MXPA03011133A

MXPA03011133A - Formas mutantes de holotoxina de colera como adyuvante.

Info

Publication number: MXPA03011133A
Application number: MXPA03011133A
Authority: MX
Inventors: G Jobling Michael
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2001-06-07
Filing date: 2002-06-05
Publication date: 2004-12-06
Also published as: BR0210225A; US20040181036A1; IL159210A; US7285281B2; CN1977971A; EP1404368A4; WO2002098368A3; EP1404368A2; DE60234695D1; JP2010017190A; ATE451386T1; KR20040073965A; AU2002346249B2; CN1297316C; WO2002098368A2; CN1538854A; KR100898648B1; EP1404368B1; CA2449663A1; JP2004535187A

Abstract

Se proporcionan holotoxinas mutantes de colera que comprenden una subunidad (A) de toxina de colera que tiene sustituciones de un solo aminoacido en las posiciones de aminoacidos (16 o 72) o en las posiciones de aminoacidos dobles (16 y 68) o (68 y 72) que tienen toxicidad reducida en comparacion con la holotoxina de colera de tipo silvestre. Las holotoxinas de colera mutantes son utiles como adyuvantes en composiciones inmunogenicas para mejorar la respuesta inmunologica en un hospedador vertebrado a un antigeno seleccionado a partir de una bacteria, virus, hongo o parasito patogenico, una celula cancerosa, una celula tumoral, un alergeno o una molecula propia.

Description

FORMAS MUTANTES DE HOLOTOXINA DE CÓLERA COMO ADYUVANTE ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El sistema inmunológico del cuerpo activa diversos mecanismos para atacar a los patógenos (Janeway, Jr. CA. y Travers P., eds . , en Immunobiology, "The Immune System in Health and Disease" , Segunda Edición, Current Biology Ltd., Londres, Gran Bretaña (1996)). Sin embargo, no todos estos mecanismos se activan necesariamente después de inmunización. ¦ La inmunidad protectora inducida por inmunización depende de la capacidad de una composición inmunogénica para inducir una respuesta inmunológica apropiada para resistir o eliminar al patógeno. Dependiendo del patógeno, se puede requerir una respuesta inmunológica mediada por células o humoral, o ambas . Muchos antigenos son poco inmunogénicos o no inmunogénicos cuando se administran solos. Una respuesta inmunológica adaptable fuerte al antígeno casi siempre requiere que los antígenos se administren junto con un adyuvante, una sustancia que aumenta la respuesta inmunológica (Audbert, F.M. y Lise, L.D. 1993 Immunology Today, 14 : 281-284) . La necesidad de procedimientos eficaces de inmunización es particularmente aguda respecto a organismos infecciosos que provocan infecciones agudas en, o que pueden REF: 152335 entrar al cuerpo a través de las , superficies gastrointestinal, pulmonar, nasofaríngeo o genitourinaria. Estas áreas se encuentran recubiertas de moco que contiene inmunoglobulinas las cuales consisten principalmente de la inmunoglobulina secretora IgA (Hanson, L.A., 1961 Intl. Arch. Allergy Appl . I munol . , 18, 241-267; Tomasi, T.B., y Zigelbaum, S., 19S3 J". Clin. Invest., 42, 1552-1560; y Tomasi, T.B., et al., 1965 J". Exptl . Med. , 121, 101-124). Esta inmunoglobulina se deriva de grandes cantidades de células plasmáticas productoras de IgA, que se infiltran en las regiones de la lámina propia subyacentes a las membranas de mucosa (Brandtzaeg, P., y Baklein, K. , 1976 Scand. J. Gastroenterol . , 11 (Suppl. 36), 1-45; y Brandtzaeg, P., 1984 "Imraune Functions of Human Nasal Mucosa and Tonsils in Health and Disease", página 28 et seg. en Immunology of the ung and Upper Respiratory Tract, Bienenstock, J. , ed. , McGraw-Hill, New York, NY) . La inmunoglobulina IgA secretora es transportada específicamente a la superficie luminal a través de la acción del componente secretor (Solari, R. , y raehenbuhl , J-P, 1985 Immunol. Today, 6, 17-20) . Los regímenes de inmunización parenterales habitualmente no son eficaces para inducir respuestas de IgA secretora. La inmunidad secretora con mucha frecuencia se obtiene mediante la inmunización directa de los tejidos linfoides asociados mucosalmente . Después de su inducción en un sitio mucosal, los precursores de células plasmáticas que producen IgA se salen de los vasos y se diseminan a diversos tejidos de mucosa en donde se produce la diferenciación final para la síntesis de IgA con gran rendimiento (Crabbe, P.A. , et al., 1969 J. Exptl . Med. , 130 723-744; Bazin, H., et al . , 1970 J. Immunol., 105, 1049-1051; Craig, S. . y Cebra, J. J., 1971 J. Exptl. Med., 134, 188-200). Estudios extensos han demostrado lo factible de la inmunización mucosal para inducir este sistema inmunológico mucosal común (Mestecky, J. , et al., 1978 J". Clin. Invest. , 61, 731-737) pero con raras excepciones las dosis grandes de antígeno necesarias para obtener inmunización eficaz, ha hecho de esta solución un trabajo poco práctico para antígenos purificados. Entre las estrategias investigadas para resolver este problema está el uso de adyuvantes de mucosa. En la técnica anterior se conocen muchos adyuvantes que incrementan la respuesta inmunológica de los antígenos (Elson, C. O., y Ealding, W. , 1984 J". Immunol., 132, 2736-2741). Estos adyuvantes, mezclados con un antígeno, vuelven al antígeno particulado lo que ayuda a retener el antígeno en el cuerpo por período de tiempo más prolongados y de esta manera se promueve la captación aumentada por parte de los macrofagos y se incrementa la respuesta inmunológica. Sin embargo, hasta ahora las reacciones inducidas por muchos adyuvantes o su ineficacia para inducir inmunidad en la mucosa han requerido del desarrollo de mejores adyuvantes para el suministro de composiciones inmunogénicas . Desafortunadamente, el desarrollo de adyuvantes hasta la fecha ha sido en gran medida un ejercicio empírico (Janeway, Jr., et al., mencionado antes en las páginas 12-25 a 12-35) . Por lo tanto, se requiere una solución razonada y más directa para desarrollar adyuvantes eficaces para la administración de composiciones antigénicas. Se ha informado que la toxina secretada por la bacteria gramnegativa Vibrio cholerae (V. cholerae) , el agente causal de la enfermedad gastrointestinal denominada cólera, es extremadamente potente como un adyuvante. Se ha reportado que la toxina del cólera (CT) tiene una secuencia de 382 aminoácidos (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1) (Mekalanos , J.J., et al., 1983 Nature, 306, 551-557) , la cual tiene una señal de 18 aminoácidos (aminoácidos 1 a 18 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1) . La molécula de holotoxina de toxina del cólera es un complejo hexaheteromérico que consiste de una única subunidad peptídica denominada CT-A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, o aminoácidos 19 a 258 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1) , la cual es responsable de la actividad enzimática de la toxina, y cinco subunidades peptidicas idénticas, cada una denominada CT-B (cada una con una señal de 21 aminoácidos (aminoácidos 259 a 279 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1) , seguido por la subunidad peptídica CT-B (aminoácidos 280 a 382 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1)), las cuales están involucradas en la unión de la toxina a las células epiteliales intestinales así como a otras células las cuales contienen el gangliósido GMi en su superficie (Gilí, D.M. , 1976 Biochem. , 15, 1242-1248; Cuatrecasas, P., 1973 Biochem. , 12, 3558-3566) . La CT producida por V. cholerae tiene una subunidad CT-A separada proteolíticamente con el bucle unido a disulfuro único entre las cisteínas en las posiciones de aminoácidos 187 y 199 de la CT-A madura (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2) . Esta separación produce un polipéptido Al enzimáticamente activo (Kassis, S., et al., 1982 J". Biol . Chem. , 257, 12148-12152) y un polipéptido A2 más pequeño el cual une al fragmento Al con el pentámero CT-B (Mekalanos , J.J., et al., 1979 J". Biol. Chem., 254, 5855-5861). La toxicidad se genera cuando el fragmento enzimáticamente activo CT-A1, al entrar en los enterocitos, ADP-ribosila una proteína G reguladora (Gsa) . Esto induce la activación constitutiva de adenilato ciclasa, una concentración intracelular aumentada de AMPc y secreción de fluido y electrolitos al interior de la luz del intestino delgado, por lo que provocan toxicidad (Gilí, D.M., y Meren, R. , 1978 Proc. Nati. Acad. Sci . , EUA, 75, 3050-3054), por lo que provoca toxicidad. In vitro, la actividad de ADP-ribosil transferasa de CT es estimulada por la presencia de proteínas accesorias denominadas ARF, proteínas de unión de GTP pequeñas que se sabe están involucradas en el tráfico de vesículas dentro de las células eucarióticas (welsh, C.F., et al., "ADP-Ribosylation Factors : -A Family of Guanine Nucleotide-Binding Proteins that Actívate Cholera Toxin and Regúlate Vesicular Transport", páginas 257-280 en Handbook of Natural Toxins : Bacterial Toxlns and Virulence Factors in Disease Vol . 8 (Moss, J. , et al., eds . , Marcel Dekker, Inc., New York, NY 1995) ) . La administración conjunta de CT con un antlgeno no relacionado se ha informado que genera en la inducción de respuestas de anticuerpos circulantes y mucosales concurrentes hacia el antígeno (Mekalanos, J.J., et al., 1983 Nature, 306, 551-557) . Para minimizar la presentación de síntomas indeseables tales como diarrea provocada por CT de tipo silvestre en los humanos, sería preferible utilizar como un adyuvante una forma de la holotoxina CT que tenga una toxicidad sustancialmente reducida. Se han sugerido imitantes de CT como un medio para obtener un adyuvante más útil. Una manera de diseñar racionalmente holotoxinas de la toxina del cólera mutante (CT-CRM) con toxicidad reducida sustancialmente, es identificar y alterar los residuos aminoácidos en las moléculas de toxina que se conservan por completo en la familia del cólera (CT) y las enterotoxinas termolábiles relacionadas (LT-I, LT-IIa y LT-IIb) de E. coli. Otra forma razonada de generar los CT-CRM mutantes con toxicidad sustancialmente reducida es alterar los residuos aminoácidos en la molécula de holotoxina que se hayan identificado como importantes para la unión de NAD en base en su alineación estructural de la estructura principal de CT con la estructura principal de toxinas relacionadas que posean actividad de la enzima ADP-ribosiltransferasa tales como la toxina de difteria (DT) y la toxina pertusis (PT) (Holmes, R. K. , "Heat-labile enterotoxins (Escherichia coli) " en Guidebook to Protein Toxins and their Use in Cell Biology, Montecucco, C. y Rappnoli, R. , Eds . , Oxford Univ. Press, Oxford, Inglaterra (1997) ; y Holmes, R. K. et al, "Cholera toxins and related enterotoxins of Gram-negative baceria", pp. 225-256 en Handbook of Natural Toxins: Bacterial Toxins and Virulance Factors in Disease, vol . 8, Moss, J., et al., Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, NY 1995). Recientemente se ha descrito un mutante de CT destoxificado genéticamente y diseñado de manera razonada, en donde se ha introducido una única sustitución en una secuencia de aminoácidos no conservadora (ácido glutámico a histidina) al alterar el aminoácido en la posición 29 en la subunidad A madura (denominado como CT-CRME29H) ¦ La holotoxina de cólera mutante resultante demuestra una toxicidad enzimática sustancialmente reducida, pero con propiedades superiores adyuvantes e inmunogénicas (Publicación de patente internacional No. O 00/18434, incorporada en su totalidad como referencia) . Por lo tanto, existe la necesidad de identificar y diseñar razonadamente formas mutantes adicionales de la holotoxina CT que tengan una toxicidad sustancialmente reducida pero que posean propiedades adyuvantes iguales o mejoradas en comparación con la holotoxina CT de tipo silvestre . SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto, esta invención proporciona formas inmunogénicas novedosas de un mutante de holotoxina de cólera (CT-CRM) que tiene una toxicidad reducida de manera significativa en comparación con una CT de tipo silvestre, pero el cual retiene la capacidad para funcionar como estimuladores poderosos del sistema inmunológico . Específicamente, la invención pertenece a cinco holotoxinas de cólera mutantes (CT-CRM) , generados de manera deseable por mutagénesis dirigida al sitio y que tienen toxicidad sustancialmente reducida en comparación con CT de tipo silvestre, pero sin pérdida en las propiedades adyuvantes. En una modalidad, una CT-CRM novedosa de esta invención comprende la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de CT o un fragmento de la misma, en donde el residuo aminoácido en la posición 16 de aminoácidos de la subunidad A está sustituido con otro aminoácido, sustitución la cual resulta en una reducción sustancial en la toxicidad.

En una modalidad preferida de la invención, el aminoácido isoleucina en la posición de aminoácido 16 de la subunidad A se sustituye con una alanina. Para determinación de la posición de aminoácido, la secuencia de CT-A se ejemplifica en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2. Sin embargo, también se pueden utilizar otras variantes y fragmentos de CT-A. En otra modalidad, una CT-CRM novedosa de esta invención comprende la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de CT o un fragmento de la misma, en donde el residuo aminoácido en la posición de aminoácido 72 de la subunidad A está sustituido con otro aminoácido, sustitución la cual resulta en una reducción sustancial en la toxicidad. En una modalidad preferida de la invención, el aminoácido valina en la posición de aminoácido 72 de la subunidad A está sustituido con una tirosina. En otra modalidad, una CT-CRM mutante inmunogénica novedosa de esta invención tiene toxicidad CT sustancialmente reducida y comprende la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de CT o un fragmento de la misma, en donde ambos residuos aminoácidos en las posiciones de aminoácidos 16 y 68 en la subunidad A están sustituidos con aminoácidos diferentes a los que se encuentran en las posiciones de aminoácidos 16 y 68 de CT de tipo silvestre, sustituciones las cuales resultan en una reducción sustancial en la toxicidad. En una modalidad preferida de este aspecto de la invención, el aminoácido alanina está sustituido por isoleucina en la posición de aminoácido 16 en la subunidad A, y el aminoácido tirosina está sustituido por serina en la posición de aminoácido 68 en la subunidad A. En otra modalidad adicional, una CT-CRM mutante inmunogénica novedosa de esta invención tiene toxicidad CT sustancialmente reducida y comprende la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de CT o un fragmento de la misma, en donde ambos residuos aminoácidos en las posiciones de aminoácidos 68 y 72 en la subunidad A están sustituidos con aminoácidos diferentes de los que se encuentran presentes en las posiciones de aminoácidos 68 y 72 de CT de tipo silvestre, sustituciones las cuales resultan en una reducción sustancial en la toxicidad. En una modalidad preferida de este aspecto de la invención, el aminoácido tirosina está sustituido por serina en la posición de aminoácido 68 de la subunidad A y el aminoácido tirosina está sustituido por valina en la posición de aminoácido 72 de la subunidad A. En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir las CT-CRM novedosas descritas antes mediante la utilización de mutagénesis dirigida al sitio del ADN que codifica para la subunidad A en la CT de tipo silvestre utilizando técnicas convencionales tales como la CT mutagenizada la cual ahora tiene una toxicidad sustancialmente reducida sin perjudicar la capacidad de la toxina para estimular una respuesta inmunológica. En otro aspecto adicional de la invención se proporciona una composición inmunogénica que comprende un antígeno seleccionado, una CT-CR mutante como se describe en lo anterior como un adyuvante para mejorar la respuesta inmunológica en un hospedador vertebrado para el antígeno, y un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente •aceptable. Preferiblemente, la CT-CRM es útil para la generación o mejoramiento de las respuestas inmunológicas antigénicas sistémicas o mucosales, o ambas en un hospedador vertebrado para el antígeno seleccionado. El antígeno seleccionado puede ser un polipeptido, péptido o un fragmento derivado de un virus, bacteria, hongo o parásito patogénico. El antígeno seleccionado puede ser un polipéptido, péptido o fragmento derivado de una célula cancerosa o célula tumoral . El antígeno seleccionado puede ser un polipéptido, péptido o fragmento derivado de un alérgeno en la medida en que interfiera en la producción de IgE de manera que modere las respuestas alérgicas al alérgeno. El antígeno seleccionado puede ser un polipéptido, péptido o fragmento derivado de una porción molecular del mismo el cual representa a aquellos producidos por un hospedador (una molécula propia) de una manera, cantidad o ubicación no deseadas de manera que formen una proteína precursora amiloide de manera que impida o que trate enfermedades caracterizadas por deposición amiloide en un ospedador vertebrado . En otro aspecto adicional, esta invención proporciona un método para utilizar estas CT-CRM como adyuvantes en composiciones inmunogénicas o métodos para incrementar la capacidad de una composición antigénica que contiene un antigeno seleccionado como se describe en lo anterior para inducir una respuesta inmunológica en un hospedador vertebrado al incluir una cantidad adyuvante eficaz de una o más de las holotoxinas de cólera mutante destoxificadas novedosas (CT-CRM) descritas antes. En un aspecto adicional de la invención, se proporcionan secuencias de ADN que codifican para las CT-CRM mutantes inmunogénicas novedosas con toxicidad sustancialmente reducida como se describe en lo anterior. De manera preferible, una o varias de las secuencias de ADN codifican tanto para la subunidad A mutante con toxicidad reducida como con la subunidad B. De manera alternativa, la secuencia de ADN puede codificar únicamente para la subunidad A mutante con toxicidad reducida, en donde la CT-A alterada o mutante se fusiona con un dominio de unión adicional o se expresa de manera conjunta con LT-B y se permite que se ensamblen de manera conjunta. En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un plásmido que contiene una secuencia aislada y purificada de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica para una holotoxina de cólera mutante destoxificada e inmunogénica como se describe en la presente y en donde tal secuencia de ADN está unida operativamente a secuencias reguladoras que dirigen la expresión de la CT-CRM en una célula hospedadora. Preferiblemente, las secuencias reguladoras comprenden un promotor inducible por arabinosa. En una modalidad de este aspecto, la invención se relaciona con un plásmido, denominado pLP903 que contiene una secuencia de ADN aislada y purificada que comprende una secuencia de ADN que codifica para una CT-CRM mutante inmunogénica con toxicidad sustancialmente reducida en donde el aminoácido alanina está sustituido por isoleucina en la posición de aminoácido 16 de la subunidad A. En una segunda modalidad de este aspecto, la invención se relaciona con un plásmido, denominado pLP905, que contiene una secuencia de ADN aislada y purificada que comprende una secuencia de ADN que codifica para una CT-CRM mutante inmunogénica con toxicidad sustancialmente reducida, en donde el aminoácido tirosina está sustituido por valina en la posición de aminoácido 72 en la subunidad A. En una tercera modalidad de este aspecto, la invención se relaciona con un plásmido denominado pLP904 que contiene una secuencia de ADN aislada y purificada que comprende una secuencia de ADN que codifica para una CT-CRM mutante inmunogénica con toxicidad sustancialmente reducida, en donde el aminoácido alanina está sustituido por isoleucina en la posición de aminoácido 16, y el aminoácido tirosina está sustituido por serina en la posición de aminoácido 68 en la subunidad A. En una modalidad adicional de este aspecto, la invención se relaciona con un plásmido, denominado pLP906 que contiene una secuencia de ADN aislada y purificada que comprende una secuencia de ADN que codifica para una CT-CRM mutante inmunogénica con toxicidad sustancialmente reducida, en donde el aminoácido tirosina está sustituido por serina en la posición de aminoácido 68 y el aminoácido tirosina está sustituido por valina en la posición de aminoácido 72 en la subunidad A. En un aspecto adicional de la invención se proporciona una línea de células hospedadoras adecuadas transformadas, infectadas, sometidas a transducción o transfectadas con un plásmido como se describe en la presente. Las holotoxinas de cólera imitantes destoxificadas e inmunogénicas se producen por transformación, infección, transducción o transfección de una célula hospedadora con uno de los plásmidos descritos en lo anterior y cultivo de la célula hospedadora bajo condiciones de cultivo que permiten la expresión por la célula hospedadora de la proteina de holotoxina de cólera mutante inmunogénica y recombinante con toxicidad sustancialmente reducida. Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes para una persona experta en la técnica ante la lectura de la siguiente descripción detallada de la invención. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION Se describen en la presente formas mutantes de holotoxina de cólera que muestran toxicidad reducida pero las cuales retienen sus propiedades adyuvantes superiores y la utilidad de estas formas mutantes de las CT como adyuvantes en composiciones inmunogénicas .

A. Holotoxinas de toxina de cólera destonificadas mutantes Las formas inmunogénicas destoxificadas mutantes novedosas de la holotoxina de cólera (CT-CRM) de esta invención están caracterizadas por toxicidad reducida de manera significativa en comparación con la CT de tipo silvestre. Sin embargo, tales CT-CRM retienen su capacidad como estimuladores poderosos del sistema inmunológico . Las CT-CRM de esta invención se caracterizan por una de varias sustituciones o inserciones de aminoácidos en la subunidad CT-A madura de la toxina del cólera. Las diversas subunidades CT-A mutantes de esta invención también retienen su capacidad para ensamblarse con las subunidades CT-B para formar holotoxinas CT mutantes que recuerdan a la CT de tipo silvestre en su capacidad adyuvante, pero que muestran una toxicidad reducida sustancialmente en comparación con la CT de tipo silvestre. Las CT-CRM de esta invención pueden utilizar las subunidades CT-A mutantes o alteradas relacionadas con las subunidades CT-B de tipo silvestre para generar una holotoxina funcional. De manera alternativa, las CT-CRM de esta invención pueden comprender las subunidades CT-A alteradas o mutadas asociadas con subunidades CT-B alteradas o mutadas. Para la determinación de los números de posición de aminoácidos que describen los lugares de las sustituciones o inserciones de aminoácidos en las CT-CRM de esta invención, la secuencia de la CT-A madura se ejemplifica como la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, es decir, los aminoácidos 19-258 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1, una secuencia CT de tipo silvestre. La secuencia nucleotídica que codifica para la subunidad A de la holotoxina de cólera se establece en la publicación de patente internacional No. WO 93/13202. De manera similar, una secuencia CT-B madura adecuada se puede ilustrar por los aminoácidos 280-382 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1. Sin embargo, también se pueden utilizar otras variantes, biotipos y fragmentos de CT-A y CT-B de V. cholerae como secuencias que contienen las sustituciones e inserciones de aminoácidos que se describen en la presente . Véase, por ejemplo, el ELTOR biotype de C. Shi et al, 1993 Sheng Wu Hua Hsueh Tsa Chih, 9 (4) ·.395-399; NCBI base de datos locus No. AAC34728 y las otras fuentes de variantes de la toxina de V. cholerae. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos resultan en que algunas de las CT-CRM de esta invención son el resultado de la sustitución de un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales o químicas similares, es decir, sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las sustituciones o inserciones "conservadoras" de aminoácidos se pueden realizar en base en la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad o la naturaleza anfipática de los residuos involucrados. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, triptófano y metionina; los aminoácidos polares/neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspartico y ácido glutámico. Esta invención se ejemplifica por las CT-CRM, que tienen una sustitución de un solo aminoácido, ya sea en la posición de aminoácido 16 o en la posición de aminoácido 72, o una sustitución de aminoácidos doble en las posiciones de aminoácidos 16 y 68 o 68 y 72, como se resume en la tabla 1.

Tabla 1: Mutantes de CT-CRM sencillas y dobles De este modo, en una modalidad, una CT-CRM novedosa de esta invención comprende la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de CT o un fragmento de la misma, en donde el residuo aminoácido en la posición de aminoácido 16 de la subunidad A está sustituido con otro aminoácido, sustitución la cual resulta en una reducción sustancial en la toxicidad. En una modalidad preferida de la invención, el aminoácido isoleucina en la posición de aminoácido 16 de la subunidad A está sustituido con alanina. Esta CT-CRMH6A demuestra propiedades adyuvantes superiores. En otra modalidad, una CT-CRM novedosa de esta invención comprende la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de CT o un fragmento de la misma, en donde el residuo aminoácido en la posición de aminoácido 72 de la subunidad A está sustituido con otro aminoácido, sustitución la cual resulta en una reducción sustancial en la toxicidad. En una modalidad preferida de la invención, el aminoácido valina en la posición de aminoácido 72 de la subunidad A está sustituido con una tirosina, lo que resulta en CT-CRMV72Y- Esta CT-CRMV72Y demuestra propiedades adyuvantes superiores. En otra modalidad, una CT-CRM imitante inmunogénica novedosa de esta invención tiene una toxicidad CT reducida sustancialmente y comprende la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de CT o un fragmento de la misma, en donde ambos residuos aminoácidos en las posiciones de aminoácidos 16 y 68 en la subunidad A están sustituidos con aminoácidos diferentes de aquellos que se encuentran en las posiciones de aminoácidos 16 y 68 de la CT de tipo silvestre, sustituciones las cuales resultan en una reducción sustancial en la toxicidad. En una modalidad preferida de este aspecto de la invención, el aminoácido alanina está sustituido por isoleucina en la posición de aminoácido 15 en la subunidad A, y el aminoácido tirosina está sustituido por serina en la posición de aminoácido 68 en la subunidad A, lo que resulta en CT-CRMi16A(S68Y/ la cual demuestra propiedades adyuvantes superiores . En otra modalidad adicional, una CT-CRM mutante inmunogénica novedosa de esta invención tiene toxicidad de CT sustancialmente reducida y comprende la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de CT o un fragmento de la misma, en donde ambos residuos aminoácidos en las posiciones de aminoácidos 68 y 72 en la subunidad A están sustituidos con aminoácidos diferentes a los que se encuentran en las posiciones de aminoácidos 68 y 72 de la CT de tipo silvestre, sustituciones las cuales resultan en una reducción sustancial en la toxicidad. En una modalidad preferida de este aspecto de la invención, el aminoácido tirosina está sustituido por serina en la posición de aminoácido 68 de la subunidad A, y el aminoácido tirosina está sustituido por valina en la posición de aminoácido 72 de la subunidad A. Esta CT-CRMS68Y,V72Y demuestra propiedades adyuvantes superiores. Se determinaron los efectos fenotípicos de las CT-CR novedosas de la- tabla 1 en la estructura y función de la CT. Las subunidades ? mutantes generadas por mutagénesis dirigida al sitio del gen que codifica para CT también son adecuadas para ensamblarse en una holotoxina inmunorreactiva en presencia de la subunidad B, como se determina por un ensayo de electroforesis en gel no desnaturalizante (véase tabla 3, ejemplo 2) . Cada holotoxina mutante también se prueba en un ensayo de célula tumoral suprarrenal Y-l para determinar su toxicidad residual en comparación con la holotoxina CT de tipo silvestre (véanse tablas 4 y 5, ejemplo 3) . Los resultados que se presentan en la tabla 4 demuestran que las CT-CRM mutantes tienen una toxicidad reducida sustancialmente cuando se comparan con la holotoxina del cólera de tipo silvestre. Las toxicidades residuales de las CT-CRM con sustituciones de aminoácidos sencillas o dobles se reducen sustancialmente en comparación con las de CT de tipo silvestre . Cada una de las CT-CRM mutantes también se compara con la CT de tipo silvestre en un ensayo de actividad de ADP-ribosiltransferasa (véase e emplo 4) . Los resultados, los cuales generalmente concuerdan con los datos de toxicidad generados en el ensayo de células suprarrenales Y-1, indican que la actividad de ADP-ribosiltransferasa de las diversas CT-CRM disminuye sustancialmente cuando se comparan con la CT de tipo silvestre (tabla 6) . El mutante con la actividad más grande de ADP-ribosiltransferasa parece ser el mutante doble CT-CRMH6A,S68Y¦ Esta actividad es aproximadamente solo 3.3% la de la CT de tipo silvestre. La actividad enzimática de las CT-CRM, C -CRMv72Y/ CT-CRMI16A y CT-CRMSS8Y,V72Y, fueron de 1.1%, 2.4% y 1.2%, respectivamente, en comparación con la actividad de la CT de tipo silvestre. Otras CT-CRM adicionales de esta invención pueden contener por lo menos una sustitución única o mutaciones sencillas o dobles descritas específicamente en lo anterior y por lo menos una mutación adicional en una posición diferente a uno o más de los residuos aminoácidos 16, 68 ó 72, como se establece en lo anterior. La publicación de patente internacional No. WO 93/13202, la cual se incorpora en la presente como referencia, describe una serie de mutaciones en la subunidad CT-A que sirve para reducir la toxicidad de la holotoxina de cólera. Estas mutaciones incluyen realizar sustituciones para la arginina en el aminoácido 7, el ácido aspártico en la posición 9, la arginina en la posición 11, el ácido glutámico en la posición 9, la histidina en la posición 44, la valina en la posición 53, la arginina en la posición 54, la serina en la posición 61, la serina en la posición 63, la histidina en la posición 70, la valina en la posición 97, la tirosina en la posición 104, la prolina en la posición 106, la histidina en la posición 107, el ácido glutámico en la posición 110, el ácido glutámico en la posición 112, la serina en la posición 114, el triptóf no en la posición 127, la arginina en la posición 146 y la arginina en la posición 192. La publicación de patente internacional No. WO 98/42375, la cual se incorpora en la presente como referencia, describe la realización de una sustitución por la serina en el aminoácido 109 en la subunidad A, lo que sirve para reducir la toxicidad de la holotoxina del cólera. Otras proteínas mutantes de CT-CRM útiles que sirven en esta invención incluyen una holotoxina de longitud completa con una o más mutaciones específicas proporcionadas antes, un polipéptido o un fragmento de la misma que contiene los residuos mutagenizados descritos antes y proteína, polipéptido o fragmentos los cuales retienen la capacidad adyuvante de la CT de tipo silvestre a partir de la cual se derivan, pero se caracterizan por toxicidad reducida. Los fragmentos inmunológicamente activos de estas CT-CRM con actividad enzimática reducida también pueden ser útiles en los métodos y composiciones de esta invención. Los fragmentos ¦ abitualmente contendrán por lo menos aproximadamente 25 aminoácidos contiguos de las proteínas de CT-CRM que contienen los sitios de mutagénesis indicados antes. De manera más típica, un fragmento de subunidad de CT-CRM contiene por lo menos aproximadamente 75 aminoácidos contiguos. Otro fragmento de una subunidad CT-CRM contiene por lo menos aproximadamente 100 aminoácidos contiguos. Otra modalidad adicional de una subunidad A de CT-CRM puede contener por lo menos aproximadamente 150 aminoácidos contiguos en longitud. Un fragmento de las CT-CRM descritas en la presente es útil en los métodos y composiciones descritas en lo siguiente si genera o aumenta la respuesta inmunológica a antígenos seleccionados en un hospedador vertebrado. Los fragmentos incluyen cortes de la región carboxi terminal de las subunidades CT-CRM. Por ejemplo, una CT-CRM truncada de manera que contenga únicamente una subunidad mutante CT-A es un fragmento deseable. De manera similar, son fragmentos deseables las subunidades CT-A truncadas en aproximadamente los residuos 240 ó 250. Se pueden seleccionar otros fragmentos adicionales de las CT-CRM de esta invención. Los fragmentos adicionales de la holotoxina CT-CRM pueden contener menos de 5 repeticiones de las subunidades CT-B o las subunidades CT-B truncadas. Los fragmentos anteriores también pueden contener una o más de las mutaciones específicas descritas antes. Otras proteínas CT-CRM adecuadas pueden incluir aquellas en las cuales uno o más de los residuos aminoácidos incluyen un grupo sustituido. Otra proteína de holotoxina CT-CRM adecuada adicional es una en la cual el polipéptido CT-CRM se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol) . Otra proteína CT-CRM adecuada es una en la cual los aminoácidos adicionales se fusionan al polipéptido, tal como un líder o una secuencia secretora, o una secuencia la cual se utiliza para aumentar la inmunogenicidad de la proteína CT-CRM. Otras modificaciones adicionales de las CT-CRM incluyen la supresión mencionada antes de las secuencias de señal o líder de CT-A en la parte N terminal de CT, es decir, los aminoácidos 1-18 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1-18 o la supresión de la secuencia señal o líder de CT-B, es decir, en los aminoácidos 259-279 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1, o la supresión de otras regiones que no alteren la inmunogenicidad. De manera similar, una modificación de las CT-CRM descritas en la presente incluyen sustituir las secuencias de señal o líder con otras secuencias de señal o líder. Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,780,601, incorporada como referencia en la presente . Otro ejemplo adicional de proteínas CT-CR adecuadas son aquellas en las cuales los aminoácidos opcionales (por ejemplo -Gly-Ser-) u otro aminoácido o separadores de compuestos químicos se pueden incluir en las partes terminales del polipéptido con el propósito de enlazar proteínas de holotoxina múltiples juntas o a un portador. Por ejemplo, las CT-CRM útiles pueden incluir una o más de las CT-CRM descritas en lo anterior acopladas a una proteína portadora. De manera alternativa, una CT-CRM útil puede estar presente en una proteína de fusión que contenga las CT-CRM múltiples, acoplado opcionalmente a una proteína portadora. Para estas modalidades, la proteína portadora de manera deseable es una proteína u otra molécula que puede mejorar la inmunogenicidad de la CT-CRM seleccionada. Tal portador puede ser una molécula más grande que también tenga un efecto adyuvante. Las proteínas portadoras convencionales ejemplares incluyen, sin limitación, la proteína DnaK de E. coli, galactosinasa (GalK, la cual cataliza la primera etapa del metabolismo de galactosa en bacterias) , ubiquitina, factor de acoplamiento a, galactosidasa ß y la proteína NS-1 de influenza. También se pueden utilizar como portadores toxoides (es decir, la secuencia que codifica para la toxina que se presenta de manera natural, con modificaciones suficientes para eliminar su actividad tóxica) , tal como el toxoide de difteria y el toxoide de tétanos, sus toxinas respectivas y cualquier forma mutante de estas proteínas tales como CRMi97 (una forma no tóxica de toxina de difteria, véase la patente de E.U.A. No. 5,614,382). Otros portadores incluyen la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, las toxinas termolábiles de ?. coli y las partículas rotavirales (que incluyen al rotavirus y partículas VP6) . De manera alternativa, se puede utilizar un fragmento o epítopo de la proteína portadora u otra proteína inmunogénica. Por ejemplo, se puede acoplar un hapteno a un epítopo de linfocito T de una toxina bacteriana. Véase la patente de E.U.A. No. 5,785,973. De manera similar se pueden utilizar una variedad de proteínas bacterianas de choque térmico, por ejemplo, hsp-70 micobacteriana . La glutation-S-transferasa (GST) es otro portador útil. Una persona experta en la técnica puede seleccionar con facilidad un portador apropiado para uso en este contexto. Las proteínas de fusión se pueden formar por técnicas estándar para acoplamiento de materiales proteináceos . Las fusiones se pueden expresar a partir de constructos (plásmidos recombinantes o montajes) preparados por técnicas de ADN recombinante, como se describe en lo siguiente.

Otras CT-CRM adecuadas descritas en la presente pueden diferir de las CT-CRM e emplificadas de manera especifica por modificaciones que no reactivan la toxicidad enzimática y que no disminuyan su capacidad adyuvante o por combinaciones de tales atributos. Por ejemplo, se pueden realizar cambios conservadores de aminoácidos los cuales, aunque pueden alterar la secuencia primaria de las subunidades de la proteína CT-CRM, que normalmente alteran su función. Al realizar tales cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir la función biológica interactiva en un polipéptido generalmente se entiende en la técnica (Kyte & Doolitle, 1982, «J. Mol. Biol., 257(1) : 105-32) . Se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tengan un índice o calificación hidropática similar y aún así resultar en un polipéptido con actividad biológica similar. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en base en su hidrofobicidad y características de carga. Estos índices son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5) . Se considera que el carácter hidropático relativo del residuo aminoácido determina la estructura secundaria y terciaria del polipéptido resultante que a su vez define la interacción del polipéptido con otras moléculas, tales como enzimas, sustratos, receptores, anticuerpos, antigenos y similares. Se conoce en la técnica que un aminoácido puede estar sustituido por otro aminoácido que tenga un índice hidropático similar y aún así obtener un polipéptido funcionalmente equivalente. En tales cambios, la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de +/-2 son los que se prefieren, prefiriéndose adicionalmente aquellos dentro de +/-1 particularmente y de manera mucho más particularmente preferida aquellos dentro de +/- 0.5. La sustitución o inserción de aminoácidos similares también se puede realizar en base en la hidrofilicidad, particularmente cuando el polipéptido equivalente biológicamente funcional o el péptido creado de esta manera se diseña para uso en modalidades inmunológicas . La patente de E.U.A. No. 4,554,101, incorporada en la presente como referencia, establece que la mayor hidrofilicidad promedio local de un polipéptido, gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se relaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica del polipéptido.

Como se detalla en la patente de E.U.A. No. 4,554,101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos aminoácidos: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0+1); glutamato (+3.0+1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0) ; prolina (-0.5+_l); treonina (-0.4); alanina (-0"i5) ; histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); triptófano (-3.4). Se entiende que el aminoácido puede estar sustituido por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y aún así obtener un polipéptido biológicamente equivalente y, en particular, uno inmunológicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de +2 ; se prefieren particularmente aquellos dentro de +_1; y se prefieren de manera más particular aquellos dentro de +0.5. Como se indica en lo anterior, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño -y similares. Las sustituciones ejemplares las cuales adquieren diversas de las características siguientes en .^consideración son bien conocidas por aquellos familiarizados en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina . Además, las modificaciones las cuales normalmente no alteran la secuencia primaria de la proteina CT-CRM incluyen la formación de derivados químicos in vivo e in vitro de polipéptidos, por ejemplo, acetilación, metilación o carboxilación. También se incluyen como las CT-CRM de esta invención las proteínas modificadas por glucosilación, por ejemplo aquellas elaboradas al modificar los patrones de glucosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento en etapas de procesamiento adicionales, o bien, por exposición del polipéptido a enzimas que afectan la glucosilación, tal como las enzimas glucosilantes o desglucosilantes de mamífero. También se abarcan como las CT-CRM aquellas secuencias mutagenizadas identificadas en lo anterior las cuales tienen residuos aminoácidos fosforilados , por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina . También se incluyen como las CT-CRM de esta invención aquellas secuencias que se han modificado utilizando técnicas biológicas moleculares habituales de manera que se mejore su resistencia a la degradación proteolítica o se optimicen las propiedades de solubilidad. Entre tales CT-CRM se incluyen aquellas que contienen residuos diferentes a los L-aminoácidos que se presentan de manera natural, por ejemplo los D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos que no se presentan de manera natural. Entre otras modificaciones conocidas las cuales pueden estar presentes en las CT-CRM de la presente invención están, sin limitación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalante de una porción hemo, unión covalente de un nucleótido o de un derivado nucleotidico, unión covalente de un lípido o un derivado lipídico, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulado, ciclización, formación de un enlace disulfuro, desmetilación, formación de enlaces reticulados covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, formación de un ancla GPI , hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos mediada por ARN de transferencia a proteínas tales como arginilación y ubiquitinación. Las CT-CRM imitantes de esta invención de esta manera son holotoxinas y muestran toxicidad reducida o son sustancialmente menos tóxica que la CT de tipo silvestre. Como se utiliza en la presente, los términos y frases "la holotoxina tiene toxicidad reducida" o "sustancialmente menos tóxica" o similar significa que el mutante de CT-CRM de esta invención, tales como los cuatro imitantes de CT-CRM descritos en la presente (CT-CRMI16A, CT-CRMV72Y, CT-CRMI16¾)S68Y) , muestran una toxicidad sustancialmente menor por unidad de proteínas de toxina purificadas en comparación con la CT de tipo silvestre. Esta "toxicidad reducida" permite que cada mutante se utilice como un adyuvante en una composición inmunogénica sin provocar efectos colaterales significativos, particularmente aquellos conocidos como relacionados con CT, por ejemplo, diarrea. Como se describe con mayor detalle en lo siguiente, las CT-CRM mutantes de esta invención muestran niveles significativamente menores de toxicidad en comparación con la CT de tipo silvestre en el ensayo de célula suprarrenal de ratón Y-l, y una actividad de ADP-ribosil transferasa reducida significativamente cuando se comparan con CT de tipo silvestre. Las CT-CRM mutantes inmunogénicas de acuerdo con la presente invención muestran un equilibrio de toxicidad reducida y capacidad adyuvante retenida, de manera que la proteína CT mutante resultante funciona como un adyuvante mientras es tolerada de manera segura por el hospedador vertebrado en el cual se introduce. Como se indica en los Ejemplos siguientes, los resultados en los sistemas de ensayo de modelo murino indican que las CT-CRM mutantes descritas en la presente son capaces de aumentar significativamente las respuestas inmunológicas de mucosa y sistémicas después de administración intranasal de antígenos disparados. Además, incluso en presencia de respuestas inmunológicas preexistentes contra CT, las CT-CRM mutantes son capaces de servir como adyuvantes mucosales eficientes . Los estudios que soportan estas características de las CT-CRM de esta invención se resumen a continuación y de manera más especifica se establecen en los Ejemplos. Para evaluar la eficacia de la CT-CRM mutantes como adyuvantes de mucosa para composiciones que contienen antigenos bacterianos o virales que se han identificado como candidatos para inclusión en composiciones inmunogénicas, se examinan tres sistemas de antígeno de modelo disparado: (1) la protelna de membrana exterior P4 recombinante (también conocida como proteína "e" (rP4) ) de la bacteria no tipificable Haemophilus influenzae (NTHi) , (véase la patente de E.U.A. No. 5,601,831), (2) la proteína de membrana exterior UspA2 nativa de la bacteria Moraxella catarrhalis (publicación de patente internacional No. O 98/28333), y (3) la glucoproteína de fusión nativa (proteína F) del virus sincitial respiratorio (RSV, por sus siglas en inglés) (véase patente de E.U.A. Número 5,223,254). Las CT-CRM mutantes se comparan entre si y las CT-CRME2SH y la CT de tipo silvestre como un adyuvante para la NTHi rP4. En un primer estudio , se determinó la capacidad adyuvante de CT-CRMneA imitante para mejorar la inducción de anticuerpos sistémicos o de mucosa a rP4 y se comparó con la CT de tipo silvestre y con la CT-C ME29H- Los resultados indican que la CT-CRMIL6A al igual que la CT de tipo silvestre y CT-CRME29H aumentan la capacidad de la proteína rP4 para inducir respuestas inmunológicas sistémicas y humorales (véanse tablas 8 y 9) . Por ejemplo, seis semanas después de una inmunización IN terciaria, los títulos de anticuerpos IgG contra rP4 de ratones inmunizados con proteina rP4 formulados ya sea con CT-CRM SA o CT-CRME29H son 40 veces mayores que los de ratones inmunizados con las proteínas recombinantes únicamente con PBS . Los títulos de anticuerpos (IgG) de los ratones a los que se les administró la proteína recombinante más la holotoxina CT de tipo silvestre a una concentración de 1 /xg se elevan 67 veces en - comparación con los títulos de anticuerpo en ratones a los que se les administra rP4 recombinante solo en solución salina, seis semanas después de la inmunización IN primaria. Los títulos de anticuerpos de ratones inmunizados con 1 ¿tg del mutante CT-CRME29H se elevan 48 veces con respecto a los títulos de anticuerpo en ratones inmunizados únicamente con rP4. En comparación, los títulos de anticuerpos de los ratones inmunizados con 1 ¿¿g y 0.1 ^g del mutante CT-CRMI16A aumentan 15 veces y 27 veces, respectivamente, con respecto a los títulos de anticuerpo contra rP4 en ratones inmunizados únicamente con rP4 en solución salina. Un examen de los anticuerpos específicos para proteína en las secreciones de mucosa dos semanas después de la inmunización terciaria indican además que CT-CRMI16A facilita la generación de respuestas inmunológicas locales contra la proteína rP . Además, los títulos de anticuerpos contra rP4 son comparables con aquellos inducidos por composición inmunogénica que tiene como adyuvante a CT tipo silvestre (tabla 9) . Para probar y comparar los efectos adyuvantes de las CT-CRM mutantes en formulaciones que contienen 1 /¿g de una de las CT-CRM mutantes (CT-CR USA, CT-CR H6A,S68Y, CT-CRMV72Y y CT-CRMS68Y,V72Y) con una formulación que contiene 1 xg de rP4 y 1 µ.<3 de CT-CR E29H o 1 Mg de rP4 solo, con solución salina. Las diversas composiciones se administraron por vía intranasal a ratones BALB/c hembra y se midieron los títulos de IgG e IgA contra rP4 en las semanas 3 y 5 , y en la semana 5, día 6. Los datos sugieren que las CT-CRM, CT-CRMI16A y CT-CRMV72Y son tan potentes como CT-CRME29H, en inducir una respuesta de anticuerpos tanto sistémica como de mucosa contra rP4 (tablas 10 y 11) . Los títulos séricos de IgG del anticuerpo contra rP4 inducidos por la formulación que contiene rP4 y CT-CRMnSA en la semana 5, día 6, son 22 veces mayores que los inducidos únicamente por rP4 y la mitad de los niveles de IgG inducidos por CT-CRME29H- Sin embargo, los títulos de IgG sérica del anticuerpo contra rP4 inducido por la formulación que contiene rP4 y CT-CRMV72Y es 1.2 veces mayor que el inducido por CT-CRME29H y 53 veces mayor que el inducido únicamente por rP4. Aunque los títulos de IgG específicos para rP4 inducidos por CT-CRMH6A,S68Y y CT-CRMSS8YIV72Y son únicamente de manera aproximada un quinto de los inducidos por CT-CRMiis¾ y CT-CR V72Y, estos niveles aún son significativamente mayores que los inducidos por rP4 administrada únicamente con solución salina. Los títulos de anticuerpos IgA específicos para proteína en los sueros de ratones inmunizados con CT-CRM, CT- CRMI16A, CT-CRMIieA,Ss8Y, CT-CRMV72Y y CT-CRMSFI8Y,V72Y son de 6 a 23 veces mayores que aquellos de ratones inmunizados IN únicamente con rP4. Los títulos de anticuerpos IgA específicos para proteína en el lavado bronquealveolar, lavado nasal, saliva y lavado vaginal de ratones inmunizados con las CT-CRM, CT-CRMI16A, CT-C MIX6A,SS8Y, CT-CRMV72Y y CT-CRMS68Y;V72Y son comparables con los niveles de IgA en los acumulados de lavado de mucosa de ratones inmunizados con CT-CRME29H/ pero significativamente mayores que aquellos de ratones inmunizados únicamente con rP4 (véase tabla 11) . En el estudio anterior, también se determinaron los títulos de anticuerpos contra rP4 en el suero de cada ratón individual en los seis grupos. De manera específica, 41 días después de la administración IN, se determinaron por ELISA los títulos de criterio de valoración de IgA e IgG que incluyen IgG subclases IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3. Los resultados indican que los títulos de IgA y las subclases de IgG en cada ratón individual que recibieron la formulación que contiene rP4 y cualquiera de las cuatro CT-CRM mutantes es significativamente mayor que los títulos de IgA e IgG en animales que únicamente recibieron el antígeno rP4 en solución salina (véanse las tablas 12-17) . Los resultados indican además que los títulos de IgA e IgG en animales que reciben rP4 y una de las CT-CRM mutantes, CT-CRM, CT-CRMngA, CT-CRMI16A,ss8Y y CT-CRMV72Y son comparables con los títulos de IgA e IgG detectados en ratones que recibieron rP4 más CT-CRME29H · Se examinó la capacidad de las CT-CRM de la presente invención para aumentar las respuestas inmunológicas sistémicas y de mucosa contra las glucoproteínas del virus sincitial respiratorio (RSV, por sus siglas en inglés) utilizando la proteína de fusión (F) nativa purificada. Previamente, se demostró que ratones BALB/c inmunizados IN con proteína F que tiene como adyuvante CT o CT-CRME29H generan títulos de IgG e IgA sistémicos y locales (Tebbey et al, mencionado antes) . Este estudio también indica que los anticuerpos preexistentes contra CT no tienen un impacto negativo en el nivel de los anticuerpos IgA e IgG contra la proteína F locales o sistémicos. En realidad, el estudio indica que los anticuerpos contra CT preexistentes resultan benéficos para la generación de una respuesta aumentada de anticuerpo contra ' la proteína F. De manera adicional, los datos también sugieren un mecanismo que involucra la neutralización de virus infeccioso ya sea por inmunoglobulinas mucosales o humorales que son estimuladas en respuesta al protocolo de inmunización por IN que contiene F/CT-CRME29H - En este estudio, la proteína F purifcada (3 µg/dosis) , sola o en solución salina, o en una formulación que contiene 0.1 ó 1 /¿g de la CT de tipo silvestre, o 0.1 o 1 µ<3 de una de las CT-CRM mutantes (CT-CRME29H, CT-CRMI1SA, CT-CRMI15A<S68Y/ CT-CRMV72Y CT-CRMS68Y, VV2Y) se administra IN a ratones BALB/c. Se determinan los títulos de anticuerpos IgG e IgA específicos para la proteína en el lavado bronquioalveolar, lavado nasal y lavado vaginal de los ratones. Los títulos de anticuerpos IgG e IgA específicos para la proteína en el lavado broncoalveolar, lavado nasal y lavado vaginal de ratones inmunizados con 1 g de CT-CRMI16A, CT-CRMH6A,S68Y/ CT- CR v72Y o CT-CR S68Y, V72Y son comparables con los niveles de IgG e IgA en los acumulados de lavados de mucosa de ratones inmunizados con CT de tipo silvestre o con CT-CRME29H (véase la tabla 19) . Las concentraciones o niveles de IgG específicos para proteína en mucosa, en ratones inmunizados con 0.1 Mg de CT-CRMn6Aj CT-CRMH6AÍS68Y, CT-CRMV72Y O CT-CR S68Y, v72Y/ aunque significativamente superiores a los niveles detectados en ratones inmunizados con proteína F en solución salina, no obstante son de un tercio a un décimo menores que los niveles detectados en ratones inmunizados con 1 µg de las CT-CRM. En contraste, los niveles elevados significativamente de IgA en lavados de mucosa fueron observados únicamente en ratones inmunizados con 1 Mg de las CT-CRM mutantes. Se examinó la capacidad de las CT-CRM mutantes para aumentar la respuesta inmunológica sistémica y de mucosa en ratones contra la proteína de membrana exterior UspA2 nativa de M. catarrhalis. UspA2 purificada (5 µg/dosis), sola en 10 µ? de solución salina o en una formulación de 10 µ? que contiene 0.1 µ9/??3?? de una CT-CRM mutante (CT-CRME29H, CT-CRMUSA, CT-CRMn6A,s68Y/ CT-CRMV72Y O CT-CRMS68Y,V72Y) se administra IN los días 0, 7 y 14. Los niveles de IgG e IgA específicos para la proteína en el suero y en los lavados de mucosa se examinaron en el día 28. Se detectaron niveles de IgG e IgA estadísticamente significativos únicamente en el suero de animales inmunizados con CT-CRME29H CT-CRMI16A,SS8Y CT-CRMV72Y. Los niveles significativos de IgG también se detectaron en el lavado bronquial de animales inmunizados con CT-CRME29H, CT- CRMI1SA(S6BY CT-CRMV72Y- B. Moléculas de ácido nucleico que codifican para las CT-CRM Otro aspecto de esta invención incluye moléculas de ácido nucleico aisladas, sintéticas o recombinantes y secuencias que codifican para las CT-CRM descritas antes que tienen las mutaciones dirigidas al sitio, especificadas, o fragmentos que pueden contener adicionalmente una o más de dichas mutaciones . Una molécula aislada de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína CT-CRM que preferiblemente puede estar bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen la expresión de la CT-CRM en una célula hospedadora. Como se describe en la presente, tales moléculas de ácido nucleico se pueden utilizar para expresar la proteína CT-CRM in vi tro o para permitir la expresión de la proteína CT-CRM in vivo, en un humano . Como se utiliza en la presente, el término "molécula nucleotídica aislada o secuencia" se refiere a un segmento de ácido nucleico o un fragmento el cual está libre de contaminación con otros componentes biológicos que se pueden relacionar con la molécula o secuencia en su ambiente natural. Por ejemplo, una modalidad de una molécula nucleotídica aislada o una secuencia de esta invención es una secuencia separada a partir de secuencias las cuales flanquean en un estado que se presenta de manera natural, por ¦ejemplo, un fragmento de ADN el cual ha sido separado de las secuencias las cuales normalmente están adyacentes al fragmento, tales como las secuencias adyacentes al fragmento en un genoma en el cual se presenta de manera natural . Además, las secuencias nucleotídicas y moléculas de esta invención han sido alteradas para codificar una' proteína CT- CRM de esta invención. Por lo tanto, el término "molécula aislada de ácido nucleico o secuencia" también se aplica a secuencias de ácido nucleico o moléculas que han sido purificadas sustancialmente de otros componentes que acompañan de manera natural al ácido nucleico no mutagenizado, por ejemplo, AR o ADN o proteínas, en la célula. Una molécula de ácido nucleico aislada o una secuencia de esta invención también abarca secuencias y moléculas que se han preparado por otros métodos convencionales, tales como métodos recombinantes , métodos sintéticos, etc., por ejemplo mutagénesis o combinaciones de tales' métodos. Las secuencias nucleotídicas o las moléculas de esta invención no deben considerarse como limitantes ¦ únicamente a las secuencias nucleotídicas específicas presentadas en este documento, sino más bien se deben considerar que incluyen cualquiera y la totalidad de las secuencias nucleotídicas las cuales comparten homología (es decir, tienen identidad de secuencia) con las secuencias nucleotídicas presentadas en este documento. Los términos "homología sustancial" o "similitud sustancial" cuando se refieren a un ácido nucleico o un fragmento del mismo indican que, cuando se alinean de manera óptima, con inserciones o supresiones nucleotídicas apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria) , existe una identidad en la secuencia nucleotídica en por lo menos aproximadamente 70% de las bases nucleotldicas , medido por cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, un programa en GCG Versión 6.1. El término "homólogo", como se utiliza en la presente, se refiere a la similitud de secuencia entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo entre dos moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, dos moléculas de ADN o dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas polipeptídicas . Cuando una posición nucleotídica o de aminoácido en ambas moléculas es ocupada por el mismo nucleótido o aminoácido monomérico, por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogos en esa posición. La homología entre dos secuencias es una fución directa del número de coincidencias o porciones homologas, por ejemplo si la mitad (es decir, cinco posiciones en un polímero con una longitud de 10 subunidades) de las posiciones en las dos secuencias de compuestos son homologas, entonces las dos secuencias son 50% homologas. Si 90% de las posiciones, por ejemplo 9 de 10 coinciden, o son homologas, las dos secuencias comparten 90% de homología. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN 3'ATTGCC5! y 31 TATGCG51 comparten 50% de homología. Mediante el término "sustancialmente homólogo", como se utiliza en la presente, se quiere significar ADN o ARN el cual es aproximadamente 70% homólogo, de manera más preferible aproximadamente 80% homólogo y de manera mucho más preferible aproximadamente 90% homólogo con respecto al ácido nucleico deseado. La invención también se relaciona con una molécula nucleotídica - aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que es por lo menos 70%, 80% o 90% homologa a una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína CT-CRM o una subunidad de esta invención que tiene toxicidad enzimática reducida en comparación con la proteína CT de tipo silvestre y que retiene la capacidad adyuvante de la CT de tipo silvestre. Además, debido a la degeneración del código genético, cualquier codón de tres nucleótidos que codifique para un mutante o un residuo aminoácido sustituido de CT-CRM que se describe en la presente, está dentro del alcance de la invención. Como se discute en la presente, cuando las CT-CRM, las subunidades CT-A mutantes o las subunidades CT-B mutantes o las secuencias de ADN que las codifican, u otras secuencias útiles en las moléculas de ácido nucleico o composiciones descritas en la presente se definen por sus por cientos de homología o identidades para identificar secuencias, los algoritmos utilizados para calcular el por ciento de homologías o el por ciento de identidades incluyen los siguientes: el algoritmo de Smith-Waterman (J. F. Collins et al, 1988, Comput. Appl . Biosci, 4:67-72; J. F. Collins et al, Molecular Sequence Comparison and Alignment, (M. J. Bishop et al, eds.) In Practical Approac Series: Nucleic Acid and Protein Sequence Analysis XVIII, IRL Press: Oxford, Inglaterra, UK (1987) pp. 417) y los programas BLAST y FASTA (E. G. Shpaer et al, 1996, Genomics, 35:179-191) . Estas referencias se incorporan en la presente como referencia. Al describir dos ADN como "unidos operablemente", como se utiliza en la presente, se quiere significar que el ADN de cadena sencilla' o doble, comprende cada uno de los dos ADN y que los dos ADN están distribuidos dentro del ADN de manera tal que por lo menos una de las secuencias de ADN es capaz de ejercer un efecto fisiológico mediante el cual se caracteriza sobre el otro. Preferiblemente, para uso en la producción de una proteína CT-CRM de esta invención o en la administración de la misma para producción in vivo en una célula, cada secuencia codificante de la proteína CT-CRM así como las secuencias reguladoras necesarias están presentes en un vector recombinante viral o no viral (que incluye métodos de suministro no virales de una molécula de ácido nucleico al interior de una célula) . De manera alternativa, dos o más de estas secuencias de ácido nucleico que codifican para copias duplicadas de una proteína CT-CRM o que codifican para los CR-CRM diferentes múltiples de esta invención pueden estar contenidos en un transcrito policistrónico, es decir, una molécula única diseñada para expresar productos de genes múltiples . La invención se relaciona adicionalmente con vectores, particularmente plásmidos qué contienen secuencias aisladas y purificadas de ADN que comprenden secuencias de ADN que codifican para una holotoxina de cólera mutante inmunogénica . Las modalidades deseables incluyen plásmidos que contienen secuencias de ADN que codifican para las CT-CRM que tienen una sustitución de un solo aminoácido en la posición de aminoácido 16 ó 72 o' la sustitución de aminoácidos dobles en las posiciones de aminoácidos 16 y 68 ó 68 y 72, respectivamente. Mediante el término "vector" como se utiliza en la presente, se quiere significar una molécula de ADN derivada de una especie viral o no viral, por ejemplo bacteriana que se ha diseñado para codificar una secuencia de ácido nucleico exógena o heteróloga. De esta manera, el término incluye plásmidos bacterianos convencionales . Tales plásmidos o vectores pueden incluir secuencias plasmídicas de virus o fagos. Tales vectores incluyen vectores cromosómicos, episómicos y derivados de virus, por ejemplo vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, episomas de levadura, elementos cromosómicos de levadura y virus. Los vectores también se pueden derivar de combinaciones de los mismos tales como las derivadas de plásmido y elementos genéticos de bacteriófago, cósmidos y fagémidos . El término también incluye virus no replicantes que transfieren un gen de una célula a otra. El término también debe considerarse que incluye compuestos no plasmídicos y no virales que facilitan la transferencia de ácido nucleico al interior de las células, tal como por ejemplo compuestos polilisina y similares . Las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen vectores no virales o métodos para el suministro de las secuencias que codifican para la proteina CT-CRM a una célula hospedadora, de acuerdo con esta invención. Se conocen en la técnica diversos vectores no virales y pueden incluir, sin limitación, plásmidos, vectores bacterianos, vectores de bacteriófago, ADN "desnudo" y ADN condensado con lípidos o polímeros catiónicos . Los ejemplos de vectores bacterianos incluyen, pero no se limitan a secuencias derivadas del bacilo de Calmette Guérin (BCG por sus siglas en inglés) , Salmonella, Shigella, E. coli, y Listeria, entre otros. Los vectores plasmídicos adecuados incluyen, por ejemplo pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC184, pUC8 , pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pK37, pKClOl, pAC105, pVA51, pKH47, pUBUO, p B9, pBR325, Col El, pSClOl, pBR313, pML21, RSF2124, pCRl , RP4, pBAD18 y pBR328. Los ejemplos de vectores de expresión inducibles por Escherichia coli adecuados incluyen a pTrc (Amann et al. , 1988 Gene, 69 : 301-315) , los vectores de expresión de arabinosa (por ejemplo pBAD18, Guzman et al, 1995 J. Bacteriol., 277:4121-4130) y pETIId (Studier et al., 1990 Methods in Enzymology, 185: 60-89). La expresión de genes objetivo a partir del vector pTrc se basa en una transcripción de ARN polimerasa hospedadora a partir de un promotor de fusión híbrido trp-lac. La expresión del gen objetivo a partir del vector pETIId se basa en la transcripción a partir de un promotor de fusión T7 gnlO-lac mediada por una polimerasa T7 gn 1 de ARN viral coexpresada. Esta polimerasa viral se suministra por las cepas hospedadoras BL21 (DE3) o HMS I 74(DE3) a partir de un profago residente que alberga un gen T7 gnl bajo el control transcripcional del promotor lacUVB. El sistema pBAD se basa en el promotor inducible por arabinosa que es regulado por el gen araC. El promotor es inducido en presencia de arabinosa. Como un ejemplo, un plásmido, denominado pLP903, contiene una secuencia de ADN aislada y purificada que comprende una secuencia de ADN que codifica para una CT-CRM mutante inmunogénica con toxicidad reducida sustancialmente , en donde el aminoácido alanina está sustituido por isoleucina en la posición de aminoácido 16 en la subunidad A. Un segundo plásmido, denominado pLP905, contiene una secuencia de ADN aislada y purificada que comprende una secuencia de ADN que codifica para una CT-CRM mutante inmunogénica con toxicidad reducida sustancialmente, en donde el aminoácido tirosina está sustituido por valina en la posición de aminoácido 72 en la subunidad A. Otro plásmido ejemplar se denomina pLP904. Este plásmido contiene una secuencia de ADN aislada y purificada que comprende una secuencia de ADN que codifica para una CT-CRM imitante inmunogénica con toxicidad sustancialmente reducida, en donde el aminoácido alanina está sustituido por isoleucina en la posición de aminoácido 16 y el aminoácido tirosina está sustituido por serina en la posición de aminoácido 68 en la subunidad A. Otro plásmido ejemplificado en esta invención se denomina pLP906. Contiene una secuencia aislada y purificada de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica para una CT-CRM mutante inmunogénica con toxicidad sustancialmente reducida, en donde el aminoácido tirosina está sustituido por serina en la posición de aminoácido 68, y el aminoácido tirosina está sustituido por valina en la posición de aminoácido 72 en la subunidad A. Otro tipo de vector útil es un vector de bacteriófago de cadena sencilla o doble. Por ejemplo, un vector de clonación adecuado incluye, pero no se limita a los vectores tales como el sistema de vector de bacteriófago ?, Xgtll, µ t /iWES.tB, Charon 4, Xgt-WES-XB, Charon 28, Charon 4A, Xgt-l-XBC, Xgt-l-XB, M13mp7, M13mp8, o M13mp9, entre otros . En otra modalidad, el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores para expresión en una levadura tal como S. cerevisiae incluyen pYepSec I (Baldari, et al., 1987 Protein Eng. , 1 (5) :433-437) , pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982 Cell, 30 (3) : 933-943) , pJRY88 (Schultz et al., 1987 Gene, 61(2): 123-133) y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . De manera alternativa se utilizan vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (por ejemplo células Sf9 o Sf21) incluyen las series pAc (Smith et al., 1983 Biotechnol., 24:434-443) y las series pVL (Luckow y Summers, 1989 Vlrol., 170 (1) : 31-39) . En otra modalidad adicional, se utiliza un vector de expresión de mamífero para la expresión en células de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, 1987 jVatux-e, 325:840-842) y pMT2PC (Kaufman et al., 1987 EMBO J. , 6(1) : 187-93) . Cuando se utilizan en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión con frecuencia se proporcionan por elementos reguladores virales. Un tipo de vector recombinante es un vector viral de ARN o ADN de cadena sencilla o doble recombinante . Se conocen en la técnica diversos sistemas de vectores virales . Los ejemplos de tales vectores incluyen, sin limitación, vectores adenovirales recombinantes , vectores basados en virus de herpes simple (HSV, por sus siglas en inglés) , vectores virales adenoasociados (AAV, por sus siglas en inglés) , y vectores híbridos adenovirales/AAV, retrovirus o lentivirus recombinantes, vectores de poxvirus recombinante , vectores de virus de vaccinia recombinantes, vectores SV-40, virus de insectos tales como baculovirus y similares que se construyen para transfectar o expresar una composición de ácido nucleico seleccionada de interés. Los vectores de retrovirus que se pueden utilizar incluyen aquellos que se describen en EP 0 415 731; las publicaciones de patentes internacionales Nos. WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; y WO 93/25234; patente de los E.U.A. No. 5,219,740; publicaciones de patentes internacionales Nos. WO 93/11230 y WO 93/10218; Vile y Hart, 1993 Cáncer Res. 53:3860-3864; Vile y Hart, 1993 Cáncer Res. 53:962-967 ; Ram et al., 1993 Cáncer Res. 53:83-88; Takamiya et al., 1992 J. Neurosci . Res. 33:493-503; Baba et al., 1993 J. Neurosurg. 79:729-735; patente de los E.U.A. No. 4, 777,127; patente GB No. 2,200,651; y EP 0 345 242. Los ejemplos de retrovirus recombinantes adecuados incluyen aquellos descritos en la publicación de patente internacional No. WO 91/02805. Los vectores basados en alfavirus también se pueden utilizar como la molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína CT-CRM. Tales vectores se pueden construir a partir de una amplia variedad de virus que incluyen, por ejemplo, los vectores de virus Sindbis, los virus de foresta Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247) , el virus Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) y el virus de encefalitis equina venezolana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532) . Los ejemplos representantivos de tales sistemas de vectores incluyen aquellos descritos en las patentes de E.U.A. Nos. 5,091,309; 5,217,879; y 5,185,440; y las patentes de publicación internacional Nos. WO 92/10578; WO 94/21792; WO 95/27069; WO 95/27044; y WO 95/07994. Los ejemplos de vectores adenovirales incluyen aquellos descritos por Berkner, 1988 Biotechniqu.es 6:616-627; Rosenfeld et al., 1991 Science 252:431-434; publicación de patente internacional No. WO 93/19191; Kolls et al., 1994 PNAS 91:215-219; Kass-Eisler et al., 1993 PNAS 90:11498-11502; Guzman et al., 1993 Circulation 88:2838-2848; Guzman et al., 1993 Cir. Res. 73 :1202-1207 ; Zabner et al., 1993 Cell 75:207-216; Li et al., 1993 Hum. Gene Ther. 4:403-409: Cailaud et al., 1993 Eur. J. Neurosci . 5:1287-1291; Vincent et al., 1993 iVat. Genet. 5:130-134; Jaffe et al., 1992 Nat. Genet. 1:372-378; y Levrero et al., 1991 Gene 101:195-202. Los vectores adenovirales ejemplares incluyen aquellos que se describen en las publicaciones de patentes internacionales Nos. WO 94/12649; WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655. Otros vectores adenovirales incluyen aquellos derivados de adenovirus de chimpancé tales como los descritos en la patente de E.U.A. No. 6,083,716. Otro vector viral se basa en un parvovirus tal como el virus adenoasociado (AAV) . Los ejemplos representativos incluyen los vectores AAV descritos en la publicación de patente internacional No. WO 93/09239, Samulski et al., 1989 J. Virol. 63:3822-3828; Mendelson et al., 1988 Virol. 166:154-165; y Flotte et al., 1993 PNAS 90:10613-10617. Otros vectores de AAV particularmente deseables incluyen aquellos basados en AAV1; véase la publicación de patente internacional No. WO 00/28061, publicado el 18 de mayo del 2000. Otros vectores AAV deseables incluyen aquellos los cuales están pseudotipificados , es decir, que contienen un minigen constituido de los ITR 5' de AAV, un transgen y los ITR 3 ' de AAV empacados en una cápside de una AAV de serotipo eterólogo a las AAV de ITR. Los métodos para producir tales vectores AAV pseudotipificados se describen con detalle en la publicación de patente internacional No. WO01/83692. En una modalidad en la cual la molécula de ácido nucleico de la invención es "ADN desnudo" se pueden combinar con polímeros que incluyen polímeros tradicionales y polímeros no tradicionales tales como polímeros que contienen ciclodextrina y polímeros no condensantes interactivos protectores, entre otros. El ADN "desnudo" y el ADN condensado con lípidos catiónicos o polímeros típicamente se suministran a las células utilizando métodos químicos. Se conocen en la técnica numerosos métodos químicos para el suministro de células e incluyen el uso de lipidos, polímeros o proteínas para formar complejos con ADN, opcionalmente condensar las mismas en partículas y suministrarlas a las células. Otro método químico no viral incluye utilizar cationes para condensar ADN, el cual después se coloca en un liposoma y se utiliza de acuerdo con la presente invención. Véase, C. Henry, 2001 Chemical and Engineering News, 79 (48) :35-41. La molécula de ácido nucleico que codifica para la CT-CRM de esta invención se introduce directamente en las células ya sea como un ADN "desnudo" (patente de E.U.A. No. 5,580,859) o se formula en composiciones con agentes que facilitan la inmunización, tales como bupivicaína y otros anestésicos locales (paente de E.U.A. No. 6,127,170) . Todos los componentes de los vectores virales y no virales anteriores se pueden seleccionar fácilmente de entre los materiales conocidos en la técnica están disponibles en la industria farmacéutica. La selección de los componentes de vector y las secuencias reguladoras no se consideran una limitación sobre esta invención. Cada secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína CT-CRM de acuerdo con esta invención preferiblemente está bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen la replicación y generación del producto de cada secuencia de ácido nucleico en un mamífero o en una célula de vertebrado. Mediante el término "secuencia promotora/reguladora" se quiere significar una secuencia de ADN necesaria para la expresión de un ácido nucleico unido operablemente a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, la secuencia promotora/reguladora puede funcionar de una manera específica de tejido. Por ejemplo, la secuencia promotora/reguladora es capaz únicamente de activar la expresión en una célula de un tipo de tejido particular. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora de núcleo y en otros casos esta secuencia también puede incluir una secuencia mejoradora y otros elementos reguladores que se necesitan para la expresión de una manera específica de tejido. De manera preferible, la molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína CT-CRM de esta invención o un vector recombinante , comprende además secuencias reguladoras. Por ejemplo, tales secuencias reguladoras comprenden un promotor que impulsa la expresión de la proteína CT-CRM. Preferiblemente, la secuencia promotora/reguladora está colocada en el extremo 5 ' de la secuencia codificante de manera que impulsa la expresión de la proteína CT-CRM en una célula. Los promotores adecuados se pueden seleccionar fácilmente de entre promotores constitutivos, promotores inducibles, promotores específicos de tejido y otros. Los ejemplos de promotores constitutivos que son no específicos en su actividad se utilizan en las moléculas de ácido nucleico que codifican para la proteína CT-C M de esta invención e incluyen, sin limitación, el promotor de virus de sarcoma de Rous retroviral (RSV, por sus siglas en inglés) , el promotor LTR retroviral (opcionalmente con el mejorador RSV) , el promotor de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el mej orador (CMV) (véase, por ejemplo, Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)), el promotor SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor de actina ß, el promotor de fosfoglicerol cinasa (PGK, por sus siglas en inglés) y el promotor EFla (Invitrogen) . Los promotores inducibles que son regulados por compuestos suministrados exógenamente incluyen, sin limitación, al promotor de arabinosa, el promotor de metalotionina de borrego (MT) inducible con zinc, el promotor del virus de tumor mamario de ratón (MMTV, por sus siglas en inglés) inducible por dexametasona (Dex) , el sistema promotor de polimerasa T7 (WO 98/10088) ; el promotor de insecto ecdisona (No et al, 1996 Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351), el sistema reprimible de tetraciclina (Gossen et al., 1992 Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551), el sistema inducible de tetraciclina (Gossen et al, 1995 Science, 268:1766-1769, véase también Harvey et al, 1998 Curr. Opin.

Chem. Biol., 2:512-518), el sistema inducible por RU486 ( ang et al, 1997 Nat. Blotech. , 15:239-243 y Wang et al, 1997 Gene Ther. , 4:432-441) y el sistema inducible por rapamicina (Magari et al, 1997 J. Clin. Invest. , 100:2865-2872). Un promotor preferido particularmente para uso en los sistemas de expresión para las CT-CRM es el promotor inducible por arabinosa . Otros tipos de promotores inducibles que pueden ser útiles en este contexto son los regulados por un estado fisiológico específico, por ejemplo la temperatura o la fase aguda o únicamente en células que se replican. Los promotores específicos de tejido útiles incluyen los promotores a partir de genes que codifican para la actina ß esquelética, la cadena ligera 2A de miosina, distrofina, creatina cinasa de músculo así como promotores de músculo sintético con actividades superiores a los promotores que se presentan de manera natural (véase Li et al., 1999 Nat. Blotech., 27:241-245) . Se conocen ejemplos de promotores que son específicos de tejido para hígado (albúmina, Miyatake et al., 1997 J. Virol., 72:5124-32; promotor de núcleo del virus de hepatitis B, Sanding et al., 1996 Gene Ther., 3:1002-9; fetoproteína a (AFP, por sus siglas en inglés), Arbuthnor et al., 1996 Hum. Gene Ther., 7:1503-14), hueso (osteocalcina, Stein et al., 1997 Mol. Biol. Rep. , 24:185-96; sialoproteína ósea, Chen et al., 1996 J. Bone Miner. Res., 11: 654-64) , linfocitos (CD2, Hansal et al., 1988 J. Imunol . , 161 : 1063 -8 ; cadena pesada de inmunoglobulina; cadena o; del receptor de linfocitos T) , neuronal (promotor de enolasa específico para neurona (NSE, por sus siglas en inglés), Andersen et al., 1993 Cell . Mol. Neurobiol., 23:503-15; gen de cadena ligera de neurofilamento, Piccioli et al., 1991 Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 88:5611-5; el gen ngf/3 específico para neurona, Piccioli et al., 1995 Neuron, 15:373-84); entre otros. Véase, por ejemplo, la publicación de patente internacional número O00/55335 para una lista adicional de promotores conocidos útiles en este contexto. Las secuencias reguladoras adicionales para inclusión en una secuencia de ácido nucleico, una molécula o un vector de esta invención incluyen, sin limitación, una secuencia mejoradora, una secuencia de poliadenilación, una secuencia donadora de empalme (maduración) y una secuencia aceptora de empalme, un sitio para inicio y terminación de transcripción colocado al inicio y al final, respectivamente, del polipeptido que se va a traducir, un sitio de unión de ribosoma para traducción en la región transcrita, una etiqueta de epítopo, una secuencia de localización nuclear, un elemento IRES, un elemento "TATA" de Goldberg-Hogness , un sitio de separación de enzima de restricción, un marcador seleccionable y similares. Las secuencias mejoradoras incluyen, por ejemplo, la secuencia repetida en tándem 72 pares de bases del ADN de SV40 o las secuencias repetidas terminales largas retrovirales de los LTR, etc., y se utilizan para aumentar la eficacia transcripcional . La selección de los promotores y otros elementos comunes de vectores son convencionales y muchas de estas secuencias están disponibles con las cuales se pueden diseñar las moléculas nucleotidicas y vectores útiles en esta invención. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1989) y las referencias mencionadas en ese documento, por ejemplo las páginas 3.18-3.26 y 16.17-16.27 y Ausubel et al., Current Protocole in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989) . Una persona con habilidad en la técnica puede seleccionar fácilmente de entre tales secuencias reguladoras conocidas para preparar moléculas de esta invención. La selección de tales secuencias reguladoras no es una limitación de esta invención. C. Métodos para producir las proteínas CT-CRM y moléculas nucleotidicas de esta invención. En vista de la utilidad demostrada de las CT-CRM mutantes como adyuvantes para composiciones antigénicas, es deseable la producción de cantidades adecuadas de CT-CRM mutantes. La preparación o síntesis de las secuencias nucleotidicas y las CT-CRM, así como las composiciones que contienen las moléculas nucleotidicas o la proteína CT-CRM de esta invención que se describen en la presente se encuentran dentro de la habilidad de una persona que tenga habilidad actual en la técnica utilizando el material disponible. Los métodos de síntesis no son una limitación de esta invención. Los ejemplos a continuación detallan las modalidades preferidas actualmente de la síntesis de secuencias que codifican para las CT-CRM de esta invención. Las CT-CRM y las moléculas nucleotídicas y las secuencias de esta invención se pueden producir por métodos de síntesis química, métodos de ingeniería genética recombinante, mutagénesis dirigida al sitio, entre otros y combinaciones de tales métodos. Por ejemplo, las secuencias nucleotídicas/CT-CRM de esta invención se pueden preparar de manera convencional por recursos para técnicas de síntesis química conocidas, por ejemplo, síntesis química en fase sólida tal como se describe por Merrifield, 1963 J. Amer. Chem. Soc, 85:2149-2154; J. Stuart y J. Young, Solid PHASE Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, IL (1984); Matteucci et al, 1981 J". Am. Chem. Soc, 103:3185; Alvarado--Urbina et al., 1980 Science, 214-270; y Sinha, N. D. et al., 1984 Nucí. Acids Res., 13:4539, entre otros. Véase también, por ejemplo PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, segunda edición, T. E. Creighton, . H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F., "Pposttranslational Protein Modifications Perspectives and Prospects", páginas 1-12 en POSTTRANSLATIONAL COVALENT ODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., 1990 Meth. Enzymol . , 182:626-646, y Rattan et al., 1992 Aran . N. F. Acad. Sci . , 663:48-62. De manera alternativa, las composiciones de esta invención se pueden construir de manera recombinante utilizando técnicas convencionales de biología molecular, mutagénesis dirigida al sitio, ingeniería genética de reacciones en cadena de polimerasa tales como clonación y expresión de una molécula nucleotídica que codifica para una proteína CT-CRM con otros inmunógenos opcionales y proteínas portadoras opcionales dentro de un microorganismo hospedador, etc., utilizando la información que se proporciona en la presente (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1997)). Las secuencias codificantes para las CT-CRM y los inmunógenos opcionales se pueden preparar sintéticamente (W. P. C. Stemmer et al., 1995 Gene, 164:49). En general, las técnicas de ADN recombinante involucran obtener por síntesis o aislamiento una secuencia de ADN que codifique para la proteína CT-CRM como se describe en lo anterior e introducirla dentro del vector/sistema de expresión de célula hospedadora apropiado en donde se expresa preferiblemente bajo el control de un promotor inducible por arabinosa. Se puede utilizar cualquiera de los métodos descritos para la inserción de ADN dentro de un vector de expresión para ligar un promotor y otros elementos de control reguladores dentro de sitios específicos al interior del vector recombinante seleccionado. Las células hospedadoras adecuadas después se transforman, se infectan, se someten a transducción o se transfectan con tales vectores o plásmidos, mediante técnicas convencionales. Se pueden utilizar diversos sistemas de célula hospedadora/vector (plásmido) para expresar el mutante inmunogénico de la holotoxina de cólera. El sistema vector, el cual de manera preferible incluye el promotor inducible por arabinosa, es compatible con la célula hospedadora utilizada. El ADN que codifica para las CT-CRM mutantes se inserta dentro de un sistema- de expresión y el promotor (preferiblemente el promotor inducible por arabinosa) y otros elementos de control se ligan en sitios específicos dentro del vector de manera que cuando el vector se inserta dentro de una célula hospedadora (por transformación, transducción o transfección, dependiendo del sistema de célula hospedadora-vector que se utilice) el ADN que codifica para la CT-CRM se expresa por la célula hospedadora. El vector se puede seleccionar de uno de los vectores virales o vectores no virales descritos antes pero debe ser compatible con la célula hospedadora que se utilice. El vector de ADN recombinante puede introducirse en células hospedadoras apropiadas (células de bacterias, virus, levaduras, de mamífero o similares) , por transformación, transducción o transfección (dependiendo del sistema de vector/célula hospedadora) . Los sistemas de hospedador-vector incluyen pero no se limitan a bacterias transformadas con ADN de bacteriófago, ADN plasmídico o ADN de cósmido; microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de levadura, sistemas de células de mamífero infectadas con virus (por ejemplo virus de vaccinia, adenovirus, etc.); y sistemas de células de insecto infectados con virus (por ejemplo baculovirus) . Los sistemas para clonar y expresar las CT-CRM y otras composiciones de esta invención utilizando las moléculas sintéticas de ácido nucleico incluyen el uso de varios microorganismos y células que son bien conocidos en la tecnología recombinante. La célula hospedadora se puede seleccionar de cualquier organismo biológico que incluye células procarióticas (por ejemplo bacterianas) y células eucarióticas que incluye a células de mamífero, de insecto, y células de levadura. Preferiblemente, las células utilizadas en los diversos métodos y composiciones de esta invención son células bacterianas . Las células bacterianas adecuadas incluyen, por ejemplo, diversas cepas de E. coli, Bacillus y Streptomyces . Las células de levadura tales como Saecharomyees y Pichia asi como células de insecto tales como las células Sf9 y Sf21 también son células hospedadoras útiles para propósitos de producción. Las células de mamífero incluyen pero no se limitan a células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) , fibroblastos de embrión de pollo, células de riñon de hámster bebé, células NIH3T3, PER C6, NSO, VERO o COS las cuales también son células hospedadoras adecuadas asi como otros organismos y plantas convencionales y no convencionales. La selección de otras células hospedadoras adecuadas y métodos para transformación, cultivo, amplificación, cribado y producción y purificación de productos se pueden realizar por una persona habitualmente experta en la técnica con referencia a técnicas conocidas. Véase, por ejemplo, Gething y Sambrook, 1981 Nature, 293:620-625, entre otros. Típicamente, la célula hospedadora se mantiene bajo condiciones de cultivo por un período de tiempo suficiente para expresión. Las condiciones de cultivo son bien conocidas en la técnica e incluyen una composición iónica y concentración, temperatura, pH y similares. Típicamente, las células transíectadas se mantienen bajo condiciones de cultivo en un medio de cultivo. Los medios adecuados para los diversos tipos de células son bien conocidos en la técnica.

En una modalidad preferida, la temperatura es de aproximadamente 20°C a aproximadamente 50°C, de manera más preferible de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C e incluso de manera más preferible de aproximadamente 37°C. El pH preferiblemente tiene un valor de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0, de manera más preferible un valor de aproximadamente 6.8 a aproximadamente 7.8, y de manera mucho más preferible un valor de aproximadamente 7.4. La osmolalidad preferiblemente es de aproximadamente 200 miliosmoles por litro (mosm/1) a aproximadamente 400 mosm/1, y de manera más preferible de aproximadamente 290 mosm/1 a aproximadamente 310 mosm/1. Otras condiciones biológicas necesarias para transfección y expresión de una proteína codificada son bien conocidas en la técnica. La proteína CT-CRM recombinante se recubre o se recolecta ya sea de células hospedadoras o membranas de las mismas o a partir del medio en el cual se cultivaron dichas, células. La recuperación comprende aislar y purificar la proteína CT-CRM recombinante. Se conocen bien en el arte las técnicas de aislamiento y purificación para polipéptidos e incluyen procedimientos tales como precipitación, filtración, cromatografía, electroforesis y similares. Cuando se producen por medios recombinantes convencionales, las CT-CRM de esta invención se pueden aislar y purificar de la célula o del medio de la misma por métodos convencionales que incluyen cromatografía (por ejemplo cromatografía de intercambio iónico, de afinidad y de determinación de tamaño por columna) , centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Existen varias técnicas para la purificación de proteína heteróloga a partir de células procarióticas . Véanse, por ejemplo, las patentes de E.U.A. números 4,518,526; 4,599,197 y 4,734,362. Sin embargo, la preparación purificada producida debe estar sustancialmente libre de toxinas del hospedador que puedan ser peligrosas para los humanos. En particular, cuando se expresan en células hospedadoras bacterianas gramnegativas tales como E. coli, el péptido o proteína purificados deben estar sustancialmente libres de contaminación por endotoxina. Véase, por ejemplo Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, Laboratory, New York (1989) Las CT-CRM utilizadas en los métodos y composiciones de la invención no se limitan a productos de cualquiera de los procedimientos ejemplares específicos incluidos en la presente. De hecho, la proteína se puede preparar por los métodos en los textos mencionados inmediatamente antes o por métodos de los textos mencionados en otra parte en esta especificación. Esta dentro de la habilidad de la técnica aislar y producir de manera recombinante o sintética composiciones proteínicas para tal uso . Las cuatro CT-CRM ejemplares de la tabla 1, dos presentan una sustitución de un solo aminoácido, y dos presentan sustituciones de dos- aminoácidos, se generan como se describen con detalle en el ejemplo 1 utilizando algunos de los métodos descritos antes. De manera especifica, se generan en E. coli un conjunto de clones de CT mutantes (las CT-CRM) mediante protocolos de mutagénesis dirigida al sitio estándar sobre plásmidos que codifican para las moléculas de holotoxina CT conocidas. Se ha demostrado previamente que el rendimiento resultante de la holotoxina CT-CRME29H purificada es de aproximadamente 50 µg por litro de medio de cultivo (véase la publicación de patente internacional número WO 00/18434) . Los intentos iniciales de aumentar el rendimiento de CT-CRME29H por modificaciones al plásmido original muestran poco o nulo efecto. Se obtiene un incremento moderado en el rendimiento mediante expresión conjunta del plásmido pIIB29H y derivados, con DsbA de Vibrio cholerae y RpoH de E. coli. La expresión conjunta y las modificaciones de expresión aumentan el rendimiento de CT-CRME29H a aproximadamente 2 mg/litro. Para aumentar la expresión de las CT-CRM de la presente invención, se sustituye el promotor inducible por lactosa en los plásmidos, con un promotor inducible por arabinosa (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) , el cual está unido operativamente a una secuencia de ADN que codifica para las CT-CRM. Durante la clonación se determina que el plásmido pIIB29H contiene un gen ctxA que codifica para la subunidad A de CT de Vijbrio cholerae cepa 569B, unido a un gen ctxB que codifica para la subunidad B de CT de Vibrio cholerae cepa 2125. La alineación cruzada de estos genes indica siete sustituciones de base entre los dos genes ctxB y un cambio de una sola base entre los genes ctxA. Varias de estas sustituciones de base llevan a cambios de aminoácidos en las subunidades maduras. Se realiza una mención especial respecto a la sustitución entre los genes ctxA que induce un cambio de aminoácidos dentro de la porción A-2 o el dominio de montaje de holotoxina de la subunidad A. No se sabe si la heterogenidad entre estos genes tenga un impacto negativo sobre la expresión de toxina o el montaje de holotoxina. Sin embargo, se considera preferible desde un punto de vista evolutivo que los genes para ambas subunidades de toxina se originen de la misma fuente. De esta manera, se utilizan los genes para ctxA y ctxB en la construcción del sistema inducible por arabinosa originado de Vibrio cholerae cepa 569B. En el ejemplo 1 se describen la construcción de los plásmidos pLP903, pLP904, pLP905, pLP906. La holotoxina de cólera mutante inmunogénica se produce por transformación, infección, transducción o transfección de una célula hospedadora con un plásmido descrito antes y el cultivo de las células hospedadoras bajo condiciones que permitan la expresión de la proteína destoxificada inmunogénica recombinante por la célula hospedadora. La producción de los CT-CRM a partir de pLP903, pLP904, pLP905 y pLP906 es de aproximadamente 10 mg de material purificado por litro de cultivo . La proteína CT-CRM resultante o la molécula de ácido nucleico se pueden formular en una composición inmunogénica con cualquier cantidad de antígenos seleccionados y se pueden cribar para determinar la eficacia adyuvante mediante ensayos in vivo tales como los que se describen en los ejemplos que sigue. D. Composiciones Inmunogénicas Una composición inmunogénica eficaz de acuerdo con la invención es aquella que comprende una holotoxina de cólera mutante de esta invención. Preferiblemente, la holotoxina de cólera mutante CT-CRM tiene toxicidad reducida en comparación con una holotoxina de cólera de tipo silvestre. Esta "toxicidad reducida" permite que se utilice a cada mutante como un adyuvante en una composición inmunogénica sin provocar efectos colaterales significativos, particularmente aquellos conocidos como relacionados con la CT de tipo silvestre, por ejemplo, diarrea. De manera más preferible, la CT-CRM en la composición inmunogénica de esta invención tiene una sustitución de un solo aminoácido en la posición de aminoácido 16 ó 72 en la subunidad A de la holotoxina, o una sustitución de aminoácido doble en las posiciones de aminoácidos 16 y 68 o 68 y 72 de la subunidad A de la holotoxina de cólera. En una modalidad, la CT-CRM puede tener una o más modificaciones adicionales como se describen en lo anterior. En otra modalidad, la composición comprende un antígeno seleccionado y una cantidad adyuvante eficaz adecuada de la CT-CRM, en donde la holotoxina mejora de manera significativa la respuesta inmunologica al antígeno en un hospedador vertebrado. Las composiciones de la presente invención modulan la respuesta inmunologica al mejorar la respuesta de anticuerpos del hospedador vertebrado y las respuestas inmunológicas mediadas por células a la administración de una composición que comprende un antígeno seleccionado como se describe en lo anterior. Como se utiliza en la presente, el término "cantidad adyuvante eficaz" significa una dosis de uno de los mutantes de CT-CRM de esta invención que es eficaz para inducir una respuesta inmunologica aumentada en un hospedador vertebrado. En una definición más específica, el término "cantidad adyuvante eficaz" significa una dosis de una de las cuatro CT-CRM mutantes descritas en la presente (CT-CRMH6A/ CT-CRMV72Y, CT-CRMII6A,SS8Y, CT-CRMS68Y,V72Y) , eficaz para inducir una respuesta inmuno-lógica aumentada en un hospedador vertebrado. Específicamente, las CT-CRM descritas en la presente aumentan las respuestas inmunológicas en mucosa y sistémicas después de su administración intranasal de antígenos disparados. Además, incluso en presencia de respuestas inmunológicas contra CT preexistentes, las CT-CRM mutantes son capaces de funcionar como adyuvantes eficaces de mucosa. Las CT-CRM mutantes inmunogénicas de acuerdo con la presente invención muestran un equilibrio de toxicidad reducida y capacidad adyuvante retenida, de manera que la proteina CT mutante resultante funciona como un adyuvante mientras es tolerada de manera inocua por el hospedador vertebrado al cual se introduce. La "dosificación o cantidad adyuvante eficaz" particular dependerá de la edad, peso y condición médica del hospedador así como del método de administración. Las dosis adecuadas se determinan fácilmente por las personas expertas en la técnica. Las composiciones inmunogénicas que contienen como un adyuvante las holotoxinas de cólera mutante de esta invención también contienen por lo menos un antígeno que se selecciona de entre una amplia variedad de antígenos. Los antígenos pueden comprender una célula completa o virus, o uno o más sacáridos, proteínas, subunidades de proteína, polipéptido, péptido o fragmentos, polinucleótidos u oligonucleótidos u otros componentes macromoleculares . Si se desea, las composiciones antigénicas pueden contener más de un antígeno del mismo microorganismo o de microorganismos patogénicos diferentes. Así, en una modalidad, las composiciones inmunogénicas de esta invención comprenden como un antígeno seleccionado a un polipéptido, péptido o fragmento derivado de una bacteria patogénica. Las composiciones inmunogénicas bacterianas deseables incluyen a los mutantes de CT-CRM como un adyuvante e incluyen aquellas dirigidas para prevención o tratamiento de enfermedades causadas, sin limitación, por Haemophilus infl enzae (tipificable y no tipificable) , Haemophílus somnus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoníae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussís, Alloiococcus otiditis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella Choleraesuis, Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare complex, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epider itis, Clostridiu tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae y Mycoplasma gallisepticum.

En otra modalidad, las composiciones inmunogénicas de esta invención comprenden como el antigeno seleccionado un polipéptido, péptido o fragmento derivado de un virus patogénico. Las composiciones inmunogénicas virales deseables incluyen los mutantes de CT-CRM como un adyuvante e incluyen aquellas dirigidas a la prevención o el tratamiento de enfermedades causadas, sin limitación, por el virus sincitial respiratorio, el virus de parainfluenza tipos 1-3, metaneumovirus humano, virus de influenza, virus de herpes simple, citomegalovirus humano, virus de inmunodeficiencia humana, virus de inmunodeficiencia simia, virus de hepatitis A, virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, papilomavirus humano, poliovirus, rotavirus, calcivirus, virus del sarampión, virus de paperas, virus de rubéola, adenovirus, virus de la rabia, virus de malestar canino, virus de rinderpest, neumovirus aviar (anteriormente virus de rinotraqueitis de pavo) , virus Hendra, virus Nipah, coronavirus, parvovirus, virus de rinotraqueitis infecciosa, virus de leucemia felina, virus de peritonitis infecciosa felina, virus de la enfermedad de la bolsa infecciosa aviar, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la enfermedad de Marek, virus del síndrome respiratorio porcino y del síndrome reproductivo, virus de arteritis equina y diversos virus de encefalitis. En otra modalidad, las composiciones inmunogénicas de esta invención comprenden como el antígeno seleccionado a un polipéptido, péptido o fragmento derivado de un hongo patogénico. Las composiciones inmunogénicas deseables contra hongos patógenos incluyen a los imitantes de CT-CRM como un adyuvante e incluyen aquellos dirigidos para la prevención o tratamiento de enfermedades causadas, sin limitación, por Aspergillus, Blastomyees, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus y Histoplasma. En otra modalidad adicional, las composiciones inmunogénicas de esta invención comprenden como el antigeno seleccionado a un polipéptido, péptido o fragmento derivado de un parásito patogénico. Las composiciones inmunogénicas deseables contra parásitos incluyen a los mutantes de CT-CRM como un adyuvante e incluyen a aquellas dirigidas para la prevención o tratamiento de una o varias enfermedades causadas, sin limitación, por Leishmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii y Pneumocystis carinii. Las composiciones inmunogénicas deseables dirigidas contra enfermedades no infecciosas incluyen a los mutantes de CT-CRM como un adyuvante también están dentro del alcance de esta invención. Tales composiciones inmunogénicas incluyen aquellas dirigidas a antígenos de vertebrado, particularmente composiciones dirigidas contra antígenos para la prevención o tratamiento de enfermedades, sin limitación, tales como alergia, enfermedades autoinmunes, enfermedad de Alzheimer y cáncer. Por ejemplo, la composición inmunogénica de esta invención puede contener un polipéptido, péptido o un fragmento derivado de una célula cancerosa o una célula tumoral . Las composiciones inmunogénicas deseables para inducir un efecto terapéutico o profiláctico anticancerígeno en un hospedador vertebrado, las cuales contienen los mutantes de CT-CRM de esta invención incluyen aquellas que utilizan un antígeno para cáncer o un antígeno asociado a tumor e incluyen, sin limitación, antígeno específico para próstata, antígeno carcinoembriónico, MUC-1, Her2 , CA-125, MAGE-3, hormonas, análogos de hormonas y así sucesivamente. Otras composiciones inmunogénicas de esta invención son deseables para moderar respuesta a alérgenos en un hospedador vertebrado. Tales composiciones contienen los mutantes de CT-CRM de esta invención y un polipéptido, péptido o fragmento derivado de un alérgeno o fragmento del mismo. Los ejemplos de tales alérgenos se describen en la patente de Estados Unidos Número 5,830,877 y en la publicación de Patente Internacional Número WO 99/51259, las cuales se incorporan en la presente como referencia e incluyen polen, venenos de insecto, caspa animal, esporas micóticas y medicamentos (tales como penicilina) . Las composiciones inmunogénicas interfieren con la producción de anticuerpos IgE, una causa conocida de reacciones alérgicas, de manera que moderan las respuesta alérgicas al alérgeno. En otra modalidad adicional, las composiciones inmunogénicas de esta invención contienen como el antígeno seleccionado a un polipéptido, péptido o fragmento derivado de una porción molecular de un antígeno, el cual representa aquellas producidas por un hospedador (una molécula propia) de una manera no deseada, cantidad o ubicación, tal como aquellas de la proteína precursora amiloide de manera que evitan o tratan la enfermedad caracterizada por deposición amiloide en un hospedador vertebrado. Las composiciones deseables para moderar respuesta a moléculas propias en un hospedador vertebrado, las cuales contienen mutantes CT-CRM de esta invención incluyen aquellas que contienen una molécula propia o un fragmento de la misma. Los ejemplos de tales moléculas incluyen la cadena ß de insulina involucrada en diabetes, la molécula G17 involucrada en enfermedad de reflujo gastroesofágico y antígenos que disminuyen las respuesta autoinmunes en enfermedades tales como esclerosis múltiple, lupus y artritis reumatoide. Otras composiciones inmunogénicas adicionales de esta invención son deseables para evitar o tratar enfermedades caracterizadas por deposición amiloide en un hospedador vertebrado. Tales composiciones contienen a uno o varios de los mutantes de CT-CRM de esta invención así como porciones de la proteína precursora amiloide (APP, por sus siglas en inglés) . Esta enfermedad se denomina de manera diversas como enfermedad de Alzheimer, amiloidosis o enfermedad amiloidogénica . La proteína precursora amiloide ß (también denominado como péptido A/3) es un fragmento de 42 aminoácidos APP, el cual se genera por procesamiento de APP por las enzimas secretasa ß y y y tiene la siguiente secuencia: Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lie Ala (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 3) . En algunos pacientes, los depósitos amiloides toman la forma de un péptido A3 agregado. Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que la administración del péptido A/3 aislado induce una respuesta inmunológica contra el componente del péptido A/3 de un depósito amiloide en un hospedador vertebrado (publicación de patente internacional número WO 99/27944) . De esta manera, las modalidades de esta invención incluyen mutantes de CT-CRM de esta invención más el péptido A/3, así como fragmentos del péptido A/3 y anticuerpos para los péptidos A/3 o fragmentos de los mismos . Uno de tales fragmentos del péptido A/3 es el péptido de 28 aminoácidos que tiene la siguiente secuencia (patente de E.U.A. número 4,666,829): Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4) . Tales composiciones inmunogénicas comprenden además un diluyente inmunológicamente aceptable o un portador farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril o solución salina isotónica estéril. Las composiciones antigénicas también se pueden mezclar con tales diluyentes o portadores de una manera convencional. Como se utiliza en la presente la frase "portador farmacéuticamente aceptable" se pretende que incluya cualquiera y la totalidad de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos y agentes isotónicos y de retraso de absorción y similares compatibles con la administración a humanos o a otros hospedadores vertebrados . El portador apropiado será evidente para aquellos expertos en la técnica y dependerá en gran parte de la vía de administración. Las composiciones inmunogénicas también pueden incluir, pero no se limitan a suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas y formulaciones implantables de liberación sostenida o biodegradables . Tales formulaciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales que incluyen pero que no se limitan a agentes que mejoren la suspensión, estabilizantes o dispersantes. En una modalidad de una formulación para administración parenteral, el ingrediente activo se proporciona en forma seca (es decir, en polvo o granular) para su dilución con un vehículo adecuado (por ejemplo agua estéril sin pirógenos) antes de la administración parenteral de la composición reconstituida. Otras formulaciones administrables por vía parenteral las cuales son útiles incluyen aquellas que comprenden al ingrediente activo en forma microcristalina, en una preparación liposómica o como un componente de un sistema de polímero biodegradable . Las composiciones para liberación sostenida o implantación pueden comprender materiales poliméricos o hidrofóbicos farmacéuticamente aceptables tales como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero escasamente soluble o una sal escasamente soluble. Los componentes adicionales que pueden estar presentes en las composiciones inmunogénicas de proteína de esta invención son adyuvantes además de las CT-CRM, conservadores, estabilizantes químicos u otras proteínas antigénicas. Típicamente, los estabilizantes, adyuvantes y conservadores se optimizan para determinar la mejor formulación para eficacia en el humano o animal al que se dirigen. Los conservadores ejemplares adecuados incluyen clorobutanol , sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, galato de propilo, los parabenos, etilvainillina, glicerina, fenol y paraclorofenol . Los ingredientes estabilizantes adecuados que se pueden utilizar incluyen, por ejemplo, casaminoácidos , sacarosa, gelatina, rojo de fenol, amina N-Z, difosfato monopotásico, lactosa, idrolizado de lactoalbúmina y leche seca. Las composiciones antigénicas de esta invención pueden comprender adyuvantes adicionales además de las CT-CRM mutantes . Los adyuvantes diferentes de CT-CRM convencionales utilizados para mejorar la respuesta inmunológica incluyen, sin limitación, MPL^ (monofosforilípido A 3 -O-desacilado; Corixa, Hamilton, MT) , el cual se describe en la patente de E.U.A. número 4,912,094, la cual se incorpora en la presente como referencia. También son adecuados para uso como adyuvantes los análogos de lipido A sintético o compuestos de fosfato de aminoalquilglucosamina (AGP, por sus siglas en inglés) o derivados o análogos de los mismos, los cuales están disponibles de Corixa (Hamilton, MT) y los cuales se describen en la patente de Estados Unidos Número 6,113,918, la cual se incorpora en la presente como referencia. Uno de tales AGP es 2- [ (R) -3 -tetradecanoiloxitetradecanoilamino) etil-2-desoxi~4-0-fosfono-3-0 [ (R) -3 -tetradecanoioxi-tetradecanoil] -2- [ (R) -3-tetradecanoioxitetradecanoilamino] -b-D-glucopiranósido, el cual también se conoce como 529 (anteriormente conocido como RC529) . Este adyuvante 529 se formula como una forma acuosa o como una emulsión estable. Otros adyuvantes adicionales diferentes de CT-CRM incluyen aceite mineral y emulsiones acuosas, sales de aluminio (alumbre) tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, etc., Amphigen, Avridine, L121/escualeno, D-láctída-poliláctida/glucósido, polioles de Pluronic, dipéptido de muramilo, Bordetella. inactivada, saponinas tales como StimulonM QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), descrita en la patente de E.U.A. número 5,057,540, la cual se incorpora en la presente como referencia, y partículas generadas a partir de la misma tales como los ISCOMS (complejos inmunoestimulantes) , Mycobacterium tuberculosis, lipopolisacáridos bacterianos, polinucleótidos sintéticos tales 'como oligonucleótidos que contienen un motivo CpG (patente de E.U.A. número 6,207,646, la cual se incorpora en la presente como referencia) , una toxina de pertussis (PT, por sus siglas en inglés) , o una toxina termolábil (LT, por sus siglas en inglés), de E. colí, particularmente LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129; véanse, las publicaciones de patentes internacionales números WO 93/13302 y WO 92/19265, incorporados en la presente como referencia. Varias citocinas y linfocinas también son adecuadas para inclusión en las composiciones inmunogénicas de esta invención. Una de tales citocinas es el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF, por sus siglas en inglés) el cual tiene una secuencia nucleotídica como se describe en la patente de E.U.A. número 5,078,996, la cual se incorpora en la presente como referencia. Un plásmido que contiene el ADNc para GM-CSF se ha transformado en E. coli y se ha depositado en la American Type Culture Collection (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, bajo el número de acceso 39900. La citocina interleucina-12 (IL-12) es otro adyuvante que se describe en la patente de E.U.A. número 5,723,127, el cual se incorpora en la presente como referencia (disponible de Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA) . Se ha demostrado que otras citocinas o linfocinas tienen actividad moduladora inmunológica e incluyen, pero no se limitan a las interleucinas 1- , ?-ß, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 y 18, los interferones a, ß Y ?, factor estimulador de colonias de granulocitos y los factores de necrosis tumoral o¿ y ß y son adecuados para uso como adyuvantes . Otros componentes opcionales adecuados adicionales de las composiciones inmunogénicas de esta invención incluyen pero no se limitan a: sustancias tensioactivas (por ejemplo hexadecilamina, octadecilamina, ásteres de ácido octadecilamino, lisolecitina, bromuro de dimetildioctadecilamonio) , metoxihexadecilglicerol y polioles Pluronic; poliaminas, por ejemplo pirano, sulfato de dextrano, poli IC, carbopol ; péptidos, por ejemplo dipéptido de muramilo, dimetilglicina, tufsina, emulsiones oleosas y geles minerales, por ejemplo fosfato de aluminio, etc., y complejos estimulantes inmunológicos . La CT-CRM y el antigeno también se pueden incorporar en liposomas o se pueden conjugar a polisacáridos, lipopolisacáridos u otros polímeros para uso en una composición inmunogénica . Las composiciones inmunogénicas de esta invención incluyen los mutantes de CT-CRM o secuencias de ADN y moléculas que codifican para las CT-CRM deseadas de esta invención, y también son útiles como composiciones polinucleotídicas (conocidas también como composiciones inmunogénicas de ADN) o se administran con polinucleótidos que codifican para el antígeno seleccionado. Por ejemplo, se ha demostrado previamente que los ratones BALB/c a los que se les administra una formulación de ADN plasmidico (ADNp) que codifica para la longitud completa de la glucoproteína D del virus de herpes simple (HASV, por sus siglas en inglés) tipo 2 (gD2) , junto con CT-CRME29H por la ruta intradérmica, generan una respuesta celular promedio superior en comparación con aquellos que reciben ADN plasmidico que codifica para HSV gD2 por si mismo, por la ruta intradérmica. Además, los títulos de anticuerpos séricos promedio para ratones, que recibieron la composición de ADN plasmidico para HSV gD2 junto con CT-CRME29H presentan aproximadamente la misma que la observada en ratones que recibieron la composición de ADN plasmidico HSV gD2 sin adyuvante. De manera similar, la composición de ADN plasmidico HSV gD2 a la que se le administra como adyuvante con CT-CRME29H, también genera una respuesta de anticuerpo específico para gD2 en muestras de lavado vaginal a concentraciones que son comparables a las que se observan después del suministro de la composición sin adyuvante por las vías intradérmica o intramuscular. Los ratones inmunizados con la composición de ADN plasmídico HSV gD2 que tienen como adyuvante CT-CRME29H o CT y suministrada por vía intradérmica también generaron concentraciones sustancialmente superiores de interferón ? e IL-5 en comparación con los ratones que recibieron la composición de ADN plasmídico HSV gD2 sin adyuvante. De esta manera, las CT-CRM mejoran las respuestas proliferativas y de interferón ? cuando se administran con una composición de ADN plasmídico contra HSV. Además de un portador como se describe en lo anterior, las composiciones inmunogénicas constituidas de moléculas polinucleotídicas contienen de manera deseable, agentes polinucleotídicos facilitadores opcionales o "agentes conjuntos" tales como un anestésico local, un péptido, un lípido que incluye lípidos catiónicos, un liposoma o una partícula lipídica, un policatión tal como polilisina, un policatión tridimensional ramificado tal como un dendrímero, un carbohidrato, una sustancia anfifílica catiónica, un detergente, un tensioactivo de bencilamonio u otro compuesto que facilite la transferencia del polinucleótido a las células . Tal agente facilitador incluye bupivicaína (véase patente de E.U.A. número 5,593,972, la cual se incorpora en la presente como referencia) . Otros ejemplos no excluyentes de tales agentes facilitadores o agentes conjuntos útiles en esta invención se describen en las patentes de E.U.A. números 5,703,055; 5,739,118; 5,837,533; la publicación de patente internacional número WO 96/10038 publicada el 4 de abril de 1996 y la publicación de patente internacional número WO 94/16737 publicada el 8 de agosto de 1994, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia. De manera más preferible, el anestésico local está presente en una cantidad que forma uno o más complejos con las moléculas de ácido nucleico. Cuando el anestésico local se mezcla con moléculas de ácido nucleico o plásmidos de esta invención, forma diversos complejos pequeños o partículas que empacan el ADN y que son homogéneas. Así, en una modalidad de las composiciones inmunogénicas de esta invención, se forman complejos al mezclar el anestésico local y por lo menos un plásmido de esta invención. Cualquier complejo único que resulta de esta mezcla puede contener diversas combinaciones de los plásmidos diferentes. De manera alternativa, en otra modalidad de las composiciones de esta invención, el anestésico local se puede mezclar de antemano con cada plásmido por separado y después las mezclas separadas se combinan en una composición única para asegurar que está presente la proporción deseada de los plásmidos en una composición inmunogénica única, si todos los plásmidos se van a administrar en- una administración única en bolo. De manera alternativa, el anestésico local y cada plásmido se pueden mezclar por separado y se pueden administrar por separado para obtener la proporción deseada. En lo siguiente, cuando se utilizan los términos "complejo" o "uno o más complejos" o "complejos" para definir esta modalidad de la composición inmunogénica, debe entenderse que el término abarca a uno o más complejos en donde cada complejo contiene una mezcla de los plásmidos que codifican para CT-CRM y plásmidos que codifican para antígeno, o bien una mezcla de complejos formados de manera separada, en donde cada complejo contiene únicamente un tipo de plásmido, o uno, o una mezcla de complejos en donde cada complejo contiene un ADN policistrónico . Preferiblemente, los complejos tienen entre aproximadamente 50 y aproximadamente 150 nm de diámetro. Cuando el agente facilitador utilizado es un anestésico local, preferiblemente bupivacaína, se prefiere una cantidad desde- aproximadamente 0.1 por ciento en peso a aproximadamente 1.0 por ciento en peso, en base en el peso total de la composición polinucleotidica . Véase, también, la publicación de patente internacional número WO 99/21591, la cual se incorpora en la presente como referencia y la cual describe la incorporación de tensioactivos de bencilamonio como agentes conjuntos, que se administran de manera preferible en una cantidad de entre aproximadamente 0.001-0.03% en peso. De acuerdo con la presente invención, la cantidad de anestésico local está presente, en una proporción respecto a las moléculas de ácido nucleico, de 0.01-2.5%, p/v de anestésico local respecto a 1-10 µ9/?t?1 de ácido nucleico. Otro intervalo similar es de 0.05-1.25%, p/v de anestésico local respecto a ¾.-00 µ9/p?1 a 1 ml/ml de ácido nucleico. Tal y como se utilizan, las composiciones inmunogénicas polinucleotídicas expresan la CT-CRM y los antígenos en una base transitoria in vivo; no se inserta material genético ni se integra dentro de los cromosomas del hospedador. Este uso se diferencia por lo tanto de la terapia de genes, en donde el objetivo es insertar o integrar el material genético de interés en el interior del cromosoma. Se utiliza un ensayo para confirmar que los polinucleótidos administrados por inmunización no generan un fenotipo transformado en el hospedador (patente de E.U.A. número 6, 168, 918) . Las composiciones, inmunogénicas también pueden contener otros aditivos adecuados para el modo seleccionado de administración de la composición. La composición de la invención también puede involucrar polinucleótidos liofilizados los cuales se pueden utilizar con otros excipientes farmacéuticamente aceptables para desarrollar formas de dosificación en polvo, líquidas o en suspensión. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Vol . 2, décima novena edición (1995), por ejemplo capítulo 95 Aerosoles; y publicación de patente internacional número WO 99/45966, cuyas enseñanzas se incorporan en la presente como referencia. Las vías de administración para estas composiciones se pueden combinar, si se desea o se pueden ajustar. Estas composiciones inmunogénicas que contienen moléculas de ácido nucleico pueden contener aditivos adecuados para administración por medio de cualquier vía de administración convencional. En algunas modalidades preferidas, la composición inmunogénica de la invención se prepara para administración a sujetos humanos en forma, por ejemplo, de líquidos, polvos, aerosoles, tabletas, cápsulas, tabletas con recubrimiento entérico, cápsulas o supositorios. Las composiciones inmunogénicas de la presente invención (ya sea composiciones que contienen proteína o composiciones que contienen moléculas de ácido nucleico) como se describe en lo anterior, no se limitan por la selección de los portadores, adyuvantes u otros ingredientes convencionales fisiológicamente aceptables útiles en la preparación farmacéutica de los tipos descritos antes. La preparación de estas composiciones farmacéuticamente aceptables a partir de los componentes descritos en lo anterior, que tienen el pH, isotonicidad, estabilidad y otras características convencionales apropiadas, están dentro de las habilidades en la técnica. E. Métodos de Uso de las Composiciones de la Invención Las composiciones inmunogénicas de esta invención pueden comprender a la CT-CRM sola o combinada con la CT-CRM y un antígeno seleccionado, y se suministran a un vertebrado humano o no humano por diversas vías para mejorar la respuesta inmunológica a un antígeno, preferiblemente un antígeno que provoca una enfermedad, como se identifica en lo anterior. Las composiciones de la presente invención modulan las respuestas inmunológicas al mejorar la respuesta de anticuerpos del hospedador vertebrado y la inmunidad mediada por células después de la administración de una composición que comprende un antígeno seleccionado como se describe en lo anterior y una cantidad adyuvante eficaz de una CT-CRM mu ante, en donde la CT-CRM mut nte tiene una toxicidad reducida sustancialmente en comparación con una CT de tipo silvestre, y en donde la toxicidad reducida es un resultado, de una sustitución de un solo aminoácido o una sustitución de aminoácido doble o inserciones de aminoácido. En una modalidad, la composición inmunogénica que contiene la CT-CRM (ya sea una proteína o codificada por una molécula de ácido nucleico) se suministra, antes de su administración a una composición constituida por el antígeno seleccionado (ya sea como una proteína o como un ácido nucleico) . En otra modalidad, la composición inmunogénica se administra simultáneamente con el antlgeno, ya sea que se administre en una composición que contiene tanto el antígeno y CT-CRM o como una composición separada a partir de la composición que contiene el antigeno. En una modalidad adicional, la composición que contiene la CT-CRM se administra después de la composición que contiene el antígeno. Es preferible, aunque no se requiere así, que el antígeno y la CT-CRM mutante se administren al mismo tiempo. La composición inmunogénica que contiene la CT-CRM se puede administrar como una proteína o como una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína, como se describe en lo anterior. La composición inmunogénica que contiene la CT-CRM se puede administrar como una proteína en combinación con un antígeno seleccionado administrado como una proteína. De manera alternativa, como se describe en lo anterior, la composición inmunogénica de CT-CRM se puede administrar como una proteína con una molécula de ácido nucleico que codifica para el antígeno, como se describe en lo anterior. Otra alternativa adicional involucra administrar tanto la CT-CRM como el antígeno, como secuencias de ácido nucleico que codifican para estas proteínas. Se puede utilizar cualquier vía de administración adecuada para suministrar la composición inmunogénica que contiene la CT-CRM. La vía puede ser la misma o puede ser diferente a la vía que se selecciona para administrar una composición que contiene el antígeno seleccionado, si la CT-CRM y el antígeno se administran en composiciones separadas o en formas diferentes, por ejemplo proteína o ácidos nucleicos. Las vías adecuadas de administración incluyen, pero no se limitan a las vías intranasal, oral, vaginal, rectal, parenteral, intradérmica, transdérmica (véase, por ejemplo, la publicación de patente internacional número WO 98/20734, la cual se incorpora en la presente como referencia) , intramuscular, intraperitoneal , subcutánea, intravenosa e intraarterial . La vía apropiada se selecciona en base en la naturaleza de la composición inmunogénica utilizada así como de una evaluación de la edad, peso, sexo y salud general del paciente y los antígenos presentes en la composición inmunogénica, y factores similares, determinados por el médico guien atiende. En general, la selección de la "cantidad eficaz" apropiada o la dosificación para la CT-CRM o los componentes antigénicos de una o varias de las composiciones inmunogénicas de la presente invención también se pueden basar en la proteína o la forma de ácido nucleico de la CT-CRM y el antígeno, la identidad del antígeno en una o varias de las composiciones inmunogénicas utilizadas así como la condición física del sujeto, y de manera más especial que incluya la salud general, edad y peso del sujeto inmunizado.

El método y las vías de administración asi como la presencia de componentes adicionales en las composiciones inmunogénicas también pueden alterar las dosificaciones y las cantidades de CT-CRM y antígeno. Tal selección y ajuste hacia arriba o hacia abajo de la dosis eficaz está dentro de las habilidades de la técnica. La cantidad de CT-CRM y antigeno necesario para inducir una respuesta inmunológica, preferiblemente una respuesta protectora, o para producir un efecto exógeno en un paciente sin efectos colaterales adversos significativos depende de estos factores. Las dosis adecuadas se determinan con facilidad por las personas expertas en la técnica. Como un ejemplo, en una modalidad, para las composiciones que contienen componentes proteínicos, por ejemplo una proteína variante de CT-CRM o un antígeno como se describe en lo anterior, cada dosis puede comprender entre aproximadamente 1 /g y aproximadamente 20 mg de la proteína por mi de la solución estéril . Se pueden contemplar otros intervalos de dosificación por los expertos en la técnica. Las dosis iniciales opcionalmente pueden estar seguidas por refuerzos repetidos, cuando así se desee. En otro ejemplo, las cantidades de moléculas nucleotídicas en las composiciones de ADN y de vector se pueden seleccionar y ajustar por una persona experta en la técnica. En una modalidad, cada dosis comprenderá entre aproximadamente 50 Mg y aproximadamente 1 mg de ácido nucleico que codifica para CT-CRM o que codifica para antígeno, por ejemplo ADN plasmldico, por mi de una solución estéril. El número de dosis así como el régimen de dosificación para la composición también se determinan fácilmente por personas expertas en la técnica. Se puede conferir protección por una sola dosis de la composición inmunogénica que contenga la CT-CRM o puede requerir la administración de varias dosis con o sin el antígeno seleccionado, además de las dosis de refuerzo en tiempos posteriores para "mantener protección. En algunos casos, la propiedad adyuvante de la CT-CRM mutante puede reducir el número de dosis que contengan antígeno que se necesitan o bien puede reducir el curso en el tiempo del régimen de dosificación. Se pueden monitorear los niveles de inmunidad para determinar si existe necesidad de refuerzos. Para que se comprenda mejor está invención, se establecen los siguientes ejemplos. Los ejemplos son únicamente con propósitos de ilustración y no necesitan considerarse como limitantes del alcance de la invención. Todas las referencias que se mencionan en la presente se incorporan en este documento como referencias . EJEMPLO 1: EXPRESIÓN DE MOTANTES DE CT A. Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de crecimiento Se utilizan como hospedadores para la clonación de plásmidos recombinantes y la expresión de proteínas mutadas a E. coli TG1 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) , y TX1, un derivado resistente al ácido nalidíxico de TG1 que presenta FTc, lacl a partir de XL1 blue (Stratagene, La Jolla, CA) , y CJ236 (FTc, lacT) (BioRadr Hercules, CA) . Las-cepas que contienen plásmido se mantienen en placas de agar LB con antibióticos, según se requiera (50 £¿g/ml de ampicilina', 25 g/ml de kanamicina; 10 ¿¿g/ml de tetraciclina) . Se subclona un operón CT completo de V. cholerae 0395 dentro del factor fagémido pSKII-, bajo el control del promotor l<ac para crear el plásmido inducible por IPTG denominado pMGJ67 (Jobling, M.G. , y Holmes, R.K., 1992 Infect. Immun., 60, 4915-4924). B. Mutagénesis del gen ctxA Se utiliza el método de Kunkel, T.A., 1985 Proc.

Nati. Acad. Sci . , USA, 82, 488-492 para seleccionar los mutantes derivados de oligonucleotido creados en el plásmido pMGJ67. Los oligonucleotidos generados para generar las CT-CRM mutantes y las diversas sustituciones de aminoácidos en las CT-CRM mutantes se incluyen en la tabla 2. Tabla 2 : Secuencia de Oligonucleotidos introducida en ctxA Sustitución Secuencia oligonucleotídica3 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO I16A CCTCCTGATGAAGSYCAAGCAGTCAGG 5 S68Y CTTTGAGATCTGCCCACT 6 V72Y GTTTGACCCACTAAGTGGGC 7 S68Y+V72Y GTTTGAGATATGCCCACTTATATGGTCAAC 8 a Las bases alteradas están subrayadas. S representa G o C; Y representa C o T. Brevemente, el mutante CT-CRMH6A se elabora directamente en pMGJ142 utilizando el equipo de mutagénesis QucikChange como se describe por el proveedor (Stratagene Inc., La Jolla, CA) . El plásmido mutante doble que contiene las sustituciones CT-CRMS6BY, W2Y se elabora por PCR utilizando el cebador mutagénico descrito en la tabla 2 para crear un megacebador seguido por clonación del fragmento Xbal-Clal que codifica para ctxA mutado dentro de pMGJ142. El mutante doble C -CRMH6A,S68Y se elabora por PCR del clon que contiene I16A utilizando el cebador mutagénico para crear un megacebador seguido por clonación del fragmento Xal-Clal que codifica para ctxA mutado dentro de pMGJ1 2. Los mutantes CT-CRM 72Y y CT-CRMII6A(S68Y se elaboran por reversión del mutante doble CT-CRMS68Y,V72Y de regreso al tipo silvestre en la posición de aminoácido 68 utilizando el equipo de mutagénesis QuickChange. Cada oligonucleótido de cadena sencilla se fosforila y utiliza para dirigir la síntesis de la segunda cadena sobre una plantilla de ADN de cadena sencilla que contiene uracilo rescatada de E. coli dut ung cepa CJ236 (F'Tc, pMGJ67) . Después de ligación y transformación de ung* cepa TX1, se recupera el ADN de cadena sencilla de los transformantes AmpR y se secuencia mediante el método de terminación de cadena didesoxi (Kunkel, mencionado antes).

C. Construcción de los vectores de expresión de CT-CRM promovidos por arabinosa La experiencia previa con CT-CRME29H (publicación de patente internacional número WO 00/18434) ha demostrado que se puede obtener una producción máxima en E. coli al sustituir las secuencias de Shine-Dalgarno sintéticas hacia el extremo 5' del gen ctxA y al colocar el operón bajo el control de los operones CT del sistema promotor de arabinosa que contienen mutaciones dirigidas al sitio en la subunidad A, realizadas como se ha descrito previamente (supra) . Las CT-CRM originalmente están bajo el control del promotor ¡Slac y los niveles de expresión en E. coli son bajos. Se utiliza PCR para modificar la región 5' respecto al ATG de la subunidad CT-A y se inserta un sitio Nhel en el extremo 5 ' . El cebador 3 ' correspondiente agrega un sitio HindIII en el extremo 3' del gen para CT-B. Las secuencias cebadoras utilizadas son: CT directa: 5 ' TTTTTGGGCTAGCATGGAGGAAAAGATGAGC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 9) y CT inversa: 5 ' CGAGGTCGAAGCTTGCATGTTTGGGC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 10) . Se realiza la PCR sobre cada operón de CT-CRM mutante y se ligan los productos de PCR en pCR2.l-Topo (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se transforman en células Top 10F'. Se siembra en placas E. coli recombinante sobre agar SOB que contiene 25 /¿g/ml de kanamicina y 40 xg/ml de X-gal . Los plásmidos a partir de las colonias blancas se criban para determinar insertos por digestión con EcoRI. Los plásmidos que contienen los insertos del tamaño correcto se digieren con Nhel y HindIII, de acuerdo con las instrucciones del fabricante y los fragmentos de ADN que contienen los operones CT se aislan de agarosa con una baja temperatura de fusión. El plásmido pBAD18-Cm(Invitrogen) se digiere con Nhel-HindIII y el ADN lineal se aisla de la agarosa con baja temperatura de fusión. El plásmido pBAD18 digerido y los operones CT se ligan a 12 °C y se transforman en ToplOF E. coli. Los plásmidos de las colonias resistentes a cloramfenicol se criban para determinar si existen insertos mediante análisis de restricción y los clones representativos se secuencian para confirmar la presencia de mutaciones dirigidas al sitio. Se transforman los plásmidos en DH5a! para expresión de las CT-CRM. Los plásmidos que codifican para la CT-CRM mutantes presentan una única sustitución de aminoácido en las posiciones 16' y 72 y se designan como pLP903 y pLP905, respectivamente, y los plásmidos que codifican para la CT-CRM mutantes presentan sustitución de aminoácidos doble en las posiciones 16 y 68 y en las posiciones 68 y 72 se denominan como pLP904 y pLP906, respectivamente. Los plásmidos contienen el policistrón de los genes de V. cholerae ctxA y ctxB los cuales codifican para la CT. D. Expresión de las CT-CRM en E. coli Se hacen crecer células E. coli DH5o! que contienen los plásmidos pLP903, pLP904, pLP905 o pLP906, células que expresan las CT-CRM, CT-CRMn6A, CT-CRMS68y(Ii6A, CT-CRMV72Y y CT-CRMS68Y, 72Y respectivamente en medio Hy-Soy amortiguada con fosfato que contiene 25 µg/ l de cloramfenicol y glicerol 0.5% a 37°C, con aireación. Cuando los cultivos alcanzan una D06oo de aproximadamente 4.5-5.5, se inducen por adición de L-arabinosa a una concentración final de 0.5%. Los cultivos se incuban a 37 °C con aireación durante tres horas después de la inducción y después se recolectan las células por centrifugación. Los sedimentos celulares se almacenan a -20°C. E. Preparación y Purificación de las CT-CRM Los sedimentos celulares se recalientan a temperatura ambiente y se resuspenden en NaP04 10 mM y EDTA 1 mM (pH 7.0) a 9% del volumen de cultivo original. Las suspensiones de células se rompen mecánicamente en un microfluidizador y se centrifugan durante 10 minutos a 8,500 xg. Los Usados celulares se clarifican adicionalmente a 160,000 xg durante una hora. El lisado celular clarificado se carga a una velocidad de flujo de 2 ml/minuto sobre una columna de carboximetil (CM, por sus siglas en inglés) -Sepharose"11 (300 mi de CM-SepharoseMR por 10 litros de cultivo) (Amersham, Pharmacia) equilibrada con NaP04 10 mM (pH 7.0). La columna se lava con >10 volúmenes de NaP04 10 mM (pH 7.0) a una velocidad de flujo de 5 ml/minuto. La holotoxina CT-CRME29H se eluye con cuatro volúmenes de columna de NaP0 10 mM (pH 8.3). Las CT-CRM purificadas se intercambian en amortiguador por diálisis en PBS y se almacenan a 4°C. Se determina la presencia de holotoxina intacta así como de las subunidades respectivas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (PAGE) y SDS-PAGE, respectivamente. La prueba de PAGE nativa indica la presencia de una molécula purificada de 86 kDa (datos no mostrados) , el peso molecular esperado para la holotoxina de cólera intacta (Tebbey et al, 2000 Vaccine, 18(24) ;2723-2734) . Además, SDS-PAGE muestra dos bandas que se alinean con las subunidades CT-A (27 kDa) y CT-B (12 kDa) que constituyen la holotoxina intacta (datos no mostrados) . EJEMPLO 2; ELECT OFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA NO DESNATURALIZANTE Las CT-CRM mutantes, CT-CRMi1SA/S68Y, y CT-CRMV72Y se analizan por electroforesis en PAGE no desnaturalizante para determinar el porcentaje de las CT-CRM presentes después de la purificación como holotoxina intacta. Las CT-CRM purificadas, 15 /xl de cada una (a diversas concentraciones de proteína) , se corren a través de un gel de poliacrilamida no desnaturalizante polimerizado 6%. Se utilizan como un estándar tres concentraciones diferentes (300, 600 y 1200 ng) de CT-B. Después de la electroforesis , el gel se tiñe con azul de Coomassie. El gel después se escanea utilizando un densitómetro y se calcula el porcentaje de la holotoxina a partir de las lecturas del densitómetro de las CT-CRM y del estándar CT-B. Los datos indican que 97.8% de CT-CRMI16A,S68Y y 99.4% de CT-CRM 72Y están presentes como holotoxinas intactas (tabla 3) . Tabla 3 : Ensayo de Gel Nativo para Holotoxina Intacta EJEMPLO 3; ENSAYO DE CÉLULAS SUPRARRENALES Y-l PARA DETERMINAR TOXICIDAD RESIDUAL DE LAS CT-CRM Las CT-CRM mutantes se comparan con la CT de tipo silvestre para determinar toxicidad en el ensayo de célula tumoral suprarrenal Yl de ratón, el cual sé utiliza in vitro para medir toxicidad de las enterotoxinas en la familia de toxina de cólera/enterotixina termolábil . El ensayo depende de la unión de la toxina a los receptores de superficie celular y la entrada subsecuente de la subunidad Al de la toxina al interior del citoplasma de la célula.

La toxina de cólera nativa aislada de V. cholerae es cortada proteolíticamente en la unión CT-A1-CTA2, lo que resulta en que las subunidades Al y A2 de la toxina de cólera se mantienen unidas únicamente por un enlace disulfuro. Esto vuelve inestable a las subunidades Al y A2 y se disocian con facilidad entre si. La subunidad Al de CT cortado se disocia de la subunidad A2 cuando se une al receptor de superficie celular y entra a la célula, en donde ADP-ribosila a la proteína G reguladora (Gsce) , lo que induce sus efectos tóxicos como se describe en los antecedentes anteriores . En contraste, las enterotoxinas producidas en E. coli (ya sea CT o LT) está sin romper y por lo tanto los péptidos A1-A2 aún se unen. En consecuencia, la CT producida en V. cholerae es significativamente más tóxica en los ensayos de células suprarrenales Y-l en comparación con la CT producida en una célula bacteriana heteróloga tal como E. coli. En un primer ensayo de células suprarrenales Y-l, las CT-CRM mutantes se comparan con la CT de tipo silvestre cortada de V. cholerae para determinar toxicidad. En este ensayo, se siembran células suprarrenales Y-l (ATCC CCL-79) en placas de fondo plano de 96 pozos a una concentración de 104 células por pozo. Después se agregan diluciones seriadas triples de las CT-CRM purificadas (-90% de pureza, determinado por tinción de Coomassie) a las células tumorales y se incuban a 37°C (5% C02) durante 18 horas. Las células después se examinan por microscopía óptica para determinar evidencia de toxicidad (redondeo de células) . El criterio de valoración de la titulación se define como la concentración mínima de toxina necesaria para obtener más de 50% de redondeo de células. Después se calcula el por ciento de toxicidad residual utilizando el criterio de valoración del título de CT cortada de tipo silvestre a partir de V. cholerae (100% de toxicidad) dividido entre el título inducido por las CT-CRM multiplicado por 100. Los datos que se establecen en la tabla 4 indican que la toxicidad residual de las cuatro holotoxinas mutantes purificadas, CT-CRMUSA, CT-CRMiieA,s68Y, CT-CRMV72Y Y CT-CRMS68Y,V72Y probadas utilizando el ensayo de célula suprarrenal Y-1 es de únicamente 0.37% Tabla 4: Ensayo de Células Suprarrenal Y-1 En un segundo estudio independiente se comparan extractos periplásmicos crudos de células E. coli (TG1) que expresan concentraciones elevadas de las CT-CRM mutantes, en comparación con holotoxina CT de tipo silvestre sin cortar expresada en E. coli para determinar toxicidad residual en el ensayo de células suprarrenales Y-1. Las células suprarrenales Y-1 se incuban en recipientes de varios pozos en medio RPMT que contiene suero bovino fetal 10% en presencia de lisado de células de E. coli crudo. Se monitorea la toxicidad celular como en lo anterior. En este estudio se define una unidad tóxica como la cantidad más pequeña de toxina o de sobrenadante que provoca redondeo de 75-100% de las células en un pozo, después de incubación durante la noche . En la tabla 5 a continuación se presentan los resultados de este estudio. Tabla 5: Ensayo de Células Suprarrenales Y-1 Los resultados de este estudio indican que aunque las toxicidades de CT-CRMn6A y CT-CRMS6SY,V72Y se reducen sustancialmente (5%) , la CT-CRMV72Y es tan tóxica como la CT de tipo silvestre. Sin desear unirse a teoría alguna, los resultados variantes en el segundo estudio (tabla 5) pueden ser atribuibles al hecho de que los Usados de células E. coli crudo periplásmico utilizado en el segundo estudio contienen las' CT-CRM mutantes sin cortar, y al hecho de que la toxicidad se mide como un porcentaje de la toxicidad de CT sin cortar tipo silvestre, producida por E. coli . En contraste CT de tipo silvestre sin cortar de E. coli tiene una dosis de redondeo de células al 50% de 6250 pg/ml en el ensayo de células Yl (datos no mostrados) . En el primer estudio, la citotoxicidad residual de las CT-CRM imitantes se expresa como un porcentaje de la toxicidad de la CT cortada de tipo silvestre producida por V. cholerae en donde la holotoxina cortada tiene 50% de dosis de redondeo celular de 125 pg/ml en el mismo ensayo de células Yl . En consecuencia, la toxicidad residual reportada en el segundo estudio es 50 veces mayor que la que se obtiene en el primer estudio. EJEMPLO 4; EL ENSAYO DE ADP-RIBOSILTRANSFERASA Se mide la actividad de ADN-ribosiltransferasa de NAD+ : agmatina, como liberación de [carbonil-14C] nicotinamida a partir de NAD+ radiomarcada . Brevemente, CT y las CT-CRM se activan por tripsina y se incuban durante 30 minutos a 30°C con glicina 50 mM/ditiotreitol 20 mM en amortiguador TEA (Tris/EDTA/azida de sodio/cloruro de sodio) (pH 8.0). Posteriormente, los materiales siguientes se agregan a la reacción: 0.1 /ig de inhibidor de tripsina de soya, fosfato de potasio 50 mM, agmatina 10 mM, ditiotreitol 20 mM, cloruro de magnesio 10 mM, GTP 100 µ,?, dimiristoilfosfatidilcolina 3 mM, colato 0.2% y 0.03 mg de ovalbúmina, [adenina-U-14C] AD 100 µ? (DuPont NEN1^, Boston, MA) y agua hasta un volumen final de 300 µ? . Después de incubación durante 90 minutos a 30°C, se aplican muestras de 100 µ? a columnas (0.64 x 5 cm) de AG1-X2 (Bio-Rad) , las cuales después se lavan cinco veces con 1.0 mi de H20 destilada/desionizada. Los eluatos que contienen [14C]ADP-ribosilagmatina se recolectan para radioensayo. La recuperación media de 14C en eluato se expresa como porcentaje de lo que se aplica a la columna. Los resultados se presentan en la tabla 6. Tabla 6: Actividad de NAD:Agmatina ADP-Ribosiltransferasa La actividad de ADP-ribosiltransferasa también es determinada independientemente utilizando dietilamino (bencilidina-amino) guanidina (DEABAG, por sus siglas en inglés) como un sustrato. En este ensayo, se incuban alícuotas de 25 µ? de las CT-CRM mutantes a partir de lisados de células purificadas, activados durante 30 minutos a 30°C con 1/50, p/p, de tripsina, se incuban con 200 µ? de DEABAG 2 mM en K2P04 0.1M, pH 7.5, NAD 10 µ?, DTT 4 mM durante dos horas. La reacción se detiene al agregar 800 µ? de un amortiguador de suspensión que contiene 400 mg de resina DOWEX AG50-X8 para unir el sustrato que no ha reaccionado. El DEABAG ADP-ribosilado en el sobrenadante se cuantifica por emisión de fluorescencia en un fluorimetro DyNA Quant calibrado con DEABAG. Con la excepción del mutante CT-CRMV72Y, las actividades de ADP ribosiltransferasa de las CT-CRM imitantes se reduce sustancialmente con respecto a la de tipo silvestre (tabla 7) . El alto nivel de actividad de ADP-ribosiltransferasa que se observa con CT-CRMV72Y puede ser atribuible al hecho de que en este estudio se mide la actividad de ADP ribosiltransferasa de las CT-CRM mutantes utilizando un sustrato diferente en un protocolo de ensayo diferente . Tabla 7: Actividad de ADP-ribosiltransferasa de las CT-CRM utilizando dietilanmino (bencilidina-amidino) guanidina (DEABAG) EJEMPLO 5: RESPUESTAS INMUNOLÓGICAS DE RATONES BALB/C INMUNIZADOS CON PROTEÍNA DE MEMBRANA EXTERIOR P4 RECOMBINANTE (RP4) DE HAEMOPHILUS INFLÜENZAE NO TIPIFICABLE (NTHI) , SOLA O JUNTO CON CT-CRM En un primer experimento se determinó la capacidad de la CR-CRMI16A mutante para aumentar la inducción de los anticuerpos sistémicos y de mucosa a la proteína de membrana exterior P4 recombinante (rP4) . Los títulos de anticuerpo de suero y de mucosa contra P4 inducidos por CR-CRMn6A mutante se determinaron y compararon con los de la CT tipo silvestre y del mutante CR-CRME29H ( O 00/18434) . En este estudio, se inmunizó a ratones BALB/c por vía intranasal (IN) en las semanas 0, 3 y 5 y en la semana 5, día 6 con una formulación que contiene 1 /¿g de proteína P4 recombinante en solución salina o 1 de P4 junto con 1 ¿íg de CT de tipo silvestre, 1 g de CR-CRME29H o 0.1, 1 ó 10 g de CR-CRMI16A. Los resultados indican que la CR-CRMI16A al igual que la CT de tipo silvestre y CR-CRME29H aumentan la capacidad de la proteína rP4 para inducir respuestas inmunológicas sistémicas y de mucosa (tabla 8) . Por ejemplo, seis semanas después de la inmunización primaria IN, los títulos de anticuerpos de IgG contra rP4 de ratones inmunizados con la proteína rP4 formulada ya sea con CR-CRMI1S¾ O CR-CRME29H es 40 veces mayor que la de ratones inmunizados con las proteínas recombinantes únicamente en PBS . Los títulos de anticuerpos (IgG) de ratones a los que se administran las proteínas recombinantes más la holotoxina CT de tipo silvestre a una concentración de 1 /j se incrementan 67 veces, en comparación con los títulos de anticuerpo en ratones a los que se les administra rP4 recombinante, únicamente con solución salina. Los títulos de anticuerpos de ratones inmunizados con 1 xo¡ de la CT-CRM mutante, CR-CRM, CR-CRME29H se incrementan 55 veces con respecto a los títulos de anticuerpos en ratones inmunizados únicamente con rP4. En comparación, los títulos de anticuerpos en ratones inmunizados con 1 g y 0.1 µg de la CT-CRM mutante CR-CRMI16A, se incrementan 15 veces y 27 veces, respectivamente, en comparación con los títulos de anticuerpos contra rP4 en ratones inmunizados únicamente con rP4 en solución salina. Tabla 8 : Respuestas de anticuerpo sérico para la proteína p4 recombinante Un examen de los anticuerpos específicos para proteína en las secreciones de mucosa de los ratones BALB/c inmunizados IN en las semanas 0, 3 y 5 se realizan dos semanas después de la inmunización terciaria. Las muestras de mucosa se recolectan en la semana 5, día 6 de lavado vaginal (VW, por sus siglas en inglés) , lavado nasal (NW, por sus siglas en inglés) , el lavado broncoalveolar (BAL, por sus siglas en inglés) y de saliva (SAL, por sus siglas en inglés) . Estos resultados se muestran en la tabla 9, que indica además que CT-CR H6A facilita la generación de respuestas inmunológicas locales contra la proteína rP4. Además, los títulos de anticuerpos contra rP4 fueron comparables a aquellos inducidos por la composición inmunogénica que tiene como adyuvante a CT tipo silvestre. Tabla 9 : Respuestas de anticuerpos mucosales a proteína rP4 En un segundo experimento, se inmuniza IN a cinco ratones BALB/C por grupo, los días 0, 21 y 35 con una dosis de 15 µ? que contiene 1 /xg de rP4 sola o 1 9 de rP4 más 1 /ig de uno de las CT-CRM mutantes, CT-CRME29H, CT-CRMI1SA, CT-CRMn6A,s68Y/ CT-CR V72Y o CT-CRMS68Y,v72Y como un adyuvante, como se indica en la tabla 10. Los títulos de anticuerpos- IgA e IgG contra P4 se determinan por ELISA en muestras acumuladas recolectadas en la semanas 0, 3 y 5, y en la semana 5, día 6 y los resultados se muestran en la tabla 10. Los resultados indican que los títulos séricos de IgA e IgG contra rP4 se incrementan sustancialmente en ratones a los que se les administra el antígeno junto con una o más CT-CRM mutantes. Las respuestas de anticuerpos de mucosa a rP4 también de miden una semana después de la última inmunización (semana 5, día 6) . Tabla 10 : Efecyos Adyuvantes de las Toxinas de Cólera Mutantes Sobre la Respuesta Inmune a la Proteína NTHi rP4 suministrada intranasalmente a Ratones BALB/c Hembra21 Se suministra 1 g de NTHi rP4, IN, a ratones BALB/c hembra en un volumen de 15 µ? las semanas 0 , 3 y 5. b Se formulan las composiciones NTHi rP4 con solución salina o con 1 /¿g de los diversos mutantes de las toxinas de cólera. c Se recolectan sueros la semana 0, 3, 5 y la semana 5, día 6 las muestras acumuladas representan una n = 5. La tabla 11 establece los títulos de IgA e IgG a partir de los lavados nasal, broncoalveolar y vaginal y de saliva, respectivamente. Estos resultados también indican que los títulos de IgA e IgG contra rP4 en mucosa también se incrementan sustancialmente ratones a los que se les administra el antígeno rP4 junto con una o más de las CT-CR mutantes, en comparación con los ratones a - los que se les administra rP4 en solución salina.

Tabla 11: Títulos de Criterio de Valoración de ELISA contra NTHi rP4 en Acumulados de Lavado de Mucosa3 a Se suministra 1 Mg de NTHi rP4, IN, a ratones BALB/c hembra en un volumen de 15 µ? en la semana 0, 3 y 5. b Se formulan composiciones NTHi rP4 con solución salina o 1 µg de diversos mutantes de toxinas de cólera c Se recolectan muestras de mucosa en la semana 6; las muestras acumuladas representan una n = 5. En la semana 5, día 6, después de la administración IN, se determinaron por ELISA los títulos de criterios de valoración de IgA e IgG que incluyen a IgG subclases IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3 en el suero de cada ratón individual en los seis grupos (tablas 12-17) . En los datos que se presentan en Is tablas 12-17, se realiza un análisis estadístico utilizando JMP, SAS Institute, Inc.; el análisis de varianza de una vía es significativo a un nivel p<0.0001; y se realizan comparaciones múltiples utilizando la prueba de Tukey-Kramer HSD , a = 0.05. Tabla 12 : Títulos de criterio de valoración por ELISA de IgG contra NTHi rP4 en cada ratón individual en la semana 5, día 6 * Los valores difieren significativamente de los del grupo de solución salina † Los valores difieren significativamente del grupo con adyuvante CT-CRMs68Yr v72Y - Tabla 13 : Títulos de criterio de valoración por ELISA de IgG contra NTHi rP4 en cada ratón individual en la semana 5, día 6 Los valores difieren significativamente del grupo al que administra solución salina Tabla 14: Títulos de criterio de valoración por ELISA de IgGl sérica contra NTHi rP4 en cada ratón individual en la semana 5, día 6 Los valores difieren significativamente del grupo olución salina Tabla 15 : Títulos de criterio de valoración por ELISA de IgG2a contra NTHi rP4 en cada ratón individual en la semana 5, día 6 Los valores difieren significativamente del grupo lución salina Tabla 16 : Títulos de criterio de valoración por ELISA de IgG2b sérica contra NTHi rP4 en cada ratón individual en la semana 5, día 6 Los valores difieren significativamente del grupo solución salina Tabla 17 : Títulos de criterio de valoración por ELISA de IgG3 sérica contra NTHi rP4 en cada ratón individual en la semana 5, día 6 Adyuvante 1 2 3 4 5 GMT StDev Media de error estándar Solución salina 992 33 33 33 33 65 429 192 CT-CR E29H 311 36 23 344 1,246 162 500 224 CT-CR 116A 2,256 62 390 290 150 299 918 411 CT-CRM116A.S68Y 120 1,953 33 612 64 198 816 365 CT-CR w2Y 479 929 25 1,124 462 357 432 193 CT-CR s68Y.V72Y 202 69 3 92 33 42 76 34 EJEMPLO 6; RESPUESTAS INMUNOLÓGICAS DE RATONES BALB/c INMUNIZADOS CON LA GLUCOPROTEINA DE FUSIÓN NATIVA PURIFICADA (F) DEL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO (RSV, POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) Se examinó la capacidad de las CT-CR de la presente invención para aumentar las respuestas inmunológicas sistémicas y mucosales contra las glucoproteínas del virus sincitial respiratorio (RSV, por sus siglas en inglés) utilizando la proteína de fusión (F) nativa purificada. Previamente se ha demostrado que ratones BALB/c inmunizados IN con proteína F en la que se administra como adyuvante CT o CT-CRME29H generan títulos de IgG e IgA sistémicos y locales (Tebbey et al, mencionado antes) . Dicho estudio también indica que los anticuerpos contra CT preexistentes no tienen un impacto perjudicial en el nivel de los anticuerpos IgA e IgG locales o sistémicos contra protelna F. En realidad, el estudio indica que los anticuerpos contra CT preexistentes son benéficos para la generación de una respuesta aumentada de anticuerpo contra la proteína F. De manera adicional, los datos también sugieren un mecanismo que . involucra la neutralización de virus infeccioso .ya sea por inmunoglobulinas mucosales o humorales que son estimuladas en respuesta al protocolo de inmunización IN que contiene F/CT-CRME29H. Se inmunizan a ratones BALB/c (5 por grupo) (IN, 0.01 mi) en las semanas 0 y 3 con proteína F purificada nativa (3 /¿g/dosis) solo o en solución salina, o en una formulación que contiene 0.1 o 1 µg de uno de la CT de tipo silvestre (Sigma) o 0.1 o 1 /xg de una de las CT-CR mutantes destoxificadas genéticamente (CT-CRME29H, CT-CRMI16A, CT-CRMI16A,SSSY, CT-CRMV72Y Y CT-CRMS68Y,V72Y) · Los sueros se recolectan dos semanas después de la inmunización secundaria. El título de las IgG, IgA y las subclases de IgG específicas para proteína, suero neutralizante, los anticuerpos en el lavado broncoalveolar, lavado nasal y lavado vaginal se realizaron por duplicado en monocapas de células HEp-2 en microcapas de 96 pozos. Además, un subgrupo de ratones inmunizados se expuso con virus vivo para determinar la capacidad protectora de las formulaciones inmunogénicas . Los resultados se presentan en la tabla 20. Las cantidades que se presentan son el criterio de valoración de una media geométrica de IgG, de una subclase de IgG y de títulos de anticuerpo IgA contra proteína F (+_ 1 desviación estándar) . El análisis de los anticuerpos séricos posterior a la inmunización secundaria muestran que la inmunización con cualquiera de los adyuvantes derivados de la toxina de cólera induce de manera significativa respuestas inmunológicas a la proteína F de RSV (tabla 18) . El uso de cada uno de los mutantes de toxina de cólera CT-CRMI:LsA, CT-CRMHSA,S68Y, CT-CRMV72Y y CT-CRMS68Y<V72Y y CT-CRME29H, en concentraciones de 0.1 a 1.0 /¿g/dosis induce de manera significativa (p<0.05) anticuerpos séricos (IgG total, IgGl, lgG2a e igA) contra la proteina F de RSV. La magnitud de la respuesta inmune IgG total contra la proteína F de RSV se incrementa aproximadamente 25 veces por inclusión de los adyuvantes derivados de toxina de cólera, cuando se compara con la respuesta que se obtiene en animales a los que se les administra una composición que contiene F/PBS. La significancia estadística de los datos que se presentan en la tabla 18 a continuación es la siguiente. Para la IgG total: p<0.05; F/PBS versus todo, p<0.05; F/CT versus F/CT-CRME29H versus F/CT-C MILSA versus F/CT-CRMIL6A.SS8Y versus F/CT-CR SS8Y,V72Y versus FCT-CRMSSgy,V72Y (todos a 0.1 y 1.0 ¿¿g/dosis) . Para IgGl: p < 0.05: F/PBS versus todos. p<0.05; F/CT versus F/CT-CRMB29H versus F/CT-CRMIL6A versus F/CT-CRMILSA, sesY versus F/CT-CRMS68Y,V72Y versus CT-CRMS68Y,V72Y (tanto a 0.1 y 1.0 yug/dosis) . Para IgG2a: p < 0.05: F/PBS versus todo, F/CT (0.1 /xg) versus F/CT-CRMiXSA (0.1 /xg) , p > 0.05: A una dosis 1.0 g, F/CT versus F/CT-CRME29H versus F/CT-CRMI1SA versus F/CT-CRMH6A,S68Y versus F/CT-CRMV72Y versus F/CT-CRMS68Y/V72Y- dosis de 0.1 /xg, F/CT versüs F/CT-CRME29H versus F/CT-CRMIL6A/S68Y versus F/CT-CRMV72Y versus F/CT-CRMSS8Y,V72Y. No se observan diferencias significativas en los títulos totales de IgG o IgGl contra F entre cada una de las toxinas mutantes nuevas (CT-CRMn6A, CT-CRMI16A(S68Y, CT-CRMV72Y y CT- CRMSS8Y, V72Y) y ya sea CTE2SH O CT de tipo silvestre. La evidencia de diferencias estadísticas se observa entre grupos específicos cuando se realiza un análisis de los tipos de IgG2a y de IgA. Sin embargo, estas comparaciones no muestran ninguna tendencia consistente respecto al desempeño inmunologico de un mutante versus otro. Tabla 18 : Respuestas inmunológicas humorales de ratones BALB/c después de inmunización intranasal con proteína F y la CT-CRM mutantes Antígeno Adyuvante (µ?) igG lgG1 lgG2a IgA proteína F Ninguno 4.1 + 0.6 3.1 + 0.4 1.9 + 0.3 1.9 + 0.4 proteína F CT-CRME29H(1) 6.3 + 0.7 5.8 + 0.8 4.9 + 0.7 4.3 + 0.6 proteína F CT-CRME29H(0.1) 5.6 + 0.2 5.4 + 0.5 4.4 + 0.2 4.0 + 0.2 proteína F CT-CRMH6A(1) 5.6 + 1.6 5.2 + 1.4 4.7 + 1.1 4.3 + 0.2 proteína F CT-CRMH6A(0.1) 5.5 + 0.3 5.0 + 0.1 3.9 + 0.4 3.5 + 0.5 proteína F CT-CRMV72Y(1) 6.4 + 0.2 5.8 + 0.3 5.3 + 0.3 4.5 + 0.3 proteína F CT-CRMU72Y(0.1) 5.6 + 0.2 5.2 + 0.4 4.1 + 0.4 3.5.+ 0.2 proteína F CT-CRM|16A,V72Y(1) 6.4 + 0.1 5.7 + 0.2 5.3 + 0.3 4.6 + 0.4 proteína F CT-CRM|16A,V72Y(0.1) 5.5 + 0.04 5.5 + 0.3 4.8 + 0.2 4.1 + 0.3 proteína F CT-CRMS68Y,V72Y(1) 6.5 + 0.1 5.6 + 0.2 4.9 + 0.3 4.8 + 0.2 proteína F CT-CRMS6B4,V72Y(0.1) 5.8 + 0.3 5.6 + 0.2 4.2 + 0.3 4.6 + 0.2 proteína F CT(1) 6.7 + 0.3 6.0 + 0.3 5.7 + 0.2 5.3 + 0.5 proteína F CT(0.1) 5.8 + 0.1 5.7 + 0.2 5.0 + 0.4 4.9 + 0.2 En otro experimento, grupos de 5 ratones BALB/c se inmunizaron (IN, 0.01 mi) en las semanas o y 3 con proteína F nativa (3 µ /??3?3) . La proteína F se mezcla con 1 ó 0.1 /xg de mutantes destoxificados genéticamente o con CT tipo silvestre. Las respuesta de anticuerpo contra proteína F también se analizaron en muestras de lavado de mucosa acumuladas de lavado broncoalveolar (BAL) , lavado nasal (NW) y lavado vaginal (V ) , recolectado 2 semanas después de la inmunización secundaria (Tabla 19) . Los datos representan el criterio de valoración de los títulos de anticuerpos IgG e IgA contra proteína F de las muestras acumuladas . Como se esperaba, no se observa inducción de anticuerpo en lavados de mucosa de ratones inmunizados con F/PBS. Sin embargo, es evidente fácilmente la poderosa capacidad adyuvante de mucosa de cada holotoxina de cólera mutante. Aunque no se realizaron análisis estadísticos respecto a estas muestras acumuladas, son evidentes algunas tendencias. Por ejemplo, en ratones que recibieron F/CT-CR 72Y (1.0 g) presentan IgG e IgA aumentados en cada una de las muestras BAL, NW y tomadas. En comparación, las toxinas mutantes CT-CRMI:L5¾, CT-CRMI16A/S68Y y CT-CRMSS8YIV72Y parecen ser comparables con CT-CR E29H en funcionar como adyuvantes de las respuestas inmunológicas locales para la proteína F de RSV.

Tabla 19 : Respuestas inmunologicas de mucosa de ratones BALB/c después de inmunización intranasal con proteína F y imitantes destoxificados genéticamente En otro experimento se inmuniza a ratones BAL /c (IN, 0.01 µ?) en las semanas 0 y 3 con proteína F nativa (3 /g/dosis-) . La proteína F se mezcla con 1 ó 0.1 de cada mutante destoxificado genéticamente o con CT de tipo silvestre. En la semana 5, se expone los ratones con la cepa A2 de RSV y se extirpan los pulmones 4 días después para cuantificar la infectividad de virus. Cada una de las holotoxinas de cólera -mutantes induce una respuesta inmunológica protectora a la exposición de RSV, medida por la carga pulmonar viral (Tabla 20) . Los datos se presentan como la media de virus recuperados (logao)/g de tejido. Se realizan ensayos de anticuerpo neutralizantes en presencia de suero de cobayo 5% como una fuente de complemento (C) en muestras de sangre tomadas dos semanas después de la inmunización secundaria. Los datos muestran el título medio (logio) que muestran una reducción de 60% en las ufp/pozo en comparación con los pozos control . El análisis estadístico de los datos a partir de los ensayos de infectividad de virus se reporta como p < 0.05; F/PBS versus todos; p > 0.05: F/CT-E29H vs. F/CT vs/F/CRM/i;L6A vs. F/CT-CRMV72Y vs . F/CT-CRMI16A,V72Y vs . F/CT-CRMS68y,v72Y 0.1 y 1.0 ^g/dosis. Respuestas neutralizantes de suero: p < 0.05: F/PBS vs . todos excepto F/CT-CRMn6A s68Y (0.1 Mg) . F/CT (1.0) vs. F/CT-CRMI16A (0.1). F/CT-CRMiieA,S68Y (0.1) vs. F/CT-CRMI1SA,SS8y (1.0) F/CT (9.0), F/CT-CRMneA (1.0), F/CT-CRME29H (1.0), F/CT-CRMv72T (0.1). Los pulmones de ratones inmunizados con F/PBS claramente están poblados con RSV (logio3.4 ufp/g de tejido) . En contraste, los ratones inmunizados con proteína F que se administra de manera conjunta con holotoxinas de cólera mutantes, no muestran virus detectable. Se observa un patrón muy similar para anticuerpos neutralizantes séricos (Tabla 20) . Los ratones inmunizados con F/PBS muestran anticuerpos neutralizantes asistidos por complemento que se encuentran reducidos notablemente en comparación con todos los ratones que recibieron holotoxinas de cólera mutantes como un adyuvante, excepto F/CT-CRMI16AjS68Y a 0.1 g por dosis. Aunque se observa evidencia de actividad neutralizante en ausencia de complemento, no se . observan diferencias estadísticas (Tabla 20) . De manera colectiva, estos datos sugieren que la inclusión de las holotoxinas de cólera mutantes CT-CRMIieA, CT-CRMI6A, S68Y , CT-CRMv72Y, y CT-CR Ss8,vv2Y contribuyen sustancialmente a la magnitud de la respuesta inmunológica funcional contra la proteína F de RSV. Tabla 20: Respuestas inmunológicas funcionales inducidas por inmunización con proteína F purificada y las CT-CRM mutantes En experimentos adicionales, se inmuniza a ratones BALB/c que previamente no han sido expuestos (8-10 semanas de edad, 5/grupo) (IN, 10 µ?) en las semanas 0 y 3 con proteína de fusión (F) purificada nativa, que se purifica a partir de la cepa 248/404 de RSV. Se prepara la proteína (3 /ig/dosis) mezclada con 1.0 o 0.1 g de la CT-CRM indicada. Se inmuniza a ratones control con proteina F mezclada únicamente con CT-CR E29H, CT de tipo silvestre o con PBS . Se recolectan suero (título de media geométrica _+ 1 desviación estándar) y lavados broncoalveolar (BA ) , nasal (NW) y vaginal (VW) dos semanas después de la inmunización secundaria, para determinación del criterio de valoración y los títulos de IgG, total y en subclases, e IgA contra proteína F, mediante ELISA. Las muestras de lavado de mucosa se acumulan para la determinación de los títulos de criterio de valoración. En las Tablas 21 y 22 se presentan los resultados de dos experimentos . Tabla 21: Títulos Ig séricos geométricos de ratones BALB/c inmunizados con protexna F en una formulación con las CT-CRM imitantes Tabla 22. Títulos de Ig de muestras de lavado de mucosa acumulados de ratones BALB/c inmunizados con proteína F en una formulación con las CT-CRM mutantes Cuando se utilizan los mutantes de CT-CRM de esta invención como adyuvantes de mucosa a una dosis de 1.0 µgr se obtienen resultados similares a los del uso del mutante CT-CRME29H o la CT de tipo silvestre (Tabla 21) . No se observan diferencias notables a partir de los títulos de IgG o IgA contra proteína F inducidos después de la inmunización con proteína F mezclada con CT-CRM29H o la CT de tipo silvestre. Debido a que se utilizaron muestras acumuladas para determinar los títulos de Ig en fluidos de lavado de mucosa, no se pudo realizar un análisis estadístico. No obstante, los títulos inducidos por las CT-CRM mutantes de esta invención son comparables con los inducidos por la proteína F mezclada con CT-CRME29H o la CT de tipo silvestre (Tabla 22) . Por lo tanto, todas las CT-CRM mutantes de esta invención tienen actividad adyuvante para proteína F. EJEMPLO 7; RESPUESTAS INMUNOLÓGICAS DE RATONES BALB/C INMUNIZADOS CON LA PROTEÍNA DE MEMBRANA EXTERIOR USPA2 DE M. CATARRHALIS En este estudio, se examina la capacidad de las CT-CRM mutantes para aumentar las respuestas inmunológicas sistémica y mucosal contra la proteína de membrana exterior UspA2 nativa de M. catarrhalis . Se administra UspA2 purificada (5 /g/dosis) , sola o en 10 µ? de solución salina, o bien en una formulación de 10 µ? que contiene 0.1 ^g/dosis de una CT- CRM mutante (CT- CRME29H , CT-CRMI16A , CT- CRMi1SA, S68Y, CT-CRMV72Y o CT-CRMS68Y,V72Y) a ratones BALB/c IN, los días 0, 7 y 14. Se examinan el día 28 los niveles de IgG e IgA específicos para la proteína en el suero y en lavados de mucosa. Los títulos resultantes de IgG tanto en suero como en mucosa se muestran en la Tabla 23. La totalidad de las CT-CRM mutantes, excepto CT- CRMI16A , inducen una respuesta aumentada de anticuerpos IgG séricos. Se miden los niveles de IgG e IgA en lavados bronquial, nasal y vaginal. No se detectó IgA en ninguno de los lavados, y se detectó IgG únicamente en algunos lavados .

Tabla 23 : Títulos de sueros para UspA2 inducidos en ratones por UspA2 administrada intranasalmente con diferentes CT-CRM.

EJEMPLO 8: CAPACIDAD ADYUVANTE DE LAS HOLOTOXINAS DE TOXINA DE CÓLERA MUTANTES Para crear un panel comprensivo de las CT-CRM mutantes con diferentes características de toxicidad, se analizaron la funcionalidad e inmnogenicidad de las CT-CRM mutantes descritas en lo anterior, como adyuvantes de mucosa y se determinó la toxicidad y los perfiles de actividad enzimática de cada uno de los mutantes. Como se resume en la Tabla 24, la totalidad de las CT-CRM mutantes presenta una toxicidad y una actividad enzimática reducidas significativamente en comparación con la CT de tipo silvestre. Se generan los siguientes datos a partir de dos estudios realizados para evaluar a estas CT mutantes destoxificadas gené icamente para determinar su capacidad para servir como adyuvantes en las respuestas inmunológicas para la proteína UspA2 nativa de M. ca.ta.rrh.alis . Los experimentos se realizaron como sigue: se inmunizó a ratones BALB/c (6-8 semanas de edad, 5 ratones/grupo) en las semanas 0, 2 y 4 con 5 xg de proteína UspA2 nativa purificada en PBS o con formulación conjunta con 1 /¿g de la CT de tipo silvestre o CT-CRME29H o CT-CRMnSA, o CT-CR V72Y, ' o CT-CRMI16A,s68Y/ o CT-CRMS68Y,V72Y por inmunización. Se administra un volumen total de 10 µ.1 intranasalmente (5 µ.1 por nariga) . Se extrae sangre de los ratones en las semanas 0, 2, 4 ó 6 con el fin de realizar un ensayo de las respuestas de anticuerpos séricos. Dos semanas después de la última inmunización (semana 6) , se sacrifica a los ratones para análisis de las respuestas de anticuerpo mucosal . Se determinaron diferencias significativas entre los grupos mediante las pruebas de comparación múltiple de Tukey-Kramer HSD mediante la utilización los elementos de programación software de descubrimiento estadístico JMP1111 (SAS Institute Inc. , Cary, NC. ) . La capacidad adyuvante de las CT-CRM se puede resumir como sigue. El análisis de los anticuerpos séricos en la semana 6 muestran que la inmunización con proteína UspA2 formulada con cualquiera de las CT-CRM mutantes, a una concentración de 1 µg/dosis, induce de manera significativa respuestas de anticuerpo IgG para la proteína UspA2. La magnitud de la respuesta de anticuerpo IgG total para la proteína UspA2 se incrementa aproximadamente 17-38 veces por inclusión de los imitantes derivados de CT (excluyendo a CT-CRMi1SA(S68Y) (Tabla 25) . No se observaron diferencias significativas en los títulos totales de IgG contra UspA2 entre las toxinas mutantes CT-CR USA, CT-CRMV72Y, y CT-CRMSSBYIV72Y y CT-C ME29H/ aunque todas indujeron títulos de IgG significativamente mayores en comparación con la proteína UspA2 sola, determinado por la prueba HSD de Tukey-Kramer (Tabla 25) . El uso de cada un de las CT-CRM mutantes también aumenta los anticuerpos de la subclase IgG en suero (IgGl, IgG2a e IgG2b) para la proteína UspA2 (Tabla 27) . La relación de los títulos de IgGl e IgG2a o IgG2b es de aproximadamente 1.0, lo que indica un tipo equilibrado Thl/Th.2 de respuesta inmunológic . Las respuestas de anticuerpo contra proteína UspA2 también se analizaron en muestras de lavado de mucosa acumulados (Tabla 27) . Como se esperaba, no se observó inducción de anticuerpo en lavado broncoalveolar (BAL) , lavados nasales (WW) , lavados vaginales (V ) o saliva de ratones inmunizados con UspA2/PBS. Sin embargo, se demostró claramente la potente capacidad adyuvante en mucosa de CT-CRMUSA, CT-CRMV72Y, y CT-CRMse8Y,v72Y y CT-CRM16A.SS8Y. Se demuestra la existencia de anticuerpos IgA mucosales específicos UspA2 detectados en la mayor parte de las muestras de mucosa. Aunque no se realizó un análisis estadístico sobre estas muestras acumuladas, son evidentes ciertas tendencias. Por ejemplo, los ratones que recibieron CT-CRMV72Y muestran anticuerpos IgA específicos para UspA2 aumentados en cada una de las muestras de W, V y saliva probadas. Los imitantes CT-CRMI16A, CT-CRMV72Y, y CT~CRMS68Y,V72Y son potentes adyuvantes mucosales para proteína UspA2 de M. catarrhalis . Los datos de anticuerpos séricos muestran que todas las CT-CRM, excepto CT-CRMI16A,S6SY a una dosis de 1 ¿g, son igualmente capaces en funcionar como adyuvantes de las respuestas inmunológicas contra la proteína UspA2 al igual que CT-CRME29H, (Tablas 25 y 26) . Los datos de lavado mucosal parecen sugerir que la totalidad de las CT-CRM mutantes retienen potentes propiedades adyuvantes para mucosa (Tabla 27) . Además, todas ellas tienen una toxicidad residual y una actividad enzimática significativamente menores en comparación con la CT de tipo silvestre, como se muestra en la Tabla 24. Por lo tanto, CT-CRMI:LEA, CT-CRMV72Y, CT-CRMS68Y,V72Y y CT-CRMi6A,s68Y son adyuvantes mucosales eficaces adicionales.

Tabla 24. Caracterización de las toxinas de cólera mutantes Grupos de cinco ratones BALB/c hembra se inmunizan intranasalmente en la semana 0, 2 y 4 con 10 µ.1 que contienen 5 g de nUspA2 que tiene como adyuvante 1 ¿tg de CT (Sigma) o mutantes de CT. Los títulos de anticuerpo de punto final se determinan a partir de sueros recolectados en la semana 5 , día 6. Los datos se presentan como la media geométrica (+_ 1 SD desviación estándar, por sus siglas en inglés)) del inverso de la dilución que resulta en una DO405 de 0.1. El análisis estadístico es por Tukey-Kramer . En la Tabla 25 se muestran los resultados .

Tabla 25: Respuestas séricas contra nUspA2 de ratones BALB/c después de inmunización intranasal con nüspA2 que tiene como adyuvante a las CT imitantes *Significativamente mayor que el grupo nUspA2/PBS (^Significativamente menor que cualquier otro grupo administrado con adyuvante. Los grupos de cinco ratones BALB/c hembra se inmunizan intranasalmente en las semanas 0, 2 y 4 con 10 µ? que contiene 5 /¿g de nUspA2 que se administra como adyuvante 1 Aig de CT (Sigma) o imitantes de CT. Se determinan los títulos de anticuerpos de criterio de valoración a partir de los sueros recolectados en la semana 5, día 6. Los datos se presentan como la media geométrica (+1 SD) del inverso de la dilución que resulte en una DO40s de 0.1. El análisis estadístico es por Tukey-Kramer. Los resultados se muestran en la Tabla 26. Tabla 26. Respuestas séricas contra nUspA2 de ratones BALB/c después de inmunización intranasal con nUspA2 que se administra con adyuvante de CT-CRM mutantes Significativamente superior en comparación con grupo nUspA2/PBS Grupos de cinco ratones BALB/c hembra se inmunizan intranasalmente en las semanas 0, 2 y 4 con 10 µ? que contienen 5 de nUspA2 que tiene como adyuvante 1 µ< de CT (Sigma) o mutantes de CT. Se determinaron los títulos de anticuerpo de criterio de valoración de las muestras de lavado de mucosa acumuladas recolectadas en la semana 6. Los datos se presentan como el inverso de la dilución que resulta en una ??405 de 0.1. Los resultados se presentan en la Tabla 27. Tabla 27: Respuestas mucosales contra nüspA2 de ratones BALB/c después de inmunización intranasal con nüspA2 que tiene como adyuvante las CT mutantes Todas las publicaciones y referencias mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente como referencia. Aunque la invención se ha descrito con referencia a una modalidad preferida particularmente, se apreciará que se pueden realizar modificaciones sin apartarse del espíritu de la invención. Tales modificaciones se pretende que se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una holotoxina de cólera mutante e inmunogénica (CT-CRM) caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos de la subunidad A de la toxina de cólera de tipo silvestre (CT) , en donde la subunidad A comprende por lo menos una sustitución de aminoácido en la subunidad A de la CT de tipo silvestre en la posición de aminoácido 16 o la posición 72, y en donde la CT-CRM mutante tiene toxicidad reducida en comparación con la CT de tipo silvestre . 2. La CT-CRM de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) una CT-CRM que comprende una sustitución de un solo aminoácido, en donde la sustitución se localiza en la posición de aminoácido 16; (b) una CT-CRM del inciso (a) que comprende una sustitución de un solo aminoácido en donde el aminoácido isoleucina en la posición de aminoácido 16 en la subunidad A se sustituye con una alanina; (c) una CT-CRM en donde la subunidad A difiere de la CT de tipo silvestre por una sustitución de aminoácido que se localiza en la posición de aminoácido 16 y una sustitución de aminoácido que se localiza en la posición 68; (d) una CT-CRM del inciso (c) en donde el aminoácido isoleucina en la posición de aminoácido 16 en la subunidad A está sustituida con una alanina, y en donde el residuo aminoácido serina en la posición de aminoácido 68 en la subunidad A está sustituida con una alanina; (e) una CT-CRM que comprende una sustitución de un solo aminoácido en donde la sustitución se localiza en la posición de aminoácido 72; (f) una CT-CRM del inciso (e) que comprende una sustitución de un solo aminoácido, en donde el aminoácido valina en la posición de aminoácido 72 en la subunidad A está sustituida con una tirosina; (g) una CT-CRM, en donde la subunidad A difiere de la CT de tipo silvestre por una sustitución de aminoácido que se localiza en la posición de aminoácido 72 y una sustitución de aminoácido que se localiza en la posición 68; y (h) una CT-CRM del inciso (g) , en donde el aminoácido serina en la posición de aminoácido 68 en la subunidad A está sustituido con una alanina y en donde el aminoácido valina en la posición de aminoácido 72 en la subunidad A, está sustituido con una tirosina.
3. La CT-CRM de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque comprende además por lo menos una mutación adicional en la subunidad A de la holotoxina de cólera en una posición de aminoácido diferente a las posiciones de aminoácidos 16, 68 y 72 en la unidad A.
4. La CT-CRM de conformidad con la reivindicación 3 , caracterizada porque la mutación adicional es una sustitución para un aminoácido de la subunidad A que se selecciona del grupo que consiste de la arginina en la posición de aminoácido 7, el ácido aspártico en la posición de aminoácido 9, la arginina en la posición de aminoácido 11, el ácido glutámico en la posición 29, la histidina en la posición de aminoácido 44, la valina en la posición de aminoácido 53, la arginina en la posición de aminoácido 54, la serina en la posición de aminoácido 61, la serina en la posición de aminoácido 63, la histidina en la posición de aminoácido 70, la valina en la posición de aminoácido 97, la tirosina en la posición de aminoácido 104, la prolina en la posición de aminoácido 106, la histidina en la posición de aminoácido 107, la serina en la posición de aminoácido 109, el ácido glutámico en la posición de aminoácido 110, el ácido glutámico en la posición de aminoácido 112, la serina en la posición de aminoácido 114, el triptófano en la posición de aminoácido 127, la arginina en la posición de aminoácido 146 y la arginina en la posición de aminoácido 192.
5. Una composición inmunogénica caracterizada porque comprende una holotoxina de cólera mutante (CT-CRM) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la holotoxina mutante mejora la respuesta inmunológica en un hospedador vertebrado a un antígeno .
6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque comprende además un antígeno que comprende una proteína, polipéptido, péptido o un fragmento derivado de una proteína, antígeno el cual se deriva del miembro del grupo que consiste de una bacteria, virus, hongo o parásito patogénicos, una célula cancerosa, una célula tumoral, una de alérgeno y una molécula propia.
7. La composición de ¦ conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el antígeno bacteriano se selecciona de la especie bacteriana que consiste de Haemophilus influenzae tipificable y no tipificable Haemophilus somnus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoea, Chlamydia tracho atis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Alloiococcus otiditis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella chooleraesuís, Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholerae, Corynecbacterium diptherieae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare coplex, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Clostridium tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi , Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobacillus pleauropneumoniae y Mycoplasma galliseptium.
8. La composición antigénica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el antígeno se selecciona del grupo que consiste de la proteína de membrana exterior P4 de Haemophilus influenzae, la proteína de membrana exterior P6 de Haemophilus Influenzae, la proteína de adherencia y penetración (Haps) , de Haemophilus influenzae, la proteína ureasa de Helicobacter pylori, la pilina clase 1 recombinante grupo B de Neisseria meningitidis (rpilina) y la proteína de membrana exterior clase 1 grupo B (PorA) de Neisseria meningitidis.
9. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el antígeno viral se selecciona de las especies virales que consisten del virus sincitial respiratorio, tipos 1,2,3 de virus de Parainfluenza, metapneumovirus humano, virus de influenza, virus de herpes simple, citomegalovirus humano, virus de inmunodeficiencia humana, virus de hepatitis A, virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, papilomavirus humano, poliovirus, rotavirus, calicivirus, virus de sarampión, virus de paperas, virus de rubéola, adenovirus, virus de la rabia, virus del malestar canino, virus de la caspa, neumovirus aviar (anteriormente virus de rinotraqueitis de pavo) , virus Hendra, virus Nipah, coronavirus, parvovirus, virus de rinotraqueitis infecciosa, virus de leucemia felina, virus de 5 peritonitis infecciosa felina, virus de enfermedad bursal infecciosa aviar, virus de enfermedad de Newcastle, virus de enfermedad de arek, virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino, virus de arteritis equina y virus de encefalitis . 0
10. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el antigeno viral se selecciona del grupo que consiste de la proteína de fusión del virus sincitial respiratorio y la glucoproteína D tipo 2 (gD2) del virus de herpes simple (HSV) . 5
11. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el antígeno es de un hongo que se selecciona del grupo de hongos patogénicos que consisten de Aspergillis, Blastomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus e Histoplasma. 0
12. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el antígeno es de un parásito que se selecciona del grupo de parásitos patogénicos que consisten de Leis mania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium, Trichomonas, -5 Toxoplasma gondií y Pneumocystis carinii.
13. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el antígeno se selecciona del grupo que consiste de un antígeno específico de próstata, antígeno carcinoembriónico, MUC-1, Her2 , CA-125, MAGE-3, una hormona y análogos de hormona. 1 . La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el antígeno se selecciona del grupo que consiste de una proteina precursora amiloide, el péptido A3, el cual es un fragmento de 42 aminoácidos de la proteína precursora amiloide, o un fragmento del péptido AjS . 15. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque comprende además un diluyente, excipiente o portador. 16. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque comprende además un segundo adyuvante además de la holotoxina de cólera mutante. 17. Un método para mejorar la respuesta inmunológica de un hospedador vertebrado ante un antígeno, el método está caracterizado porque comprende administrar al hospedador la composición de conformidad con la reivindicación 12 ó 13. 18. Una molécula caracterizada porque es aislada y purificada de ácido nucleico o una secuencia que codifica para una holotoxina de cólera mutante inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 19. La molécula de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque comprende además secuencias reguladoras unidas operablemente a la secuencia codificante y que permiten la expresión de la holotoxina mutante en una célula hospedadora. 20. Una célula hospedadora caracterizada porque está transformada, transducida, infectada o transfectada con la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 18. 21. Un método para producir una holotoxina de cólera mutante inmunogénica, caracterizado porque la holotoxina de cólera tiene toxicidad reducida en comparación con una holotoxina de cólera de tipo silvestre y tiene una sustitución de un solo aminoácido en la subunidad A de la holotoxina de cólera, que comprende transformar, infectar, someter a transducción o transfectar una célula hospedadora con la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 18 y cultivar la célula hospedadora bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína destoxificada inmunogénica recombinante por la célula hospedadora . 22. El uso de una cantidad adyuvante eficaz de una holotoxina de cólera mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en combinación con un antígeno que se selecciona de una bacteria, virus, hongo, o parásito patogénico, una célula cancerosa, una célula tumoral, un alérgeno, una molécula propia o un antígeno vertebrado, en la preparación de un medicamento para mejorar la respuesta inmunológica en un hospedador vertebrado al antigeno.