む免疫原性産物に関し、サイトカインはＩＬ－４、ＩＬ－１３およびそれらの混合物を含む群から選択され、かつ担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。本発明はさらに本発明の免疫原性産物を製造するための方法に関する。本発明は、異常なＩＬ－４および／またはＩＬ－１３発現または活性に関連する炎症性疾患を治療するための本発明の免疫原性産物の治療的使用にも関する。【選択図】なし

Description

本発明は免疫原性産物と、異常なＩＬ－４および／またはＩＬ－１３の発現または活性に関連する疾患（特に喘息、アトピー性皮膚炎およびアレルギー性疾患）を治療するためのその使用と、に関する。
アレルギー性疾患は複数の遺伝および環境因子間の相互作用により生じる複雑な疾患である。ここ数十年で観察されているアレルギーの増加は、主に同じ期間に生じる環境の変化によって説明されている。全てのアレルギーのうち、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎および食物アレルギーは主要な公衆衛生問題であり、今ではそれぞれが世界中で少なくとも三億人の人々を冒している。さらに、２０５０年までには世界人口の半分がアレルギー性疾患に冒されるであろうと推定されている。年間死亡率に関しては、世界的に喘息、食物アレルギーまたはアナフィラキシーによって引き起こされるほぼ３００，０００人の回避可能なアレルギー関連死が存在する。従って、アレルギー性疾患の増加は世界の至るところで重大な健康問題となり、大きな社会経済的負担をもたらしているが、そのための効率的な長期治療法はまだ存在しない。
アレルギー性疾患の発病は免疫系のアレルゲンへの曝露により生じる。そのような曝露は、インターロイキン４（ＩＬ－４）およびインターロイキン１３（ＩＬ－１３）などの２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）サイトカインの産生、高レベルの免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体ならびに炎症組織内での免疫細胞の浸潤および増殖を特徴とする２型免疫応答を生じさせる寛容の破綻の原因であるとみなされている。肥満細胞、好塩基球および好酸球は特に、ヒスタミンなどの予め形成された炎症性メディエーターを含む細胞質顆粒の放出に関与している。アレルゲンに曝露されると、そのようなアレルゲンはＩｇＥによって認識され、かつ肥満細胞、好塩基球および好酸球の表面にある受容体に結合し、これによりこれらの細胞の脱顆粒およびひいては臨床的症状の出現が促進される。なおこのような理由から、アレルギーの臨床診断は大部分がアレルゲン特異的ＩｇＥの測定に基づいている。
興味深いことに、ＩＬ－４およびＩＬ－１３サイトカインはアレルギー性疾患の発病において重要な役割を担う。両サイトカインは長い間アレルギー性疾患の発病に関連づけられており、それらの生物学的機能に基づき治療的に重要なサイトカインである。これらの２種類のサイトカインは同様の構造を呈し、かつ１つの受容体サブユニット（ＩＬ－４Ｒα）を共有している。但しそれらの多くの類似性にも関わらず、ＩＬ－４およびＩＬ－１３はアレルギーにおいていくつかの非重複機能を担っているとも考えられている。
ＩＬ－４レベルの増加が喘息患者の血清および気管支肺胞洗浄中で観察されているため、ＩＬ－４はアレルギーの発生に関与している多面的サイトカインである（Ｇｏｕｒ Ｎ．＆Ｗｉｌｌｓ－Ｋａｒｐ Ｍ．，２０１５）。ＩＬ－４はアレルギー発生の初期に特異的に作用するとみなされている。ＩＬ－４の重要な役割は、ＩｇＥ産生の誘導、ＩｇＥ受容体発現の上方制御およびナイーブ０型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０）のＴｈ２リンパ球への分化などのアレルギーを引き起こすその複数の効果にある。
２型免疫細胞は、ＩｇＥクラスに対する抗体応答において体液性免疫およびＢ細胞のスイッチを制御することによりアレルギープロセスにおいて中心的な役割を担う。従ってＴｈ２細胞はＩｇ産生（例えば、ＩｇＥ、ＩｇＧ）のメディエーターであり、かつ各種サイトカインならびにＩＬ－４およびＩＬ－１３を産生する。
対照的にＩＬ－１３はアレルギー反応のエフェクターおよび後期により多く関与している（Ｇｏｕｒ Ｎ．＆Ｗｉｌｌｓ－Ｋａｒｐ Ｍ．，２０１５）。ＩＬ－１３は、限定されるものではないが、気道過敏性、粘液産生、気道平滑筋の変化および上皮下線維症などのアレルギー性疾患の主要な症状発現を誘導するのに十分であることが分かっている。
ＩＬ－４およびＩＬ－１３が作用することが知られている喘息に関与する細胞の範囲およびこれらのインターロイキンに関連する病原体の機能を考慮すると、一方または両方のサイトカインの中和はアレルギー性炎症性疾患の治療にとって信頼できる手法である。従って、ＩＬ－４およびＩＬ－１３はアレルギーの治療のための有望な治療標的であるため、長期治療効果に達するためには、これらの分子をブロックするための現在の戦略を改良することが明らかに必要である。
最近ではアレルギーを治療するための新規な治療法が開発されている。受動免疫に基づくこれらの治療はアレルギーに関与する病原因子を特異的に標的する。例えばＩＬ－４およびＩＬ－１３またはそれらの受容体に対する組換え抗体の使用が当該技術分野において記載されてきた。しかし組換え抗体の使用は、高コスト、頻回注射を行う必要性、および抗薬物抗体（ＡＤＡ）または他の有害反応の出現の潜在的リスクによって制限されている。
本出願人は本明細書において、ＩＬ－４およびＩＬ－１３から選択されるサイトカインとＣＲＭ１９７との組み合わせをベースとする新規な免疫原性産物を提供する。この新規な免疫原性産物は、特に喘息、アトピー性皮膚炎およびアレルギー性疾患など、炎症性疾患を治療するために特に興味深い。
本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートされた少なくとも１種のサイトカインを含む、免疫原性産物（immunogenic product）であって、少なくとも１種のサイトカインがＩＬ－４、ＩＬ－１３およびそれらの混合物を含む群から選択され、かつ担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、免疫原性産物に関する。
一実施形態では、少なくとも１種のサイトカインはＩＬ－４である。
一実施形態では、少なくとも１種のサイトカインはＩＬ－１３である。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物はＩＬ－４およびＩＬ－１３の両方に結合されたＣＲＭ１９７を含む。
本発明はさらに、本明細書の上に記載されている少なくとも１種の免疫原性産物を含む、組成物に関する。
一実施形態では、本組成物は本明細書の上に記載されている少なくとも２種の免疫原性産物の混合物を含む。
一実施形態では、本組成物は、ＩＬ－４およびＣＲＭ１９７を含む免疫原性産物とＩＬ－１３およびＣＲＭ１９７を含む免疫原性産物との混合物を含む。
一実施形態では、本組成物は、約１０：１～約１：１０の範囲の重量比の、ＩＬ－４およびＣＲＭ１９７を含む免疫原性産物とＩＬ－１３およびＣＲＭ１９７を含む免疫原性産物との混合物を含む。
一実施形態では、本組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤および／または少なくとも１種のアジュバントをさらに含む。
一実施形態では、本組成物はエマルションである。
本発明はさらに、
ａ）少なくとも１種のサイトカインを、ＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性クロスリンカー（好ましくはＮ－［γ－マレイミドブチリルオキシ］－スクシンイミドエステル（ｓＧＭＢＳ））と接触させる工程と、
ｂ）担体タンパク質を、ＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性クロスリンカー（好ましくはＮ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ））と接触させて担体－ＳＡＴＡ複合体を生成する工程と、
ｃ）工程（ａ）で得られたｓＧＭＢＳ－サイトカイン複合体を工程（ｂ）で得られた担体－ＳＡＴＡ複合体と接触させる工程と
を含む、本明細書に記載されている免疫原性産物を作製するための方法に関する。
本発明はさらに、炎症性疾患を治療するための、本明細書に記載されている免疫原性産物または本明細書に記載されている組成物に関する。
一実施形態では、炎症性疾患は、異常なＩＬ－４および／またはＩＬ－１３の発現または活性に関連する疾患である。
一実施形態では、炎症性疾患は、喘息（アレルギー性もしくは非アレルギー性のいずれか）、アレルギー症状（例えば、食物アレルギー、毒アレルギー、動物アレルギー、薬物アレルギー、高ＩｇＥ症候群、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎およびアレルギー性胃腸炎など）、アトピー性疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹（慢性特発性蕁麻疹および慢性蕁麻疹を含む）、湿疹など）、水疱性類天疱瘡、呼吸器疾患（アレルギー性および非アレルギー性喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）など）、鼻ポリープおよび気道炎症を伴う他の症状（例えば、好酸球増加症、嚢胞性線維症および肺線維症を含む線維症および過剰粘液産生、全身性強皮症（ＳＳｃ）など）、炎症性および／または自己免疫疾患または症状、胃腸障害または胃腸病（例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および好酸球性食道炎（ＥＥ）、および好酸球媒介性胃腸疾患、潰瘍性大腸炎およびクローン病など）、全身性エリテマトーデス、肝障害または肝臓病（例えば、肝硬変および肝細胞癌など）、強皮症、線維性疾患または障害（例えば、肝臓の線維症（例えば、Ｂ型および／またはＣ型肝炎ウイルスによって引き起こされる線維症など）など）、強皮症、固形腫瘍または白血病などの癌（例えばＢ細胞慢性リンパ性白血病など）、神経膠芽腫、リンパ腫（例えばホジキンリンパ腫など）ならびに肥満細胞症を含む群から選択される。
一実施形態では、炎症性疾患は、喘息（例えばアレルギー性喘息）、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、食物アレルギー、鼻ポリープおよび好酸球性食道炎を含む群から選択される。
一実施形態では、炎症性疾患は、喘息（例えばアレルギー性喘息）、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症および食物アレルギーを含む群から選択される。
一実施形態では、炎症性疾患はアレルギー、喘息またはアトピー性皮膚炎である。
一実施形態では、本明細書に記載されている免疫原性産物または組成物は、アレルゲンに対してアレルギー性の対象の脱感作を誘導する。
本発明はさらに、特異抗原に対してアレルギー性の対象の脱感作を誘導するための本明細書に記載されている免疫原性産物または組成物であって、当該アレルギー性の対象に前記免疫原性産物または組成物および前記特異抗原が投与される、免疫原性産物または組成物に関する。
本発明はさらに、特異抗原に対してアレルギー性の対象の脱感作を誘導するための方法であって、当該対象に本明細書に記載されている免疫原性産物または組成物および前記特異抗原を投与することを含む方法に関する。
本発明はさらに、特異アレルゲンに対してアレルギー性の対象の脱感作の有効性を高めるための、および／またはその持続期間を減少させるための、方法であって、前記対象に本明細書に記載されている免疫原性産物または組成物を投与し、前記対象を脱感作によってさらに治療する、方法にも関する。
定義
本発明では以下の用語は以下の意味を有する。
本明細書で使用される「約」という用語は、量および一時的な持続期間などの測定可能な値を指す場合、そのようなばらつきがここに開示されている方法を行うのに適当である場合には、指定された値から±２０％または場合によっては±１０％、または場合によっては±５％、または場合によっては±１％、または場合によっては±０．１％のばらつきを包含することが意図されている。
本明細書で使用される「アジュバント」は、本発明の免疫原性産物の免疫原性を高める物質である。アジュバントは免疫応答を増強するために与えられることが多く、当業者には周知である。
本明細書で使用される「担体タンパク質分子」という用語は、ヘテロ複合体を形成するためにＩＬ－４、ＩＬ－１３およびそれらの混合物から選択される少なくとも１種のサイトカインに部分的に共有結合されている場合に、前記少なくとも１種のサイトカインの多数の抗原をＢリンパ球に提示させるのを可能にする少なくとも１５、３０または５０アミノ酸長のタンパク質またはペプチドを指す。
本明細書で使用される「免疫応答」という用語は、例えばリンパ球、抗原提示細胞、食細胞および上記細胞または肝臓によって産生される巨大分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の作用を指す。
本明細書で使用される「免疫原性産物（immunogenic product）」という用語は、前記免疫原性産物が投与される対象（好ましくは哺乳類）において、体液性免疫応答（すなわち、例えば内因性サイトカインの生物活性などの特性を中和する抗体の産生）を含む免疫応答を誘導する、担体タンパク質に結合された少なくとも１種のサイトカインを指す。
本明細書で使用される、ＩＬ－４、ＩＬ－１３またはそれらの混合物から選択される少なくとも１種のサイトカインの「生物活性を阻害する」または「生物活性を中和する」抗体は、例えば実施例に記載されているような機能アッセイを使用することにより、そのサイトカインの活性を当該抗体の非存在下での当該サイトカインの活性レベルと比較した場合に少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれ以上で阻害する抗体を指すことが意図されている。
本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、哺乳類、好ましくはヒトに投与した場合に副作用、アレルギー反応または他の有害反応を生じない賦形剤を指す。それは、ありとあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される担体または賦形剤は、あらゆる種類の非毒性固体、半固体もしくは液体充填剤、希釈液、封入材料または製剤補助剤を指す。ヒトへの投与のために製剤は、例えばＦＤＡまたはＥＭＡなどの規制当局によって要求される無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度基準を満たすものでなければならない。
本明細書で使用される「組換えタンパク質」という用語は、例えば原核生物細胞（バクテリオファージまたはプラスミド発現系を用いる）または真核細胞（例えば酵母、昆虫または哺乳類発現系など）において発現されるタンパク質（例えばサイトカインまたは担体タンパク質ＣＲＭ１９７）などの、組換えＤＮＡ技術を用いて産生されるタンパク質（例えばサイトカインまたは担体タンパク質ＣＲＭ１９７）を指す。この用語は、タンパク質（例えばサイトカインまたは担体タンパク質ＣＲＭ１９７）をコードするＤＮＡ分子の合成によって産生され、かつそのＤＮＡ分子がタンパク質（例えばサイトカインまたは担体タンパク質ＣＲＭ１９７）を発現するタンパク質（例えばサイトカインまたは担体タンパク質ＣＲＭ１９７）、あるいはそのタンパク質（例えばサイトカインまたは担体タンパク質ＣＲＭ１９７）を指定するアミノ酸配列を意味するようにも解釈されるべきであり、ここではそのＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当該技術分野で利用可能であり、かつよく知られている組換えＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を用いて得られたものである。
本明細書で使用される「対象」という用語は、免疫応答を惹起することができる生きている生物（例えば、哺乳類、特にヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ウマおよびヒツジなど）を含むことが意図されている。好ましくは、当該対象はヒトである。一実施形態では、対象は、医療的ケアを受けるのを待っているか受けている途中である、過去に医療処置の対象であったか現在対象であるか今後対象になる、あるいは例えば炎症性疾患などの標的となる疾患または病気の発生について監視されている「患者」、すなわち温血動物、好ましくはヒトであってもよい。一実施形態では、当該対象は成人（例えば１８歳以上の対象）である。別の実施形態では、当該対象は小児（例えば１８歳未満の対象）である。一実施形態では、当該対象は男性である。別の実施形態では、当該対象は女性である。一実施形態では、当該対象は炎症性疾患に罹患しており、好ましくは炎症性疾患であると診断されている。一実施形態では、当該対象は炎症性疾患を発生するリスクがある。リスク因子の例としては、限定されるものではないが、炎症性疾患の遺伝的素因または家族歴が挙げられる。
本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、特定の生物学的結果を達成するのに有効な本明細書に記載されている免疫原性産物の量を指す。従って「治療有効量」という用語は、標的に対して有意なマイナスもしくは有害な副作用を引き起こすことなく、（１）標的となる疾患または病気の発症を遅らせるか予防する、（２）標的となる疾患または病気の１つ以上の症状の進行、増悪または悪化を減速または停止する、（３）標的となる疾患または病気の症状の寛解をもたらす、（４）標的となる疾患または病気の重症度または発生率を低下させる、あるいは（５）標的となる疾患または病気を治癒させることを目的とした免疫原性産物のレベルまたは量を意味する。予防処置のために標的となる疾患または病気の発症前に治療有効量を投与してもよい。代わりまたは追加として、治療処置のために標的となる疾患または病気の開始後に治療有効量を投与してもよい。
本明細書で使用される、「治療」または「治療する」という用語は、治療処置および予防処置の両方を指し、その目的は、標的となる疾患または病気を予防するか減速させる（和らげる）ことである。治療を必要とするものとしては、既に病気に罹患しているものならびに病気に罹患しやすいものまたは病気が予防されるべきものが挙げられる。対象は、治療量の本明細書に記載されている免疫原性産物が投与された後に、当該対象が病原性細胞の数の減少、総病原性細胞の割合の減少、特定の病気に関連する１つ以上の症状のある程度の緩和、罹患率および死亡率の低下および／または生活の質の問題の改善のうちの１つ以上の観察可能および／または測定可能な向上を示す場合に、疾患または病気に対する「治療」が成功となる。治療の成功および病気の改善を評価するための上記パラメータは、医師が精通している通常の手順によって容易に測定可能である。
詳細な説明
本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートされた少なくとも１種のサイトカインを含む免疫原性産物であって、少なくとも１種のサイトカインがＩＬ－４、ＩＬ－１３およびそれらの混合物を含む群から選択され、担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、免疫原性産物に関する。
本発明者らは本明細書において、本発明の免疫原性産物がＣＲＭ１９７の代わりにＫＬＨを含む同じ免疫原性産物と比較した場合に、特に免疫原性の点で、利点を提供することを実証した。
ＣＲＭ１９７は、一塩基置換（５２位におけるグリシンからグルタミン酸への変異）により毒性活性を有しない配列番号１の配列を有するジフテリア毒素の非毒性変異体である。
配列番号１
ＧＡＤＤＶＶＤＳＳＫＳＦＶＭＥＮＦＳＳＹＨＧＴＫＰＧＹＶＤＳＩＱＫＧＩＱＫＰＫＳＧＴＱＧＮＹＤＤＤＷＫＥＦＹＳＴＤＮＫＹＤＡＡＧＹＳＶＤＮＥＮＰＬＳＧＫＡＧＧＶＶＫＶＴＹＰＧＬＴＫＶＬＡＬＫＶＤＮＡＥＴＩＫＫＥＬＧＬＳＬＴＥＰＬＭＥＱＶＧＴＥＥＦＩＫＲＦＧＤＧＡＳＲＶＶＬＳＬＰＦＡＥＧＳＳＳＶＥＹＩＮＮＷＥＱＡＫＡＬＳＶＥＬＥＩＮＦＥＴＲＧＫＲＧＱＤＡＭＹＥＹＭＡＱＡＣＡＧＮＲＶＲＲＳＶＧＳＳＬＳＣＩＮＬＤＷＤＶＩＲＤＫＴＫＴＫＩＥＳＬＫＥＨＧＰＩＫＮＫＭＳＥＳＰＮＫＴＶＳＥＥＫＡＫＱＹＬＥＥＦＨＱＴＡＬＥＨＰＥＬＳＥＬＫＴＶＴＧＴＮＰＶＦＡＧＡＮＹＡＡＷＡＶＮＶＡＱＶＩＤＳＥＴＡＤＮＬＥＫＴＴＡＡＬＳＩＬＰＧＩＧＳＶＭＧＩＡＤＧＡＶＨＨＮＴＥＥＩＶＡＱＳＩＡＬＳＳＬＭＶＡＱＡＩＰＬＶＧＥＬＶＤＩＧＦＡＡＹＮＦＶＥＳＩＩＮＬＦＱＶＶＨＮＳＹＮＲＰＡＹＳＰＧＨＫＴＱＰＦＬＨＤＧＹＡＶＳＷＮＴＶＥＤＳＩＩＲＴＧＦＱＧＥＳＧＨＤＩＫＩＴＡＥＮＴＰＬＰＩＡＧＶＬＬＰＴＩＰＧＫＬＤＶＮＫＳＫＴＨＩＳＶＮＧＲＫＩＲＭＲＣＲＡＩＤＧＤＶＴＦＣＲＰＫＳＰＶＹＶＧＮＧＶＨＡＮＬＨＶＡＦＨＲＳＳＳＥＫＩＨＳＮＥＩＳＳＤＳＩＧＶＬＧＹＱＫＴＶＤＨＴＫＶＮＳＫＬＳＬＦＦＥＩＫＳ
一実施形態では、ＣＲＭ１９７は、２０１８年にＨｉｃｋｅｙ（Ｈｉｃｋｅｙら ２０１８）に記載されているように、自家系（ジフテリア菌）または異種系（大腸菌およびシュードモナス・フルオレッセンス）において当該技術分野で知られている従来の方法によって得てもよい。例えば組換えＣＲＭ１９７は、ＣＲＭ１９７の遺伝子を含む発現ベクターを含む細胞を培養し、封入体を回収し、かつＣＲＭ１９７を精製することにより得てもよい。ＣＲＭ１９７はＡＴＣＣで購入した細菌の菌株（ＡＴＣＣ３９２５５）からのジフテリア菌の培養物から抽出することもできる。一実施形態では、ＣＲＭ１９７は市販されており、例えばＲｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ社（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から購入してもよい。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物はＣＲＭ１９７のバリアントを含み、前記バリアントは配列番号１と少なくとも約７０％、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれ以上の同一性を示す。一実施形態では、ＣＲＭ１９７の前記バリアントは５２位にグリシンからグルタミン酸への変異を含み、従って非毒性である。
「同一性」または「同一の」という用語は、２つ以上の核酸配列または２つ以上のポリペプチドの配列間の関係において使用する場合、それぞれ２つ以上の核酸またはアミノ酸残基からなる配列間の一致数によって決定される核酸配列またはポリペプチド間の配列関連性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ）の程度を指す。「同一性」とは、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって扱われるギャップアラインメント（存在すれば）を有する２つ以上の配列のより短い配列間の完全な一致率の尺度である。関連する核酸配列またはポリペプチドの同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。そのような方法としては、限定されるものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（コンピューターを使用した分子生物学），Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（バイオコンピューティング：情報科学およびゲノムプロジェクト），Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １（配列データのコンピューター解析、パート１），Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ニュージャージー，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における配列分析），ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（配列解析プライマー），Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏら，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載されているものが挙げられる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最大の一致を与えるように設計されている。同一性の決定方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに記述されている。好ましいコンピュータプログラムによる２つの配列間の同一性を決定するための方法としては、ＣｌｕｓｔａｌＯ（Ｓｉｅｖｅｒｓ Ｆ．ら ２０１１）、ｔｈｅ ＧＣＧ ｐｒｏｇｒａｍ ｐａｃｋａｇｅ、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２：３８７（１９８４）；ジェネティクスコンピュータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）、ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０（１９９０））などのＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および他の提供源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら，ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ，メリーランド州ベセズダ，２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）から公的に入手可能である。また周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して同一性を決定してもよい。
一実施形態では、ＣＲＭ１９７は完全長ＣＲＭ１９７である。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物は、例えば配列番号１からの少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００個のアミノ酸（好ましくは隣接するアミノ酸）を含む断片などのＣＲＭ１９７の断片を含む。
一実施形態では、少なくとも１種のサイトカインはＩＬ－４である。
一実施形態では、ＩＬ－４は組換え型である。組換えＩＬ－４は、ＩＬ－４をコードする核酸配列を用いて当該技術分野で知られている従来の方法によって得てもよい。例えば組換えＩＬ－４は、ＩＬ－４の遺伝子を含む発現ベクターを含む細胞を培養し、封入体を回収し、かつＩＬ－４サイトカインを精製することにより得てもよい。組換えＩＬ－４は市販されており、例えばＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社（米国ニュージャージー州ロッキーヒル（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ））から購入してもよい。
本発明の一実施形態では、ＩＬ－４は哺乳類由来である。
一実施形態では、ＩＬ－４は哺乳類ＩＬ－４のバリアントであり、前記バリアントはその由来元である哺乳類ＩＬ－４と少なくとも約７０％、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれ以上の同一性を示す。
一実施形態では、ＩＬ－４は完全長ＩＬ－４である。
別の実施形態では、少なくとも１種のサイトカインは、例えばその由来元であるＩＬ－４の少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０または１２５個のアミノ酸（好ましくは隣接するアミノ酸）を含むＩＬ－４の断片などのＩＬ－４の断片である。
一実施形態では、前記断片はＩＬ－４の少なくとも１つの特異的エピトープを含む。
本発明の一実施形態では、ＩＬ－４はヒトＩＬ－４、好ましくは組換えヒトＩＬ－４である。ヒトＩＬ－４は配列番号２の配列（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０５１１２－１）を有する。
配列番号２
ＨＫＣＤＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮＳＬＴＥＱＫＴＬＣＴＥＬＴＶＴＤＩＦＡＡＳＫＮＴＴＥＫＥＴＦＣＲＡＡＴＶＬＲＱＦＹＳＨＨＥＫＤＴＲＣＬＧＡＴＡＱＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮＬＷＧＬＡＧＬＮＳＣＰＶＫＥＡＮＱＳＴＬＥＮＦＬＥＲＬＫＴＩＭＲＥＫＹＳＫＣＳＳ
一実施形態では、ＩＬ－４は配列番号２のバリアントであり、前記バリアントは配列番号２と少なくとも約７０％、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれ以上の同一性を示す。
一実施形態では、ＩＬ－４は完全長ヒトＩＬ－４である。
別の実施形態では、少なくとも１種のサイトカインは、例えば配列番号２の少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０または１２５個のアミノ酸（好ましくは隣接するアミノ酸）を含むヒトＩＬ－４の断片などのヒトＩＬ－４の断片である。
一実施形態では、前記断片はヒトＩＬ－４の少なくとも１つの特異的エピトープを含む。
一実施形態では、前記断片は、ＡＱＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮＬＷ（配列番号３）の配列を含むかそれからなる。
本発明の一実施形態では、ＩＬ－４はマウスＩＬ－４、好ましくは組換えマウスＩＬ－４である。マウスＩＬ－４は配列番号４の配列（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０７７５０－１）を有する。
配列番号４
ＨＩＨＧＣＤＫＮＨＬＲＥＩＩＧＩＬＮＥＶＴＧＥＧＴＰＣＴＥＭＤＶＰＮＶＬＴＡＴＫＮＴＴＥＳＥＬＶＣＲＡＳＫＶＬＲＩＦＹＬＫＨＧＫＴＰＣＬＫＫＮＳＳＶＬＭＥＬＱＲＬＦＲＡＦＲＣＬＤＳＳＩＳＣＴＭＮＥＳＫＳＴＳＬＫＤＦＬＥＳＬＫＳＩＭＱＭＤＹＳ
一実施形態では、ＩＬ－４は配列番号４のバリアントであり、前記バリアントは配列番号４と少なくとも約７０％、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれ以上の同一性を示す。
一実施形態では、ＩＬ－４は完全長マウスＩＬ－４である。
別の実施形態では、少なくとも１種のサイトカインは、例えば配列番号４の少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０または１１５個のアミノ酸（好ましくは隣接するアミノ酸）を含むマウスＩＬ－４の断片などのマウスＩＬ－４の断片である。
一実施形態では、前記断片は、マウスＩＬ－４の少なくとも１つの特異的エピトープを含む。
本発明の一実施形態では、ＩＬ－４はイヌＩＬ－４、好ましくは組換えイヌＩＬ－４である。イヌＩＬ－４は配列番号５の配列（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｏ７７７６２－１）を有する。
配列番号５
ＨＮＦＮＩＴＩＫＥＩＩＫＭＬＮＩＬＴＡＲＮＤＳＣＭＥＬＴＶＫＤＶＦＴＡＰＫＮＴＳＤＫＥＩＦＣＲＡＡＴＶＬＲＱＩＹＴＨＮＣＳＮＲＹＬＲＧＬＹＲＮＬＳＳＭＡＮＫＴＣＳＭＮＥＩＫＫＳＴＬＫＤＦＬＥＲＬＫＶＩＭＱＫＫＹＹＲＨ
一実施形態では、ＩＬ－４は配列番号５のバリアントであり、前記バリアントは、配列番号５との少なくとも約７０％、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれ以上の同一性を示す。
一実施形態では、ＩＬ－４は完全長イヌＩＬ－４である。
別の実施形態では、少なくとも１種のサイトカインは、例えば配列番号５の少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００または１０５個のアミノ酸（好ましくは隣接するアミノ酸）を含むイヌＩＬ－４の断片などのイヌＩＬ－４の断片である。
一実施形態では、前記断片はイヌＩＬ－４の少なくとも１つの特異的エピトープを含む。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物は、約１６：１～約１：２、好ましくは約８：１～約２：１の範囲、より好ましくは約４：１のＩＬ－４：ＣＲＭ１９７モル比でＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－４を含む。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物はＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－４を含み、抗ＩＬ－４抗体によって認識される。
免疫原性産物がＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－４を含み、かつ抗ＩＬ－４抗体によって認識されるという事実は、当該技術分野で知られている従来の方法によって確認してもよい。そのような方法の例は、例えばビオチンで標識した検出抗体を用いる抗サイトカイン／担体タンパク質サンドイッチＥＬＩＳＡ、ストレプトアビジンＨＲＰ増幅システムおよびｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質溶液である。
一実施形態では、本明細書に記載されているＡＩＬ－４試験は、本発明の免疫原性産物がＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－４を含み、かつ抗ＩＬ－４抗体によって認識されることを確認するために使用してもよい。ＡＩＬ－４試験は抗ＩＬ－４／ＣＲＭ１９７ＥＬＩＳＡ試験である。
ＡＩＬ－４試験は、
－例えばＡｂｃａｍ社（ＡＢ５３８２８）またはＢｉｏ－Ｒａｄ社（３７１０－０９５６、３７１０－０１５０または３７１０－０１００）からの抗ジフテリア毒素抗体などのＣＲＭ１９７に対する捕獲抗体でプレートをコーティングし、
－そのプレートをブロッキング緩衝液（例えば、ＰＢＳ中に例えばカゼイン２％（ｗ／ｖ）など）を用いて約３７℃で約９０分間ブロッキングし、
－そのプレートを２５０ｎｇ／ｍＬで開始する本免疫原性産物の２倍連続希釈物または例えばＩＬ－４およびＣＲＭ１９７などの陰性対照と共に約３７℃で約９０分間インキュベートし、
－そのプレートを例えばＡｂｃａｍ社（ＡＢ８４２７８）、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社（ＢＡＦ２０４）またはＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社（５００－Ｐ２４ＢＴ）からの抗ＩＬ－４ビオチン化抗体あるいはＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（１０２０４－０８）、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社（ＢＡＦ４０４）またはＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社（５００－Ｐ５４ＢＴ）からのマウス抗ＩＬ－４ビオチン化抗体などのＩＬ－４に対するビオチン化検出抗体と共に約３７℃で約９０分間インキュベートし、
－そのプレートをストレプトアビジン－ＨＲＰと共に約３７℃で約３０分間インキュベートし、かつその複合体をＯＰＤ基質溶液で約３０分間発色させ、
－その酵素反応を停止させた後に得られた色の強度を４９０ｎｍでの分光光度法により決定する、
というように行う。
一実施形態では、１ウェル当たり約２５ｎｇで本発明の免疫原性産物を含むウェルの光学濃度が陰性対照を含むウェルの光学濃度の少なくとも約３倍、好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍である場合、当業者は本発明の免疫原性産物が（ｉ）抗ＩＬ－４抗体によって認識され、かつ（ｉｉ）ＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－４を含むという結論に達し得る。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物はＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－４を含み、かつ強く不活性化されており、これは以下で引用されているＢＩＬ－４試験条件下で本免疫原性産物が約１０％未満のＩＬ－４初期活性、好ましくは約５％未満であって好ましくは約１％未満のＩＬ－４初期活性を示すことを意味する。ＢＩＬ－４試験は、本発明の免疫原性産物に含まれているＩＬ－４によって機能的に活性化させることができる（すなわち、本発明の免疫原性産物に含まれているＩＬ－４に結合し、かつこの結合後に活性化させることができる）ＩＬ－４Ｒαを発現する細胞株を用いる比色定量Ｔ細胞増殖アッセイまたはレポーター遺伝子バイオアッセイである。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物はマウスＩＬ－４を含み、かつＢＩＬ－４試験は、
－２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（完全ＲＭＰＩすなわちＲＰＭＩｃ）および１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩを用いて最終１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２の存在下でＣＴＬＬ－２細胞を増殖させ、
－本免疫原性産物のために１０００ｎｇ／ｍＬで開始して最終４ｎｇ／ｍＬまで、そしてｍｕＩＬ－４のために１０ｎｇ／ｍＬで開始して最終０．０４ｎｇ／ｍＬまで、本発明の免疫原性産物（ＩＬ－４／ＣＲＭ１９７）およびｍｕＩＬ－４対照を９６ウェルプレートにおいてＲＰＭＩｃ＋１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで２倍連続希釈し、
－陽性対照として１０ｎｇ／ｍＬのｍｕＩＬ－４を含む６つのウェルを追加し、かつ最大細胞増殖対照として使用し、
－これらの試料を１ウェル当たり２０，０００個のＣＴＬＬ－２細胞に添加し、かつプレートを５％ＣＯ２加湿インキュベータ中約３７℃で約４８時間インキュベートし、
－培養の終了時に当該技術分野でよく知られている方法を用いて細胞生存率を評価する（そのような方法の一例は、製造業者の説明書に従い、４０μＬ／ウェルのＭＴＳ／ＰＭＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国ウィスコンシン州マディソン）（ここではＭＴＳは、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム分子内塩を表し、ＰＭＳはフェナジンメトサルフェートを表す）をウェルに添加し、かつそのプレートを５％ＣＯ２中３７℃でさらに４時間インキュベートし、次いでこのプレートを分光光度計を用いて４９０ｎｍで読み取ることである）
という方法で、ＣＴＬＬ－２細胞（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社によって提供されているＥＣＡＣＣ細胞株から、参照番号９３０４２６１０－１ＶＬ）を用いて行う比色定量Ｔ細胞増殖アッセイである。
別の実施形態では、本発明の免疫原性産物はヒトＩＬ－４を含み、ＢＩＬ－４試験はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から購入したＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞株を用いて行うレポーター遺伝子アッセイである。これらの細胞ではＩＬ－４またはＩＬ－１３による刺激によりＪＡＫ／ＳＴＡＴ６経路を活性化させるとその後にＳＥＡＰが産生される。次いで、その上澄み中のＳＥＡＰレベルを評価することにより本発明の免疫原性産物に含まれているＩＬ－４の生物活性を評価することができる。
本実施形態によれば、ＢＩＬ－４試験は、
－１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）からなるアッセイ培地においてＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞を培養する工程と、
－免疫原性産物（ＩＬ－４／ＣＲＭ１９７）およびＩＬ－４対照をそれぞれ最終８０００および１ｎｇ／ｍＬでアッセイ培地で２倍連続希釈する工程と、
－次いでこれらの希釈試料を１ウェル当たり４０，０００個の細胞（ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞）を含む予め播種されたプレートに移し、プレートを５％ＣＯ２加湿インキュベータ中約３７℃で約２４時間インキュベートする工程と、
－培養の終了時に、当該技術分野でよく知られている方法を用いて活性化経路を評価する工程（そのような方法の一例は、９０μＬ／ウェルのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社から購入）を１０μＬ／ウェルの細胞上澄みに添加し、次いでこのプレートを５％ＣＯ２加湿インキュベータ中約３７℃で約１時間インキュベートし、次いでこのプレートを分光光度計を用いて６２５ｎｍで読み取ることである）と
を含む。
５０％有効量（ＥＤ５０）値は、最大細胞シグナルの５０％を生じさせる免疫原性産物またはサイトカインの量に対応している。この値は、５０％変曲点を取り囲んでいる希釈点を通る曲線からの式ｙ＝ａｘ＋ｂを用いて最大細胞シグナルの５０％を横座標軸に補間することにより決定する。
ＢＩＬ－４試験では、被験免疫原性産物のＥＤ５０をＩＬ－４対照標準曲線の平均ＥＤ５０で割ることにより不活性化係数を計算する。不活性化係数＞１００という結果は同じ量のタンパク質の場合、本免疫原性産物中のＩＬ－４活性が自然なＩＬ－４活性の１％未満に対応していることを意味する。一実施形態では、約２、２．５、３．３３、５または１０、好ましくは約２０、より好ましくは約１００を超える不活性化係数は本免疫原性産物が強く不活性化されていることを示す。一実施形態では、自然なＩＬ－４活性よりも約５０％、４０％、３０％、２０％または１０％低い、好ましくは約５％低い、より好ましくは約１％低い残留活性は、本免疫原性産物が強く不活性化されていることを示す。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物はＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－４を含み、かつ免疫原性であり、これは本免疫原性産物がＣＩＬ－４試験条件下でインビボにおいて抗ＩＬ－４抗体を誘導することができることを意味する。一実施形態では、本発明の免疫原性産物は例えばＣＩＬ－４試験条件下などでインビボにおいてポリクローナル抗ＩＬ－４抗体を誘導することができる。
ＣＩＬ－４試験は以下の方法に従って行い、すなわち本免疫原性産物の特定量の総タンパク質（例えばブラッドフォードタンパク質アッセイにより決定）をマウス（４週齢以上）に１２０日で３～４回注射する。一実施形態では、ＣＩＬ－４試験は例えば異種系であり、非マウスＩＬ－４を含む免疫原性産物をマウスに注射し、この試験は約０．３～３０μｇの範囲の総タンパク質用量を投与することを含む。別の実施形態では、ＣＩＬ－４試験は同種系であり、すなわちマウスＩＬ－４を含む免疫原性産物をマウスに注射し、この試験は約５～約３０μｇの範囲の総タンパク質用量を投与することを含む。血清試料は免疫前（免疫前血清試料）および３９日目～１２０日目の間（試験血清試料）に得る。ＥＬＩＳＡ抗ＩＬ－４は以下に説明されているように行う。
簡単に言えば、本免疫原性産物を調製するために使用される１μｇ／ｍＬのＩＬ－４で９６ウェルプレートをコーティングし、かつ約２℃～約８℃の範囲の温度で一晩インキュベートする。次いでこのプレートをブロッキング緩衝液を用いて約３７℃で約９０分間ブロッキングする。１００μＬの免疫前試料および血清試料（免疫前および試験）を例えば５００ｄｉｌ－１で開始して２５６，０００ｄｉｌ－１までなどの２倍連続希釈でそのウェルに添加する。標識した抗マウス免疫グロブリン二次抗体（例えばＨＲＰ結合抗体など）を最後にウェルに添加し、かつ例えばＯＰＤ基質溶液などの当該技術分野で知られている任意の比色手段を用いてＥＬＩＳＡを発色させる。
一実施形態では、試験血清試料を含むウェルの光学濃度（４９０ｎｍ）が免疫前血清試料を含むウェルの光学濃度よりも少なくとも約１．５倍、好ましくは少なくとも約２倍高い場合、本免疫原性産物を免疫原性であるとみなし、これは本免疫原性産物がインビボにおいて抗ＩＬ－４抗体を誘導したことを意味する。
この試験では力価は、当該アッセイにおいて「ＯＤｍａｘ－対応する免疫前試料のＯＤ」の５０％に達した場合の血清の希釈として定めた。この計算様式は周知の抗体陽転力価を見る場合よりも非常に厳しいが、よりロバストな分析およびより低い偽陽性を提供する。力価は血清希釈係数（ｄｉｌ－１）として表す。
別の実施形態では、ＣＩＬ－４試験において力価の値≧２５０ｄｉｌ－１、好ましくは≧５００ｄｉｌ－１は、本発明の免疫原性産物がＩＬ－４に対する結合抗体の産生を可能にすることを示す。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物はＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－４を含み、かつ以下で引用されているＤＩＬ－４試験条件下でＩＬ－４活性を中和することができる。本発明によれば、本免疫原性産物で免疫したマウスから得られた血清の中和能を評価するためにＤＩＬ－４試験を行う。そのような評価は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞を用いてマウス産物のための比色定量Ｔ細胞増殖アッセイまたはヒト産物のためのレポーター遺伝子バイオアッセイにより行ってもよい。これらの細胞ではＩＬ－４またはＩＬ－１３による刺激によりＪＡＫ／ＳＴＡＴ６経路を活性化させるとその後にＳＥＡＰが産生される。次いで、その上澄み中のＳＥＡＰレベルを評価することにより本免疫原性産物を用いた免疫によって誘導された抗ＩＬ－４中和抗体を評価することができる。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物はマウスＩＬ－４を含み、かつＤＩＬ－４試験は、
－ＲＰＭＩｃおよび１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳと共に最終１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２の存在下でＣＴＬＬ－２細胞を増殖させ、
－血清試料を最終１／２００で、陽性対照ポリクローナル抗ＩＬ－４抗体を最終１μｇ／ｍＬで添加し、かつ培養プレートにおいて１ウェル当たり２５μLのＲＰＭＩｃ＋１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで２倍連続希釈し、
－次いでｍｕＩＬ－４を最終２ｎｇ／ｍＬで血清試料に添加し、かつ次いで対照を室温で１時間インキュベートし、
－次いで、１ウェル当たり２０，０００個のＣＴＬＬ－２細胞を予めインキュベートした試料に添加し、次いでプレートを５％ＣＯ２加湿インキュベータ中約３７℃で約４８時間インキュベートし、
－培養の終了時に、当該技術分野で良く知られている方法を用いて細胞生存率を評価する（そのような方法の一例は、４０μＬ／ウェルのＭＴＳ／ＰＭＳ溶液をそのウェルに添加し、かつそのプレートを５％ＣＯ２中３７℃でさらに４時間インキュベートし、次いでこのプレートを分光光度計を用いて４９０ｎｍで読み取ることである）
という方法で、ＣＴＬＬ－２細胞を用いて行う比色定量Ｔ細胞増殖アッセイである。
別の実施形態では、本発明の免疫原性産物はヒトＩＬ－４を含み、かつＤＩＬ－４試験はＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞を用いて行うレポーター遺伝子バイオアッセイであり、
－１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）からなるアッセイ培地にＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞を播種する工程と、
－血清試料、対照抗体（ポリクローナルヤギ抗ＩＬ－４抗体）をそれぞれ最終１／２００および１μｇ／ｍＬでアッセイ培地で希釈し、血清試料または対照抗体を室温での１時間のインキュベーションのために最終０．２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４の存在下で９６丸底ウェルプレートにおいて２倍連続希釈する工程と、
－次いでこれらの混合物を１ウェル当たり４０，０００個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞を含む予め播種されたプレートに添加し、プレートを５％ＣＯ２加湿インキュベータ中約３７℃で約２４時間インキュベートする工程と、
－培養の終了時に、当該技術分野でよく知られている方法を用いて活性化経路を評価する工程（そのような方法の一例は、９０μＬ／ウェルのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液を１０μＬ／ウェルの細胞上澄みに添加し、次いでプレートを５％ＣＯ２加湿インキュベータ中３７℃で１時間インキュベートし、次いでプレートを分光光度計を用いて６２５ｎｍで読み取ることである）と
を含む。
ＮＣ５０の結果は、ｍｕＩＬ－４またはＩＬ－４活性の５０％を中和する血清希釈係数（ｄｉｌ－１）として表す。ＮＣ５０はＩＬ－４活性の５０％を生じさせる血清希釈を横座標軸に補間することにより決定する。
ＤＩＬ－４試験では、ＮＣ５０値≧１００ｄｉｌ－１、好ましくは≧２００ｄｉｌ－１は、本発明の免疫原性産物がＩＬ－４に対する中和抗体の産生を可能にすることを示す。一実施形態では、本発明の免疫原性産物の投与によって誘導されるＩＬ－４に対する中和抗体はポリクローナルである。
一実施形態では、少なくとも１種のサイトカインはＩＬ－１３である。
一実施形態では、ＩＬ－１３は組換え型である。組換えＩＬ－１３はＩＬ－１３をコードする核酸配列を用いて当該技術分野で知られている従来の方法によって得てもよい。例えば、組換えＩＬ－１３は、ＩＬ－１３の遺伝子を含む発現ベクターを含む細胞を培養し、封入体を回収し、かつＩＬ－１３サイトカインを精製することにより得てもよい。組換えＩＬ－１３は市販されており、例えばＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社（米国ニュージャージー州ロッキーヒル）から購入してもよい。
本発明の一実施形態では、ＩＬ－１３は哺乳類由来である。
一実施形態では、ＩＬ－１３は哺乳類ＩＬ－１３のバリアントであり、前記バリアントはその由来元である哺乳類ＩＬ－１３と少なくとも約７０％、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれ以上の同一性を示す。
一実施形態では、ＩＬ－１３は完全長ＩＬ－１３である。
別の実施形態では、少なくとも１種のサイトカインは、例えばその由来元であるＩＬ－１３の少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５または１２０個のアミノ酸（好ましくは隣接するアミノ酸）を含むＩＬ－１３の断片などのＩＬ－１３の断片である。
一実施形態では、前記断片はＩＬ－１３の少なくとも１つの特異的エピトープを含む。
本発明の一実施形態では、ＩＬ－１３はヒトＩＬ－１３、好ましくは組換えヒトＩＬ－１３である。ヒトＩＬ－１３は配列番号６の配列（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ３５２２５－１）を有する。
配列番号６
ＬＴＣＬＧＧＦＡＳＰＧＰＶＰＰＳＴＡＬＲＥＬＩＥＥＬＶＮＩＴＱＮＱＫＡＰＬＣＮＧＳＭＶＷＳＩＮＬＴＡＧＭＹＣＡＡＬＥＳＬＩＮＶＳＧＣＳＡＩＥＫＴＱＲＭＬＳＧＦＣＰＨＫＶＳＡＧＱＦＳＳＬＨＶＲＤＴＫＩＥＶＡＱＦＶＫＤＬＬＬＨＬＫＫＬＦＲＥＧＲＦＮ
一実施形態では、ＩＬ－１３は配列番号６のバリアントであり、前記バリアントは配列番号６と少なくとも約７０％、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれ以上の同一性を示す。
一実施形態では、ＩＬ－１３は完全長ヒトＩＬ－１３である。
別の実施形態では、少なくとも１種のサイトカインは、例えば配列番号６の少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５または１２０個のアミノ酸（好ましくは隣接するアミノ酸）を含むヒトＩＬ－１３の断片などのヒトＩＬ－１３の断片である。
一実施形態では、前記断片はヒトＩＬ－１３の少なくとも１つの特異的エピトープを含む。
本発明の一実施形態では、ＩＬ－１３はマウスＩＬ－１３、好ましくは組換えマウスＩＬ－１３である。マウスＩＬ－１３は配列番号７の配列（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ２０１０９－１）を有する。
配列番号７
ＰＶＰＲＳＶＳＬＰＬＴＬＫＥＬＩＥＥＬＳＮＩＴＱＤＱＴＰＬＣＮＧＳＭＶＷＳＶＤＬＡＡＧＧＦＣＶＡＬＤＳＬＴＮＩＳＮＣＮＡＩＹＲＴＱＲＩＬＨＧＬＣＮＲＫＡＰＴＴＶＳＳＬＰＤＴＫＩＥＶＡＨＦＩＴＫＬＬＳＹＴＫＱＬＦＲＨＧＰＦ
一実施形態では、ＩＬ－１３は配列番号７のバリアントであり、前記バリアントは配列番号７と少なくとも約７０％、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれ以上の同一性を示す。
一実施形態では、ＩＬ－１３は完全長マウスＩＬ－１３である。
別の実施形態では、少なくとも１種のサイトカインは、例えば配列番号７の少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００または１０５個のアミノ酸（好ましくは隣接するアミノ酸）を含むマウスＩＬ－１３の断片などのマウスＩＬ－１３の断片である。
一実施形態では、前記断片はマウスのＩＬ－１３の少なくとも１つの特異的エピトープを含む。
本発明の一実施形態では、ＩＬ－１３はイヌＩＬ－１３、好ましくは組換えイヌＩＬ－１３である。イヌＩＬ－１３は配列番号８の配列（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｑ９Ｎ０Ｗ９－１）を有する。
配列番号８
ＳＰＳＰＶＴＰＳＰＴＬＫＥＬＩＥＥＬＶＮＩＴＱＮＱＡＳＬＣＮＧＳＭＶＷＳＶＮＬＴＡＧＭＹＣＡＡＬＥＳＬＩＮＶＳＤＣＳＡＩＱＲＴＱＲＭＬＫＡＬＣＳＱＫＰＡＡＧＱＩＳＳＥＲＳＲＤＴＫＩＥＶＩＱＬＶＫＮＬＬＴＹＶＲＧＶＹＲＨＧＮＦＲ
一実施形態では、ＩＬ－１３は配列番号８のバリアントであり、前記バリアントは配列番号８と少なくとも約７０％、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれ以上の同一性を示す。
一実施形態では、ＩＬ－１３は完全長イヌＩＬ－１３である。
別の実施形態では、少なくとも１種のサイトカインは、例えば配列番号８の少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５または１１０個のアミノ酸（好ましくは隣接するアミノ酸）を含むイヌＩＬ－１３の断片などのイヌＩＬ－１３の断片である。
一実施形態では、前記断片はイヌＩＬ－１３の少なくとも１つの特異的エピトープを含む。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物は約１６：１～約１：２、好ましくは約８：１～約２：１の範囲、より好ましくは約４：１のＩＬ－１３：ＣＲＭ１９７モル比でＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－１３を含む。
本発明の一実施形態では、本免疫原性産物はＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－１３を含み、かつ抗ＩＬ－１３抗体によって認識される。
本免疫原性産物がＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－１３を含み、かつ抗ＩＬ－１３抗体によって認識されるという事実は、当該技術分野で知られている従来の方法によって確認してもよい。そのような方法の例は、例えばビオチンで標識した検出抗体を用いる抗サイトカイン／担体タンパク質サンドイッチＥＬＩＳＡ、ストレプトアビジンＨＲＰ増幅システムおよび／またはＯＰＤ基質溶液である。
一実施形態では、本明細書に記載されているＡＩＬ－１３試験は本発明の免疫原性産物がＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－１３を含み、かつ抗ＩＬ－１３抗体によって認識されることを確認するために使用してもよい。ＡＩＬ－１３試験は抗ＩＬ－１３／ＣＲＭ１９７ＥＬＩＳＡ試験である。
ＡＩＬ－１３試験は、
－例えばＡｂｃａｍ社（ＡＢ５３８２８）またはＢｉｏ－Ｒａｄ社（３７１０－０９５６、３７１０－０１５０または３７１０－０１００）からの抗ジフテリア毒素抗体などのＣＲＭ１９７に対する捕獲抗体でプレートをコーティングし、
－そのプレートをブロッキング緩衝液（例えばＰＢＳ中に例えばカゼイン２％（ｗ／ｖ）など）を用いて約３７℃で約９０分間ブロッキングし、
－そのプレートを２５０ｎｇ／ｍＬで開始する本免疫原性産物の２倍連続希釈物または例えばＩＬ－１３およびＣＲＭ１９７などの陰性対照と共に約３７℃で約９０分間インキュベートし、
－そのプレートを、例えばＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社（１０１２６－０８）、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社（５００－Ｐ１３ＢＴ）またはＲ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社（ＢＡＦ２１３）からの抗ＩＬ－１３ビオチン化抗体あるいはＢｉｏ－Ｒａｄ社（ＡＡＭ３４Ｂ）、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社（５００－Ｐ１７８ＢＴ）またはＲ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社（ＢＡＦ４１３）からのマウス抗ＩＬ－１３ビオチン化抗体などのＩＬ－１３に対するビオチン化検出抗体と共に約３７℃で約９０分間インキュベートし、
－そのプレートをストレプトアビジン－ＨＲＰと共に約３７℃で約３０分間インキュベートし、かつその複合体をＯＰＤ基質溶液で約３０分間発色させ、
－その酵素反応を停止させた後に得られた色の強度を４９０ｎｍでの分光光度法により決定する
というように行う。
一実施形態では、１ウェル当たり２５ｎｇで本発明の免疫原性産物を含むウェルの光学濃度が陰性対照を含むウェルの光学濃度の少なくとも約３倍、好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍である場合、当業者は本発明の免疫原性産物が（ｉ）抗ＩＬ－１３抗体によって認識され、かつ（ｉｉ）ＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－１３を含むという結論に達し得る。
別の実施形態では、本発明の免疫原性産物はＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－１３を含み、かつ強く不活性化されており、これは本免疫原性産物が以下で引用されているＢＩＬ－１３試験条件下で約１５％未満の残留活性、好ましくは約１０％未満の残留活性、より好ましくは約５％未満の残留活性を示すことを意味する。ＢＩＬ－１３試験はＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞を用いるレポーター遺伝子バイオアッセイである。これらの細胞ではＩＬ－４またはＩＬ－１３による刺激によりＪＡＫ／ＳＴＡＴ６経路を活性化させるとその後にＳＥＡＰが産生される。次いで、その上澄み中のＳＥＡＰレベルを評価することにより本発明の免疫原性産物に含まれているＩＬ－１３の生物活性を評価することができる。
一実施形態では、ＢＩＬ－１３試験はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社から購入したＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞株を使用する。マウスもしくはヒトＩＬ－１３の存在下で、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞株のＳＴＡＴ６経路を活性化させ、かつＳＥＡＰを産生させ、これは当該技術分野でよく知られている方法を用いて定量化することができる。
ＢＩＬ－１３試験は、
－１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）からなるアッセイ培地にＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞を播種する工程と、
－ヒト免疫原性産物（ＩＬ－１３／ＣＲＭ１９７）およびＩＬ－１３対照をそれぞれ最終８０００および１０ｎｇ／ｍＬでアッセイ培地で２倍連続希釈する工程と、
－マウス免疫原性産物（ｍｕＩＬ－１３／ＣＲＭ１９７）およびｍｕＩＬ－１３対照をそれぞれ最終２５０および１０ｎｇ／ｍＬでアッセイ培地で２倍連続希釈する工程と、
－次いでこの試料を１ウェル当たり４０，０００個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞を含む予め播種されたプレートに移し、プレートを５％ＣＯ２加湿インキュベータ中約３７℃で約２４時間インキュベートする工程と、
－培養の終了時に、当該技術分野でよく知られている方法を用いて活性化経路を評価する工程（そのような方法の一例は、９０μＬ／ウェルのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社から購入）を１０μＬ／ウェルの細胞上澄みに添加し、次いでプレートを５％ＣＯ２加湿インキュベータ中約３７℃で約１時間インキュベートし、次いでプレートを分光光度計を用いて６２５ｎｍで読み取ることである）と
を含む。
考察される試料のために記録した最大シグナルの５０％を生じさせる本免疫原性産物（またはＩＬ－１３）の量に対応する５０％有効量（ＥＤ５０）値は、全体の希釈点からの４パラメータロジスティック（４ＰＬ）非線形回帰を用いてＯＤｍａｘ／２値を対応する試料濃度に補間することにより決定する。
ＢＩＬ－１３試験では、本発明の被験免疫原性産物のＥＤ５０をＩＬ－１３対照標準曲線の対応するＥＤ５０で割ることにより不活性化係数を計算する。不活性化係数＞２０という結果は同じ量のタンパク質の場合、本免疫原性産物におけるＩＬ－１３活性が自然なＩＬ－１３活性の５％未満に対応していることを意味する。一実施形態では、約２、２．５、３．３３、５または１０、好ましくは約２０よりも高い不活性化係数は、本免疫原性産物が強く不活性化されていることを示す。一実施形態では、自然なＩＬ－１３活性よりも約５０％、４０％、３０％、２０％または１０％低い、好ましくは約５％低い残留活性は、本免疫原性産物が強く不活性化されていることを示す。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物は、ＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－１３を含み、かつ免疫原性であり、これは本免疫原性産物がＣＩＬ－１３試験条件下でインビボにおいて抗ＩＬ－１３抗体を誘導することができることを意味する。一実施形態では、本発明の免疫原性産物は、例えばＣＩＬ－１３試験条件下などでインビボにおいてポリクローナル抗ＩＬ－１３抗体を誘導することができる。
ＣＩＬ－１３試験は以下の方法に従って行い、すなわち本免疫原性産物の特定量の総タンパク質（例えばブラッドフォードタンパク質アッセイにより決定）をマウス（４週齢以上）に１２０日で少なくとも３回注射する。一実施形態では、ＣＩＬ－１３試験は例えば異種系であり、非マウスＩＬ－１３を含む免疫原性産物をマウスに注射し、この試験は、約０．３～１０μｇの範囲の総タンパク質用量を投与することを含む。別の実施形態では、ＣＩＬ－１３試験は例えば同種系であり、マウスＩＬ－１３を含む免疫原性産物をマウスに注射し、この試験は約５～約３０μｇの範囲の総タンパク質用量を投与することを含む。血清試料は免疫前（免疫前血清試料）および３９日目～１２０日目の間（試験血清試料）に得る。抗ＩＬ－１３ＥＬＩＳＡは以下に説明されているように行う。
簡単に言えば、本免疫原性産物を調製するために使用される１μｇ／ｍＬのＩＬ－１３で９６ウェルプレートをコーティングし、かつ約２℃～約８℃の範囲の温度で一晩インキュベートする。次いでこのプレートをブロッキング緩衝液を用いて約３７℃で約９０分間ブロッキングする。１００μＬの免疫前試料および血清試料（免疫前および試験）を例えば５００ｄｉｌ－１で開始して２５６，０００ｄｉｌ－１までなどの２倍連続希釈でそのウェルに添加する。標識した抗マウス免疫グロブリン二次抗体（ＨＲＰ結合抗体など）を最後にウェルに添加し、かつ例えばＯＰＤ基質溶液などの当該技術分野で知られている任意の比色手段を用いてＥＬＩＳＡを発色させる。
一実施形態では、試験血清試料を含むウェルの光学濃度が免疫前血清試料を含むウェルの光学濃度よりも少なくとも約１．５倍、好ましくは少なくとも約２倍高い場合、本免疫原性産物を免疫原性であるとみなし、これは本免疫原性産物がインビボにおいて抗ＩＬ－１３抗体を誘導したことを意味する。
この試験では力価は、当該アッセイにおいて「ＯＤｍａｘ－対応する免疫前試料のＯＤ」の５０％に達した場合の血清の希釈として定めた。この計算様式は周知の抗体陽転力価を見る場合よりも非常に厳しいが、よりロバストな分析およびより低い偽陽性を提供する。力価は血清希釈係数（ｄｉｌ－１）として表す。
別の実施形態ではＣＩＬ－１３試験において、力価の値≧２５０ｄｉｌ－１、好ましくは≧５００ｄｉｌ－１は、本発明の免疫原性産物がＩＬ－１３に対する結合抗体の産生を可能にすることを示す。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物はＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－１３を含み、かつ以下で引用されているＤＩＬ－１３試験条件下でＩＬ－１３活性を中和することができる。本発明によれば、ＤＩＬ－１３試験はレポーター細胞株ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３を用いて本免疫原性産物で免疫したマウスから得られた血清の中和能を評価するために行う。これらの細胞では、ＩＬ－４またはＩＬ－１３による刺激によりＪＡＫ／ＳＴＡＴ６経路を活性化させるとその後にＳＥＡＰが産生される。次いで、その上澄み中のＳＥＡＰレベルを評価することにより本免疫原性産物を用いた免疫によって誘導された抗ＩＬ－１３中和抗体を評価することができる。
ＤＩＬ－１３試験は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞を用いて以下の方法で行い、すなわち生理活性のＩＬ－１３の存在下でＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞株のＳＴＡＴ６経路を活性化させ、ＳＥＡＰを産生させ、これは当該技術分野でよく知られている方法を用いて定量化することができる。このアッセイは以下の方法、すなわち
－１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）からなるアッセイ培地においてＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞を培養し、
－ヒト免疫原性産物の投与後に得られた血清試料および対照抗体（例えばＡＦ－２１３－ＮＡなどのポリクローナルヤギ抗ＩＬ－１３抗体）をそれぞれ最終１／１００および４μｇ／ｍＬでアッセイ培地で希釈し、かつ２ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１３に添加し、
－マウス免疫原性産物の投与後に得られた血清試料および対照抗体（ＡＦ－４１３－ＮＡなどのポリクローナルヤギ抗ｍｕＩＬ－１３抗体）をそれぞれ最終１／１００および１μｇ／ｍＬでアッセイ培地で希釈し、かつ２ｎｇ／ｍＬのｍｕＩＬ－１３に添加し、
－次いでこれらの混合物を１ウェル当たり４０，０００個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞に添加する前に室温で１時間インキュベートし、プレートを５％ＣＯ２加湿インキュベータ中約３７℃で約２４間インキュベートし、
－培養の終了時に、当該技術分野でよく知られている方法を用いて活性化経路を評価する（そのような方法の一例は、９０μＬ／ウェルのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液を１０μＬ／ウェルの細胞上澄みに添加し、次いでプレートを５％ＣＯ２加湿インキュベータ中３７℃で１時間インキュベートし、次いでプレートを分光光度計を用いて６２５ｎｍで読み取ることである）
という方法に従って行う。
ＮＣ５０の結果は、ｍｕＩＬ－１３またはＩＬ－１３活性の５０％を中和する血清希釈係数（ｄｉｌ－１）として表す。ＮＣ５０はＩＬ－１３活性の５０％を生じさせる血清希釈を横座標軸に補間することにより決定する。
ＤＩＬ－１３試験では、ＮＣ５０値≧５０、好ましくはＮＣ５０値≧１００ｄｉｌ－１は、本発明の免疫原性産物がＩＬ－１３に対する中和抗体の産生を可能にすることを示す。一実施形態では、本発明の免疫原性産物の投与によって誘導されるＩＬ－１３に対する中和抗体はポリクローナルである。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物はＩＬ－４およびＩＬ－１３を含む。
一実施形態では、ＩＬ－４、ＩＬ－１３または両方が組換え型である。
一実施形態では、ＩＬ－４およびＩＬ－１３はどちらも同じ哺乳類由来である。一実施形態では、ＩＬ－４、ＩＬ－１３または両方がヒトである。
一実施形態では、ＩＬ－４はヒトＩＬ－４のバリアントであり、前記バリアントはヒトＩＬ－４と少なくとも約７０％、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれ以上の同一性を示す。一実施形態では、ＩＬ－１３はヒトＩＬ－１３のバリアントであり、前記バリアントはヒトＩＬ－１３と少なくとも約７０％、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれ以上の同一性を示す。
一実施形態では、ＩＬ－４、ＩＬ－１３または両方が完全長である。
一実施形態では、ＩＬ－４は完全長ＩＬ－４の断片である。一実施形態では、ＩＬ－１３は完全長ＩＬ－１３の断片である。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物は、どちらもＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－４およびＩＬ－１３を含む。
一実施形態では、サイトカイン（すなわち、ＩＬ－４およびＩＬ－１３）：ＣＲＭ１９７モル比は、約１６：１～約１：２、好ましくは約８：１～約２：１、より好ましくは約４：１の範囲である。
一実施形態では、ＩＬ－４：ＣＲＭ１９７モル比は、約８：１～約１：２、好ましくは約４：１～約１：１の範囲、より好ましくは約２：１である。
一実施形態では、ＩＬ－１３：ＣＲＭ１９７モル比は、約８：１～約１：２、好ましくは約４：１～約１：１の範囲、より好ましくは約２：１である。
一実施形態では、ＩＬ－４：ＩＬ－１３モル比は、約５：１～約１：５、好ましくは約２：１～約１：２の範囲、より好ましくは約１：１である。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物はＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－４およびＩＬ－１３を含み、かつは抗ＩＬ－４および抗ＩＬ－１３抗体によって認識される。
本免疫原性産物は、ＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－４およびＩＬ－１３を含み、かつ抗ＩＬ－４および抗ＩＬ－１３抗体によって認識されるという事実は当該技術分野で知られている従来の方法によって確認してもよい。そのような方法の例は、例えばビオチンで標識した検出抗体を用いる抗サイトカイン／担体タンパク質サンドイッチＥＬＩＳＡ、ストレプトアビジンＨＲＰ増幅システムおよび／またはＯＰＤ基質溶液である。
一実施形態では、抗ＩＬ－４および抗ＩＬ－１３抗体による本免疫原性産物の認識は、本明細書に記載されているＡ試験（ＡＩＬ－４試験およびＡＩＬ－１３試験）を用いて確認してもよい。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物はＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－４およびＩＬ－１３を含み、かつ強く不活性化されており、これは、本免疫原性産物は以下で引用されているＢ試験（ＢＩＬ－４試験およびＢＩＬ－１３試験）条件下で約１０％未満のＩＬ－４初期活性、好ましくは約５％未満および好ましくは約１％未満のＩＬ－４初期活性ならびに約１５％未満のＩＬ－１３初期活性、好ましくは約１０％未満および好ましくは約５％未満のＩＬ－１３初期活性を示すことを意味する。
一実施形態では、本免疫原性産物はＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－４およびＩＬ－１３を含み、かつ免疫原性であり、これは本免疫原性産物が（ｉ）ＣＩＬ－４試験条件下でインビボにおいて抗ＩＬ－４抗体を誘導することができ、かつ（ｉ）ＣＩＬ－１３試験条件下でインビボにおいて抗ＩＬ－１３抗体を誘導することができることを意味する。一実施形態では、本発明の免疫原性産物は、例えばＣＩＬ－４試験条件下などでインビボにおいてポリクローナル抗ＩＬ－４抗体を誘導することができ、かつ例えばＣＩＬ－１３試験条件下などでインビボにおいて抗ＩＬ－１３抗体を誘導することができる。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物はＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－４およびＩＬ－１３を含み、（ｉ）本明細書において引用されているＤＩＬ－４試験条件下でＩＬ－４活性を中和することができ、かつ（ｉｉ）以下で引用されているＤＩＬ－１３試験条件下でＩＬ－１３活性を中和することができる。一実施形態では、本発明の免疫原性産物の投与によって誘導されるＩＬ－４およびＩＬ－１３に対する中和抗体はポリクローナルである。
本発明はさらに、担体タンパク質、好ましくはＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－４、ＩＬ－１３およびそれらの混合物から選択される少なくとも１種のサイトカインを含む免疫原性産物を産生するための方法に関し、本方法は、
ａ）少なくとも１種のサイトカインをＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性クロスリンカー（好ましくはＮ－［γ－マレイミドブチリルオキシ］－スクシンイミドエステル（ｓＧＭＢＳ））と接触させる工程と、
ｂ）担体タンパク質をＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性クロスリンカー（好ましくはＮ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ））と接触させて担体－ＳＡＴＡ複合体を生成する工程と、
ｃ）工程（ａ）で得られたｓＧＭＢＳ－サイトカイン複合体を工程（ｂ）で得られた担体－ＳＡＴＡ複合体と接触させる工程と
を含む。
一実施形態では工程ａ）において、当該反応緩衝液は液体、好ましくは水溶液である。
一実施形態では工程ａ）において、当該反応緩衝液は約６～約８の範囲、好ましくは約６．５～約７．５の範囲、より好ましくは約ｐＨ７．２のｐＨである。
一実施形態では工程ａ）において、当該サイトカインは、約０．１～約１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．５～約５ｍｇ／ｍｌの範囲、より好ましくは約１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶液中に存在する。
一実施形態では工程ａ）において、ＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性クロスリンカー（好ましくはｓＧＭＢＳ）を反応緩衝液中で１ｍＭ～１００ｍＭ、好ましくは５ｍＭ～５０ｍＭの範囲、より好ましくは１０ｍＭの濃度で調製する。
一実施形態では工程ａ）において、ＩＬ－４およびＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性クロスリンカー、好ましくはｓＧＭＢＳを約１：１２０～約１：１、好ましくは約１：５０～約１：１０の範囲のＩＬ－４：ＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性クロスリンカー、好ましくはｓＧＭＢＳモル比で混合する。
一実施形態では工程ａ）において、ＩＬ－１３およびＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性クロスリンカー、好ましくはｓＧＭＢＳを約１：１２０～約１：１、好ましくは約１：５０～約１：１０の範囲のＩＬ－１３：ＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性クロスリンカー、好ましくはｓＧＭＢＳモル比で混合する。
一実施形態では工程ａ）において、少なくとも１種のサイトカインをＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性クロスリンカー、好ましくはｓＧＭＢＳと共に約３０分間～約１２０分間、好ましくは約４５～約９０分間の範囲の期間にわたって、より好ましくは少なくとも６０分間インキュベートする。
一実施形態では工程ａ）において、少なくとも１種のサイトカインをＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性クロスリンカー（好ましくはｓＧＭＢＳ）と接触させる工程を約１５℃～約３５℃、好ましくは約１８℃～約２７℃の範囲の温度で行う。
一実施形態では工程ａ）の後に、反応混合物中に存在する約１０ｋＤａ未満、約５ｋＤａ未満または約３ｋＤａ未満の分子量を有する低分子化合物を除去する。これらの低分子化合物は主に、ＮＨＳエステル（およびＮＨＳエステル加水分解関連副産物）を含む過剰なヘテロ二官能性クロスリンカー、好ましくはｓＧＭＢＳおよび反応していない過剰な分子を包含する。そのような除去する工程は当該技術分野でよく知られている方法によって行ってもよい。
一実施形態では工程ａ）の終了時に、ブラッドフォードアッセイまたは当該技術分野でよく知られている任意の方法によってタンパク質含有量を決定する。
一実施形態では工程ｂ）において、当該反応緩衝液は液体、好ましくは水溶液である。
一実施形態では工程ｂ）において、当該反応緩衝液は約６～約８の範囲、好ましくは約６．５～約７．５の範囲、より好ましくは約ｐＨ７．２のｐＨである。
一実施形態では工程ｂ）において、ＣＲＭ１９７は約０．２～約２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約１～約１０ｍｇ／ｍｌの範囲、より好ましくは約２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶液中に存在する。
一実施形態では工程ｂ）において、ＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性クロスリンカー、好ましくはＳＡＴＡは、２０ｍＭ～約５００ｍＭ、好ましくは約５０ｍＭ～約２００ｍＭの濃度範囲、より好ましくは約１００ｍＭの濃度で溶液、好ましくはＤＭＳＯ中に存在する。
一実施形態では工程ｂ）において、ＣＲＭ１９７およびＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性クロスリンカー、好ましくはＳＡＴＡを、約１：３２０～約１：１０の範囲の担体：ＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性クロスリンカー、好ましくはＳＡＴＡモル比で混合する。
一実施形態では工程ｂ）において、ＣＲＭ１９７をＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性クロスリンカー、好ましくはＳＡＴＡと共に約１０分間～約６０分間、好ましくは約１５分間～約４５分間の範囲の期間にわたって、より好ましくは３０分間インキュベートする。
一実施形態では、接触させる工程ｂ）は、約１５℃～約３５℃、好ましくは約１８℃～約２７℃の範囲の温度で行う。
一実施形態では工程ｂ）の後に、反応混合物中に存在する約１０ｋＤａ未満、約５ｋＤａ未満または約３ｋＤａ未満の分子量を有する低分子化合物を除去する。これらの低分子化合物は主に、ＮＨＳエステル（およびＮＨＳエステル加水分解関連副産物）を含む過剰なヘテロ二官能性クロスリンカー、好ましくはＳＡＴＡ、ＤＭＳＯ、反応していない過剰な分子を包含する。そのような除去する工程は当該技術分野でよく知られている方法によって行ってもよい。
一実施形態では工程ｂ）の後に、ＣＲＭ１９７とＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性クロスリンカー、好ましくはＳＡＴＡとの複合体を脱保護して保護基（ＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性クロスリンカー、好ましくはＳＡＴＡ）を官能基に変換する。一実施形態では、前記脱保護する工程は、反応混合物中に存在する約１０ｋＤａ未満、約５ｋＤａ未満または約３ｋＤａ未満の分子量を有する低分子化合物を除去する工程の後に行う。
分子を脱保護するための方法の例は当該技術分野でよく知られており、限定されるものではないが、ヒドロキシルアミンの使用、メトキシルアミンの使用または塩基（例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｋ２ＣＯ３、ＭｅＯＮａ、ＮＨ３のメタノール溶液など）の使用が挙げられる。
一実施形態では、脱保護する工程は、好ましくは約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ～約１００ｍＭの範囲、より好ましくは約５０ｍＭの最終濃度でのヒドロキシルアミン溶液の反応混合物への添加を含む。
一実施形態では、ヒドロキシルアミン溶液を反応混合物と共に約６０分間～約１８０分間、好ましくは約９０分間～約１５０分間の範囲の期間にわたって、より好ましくは１２０分間インキュベートする。
一実施形態では、ヒドロキシルアミン溶液を５０ｍＭで１２０分間添加する。
一実施形態では、ヒドロキシルアミン溶液の反応混合物とのインキュベーションは約１５℃～約３５℃、好ましくは約１８℃～約２７℃の範囲の温度で行う。
一実施形態では脱保護工程の後に、反応混合物中に存在する約１０ｋＤａ、５ｋＤａまたは３ｋＤａ未満の分子量を有する低分子化合物を除去する。これらの低分子化合物は主に、過剰なヒドロキシルアミンおよび前の工程からの潜在的な残留ＳＡＴＡを包含する。そのような除去する工程は当該技術分野でよく知られている方法によって行ってもよい。
一実施形態では工程ｂ）の終了時に、ブラッドフォードアッセイまたは当該技術分野でよく知られている任意の方法によってタンパク質含有量を決定する。
次いで本発明の方法の工程ｃ）において、工程ａ）の最終産物を工程ｂ）の最終産物と接触させ、それにより本発明の免疫原性産物を産生する。
一実施形態では工程ｃ）において、ＩＬ－４を含む工程ａ）の最終産物およびＣＲＭ１９７を含む工程ｂ）の最終産物を、約１６：１～約１：２、好ましくは約８：１～約２：１の範囲、より好ましくは約４：１のＩＬ－４：ＣＲＭ１９７モル比で接触させる。
一実施形態では工程ｃ）において、ＩＬ－１３を含む工程ａ）の最終産物およびＣＲＭ１９７を含む工程ｂ）の最終産物を、約１６：１～約１：２、好ましくは約８：１～約２：１の範囲、より好ましくは約４：１のＩＬ－１３：ＣＲＭ１９７比で接触させる。
工程ｃ）の別の実施形態では、ＩＬ－４を含む工程ａ）の最終産物、ＩＬ－１３を含む工程ａ）の最終産物および工程ｂ）の最終産物を接触させる。一実施形態では、前記接触させる工程は、約１６：１～約１：２、好ましくは約８：１～約２：１の範囲、より好ましくは約４：１のサイトカイン（すなわちＩＬ－４およびＩＬ－１３）：ＣＲＭ１９７モル比で行う。一実施形態では、前記接触させる工程は、約８：１～約１：２、好ましくは約４：１～約１：１の範囲、より好ましくは約２：１のＩＬ－４：ＣＲＭ１９７モル比で行う。一実施形態では、前記接触させる工程は約８：１～約１：２、好ましくは約４：１～約１：１の範囲、より好ましくは約２：１のＩＬ－１３：ＣＲＭ１９７モル比で行う。一実施形態では、前記接触させる工程は約５：１～約１：５、好ましくは約２：１～約１：２の範囲、より好ましくは約１：１のＩＬ－４：ＩＬ－１３モル比で行う。
一実施形態では工程ｃ）において、当該反応緩衝液は液体、好ましくは水溶液である。
一実施形態では工程ｃ）において、当該反応緩衝液は約６～約８の範囲、好ましくは約６．５～約７．５の範囲のｐＨ、より好ましくは約７．２のｐＨである。
工程ｃ）の一実施形態では、接触させる工程は約２時間～約２６時間、好ましくは約１０～１８時間、より好ましくは約１２～約１８時間の範囲の期間にわたって行う。
一実施形態では、インキュベーション工程ｃ）は約２℃～１０℃、好ましくは約３℃～約７℃の範囲、より好ましくは約４℃の温度で行う。
一実施形態では工程ｃ）の後に、反応混合物中に存在する約１００ｋＤａ未満、約５０ｋＤａ未満、約２５ｋＤａ未満、約１０ｋＤａ未満、約５ｋＤａ未満または約３ｋＤａ未満の分子量を有する低分子化合物を除去する。これらの低分子化合物は主に反応していない過剰な分子を包含する。そのような除去する工程は当該技術分野でよく知られている方法によって行ってもよい。
一実施形態では、工程ｃ）で得られた免疫原性産物を濃縮する。免疫原性産物の濃縮は例えば、無菌濾過と任意に組み合わせることができる遠心限外濾過法などの当該技術分野で知られている任意の技術によって当業者により行ってもよい。
一実施形態では、工程ｃ）で得られ、かつ任意に濃縮された免疫原性産物を凍結乾燥する。
本発明はさらに、本発明の方法によって得ることができる免疫原性産物に関する。
本発明はさらに、本明細書の上に記載されている少なくとも１種の免疫原性産物を含むか（本質的に）それからなる組成物に関する。一実施形態では、前記組成物を免疫原性組成物と呼んでもよい。
本発明はさらに、本明細書の上に記載されている少なくとも１種の免疫原性産物および少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含むか（本質的に）それらからなる医薬組成物に関する。
本発明の医薬組成物に使用することができる薬学的に許容される賦形剤としては、限定されるものではないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、例えばヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、例えばリン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム）、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。
本発明はさらに、本明細書の上に記載されている少なくとも１種の免疫原性産物を含むか（本質的に）それらからなる薬に関する。
組成物、医薬組成物または薬に関連して本明細書で使用される「本質的に～からなる」という用語は、本発明の少なくとも１種の免疫原性産物が前記組成物、医薬組成物または薬中でたった１種の治療薬すなわち生物学的活性を有する薬剤であることを意味する。
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物または薬は、ＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－４を含む免疫原性産物を含むか本質的にそれからなる。
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物または薬は、ＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－１３を含む免疫原性産物を含むか本質的にそれからなる。
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物または薬は、ＩＬ－４およびＩＬ－１３の両方に結合されたＣＲＭ１９７を含む免疫原性産物を含むか本質的にそれからなる。
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物または薬は、約１０：１～約１：１０の範囲の重量比、好ましくは約４：１～１：４の範囲の重量比でＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－４を含む免疫原性産物とＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－１３を含む免疫原性産物との混合物を含むか本質的にそれからなる。
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物または薬はワクチン組成物である。本発明の一実施形態では、本発明のワクチン組成物は少なくとも１種のアジュバントを含む。
本発明はさらに、本発明の組成物、医薬組成物、薬またはワクチンの製剤に関し、ここでは本組成物、医薬組成物、薬またはワクチンはアジュバント化されている。
従って一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物、薬またはワクチンは１種以上のアジュバントを含む。
本発明で使用することができる好適なアジュバントとしては、限定されるものではないが以下のものが挙げられる。
（１）例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩（ミョウバン）、
（２）例えばスクアレン系エマルション（例えばスクアレン系水中油型エマルション）またはスクアラン系エマルションなどの水中油型エマルション製剤（例えば、ムラミルペプチド（以下に定義されている）または細菌細胞壁成分などの他の特定の免疫賦活剤の有無を問わない）、例えば
（ａ）モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社、マサチューセッツ州ニュートン）などのマイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に製剤化された５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０および０．５％ｓｐａｎ８５（任意に様々な量のＭＴＰ－ＰＥ（以下を参照、但し必須ではない）を含有）を含有するＭＦ５９（ＰＣＴ出願の国際公開第９０／１４８３７号に記載されているスクアレン系水中油型アジュバント）、
（ｂ）サブミクロンエマルションまで微小流体化されているかより大きい粒径のエマルションを生成するためにボルテックスされた１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニック（登録商標）ブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ－ＭＤＰ（以下を参照）を含有するＳＡＦ、および
（ｃ）２％スクアレンと、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０と、米国特許出願公開第４，９１２，０９４号（Ｃｏｒｉｘａ）に記載されている３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（商標））、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群からの１種以上の細菌細胞壁成分とを含有するＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｃｏｒｉｘａ社、モンタナ州ハミルトン）、
（ｄ）クエン酸緩衝液に分散されている、限定されるものではないが以下の組成：スクアラン（３．９％、ｗ／ｖ）、ソルビタントリオレエート（０．４７％、ｗ／ｖ）およびポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレエート（０．４７％、ｗ／ｖ）を含むスクアラン系アジュバントなど、
（３）例えばＩＳＡ－５１などの油中水型エマルション製剤またはスクアレン系油中水型アジュバント（例えばＩＳＡ－７２０）（油中水型エマルションに使用するのに適した油アジュバントは鉱油および／または代謝可能な油を含んでいてもよい。鉱油はＢａｙｏｌ（登録商標）、Ｍａｒｃｏｌ．（登録商標）およびＤｒａｋｅｏｌ（登録商標）６ＶＲ（ＳＥＰＰＩＣ社、フランス）を含むＤｒａｋｅｏｌ（登録商標）から選択されてもよい。代謝可能な油は、ＳＰオイル（以下に記載されている）、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（ＭＰＶ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ラルストン、ＮＺ）、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ２６４，２６６，２６（ＳＥＰＰＩＣ社社、フランスのパリ）、ならびに植物油、魚油スクアランおよびスクアレンなどの動物油、およびトコフェロールおよびその誘導体から選択されてもよい）、
（４）Ｑｕｉｌ ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ－２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ社、マサチューセッツ州フレーミングハム）（米国特許出願公開第５，０５７，５４０号）などのサポニンアジュバントまたはＩＳＣＯＭ（免疫賦活複合体）などのそこから生成された粒子、
（５）Ｃｏｒｉｘａ社から入手可能であり、かつ米国特許出願公開第６，１１３，９１８号に記載されている細菌性リポ多糖、アミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）などの合成の脂質Ａ類似体、またはその誘導体もしくは類似体（そのようなＡＧＰの１つは水性形態または安定なエマルションとして製剤化されている５２９としても知られている（かつてはＲＣ５２９として知られていた）２－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２－デオキシ－４－Ｏ－ホスホノ－３－Ｏｉ［（Ｒ）－３テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］－２－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］－ｂ－Ｄグルコピラノシドである）、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドなどの合成のポリヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）、
（６）インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８など）などのサイトカイン、インターフェロン（例えばγインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、同時刺激分子Ｂ７－１およびＢ７－２など、
（７）公開されている国際特許出願の国際公開第００／１８４３４号（国際公開第０２／０９８３６８号および国際公開第０２／０９８３６９号も参照）に係る、アミノ酸２９位のグルタミン酸が別のアミノ酸、好ましくはヒスチジンで置換されている例えば野生型または変異型のいずれかのコレラ毒素（ＣＴ）などの細菌性ＡＤＰリボシル化毒素の解毒された変異体、百日咳毒素（ＰＴ）または大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）、特にＬＴ－Ｋ６３、ＬＴ－Ｒ７２、ＣＴ－Ｓ１０９、ＰＴ－Ｋ９／Ｇ１２９（例えば、国際公開第９３／１３３０２号および国際公開第９２／１９２６５号を参照）、および
（８）本組成物の有効性を高めるために免疫賦活剤として作用する他の物質（ムラミルペプチドとしては、限定されるものではないが、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチルノルムラミル（ｎｏｒｍｕｒａｍｙｌ）－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）などが挙げられる）。
使用されるアジュバントは部分的にレシピエント生物によって決まってもよい。さらに、投与するアジュバントの量は動物の種類および大きさによって決まる。
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物は、１種以上の界面活性剤および任意に本明細書の上に記載されている少なくとも１種のアジュバントをさらに含むエマルションである（を含む）。一実施形態では、エマルションは油中水型エマルションまたは水中油型エマルションである。
本発明で使用することができる界面活性剤の例は当該技術分野でよく知られており、限定されるものではないが、Ａｒｌａｃｅｌとして市販されているＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）８０（ＳＥＰＰＩＣ社社、フランス）などのモノオレイン酸マンニド、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ｓｐａｎ８５、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００が挙げられる。
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物、薬、ワクチン組成物は治療有効量の本発明の少なくとも１種の免疫原性産物を含む。
一実施形態では貯蔵目的のために、本発明の免疫原性産物または組成物、医薬組成物、薬、ワクチン組成物またはエマルションを凍結乾燥する。
従って一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物、薬、ワクチン組成物またはエマルションはフリーズドライ（凍結乾燥）した形態で提供してもよい。本実施形態によれば、本発明の免疫原性産物を１種以上の凍結乾燥補助物質と組み合わせる。様々な凍結乾燥補助物質は当業者によって周知であり、限定されるものではないが、ラクトースおよびマンニトールのような糖が挙げられる。
一実施形態では、例えば分解しやすいタンパク質が分解しないように保護するか、本免疫原性産物の貯蔵寿命を高めるか、凍結乾燥効率を高めるために、本発明の組成物、医薬組成物、薬、ワクチン組成物またはエマルションを安定化剤と混合してもよい。有用な安定化剤としては、限定されるものではないが、ＳＰＧＡ、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、澱粉、スクロース、デキストランまたはグルコース）、タンパク質（例えば、アルブミンまたはカゼインまたはそれらの分解産物など）、例えばリジンまたはグリシンなどのアミノ酸と例えばアルカリ金属リン酸塩などの緩衝液との混合物が挙げられる。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、ワクチン組成物またはエマルションは、注射、局所（例えば経皮送達など）、直腸内、鼻内または膣内投与してもよい。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、薬、ワクチン組成物またはエマルションは注射に適した形態である。従って一実施形態では、本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物は当該対象に筋肉内、腹膜内または皮下注射することができる。
注射可能な使用に適した形態の例としては、限定されるものではないが、無菌注射溶液または分散液の即時調製のための無菌溶液または分散液および無菌粉末が挙げられる。微生物による汚染に対する予防は、本組成物中に例えば各種抗菌剤および抗真菌剤（例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸およびチメロサールなど）などの防腐剤を添加することにより実現することができる。一実施形態では、注射時の痛みを軽減するために等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい場合がある。一実施形態では、注射可能な組成物の長期吸収は、本組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによりを実現することができる。
一実施形態では、本発明の凍結乾燥したワクチン組成物を注射用水に可溶化させ、かつ穏やかに混合し、次いで本明細書の上に記載されている免疫アジュバントを添加し、混合物を穏やかに混合し、かつ好適な注射器の中に充填する。従って本発明は、本発明のワクチン組成物が充填されたか予め充填された注射器などの医療装置にも関する。
一実施形態では、本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物は局所投与に適した形態である。局所投与に適した形態の例としては、限定されるものではないが、ポリマーパッチまたは制御放出パッチなどが挙げられる。
別の実施形態では、本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、薬、ワクチン組成物またはエマルションは腸内投与に適した形態である。直腸内投与に適した形態の例としては限定されるものではないが、坐薬、マイクロ浣腸、浣腸、ゲル、直腸フォーム（ｒｅｃｔａｌ ｆｏａｍ）、クリームおよび軟膏などが挙げられる。
本発明は、本発明の組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物が充填されたか予め充填された注射器である医療装置にも関する。
一実施形態では、前記注射器は、一方のチャンバーが本発明の免疫原性産物を含む溶液を含み、かつ他方のチャンバーがアジュバントを含むデュアルチャンバー注射器である。
本発明は、本発明の免疫原性産物あるいは本発明の組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物が予め充填されたバイアルを含む医療装置にも関する。
本発明はさらに、対象における炎症性疾患を治療するための本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物に関する。
従って本発明はさらに、対象に本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、薬、ワクチン組成物またはエマルションを投与することを含む、対象における炎症性疾患を治療するための方法に関する。
本発明はさらに、対象に本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物を投与することを含む、対象においてＩＬ－４、ＩＬ－１３または両方に対する免疫応答を誘導するための方法に関する。
本発明はさらに、対象に本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物を投与することを含む、対象においてＩＬ－４、ＩＬ－１３または両方の生物活性を阻害するかその生物活性を中和する抗体の産生を誘導するための方法に関する。一実施形態では、当該抗体はポリクローナル抗体である。
一実施形態では、当該対象は、炎症性疾患、特に異常なＩＬ－４および／またはＩＬ－１３発現または活性に関連する疾患に罹患しており、好ましくはそうであると診断されている。
一実施形態では、当該対象はヒトである。好ましくは本実施形態によれば、本発明の免疫原性産物に含まれている少なくとも１種のサイトカインはヒトである。
一実施形態では、当該対象は非ヒト哺乳類（例えばペットなど）である。好ましくは本実施形態によれば、本発明の免疫原性産物に含まれている少なくとも１種のサイトカインは前記非ヒト哺乳類由来である。
一実施形態では、炎症性疾患は異常なＩＬ－４および／またはＩＬ－１３発現または活性に関連する疾患である。
炎症性疾患の例としては、限定されるものではないが、喘息（アレルギー性もしくは非アレルギー性のいずれか）、アレルギー症状（例えば、食物アレルギー、毒アレルギー、ネコアレルギー、薬物アレルギー、高ＩｇＥ症候群、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎およびアレルギー性胃腸炎など）、アトピー性疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹（慢性特発性蕁麻疹および慢性蕁麻疹を含む）、湿疹など）、水疱性類天疱瘡、呼吸器疾患（アレルギー性および非アレルギー性喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）など）、鼻ポリープおよび気道炎症を伴う他の症状（例えば、好酸球増加症、嚢胞性線維症および肺線維症を含む線維症および過剰粘液産生、全身性強皮症（ＳＳｃ）など）、炎症性および／または自己免疫疾患または症状、胃腸障害または胃腸病（例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および好酸球性食道炎（ＥＥ）、および好酸球媒介性胃腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病および全身性エリテマトーデスなど）、全身性エリテマトーデス、肝障害または肝臓病（例えば、肝硬変および肝細胞癌など）、強皮症、線維性疾患または障害（例えば、肝臓の線維症（例えば、Ｂ型および／またはＣ型肝炎ウイルスによって引き起こされる線維症など）など）、強皮症、固形腫瘍または白血病などの癌（例えばＢ細胞慢性リンパ性白血病など）、神経膠芽腫、リンパ腫（例えばホジキンリンパ腫など）ならびに肥満細胞症が挙げられる。
一実施形態では、炎症性疾患は、喘息（例えばアレルギー性喘息）、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、食物アレルギー、鼻ポリープおよび好酸球性食道炎を含む群から選択される。
一実施形態では、炎症性疾患は、喘息（例えばアレルギー性喘息）、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症および食物アレルギーを含む群から選択される。
一実施形態では、炎症性疾患はアレルギー、喘息またはアトピー性皮膚炎である。
一実施形態では、炎症性疾患はアレルギー性喘息である。
一実施形態では、炎症性疾患は固形腫瘍である。一実施形態では、本発明の方法は固形腫瘍からの転移を予防するためのものである。
本発明はさらに、特異抗原に対してアレルギー性の対象の脱感作を誘導するための方法に関し、前記方法は当該対象に本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物および前記アレルゲンを投与することを含む。
アレルゲン免疫療法、脱感作または減感作またはアレルギーワクチン接種としても知られている本明細書で使用される「脱感作」という用語は、アレルギー性喘息などの環境アレルギーのための医学的治療を指す。そのような治療は、アレルゲンの存在下で免疫系の応答を減少させることを試みて人々にますます多くの量のアレルゲンに曝露させることを含む。
アレルゲンの例としては、限定されるものではないが、吸入アレルゲン、摂取アレルゲンおよび接触アレルゲンが挙げられる。
吸入アレルゲンの例としては、限定されるものではないが、コナダニ亜目（例えば、アシブトコナダニ（Ａｃａｒｕｓ ｓｉｒｏ）（貯蔵庫ダニ、Ａｃａ ｓ １３）、ネッタイタマニクダニ（Ｂｌｏｍｉａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）（ダニ、Ｂｌｏ ｔ）、コナヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）（アメリカイエダニ、Ｄｅｒ ｆ）、デルマトファゴイデス・ミクロセラス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｍｉｃｒｏｃｅｒａｓ）（イエダニ、Ｄｅｒ ｍ）、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）（ヨーロッパイエダニ、Ｄｅｒ ｐ）、シワチリダニ（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ ｍａｙｎｅｉ）（イエダニ、Ｅｕｒ ｍ）、イエニクダニ（Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）（貯蔵庫ダニ、Ｇｌｙ ｄ ２）、サヤアシニクダニ（Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）（貯蔵庫ダニ、Ｌｅｐ ｄ）、ケナガコナダニ（Ｔｙｒｏｐｈａｇｕｓ ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｔｉａｅ）（貯蔵庫ダニ、Ｔｙｒ ｐ））、ゴキブリ目（例えば、チャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）（ドイツゴキブリ、Ｂｌａ ｇ）、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）（アメリカゴキブリ、Ｐｅｒ ａ））、甲虫目（例えば、ナミテントウ（Ｈａｒｍｏｎｉａ ａｘｙｒｉｄｉｓ）（アジアテントウムシ、Ｈａｒ ａ））、ハエ目（例えば、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（黄熱病カ（Ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｍｏｓｑｕｉｔｏ）、Ａｅｄ ａ）、ウスイロユスリカ（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｋｉｉｅｎｓｉｓ）（ユリスカ、Ｃｈｉ ｋ）、キロノムス・トゥンミ・トゥンミ（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｈｕｍｍｉ ｔｈｕｍｍｉ）（ユリスカ、Ｃｈｉ ｔ）、フォルキポミュイア・タイワナ（Ｆｏｒｃｉｐｏｍｙｉａ ｔａｉｗａｎａ）（ヌカカ、Ｆｏｒ ｔ）、グロシナ・モルシタンス（Ｇｌｏｓｓｉｎａ ｍｏｒｓｉｔａｎｓ）（サヴァンナツェツェバエ、Ｇｌｏ ｍ）、カメムシ目：トリアトマ・プロトラクタ（Ｔｒｉａｔｏｍａ ｐｒｏｔｒａｃｔａ）（カリフォルニアサシガメ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ｋｉｓｓｉｎｇ ｂｕｇ）、Ｔｒｉａ ｐ））、ハチ目（例えば、トウヨウミツバチ（Ａｐｉｓ ｃｅｒａｎａ）（トウヨウミツバチ（Ｅａｓｔｅｒｎ ｈｉｖｅ ｂｅｅ）、Ａｐｉ ｃ）、オオミツバチ（Ａｐｉｓ ｄｏｒｓａｔａ）（オオミツバチ（Ｇｉａｎｔ ｈｏｎｅｙｂｅｅ）、Ａｐｉ ｄ）、セイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）（ミツバチ、Ａｐｉ ｍ）、ボンブス・ペンシルバニカス（Ｂｏｍｂｕｓ ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓ）（マルハナバチ、Ｂｏｍ ｐ）、ボンブス・テレストリス（Ｂｏｍｂｕｓ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）（マルハナバチ、Ｂｏｍ ｔ）、ドリコベスプラ・アレナリア（Ｄｏｌｉｃｈｏｖｅｓｐｕｌａ ａｒｅｎａｒｉａ）（黄色スズメバチ、Ｄｏｌ ａ）、ドリコベスプラ・マクラタ（Ｄｏｌｉｃｈｏｖｅｓｐｕｌａ ｍａｃｕｌａｔａ）（ホワイトフェイススズメバチ（Ｗｈｉｔｅ ｆａｃｅ ｈｏｒｎｅｔ）、Ｄｏｌ ｍ）、ミルメシア・ピロスラ（Ｍｙｒｍｅｃｉａ ｐｉｌｏｓｕｌａ）（オーストラリアトビキバハリアリ（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ｊｕｍｐｅｒ ａｎｔ）、Ｍｙｒ ｐ）、ポリステス・アヌラリス（Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ａｎｎｕｌａｒｉｓ）（スズメバチ、Ｐｏｌ ａ）、ポリステス・ドミヌルス（Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｄｏｍｉｎｕｌｕｓ）（地中海アシナガバチ、Ｐｏｌ ｄ）、ポリステス・エクスクラマンス（Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｅｘｃｌａｍａｎｓ）（スズメバチ、Ｐｏｌ ｅ）、ポリステス・フスカトゥス（Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｆｕｓｃａｔｕｓ）（スズメバチ、Ｐｏｌ ｆ）、ポリステス・ガリクス（Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｇａｌｌｉｃｕｓ）（スズメバチ、Ｐｏｌ ｇ）、ポリステス・メトリカス（Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｍｅｔｒｉｃｕｓ）（スズメバチ、Ｐｏｌ ｍ）、ポリビア・ポーリスタ（Ｐｏｌｙｂｉａ ｐａｕｌｉｓｔａ）（スズメバチ、Ｐｏｌ ｐ）、ポリビア・スクテラリス（Ｐｏｌｙｂｉａ ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｓ）（スズメバチ、Ｐｏｌ ｓ）、アカカミアリ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｇｅｍｉｎａｔａ）（熱帯ヒアリ（Ｔｒｏｐｉｃａｌ ｆｉｒｅ ａｎｔ）、Ｓｏｌ ｇ）、ヒアリ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ）（赤色外来ヒアリ（Ｒｅｄ ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｆｉｒｅ ａｎｔ）、Ｓｏｌ ｉ）、ソレノプシス・リクテリ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｒｉｃｈｔｅｒｉ）（黒ヒアリ（Ｂｌａｃｋ ｆｉｒｅ ａｎｔ）、Ｓｏｌ ｒ）、ソレノプシス・サエヴィシマ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｓａｅｖｉｓｓｉｍａ）（ブラジルヒアリ（Ｂｒａｚｉｌｉａｎ ｆｉｒｅ ａｎｔ）、Ｓｏｌ ｓ）、モンスズメバチ（Ｖｅｓｐａ ｃｒａｂｒｏ）（ヨーロッパスズメバチ、Ｖｅｓｐ ｃ）、オオスズメバチ（Ｖｅｓｐａ ｍａｎｄａｒｉｎｉａ）（巨大なアジアスズメバチ（Ｇｉａｎｔ ａｓｉａｎ ｈｏｒｎｅｔ）、Ｖｅｓｐ ｍ）、ベスプラ・フィアヴォピロサ（Ｖｅｓｐｕｌａ ｆｉａｖｏｐｉｌｏｓａ）（イエロージャケット、Ｖｅｓｐ ｆ）、ベスプラ・ゲルマニカ（Ｖｅｓｐｕｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）（イエロージャケット、Ｖｅｓｐ ｇ）、ベスプラ・マクリフロンス（Ｖｅｓｐｕｌａ ｍａｃｕｌｉｆｒｏｎｓ）（イエロージャケット、Ｖｅｓｐ ｍ）、ベスプラ・ペンシルヴァニカ（Ｖｅｓｐｕｌａ ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）（イエロージャケット、Ｖｅｓｐ ｐ）、ベスプラ・スクアモサ（Ｖｅｓｐｕｌａ ｓｑｕａｍｏｓａ）（イエロージャケット、Ｖｅｓｐ ｓ）、ベスプラ・ビジュア（Ｖｅｓｐｕｌａ ｖｉｄｕａ）（ジガバチ、Ｖｅｓｐ ｖｉ）、キオビクロスズメバチ（Ｖｅｓｐｕｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）（イエロージャケット、Ｖｅｓｐ ｖ））、マダニ科（例えば、鳩扁ダニ（Ａｒｇａｓ ｒｅｆｌｅｘｕｓ）（ハトダニ（Ｐｉｇｅｏｎ ｔｉｃｋ）、Ａｒｇ ｒ））、チョウ目（例えば、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｎｉｏｒｉ）（カイコガ（Ｓｉｌｋ ｍｏｔｈ）、Ｂｏｍｂ ｎ）、ノシメマダラメイガ（Ｐｌｏｄｉａ ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ）（インディアンミールモス（Ｉｎｄｉａｎｍｅａｌ ｍｏｔｈ）、Ｐｌｏ ｉ）、マツノギョウレツケムシガ（Ｔｈａｕｍｅｔｏｐｏｅａ ｐｉｔｙｏｃａｍｐａ）（パインプロセッショナリーモス（Ｐｉｎｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｏｎａｒｙ ｍｏｔｈ）、Ｔｈａ ｐ））、シミ目（例えば、セイヨウシミ（Ｌｅｐｉｓｍａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ）（シルバーフィッシュ（Ｓｉｌｖｅｒｆｉｓｈ）、Ｌｅｐ ｓ））、ノミ目（例えば、ネコノミ（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｆｅｌｉｓ ｆｅｌｉｓ）（ネコノミ（Ｃａｔ ｆｌｅａ）、Ｃｔｅ ｆ））、食肉目（例えば、イヌ（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）（イヌ（ｄｏｇ）、Ｃａｎ ｆ）、ネコ（Ｆｅｌｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）（ネコ（Ｃａｔ）、Ｆｅｌ ｄ））、ウサギ目（例えば、アナウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）（ウサギ、Ｏｒｙ ｃ）、ウマ目：ウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）（家畜ウマ、Ｅｑｕ ｃ））、カレイ目（例えば、メグリム（Ｌｅｐｉｄｏｒｈｏｍｂｕｓ ｗｈｉｆｆｉａｇｏｎｉｓ）（メグリム（Ｍｅｇｒｉｍ）、ホイフ（Ｗｈｉｆｆ）、ガロ（Ｇａｌｌｏ）、Ｌｅｐ ｗ））、齧歯目（例えば、モルモット（Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）（モルモット（ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ）、Ｃａｖ ｐ）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（マウス、Ｍｕｓ ｍ）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｕｓ）（ラット、Ｒａｔ ｎ））、マツ目：ヒノキ（Ｃｏｎｉｆｅｒａｌｅｓ）（日本イトスギ（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｃｙｐｒｅｓｓ）、Ｃｈａ ｏ）、アリゾナイトスギ（イトスギ、Ｃｕｐ ａ）、スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）（スギ（Ｓｕｇｉ）、Ｃｒｙ ｊ）、ホソイトスギ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）（一般的なイトスギ、Ｃｕｐ ｓ）、ジュニペルス・アシェイ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ）（マウンテンシダー、Ｊｕｎ ａ）、ジュニペルス・オキシセドルス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｏｘｙｃｅｄｒｕｓ）（ケードネズ、Ｊｕｎ ｏ）、ジュニペルス・サビノイデス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ）（マウンテンシダー、Ｊｕｎ ｓ）、エンピツビャクシン（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）（イースタンレッドシダー（Ｅａｓｔｅｒｎ ｒｅｄ ｃｅｄａｒ）、Ｊｕｎ ｖ））、リンドウ目（例えば、カタランタス・ロゼウス（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）（ニチニチソウ（Ｒｏｓｙ ｐｅｒｉｗｉｎｋｌｅ）、Ｃａｔ ｒ））、イネ目（例えば、ハルガヤ（Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ ｏｄｏｒａｔｕｍ）（スイートバーナルグラス（Ｓｗｅｅｔ ｖｅｒｎａｌ ｇｒａｓｓ）、Ａｎｔ ｏ １）、ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ）（バミューダグラス（Ｂｅｒｍｕｄａ ｇｒａｓｓ）、Ｃｙｎ ｄ １、Ｃｙｎ ｄ ７、Ｃｙｎ ｄ １２、Ｃｙｎ ｄ １５、Ｃｙｎ ｄ ２２ｗ、Ｃｙｎ ｄ ２３、Ｃｙｎ ｄ ２４）、カモガヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒａｔａ）（オーチャードグラス（Ｏｒｃｈａｒｄ ｇｒａｓｓ）、Ｄａｅ ｇ １、Ｄａｅ ｇ ２、Ｄａｅ ｇ ３、Ｄａｅ ｇ ４、Ｄａｅ ｇ ５）、ヒロハノウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）（メド－フェスク（Ｍｅａｄｏｗ ｆｅｓｃｕｅ）、Ｆｅｓ ｐ ４））、シラゲガヤ（Ｈｏｌｃｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）（ベルベットグラス（Ｖｅｌｖｅｔ ｇｒａｓｓ）、Ｈｏｌ ｌ １、Ｈｏｌ ｌ ５）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）（バーレイ（Ｂａｒｌｅｙ）、Ｈｏｒ ｖ １、Ｈｏｒ ｖ ５、Ｈｏｒ ｖ １２、Ｈｏｒ ｖ １５、Ｈｏｒ ｖ １６、Ｈｏｒ ｖ １７、Ｈｏｒ ｖ ２１）、ホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ）（ライグラス（Ｒｙｅ ｇｒａｓｓ）、Ｌｏｌ ｐ １、Ｌｏｌ ｐ ２、Ｌｏｌ ｐ ３、Ｌｏｌ ｐ ４、Ｌｏｌ ｐ ５、Ｌｏｌ ｐ １１）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）（イネ（Ｒｉｃｅ）、Ｏｒｙ ｓ １、Ｏｒｙ ｓ １２）、アメリカスズメノヒエ（Ｐａｓｐａｌｕｍ ｎｏｔａｒｕｍ）（バヒアグラス（Ｂａｈｉａ ｇｒａｓｓ）、Ｐａｓ ｎ １）、オニクサヨシ（Ｐｈａｌａｒｉｓ ａｑｕａｔｉｃａ）（カナリーグラス（Ｃａｎａｒｙ ｇｒａｓｓ）、Ｐｈａ ａ １、Ｐｈａ ａ ５）、オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ）（ティモシー（Ｔｉｍｏｔｈｙ）、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ４、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ６、Ｐｈｌ ｐ ７、Ｐｈｌ ｐ １１、Ｐｈｌ ｐ １２、Ｐｈｌ ｐ １３）、ナガハグサ（Ｐｏａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）（ケンタッキーブルーグラス（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ ｂｌｕｅ ｇｒａｓｓ）、Ｐｏａ ｐ １、Ｐｏａ ｐ ５）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）（ライムギ（Ｒｙｅ）、Ｓｅｃ ｃ １、Ｓｅｃ ｃ ２０）、セイバンモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｈａｌｅｐｅｎｓｅ）（ジョンソングラス（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｇｒａｓｓ）、Ｓｏｒ ｈ １）、パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）（コムギ、Ｔｒｉ ａ １２、Ｔｒｉ ａ １４、Ｔｒｉ ａ １８５、Ｔｒｉ ａ １９、Ｔｒｉ ａ ２５、Ｔｒｉ ａ ２６、Ｔｒｉ ａ ２７、Ｔｒｉ ａ ２８、Ｔｒｉ ａ ２９、Ｔｒｉ ａ ３０）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（メイズ（Ｍａｉｚｅ）、Ｚｅａ ｍ １、Ｚｅａ ｍ １２、Ｚｅａ ｍ １４、Ｚｅａ ｍ ２５）、ブナ目：ヨーロッパハンノキ（Ａｌｎｕｓ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）（ハンノキ（Ａｌｄｅｒ）、Ａｌｎ ｇ １、Ａｌｎ ｇ ４）、カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）（カバノキ（Ｂｉｒｃｈ）、Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ ２、Ｂｅｔ ｖ ３、Ｂｅｔ ｖ ４ 、Ｂｅｔ ｖ ５、Ｂｅｔ ｖ ６、Ｂｅｔ ｖ ７）、シデ（Ｃａｒｐｉｎｕｓ ｂｅｔｕｈｘｓ）（シ
デ（Ｈｏｒｎｂｅａｍ）、Ｃａｒ ｂ １））、シソ目（例えば、セイヨウトネリコ（Ｆｒａｘｉｎｕｓ ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ）（トリネコ、Ｆｒａ ｅ ｌ）、セイヨウイボタ（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）（イボタ、Ｌｉｇ ｖ）、ライラック（Ｓｙｒｉｎｇａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）（ライラック（Ｌｉｌａｃ）、Ｓｙｒ ｖ））、キントラノオ目（例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）（パラゴムノキ（ｐａｒａ ｒｕｂｂｅｒ ｔｒｅｅ）（ラテックス）、Ｈｅｖ ｂ １、Ｈｅｖ ｂ ２、Ｈｅｖ ｂ ３、Ｈｅｖ ｂ ４、Ｈｅｖ ｂ ５、Ｈｅｖ ｂ ６、Ｈｅｖ ｂ ７、Ｈｅｖ ｂ ８、Ｈｅｖ ｂ ９、Ｈｅｖ ｂ １０、Ｈｅｖ ｂ １１、Ｈｅｖ ｂ １２、Ｈｅｖ ｂ １３））、ヤマモガシ目（例えば、モミジバスズカケノキ（Ｐｌａｔａｎｕｓ ａｃｅｒｉｆｏｌｉａ）（ロンドンプレインツリー（Ｌｏｎｄｏｎ ｐｌａｎｅ ｔｒｅｅ）、Ｐｌａ ａ １、Ｐｌａ ａ ２、Ｐｌａ ａ ３）、スズカケノキ（Ｐｌａｔａｎｕｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）（オリエンタルプレーン（Ｏｒｉｅｎｔａｌ ｐｌａｎｅ）、Ｐｌａ ｏｒ １、Ｐｌａ ｏｒ ２、Ｐｌａ ｏｒ ３））からのアレルゲンが挙げられる。
一実施形態では、吸入アレルゲンは、アシブトコナダニ（貯蔵庫ダニ、Ａｃａ ｓ １３）、コナヒョウヒダニ（アメリカイエダニ、Ｄｅｒ ｆ）、デルマトファゴイデス・ミクロセラス（イエダニ、Ｄｅｒ ｍ）、ヤケヒョウヒダニ（ヨーロッパイエダニ、Ｄｅｒ ｐ）、シワチリダニ（イエダニ、Ｅｕｒ ｍ）、イエニクダニ（貯蔵庫ダニ、Ｇｌｙ ｄ ２）、ポリステス・アヌラリス（スズメバチ、Ｐｏｌ ａ）、ポリステス・ドミヌルス（地中海アシナガバチ、Ｐｏｌ ｄ）、ポリステス・エクスクラマンス（スズメバチ、Ｐｏｌ ｅ）、ポリステス・フスカトゥス（スズメバチ、Ｐｏｌ ｆ）、ポリステス・ガリクス（スズメバチ、Ｐｏｌ ｇ）、ポリステス・メトリカス（スズメバチ、Ｐｏｌ ｍ）、ポリビア・ポーリスタ（スズメバチ、Ｐｏｌ ｐ）、ポリビア・スクテラリス（スズメバチ、Ｐｏｌ ｓ）、ネコ（Ｆｅｌｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）（ネコ（Ｃａｔ）、Ｆｅｌ ｄ）、イネ目およびカバノキ（Ｂｅｔｕｌａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）（カバノキ（Ｂｉｒｃｈ）、Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ ２、Ｂｅｔ ｖ ３、Ｂｅｔ ｖ ４ 、Ｂｅｔ ｖ ５、Ｂｅｔ ｖ ６、Ｂｅｔ ｖ ７）を含むかそれらからなる群から選択される。
摂取アレルゲンの例としては、限定されるものではないが、真菌子嚢菌門、例えばクロイボタケ目（例えば、アルテルナリア・アルテルナータ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ）（アルテルナリア腐朽菌、Ａｌｔ ａ）、クラドスポリウム・クラドスポリオイデス（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）（Ｃｌａ ｃ）、クラドスポリウム・ヘルバルム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｈｅｒｂａｒｕｍ）（Ｃｌａ ｈ）、クルブラリア・ルナータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｌｕｎａｔａ）（Ｃｕｒ ｌ）、ユーロチウム目：アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）（Ａｓｐ ｆｌ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）（Ａｓｐ ｆ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（Ａｓｐ ｎ）、ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）（Ａｓｐ ｏ）、ペニシリウム・ブレビコンパクツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）（Ｐｅｎ ｂ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）（Ｐｅｎ ｃｈ）、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）（Ｐｅｎ ｃ）、ペニシリウム・オキサリカム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｘａｌｉｃｕｍ）（Ｐｅｎ ｏ））、ボタンタケ目（例えばフザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）（Ｆｕｓ ｃ））、ホネタケ目（例えば紅色白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ）（Ｔｒｉ ｒ）、トリコフィトン・トンズランス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ）（Ｔｒｉ ｔ）、サッカロミケス目：カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）（酵母、Ｃａｎｄ ａ）、カンジダ・ボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）（酵母、Ｃａｎｄ ｂ））、ツベルクラリア目（Ｔｕｂｅｒｃｕｌａｒｉａｌｅｓ）（例えばエピコッカム・パープラセンス（Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ）（Ｅｐｉ ｐ））などからのアレルゲン、真菌担子菌門、例えば帽菌類（例えば、ササクレヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）（ササクレヒトヨタケ（Ｓｈａｇｇｙ ｍａｎｅ）、Ｃｏｐ ｃ）、ミナミシビレタケ（Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ ｃｕｂｅｎｓｉｓ）（マジックマッシュルーム、Ｐｓｉ ｃ）、サビキン綱（Ｕｒｅｄｉｎｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）（例えば、ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）（酵母、Ｒｈｏ ｍ））、クロボキン綱（例えば、マラセチア・フルフル（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｆｕｒｆｕｒ）（癜風感染物質（Ｐｉｔｙｒｉａｓｉｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ｉｎｆｅｃｔ．Ａｇｅｎｔ）、Ｍａｌａ ｆ）、マラセチア・シンポジアリス（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｙｍｐｏｄｉａｌｉｓ）（Ｍａｌａ ｓ））などからのアレルゲン、抗生物質（例えばペニシリン、セファロスポリン、アミノシド（Ａｍｉｎｏｓｉｄｅｓ）、キノロン、マクロライド、テトラサイクリン、スルファミド）、薬物（例えばアセチルサリチル酸、ワクチン、モルヒネおよび誘導体など）、例えばビタミンＫ１などのビタミン、ならびに食物アレルゲン（例えば牛乳、卵、ピーナッツ、木の実（クルミ、カシューなど）、魚、甲殻類、ダイズ、コムギおよびニンジン、リンゴ、ナシ、アボカド、アンズ、モモからのアレルゲンなど）が挙げられる。
一実施形態では、摂取アレルゲンは食物アレルゲンである。
一実施形態では、食物アレルゲンは、牛乳、卵、ピーナッツ、木の実（クルミ、カシューなど）、魚、甲殻類、ダイズ、コムギおよびニンジン、リンゴ、ナシ、アボカド、アンズ、モモからのアレルゲンを含むかそれらからなる群から選択される。
接触アレルゲンの例としては、限定されるものではないが、重金属（例えばニッケル、クロム、金など）、ラテックス、例えばハロタンなどのハプテン、ヒドララジンが挙げられる。
一実施形態では、アレルゲンは、アシブトコナダニ（貯蔵庫ダニ、Ａｃａ ｓ １３）、コナヒョウヒダニ（アメリカイエダニ、Ｄｅｒ ｆ）、デルマトファゴイデス・ミクロセラス（イエダニ、Ｄｅｒ ｍ）、ヤケヒョウヒダニ（ヨーロッパイエダニ、Ｄｅｒ ｐ）、シワチリダニ（イエダニ、Ｅｕｒ ｍ）、イエニクダニ（貯蔵庫ダニ、Ｇｌｙ ｄ ２）、ポリステス・アヌラリス（スズメバチ、Ｐｏｌ ａ）、ポリステス・ドミヌルス（地中海アシナガバチ、Ｐｏｌ ｄ）、ポリステス・エクスクラマンス（スズメバチ、Ｐｏｌ ｅ）、ポリステス・フスカトゥス（スズメバチ、Ｐｏｌ ｆ）、ポリステス・ガリクス（スズメバチ、Ｐｏｌ ｇ）、ポリステス・メトリカス（スズメバチ、Ｐｏｌ ｍ）、ポリビア・ポーリスタ（スズメバチ、Ｐｏｌ ｐ）、ポリビア・スクテラリス（スズメバチ、Ｐｏｌ ｓ）、ネコ（Ｆｅｌｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）（ネコ（Ｃａｔ）、Ｆｅｌ ｄ）、イネ目およびカバノキ（Ｂｅｔｕｌａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）（カバノキ（Ｂｉｒｃｈ）、Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ ２、Ｂｅｔ ｖ ３、Ｂｅｔ ｖ ４、Ｂｅｔ ｖ ５、Ｂｅｔ ｖ ６、Ｂｅｔ ｖ ７）ならびに食物アレルゲンを含むかそれらからなる群から選択される。
本発明はさらに、特異アレルゲンに対してアレルギー性の対象の脱感作の有効性を高め、かつ／またはその持続期間を減少させるための方法にも関し、ここでは前記対象を脱感作により治療し、かつさらに前記対象に本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物を投与する。
一実施形態では本発明の方法において、当該対象に最初に本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物を投与し、かつ次にアレルゲンを投与する。
一実施形態では本発明の方法において、当該対象に最初にアレルゲンを投与し、かつ次に本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物を投与する。
別の実施形態では本発明の方法において、当該対象に本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物とアレルゲンとの併用投与を行う。
本発明はさらに、本明細書の上に記載されている組成物、医薬組成物、薬またはワクチンに関し、ここでは前記組成物、医薬組成物、薬またはワクチンは少なくとも１種のアレルゲンをさらに含む。
一実施形態では、治療有効量の本発明の少なくとも１種の免疫原性産物を当該対象に投与するか投与する予定である。一実施形態では、治療有効量は、当該技術分野でよく知られているブラッドフォードタンパク質アッセイを用いて決定される総タンパク質の量に対応している。
一実施形態では、当該対象に投与される本免疫原性産物の量は有意な有害作用を生じることなく免疫防御応答を誘導する。
一実施形態では、当該対象に投与される本免疫原性産物の量は有意な有害作用を生じることなくアレルゲン脱感作を誘導する。
本発明の免疫原性産物のための成分の最適な量は、対象における適切な免疫応答の観察を含む標準的な研究によって確認することができる。初回のワクチン接種後に、対象は１回または適切に間隔をあけた数回の追加免疫を受けることができる。
一実施形態では、当該治療は単回投与またはある期間にわたる複数回投与からなる。
本発明の一実施形態では、治療される対象に治療有効量の本明細書の上に記載されている免疫原性産物を１ヶ月に少なくとも２回投与する。
本発明の別の実施形態では、治療される対象に治療有効量の本発明の免疫原性産物を１ヶ月に２回投与する。本実施形態では、当該対象に０日目に１回目を投与し、かつ７日目～２８日目の間に２回目を投与してもよい。一実施形態では、当該対象に０日目に１回目を投与し、かつ２８日目に２回目を投与する。
本発明の別の実施形態では、治療される対象に治療有効量の本発明の免疫原性産物を１ヶ月に３回投与する。本実施形態では、治療される対象に０日目に１回目を投与し、かつ７日目～１４日目の間に２回目を投与し、かつ２１日目～２８日目の間に３回目を投与してもよい。一実施形態では、当該対象に０日目に１回目を投与し、かつ７日目に２回目を投与し、かつ２８日目に３回目を投与する。
本発明の別の実施形態では、治療される対象に治療有効量の本発明の免疫原性産物を３ヶ月ごとに１回さらに投与してもよい。
本発明の一実施形態では、治療される対象に本明細書の上に記載されているように１ヶ月に３回投与し、次いで治療有効量の本発明の免疫原性産物を３ヶ月ごとに１回さらに投与する。
本発明の別の実施形態では、ＩＬ－４に対する抗体の量が治療される対象から得られた血清試料において検出不可能な場合に、当該対象に治療有効量の本明細書の上に記載されている免疫原性産物をさらに投与してもよい。
本発明の別の実施形態では、ＩＬ－１３に対する抗体の量が治療される対象から得られた血清試料において検出不可能な場合に、当該対象に治療有効量の本明細書の上に記載されている免疫原性産物をさらに投与してもよい。
本発明の別の実施形態では、ＩＬ－４およびＩＬ－１３に対する抗体の量が治療される対象から得られた血清試料において検出不可能な場合に、当該対象に治療有効量の本明細書の上に記載されている免疫原性産物をさらに投与してもよい。
図１は、本発明の免疫原性産物の製造のための、チオール－マレイミドの添加によりｓＧＭＢＳで修飾されたＩＬ－４またはＩＬ－１３とＳＡＴＡで標識した担体タンパク質との化学的コンジュゲートのスキームである。 図２は、ｍｕＩＬ－４およびｍｕＩＬ－１３免疫原性産物の抗原性を示すグラフの組み合わせである。捕捉は抗ＣＲＭ１９７抗体（Ａ、Ｃ）または抗ＫＬＨ抗体（Ｂ、Ｄ）を用いて行い、検出はビオチン化ポリクローナル抗ｍｕＩＬ－４抗体（Ａ、Ｂ）またはビオチン化ポリクローナル抗ｍｕＩＬ－１３抗体（Ｃ、Ｄ）を用いて行った。表されているＯＤ値は繰り返しのＯＤ平均である。 図３は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける免疫の研究スキームである。０、７、２８および４９日目における、全てがスクアレンアジュバントで乳化されており、かつ５匹のみのマウスからなる対照群を除いて１群当たり１０匹のマウスに筋肉内注射される免疫原性産物（担体タンパク質としてＣＲＭ１９７またはＫＬＨを用いる）、未結合のｍｕＩＬ－４またはｍｕＩＬ－１３＋ＣＲＭ１９７、およびＣＲＭ１９７単独およびＰＢＳの４回の免疫。投与前ならびに３９日目および１２０日目に血液サンプリングを行った。 図４は、マウス血清における（Ａ）抗ｍｕＩＬ－４、（Ｂ）抗ｍｕＩＬ－１３、（Ｃ）抗ＣＲＭ１９７および（Ｄ）抗ＫＬＨの抗体力価を示すグラフの組み合わせである。１群当たり１０匹のマウスを免疫原性産物群に使用し、５匹のマウスを対照群に使用した。バーは中央値を表す。 同上。 図５は、マウス血清におけるｍｕＩＬ－４中和能を示すグラフである。１群当たり１０匹のマウスを免疫原性産物群に使用し、５匹のマウスを対照群に使用した。バーは中央値を表す。 図６は、マウス血清におけるｍｕＩＬ－１３中和能を示すグラフである。１群当たり１０匹のマウスを免疫原性産物群に使用し、５匹のマウスを対照群に使用した。バーは中央値を表す。 図７は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける免疫および喘息感作の研究スキームである。 図８は、マウス血清における（Ａ）抗ｍｕＩＬ－４および（Ｂ）抗ｍｕＩＬ－１３の抗体力価を示すグラフの組み合わせである。１群当たり１２匹のマウス。バーは中央値を表す。 図９は、マウス血清における（Ａ）ｍｕＩＬ－４および（Ｂ）ｍｕＩＬ－１３中和能を示すグラフの組み合わせである。１群当たり１２匹のマウス。バーは中央値を表す。 図１０は、吸入されたメタコリンに対する気道過敏症を示すグラフである。気道収縮指標（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐａｕｓｅ）（Ｐｅｎｈ）値を非侵襲的全身体積変動記録法によって測定した。ＨＤＭ感作／アレルギー誘発したマウスのために１群当たり７～８匹のマウスを使用し、かつＰＢＳ対照のためにｎ＝１６を使用してデータを得た。＊または＊＊または＊＊＊：対応のないマンホイットニーＵ試験を用いてＣＲＭ１９７－ＨＤＭ群に対してＰ＜０．５または０．１または０．００１。 図１１は、（Ａ）ワクチン接種前および（Ｂ）ＨＤＭまたはＰＢＳによる最後のアレルギー誘発から２４時間後に採取した血清中の循環ＩｇＥレベルを示すグラフの組み合わせである。ＨＤＭ感作／アレルギー誘発したマウスのために１群当たり７～８匹のマウスを使用し、ＰＢＳ対照のためにｎ＝１６を使用してデータを得た。＊＊＊：対応のないマンホイットニーＵ試験を用いてＣＲＭ１９７－ＨＤＭ群に対してＰ＜０．００１。 図１２は、ＨＤＭによる最後のアレルギー誘発から２４時間後に採取したＢＡＬ中の（Ａ）ＣＤ４５＋細胞および（Ｂ）好酸球のレベルを示すグラフの組み合わせである。ＨＤＭ感作／アレルギー誘発したマウスのために１群当たり７～８匹のマウスを使用し、ＰＢＳ対照のためにｎ＝１６を使用してデータを得た。＊または＊＊または＊＊＊：対応のないマンホイットニーＵ試験を用いてＣＲＭ１９７－ＨＤＭ群に対してＰ＜０．５または０．１または０．００１。 図１３は、（Ａ）ＩＬ－４免疫原性産物、（Ｂ）ＩＬ－１３免疫原性産物ならびに（ＡおよびＢ）Ｃｏｍｂｏ免疫原性産物の抗原性を示すグラフの組み合わせである。捕捉は抗ＣＲＭ１９７抗体を用いて行い、検出は（Ａ）ビオチン化ポリクローナル抗ｈｕＩＬ－４抗体または（Ｂ）ビオチン化ポリクローナル抗ｈｕＩＬ－１３抗体を用いて行った。表されているＯＤ値は繰り返しのＯＤ平均である。 図１４は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける免疫の研究スキームである。 図１５は、マウス血清における抗（Ａ）ＩＬ－４および（Ｂ）抗ＩＬ－１３の抗体力価を示すグラフの組み合わせである。１群当たり１０匹のマウス。バーは中央値を表す。 図１６は、マウス血清における（Ａ）抗ＩＬ－４および（Ｂ）抗ＩＬ－１３中和能を示すグラフの組み合わせである。１群当たり１０匹のマウス。バーは中央値を表す。
本発明を以下の実施例によりさらに例示する。
本発明は、担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を用いる免疫原性産物に関する。本発明の免疫原性産物の特性は以下の実施例によって例示されている。さらに本発明の産物をＫＬＨと共に調製した免疫原性産物と比較して本発明を以前の技術と区別し、かつ以前の技術に対するその優位性を示した。
ＣＲＭ１９７は、その毒素ドメインにおいて５２位にグリシンからグルタミン酸に一塩基置換されていることにより毒性活性を有しないジフテリア毒素の非毒性形態である（Ｕｃｈｉｄａら １９７３ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ）。代わりとして、節足動物および軟体動物に存在する銅含有タンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎら ２０１４）も試験してＣＲＭ１９７と比較した。
本発明の免疫原性産物は、以下の開発された製造プロセスを用いて産生した。
ＩＬ－４およびＩＬ－１３免疫原性産物の調製のためにチオール－マレイミド結合を用いる。ＳＡＴＡを用いてスルフヒドリル部分を担体タンパク質ＣＲＭ１９７上に導入し、その後にヒドロキシルアミンの脱保護を行うと共に、サイトカインｍｕＩＬ－４またはｍｕＩＬ－１３をマレイミド含有薬剤であるｓＧＭＢＳによって誘導体化した。ＳＡＴＡおよびｓＧＭＢＳはどちらも第一級アミン（リジン残基のε－アミノ基およびタンパク質Ｎ末端など）と反応するＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性クロスリンカーである。チオール－マレイミド結合による本免疫原性産物合成の概略は図１に提供されている。
実施例１：２種類の担体タンパク質を用いた本発明のマウスＩＬ－４およびＩＬ－１３免疫原性産物の調製
ａ）担体タンパク質の機能化
ＣＲＭ１９７またはＫＬＨを７０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）を含む修飾緩衝液に希釈した。ＳＡＴＡをＤＭＳＯで希釈して１００ｍＭ濃度にした。次いでＳＡＴＡをＣＲＭ１９７またはＫＬＨに添加し、かつ回転装置上室温で３０分間インキュベートした後、製造業者の説明書に従ってＺｅｂａ（商標）脱塩スピンカラムを用いて過剰なＳＡＴＡを除去した。
その後にヒドロキシルアミンを５００ｍＭで同じ緩衝液で希釈した。次いで、ＣＲＭ１９７－ＳＡＴＡまたはＫＬＨ－ＳＡＴＡを５０ｍＭの最終濃度のヒドロキシルアミン溶液と共に回転装置上室温で２時間インキュベートした。最後に混合物を脱塩し、かつＺｅｂａ（商標）脱塩スピンカラムを用いて過剰な試薬を除去した。
ｂ）ｍｕＩＬ－４およびｍｕＩＬ－１３の機能化
ｍｕＩＬ－４またはｍｕＩＬ－１３を修飾緩衝液（７０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）に溶解した。ｓＧＭＢＳを１０ｍＭで修飾緩衝液で希釈した。次いでｓＧＭＢＳをｍｕＩＬ－４またはｍｕＩＬ－１３に添加し、かつ回転装置上室温で１時間インキュベートした後、Ｚｅｂａ（商標）脱塩スピンカラムを用いて過剰なｓＧＭＢＳを除去した。
ｃ）コンジュゲート
ＣＲＭ１９７、ＫＬＨ、ｍｕＩＬ－４およびｍｕＩＬ－１３の機能化後に、各調製物のタンパク質含有量をブラッドフォードアッセイにより決定した。
機能化ＣＲＭ１９７または機能化ＫＬＨをそれぞれ１：２（担体：ｍｕＩＬ－４または担体：ｍｕＩＬ－１３）および１：２０のモル比で機能化ｍｕＩＬ－４または機能化ｍｕＩＬ－１３に添加した。ＫＬＨとＣＲＭ１９７（約４００ｋＤａのこの製造に使用されるＫＬＨサブユニットに対して約５８ｋＤａのＣＲＭ１９７）との分子量差に基づき、かつ狼瘡患者における第２相ｂ臨床試験（ＮＣＴ０２６６５３６４）において現在評価されているワクチンであるＩＦＮ免疫原性産物を調製する際の過去の経験に基づいて、ＫＬＨのために全ての製造において同様の量のサイトカインおよび担体を混合するのを可能にする１：２０の比を選択した。
個々の免疫原性産物調製物を回転装置上４℃で一晩インキュベートした。次いで得られた免疫原性産物をアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）（３ｋＤａカットオフ膜）を用いて濃縮し、０．２２μｍで濾過し、かつ４℃で維持した。
ｄ）対照（コンジュゲートされていないサイトカインとＣＲＭ１９７）
対照として、タンパク質の機能化を行っていない２種類の混合物（未結合のサイトカインおよびＣＲＭ１９７と呼ぶ）を調製した。
－ｍｕＩＬ－４およびＣＲＭ１９７を１：２のモル比（ＣＲＭ１９７：サイトカイン）で混合した。この混合物をどんな結合試薬も使用せずに７００μｇ／ｍＬで調製した。
－ｍｕＩＬ－１３およびＣＲＭ１９７を１：２のモル比（ＣＲＭ１９７：サイトカイン）で混合した。この混合物をどんな結合試薬も使用せずに７００μｇ／ｍＬで調製した。
両方の混合物を０．２２μｍで濾過し、４℃で貯蔵した。
ｅ）免疫原性産物の定量化
製造業者の説明書に従い、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ（ブラッドフォード）タンパク質アッセイによって、ｍｕＩＬ－４免疫原性産物およびｍｕＩＬ－１３免疫原性産物の濃度を決定した。
実施例２：マウス産物の抗原性
サンドイッチＥＬＩＳＡを行ってサイトカインの担体タンパク質への結合を評価し、かつ製造プロセス中にエピトープが保存されているか否かも評価した。
簡単に言えば、捕獲抗体（抗担体タンパク質抗体）を９６ウェルプレートにコーティングした。２％（ｗ／ｖ）カゼインのＰＢＳ溶液によるブロッキング工程後に、免疫原性産物試料を添加し、２倍連続希釈した。３７℃で９０分間インキュベートした後、結合した免疫原性産物をビオチン化抗ｍｕＩＬ－４抗体（ポリクローナルヤギＩｇＧ抗ｍｕＩＬ－４）またはビオチン化抗ｍｕＩＬ－１３抗体（ポリクローナルヤギＩｇＧ抗ｍｕＩＬ－１３）を用いて検出し、次いでストレプトアビジン－ＨＲＰおよびＯＰＤ基質で発色させた。酵素反応を硫酸で停止し、かつ光学濃度（ＯＤ）を４９０ｎｍで読み取った。結果は図２に示されている。
この試験により、本発明の免疫原性産物は、ＣＲＭ１９７またはＫＬＨに結合されたｍｕＩＬ－４またはｍｕＩＬ－１３を含むことを確認した。さらにこれらの結果から、本免疫原性産物が抗原性である（すなわち抗ｍｕＩＬ－４または抗ｍｕＩＬ－１３抗体によって認識される）ことが確認される。
実施例３：免疫原性産物の免疫原性
免疫原性産物をスクアレン系アジュバントを含むエマルションとしてマウスに投与した。免疫原性産物を所望の濃度までＰＢＳで希釈し、かつ希釈物を等体積のアジュバントと混合した。
マウスの免疫プロトコル
全てがスクアレン系アジュバントで乳化されている（１：１）免疫原性産物（ＣＲＭ１９７またはＫＬＨを含む）あるいはＰＢＳ、ＣＲＭ１９７との未結合サイトカインまたはＣＲＭ１９７単独などの対照の４回の筋肉内（ｉ．ｍ．）注射を各Ｂａｌｂ／ｃマウスに接種した。表１および図３に詳述されているように０、７、２８および４９日目に注射を行った。７週齢で１回目の免疫を行った。
Figure 2023110045000001
投与前ならびに３９、６０および１２０日目に血液採取を行った。室温で凝血させ、かつ遠心分離して血餅を除去した後に、血清試料を調製した。１２０日目に致死的な麻酔によりマウスを屠殺した。
ＥＬＩＳＡによる抗サイトカインおよび抗担体タンパク質抗体力価の決定
免疫したマウスの血清試料をＥＬＩＳＡにより抗サイトカイン抗体および抗担体タンパク質抗体の存在について評価した。
簡単に言えば、ｍｕＩＬ－４、ｍｕＩＬ－１３、ＣＲＭ１９７またはＫＬＨを９６ウェルプレートにコーティングした。カゼインによるブロッキング後に、血清試料を添加し、かつ２倍連続希釈した。３７℃でインキュベートした後、結合した抗体をＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧで検出し、ＯＰＤ基質を用いてプレートを発色させた。反応を硫酸で停止させ、次いで４９０ｎｍでの吸光度を記録した。
抗ｍｕＩＬ－４抗体、抗ｍｕＩＬ－１３抗体、抗ＫＬＨ抗体および抗ＣＲＭ１９７抗体力価のために使用される陽性対照はそれぞれ、ラットモノクローナル抗ｍｕＩＬ－４ ＩｇＧ１抗体、マウスモノクローナル抗ｍｕＩＬ－１３抗体、ＫＬＨで免疫したマウスから採取した血清のプールおよび抗ジフテリア毒素ＡマウスモノクローナルＩｇＧ１であった。
５００ｄｉｌ－１でのみ分析した免疫前血清以外は、試料を５００ｄｉｌ－１で開始して最大２５６，０００ｄｉｌ－１の希釈において分析した。
抗ｍｕＩＬ－４、抗ｍｕＩＬ－１３、抗ＣＲＭ１９７および抗ＫＬＨの力価は、最大半量のＯＤを生じる血清希釈として表した。
結果は図４に示されている。免疫原性産物で治療した全ての群ならびにアジュバント化ＤＰＢＳまたは担体タンパク質または未結合の調製物を注射したマウスにおいて投与前に抗ｍｕＩＬ－４、抗ｍｕＩＬ－１３、抗ＫＬＨおよび抗ＣＲＭ１９７は検出されなかった。さらにアジュバント化ＤＰＢＳを投与したマウスにおいて抗サイトカインまたは抗担体抗体はどの時点においても検出されなかった。
３９、６０および１２０日目にＣＲＭ１９７対照で治療した全ての群ならびに未結合のｍｕＩＬ－４＋ＣＲＭ１９７または未結合のｍｕＩＬ－１３＋ＣＲＭ１９７で治療した群において抗ＣＲＭ１９７力価が検出された。３９、６０および１２０日目にＣＲＭ１９７で調製した本免疫原性産物で治療した全ての群において抗ｍｕＩＬ－４、抗ｍｕＩＬ－１３および抗ＣＲＭ１９７力価が検出された。３９、６０および１２０日目にＫＬＨと共に調製した免疫原性産物で治療した全ての群の全てのマウスではないが抗ｍｕＩＬ－４、抗ｍｕＩＬ－１３および抗ＫＬＨ力価が検出された。なお、抗ＩＬ－４抗体のレベルはＫＬＨと共に調製した免疫原性産物よりもＣＲＭ１９７で調製した免疫原性産物で免疫したマウスにおいてより高かった。
ｍｕＩＬ－４中和バイオアッセイ
ｍｕＩＬ－４免疫原性産物の投与によって誘導された抗体を、「Ｓｏｍａｎら，２００９」から改変されたＣＴＬＬ－２細胞を用いる増殖アッセイにおいてそれらの抗ｍｕＩＬ－４中和能についてさらに評価した。簡単に言えば、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩを用いて最終１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２の存在下でＣＴＬＬ－２細胞を増殖させた。中和バイオアッセイのためにＩＬ－２をｍｕＩＬ－４で置き換えた。従って、免疫原性産物の注射後に誘導された潜在的中和ｍｕＩＬ－４抗体はＣＴＬＬ－２増殖を防止する。
血清試料を最終１／２００で添加し、かつ陽性対照ポリクローナル抗ｍｕＩＬ－４抗体を最終１μｇ／ｍＬで添加し、培養プレートにおいて１ウェル当たり２５μＬのＲＰＭＩ＋１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで２倍連続希釈した。次いでｍｕＩＬ－４を最終２ｎｇ／ｍＬで血清試料に添加し、かつ室温で１時間インキュベートした。次いで２０，０００個のＣＴＬＬ－２細胞を予めインキュベートした試料（血清または陽性対照＋ｍｕＩＬ－４）に添加した。プレートを加湿インキュベータ中３７℃および５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。細胞生存率をＭＴＳ／ＰＭＳアッセイにより定量化した。１ウェル当たり４０マイクロリットルのＭＴＳ／ＰＭＳを添加し、かつＣＯ２加湿インキュベータ中３７℃および５％で４時間インキュベートした後ＯＤを４９０ｎｍで読み取った。
ＮＣ５０の結果は、血清の存在下においてｍｕＩＬ－４活性の５０％を中和する血清希釈係数（ｄｉｌ－１）として表した。ＮＣ５０はＩＬ－４活性の５０％を生じさせる血清希釈を横座標軸に補間することにより決定する。なおマウスは、ＮＣ５０≧２００ｄｉｌ－１であればこの実験における応答動物としてみなす。
投与前に抗ｍｕＩＬ－４中和抗体を示したマウスはいなかった（図５および表２）。対照群では中和能を有する抗ｍｕＩＬ－４抗体はどの時点においても検出されなかった。ＣＲＭ１９７で調製した免疫原性産物で免疫したマウスの場合、ｍｕＩＬ－４に対する中和能を有する抗体が１０匹中９匹のマウスにおいて検出可能であった。対照的に、ＫＬＨで調製した免疫原性産物で免疫したマウスでは、抗ＩＬ－４中和抗体のレベルはＣＲＭ１９７が担体である場合に観察されたものよりもどの時点においても低く、かつ中和抗体を示した血清は少なかった（最良の時点で６種類の血清のみが中和能を示した（１２０日目に））。これらの結果はＣＲＭ１９７で調製したｍｕＩＬ－４免疫原性産物での治療はＫＬＨで調製した結合ワクチンよりも免疫原性であることを実証した。
Figure 2023110045000002
ｍｕＩＬ－１３中和バイオアッセイ
ｍｕＩＬ－１３免疫原性産物の投与によって誘導された抗体をそれらの中和能について投与前ならびに３９、６０および１２０日目にｍｕＩＬ－１３中和バイオアッセイにより評価した。
抗ｍｕＩＬ－１３抗体の中和能をＳＴＡＴ６経路の活性化を監視することによってＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３レポーター遺伝子バイオアッセイ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社＃ｈｋｂ－ｉｌ４１３）を用いて評価した。この活性化に応答して、この細胞株は分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を産生し、これはＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）を用いて（λ＝６２５ｎｍにおいて）定量化することができる。従って、免疫原性産物の注射後に誘導される潜在的中和ｍｕＩＬ－１３抗体はＳＴＡＴ６経路の活性化を防止し、評価することができる。
簡単に言えば、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）からなるアッセイ培地に播種した。次いでｍｕＩＬ－１３（２ｎｇ／ｍＬの最終濃度）と最終１／１００で開始して２倍連続希釈した血清試料または最終１μｇ／ｍＬから２倍連続希釈した対照抗体（ポリクローナルヤギ抗ｍｕＩＬ－１３抗体）との混合物を４０，０００個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞に添加した。プレートを５％ＣＯ２加湿インキュベータ中３７℃で２４時間インキュベートした。次いで新しい平底プレートにおいて、１ウェル当たり１０μLの細胞上澄みを１ウェル当たり９０μLのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）に添加し、５％ＣＯ２加湿インキュベータ中３７℃で１時間後に吸光度を６２５ｎｍで読み取った。
ＮＣ５０の結果は、血清の存在下においてｍｕＩＬ－１３活性の５０％を中和する血清希釈係数（ｄｉｌ－１）として表した。ＮＣ５０はｍｕＩＬ－１３活性の５０％を生じさせる血清希釈を横座標軸に補間することにより決定する。なおマウスは、ＮＣ５０≧１００ｄｉｌ－１であればこの実験における応答動物としてみなす。
ｍｕＩＬ－１３中和抗体は全ての群ならびに対照群において投与前にはどの時点においても検出されなかった（図６および表３）。ＣＲＭ１９７で調製した免疫原性産物で治療したマウスはｍｕＩＬ－１３に対する検出可能な中和能を有する抗体を産生した（図６および表３）。ＫＬＨと共に調製した免疫原性産物で免疫したマウスでは、マウス血清はｍｕＩＬ－１３に対する中和抗体を示さなかった。なお、未結合のｍｕＩＬ－１３およびＣＲＭ１９７群においてＥＬＩＳＡにより評価した場合に１匹のマウスが抗ｍｕＩＬ－１３抗体を示したとしても（図４Ｂ）、これらの抗体は中和抗体ではなかった。これらの結果は、ＣＲＭ１９７で調製した免疫原性産物による治療はＫＬＨで調製したものよりも免疫原性であることを実証した。
Figure 2023110045000003
予想したとおり、中和抗ｍｕＩＬ－４および抗ｍｕＩＬ－１３抗体はＣＲＭ１９７およびＤＰＢＳ対照群においてはどの時点においても検出されなかった。当該サイトカインおよびＣＲＭ１９７を化学的機能化を行わずに（未結合状態で）混合した対照群では、免疫により抗ｍｕＩＬ－４および抗ｍｕＩＬ－１３中和抗体が惹起されず、これはサイトカインに対するＢ細胞の自己寛容を破綻させるためにはサイトカインと担体タンパク質との結合が必須であることを強調している。さらに、ＫＬＨで調製した免疫原性産物で免疫したマウスの場合、抗ＩＬ－１３中和抗体は観察されなかったがＣＲＭ１９７で調製した免疫原性産物で免疫したマウスの場合、ｍｕＩＬ－１３に対する中和能を有する抗体は１０匹中５匹マウスにおいて検出可能であった。これらの結果は、ＣＲＭ１９７で調製したｍｕＩＬ－１３免疫原性産物による治療がＫＬＨで調製した結合ワクチンよりも免疫原性であることを実証した。
実施例４：免疫原性産物の残留活性
ｍｕＩＬ－４免疫原性産物の残留活性
ｍｕＩＬ－４免疫原性産物の残留活性を以下に記載されているように（「Ｓｏｍａｎら，２００９」から改変された方法で）評価した。
簡単に言えば、ＣＴＬＬ－２細胞をＩＬ－２と共に増殖させる。培地は最終１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２および１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩｃ培地から構成されていた。
残留活性バイオアッセイのためにＩＬ－２をｍｕＩＬ－４で置き換えた。本発明の免疫原性産物（ＣＲＭ１９７またはＫＬＨを含む）およびｍｕＩＬ－４対照を、免疫原性産物のために１０００ｎｇ／ｍＬで開始して４ｎｇ／ｍＬまで、ｍｕＩＬ－４のために１０ｎｇ／ｍＬから開始して最終０．０４ｎｇ／ｍＬまで、９６ウェルプレートにおいてＲＰＭＩ＋１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで２倍連続希釈した。陽性対照として１０ｎｇ／ｍＬのｍｕＩＬ－４を含む６つのウェルを追加し、かつ最大細胞増殖対照として使用した。これらの試料を１ウェル当たり２０，０００個のＣＴＬＬ－２細胞に添加し、かつプレートを加湿インキュベータ中３７℃および５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。細胞増殖をＭＴＳ／ＰＭＳアッセイにより定量化した。１ウェル当たり４０マイクロリットルのＭＴＳ／ＰＭＳを添加し、かつ５％ＣＯ２加湿インキュベータ中３７℃およびで４時間インキュベートした後プレートを４９０ｎｍで読み取った。
５０％有効量（ＥＤ５０）値は、最大細胞シグナルの５０％を生じさせる免疫原性産物またはサイトカインの量に対応している。この値は、５０％変曲点を取り囲んでいる希釈点を通る曲線からの式ｙ＝ａｘ＋ｂを用いて最大細胞シグナルの５０％を横座標軸に補間することにより決定する。
被験免疫原性産物のＥＤ５０をｍｕＩＬ－４対照標準曲線の平均ＥＤ５０で割ることにより不活性化係数（inactivation factor）を計算した。
Figure 2023110045000004
表４に示されているように、ｍｕＩＬ－４残留活性はＣＲＭ１９７で調製した免疫原性産物においてＫＬＨで調製したものと比較してより減少していた（ＣＲＭ１９７で調製したｍｕＩＬ－４免疫原性産物において非常により高い不活性化係数）。
ｍｕＩＬ－１３免疫原性産物の残留活性
以下に記載されているように、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３レポーター細胞株を用いてｍｕＩＬ－１３免疫原性産物の残留活性を監視した。
簡単に言えば、丸底プレートにおいてｍｕＩＬ－１３免疫原性産物およびｍｕＩＬ－１３対照をそれぞれ２５０ｎｇ／ｍＬで開始して最終１０ｎｇ／ｍＬまでアッセイ培地（ＤＭＥＭ、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）で２倍連続希釈した。これらの混合物を１ウェル当たり４０，０００個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞に添加した。プレートを５％ＣＯ２加湿インキュベータ中３７℃で２４時間インキュベートした。次いで新しい平底プレートにおいて、１ウェル当たり１０μLの培養物上澄みを１ウェル当たり９０μLのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）に添加し、かつ５％ＣＯ２加湿インキュベータ中３７℃で１時間後にＯＤを６２５ｎｍで読み取った。
考察される試料のために記録した最大シグナルの５０％を生じさせる本免疫原性産物（またはＩＬ－１３）の量に対応する５０％有効量（ＥＤ５０）値は、全体の希釈点からの４パラメータロジスティック（４ＰＬ）非線形回帰を用いてＯＤｍａｘ／２値を対応する試料濃度に補間することにより決定する。
ｍｕＩＬ－１３免疫原性産物のＥＤ５０をｍｕＩＬ－１３対照標準曲線の対応するＥＤ５０で割ることにより不活性化係数を計算した。
Figure 2023110045000005
表５に示されているように、ｍｕＩＬ－１３残留活性はＣＲＭ１９７で調製した免疫原性産物においてＫＬＨで調製したものと比較してより減少していた（ＣＲＭ１９７で調製したｍｕＩＬ－１３免疫原性産物において非常により高い不活性化係数）。
抗ＩＬ－４および抗ＩＬ－１３に対する免疫応答の強度は、担体としてＫＬＨで調製したものと比較して本免疫原性産物をＣＲＭ１９７で調製した場合により高かった。さらにサイトカイン残留活性はＣＲＭ１９７で調製した免疫原性産物においてＫＬＨで調製したものと比較してより減少していた。これらの結果から、本発明者らは担体タンパク質としてＣＲＭ１９７で調製した本発明の産物を用いて概念実証を行うことを決定した。さらにアレルギーではＩＬ－４およびＩＬ－１３の両方が関与するため、本発明者らはＩＬ－４およびＩＬ－１３両方とＣＲＭ１９７との結合体を含む免疫原性産物を投与するマウスの群を含めることを決定した。ここからは、全ての本免疫原性産物を担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を用いて製造し、かつそれらの混合物をＣｏｍｂｏ免疫原性産物と呼ぶことにする。
実施例５：アレルギーマウスモデルにおける本発明の免疫原性産物の有効性
全てのアレルギーのうちアレルギー性喘息および食物アレルギーは、今ではそれぞれが世界中で３億人超の人々を冒している主要な公衆衛生問題である。アレルギーは寛容の破綻により生じ、ＩＬ－４およびＩＬ－１３などのＴＨ２サイトカインの産生、高レベルのＩｇＥ抗体ならびに炎症組織を伴わない免疫細胞（特に肥満細胞、好塩基球、好酸球およびＴ細胞）の浸潤および増殖を特徴とする２型免疫応答を生じさせると考えられている。
イエダニ（ＨＤＭ）はアレルギー性患者の５０％超を冒している主要アレルゲン源である（Ｍｅｙｅｒら １９９４）。マウスにおいてＨＤＭによる頻回の鼻腔内アレルギー誘発により、気道過敏症（ＡＨＲ）、気流閉塞、気道壁リモデリング、粘液産生および、高レベルの好酸球を特徴とする肺における炎症反応などのヒトの慢性喘息の重要な特徴を再現した。
ｍｕＩＬ－４／ＩＬ－１３免疫原性産物の調製
ａ）ＣＲＭ１９７の機能化
ＣＲＭ１９７を７０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）を含む修飾緩衝液で希釈した。ＳＡＴＡをＤＭＳＯで希釈して１００ｍＭの濃度にした。次いでＳＡＴＡをＣＲＭ１９７に添加し、回転装置上室温で３０分間インキュベートした後、製造業者の説明書に従い、Ｚｅｂａ（商標）脱塩スピンカラムを用いて過剰なＳＡＴＡを除去した。
その後にヒドロキシルアミンを５００ｍＭで同じ緩衝液で希釈した。次いで、ＣＲＭ１９７－ＳＡＴＡを５０ｍＭの最終濃度でヒドロキシルアミン溶液と共に回転装置上室温で２時間インキュベートした。最後に混合物を脱塩し、かつＺｅｂａ（商標）脱塩スピンカラムを用いて過剰な試薬を除去した。
ｂ）ｍｕＩＬ－４およびｍｕＩＬ－１３の機能化
ｍｕＩＬ－４を修飾緩衝液（７０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）に溶解した。ｓＧＭＢＳを１０ｍＭで修飾緩衝液で希釈した。次いでｓＧＭＢＳをｍｕＩＬ－４に添加し、回転装置上室温で１時間インキュベートした後、Ｚｅｂａ（商標）脱塩スピンカラムを用いて過剰なｓＧＭＢＳを除去した。
ｍｕＩＬ－１３を修飾緩衝液（７０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）に溶解した。ｓＧＭＢＳを１０ｍＭで修飾緩衝液で希釈した。次いでｓＧＭＢＳをｍｕＩＬ－１３に添加し、回転装置上室温で１時間インキュベートした後、Ｚｅｂａ（商標）脱塩スピンカラムを用いて過剰なｓＧＭＢＳを除去した。
ｃ）コンジュゲート
ＣＲＭ１９７、ｍｕＩＬ－４およびｍｕＩＬ－１３の機能化後に、各調製物のタンパク質含有量をブラッドフォードアッセイにより決定した。
機能化ＣＲＭ１９７を機能化ｍｕＩＬ－４または機能化ｍｕＩＬ－１３に１：２のモル比（担体：ｍｕＩＬ－４）および１：４（または担体：ｍｕＩＬ－１３）で添加した。個々の免疫原性産物調製物を回転装置上４℃で一晩インキュベートした。次いで得られた免疫原性産物をアミコン（登録商標）（３ｋＤａカットオフ膜）を用いて濃縮し、０．２２μｍで濾過し、かつ４℃で維持した。
ｄ）免疫原性産物の定量化
製造業者の説明書に従い、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ（ブラッドフォード）タンパク質アッセイによってｍｕＩＬ－４免疫原性産物およびｍｕＩＬ－１３免疫原性産物の濃度を決定した。
ｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物の調製
独立して合成したｍｕＩＬ－４免疫原性産物およびｍｕＩＬ－１３免疫原性産物を濃縮および０．２２μｍ無菌濾過工程の後に１：１の重量比で一緒に混合し、得られたｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物を４℃で貯蔵した。
マウスの免疫、アレルギー性喘息プロトコルおよび血液試料採取
表６および図７に詳述されているように０、７、２８および５５日目に、各Ｂａｌｂ／ｃマウスに全てがスクアレン系アジュバントで乳化されている免疫原性産物単独またはｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物または対照としてのＣＲＭ１９７単独の４回の筋肉内（ｉ．ｍ．）注射を接種した。７週齢のマウスに対して１回目の免疫を行った。
Figure 2023110045000006
１回目の免疫原性産物による免疫後３９日目に、コナヒョウヒダニ（Ｇｒｅｅｒ社から購入）由来の１００μｇのＨＤＭの３９、４３および４６日目における３回の鼻腔内注射によりマウスにおいて慢性気道炎症を誘導させた。５０日目に開始して、１週間に２回の２５μｇのＨＤＭの鼻腔内注射によりマウスをアレルギー誘発させた（計９回のアレルギー誘発）。
投与の７日前、３９、６４日目および最後のＨＤＭによるアレルギー誘発から２４時間後（マウスの屠殺）に血液採取を行った。先に記載したように血清試料を調製し、分析まで－２０℃で貯蔵した。
この研究では、
－ＥＬＩＳＡおよびバイオアッセイによる注射した産物の免疫原性、
－全身体積変動記録法によって測定される気道過敏症（ＡＨＲ）、
－生物学的マーカー：ＥＬＩＳＡによる血清中の循環ＩｇＥレベル、ＦＡＣＳ分析および気道組織学的分析による肺および気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）における気道炎症ならびに炎症性細胞浸潤
を評価した。
ａ）ＥＬＩＳＡおよびバイオアッセイによる注射した産物の免疫原性
４種類の治療群において採取したマウス血清からＥＬＩＳＡにより（上記のように）、抗ｍｕＩＬ－４および抗ｍｕＩＬ－１３の抗体力価を測定した。
全ての時点で全ての群およびＣＲＭ１９７投与群において投与前にサイトカイン抗体力価は検出されなかった。ｍｕＩＬ－４免疫原性産物およびｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物による免疫後の全ての時点で全てのマウスにおいて抗ｍｕＩＬ－４抗体力価が検出された（図８Ａ）。ｍｕＩＬ－４免疫原性産物を投与したマウスにおいてｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物と比較してより高いレベルが観察された。ｍｕＩＬ－１３免疫原性産物群では、Ｄ３９にマウスにおいて抗ｍｕＩＬ－１３抗体力価が検出され始め、Ｄ６５では１００％のマウスが応答していた（図８Ｂ）。ｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物群でも、Ｄ３９直後に抗ｍｕＩＬ－１３抗体が検出され、Ｄ６５では１２匹中９匹のマウスが応答してた。全体として、ｍｕＣｏｍｂｏ群のマウスには個々の免疫原性産物用量の半分しか投与していないため、予想したとおり、ｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物を用いた場合よりもｍｕＩＬ－４およびｍｕＩＬ－１３免疫原性産物による免疫後に血清中により高い抗体力価が観察された（図１４）。
上記のように２つの異なるバイオアッセイを用いて各免疫原性産物の中和活性をインビトロで評価した。なおマウスは、ＩＬ－４の場合はＮＣ５０≧２００ｄｉｌ－１、ＩＬ－１３の場合は≧１００ｄｉｌ－１であればこの実験における応答動物としてみなす。
ｍｕＩＬ－４免疫原性産物およびｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物で免疫したマウスにおいてそれぞれ少なくとも１つの時点で１２匹中ｎ＝１１または１２匹中ｎ＝９でｍｕＩＬ－４に対する高い中和能が観察された（図９Ａおよび表７）。
Figure 2023110045000007
興味深いことに、ｍｕＩＬ－４またはｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物による免疫から１年後に、抗ＩＬ－４抗体はマウスにおいてまだ検出された（データは示さず）。
ｍｕＩＬ－１３免疫原性産物およびｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物で免疫したマウスにおいてそれぞれ少なくとも１つ時点で１２匹中ｎ＝１０または１２匹中ｎ＝７でｍｕＩＬ－１３に対する中和能も誘導された（図９Ｂおよび表８）。
Figure 2023110045000008
興味深いことに、ｍｕＩＬ－１３またはｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物による免疫から１年後に、マウスにおいて抗ＩＬ－１３抗体はまだ検出された（データは示さず）。
なお、事前に化学的連結（chemical coupling）を行っていないｍｕＩＬ－４および／またはｍｕＩＬ－１３およびＣＲＭ１９７の同時注射は抗ＩＬ－４および抗ＩＬ－１３抗体を惹起せず、これはサイトカインに対するＢ細胞の自己寛容を破綻させるためにはサイトカインと担体タンパク質との結合が必須であることを強調している。
異なるクラス（特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭを含む）、主としてＩｇＧ１の抗ＩＬ－４および抗ＩＬ－１３抗体が免疫後に産生された（データは示さず）。
ｂ）全身体積変動記録法により測定した気道過敏症（ＡＨＲ）
最後のアレルギー誘発から２４時間後に、全身体積変動記録法によりＡＨＲを評価した。意識のあるマウスにおいて気管支収縮剤であるメタコリンに対する応答を測定した。
異なる用量すなわち０ｍｇ／ｍＬ、３．５ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬおよび１４ｍｇ／ｍＬのメタコリンをエアロゾルにより投与した。気道収縮指標（Ｐｅｎｈ）を使用して肺機能の変化を評価した（Ｈａｍｅｌｍａｎｎら，１９９７）。この測定は、胸部流動曲線と鼻部流動曲線との間での位相変化を概念化したものであり、位相変化の増加は呼吸器系の抵抗の増加と相関していた。Ｐｅｎｈは、式Ｐｅｎｈ＝（Ｔｅ／ＲＴ－１）×ＰＥＦ／ＰＩＦ（式中、Ｔｅは呼気時間であり、ＲＴは弛緩時間であり、ＰＥＦはピーク呼気流量であり、ＰＩＦはピーク吸気流量である）により計算する。Ｐｅｎｈ値を各メタコリンによるアレルギー誘発後に５分間記録し、この期間中の最大値をグラフィックで報告する。
ＣＲＭ１９７対照群のＨＤＭで感作したマウスにおいて高い気管支収縮が観察された（図１０）。気管支収縮はｍｕＩＬ－１３免疫原性産物およびｍｕＩＬ－４免疫原性産物により部分的に阻害されたが、本発明の産物の高い保護効果を示すｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物で免疫したマウスではほぼ抑制されていた。実際には、ｍｕＣｏｍｂｏ群で観察された残留気管支収縮のレベルはＨＤＭ非感作マウスにおいて観察されたものと同様であった（図１０の〇）。
これらの結果は侵襲的気道応答測定を用いて確認した。実際には、ＨＤＭ処置した対照マウスはＰＢＳ処置した対照群と比較した場合にメタコリンによるアレルギー誘発時に肺抵抗およびエラスタンスにおける有意に増加した変化を示したが、これらの２つの特徴はｍｕＩＬ－４、ｍｕＩＬ－１３またはｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物で治療したマウスでは部分的に減少していた（データは示さず）。
全体的に見てこれらの結果は、ＩＬ－４およびＩＬ－１３に対する二重ワクチン接種時にＡＨＲをブロックすることができることを示している。
ｃ）生物学的マーカー
ＥＬＩＳＡによる血清中の循環ＩｇＥレベル
免疫原性産物ワクチン接種の前および最後のＨＤＭによるアレルギー誘発から２４時間後に、製造業者の説明書に従いＥＬＩＳＡにより総循環ＩｇＥレベルを測定した（マウスＩｇＥのＥＬＩＳＡ定量化セット（Ｍｏｕｓｅ ＩｇＥ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｓｅｔ）、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｓ Ｅ９０－１１５）（図１１）。
ワクチン接種前に循環ＩｇＥは検出されなかった。ＨＤＭによる最後のアレルギー誘発から２４時間後に、ＨＤＭ感作により総循環ＩｇＥを誘導させた（図１１Ｂ）。全ての本免疫原性産物投与群においてそのレベルは減少し、これはＣＲＭ１９７で免疫したマウスと比較して本発明の産物の保護効果を実証した。なおＥＬＩＳＡによりＨＤＭ特異的ＩｇＥのみを測定した場合に同様の結果が得られた（データは示さず）。
ＨＤＭ処置したマウスは上昇したレベルのＨＤＭ特異的ＩｇＧ抗体も示す。但し、これらのレベルはｍｕＩＬ－４および／またはｍｕＩＬ－１３免疫原性産物による治療によって影響を受けなかった（データは示さず）。
肺および気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）における気道炎症
ＨＤＭまたはＰＢＳにより感作したマウスの肺および気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）における細胞変化の詳細な経時的分析を行った。
ＢＡＬからの炎症性細胞を製造業者の説明書に従い、以下の抗体（表９）：ＣＤ４５－ＦＩＴＣ、Ｌｙ６Ｇ－ＰＥ、ＣＤ１１ｂ－ＶＧ、ＳｉｇｌｅｃＦ－ＰＥＣｙ７、Ｂ２２０－ＡＰＣおよびＣＤ３－ＡＰＣを用いてＦＡＣＳにより分析した。
Figure 2023110045000009
対照マウスの肺において、ＨＤＭへの慢性鼻腔内アレルギー誘発によりＰＢＳ処置した動物と比較した場合に主に好酸球（ＣＤ４５＋、Ｌｙ６Ｇ－、ＣＤ１１ｂ＋、ＳｉｇｌｅｃＦ＋）からなる造血系由来のＣＤ４５＋細胞浸潤の数における有意な増加が生じた（データは示さず）。興味深いことに、免疫原性産物ワクチン接種は特に統計的に有意な減少を示したｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物群において、ＣＤ４５＋浸潤細胞のうちの好酸球浸潤を防止した。
気管支肺胞洗浄において、ＨＤＭ感作により主に好酸球（ＣＤ４５＋、Ｌｙ６Ｇ－、ＣＤ１１ｂ＋、ＳｉｇｌｅｃＦ＋）からなる造血系由来のＣＤ４５＋細胞浸潤を特徴とする炎症反応が生じた（図１２）。興味深いことに、免疫原性産物ワクチン接種は特に統計的に有意な減少を示したｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物群においてＣＤ４５＋浸潤細胞のうちの好酸球浸潤を防止した。
興味深いことに、本発明の免疫原性産物によるワクチン接種は血中の好酸球レベルには全く効果はなく（データは示さず）、これは、ワクチン接種したマウスにおいて観察された気道好酸球増加症の減少が好酸球または好酸球前駆細胞の数に対する全身的効果ではなく肺への好酸球動員の減少の結果であることを示している。
気道組織学的分析
気道に対する感作およびワクチン接種の効果を組織学的分析により調べた。簡単に言えば、左の肺を死後に切除し、４％ＰＦＡにより室温で２４時間固定し、かつ７０％エタノール中に保存した。長手方向に薄切りにし、かつ
－白血球浸潤の評価のためにヘマトキシリンおよびＥｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）で、
－肥満細胞の数の定量化のためにトルイジンブルーで、あるいは
－杯細胞過形成および粘液産生の評価のために過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色で
染色した。
全体的に、これらの肺組織学的分析により、ＨＤＭ処置した動物におけるｍｕＩＬ－４、ｍｕＩＬ－１３またはｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物によるワクチン接種により、白血球および上皮内肥満細胞の数がワクチン接種していないＨＤＭ処置した動物と比較した場合に有意に減少したことが確認される（データは示さず）。
ＰＡＳ組織学的分析により、ＨＤＭ処置した動物におけるｍｕＩＬ－４、ｍｕＩＬ－１３またはｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物によるワクチン接種により、杯細胞過形成／粘液分泌がワクチン接種していないＨＤＭ処置した動物と比較した場合に有意に減少したことも確認される（データは示さず）。これらの結果は、本免疫原性産物（特にｍｕＩＬ－１３およびｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物）がＨＤＭ感作により誘導された粘液過分泌を制御することができるということを支持している。
結論として、本発明者らはＣＲＭ１９７で調製した本発明の産物が免疫原性であり、かつ単独または組み合わせ（ｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物）で注射するかに関わらず抗サイトカイン中和抗体を誘導したことを実証した。抗サイトカイン中和抗体の存在は、メタコリン吸入後にＰｅｎｈ値によって測定したＨＤＭ誘導ＡＨＲの減少に関連づけられた。さらに、これらの抗サイトカイン中和抗体は循環ＩｇＥレベルならびに肺における肥満細胞数および気道における好酸球浸潤を制限することができた。
従って、これらの結果は本発明の免疫原性産物がＩＬ－４およびＩＬ－１３に対するＢ細胞の寛容を破綻させることができることを実証しており、これらの免疫原性産物が喘息および／またはアレルギーの治療、特にアレルギー性喘息の治療における有望な新しい治療戦略の代表となり得ることを提案している。
興味深いことに、個々の免疫原性産物は活性であったが、喘息および／またはアレルギー症状（および特にアレルギー性喘息症状）に対する優れた有益な効果を有し、かつ本免疫原性産物を組み合わせた場合に（ｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物）、生物学的マーカーが観察された。
実施例６：本発明のヒト免疫原性産物の調製
上記のように同じ製造プロセスに従い、マウスのサイトカインの代わりにヒトのサイトカインＩＬ－４およびＩＬ－１３を用いて、ヒトＩＬ－４免疫原性産物、ＩＬ－１３免疫原性産物およびＣｏｍｂｏ免疫原性産物の調製を行った。
ＩＬ－４およびＩＬ－１３免疫原性産物の調製
ａ）ＣＲＭ１９７の機能化
マウス産物のために記載されているようにＣＲＭ１９７の機能化を行った。
ｂ）ＩＬ－４およびＩＬ－１３の機能化
緩衝液（７０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）に溶解したＩＬ－４またはＩＬ－１３を、先に緩衝液に１０ｍＭの濃度で溶解したｓＧＭＢＳと反応させた。穏やかに撹拌しながら室温で１時間反応させた後に、Ｚｅｂａ脱塩カラムによって過剰なｓＧＭＢＳを除去した。
ｃ）コンジュゲート
ＣＲＭ１９７、ＩＬ－４およびＩＬ－１３の機能化後に、各調製物のタンパク質含有量をブラッドフォードアッセイにより決定した。機能化ＣＲＭ１９７を機能化ＩＬ－４または機能化ＩＬ－１３に１：４モル比（担体：ＩＬ－４または担体：ＩＬ－１３）で添加した。個々の免疫原性産物調製物を回転装置上４℃で一晩インキュベートした。この結合体を脱塩カラムに通して前の工程からの残りのヒドロキシルアミンなどの潜在的不純物を除去した。得られた免疫原性産物を濃縮し、０．２２μｍのフィルタで濾過し、４℃で貯蔵した。
Ｃｏｍｂｏ免疫原性産物の調製
Ｃｏｍｂｏ免疫原性産物の調製は２つの異なる方法を用いて、すなわち修飾された担体タンパク質と共に両方の修飾されたサイトカインを同時にインキュベートすること（同時合成）、または２種類の独立して合成したＩＬ－４およびＩＬ－１３免疫原性産物を混合すること（混合調製）により行うことができる。
同時合成によるＣｏｍｂｏ免疫原性産物の調製
ａ）ＣＲＭ１９７の機能化
マウス産物のために記載されているようにＣＲＭ１９７の機能化を行った。
ｂ）ＩＬ－４およびＩＬ－１３の機能化
個々の免疫原性産物調製のために記載されているようにＩＬ－４またはＩＬ－１３の機能化を行った。
ｃ）コンジュゲート
ＣＲＭ１９７、ＩＬ－４およびＩＬ－１３の機能化後に、各調製物のタンパク質含有量をブラッドフォードアッセイにより決定した。リン酸塩緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）に入れた３種類の修飾されたタンパク質を全て２：２：１（ＩＬ－４：ＩＬ－１３：ＣＲＭ１９７）モル比で混合した。この反応は４℃で一晩行った。この結合体を脱塩カラムに通して前の工程からの残りのヒドロキシルアミンなどの潜在的不純物を除去した。得られた免疫原性産物を濃縮し、０．２２μｍのフィルタで濾過し、４℃で貯蔵した。
混合調製によるＣｏｍｂｏ免疫原性産物の調製
独立して合成したＩＬ－４およびＩＬ－１３免疫原性産物を濃縮および０．２２μｍの無菌濾過工程の後に１：１の重量比で一緒に混合した。Ｃｏｍｂｏ免疫原性産物を使用するまで４℃で貯蔵した。
実施例７：ヒト産物の抗原性
サンドイッチＥＬＩＳＡを行ってサイトカインの担体タンパク質への結合を評価し、かつ製造プロセス中にエピトープが保存されているか否かも評価した。使用したプロトコルは、ビオチン化抗ヒトＩＬ－４およびＩＬ－１３抗体を用いる上に記載したものと同じであった。
結果は図１３に示されている。この試験により、本発明の免疫原性産物がＣＲＭ１９７に結合されたＩＬ－４またはＩＬ－１３を含むことを確認した。さらにこれらの結果から、本免疫原性産物が抗原性であり（すなわち、抗ＩＬ－４または抗ＩＬ－１３抗体によって認識され）、かつＣｏｍｂｏ免疫原性産物でもそうであることが確認される。
実施例８：ヒト産物の免疫原性
マウスの免疫プロトコル
図１４に詳述されているように０、７、２８および４９日目に、スクアレン系アジュバントで乳化した免疫原性産物の４回の筋肉内（ｉ．ｍ．）注射を各Ｂａｌｂ／ｃマウス（１群当たり１０匹のマウス）に接種し、全てを４μｇの用量で行った。１回目の免疫を７週齢で行った。投与前ならびに３８、５９、９０および１２０日目に血液採取を行った。室温で凝血および遠心分離して血餅を除去した後に、血清試料を調製した。
ＥＬＩＳＡによる抗ＩＬ－４および抗ＩＬ－１３抗体力価の決定
各群において採取したマウス血清からＥＬＩＳＡにより抗サイトカイン抗体力価を測定した。
免疫原性産物またはＣｏｍｂｏ免疫原性産物による免疫後の血清中の各抗体力価の決定をヒトＩＬ－４およびＩＬ－１３を９６ウェルプレートにコーティングすることにより上記のように評価した。
全ての群において投与前にサイトカイン抗体力価は検出されなかった。ＩＬ－４免疫原性産物およびｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物による免疫後の全ての時点で、全てのマウスにおいて抗ＩＬ－４抗体力価が検出された（図１５Ａ）。ＩＬ－４免疫原性産物およびＣｏｍｂｏ免疫原性産物を投与したマウスにおいて同様のレベルが観察され、これは本発明者らが免疫応答のプラトーに到達した可能性があることを示していた。ＩＬ－１３免疫原性産物群における免疫後の全ての時点で、全てのマウスにおいて抗ＩＬ－１３抗体力価が検出された（図１５Ｂ）。Ｃｏｍｂｏ免疫原性産物群においてＤ３８直後およびＤ５９に１０匹中８匹のマウスにおいて抗ＩＬ－１３抗体も検出された。組み合わせ群のマウスには個々の免疫原性産物用量の半分しか投与していないため、ＩＬ－１３免疫原性産物による免疫後に血清中でＣｏｍｂｏ免疫原性産物よりも高い抗ＩＬ－１３抗体力価が観察された。
免疫後の中和能の決定
上記のようにＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３レポーター細胞株を用いて抗ＩＬ－４および抗ＩＬ－１３中和能を評価した。なおこの実験ではマウスは、ＩＬ－４の場合はＮＣ５０≧２００ｄｉｌ－１、ＩＬ－１３の場合は≧１００ｄｉｌ－１であれば応答動物としてみなす。
ＩＬ－４免疫原性産物およびＣｏｍｂｏ免疫原性産物で免疫した群においてＩＬ－４に対する高い中和能が観察され、免疫後の全ての時点で１００％のマウスが応答していた（図１６Ａおよび表１０）。
Figure 2023110045000010
ＩＬ－１３免疫原性産物およびＣｏｍｂｏ免疫原性産物で免疫したマウスにおいてＩＬ－１３に対する中和能を有する抗体も誘導され、Ｄ５９では１００％のマウスが応答していた（図１６Ｂおよび表１１）。
Figure 2023110045000011
まとめると、本発明の産物は強い中和能により高い抗サイトカイン抗体力価を誘導することができた。
ヒト免疫原性産物の残留活性
ＩＬ－４およびＩＬ－１３の残留活性について上記のようにＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３レポーター細胞株を用いて、ヒトＩＬ－４免疫原性産物、ＩＬ－１３免疫原性産物およびＣｏｍｂｏ免疫原性産物の残留活性を監視した。
Figure 2023110045000012
Figure 2023110045000013
表１２および表１３に示されているように、ヒト免疫原性産物におけるＩＬ－４またはＩＬ－１３に対する不活性化係数は全て１０００超（であって最大８７６５）であり、これは、本免疫原性産物中のサイトカインの残留活性が自然なサイトカインと比較して少なくとも３桁の大きさで減少したことを示している。
これらの大きく減少した残留活性は、本発明の産物の安全性プロファイルを支持する重要な要素である。
実施例９：食物アレルギーモデルマウスモデルにおける本発明の免疫原性産物の治療効果
食物アレルギーはここ数十年の間の有病率の増加および治癒的治療の欠如により、欧米化された国々では主要な健康問題である。牛乳、ピーナッツ、ダイズおよびコムギなどのいくつかの主要な主食は食物アレルギー反応を引き起こす可能性がある。食物アレルギーは無害な食物アレルゲンの経口寛容の不足を反映しており、Ｔｈ２免疫応答調節不全の発生、Ｔｈ２サイトカイン（主としてＩＬ－４およびＩＬ－１３）の分泌、アレルゲン特異的ＩｇＥの分泌、および胃腸（ＧＩ）管へのエフェクター細胞の動員が生じる。
ＩＬ－４ｒａＦ７０９変異マウスを用いて食物アレルギーにおける本発明の免疫原性産物の治療効果を調べた。ＩＬ－４ｒａＦ７０９マウスはＩＬ－４受容体（ＩＬ－４Ｒ）α鎖に、タンパク質チロシンホスファターゼ１（ＳＨＰ－１）を含むＳｒｃ相同性ドメイン２の受容体サブユニットへの結合を破壊し、かつＩＬ－４およびＩＬ－１３によるシグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）の活性化の増強を生じる機能獲得変異を有する。これらのマウスはＴｈ２細胞応答およびＩｇＥ産生の増強を示す。従って、この変異は受容体シグナル伝達を促進し、かつアトピーに関連している多くのヒトＩＬ－４Ｒα多型の典型である。
ｍｕＩＬ－４／ＩＬ－１３およびｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物の調製
本明細書の上に記載されているようにｍｕＩＬ－４、ｍｕＩＬ－１３およびｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物を合成する。
マウスの免疫、食物アレルギーモデル、アナフィラキシー応答、組織学的分析および血液試料採取
０、７、２８日目に、全てがスクアレン系アジュバントで乳化されているｍｕＩＬ－４、ｍｕＩＬ－１３またはｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物または対照としてのＣＲＭ１９７で各ＩＬ－４ｒａＦ７０９変異マウスを免疫し、次いで追加免疫した。
平行して、マウスを強制経口投与によりＰＢＳまたは２５０μｌの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．０）に懸濁させた５ｍｇのピーナッツタンパク質に対応する２３ｍｇのピーナッツ（ＰＥ）バターのいずれかで感作した。水で希釈した４５０ｍｇのピーナッツバター（１００ｍｇのタンパク質）の腸内ボーラスでマウスをアレルギー誘発した（Ｂｕｒｔｏｎら，２０１４）。
アレルギー誘発直後に、核心温度を１時間測定すると共に下痢の発症が確認された。
臨床的スコア（０：臨床的症状なし、１：後ろ脚による繰り返しの口／耳の引っ掻きおよび外耳道の掘り、２：活動の低下、自己隔離、眼および／または口の周りの腫脹、３：胃を下にした伏臥位で１分超の静止期間、４：ひげ刺激に対する応答なし、突きに対する応答減少または応答なし、５：振戦、痙攣または死亡）も決定した。
組織学的分析（例えば肥満細胞定量化）のために腸組織の切片を回収した。
炎症（例えば肥満細胞脱顆粒産物）のレベル、抗体レベル（例えば、抗サイトカイン力価、中和能、アレルゲン特異的ＩｇＧおよびＩｇＥならびに総ＩｇＥ）を調査するために血液も採取した。
実施例１０：アトピー性皮膚炎マウスモデルにおける本発明の免疫原性産物の治療効果
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は慢性もしくは慢性再発性のそう痒性炎症性皮膚疾患である。ＡＤの発生率はここ３０年の間に先進国において劇的に増加した。ＡＤの免疫異常は一般に、各種アレルゲン（例えば、食物、空気アレルゲン、微生物および自己アレルゲン）による感作、高い血清中ＩｇＥレベル、およびアポトーシスに陥ったケラチノサイトを有する皮膚病変、ならびにＩＬ－４、ＩＬ－５およびＩＬ－１３などのＴｈ２サイトカインを分泌する免疫細胞による浸潤を特徴とする。
動物モデルを用いてＡＤにおける本発明の免疫原性産物の治療効果を調査し、ここではイエダニ（ＨＤＭ）抽出物およびブドウ球菌エンテロトキシンＢの皮膚への頻回塗布により湿疹性皮膚病変を誘導する。
ｍｕＩＬ－４／ＩＬ－１３およびｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物の調製
本明細書の上に記載されているようにｍｕＩＬ－４、ｍｕＩＬ－１３およびｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物を合成する。
マウスの免疫、アトピー性皮膚炎誘導、臨床的重症度測定、組織学的分析および血液試料採取
全てがスクアレン系アジュバントで乳化されているｍｕＩＬ－４、ｍｕＩＬ－１３またはｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物または対照としてのＣＲＭ１９７でマウスを免疫した。
平行して、先にＡｎｄｏら（Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１３年１２月；１３３（１２）：２６９５－２７０５）に記載されたようにアトピー性皮膚炎を誘導させた。簡単に言えば、５００ｎｇのブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＢ）および１０μｇのコナヒョウヒダニ抽出物（Ｄｅｒ ｆはイエダニ（ＨＤＭ）である）の溶液を剪毛領域に置いたガーゼパッドに塗布した。背中の皮膚のこの部分を、帯具を用いてＴｅｇａｄｅｒｍ（商標）透明ドレッシングで塞いだ。３日後にこのドレッシングを新しいものに取り換えた。さらに４日が経過した後、このドレッシングを除去し、翌週の間はこのマウスを処置せずに維持した。１週間のＤｅｒ ｆ／ＳＥＢ処置を２回以上繰り返し、このようにしてマウスを３サイクルのそのような処置に供した。
最後のサイクルでこのドレッシングを除去してから２日後に、マウスの識別を知らない調査者によって臨床的重症度をスコア化した。臨床的スコアは４種類の可能な症状（発赤、出血、発疹および鱗屑（ｓｃａｌｉｎｇ））の重症度（０：症状なし、１：軽度、２：中度、３：重度）に基づいていた。最大で可能なスコアは１２である。
スコア化直後にマウスを安楽死させ、表皮の厚さおよび好酸球増加症の組織学的分析のために処置した領域に対応する背中の皮膚標本を得た。炎症のレベルおよび抗体レベル（例えば、抗サイトカイン力価、中和能、アレルゲン特異的ＩｇＧおよびＩｇＥならびに総ＩｇＥ）を調査するために血液も採取した。
実施例１１：慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）マウスモデルにおける本発明の免疫原性産物の治療効果
ＣＯＰＤは吸入された刺激物質への過度の炎症反応に一般に関連する進行性気流制限を特徴とし、これは慢性閉塞性気管支炎および肺気腫と呼ばれる肺実質の破壊を引き起こす。
ＣＯＰＤの開始および進行の根底にある可能な機序を解明するためにＣＯＰＤのいくつかの動物モデルを確立した。ここではプロテアーゼ誘導モデルを使用して、ＣＯＰＤにおける本発明の免疫原性産物の治療効果を評価した。
ｍｕＩＬ－４／ＩＬ－１３およびｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物の調製
本明細書の上に記載されているようにｍｕＩＬ－４、ｍｕＩＬ－１３およびｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物を合成する。
マウスの免疫、アトピー性皮膚炎誘導、白血球定量化および組織学的分析
全てがスクアレン系アジュバントで乳化されているｍｕＩＬ－４、ｍｕＩＬ－１３またはｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物または対照としてのＣＲＭ１９７でマウスを免疫した。
平行して、ブタ膵エラスターゼなどのエラスチン分解酵素の鼻腔内滴下を使用して例えば肺気腫形成などのＣＯＰＤ様症状を引き起こした。簡単に言えば、ＢＡＬＢ／ｃマウスを３０μＬのＰＢＳに入れた０．６Ｕのブタ膵エラスターゼで鼻腔内処置した（Ｓｈｉｂａｔａら Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国 ２０１８年１２月１８日；１１５（５１）：１３０５７－１３０６２）。
第１の実験では、白血球の評価のために５日目にマウスを安楽死させ、白血球（例えば、単球、マクロファージ、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞および好酸球）の数を気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）流体および肺細胞の単細胞懸濁液におけるフローサイトメトリーにより定量化した。先にヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した肺組織の組織学的検査によって肺における白血球浸潤のさらなる評価を行った。炎症のレベルおよび抗体レベル（例えば、抗サイトカイン力価、中和能）を調査するために血液も採取した。
第２の実験では、肺気腔拡張の指標として平均肺胞径（ＭＬＩ）を用いたＨ＆Ｅ染色した肺組織切片における組織学的検査による肺気腫の評価のために、エラスターゼ処置後２１日目にマウスを屠殺した。炎症のレベルおよび抗体レベル（例えば、抗サイトカイン力価、中和能、アレルゲン特異的ＩｇＧおよびＩｇＥならびに総ＩｇＥ）を調査するために血液も採取した。
実施例１２：肺線維症マウスモデルにおける本発明の免疫原性産物の治療効果
肺線維症は、異なる程度の肺炎症、肺線維芽細胞の過剰な増殖および肺コラーゲン含有量の増加を特徴とする広範囲の疾患を表す。
動物モデルを用いて肺線維症における本発明の免疫原性産物の治療効果を調査し、ここでは肺へのブレオマイシン（ＢＬＭ）投与により炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの分泌、白血球の動員、コラーゲン産生の増加、リモデリングおよび線維症肺炎症を生じさせる。
ｍｕＩＬ－４／ＩＬ－１３およびｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物の調製
本明細書の上に記載されているようにｍｕＩＬ－４、ｍｕＩＬ－１３およびｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物を合成する。
マウスの免疫、肺線維症誘導、白血球定量化および組織学的分析
全てがスクアレン系アジュバントで乳化されているｍｕＩＬ－４、ｍｕＩＬ－１３またはｍｕＣｏｍｂｏ免疫原性産物または対照としてのＣＲＭ１９７でマウスを免疫した。
平行して、Ｒｅｂｅｒら（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４年２月１５日；１９２（４）：１８４７－５４）によって以前に記載されたようにＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて肺線維症を誘導させた。簡単に言えば、ＢＬＭ塩酸塩（２５μｌのＰＢＳ中に０．１ｍｇ；１２．５μｌ／鼻孔）の鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与によって肺線維症を誘導させた。
実験終了時まで１週間に５回体重を監視し、肺線維症の評価のためにＢＬＭ治療後７日目または１４日目にマウスを安楽死させた。
白血球（例えば、単球、マクロファージ、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞および好酸球）の数を気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）流体および肺細胞の単細胞懸濁液におけるフローサイトメトリーにより定量化した。
ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した肺組織の組織学的検査（白血球浸潤の評価のため）、マッソントリクローム（線維症の評価のため）またはトルイジンブルー（肥満細胞数の評価のため）を行った。
炎症のレベルおよび抗体レベル（例えば、抗サイトカイン力価、中和能）を調査するために血液も採取した。

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  1. 本出願の明細書または図面に記載される発明。
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